α１−アンチトリプシン溶液の製造方法
以下の工程：
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）洗浄剤、及び任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化するための溶液を加える工程；
（ｃ）続いて、塩濃度を上げて洗浄剤を塩析する工程
を含む、Ａ１ＡＴ含有溶液からのＡ１ＡＴの製造方法。
純度が９０％超であり、活性形態における活性が０．８ＰＥＵ／ｍｇ以上であるＡ１ＡＴ。
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）洗浄剤、及び任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化するための溶液を加える工程；
（ｃ）続いて、塩濃度を上げて洗浄剤を塩析する工程
を含む、Ａ１ＡＴ含有溶液からのＡ１ＡＴの製造方法。
純度が９０％超であり、活性形態における活性が０．８ＰＥＵ／ｍｇ以上であるＡ１ＡＴ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）を含有する溶液の製造方法、及びＡ１ＡＴに関する。
【０００２】
Ａ１ＡＴは、分子量が約５５，０００ダルトンの糖タンパクであり、セリンプロテアーゼインヒビター群に属する。Ａ１ＡＴは、例えばトリプシン等の多数のプロテアーゼの活性を阻害することができ、阻害剤の名前は歴史的理由によりプロテアーゼに基づいている。エラスターゼは生理学的に標的プロテアーゼであり、特に組織及びマトリックスの再構築、及び分解工程の両者に関係し、顆粒球等の細胞によって放出され、故に炎症過程に関係する。エラスターゼの活性期間は、時間及び空間的に限定され、阻害剤Ａ１ＡＴによって本質的に制御される。このような活性の調節異常によって、組織の迅速な分解が起き、病態生理学的結果に帰する可能性がある。加えて、炎症工程が開始され、及び／または促進される。エラスターゼの制御が減損または欠損する例として、炎症状態を伴う肺の局所組織分解が進展することが知られており、それは次第に肺気腫となり、従って、幾分注目すべきことに、肺機能が制限される。最終段階では、患者が死亡する可能性があり、これは結局のところ、肺移植によってのみ阻止することができる。
【０００３】
このような患者は、Ａ１ＡＴの欠損またはその機能が制限されたＡ１ＡＴを患う。阻害剤は、通常、肝臓で比較的多量に製造されて分泌され、血漿中で比較的高濃度で循環する（典型的濃度は1.3mg/mlである）。加えて、Ａ１ＡＴの生理学的に有効かつ充分な濃度は、健常人の器官、特に肺液（肺胞上皮粘液）中に認められる。このＡ１ＡＴ濃度が有意に低下する場合、または存在するＡ１ＡＴがその機能を制限されるか不活性である（不活化される）場合、上述の結果を伴って、肺組織の変性が制御されない。
【０００４】
Ａ１ＡＴの欠損またはＡ１ＡＴの阻害機能が減じられる原因は、主として遺伝的欠陥である。特にホモ接合型（ＰｉＺＺ）の個体において、いわゆる「Ｚ」突然変異によって、Ａ１ＡＴ分子を合成する細胞で、Ａ１ＡＴ分子が既に重合している。従って、Ａ１ＡＴはもはや循環系に到達することはできず、または極少量のみしか到達できない。一方では、このことから阻害活性が欠損し、これは特に肺において長時間にわたり見られるが、他方では、肝細胞においてポリマーが濃縮し、それによって対応する機能障害が生じる。ヘテロ接合型のＰｉＺ個体は、相応して阻害力が減じられている。同様の欠陥を有するさらなる突然変異が知られている。
【０００５】
現在の評価によれば、米国においてＰｉＺＺ突然変異の有病率は人口の約１／１６００であり、従って、突然変異のキャリアーの数は、それより極めて多いが、推定上、その１０％だけが確認されている。
【０００６】
Ａ１ＡＴ欠損またはＡ１ＡＴ機能減損に基づく肺の機能障害（進行性肺気腫）を罹患する患者のうち、現在、全ての患者は治療できないが、これは治療及び／または予防のためのＡ１ＡＴが、認可された薬物として充分に利用できないためである。確立された治療は、ドナーの血漿から調製されるＡ１ＡＴ含有溶液の静脈内投与に基づいている。確立され、現在推奨される投与量は、１週間当たり、Ａ１ＡＴ６０ｍｇ／体重１ｋｇであり、この量は、１ヶ月につき患者一人当たりのＡ１ＡＴの平均消費量である１６〜２０ｇに相当する。これは言い換えると平均で血漿１５リットルに含まれる量に相当する。出発材料である血漿に含有される阻害剤の一部のみが製剤として純粋な形態で得られることを考えると、健常人血漿１５リットルの何倍かが、１ヶ月につき患者一人のための原料として必要である。Ａ１ＡＴを回収するため、従って患者の維持療法のための原料として必要とされる血漿の総容量は、相応して多量である。
【０００７】
Ａ１ＡＴ製剤を製造するための確立された製造方法は、出発物質としていわゆるコーンのＩＶ１ペーストを使用する。後者は、コーン・オンクレイ(Cohn-Oncley)の方法で製造されるが、この方法は当業者にはよく知られており、または、この方法の変更法によって製造される、この変更法は、本質的に、添加されるエタノールの濃度、調整されるｐＨ値、及び溶液の温度を変化させて、血漿タンパク質を部分分離することに基づく。Ａ１ＡＴに加えて、いわゆるＩＶ１分画は通常、一部、先の沈殿工程によって既に減じられた量の、広範な種類の他の血漿タンパク質を含有する。この方法の変形はキストラー・ニッチマン(Kistler-Nitschmann)法である。従って、いわゆる上澄Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ等の、他のＡ１ＡＴ含有分画に加え、コーンのＩＶ１分画に類似の分画もまた、出発物質として使用され得る。
【０００８】
おおよそ純粋なＡ１ＡＴ製剤を製造する種々の方法が記載されている。Ａ１ＡＴの濃縮のために、特に陰イオン交換体による、イオン交換クロマトグラフィーを使用することが度々報告されている（グレイ(Gray)ら、1960年；クローフォード(Crawford)ら、1973年；チャン(Chan)ら、1973年；等）。しかしながら、この製造工程単独では、最先端技術に相当する純度のＡ１ＡＴ製剤が得られない。従って、他の製造工程が用いられ、一部はイオン交換体と組み合わせる。例えば、ポリエチレングリコールとインキュベートする方法（米国特許A-4,379,087号）、亜鉛キレート化合物またはヘパリン吸着体とインキュベートする方法（米国特許A-4,629,567号）、その他等の、吸着または沈澱法が用いられる。これらの方法はＡ１ＡＴの（さらなる）精製に使用されるが、それぞれの方法において、製品の収率のおおよそ大きな損失に目をつぶらなければならない。原理上は、製品の損失は、製造工程数が増えるに従って増加する。加えて、製造工程数の増加に伴い、しばしば製造時間が延長され、両者によってＡ１ＡＴの完全性及び活性が損われる可能性があり、かつ製品のコストが増加する。
【０００９】
タンパク質製造工程に加えて、いわゆるウイルス不活化工程または除去工程は、血漿から調製されるタンパク質製品の製造方法の本質的な部分である。ウイルスを保護している脂質エンベロープを損傷することによって対応するウイルスを不活化する、いわゆるＳＤ（溶媒／洗浄剤）法に加えて、熱による不活化方法、例えば低温殺菌（６０℃で１０時間の熱処理）が、ウイルスからの安全性を高めるために適用される。ウイルスが脂質エンベロープで被覆されていても、脂質がなくても、「ナノフィルター」による濾過は、通常ウイルスの大きさによってウイルスを保持する。最先端技術では、ウイルス安全性を最大にするため、それぞれが自身有効で異なる法則に基づく二つの製造工程を一つの製造方法に統合する。
【００１０】
タンパク質によって、安定剤、例えばアミノ酸または糖類が、タンパク質を安定化するこれらの方法中に添加される。従って、後にこれらの安定剤を、Ａ１ＡＴ含有溶液から除去しなければならない。ＳＤ法において、洗浄剤はウイルス不活化のための有効成分として添加され、好適な方法によって、製造方法のさらなる過程で除去しなければならない。この目的のため、固定化されたＣ１８鎖を用いるクロマトグラフィー等の、疎水性マトリックスへの吸着が確立された。そのようなクロマトグラフィーでは、再度製品の収率が損なわれ、方法中のそれぞれの（さらなる）クロマトグラフィー工程に上述した欠点がある。加えて、これらのマトリックスは、通例繰り返し使用され、即ち、コスト及び時間のかかるマトリックス再生工程が必要である。
【００１１】
従って、クロマトグラフィー工程を省く、洗浄剤の質的除去のための、代替の有効かつ迅速な方法が記載されている（国際特許WO 94/26287号、米国特許A-5,817,765号）。このように、洗浄剤含有タンパク質溶液は、塩、例えばクエン酸ナトリウムを超生理学的(superphysiological)濃度（０．５Ｍ以上）とし、例えば、単なる濾過によって分離することができる、洗浄剤含有粒子を形成させる。以下、この方法を「洗浄剤／塩析」法と言う。
【００１２】
国際特許WO94/26287号の実施例では、「洗浄剤／塩析」法が、溶液中の３種の単離されたタンパク質である、トランスフェリン、アンチトロンビンIII及びアルブミンに適用されている。実施例では、この方法によって、それぞれ、９５％のタンパク質活性が回収され、洗浄剤濃度が低下する。この方法を、標的タンパク質の収率があまり影響されないような条件下で適用する場合、しばしば製品中のトリトン濃度はなおも高い。国際特許WO94/26287号の実施例４では、発明者らはアルブミン活性の９５％を回収することができるが、２５０ｐｐｍのトリトンＸ−１００及び３５ｐｐｍのＴＮＢＰを含む製品が得られる。特に医薬製剤を生産する場合、５０ｐｐｍ以上のトリトンＸ−１００濃度、好ましくは１０ｐｐｍ以上は避けるべきであり、洗浄剤含量をできるだけ少なくすることが一般に望ましい。
【００１３】
本発明の目的は、可能な限り効果的かつ迅速に、高純度で安全な製品となるＡ１ＡＴ製剤を製造する方法を提供することであった。好ましくは、この方法の間、Ａ１ＡＴの活性及び／または品質は、負の影響を受けるべきではなく、また、洗浄剤は医薬製剤として許容されるレベルまで除去されるべきである。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、Ａ１ＡＴを含む溶液の精製方法を提供することであったが、この方法の間、他のタンパク成分が除去される。好ましくは、Ａ１ＡＴ溶液は、脂質またはウイルス等の他の成分も除去されるべきである。
【００１５】
この目的は、
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）洗浄剤、及び任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化するための溶媒を加える工程；
（ｃ）その後、塩濃度を上げて洗浄剤を塩析する工程
を含む、Ａ１ＡＴ含有溶液からのＡ１ＡＴの製造方法によって達成される。
【００１６】
さらには、本発明の問題点は、請求項１〜１９によって定義される通りの具体例によって解決される。Ａ１ＡＴ含有溶液、例えば再構築された血漿分画ＩＶ１（コーン）からの、Ａ１ＡＴの製造方法は、原理上、Ａ１ＡＴの濃縮に関して、２つの非常に効果的な方法工程のみからなる：即ち、アニオン交換基によるクロマトグラフィー、及びトリトンＸ−１００及びＴｎＢＰを用いたＳＤウイルス不活化処理であり、その後、ウイルス不活化剤を塩析する。
【００１７】
最後に記した工程は、Ａ１ＡＴ含有溶液においても、非常に効果的に使用することができることがわかった。
【００１８】
本発明の方法は、Ａ１ＡＴ含有溶液がＡ１ＡＴと異なる多量のタンパク質を含む場合に特に有用である。驚くべきことには、この方法の条件下では、この方法工程は、ウイルス不活化のための洗浄剤を除去するために使用することができるだけではなく、加えて、Ａ１ＡＴの収率に悪影響を及ぼすことなく存在する、あらゆるタンパク質、リポタンパク及び脂質不純物の分離に有意な精製効果を有する。上述の陰イオン交換クロマトグラフィーとの組み合わせにおいて、本質的に、純度が９０％超、好ましくは９５％超で、活性形態のＡ１ＡＴを含有するＡ１ＡＴ製品が得られる。溶媒洗浄剤処理及び塩析の方法工程によって、活性Ａ１ＡＴが収率８０％以上で回収される。例えば、再構築されたペーストＩＶ１を出発物質として使用する場合、本発明の方法により、Ａ１ＡＴを含む溶液から、α−２−マクログロブリン、ハプトグロビン、α−１酸性糖タンパク質、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭを除去することによって、Ａ１ＡＴが精製される。本発明特有の具体例において、例えば、先の陰イオン交換クロマトグラフィーの溶離液である溶媒／洗浄剤処理前のＡ１ＡＴ溶液を参照すると、Ａ１ＡＴを含む溶液は、塩析工程後、１０％未満のα−２−マクログロブリン、４０％未満のハプトグロビン、１０％未満のα−１酸性糖タンパク質、１０％未満のＩｇＧ、１０％未満のＩｇＡ及び／または１０％未満のＩｇＭを回収する。本発明の好ましい具体例において、最初のＡ１ＡＴを含む溶液は、他のタンパク質を５０％以下、２０％以下、または１０％（ｗ／ｗ）以下含む。最初の溶液は、好ましくは、他のタンパク質を少なくとも１、２または５％（ｗ／ｗ）含む。
【００１９】
さらには、驚くべきことに、本発明の方法が、ウイルス不活化及び／または除去工程としても有用であることも認められた。Ａ１ＡＴは高収率で回収されるが、製品は他のタンパク質成分だけではなく、ウイルスをも除去または低減される。脂質で被覆されたウイルスは洗浄剤処理によって既に不活化されているはずなので、ウイルスが除去または低減されることは、脂質で被覆されていないウイルスに対して特に有用である。このように、本発明の方法は、Ａ１ＡＴを含む溶液中のウイルス、特に脂質で被覆されていないウイルスを不活化する方法でもある。
【００２０】
国際特許WO 94/26287号に記載されたような「洗浄剤／塩析」法が目下の場合において適用可能であり、この方法により医薬製剤において許容されるレベルまで洗浄剤が除去され、さらに、Ａ１ＡＴが非常に特異的に濃縮されるという発見は、驚くべきである。国際特許WO 94/26287号の方法によって、洗浄剤濃度が低減された製品が得られるであろうが、それでも医薬品にはなお高すぎる可能性があり、この方法において洗浄剤以外の全てのタンパク質及び他の成分は、同等の比率で回収される。従って、国際特許WO 94/26287号の方法が、あるタンパク質を他のタンパク質から精製するために有用であるとは推測されないであろう。
【００２１】
例えば、フェニル−セファロース(R)を用いる疎水性（相互作用）クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の使用は、さらに高程度の純度を有するＡ１ＡＴ製品を得ることができるのであれば望ましい。この工程の性能によって、特に、後の洗浄剤／塩析処理が考えられるが、それは疎水性マトリックスまたはリガンドに結合するタンパク質が、通常、超生理的塩濃度の存在下に介在するからである。次に、結合したタンパク質の溶離は、例えば、塩濃度を低下させることによって達成される。相応して、塩濃度の合理的な減少の後に、直接「塩析された」洗浄剤を除去した後（希釈または限外濾過／透析濾過(diafiltration)；ＵＦ／ＤＦによる）、Ａ１ＡＴ含有溶液を疎水性マトリックスと接触させることができ、クロマトグラフィーは当業者によく知られた方法で実施される。
【００２２】
Ａ１ＡＴ含有溶液のＳＤ処理に加えて、ウイルス不活化、ウイルス除去及び／またはプリオン除去のための少なくとも１つのさらなる工程を、本方法、例えば、Ａ１ＡＴ含有溶液の熱ウイルス不活化に統合することができる。これらの工程は、溶液に含有される塩、特にクエン酸ナトリウムが、熱処理の間、安定剤として働くので、特に、塩析の方法工程の直後の溶液において実施することができる。別の可能性として、凍結乾燥品の熱処理が考えられる。代替として、または付加的に、ウイルスまたはプリオンの除去に好適なあらゆる濾過方法を含んでいてもよい。特に、ナノ濾過は当業者によく知られており、好ましくは１５〜２０ｎｍの範囲内の細孔サイズの市販のフィルター、またはウイルス及び／またはプリオンを除去するためのあらゆる好適な濾過を用いた方法を統合してもよい。ウイルスの除去は、アミノ酸の添加、好ましくは各アミノ酸０．１Ｍの濃度でのアミノ酸の添加によって向上すると考えられる。好ましい具体例では、グリシンを０．２Ｍ以上の濃度で添加する。好ましい方法は、横山らによって記載されている（2004,ヴォックス・サンギニス(Vox Sanguinis)86, 225-229）。
【００２３】
本発明によるＡ１ＡＴ含有製剤は、原理上は、以下の工程の組み合わせを特徴とする方法によって得られる：
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）任意に、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー及び／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程；
（ｃ）洗浄剤、及び、任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化するための溶媒を添加する工程；
（ｄ）続いて、これらの化学物質及びタンパク不純物を塩析する工程；
（ｅ）少なくとも１つ以上のウイルス不活化及び／または除去工程に付す工程。
【００２４】
一般的に好適なものは、血漿から得られるＡ１ＡＴ含有溶液及びその分画、または組み換えまたは遺伝子移植的に発現したＡ１ＡＴである。
【００２５】
本方法の好ましい具体例において、ペーストＩＶ１（コーン）は、水または緩衝液、より好ましくは２０ｍＭトリス緩衝液で再構築し、溶液対ペーストの割合を３以上：１（好ましくは１０以上：１）にし、続いて、イオン交換ゲル、好ましくは陰イオン交換ゲル、好ましい具体例においてＤＥＡＥ-セファロース(R)（アマルシャム）、より好ましくはＤＥＡＥ-セファロース(R)ファースト・フローと接触させ、ゲルを洗浄し、そしてＡ１ＡＴをイオン強度を上げることによって溶出する。ウイルス不活化は、例えば欧州特許EP-A-0131740号の方法によって達成される。安定剤の任意の添加の後、ウイルス不活化剤、好ましくはトリトンＸ−１００、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、ＴｎＢＰ及び／またはカプリル酸／カプリレートを添加し、好ましくは、最終濃度をトリトン及びツイーン８０で０．１％（ｗ／ｗ）以上、ＴｎＢＰで０．０３％（ｗ／ｗ）以上、カプリル酸／カプリレートで０．１ｍＭ以上とする。４℃以上、好ましくは１５℃以上での適当なインキュベーション時間、好ましくは０．１時間以上、より好ましくは１時間以上のインキュベーション後、特にクエン酸塩によって、塩濃度を上昇させ、特に０．５Ｍ以上の濃度とする。それによって形成される粒子は、特に濾過によって除去する。フィルターまたは分離した粒子を再洗浄することによって、Ａ１ＡＴ収率を上げることができる。この後、さらなるウイルス不活化工程、好ましくは、０．５Ｍ以上のクエン酸ナトリウム、アミノ酸、糖類またはこれらの物質の混合物の存在下での低温殺菌を行ってもよい。続いて、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、添加した物質の濃度を低下させるのが好ましい。より好ましくは、その後のウイルス粒子の分離は、ナノフィルター、好ましくは細孔サイズ１５〜２０ｎｍのフィルターを用いて達成される。このようにして得られるＡ１ＡＴは、液体または凍結製剤として保存することができ、または当業者によく知られた方法によって、凍結乾燥することができる。
【００２６】
請求項１２〜１７で定義される通りの本発明のＡ１ＡＴは、最先端の製剤とは異なる。欧州特許EP436086号及び独国特許DE4407837号の製剤は、本発明の製剤である高純度のものではなく、ＩｇＡ含量が１ｍｇ／ｍｌ以下ではない。
【００２７】
このようにして得られるＡ１ＡＴ製品は、液剤として皮下、筋肉内、局所投与することができ、またはエアロゾルとして投与することができ、好ましくは静脈内投与することができる。乾燥材料として、パウダー形態の吸入に用いてもよい。例えば静脈内適用のため、他の液剤との混合調剤として適用することも可能である。可能な投与量は、例えば、一週間当り６０ｍｇ／体重１ｋｇ、または一ヶ月当り２５０ｍｇ／ｋｇである。
【００２８】
別の好ましい方法は、上記の方法工程に加えてＨＩＣを含み、上述のように、好ましくは、ＳＤ処理、及び殺ウイルス剤及び他の不純物を塩析した後、好ましくはフェニルマトリックスを用いたＨＩＣを含む。好ましくは、負の精製が実施され、即ち、有益な物質であるＡ１ＡＴがクロマトグラフィーのマトリックスに結合せずに通過し、望ましくない物質が結合して、従って本方法の溶液から除去される。
【００２９】
上記のＨＩＣを含んでいてもよい別の好ましい方法において、固定化したヘパリン、好ましくはヘパリン・セファロースまたはヘパリン・フラクトゲルを用いたクロマトグラフィーを実施する。従って、Ａ１ＡＴ含有溶液は、カラムまたは回分操作においてヘパリンゲルと接触する。濃縮されたＡ１ＡＴは、カラムに結合せずに通過し、またはゲル分離の後、上澄中に認められる。この方法工程は、好ましくは上述のイオン交換クロマトグラフィーの前または後に実施されるか、または洗浄剤の塩析、及び、例えば透析によって、溶液のイオン強度を低下させた後に実施される。
【００３０】
また、本発明のＡ１ＡＴを、単独の有効成分として、または抗炎症剤、好ましくは、ステロイド、ＮＳＡＩＤと組み合わせて含有する医薬、及び、Ａ１ＡＴ欠損、肺線維症及び肺気腫等の肺における変性現象の治療用の医薬を製造するための、本発明のＡ１ＡＴの使用も、本発明で特許請求される。
【００３１】
Ａ１ＡＴ含有医薬の好適な適用形態は、それ自体当業者に公知である。特に、タンパク質の全ての適用形態、例えば、非経口 経皮的適用、静脈内または吸入投与が好適である。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例によって、本発明の方法をさらに説明する。
【００３３】
実施例１：
再構築のため、凍結コーンＩＶ１ペーストを２０ｍＭトリス溶液中、重量比１：９で、アルカリ性のｐＨで３時間攪拌しながら溶解する。
【００３４】
陰イオン交換クロマトグラフィー
この方法工程に好ましいクロマトグラフィー材料は、ＤＥＡＥ-セファロースＦＦ（ファースト・フロー(Fast Flow)）であるが、各陰イオン交換材料について、当業者が条件も適合することが可能である。充填したDEDA-セファロースＦＦクロマトグラフィーカラムは、２０ｍＭトリス溶液（ｐＨ８．０）で平衡化する。その後、溶解したコーンＩＶ１ペーストをｐＨ８．０で適用する。平衡緩衝液で洗浄し、その後、緩衝溶液での洗浄工程を行う。次に、マトリックスに結合したＡ１ＡＴは、２０ｍＭトリス、０．０７５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０でカラムを洗浄することによって溶出することができる。このようにして得られたＡ１ＡＴ溶液の比活性は、約０．５ＰＥＵ／ｍｇタンパク質（ＰＥＵ：血漿等価単位（plasma equivalent unit）；ヒト血漿１ｍｌ中に見られる平均Ａ１ＡＴ量または活性に相当）である。カラムは高塩緩衝液（例えば、２Ｍ ＮａＣｌ）で溶出し、クロマトグラフィー用ゲルは、その後、それ自体公知の方法によって再生することができる。
【００３５】
溶媒／洗浄剤処理
このようにして得られた溶離液を限外濾過で濃縮する。その後、医薬品（ＷＦＩ）として用いるために、トリトンＸ−１００、ＴｎＢＰ及び水を予め混合した溶液を加え、最終濃度をトリトンＸ−１００で１％（ｗ／ｗ）、ＴｎＢＰで０．３％（ｗ／ｗ）とする。ＳＤ処理を、緩やかに攪拌しながら、２０℃で４時間実施する。
【００３６】
塩析
ＳＤ試薬を除去し、望ましくない共存するタンパク質を沈殿させるため、Ａ１ＡＴ含有溶液を、１．５Ｍクエン酸ナトリウム及び２０ｍＭトリスを含有するｐＨ７．０の溶液で希釈する。クエン酸塩濃度が１Ｍになるまで、攪拌下、少なくとも１５分にわたって添加する。続いて、本方法の溶液を、緩やかに攪拌しながら、少なくとも１時間インキュベーションする。その後、形成された白色沈殿を濾過によって分離する。これによって、ＳＤ試薬の濃度が１０ｐｐｍ未満に低下し、かつ、望ましくない共存するタンパク質及び変性Ａ１ＡＴも分離される。
【００３７】
この製造工程の後、Ａ１ＡＴの非活性は少なくとも０．８ＰＥＵ／ｍｇ（ＰＥＵ：血漿等価単位（plasma equivalent unit）；ヒト血漿１ｍｌ中に見られる平均Ａ１ＡＴ量または活性に相当）である。
【００３８】
ナノ濾過
Ａ１ＡＴ製品のウイルス安全性をさらに高めるために、ＵＦ／ＤＦによって低分子物質を除去した後、このようにして得られた溶液を、ポール社のＤＶ２０フィルター等の、名目除外サイズ(nominal exclusion size)が１５〜２０ｎｍのフィルターで濾過する。
【００３９】
結果：
濾過後の製品中のトリトンＸ−１００及びＴＮＢＰの濃度は５ｐｐｍ未満であった。製品中のＡ１ＡＴ及び他のタンパク質成分の量を定量し、溶媒／洗浄剤処理前に定量した量と比較した。以下の回収率を算出した。
【００４０】
A1AT > 80%
(-2-マクログロブリン < 10%
ハプトグロビン < 40%
(-1酸性糖タンパク質 < 10%
IgG < 10%
IgA < 10%
IgM < 10%
【００４１】
この結果は、製品中、特異的にＡ１ＡＴが多量に回収され、一方で製品から他のタンパク質成分が有意に除去されたことを示す。このことは図１によってさらに説明されるが、図１は、溶媒／洗浄剤処理前の溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（２レーン）及び塩析工程後の結果（３レーン）を示す。Ａ１ＡＴは、５０ｋＤよりわずかに上の幅広のバンドに相当する（１レーンの分子量マーカーとの比較）。出発溶液中に明らかに検出される種々の他のタンパク質成分は、有意に低減される。
【００４２】
実施例２
実施例１に記載した方法を一部変更し、イオン交換クロマトグラフィーからのＡ１ＡＴ含有溶出液をヘパリン・セファロースに接触させる。Ａ１ＡＴは、ヘパリン・セファロースカラムに結合せずに通過する。回分操作を用いる場合、Ａ１ＡＴは上澄中に残る。カラム溶出液または回分変形型からの上澄のさらなる処理は、実施例１に記載した通りに実施する。このようにして得られた製品は、純度が上がっていることが特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、還元条件下、勾配４〜２０％、クームス染色、５μｇタンパク質／レーンでの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。１レーン：分子量マーカー；２レーン：溶媒／洗浄剤処理前の実施例１の溶液の試験；３レーン：塩析工程後の実施例１の溶液の試験。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）を含有する溶液の製造方法、及びＡ１ＡＴに関する。
【０００２】
Ａ１ＡＴは、分子量が約５５，０００ダルトンの糖タンパクであり、セリンプロテアーゼインヒビター群に属する。Ａ１ＡＴは、例えばトリプシン等の多数のプロテアーゼの活性を阻害することができ、阻害剤の名前は歴史的理由によりプロテアーゼに基づいている。エラスターゼは生理学的に標的プロテアーゼであり、特に組織及びマトリックスの再構築、及び分解工程の両者に関係し、顆粒球等の細胞によって放出され、故に炎症過程に関係する。エラスターゼの活性期間は、時間及び空間的に限定され、阻害剤Ａ１ＡＴによって本質的に制御される。このような活性の調節異常によって、組織の迅速な分解が起き、病態生理学的結果に帰する可能性がある。加えて、炎症工程が開始され、及び／または促進される。エラスターゼの制御が減損または欠損する例として、炎症状態を伴う肺の局所組織分解が進展することが知られており、それは次第に肺気腫となり、従って、幾分注目すべきことに、肺機能が制限される。最終段階では、患者が死亡する可能性があり、これは結局のところ、肺移植によってのみ阻止することができる。
【０００３】
このような患者は、Ａ１ＡＴの欠損またはその機能が制限されたＡ１ＡＴを患う。阻害剤は、通常、肝臓で比較的多量に製造されて分泌され、血漿中で比較的高濃度で循環する（典型的濃度は1.3mg/mlである）。加えて、Ａ１ＡＴの生理学的に有効かつ充分な濃度は、健常人の器官、特に肺液（肺胞上皮粘液）中に認められる。このＡ１ＡＴ濃度が有意に低下する場合、または存在するＡ１ＡＴがその機能を制限されるか不活性である（不活化される）場合、上述の結果を伴って、肺組織の変性が制御されない。
【０００４】
Ａ１ＡＴの欠損またはＡ１ＡＴの阻害機能が減じられる原因は、主として遺伝的欠陥である。特にホモ接合型（ＰｉＺＺ）の個体において、いわゆる「Ｚ」突然変異によって、Ａ１ＡＴ分子を合成する細胞で、Ａ１ＡＴ分子が既に重合している。従って、Ａ１ＡＴはもはや循環系に到達することはできず、または極少量のみしか到達できない。一方では、このことから阻害活性が欠損し、これは特に肺において長時間にわたり見られるが、他方では、肝細胞においてポリマーが濃縮し、それによって対応する機能障害が生じる。ヘテロ接合型のＰｉＺ個体は、相応して阻害力が減じられている。同様の欠陥を有するさらなる突然変異が知られている。
【０００５】
現在の評価によれば、米国においてＰｉＺＺ突然変異の有病率は人口の約１／１６００であり、従って、突然変異のキャリアーの数は、それより極めて多いが、推定上、その１０％だけが確認されている。
【０００６】
Ａ１ＡＴ欠損またはＡ１ＡＴ機能減損に基づく肺の機能障害（進行性肺気腫）を罹患する患者のうち、現在、全ての患者は治療できないが、これは治療及び／または予防のためのＡ１ＡＴが、認可された薬物として充分に利用できないためである。確立された治療は、ドナーの血漿から調製されるＡ１ＡＴ含有溶液の静脈内投与に基づいている。確立され、現在推奨される投与量は、１週間当たり、Ａ１ＡＴ６０ｍｇ／体重１ｋｇであり、この量は、１ヶ月につき患者一人当たりのＡ１ＡＴの平均消費量である１６〜２０ｇに相当する。これは言い換えると平均で血漿１５リットルに含まれる量に相当する。出発材料である血漿に含有される阻害剤の一部のみが製剤として純粋な形態で得られることを考えると、健常人血漿１５リットルの何倍かが、１ヶ月につき患者一人のための原料として必要である。Ａ１ＡＴを回収するため、従って患者の維持療法のための原料として必要とされる血漿の総容量は、相応して多量である。
【０００７】
Ａ１ＡＴ製剤を製造するための確立された製造方法は、出発物質としていわゆるコーンのＩＶ１ペーストを使用する。後者は、コーン・オンクレイ(Cohn-Oncley)の方法で製造されるが、この方法は当業者にはよく知られており、または、この方法の変更法によって製造される、この変更法は、本質的に、添加されるエタノールの濃度、調整されるｐＨ値、及び溶液の温度を変化させて、血漿タンパク質を部分分離することに基づく。Ａ１ＡＴに加えて、いわゆるＩＶ１分画は通常、一部、先の沈殿工程によって既に減じられた量の、広範な種類の他の血漿タンパク質を含有する。この方法の変形はキストラー・ニッチマン(Kistler-Nitschmann)法である。従って、いわゆる上澄Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ等の、他のＡ１ＡＴ含有分画に加え、コーンのＩＶ１分画に類似の分画もまた、出発物質として使用され得る。
【０００８】
おおよそ純粋なＡ１ＡＴ製剤を製造する種々の方法が記載されている。Ａ１ＡＴの濃縮のために、特に陰イオン交換体による、イオン交換クロマトグラフィーを使用することが度々報告されている（グレイ(Gray)ら、1960年；クローフォード(Crawford)ら、1973年；チャン(Chan)ら、1973年；等）。しかしながら、この製造工程単独では、最先端技術に相当する純度のＡ１ＡＴ製剤が得られない。従って、他の製造工程が用いられ、一部はイオン交換体と組み合わせる。例えば、ポリエチレングリコールとインキュベートする方法（米国特許A-4,379,087号）、亜鉛キレート化合物またはヘパリン吸着体とインキュベートする方法（米国特許A-4,629,567号）、その他等の、吸着または沈澱法が用いられる。これらの方法はＡ１ＡＴの（さらなる）精製に使用されるが、それぞれの方法において、製品の収率のおおよそ大きな損失に目をつぶらなければならない。原理上は、製品の損失は、製造工程数が増えるに従って増加する。加えて、製造工程数の増加に伴い、しばしば製造時間が延長され、両者によってＡ１ＡＴの完全性及び活性が損われる可能性があり、かつ製品のコストが増加する。
【０００９】
タンパク質製造工程に加えて、いわゆるウイルス不活化工程または除去工程は、血漿から調製されるタンパク質製品の製造方法の本質的な部分である。ウイルスを保護している脂質エンベロープを損傷することによって対応するウイルスを不活化する、いわゆるＳＤ（溶媒／洗浄剤）法に加えて、熱による不活化方法、例えば低温殺菌（６０℃で１０時間の熱処理）が、ウイルスからの安全性を高めるために適用される。ウイルスが脂質エンベロープで被覆されていても、脂質がなくても、「ナノフィルター」による濾過は、通常ウイルスの大きさによってウイルスを保持する。最先端技術では、ウイルス安全性を最大にするため、それぞれが自身有効で異なる法則に基づく二つの製造工程を一つの製造方法に統合する。
【００１０】
タンパク質によって、安定剤、例えばアミノ酸または糖類が、タンパク質を安定化するこれらの方法中に添加される。従って、後にこれらの安定剤を、Ａ１ＡＴ含有溶液から除去しなければならない。ＳＤ法において、洗浄剤はウイルス不活化のための有効成分として添加され、好適な方法によって、製造方法のさらなる過程で除去しなければならない。この目的のため、固定化されたＣ１８鎖を用いるクロマトグラフィー等の、疎水性マトリックスへの吸着が確立された。そのようなクロマトグラフィーでは、再度製品の収率が損なわれ、方法中のそれぞれの（さらなる）クロマトグラフィー工程に上述した欠点がある。加えて、これらのマトリックスは、通例繰り返し使用され、即ち、コスト及び時間のかかるマトリックス再生工程が必要である。
【００１１】
従って、クロマトグラフィー工程を省く、洗浄剤の質的除去のための、代替の有効かつ迅速な方法が記載されている（国際特許WO 94/26287号、米国特許A-5,817,765号）。このように、洗浄剤含有タンパク質溶液は、塩、例えばクエン酸ナトリウムを超生理学的(superphysiological)濃度（０．５Ｍ以上）とし、例えば、単なる濾過によって分離することができる、洗浄剤含有粒子を形成させる。以下、この方法を「洗浄剤／塩析」法と言う。
【００１２】
国際特許WO94/26287号の実施例では、「洗浄剤／塩析」法が、溶液中の３種の単離されたタンパク質である、トランスフェリン、アンチトロンビンIII及びアルブミンに適用されている。実施例では、この方法によって、それぞれ、９５％のタンパク質活性が回収され、洗浄剤濃度が低下する。この方法を、標的タンパク質の収率があまり影響されないような条件下で適用する場合、しばしば製品中のトリトン濃度はなおも高い。国際特許WO94/26287号の実施例４では、発明者らはアルブミン活性の９５％を回収することができるが、２５０ｐｐｍのトリトンＸ−１００及び３５ｐｐｍのＴＮＢＰを含む製品が得られる。特に医薬製剤を生産する場合、５０ｐｐｍ以上のトリトンＸ−１００濃度、好ましくは１０ｐｐｍ以上は避けるべきであり、洗浄剤含量をできるだけ少なくすることが一般に望ましい。
【００１３】
本発明の目的は、可能な限り効果的かつ迅速に、高純度で安全な製品となるＡ１ＡＴ製剤を製造する方法を提供することであった。好ましくは、この方法の間、Ａ１ＡＴの活性及び／または品質は、負の影響を受けるべきではなく、また、洗浄剤は医薬製剤として許容されるレベルまで除去されるべきである。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、Ａ１ＡＴを含む溶液の精製方法を提供することであったが、この方法の間、他のタンパク成分が除去される。好ましくは、Ａ１ＡＴ溶液は、脂質またはウイルス等の他の成分も除去されるべきである。
【００１５】
この目的は、
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）洗浄剤、及び任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化するための溶媒を加える工程；
（ｃ）その後、塩濃度を上げて洗浄剤を塩析する工程
を含む、Ａ１ＡＴ含有溶液からのＡ１ＡＴの製造方法によって達成される。
【００１６】
さらには、本発明の問題点は、請求項１〜１９によって定義される通りの具体例によって解決される。Ａ１ＡＴ含有溶液、例えば再構築された血漿分画ＩＶ１（コーン）からの、Ａ１ＡＴの製造方法は、原理上、Ａ１ＡＴの濃縮に関して、２つの非常に効果的な方法工程のみからなる：即ち、アニオン交換基によるクロマトグラフィー、及びトリトンＸ−１００及びＴｎＢＰを用いたＳＤウイルス不活化処理であり、その後、ウイルス不活化剤を塩析する。
【００１７】
最後に記した工程は、Ａ１ＡＴ含有溶液においても、非常に効果的に使用することができることがわかった。
【００１８】
本発明の方法は、Ａ１ＡＴ含有溶液がＡ１ＡＴと異なる多量のタンパク質を含む場合に特に有用である。驚くべきことには、この方法の条件下では、この方法工程は、ウイルス不活化のための洗浄剤を除去するために使用することができるだけではなく、加えて、Ａ１ＡＴの収率に悪影響を及ぼすことなく存在する、あらゆるタンパク質、リポタンパク及び脂質不純物の分離に有意な精製効果を有する。上述の陰イオン交換クロマトグラフィーとの組み合わせにおいて、本質的に、純度が９０％超、好ましくは９５％超で、活性形態のＡ１ＡＴを含有するＡ１ＡＴ製品が得られる。溶媒洗浄剤処理及び塩析の方法工程によって、活性Ａ１ＡＴが収率８０％以上で回収される。例えば、再構築されたペーストＩＶ１を出発物質として使用する場合、本発明の方法により、Ａ１ＡＴを含む溶液から、α−２−マクログロブリン、ハプトグロビン、α−１酸性糖タンパク質、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭを除去することによって、Ａ１ＡＴが精製される。本発明特有の具体例において、例えば、先の陰イオン交換クロマトグラフィーの溶離液である溶媒／洗浄剤処理前のＡ１ＡＴ溶液を参照すると、Ａ１ＡＴを含む溶液は、塩析工程後、１０％未満のα−２−マクログロブリン、４０％未満のハプトグロビン、１０％未満のα−１酸性糖タンパク質、１０％未満のＩｇＧ、１０％未満のＩｇＡ及び／または１０％未満のＩｇＭを回収する。本発明の好ましい具体例において、最初のＡ１ＡＴを含む溶液は、他のタンパク質を５０％以下、２０％以下、または１０％（ｗ／ｗ）以下含む。最初の溶液は、好ましくは、他のタンパク質を少なくとも１、２または５％（ｗ／ｗ）含む。
【００１９】
さらには、驚くべきことに、本発明の方法が、ウイルス不活化及び／または除去工程としても有用であることも認められた。Ａ１ＡＴは高収率で回収されるが、製品は他のタンパク質成分だけではなく、ウイルスをも除去または低減される。脂質で被覆されたウイルスは洗浄剤処理によって既に不活化されているはずなので、ウイルスが除去または低減されることは、脂質で被覆されていないウイルスに対して特に有用である。このように、本発明の方法は、Ａ１ＡＴを含む溶液中のウイルス、特に脂質で被覆されていないウイルスを不活化する方法でもある。
【００２０】
国際特許WO 94/26287号に記載されたような「洗浄剤／塩析」法が目下の場合において適用可能であり、この方法により医薬製剤において許容されるレベルまで洗浄剤が除去され、さらに、Ａ１ＡＴが非常に特異的に濃縮されるという発見は、驚くべきである。国際特許WO 94/26287号の方法によって、洗浄剤濃度が低減された製品が得られるであろうが、それでも医薬品にはなお高すぎる可能性があり、この方法において洗浄剤以外の全てのタンパク質及び他の成分は、同等の比率で回収される。従って、国際特許WO 94/26287号の方法が、あるタンパク質を他のタンパク質から精製するために有用であるとは推測されないであろう。
【００２１】
例えば、フェニル−セファロース(R)を用いる疎水性（相互作用）クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の使用は、さらに高程度の純度を有するＡ１ＡＴ製品を得ることができるのであれば望ましい。この工程の性能によって、特に、後の洗浄剤／塩析処理が考えられるが、それは疎水性マトリックスまたはリガンドに結合するタンパク質が、通常、超生理的塩濃度の存在下に介在するからである。次に、結合したタンパク質の溶離は、例えば、塩濃度を低下させることによって達成される。相応して、塩濃度の合理的な減少の後に、直接「塩析された」洗浄剤を除去した後（希釈または限外濾過／透析濾過(diafiltration)；ＵＦ／ＤＦによる）、Ａ１ＡＴ含有溶液を疎水性マトリックスと接触させることができ、クロマトグラフィーは当業者によく知られた方法で実施される。
【００２２】
Ａ１ＡＴ含有溶液のＳＤ処理に加えて、ウイルス不活化、ウイルス除去及び／またはプリオン除去のための少なくとも１つのさらなる工程を、本方法、例えば、Ａ１ＡＴ含有溶液の熱ウイルス不活化に統合することができる。これらの工程は、溶液に含有される塩、特にクエン酸ナトリウムが、熱処理の間、安定剤として働くので、特に、塩析の方法工程の直後の溶液において実施することができる。別の可能性として、凍結乾燥品の熱処理が考えられる。代替として、または付加的に、ウイルスまたはプリオンの除去に好適なあらゆる濾過方法を含んでいてもよい。特に、ナノ濾過は当業者によく知られており、好ましくは１５〜２０ｎｍの範囲内の細孔サイズの市販のフィルター、またはウイルス及び／またはプリオンを除去するためのあらゆる好適な濾過を用いた方法を統合してもよい。ウイルスの除去は、アミノ酸の添加、好ましくは各アミノ酸０．１Ｍの濃度でのアミノ酸の添加によって向上すると考えられる。好ましい具体例では、グリシンを０．２Ｍ以上の濃度で添加する。好ましい方法は、横山らによって記載されている（2004,ヴォックス・サンギニス(Vox Sanguinis)86, 225-229）。
【００２３】
本発明によるＡ１ＡＴ含有製剤は、原理上は、以下の工程の組み合わせを特徴とする方法によって得られる：
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）任意に、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー及び／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程；
（ｃ）洗浄剤、及び、任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化するための溶媒を添加する工程；
（ｄ）続いて、これらの化学物質及びタンパク不純物を塩析する工程；
（ｅ）少なくとも１つ以上のウイルス不活化及び／または除去工程に付す工程。
【００２４】
一般的に好適なものは、血漿から得られるＡ１ＡＴ含有溶液及びその分画、または組み換えまたは遺伝子移植的に発現したＡ１ＡＴである。
【００２５】
本方法の好ましい具体例において、ペーストＩＶ１（コーン）は、水または緩衝液、より好ましくは２０ｍＭトリス緩衝液で再構築し、溶液対ペーストの割合を３以上：１（好ましくは１０以上：１）にし、続いて、イオン交換ゲル、好ましくは陰イオン交換ゲル、好ましい具体例においてＤＥＡＥ-セファロース(R)（アマルシャム）、より好ましくはＤＥＡＥ-セファロース(R)ファースト・フローと接触させ、ゲルを洗浄し、そしてＡ１ＡＴをイオン強度を上げることによって溶出する。ウイルス不活化は、例えば欧州特許EP-A-0131740号の方法によって達成される。安定剤の任意の添加の後、ウイルス不活化剤、好ましくはトリトンＸ−１００、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、ＴｎＢＰ及び／またはカプリル酸／カプリレートを添加し、好ましくは、最終濃度をトリトン及びツイーン８０で０．１％（ｗ／ｗ）以上、ＴｎＢＰで０．０３％（ｗ／ｗ）以上、カプリル酸／カプリレートで０．１ｍＭ以上とする。４℃以上、好ましくは１５℃以上での適当なインキュベーション時間、好ましくは０．１時間以上、より好ましくは１時間以上のインキュベーション後、特にクエン酸塩によって、塩濃度を上昇させ、特に０．５Ｍ以上の濃度とする。それによって形成される粒子は、特に濾過によって除去する。フィルターまたは分離した粒子を再洗浄することによって、Ａ１ＡＴ収率を上げることができる。この後、さらなるウイルス不活化工程、好ましくは、０．５Ｍ以上のクエン酸ナトリウム、アミノ酸、糖類またはこれらの物質の混合物の存在下での低温殺菌を行ってもよい。続いて、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、添加した物質の濃度を低下させるのが好ましい。より好ましくは、その後のウイルス粒子の分離は、ナノフィルター、好ましくは細孔サイズ１５〜２０ｎｍのフィルターを用いて達成される。このようにして得られるＡ１ＡＴは、液体または凍結製剤として保存することができ、または当業者によく知られた方法によって、凍結乾燥することができる。
【００２６】
請求項１２〜１７で定義される通りの本発明のＡ１ＡＴは、最先端の製剤とは異なる。欧州特許EP436086号及び独国特許DE4407837号の製剤は、本発明の製剤である高純度のものではなく、ＩｇＡ含量が１ｍｇ／ｍｌ以下ではない。
【００２７】
このようにして得られるＡ１ＡＴ製品は、液剤として皮下、筋肉内、局所投与することができ、またはエアロゾルとして投与することができ、好ましくは静脈内投与することができる。乾燥材料として、パウダー形態の吸入に用いてもよい。例えば静脈内適用のため、他の液剤との混合調剤として適用することも可能である。可能な投与量は、例えば、一週間当り６０ｍｇ／体重１ｋｇ、または一ヶ月当り２５０ｍｇ／ｋｇである。
【００２８】
別の好ましい方法は、上記の方法工程に加えてＨＩＣを含み、上述のように、好ましくは、ＳＤ処理、及び殺ウイルス剤及び他の不純物を塩析した後、好ましくはフェニルマトリックスを用いたＨＩＣを含む。好ましくは、負の精製が実施され、即ち、有益な物質であるＡ１ＡＴがクロマトグラフィーのマトリックスに結合せずに通過し、望ましくない物質が結合して、従って本方法の溶液から除去される。
【００２９】
上記のＨＩＣを含んでいてもよい別の好ましい方法において、固定化したヘパリン、好ましくはヘパリン・セファロースまたはヘパリン・フラクトゲルを用いたクロマトグラフィーを実施する。従って、Ａ１ＡＴ含有溶液は、カラムまたは回分操作においてヘパリンゲルと接触する。濃縮されたＡ１ＡＴは、カラムに結合せずに通過し、またはゲル分離の後、上澄中に認められる。この方法工程は、好ましくは上述のイオン交換クロマトグラフィーの前または後に実施されるか、または洗浄剤の塩析、及び、例えば透析によって、溶液のイオン強度を低下させた後に実施される。
【００３０】
また、本発明のＡ１ＡＴを、単独の有効成分として、または抗炎症剤、好ましくは、ステロイド、ＮＳＡＩＤと組み合わせて含有する医薬、及び、Ａ１ＡＴ欠損、肺線維症及び肺気腫等の肺における変性現象の治療用の医薬を製造するための、本発明のＡ１ＡＴの使用も、本発明で特許請求される。
【００３１】
Ａ１ＡＴ含有医薬の好適な適用形態は、それ自体当業者に公知である。特に、タンパク質の全ての適用形態、例えば、非経口 経皮的適用、静脈内または吸入投与が好適である。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例によって、本発明の方法をさらに説明する。
【００３３】
実施例１：
再構築のため、凍結コーンＩＶ１ペーストを２０ｍＭトリス溶液中、重量比１：９で、アルカリ性のｐＨで３時間攪拌しながら溶解する。
【００３４】
陰イオン交換クロマトグラフィー
この方法工程に好ましいクロマトグラフィー材料は、ＤＥＡＥ-セファロースＦＦ（ファースト・フロー(Fast Flow)）であるが、各陰イオン交換材料について、当業者が条件も適合することが可能である。充填したDEDA-セファロースＦＦクロマトグラフィーカラムは、２０ｍＭトリス溶液（ｐＨ８．０）で平衡化する。その後、溶解したコーンＩＶ１ペーストをｐＨ８．０で適用する。平衡緩衝液で洗浄し、その後、緩衝溶液での洗浄工程を行う。次に、マトリックスに結合したＡ１ＡＴは、２０ｍＭトリス、０．０７５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０でカラムを洗浄することによって溶出することができる。このようにして得られたＡ１ＡＴ溶液の比活性は、約０．５ＰＥＵ／ｍｇタンパク質（ＰＥＵ：血漿等価単位（plasma equivalent unit）；ヒト血漿１ｍｌ中に見られる平均Ａ１ＡＴ量または活性に相当）である。カラムは高塩緩衝液（例えば、２Ｍ ＮａＣｌ）で溶出し、クロマトグラフィー用ゲルは、その後、それ自体公知の方法によって再生することができる。
【００３５】
溶媒／洗浄剤処理
このようにして得られた溶離液を限外濾過で濃縮する。その後、医薬品（ＷＦＩ）として用いるために、トリトンＸ−１００、ＴｎＢＰ及び水を予め混合した溶液を加え、最終濃度をトリトンＸ−１００で１％（ｗ／ｗ）、ＴｎＢＰで０．３％（ｗ／ｗ）とする。ＳＤ処理を、緩やかに攪拌しながら、２０℃で４時間実施する。
【００３６】
塩析
ＳＤ試薬を除去し、望ましくない共存するタンパク質を沈殿させるため、Ａ１ＡＴ含有溶液を、１．５Ｍクエン酸ナトリウム及び２０ｍＭトリスを含有するｐＨ７．０の溶液で希釈する。クエン酸塩濃度が１Ｍになるまで、攪拌下、少なくとも１５分にわたって添加する。続いて、本方法の溶液を、緩やかに攪拌しながら、少なくとも１時間インキュベーションする。その後、形成された白色沈殿を濾過によって分離する。これによって、ＳＤ試薬の濃度が１０ｐｐｍ未満に低下し、かつ、望ましくない共存するタンパク質及び変性Ａ１ＡＴも分離される。
【００３７】
この製造工程の後、Ａ１ＡＴの非活性は少なくとも０．８ＰＥＵ／ｍｇ（ＰＥＵ：血漿等価単位（plasma equivalent unit）；ヒト血漿１ｍｌ中に見られる平均Ａ１ＡＴ量または活性に相当）である。
【００３８】
ナノ濾過
Ａ１ＡＴ製品のウイルス安全性をさらに高めるために、ＵＦ／ＤＦによって低分子物質を除去した後、このようにして得られた溶液を、ポール社のＤＶ２０フィルター等の、名目除外サイズ(nominal exclusion size)が１５〜２０ｎｍのフィルターで濾過する。
【００３９】
結果：
濾過後の製品中のトリトンＸ−１００及びＴＮＢＰの濃度は５ｐｐｍ未満であった。製品中のＡ１ＡＴ及び他のタンパク質成分の量を定量し、溶媒／洗浄剤処理前に定量した量と比較した。以下の回収率を算出した。
【００４０】
A1AT > 80%
(-2-マクログロブリン < 10%
ハプトグロビン < 40%
(-1酸性糖タンパク質 < 10%
IgG < 10%
IgA < 10%
IgM < 10%
【００４１】
この結果は、製品中、特異的にＡ１ＡＴが多量に回収され、一方で製品から他のタンパク質成分が有意に除去されたことを示す。このことは図１によってさらに説明されるが、図１は、溶媒／洗浄剤処理前の溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（２レーン）及び塩析工程後の結果（３レーン）を示す。Ａ１ＡＴは、５０ｋＤよりわずかに上の幅広のバンドに相当する（１レーンの分子量マーカーとの比較）。出発溶液中に明らかに検出される種々の他のタンパク質成分は、有意に低減される。
【００４２】
実施例２
実施例１に記載した方法を一部変更し、イオン交換クロマトグラフィーからのＡ１ＡＴ含有溶出液をヘパリン・セファロースに接触させる。Ａ１ＡＴは、ヘパリン・セファロースカラムに結合せずに通過する。回分操作を用いる場合、Ａ１ＡＴは上澄中に残る。カラム溶出液または回分変形型からの上澄のさらなる処理は、実施例１に記載した通りに実施する。このようにして得られた製品は、純度が上がっていることが特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、還元条件下、勾配４〜２０％、クームス染色、５μｇタンパク質／レーンでの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。１レーン：分子量マーカー；２レーン：溶媒／洗浄剤処理前の実施例１の溶液の試験；３レーン：塩析工程後の実施例１の溶液の試験。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）洗浄剤、及び任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化する溶媒を加える工程；
（ｃ）その後、塩濃度を上げて洗浄剤を塩析する工程
を含む、Ａ１ＡＴ含有溶液からのＡ１ＡＴの製造方法。
【請求項２】
前記Ａ１ＡＴ含有溶液が、血漿またはその分画、好ましくは再構築された血漿分画ＩＶ１（コーン）より得られたものであるか、または組み換えまたは遺伝子移植的に発現したＡ１ＡＴ調製品または培養上清に由来するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオン交換クロマトグラフィーを、アニオン交換ゲル、好ましくはＤＥＡＥ−セファロース(R)またはＤＥＡＥ−セファロース(R)ファースト・フローで実施することを特徴とする、請求項１及び／または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）による前記ウイルス不活化が、トリトンＸ−１００、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、ＴｎＢＰ及び／またはカプリル酸またはカプリレート 、好ましくは最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）以上のトリトン及びツイーン８０、０．０３％（ｗ／ｗ）以上のＴｎＢＰ、０．１ｍＭ以上のカプリル酸またはカプリレートを用い、インキュベーション時間０．１時間以上、好ましくは１時間以上、４℃以上、特に１５℃以上で達成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）において該溶液の塩濃度を０．５Ｍ以上とし、好ましくはそれによって形成される粒子を濾過によって除去することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
クロマトグラフィーを疎水性クロマトグラフィー物質で実施することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該Ａ１ＡＴ含有分画の処理を固定化形態のヘパリン（ヘパリンゲル）を含む材料を用いて実施することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
後にさらなるウイルス不活化工程、好ましくは０．５Ｍ以上のクエン酸ナトリウム、アミノ酸、糖またはそれらの混合物の存在下での低温殺菌を実施することを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該溶液のイオン強度を好ましくは限外濾過／透析濾過によって減じることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス粒子の分離を、好ましくはナノ濾過で、好ましくは１５〜２０ｎｍの細孔サイズのフィルターを用いたナノ濾過で実施することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
得られたＡ１ＡＴ分画を、液体、凍結または凍結乾燥製剤として保存することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ａ１ＡＴの全量に基づいて、純度が９０％超であり、活性形態における活性が０．８ＰＥＵ／ｍｇ以上であり、ＩｇＡ含量が１ｍｇ／ｍｌ以下であり、残存洗浄剤含量が５０ｐｐｍ未満、特に１０ｐｐｍ未満であり、かつモノマー含量が９０％超である、Ａ１ＡＴ。
【請求項１３】
以下の工程：
−血漿IV1分画（コーン）の再構築；
−ＤＥＡＥ−セファロース(R)ファースト・フローでのアニオン交換クロマトグラフィー；
−任意に、固定化形態のヘパリンを含む固相でのクロマトグラフィー（ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー）；
−任意に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；
−トリトン０．１％（ｗ／ｗ）以上／ＴｎＢＰ０．０３％（ｗ／ｗ）以上を用い、インキュベーション時間１時間以上、１５℃以上でのウイルス不活化；
−該溶液のイオン強度を上げるための塩の添加；及び
−それによって形成された粒子の濾過による除去；
を含む方法によって得られ得る、請求項１２に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１４】
後に、さらなるウイルス不活化工程、好ましくは０．５Ｍ以上のクエン酸ナトリウム、アミノ酸、糖またはそれらの混合物の存在下での低温殺菌を実施することを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１５】
好ましくは該溶液のイオン強度を限外濾過／透析濾過によって減じることを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１６】
ウイルス及び／またはプリオン除去または不活化工程が、好ましくはナノ濾過、好ましくは１５〜２０ｎｍの細孔サイズのフィルターを用いたナノ濾過によるウイルス粒子の分離から構成されることを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１７】
得られたＡ１ＡＴ分画を、液体、凍結または凍結乾燥製剤として保存することを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１８】
単独の有効成分として、または、抗炎症剤、好ましくはステロイド、NSAIDとの組み合わせで、請求項１２〜１７のいずれかに記載のＡ１ＡＴを含有する医薬。
【請求項１９】
Ａ１ＡＴ欠損症、肺線維症及び肺気腫等の肺の変性現象の治療用の医薬を製造するための、請求項１２〜１７のいずれかに記載のＡ１ＡＴの使用。
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）Ａ１ＡＴ含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーに付す工程；
（ｂ）洗浄剤、及び任意に脂質エンベロープで被覆されたウイルスを不活化する溶媒を加える工程；
（ｃ）その後、塩濃度を上げて洗浄剤を塩析する工程
を含む、Ａ１ＡＴ含有溶液からのＡ１ＡＴの製造方法。
【請求項２】
前記Ａ１ＡＴ含有溶液が、血漿またはその分画、好ましくは再構築された血漿分画ＩＶ１（コーン）より得られたものであるか、または組み換えまたは遺伝子移植的に発現したＡ１ＡＴ調製品または培養上清に由来するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオン交換クロマトグラフィーを、アニオン交換ゲル、好ましくはＤＥＡＥ−セファロース(R)またはＤＥＡＥ−セファロース(R)ファースト・フローで実施することを特徴とする、請求項１及び／または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）による前記ウイルス不活化が、トリトンＸ−１００、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、ＴｎＢＰ及び／またはカプリル酸またはカプリレート 、好ましくは最終濃度０．１％（ｗ／ｗ）以上のトリトン及びツイーン８０、０．０３％（ｗ／ｗ）以上のＴｎＢＰ、０．１ｍＭ以上のカプリル酸またはカプリレートを用い、インキュベーション時間０．１時間以上、好ましくは１時間以上、４℃以上、特に１５℃以上で達成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）において該溶液の塩濃度を０．５Ｍ以上とし、好ましくはそれによって形成される粒子を濾過によって除去することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
クロマトグラフィーを疎水性クロマトグラフィー物質で実施することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該Ａ１ＡＴ含有分画の処理を固定化形態のヘパリン（ヘパリンゲル）を含む材料を用いて実施することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
後にさらなるウイルス不活化工程、好ましくは０．５Ｍ以上のクエン酸ナトリウム、アミノ酸、糖またはそれらの混合物の存在下での低温殺菌を実施することを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該溶液のイオン強度を好ましくは限外濾過／透析濾過によって減じることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス粒子の分離を、好ましくはナノ濾過で、好ましくは１５〜２０ｎｍの細孔サイズのフィルターを用いたナノ濾過で実施することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
得られたＡ１ＡＴ分画を、液体、凍結または凍結乾燥製剤として保存することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ａ１ＡＴの全量に基づいて、純度が９０％超であり、活性形態における活性が０．８ＰＥＵ／ｍｇ以上であり、ＩｇＡ含量が１ｍｇ／ｍｌ以下であり、残存洗浄剤含量が５０ｐｐｍ未満、特に１０ｐｐｍ未満であり、かつモノマー含量が９０％超である、Ａ１ＡＴ。
【請求項１３】
以下の工程：
−血漿IV1分画（コーン）の再構築；
−ＤＥＡＥ−セファロース(R)ファースト・フローでのアニオン交換クロマトグラフィー；
−任意に、固定化形態のヘパリンを含む固相でのクロマトグラフィー（ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー）；
−任意に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；
−トリトン０．１％（ｗ／ｗ）以上／ＴｎＢＰ０．０３％（ｗ／ｗ）以上を用い、インキュベーション時間１時間以上、１５℃以上でのウイルス不活化；
−該溶液のイオン強度を上げるための塩の添加；及び
−それによって形成された粒子の濾過による除去；
を含む方法によって得られ得る、請求項１２に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１４】
後に、さらなるウイルス不活化工程、好ましくは０．５Ｍ以上のクエン酸ナトリウム、アミノ酸、糖またはそれらの混合物の存在下での低温殺菌を実施することを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１５】
好ましくは該溶液のイオン強度を限外濾過／透析濾過によって減じることを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１６】
ウイルス及び／またはプリオン除去または不活化工程が、好ましくはナノ濾過、好ましくは１５〜２０ｎｍの細孔サイズのフィルターを用いたナノ濾過によるウイルス粒子の分離から構成されることを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１７】
得られたＡ１ＡＴ分画を、液体、凍結または凍結乾燥製剤として保存することを特徴とする、請求項１３に記載のＡ１ＡＴ。
【請求項１８】
単独の有効成分として、または、抗炎症剤、好ましくはステロイド、NSAIDとの組み合わせで、請求項１２〜１７のいずれかに記載のＡ１ＡＴを含有する医薬。
【請求項１９】
Ａ１ＡＴ欠損症、肺線維症及び肺気腫等の肺の変性現象の治療用の医薬を製造するための、請求項１２〜１７のいずれかに記載のＡ１ＡＴの使用。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５２３８８３（Ｐ２００７−５２３８８３Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２９８７（Ｐ２００６−５２２９８７）
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９０４３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４６４８
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０００５０４０２）オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９０４３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４６４８
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０００５０４０２）オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト (9)
【Ｆターム（参考）】
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