アニサキス種のペプチドおよびヌクレオチド配列、この配列を認識する抗体およびその使用
本発明は、アニサキス属の種に関わるヒトおよび動物感染の診断、予防および治療を包含する分野に関する。本発明はまた、食品中のアニサキスの抗原の検出に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニサキス属の種によるヒトおよび動物感染の診断、予防および治療の分野に関する。本発明はまた、食品中のアニサキスの抗原の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
アニサキス属（Ａｎｉｓａｋｉｓ）（アニサキス科（Ａｎｉｓａｋｉｄａｅ））は、いくつかの関連種に属する線虫寄生生物を含む。形態学的および遺伝／分子マーカーを使用して、現在アニサキスの８つの種が認識されており、それらは、ａ）姉妹種である、「狭義の（ｓｔｒｉｃｔｕ ｓｅｎｓｕ）」アニサキス・シンプレックス（Ａｎｉｓａｋｉｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）（Ｒｕｄｏｌｐｈｉ、１８０９）、Ａ．ペグレッフィ（Ａ．ｐｅｇｒｅｆｆｉ）（Ｃａｍｐａｎａ−ＲｏｕｇｅｔおよびＢｉｏｃｃａ、１９５５）および以前はＡ．シンプレックス複合体に含まれたＡ．シンプレックスＣ（Ｎａｓｃｅｔｔｉら、１９８６、Ｍａｔｔｉｕｃｃｉら、２００２）、Ａ．ティピカ（Ａ．ｔｙｐｉｃａ）（Ｄｉｅｓｈｉｎｇ、１８６０）、ｃ）Ａ．フィセテリス（Ａ．ｐｈｙｓｅｔｅｒｉｓ）（Ｂａｙｌｉｓ、１９２３）、ｄ）Ａ．ブレビスピキュラタ（Ａ．ｂｒｅｖｉｓｐｉｃｕｌａｔａ）（Ｄｏｌｌｆｕｓ、１９６６）、ｅ）Ａ．ジフィダラム（Ａ．ｚｉｐｈｉｄａｒｕｍ）（Ｐａｇｇｉら、１９９８）、およびｆ）Ａ．パギアエ（Ａ．ｐａｇｇｉａｅ）（Ｍａｔｔｉｕｃｃｉら、２００５）を含む。
【０００３】
アニサキス種は、鯨類の胃の中、あるいは頻度は低いが鰭脚類の中で性的成熟に達する。これらの哺乳動物は、ａ）寄生生物の第三幼虫期（Ｌ３）の宿主となる待機宿主、すなわち魚類（主として硬骨魚）および頭足動物（主としてイカ）の摂取によって、およびｂ）中間宿主として、同じくＬ３幼虫の宿主となるオキアミの摂取によって感染し得る（たとえば鯨）。
【０００４】
海洋哺乳動物の場合と同様に、ヒトも、寄生生物を保有する生魚およびイカの摂取によってＬ３アニサキス幼虫に感染することがあり、これはアニサキス症（ａｎｉｓａｋｉｏｓｉｓまたはａｎｉｓａｋｉａｓｉｓ）と呼ばれる臨床疾患を引き起こす。いくつかの魚料理は、アニサキス種による感染の危険度が高いとみなされることが多い。これらは、日本の寿司および刺身、ドイツのソテーまたはスモークしたニシン、スカンジナビアのグラブラクス、ハワイのロミロミ、南アメリカのセビチェおよびスペインの塩漬けアンチョビを含む。
【０００５】
Ｌ３アニサキス幼虫がヒトに感染すると、胃腸症状を引き起こすことが多く、この症状は様々な重症度のアレルギー反応に結びつくことがある。幼虫の位置および主要症状に応じて、アニサキス症の主たる４つの臨床形態（胃／胃アレルギー、腸、胃腸管外およびアレルギー）がヒトにおいて発現する。胃（急性）形態のアニサキス症では、幼虫が胃壁に侵入し、生Ｌ３アニサキス幼虫を含む魚を摂取してから数時間後に、急性上腹部痛、吐気、および嘔吐を特徴とする臨床経過が認められることが多い。そして、内視鏡検査から、しばしば侵入部位の点状出血、溢血点およびびらんから成る病変が明らかになることが多い。さらに、アレルギー症状（すなわち蕁麻疹／血管性浮腫および時としてアナフィラキシー）も症例の約１０％において認められる。胃感染とアレルギー症状の併発は「胃アレルギー性アニサキス症」と呼ばれていた（Ｄａｓｃｈｎｅｒら、２０００）。一部の患者は亜急性または慢性形態を発症することがあり、その臨床症状発現は、上腹部痛、消化不良、嘔吐、および食欲不振を含み、それらは数ヶ月間、場合によっては数年間持続することもある。
【０００６】
腸形態のアニサキス症の場合には、幼虫が回腸末端のレベルで腸壁に侵入することが多い。急性症例の場合には、腹痛がしばしば認められ（通常は汚染された魚の摂取から２４〜４８時間後）、吐気、嘔吐、腹部腫脹、硬化、および便秘や下痢を伴う腸リズムの逸脱を伴う。感染組織の顕微鏡所見は、腸アニサキス症の症例では、強度の局所浮腫、点状出血、充血、および漿膜と腸間膜のびまん性炎症を特徴とする蜂巣炎性病変を明らかにする。これらの病変は、腸の近位閉塞と拡張を引き起こし得る。相当数の患者において、高い含量の好酸球を有する腹水が認められる。亜急性または慢性腸アニサキス症の場合には、幼虫によって誘導される肉芽腫性の変化が、壁の肥厚、管腔狭窄および慢性腹部症状を招く。
【０００７】
胃腸管外または異所性形態では、感染性アニサキス幼虫が胃腸壁を越え、腹腔に達して、肺、膵臓、肝臓等の器官および組織へと移動する。これらの症例の臨床症状は、幼虫の局所位置に依存する。
【０００８】
アレルギー性アニサキス症の形態は、アニサキス幼虫による感染後にアレルギー反応を有しつつも胃や腸には症状がない患者に限られる。最初の症状は非常に早く、汚染された魚を摂取してから最初の数時間のうちに発現し、臨床経過はＩ型アレルギー反応について一般的なパターンをたどることが多い。重症度は、単純な蕁麻疹または血管性浮腫からアナフィラキシーショックまでにわたる。
【０００９】
アニサキス幼虫が胃、十二指腸、または結腸内に存在するとき、感染を明らかにするための好ましい方法は内視鏡検査である。この手法は、内視鏡に結合された鋏によって幼虫を除去するためにも有用であり、患者の治癒を導く。しかし、ａ）幼虫が内視鏡検査によってアクセスできない、ｂ）幼虫が部分的に破壊されているかまたは内視鏡医に見えない、またはｃ）主要症状がアレルギーであるときには、感染を確認するための好ましい方法は、患者の血清中の特異抗体の存在を明らかにすることである。後者はまた、無症候性被験者においてアニサキスによる以前の感染を明らかにするためにも好ましい方法である。
【００１０】
感染の間に産生されるアニサキスの抗原に対する種々のクラスの抗体の中では、ＩｇＥ抗体が最も関連性がある。なぜなら、１）それらはアニサキスによる感染の間に認められるＩ型アレルギー反応に関与し、および２）感染患者の血清中に存在するものの中で特異性の見地から最も適切なクラスの免疫グロブリンであるためである。
【００１１】
アニサキス幼虫によるヒト感染の最初の症例記述（Ｖａｎ Ｔｈｉｅｌ、１９６０）以来、種々のクラスの抗アニサキス抗体を検出するための高精度な血清学的検定法を開発するべく数多くの試みがなされてきた。
【００１２】
血清中の抗アニサキス抗体を測定することを目的とした最初の方法には、ラテックス凝集法（ＡｋａｏとＹｏｓｈｈｉｍｕｒａ、１９８９）、二重免疫拡散法および免疫電気泳動（Ｐｅｔｉｔｈｏｒｙら、１９８６、Ｔｓｕｊｉ、１９９０）、間接赤血球凝集反応（Ａｓａｉｓｈｉら、１９８９、Ｔｓｕｊｉ、１９８９）、および補体固定検定法（Ｏｓｈｉｍａ、１９７２、Ｔｓｕｊｉ、１９８９）が含まれた。これらの方法はすべて、ａ）十分な具体性と特異性を欠き、およびｂ）これらの手法を使用してＩｇＥ抗体（レアギン）を測定することができない、という２つの主要な難点を有していた。
【００１３】
最近になって、放射性アレルギー吸着試験（Ｄｅｓｏｗｉｔｚら、１９８５、Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０）、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｒｏｄｅｒｏら、２００２）、蛍光酵素免疫検定法（ＵｎｉＣａｐ ＦＥＩＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）および免疫移動法（Ｄｅｌ Ｐｏｚｏら、１９９６、Ｇａｒｃｉａら、１９９７）といった他の免疫検定法の実施によって感染患者の血清中の抗アニサキスＩｇＥの測定が行われたが、精度および／または特異性の問題がこれらの方法に関しても発生した。
【００１４】
ヒトアニサキス症を診断するための有用な血清学的方法の開発における主な問題は、一方では、（ｉ）すべての感染患者の血清中に存在するＩｇＥ抗体によって認識され、かつ（ｉｉ）全分子（すなわち選択されたアレルゲン中に存在するすべてのエピトープ）がアニサキス属に特異的である寄生虫抗原（我々の場合はアレルゲン）を入手することにある。さもなければ、低い精度しか得られないか、および／または擬陽性を導く交差反応性が起こる。
【００１５】
インビトロで培養されたアニサキス種幼虫の完全な天然排出／分泌抗原（ＥＳＡ）を使用して（Ｐｏｇｇｅｎｓｅｅら、１９８９、Ｂａｅｚａら、２００４）、またはＬ３アニサキス幼虫の粗抽出物から特異的標的抗原を捕捉するモノクローナル抗体を使用して（Ｙａｇｉｈａｓｈｉら、１９９０、ＵｂｅｉｒａおよびＩｇｌｅｓｉａｓ、２０００）、ヒトアニサキス症の血清学的診断を改善するための試みが為された。しかし、これらの戦略に基づくＥＬＩＳＡ法もまた、ＥＳＡを含む、アニサキスの糖タンパク質中に存在する交差反応性エピトープ（主としてＯ−およびＮ−グリカン）の存在ゆえに十分な特異性を有していなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、それらが由来するアニサキスの天然分子の抗原性を保持するペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質配列、ならびに前記配列をコードする核酸、および前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対する特異的抗体またはそのフラグメントを提供する。開示されるペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、ならびに前記ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に対する特異的抗体またはそのフラグメントは、ヒトおよび動物アニサキス症の血清学的診断のための免疫検定法を開発するために有用であり、上述した方法の難点を有さない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
それ故、本発明の第１の態様は、以下の群：
ａ．配列番号１を含む核酸、
ｂ．配列番号１の相補的核酸を含む核酸、
ｃ．配列番号１５または１７を含む配列番号１の核酸のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｆ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｇ．（ａ）〜（ｆ）の項で述べた核酸配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列
から選択される単離核酸配列（以下、本発明の核酸配列と称する）を提供する。本発明の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ａ）〜（ｆ）の項で前述した核酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有し、さらに一層好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド配列は、（ａ）〜（ｆ）の項で前述した核酸配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１８】
本発明の第２の態様は、以下の群：
ａ．配列番号２を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号１６または１８を含む配列番号２のフラグメント、
ｃ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｆ．この項目の（ａ）〜（ｅ）の項で述べたアミノ酸配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択される、単離ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質（以下、本発明のアミノ酸配列と称する）を提供する。本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸配列は、この項目の（ａ）〜（ｅ）の項で前述したアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有し、さらに一層好ましい実施形態では、前記アミノ酸配列は、この項目の（ａ）〜（ｅ）の項で前述したアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１９】
これらのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質はすべて、アニサキスに感染したすべての患者の血清中に存在するＩｇＥ分子によって認識されるアニサキス属寄生虫の特異的抗原を提供することにより、ヒトアニサキス症を診断するための有用な血清学的方法を開発する上での主要な問題を克服するために使用され得る。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、抗アニサキス抗体によって認識され得るアミノ酸配列に関し、前記アミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列：
ａ．配列番号７を含むアミノ酸配列、
ｂ．配列番号８を含むアミノ酸配列、
ｃ．配列番号９を含むアミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０を含むアミノ酸配列、
ｅ．配列番号１１を含むアミノ酸配列、
ｆ．配列番号１２を含むアミノ酸配列、
ｇ．配列番号１３を含むアミノ酸配列、
ｈ．配列番号１４を含むアミノ酸配列
から選択される、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸を有し、かつ配列番号２にいずれかのフラグメントと少なくとも７０％の同一性を有するフラグメントを含む。
【００２１】
第３の態様では、本発明のアミノ酸配列は、以下の手法：
ａ．組換え手法
ｂ．化学合成
ｃ．アニサキス科の線虫の実質的精製
を含むが、これらに限定されない手法のいずれかによって作製される。
【００２２】
本発明の第４の態様は、本発明のアミノ酸配列の２つ以上を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する。
【００２３】
本発明の第５の態様は、本発明のアミノ酸配列の１つ以上をコードする核酸配列を含む合成または組換え核酸分子に関する。
【００２４】
本発明の第６の態様は、シグナル分子で標識された、本発明の単離核酸またはアミノ酸配列に関する。本発明の好ましい実施形態では、前記標識分子は、以下の群：
ａ．放射性
ｂ．酵素
ｃ．蛍光性
ｄ．発光性
ｅ．化学発光性
ｆ．呈色性
を含むが、これらに限定されないシグナル分子のいずれかから選択される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、標識分子は、以下の群：
ａ．ビオチンまたはその誘導体
ｂ．ニトロフェノール誘導体
ｃ．コロイド状金
ｄ．ラテックス
ｅ．フルオレセイン
を含むが、これらに限定されないシグナル分子のいずれかから選択される。
【００２６】
本発明の第７の態様は、本発明のアミノ酸配列のいずれかと相互作用することができる抗体またはそのフラグメント（以下本発明の抗体と称する）に関する。本発明の抗体のいずれかをコードすることができる核酸配列も本発明の一部である。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の前記抗体は、２００６年６月１５日にドイツ微生物および培養細胞保存機関（Ｇｅｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ）に寄託された、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体（以下ＵＡ３抗体）である。
【００２８】
さらなる実施形態は、２００６年６月１５日にＤＳＭＺ機関に寄託された、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の抗体のいずれかの抗原認識配列、特にＵＡ３抗体の抗原認識配列に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、付加的なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に化学的に結合または連結されている、本発明の単離アミノ酸配列を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現系（以下本発明の発現系と称する）に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明の核酸配列でもしくは本発明の発現ベクターまたは発現系で形質転換またはトランスフェクトされた単離原核または真核宿主細胞（以下本発明の宿主細胞と称する）を提供する。
【００３３】
本発明の第８の態様は、本発明の核酸配列によってコードされる組換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生産する方法に関し、前記方法は、前記ヌクレオチドが発現され、生産される条件下で本発明の宿主細胞を培養し、その後前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を単離することを含む。
【００３４】
本発明の第９の態様は、
ａ．生物学的試料を、本発明のアミノ酸配列と、前記ポリペプチドと試料中の抗体との間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、単離された生物学的試料、好ましくは血清中のアニサキス種に対する抗体を検出するインビトロ法に関する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、インビトロ法は、免疫検定法または酵素免疫検定法である。
【００３６】
本発明の第１０の態様は、
ａ．生物学的試料または食品抽出物を、本発明の抗体と、前記抗体と試料中の抗原の間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、試料、好ましくは生物学的試料、または食品抽出物中のアニサキス種の抗原を検出するインビトロ法に関する。
【００３７】
好ましい実施形態では、インビトロ試料中のアニサキス種の抗原を検出するために使用される本発明の抗体は、ＵＡ３抗体である。
【００３８】
本発明の１つの好ましい態様は、被験者を本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に曝露し、被験者の反応を観測することを含む、被験者におけるアニサキス種に対するアレルギーを診断または予後判定するインビボ法に関する。
【００３９】
アニサキス種に対する抗体を検出する本発明のインビボ法のさらに一層好ましい態様は、プリック試験を使用することである。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様は、
ａ．少なくとも１つの本発明の抗体またはそのフラグメント、および
ｂ．免疫複合体の検出手段
を含む、生物学的試料または食品抽出物中のアニサキス種の抗原を検出するのに適したキット（以下本発明のキット）である。
【００４１】
本発明の別の好ましい態様は、
ａ．少なくとも１つの本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、および
ｂ．免疫複合体の検出手段
を含む、生物学的試料、好ましくは血清中の抗アニサキス種抗体を検出するのに適したキットである。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明のキットにおいて使用される検出手段は、免疫複合体の形成を認識することができる標識二次抗体から成る。
【００４３】
さらに一層好ましい実施形態では、本発明のキットにおいて使用される検出手段は、免疫複合体の形成を認識することができる標識二次試薬である。
【００４４】
本発明の別の態様は、アニサキス種に対する何らかの型のアレルギー反応の治療のための医薬組成物を製造するための、本発明のアミノ酸配列の使用に関する。本発明の１つの好ましい実施形態は、医薬組成物それ自体に関する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書において使用される「核酸」または「核酸分子」は、ホスホジエステル架橋によって互いに結合された、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである２つ以上のサブユニットから成るヌクレオチドのポリマーを指す。「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってまたは連結、スプライシング、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用のような他の方法によって生成されるフラグメントを含む。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖（五炭糖）の残りの部分（ａ ｒｅｍａｉｎｄｅｒ ｏｆ ｓｕｇａｒ）、リン酸および含窒素複素環式塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位を意味する。ＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。ＲＮＡの４つの塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
【００４６】
本明細書において使用される「単離核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。前記核酸分子は、細胞のゲノムＤＮＡから分離され得るか、組換えＤＮＡ技術（たとえばＰＣＲ増幅、クローニング等）を用いて生産され得るか、または化学合成され得る。単離核酸分子は、完全な遺伝子としてまたはその遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができるその部分として、その天然ソースから得られ得る。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。
【００４７】
本明細書において使用される「プライマー」は、プライマー鋳型二本鎖を形成するように相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型とハイブリダイズし得る天然または合成オリゴヌクレオチド（好ましくは１５〜４０ヌクレオチド長の範囲である）を指す。典型的には、プライマーは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドであり、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーション後にポリメラーゼによる核酸合成のための出発点として働く。
【００４８】
本明細書において使用される「をコードするヌクレオチド配列」という表現は、特定ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を指令する核酸配列を指す。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖の配列と、タンパク質へと翻訳されるＲＮＡ配列とを含む。本発明の核酸配列は、完全長核酸配列と完全長タンパク質に由来するトランケート型配列（完全長を有さないもの）との両方を含む。それらはまた、特定宿主細胞においてコドン選択を与えるように構築され得る、天然配列と同じペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列の変異体を含む。
【００４９】
本明細書において使用される「の相補物」は、２本のポリヌクレオチド鎖の領域の間または塩基対の形成を通じた２つのヌクレオチド間の逆対応の概念を指す。その結果として、「相補的塩基の配列」は、その中のすべての塩基がもう１つ別のポリヌクレオチド鎖内の塩基の配列と塩基対を形成し得るポリヌクレオチド鎖を指す。周知のように、アデニンヌクレオチドはチミン（Ａ−Ｔ）またはウラシル（Ａ−Ｕ）と塩基対を形成することができ、シトシンヌクレオチドはグアニン（Ｃ−Ｇ）と塩基対を形成し得る。
【００５０】
本明細書において使用される「発現ベクター」は、対象とする配列または遺伝子の発現を指令することができる集合体を指す。本発明によれば、発現ベクターは、プラスミドまたはファージのような、アニサキス種の抗原を発現することができる何らかのＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターであり得る。好ましくは、本発明における発現ベクターはプラスミド（たとえばｐＱＥ３１およびｐＴＡＲＧＥＴ）である。
【００５１】
本明細書において使用される「プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡから独立した細胞中で複製することができる自律環状ＤＮＡを指し、発現型および非発現型の両方を含む。
【００５２】
本明細書において使用される「組換え」という用語は、天然または合成ＤＮＡ分子を、生細胞において複製し得るＤＮＡ分子またはその複製の結果である分子に人為的に結合することにより、生細胞の外部で作製される複合ＤＮＡ分子を指す。この文書では、「組換え」という用語はまた、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。
【００５３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つのアミノ酸のα−アミノ基と隣接アミノ酸のα−カルボキシル基の間のアミド結合によって互いに結合されたアミノ酸の直鎖状配列を表わすために、この文書では交換可能に使用される。２５のアミノ酸以下の長さを有するポリペプチドは「ペプチド」とみなされる。好ましくは、シストロンによってコードされるポリペプチドは「タンパク質」とみなされる。
【００５４】
本明細書において使用される「アミノ酸配列のフラグメント」という表現は、特定ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸配列内の隣接アミノ酸の部分を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される「単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」は、自然界においてポリペプチドと結合している脂質、炭水化物または他の不純物のような細胞夾雑物を本質的に含まないペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、従来のクロマトグラフィー手法によってその天然媒質から精製され得る。単離ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質はまた、組換え法によってまたは化学合成によっても入手され得る。典型的には、「実質的に精製されたポリペプチド」は、それが細胞、組織、または生物において天然に共存するその他のポリペプチドの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％から分離されるときに得られる。
【００５６】
本明細書において使用される「アミノ酸（単数および複数）」という用語は、すべての天然起源のＬ−α−アミノ酸またはその残りのものを指す。以下の表（表１）は、天然アミノ酸を表わすために使用される３文字表記および１文字表記（生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会によって推奨される）を示す。
【００５７】
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リシン
Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｃｙｃ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
【００５８】
本明細書において使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、海洋哺乳動物および家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）を含む、哺乳動物として分類される何らかの動物を指す。好ましくは、この文書における哺乳動物はヒトである。
【００５９】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原結合特性を有し、形質細胞によって産生されることを特徴とする、免疫グロブリンファミリーの糖タンパク質を指す。「抗体」という用語は、抗体のあらゆるクラス、たとえばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはその誘導体に属するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を含む。
【００６０】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という表現は、抗体の均一な集団を有する抗体の組成物を指す。抗体の特定ソースまたはそれらが生産される方法に限定されることは意図されておらず、細胞融合または組換え手法によって生産される抗体およびそのフラグメントを包含する。
【００６１】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫適格宿主に導入されたときに特異的抗体の産生を誘導することができる何らかの分子または物質を指す。本明細書において使用される「抗原」という用語はまた、特異的抗体によって認識され得る何らかの分子または物質を指す。典型的には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸またはこれらの分子の組合せは抗原として認識され得る。これらの抗原はまた、結合有機および無機化学基を含み得る。
【００６２】
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体によって、または細胞の抗原特異的受容体によって認識される抗原の部分を指す。抗原がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であるとき、エピトープは、一次アミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸のフラグメントであり得るが、５またはそれ以上のアミノ酸から成る成熟折りたたみタンパク質（三次（三次元）構造）の表面の露出領域でもあり得る。典型的には、エピトープは、それらが生じさせる免疫応答の種類に基づき、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープとして分類され得る。
【００６３】
本明細書において使用される「生物学的試料」という用語は、本発明の核酸、抗体、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の１つ以上を含む生体組織または液体の何らかの試料に適用される。本発明において、「生物学的試料」という用語はまた、抗アニサキス抗体を測定するためのソースとして使用し得る生体組織または液体の何らかの試料に適用される。前記試料は、単離組織、血液、血清、血漿、脳脊髄液、腹水、滑液、唾液、尿または糞便を含むが、これらに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的検査のために採取された凍結切片のような組織切片も包含し得る。生物学的試料は、何らかの真核生物、好ましくはラット、マウス、ウサギ、海洋哺乳動物またはヒトのような哺乳動物から入手され得る。
【００６４】
本明細書において使用される「食品試料」という用語は、広範囲の食用材料から得られる何らかの試料を指す。これらの試料は、生魚、スモークされた魚および調理された魚の部分、およびその組成物中に魚材料を含有する食品を含むが、これらに限定されない。「食品試料」という用語はまた、乳児用栄養食品を含む。
【００６５】
本明細書において使用される「抗アニサキス抗体」という表現は、アニサキス属の何らかの種の抗原中に存在する少なくとも１つのエピトープを認識することができる、試料中に存在する何らかのクラスまたはサブクラスの抗体を指す。この表現は、寄生生物によるヒトおよび動物の自然感染または実験的感染の間に産生される抗体、ならびにアニサキス属の種から得られた、精製されていないかまたは実質的に精製された組換えまたは合成抗原によるヒトまたは動物の免疫後に産生されるモノクローナルおよびポリクローナル抗体を包含する。この表現はまた、組換え手法、化学合成または等価手法によって作製される抗原結合抗体およびフラグメントを含む。
【００６６】
本明細書において使用される「同一性の割合」という表現は、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列が互いに隣接して整列したとき同じ相対位置を占めるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を指す。本発明に関して、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列同一性の割合を算定するための適切な方法は、参照としてこの文書に組み込まれる、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７に公表されたＨｕａｎｇとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムを適用する、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐｅａｒｏｎのｌａｌｉｇｎプログラムである。このプログラムは、［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ］においてオンラインで処理され得る。
【００６７】
本明細書において使用される「免疫検定法」という用語は、抗原−抗体反応によって試料中の分析物を検出する方法を指す。分析物は、低分子（ハプテン）または多くの血漿タンパク質のような高分子であり得る。分析物は、抗体とリガンドの間の特異的結合によって検出され得る抗体であることが多い。本明細書において使用される「酵素免疫検定法」（ＥＩＡ）という用語は、試薬の少なくとも１つが酵素で標識されていることを特徴とする、広い範囲の免疫検定法を指す。典型的なＥＩＡは、多くの変法を有する、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。免疫検定法形式の分類または詳細な説明については、ＰｒｉｃｅとＮｅｗｍａｎ（１９９７）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｒｅｎｅｃｅ ＬＴＤ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９８５）、および酵素免疫検定法の理論については、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｏｎとＰＨ ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｎｕｎｏａｓｓａｙｓ，ｆｒｏｍ ｃｏｎｃｅｐｔ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【００６８】
本明細書において使用される「医薬組成物」は、哺乳動物被験者に投与されるのに適した化学的または生物学的組成物を指す。典型的には、医薬組成物は、一定量の薬理的に有効な活性物質と医薬的に許容される担体を含む。適切な担体および医薬製剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，２０００に述べられている。医薬組成物は、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻内、舌下および同様の経路を含むが、これらに限定されない、種々の経路による投与のために特に製剤され得る。
【００６９】
本明細書において使用される「診断方法」という表現は、動物または被験者において病的状態を特定する方法を指す。前記病的状態が病原体によって生じるとき、診断は、宿主において病原体によって放出される抗原、または前記病原体によって誘導される抗体を検出することを可能にする免疫検定法（上記参照）を使用して行われ得ることが多い。本発明の診断方法は、インビトロ検定法（ＥＬＩＳＡ検定法または好塩基球ヒスタミン放出試験など）および、しばしばアレルギーを診断するために使用される、皮膚試験（たとえばプリック試験を含むが、これに限定されない）、皮内反応試験または表皮試験（たとえばパッチテスト）のようなインビボ検定法を含む。「診断方法」という表現はまた、経口、結膜、鼻、気管支等、種種の経路でアレルギー症状を引き起こすことが疑われる物質に対する耐性を調べるために、制御しながら段階的に投与することから成る、誘発試験を含む。後者の方法のより詳細な説明は、「Ｃｏｍｉｔe ｄｅ Ｒｅａｃｃｉｏｎｅｓ Ａｄｖｅｒｓａｓ ａ Ａｌｉｍｅｎｔｏｓ：Ｍｅｔｏｄｏｌｏｇｉａ ｄｉａｇｎoｓｔｉｃａ ｅｎ ｌａ ａｌｅｒｇｉａ ａ ａｌｉｍｅｎｔｏｓ”．Ａｌｅｒｇｏｌｏｇiａ ｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｃｌｉｎｉｃａ，１４：５０−５２（１９９９）、ならびに臨床アレルギー学および免疫学診療科に関する様々な手引書に見出され得る。
【００７０】
本明細書において使用される「配列反復」という表現は、所与のタンパク質または核酸分子の配列内の反復モチーフを指す。本発明のポリペプチド配列における配列反復は、ＲＡＤＡＲプログラムを使用して実施した（実施例１２参照）。
【００７１】
異なる定義がある場合を除き、この文書において使用される技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施においては、この文書の中で開示されるのと類似または等価の方法および材料が使用され得る。明細書全体および特許請求の範囲を通じて、「含む」という語およびその変形は、他の技術的特徴、付加物、成分または工程を排除することを意図しない。本発明の他の目的、利点および特徴は、明細書を検討した後当業者に明白となるかまたは本発明の実施によって学習され得る。以下の実施例は例示のために提供するものであり、本発明を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００７２】
アニサキス・シンプレックスからのｍＲＮＡの単離および発現ライブラリーの構築
Ｌ３幼虫期（Ｌ３）のアニサキス・シンプレックス幼虫をブルーホワイティング（またはプタスダラ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓ ｐｏｕｔａｓｓｏｕ）の内臓および腹腔から手操作で抽出し、ｃＤＮＡライブラリーの構築を開始するまで液体窒素中で保存した。全メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を製造者の指示に従って使用して凍結Ｌ３アニサキス・シンプレックス１ｇから得た。
【００７３】
ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてアニサキスｃＤＮＡライブラリーを構築するために得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡ ５μｇを、製造者の指示に従って使用した。提供される指示に従い、アニサキス・シンプレックスのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを最初に二本鎖ｃＤＮＡに変換した、その後、それをλ−ＺＡＰ発現ベクターに結合し、ベクターをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩパッキング抽出物を使用して挿入した。大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を宿主として使用した。生じたライブラリーを増幅したところ、約１．３×１０１０ｐｆｕ／ｍｌおよび１％の非組換えファージを含有していた。
【００７４】
アニサキス・シンプレックスのｃＤＮＡライブラリーの探査
増幅した後、Ａ．シンプレックスのｃＤＮＡライブラリーを、ＵＡ３モノクローナル抗体を用いた免疫学的スクリーニングに供した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で提供される推奨に従って、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’宿主細胞を補足ＬＢブロス中で増殖させ、１，０００×ｇで遠心分離して、沈降物を１０ｍＭ硫酸マグネシウムに再懸濁した。組換えファージのアリコートをこの懸濁液に加え、ファージを細胞に結合させるために混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。その後、結合ファージを含む細胞懸濁液を溶融ＮＺＹ寒天（約５５℃に冷却）と混合し、この混合物を、新たに注ぎ入れたＮＺＹ寒天を含む直径１５０ｍｍのプレート上に均一に塗布した。４２℃で約３時間インキュベーショトし、ファージプラークの形成を開始させた後、あらかじめ水中の１０ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）に含浸したニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でプレートを被覆することによって組換えタンパク質の発現を誘導した。その後、プレートを３７℃で３時間半インキュベートし、吸着したファージプラークを含むニトロセルロースフィルターを慎重に取り出し、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の３％ＢＳＡにより３７℃で３０分間ブロックして、その後ＩｇＧ１／κＵＡ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ＴＢＳ中１：１０，０００希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。ニトロセルロース膜を、０．０５％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中で洗浄し、１：１０，０００のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）と共に周囲温度で２時間インキュベートした。再び１回洗浄した後、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）およびＢＣＩＰ（ｐ−トルイジン−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて免疫複合体を観察した。
【００７５】
単一クローンのインビボスプライシングおよびｃＤＮＡ塩基配列決定
無傷λＺＡＰベクターの免疫学的スクリーニングにより、ＭＡｂ ＵＡ３によって認識されるタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定した後、対応するファージプラーク（ＵＡＲ−Ｈ５クローン）を精製した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で与えられる指示に従って、ファージを選択した陽性プレートの中央部分を微量遠心管に移し、組換えファージ粒子をＳＭ緩衝液中に放出した。その後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’宿主細胞を組換えファージおよびキットと共に供給されるＥｘＡｓｓｉｓｔ補助ファージに重複感染させることにより、λＺＡＰベクターのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドのインビボスプライシングを実施した。この手順の最後に、糸状ファージ粒子の形態で充填されて得られるスプライシングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを使用して、ＳＯＬＲ宿主細胞に感染させた。クローニングされた対象ＤＮＡ挿入物を有する二本鎖ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを含むトランスフェクトされたＳＯＬＲ細胞のコロニーを得、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリア−ベルタニ（ＬＢ）寒天プレートで細胞を増殖させた。個々の細菌コロニーをＬＢブロス−アンピシリン中で増殖させ、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドＤＮＡを精製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ配列の正（５’配列番号１９ ３’）および逆（５’配列番号２０ ３’）Ｍ１３プライマーを、いくつかの内部プライマーと共に、Ｂｉｇ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したファージミドＤＮＡの自動塩基配列決定のために使用した。ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、ｔｈｅ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓからの、ＥｘＰＡＳｙソフトウエアパッケージ（ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）を使用してＥＭＢＬおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンクと比較した（Ｇａｔｅｉｇｅｒら、２００３）。記述されているヌクレオチド配列は、配列番号１の配列によって表わされる３，２８８ヌクレオチドの配列を含み、配列番号２によって表わされる１，０９６アミノ酸の推定アミノ酸配列をコードする。
【実施例２】
【００７６】
ｐＱＥ−３１ベクターへのアニサキス・シンプレックスのｃＤＮＡ配列（配列番号１）のフラグメントのサブクローニング
好ましい実施形態では、２７９アミノ酸のポリペプチド配列（配列番号１６）をコードする、配列番号１のヌクレオチド１３０３−２１３９の位置に対応する組換え内部ＤＮＡのフラグメント（配列番号１５）を、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｙｐｅ ＩＶキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＩＺＡＳＡ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を製造者の指示に従って用いて、ｐＱＥ−３１のマルチクローニングサイトの制限部位Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して発現ベクターｐＱＥ−３１にサブクローニングした。もう１つの類似の方法が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８）などの手引書において入手可能である。
【００７７】
クローニングの前に、配列番号１５に対応するｃＤＮＡフラグメントの配列をＰＣＲによって増幅して、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを鋳型として使用し、制限部位Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを含む正プライマー（５’配列番号２１ ３’）と逆プライマー（５’配列番号２２ ３’）のセットを用いて配列の末端を修飾した。このＰＣＲ修飾は、組換え挿入物が消化されたプラスミドに対して粘着末端を有するために、制限酵素Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩについての特異的ヌクレオチド配列を提供した。配列番号１５に対応するＤＮＡフラグメントの配列の増幅および修飾のためのＰＣＲ条件は、９４℃で４分間の変性サイクルとそれに続く（９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のハイブリダイゼーション、および７２℃で１分間の伸長）の３５サイクル、および７２℃で７分間の最終伸長サイクルを含んだ。ＰＣＲが完了した後、増幅されたアニサキスの組換えＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。その後、プラスミドＤＮＡ １μｇおよび挿入するフラグメントをコードするＤＮＡ ２μｇを、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）によって推奨される緩衝液およびインキュベーション条件に従って、制限酵素Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した。最後に、消化したベクターとＤＮＡ挿入物の両方をＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、１６℃で一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してベクターと挿入物を１：３の割合で連結した。ｐＱＥ−３１のマルチクローニングサイトの部位Ｓａｌ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの間に配列番号１５のアニサキス・シンプレックス組換えＤＮＡを挿入することは、アニサキスの配列番号１６（中央部分）および２つの付加的なアミノ酸配列（尾部）：それぞれクローニングされたアニサキス配列のアミノ末端とカルボキシル末端部分に位置する、配列番号２３および配列番号２４を含む、配列番号４のアミノ酸配列をコードする９１５ヌクレオチドのプラスミドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号３）を導いた。コードされるポリペプチドのアミノ部分における６ｘヒスチジンシグナルの存在は組換えポリペプチドの精製を促進し得るが、他のベクターおよび精製方法も、都合によって使用し得る。
【実施例３】
【００７８】
組換えｐＱＥ−３１によるＭ１５細胞（ｐＲＥＰ４）の形質転換
組換えベクターｐＱＥ−３１による大腸菌のＭ１５細胞［ｐＲＥＰ４］の形質転換を、製造者（Ｑｉａｇｅｎ）の手引書（Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ：Ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ６ｘＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の中で与えられる指示に従って実施した。このプロトコルに従って、あらかじめ作製したコンピテントＭ１５細胞のアリコートを連結混合物のアリコートと共に氷中で２０分間インキュベートし、その後４２℃で９０分間インキュベートした。前記インキュベーション後、細胞をΨブロスに再懸濁し、３７℃で９０分間インキュベートした。その後、Ｍ１５細胞を、カナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびアンピシリン１００μｇを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーを、カナマイシンとペニシリンを添加したＬＢブロス中で増殖させ、遠心分離して、沈降した細胞をグリセロール含有ＳＯＢ培地において−８０℃で保存した。
【実施例４】
【００７９】
アニサキス・シンプレックスの組換えポリペプチドの発現
実施例２の組換えアニサキスの組換えポリペプチドを生産するために、形質転換したＭ１５細胞を解凍し、０．５のＯＤ６００が達成されるまで、軌道攪拌（２００ｒｐｍ）しながら、カナマイシンおよびアンピシリンを添加したＬＢブロスにおいて３７℃で増殖させた。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによってポリペプチドの発現を誘導し、細胞を同じ攪拌条件下にて３７℃でさらに４時間インキュベートした。その後、細胞を５０００×ｇで遠心分離し、実施例５に述べられているように、発現されたポリペプチドの精製が達成されるまで、−３０℃で凍結保存した。これらの培養条件下で、Ｍ１５細胞は、封入体の形態で沈殿した配列番号４の組換えポリペプチドを生産する。
【実施例５】
【００８０】
アニサキス・シンプレックスの組換えポリペプチドの精製
好ましい実施形態では、２５０ｍｌの培養物から得た、沈降したＭ１５細胞の封入体を以下の工程に従って精製した。ａ）細菌沈降物をＢ−ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）１５ｍｌに再懸濁し、１０分間静かに攪拌した。ｂ）試料を１５，０００×ｇで遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を廃棄した。ｃ）封入体を含む沈降物を別途のＢ−ＰＥＲ １５ｍｌに再懸濁し、最終濃度２００μｇのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を細胞懸濁液に添加して、周囲温度で５分間インキュベートした。ｄ）懸濁液を１：１０希釈のＢ−ＰＥＲ １００ｍｌで希釈し、ボルテックス攪拌器を用いて細胞を再懸濁した。ｅ）細胞懸濁液を１５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、沈降物を別途のＢ−ＰＥＲ １００ｍｌに再懸濁して、ボルテックスで攪拌した。ｆ）希釈したＢ−ＰＥＲを１５，０００×ｇで遠心分離し、沈降物を、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスＣｌおよび６Ｍ尿素、ｐＨ８．０から成る変性緩衝液５０ｍｌに再懸濁して、その後ボルテックスで攪拌した。ｇ）懸濁液を１５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスＣｌおよび８Ｍ尿素、ｐＨ８．０から成る変性緩衝液（負荷緩衝液）１０ｍｌに溶解した。ｈ）５０％Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂懸濁液（Ｑｉａｇｅｎ）２．５ｍｌを、ペプチドを含む溶液に添加し、混合物を軌道攪拌器において周囲温度で３０分間攪拌した。その後、樹脂懸濁液を空のカラムに負荷し、２容の負荷緩衝液で洗浄した。ｉ）保持されたポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する、０．１５ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ１０．５を含む溶液で溶出し、使用するときまで−３０℃で凍結保存した。
【実施例６】
【００８１】
ｐＴＡＲＧＥＴベクターへの配列番号１７のアニサキス・シンプレックスｃＤＮＡ配列のフラグメントのサブクローニングおよびコンピテントＪＭ１０９細胞の形質転換
もう１つの好ましい実施形態では、配列番号１８によって表わされるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする、配列番号１のヌクレオチド１３０６−２１３９の位置に対応する８３４アミノ酸の内部フラグメント（配列番号１７）をｐＴＡＲＧＥＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。そのために、配列番号１７を、正プライマー（５’配列番号２５ ３’）と逆プライマー（５’配列番号２６ ３’）のセットを使用し、実施例３の形質転換ｐＱＥ−３１ベクターを鋳型として用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。９４℃で５分間の変性サイクルとそれに続く（９４℃で４５秒間の変性、５５℃で４５秒間のハイブリダイゼーション、および７２℃で１．５分間の伸長）の３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終伸長サイクル。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析し、その後ｐＴＡＲＧＥＴベクターにクローニングした。ｐＴＡＲＧＥＴとアニサキス挿入物の連結、およびコンピテントＪＭ１０９細胞の形質転換を、製品の使用指示書に記載されているように実施した。陽性ＪＭ１０９形質転換体を、製造者によって記述されているように、アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌを添加したＬＢ寒天プレートを用いて白色コロニー選択によって選択した。
【００８２】
記述した実験条件下で、ｐＴＡＲＧＥＴベクターへの配列番号１７に対応するｃＤＮＡ配列のフラグメントのサブクローニングは、配列番号１７のアニサキスポリペプチド、および配列番号１７のカルボキシル末端部分に位置する４アミノ酸の付加的な配列（配列番号２４）を含む、配列番号６の２８２アミノ酸の配列をコードする８４６ヌクレオチドのプラスミドＯＲＦ（配列番号５）を導いた。
【実施例７】
【００８３】
ＪＭ１０９細胞の組換えプラスミドＤＮＡの単離およびプラスミドＤＮＡによるマウスのワクチン接種
ＪＭ１０９細胞の陽性コロニーをＬＢブロス−アンピシリン中で増殖させ、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して、沈降物を、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出するために使用した。合計５０μｌ（１μｇ／μｌの濃度）の内毒素不含プラスミドＤＮＡを、１０〜２０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの２本の脚の四頭筋に接種した。接種は、Ｌｅｉｒｏら（２００２）によって述べられているようにインスリン注射器を使用して実施した。
【実施例８】
【００８４】
感染患者の血清中の抗アニサキス抗体の測定のための免疫検定法
本発明における免疫検定法は、動物被験者または種からの何らかの生体液中の抗アニサキス抗体の存在を検出することができる任意の免疫検定法であって良い。
【００８５】
免疫検定法の種類の例は、液相および固相免疫検定法、および直接または間接形式の競合および非競合免疫検定法を含む。
【００８６】
典型的には、血清または血漿のような生体液中の抗アニサキス抗体のレベルの測定は、この実施例において述べるＥＬＩＳＡ法のような、ＥＬＩＳＡ法を用いて実施し得る。
【００８７】
ａ）血清試料
この実施例のＥＬＩＳＡ法において使用する血清試料は、非感染被験者（健常供血者）およびアニサキス・シンプレックス寄生虫に感染した被験者から得た。血清は、最近生魚を食したことがあり、内視鏡検査によって寄生生物の存在が確認された被験者から得たものであるとき、陽性とみなした。
【００８８】
ｂ）Ｏ−脱グリコシル化抗原およびＵＡ３モノクローナル抗体による捕捉ＥＬＩＳＡ
固定化ＵＡ３モノクローナル抗体によるアニサキス種の特異的Ｏ−脱グリコシル化抗原の捕捉に基づく、捕捉ＥＬＩＳＡ法（ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）を述べる。
【００８９】
この免疫検定法において使用するＯ−脱グリコシル化抗原は、上述したように入手されたものであり、５０℃で１６時間の０．０２ｍＭ ＮａＯＨによるアニサキスの無傷抗原の処理、およびＨＣｌによるｐＨの付加的な中和に基づく。
【００９０】
捕捉ＥＬＩＳＡを実施するため、以下の工程を行った。ａ）精製ＵＡ３モノクローナル抗体（１００μｌ／ウエル、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度）を一晩結合した。ｂ）吸引後、ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した。ｃ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＴＭ）を使用してＥＬＩＳＡウエルを３７℃で１時間ブロックした。ｄ）吸引後、非希釈ヒト血清１００μｌを使用して３７℃で１時間半インキュベートした。ｅ）０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｆ）１：２，５００希釈のＦＩＴＣ標識ヒト抗ＩｇＥモノクローナル抗体（Ｉｎｇｅｎａｓａ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ。ＦＩＴＣによる標識は、ＬｉｄｄｅｌとＣｒｙｅｒ、１９９１によって述べられた方法に従って実施した）１００μｌを使用してインキュベートした。ｇ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｈ）吸引に加え、１：１，５００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）１００μｌでインキュベートした。ｉ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｊ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｋ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【００９１】
ｃ）形質転換Ｍ１５細胞において発現されたアニサキスの組換えポリペプチドに関する間接ＥＬＩＳＡ
好ましい実施形態では、アニサキスに感染した被験者の血清中の抗アニサキス抗体を測定するために、配列番号４の組換えポリペプチドを使用して間接ＥＬＩＳＡを実施した。
【００９２】
この実施例では、ヒト血清試料中のＩｇＥ抗体の測定のためのＥＬＩＳＡ法を述べるが、他のクラス（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）およびサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）の抗体も、二次抗ヒト抗体の特異性を変えることによって測定し得る。同様に、この免疫検定法はまた、適切な二次抗種抗体を選択することにより、他の動物種（たとえば他の哺乳動物、鳥類または魚類）の生体液中の抗体の測定のためにも適合させ得る。
【００９３】
好ましい実施形態では、この実施例の間接ＥＬＩＳＡ（ｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）を実施するための方法を以下の工程に従って行った。ａ）０．１ＭトリスＣｌ、ｐＨ１０．５中の配列番号４のアニサキスの組換え抗原とＥＬＩＳＡプレートとを結合した。ｂ）吸引後、ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した。ｃ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックした。ｄ）吸引後、非希釈ヒト血清１００μｌを使用してプレートを３７℃で１時間半インキュベートした。ｅ）０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｆ）１：２，５００希釈のＦＩＴＣ標識ヒト抗ＩｇＥモノクローナル抗体（Ｉｎｇｅｎａｓａ、ＬｉｄｄｅｌとＣｒｙｅｒ、１９９１によって述べられた方法に従ってＦＩＴＣで標識した）１００μｌでインキュベートした。ｇ）吸引後、２００μｌ／ウエルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｈ）吸引後、１：１，５００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ）１００μｌでインキュベートした。ｉ）吸引後、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｊ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｋ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【００９４】
以下の表Ｉは、本発明の実施例８で述べる捕捉ＥＬＩＳＡ（ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）法および間接ＥＬＩＳＡ（ｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）法によって検定した、アニサキス・シンプレックス線虫に感染した患者からの２２の陽性血清試料について得たＩｇＥ値の比較を示す。表は、各々血清について４９２ｎｍで測定した平均吸光度値を示す。ＩｇＥの定量のためのカットオフ値は、ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法についてはＯＤ＝０．１０５およびｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法についてはＯＤ＝０．０４９であった。試料２はｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法に関してのみ陽性であったことに留意されたい。これらの結果は、ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法（９５．４５％の感受性）およびｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法（１００％の感受性）の両方が、アニサキス種によるヒト感染の血清学的診断のための有効な方法であることを示す。
【表Ｉ】
【実施例９】
【００９５】
配列番号６のポリペプチドをコードする組換えｐＴＡＲＧＥＴベクターでトランスフェクトしたマウスにおける抗体の産生
この実施例では、配列番号６のポリペプチドをコードする組換えｐＴＡＲＧＥＴベクターでトランスフェクトしたマウスから麻酔下で血液を採取し（実施例７参照）、ＥＬＩＳＡプレートに固定化した配列番号４のポリペプチドで反応性ＩｇＧ１抗体の存在を判定するため、得られた血清を間接ＥＬＩＳＡにおいて検定した。ＥＬＩＳＡ法は、二次抗ヒト試薬の代わりにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ、１：３，０００希釈）を使用したことを除き、実施例８ｂで述べたのと同じであった。
【００９６】
以下の表ＩＩは、配列番号６のポリペプチドをコードするアニサキス・シンプレックスのＤＮＡ挿入物を含む組換えｐＴＡＲＧＥＴプラスミド１００μｇ／マウスによるワクチン接種（非経口経路）後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて得られたＩｇＧ１抗体の反応を示す。免疫の１ヵ月後にマウスからの血液採取を実施した。表は、４９２ｎｍで測定した（３回の独立した測定）、各々の血清についての平均吸光度値±ＳＤを示す。
【００９７】
これらの結果は、アニサキスのＤＮＡ配列（この実験では本発明の配列番号６によって示される）を含む組換えＤＮＡワクチンが抗アニサキス抗体のインビボ誘導のために有用であり得ることを示す。ワクチンによる抗体のインビボ誘導は、ａ）病原菌に対する免疫防御の誘導、およびｂ）アレルギー反応の予防のために興味深い。
【表ＩＩ】
【実施例１０】
【００９８】
本発明のアニサキス・シンプレックスの組換えペプチドおよびポリペプチドの標識と適用
検出可能な生体分子または化学分子による本発明のペプチドおよびポリペプチドの標識は、インビボおよびインビトロ診断および実験研究などの目的のために有用である。当業者に公知の様々な標識および方法がある（たとえばＫｅｓｓｌｅｒ（編集）．Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９９２）、Ｗａｌｋｅｒ（編集）．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９６））。
【００９９】
本発明において使用し得る標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物および、コロイド状金およびラテックス粒子などの呈色粒子を含む発色物質を包含する。
【０１００】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉまたは１３１Ｉで放射性標識されるが、これらに限定されない。標識ペプチドは、シンチレーション計数、ガンマ線スペクトロメトリーまたはオートラジオグラフィーなどの方法によって検出し得る。
【０１０１】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ホタルルシフェリンで標識し得る。生物発光化合物は従来の方法によって選択ペプチドまたはポリペプチドに共有結合でき、標識ペプチドまたはポリペプチドは、酵素、たとえばルシフェラーゼが、生物発光分子に光量子を放出させるＡＴＰとの反応を触媒するとき、検出され得る。
【０１０２】
蛍光物質も標識として広く使用される。蛍光物質の例は、フルオレセインおよび誘導体、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、フィコシアニンその他を含む。一般に、蛍光物質分子は蛍光検出器によって検出される。
【０１０３】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチド（たとえば配列番号４のポリペプチド）はビオチンで標識され、アビジンまたはストレプトアビジンのような特異的ビオチンリガンドによって液体支持体中で捕捉され得る。ひとたび標識ポリペプチドが固体支持体（たとえばＥＬＩＳＡプレートのウエル）上に固定化されれば、本発明の実施例８ｂで述べたような典型的インキュベーションおよび洗浄工程を実施することにより、選択ポリペプチドに対する抗体を検出するために使用し得る。
【０１０４】
代替法として、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、酵素（たとえばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および適切な基質の添加後に発色または発蛍光反応を与える他の酵素）で標識し得る。選択酵素で標識されたペプチドおよびポリペプチドは、たとえば、捕捉ＥＬＩＳＡ法において前記ペプチドまたはポリペプチドを認識する特異的抗体を検出するために使用でき、前記捕捉ＥＬＩＳＡ法では、検出する抗体を、固体支持体に固定化されたもう１つ別の抗体によってまず捕捉し、標識ペプチドまたはポリペプチドおよび適切な基質を、抗体−ポリペプチド結合が形成されたことを示すために使用する。
【０１０５】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドは、当業者に周知の方法に従って、側方流免疫クロマトグラフィー検定法において使用されるコロイド状金で標識し得る。たとえば様々な大きさの金粒子を生産する方法およびタンパク質と金の結合のための方法は、Ｄｙｋｓｔｒａ（編集）．Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に述べられている。
【０１０６】
さらに、もう１つの好ましい実施形態では、標識分子は磁性マイクロ粒子であり得、固定化系は磁石であり得る。
【実施例１１】
【０１０７】
本発明のアニサキス・シンプレックス核酸分子の標識と適用
標識核酸分子は、サザントランスファー法、ノーザントランスファー法、スロットブロット法およびドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）およびマイクロアレイなどの特異的ハイブリダイゼーション法によって複雑な核酸混合物中の相補的標的配列を検出するためのプローブとして使用し得る。核酸分子を標識する方法は当分野の技術水準において周知であり、放射性物質、蛍光呈色物質、化学発光物質、マイクロ粒子、酵素、比色標識（たとえば呈色剤、コロイド状金など）、磁気標識およびハプテン（たとえばビオチン、ジオキシゲニン（ＤＩＧ）および抗血清またはモノクローナル抗体が使用可能であるその他のものを含むが、これらに限定されない、種々の標識物質を使用して実施し得る。
【０１０８】
本発明の標識プローブは、たとえばヒトおよび／または動物感染組織中のアニサキス種ＤＮＡを検出および研究するための診断ツールとして使用し得る。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明の選択核酸配列は、ＤＩＧ標識ヌクレオチド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＰＣＲ増幅によってＤＩＧで標識し得る。
【０１１０】
一例として、配列番号１のヌクレオチド１４９０−１９７１の位置に対応する、選択ＤＩＧ標識ヌクレオチド配列プローブ（４８２塩基対）は、実施例３の形質転換ｐＱＥ−３１ベクターを鋳型として使用し、正プライマー（５’配列番号２７ ３’）と逆プライマー（５’配列番号２８ ３’）のセットを用いて入手し得る。感染したヒトまたは動物の生検から得た、分析しようとする組織試料を、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、その後ＩＳＨ法および上記ＤＩＧ標識プローブを使用してアニサキス種ＤＮＡの存在を検出するために分析し得る。この実施例のＩＳＨを実施する方法の詳細な説明は、参照としてこの文書に組み込まれる、Ｌｅｉｒｏら（２００１）によって提供されている。
【実施例１２】
【０１１１】
アニサキス・シンプレックスペプチドおよび本発明のポリペプチドへのモノクローナル抗体ＵＳ３の結合を阻害する合成ペプチド配列の分析
本発明の１つの態様では、モノクローナル抗体ＵＡ３によって認識されるペプチド配列について述べる。前記ペプチド配列は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））の、ＲＡＤＡＲプログラム、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｒａｄａｒ／を使用して配列番号２のアミノ酸配列を分析することにより、アミノ酸の「反復配列」として認識された。選択された１２のアミノ酸の配列をこれらの「反復配列」から化学合成し、ＥＬＩＳＡプレートのウエルに固定化した配列番号４の組換えポリペプチドへのＵＡ３モノクローナル抗体の結合の阻害に関して競合ＥＬＩＳＡにおいて検定した。
【０１１２】
アミノ酸配列番号７−１１に対応するペプチドの阻害活性を、以下の典型的工程に従って捕捉ＥＬＩＳＡにおいて検定した。ａ）ＥＬＩＳＡプレートのウエルに配列番号４のポリペプチドを一晩結合した。ｂ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックした。ｃ）吸引後、検定対象の阻害性ペプチドでプレインキュベートした適切な希釈のＭＡｂ ＵＡ３ １００μｌを使用して３７℃で２時間インキュベートした。ｄ）０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｅ）１：３，０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１００μｌでインキュベートした。ｆ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｇ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｈ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｉ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【０１１３】
以下の表ＩＩＩは、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された配列番号４のポリペプチドにモノクローナル抗体ＵＡ３を結合した場合に配列番号７−１１の合成ペプチド（３つの濃度で検定）について得られた阻害値を示す。結果は、対照（阻害なし）に対する各々のペプチド希釈液の阻害率として表わした。ＮＤ：実施せず。認められた結果から推定されるように、モノクローナル抗体ＵＡ３は、１個のアミノ酸だけが異なる配列番号７および８のペプチドに対して選択性を有する。
【表ＩＩＩ】
【実施例１３】
【０１１４】
感染患者の血清中に存在する抗アニサキスＩｇＥ抗体についての標的としての配列番号７−１１の合成アミノ酸配列の重要性
もう１つの好ましい実施形態では、配列番号４のポリペプチドへのヒト抗アニサキス抗体の結合に対するアミノ酸配列（配列番号７−１１）の阻害活性を以下のように間接競合ＥＬＩＳＡにおいて検定した。ａ）ＥＬＩＳＡプレートのウエルに配列番号４のポリペプチドを一晩結合した。ｂ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックした。ｃ）吸引後、１：１希釈の対応する患者の血清１００μｌおよびＴＢＳ中のペプチド溶液（１．５×１０−３Ｍ、上記ペプチドの各々についての最終濃度）を使用して３７℃で２時間インキュベートした。ｄ）０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｅ）１：２，５００希釈のＦＩＴＣ標識ヒト抗ＩｇＥモノクローナル抗体１００μｌでインキュベートした。ｆ）吸引後、２００μｌ／ウエルのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｇ）吸引後、１：１，５００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ）１００μｌでインキュベートした。ｈ）吸引後、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｉ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｊ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【０１１５】
以下の表ＩＶは、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された配列番号４のポリペプチドに、５名の感染患者の血清中に存在するＩｇＥ抗体を結合した場合の、配列番号７−１１に対応する合成ペプチドの混合物の阻害活性を示す。ペプチド混合物は、各ペプチドについて１．５×１０−３Ｍの最終濃度で検定した。結果は、（同じ最終濃度の無関係なペプチドの混合物で阻害された）対照に対する各々のペプチド混合物の阻害率として表わした。表に認められるように、検定した配列は、感染患者の血清中に存在するすべての抗アニサキスＩｇＥ抗体の２５〜７４％の範囲に関して標的であった。しかし、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸、または前記配列の反復配列を含む他の組換えまたは合成ペプチドおよびポリペプチドもおそらく、感染患者の血清中に存在するいくつかのアイソタイプの抗アニサキス抗体によって認識され得る。
【表ＩＶ】
【実施例１４】
【０１１６】
生体組織中のアニサキス幼虫の抗原の特性決定
好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物（たとえばウサギ、ヒツジ、ヤギ、マウスまたはラットなど）を免疫するために使用して良く、得られる特異的ポリクローナル抗体は、ヒトまたは動物の感染組織中のアニサキス幼虫の存在を示すために使用して良い。典型的には、寄生生物を含む組織中のアニサキスの抗原を明らかにするための手順は、以下の一般的工程に従って従来の免疫組織化学的方法によって実施し得る。ａ）パラフィン中に包埋された組織切片を含むスライドガラスの調製、ｂ）ＴＢＳ−ＴＭまたは他の何らかのブロッキング試薬による組織のブロッキング、ｃ）洗浄工程、ｄ）抗アニサキスポリクローナル抗体とのインキュベーション、ｅ）洗浄工程、ｆ）免疫のために使用された動物種のＩｇＧ抗体を認識する標識二次抗体とのインキュベーション（この実施例では、好ましい標識分子はペルオキシダーゼ酵素であるが、本発明の実施例１０で特定される標識など、他の任意の標識を使用して二次抗体を標識して良い）、ｇ）洗浄工程、ｈ）適切な酵素基質（たとえばＨ２Ｏ２±ＤＡＢなど）とのインキュベーション、ｉ）顕微鏡観察。
【０１１７】
もう１つの好ましい実施形態では、ヒトまたは動物の感染組織中の、本発明のアミノ酸配列を含むアニサキス種タンパク質の存在は、従来の免疫組織化学的方法により、モノクローナル抗体ＵＡ３を一次抗体として使用して明らかにし得る。
【実施例１５】
【０１１８】
本発明のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用した、食品抽出物中のアニサキスの抗原の存在の検出
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対して得られるＭＡｂ（たとえばＭＡｂ ＵＡ３）およびポリクローナル抗体は、その組成物中に魚を含む食品抽出物においてアニサキスの抗原の存在を検出することを目的とした捕捉ＥＬＩＳＡ法を設計するために使用し得る。
【０１１９】
さらに一層好ましい実施形態では、食品抽出物におけるアニサキスの抗原の測定のための捕捉ＥＬＩＳＡ法は、以下の工程に従って実施し得る。ａ）抗アニサキスポリクローナル抗体（１００μｌ／ウエル。１０μｇ／ｍｌの抗体濃度）を一晩結合する。ｂ）吸引後、ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄する。ｃ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックする。ｄ）吸引後、対応する食品抽出物１００μｌを使用して４℃で一晩インキュベートおよび軌道攪拌する（ＰＢＳ中の試料を均質化した後に３，０００ｇで３０分間遠心分離して得られた上清）。ｅ）０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄する。ｆ）１：２，５００希釈のビオチン標識ＵＡ３モノクローナル抗体（標識は、Ｗｌｋｅｒ（１９９６）の参考文献に述べられているように実施した）１００μｌでインキュベートする。ｇ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ｈ）吸引に加え、１：１，５００のアビジン−ペルオキシダーゼ希釈液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）１００μｌでインキュベートする。ｉ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。ｊ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベーションする。ｋ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取る。
【０１２０】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニサキス属の種によるヒトおよび動物感染の診断、予防および治療の分野に関する。本発明はまた、食品中のアニサキスの抗原の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
アニサキス属（Ａｎｉｓａｋｉｓ）（アニサキス科（Ａｎｉｓａｋｉｄａｅ））は、いくつかの関連種に属する線虫寄生生物を含む。形態学的および遺伝／分子マーカーを使用して、現在アニサキスの８つの種が認識されており、それらは、ａ）姉妹種である、「狭義の（ｓｔｒｉｃｔｕ ｓｅｎｓｕ）」アニサキス・シンプレックス（Ａｎｉｓａｋｉｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）（Ｒｕｄｏｌｐｈｉ、１８０９）、Ａ．ペグレッフィ（Ａ．ｐｅｇｒｅｆｆｉ）（Ｃａｍｐａｎａ−ＲｏｕｇｅｔおよびＢｉｏｃｃａ、１９５５）および以前はＡ．シンプレックス複合体に含まれたＡ．シンプレックスＣ（Ｎａｓｃｅｔｔｉら、１９８６、Ｍａｔｔｉｕｃｃｉら、２００２）、Ａ．ティピカ（Ａ．ｔｙｐｉｃａ）（Ｄｉｅｓｈｉｎｇ、１８６０）、ｃ）Ａ．フィセテリス（Ａ．ｐｈｙｓｅｔｅｒｉｓ）（Ｂａｙｌｉｓ、１９２３）、ｄ）Ａ．ブレビスピキュラタ（Ａ．ｂｒｅｖｉｓｐｉｃｕｌａｔａ）（Ｄｏｌｌｆｕｓ、１９６６）、ｅ）Ａ．ジフィダラム（Ａ．ｚｉｐｈｉｄａｒｕｍ）（Ｐａｇｇｉら、１９９８）、およびｆ）Ａ．パギアエ（Ａ．ｐａｇｇｉａｅ）（Ｍａｔｔｉｕｃｃｉら、２００５）を含む。
【０００３】
アニサキス種は、鯨類の胃の中、あるいは頻度は低いが鰭脚類の中で性的成熟に達する。これらの哺乳動物は、ａ）寄生生物の第三幼虫期（Ｌ３）の宿主となる待機宿主、すなわち魚類（主として硬骨魚）および頭足動物（主としてイカ）の摂取によって、およびｂ）中間宿主として、同じくＬ３幼虫の宿主となるオキアミの摂取によって感染し得る（たとえば鯨）。
【０００４】
海洋哺乳動物の場合と同様に、ヒトも、寄生生物を保有する生魚およびイカの摂取によってＬ３アニサキス幼虫に感染することがあり、これはアニサキス症（ａｎｉｓａｋｉｏｓｉｓまたはａｎｉｓａｋｉａｓｉｓ）と呼ばれる臨床疾患を引き起こす。いくつかの魚料理は、アニサキス種による感染の危険度が高いとみなされることが多い。これらは、日本の寿司および刺身、ドイツのソテーまたはスモークしたニシン、スカンジナビアのグラブラクス、ハワイのロミロミ、南アメリカのセビチェおよびスペインの塩漬けアンチョビを含む。
【０００５】
Ｌ３アニサキス幼虫がヒトに感染すると、胃腸症状を引き起こすことが多く、この症状は様々な重症度のアレルギー反応に結びつくことがある。幼虫の位置および主要症状に応じて、アニサキス症の主たる４つの臨床形態（胃／胃アレルギー、腸、胃腸管外およびアレルギー）がヒトにおいて発現する。胃（急性）形態のアニサキス症では、幼虫が胃壁に侵入し、生Ｌ３アニサキス幼虫を含む魚を摂取してから数時間後に、急性上腹部痛、吐気、および嘔吐を特徴とする臨床経過が認められることが多い。そして、内視鏡検査から、しばしば侵入部位の点状出血、溢血点およびびらんから成る病変が明らかになることが多い。さらに、アレルギー症状（すなわち蕁麻疹／血管性浮腫および時としてアナフィラキシー）も症例の約１０％において認められる。胃感染とアレルギー症状の併発は「胃アレルギー性アニサキス症」と呼ばれていた（Ｄａｓｃｈｎｅｒら、２０００）。一部の患者は亜急性または慢性形態を発症することがあり、その臨床症状発現は、上腹部痛、消化不良、嘔吐、および食欲不振を含み、それらは数ヶ月間、場合によっては数年間持続することもある。
【０００６】
腸形態のアニサキス症の場合には、幼虫が回腸末端のレベルで腸壁に侵入することが多い。急性症例の場合には、腹痛がしばしば認められ（通常は汚染された魚の摂取から２４〜４８時間後）、吐気、嘔吐、腹部腫脹、硬化、および便秘や下痢を伴う腸リズムの逸脱を伴う。感染組織の顕微鏡所見は、腸アニサキス症の症例では、強度の局所浮腫、点状出血、充血、および漿膜と腸間膜のびまん性炎症を特徴とする蜂巣炎性病変を明らかにする。これらの病変は、腸の近位閉塞と拡張を引き起こし得る。相当数の患者において、高い含量の好酸球を有する腹水が認められる。亜急性または慢性腸アニサキス症の場合には、幼虫によって誘導される肉芽腫性の変化が、壁の肥厚、管腔狭窄および慢性腹部症状を招く。
【０００７】
胃腸管外または異所性形態では、感染性アニサキス幼虫が胃腸壁を越え、腹腔に達して、肺、膵臓、肝臓等の器官および組織へと移動する。これらの症例の臨床症状は、幼虫の局所位置に依存する。
【０００８】
アレルギー性アニサキス症の形態は、アニサキス幼虫による感染後にアレルギー反応を有しつつも胃や腸には症状がない患者に限られる。最初の症状は非常に早く、汚染された魚を摂取してから最初の数時間のうちに発現し、臨床経過はＩ型アレルギー反応について一般的なパターンをたどることが多い。重症度は、単純な蕁麻疹または血管性浮腫からアナフィラキシーショックまでにわたる。
【０００９】
アニサキス幼虫が胃、十二指腸、または結腸内に存在するとき、感染を明らかにするための好ましい方法は内視鏡検査である。この手法は、内視鏡に結合された鋏によって幼虫を除去するためにも有用であり、患者の治癒を導く。しかし、ａ）幼虫が内視鏡検査によってアクセスできない、ｂ）幼虫が部分的に破壊されているかまたは内視鏡医に見えない、またはｃ）主要症状がアレルギーであるときには、感染を確認するための好ましい方法は、患者の血清中の特異抗体の存在を明らかにすることである。後者はまた、無症候性被験者においてアニサキスによる以前の感染を明らかにするためにも好ましい方法である。
【００１０】
感染の間に産生されるアニサキスの抗原に対する種々のクラスの抗体の中では、ＩｇＥ抗体が最も関連性がある。なぜなら、１）それらはアニサキスによる感染の間に認められるＩ型アレルギー反応に関与し、および２）感染患者の血清中に存在するものの中で特異性の見地から最も適切なクラスの免疫グロブリンであるためである。
【００１１】
アニサキス幼虫によるヒト感染の最初の症例記述（Ｖａｎ Ｔｈｉｅｌ、１９６０）以来、種々のクラスの抗アニサキス抗体を検出するための高精度な血清学的検定法を開発するべく数多くの試みがなされてきた。
【００１２】
血清中の抗アニサキス抗体を測定することを目的とした最初の方法には、ラテックス凝集法（ＡｋａｏとＹｏｓｈｈｉｍｕｒａ、１９８９）、二重免疫拡散法および免疫電気泳動（Ｐｅｔｉｔｈｏｒｙら、１９８６、Ｔｓｕｊｉ、１９９０）、間接赤血球凝集反応（Ａｓａｉｓｈｉら、１９８９、Ｔｓｕｊｉ、１９８９）、および補体固定検定法（Ｏｓｈｉｍａ、１９７２、Ｔｓｕｊｉ、１９８９）が含まれた。これらの方法はすべて、ａ）十分な具体性と特異性を欠き、およびｂ）これらの手法を使用してＩｇＥ抗体（レアギン）を測定することができない、という２つの主要な難点を有していた。
【００１３】
最近になって、放射性アレルギー吸着試験（Ｄｅｓｏｗｉｔｚら、１９８５、Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９０）、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｒｏｄｅｒｏら、２００２）、蛍光酵素免疫検定法（ＵｎｉＣａｐ ＦＥＩＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）および免疫移動法（Ｄｅｌ Ｐｏｚｏら、１９９６、Ｇａｒｃｉａら、１９９７）といった他の免疫検定法の実施によって感染患者の血清中の抗アニサキスＩｇＥの測定が行われたが、精度および／または特異性の問題がこれらの方法に関しても発生した。
【００１４】
ヒトアニサキス症を診断するための有用な血清学的方法の開発における主な問題は、一方では、（ｉ）すべての感染患者の血清中に存在するＩｇＥ抗体によって認識され、かつ（ｉｉ）全分子（すなわち選択されたアレルゲン中に存在するすべてのエピトープ）がアニサキス属に特異的である寄生虫抗原（我々の場合はアレルゲン）を入手することにある。さもなければ、低い精度しか得られないか、および／または擬陽性を導く交差反応性が起こる。
【００１５】
インビトロで培養されたアニサキス種幼虫の完全な天然排出／分泌抗原（ＥＳＡ）を使用して（Ｐｏｇｇｅｎｓｅｅら、１９８９、Ｂａｅｚａら、２００４）、またはＬ３アニサキス幼虫の粗抽出物から特異的標的抗原を捕捉するモノクローナル抗体を使用して（Ｙａｇｉｈａｓｈｉら、１９９０、ＵｂｅｉｒａおよびＩｇｌｅｓｉａｓ、２０００）、ヒトアニサキス症の血清学的診断を改善するための試みが為された。しかし、これらの戦略に基づくＥＬＩＳＡ法もまた、ＥＳＡを含む、アニサキスの糖タンパク質中に存在する交差反応性エピトープ（主としてＯ−およびＮ−グリカン）の存在ゆえに十分な特異性を有していなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、それらが由来するアニサキスの天然分子の抗原性を保持するペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質配列、ならびに前記配列をコードする核酸、および前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対する特異的抗体またはそのフラグメントを提供する。開示されるペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、ならびに前記ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に対する特異的抗体またはそのフラグメントは、ヒトおよび動物アニサキス症の血清学的診断のための免疫検定法を開発するために有用であり、上述した方法の難点を有さない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
それ故、本発明の第１の態様は、以下の群：
ａ．配列番号１を含む核酸、
ｂ．配列番号１の相補的核酸を含む核酸、
ｃ．配列番号１５または１７を含む配列番号１の核酸のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｆ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｇ．（ａ）〜（ｆ）の項で述べた核酸配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列
から選択される単離核酸配列（以下、本発明の核酸配列と称する）を提供する。本発明の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ａ）〜（ｆ）の項で前述した核酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有し、さらに一層好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド配列は、（ａ）〜（ｆ）の項で前述した核酸配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１８】
本発明の第２の態様は、以下の群：
ａ．配列番号２を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号１６または１８を含む配列番号２のフラグメント、
ｃ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｆ．この項目の（ａ）〜（ｅ）の項で述べたアミノ酸配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択される、単離ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質（以下、本発明のアミノ酸配列と称する）を提供する。本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸配列は、この項目の（ａ）〜（ｅ）の項で前述したアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有し、さらに一層好ましい実施形態では、前記アミノ酸配列は、この項目の（ａ）〜（ｅ）の項で前述したアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１９】
これらのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質はすべて、アニサキスに感染したすべての患者の血清中に存在するＩｇＥ分子によって認識されるアニサキス属寄生虫の特異的抗原を提供することにより、ヒトアニサキス症を診断するための有用な血清学的方法を開発する上での主要な問題を克服するために使用され得る。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、抗アニサキス抗体によって認識され得るアミノ酸配列に関し、前記アミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列：
ａ．配列番号７を含むアミノ酸配列、
ｂ．配列番号８を含むアミノ酸配列、
ｃ．配列番号９を含むアミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０を含むアミノ酸配列、
ｅ．配列番号１１を含むアミノ酸配列、
ｆ．配列番号１２を含むアミノ酸配列、
ｇ．配列番号１３を含むアミノ酸配列、
ｈ．配列番号１４を含むアミノ酸配列
から選択される、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸を有し、かつ配列番号２にいずれかのフラグメントと少なくとも７０％の同一性を有するフラグメントを含む。
【００２１】
第３の態様では、本発明のアミノ酸配列は、以下の手法：
ａ．組換え手法
ｂ．化学合成
ｃ．アニサキス科の線虫の実質的精製
を含むが、これらに限定されない手法のいずれかによって作製される。
【００２２】
本発明の第４の態様は、本発明のアミノ酸配列の２つ以上を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する。
【００２３】
本発明の第５の態様は、本発明のアミノ酸配列の１つ以上をコードする核酸配列を含む合成または組換え核酸分子に関する。
【００２４】
本発明の第６の態様は、シグナル分子で標識された、本発明の単離核酸またはアミノ酸配列に関する。本発明の好ましい実施形態では、前記標識分子は、以下の群：
ａ．放射性
ｂ．酵素
ｃ．蛍光性
ｄ．発光性
ｅ．化学発光性
ｆ．呈色性
を含むが、これらに限定されないシグナル分子のいずれかから選択される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、標識分子は、以下の群：
ａ．ビオチンまたはその誘導体
ｂ．ニトロフェノール誘導体
ｃ．コロイド状金
ｄ．ラテックス
ｅ．フルオレセイン
を含むが、これらに限定されないシグナル分子のいずれかから選択される。
【００２６】
本発明の第７の態様は、本発明のアミノ酸配列のいずれかと相互作用することができる抗体またはそのフラグメント（以下本発明の抗体と称する）に関する。本発明の抗体のいずれかをコードすることができる核酸配列も本発明の一部である。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の前記抗体は、２００６年６月１５日にドイツ微生物および培養細胞保存機関（Ｇｅｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ）に寄託された、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体（以下ＵＡ３抗体）である。
【００２８】
さらなる実施形態は、２００６年６月１５日にＤＳＭＺ機関に寄託された、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の抗体のいずれかの抗原認識配列、特にＵＡ３抗体の抗原認識配列に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、付加的なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に化学的に結合または連結されている、本発明の単離アミノ酸配列を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現系（以下本発明の発現系と称する）に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明の核酸配列でもしくは本発明の発現ベクターまたは発現系で形質転換またはトランスフェクトされた単離原核または真核宿主細胞（以下本発明の宿主細胞と称する）を提供する。
【００３３】
本発明の第８の態様は、本発明の核酸配列によってコードされる組換えペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生産する方法に関し、前記方法は、前記ヌクレオチドが発現され、生産される条件下で本発明の宿主細胞を培養し、その後前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を単離することを含む。
【００３４】
本発明の第９の態様は、
ａ．生物学的試料を、本発明のアミノ酸配列と、前記ポリペプチドと試料中の抗体との間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、単離された生物学的試料、好ましくは血清中のアニサキス種に対する抗体を検出するインビトロ法に関する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、インビトロ法は、免疫検定法または酵素免疫検定法である。
【００３６】
本発明の第１０の態様は、
ａ．生物学的試料または食品抽出物を、本発明の抗体と、前記抗体と試料中の抗原の間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、試料、好ましくは生物学的試料、または食品抽出物中のアニサキス種の抗原を検出するインビトロ法に関する。
【００３７】
好ましい実施形態では、インビトロ試料中のアニサキス種の抗原を検出するために使用される本発明の抗体は、ＵＡ３抗体である。
【００３８】
本発明の１つの好ましい態様は、被験者を本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に曝露し、被験者の反応を観測することを含む、被験者におけるアニサキス種に対するアレルギーを診断または予後判定するインビボ法に関する。
【００３９】
アニサキス種に対する抗体を検出する本発明のインビボ法のさらに一層好ましい態様は、プリック試験を使用することである。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様は、
ａ．少なくとも１つの本発明の抗体またはそのフラグメント、および
ｂ．免疫複合体の検出手段
を含む、生物学的試料または食品抽出物中のアニサキス種の抗原を検出するのに適したキット（以下本発明のキット）である。
【００４１】
本発明の別の好ましい態様は、
ａ．少なくとも１つの本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、および
ｂ．免疫複合体の検出手段
を含む、生物学的試料、好ましくは血清中の抗アニサキス種抗体を検出するのに適したキットである。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明のキットにおいて使用される検出手段は、免疫複合体の形成を認識することができる標識二次抗体から成る。
【００４３】
さらに一層好ましい実施形態では、本発明のキットにおいて使用される検出手段は、免疫複合体の形成を認識することができる標識二次試薬である。
【００４４】
本発明の別の態様は、アニサキス種に対する何らかの型のアレルギー反応の治療のための医薬組成物を製造するための、本発明のアミノ酸配列の使用に関する。本発明の１つの好ましい実施形態は、医薬組成物それ自体に関する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書において使用される「核酸」または「核酸分子」は、ホスホジエステル架橋によって互いに結合された、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである２つ以上のサブユニットから成るヌクレオチドのポリマーを指す。「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってまたは連結、スプライシング、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用のような他の方法によって生成されるフラグメントを含む。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、糖（五炭糖）の残りの部分（ａ ｒｅｍａｉｎｄｅｒ ｏｆ ｓｕｇａｒ）、リン酸および含窒素複素環式塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位を意味する。ＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。ＲＮＡの４つの塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
【００４６】
本明細書において使用される「単離核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。前記核酸分子は、細胞のゲノムＤＮＡから分離され得るか、組換えＤＮＡ技術（たとえばＰＣＲ増幅、クローニング等）を用いて生産され得るか、または化学合成され得る。単離核酸分子は、完全な遺伝子としてまたはその遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができるその部分として、その天然ソースから得られ得る。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。
【００４７】
本明細書において使用される「プライマー」は、プライマー鋳型二本鎖を形成するように相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型とハイブリダイズし得る天然または合成オリゴヌクレオチド（好ましくは１５〜４０ヌクレオチド長の範囲である）を指す。典型的には、プライマーは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドであり、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーション後にポリメラーゼによる核酸合成のための出発点として働く。
【００４８】
本明細書において使用される「をコードするヌクレオチド配列」という表現は、特定ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を指令する核酸配列を指す。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖の配列と、タンパク質へと翻訳されるＲＮＡ配列とを含む。本発明の核酸配列は、完全長核酸配列と完全長タンパク質に由来するトランケート型配列（完全長を有さないもの）との両方を含む。それらはまた、特定宿主細胞においてコドン選択を与えるように構築され得る、天然配列と同じペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列の変異体を含む。
【００４９】
本明細書において使用される「の相補物」は、２本のポリヌクレオチド鎖の領域の間または塩基対の形成を通じた２つのヌクレオチド間の逆対応の概念を指す。その結果として、「相補的塩基の配列」は、その中のすべての塩基がもう１つ別のポリヌクレオチド鎖内の塩基の配列と塩基対を形成し得るポリヌクレオチド鎖を指す。周知のように、アデニンヌクレオチドはチミン（Ａ−Ｔ）またはウラシル（Ａ−Ｕ）と塩基対を形成することができ、シトシンヌクレオチドはグアニン（Ｃ−Ｇ）と塩基対を形成し得る。
【００５０】
本明細書において使用される「発現ベクター」は、対象とする配列または遺伝子の発現を指令することができる集合体を指す。本発明によれば、発現ベクターは、プラスミドまたはファージのような、アニサキス種の抗原を発現することができる何らかのＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターであり得る。好ましくは、本発明における発現ベクターはプラスミド（たとえばｐＱＥ３１およびｐＴＡＲＧＥＴ）である。
【００５１】
本明細書において使用される「プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡから独立した細胞中で複製することができる自律環状ＤＮＡを指し、発現型および非発現型の両方を含む。
【００５２】
本明細書において使用される「組換え」という用語は、天然または合成ＤＮＡ分子を、生細胞において複製し得るＤＮＡ分子またはその複製の結果である分子に人為的に結合することにより、生細胞の外部で作製される複合ＤＮＡ分子を指す。この文書では、「組換え」という用語はまた、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。
【００５３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つのアミノ酸のα−アミノ基と隣接アミノ酸のα−カルボキシル基の間のアミド結合によって互いに結合されたアミノ酸の直鎖状配列を表わすために、この文書では交換可能に使用される。２５のアミノ酸以下の長さを有するポリペプチドは「ペプチド」とみなされる。好ましくは、シストロンによってコードされるポリペプチドは「タンパク質」とみなされる。
【００５４】
本明細書において使用される「アミノ酸配列のフラグメント」という表現は、特定ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸配列内の隣接アミノ酸の部分を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される「単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」は、自然界においてポリペプチドと結合している脂質、炭水化物または他の不純物のような細胞夾雑物を本質的に含まないペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、従来のクロマトグラフィー手法によってその天然媒質から精製され得る。単離ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質はまた、組換え法によってまたは化学合成によっても入手され得る。典型的には、「実質的に精製されたポリペプチド」は、それが細胞、組織、または生物において天然に共存するその他のポリペプチドの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％から分離されるときに得られる。
【００５６】
本明細書において使用される「アミノ酸（単数および複数）」という用語は、すべての天然起源のＬ−α−アミノ酸またはその残りのものを指す。以下の表（表１）は、天然アミノ酸を表わすために使用される３文字表記および１文字表記（生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会によって推奨される）を示す。
【００５７】
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リシン
Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｃｙｃ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
【００５８】
本明細書において使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、マウス、ラット、海洋哺乳動物および家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）を含む、哺乳動物として分類される何らかの動物を指す。好ましくは、この文書における哺乳動物はヒトである。
【００５９】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原結合特性を有し、形質細胞によって産生されることを特徴とする、免疫グロブリンファミリーの糖タンパク質を指す。「抗体」という用語は、抗体のあらゆるクラス、たとえばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはその誘導体に属するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を含む。
【００６０】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という表現は、抗体の均一な集団を有する抗体の組成物を指す。抗体の特定ソースまたはそれらが生産される方法に限定されることは意図されておらず、細胞融合または組換え手法によって生産される抗体およびそのフラグメントを包含する。
【００６１】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫適格宿主に導入されたときに特異的抗体の産生を誘導することができる何らかの分子または物質を指す。本明細書において使用される「抗原」という用語はまた、特異的抗体によって認識され得る何らかの分子または物質を指す。典型的には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸またはこれらの分子の組合せは抗原として認識され得る。これらの抗原はまた、結合有機および無機化学基を含み得る。
【００６２】
本明細書において使用される「エピトープ」という用語は、（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体によって、または細胞の抗原特異的受容体によって認識される抗原の部分を指す。抗原がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であるとき、エピトープは、一次アミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸のフラグメントであり得るが、５またはそれ以上のアミノ酸から成る成熟折りたたみタンパク質（三次（三次元）構造）の表面の露出領域でもあり得る。典型的には、エピトープは、それらが生じさせる免疫応答の種類に基づき、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープとして分類され得る。
【００６３】
本明細書において使用される「生物学的試料」という用語は、本発明の核酸、抗体、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の１つ以上を含む生体組織または液体の何らかの試料に適用される。本発明において、「生物学的試料」という用語はまた、抗アニサキス抗体を測定するためのソースとして使用し得る生体組織または液体の何らかの試料に適用される。前記試料は、単離組織、血液、血清、血漿、脳脊髄液、腹水、滑液、唾液、尿または糞便を含むが、これらに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的検査のために採取された凍結切片のような組織切片も包含し得る。生物学的試料は、何らかの真核生物、好ましくはラット、マウス、ウサギ、海洋哺乳動物またはヒトのような哺乳動物から入手され得る。
【００６４】
本明細書において使用される「食品試料」という用語は、広範囲の食用材料から得られる何らかの試料を指す。これらの試料は、生魚、スモークされた魚および調理された魚の部分、およびその組成物中に魚材料を含有する食品を含むが、これらに限定されない。「食品試料」という用語はまた、乳児用栄養食品を含む。
【００６５】
本明細書において使用される「抗アニサキス抗体」という表現は、アニサキス属の何らかの種の抗原中に存在する少なくとも１つのエピトープを認識することができる、試料中に存在する何らかのクラスまたはサブクラスの抗体を指す。この表現は、寄生生物によるヒトおよび動物の自然感染または実験的感染の間に産生される抗体、ならびにアニサキス属の種から得られた、精製されていないかまたは実質的に精製された組換えまたは合成抗原によるヒトまたは動物の免疫後に産生されるモノクローナルおよびポリクローナル抗体を包含する。この表現はまた、組換え手法、化学合成または等価手法によって作製される抗原結合抗体およびフラグメントを含む。
【００６６】
本明細書において使用される「同一性の割合」という表現は、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列が互いに隣接して整列したとき同じ相対位置を占めるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を指す。本発明に関して、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列同一性の割合を算定するための適切な方法は、参照としてこの文書に組み込まれる、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７に公表されたＨｕａｎｇとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムを適用する、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐｅａｒｏｎのｌａｌｉｇｎプログラムである。このプログラムは、［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ］においてオンラインで処理され得る。
【００６７】
本明細書において使用される「免疫検定法」という用語は、抗原−抗体反応によって試料中の分析物を検出する方法を指す。分析物は、低分子（ハプテン）または多くの血漿タンパク質のような高分子であり得る。分析物は、抗体とリガンドの間の特異的結合によって検出され得る抗体であることが多い。本明細書において使用される「酵素免疫検定法」（ＥＩＡ）という用語は、試薬の少なくとも１つが酵素で標識されていることを特徴とする、広い範囲の免疫検定法を指す。典型的なＥＩＡは、多くの変法を有する、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を含む。免疫検定法形式の分類または詳細な説明については、ＰｒｉｃｅとＮｅｗｍａｎ（１９９７）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｒｅｎｅｃｅ ＬＴＤ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９８５）、および酵素免疫検定法の理論については、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｏｎとＰＨ ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｎｕｎｏａｓｓａｙｓ，ｆｒｏｍ ｃｏｎｃｅｐｔ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【００６８】
本明細書において使用される「医薬組成物」は、哺乳動物被験者に投与されるのに適した化学的または生物学的組成物を指す。典型的には、医薬組成物は、一定量の薬理的に有効な活性物質と医薬的に許容される担体を含む。適切な担体および医薬製剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，２０００に述べられている。医薬組成物は、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻内、舌下および同様の経路を含むが、これらに限定されない、種々の経路による投与のために特に製剤され得る。
【００６９】
本明細書において使用される「診断方法」という表現は、動物または被験者において病的状態を特定する方法を指す。前記病的状態が病原体によって生じるとき、診断は、宿主において病原体によって放出される抗原、または前記病原体によって誘導される抗体を検出することを可能にする免疫検定法（上記参照）を使用して行われ得ることが多い。本発明の診断方法は、インビトロ検定法（ＥＬＩＳＡ検定法または好塩基球ヒスタミン放出試験など）および、しばしばアレルギーを診断するために使用される、皮膚試験（たとえばプリック試験を含むが、これに限定されない）、皮内反応試験または表皮試験（たとえばパッチテスト）のようなインビボ検定法を含む。「診断方法」という表現はまた、経口、結膜、鼻、気管支等、種種の経路でアレルギー症状を引き起こすことが疑われる物質に対する耐性を調べるために、制御しながら段階的に投与することから成る、誘発試験を含む。後者の方法のより詳細な説明は、「Ｃｏｍｉｔe ｄｅ Ｒｅａｃｃｉｏｎｅｓ Ａｄｖｅｒｓａｓ ａ Ａｌｉｍｅｎｔｏｓ：Ｍｅｔｏｄｏｌｏｇｉａ ｄｉａｇｎoｓｔｉｃａ ｅｎ ｌａ ａｌｅｒｇｉａ ａ ａｌｉｍｅｎｔｏｓ”．Ａｌｅｒｇｏｌｏｇiａ ｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｃｌｉｎｉｃａ，１４：５０−５２（１９９９）、ならびに臨床アレルギー学および免疫学診療科に関する様々な手引書に見出され得る。
【００７０】
本明細書において使用される「配列反復」という表現は、所与のタンパク質または核酸分子の配列内の反復モチーフを指す。本発明のポリペプチド配列における配列反復は、ＲＡＤＡＲプログラムを使用して実施した（実施例１２参照）。
【００７１】
異なる定義がある場合を除き、この文書において使用される技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施においては、この文書の中で開示されるのと類似または等価の方法および材料が使用され得る。明細書全体および特許請求の範囲を通じて、「含む」という語およびその変形は、他の技術的特徴、付加物、成分または工程を排除することを意図しない。本発明の他の目的、利点および特徴は、明細書を検討した後当業者に明白となるかまたは本発明の実施によって学習され得る。以下の実施例は例示のために提供するものであり、本発明を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００７２】
アニサキス・シンプレックスからのｍＲＮＡの単離および発現ライブラリーの構築
Ｌ３幼虫期（Ｌ３）のアニサキス・シンプレックス幼虫をブルーホワイティング（またはプタスダラ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｓｉｓｔｉｕｓ ｐｏｕｔａｓｓｏｕ）の内臓および腹腔から手操作で抽出し、ｃＤＮＡライブラリーの構築を開始するまで液体窒素中で保存した。全メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を製造者の指示に従って使用して凍結Ｌ３アニサキス・シンプレックス１ｇから得た。
【００７３】
ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてアニサキスｃＤＮＡライブラリーを構築するために得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡ ５μｇを、製造者の指示に従って使用した。提供される指示に従い、アニサキス・シンプレックスのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを最初に二本鎖ｃＤＮＡに変換した、その後、それをλ−ＺＡＰ発現ベクターに結合し、ベクターをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩパッキング抽出物を使用して挿入した。大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を宿主として使用した。生じたライブラリーを増幅したところ、約１．３×１０１０ｐｆｕ／ｍｌおよび１％の非組換えファージを含有していた。
【００７４】
アニサキス・シンプレックスのｃＤＮＡライブラリーの探査
増幅した後、Ａ．シンプレックスのｃＤＮＡライブラリーを、ＵＡ３モノクローナル抗体を用いた免疫学的スクリーニングに供した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で提供される推奨に従って、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’宿主細胞を補足ＬＢブロス中で増殖させ、１，０００×ｇで遠心分離して、沈降物を１０ｍＭ硫酸マグネシウムに再懸濁した。組換えファージのアリコートをこの懸濁液に加え、ファージを細胞に結合させるために混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。その後、結合ファージを含む細胞懸濁液を溶融ＮＺＹ寒天（約５５℃に冷却）と混合し、この混合物を、新たに注ぎ入れたＮＺＹ寒天を含む直径１５０ｍｍのプレート上に均一に塗布した。４２℃で約３時間インキュベーショトし、ファージプラークの形成を開始させた後、あらかじめ水中の１０ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）に含浸したニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でプレートを被覆することによって組換えタンパク質の発現を誘導した。その後、プレートを３７℃で３時間半インキュベートし、吸着したファージプラークを含むニトロセルロースフィルターを慎重に取り出し、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の３％ＢＳＡにより３７℃で３０分間ブロックして、その後ＩｇＧ１／κＵＡ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ＴＢＳ中１：１０，０００希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。ニトロセルロース膜を、０．０５％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中で洗浄し、１：１０，０００のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）と共に周囲温度で２時間インキュベートした。再び１回洗浄した後、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）およびＢＣＩＰ（ｐ−トルイジン−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて免疫複合体を観察した。
【００７５】
単一クローンのインビボスプライシングおよびｃＤＮＡ塩基配列決定
無傷λＺＡＰベクターの免疫学的スクリーニングにより、ＭＡｂ ＵＡ３によって認識されるタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定した後、対応するファージプラーク（ＵＡＲ−Ｈ５クローン）を精製した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中で与えられる指示に従って、ファージを選択した陽性プレートの中央部分を微量遠心管に移し、組換えファージ粒子をＳＭ緩衝液中に放出した。その後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’宿主細胞を組換えファージおよびキットと共に供給されるＥｘＡｓｓｉｓｔ補助ファージに重複感染させることにより、λＺＡＰベクターのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドのインビボスプライシングを実施した。この手順の最後に、糸状ファージ粒子の形態で充填されて得られるスプライシングされたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを使用して、ＳＯＬＲ宿主細胞に感染させた。クローニングされた対象ＤＮＡ挿入物を有する二本鎖ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを含むトランスフェクトされたＳＯＬＲ細胞のコロニーを得、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリア−ベルタニ（ＬＢ）寒天プレートで細胞を増殖させた。個々の細菌コロニーをＬＢブロス−アンピシリン中で増殖させ、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドＤＮＡを精製した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ配列の正（５’配列番号１９ ３’）および逆（５’配列番号２０ ３’）Ｍ１３プライマーを、いくつかの内部プライマーと共に、Ｂｉｇ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したファージミドＤＮＡの自動塩基配列決定のために使用した。ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、ｔｈｅ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓからの、ＥｘＰＡＳｙソフトウエアパッケージ（ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）を使用してＥＭＢＬおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータバンクと比較した（Ｇａｔｅｉｇｅｒら、２００３）。記述されているヌクレオチド配列は、配列番号１の配列によって表わされる３，２８８ヌクレオチドの配列を含み、配列番号２によって表わされる１，０９６アミノ酸の推定アミノ酸配列をコードする。
【実施例２】
【００７６】
ｐＱＥ−３１ベクターへのアニサキス・シンプレックスのｃＤＮＡ配列（配列番号１）のフラグメントのサブクローニング
好ましい実施形態では、２７９アミノ酸のポリペプチド配列（配列番号１６）をコードする、配列番号１のヌクレオチド１３０３−２１３９の位置に対応する組換え内部ＤＮＡのフラグメント（配列番号１５）を、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｙｐｅ ＩＶキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＩＺＡＳＡ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を製造者の指示に従って用いて、ｐＱＥ−３１のマルチクローニングサイトの制限部位Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して発現ベクターｐＱＥ−３１にサブクローニングした。もう１つの類似の方法が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８）などの手引書において入手可能である。
【００７７】
クローニングの前に、配列番号１５に対応するｃＤＮＡフラグメントの配列をＰＣＲによって増幅して、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを鋳型として使用し、制限部位Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを含む正プライマー（５’配列番号２１ ３’）と逆プライマー（５’配列番号２２ ３’）のセットを用いて配列の末端を修飾した。このＰＣＲ修飾は、組換え挿入物が消化されたプラスミドに対して粘着末端を有するために、制限酵素Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩについての特異的ヌクレオチド配列を提供した。配列番号１５に対応するＤＮＡフラグメントの配列の増幅および修飾のためのＰＣＲ条件は、９４℃で４分間の変性サイクルとそれに続く（９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のハイブリダイゼーション、および７２℃で１分間の伸長）の３５サイクル、および７２℃で７分間の最終伸長サイクルを含んだ。ＰＣＲが完了した後、増幅されたアニサキスの組換えＤＮＡをＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。その後、プラスミドＤＮＡ １μｇおよび挿入するフラグメントをコードするＤＮＡ ２μｇを、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）によって推奨される緩衝液およびインキュベーション条件に従って、制限酵素Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した。最後に、消化したベクターとＤＮＡ挿入物の両方をＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、１６℃で一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してベクターと挿入物を１：３の割合で連結した。ｐＱＥ−３１のマルチクローニングサイトの部位Ｓａｌ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの間に配列番号１５のアニサキス・シンプレックス組換えＤＮＡを挿入することは、アニサキスの配列番号１６（中央部分）および２つの付加的なアミノ酸配列（尾部）：それぞれクローニングされたアニサキス配列のアミノ末端とカルボキシル末端部分に位置する、配列番号２３および配列番号２４を含む、配列番号４のアミノ酸配列をコードする９１５ヌクレオチドのプラスミドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号３）を導いた。コードされるポリペプチドのアミノ部分における６ｘヒスチジンシグナルの存在は組換えポリペプチドの精製を促進し得るが、他のベクターおよび精製方法も、都合によって使用し得る。
【実施例３】
【００７８】
組換えｐＱＥ−３１によるＭ１５細胞（ｐＲＥＰ４）の形質転換
組換えベクターｐＱＥ−３１による大腸菌のＭ１５細胞［ｐＲＥＰ４］の形質転換を、製造者（Ｑｉａｇｅｎ）の手引書（Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ：Ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ６ｘＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の中で与えられる指示に従って実施した。このプロトコルに従って、あらかじめ作製したコンピテントＭ１５細胞のアリコートを連結混合物のアリコートと共に氷中で２０分間インキュベートし、その後４２℃で９０分間インキュベートした。前記インキュベーション後、細胞をΨブロスに再懸濁し、３７℃で９０分間インキュベートした。その後、Ｍ１５細胞を、カナマイシン２５μｇ／ｍｌおよびアンピシリン１００μｇを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーを、カナマイシンとペニシリンを添加したＬＢブロス中で増殖させ、遠心分離して、沈降した細胞をグリセロール含有ＳＯＢ培地において−８０℃で保存した。
【実施例４】
【００７９】
アニサキス・シンプレックスの組換えポリペプチドの発現
実施例２の組換えアニサキスの組換えポリペプチドを生産するために、形質転換したＭ１５細胞を解凍し、０．５のＯＤ６００が達成されるまで、軌道攪拌（２００ｒｐｍ）しながら、カナマイシンおよびアンピシリンを添加したＬＢブロスにおいて３７℃で増殖させた。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによってポリペプチドの発現を誘導し、細胞を同じ攪拌条件下にて３７℃でさらに４時間インキュベートした。その後、細胞を５０００×ｇで遠心分離し、実施例５に述べられているように、発現されたポリペプチドの精製が達成されるまで、−３０℃で凍結保存した。これらの培養条件下で、Ｍ１５細胞は、封入体の形態で沈殿した配列番号４の組換えポリペプチドを生産する。
【実施例５】
【００８０】
アニサキス・シンプレックスの組換えポリペプチドの精製
好ましい実施形態では、２５０ｍｌの培養物から得た、沈降したＭ１５細胞の封入体を以下の工程に従って精製した。ａ）細菌沈降物をＢ−ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）１５ｍｌに再懸濁し、１０分間静かに攪拌した。ｂ）試料を１５，０００×ｇで遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を廃棄した。ｃ）封入体を含む沈降物を別途のＢ−ＰＥＲ １５ｍｌに再懸濁し、最終濃度２００μｇのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）を細胞懸濁液に添加して、周囲温度で５分間インキュベートした。ｄ）懸濁液を１：１０希釈のＢ−ＰＥＲ １００ｍｌで希釈し、ボルテックス攪拌器を用いて細胞を再懸濁した。ｅ）細胞懸濁液を１５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、沈降物を別途のＢ−ＰＥＲ １００ｍｌに再懸濁して、ボルテックスで攪拌した。ｆ）希釈したＢ−ＰＥＲを１５，０００×ｇで遠心分離し、沈降物を、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスＣｌおよび６Ｍ尿素、ｐＨ８．０から成る変性緩衝液５０ｍｌに再懸濁して、その後ボルテックスで攪拌した。ｇ）懸濁液を１５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスＣｌおよび８Ｍ尿素、ｐＨ８．０から成る変性緩衝液（負荷緩衝液）１０ｍｌに溶解した。ｈ）５０％Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂懸濁液（Ｑｉａｇｅｎ）２．５ｍｌを、ペプチドを含む溶液に添加し、混合物を軌道攪拌器において周囲温度で３０分間攪拌した。その後、樹脂懸濁液を空のカラムに負荷し、２容の負荷緩衝液で洗浄した。ｉ）保持されたポリペプチドを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する、０．１５ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ１０．５を含む溶液で溶出し、使用するときまで−３０℃で凍結保存した。
【実施例６】
【００８１】
ｐＴＡＲＧＥＴベクターへの配列番号１７のアニサキス・シンプレックスｃＤＮＡ配列のフラグメントのサブクローニングおよびコンピテントＪＭ１０９細胞の形質転換
もう１つの好ましい実施形態では、配列番号１８によって表わされるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする、配列番号１のヌクレオチド１３０６−２１３９の位置に対応する８３４アミノ酸の内部フラグメント（配列番号１７）をｐＴＡＲＧＥＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。そのために、配列番号１７を、正プライマー（５’配列番号２５ ３’）と逆プライマー（５’配列番号２６ ３’）のセットを使用し、実施例３の形質転換ｐＱＥ−３１ベクターを鋳型として用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。９４℃で５分間の変性サイクルとそれに続く（９４℃で４５秒間の変性、５５℃で４５秒間のハイブリダイゼーション、および７２℃で１．５分間の伸長）の３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終伸長サイクル。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析し、その後ｐＴＡＲＧＥＴベクターにクローニングした。ｐＴＡＲＧＥＴとアニサキス挿入物の連結、およびコンピテントＪＭ１０９細胞の形質転換を、製品の使用指示書に記載されているように実施した。陽性ＪＭ１０９形質転換体を、製造者によって記述されているように、アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌを添加したＬＢ寒天プレートを用いて白色コロニー選択によって選択した。
【００８２】
記述した実験条件下で、ｐＴＡＲＧＥＴベクターへの配列番号１７に対応するｃＤＮＡ配列のフラグメントのサブクローニングは、配列番号１７のアニサキスポリペプチド、および配列番号１７のカルボキシル末端部分に位置する４アミノ酸の付加的な配列（配列番号２４）を含む、配列番号６の２８２アミノ酸の配列をコードする８４６ヌクレオチドのプラスミドＯＲＦ（配列番号５）を導いた。
【実施例７】
【００８３】
ＪＭ１０９細胞の組換えプラスミドＤＮＡの単離およびプラスミドＤＮＡによるマウスのワクチン接種
ＪＭ１０９細胞の陽性コロニーをＬＢブロス−アンピシリン中で増殖させ、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して、沈降物を、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出するために使用した。合計５０μｌ（１μｇ／μｌの濃度）の内毒素不含プラスミドＤＮＡを、１０〜２０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの２本の脚の四頭筋に接種した。接種は、Ｌｅｉｒｏら（２００２）によって述べられているようにインスリン注射器を使用して実施した。
【実施例８】
【００８４】
感染患者の血清中の抗アニサキス抗体の測定のための免疫検定法
本発明における免疫検定法は、動物被験者または種からの何らかの生体液中の抗アニサキス抗体の存在を検出することができる任意の免疫検定法であって良い。
【００８５】
免疫検定法の種類の例は、液相および固相免疫検定法、および直接または間接形式の競合および非競合免疫検定法を含む。
【００８６】
典型的には、血清または血漿のような生体液中の抗アニサキス抗体のレベルの測定は、この実施例において述べるＥＬＩＳＡ法のような、ＥＬＩＳＡ法を用いて実施し得る。
【００８７】
ａ）血清試料
この実施例のＥＬＩＳＡ法において使用する血清試料は、非感染被験者（健常供血者）およびアニサキス・シンプレックス寄生虫に感染した被験者から得た。血清は、最近生魚を食したことがあり、内視鏡検査によって寄生生物の存在が確認された被験者から得たものであるとき、陽性とみなした。
【００８８】
ｂ）Ｏ−脱グリコシル化抗原およびＵＡ３モノクローナル抗体による捕捉ＥＬＩＳＡ
固定化ＵＡ３モノクローナル抗体によるアニサキス種の特異的Ｏ−脱グリコシル化抗原の捕捉に基づく、捕捉ＥＬＩＳＡ法（ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）を述べる。
【００８９】
この免疫検定法において使用するＯ−脱グリコシル化抗原は、上述したように入手されたものであり、５０℃で１６時間の０．０２ｍＭ ＮａＯＨによるアニサキスの無傷抗原の処理、およびＨＣｌによるｐＨの付加的な中和に基づく。
【００９０】
捕捉ＥＬＩＳＡを実施するため、以下の工程を行った。ａ）精製ＵＡ３モノクローナル抗体（１００μｌ／ウエル、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度）を一晩結合した。ｂ）吸引後、ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した。ｃ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＴＭ）を使用してＥＬＩＳＡウエルを３７℃で１時間ブロックした。ｄ）吸引後、非希釈ヒト血清１００μｌを使用して３７℃で１時間半インキュベートした。ｅ）０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｆ）１：２，５００希釈のＦＩＴＣ標識ヒト抗ＩｇＥモノクローナル抗体（Ｉｎｇｅｎａｓａ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ。ＦＩＴＣによる標識は、ＬｉｄｄｅｌとＣｒｙｅｒ、１９９１によって述べられた方法に従って実施した）１００μｌを使用してインキュベートした。ｇ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｈ）吸引に加え、１：１，５００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）１００μｌでインキュベートした。ｉ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｊ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｋ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【００９１】
ｃ）形質転換Ｍ１５細胞において発現されたアニサキスの組換えポリペプチドに関する間接ＥＬＩＳＡ
好ましい実施形態では、アニサキスに感染した被験者の血清中の抗アニサキス抗体を測定するために、配列番号４の組換えポリペプチドを使用して間接ＥＬＩＳＡを実施した。
【００９２】
この実施例では、ヒト血清試料中のＩｇＥ抗体の測定のためのＥＬＩＳＡ法を述べるが、他のクラス（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）およびサブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）の抗体も、二次抗ヒト抗体の特異性を変えることによって測定し得る。同様に、この免疫検定法はまた、適切な二次抗種抗体を選択することにより、他の動物種（たとえば他の哺乳動物、鳥類または魚類）の生体液中の抗体の測定のためにも適合させ得る。
【００９３】
好ましい実施形態では、この実施例の間接ＥＬＩＳＡ（ｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）を実施するための方法を以下の工程に従って行った。ａ）０．１ＭトリスＣｌ、ｐＨ１０．５中の配列番号４のアニサキスの組換え抗原とＥＬＩＳＡプレートとを結合した。ｂ）吸引後、ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した。ｃ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックした。ｄ）吸引後、非希釈ヒト血清１００μｌを使用してプレートを３７℃で１時間半インキュベートした。ｅ）０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｆ）１：２，５００希釈のＦＩＴＣ標識ヒト抗ＩｇＥモノクローナル抗体（Ｉｎｇｅｎａｓａ、ＬｉｄｄｅｌとＣｒｙｅｒ、１９９１によって述べられた方法に従ってＦＩＴＣで標識した）１００μｌでインキュベートした。ｇ）吸引後、２００μｌ／ウエルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｈ）吸引後、１：１，５００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ）１００μｌでインキュベートした。ｉ）吸引後、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｊ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｋ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【００９４】
以下の表Ｉは、本発明の実施例８で述べる捕捉ＥＬＩＳＡ（ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）法および間接ＥＬＩＳＡ（ｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ）法によって検定した、アニサキス・シンプレックス線虫に感染した患者からの２２の陽性血清試料について得たＩｇＥ値の比較を示す。表は、各々血清について４９２ｎｍで測定した平均吸光度値を示す。ＩｇＥの定量のためのカットオフ値は、ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法についてはＯＤ＝０．１０５およびｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法についてはＯＤ＝０．０４９であった。試料２はｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法に関してのみ陽性であったことに留意されたい。これらの結果は、ＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法（９５．４５％の感受性）およびｒＵＡ３−ＥＬＩＳＡ法（１００％の感受性）の両方が、アニサキス種によるヒト感染の血清学的診断のための有効な方法であることを示す。
【表Ｉ】
【実施例９】
【００９５】
配列番号６のポリペプチドをコードする組換えｐＴＡＲＧＥＴベクターでトランスフェクトしたマウスにおける抗体の産生
この実施例では、配列番号６のポリペプチドをコードする組換えｐＴＡＲＧＥＴベクターでトランスフェクトしたマウスから麻酔下で血液を採取し（実施例７参照）、ＥＬＩＳＡプレートに固定化した配列番号４のポリペプチドで反応性ＩｇＧ１抗体の存在を判定するため、得られた血清を間接ＥＬＩＳＡにおいて検定した。ＥＬＩＳＡ法は、二次抗ヒト試薬の代わりにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ、１：３，０００希釈）を使用したことを除き、実施例８ｂで述べたのと同じであった。
【００９６】
以下の表ＩＩは、配列番号６のポリペプチドをコードするアニサキス・シンプレックスのＤＮＡ挿入物を含む組換えｐＴＡＲＧＥＴプラスミド１００μｇ／マウスによるワクチン接種（非経口経路）後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて得られたＩｇＧ１抗体の反応を示す。免疫の１ヵ月後にマウスからの血液採取を実施した。表は、４９２ｎｍで測定した（３回の独立した測定）、各々の血清についての平均吸光度値±ＳＤを示す。
【００９７】
これらの結果は、アニサキスのＤＮＡ配列（この実験では本発明の配列番号６によって示される）を含む組換えＤＮＡワクチンが抗アニサキス抗体のインビボ誘導のために有用であり得ることを示す。ワクチンによる抗体のインビボ誘導は、ａ）病原菌に対する免疫防御の誘導、およびｂ）アレルギー反応の予防のために興味深い。
【表ＩＩ】
【実施例１０】
【００９８】
本発明のアニサキス・シンプレックスの組換えペプチドおよびポリペプチドの標識と適用
検出可能な生体分子または化学分子による本発明のペプチドおよびポリペプチドの標識は、インビボおよびインビトロ診断および実験研究などの目的のために有用である。当業者に公知の様々な標識および方法がある（たとえばＫｅｓｓｌｅｒ（編集）．Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９９２）、Ｗａｌｋｅｒ（編集）．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９６））。
【００９９】
本発明において使用し得る標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物および、コロイド状金およびラテックス粒子などの呈色粒子を含む発色物質を包含する。
【０１００】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉまたは１３１Ｉで放射性標識されるが、これらに限定されない。標識ペプチドは、シンチレーション計数、ガンマ線スペクトロメトリーまたはオートラジオグラフィーなどの方法によって検出し得る。
【０１０１】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ホタルルシフェリンで標識し得る。生物発光化合物は従来の方法によって選択ペプチドまたはポリペプチドに共有結合でき、標識ペプチドまたはポリペプチドは、酵素、たとえばルシフェラーゼが、生物発光分子に光量子を放出させるＡＴＰとの反応を触媒するとき、検出され得る。
【０１０２】
蛍光物質も標識として広く使用される。蛍光物質の例は、フルオレセインおよび誘導体、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、フィコシアニンその他を含む。一般に、蛍光物質分子は蛍光検出器によって検出される。
【０１０３】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチド（たとえば配列番号４のポリペプチド）はビオチンで標識され、アビジンまたはストレプトアビジンのような特異的ビオチンリガンドによって液体支持体中で捕捉され得る。ひとたび標識ポリペプチドが固体支持体（たとえばＥＬＩＳＡプレートのウエル）上に固定化されれば、本発明の実施例８ｂで述べたような典型的インキュベーションおよび洗浄工程を実施することにより、選択ポリペプチドに対する抗体を検出するために使用し得る。
【０１０４】
代替法として、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、酵素（たとえばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および適切な基質の添加後に発色または発蛍光反応を与える他の酵素）で標識し得る。選択酵素で標識されたペプチドおよびポリペプチドは、たとえば、捕捉ＥＬＩＳＡ法において前記ペプチドまたはポリペプチドを認識する特異的抗体を検出するために使用でき、前記捕捉ＥＬＩＳＡ法では、検出する抗体を、固体支持体に固定化されたもう１つ別の抗体によってまず捕捉し、標識ペプチドまたはポリペプチドおよび適切な基質を、抗体−ポリペプチド結合が形成されたことを示すために使用する。
【０１０５】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドは、当業者に周知の方法に従って、側方流免疫クロマトグラフィー検定法において使用されるコロイド状金で標識し得る。たとえば様々な大きさの金粒子を生産する方法およびタンパク質と金の結合のための方法は、Ｄｙｋｓｔｒａ（編集）．Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に述べられている。
【０１０６】
さらに、もう１つの好ましい実施形態では、標識分子は磁性マイクロ粒子であり得、固定化系は磁石であり得る。
【実施例１１】
【０１０７】
本発明のアニサキス・シンプレックス核酸分子の標識と適用
標識核酸分子は、サザントランスファー法、ノーザントランスファー法、スロットブロット法およびドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）およびマイクロアレイなどの特異的ハイブリダイゼーション法によって複雑な核酸混合物中の相補的標的配列を検出するためのプローブとして使用し得る。核酸分子を標識する方法は当分野の技術水準において周知であり、放射性物質、蛍光呈色物質、化学発光物質、マイクロ粒子、酵素、比色標識（たとえば呈色剤、コロイド状金など）、磁気標識およびハプテン（たとえばビオチン、ジオキシゲニン（ＤＩＧ）および抗血清またはモノクローナル抗体が使用可能であるその他のものを含むが、これらに限定されない、種々の標識物質を使用して実施し得る。
【０１０８】
本発明の標識プローブは、たとえばヒトおよび／または動物感染組織中のアニサキス種ＤＮＡを検出および研究するための診断ツールとして使用し得る。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明の選択核酸配列は、ＤＩＧ標識ヌクレオチド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＰＣＲ増幅によってＤＩＧで標識し得る。
【０１１０】
一例として、配列番号１のヌクレオチド１４９０−１９７１の位置に対応する、選択ＤＩＧ標識ヌクレオチド配列プローブ（４８２塩基対）は、実施例３の形質転換ｐＱＥ−３１ベクターを鋳型として使用し、正プライマー（５’配列番号２７ ３’）と逆プライマー（５’配列番号２８ ３’）のセットを用いて入手し得る。感染したヒトまたは動物の生検から得た、分析しようとする組織試料を、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、その後ＩＳＨ法および上記ＤＩＧ標識プローブを使用してアニサキス種ＤＮＡの存在を検出するために分析し得る。この実施例のＩＳＨを実施する方法の詳細な説明は、参照としてこの文書に組み込まれる、Ｌｅｉｒｏら（２００１）によって提供されている。
【実施例１２】
【０１１１】
アニサキス・シンプレックスペプチドおよび本発明のポリペプチドへのモノクローナル抗体ＵＳ３の結合を阻害する合成ペプチド配列の分析
本発明の１つの態様では、モノクローナル抗体ＵＡ３によって認識されるペプチド配列について述べる。前記ペプチド配列は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））の、ＲＡＤＡＲプログラム、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｒａｄａｒ／を使用して配列番号２のアミノ酸配列を分析することにより、アミノ酸の「反復配列」として認識された。選択された１２のアミノ酸の配列をこれらの「反復配列」から化学合成し、ＥＬＩＳＡプレートのウエルに固定化した配列番号４の組換えポリペプチドへのＵＡ３モノクローナル抗体の結合の阻害に関して競合ＥＬＩＳＡにおいて検定した。
【０１１２】
アミノ酸配列番号７−１１に対応するペプチドの阻害活性を、以下の典型的工程に従って捕捉ＥＬＩＳＡにおいて検定した。ａ）ＥＬＩＳＡプレートのウエルに配列番号４のポリペプチドを一晩結合した。ｂ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックした。ｃ）吸引後、検定対象の阻害性ペプチドでプレインキュベートした適切な希釈のＭＡｂ ＵＡ３ １００μｌを使用して３７℃で２時間インキュベートした。ｄ）０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｅ）１：３，０００希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１００μｌでインキュベートした。ｆ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｇ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｈ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｉ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【０１１３】
以下の表ＩＩＩは、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された配列番号４のポリペプチドにモノクローナル抗体ＵＡ３を結合した場合に配列番号７−１１の合成ペプチド（３つの濃度で検定）について得られた阻害値を示す。結果は、対照（阻害なし）に対する各々のペプチド希釈液の阻害率として表わした。ＮＤ：実施せず。認められた結果から推定されるように、モノクローナル抗体ＵＡ３は、１個のアミノ酸だけが異なる配列番号７および８のペプチドに対して選択性を有する。
【表ＩＩＩ】
【実施例１３】
【０１１４】
感染患者の血清中に存在する抗アニサキスＩｇＥ抗体についての標的としての配列番号７−１１の合成アミノ酸配列の重要性
もう１つの好ましい実施形態では、配列番号４のポリペプチドへのヒト抗アニサキス抗体の結合に対するアミノ酸配列（配列番号７−１１）の阻害活性を以下のように間接競合ＥＬＩＳＡにおいて検定した。ａ）ＥＬＩＳＡプレートのウエルに配列番号４のポリペプチドを一晩結合した。ｂ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックした。ｃ）吸引後、１：１希釈の対応する患者の血清１００μｌおよびＴＢＳ中のペプチド溶液（１．５×１０−３Ｍ、上記ペプチドの各々についての最終濃度）を使用して３７℃で２時間インキュベートした。ｄ）０．２％トゥイーン２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄した。ｅ）１：２，５００希釈のＦＩＴＣ標識ヒト抗ＩｇＥモノクローナル抗体１００μｌでインキュベートした。ｆ）吸引後、２００μｌ／ウエルのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｇ）吸引後、１：１，５００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｋｏ）１００μｌでインキュベートした。ｈ）吸引後、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ｉ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。ｊ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取った。
【０１１５】
以下の表ＩＶは、ＥＬＩＳＡプレートに固定化された配列番号４のポリペプチドに、５名の感染患者の血清中に存在するＩｇＥ抗体を結合した場合の、配列番号７−１１に対応する合成ペプチドの混合物の阻害活性を示す。ペプチド混合物は、各ペプチドについて１．５×１０−３Ｍの最終濃度で検定した。結果は、（同じ最終濃度の無関係なペプチドの混合物で阻害された）対照に対する各々のペプチド混合物の阻害率として表わした。表に認められるように、検定した配列は、感染患者の血清中に存在するすべての抗アニサキスＩｇＥ抗体の２５〜７４％の範囲に関して標的であった。しかし、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸、または前記配列の反復配列を含む他の組換えまたは合成ペプチドおよびポリペプチドもおそらく、感染患者の血清中に存在するいくつかのアイソタイプの抗アニサキス抗体によって認識され得る。
【表ＩＶ】
【実施例１４】
【０１１６】
生体組織中のアニサキス幼虫の抗原の特性決定
好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物（たとえばウサギ、ヒツジ、ヤギ、マウスまたはラットなど）を免疫するために使用して良く、得られる特異的ポリクローナル抗体は、ヒトまたは動物の感染組織中のアニサキス幼虫の存在を示すために使用して良い。典型的には、寄生生物を含む組織中のアニサキスの抗原を明らかにするための手順は、以下の一般的工程に従って従来の免疫組織化学的方法によって実施し得る。ａ）パラフィン中に包埋された組織切片を含むスライドガラスの調製、ｂ）ＴＢＳ−ＴＭまたは他の何らかのブロッキング試薬による組織のブロッキング、ｃ）洗浄工程、ｄ）抗アニサキスポリクローナル抗体とのインキュベーション、ｅ）洗浄工程、ｆ）免疫のために使用された動物種のＩｇＧ抗体を認識する標識二次抗体とのインキュベーション（この実施例では、好ましい標識分子はペルオキシダーゼ酵素であるが、本発明の実施例１０で特定される標識など、他の任意の標識を使用して二次抗体を標識して良い）、ｇ）洗浄工程、ｈ）適切な酵素基質（たとえばＨ２Ｏ２±ＤＡＢなど）とのインキュベーション、ｉ）顕微鏡観察。
【０１１７】
もう１つの好ましい実施形態では、ヒトまたは動物の感染組織中の、本発明のアミノ酸配列を含むアニサキス種タンパク質の存在は、従来の免疫組織化学的方法により、モノクローナル抗体ＵＡ３を一次抗体として使用して明らかにし得る。
【実施例１５】
【０１１８】
本発明のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用した、食品抽出物中のアニサキスの抗原の存在の検出
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に対して得られるＭＡｂ（たとえばＭＡｂ ＵＡ３）およびポリクローナル抗体は、その組成物中に魚を含む食品抽出物においてアニサキスの抗原の存在を検出することを目的とした捕捉ＥＬＩＳＡ法を設計するために使用し得る。
【０１１９】
さらに一層好ましい実施形態では、食品抽出物におけるアニサキスの抗原の測定のための捕捉ＥＬＩＳＡ法は、以下の工程に従って実施し得る。ａ）抗アニサキスポリクローナル抗体（１００μｌ／ウエル。１０μｇ／ｍｌの抗体濃度）を一晩結合する。ｂ）吸引後、ＰＢＳでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄する。ｃ）吸引後、３％脱脂粉乳および０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＴＭ）を使用して３７℃で１時間ＥＬＩＳＡウエルをブロックする。ｄ）吸引後、対応する食品抽出物１００μｌを使用して４℃で一晩インキュベートおよび軌道攪拌する（ＰＢＳ中の試料を均質化した後に３，０００ｇで３０分間遠心分離して得られた上清）。ｅ）０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄する。ｆ）１：２，５００希釈のビオチン標識ＵＡ３モノクローナル抗体（標識は、Ｗｌｋｅｒ（１９９６）の参考文献に述べられているように実施した）１００μｌでインキュベートする。ｇ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ｈ）吸引に加え、１：１，５００のアビジン−ペルオキシダーゼ希釈液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）１００μｌでインキュベートする。ｉ）吸引に加え、２００μｌ／ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄する。ｊ）吸引に加え、ペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）でインキュベーションする。ｋ）マルチウエルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して４９２ｎｍで光学密度（ＯＤ）を読み取る。
【０１２０】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群：
ａ．配列番号１を含む核酸、
ｂ．配列番号１の相補物を含む核酸、
ｃ．配列番号１５または配列番号１７を含む配列番号１の核酸のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｆ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｇ．上記の核酸配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有する核酸
から選択される単離核酸配列。
【請求項２】
以下の群：
ａ．配列番号２を含むポリペプチド、タンパク質、またはペプチド、
ｂ．配列番号１６または配列番号１８を含む配列番号２のフラグメント、
ｃ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｆ．前記ポリペプチド、タンパク質またはペプチド配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質
から選択される、請求項１の単離核酸配列のいずれかによってコードされる単離ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質。
【請求項３】
請求項２（ａ）〜２（ｅ）に記載の単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは請求項１（ａ）〜１（ｆ）に記載の単離核酸配列であって、これらの配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有する、単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは単離核酸配列。
【請求項４】
請求項２（ａ）から２（ｅ）に記載の単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。もしくは請求項１（ａ）〜１（ｆ）に記載の単離核酸配列であって、これらの配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する、単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは単離核酸配列。
【請求項５】
以下の群：
ａ．配列番号７を含むアミノ酸配列、
ｂ．配列番号８を含むアミノ酸配列、
ｃ．配列番号９を含むアミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０を含むアミノ酸配列、
ｅ．配列番号１１を含むアミノ酸配列、
ｆ．配列番号１２を含むアミノ酸配列、
ｇ．配列番号１３を含むアミノ酸配列、
ｈ．配列番号１４を含むアミノ酸配列
から選択される、請求項２（ｃ）〜２（ｆ）、３、または４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項６】
前記請求項に記載のペプチドのいずれかをコードすることができる単離核酸配列。
【請求項７】
請求項２から５のいずれかのアミノ酸配列を２つ以上含む、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項８】
請求項７のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項９】
請求項２〜５のいずれかに記載のいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を認識することができる抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である、前記請求項に記載の抗体。
【請求項１１】
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有する、前記請求項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞系。
【請求項１２】
請求項９〜１０に記載の抗体のいずれかによって特異的に認識されるエピトープ。
【請求項１３】
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体によって認識される１つ以上のエピトープを含有する、アニサキス属の線虫から得られる合成、組換え、または実質的に精製されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１５】
前記核酸またはアミノ酸配列がシグナル分子で標識されている、前記請求項のいずれかに記載の単離核酸配列またはアミノ酸配列。
【請求項１６】
前記標識分子が、以下の群：
ａ．放射性
ｂ．酵素
ｃ．蛍光性
ｄ．発光性
ｅ．化学発光性
ｆ．ハプテン
ｇ．呈色性
から選択される、請求項１３に記載の単離核酸配列またはアミノ酸配列。
【請求項１７】
前記標識分子が、以下の群：
ａ．ビオチンまたはその誘導体
ｂ．ニトロフェノール誘導体
ｃ．コロイド状金
ｄ．ラテックス
から選択される、前記請求項に記載の単離核酸配列またはアミノ酸配列。
【請求項１８】
付加的なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に化学的に融合または結合した、請求項２〜５のいずれかに記載の単離ポリペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項１９】
請求項１、３〜４、６〜８または１３〜１５のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現系。
【請求項２０】
請求項１、３〜４、６〜８、または１３〜１５のいずれかに記載の核酸配列で、または請求項１７に記載の発現ベクターまたは発現系で形質転換またはトランスフェクトされた単離原核または真核宿主細胞。
【請求項２１】
以下の手法：
ａ．組換え手法
ｂ．化学合成
ｃ．アニサキス科の線虫の実質的精製
のいずれかによって、請求項２〜５のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を作製する方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列が発現される条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養すること、および前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生産し、その後単離することと、を含む方法。
【請求項２３】
ａ．生物学的試料、好ましくは血清を、請求項２〜５、７、または１３のいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と、前記ポリペプチドと前記試料中の抗体との間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、生物学的試料中のアニサキス種に対する抗体を検出するインビトロ法。
【請求項２４】
前記方法が、免疫検定法または酵素免疫検定法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．生物学的試料または食品抽出物を、請求項９〜１０のいずれかの抗体と、前記抗体と前記試料中の抗原との間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、生物学的試料または食品抽出物中のアニサキス種の抗原を検出するインビトロ法。
【請求項２６】
免疫複合体を形成するために使用される抗体がＵＡ３である、請求項２３に記載のインビトロ法。
【請求項２７】
請求項２〜５、７のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは請求項１、３〜４、６、８、または１０のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む免疫学的組成物。
【請求項２８】
アニサキス種に対するアレルギーの治療のための薬剤の製造における、請求項２〜５または７のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の使用。
【請求項２９】
請求項２〜５、７、または１３のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む、生物学的試料中の抗アニサキス種抗体を検出するための適切なキット。
【請求項３０】
請求項９〜１０のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを含む、生物学的試料または食品抽出物中のアニサキス種の抗原の検出のための適切なキット。
【請求項１】
以下の群：
ａ．配列番号１を含む核酸、
ｂ．配列番号１の相補物を含む核酸、
ｃ．配列番号１５または配列番号１７を含む配列番号１の核酸のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｆ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する配列番号２の隣接アミノ酸をコードする配列番号１のフラグメントを含む核酸、
ｇ．上記の核酸配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有する核酸
から選択される単離核酸配列。
【請求項２】
以下の群：
ａ．配列番号２を含むポリペプチド、タンパク質、またはペプチド、
ｂ．配列番号１６または配列番号１８を含む配列番号２のフラグメント、
ｃ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、８以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｄ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１０以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｅ．抗アニサキス抗体によって認識され得る、１２以上連続する隣接アミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、
ｆ．前記ポリペプチド、タンパク質またはペプチド配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質
から選択される、請求項１の単離核酸配列のいずれかによってコードされる単離ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質。
【請求項３】
請求項２（ａ）〜２（ｅ）に記載の単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは請求項１（ａ）〜１（ｆ）に記載の単離核酸配列であって、これらの配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有する、単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは単離核酸配列。
【請求項４】
請求項２（ａ）から２（ｅ）に記載の単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。もしくは請求項１（ａ）〜１（ｆ）に記載の単離核酸配列であって、これらの配列のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する、単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは単離核酸配列。
【請求項５】
以下の群：
ａ．配列番号７を含むアミノ酸配列、
ｂ．配列番号８を含むアミノ酸配列、
ｃ．配列番号９を含むアミノ酸配列、
ｄ．配列番号１０を含むアミノ酸配列、
ｅ．配列番号１１を含むアミノ酸配列、
ｆ．配列番号１２を含むアミノ酸配列、
ｇ．配列番号１３を含むアミノ酸配列、
ｈ．配列番号１４を含むアミノ酸配列
から選択される、請求項２（ｃ）〜２（ｆ）、３、または４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項６】
前記請求項に記載のペプチドのいずれかをコードすることができる単離核酸配列。
【請求項７】
請求項２から５のいずれかのアミノ酸配列を２つ以上含む、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項８】
請求項７のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項９】
請求項２〜５のいずれかに記載のいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を認識することができる抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である、前記請求項に記載の抗体。
【請求項１１】
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有する、前記請求項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞系。
【請求項１２】
請求項９〜１０に記載の抗体のいずれかによって特異的に認識されるエピトープ。
【請求項１３】
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２７９３を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体によって認識される１つ以上のエピトープを含有する、アニサキス属の線虫から得られる合成、組換え、または実質的に精製されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１５】
前記核酸またはアミノ酸配列がシグナル分子で標識されている、前記請求項のいずれかに記載の単離核酸配列またはアミノ酸配列。
【請求項１６】
前記標識分子が、以下の群：
ａ．放射性
ｂ．酵素
ｃ．蛍光性
ｄ．発光性
ｅ．化学発光性
ｆ．ハプテン
ｇ．呈色性
から選択される、請求項１３に記載の単離核酸配列またはアミノ酸配列。
【請求項１７】
前記標識分子が、以下の群：
ａ．ビオチンまたはその誘導体
ｂ．ニトロフェノール誘導体
ｃ．コロイド状金
ｄ．ラテックス
から選択される、前記請求項に記載の単離核酸配列またはアミノ酸配列。
【請求項１８】
付加的なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に化学的に融合または結合した、請求項２〜５のいずれかに記載の単離ポリペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質。
【請求項１９】
請求項１、３〜４、６〜８または１３〜１５のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現系。
【請求項２０】
請求項１、３〜４、６〜８、または１３〜１５のいずれかに記載の核酸配列で、または請求項１７に記載の発現ベクターまたは発現系で形質転換またはトランスフェクトされた単離原核または真核宿主細胞。
【請求項２１】
以下の手法：
ａ．組換え手法
ｂ．化学合成
ｃ．アニサキス科の線虫の実質的精製
のいずれかによって、請求項２〜５のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を作製する方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列が発現される条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養すること、および前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生産し、その後単離することと、を含む方法。
【請求項２３】
ａ．生物学的試料、好ましくは血清を、請求項２〜５、７、または１３のいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と、前記ポリペプチドと前記試料中の抗体との間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、生物学的試料中のアニサキス種に対する抗体を検出するインビトロ法。
【請求項２４】
前記方法が、免疫検定法または酵素免疫検定法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．生物学的試料または食品抽出物を、請求項９〜１０のいずれかの抗体と、前記抗体と前記試料中の抗原との間で免疫複合体を形成するために十分な条件下で接触させることと、
ｂ．前記免疫複合体を検出することと、
を含む、生物学的試料または食品抽出物中のアニサキス種の抗原を検出するインビトロ法。
【請求項２６】
免疫複合体を形成するために使用される抗体がＵＡ３である、請求項２３に記載のインビトロ法。
【請求項２７】
請求項２〜５、７のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、もしくは請求項１、３〜４、６、８、または１０のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む免疫学的組成物。
【請求項２８】
アニサキス種に対するアレルギーの治療のための薬剤の製造における、請求項２〜５または７のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の使用。
【請求項２９】
請求項２〜５、７、または１３のいずれかに記載のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含む、生物学的試料中の抗アニサキス種抗体を検出するための適切なキット。
【請求項３０】
請求項９〜１０のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを含む、生物学的試料または食品抽出物中のアニサキス種の抗原の検出のための適切なキット。
【公表番号】特表２００９−５４２２４３（Ｐ２００９−５４２２４３Ａ）
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１８９０７（Ｐ２００９−５１８９０７）
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００７／０７０１３０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００６９２７
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０９０６４８０８）
【氏名又は名称原語表記】Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｕｂｅｉｒａ， Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ
【住所又は居所原語表記】Ｅｄｉｆ．Ｃａｃｔｕｓ−ｃｉｔｔ−Ｃａｍｐｕｓ Ｓｕｒ，Ｅ−１５７８２ Ｓａｎｔｉａｇｏ Ｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ（ＥＳ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００７／０７０１３０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００６９２７
【国際公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（５０９０６４８０８）
【氏名又は名称原語表記】Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｕｂｅｉｒａ， Ｆｌｏｒｅｎｃｉｏ
【住所又は居所原語表記】Ｅｄｉｆ．Ｃａｃｔｕｓ−ｃｉｔｔ−Ｃａｍｐｕｓ Ｓｕｒ，Ｅ−１５７８２ Ｓａｎｔｉａｇｏ Ｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ（ＥＳ）
【Ｆターム（参考）】
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