アポリポタンパク質Ａ−Ｉおよびアポリポタンパク質Ａ−ＩＭＩＬＡＮＯをコードする組換えアデノ随伴ウイルスベクターによる血管疾患の予防および処置
本明細書において、血管疾患および冠動脈性心臓疾患（特に、アテローム硬化症）を予防および処置するための遺伝子治療アプローチが記載される。本発明の方法は、アテローム硬化症の予防および処置、ならびにアテローム硬化症が一因となる任意の疾患または生理学的状態の予防および処置に使用され得る。本発明の方法は、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの遺伝子送達に関する。これは、ｒＡＡＶ技術を使用することにより達成され得る。ｒＡＡＶビリオンは、種々の方法によって哺乳動物被験体に送達され得る。これらの方法としては、形質導入骨髄細胞の移植、直接的な筋肉内注射、静脈内注射もしくは門脈注入、またはステント送達が挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
米国政府は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより与えられた助成金番号ＨＬ−６０８９８に従って、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、血管疾患の処置に関し、より詳細には、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（「ＡｐｏＡ−Ｉ」）またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによる血管疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
冠動脈性心臓疾患は、米国における主な死亡原因であり、喫煙に関連した死亡原因である。喫煙は、心臓に対して顕著な、有害な影響をもたらし、そしてタバコの煙の中の毒素は、動脈内にプラークを形成させ、このプラークは、しばしば、アテローム硬化症を引き起こす。アテローム硬化症は、動脈硬化の数種の型のうちの１つであり、動脈壁（例えば、冠状動脈、頚動脈、大動脈、回腸大腿動脈）の肥厚および硬化によって特徴付けられる。長期にわたり、この物質は肥厚し、硬化し、そして最終的に、動脈を遮断するかもしくは大幅に狭める。６，１００万人を超える米国人が、高血圧、冠動脈性心臓疾患、卒中、うっ血性心不全および他の状態を含む、何らかの形態の心臓血管疾患に罹患する。２，６００人を超える米国人が、毎日、心臓血管疾患が原因で死亡している（３３秒ごとに約１人死亡している）。
【０００４】
高密度リポタンパク質（「ＨＤＬ］）の主要な構成要素であるＡｐｏＡ−Ｉは、抗アテローム発生特性を有することが示されている。アポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ（「ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ」）は、単一のアミノ酸置換（Ａｒｇ１７３からＣＹＳ１７３への置換）を有するＡｐｏＡ−Ｉの変異形態である（非特許文献１）。この変異は、この遺伝子型を有する個体において、アテローム硬化症に対する強い耐性を与えるようである（非特許文献２）。ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの構造変化は、脂質に対するより高い反応速度論的親和性、そして脂質タンパク質複合体からのより容易な解離を伴い、このことは、その代謝の加速および組織脂質の取り込みの増大に寄与する（非特許文献３）．ＡｐｏＡ−Ｉは、コレステロール輸送を逆転させ、ＨＤＬ中の酸化脂質を減少させ、泡沫細胞形成を妨げ、血小板活性を阻害するように機能すること、ならびに抗炎症作用、好酸化作用、および抗血栓作用を有することによって、抗アテローム発生機能を果たす。しかし、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏがアテローム硬化症に対するその耐性を与える正確な機序は、未だ解明されていない。
【０００５】
これまでに、組換えａｐｏ Ａ−Ｉ ｍｉｌａｎｏの５回の静脈内注射が、ウサギにおいて高コレステロールを低下させ、バルーン傷害誘発性回腸大腿アテローム硬化症を減少させることが報告されている（非特許文献４）；さらに、４０〜８０ｍｇ／ｋｇ用量の組換えＡｐｏＡ−Ｉｍｉｌａｎｏ（ｒＡｐｏＡ−Ｉｍｉｌａｎｏ）の、５週間にわたる繰り返しの静脈内注射は、ＡｐｏＥ−欠損マウスにおいて、未処置コントロールと比較して、大動脈アテローム硬化症の有意な減少／後退を誘発する（非特許文献５）。さらに、組換えＡｐｏ Ａ−Ｉ ｍｉｌａｎｏの単回大量静脈内投与が、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいて、４８時間以内に、大動脈洞プラークにおける脂質含有量および炎症を低下させ、より安定なプラーク表現型を生じることが示された（非特許文献６）。ｒＡｐｏ Ａ−Ｉ ｍｉｌａｎｏを使用したさらなる研究はまた、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおける内皮機能不全を改善し、ブタモデルにおいてステント埋入部位に適用した場合にステント狭窄を減少させるという、その能力を示した（非特許文献７；非特許文献８）。より最近の二重盲検無作為偽薬対照研究において、急性冠動脈症候群を有する患者への、隔週で５回の投与による組換えＡｐｏＡ−ＩＭｉｉａｎｏ−脂質複合体の注入は、冠動脈アテローム荷重（ｂｕｒｄｅｎ）の有意な後退を生じたことが示された。（非特許文献９）。これらの知見は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏに基づく治療が、有効な抗アテローム発生方法としての可能性を有し得るかもしれないことを示唆する。しかし、頻繁な静脈内注射および組換えタンパク質の生成に関する費用は、ヒトにおけるこのアプローチの実施および広範に適用する可能性を制限する。
【０００６】
遺伝子送達は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための有望な方法である。遺伝子導入目的の多くのウイルスベースの系が記載されている（例えば、レトロウイルス系、これは現在、遺伝子導入のために最も広く使用されているウイルスベクター系である）。種々のレトロウイルス系についての記載は、例えば、以下を参照のこと：特許文献１；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；ならびに非特許文献１４。しかし、２人の患者におけるレトロウイルスベクターに関連する白血病誘発についての最近の記載は、このベクター系の潜在的な限界を明らかにした。
【０００７】
多くのアデノウイルスベースの遺伝子送達系も開発されている。ヒトアデノウイルスは、レセプター媒介性エンドサイトーシスによって細胞に侵入する二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、特に、遺伝子導入に非常に適切である。なぜなら、これらは増殖および操作が容易であり、そしてインビボおよびインビトロの両方において、広範な宿主範囲を示すからである。アデノウイルスは、高力価で容易に生成され、安定であるので、精製および保存され得る。種々のアデノウイルスベースの遺伝子送達系の記載については、例えば、以下を参照のこと：非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；ならびに非特許文献２１。しかし、アデノウイルスのウイルスベクターは、より新しいヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含め、宿主の先天免疫の誘発に関連し、非常に毒性であり得る。
【０００８】
組換えヒトＡｐｏＡ−Ｉアデノウイルスを利用した初期の研究において、Ｄｅ Ｇｅｅｓｔらは、ＡｐｏＥ欠損マウスにおける野生型ヒトＡｐｏＡ−Ｉの、１５０ｍｇ／ｄｌを超え、６日でピークに達する一過性の発現を示した（非特許文献２２）。同様の研究において、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらは、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウス、低密度リポタンパク質レセプター欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウス、および野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの静脈内注射により、血漿ヒトＡｐｏＡ−Ｉ平均ピーク濃度が、注入３日後、それぞれ２３５ｍｇ／ｄｌ、３２４ｍｇ／ｄｌおよび２７６ｍｇ／ｄｌとなり、そしてその後減少したことを示した（非特許文献２３。ヒトＡｐｏＡ−Ｉ導入遺伝子発現のレベルの全体的な低下は、ウイルス感染細胞の炎症反応に起因し得る（非特許文献２４）。別の研究において、アデノウイルスおよび２５６ｂｐ ＡｐｏＡ−Ｉプロモーター、ゲノムＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡ、および４つのＡｐｏＥエンハンサーによる遺伝子導入は、６ヶ月までの間、２０ｍｇ／ｄｌを超えるＡｐｏＡ−Ｉ発現を引き起こした（非特許文献２５）。しかし、循環するＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの有効濃度に関するデータは存在しない。むしろ、過去の研究は、血清タンパク質の循環レベルは、それらの有効生物学的濃度に必ずしも相関しないことを示唆している。例えば、ＡｐｏＥ＋／＋ドナーマウスおよびＡｐｏＥ−／−レシピエントマウスを使用した骨髄移植研究は、１０％キメラ現象を有するレシピエントマウスにおける動脈硬化病変の有意な改善を示した（非特許文献２６）。他の研究はまた、野生型骨髄を用いた骨髄移植によるマクロファージ由来ＡｐｏＥの効果を調べた（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。これらの研究は、移植後４〜５週での血漿コレステロールの正常化、および移植後１４〜２０週でのアテローム硬化症の減少を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＡｐｏＥの循環レベルは、正常レベルの３．８％〜１２．５％で変動した（非特許文献２７；非特許文献２９；非特許文献３０）。したがって、かなり低いレベルの循環性生物活性血清分子でも、脈管壁における有効な生物学的作用には十分であり得る。
【０００９】
最近の研究において、Ｖａｎ Ｌｉｎｔｈｏｕｔらは、ＡｐｏＡ−Ｉ導入遺伝子発現の持続時間をどうにか改善する目的で、「中身を抜いた（ｇｕｔｔｅｄ）」ヘルパーウイルス非依存性アデノウイルスベクターと、ヒトα１−抗トリプシンプロモーター、ヒトゲノムＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡおよび４コピーのヒトＡｐｏＥエンハンサーから構成される発現カセットとを使用した（非特許文献３１）。この研究者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、長期かつ高レベルのＡｐｏＡ−Ｉ発現を生じさせることができた（６ヶ月において、１７０±１６ｍｇ／ｄｌ）。しかし、これらのアデノウイルスベクターをヒトで使用することには、なお毒性の不安がいくらか存在する（非特許文献３２）。ＡＡＶベクターの場合、親の野生型ＡＡＶは、非病原性である（非特許文献３３）。
【００１０】
組換えアデノ随伴ウイルス（「ｒＡＡＶ」）ベクターの構築は、記載されている。例えば、以下を参照のこと：特許文献２および特許文献３；特許文献４（１９９２年１月２３日公開）および特許文献５（１９９３年３月４日公開）；非特許文献３４；非特許文献３５ ；非特許文献３６；非特許文献３３；および非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０。
【００１１】
非病原性のパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）に基づく真核生物ベクターが、効率的な遺伝子導入のための有望なビヒクルとして、最近出現した。ＡＡＶは、パリンドローム逆方向末端反復（「ＩＴＲ」）を含む４．７ｋｂのゲノムを有する、複製欠損ＤＮＡウイルスである。増殖性の感染のためには、ヘルパーウイルス（代表的に、アデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス）との同時感染が必要とされる。ヘルパーウイルスの同時感染がない場合、ＡＡＶは、ＩＴＲを介して染色体ＤＮＡに安定に組み込まれるか、またはエピソーム状態を持続し得る。野生型ＡＡＶは、ヒト第１９番染色体上の「ＡＡＶＳ１」と称されるヒトＤＮＡの特定の領域へと組み込まれるその能力の点で、独特である。ＡＡＶは、多くの動物種（非ヒト霊長類、イヌ、家禽、およびヒトが挙げられる）に見出されている（非特許文献４１）。１００を超えるＡＡＶの血清型が存在する。これらの血清型としては、霊長類から単離されたＡＡＶ １型（ＡＡＶ−１）、ヒトから単離されたＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−５、ならびにヒトアデノウイルス調製物から単離されたＡＡＶ−６が挙げられる。他の血清型が、遺伝子治療における使用について集中的に調べられている。例えば、非特許文献４０を参照のこと。ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされた霊長類血清型である。なぜなら、その感染性クローンは最初に作製されたクローンだからである（非特許文献４２）。ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６についての完全配列が、最近決定された（非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５）。一般的に、霊長類ＡＡＶは、ヌクレオチド配列において８０％を超える相同性を示す。ＡＡＶベクターは、主に、血清型２（ヒト由来パルボウイルス）に基づいている（非特許文献４６；非特許文献４７）。ＡＡＶ−２の感染性クローンが早くに利用可能であったことは、複製欠損ベクターの開発に関する研究を刺激した。ＡＡＶ２ゲノムは、２つの主要なオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有する；左は、ＡＡＶ ｏｒｉ媒介性の複製および部位特異的組み込みのために必要な機能をコードし（Ｒｅｐ）、一方右は、キャプシド形成のために必要な機能をコードする（Ｃａｐ）。ＡＡＶベクターは、多くの異なる型の細胞に形質導入する。複数の研究は、ｒＡＡＶベクターが静止状態の非増殖性標的に形質導入し得ることを、十分実証している。ｒＡＡＶベクターは、ウイルスがコードする遺伝子を何もコードせず、それらの内因性の免疫原性を低下させている。さらに、ｒＡＡＶ形質導入後の長期のインビボ導入遺伝子発現が、動物モデルにおいて示されている。最後に、１９６０年代半ばにおけるその発見以来、野生型ＡＡＶは、動物においてもヒトにおいても未だに病原性であるとは明確に同定されていない。これに対して、野生型ＡＡＶによる感染が、インビトロにおいてウシおよびヒトのパピローマウイルスならびに活性型Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子による形質転換を阻害し、そしてｐ５３欠損悪性細胞においてアポトーシスを誘導するという証拠が存在し、一方疫学的研究は、ヒトにおける前感染が、癌保護効果を実際に与え得ることを示唆する。したがって、上記に概要を述べた理由または本明細書において記載されるデータによって支持される理由から、ＡＡＶベースのベクターは、導入遺伝子の造血細胞への安定的導入に非常に適している。
【特許文献１】米国特許第５，２１９，７４０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１７３，４１４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１３９，９４１号明細書
【特許文献４】国際公開第９２／０１０７０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９３／０３７６９号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら，「Ａ−ＩＭｉｌａｎｏａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａ−Ｉ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８０年，第６６巻，ｐ．９０１−７
【非特許文献２】Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，Ｇ．ら，「Ａ−ＩＭｉｌａｎｏａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｎ Ｉｔａｌｉａｎ ｆａｍｉｌｙ」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８０年，第６６巻，ｐ．８９２−９００
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，Ｇ．ら，「ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｉｐｉｄｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｒｉａｎｔ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ” ｅｍ，１９８５年，第２６０巻，ｐ．１６３２１−５
【非特許文献４】Ａｍｅｌｉ，Ｓ．ら，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｂａｌｌｏｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｒａｂｂｉｔｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９４年，第９０巻，ｐ．１９３０−１９４１
【非特許文献５】Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｋ．ら，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ（Ｍｉｌａｎｏ）ｏｎ ａｏｒｔｉｃ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９８年，第９７巻，ｐ．７８０−５
【非特許文献６】Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｋ．ら，「Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ Ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｐｌａｑｕｅ Ｌｉｐｉｄ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｃｕｔｅ Ｐｌａｑｕｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１年，第１０３巻，ｐ．３０４７−３０５０
【非特許文献７】Ｋａｕｌ，Ｓ．ら，「Ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ／Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＥＴＣ−２１６）Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｉｎ−Ｓｔｅｎｔ Ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｉｅｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，ｐ．２５５１−２５５４
【非特許文献８】Ｋａｕｌ，Ｓ．ら，「Ｒａｐｉｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｎｕｌｌ ｍｉｃｅ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４４巻，第６号，ｐ．１３１１−１３１９
【非特許文献９】Ｎｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｅ．ら，「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡｐｏＡ−１ Ｍｉｌａｎｏ ｏｎ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ」，ＪＡＭＡ，２００３年，第２９０巻，ｐ．２２９２−３００
【非特許文献１０】ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，１９８９年，第７巻，ｐ．９８０−９９０
【非特許文献１１】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９０年，第１巻，ｐ．５−１４
【非特許文献１２】Ｓｃａｒｐａら，「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，１９９１年，第１８０巻，ｐ．８４９−８５２
【非特許文献１３】Ｂｕｒｎｓら，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」，１９９３年，第９０巻，ｐ．８０３３−８０３７
【非特許文献１４】Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，「Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．」，１９９３年，第３巻，ｐ．１０２−１０９
【非特許文献１５】Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」，１９８６年，第５７巻，ｐ．２６７−２７４
【非特許文献１６】Ｂｅｔｔら，「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」，１９９３年，第６７巻，ｐ．５９１１−５９２１
【非特許文献１７】Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら，「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９４年，５巻，ｐ．７１７−７２９
【非特許文献１８】Ｓｅｔｈら，「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」，１９９４年，第６８巻，ｐ．９３３−９４０
【非特許文献１９】Ｂａｒｒら，「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９４年，第１巻，ｐ．５１−５８
【非特許文献２０】Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，１９８８年，第６巻，ｐ．６１６−６２９
【非特許文献２１】Ｒｉｃｈら，「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９３年，第４巻，ｐ．４６１−４７６
【非特許文献２２】Ｄｅ Ｇｅｅｓｔ，Ｂ．ら，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ａｐｏ Ａ−Ｉ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｎ ｎｅｏｉｎｔｉｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａｐｏ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９７年，第９６巻，ｐ．４３４９−５６
【非特許文献２３】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏＡ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ」，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，１９９７年，第３８巻，ｐ．１８６９−７６
【非特許文献２４】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｆ．ら，「Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ２Ａ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９４年，第９１巻，ｐ．６１９６−２００
【非特許文献２５】Ｄｅ Ｇｅｅｓｔ，Ｂ．ら，「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ：ｒｏｌｅ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｉｎｔｒｏｎｓ，ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ」，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０００年，第１１巻，ｐ．１０１−１２
【非特許文献２６】Ｓａｋａｉ，Ｙ．ら，「Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｗａｌｌｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ」，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００２年，第１６１巻，ｐ．２７−３４
【非特許文献２７】Ｌｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．ら，「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５年，第２６７巻，ｐ．１０３４−７
【非特許文献２８】Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｗ．Ａ．ら，「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｈｙｐｅｒ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９５年，第９６巻，ｐ．１１１８−２４
【非特許文献２９】Ｖａｎ Ｅｃｋ，Ｍ．ら，「Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＡｐｏＥ ｇｅｎｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｓｅｒｕｍ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，（ｂｅｔａ）ＶＬＤＬ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，１９９７年，第１７巻，ｐ．３１１７−２６
【非特許文献３０】Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．ら，「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ」，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９７年，第１３４９巻，ｐ．１０９−２１
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【非特許文献４７】Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｔ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃｕｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１９９３年，第３巻，ｐ．７４−８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、当該分野において、アテローム硬化症ならびにそれに関連する一連の疾患および生理学的状態を処置するための遺伝子治療方法に対する必要性が存在する。ｒＡＡＶベクターの使用は、インビボ遺伝子導入に関して実質的に無害であり、そしてＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ発現のレベルの上昇および維持のための実行可能なアプローチを提供し得るという可能性がある。したがって、特にｒＡＡＶベクター技術を介して送達された場合、循環するＡｐｏＡ−Ｉタンパク質および／もしくは循環するＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏタンパク質の恒常的および持続的なレベルを生じる、遺伝子送達および遺伝子発現のための方法が、特に所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
アテローム硬化症を防止するための組成物および方法が、本明細書中に記載される。この組成物および方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する工程およびｒＡＡＶベクターを哺乳動物に送達する工程を含む。本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターを形質導入する工程をさらに包含する。本発明は、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードする精製されたｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ１またはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ１ ｍｉｌａｎｏによって遺伝子的に改変された宿主細胞を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、このｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩベクターまたはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターは、第１に、多能性幹細胞中に形質転換される。本発明は、哺乳動物中にこの多能性幹細胞を移植する工程を、さらに包含する。この多能性幹細胞は、骨髄細胞、臍帯血細胞またはサイトカインで初回刺激された末梢血細胞であり得る。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、キットは、本発明のｒＡＡＶベクター、および哺乳動物におけるアテローム硬化症の処置にこのベクターを使用するための指示書を備える。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用される全て刊行物は、あたかも完全に示されるかのように、その全体が参考として援用される。特に明記されない限り、本明細書中で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １９９４）；Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １９９２）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ ２００１）は、本願において使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００１７】
当業者は、本明細書中に記載される方法および材料と同様であるか、またはそれらと等価である多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明の実施に使用され得る。実際に、本発明は、決して記載される方法および材料に限定されない。本発明の目的に関して、下記の用語が、以下に定義される。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「状態」および「疾患状態」としては、冠状動脈性心疾患および／もしくは血管疾患ならびに／またはこれらの病理の任意の形態（特に、アテローム硬化症）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。
【００１９】
冠状動脈性心疾患および／または血管疾患の「病理」としては、患者の幸福を危うくする全ての現象が挙げられる。これらとしては、アテローム硬化症、アテローム発生、血管の炎症、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症もしくは免疫応答の抑制または悪化などを含む動脈硬化の全ての形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「アテローム硬化症」は、長期にわたる動脈の進行性の狭窄および硬化を記述する。これは、ある程度、老化に伴って生じることが公知であるが、このプロセスを促進する他の危険因子が、同定された。これらの因子としては、高コレステロール、高血圧、喫煙、糖尿病およびアテローム硬化型の疾患に関する家族歴が挙げられる。一般的に、「アテローム発生」は、「アテローム性動脈硬化症」およびアテローム硬化症の病因において重要であるアテロームの形成に関連する。
【００２１】
「遺伝子導入」または「遺伝子送達」とは、宿主細胞中に外来ＤＮＡを容易に挿入するための方法またはシステムをいう。このような方法は、組み込まれずに移入されるＤＮＡの一過性の発現、染色体外の複製および移入されるレプリコン（例えば、エピソーム）の複製、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移入される遺伝物質の組み込みを生じ得る。遺伝子導入は、急性疾患および遺伝性疾患の処置のための独特なアプローチを提供する。多くのシステムが、哺乳動物細胞中への遺伝子導入のために開発された。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００２２】
「ベクター」とは、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）をいい、これらは、適切な制御エレメントに付随して複製が可能であり、そしてこれらの遺伝的エレメントは、細胞間で遺伝子配列を移入し得る。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００２３】
「ＡＡＶベクター」とは、任意のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する任意のベクターをいい、これらとしては、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８などが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＡＶベクターは、１種以上の、全体的または部分的に欠失したＡＡＶ野生型遺伝子（好ましくはＲｅｐ遺伝子および／またはＣａｐ遺伝子）を有し得るが、機能的フランキングＩＴＲ配列を保持し得る。機能的ＩＴＲ配列は、一般的にはＡＡＶゲノムのレスキュー、複製、パッケージングおよび強力な染色体への組み込みに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、少なくともウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むことが、本明細書中で定義される。このＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そしてこの配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）変更され得る。
【００２４】
「組換えウイルス」とは、遺伝子的に変更されたウイルス（例えば、この粒子への異種核酸構築物の付加または挿入によって）をいう。
【００２５】
「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（「ｗｔ」）ＡＡＶウイルス粒子（すなわち、ＡＡＶカプシドタンパク質外皮に結合した直鎖状の、一本鎖のＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子をいう。このことに関して、相補的なセンス（すなわち、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）のいずれかの一本鎖のＡＡＶ核酸分子は、いずれか１つＡＡＶビリオン中にパッケージングされ得；両方の鎖は、等しく感染性である。さらに、このＡＡＶカプシドタンパク質外皮は、上記ＡＡＶビリオンの標的に依存する種々のＡＡＶの血清型のいずれかに由来し得る。
【００２６】
「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、目的の異種ＤＮＡ分子（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードする遺伝子）をカプシド形成するＡＡＶタンパク質の殻からなる感染性の複製欠損ウイルスとして定義され、このＤＮＡ分子は、ＡＡＶのＩＴＲによって隣接される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、ＡＡＶのＲｅｐ機能およびＣａｐ機能、ならびにその細胞に導入されるヘルパーウイルス機能を有した適切な宿主細胞中で産生され得る。この様式において、この宿主細胞は、ＡＡＶベクター（すなわち、目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を複製し、そしてパッケージングし、次いで遺伝子送達を行うために必要とされるＡＡＶの複製およびカプシドタンパク質を形成する能力を、組換えビリオン粒子に与える。完全な導入遺伝子は、プロモーター、コード配列、通常はｃＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルからなり得る。導入遺伝子はまた、調節塩基配列およびイントロン領域を含み得る。導入遺伝子の発現を調節するプロモーターとしては、恒常的な、誘導性でありかつ組織特異的なプロモーターが挙げられ得る。
【００２７】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために本明細書中で使用される。細胞は、外来のＤＮＡがその細胞膜の内側に導入されたときに「トランスフェクトされ」る。多くのトランスフェクション技術は、一般的には当該分野において公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら、（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術が使用されて、適切な宿主細胞中に１種以上の異種ＤＮＡ部分（例えば、プラスミドベクターおよび他の核酸分子）が導入され得る。この用語は、遺伝物質の安定した取り込みおよび一過性の取り込みの両方を指す。
【００２８】
用語「形質転換」は、インビボまたはインビトロのいずれかにおける、遺伝子送達の任意の方法を介するＤＮＡ分子のレシピエント細胞への送達を示し、これらの方法としては、複製欠損ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶを介する）が挙げられる。
【００２９】
用語「異種」は、それが核酸配列（例えば、遺伝子配列および制御配列）に関連する場合、通常は一緒に連結されずそして／または特定のウイルスに通常は付随しない配列を示す。対立遺伝子の変化または天然に存在する変異的な事象は、本明細書中で使用されるような異種ＤＮＡを生じない。
【００３０】
「ＤＮＡ」は、緩んでいるかまたはスーパーコイルのいずれかの、二本鎖または一本鎖の形態にあるデオキシリボヌクレオチド（すなわち、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン）のポリマー形態をいうことが意味される。この用語は、上記分子の一次構造および二次構造のみを指し、そしてそれを任意の特定の三次形態に限定しない。したがって、この用語は、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限酵素断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体において見出される一本鎖のＤＮＡおよび二本鎖のＤＮＡを含む。特定のＤＮＡ分子の構造を議論することにおいて、配列は、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った５’方向から３’方向の配列のみを与えるという通常の慣習に従って、本明細書中に記載され得る。この用語は、４種の塩基アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンを含む分子、ならびに当該分野において公知である塩基アナログを含む分子を包含する。
【００３１】
「遺伝子」または「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節塩基配列の制御下にある場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡの場合において）され、そしてポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合において）される核酸分子であるが；当業者は、種々のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物がそれらの生成物であるアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）は、この様式で作動しないことを容易に理解する。タンパク質生成物（すなわち、ＲＮＡ生成物ではない）に関して、上記コード配列の境界は、５’（すなわち、アミノ）末端における開始コドンおよび３’（すなわち、カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子としては、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物ＤＮＡまたは真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終止配列は、通常は遺伝子配列に対して３’に位置決めされる。さらに、「遺伝子」は、（ｉ）コード領域配列の転写を方向付けるために複数の調節エレメントを含む（おそらく、エンハンサーを含む）プロモーター領域で始まり；（ｉｉ）翻訳の開始部位の上流に位置決めされる転写の開始部位で始まり、そして終止コドンのかなり下流であり得る転写の終止部位（ポリアデニル化シグナルは、通常は転写の終止部位に結合し、そして転写の終止の下流に位置決めされる）で終わるコード配列を含み；そして（ｉｉｉ）発現を変調し、そしてＲＮＡ転写物の安定性を改良するイントロンおよび他の調節塩基配列を含み得る。
【００３２】
用語「制御エレメント」とは、まとめて、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどをいい、これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集合して提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞中で複製され、転写されそして翻訳され得る限り、制御エレメントが、常に全て存在する必要はない。
【００３３】
用語「プロモーター領域」は、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を指す通常の意味において本明細書中で使用され、この制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列の下流（３’方向）への転写を開始し得る遺伝子に由来する。
【００３４】
「作動可能に連結された」とは、エレメントの配置をいい、このように記載される構成要素は、それらの通常の機能を果たすように構成される。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、このコード配列の発現を達成し得る。この制御エレメントは、このエレメントがその発現を方向付けるように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、転写されるが翻訳されない介在性の配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、すでにこのコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【００３５】
本願全体を通して、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的に関して、ある特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対して、「上流」、「下流」、「５’」、または「３’」に位置すると記載されるような場合、これらが、ＤＮＡ分子の転写されない鎖中の配列の位置であり、この位置が、当該分野において慣習的であると見なされることが理解されるべきである。
【００３６】
「幹細胞」は、複数の組織型の細胞を生じ得る全ての細胞を記載するために使用される用語である。本明細書中で使用される場合、「多能性幹細胞」とは、広範に増殖する能力を有する未分化細胞をいい、この増殖は、さらなる細胞および最終的にそれらが得られた組織において見出される細胞の型（例えば、赤血球、白血球および血小板のみを生じる血液幹細胞、または種々の型の皮膚細胞のみを生じる皮膚幹細胞）へと分化し得る子孫を生じる。他の例としては、例えば、骨髄細胞、造血幹細胞、間葉細胞などが挙げられる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「相同性」および「相同な」とは、２つのポリヌクレオチドの間または２つのポリペプチド部分の間の同一性の割合をいう。一方の部分の他方に対する配列間の一致は、当該分野において公知である技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報を整列し、そして容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子の間で配列情報を直接比較することによって決定され得る。あるいは、相同性は、相同な領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下においてポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、次いで一本鎖に特異的なヌクレアーゼによって消化し、そして消化したフラグメントのサイズを決定することによって決定され得る。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定されるように、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸が、それぞれ、これらの分子の定義される長さにわたって一致する場合、互いに対して「実質的に相同」である。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列、ベクターなどに関して、「単離された」とは、示された分子が、同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下において存在する事実をいう。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう。同様に、「単離されたベクター」とは、対象ベクターと異なる他のベクターを実質的に含まないベクターをいう。しかし、対象分子またはベクターは、上記組成物の基本的な特徴に有害な影響を与えない、ある程度のさらなる塩基または部分を含み得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、ベクターに関して、「精製された」とは、他の生物学的高分子の実質的な非存在下において存在する多量の示されたベクターをいう。したがって、「精製されたベクター」とは、組成物の他の構成要素に対して、少なくとも８０％の対象ベクター、好ましくは少なくとも９０％の対象ベクター、最も好ましくは少なくとも９５％の対象ベクターを含む組成物をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」とは、哺乳類の任意のメンバーをいい、これらとしては、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅ）の種およびサル（ｍｏｎｋｅｙ）の種；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭内の哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；げっ歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモットなど）を含む実験動物が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、雄であっても雌であっても、成体被験体および新生児（新生仔）被験体、ならびに胎児（胎仔）は、この用語の範囲内に含まれることが意図される。
【００４１】
本発明は、アテローム硬化症の防止および処置のために、哺乳動物においてＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの発現を増加させる遺伝子治療のアプローチに基づく。この遺伝子治療は、非病原性であり、そして循環するＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの持続的なレベルをもたらす。
【００４２】
ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏは、動物モデルにおいてアテローム硬化症を減少させる、実証された顕著な能力を有する。組換えＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注入の最近の臨床試験は、同様に、アテロームの体積の顕著な減少を示した。ここで、ｒＡＡＶ形質転換骨髄細胞の筋肉内注射または移植のいずれかによるインビボでのアテローム硬化症の遺伝子治療のために、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターの能力が試験された。
【００４３】
本発明のベクターは、米国特許第５，４７４，９３５号に記載されるベクターに基づき、このベクターは、アテローム硬化症の処置のために、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌｉａｎｏである導入遺伝子を有する。ｒＡＡＶベクターの調製は、これまでに記載される通りに完了された（「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」のＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．＆Ｋ．Ｋ．Ｗｏｎｇ、Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ、ＪＪ ＲｏｓｓｉおよびＬ．Ｃｏｕｔｕｒｅ（編）、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．１８９−２１５（２０００）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．ら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ」、Ｂｌｏｏｄ、第９３巻、ｐｐ．１８８２−１８９４（１９９９））。ＣＭＶ最初期プロモーターは、特定の宿主細胞の型を要求しないウイルス種および真核生物種の間で最も活性なプロモーターの１つであるので、導入遺伝子送達システムは、ＣＭＶ最初期プロモーターの使用を頻繁に含んだ（Ｆｉｔｚｓｉｍｏｎｓ，Ｈ．Ｌ．ら、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｉｍｐｒｏｖｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２８巻、ｐｐ．２２７−３６（２００２）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｉ．、「Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、第１巻、ｐｐ．６５５−６２（２００１）；Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．ら、「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、第２巻、ｐｐ．１５０−４（２０００）；Ｋｅａｔｉｎｇ，Ａ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、第１８巻、ｐｐ．９９−１０２（１９９０）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．ら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ」、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第９巻、ｐｐ．２２１−９（１９９０））。しかし、多くのプロモーターが、当業者に認識されるような本発明のｒＡＡＶベクターの構築に使用され得る。例えば、本発明において使用されるｒＡＡＶ−５ベクターは、ＣＢＡプロモーターを組み込む。
【００４４】
本発明のベクターの構築は、ＡＡＶビリオンを生産するための広く認識された手段によって完了され、この手段は、２つの異なるが補完するプラスミドによる宿主細胞の同時トランスフェクションを伴う。これらの１つは、２つのシス活性ＡＡＶ ＩＴＲの間に挟まれる、治療用導入遺伝子またはレポーター導入遺伝子を含む。レスキューおよびこれに続く子孫の組換えゲノムのパッケージングに必要とされるＡＡＶ構成要素は、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質のためのウイルスのオープンリーディングフレームをコードする第２のプラスミドによってトランスで提供される。しかし、当業者に認識されるように、本発明のベクターの構築に関する多くの他の技術は、使用され得る。例えば、Ｇａｏ，Ｇ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１８５４−１１８５９；Ｈａｕｃｋ，Ｂ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（４）：２７６８−２７７４；Ｇａｏ，Ｇ．（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８（１２）：６３８１−６３８８を参照のこと。さらに他の方法が、本発明のベクターの構築のために使用され得る。例えば、米国特許第５，６５８，７７６号は、パッケージングシステム、およびＡＡＶ Ｐ５プロモーターを異種プロモーターで置換するＡＡＶベクターをパッケージングするためのプロセスについて言及する。あるいは、米国特許第５，６２２，８５６号は、ＡＡＶベクターの生成のための構築物および方法について言及し、これは、相同なＰ５プロモーターを遺伝子に対して３’の位置に移動し、そして必要に応じてｒｅｐ−ｃａｐと、位置を移されたＰ５プロモーターとをＦＲＴ配列を用いて隣接させることによって形成される構築物を提供する。
【００４５】
さらに、本発明の種々の実施形態において、ＩＴＲおよび第１のプラスミドの部分ならびに第２のプラスミドのｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、ＡＶＶベクターの任意の血清型に由来し得る。このように、本発明のｒＡＡＶビリオンは、より高い特異性で被験組織を標的する目的に合わせて特別に作製される。ＡＡＶ血清型が、組織特異的遺伝子発現に有意な影響を及ぼすことは、当該分野で公知である（Ｈａｕｃｋ，Ｂ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、Ｖｏｌ．７、ｐｐ．４１９−２５（２００３）；Ｃｈａｏ，Ｈ．ら、「Ｓｅｖｅｒａｌ ｌｏｇ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、Ｖｏｌ．２、ｐｐ．６１９−２３（２０００）；Ｘｉａｏ，Ｗ．ら、「Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７３、ｐｐ．３９９４−４００３（１９９９）；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ら、「Ｃｒｏｓｓ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７６，ｐｐ．７９１−８０１（２００２）；Ａｌｉｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．ら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＦＩＶ ａｎｄ ＡＡＶ５ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．２６６９−７３（２０００）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．ら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７３、ｐｐ．１３０９−１９（１９９９）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２，４， ａｎｄ ５ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、ｐｐ．３４２８−３２（２０００）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ＡＡＶ ｔｙｐｅ ２」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７２、ｐｐ．３０９−１９（１９９８））。例えば、第１のプラスミドのＤＮＡエレメントは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、ｒｅｐタンパク質は、別の血清型に由来し得、そしてｃａｐタンパク質は、なお別のＡＡＶ血清型に由来し得る。特に、ＡＡＶベクターゲノムは、異なるＡＡＶ血清型で包み込まれる（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）ことにより偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）され得、これは、ｒＡＡＶ遺伝子治療を特定の組織に方向付けることにおいて、有効である（Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．ら、「Ｂｒｅａｋｉｎｉｇ ｔｈｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２３、Ｉｓｓｕｅ ３、ｐｐ．３０５−３０６（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｓ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｈｅａｒｔ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２３、Ｉｓｓｕｅ ３、ｐｐ．３２１−３２８（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ＡＡＶ２−ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｄｏｇｓ： ＡＡＶ２／８−ｍｅｄｉａｔｅｄ， ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．１０５、Ｉｓｓｕｅ ８、ｐｐ．３０７９−３０８６（２００５））。本発明の種々の実施形態において、ＡＡＶ血清型１、８、９および１０に由来するカプシドは、筋肉内注射において特に有効であり得る。さらに、ＡＡＶ血清型１、７および８に由来するカプシドは、造血幹細胞形質導入のために、特に有効であり得る。なおさらに、ＡＡＶ血清型８に由来するカプシドは、肝臓を標的するために特に有効であり得る。
【００４６】
本発明が基づくところの動物モデルにおいて、ＡｐｏＥ−／−マウスは、６〜８週齢で、約１０１２ベクターゲノム／ｋｇを注射され、そして２週間後に高脂肪食餌におかれた。処置群の間に、大きな体重の相違は観察されなかった。注射の約２０〜２４週間後、マウスは回収され、大動脈が洗浄され、固定され、マウントされ、オイルレッドＯで染色され、そしてアテローム性斑領域が定量された。コントロール未処置マウスまたは無関係なｒＡＡＶベクターで処置したマウスは、著しいアテローム硬化症病変形成を示した。対照的に、血漿総コレステロール値に大きな相違はないにもかかわらず、ｒＡＡＶ−２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏおよびｒＡＡＶ−５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注射群は、斑形成における有意な減少（それぞれ５８％および５０％）を示した骨髄由来の単球およびマクロファージが、アテローム発生において中心的な役割を果たすので、ｒＡＡＶおよびＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄細胞の移植もまた、おそらくアテローム硬化症病変における形質導入マクロファージの局在化に起因して、斑形成を減少させるという仮説が立てられた。致死的に放射線照射されたＡｐｏＥ−／−マウスは、ｒＡＡＶ形質導入細胞を移植され、そして高脂肪食餌が３週間後に開始された。移植の２２〜２４週間後、マウスを安楽死させ、そして大動脈を、アテローム性斑について分析した。未移植マウスならびに非形質導入骨髄移植マウスおよびコントロールｒＡＡＶ形質導入骨髄移植マウスは、ネガティブコントロールとして役立った。野生型Ｂ６からＡｐｏＥ−／−への移植体は、斑減少についてのポジティブコントロールとして役立った。結果は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶ−２ベクターおよびｒＡＡＶ−５ベクターを形質導入した細胞を移植した後の、大動脈形成におけるそれぞれ４１％および４７％の減少を明らかにした。これらの結果は、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射またはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄細胞の移植のどちらも、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターでの単回治療後の、アテローム発生の有意な長期的阻害をもたらすことを示唆する。
【００４７】
本発明の方法は、アテローム硬化症の処置、予防、阻害、安定化および／または後退の誘導、ならびに、アテローム硬化症（またはアテローム発生）が役割を果たしている任意の疾患または生理学的状態の処置、予防、阻害および／または安定化に関連する。さらに、本発明の方法は、以下のような侵襲性技術によって惹起される、アテローム硬化症の標的化において特に有用であり得る：経皮経管冠状動脈形成（「ＰＴＣＡ」）；バイパス移植片の挿入またはステントの挿入；ステント設置後の再狭窄の処置；または、バイパス移植片挿入の結果。上述の適用の各々は、本発明の範囲内であることが企図される。なおさらに、本発明の方法から利益を受け得る他の疾患および生理学的状態は、当業者に容易に理解され、そしてまた本発明の範囲内であることが企図される。
【００４８】
本発明は、冠状動脈性の心臓病および／または血管疾患の処置のための、遺伝子治療アプローチに基づく。本発明の１つの実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉコード配列またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏコード配列に関連する異種ＤＮＡを含むｒＡＡＶビリオンは、当該分野で公知の任意の従来技術によって作製される。例として、目的のＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ ＤＮＡを含む本発明の組換えＡＡＶビリオンは、標準的方法論によって作製され得、この方法論は、以下の工程を包含する：（１）ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞内に導入する工程；（２）ＡＡＶヘルパー構築物を宿主内に導入する工程であって、このヘルパー構築物は、ＡＡＶベクターから失われているＡＡＶヘルパー機能を補完するために宿主細胞内に発現され得るＡＡＶコード領域を含む工程；（３）１以上のヘルパーウイルスおよび／または付属機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ベクターを宿主細胞に導入する工程であって、ここで、このヘルパーウイルスおよび／または付属機能ベクターは、宿主細胞における効率的なｒＡＡＶビリオン産生を支持可能な付属機能を提供する工程；ならびに（４）宿主細胞を培養し、ｒＡＡＶビリオンを産生する工程。ＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー構築物およびヘルパーウイルスまたは付属機能ベクターは、標準的トランスフェクション技術を用いて、同時的または連続的に宿主細胞内に導入される。当業者に容易に理解されるように、任意の数の他のアプローチもまた使用され得る。
【００４９】
ＡＡＶベクターは、少なくとも以下の、転写の方向で作動可能に連結した構成部分を提供するように、公知の技術を用いて構築される：（ａ）転写開始領域を含む制御エレメント、（ｂ）目的のＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ ＤＮＡおよび（ｃ）転写終止領域。さらに、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏに相同な任意のコード配列が、（ＡｐｏＡ−Ｉコード配列またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏコード配列と実質的に同様の機能特性を示すように）本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。制御エレメントは、標的細胞内で機能的であるように選択される。得られた構築物（作動可能に連結した構成部分を含む）は、５’および３’で機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合され得る。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のこのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、以下を参照：Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）（ＡＡＶ−２配列について）。ＡＡＶ ＩＴＲは、本発明のベクターにおいて使用され、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、そして（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）改変されていてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよく、これらの血清型としては、非限定で、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０などが挙げられる。例えば、Ｇａｏら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；７８（１２）：６３８１−８；Ｗｅｉｔａｍａｎ Ｍ．ら（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｚ．ら（２００５）；およびＷａｎｇ，ら（２００５）を、参照。その上さらに、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、意図されるように（すなわち、結合した目的のＡｐｏ−Ｉヌクレオチド配列またはＡｐｏ−ＩＭｉｌａｎｏヌクレオチド配列の切り出しおよび複製を可能にするように）機能する限り、同一である必要はなく、または同じＡＡＶ血清型に由来するかまたは異なるＡＡＶ血清型に由来する。
【００５０】
ＡＡＶ ＩＴＲ内のＡｐｏ−Ｉ導入遺伝子またはＡｐｏ−ＩＭｉｌａｎｏ導入遺伝子をコードするｒＡＡＶゲノムは、いずれかのＡＡＶ血清型（ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０などが挙げられる）に由来するビリオンカプシド内に包まれ得る。例えば、Ｇａｏら（２００４）；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．ら（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｚ．ら（２００５）；およびＷａｎｇ，Ｌ．ら（２００５）を、参照。
【００５１】
上述のビリオンは、冠状動脈性の心臓病および／または血管疾患の予防および処置のために有用であり、したがって、有効量のｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターを、無機または有機の、固体または液体の、薬学的に受容可能なキャリアと混合して含む、薬学的組成物の製造のために有用である。したがって、本発明の別の局面は、本明細書中で記載される冠状動脈性の心臓病および／または血管疾患を予防しそして処置するための組成物であり、この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤と併用される。
【００５２】
本発明に従う薬学的組成物は、ヒトへの経口投与、経皮投与、局所投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与または静脈内投与）に適した薬学的組成物であり、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターを、薬学的に受容可能なキャリアとともに含有する。用量は、種々の因子（例えば、年齢、体重、血管状態の重篤度および医師によって認められる他の因子）に依存する。
【００５３】
特定の実施形態において、治療的組成物は、坐剤を介して、または経口送達のための錠剤処方物もしくはカプセル剤処方物中で、投与される。通常、経口処方物は、結合剤、フィラー、キャリア、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝液、および、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤のような、普通に使用される添加剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、腸溶性薬物（ｅｎｔｅｒｉｃ）、徐放性処方物、散剤などの形態をとる。遺伝子治療のための経口処方物は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（２００４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １０（１）：１１２−１１６を参照のこと。さらに、他の経口処方物が、当業者に理解されるように、本発明における使用を意図される。
【００５４】
他の投与様式（例えば、経皮投与および局所投与）に適したさらなる処方物としては、軟膏、チンキ剤、クリーム剤、ローション剤、経皮パッチ、移植皮膚、遺伝子改変した皮膚、ステントコーティングおよび坐剤が挙げられる。軟膏およびクリーム剤については、代表的な結合剤、キャリアおよび賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる。特定の実施形態において、経皮パッチが、治療法を送達するために使用され得る。例えば、米国特許第４，６３８，０４３号を参照。遺伝子治療のための経皮処方物および局所処方物は、当該分野で公知である。例えば、Ｊｅｎｓｅｎ，ＴＧ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．４（５）：６７７−８２を参照。さらに、他の経皮処方物および局所処方物が、当業者に理解されるように、本発明における使用を企図される。
【００５５】
非経口投与のために特に適した投薬形態は、水溶性形態（例えば、水溶性の塩または滅菌水溶性注射用懸濁液）の薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターの、滅菌水溶液であって、これらは、粘性を高める物質（例えば、ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストラン）および必要に応じて安定剤を含有する。さらに、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターは、アジュバントとともにまたはアジュバントなしで、凍結乾燥形態になり得、適切な溶媒の添加により、非経口投与の前に溶液中に入れられる。
【００５６】
一般に、本発明の注射可能組成物は、注射のために準備された溶液、もしくは、使用直前に溶媒と合わせるように準備された乾燥水溶性組成物、または、投与の前に希釈するように準備された液体濃縮物であり得る。注射用の組成物の調製においては、刺激を避けるため、張度の調節に非常に注意を払わなければならない。
【００５７】
このビヒクルは、普通は治療活性を有さずかつ非毒性であるであるが、吸収に適した形態において、身体組織に対し、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターを提示する。吸収は、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターが水溶液として提示される時に、迅速かつ完全に起こる。しかし、水混和性の液体でのヒビクルの改変または水非混和性の液体との置き換えは、吸収速度に影響し得る。皮下注射に適した組成物の調製において、水溶性ビヒクル、水混和性ビヒクルおよび非水溶性ビヒクルを使用し得る。特定の水溶性ビヒクルは、その非経口の正当な使用のために、公的に認識されている。
【００５８】
水混和性ビヒクルはまた、本発明の非経口組成物の処方においても有用である。これらの溶媒は、主に、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターの、水溶性に影響を与えるために使用される。これらの溶媒としては、例えば、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが挙げられ得る。
【００５９】
本発明の注射可能組成物中に、組成物の品質を改善するかまたは保護するために、さらなる物質が含まれ得る。したがって、加えられた物質は、水溶性に影響し得、患者の快適さ、化学的安定性の増大、または微生物の増殖に対する保護調製を提供する。したがって、この組成物は、適切な水溶化剤、溶液を等張にする物質、抗酸化剤として作用する物質、および微生物の増殖を阻止するための保存剤として作用する物質を含有し得る。これらの物質は、本明細書中で企図されるような疾患状態の処置の折に、その機能のために適切であるが組成物の作用に悪影響を及ぼさない量で存在する。
【００６０】
一般に、本発明の種々の実施形態に従って哺乳動物に送達されるのに適した、本発明の滅菌非経口注射可能組成物および他の治療処方物は、当業者により、慣用的な実験によって容易に調製され得る。適切な薬学的処方物が提供されるための手引きは、以下による：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版。
【００６１】
本発明の実施形態に従い、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶビリオンは、遺伝子導入に影響を及ぼすのに十分な量かつ十分な送達経路で、哺乳動物に送達される。以下の実施例に記載されるように、本発明は、哺乳動物におけるアテローム硬化症に対する有効な処置を提供する。種々の実施形態において、十分かつ治療的な量は、インビボで、約１×１０１０ベクターゲノム／ｋｇから約１×１０１４ベクターゲノム／ｋｇまでのｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩベクターまたはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターであり得る。本発明の１つの実施形態において、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターは、まず、多分化能幹細胞（例えば、骨髄細胞、血液幹細胞、間質細胞、間葉幹細胞など）を、一定量のｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターで形質導入し、次いで、これらの細胞を哺乳動物内に移植することによって、被験体に送達され得る。代替の実施形態において、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターは、当業者に容易に理解されるように、哺乳動物内に、直接、筋肉内注射または静脈内注射により導入され得るか、ＰＴＣＡの部位またはステント設置により直接的に動脈内に導入され得る。これは、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの循環への直接的な分泌か、またはアテローム性（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）斑領域における局所的な分泌をもたらす。さらに、本発明のｒＡＡＶビリオンは、当業者に容易に理解されるように、単回投与として送達され得るか、または（例えば、毎日、毎週または任意の他の適切な時間間隔での）処置レジメンとして送達され得る。本発明の別の実施形態において、ｒＡＡＶビリオンの１つの血清型が、単回投与として送達され得、その後、ｒＡＡＶビリオンの異なる血清型が送達される。
【００６２】
本発明はまた、被験体におけるアテローム硬化症および関連疾患状態の処置のためのキットに関する。このキットは、材料および構成要素の集合であり、本発明の種々の実施形態に従い、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの被験体への有効な遺伝子導入の少なくとも１つの手段を備える。本発明のキットを構成する構成要素の正確な性質は、意図する目的および使用される特定の方法論に依存する。例えば、このキットのいくつかの実施形態は、哺乳動物被験体におけるアテローム硬化症および／または関連疾患状態を処置する目的のために構成されている。他の実施形態は、例えば血管形成またはステント設置のような別の治療の結果であるアテローム硬化症の発症を予防する目的で構成されている。１つの実施形態において、このキットは、特にヒト被験体を処置する目的で、構成される。
【００６３】
指示書が、キットの中に含まれ得る。「指示書」は、代表的に、ビリオンの調製および／または少なくとも１つの方法パラメータ（例えば、ＡＡＶ−ＡｐｏＡ−Ｉベクターゲノムおよび／またはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターゲノムの相対量、投薬条件および投与指示など）を、代表的に意図される目的のために記載する、具体的な表現を含む。必要に応じて、このキットは、他の有用な構成要素（例えば、希釈剤、緩衝液、薬学的に受容可能なキャリア、生検容器、シリンジ、ステント、カテーテル、ならびにピペット用具および測定用具）を含み得る。
【００６４】
キット中に集められた材料および構成要素は、任意の便利かつ適切な（その操作性および有用性を保存する）方法で保管されて、医師に提供され得る。例えば、構成要素は、溶解形態、脱水形態または凍結乾燥形態であり得る；これらは、室温、冷蔵温度、または冷凍温度で提供され得る。構成要素は、代表的に、適切な包装材の中に含まれる。本明細書中に使用されるように、語句「包装材」は、このキットの内容物を収容するために使用される、１以上の物理的構造体をいう。包装材は、周知の方法によって構築され、好ましくは、滅菌の汚染物を含まない環境を提供する。このキットにおいて使用される包装材は、当該分野で慣習的に利用されている。本明細書中で使用される場合、用語「包装」は、適切なしっかりした母型または材質（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔など）であり、個々のキット構成要素を包むことが可能である。したがって、例えば、包装は、一定容量のｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩベクターおよびｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏを含有する適切な量の組成物を含むために使用される、ガラスバイアルであり得る。包装材は、一般に、内容物および／またはキットの目的および／またはその構成要素を示す、外側ラベルを有する。
【００６５】
本発明のツール、キットおよび方法は、アテローム硬化症および関連の疾患状態を処置するための遺伝子治療アプローチに関連して実施され得る。したがって、本発明の種々の実施形態は、上述の疾患状態の予防のための手段を提供する。本発明の実施形態はまた、進行中または完了した治療的介入の成功のモニタリングに関連する。例えば、被験体の血清は、処置の前（ＡｐｏＡ−Ｉおよび／またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの循環レベルについてスクリーニングするため）；処置の経過の間（例えば、有効な処置レジメンを実施する医師の能力を増強するため）；および／または介入の完了後（例えば、生活様式の変化、血管形成手術およびバイパス手術のような成功のレベルを決定するため）に試験され得る。
【実施例】
【００６６】
（実施例）
以下の実施例は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターを使用してアテローム硬化症を処置する遺伝子治療の成功を実証する。これらの実施例は、インビボ（筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質導入造血前駆細胞の移植のいずれか）で、ベクターの成功をさらに実証する。これらの例は、例示の目的にのみ関し、本発明は、これらの実施例に記載されない多くの方法において実施され得る。
【００６７】
（実施例１）
（組換えアデノ関連ウイルスベクター）
本発明のｒＡＡＶベクターの構築を、宿主細胞の２つの異なるプラスミドでの共トランスフェクションによって完了した。ｒＡＡＶビリオンを、種々のＡＡＶ血清型に由来するプラスミドで調製した。第１のプラスミドの各々において、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏを、２つのシス作動性ＡＡＶ ＩＴＲの間にはさんだ。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶｃａｐタンパク質は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質についてのウイルスオープンリーディングフレームをコードする第２のプラスミドにより、トランスで提供された。１つのビリオンにおいて、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２に由来した（Ｒｅｐ２Ｃａｐ２）。第２のビリオン（ｒＡＡＶ５）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型５に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型５に由来した（Ｒｅｐ５Ｃａｐ５）。第３のビリオン（ｒＡＡＶ１）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型１に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ１）。第４のビリオン（ｒＡＡＶ７）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型７に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ７）。第５のビリオン（ｒＡＡＶ８）において、第１のプラスミドゲノムはＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型８に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ８）。第６のビリオン（ｒＡＡＶ９）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型９に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ９）。他のビリオンは、当業者に理解されるように、本発明の一部として容易に実施され得る。
【００６８】
（実施例２）
（動物手順）
８〜１２週齢のＡｐｏＡ−Ｉ欠損マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、ウイルス導入のために使用した。マウスを、ｒＡＡＶの尾静脈内注射および後脚への筋肉内注射のために拘束した。血液サンプルを、眼窩後採血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）により得、ここで、動物をイソフルレンで安楽死させた。実験動物の使用は、ＣＳＨＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従った。
【００６９】
（実施例３）
（ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターは、動物モデルにおいて抗アテローム発生特性を示す）
ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターの抗アテローム発生特性を、ホモ接合体トランスジェニックアポリポタンパク質Ｅ（「ＡｐｏＥ」）−／−マウスにおいて試験した。これらのマウスは、高脂肪食餌を与えた場合、大血管アテローム性斑を発達させる。アテローム発生において中心的役割を果たす泡沫細胞は、骨髄由来のマクロファージから生じ、野生型骨髄細胞の移植は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいてアテローム硬化症の発症を予防することが示されている。この研究において、形質導入した骨髄細胞の移植は、アテローム硬化症の発達から防護するという仮説を、試験した。ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄細胞の移植の、アテローム硬化症の程度の低減における効力を、直接の筋肉内ベクター注射と比較した。直接の筋肉内ベクター注射は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの循環中への直接的な分泌をもたらす。
【００７０】
移植片について、１０，０００，０００のＡｐｏＥ−／−骨髄細胞を、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏで、５０００の感染効率（ＭＯＩ）で一晩形質導入し（３７℃、ＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍｌおよびＳＣＦ １ｎｇ／ｍｌ）、洗浄し（３回）、そして６〜８週齢の、致死的に放射線照射した雄ＡｐｏＥ−／−マウスに、尾静脈を介して（１１００ｃＧｙ、２回に分けて）移植した。筋肉内注射について、６〜８週齢ＡｐｏＥ−／−マウスに、１〜５×１０１２ベクターゲノム／ｋｇを（２×５０μＬを腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）中に）注射した。高脂肪食餌を、骨髄移植の３週間後、筋肉内注射の２週間後から開始した。測量および後眼窩採血を、２週間の間隔で行った。
【００７１】
約２０〜２４週間後、大動脈弓から大腿の分岐部に広がる大動脈および大血管を単離し、オイルレッドＯで染色し、そしてアテローム性斑の拡大を定量した。ネガティブコントロールとしては、無関係のｒＡＡＶで形質導入した細胞の移植、非形質導入移植片、および未操作マウスが挙げられる。ポジティブコントロールとしては、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ骨髄細胞の放射線照射ＡｐｏＥ−／−マウスへの移植が挙げられる。
【００７２】
全てのＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処理群は、斑形成における著しい減少を示したが、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄の移植およびｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射は、コントロールと比較して、大動脈アテローム性斑形成における有意な（約５０〜６０％）減少を示した。これらの結果は、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入多分化能幹細胞の移植および直接筋肉内注射は、アテローム硬化症の発達を制御するための新規の有効な戦略を示唆する。
【００７３】
（実施例４）
（動物モデルにおいて実証される、筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質誘導骨髄細胞の移植によるアテローム発生の長期的阻害）
ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターのアテローム硬化症の遺伝子治療へのインビボの有効性を、試験した。特に、筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質導入骨髄細胞の移植のいずれかの後の、これらのベクターの有効性を、試験した。
【００７４】
ＡｐｏＥ−／−マウスに、約１０１２ベクターゲノム／ｋｇを、６〜８週齢で注射し、そして２週間後、高脂肪食餌に置いた。処置群の間に、主要な体重の相違は観察されなかった。注射の２０〜２４週間後、マウスを回収し、大動脈を洗浄し、固定し、マウントし、オイルレッドＯで染色して、アテローム性斑領域を定量した。コントロール未処置マウスまたは無関係なｒＡＡＶベクターで処置したマウスは、著しいアテローム硬化症病変の形成を示した。対照的に、血漿総コレステロール値には大きな相違がないにもかかわらず、ｒＡＡＶ−２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注射群およびｒＡＡＶ−５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注射群は、斑形成において有意な減少（それぞれ５８％および５０％）を示した。
【００７５】
骨髄由来の単球およびマクロファージが、アテローム発生において中心的な役割を果たすので、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質誘導骨髄細胞もまた、形質誘導マクロファージのアテローム硬化症病変内の局在に起因して、斑形成における減少をもたらすとの仮説を立てた。
【００７６】
致死的に放射線照射したＡｐｏＥ−／−マウスに、ｒＡＡＶ形質誘導細胞を移植し、そして２週間後に高脂肪食餌を開始した。移植の約２２〜２４週間後、マウスを安楽死させ、そして大動脈を、アテローム性斑について分析した。未移植マウスならびに未形質導入骨髄移植マウスおよびコントロールｒＡＡＶ形質導入骨髄移植マウスは、ネガティブコントロールとして役立った。野生型Ｂ６からＡｐｏＥ−／−への移植体は、斑減少についてのポジティブコントロールとして役立った。結果は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶ−２ベクターおよびｒＡＡＶ−５ベクターで形質導入した骨髄細胞移植後の、アテローム形成における、それぞれ４７％および４９％の減少を明らかにした。
【００７７】
これらの結果は、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質導入骨髄細胞の移植が、ｒＡＡＶベクターでの単回処理後の、アテローム発生の長期的阻害をもたらすことを示唆する。
【００７８】
（実施例５）
（ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの骨髄移植（ｔｒａｎｓｌａｎｔ））
１０，０００，０００のＡｐｏＥ−／−骨髄細胞を、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏで、５０００の感染効率（ＭＯＩ）で、一晩形質導入し（３７℃、ＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍｌおよびＳＣＦ １ｎｇ／ｍｌ）、洗浄し（３回）、そして尾静脈を介して６〜８週齢の致死的に放射線照射したＡｐｏＥ−／−マウスに（１１００ｃＧｙ、２回に分けて）移植した。高脂肪食餌を、全ての処置群について、手順の３週間後に開始した。野生型骨髄を移植したＡｐｏＥ−／−マウスを、実験のポジティブコントロールとして使用した。図１３参照。
【００７９】
（実施例６）
（ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射）
筋肉内注射について、６〜８週齢のＡｐｏＥ−／−マウスに、１〜５×１０１２ベクターゲノム／ｋｇを（２×５０μＬを腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）中に）注射した。高脂肪食餌を、注射の２週間後に開始した。図１４参照。
【００８０】
上の記載は、本発明の特定の実施形態を言及するが、多くの改変が本発明の精神から逸脱することなくなされることが、理解される。例えば、当業者に周知の代替の方法論および手順は、本発明と関連して記載されるｒＡＡＶ形質導入手順に置き換えられ得る。このような代替の方法論および手順は、過度の実験を要せずに容易に実施され得る。従って、ここで開示された実施形態は、全ての局面において例示としてみなされるべきであり、限定としてみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従う、ＡｐｏＥ−／−マウスのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターによる筋肉内注射後の上清ＡｐｏＡ−Ｉレベルを示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従う、筋肉内注射後のＡｐｏＥ−／−マウスの体重を、コントロールベクター処置、ｒＡＡＶベクター処置、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置およびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置について示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従う、筋肉内注射後のＡｐｏＥ−／−マウスの血漿コレステロールレベルを、コントロールベクター処置、ｒＡＡＶベクター処置、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置およびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置について示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入において、体重（図４Ａ）または血漿コレステロールレベル（図４Ｂ）で違いがないことを示す。
【図５Ａ】図５は、本発明の実施形態に従う、ネイティブな大動脈のアテローム硬化症に対する筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の効果を示す。図５Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールのベクター処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの切除した大動脈サンプルの写真を示す。図５Ｂは、図５Ａの写真の大動脈サンプルにおけるプラークの相対的な％を示す。
【図５Ｂ】図５は、本発明の実施形態に従う、ネイティブな大動脈のアテローム硬化症に対する筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の効果を示す。図５Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールのベクター処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの切除した大動脈サンプルの写真を示す。図５Ｂは、図５Ａの写真の大動脈サンプルにおけるプラークの相対的な％を示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片プラークのサイズに対する効果を示す。
【図７Ａ】図７は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片におけるマクロファージ（ＭＯＭＡ）免疫反応性に対する効果を示す。図７Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置され、染色されたサンプルのマクロファージの写真を示す。図７Ｂは、図７Ａの写真におけるＭＯＭＡ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図７Ｂ】図７は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片におけるマクロファージ（ＭＯＭＡ）免疫反応性に対する効果を示す。図７Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置され、染色されたサンプルのマクロファージの写真を示す。図７Ｂは、図７Ａの写真におけるＭＯＭＡ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図８Ａ】図８は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片中の脂質内容物に対する効果を示す。図８Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置されたマウスにおいて、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図８Ｂは、図８Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図８Ｂ】図８は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片中の脂質内容物に対する効果を示す。図８Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置されたマウスにおいて、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図８Ｂは、図８Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図９】図９は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の、大動脈洞プラークのサイズに対する効果を示す。
【図１０Ａ】図１０は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の、大動脈洞中のマクロファージ免疫反応性に対する効果を示す。図１０Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの染色されたサンプルの写真を示す。図１０Ｂは、図１０Ａの写真におけるマクロファージ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の、大動脈洞中のマクロファージ免疫反応性に対する効果を示す。図１０Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの染色されたサンプルの写真を示す。図１０Ｂは、図１０Ａの写真におけるマクロファージ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図１１Ａ】図１１は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ 遺伝子導入の大動脈洞中の脂質内容物に対する効果を示す。図１１Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図１１Ｂは、図１１Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ 遺伝子導入の大動脈洞中の脂質内容物に対する効果を示す。図１１Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図１１Ｂは、図１１Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態に従う、高脂肪食を与えたマウスにおける大動脈弓の病変の写真を示す。図１２Ａは、コントロールの大動脈弓を示し、そして図１２Ｂは、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって形質転換された骨髄移植組織を受容するマウスの大動脈弓を示す。図１２Ｃは、コントロールの大動脈弓およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射を受けるマウスの大動脈弓を示す。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態に従う、単離され、そしてオイルレッドＯによって染色された大動脈弓から大腿の分岐まで延びる大動脈および大血管を、高脂肪食における２０〜２４週間後のアテローム斑の程度について示す。１０００万個のＡｐｏＥ−／−骨髄細胞は、５０００の感染効率（ＭＯＩ）でｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって一晩形質転換され（３７℃、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および１ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ）、洗浄され（３回）、そして尾静脈を介して６〜８週齢の、致死的に放射線照射された雄ＡｐｏＥ−／−マウス（１１００ｃＧｙ、分割用量）中に移植された。高脂肪食は、全ての処置群に対して、上記手順の３週間後に開始された。図１３Ａは、野生型の骨髄を移植されたＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。これは、この実験のポジティブコントロールである。図１３Ｂは、ｒＡＡＶ−２−Ａｐｏ Ａ１ ｍｉｌａｎｏ形質転換された骨髄細胞を移植されたＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。オイルレッド染色されたプラークを欠くマウス（ｍｔｈｅ）に注目する。図１３Ｃは、高脂肪食下における移植物を有さないＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。多くのアテローム斑が、目視できる。図１３Ｄは、高脂肪食下における形質転換されていない骨髄移植物を有するＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態に従う、単離され、そしてオイルレッドＯによって染色された大動脈弓から大腿の分岐まで延びる大動脈および大血管を、高脂肪食における２０〜２４週間後のアテローム斑の程度について示す。筋肉内注射に関して、６〜８週齢のＡｐｏＥ−／−マウスは、１×１０−１２ベクターゲノム／ｋｇ〜５×１０−１２ベクターゲノム／ｋｇ（腓腹筋中に２×５０μＬ）を注射された。高脂肪食は、注射の２週間後に開始された。図１４Ａは、注射を伴わないマウスについての結果を示す。図１４Ｂは、コントロールの無関係なｒＡＡＶ−２ベクターを伴うマウスについての結果を示す。図１４Ｃは、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをＩＭ注射した後の結果を示す。図１４Ｄは、ｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをＩＭ注射した後の結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明の実施形態に従う、単回ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ筋肉内注射の抗アテローム発生効果を示す。グラフは、コントロール処置マウス、非トランスフェクトｒＡＡＶベクター処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおけるプラークを有する大動脈の表面の％を示す。
【図１６】図１６は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの単回筋肉内注射後におけるプラーク形成の阻害を示す。グラフは、コントロール処置マウス、非トランスフェクトｒＡＡＶベクター処置マウス、ならびにｒＡＡＶ１−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウス、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスおよびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおけるプラークを有する大動脈の表面の％を示す。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの単回筋肉内注射後におけるＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈プラーク中の脂質内容物およびマクロファージ内容物の減少を示す。グラフは、コントロール処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおける、大動脈洞中の脂質の％およびマクロファージ免疫反応性の％を示す。
【図１８】図１８は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって形質転換された骨髄の移植後のＡｐｏＥヌルマウスにおけるアテローム硬化症の減少を示す。グラフは、コントロール処置マウス、非形質転換の骨髄移植物処置マウス、非トランスフェクトｒＡＡＶベクター処置マウス、ｒＡＡＶ１−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウス、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスおよびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウス、ならびにＡｐｏＥ−／−骨髄処置マウスにおける大動脈プラークの％を示す。
【図１９】図１９は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって形質転換された骨髄の移植後における、ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈プラークの脂質内容物およびマクロファージ内容物の減少を示す。グラフは、コントロール処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおける、大動脈洞中の脂質の％およびマクロファージ免疫反応性の％を示す。
【図２０】図２０は、本発明の実施形態に従う、ＡｐｏＡ−１（野生型）およびＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子を保有するレトロウイルスによって形質転換された骨髄の移植における、顕著な抗アテローム発生効果を示す。グラフは、コントロール処置マウス、ＡｐｏＡ−Ｉ野生型処置マウスおよびＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおける大動脈のアテロームの％を示す。
【図２１】図２１は、本発明の実施形態に従う、ゲノム中に挿入されるヒトＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子をコードする野生型ｒＡＡＶベクターの構造を示す。この構築物は、遺伝子送達の後にゲノム中に挿入されるか、またはこの構築物は、ゲノムへの挿入を伴わずに細胞中で残存し得、これらの両方は、ＡＡＶに関して可能である。
【図２２】図２２は、本発明の実施形態に従う、ゲノム中に挿入されるヒトＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子をコードするｒＡＡＶベクターの、血清型２および血清型５のベクター地図を示す。これらの構築物は、遺伝子送達の後にゲノム中に挿入されるか、またはこの構築物は、ゲノムへの挿入を伴わずに細胞中で残存し得、これらの両方は、ＡＡＶに関して起こり得る。
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
米国政府は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより与えられた助成金番号ＨＬ−６０８９８に従って、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、血管疾患の処置に関し、より詳細には、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（「ＡｐｏＡ−Ｉ」）またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによる血管疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
冠動脈性心臓疾患は、米国における主な死亡原因であり、喫煙に関連した死亡原因である。喫煙は、心臓に対して顕著な、有害な影響をもたらし、そしてタバコの煙の中の毒素は、動脈内にプラークを形成させ、このプラークは、しばしば、アテローム硬化症を引き起こす。アテローム硬化症は、動脈硬化の数種の型のうちの１つであり、動脈壁（例えば、冠状動脈、頚動脈、大動脈、回腸大腿動脈）の肥厚および硬化によって特徴付けられる。長期にわたり、この物質は肥厚し、硬化し、そして最終的に、動脈を遮断するかもしくは大幅に狭める。６，１００万人を超える米国人が、高血圧、冠動脈性心臓疾患、卒中、うっ血性心不全および他の状態を含む、何らかの形態の心臓血管疾患に罹患する。２，６００人を超える米国人が、毎日、心臓血管疾患が原因で死亡している（３３秒ごとに約１人死亡している）。
【０００４】
高密度リポタンパク質（「ＨＤＬ］）の主要な構成要素であるＡｐｏＡ−Ｉは、抗アテローム発生特性を有することが示されている。アポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ（「ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ」）は、単一のアミノ酸置換（Ａｒｇ１７３からＣＹＳ１７３への置換）を有するＡｐｏＡ−Ｉの変異形態である（非特許文献１）。この変異は、この遺伝子型を有する個体において、アテローム硬化症に対する強い耐性を与えるようである（非特許文献２）。ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの構造変化は、脂質に対するより高い反応速度論的親和性、そして脂質タンパク質複合体からのより容易な解離を伴い、このことは、その代謝の加速および組織脂質の取り込みの増大に寄与する（非特許文献３）．ＡｐｏＡ−Ｉは、コレステロール輸送を逆転させ、ＨＤＬ中の酸化脂質を減少させ、泡沫細胞形成を妨げ、血小板活性を阻害するように機能すること、ならびに抗炎症作用、好酸化作用、および抗血栓作用を有することによって、抗アテローム発生機能を果たす。しかし、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏがアテローム硬化症に対するその耐性を与える正確な機序は、未だ解明されていない。
【０００５】
これまでに、組換えａｐｏ Ａ−Ｉ ｍｉｌａｎｏの５回の静脈内注射が、ウサギにおいて高コレステロールを低下させ、バルーン傷害誘発性回腸大腿アテローム硬化症を減少させることが報告されている（非特許文献４）；さらに、４０〜８０ｍｇ／ｋｇ用量の組換えＡｐｏＡ−Ｉｍｉｌａｎｏ（ｒＡｐｏＡ−Ｉｍｉｌａｎｏ）の、５週間にわたる繰り返しの静脈内注射は、ＡｐｏＥ−欠損マウスにおいて、未処置コントロールと比較して、大動脈アテローム硬化症の有意な減少／後退を誘発する（非特許文献５）。さらに、組換えＡｐｏ Ａ−Ｉ ｍｉｌａｎｏの単回大量静脈内投与が、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいて、４８時間以内に、大動脈洞プラークにおける脂質含有量および炎症を低下させ、より安定なプラーク表現型を生じることが示された（非特許文献６）。ｒＡｐｏ Ａ−Ｉ ｍｉｌａｎｏを使用したさらなる研究はまた、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおける内皮機能不全を改善し、ブタモデルにおいてステント埋入部位に適用した場合にステント狭窄を減少させるという、その能力を示した（非特許文献７；非特許文献８）。より最近の二重盲検無作為偽薬対照研究において、急性冠動脈症候群を有する患者への、隔週で５回の投与による組換えＡｐｏＡ−ＩＭｉｉａｎｏ−脂質複合体の注入は、冠動脈アテローム荷重（ｂｕｒｄｅｎ）の有意な後退を生じたことが示された。（非特許文献９）。これらの知見は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏに基づく治療が、有効な抗アテローム発生方法としての可能性を有し得るかもしれないことを示唆する。しかし、頻繁な静脈内注射および組換えタンパク質の生成に関する費用は、ヒトにおけるこのアプローチの実施および広範に適用する可能性を制限する。
【０００６】
遺伝子送達は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための有望な方法である。遺伝子導入目的の多くのウイルスベースの系が記載されている（例えば、レトロウイルス系、これは現在、遺伝子導入のために最も広く使用されているウイルスベクター系である）。種々のレトロウイルス系についての記載は、例えば、以下を参照のこと：特許文献１；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；ならびに非特許文献１４。しかし、２人の患者におけるレトロウイルスベクターに関連する白血病誘発についての最近の記載は、このベクター系の潜在的な限界を明らかにした。
【０００７】
多くのアデノウイルスベースの遺伝子送達系も開発されている。ヒトアデノウイルスは、レセプター媒介性エンドサイトーシスによって細胞に侵入する二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、特に、遺伝子導入に非常に適切である。なぜなら、これらは増殖および操作が容易であり、そしてインビボおよびインビトロの両方において、広範な宿主範囲を示すからである。アデノウイルスは、高力価で容易に生成され、安定であるので、精製および保存され得る。種々のアデノウイルスベースの遺伝子送達系の記載については、例えば、以下を参照のこと：非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；ならびに非特許文献２１。しかし、アデノウイルスのウイルスベクターは、より新しいヘルパー依存性アデノウイルスベクターを含め、宿主の先天免疫の誘発に関連し、非常に毒性であり得る。
【０００８】
組換えヒトＡｐｏＡ−Ｉアデノウイルスを利用した初期の研究において、Ｄｅ Ｇｅｅｓｔらは、ＡｐｏＥ欠損マウスにおける野生型ヒトＡｐｏＡ−Ｉの、１５０ｍｇ／ｄｌを超え、６日でピークに達する一過性の発現を示した（非特許文献２２）。同様の研究において、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらは、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウス、低密度リポタンパク質レセプター欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウス、および野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの静脈内注射により、血漿ヒトＡｐｏＡ−Ｉ平均ピーク濃度が、注入３日後、それぞれ２３５ｍｇ／ｄｌ、３２４ｍｇ／ｄｌおよび２７６ｍｇ／ｄｌとなり、そしてその後減少したことを示した（非特許文献２３。ヒトＡｐｏＡ−Ｉ導入遺伝子発現のレベルの全体的な低下は、ウイルス感染細胞の炎症反応に起因し得る（非特許文献２４）。別の研究において、アデノウイルスおよび２５６ｂｐ ＡｐｏＡ−Ｉプロモーター、ゲノムＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡ、および４つのＡｐｏＥエンハンサーによる遺伝子導入は、６ヶ月までの間、２０ｍｇ／ｄｌを超えるＡｐｏＡ−Ｉ発現を引き起こした（非特許文献２５）。しかし、循環するＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの有効濃度に関するデータは存在しない。むしろ、過去の研究は、血清タンパク質の循環レベルは、それらの有効生物学的濃度に必ずしも相関しないことを示唆している。例えば、ＡｐｏＥ＋／＋ドナーマウスおよびＡｐｏＥ−／−レシピエントマウスを使用した骨髄移植研究は、１０％キメラ現象を有するレシピエントマウスにおける動脈硬化病変の有意な改善を示した（非特許文献２６）。他の研究はまた、野生型骨髄を用いた骨髄移植によるマクロファージ由来ＡｐｏＥの効果を調べた（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。これらの研究は、移植後４〜５週での血漿コレステロールの正常化、および移植後１４〜２０週でのアテローム硬化症の減少を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＡｐｏＥの循環レベルは、正常レベルの３．８％〜１２．５％で変動した（非特許文献２７；非特許文献２９；非特許文献３０）。したがって、かなり低いレベルの循環性生物活性血清分子でも、脈管壁における有効な生物学的作用には十分であり得る。
【０００９】
最近の研究において、Ｖａｎ Ｌｉｎｔｈｏｕｔらは、ＡｐｏＡ−Ｉ導入遺伝子発現の持続時間をどうにか改善する目的で、「中身を抜いた（ｇｕｔｔｅｄ）」ヘルパーウイルス非依存性アデノウイルスベクターと、ヒトα１−抗トリプシンプロモーター、ヒトゲノムＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡおよび４コピーのヒトＡｐｏＥエンハンサーから構成される発現カセットとを使用した（非特許文献３１）。この研究者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、長期かつ高レベルのＡｐｏＡ−Ｉ発現を生じさせることができた（６ヶ月において、１７０±１６ｍｇ／ｄｌ）。しかし、これらのアデノウイルスベクターをヒトで使用することには、なお毒性の不安がいくらか存在する（非特許文献３２）。ＡＡＶベクターの場合、親の野生型ＡＡＶは、非病原性である（非特許文献３３）。
【００１０】
組換えアデノ随伴ウイルス（「ｒＡＡＶ」）ベクターの構築は、記載されている。例えば、以下を参照のこと：特許文献２および特許文献３；特許文献４（１９９２年１月２３日公開）および特許文献５（１９９３年３月４日公開）；非特許文献３４；非特許文献３５ ；非特許文献３６；非特許文献３３；および非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０。
【００１１】
非病原性のパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）に基づく真核生物ベクターが、効率的な遺伝子導入のための有望なビヒクルとして、最近出現した。ＡＡＶは、パリンドローム逆方向末端反復（「ＩＴＲ」）を含む４．７ｋｂのゲノムを有する、複製欠損ＤＮＡウイルスである。増殖性の感染のためには、ヘルパーウイルス（代表的に、アデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス）との同時感染が必要とされる。ヘルパーウイルスの同時感染がない場合、ＡＡＶは、ＩＴＲを介して染色体ＤＮＡに安定に組み込まれるか、またはエピソーム状態を持続し得る。野生型ＡＡＶは、ヒト第１９番染色体上の「ＡＡＶＳ１」と称されるヒトＤＮＡの特定の領域へと組み込まれるその能力の点で、独特である。ＡＡＶは、多くの動物種（非ヒト霊長類、イヌ、家禽、およびヒトが挙げられる）に見出されている（非特許文献４１）。１００を超えるＡＡＶの血清型が存在する。これらの血清型としては、霊長類から単離されたＡＡＶ １型（ＡＡＶ−１）、ヒトから単離されたＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−５、ならびにヒトアデノウイルス調製物から単離されたＡＡＶ−６が挙げられる。他の血清型が、遺伝子治療における使用について集中的に調べられている。例えば、非特許文献４０を参照のこと。ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされた霊長類血清型である。なぜなら、その感染性クローンは最初に作製されたクローンだからである（非特許文献４２）。ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６についての完全配列が、最近決定された（非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５）。一般的に、霊長類ＡＡＶは、ヌクレオチド配列において８０％を超える相同性を示す。ＡＡＶベクターは、主に、血清型２（ヒト由来パルボウイルス）に基づいている（非特許文献４６；非特許文献４７）。ＡＡＶ−２の感染性クローンが早くに利用可能であったことは、複製欠損ベクターの開発に関する研究を刺激した。ＡＡＶ２ゲノムは、２つの主要なオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有する；左は、ＡＡＶ ｏｒｉ媒介性の複製および部位特異的組み込みのために必要な機能をコードし（Ｒｅｐ）、一方右は、キャプシド形成のために必要な機能をコードする（Ｃａｐ）。ＡＡＶベクターは、多くの異なる型の細胞に形質導入する。複数の研究は、ｒＡＡＶベクターが静止状態の非増殖性標的に形質導入し得ることを、十分実証している。ｒＡＡＶベクターは、ウイルスがコードする遺伝子を何もコードせず、それらの内因性の免疫原性を低下させている。さらに、ｒＡＡＶ形質導入後の長期のインビボ導入遺伝子発現が、動物モデルにおいて示されている。最後に、１９６０年代半ばにおけるその発見以来、野生型ＡＡＶは、動物においてもヒトにおいても未だに病原性であるとは明確に同定されていない。これに対して、野生型ＡＡＶによる感染が、インビトロにおいてウシおよびヒトのパピローマウイルスならびに活性型Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子による形質転換を阻害し、そしてｐ５３欠損悪性細胞においてアポトーシスを誘導するという証拠が存在し、一方疫学的研究は、ヒトにおける前感染が、癌保護効果を実際に与え得ることを示唆する。したがって、上記に概要を述べた理由または本明細書において記載されるデータによって支持される理由から、ＡＡＶベースのベクターは、導入遺伝子の造血細胞への安定的導入に非常に適している。
【特許文献１】米国特許第５，２１９，７４０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１７３，４１４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１３９，９４１号明細書
【特許文献４】国際公開第９２／０１０７０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９３／０３７６９号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら，「Ａ−ＩＭｉｌａｎｏａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａ−Ｉ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８０年，第６６巻，ｐ．９０１−７
【非特許文献２】Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，Ｇ．ら，「Ａ−ＩＭｉｌａｎｏａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｎ Ｉｔａｌｉａｎ ｆａｍｉｌｙ」，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８０年，第６６巻，ｐ．８９２−９００
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，Ｇ．ら，「ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｉｐｉｄｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｒｉａｎｔ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ” ｅｍ，１９８５年，第２６０巻，ｐ．１６３２１−５
【非特許文献４】Ａｍｅｌｉ，Ｓ．ら，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｂａｌｌｏｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｒａｂｂｉｔｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９４年，第９０巻，ｐ．１９３０−１９４１
【非特許文献５】Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｋ．ら，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ（Ｍｉｌａｎｏ）ｏｎ ａｏｒｔｉｃ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９８年，第９７巻，ｐ．７８０−５
【非特許文献６】Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｋ．ら，「Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ Ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｐｌａｑｕｅ Ｌｉｐｉｄ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｃｕｔｅ Ｐｌａｑｕｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００１年，第１０３巻，ｐ．３０４７−３０５０
【非特許文献７】Ｋａｕｌ，Ｓ．ら，「Ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ／Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＥＴＣ−２１６）Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｉｎ−Ｓｔｅｎｔ Ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｉｅｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３年，第１０７巻，ｐ．２５５１−２５５４
【非特許文献８】Ｋａｕｌ，Ｓ．ら，「Ｒａｐｉｄ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｎｕｌｌ ｍｉｃｅ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４４巻，第６号，ｐ．１３１１−１３１９
【非特許文献９】Ｎｉｓｓｅｎ，Ｓ．Ｅ．ら，「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡｐｏＡ−１ Ｍｉｌａｎｏ ｏｎ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ」，ＪＡＭＡ，２００３年，第２９０巻，ｐ．２２９２−３００
【非特許文献１０】ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，１９８９年，第７巻，ｐ．９８０−９９０
【非特許文献１１】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９０年，第１巻，ｐ．５−１４
【非特許文献１２】Ｓｃａｒｐａら，「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，１９９１年，第１８０巻，ｐ．８４９−８５２
【非特許文献１３】Ｂｕｒｎｓら，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」，１９９３年，第９０巻，ｐ．８０３３−８０３７
【非特許文献１４】Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，「Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．」，１９９３年，第３巻，ｐ．１０２−１０９
【非特許文献１５】Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」，１９８６年，第５７巻，ｐ．２６７−２７４
【非特許文献１６】Ｂｅｔｔら，「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」，１９９３年，第６７巻，ｐ．５９１１−５９２１
【非特許文献１７】Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら，「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９４年，５巻，ｐ．７１７−７２９
【非特許文献１８】Ｓｅｔｈら，「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」，１９９４年，第６８巻，ｐ．９３３−９４０
【非特許文献１９】Ｂａｒｒら，「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９４年，第１巻，ｐ．５１−５８
【非特許文献２０】Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，１９８８年，第６巻，ｐ．６１６−６２９
【非特許文献２１】Ｒｉｃｈら，「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，１９９３年，第４巻，ｐ．４６１−４７６
【非特許文献２２】Ｄｅ Ｇｅｅｓｔ，Ｂ．ら，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ａｐｏ Ａ−Ｉ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｎ ｎｅｏｉｎｔｉｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａｐｏ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９７年，第９６巻，ｐ．４３４９−５６
【非特許文献２３】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏＡ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ」，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，１９９７年，第３８巻，ｐ．１８６９−７６
【非特許文献２４】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｆ．ら，「Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ２Ａ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ」，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９４年，第９１巻，ｐ．６１９６−２００
【非特許文献２５】Ｄｅ Ｇｅｅｓｔ，Ｂ．ら，「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ：ｒｏｌｅ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｉｎｔｒｏｎｓ，ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ」，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０００年，第１１巻，ｐ．１０１−１２
【非特許文献２６】Ｓａｋａｉ，Ｙ．ら，「Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｗａｌｌｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ」，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，２００２年，第１６１巻，ｐ．２７−３４
【非特許文献２７】Ｌｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．ら，「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５年，第２６７巻，ｐ．１０３４−７
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【非特許文献３０】Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．ら，「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｉ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ」，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９７年，第１３４９巻，ｐ．１０９−２１
【非特許文献３１】Ｖａｎ Ｌｉｎｔｈｏｕｔ，Ｓ．ら，「Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏ Ａ−Ｉ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００２年，第９巻，ｐ．１５２０−８
【非特許文献３２】Ｓｔ Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ａ．，「Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ：ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００３年，第１０巻，ｐ．１１３５−４１
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【非特許文献４５】Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．ら，「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ＡＡＶ ｔｙｐｅ ２」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８年，第７２巻，ｐ．３０９−３１９
【非特許文献４６】Ｐａｒｋｓ，Ｗ．Ｐ．ら，「Ｓｅｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｖｉｒｕｓｅｓ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９７０年，第２巻，ｐ．７１６−７２２
【非特許文献４７】Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｔ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃｕｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１９９３年，第３巻，ｐ．７４−８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、当該分野において、アテローム硬化症ならびにそれに関連する一連の疾患および生理学的状態を処置するための遺伝子治療方法に対する必要性が存在する。ｒＡＡＶベクターの使用は、インビボ遺伝子導入に関して実質的に無害であり、そしてＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ発現のレベルの上昇および維持のための実行可能なアプローチを提供し得るという可能性がある。したがって、特にｒＡＡＶベクター技術を介して送達された場合、循環するＡｐｏＡ−Ｉタンパク質および／もしくは循環するＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏタンパク質の恒常的および持続的なレベルを生じる、遺伝子送達および遺伝子発現のための方法が、特に所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
アテローム硬化症を防止するための組成物および方法が、本明細書中に記載される。この組成物および方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する工程およびｒＡＡＶベクターを哺乳動物に送達する工程を含む。本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターを形質導入する工程をさらに包含する。本発明は、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードする精製されたｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ１またはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ１ ｍｉｌａｎｏによって遺伝子的に改変された宿主細胞を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、このｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩベクターまたはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターは、第１に、多能性幹細胞中に形質転換される。本発明は、哺乳動物中にこの多能性幹細胞を移植する工程を、さらに包含する。この多能性幹細胞は、骨髄細胞、臍帯血細胞またはサイトカインで初回刺激された末梢血細胞であり得る。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、キットは、本発明のｒＡＡＶベクター、および哺乳動物におけるアテローム硬化症の処置にこのベクターを使用するための指示書を備える。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用される全て刊行物は、あたかも完全に示されるかのように、その全体が参考として援用される。特に明記されない限り、本明細書中で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １９９４）；Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １９９２）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ ２００１）は、本願において使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００１７】
当業者は、本明細書中に記載される方法および材料と同様であるか、またはそれらと等価である多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明の実施に使用され得る。実際に、本発明は、決して記載される方法および材料に限定されない。本発明の目的に関して、下記の用語が、以下に定義される。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「状態」および「疾患状態」としては、冠状動脈性心疾患および／もしくは血管疾患ならびに／またはこれらの病理の任意の形態（特に、アテローム硬化症）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。
【００１９】
冠状動脈性心疾患および／または血管疾患の「病理」としては、患者の幸福を危うくする全ての現象が挙げられる。これらとしては、アテローム硬化症、アテローム発生、血管の炎症、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症もしくは免疫応答の抑制または悪化などを含む動脈硬化の全ての形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「アテローム硬化症」は、長期にわたる動脈の進行性の狭窄および硬化を記述する。これは、ある程度、老化に伴って生じることが公知であるが、このプロセスを促進する他の危険因子が、同定された。これらの因子としては、高コレステロール、高血圧、喫煙、糖尿病およびアテローム硬化型の疾患に関する家族歴が挙げられる。一般的に、「アテローム発生」は、「アテローム性動脈硬化症」およびアテローム硬化症の病因において重要であるアテロームの形成に関連する。
【００２１】
「遺伝子導入」または「遺伝子送達」とは、宿主細胞中に外来ＤＮＡを容易に挿入するための方法またはシステムをいう。このような方法は、組み込まれずに移入されるＤＮＡの一過性の発現、染色体外の複製および移入されるレプリコン（例えば、エピソーム）の複製、または宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への移入される遺伝物質の組み込みを生じ得る。遺伝子導入は、急性疾患および遺伝性疾患の処置のための独特なアプローチを提供する。多くのシステムが、哺乳動物細胞中への遺伝子導入のために開発された。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００２２】
「ベクター」とは、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）をいい、これらは、適切な制御エレメントに付随して複製が可能であり、そしてこれらの遺伝的エレメントは、細胞間で遺伝子配列を移入し得る。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００２３】
「ＡＡＶベクター」とは、任意のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する任意のベクターをいい、これらとしては、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８などが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＡＶベクターは、１種以上の、全体的または部分的に欠失したＡＡＶ野生型遺伝子（好ましくはＲｅｐ遺伝子および／またはＣａｐ遺伝子）を有し得るが、機能的フランキングＩＴＲ配列を保持し得る。機能的ＩＴＲ配列は、一般的にはＡＡＶゲノムのレスキュー、複製、パッケージングおよび強力な染色体への組み込みに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、少なくともウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むことが、本明細書中で定義される。このＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そしてこの配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）変更され得る。
【００２４】
「組換えウイルス」とは、遺伝子的に変更されたウイルス（例えば、この粒子への異種核酸構築物の付加または挿入によって）をいう。
【００２５】
「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（「ｗｔ」）ＡＡＶウイルス粒子（すなわち、ＡＡＶカプシドタンパク質外皮に結合した直鎖状の、一本鎖のＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子をいう。このことに関して、相補的なセンス（すなわち、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）のいずれかの一本鎖のＡＡＶ核酸分子は、いずれか１つＡＡＶビリオン中にパッケージングされ得；両方の鎖は、等しく感染性である。さらに、このＡＡＶカプシドタンパク質外皮は、上記ＡＡＶビリオンの標的に依存する種々のＡＡＶの血清型のいずれかに由来し得る。
【００２６】
「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、目的の異種ＤＮＡ分子（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードする遺伝子）をカプシド形成するＡＡＶタンパク質の殻からなる感染性の複製欠損ウイルスとして定義され、このＤＮＡ分子は、ＡＡＶのＩＴＲによって隣接される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、ＡＡＶのＲｅｐ機能およびＣａｐ機能、ならびにその細胞に導入されるヘルパーウイルス機能を有した適切な宿主細胞中で産生され得る。この様式において、この宿主細胞は、ＡＡＶベクター（すなわち、目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を複製し、そしてパッケージングし、次いで遺伝子送達を行うために必要とされるＡＡＶの複製およびカプシドタンパク質を形成する能力を、組換えビリオン粒子に与える。完全な導入遺伝子は、プロモーター、コード配列、通常はｃＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルからなり得る。導入遺伝子はまた、調節塩基配列およびイントロン領域を含み得る。導入遺伝子の発現を調節するプロモーターとしては、恒常的な、誘導性でありかつ組織特異的なプロモーターが挙げられ得る。
【００２７】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために本明細書中で使用される。細胞は、外来のＤＮＡがその細胞膜の内側に導入されたときに「トランスフェクトされ」る。多くのトランスフェクション技術は、一般的には当該分野において公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら、（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術が使用されて、適切な宿主細胞中に１種以上の異種ＤＮＡ部分（例えば、プラスミドベクターおよび他の核酸分子）が導入され得る。この用語は、遺伝物質の安定した取り込みおよび一過性の取り込みの両方を指す。
【００２８】
用語「形質転換」は、インビボまたはインビトロのいずれかにおける、遺伝子送達の任意の方法を介するＤＮＡ分子のレシピエント細胞への送達を示し、これらの方法としては、複製欠損ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶを介する）が挙げられる。
【００２９】
用語「異種」は、それが核酸配列（例えば、遺伝子配列および制御配列）に関連する場合、通常は一緒に連結されずそして／または特定のウイルスに通常は付随しない配列を示す。対立遺伝子の変化または天然に存在する変異的な事象は、本明細書中で使用されるような異種ＤＮＡを生じない。
【００３０】
「ＤＮＡ」は、緩んでいるかまたはスーパーコイルのいずれかの、二本鎖または一本鎖の形態にあるデオキシリボヌクレオチド（すなわち、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン）のポリマー形態をいうことが意味される。この用語は、上記分子の一次構造および二次構造のみを指し、そしてそれを任意の特定の三次形態に限定しない。したがって、この用語は、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限酵素断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体において見出される一本鎖のＤＮＡおよび二本鎖のＤＮＡを含む。特定のＤＮＡ分子の構造を議論することにおいて、配列は、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った５’方向から３’方向の配列のみを与えるという通常の慣習に従って、本明細書中に記載され得る。この用語は、４種の塩基アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンを含む分子、ならびに当該分野において公知である塩基アナログを含む分子を包含する。
【００３１】
「遺伝子」または「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節塩基配列の制御下にある場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡの場合において）され、そしてポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合において）される核酸分子であるが；当業者は、種々のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物がそれらの生成物であるアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）は、この様式で作動しないことを容易に理解する。タンパク質生成物（すなわち、ＲＮＡ生成物ではない）に関して、上記コード配列の境界は、５’（すなわち、アミノ）末端における開始コドンおよび３’（すなわち、カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子としては、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物ＤＮＡまたは真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終止配列は、通常は遺伝子配列に対して３’に位置決めされる。さらに、「遺伝子」は、（ｉ）コード領域配列の転写を方向付けるために複数の調節エレメントを含む（おそらく、エンハンサーを含む）プロモーター領域で始まり；（ｉｉ）翻訳の開始部位の上流に位置決めされる転写の開始部位で始まり、そして終止コドンのかなり下流であり得る転写の終止部位（ポリアデニル化シグナルは、通常は転写の終止部位に結合し、そして転写の終止の下流に位置決めされる）で終わるコード配列を含み；そして（ｉｉｉ）発現を変調し、そしてＲＮＡ転写物の安定性を改良するイントロンおよび他の調節塩基配列を含み得る。
【００３２】
用語「制御エレメント」とは、まとめて、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどをいい、これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集合して提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞中で複製され、転写されそして翻訳され得る限り、制御エレメントが、常に全て存在する必要はない。
【００３３】
用語「プロモーター領域」は、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を指す通常の意味において本明細書中で使用され、この制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列の下流（３’方向）への転写を開始し得る遺伝子に由来する。
【００３４】
「作動可能に連結された」とは、エレメントの配置をいい、このように記載される構成要素は、それらの通常の機能を果たすように構成される。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、このコード配列の発現を達成し得る。この制御エレメントは、このエレメントがその発現を方向付けるように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、転写されるが翻訳されない介在性の配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、すでにこのコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【００３５】
本願全体を通して、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的に関して、ある特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対して、「上流」、「下流」、「５’」、または「３’」に位置すると記載されるような場合、これらが、ＤＮＡ分子の転写されない鎖中の配列の位置であり、この位置が、当該分野において慣習的であると見なされることが理解されるべきである。
【００３６】
「幹細胞」は、複数の組織型の細胞を生じ得る全ての細胞を記載するために使用される用語である。本明細書中で使用される場合、「多能性幹細胞」とは、広範に増殖する能力を有する未分化細胞をいい、この増殖は、さらなる細胞および最終的にそれらが得られた組織において見出される細胞の型（例えば、赤血球、白血球および血小板のみを生じる血液幹細胞、または種々の型の皮膚細胞のみを生じる皮膚幹細胞）へと分化し得る子孫を生じる。他の例としては、例えば、骨髄細胞、造血幹細胞、間葉細胞などが挙げられる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「相同性」および「相同な」とは、２つのポリヌクレオチドの間または２つのポリペプチド部分の間の同一性の割合をいう。一方の部分の他方に対する配列間の一致は、当該分野において公知である技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報を整列し、そして容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子の間で配列情報を直接比較することによって決定され得る。あるいは、相同性は、相同な領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下においてポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、次いで一本鎖に特異的なヌクレアーゼによって消化し、そして消化したフラグメントのサイズを決定することによって決定され得る。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定されるように、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸が、それぞれ、これらの分子の定義される長さにわたって一致する場合、互いに対して「実質的に相同」である。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列、ベクターなどに関して、「単離された」とは、示された分子が、同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下において存在する事実をいう。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう。同様に、「単離されたベクター」とは、対象ベクターと異なる他のベクターを実質的に含まないベクターをいう。しかし、対象分子またはベクターは、上記組成物の基本的な特徴に有害な影響を与えない、ある程度のさらなる塩基または部分を含み得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、ベクターに関して、「精製された」とは、他の生物学的高分子の実質的な非存在下において存在する多量の示されたベクターをいう。したがって、「精製されたベクター」とは、組成物の他の構成要素に対して、少なくとも８０％の対象ベクター、好ましくは少なくとも９０％の対象ベクター、最も好ましくは少なくとも９５％の対象ベクターを含む組成物をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」とは、哺乳類の任意のメンバーをいい、これらとしては、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅ）の種およびサル（ｍｏｎｋｅｙ）の種；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）；家庭内の哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；げっ歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモットなど）を含む実験動物が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、雄であっても雌であっても、成体被験体および新生児（新生仔）被験体、ならびに胎児（胎仔）は、この用語の範囲内に含まれることが意図される。
【００４１】
本発明は、アテローム硬化症の防止および処置のために、哺乳動物においてＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの発現を増加させる遺伝子治療のアプローチに基づく。この遺伝子治療は、非病原性であり、そして循環するＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの持続的なレベルをもたらす。
【００４２】
ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏは、動物モデルにおいてアテローム硬化症を減少させる、実証された顕著な能力を有する。組換えＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注入の最近の臨床試験は、同様に、アテロームの体積の顕著な減少を示した。ここで、ｒＡＡＶ形質転換骨髄細胞の筋肉内注射または移植のいずれかによるインビボでのアテローム硬化症の遺伝子治療のために、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターの能力が試験された。
【００４３】
本発明のベクターは、米国特許第５，４７４，９３５号に記載されるベクターに基づき、このベクターは、アテローム硬化症の処置のために、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌｉａｎｏである導入遺伝子を有する。ｒＡＡＶベクターの調製は、これまでに記載される通りに完了された（「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」のＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．＆Ｋ．Ｋ．Ｗｏｎｇ、Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ、ＪＪ ＲｏｓｓｉおよびＬ．Ｃｏｕｔｕｒｅ（編）、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．１８９−２１５（２０００）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．ら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ」、Ｂｌｏｏｄ、第９３巻、ｐｐ．１８８２−１８９４（１９９９））。ＣＭＶ最初期プロモーターは、特定の宿主細胞の型を要求しないウイルス種および真核生物種の間で最も活性なプロモーターの１つであるので、導入遺伝子送達システムは、ＣＭＶ最初期プロモーターの使用を頻繁に含んだ（Ｆｉｔｚｓｉｍｏｎｓ，Ｈ．Ｌ．ら、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｉｍｐｒｏｖｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２８巻、ｐｐ．２２７−３６（２００２）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｉ．、「Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、第１巻、ｐｐ．６５５−６２（２００１）；Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．ら、「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、第２巻、ｐｐ．１５０−４（２０００）；Ｋｅａｔｉｎｇ，Ａ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、第１８巻、ｐｐ．９９−１０２（１９９０）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．ら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ」、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、第９巻、ｐｐ．２２１−９（１９９０））。しかし、多くのプロモーターが、当業者に認識されるような本発明のｒＡＡＶベクターの構築に使用され得る。例えば、本発明において使用されるｒＡＡＶ−５ベクターは、ＣＢＡプロモーターを組み込む。
【００４４】
本発明のベクターの構築は、ＡＡＶビリオンを生産するための広く認識された手段によって完了され、この手段は、２つの異なるが補完するプラスミドによる宿主細胞の同時トランスフェクションを伴う。これらの１つは、２つのシス活性ＡＡＶ ＩＴＲの間に挟まれる、治療用導入遺伝子またはレポーター導入遺伝子を含む。レスキューおよびこれに続く子孫の組換えゲノムのパッケージングに必要とされるＡＡＶ構成要素は、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質のためのウイルスのオープンリーディングフレームをコードする第２のプラスミドによってトランスで提供される。しかし、当業者に認識されるように、本発明のベクターの構築に関する多くの他の技術は、使用され得る。例えば、Ｇａｏ，Ｇ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１８５４−１１８５９；Ｈａｕｃｋ，Ｂ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（４）：２７６８−２７７４；Ｇａｏ，Ｇ．（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８（１２）：６３８１−６３８８を参照のこと。さらに他の方法が、本発明のベクターの構築のために使用され得る。例えば、米国特許第５，６５８，７７６号は、パッケージングシステム、およびＡＡＶ Ｐ５プロモーターを異種プロモーターで置換するＡＡＶベクターをパッケージングするためのプロセスについて言及する。あるいは、米国特許第５，６２２，８５６号は、ＡＡＶベクターの生成のための構築物および方法について言及し、これは、相同なＰ５プロモーターを遺伝子に対して３’の位置に移動し、そして必要に応じてｒｅｐ−ｃａｐと、位置を移されたＰ５プロモーターとをＦＲＴ配列を用いて隣接させることによって形成される構築物を提供する。
【００４５】
さらに、本発明の種々の実施形態において、ＩＴＲおよび第１のプラスミドの部分ならびに第２のプラスミドのｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、ＡＶＶベクターの任意の血清型に由来し得る。このように、本発明のｒＡＡＶビリオンは、より高い特異性で被験組織を標的する目的に合わせて特別に作製される。ＡＡＶ血清型が、組織特異的遺伝子発現に有意な影響を及ぼすことは、当該分野で公知である（Ｈａｕｃｋ，Ｂ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、Ｖｏｌ．７、ｐｐ．４１９−２５（２００３）；Ｃｈａｏ，Ｈ．ら、「Ｓｅｖｅｒａｌ ｌｏｇ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、Ｖｏｌ．２、ｐｐ．６１９−２３（２０００）；Ｘｉａｏ，Ｗ．ら、「Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７３、ｐｐ．３９９４−４００３（１９９９）；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ら、「Ｃｒｏｓｓ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７６，ｐｐ．７９１−８０１（２００２）；Ａｌｉｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．ら、「Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＦＩＶ ａｎｄ ＡＡＶ５ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．２６６９−７３（２０００）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．ら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７３、ｐｐ．１３０９−１９（１９９９）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２，４， ａｎｄ ５ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、ｐｐ．３４２８−３２（２０００）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｔｈｅｒ ｔｈａｎ ＡＡＶ ｔｙｐｅ ２」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、Ｖｏｌ．７２、ｐｐ．３０９−１９（１９９８））。例えば、第１のプラスミドのＤＮＡエレメントは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、ｒｅｐタンパク質は、別の血清型に由来し得、そしてｃａｐタンパク質は、なお別のＡＡＶ血清型に由来し得る。特に、ＡＡＶベクターゲノムは、異なるＡＡＶ血清型で包み込まれる（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）ことにより偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）され得、これは、ｒＡＡＶ遺伝子治療を特定の組織に方向付けることにおいて、有効である（Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．ら、「Ｂｒｅａｋｉｎｉｇ ｔｈｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２３、Ｉｓｓｕｅ ３、ｐｐ．３０５−３０６（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｓ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｈｅａｒｔ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２３、Ｉｓｓｕｅ ３、ｐｐ．３２１−３２８（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ＡＡＶ２−ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｄｏｇｓ： ＡＡＶ２／８−ｍｅｄｉａｔｅｄ， ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌ．１０５、Ｉｓｓｕｅ ８、ｐｐ．３０７９−３０８６（２００５））。本発明の種々の実施形態において、ＡＡＶ血清型１、８、９および１０に由来するカプシドは、筋肉内注射において特に有効であり得る。さらに、ＡＡＶ血清型１、７および８に由来するカプシドは、造血幹細胞形質導入のために、特に有効であり得る。なおさらに、ＡＡＶ血清型８に由来するカプシドは、肝臓を標的するために特に有効であり得る。
【００４６】
本発明が基づくところの動物モデルにおいて、ＡｐｏＥ−／−マウスは、６〜８週齢で、約１０１２ベクターゲノム／ｋｇを注射され、そして２週間後に高脂肪食餌におかれた。処置群の間に、大きな体重の相違は観察されなかった。注射の約２０〜２４週間後、マウスは回収され、大動脈が洗浄され、固定され、マウントされ、オイルレッドＯで染色され、そしてアテローム性斑領域が定量された。コントロール未処置マウスまたは無関係なｒＡＡＶベクターで処置したマウスは、著しいアテローム硬化症病変形成を示した。対照的に、血漿総コレステロール値に大きな相違はないにもかかわらず、ｒＡＡＶ−２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏおよびｒＡＡＶ−５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注射群は、斑形成における有意な減少（それぞれ５８％および５０％）を示した骨髄由来の単球およびマクロファージが、アテローム発生において中心的な役割を果たすので、ｒＡＡＶおよびＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄細胞の移植もまた、おそらくアテローム硬化症病変における形質導入マクロファージの局在化に起因して、斑形成を減少させるという仮説が立てられた。致死的に放射線照射されたＡｐｏＥ−／−マウスは、ｒＡＡＶ形質導入細胞を移植され、そして高脂肪食餌が３週間後に開始された。移植の２２〜２４週間後、マウスを安楽死させ、そして大動脈を、アテローム性斑について分析した。未移植マウスならびに非形質導入骨髄移植マウスおよびコントロールｒＡＡＶ形質導入骨髄移植マウスは、ネガティブコントロールとして役立った。野生型Ｂ６からＡｐｏＥ−／−への移植体は、斑減少についてのポジティブコントロールとして役立った。結果は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶ−２ベクターおよびｒＡＡＶ−５ベクターを形質導入した細胞を移植した後の、大動脈形成におけるそれぞれ４１％および４７％の減少を明らかにした。これらの結果は、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射またはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄細胞の移植のどちらも、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターでの単回治療後の、アテローム発生の有意な長期的阻害をもたらすことを示唆する。
【００４７】
本発明の方法は、アテローム硬化症の処置、予防、阻害、安定化および／または後退の誘導、ならびに、アテローム硬化症（またはアテローム発生）が役割を果たしている任意の疾患または生理学的状態の処置、予防、阻害および／または安定化に関連する。さらに、本発明の方法は、以下のような侵襲性技術によって惹起される、アテローム硬化症の標的化において特に有用であり得る：経皮経管冠状動脈形成（「ＰＴＣＡ」）；バイパス移植片の挿入またはステントの挿入；ステント設置後の再狭窄の処置；または、バイパス移植片挿入の結果。上述の適用の各々は、本発明の範囲内であることが企図される。なおさらに、本発明の方法から利益を受け得る他の疾患および生理学的状態は、当業者に容易に理解され、そしてまた本発明の範囲内であることが企図される。
【００４８】
本発明は、冠状動脈性の心臓病および／または血管疾患の処置のための、遺伝子治療アプローチに基づく。本発明の１つの実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉコード配列またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏコード配列に関連する異種ＤＮＡを含むｒＡＡＶビリオンは、当該分野で公知の任意の従来技術によって作製される。例として、目的のＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ ＤＮＡを含む本発明の組換えＡＡＶビリオンは、標準的方法論によって作製され得、この方法論は、以下の工程を包含する：（１）ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞内に導入する工程；（２）ＡＡＶヘルパー構築物を宿主内に導入する工程であって、このヘルパー構築物は、ＡＡＶベクターから失われているＡＡＶヘルパー機能を補完するために宿主細胞内に発現され得るＡＡＶコード領域を含む工程；（３）１以上のヘルパーウイルスおよび／または付属機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ベクターを宿主細胞に導入する工程であって、ここで、このヘルパーウイルスおよび／または付属機能ベクターは、宿主細胞における効率的なｒＡＡＶビリオン産生を支持可能な付属機能を提供する工程；ならびに（４）宿主細胞を培養し、ｒＡＡＶビリオンを産生する工程。ＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー構築物およびヘルパーウイルスまたは付属機能ベクターは、標準的トランスフェクション技術を用いて、同時的または連続的に宿主細胞内に導入される。当業者に容易に理解されるように、任意の数の他のアプローチもまた使用され得る。
【００４９】
ＡＡＶベクターは、少なくとも以下の、転写の方向で作動可能に連結した構成部分を提供するように、公知の技術を用いて構築される：（ａ）転写開始領域を含む制御エレメント、（ｂ）目的のＡｐｏＡ−Ｉ ＤＮＡまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ ＤＮＡおよび（ｃ）転写終止領域。さらに、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏに相同な任意のコード配列が、（ＡｐｏＡ−Ｉコード配列またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏコード配列と実質的に同様の機能特性を示すように）本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。制御エレメントは、標的細胞内で機能的であるように選択される。得られた構築物（作動可能に連結した構成部分を含む）は、５’および３’で機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合され得る。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のこのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、以下を参照：Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）（ＡＡＶ−２配列について）。ＡＡＶ ＩＴＲは、本発明のベクターにおいて使用され、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、そして（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）改変されていてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由来してもよく、これらの血清型としては、非限定で、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０などが挙げられる。例えば、Ｇａｏら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；７８（１２）：６３８１−８；Ｗｅｉｔａｍａｎ Ｍ．ら（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｚ．ら（２００５）；およびＷａｎｇ，ら（２００５）を、参照。その上さらに、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、意図されるように（すなわち、結合した目的のＡｐｏ−Ｉヌクレオチド配列またはＡｐｏ−ＩＭｉｌａｎｏヌクレオチド配列の切り出しおよび複製を可能にするように）機能する限り、同一である必要はなく、または同じＡＡＶ血清型に由来するかまたは異なるＡＡＶ血清型に由来する。
【００５０】
ＡＡＶ ＩＴＲ内のＡｐｏ−Ｉ導入遺伝子またはＡｐｏ−ＩＭｉｌａｎｏ導入遺伝子をコードするｒＡＡＶゲノムは、いずれかのＡＡＶ血清型（ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０などが挙げられる）に由来するビリオンカプシド内に包まれ得る。例えば、Ｇａｏら（２００４）；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．ら（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｚ．ら（２００５）；およびＷａｎｇ，Ｌ．ら（２００５）を、参照。
【００５１】
上述のビリオンは、冠状動脈性の心臓病および／または血管疾患の予防および処置のために有用であり、したがって、有効量のｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターを、無機または有機の、固体または液体の、薬学的に受容可能なキャリアと混合して含む、薬学的組成物の製造のために有用である。したがって、本発明の別の局面は、本明細書中で記載される冠状動脈性の心臓病および／または血管疾患を予防しそして処置するための組成物であり、この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤と併用される。
【００５２】
本発明に従う薬学的組成物は、ヒトへの経口投与、経皮投与、局所投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与または静脈内投与）に適した薬学的組成物であり、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターを、薬学的に受容可能なキャリアとともに含有する。用量は、種々の因子（例えば、年齢、体重、血管状態の重篤度および医師によって認められる他の因子）に依存する。
【００５３】
特定の実施形態において、治療的組成物は、坐剤を介して、または経口送達のための錠剤処方物もしくはカプセル剤処方物中で、投与される。通常、経口処方物は、結合剤、フィラー、キャリア、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝液、および、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤のような、普通に使用される添加剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、腸溶性薬物（ｅｎｔｅｒｉｃ）、徐放性処方物、散剤などの形態をとる。遺伝子治療のための経口処方物は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（２００４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １０（１）：１１２−１１６を参照のこと。さらに、他の経口処方物が、当業者に理解されるように、本発明における使用を意図される。
【００５４】
他の投与様式（例えば、経皮投与および局所投与）に適したさらなる処方物としては、軟膏、チンキ剤、クリーム剤、ローション剤、経皮パッチ、移植皮膚、遺伝子改変した皮膚、ステントコーティングおよび坐剤が挙げられる。軟膏およびクリーム剤については、代表的な結合剤、キャリアおよび賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる。特定の実施形態において、経皮パッチが、治療法を送達するために使用され得る。例えば、米国特許第４，６３８，０４３号を参照。遺伝子治療のための経皮処方物および局所処方物は、当該分野で公知である。例えば、Ｊｅｎｓｅｎ，ＴＧ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．４（５）：６７７−８２を参照。さらに、他の経皮処方物および局所処方物が、当業者に理解されるように、本発明における使用を企図される。
【００５５】
非経口投与のために特に適した投薬形態は、水溶性形態（例えば、水溶性の塩または滅菌水溶性注射用懸濁液）の薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターの、滅菌水溶液であって、これらは、粘性を高める物質（例えば、ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストラン）および必要に応じて安定剤を含有する。さらに、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターは、アジュバントとともにまたはアジュバントなしで、凍結乾燥形態になり得、適切な溶媒の添加により、非経口投与の前に溶液中に入れられる。
【００５６】
一般に、本発明の注射可能組成物は、注射のために準備された溶液、もしくは、使用直前に溶媒と合わせるように準備された乾燥水溶性組成物、または、投与の前に希釈するように準備された液体濃縮物であり得る。注射用の組成物の調製においては、刺激を避けるため、張度の調節に非常に注意を払わなければならない。
【００５７】
このビヒクルは、普通は治療活性を有さずかつ非毒性であるであるが、吸収に適した形態において、身体組織に対し、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターを提示する。吸収は、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターが水溶液として提示される時に、迅速かつ完全に起こる。しかし、水混和性の液体でのヒビクルの改変または水非混和性の液体との置き換えは、吸収速度に影響し得る。皮下注射に適した組成物の調製において、水溶性ビヒクル、水混和性ビヒクルおよび非水溶性ビヒクルを使用し得る。特定の水溶性ビヒクルは、その非経口の正当な使用のために、公的に認識されている。
【００５８】
水混和性ビヒクルはまた、本発明の非経口組成物の処方においても有用である。これらの溶媒は、主に、薬学的に活性なｒＡＡＶでトランスフェクトされたベクターの、水溶性に影響を与えるために使用される。これらの溶媒としては、例えば、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが挙げられ得る。
【００５９】
本発明の注射可能組成物中に、組成物の品質を改善するかまたは保護するために、さらなる物質が含まれ得る。したがって、加えられた物質は、水溶性に影響し得、患者の快適さ、化学的安定性の増大、または微生物の増殖に対する保護調製を提供する。したがって、この組成物は、適切な水溶化剤、溶液を等張にする物質、抗酸化剤として作用する物質、および微生物の増殖を阻止するための保存剤として作用する物質を含有し得る。これらの物質は、本明細書中で企図されるような疾患状態の処置の折に、その機能のために適切であるが組成物の作用に悪影響を及ぼさない量で存在する。
【００６０】
一般に、本発明の種々の実施形態に従って哺乳動物に送達されるのに適した、本発明の滅菌非経口注射可能組成物および他の治療処方物は、当業者により、慣用的な実験によって容易に調製され得る。適切な薬学的処方物が提供されるための手引きは、以下による：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版。
【００６１】
本発明の実施形態に従い、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶビリオンは、遺伝子導入に影響を及ぼすのに十分な量かつ十分な送達経路で、哺乳動物に送達される。以下の実施例に記載されるように、本発明は、哺乳動物におけるアテローム硬化症に対する有効な処置を提供する。種々の実施形態において、十分かつ治療的な量は、インビボで、約１×１０１０ベクターゲノム／ｋｇから約１×１０１４ベクターゲノム／ｋｇまでのｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩベクターまたはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターであり得る。本発明の１つの実施形態において、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターは、まず、多分化能幹細胞（例えば、骨髄細胞、血液幹細胞、間質細胞、間葉幹細胞など）を、一定量のｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターで形質導入し、次いで、これらの細胞を哺乳動物内に移植することによって、被験体に送達され得る。代替の実施形態において、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターは、当業者に容易に理解されるように、哺乳動物内に、直接、筋肉内注射または静脈内注射により導入され得るか、ＰＴＣＡの部位またはステント設置により直接的に動脈内に導入され得る。これは、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの循環への直接的な分泌か、またはアテローム性（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）斑領域における局所的な分泌をもたらす。さらに、本発明のｒＡＡＶビリオンは、当業者に容易に理解されるように、単回投与として送達され得るか、または（例えば、毎日、毎週または任意の他の適切な時間間隔での）処置レジメンとして送達され得る。本発明の別の実施形態において、ｒＡＡＶビリオンの１つの血清型が、単回投与として送達され得、その後、ｒＡＡＶビリオンの異なる血清型が送達される。
【００６２】
本発明はまた、被験体におけるアテローム硬化症および関連疾患状態の処置のためのキットに関する。このキットは、材料および構成要素の集合であり、本発明の種々の実施形態に従い、ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの被験体への有効な遺伝子導入の少なくとも１つの手段を備える。本発明のキットを構成する構成要素の正確な性質は、意図する目的および使用される特定の方法論に依存する。例えば、このキットのいくつかの実施形態は、哺乳動物被験体におけるアテローム硬化症および／または関連疾患状態を処置する目的のために構成されている。他の実施形態は、例えば血管形成またはステント設置のような別の治療の結果であるアテローム硬化症の発症を予防する目的で構成されている。１つの実施形態において、このキットは、特にヒト被験体を処置する目的で、構成される。
【００６３】
指示書が、キットの中に含まれ得る。「指示書」は、代表的に、ビリオンの調製および／または少なくとも１つの方法パラメータ（例えば、ＡＡＶ−ＡｐｏＡ−Ｉベクターゲノムおよび／またはｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターゲノムの相対量、投薬条件および投与指示など）を、代表的に意図される目的のために記載する、具体的な表現を含む。必要に応じて、このキットは、他の有用な構成要素（例えば、希釈剤、緩衝液、薬学的に受容可能なキャリア、生検容器、シリンジ、ステント、カテーテル、ならびにピペット用具および測定用具）を含み得る。
【００６４】
キット中に集められた材料および構成要素は、任意の便利かつ適切な（その操作性および有用性を保存する）方法で保管されて、医師に提供され得る。例えば、構成要素は、溶解形態、脱水形態または凍結乾燥形態であり得る；これらは、室温、冷蔵温度、または冷凍温度で提供され得る。構成要素は、代表的に、適切な包装材の中に含まれる。本明細書中に使用されるように、語句「包装材」は、このキットの内容物を収容するために使用される、１以上の物理的構造体をいう。包装材は、周知の方法によって構築され、好ましくは、滅菌の汚染物を含まない環境を提供する。このキットにおいて使用される包装材は、当該分野で慣習的に利用されている。本明細書中で使用される場合、用語「包装」は、適切なしっかりした母型または材質（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔など）であり、個々のキット構成要素を包むことが可能である。したがって、例えば、包装は、一定容量のｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩベクターおよびｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏを含有する適切な量の組成物を含むために使用される、ガラスバイアルであり得る。包装材は、一般に、内容物および／またはキットの目的および／またはその構成要素を示す、外側ラベルを有する。
【００６５】
本発明のツール、キットおよび方法は、アテローム硬化症および関連の疾患状態を処置するための遺伝子治療アプローチに関連して実施され得る。したがって、本発明の種々の実施形態は、上述の疾患状態の予防のための手段を提供する。本発明の実施形態はまた、進行中または完了した治療的介入の成功のモニタリングに関連する。例えば、被験体の血清は、処置の前（ＡｐｏＡ−Ｉおよび／またはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの循環レベルについてスクリーニングするため）；処置の経過の間（例えば、有効な処置レジメンを実施する医師の能力を増強するため）；および／または介入の完了後（例えば、生活様式の変化、血管形成手術およびバイパス手術のような成功のレベルを決定するため）に試験され得る。
【実施例】
【００６６】
（実施例）
以下の実施例は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターを使用してアテローム硬化症を処置する遺伝子治療の成功を実証する。これらの実施例は、インビボ（筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質導入造血前駆細胞の移植のいずれか）で、ベクターの成功をさらに実証する。これらの例は、例示の目的にのみ関し、本発明は、これらの実施例に記載されない多くの方法において実施され得る。
【００６７】
（実施例１）
（組換えアデノ関連ウイルスベクター）
本発明のｒＡＡＶベクターの構築を、宿主細胞の２つの異なるプラスミドでの共トランスフェクションによって完了した。ｒＡＡＶビリオンを、種々のＡＡＶ血清型に由来するプラスミドで調製した。第１のプラスミドの各々において、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏを、２つのシス作動性ＡＡＶ ＩＴＲの間にはさんだ。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶｃａｐタンパク質は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質についてのウイルスオープンリーディングフレームをコードする第２のプラスミドにより、トランスで提供された。１つのビリオンにおいて、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２に由来した（Ｒｅｐ２Ｃａｐ２）。第２のビリオン（ｒＡＡＶ５）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型５に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型５に由来した（Ｒｅｐ５Ｃａｐ５）。第３のビリオン（ｒＡＡＶ１）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型１に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ１）。第４のビリオン（ｒＡＡＶ７）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型７に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ７）。第５のビリオン（ｒＡＡＶ８）において、第１のプラスミドゲノムはＡＡＶ血清型２に由来し、そして第２のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型８に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ８）。第６のビリオン（ｒＡＡＶ９）において、第１のプラスミドゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来し、第２のプラスミドは、ＡＡＶ血清型２およびＡＡＶ血清型９に由来する（Ｒｅｐ２Ｃａｐ９）。他のビリオンは、当業者に理解されるように、本発明の一部として容易に実施され得る。
【００６８】
（実施例２）
（動物手順）
８〜１２週齢のＡｐｏＡ−Ｉ欠損マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、ウイルス導入のために使用した。マウスを、ｒＡＡＶの尾静脈内注射および後脚への筋肉内注射のために拘束した。血液サンプルを、眼窩後採血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）により得、ここで、動物をイソフルレンで安楽死させた。実験動物の使用は、ＣＳＨＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従った。
【００６９】
（実施例３）
（ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターは、動物モデルにおいて抗アテローム発生特性を示す）
ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターの抗アテローム発生特性を、ホモ接合体トランスジェニックアポリポタンパク質Ｅ（「ＡｐｏＥ」）−／−マウスにおいて試験した。これらのマウスは、高脂肪食餌を与えた場合、大血管アテローム性斑を発達させる。アテローム発生において中心的役割を果たす泡沫細胞は、骨髄由来のマクロファージから生じ、野生型骨髄細胞の移植は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいてアテローム硬化症の発症を予防することが示されている。この研究において、形質導入した骨髄細胞の移植は、アテローム硬化症の発達から防護するという仮説を、試験した。ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄細胞の移植の、アテローム硬化症の程度の低減における効力を、直接の筋肉内ベクター注射と比較した。直接の筋肉内ベクター注射は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの循環中への直接的な分泌をもたらす。
【００７０】
移植片について、１０，０００，０００のＡｐｏＥ−／−骨髄細胞を、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏで、５０００の感染効率（ＭＯＩ）で一晩形質導入し（３７℃、ＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍｌおよびＳＣＦ １ｎｇ／ｍｌ）、洗浄し（３回）、そして６〜８週齢の、致死的に放射線照射した雄ＡｐｏＥ−／−マウスに、尾静脈を介して（１１００ｃＧｙ、２回に分けて）移植した。筋肉内注射について、６〜８週齢ＡｐｏＥ−／−マウスに、１〜５×１０１２ベクターゲノム／ｋｇを（２×５０μＬを腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）中に）注射した。高脂肪食餌を、骨髄移植の３週間後、筋肉内注射の２週間後から開始した。測量および後眼窩採血を、２週間の間隔で行った。
【００７１】
約２０〜２４週間後、大動脈弓から大腿の分岐部に広がる大動脈および大血管を単離し、オイルレッドＯで染色し、そしてアテローム性斑の拡大を定量した。ネガティブコントロールとしては、無関係のｒＡＡＶで形質導入した細胞の移植、非形質導入移植片、および未操作マウスが挙げられる。ポジティブコントロールとしては、野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ骨髄細胞の放射線照射ＡｐｏＥ−／−マウスへの移植が挙げられる。
【００７２】
全てのＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処理群は、斑形成における著しい減少を示したが、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入骨髄の移植およびｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射は、コントロールと比較して、大動脈アテローム性斑形成における有意な（約５０〜６０％）減少を示した。これらの結果は、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質導入多分化能幹細胞の移植および直接筋肉内注射は、アテローム硬化症の発達を制御するための新規の有効な戦略を示唆する。
【００７３】
（実施例４）
（動物モデルにおいて実証される、筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質誘導骨髄細胞の移植によるアテローム発生の長期的阻害）
ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶベクターのアテローム硬化症の遺伝子治療へのインビボの有効性を、試験した。特に、筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質導入骨髄細胞の移植のいずれかの後の、これらのベクターの有効性を、試験した。
【００７４】
ＡｐｏＥ−／−マウスに、約１０１２ベクターゲノム／ｋｇを、６〜８週齢で注射し、そして２週間後、高脂肪食餌に置いた。処置群の間に、主要な体重の相違は観察されなかった。注射の２０〜２４週間後、マウスを回収し、大動脈を洗浄し、固定し、マウントし、オイルレッドＯで染色して、アテローム性斑領域を定量した。コントロール未処置マウスまたは無関係なｒＡＡＶベクターで処置したマウスは、著しいアテローム硬化症病変の形成を示した。対照的に、血漿総コレステロール値には大きな相違がないにもかかわらず、ｒＡＡＶ−２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注射群およびｒＡＡＶ−５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ注射群は、斑形成において有意な減少（それぞれ５８％および５０％）を示した。
【００７５】
骨髄由来の単球およびマクロファージが、アテローム発生において中心的な役割を果たすので、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ形質誘導骨髄細胞もまた、形質誘導マクロファージのアテローム硬化症病変内の局在に起因して、斑形成における減少をもたらすとの仮説を立てた。
【００７６】
致死的に放射線照射したＡｐｏＥ−／−マウスに、ｒＡＡＶ形質誘導細胞を移植し、そして２週間後に高脂肪食餌を開始した。移植の約２２〜２４週間後、マウスを安楽死させ、そして大動脈を、アテローム性斑について分析した。未移植マウスならびに未形質導入骨髄移植マウスおよびコントロールｒＡＡＶ形質導入骨髄移植マウスは、ネガティブコントロールとして役立った。野生型Ｂ６からＡｐｏＥ−／−への移植体は、斑減少についてのポジティブコントロールとして役立った。結果は、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをコードするｒＡＡＶ−２ベクターおよびｒＡＡＶ−５ベクターで形質導入した骨髄細胞移植後の、アテローム形成における、それぞれ４７％および４９％の減少を明らかにした。
【００７７】
これらの結果は、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射またはｒＡＡＶ形質導入骨髄細胞の移植が、ｒＡＡＶベクターでの単回処理後の、アテローム発生の長期的阻害をもたらすことを示唆する。
【００７８】
（実施例５）
（ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの骨髄移植（ｔｒａｎｓｌａｎｔ））
１０，０００，０００のＡｐｏＥ−／−骨髄細胞を、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏで、５０００の感染効率（ＭＯＩ）で、一晩形質導入し（３７℃、ＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍｌおよびＳＣＦ １ｎｇ／ｍｌ）、洗浄し（３回）、そして尾静脈を介して６〜８週齢の致死的に放射線照射したＡｐｏＥ−／−マウスに（１１００ｃＧｙ、２回に分けて）移植した。高脂肪食餌を、全ての処置群について、手順の３週間後に開始した。野生型骨髄を移植したＡｐｏＥ−／−マウスを、実験のポジティブコントロールとして使用した。図１３参照。
【００７９】
（実施例６）
（ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射）
筋肉内注射について、６〜８週齢のＡｐｏＥ−／−マウスに、１〜５×１０１２ベクターゲノム／ｋｇを（２×５０μＬを腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）中に）注射した。高脂肪食餌を、注射の２週間後に開始した。図１４参照。
【００８０】
上の記載は、本発明の特定の実施形態を言及するが、多くの改変が本発明の精神から逸脱することなくなされることが、理解される。例えば、当業者に周知の代替の方法論および手順は、本発明と関連して記載されるｒＡＡＶ形質導入手順に置き換えられ得る。このような代替の方法論および手順は、過度の実験を要せずに容易に実施され得る。従って、ここで開示された実施形態は、全ての局面において例示としてみなされるべきであり、限定としてみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従う、ＡｐｏＥ−／−マウスのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクターによる筋肉内注射後の上清ＡｐｏＡ−Ｉレベルを示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従う、筋肉内注射後のＡｐｏＥ−／−マウスの体重を、コントロールベクター処置、ｒＡＡＶベクター処置、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置およびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置について示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従う、筋肉内注射後のＡｐｏＥ−／−マウスの血漿コレステロールレベルを、コントロールベクター処置、ｒＡＡＶベクター処置、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置およびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏベクター処置について示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入において、体重（図４Ａ）または血漿コレステロールレベル（図４Ｂ）で違いがないことを示す。
【図５Ａ】図５は、本発明の実施形態に従う、ネイティブな大動脈のアテローム硬化症に対する筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の効果を示す。図５Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールのベクター処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの切除した大動脈サンプルの写真を示す。図５Ｂは、図５Ａの写真の大動脈サンプルにおけるプラークの相対的な％を示す。
【図５Ｂ】図５は、本発明の実施形態に従う、ネイティブな大動脈のアテローム硬化症に対する筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の効果を示す。図５Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールのベクター処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの切除した大動脈サンプルの写真を示す。図５Ｂは、図５Ａの写真の大動脈サンプルにおけるプラークの相対的な％を示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片プラークのサイズに対する効果を示す。
【図７Ａ】図７は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片におけるマクロファージ（ＭＯＭＡ）免疫反応性に対する効果を示す。図７Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置され、染色されたサンプルのマクロファージの写真を示す。図７Ｂは、図７Ａの写真におけるＭＯＭＡ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図７Ｂ】図７は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片におけるマクロファージ（ＭＯＭＡ）免疫反応性に対する効果を示す。図７Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置され、染色されたサンプルのマクロファージの写真を示す。図７Ｂは、図７Ａの写真におけるＭＯＭＡ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図８Ａ】図８は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片中の脂質内容物に対する効果を示す。図８Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置されたマウスにおいて、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図８Ｂは、図８Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図８Ｂ】図８は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の静脈移植片中の脂質内容物に対する効果を示す。図８Ａは、ＰＢＳ、コントロールベクター、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって処置されたマウスにおいて、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図８Ｂは、図８Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図９】図９は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の、大動脈洞プラークのサイズに対する効果を示す。
【図１０Ａ】図１０は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の、大動脈洞中のマクロファージ免疫反応性に対する効果を示す。図１０Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの染色されたサンプルの写真を示す。図１０Ｂは、図１０Ａの写真におけるマクロファージ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子導入の、大動脈洞中のマクロファージ免疫反応性に対する効果を示す。図１０Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの染色されたサンプルの写真を示す。図１０Ｂは、図１０Ａの写真におけるマクロファージ免疫反応性の相対的な％を示す。
【図１１Ａ】図１１は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ 遺伝子導入の大動脈洞中の脂質内容物に対する効果を示す。図１１Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図１１Ｂは、図１１Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、本発明の実施形態に従う、筋肉内へのｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ 遺伝子導入の大動脈洞中の脂質内容物に対する効果を示す。図１１Ａは、ＰＢＳ処置マウス、コントロールベクター処置マウス、およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスの、脂質の蓄積を示す染色されたサンプルの写真を示す。図１１Ｂは、図１１Ａの写真における脂質内容物の相対的な％を示す。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態に従う、高脂肪食を与えたマウスにおける大動脈弓の病変の写真を示す。図１２Ａは、コントロールの大動脈弓を示し、そして図１２Ｂは、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって形質転換された骨髄移植組織を受容するマウスの大動脈弓を示す。図１２Ｃは、コントロールの大動脈弓およびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの筋肉内注射を受けるマウスの大動脈弓を示す。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態に従う、単離され、そしてオイルレッドＯによって染色された大動脈弓から大腿の分岐まで延びる大動脈および大血管を、高脂肪食における２０〜２４週間後のアテローム斑の程度について示す。１０００万個のＡｐｏＥ−／−骨髄細胞は、５０００の感染効率（ＭＯＩ）でｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって一晩形質転換され（３７℃、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および１ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ）、洗浄され（３回）、そして尾静脈を介して６〜８週齢の、致死的に放射線照射された雄ＡｐｏＥ−／−マウス（１１００ｃＧｙ、分割用量）中に移植された。高脂肪食は、全ての処置群に対して、上記手順の３週間後に開始された。図１３Ａは、野生型の骨髄を移植されたＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。これは、この実験のポジティブコントロールである。図１３Ｂは、ｒＡＡＶ−２−Ａｐｏ Ａ１ ｍｉｌａｎｏ形質転換された骨髄細胞を移植されたＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。オイルレッド染色されたプラークを欠くマウス（ｍｔｈｅ）に注目する。図１３Ｃは、高脂肪食下における移植物を有さないＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。多くのアテローム斑が、目視できる。図１３Ｄは、高脂肪食下における形質転換されていない骨髄移植物を有するＡｐｏＥ−／−マウスについての結果を示す。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態に従う、単離され、そしてオイルレッドＯによって染色された大動脈弓から大腿の分岐まで延びる大動脈および大血管を、高脂肪食における２０〜２４週間後のアテローム斑の程度について示す。筋肉内注射に関して、６〜８週齢のＡｐｏＥ−／−マウスは、１×１０−１２ベクターゲノム／ｋｇ〜５×１０−１２ベクターゲノム／ｋｇ（腓腹筋中に２×５０μＬ）を注射された。高脂肪食は、注射の２週間後に開始された。図１４Ａは、注射を伴わないマウスについての結果を示す。図１４Ｂは、コントロールの無関係なｒＡＡＶ−２ベクターを伴うマウスについての結果を示す。図１４Ｃは、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをＩＭ注射した後の結果を示す。図１４Ｄは、ｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏをＩＭ注射した後の結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明の実施形態に従う、単回ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ筋肉内注射の抗アテローム発生効果を示す。グラフは、コントロール処置マウス、非トランスフェクトｒＡＡＶベクター処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおけるプラークを有する大動脈の表面の％を示す。
【図１６】図１６は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの単回筋肉内注射後におけるプラーク形成の阻害を示す。グラフは、コントロール処置マウス、非トランスフェクトｒＡＡＶベクター処置マウス、ならびにｒＡＡＶ１−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウス、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスおよびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおけるプラークを有する大動脈の表面の％を示す。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの単回筋肉内注射後におけるＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈プラーク中の脂質内容物およびマクロファージ内容物の減少を示す。グラフは、コントロール処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおける、大動脈洞中の脂質の％およびマクロファージ免疫反応性の％を示す。
【図１８】図１８は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって形質転換された骨髄の移植後のＡｐｏＥヌルマウスにおけるアテローム硬化症の減少を示す。グラフは、コントロール処置マウス、非形質転換の骨髄移植物処置マウス、非トランスフェクトｒＡＡＶベクター処置マウス、ｒＡＡＶ１−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウス、ｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスおよびｒＡＡＶ５−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウス、ならびにＡｐｏＥ−／−骨髄処置マウスにおける大動脈プラークの％を示す。
【図１９】図１９は、本発明の実施形態に従う、ｒＡＡＶ−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏによって形質転換された骨髄の移植後における、ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈プラークの脂質内容物およびマクロファージ内容物の減少を示す。グラフは、コントロール処置マウスおよびｒＡＡＶ２−ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおける、大動脈洞中の脂質の％およびマクロファージ免疫反応性の％を示す。
【図２０】図２０は、本発明の実施形態に従う、ＡｐｏＡ−１（野生型）およびＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子を保有するレトロウイルスによって形質転換された骨髄の移植における、顕著な抗アテローム発生効果を示す。グラフは、コントロール処置マウス、ＡｐｏＡ−Ｉ野生型処置マウスおよびＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ処置マウスにおける大動脈のアテロームの％を示す。
【図２１】図２１は、本発明の実施形態に従う、ゲノム中に挿入されるヒトＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子をコードする野生型ｒＡＡＶベクターの構造を示す。この構築物は、遺伝子送達の後にゲノム中に挿入されるか、またはこの構築物は、ゲノムへの挿入を伴わずに細胞中で残存し得、これらの両方は、ＡＡＶに関して可能である。
【図２２】図２２は、本発明の実施形態に従う、ゲノム中に挿入されるヒトＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ遺伝子をコードするｒＡＡＶベクターの、血清型２および血清型５のベクター地図を示す。これらの構築物は、遺伝子送達の後にゲノム中に挿入されるか、またはこの構築物は、ゲノムへの挿入を伴わずに細胞中で残存し得、これらの両方は、ＡＡＶに関して起こり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを保有する細胞であって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−１もしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−１もしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子をさらに含む、細胞。
【請求項２】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞であって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞であって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、細胞。
【請求項５】
前記細胞が幹細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、以下：
（ａ）アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）；
（ｂ）ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のフラグメント；または
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の誘導体、
をコードする外来遺伝子を含む、ベクター。
【請求項９】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターであって、該ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターであって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、ベクター。
【請求項１２】
組成物であって、以下：
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子をさらに含む、ベクター；および
キャリア、
を含有する、組成物。
【請求項１３】
前記ベクターが哺乳動物への送達のために処方されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組成物であって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、組成物。
【請求項１７】
哺乳動物における状態を処置する方法であって、以下：
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する工程；および
該哺乳動物に、該状態を処置するのに十分な量の該ｒＡＡＶベクターを送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、前記状態が、冠動脈性心臓疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、アテローム発生、血管炎症、サイトカインもしくは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症反応もしくは免疫応答の抑制もしくは悪化、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記状態の処置に十分な量が、前記哺乳動物１ｋｇあたり約１×１０１０ベクターゲノム〜該哺乳動物１ｋｇあたり約１×１０１４ベクターゲノムである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターが、前記哺乳動物に、筋肉内送達されるか、静脈内送達されるか、または筋肉内送達かつ静脈内送達される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１７に記載の方法であって、前記ｒＡＡＶベクターを提供する工程が、一定量の該ｒＡＡＶベクターで多能性幹細胞に形質導入する工程をさらに包含し、そして該ｒＡＡＶベクターを送達する工程が、該多能性幹細胞を前記哺乳動物に移植する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物における疾患状態を処置するためのキットであって、以下：
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子を含む、一定量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；および
該哺乳動物における状態を処置するために該量のｒＡＡＶベクターを使用するための、指示書、
を備える、キット。
【請求項２８】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
請求項２７に記載のキットであって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、キット。
【請求項３０】
請求項２９に記載のキットであって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、キット。
【請求項３１】
請求項２７に記載のキットであって、前記状態が、冠動脈性心臓疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、アテローム発生、血管炎症、サイトカインもしくは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症反応もしくは免疫応答の抑制もしくは悪化、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、キット。
【請求項３２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載のキット。
【請求項３３】
前記ベクターが多能性幹細胞へと形質導入される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３４】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ｒＡＡＶベクターを調製する方法であって、以下：
（ｉ）アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子を含む、第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
を包含し、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、方法。
【請求項１】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを保有する細胞であって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−１もしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−１もしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子をさらに含む、細胞。
【請求項２】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞であって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞であって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、細胞。
【請求項５】
前記細胞が幹細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、以下：
（ａ）アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）；
（ｂ）ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のフラグメント；または
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の誘導体、
をコードする外来遺伝子を含む、ベクター。
【請求項９】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターであって、該ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターであって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、ベクター。
【請求項１２】
組成物であって、以下：
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子をさらに含む、ベクター；および
キャリア、
を含有する、組成物。
【請求項１３】
前記ベクターが哺乳動物への送達のために処方されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組成物であって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、組成物。
【請求項１７】
哺乳動物における状態を処置する方法であって、以下：
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する工程；および
該哺乳動物に、該状態を処置するのに十分な量の該ｒＡＡＶベクターを送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、前記状態が、冠動脈性心臓疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、アテローム発生、血管炎症、サイトカインもしくは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症反応もしくは免疫応答の抑制もしくは悪化、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記状態の処置に十分な量が、前記哺乳動物１ｋｇあたり約１×１０１０ベクターゲノム〜該哺乳動物１ｋｇあたり約１×１０１４ベクターゲノムである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターが、前記哺乳動物に、筋肉内送達されるか、静脈内送達されるか、または筋肉内送達かつ静脈内送達される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１７に記載の方法であって、前記ｒＡＡＶベクターを提供する工程が、一定量の該ｒＡＡＶベクターで多能性幹細胞に形質導入する工程をさらに包含し、そして該ｒＡＡＶベクターを送達する工程が、該多能性幹細胞を前記哺乳動物に移植する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物における疾患状態を処置するためのキットであって、以下：
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子を含む、一定量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；および
該哺乳動物における状態を処置するために該量のｒＡＡＶベクターを使用するための、指示書、
を備える、キット。
【請求項２８】
前記外来遺伝子がＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
請求項２７に記載のキットであって、前記ｒＡＡＶベクターが、以下：
（ｉ）前記外来遺伝子を含む第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
のプロセスによって生成され、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、キット。
【請求項３０】
請求項２９に記載のキットであって、前記第２のプラスミドが、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶレスキュー構成要素およびＡＡＶパッケージング構成要素をさらに含み、該血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、キット。
【請求項３１】
請求項２７に記載のキットであって、前記状態が、冠動脈性心臓疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、アテローム発生、血管炎症、サイトカインもしくは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症反応もしくは免疫応答の抑制もしくは悪化、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、キット。
【請求項３２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載のキット。
【請求項３３】
前記ベクターが多能性幹細胞へと形質導入される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３４】
前記細胞が骨髄細胞である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ｒＡＡＶベクターを調製する方法であって、以下：
（ｉ）アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）、ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ、ＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏのフラグメント、またはＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの誘導体をコードする外来遺伝子を含む、第１のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉ）該第１のプラスミドに相補的であり、かつレスキューおよびパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供する工程、
（ｉｉｉ）該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとを宿主細胞に同時トランスフェクトする工程、および
（ｉｖ）該同時トランスフェクトされた宿主細胞から一定量の該ｒＡＡＶベクターを生成する工程、
を包含し、ここで、該第１のプラスミドと該第２のプラスミドとの対が、該ｒＡＡＶベクターが特定の組織型への送達を目標とするように選択される、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２００７−５３１５３７（Ｐ２００７−５３１５３７Ａ）
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０７４２５（Ｐ２００７−５０７４２５）
【出願日】平成１７年４月５日（２００５．４．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１４６６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９７２０６
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【出願人】（５９８００４４２４）シティ・オブ・ホープ (15)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
【住所又は居所原語表記】１５００ Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９１０１０−０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月５日（２００５．４．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１４６６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９７２０６
【国際公開日】平成１７年１０月２０日（２００５．１０．２０）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【出願人】（５９８００４４２４）シティ・オブ・ホープ (15)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
【住所又は居所原語表記】１５００ Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９１０１０−０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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