γ−アミノ酪酸高生産能を有する新規乳酸菌、ならびにそれを使用したγ−アミノ酪酸および乳酸発酵食品の製造方法
【課題】γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）高生産能を有する乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）およびそれをコードする核酸を提供すること。
【解決手段】ＧＡＢＡ高生産能を有する新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸。
【解決手段】ＧＡＢＡ高生産能を有する新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）高生産能を有する新規乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるグルタミン酸脱炭酸酵素（以下、ＧＡＤ）およびそれをコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、生物界に広く分布する非タンパク質アミノ酸であり、生体内では抑制性の神経伝達物質として機能していることが知られている（非特許文献１）。また、ＧＡＢＡは、いろいろな生理機能を有することが知られてきており、血圧降下作用（非特許文献２）を始め、動脈硬化予防、肝機能改善、腎機能向上、精神安定等の作用が報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
このようなＧＡＢＡの機能を利用するために、まずＧＡＢＡを含有する食品素材を摂取することが考えられた。ＧＡＢＡは、玄米、紅麹、茶、一部の野菜や果実等の食品に含まれているが、これらはＧＡＢＡを微量しか含まず（非特許文献３）、元来の生理機能を発現するのに有効な量のＧＡＢＡを含有する食品ではなかった。そこで、食品中のＧＡＢＡ含量を増加する方法が種々検討された。現在までに提案されている上記目的に対応する方法は大きく２種類に分けられる。一方は、ＧＡＢＡまたはエキス化したＧＡＢＡを食品に添加する方法であり、他方は、乳酸菌などの微生物を用いて当該食品を発酵させるか、もしくは当該食品においてグルタミン酸に酵素を作用させてＧＡＢＡを生産する方法である。
【０００４】
前者の方法において添加するＧＡＢＡを生産する方法としては、γ−ハロゲン酪酸のアミノ化やピロリドンの加水分解による化学合成方法以外に、天然素材の培地で選抜または育種した高濃度にＧＡＢＡを生産する乳酸菌を用いて発酵させる方法（非特許文献３、非特許文献５、特許文献１）、およびグルタミン酸またはこれを含む原料に酵素（グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ））を反応させ、高濃度にＧＡＢＡを生産する方法が提案された。これらの方法では、既存の食品に後からＧＡＢＡを添加するため、化学物質の添加物を加えるというイメージの悪さがあり、また食品の工業的製造工程が増えるという問題があった。さらに、ＧＡＢＡを発酵により製造する場合は、培養物由来の不純物としての香味原因物質が添加の際に食品に移行して食品本来の香味を損なう可能性があり、さらには微生物汚染が発生するなどの懸念が生じた。従って、食品製造における製造面および品質面での不自然さを生じることとなった。
【０００５】
一方、後者の方法（特許文献２）では、乳酸菌による発酵を利用する場合、食品によっては必ずしも乳酸菌による発酵が生じるとは限らず、また発酵しても乳酸菌がＧＡＢＡを生産するとは限らないなどの問題があった。また、場合によっては乳酸菌による発酵により当該食品の香味が損なわれる可能性もあり、その食品における乳酸菌による発酵の条件を満たす乳酸菌株は非常に限定されてしまうという制約があった。
【０００６】
これまでにＧＡＢＡ生産能の高い乳酸菌として、キムチなどの漬け物から単離され育種された株についての報告がある（特許文献３）。このような乳酸菌を上記のような添加用ＧＡＢＡの製造またはＧＡＢＡ含有食品の製造に使用できる可能性があるが、いずれの場合でも、本来臭いの強いキムチなどの漬け物から得られた菌株を使用した場合、漬け物臭やダイアセチル臭のような不快な香味を食品に付加する可能性がある。
【０００７】
乳酸菌の発酵により得られる代表的な食品であるヨーグルトと長寿との関連についてのいわゆるメチニコフの不老不死説以来、乳酸菌や乳酸発酵食品がヒトの健康に良い影響を与えると考えられ、疫学的研究やヒトを含めた動物実験が行われている。現在までに乳酸菌摂取による腸管菌叢の安定、血中コレステロールの低下および発癌の抑制などの効果が確認されている。また、食品製造の立場からは、乳酸菌による食中毒菌の抑制などの安全性の向上、塩慣れ効果や発酵および発酵産物による風味の向上が認められている。
【０００８】
漬け物は世界各地で古来より野菜を原料として生産されている食品である。従来、日本において漬け物は発酵法により製造されており、その発酵過程に乳酸菌などの微生物が関与していたと考えられる。すなわち、従来の漬け物には乳酸発酵食品に含まれるものがあった。従って、ＧＡＢＡを生産する乳酸菌による発酵を利用してこのような漬け物を製造することができれば、ＧＡＢＡを含有する機能的発酵食品としての漬け物を得ることができる可能性がある。
【０００９】
しかし、現在、伝統的な発酵法による日本の漬け物製造は、漬け物全体の０．１％程度であるといわれており、ほとんどの漬け物は、非発酵的に製造される。非発酵法のメリットとしては、食品衛生問題の低減、製造期間短縮、品質の均一化が挙げられる。京漬け物の一種である千枚漬けの製造を例に挙げれば、原料野菜であるかぶらに食塩を添加して放置する下漬けの期間が、現在の主流となっている簡易製造法は１晩であるのに対し、伝統法では１週間もの期間を要している。このような理由から、非発酵法の方が効率的な漬け物の工業生産により適しているとされている。
【００１０】
一方、工業的漬け物製造において乳酸発酵が利用されない別の理由として、漬け物に適したスターターがないことで挙げられる。すなわち、植物成分を利用して生育し、食品の香味に悪影響を及ぼさない乳酸菌が得られれば、これをスターターとして原料野菜に添加して安定に漬け物を製造できる可能性がある。また、このような乳酸菌がＧＡＢＡを高生産する能力を有していれば、ＧＡＢＡを含有する発酵食品を効率的かつ安定に得ることができる。チーズやヨーグルトとは異なり、漬け物の発酵においては、一般にスターターは使用されておらず、原料野菜や製造環境に存在する微生物が利用される。例えば、特許文献４には、キムチから分離された乳酸菌をスターターとして添加する漬け物の製造方法が記載されているが、これが漬け物製造に実用的に使用可能であるかどうかは不明である。また、この文献に記載されている乳酸菌がＧＡＢＡ生産能を有するかどうかも知られていない。
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−２１００７５号公報
【特許文献２】特開平３−２３６７６３号公報
【特許文献３】特開２００３−７０４６２号公報
【特許文献４】特開２００１−１２０１７３号公報
【非特許文献１】上野義栄他、京都Ｍ＆Ｔ総合センター情報、１９９９．６ 研究報告
【非特許文献２】日本食品科学工学会誌、４９、４０９−４１５（２００２）
【非特許文献３】大阪生物環境科学研究所レポート「ＧＡＢＡ 高濃度発酵エキス」（２００２）
【非特許文献４】上野義栄他、京都Ｍ＆Ｔ総合センター情報、２００１．６ 研究報告
【非特許文献５】早川 潔他、京都Ｍ＆Ｔ総合センター情報、１９９１．１ 研究報告
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解消するものである。本発明の目的は、ＧＡＢＡ高生産能を有する乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、千枚漬けから得られた新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）が高いＧＡＢＡ生産能を有することを見出した。
【００１４】
上記のように、現在、漬け物の大部分は非発酵的に製造されており、千枚漬けも主に乳酸発酵によらない酢漬法で製造されている。従来のように千枚漬けを発酵法で製造した場合に発酵に関与する微生物に関する知見は少なく、発酵によって千枚漬け中にＧＡＢＡが生産されるかどうかについての報告はない。それゆえ、千枚漬けの発酵過程からＧＡＢＡ高生産能を有する乳酸菌が得られたことは予想外であった。千枚漬けはキムチのように臭いが強くないため、千枚漬けから得られた本発明の乳酸菌は不快な香味を食品に付加しないという利点があると考えられる。また、この乳酸菌は千枚漬けから得られたため、食品製造に使用した場合の安全性に問題はないと考えられる。
【００１５】
さらに、本発明者らは、当該乳酸菌を使用して優れた性質を有する乳酸発酵食品が製造できることを見出し、当該乳酸菌よりＧＡＤをコードする核酸をクローニングしてＧＡＢＡの組換え生産を可能にして、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は：
［１］γ−アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）；
［２］乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法；
［３］発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品の製造方法；
［４］乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、［３］の製造方法；
［５］発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する方法により製造される、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品；
［６］乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、［５］の乳酸発酵食品；
［７］配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチド；
［８］以下からなる群より選択され、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
（１）配列番号６の塩基配列からなる核酸；
（２）配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸；
（３）配列番号６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
［９］［８］の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含する、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドの製造方法；
［１０］［８］の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＧＡＢＡ高生産能を有する新規乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、生物界に広く分布する非タンパク質アミノ酸であり、グルタミン酸からグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）の作用を受けて生合成される。ＧＡＤはビタミンＢ６リン酸エステル化合物の一種であるピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を補酵素とすることが知られている。ＧＡＢＡは、抑制性神経伝達物質として機能する。また、ＧＡＢＡは、血圧降下作用、動脈硬化予防、肝機能改善、腎機能向上、精神安定等の生理機能を有する。その効能の発揮のために好ましい成人１日当たりの摂取量は、例えば１０〜５００ｍｇ、好ましくは２５〜２００ｍｇ、より好ましくは５０〜１００ｍｇである。
【００１９】
本発明は、γ−アミノ酪酸高生産能を有する乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）（以下、Ｌ１３株）を提供する。本発明の乳酸菌は、ＧＡＢＡの製造およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造に使用できる。本明細書において乳酸菌とは、炭水化物を分解して乳酸を生成する細菌をいう。乳酸菌が属する属には特に限定はなく、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属が挙げられる。
【００２０】
本発明の乳酸菌は、従来の発酵法で製造された千枚漬けからＧＡＢＡ高生産能を有する株として単離された。従って、同様に千枚漬けなどの乳酸発酵食品から本明細書の開示に従ってＬ１３株と同様に高いＧＡＢＡ生産能を有する乳酸菌を取得することができる。このような乳酸菌も本発明の乳酸菌に含まれる。
【００２１】
Ｌ１３株は、生化学的な性質に基づけばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌とは異なることが示唆されるが、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の相同性に基づく遺伝学的分類方法によればＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する新種であると結論付けられる。Ｌ１３株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と公知の細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列との同一性は最高で９８％であった。従って、Ｌ１３株と９８％より高い１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の同一性を示す細菌はＬ１３株と同じ種に属すると考えられ、Ｌ１３株と同様に高いＧＡＢＡ生産能を有する可能性が高い。このような細菌も本発明の乳酸菌に含まれる。
【００２２】
本発明は、Ｌ１３株を培養する工程、および培養物からＧＡＢＡを採取する工程を包含するＧＡＢＡの製造方法を提供する。培養条件は、Ｌ１３株が良好に増殖する限り限定されない。培地としては、例えばＧＹＰ培地を使用することができる。培養温度は、例えば１０〜３５℃、好ましくは１５℃〜３０℃である。培養期間は、例えば１〜１０日間、好ましくは２〜５日間である。
【００２３】
ＧＡＢＡはグルタミン酸から生合成されるので、グルタミン酸またはその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）の存在下でＬ１３株を培養することにより、効率的にＧＡＢＡを製造することができる。本発明のＬ１３株は培地中のグルタミン酸濃度を上昇させてもグルタミン酸からＧＡＢＡへの変換率がさほど低下しないという優れた性質を有している。従って、より多くのグルタミン酸を培地に添加することによって、より多くのＧＡＢＡを採取することができる。培地中のグルタミン酸濃度は、例えば１〜２０％、好ましくは５〜１５％である。グルタミン酸からＧＡＢＡへの変換率は、例えば７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは８５〜１００％である。
【００２４】
また、培地のｐＨを酸性に維持することによってＧＡＢＡ生産能をさらに上昇させることができる。培地ｐＨは、例えば３〜７、好ましくは４〜６、より好ましくは約５に維持される。培養中に培地ｐＨを維持する方法は当該分野において公知である。
【００２５】
なお、本発明の方法によれば、ＧＡＢＡの合成に関与するＧＡＤの補酵素として知られているＰＬＰを培地に添加してもいいが、添加は必ずしも必要ではない。
【００２６】
培養物からのＧＡＢＡの採取は常法に従って行われる。例えば、培養物から遠心分離によって菌体を除去して得られた培養上清をそのまままたは濃縮して使用することもできるが、各種クロマトグラフィーなどの公知の精製手段に供することによってさらに純度の高いＧＡＢＡを得ることができる。
【００２７】
ＧＡＢＡおよびグルタミン酸の測定は、例えば１−ブタノール：酢酸：水＝３：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）を展開液として使用した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）やオルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム法での検出により行うことができる。
【００２８】
本発明は、発酵食品の原料をＬ１３株の存在下で発酵させる工程を包含する、ＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法および当該方法によって製造される乳酸発酵食品を提供する。
【００２９】
本明細書において乳酸発酵とは、糖質が乳酸菌の作用を受けて主として乳酸を生成する現象をいう。乳酸発酵にはホモ発酵およびヘテロ発酵の２つの形式が存在する。ホモ発酵では１分子のグルコースから２分子の乳酸が生成される。ヘテロ発酵ではグルコースから乳酸に加えてエタノール、二酸化炭素などが生成される。乳酸の効率的な生成を意図する場合にはホモ発酵が好ましいが、食品の乳酸発酵の場合はヘテロ発酵において生じる副生成物によって食品の香味へ良好な効果がもたらされることも期待され得る。
【００３０】
本明細書において乳酸発酵食品とは、その製造過程に乳酸発酵が含まれる食品をいう。また、本明細書において発酵食品の原料とは、乳酸発酵食品の製造のために乳酸発酵に供される原料をいう。すなわち、本発明の方法によれば、製造過程に乳酸菌が関与する任意の発酵食品を製造することができる。そのような乳酸発酵食品の例としては、食肉加工品（ハム、ソーセージ、ベーコンなど）、魚介類加工品（鰹節、なれ鮨など）、乳加工品（チーズ、バター、ヨーグルト、乳性飲料など）、野菜・果実加工品（漬け物、酒類など）、穀類加工品（パン、酒類など）、豆類加工品（味噌、醤油、納豆、おから加工品など）、海藻（昆布など）加工品が挙げられる。漬け物としては、千枚漬け、しば漬け、たくあん、白菜漬け、きゅうり漬け、すぐき、ぬかみそ漬け、サワークラウト、キムチなどが挙げられる。発酵食品の原料としては、例えば野菜の場合、かぶら、なす、きゅうり、大根、白菜、すぐき菜、キャベツ、トマトなどが挙げられる。
【００３１】
本発明の乳酸発酵食品の製造方法によれば、発酵食品の原料をＬ１３株の存在下で発酵させる。これは、Ｌ１３株をスターターとして発酵食品の原料に添加して行うことができる。すなわち、１つの実施態様において、本発明は、乳酸発酵食品の製造における乳酸菌のスターターとしての使用を提供する。発酵は、それぞれの発酵食品の従来の製造方法に準じて行う。乳酸菌の添加量、発酵温度、発酵期間などは製造しようとする乳酸発酵食品などにより変動し、当業者は産物の性質（例えば、官能評価、安定性）などを考慮してこれらの条件を適切に設定することができる。乳酸菌の添加量を多くし、発酵温度を高く設定することにより、より短期間で発酵させることができる可能性がある。しかし、雑菌汚染を防止するためにはより低い温度で発酵させることが好ましい。例えば、千枚漬けは、下漬けしたかぶらに、本漬けの段階でＬ１３株を１×１０８細胞／ｍｌの濃度で接種し、１０℃で３〜５日静置して製造することができる。
【００３２】
本発明の乳酸発酵食品はＧＡＢＡを含有する。特に限定するものではないが、乳酸発酵食品中のＧＡＢＡの含量は、例えば０．０５〜１％、好ましくは０．１〜０．４％である。ＧＡＢＡを生成させるために、発酵過程にグルタミン酸またはその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）を添加してもよく、あるいは発酵食品のグルタミン酸またはその塩の含量が多い場合（例えば、なす、トマトなど）は添加しなくてもよい。
【００３３】
乳酸発酵は、複数の微生物の組み合わせによって行われる場合がある。本発明の乳酸発酵食品は、本発明の乳酸菌Ｌ１３株を単独で用いて実施してもよく、他の微生物（例えば、別の乳酸菌、酵母、糸状菌など）との組み合わせによって実施してもよい。
【００３４】
本発明はＧＡＤ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該核酸を含む細胞を用いたＧＡＢＡの製造方法を提供する。
【００３５】
例えば、本発明のＧＡＤ活性を有するポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなる。配列番号７のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、ＧＡＤ活性を有するのであれば本発明のポリペプチドに含まれる。公知のＧＡＤのアミノ酸配列と配列番号７のアミノ酸配列との同一性は最高で７９．８％であった。従って、配列番号７のアミノ酸配列と例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドは本発明のポリペプチドに含まれる。このようなポリペプチドは、グルタミン酸のＧＡＢＡへの変換に使用することができる。
【００３６】
例えば、本発明のＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号６の塩基配列からなる。配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であっても、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードするのであれば本発明の核酸に含まれる。配列番号６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であっても、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードするのであれば本発明の核酸に含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌポリ（Ａ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび標識プローブを含む溶液中６８℃でのインキュベーションが挙げられる（J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 6.50-6.64 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００３７】
上記のような核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からＧＡＤ活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含する方法によってＧＡＤ活性を有するポリペプチドを製造することができる。また、上記のような核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からＧＡＢＡを採取する工程を包含する方法によってＧＡＢＡを製造することができる。本発明の核酸を含む細胞は、本発明の核酸を、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに天然において隣接する制御配列（プロモーターなど）とともに宿主として利用可能な細胞に導入して得ることができる。あるいは、本発明の核酸を、使用する宿主において機能する適切な制御配列（プロモーター）に作動可能に連結して、宿主細胞に導入してもよい。宿主細胞としては、組換えＤＮＡ技術の宿主として利用可能な任意の細胞が使用される。宿主細胞の例としては、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などの細菌が挙げられる。導入に使用されるベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクターなど任意のベクターを使用することができる。培養は、使用する宿主に適切な条件で行われる。発現が誘導性である場合は、適切な誘導物質を培養中に添加してもよい。ＧＡＢＡを製造する場合は、Ｌ１３株の場合と同様に、グルタミン酸またはその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）の存在下で上記細胞を培養してＧＡＢＡを製造することができる。培養物からのＧＡＢＡの採取はＬ１３株の場合と同様に行われる。
【００３８】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドがＧＡＤ活性を有するかどうかは、当該核酸を上記のようにして宿主中で発現させ、得られた培養物にグルタミン酸をＧＡＢＡに変換する活性が存在するかどうかを調べることによって確認することができる。
【００３９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
γ−アミノ酪酸生産菌の分離
伝統的な発酵法によって製造された千枚漬けの漬け液及びかぶらの磨砕物からγ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）生産菌を分離した。詳細には、かぶらスライス７０ｋｇに塩化ナトリウム５．０ｋｇおよび食品用脱色増強剤Ｌｏｖｉｎｇ（（株）今井嘉兵衛商店）３００ｇを添加し、５℃で１週間放置して発酵させ（下漬け）、次いで、調味液、ショ糖、グルタミン酸ナトリウム、昆布、食酢からなる漬け液中で５℃で一晩放置した（本漬け）。得られた漬け液、及び、かぶらの磨砕物を試料とし、５％グルタミン酸ナトリウムを含むＧＹＰ（１％グルコース、１％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．２％酢酸ナトリウム・３水和物、２０ｐｐｍ硫酸マグネシウム・７水和物、１ｐｐｍ硫酸マンガン・４水和物、１ｐｐｍ硫酸鉄・７水和物、１０ｐｐｍ塩化ナトリウム、５０ｐｐｍ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ ６．８）寒天培地に塗布し、３０℃、５日間の培養後、単一コロニーを得た。次にそれぞれのコロニーをＧＹＰ液体培地に植菌し、３０℃、２日間静置培養を行った。
【００４１】
ＧＡＢＡの生産は、培養上清を試料とし、薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣ）によって確認した。薄層としてはシリカゲル６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用し、展開には１−ブタノール：酢酸：水＝３：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。また、検出にはニンヒドリンを用いた。ＴＬＣの結果の一例を図１に示す。図中、レーン１はＧＡＢＡおよびグルタミン酸ナトリウム（以下、ＧｌｕＮａ）の標準品を使用したＴＬＣの結果を示す。レーン３ではＧｌｕＮａのスポットしか観察されないのに対し、レーン２ではＧＡＢＡのスポットが観察される。このことから、レーン２の試料にはＧＡＢＡが含まれていることがわかる。以上の操作により、Ｌ１３株を取得した。
【実施例２】
【００４２】
分離株Ｌ１３株の分類学的位置の検討
まず、Ｌ１３株の分類学的位置について検討を加えた。分析はテクノスルガ社に依頼した。Ｌ１３株の生化学的な性質を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
本菌株はグラム陽性桿菌で、芽胞を形成せず、運動性を示さなかった。カタラーゼ反応、及び、オキシダーゼ反応は共に陰性を示した。これらの性質は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の一般性状と一致するが、グルコースを酸化、発酵しない点が異なった。
【００４５】
次に、遺伝学的分類方法を用いて検討を加えた。すなわち、Ｌ１３株のゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＣＲ法によって１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅し、ＤＮＡ塩基配列を決定した。ＰＣＲ法に使用したプライマー８−２７ ｆｗｄおよび１４９２ ｒｅｖの配列を配列番号１および２に、決定した１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。
【００４６】
１６Ｓ ｒＤＮＡのＤＮＡ塩基配列をＤＤＢＪ（DNA data bank of Japan）データベースに対して検索した結果、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｍｅｓｉｉ（Valcheva,R., Korakli,M., Onno,B., Prevost,H., Ivanova,I., Ehrmann,M.A., Dousset,X., Ganzle,M.G. and Vogel,R.F., Lactobacillus hammesii sp. nov., isolated from French sourdough Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 763-767 (2005)）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ（Vancanneyt,M., Naser,S.M., Engelbeen,K., De Wachter,M., Van der Meulen,R., Cleenwerck,I., Hoste,B., De Vuyst,L. and Swings,J. Reclassification of Lactobacillus brevis strains LMG 11494 and LMG 11984 as Lactobacillus parabrevis sp. nov Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 1553-1557 (2006)）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と９８％の同一性を示した。これらの配列データに基づいて分子系統樹を作成した結果、Ｌ１３株は上記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｍｅｓｉｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓとは別の分枝を示した。これらの結果から、Ｌ１３株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する新しい種の細菌であることが示唆された。
【００４７】
上記生化学的性質および遺伝学的性質に基づき、分離株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３と命名した。この株は、平成１８年８月２日より、〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２５３のもとで寄託されている。
【実施例３】
【００４８】
Ｌ１３株のＧＡＢＡ生産
Ｌ１３株のＧＡＢＡ生産性をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株と比較した。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株は、ＧＡＢＡを生産することが知られており、本発明者らはこの乳酸菌株をＧＡＢＡ生産性乳酸菌の基準株として使用している。Ｌ１３株またはＬ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株を種々の濃度のＧｌｕＮａを含むＧＹＰ培地に植菌し、３０℃で培養し、ＧＡＢＡ含量を経時的に測定した。
【００４９】
グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびＧＡＢＡを以下のように定量した。オルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム法によって検出した。使用したシステムは、強酸性イオン交換樹脂カラムＳｈｉｍ−ｐａｃｋ Ａｍｉｎｏ−Ｎａを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所）であった。蛍光検出器を使用して検出し（Ｅｘ ３４８ｎｍ、Ｅｍ ４５０ｎｍ）、標準液としてアミノ酸標準液（Ｈ型、和光純薬）を使用した。
【００５０】
結果を図２に示す。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株が、培地中の初発グルタミン酸ナトリウム濃度によらず、最大約１％のＧＡＢＡを生産するのに対し（図２Ａ）、Ｌ１３株は培地中の初発ＧｌｕＮａ濃度に応じてＧＡＢＡを生産し、初発ＧｌｕＮａ濃度１５％の場合で最大５．７％のＧＡＢＡを生産可能であった。
【００５１】
以上２菌株のＧＡＢＡ変換率をまとめると、表２のようになる。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ １２００５株は、初発のＧｌｕＮａ濃度が高くなるとＧＡＢＡ変換率は大幅に低下したが、Ｌ１３株のＧＡＢＡ変換率は初発ＧｌｕＮａ濃度に大きくは影響されず、約８５％の変換率が得られた。
【００５２】
【表２】
【００５３】
なお、ＧＡＢＡ生産性の高い乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉが報告されている（Noriko Komatsuzaki, Jun Shimaa, Shinichi Kawamoto, Hiroh Momose, Toshinori Kimura, Production of g-aminobutylic acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods, Food Microbiology 22, 497504(2005)）。本菌は最大３．１％のＧＡＢＡ生産能を有していると報告されている（初発グルタミン酸濃度：７．４％、変換率：６０．４％）。この菌株とＬ１３株のＧＡＢＡ生産能を比較すると、Ｌ１３株はＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉの約２倍のＧＡＢＡを生産可能であることが明らかとなった。このように、Ｌ１３株は、公知のＧＡＢＡ高生産乳酸菌に比較して非常に高いＧＡＢＡ生産性を示す。
【００５４】
微生物がＧＡＢＡを生成することの生理学的意義の一つは、培地酸性化に対する防御であると考えられる。この点に着目し、培養中の培地ｐＨを酸性（ｐＨ ５）に維持することの、Ｌ１３株によるＧＡＢＡ生産性に対する効果を検討した。その結果を図３に示す。図３中、ＡはＬ１３株を初発グルタミン酸濃度１２％（実際に使用したグルタミン酸ナトリウム・一水和物濃度をグルタミン酸濃度に換算）とした以外、上記と同様にｐＨ無調製で培養した場合のＧＡＢＡおよびＧｌｕＮａの含量を経時的に測定した結果を、Ｂは培地ｐＨを５に維持して培養した場合の結果を示す。図３に示すように、初発濃度１２％のグルタミン酸から約６．７％のＧＡＢＡを生産することに成功した。変換率は約８５％であった。
【００５５】
なお、この際、培地中のＧｌｕＮａは５日間の培養後、完全に消失した。また、ＧＡＢＡ生産の際、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）の補酵素であるピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を培地に添加する必要がなかったことは、ＧＡＢＡ生産上のメリットの一つといえる。
【実施例４】
【００５６】
Ｌ１３株を用いた発酵法による千枚漬け製造
Ｌ１３株をスターターとして用い、千枚漬けを発酵法で作製すると共に、その製品にＧＡＢＡも同時に生産することを試みた。その検討は、６Ｌの小スケールで実施した。即ち、かぶらを０．２％酢酸溶液に漬けて洗浄したのち、実施例１と同様に塩化ナトリウムおよび食品用脱色増強剤Ｌｏｖｉｎｇを添加して４℃で一晩下漬けした。本漬けは、初発菌体濃度（漬け液）が１×１０８細胞／ｍｌとなるように調製して、１０℃で６日間静置した（２連で行なった）。コントロールとして、Ｌ１３を接種しない系列も作製した。本漬け開始後、１日ごとに６日までサンプリングし、官能試験の他、グルタミン酸とＧＡＢＡの定量を行なった。
【００５７】
試料は以下のように調製した。千枚漬け１０ｇに精製水４０ｍｌを加え、ホモジナイズ（エースホモジナイザー（日本精機）、１０，０００ｒｐｍ、５分間）し、５分間煮沸後の遠心上清を希釈バッファー（クエン酸３ナトリウム緩衝液、ｐＨ ２．２）で適宜希釈した。調製した試料を用いて実施例３に記載の方法によりＧＡＢＡを定量した。
【００５８】
結果を図４に示す。図４に示すように、３日後に０．１％程度のＧＡＢＡが生産された。更に５〜６日後では最大０．４％程度のＧＡＢＡが生産された。４日以降では雑菌の増殖が観察された。
【００５９】
官能試験は４名のパネリストにより実施し、臭いおよび味覚について３段階の評価（○、△、×）およびコメントを得た。結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３に示すように、官能試験では、３日後の製品まではフルーツのようなフレッシュな香りがあり、味覚も、甘みはあるが後味の引かないすっきりとした味であるなど、独特の優れた性質を有していることが判明した。
【００６２】
尚、ＧＡＢＡは成人１日あたり５０ｍｇ摂取すると、その効能を享受できるとされている。千枚漬け１枚は約３０ｇであり、例えば上記条件で３日後に得られる千枚漬けであれば約０．１％のＧＡＢＡを含有するので一日あたり２枚程度を食すればよい計算となる。
【実施例５】
【００６３】
５−１．グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）遺伝子のクローニング
既報のＧＡＤ遺伝子を参考にしてＰＣＲ用プライマーを作成し、定法に従ってＰＣＲ法によってＧＡＤ遺伝子（ｇａｄＢ遺伝子）を取得した。ＰＣＲ法に使用したプライマーＬ１３ ＧＡＤ ｆｗｄおよびＬ１３ ＧＡＤ ｒｅｖの配列を配列番号４および５に、決定したｇａｄＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６に示す。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３株のｇａｄＢ遺伝子の塩基配列には、１４１０ ｂｐのオープンリーディングフレームが存在した。このオープンリーディングフレームから推察されるアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００６４】
５−２．Ｌ１３株由来ＧＡＤと既報ＧＡＤとの比較
Ｌ１３株由来のｇａｄＢ遺伝子から推察されたアミノ酸配列（Ｌ１３ｇａｄＢ）を用いて、ＤＤＢＪのデータベースに対してＦＡＳＴＡプログラム等により相同性検索を行った。結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】
参考文献等
* Unpublished data (our data); accession number: AB258458
1) Nomura M., Nakajima I., Fujita Y., Kobayashi M., Kimoto H., Suzuki I., Aso H.; Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene. Microbiology, 145:1375-1380(1999).
2) Bolotin A., Wincker P., Mauger S., Jaillon O., Malarme K., Weissenbach J., Ehrlich S.D., Sorokin A., The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403., Genome Res. 11:731-753(2001).
3) Sanders J.W., Leenhouts K., Burghoorn J., Brands J.R., Venema G., Kok J.; A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol. Microbiol. 27:299-310(1998).
4) Nomura, M., Kobayashi, M., Ohmomo, S., and Okamoto, T., Inactivation of the Glutamate Decarboxylase Gene in Lactococcus lactis subsp. cremoris, Appl. Envir. Microbiol. 66: 2235-2237(2000).
5) Park KB, Oh SH., Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3. Bioresour Technol. Feb 22, (2006) [Epub ahead of print] 6) Kleerebezem M, Boekhorst J, van Kranenburg R, Molenaar D, Kuipers OP, Leer R, Tarchini R, Peters SA, Sandbrink HM, Fiers MW, Stiekema W, Lankhorst RM, Bron PA, Hoffer SM, Groot MN, Kerkhoven R, de Vries M, Ursing B, de Vos WM, Siezen RJ., Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100(4):1990-1995 (2003).
7) Blattner FR, Plunkett G 3rd, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y., The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, Science, 277(5331):1453-1474 (1997).
【００６７】
表４に示すように、Ｌ１３ｇａｄＢの推定アミノ酸配列は、ＵｅｎｏｇａｄＢ（Lactobacillus brevis IFO12005）のものと特に相同性が高く、７９．８％の同一性を示した。上記のように、本発明者らはこの乳酸菌株をＧＡＢＡ生産性乳酸菌の基準株として使用している。他の微生物由来のＧＡＤの中では、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｌａｃ（Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403）や、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｃｒｅ（Lactococcus lactis subsp.cremoris）のアミノ酸配列とそれぞれ５２．７％、５２．２％の同一性を示した。
【００６８】
さらに、これらの配列について、ＢｉｏＥｄｉｔ ７．０．１ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １．８３と称する解析ソフトを用いて多重アライメントを作成した。結果を図５−１〜５−４に示す。この場合でも、Ｌ１３ｇａｄＢおよびＵｅｎｏｇａｄＢは、これら以外のＧＡＤタンパク質とは明らかに異なるグループを形成した。
【００６９】
これらのＧＡＤと他のＧＡＤのアミノ酸配列との相違点は、以下のとおりである：
（１）Ｌ１３ｇａｄＢの１９−２１残基（−ＥＫＴ−）、１２０−１２４残基（−ＫＦＧＤ−）、１６１−１６３残基（−ＤＬＨ−）に相当する部分が、上記２者以外では欠失している（図５−１、図５−２）；
（２）Ｌ１３ｇａｄＢのバリン１７８残基が、上記２者以外ではシステインである（図５−２）；
（３）上記２者のシステイン残基は５個であるのに対し、これら以外は６個である（ただし、大腸菌ＧＡＤ（Ｅｃｏｌｉ ｇａｄＢ、Ｅｃｏｌｉ ｇａｄＡ）のシステインは例外的に１０個である）（図５−１〜図５−４）。システイン２つの間でジスルフィド結合が形成され、タンパク質の立体構造の形成に重要な役割をする。システインの個数が異なることは、これらのグループ間で立体構造が異なる可能性を示唆する。
【００７０】
一方、アライメントの共通点は、活性に必須とされ、基質結合に重要と考えられるアスパラギン酸残基（Ｄ９１、図５−１）や、補酵素であるピリドキサールリン酸が結合するリシン残基（Ｋ２８９、図５−３）等が高度に保存されている点である。
【００７１】
以上の結果から、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３株のｇａｄＢ遺伝子は、公知のＧＡＤと同様に活性なグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）をコードすることが示唆された。また、Ｌ１３ ＧＡＤの多重アラインメント解析より、既報のＧＡＤとは多くの相違点のあることも確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、ＧＡＢＡ高生産能を有する新規乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】薄層クロマトグラフィーの結果の一例を示す図である。
【図２】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３株およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株のＧＡＢＡ生産量を示す図である。
【図３】培養中の培地ｐＨを酸性に維持することのＧＡＢＡ生産性に対する効果を示す図である。
【図４】千枚漬け発酵中のＧＡＢＡ生産量を示す図である。
【図５−１】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【図５−２】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【図５−３】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【図５−４】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
SEQ ID NO:1: A primer 8-27 fwd for amplification of 16S rDNA
SEQ ID NO:2: A primer 1492 rev for amplification of 16S rDNA
SEQ ID NO:4: A primer L13 GAD fwd for amplification of L13 gadB gene
SEQ ID NO:5: A primer L13 GAD rev for amplification of L13 gadB gene
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）高生産能を有する新規乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるグルタミン酸脱炭酸酵素（以下、ＧＡＤ）およびそれをコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、生物界に広く分布する非タンパク質アミノ酸であり、生体内では抑制性の神経伝達物質として機能していることが知られている（非特許文献１）。また、ＧＡＢＡは、いろいろな生理機能を有することが知られてきており、血圧降下作用（非特許文献２）を始め、動脈硬化予防、肝機能改善、腎機能向上、精神安定等の作用が報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
このようなＧＡＢＡの機能を利用するために、まずＧＡＢＡを含有する食品素材を摂取することが考えられた。ＧＡＢＡは、玄米、紅麹、茶、一部の野菜や果実等の食品に含まれているが、これらはＧＡＢＡを微量しか含まず（非特許文献３）、元来の生理機能を発現するのに有効な量のＧＡＢＡを含有する食品ではなかった。そこで、食品中のＧＡＢＡ含量を増加する方法が種々検討された。現在までに提案されている上記目的に対応する方法は大きく２種類に分けられる。一方は、ＧＡＢＡまたはエキス化したＧＡＢＡを食品に添加する方法であり、他方は、乳酸菌などの微生物を用いて当該食品を発酵させるか、もしくは当該食品においてグルタミン酸に酵素を作用させてＧＡＢＡを生産する方法である。
【０００４】
前者の方法において添加するＧＡＢＡを生産する方法としては、γ−ハロゲン酪酸のアミノ化やピロリドンの加水分解による化学合成方法以外に、天然素材の培地で選抜または育種した高濃度にＧＡＢＡを生産する乳酸菌を用いて発酵させる方法（非特許文献３、非特許文献５、特許文献１）、およびグルタミン酸またはこれを含む原料に酵素（グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ））を反応させ、高濃度にＧＡＢＡを生産する方法が提案された。これらの方法では、既存の食品に後からＧＡＢＡを添加するため、化学物質の添加物を加えるというイメージの悪さがあり、また食品の工業的製造工程が増えるという問題があった。さらに、ＧＡＢＡを発酵により製造する場合は、培養物由来の不純物としての香味原因物質が添加の際に食品に移行して食品本来の香味を損なう可能性があり、さらには微生物汚染が発生するなどの懸念が生じた。従って、食品製造における製造面および品質面での不自然さを生じることとなった。
【０００５】
一方、後者の方法（特許文献２）では、乳酸菌による発酵を利用する場合、食品によっては必ずしも乳酸菌による発酵が生じるとは限らず、また発酵しても乳酸菌がＧＡＢＡを生産するとは限らないなどの問題があった。また、場合によっては乳酸菌による発酵により当該食品の香味が損なわれる可能性もあり、その食品における乳酸菌による発酵の条件を満たす乳酸菌株は非常に限定されてしまうという制約があった。
【０００６】
これまでにＧＡＢＡ生産能の高い乳酸菌として、キムチなどの漬け物から単離され育種された株についての報告がある（特許文献３）。このような乳酸菌を上記のような添加用ＧＡＢＡの製造またはＧＡＢＡ含有食品の製造に使用できる可能性があるが、いずれの場合でも、本来臭いの強いキムチなどの漬け物から得られた菌株を使用した場合、漬け物臭やダイアセチル臭のような不快な香味を食品に付加する可能性がある。
【０００７】
乳酸菌の発酵により得られる代表的な食品であるヨーグルトと長寿との関連についてのいわゆるメチニコフの不老不死説以来、乳酸菌や乳酸発酵食品がヒトの健康に良い影響を与えると考えられ、疫学的研究やヒトを含めた動物実験が行われている。現在までに乳酸菌摂取による腸管菌叢の安定、血中コレステロールの低下および発癌の抑制などの効果が確認されている。また、食品製造の立場からは、乳酸菌による食中毒菌の抑制などの安全性の向上、塩慣れ効果や発酵および発酵産物による風味の向上が認められている。
【０００８】
漬け物は世界各地で古来より野菜を原料として生産されている食品である。従来、日本において漬け物は発酵法により製造されており、その発酵過程に乳酸菌などの微生物が関与していたと考えられる。すなわち、従来の漬け物には乳酸発酵食品に含まれるものがあった。従って、ＧＡＢＡを生産する乳酸菌による発酵を利用してこのような漬け物を製造することができれば、ＧＡＢＡを含有する機能的発酵食品としての漬け物を得ることができる可能性がある。
【０００９】
しかし、現在、伝統的な発酵法による日本の漬け物製造は、漬け物全体の０．１％程度であるといわれており、ほとんどの漬け物は、非発酵的に製造される。非発酵法のメリットとしては、食品衛生問題の低減、製造期間短縮、品質の均一化が挙げられる。京漬け物の一種である千枚漬けの製造を例に挙げれば、原料野菜であるかぶらに食塩を添加して放置する下漬けの期間が、現在の主流となっている簡易製造法は１晩であるのに対し、伝統法では１週間もの期間を要している。このような理由から、非発酵法の方が効率的な漬け物の工業生産により適しているとされている。
【００１０】
一方、工業的漬け物製造において乳酸発酵が利用されない別の理由として、漬け物に適したスターターがないことで挙げられる。すなわち、植物成分を利用して生育し、食品の香味に悪影響を及ぼさない乳酸菌が得られれば、これをスターターとして原料野菜に添加して安定に漬け物を製造できる可能性がある。また、このような乳酸菌がＧＡＢＡを高生産する能力を有していれば、ＧＡＢＡを含有する発酵食品を効率的かつ安定に得ることができる。チーズやヨーグルトとは異なり、漬け物の発酵においては、一般にスターターは使用されておらず、原料野菜や製造環境に存在する微生物が利用される。例えば、特許文献４には、キムチから分離された乳酸菌をスターターとして添加する漬け物の製造方法が記載されているが、これが漬け物製造に実用的に使用可能であるかどうかは不明である。また、この文献に記載されている乳酸菌がＧＡＢＡ生産能を有するかどうかも知られていない。
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−２１００７５号公報
【特許文献２】特開平３−２３６７６３号公報
【特許文献３】特開２００３−７０４６２号公報
【特許文献４】特開２００１−１２０１７３号公報
【非特許文献１】上野義栄他、京都Ｍ＆Ｔ総合センター情報、１９９９．６ 研究報告
【非特許文献２】日本食品科学工学会誌、４９、４０９−４１５（２００２）
【非特許文献３】大阪生物環境科学研究所レポート「ＧＡＢＡ 高濃度発酵エキス」（２００２）
【非特許文献４】上野義栄他、京都Ｍ＆Ｔ総合センター情報、２００１．６ 研究報告
【非特許文献５】早川 潔他、京都Ｍ＆Ｔ総合センター情報、１９９１．１ 研究報告
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解消するものである。本発明の目的は、ＧＡＢＡ高生産能を有する乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、千枚漬けから得られた新規乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）が高いＧＡＢＡ生産能を有することを見出した。
【００１４】
上記のように、現在、漬け物の大部分は非発酵的に製造されており、千枚漬けも主に乳酸発酵によらない酢漬法で製造されている。従来のように千枚漬けを発酵法で製造した場合に発酵に関与する微生物に関する知見は少なく、発酵によって千枚漬け中にＧＡＢＡが生産されるかどうかについての報告はない。それゆえ、千枚漬けの発酵過程からＧＡＢＡ高生産能を有する乳酸菌が得られたことは予想外であった。千枚漬けはキムチのように臭いが強くないため、千枚漬けから得られた本発明の乳酸菌は不快な香味を食品に付加しないという利点があると考えられる。また、この乳酸菌は千枚漬けから得られたため、食品製造に使用した場合の安全性に問題はないと考えられる。
【００１５】
さらに、本発明者らは、当該乳酸菌を使用して優れた性質を有する乳酸発酵食品が製造できることを見出し、当該乳酸菌よりＧＡＤをコードする核酸をクローニングしてＧＡＢＡの組換え生産を可能にして、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明は：
［１］γ−アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）；
［２］乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法；
［３］発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品の製造方法；
［４］乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、［３］の製造方法；
［５］発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する方法により製造される、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品；
［６］乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、［５］の乳酸発酵食品；
［７］配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチド；
［８］以下からなる群より選択され、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
（１）配列番号６の塩基配列からなる核酸；
（２）配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸；
（３）配列番号６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
［９］［８］の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含する、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドの製造方法；
［１０］［８］の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＧＡＢＡ高生産能を有する新規乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、生物界に広く分布する非タンパク質アミノ酸であり、グルタミン酸からグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）の作用を受けて生合成される。ＧＡＤはビタミンＢ６リン酸エステル化合物の一種であるピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を補酵素とすることが知られている。ＧＡＢＡは、抑制性神経伝達物質として機能する。また、ＧＡＢＡは、血圧降下作用、動脈硬化予防、肝機能改善、腎機能向上、精神安定等の生理機能を有する。その効能の発揮のために好ましい成人１日当たりの摂取量は、例えば１０〜５００ｍｇ、好ましくは２５〜２００ｍｇ、より好ましくは５０〜１００ｍｇである。
【００１９】
本発明は、γ−アミノ酪酸高生産能を有する乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）（以下、Ｌ１３株）を提供する。本発明の乳酸菌は、ＧＡＢＡの製造およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造に使用できる。本明細書において乳酸菌とは、炭水化物を分解して乳酸を生成する細菌をいう。乳酸菌が属する属には特に限定はなく、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属が挙げられる。
【００２０】
本発明の乳酸菌は、従来の発酵法で製造された千枚漬けからＧＡＢＡ高生産能を有する株として単離された。従って、同様に千枚漬けなどの乳酸発酵食品から本明細書の開示に従ってＬ１３株と同様に高いＧＡＢＡ生産能を有する乳酸菌を取得することができる。このような乳酸菌も本発明の乳酸菌に含まれる。
【００２１】
Ｌ１３株は、生化学的な性質に基づけばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌とは異なることが示唆されるが、１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の相同性に基づく遺伝学的分類方法によればＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する新種であると結論付けられる。Ｌ１３株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列と公知の細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列との同一性は最高で９８％であった。従って、Ｌ１３株と９８％より高い１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の同一性を示す細菌はＬ１３株と同じ種に属すると考えられ、Ｌ１３株と同様に高いＧＡＢＡ生産能を有する可能性が高い。このような細菌も本発明の乳酸菌に含まれる。
【００２２】
本発明は、Ｌ１３株を培養する工程、および培養物からＧＡＢＡを採取する工程を包含するＧＡＢＡの製造方法を提供する。培養条件は、Ｌ１３株が良好に増殖する限り限定されない。培地としては、例えばＧＹＰ培地を使用することができる。培養温度は、例えば１０〜３５℃、好ましくは１５℃〜３０℃である。培養期間は、例えば１〜１０日間、好ましくは２〜５日間である。
【００２３】
ＧＡＢＡはグルタミン酸から生合成されるので、グルタミン酸またはその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）の存在下でＬ１３株を培養することにより、効率的にＧＡＢＡを製造することができる。本発明のＬ１３株は培地中のグルタミン酸濃度を上昇させてもグルタミン酸からＧＡＢＡへの変換率がさほど低下しないという優れた性質を有している。従って、より多くのグルタミン酸を培地に添加することによって、より多くのＧＡＢＡを採取することができる。培地中のグルタミン酸濃度は、例えば１〜２０％、好ましくは５〜１５％である。グルタミン酸からＧＡＢＡへの変換率は、例えば７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは８５〜１００％である。
【００２４】
また、培地のｐＨを酸性に維持することによってＧＡＢＡ生産能をさらに上昇させることができる。培地ｐＨは、例えば３〜７、好ましくは４〜６、より好ましくは約５に維持される。培養中に培地ｐＨを維持する方法は当該分野において公知である。
【００２５】
なお、本発明の方法によれば、ＧＡＢＡの合成に関与するＧＡＤの補酵素として知られているＰＬＰを培地に添加してもいいが、添加は必ずしも必要ではない。
【００２６】
培養物からのＧＡＢＡの採取は常法に従って行われる。例えば、培養物から遠心分離によって菌体を除去して得られた培養上清をそのまままたは濃縮して使用することもできるが、各種クロマトグラフィーなどの公知の精製手段に供することによってさらに純度の高いＧＡＢＡを得ることができる。
【００２７】
ＧＡＢＡおよびグルタミン酸の測定は、例えば１−ブタノール：酢酸：水＝３：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）を展開液として使用した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）やオルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム法での検出により行うことができる。
【００２８】
本発明は、発酵食品の原料をＬ１３株の存在下で発酵させる工程を包含する、ＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法および当該方法によって製造される乳酸発酵食品を提供する。
【００２９】
本明細書において乳酸発酵とは、糖質が乳酸菌の作用を受けて主として乳酸を生成する現象をいう。乳酸発酵にはホモ発酵およびヘテロ発酵の２つの形式が存在する。ホモ発酵では１分子のグルコースから２分子の乳酸が生成される。ヘテロ発酵ではグルコースから乳酸に加えてエタノール、二酸化炭素などが生成される。乳酸の効率的な生成を意図する場合にはホモ発酵が好ましいが、食品の乳酸発酵の場合はヘテロ発酵において生じる副生成物によって食品の香味へ良好な効果がもたらされることも期待され得る。
【００３０】
本明細書において乳酸発酵食品とは、その製造過程に乳酸発酵が含まれる食品をいう。また、本明細書において発酵食品の原料とは、乳酸発酵食品の製造のために乳酸発酵に供される原料をいう。すなわち、本発明の方法によれば、製造過程に乳酸菌が関与する任意の発酵食品を製造することができる。そのような乳酸発酵食品の例としては、食肉加工品（ハム、ソーセージ、ベーコンなど）、魚介類加工品（鰹節、なれ鮨など）、乳加工品（チーズ、バター、ヨーグルト、乳性飲料など）、野菜・果実加工品（漬け物、酒類など）、穀類加工品（パン、酒類など）、豆類加工品（味噌、醤油、納豆、おから加工品など）、海藻（昆布など）加工品が挙げられる。漬け物としては、千枚漬け、しば漬け、たくあん、白菜漬け、きゅうり漬け、すぐき、ぬかみそ漬け、サワークラウト、キムチなどが挙げられる。発酵食品の原料としては、例えば野菜の場合、かぶら、なす、きゅうり、大根、白菜、すぐき菜、キャベツ、トマトなどが挙げられる。
【００３１】
本発明の乳酸発酵食品の製造方法によれば、発酵食品の原料をＬ１３株の存在下で発酵させる。これは、Ｌ１３株をスターターとして発酵食品の原料に添加して行うことができる。すなわち、１つの実施態様において、本発明は、乳酸発酵食品の製造における乳酸菌のスターターとしての使用を提供する。発酵は、それぞれの発酵食品の従来の製造方法に準じて行う。乳酸菌の添加量、発酵温度、発酵期間などは製造しようとする乳酸発酵食品などにより変動し、当業者は産物の性質（例えば、官能評価、安定性）などを考慮してこれらの条件を適切に設定することができる。乳酸菌の添加量を多くし、発酵温度を高く設定することにより、より短期間で発酵させることができる可能性がある。しかし、雑菌汚染を防止するためにはより低い温度で発酵させることが好ましい。例えば、千枚漬けは、下漬けしたかぶらに、本漬けの段階でＬ１３株を１×１０８細胞／ｍｌの濃度で接種し、１０℃で３〜５日静置して製造することができる。
【００３２】
本発明の乳酸発酵食品はＧＡＢＡを含有する。特に限定するものではないが、乳酸発酵食品中のＧＡＢＡの含量は、例えば０．０５〜１％、好ましくは０．１〜０．４％である。ＧＡＢＡを生成させるために、発酵過程にグルタミン酸またはその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）を添加してもよく、あるいは発酵食品のグルタミン酸またはその塩の含量が多い場合（例えば、なす、トマトなど）は添加しなくてもよい。
【００３３】
乳酸発酵は、複数の微生物の組み合わせによって行われる場合がある。本発明の乳酸発酵食品は、本発明の乳酸菌Ｌ１３株を単独で用いて実施してもよく、他の微生物（例えば、別の乳酸菌、酵母、糸状菌など）との組み合わせによって実施してもよい。
【００３４】
本発明はＧＡＤ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該核酸を含む細胞を用いたＧＡＢＡの製造方法を提供する。
【００３５】
例えば、本発明のＧＡＤ活性を有するポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなる。配列番号７のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、ＧＡＤ活性を有するのであれば本発明のポリペプチドに含まれる。公知のＧＡＤのアミノ酸配列と配列番号７のアミノ酸配列との同一性は最高で７９．８％であった。従って、配列番号７のアミノ酸配列と例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドは本発明のポリペプチドに含まれる。このようなポリペプチドは、グルタミン酸のＧＡＢＡへの変換に使用することができる。
【００３６】
例えば、本発明のＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号６の塩基配列からなる。配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であっても、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードするのであれば本発明の核酸に含まれる。配列番号６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であっても、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードするのであれば本発明の核酸に含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌポリ（Ａ）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび標識プローブを含む溶液中６８℃でのインキュベーションが挙げられる（J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 6.50-6.64 (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００３７】
上記のような核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からＧＡＤ活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含する方法によってＧＡＤ活性を有するポリペプチドを製造することができる。また、上記のような核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からＧＡＢＡを採取する工程を包含する方法によってＧＡＢＡを製造することができる。本発明の核酸を含む細胞は、本発明の核酸を、ＧＡＤ活性を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに天然において隣接する制御配列（プロモーターなど）とともに宿主として利用可能な細胞に導入して得ることができる。あるいは、本発明の核酸を、使用する宿主において機能する適切な制御配列（プロモーター）に作動可能に連結して、宿主細胞に導入してもよい。宿主細胞としては、組換えＤＮＡ技術の宿主として利用可能な任意の細胞が使用される。宿主細胞の例としては、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などの細菌が挙げられる。導入に使用されるベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクターなど任意のベクターを使用することができる。培養は、使用する宿主に適切な条件で行われる。発現が誘導性である場合は、適切な誘導物質を培養中に添加してもよい。ＧＡＢＡを製造する場合は、Ｌ１３株の場合と同様に、グルタミン酸またはその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）の存在下で上記細胞を培養してＧＡＢＡを製造することができる。培養物からのＧＡＢＡの採取はＬ１３株の場合と同様に行われる。
【００３８】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドがＧＡＤ活性を有するかどうかは、当該核酸を上記のようにして宿主中で発現させ、得られた培養物にグルタミン酸をＧＡＢＡに変換する活性が存在するかどうかを調べることによって確認することができる。
【００３９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
γ−アミノ酪酸生産菌の分離
伝統的な発酵法によって製造された千枚漬けの漬け液及びかぶらの磨砕物からγ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）生産菌を分離した。詳細には、かぶらスライス７０ｋｇに塩化ナトリウム５．０ｋｇおよび食品用脱色増強剤Ｌｏｖｉｎｇ（（株）今井嘉兵衛商店）３００ｇを添加し、５℃で１週間放置して発酵させ（下漬け）、次いで、調味液、ショ糖、グルタミン酸ナトリウム、昆布、食酢からなる漬け液中で５℃で一晩放置した（本漬け）。得られた漬け液、及び、かぶらの磨砕物を試料とし、５％グルタミン酸ナトリウムを含むＧＹＰ（１％グルコース、１％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．２％酢酸ナトリウム・３水和物、２０ｐｐｍ硫酸マグネシウム・７水和物、１ｐｐｍ硫酸マンガン・４水和物、１ｐｐｍ硫酸鉄・７水和物、１０ｐｐｍ塩化ナトリウム、５０ｐｐｍ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ ６．８）寒天培地に塗布し、３０℃、５日間の培養後、単一コロニーを得た。次にそれぞれのコロニーをＧＹＰ液体培地に植菌し、３０℃、２日間静置培養を行った。
【００４１】
ＧＡＢＡの生産は、培養上清を試料とし、薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣ）によって確認した。薄層としてはシリカゲル６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用し、展開には１−ブタノール：酢酸：水＝３：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。また、検出にはニンヒドリンを用いた。ＴＬＣの結果の一例を図１に示す。図中、レーン１はＧＡＢＡおよびグルタミン酸ナトリウム（以下、ＧｌｕＮａ）の標準品を使用したＴＬＣの結果を示す。レーン３ではＧｌｕＮａのスポットしか観察されないのに対し、レーン２ではＧＡＢＡのスポットが観察される。このことから、レーン２の試料にはＧＡＢＡが含まれていることがわかる。以上の操作により、Ｌ１３株を取得した。
【実施例２】
【００４２】
分離株Ｌ１３株の分類学的位置の検討
まず、Ｌ１３株の分類学的位置について検討を加えた。分析はテクノスルガ社に依頼した。Ｌ１３株の生化学的な性質を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
本菌株はグラム陽性桿菌で、芽胞を形成せず、運動性を示さなかった。カタラーゼ反応、及び、オキシダーゼ反応は共に陰性を示した。これらの性質は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の一般性状と一致するが、グルコースを酸化、発酵しない点が異なった。
【００４５】
次に、遺伝学的分類方法を用いて検討を加えた。すなわち、Ｌ１３株のゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＣＲ法によって１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅し、ＤＮＡ塩基配列を決定した。ＰＣＲ法に使用したプライマー８−２７ ｆｗｄおよび１４９２ ｒｅｖの配列を配列番号１および２に、決定した１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。
【００４６】
１６Ｓ ｒＤＮＡのＤＮＡ塩基配列をＤＤＢＪ（DNA data bank of Japan）データベースに対して検索した結果、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｍｅｓｉｉ（Valcheva,R., Korakli,M., Onno,B., Prevost,H., Ivanova,I., Ehrmann,M.A., Dousset,X., Ganzle,M.G. and Vogel,R.F., Lactobacillus hammesii sp. nov., isolated from French sourdough Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 763-767 (2005)）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ（Vancanneyt,M., Naser,S.M., Engelbeen,K., De Wachter,M., Van der Meulen,R., Cleenwerck,I., Hoste,B., De Vuyst,L. and Swings,J. Reclassification of Lactobacillus brevis strains LMG 11494 and LMG 11984 as Lactobacillus parabrevis sp. nov Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 1553-1557 (2006)）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列と９８％の同一性を示した。これらの配列データに基づいて分子系統樹を作成した結果、Ｌ１３株は上記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｍｅｓｉｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓとは別の分枝を示した。これらの結果から、Ｌ１３株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する新しい種の細菌であることが示唆された。
【００４７】
上記生化学的性質および遺伝学的性質に基づき、分離株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３と命名した。この株は、平成１８年８月２日より、〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ−２５３のもとで寄託されている。
【実施例３】
【００４８】
Ｌ１３株のＧＡＢＡ生産
Ｌ１３株のＧＡＢＡ生産性をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株と比較した。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株は、ＧＡＢＡを生産することが知られており、本発明者らはこの乳酸菌株をＧＡＢＡ生産性乳酸菌の基準株として使用している。Ｌ１３株またはＬ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株を種々の濃度のＧｌｕＮａを含むＧＹＰ培地に植菌し、３０℃で培養し、ＧＡＢＡ含量を経時的に測定した。
【００４９】
グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびＧＡＢＡを以下のように定量した。オルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム法によって検出した。使用したシステムは、強酸性イオン交換樹脂カラムＳｈｉｍ−ｐａｃｋ Ａｍｉｎｏ−Ｎａを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所）であった。蛍光検出器を使用して検出し（Ｅｘ ３４８ｎｍ、Ｅｍ ４５０ｎｍ）、標準液としてアミノ酸標準液（Ｈ型、和光純薬）を使用した。
【００５０】
結果を図２に示す。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株が、培地中の初発グルタミン酸ナトリウム濃度によらず、最大約１％のＧＡＢＡを生産するのに対し（図２Ａ）、Ｌ１３株は培地中の初発ＧｌｕＮａ濃度に応じてＧＡＢＡを生産し、初発ＧｌｕＮａ濃度１５％の場合で最大５．７％のＧＡＢＡを生産可能であった。
【００５１】
以上２菌株のＧＡＢＡ変換率をまとめると、表２のようになる。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ １２００５株は、初発のＧｌｕＮａ濃度が高くなるとＧＡＢＡ変換率は大幅に低下したが、Ｌ１３株のＧＡＢＡ変換率は初発ＧｌｕＮａ濃度に大きくは影響されず、約８５％の変換率が得られた。
【００５２】
【表２】
【００５３】
なお、ＧＡＢＡ生産性の高い乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉが報告されている（Noriko Komatsuzaki, Jun Shimaa, Shinichi Kawamoto, Hiroh Momose, Toshinori Kimura, Production of g-aminobutylic acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods, Food Microbiology 22, 497504(2005)）。本菌は最大３．１％のＧＡＢＡ生産能を有していると報告されている（初発グルタミン酸濃度：７．４％、変換率：６０．４％）。この菌株とＬ１３株のＧＡＢＡ生産能を比較すると、Ｌ１３株はＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉの約２倍のＧＡＢＡを生産可能であることが明らかとなった。このように、Ｌ１３株は、公知のＧＡＢＡ高生産乳酸菌に比較して非常に高いＧＡＢＡ生産性を示す。
【００５４】
微生物がＧＡＢＡを生成することの生理学的意義の一つは、培地酸性化に対する防御であると考えられる。この点に着目し、培養中の培地ｐＨを酸性（ｐＨ ５）に維持することの、Ｌ１３株によるＧＡＢＡ生産性に対する効果を検討した。その結果を図３に示す。図３中、ＡはＬ１３株を初発グルタミン酸濃度１２％（実際に使用したグルタミン酸ナトリウム・一水和物濃度をグルタミン酸濃度に換算）とした以外、上記と同様にｐＨ無調製で培養した場合のＧＡＢＡおよびＧｌｕＮａの含量を経時的に測定した結果を、Ｂは培地ｐＨを５に維持して培養した場合の結果を示す。図３に示すように、初発濃度１２％のグルタミン酸から約６．７％のＧＡＢＡを生産することに成功した。変換率は約８５％であった。
【００５５】
なお、この際、培地中のＧｌｕＮａは５日間の培養後、完全に消失した。また、ＧＡＢＡ生産の際、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）の補酵素であるピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）を培地に添加する必要がなかったことは、ＧＡＢＡ生産上のメリットの一つといえる。
【実施例４】
【００５６】
Ｌ１３株を用いた発酵法による千枚漬け製造
Ｌ１３株をスターターとして用い、千枚漬けを発酵法で作製すると共に、その製品にＧＡＢＡも同時に生産することを試みた。その検討は、６Ｌの小スケールで実施した。即ち、かぶらを０．２％酢酸溶液に漬けて洗浄したのち、実施例１と同様に塩化ナトリウムおよび食品用脱色増強剤Ｌｏｖｉｎｇを添加して４℃で一晩下漬けした。本漬けは、初発菌体濃度（漬け液）が１×１０８細胞／ｍｌとなるように調製して、１０℃で６日間静置した（２連で行なった）。コントロールとして、Ｌ１３を接種しない系列も作製した。本漬け開始後、１日ごとに６日までサンプリングし、官能試験の他、グルタミン酸とＧＡＢＡの定量を行なった。
【００５７】
試料は以下のように調製した。千枚漬け１０ｇに精製水４０ｍｌを加え、ホモジナイズ（エースホモジナイザー（日本精機）、１０，０００ｒｐｍ、５分間）し、５分間煮沸後の遠心上清を希釈バッファー（クエン酸３ナトリウム緩衝液、ｐＨ ２．２）で適宜希釈した。調製した試料を用いて実施例３に記載の方法によりＧＡＢＡを定量した。
【００５８】
結果を図４に示す。図４に示すように、３日後に０．１％程度のＧＡＢＡが生産された。更に５〜６日後では最大０．４％程度のＧＡＢＡが生産された。４日以降では雑菌の増殖が観察された。
【００５９】
官能試験は４名のパネリストにより実施し、臭いおよび味覚について３段階の評価（○、△、×）およびコメントを得た。結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３に示すように、官能試験では、３日後の製品まではフルーツのようなフレッシュな香りがあり、味覚も、甘みはあるが後味の引かないすっきりとした味であるなど、独特の優れた性質を有していることが判明した。
【００６２】
尚、ＧＡＢＡは成人１日あたり５０ｍｇ摂取すると、その効能を享受できるとされている。千枚漬け１枚は約３０ｇであり、例えば上記条件で３日後に得られる千枚漬けであれば約０．１％のＧＡＢＡを含有するので一日あたり２枚程度を食すればよい計算となる。
【実施例５】
【００６３】
５−１．グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）遺伝子のクローニング
既報のＧＡＤ遺伝子を参考にしてＰＣＲ用プライマーを作成し、定法に従ってＰＣＲ法によってＧＡＤ遺伝子（ｇａｄＢ遺伝子）を取得した。ＰＣＲ法に使用したプライマーＬ１３ ＧＡＤ ｆｗｄおよびＬ１３ ＧＡＤ ｒｅｖの配列を配列番号４および５に、決定したｇａｄＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６に示す。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３株のｇａｄＢ遺伝子の塩基配列には、１４１０ ｂｐのオープンリーディングフレームが存在した。このオープンリーディングフレームから推察されるアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００６４】
５−２．Ｌ１３株由来ＧＡＤと既報ＧＡＤとの比較
Ｌ１３株由来のｇａｄＢ遺伝子から推察されたアミノ酸配列（Ｌ１３ｇａｄＢ）を用いて、ＤＤＢＪのデータベースに対してＦＡＳＴＡプログラム等により相同性検索を行った。結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】
参考文献等
* Unpublished data (our data); accession number: AB258458
1) Nomura M., Nakajima I., Fujita Y., Kobayashi M., Kimoto H., Suzuki I., Aso H.; Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene. Microbiology, 145:1375-1380(1999).
2) Bolotin A., Wincker P., Mauger S., Jaillon O., Malarme K., Weissenbach J., Ehrlich S.D., Sorokin A., The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403., Genome Res. 11:731-753(2001).
3) Sanders J.W., Leenhouts K., Burghoorn J., Brands J.R., Venema G., Kok J.; A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol. Microbiol. 27:299-310(1998).
4) Nomura, M., Kobayashi, M., Ohmomo, S., and Okamoto, T., Inactivation of the Glutamate Decarboxylase Gene in Lactococcus lactis subsp. cremoris, Appl. Envir. Microbiol. 66: 2235-2237(2000).
5) Park KB, Oh SH., Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3. Bioresour Technol. Feb 22, (2006) [Epub ahead of print] 6) Kleerebezem M, Boekhorst J, van Kranenburg R, Molenaar D, Kuipers OP, Leer R, Tarchini R, Peters SA, Sandbrink HM, Fiers MW, Stiekema W, Lankhorst RM, Bron PA, Hoffer SM, Groot MN, Kerkhoven R, de Vries M, Ursing B, de Vos WM, Siezen RJ., Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100(4):1990-1995 (2003).
7) Blattner FR, Plunkett G 3rd, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK, Mayhew GF, Gregor J, Davis NW, Kirkpatrick HA, Goeden MA, Rose DJ, Mau B, Shao Y., The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, Science, 277(5331):1453-1474 (1997).
【００６７】
表４に示すように、Ｌ１３ｇａｄＢの推定アミノ酸配列は、ＵｅｎｏｇａｄＢ（Lactobacillus brevis IFO12005）のものと特に相同性が高く、７９．８％の同一性を示した。上記のように、本発明者らはこの乳酸菌株をＧＡＢＡ生産性乳酸菌の基準株として使用している。他の微生物由来のＧＡＤの中では、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｌａｃ（Lactococcus lactis ssp.lactis IL1403）や、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ｃｒｅ（Lactococcus lactis subsp.cremoris）のアミノ酸配列とそれぞれ５２．７％、５２．２％の同一性を示した。
【００６８】
さらに、これらの配列について、ＢｉｏＥｄｉｔ ７．０．１ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １．８３と称する解析ソフトを用いて多重アライメントを作成した。結果を図５−１〜５−４に示す。この場合でも、Ｌ１３ｇａｄＢおよびＵｅｎｏｇａｄＢは、これら以外のＧＡＤタンパク質とは明らかに異なるグループを形成した。
【００６９】
これらのＧＡＤと他のＧＡＤのアミノ酸配列との相違点は、以下のとおりである：
（１）Ｌ１３ｇａｄＢの１９−２１残基（−ＥＫＴ−）、１２０−１２４残基（−ＫＦＧＤ−）、１６１−１６３残基（−ＤＬＨ−）に相当する部分が、上記２者以外では欠失している（図５−１、図５−２）；
（２）Ｌ１３ｇａｄＢのバリン１７８残基が、上記２者以外ではシステインである（図５−２）；
（３）上記２者のシステイン残基は５個であるのに対し、これら以外は６個である（ただし、大腸菌ＧＡＤ（Ｅｃｏｌｉ ｇａｄＢ、Ｅｃｏｌｉ ｇａｄＡ）のシステインは例外的に１０個である）（図５−１〜図５−４）。システイン２つの間でジスルフィド結合が形成され、タンパク質の立体構造の形成に重要な役割をする。システインの個数が異なることは、これらのグループ間で立体構造が異なる可能性を示唆する。
【００７０】
一方、アライメントの共通点は、活性に必須とされ、基質結合に重要と考えられるアスパラギン酸残基（Ｄ９１、図５−１）や、補酵素であるピリドキサールリン酸が結合するリシン残基（Ｋ２８９、図５−３）等が高度に保存されている点である。
【００７１】
以上の結果から、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３株のｇａｄＢ遺伝子は、公知のＧＡＤと同様に活性なグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）をコードすることが示唆された。また、Ｌ１３ ＧＡＤの多重アラインメント解析より、既報のＧＡＤとは多くの相違点のあることも確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、ＧＡＢＡ高生産能を有する新規乳酸菌、当該乳酸菌を使用するＧＡＢＡの製造方法およびＧＡＢＡ含有乳酸発酵食品の製造方法、ならびに当該乳酸菌より得られるＧＡＤおよびそれをコードする核酸が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】薄層クロマトグラフィーの結果の一例を示す図である。
【図２】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３株およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＩＦＯ１２００５株のＧＡＢＡ生産量を示す図である。
【図３】培養中の培地ｐＨを酸性に維持することのＧＡＢＡ生産性に対する効果を示す図である。
【図４】千枚漬け発酵中のＧＡＢＡ生産量を示す図である。
【図５−１】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【図５−２】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【図５−３】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【図５−４】各種ＧＡＤアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
SEQ ID NO:1: A primer 8-27 fwd for amplification of 16S rDNA
SEQ ID NO:2: A primer 1492 rev for amplification of 16S rDNA
SEQ ID NO:4: A primer L13 GAD fwd for amplification of L13 gadB gene
SEQ ID NO:5: A primer L13 GAD rev for amplification of L13 gadB gene
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）。
【請求項２】
乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項３】
発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品の製造方法。
【請求項４】
乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する方法により製造される、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品。
【請求項６】
乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、請求項５記載の乳酸発酵食品。
【請求項７】
配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
以下からなる群より選択され、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
（１）配列番号６の塩基配列からなる核酸；
（２）配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸；
（３）配列番号６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含する、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項８記載の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項１】
γ−アミノ酪酸生産能を有する乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）。
【請求項２】
乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項３】
発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品の製造方法。
【請求項４】
乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
発酵食品の原料を乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｌ１３（ＮＩＴＥ Ｐ−２５３）の存在下で発酵させる工程を包含する方法により製造される、γ−アミノ酪酸含有乳酸発酵食品。
【請求項６】
乳酸発酵食品が千枚漬けであり、発酵食品の原料がかぶらである、請求項５記載の乳酸発酵食品。
【請求項７】
配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
以下からなる群より選択され、かつグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
（１）配列番号６の塩基配列からなる核酸；
（２）配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸；
（３）配列番号６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からグルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含する、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項８記載の核酸を含む細胞を培養する工程、および培養物からγ−アミノ酪酸を採取する工程を包含する、γ−アミノ酪酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図５−４】
【公開番号】特開２００８−５４５５５（Ｐ２００８−５４５５５Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３３９８４（Ｐ２００６−２３３９８４）
【出願日】平成１８年８月３０日（２００６．８．３０）
【出願人】（５０４２５５６８５）国立大学法人京都工芸繊維大学 (203)
【出願人】（３０００２４９１１）株式会社もり (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月３０日（２００６．８．３０）
【出願人】（５０４２５５６８５）国立大学法人京都工芸繊維大学 (203)
【出願人】（３０００２４９１１）株式会社もり (2)
【Ｆターム（参考）】
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