インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、組成物、及び治療方法
ＩＬ−１ １型受容体の生物活性を阻害し、且つＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ関連細胞シグナル伝達及び生物活性を阻害するようにデザインされたペプチドが開示される。本発明のＩＬ−１Ｒアンタゴニストを含む組成物は、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、及び炎症性大腸炎、並びに他の慢性又は急性の炎症性疾患などのＩＬ−１関連疾患又は病態の治療に有用である。また、本発明は、アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸを含むペプチド（式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される）；及びペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性維持する（ａ）の誘導体から成る群より選択される、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を有する単離化合物を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、及びそれを用いたＩＬ−１受容体活性の調節方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞外非競合的ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰ）ペプチド及びペプチド模倣アンタゴニスト、それらの同定及び治療用途に関する。より具体的には、本発明は、関節リウマチ及び炎症性大腸炎などのＩＬ−１関連疾患の治療に使用するためのペプチド及びペプチド模倣アンタゴニストに関する。本発明は、生化学及び医薬品化学の分野へ応用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
サイトカインは、生物学的に活性なホルモン様タンパク質（インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、成長因子）を示す総称であり、受容体のスーパーファミリーによってその効果を介在する。サイトカイン及びその受容体は強力な制御ネットワークを構成しており、それによって細胞はシグナルを送り、細胞増殖及び分化、細胞死及び生存を調整する。サイトカインは、具体的に、非常に強力な生物活性を有する低分子量ペプチドであり得る。それらの作用メカニズムは、通常、オートクリン及びパラクリンであり、最終的に遺伝子発現を調節することによって作用する。
【０００３】
ポリペプチドホルモンのインターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーは、単球（ＩＬ−１の顕著な供給源である）、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞、星状細胞、上皮細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び数多くのがん細胞を含めたさまざまな細胞種によって発現されるサイトカインの重要なクラスを表す。このサイトカインファミリーは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１８を含めた７つを越える異なるが構造的に関連のある分子から成り、これらは、生物学的反応、及び天然に産生される受容体アンタゴニストであるＩＬ−１ｒａを顕在化する（Ｋｕｍａｒら、２０００）。
【０００４】
ＩＬ−１α遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子はともに２番染色体に局在する。それぞれの遺伝子は７つのエクソンを含有し、第６エクソンの領域が相同である。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βはいずれも、初めに３１ｋＤａの前駆体として産生されるが、プロテアーゼによってプロセシングされて１７、５ｋＤａの成熟タンパク質を生ずる。ＩＬ−１受容体はα型もβ型も認識し、いずれの形態も類似の生物学的特性を有する。ＩＬ−１αはマウスで顕著な形態であるが、ＩＬ−１βはヒトで顕著なサイトカインである。ＩＬ−１の生物学的特性は数多くあり、感染及び損傷に対する多くの免疫反応及び炎症反応を介在することが含まれる。
【０００５】
感染及び損傷への生体反応に対するその正常な有益効果にもかかわらず、ＩＬ−１の作用が有害な状況が明らかになっている。例えば、ＩＬ−１の不適切な産生又は反応が、関節リウマチ、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、変形性関節症、乾癬、敗血症、脳炎、及び呼吸窮迫症候群などの多くの急性及び慢性の炎症性疾患において示されている。ＩＬ−１は、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、及び多くの自己免疫疾患を含めたいくつかの他の病気において役割を果たすことが示されている。
【０００６】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、ＩＬ−６、プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2；ＣＯＸ−２及びＰＧＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）の発現誘導を介する）、及びそれ自体のような炎症性メディエーターの産生を刺激することによって、炎症の調節の上流において主要な役割を果たし、したがって、炎症プロセスを促進する。ＩＬ−１の他の生物活性は、Ｔ細胞のような数多くの細胞種の増殖及び活性化を誘導することである（Ｃｕｌｌｉｎａｎら、１９９８；Ｄｕｎｎｅ及びＯ’Ｎｅｉｌｌ、２００３）。ＩＬ−１は、関節においてコラーゲナーゼレベルを増加させることもでき、関節リウマチの免疫病理学の急性期及び慢性期に関係している。ＩＬ−１は、内皮細胞機能を変化させ、リンパ球及び白血球の滑膜組織への走化性を指示し、並びに軟骨細胞及び線維芽細胞による潜在的コラーゲナーゼの分泌を誘導することに関与することができる。ＩＬ−１は、ＴＮＦとともに、炎症性サイトカインの代表例であると考えられている。しかしながら、ＩＬ−１の効果は炎症に限定されず、このサイトカインは骨形成及びリモデリング、インスリン分泌、並びに発熱誘導においても役割を果たす。
【０００７】
主要な炎症性サイトカインとして、ＩＬ−１は、関節炎などの関節軟骨損傷のような疾患における治療行為のための潜在的に強力な標的である。北米では、変形性関節症や関節リウマチは、心疾患に次いで２番目に勤労不能を引き起こし、その罹患率は年齢と共に劇的に増加する（Ｈａｌｌｅｇｕａ及びＷｅｉｓｍａｎ、２００２）。
【０００８】
２つの異なるＩＬ−１受容体がクローニングされ、特徴付けられている：ＩＬ−１の生体作用を生ずるＩＬ−１ＲＩ（Ｓｉｍｓら、１９８９）と、ＩＬ−１ＲＩＩである。更に、受容体複合体の推定シグナル伝達サブユニットである受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）が同定されている。ＩＬ−１ＲＩ型は主にＴ細胞、表皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、及び上皮細胞に見出される。生体作用を生ずるには、ＩＬ−１ＲはＩＬ−１に結合し、続いてＩＬ−１ＲａｃＰに結合してシグナル伝達を誘引する必要がある。ＩＬ−１Ｒの細胞外部分は、ＩＬ−１に結合する３つのＩｇ様ドメインを含有する（Ｖｉｇｅｒｓら、１９９７；Ｖｉｇｅｒｓら、２０００）。ＩＬ−１Ｒ受容体サブユニットとは対照的に、そしてＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質の細胞外部分に対する抗体に関与する研究によれば、後者はサイトカインと相互作用しない（Ｃｕｌｌｉｎａｎら、１９９８；Ｌａｙｅら、１９９８；Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｙら、１９９８；Ｃａｓａｄｉｏら、２００１）。
【０００９】
ＩＬ−１が結合した後のシグナル伝達の最初のイベントは、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ複合体の形成であり、これは、複合体へのＩＲＡＫ（ＩＬ−１受容体結合キナーゼ）動員、及びキナーゼによるリン酸化カスケードをもたらし、ＮＦκＢ及びＡＰ−１を含めた転写因子の活性化を引き起こす。ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ複合体は、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのようなキナーゼを動員して活性化することもでき、シグナル伝達のＰＬＣ／ＰＫＣ経路の活性化をもたらすこともできる（Ｄａｕｎ及びＦｅｎｔｏｎ、２０００）。
【００１０】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの２つの主要な臨床応用は、関節炎及び炎症性大腸炎（ＩＢＤ）の治療である。これらの病状に利用可能な治療は現在限られている。それらは毒性及び副次的効果を生ずることが多い。したがって、より安全で標的化した治療に対する医学界の要求は無視できない。
【００１１】
ＩＢＤ及び関節リウマチ療法の分野における最近のアプローチには、可溶性受容体、ＩＬ−１Ｒ及びＴＮＦＲに対するモノクローナル抗体、サイトカイン模倣薬、アンチセンス技術、並びにキナーゼ阻害剤の開発が含まれる（Ｖｉｇｅｒｓら、１９９７；Ｖｉｇｅｒｓら、２０００；Ｈａｌｌｅｇｕａ及びＷｅｉｓｍａｎ、２００２；Ｂｏｕｍａ及びＳｔｒｏｂｅｒ、２００３）。ＩＬ−１の具体的な場合では、天然可溶性受容体ＩＬ−１Ｒａ模倣薬であるアナキンラ（一般名キネレット（商標））が、メトトレキセート（ジヒドロ葉酸（葉酸）還元酵素阻害剤）の代わりに重症の活性な関節リウマチを治療するためにアムジェンによって開発された。他の主要な炎症性サイトカイン受容体ＴＮＦＲの場合、２つのアンタゴニスト エタネルセプト（エンブレル（商標）、アムジェン）及びインフリキシマブ（レミケード（商標）、シェーリングプラウ)が開発されている。
【００１２】
先行技術のアンタゴニストはいずれも競合的であり（例えば可溶性受容体、抗体、サイトカイン模倣薬）、多くの場合製造費用がかかるか又はｉｎ ｖｉｖｏで適用困難である（例えばアンチセンス）。リガンドは受容体濃度を遙かに超えているため、ＩＬ−１とその天然受容体との相互作用を阻害するために要する競合的阻害剤の濃度は相当量であることが多い。
【００１３】
したがって、ＩＬ−１によって介在される活性を下方制御できる新規療法に対する必要性が残されている。
本発明は、これらの必要性及び他の必要性を満たすことを求めている。
【００１４】
本明細書は、多くの文献を参照し、それらの内容は本明細書にその全体が援用される。
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【非特許文献５２】Ｔｏｒｒｅｓ ＭＩ、Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎ Ｍ．ら（１９９９）．「トリニトロベンゼンスルホン酸によって誘導された実験的大腸炎。微細構造的組織化学的研究」Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．４４：Ｎｏ．１２：２５２３−２５２９．
【非特許文献５３】Ｖｉｇｅｒｓ，Ｇ．Ｐ．、Ｌ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）．「インターロイキン−１βと複合体を形成したＩ型インターロイキン−１受容体の結晶構造」Ｎａｔｕｒｅ、３８６（６６２１）：１９０−４．
【非特許文献５４】Ｖｉｇｅｒｓ，Ｇ．Ｐ．、Ｄ．Ｊ．Ｄｒｉｐｐｓら（２０００）．「インターロイキン−１ １型受容体に結合した小さなアンタゴニストペプチドのＸ線結晶構造」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（４７）：３６９２７−３３．
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
したがって、本発明は、非競合的な、効率的且つ選択的細胞外ＩＬ−１受容体アンタゴニストに関するものであり、先行技術のＩＬ−１受容体アンタゴニストの１以上の欠点を克服する。
【００１６】
また、本発明は、本発明の非競合的且つ選択的アンタゴニストの、ＩＬ−１関連疾患における使用に関するものである。
１つの態様では、本発明の化合物は、ＩＬ−１Ｒの生物活性を阻害し、受容体を介したシグナル伝達を妨げることによってサイトカイン活性を阻害するペプチド及びペプチド模倣薬である。したがって、ＩＬ−１介在イベントの阻害は、例えば、いくつかある炎症性疾患並びにＩＬ−１機能に関連した疾患及び病態の中で、関節リウマチ及び炎症性大腸炎などのさまざまな慢性及び急性の炎症性疾患の予防又は治療に有益な抗炎症性反応をもたらす。
【００１７】
細胞外標的を狙うようにデザインすることにより、ＩＬ−１受容体の細胞内領域を標的とする、ある公知の薬物候補とは異なり、本発明のアンタゴニストは、薬理反応を生ずるように標的細胞へ接近するために細胞膜を前もって透過性にすること又は他の破壊を必要としない。
【００１８】
それらは非競合的アンタゴニストとして機能するため、本発明のアンタゴニストは、それらが標的とする受容体を阻害するのに必要な量が競合的阻害剤と比較して少ない。
関連する態様では、本発明のアンタゴニストは有利に簡便に合成される。
【００１９】
本発明のペプチド、その誘導体及びペプチド模倣薬は、受容体活性を阻害するようにＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体複合体の特定細胞外ドメインと相互作用する。重要なことには、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬は、ＩＬ−１ＲサブユニットのＩＬ−１結合部位と相互作用せず、したがって、非競合的ペプチドアンタゴニストであると考えられる。本発明のアンタゴニストは、表示がある場合以外は全てＤ−アミノ酸である、以下のＡＰＩ−１０１配列：ＡＰＲＹＴＶＥＬＡ（配列番号１）に由来する（配列番号１３５のアスタリスクは、残基（Ｒ）がＬ−アミノ酸であることを示している、表１を参照されたい）。
【００２０】
【表１】
【００２１】
特定の理論に限定されることなく、ＩＬ−１受容体アンタゴニストは、ＩＬ−１受容体の具体的立体構造を助成し又は安定化することができ、受容体活性の阻害を生ずる。本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬はＩＬ−１依存性細胞内シグナル伝達を非競合的な方法で阻害する。これらのペプチドは、ＩＬ−１受容体のシグナル伝達に関与する細胞内受容体ドメインの活性化を有効に妨げる。疾患の発現に部分的に関与する分子（例えばサイトカイン、サイトカイン受容体、プロスタグランジン、コラーゲナーゼ分泌などのような炎症性分子）の発現をもたらすその後の細胞シグナル伝達イベントは、それによって妨げられる。
【００２２】
これらの化合物には、リード化合物、及びリード化合物と同一若しくは類似の分子構造又は形状を有するが、加水分解若しくはタンパク質分解に対する感受性、又は生物学的特性（例えば受容体に対する親和性増加）に関してリード化合物とは異なるように構築された誘導体化合物が含まれる。また、本発明は、不適切なＩＬ−１産生若しくはＩＬ−１反応に関連した病態、疾患、又は障害の治療又は予防に有用な化合物及び組成物に関する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の１以上の化合物と生理的に許容可能な担体とを含む医薬組成物にも関する。これらの医薬組成物は、経口剤形、局所クリーム、坐薬、鼻腔用スプレー、及び吸入器、並びに注射液及び輸液を含めたさまざまな形態であり得る。医薬組成物の調整方法は、『レミントンの薬学』、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イートン、ペンシルバニア州、米国が参照されるように、当該技術分野に周知である。
【００２４】
本発明の治療方法は、予防的であり、ＩＬ−１に関連する疾患又は病態を発症する危険性を低下させることができ、そして病態の緩和又は回避に用いることができる。治療剤は、好適な担体中の医薬的に許容可能な形態で、治療的に許容可能な用量で投与することができる。
【００２５】
動物の数多くの経路及び病態におけるＩＬ−１及び／又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体の機能の重要性に鑑みると、本発明は、ＩＬ−１の反応に関連した病態又は疾患の同定、検証、及び治療に対して広範な影響を及ぼす（例えばＩＬ−１の過剰発現又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰを介した異常なシグナル伝達）。
【００２６】
また、本発明は、非競合的、効率的、且つ選択的な細胞外受容体アゴニストに関するものである。更に、本発明は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）が既に炎症活性又は他の活性を示しているインターロイキン関連疾患の治療における、本発明の非競合的且つ選択的アゴニストの使用に関するものであり、１以上の本発明のアゴニストは上記の抗炎症作用又は他の活性を有するＩＬの活性を上昇させる。関連する態様では、本発明のアゴニストは、有利に簡便に合成される。本発明によるアゴニストの非限定的な例には、ペプチドＴＴＩ−１０１．１０１（配列番号１３）及びＴＴＩ−１０１．１０２（配列番号１４）、並びにペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１−１３７及びＴＴＩ−１０１−１４２（それぞれ図２９及び３０）が含まれる。
【００２７】
本発明のアゴニストが治療用途を見出すことができるサイトカイン受容体の非限定的な例には、以下が含まれる：
（１） 色素上皮由来因子。ＰＥＤＦは網膜の色素上皮細胞によって合成される、網膜の抗血管新生因子である。また、酸化ストレス及びグルタミン酸の外毒性から神経細胞を保護する。したがって、本発明のアゴニストは、網膜及び腫瘍増殖（例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、及びがん；Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅら、２００４）における異常な血管新生の症例に治療可能性を有するであろう。
（２） ＩＬ−４受容体：ＩＬ−４は、単球によるＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αのような炎症性分子の産生、及びＴ細胞によるＴＮＦ−αの産生を炎症部位で阻害できる抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−４は、結腸癌及び乳癌の増殖も阻害する。関節リウマチでは、軟骨細胞に対する保護作用及び炎症性メディエーターの産生阻害によって、抗炎症性サイトカインとしても作用する（Ｓｃｈｕｅｒｗｅｇｈら）。
（３） ＩＬ−１０サイトカインファミリー：このファミリーは全て炎症部位に対して有益な効果を有し、その抗炎症作用は創傷治癒、炎症性大腸炎、及び乾癬の症例において記載されている。ＩＬ−１０は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γのような炎症性因子の産生をＴｈ１細胞において低下させる。ＩＬ−１０は、腫瘍部位においてマクロファージの浸潤を阻害することにより腫瘍増殖を低下させる（Ｌｉら、２００４；Ａｓａｄｕｌｌａｈら、２００４）。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、ａ）ＩＬ−１Ｒに結合し、又はＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を有する、アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＡを含むペプチド、又は単離ペプチド（式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、及びＡは対応のアミノ酸を表し、ペプチドはＩＬ−１Ｒに結合できるか、又はＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を有する）；及びｂ）１つ〜４つのアミノ酸の付加、欠失、又は置換を組み込み、且つＩＬ−１Ｒへの結合に関してａ）のペプチドと競合するか、又はそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を維持するａ）の誘導体から成る群より選択される単離化合物に関する。１つの具体的な態様では、そのような誘導体は、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の付加、欠失、又は置換を組み込む。
【００２９】
１つの更なる態様では、本発明は、一般式：ＲＹＴＰＥＬＸによって特徴付けられる配列を含む、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチド、又は単離ペプチドに関するものであり、式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、及びＬは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される。また、本発明は、ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ ペプチドＲＹＴＰＥＬＸのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を維持する、この一般式の誘導体に関するものである。通常、アミノ酸の置換は、類似アミノ酸又は保存アミノ酸を用いてなされる。以下を参照されたい。
【００３０】
１つの更なる態様では、誘導体は、アミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される２以下のアミノ酸修飾をペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分に含む。１つの具体的な態様では、そのようなペプチド、単離ペプチド、又はそれらの誘導体は、１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、１０１．１０、１０１．１０６、１０１．１１６、１０１．１０８、１０１．１３５、１０１．１２８、１０１．９、１０１．１０５、１０１．１２９、１０１．１１、１０１．１２、及び１０１．１３２から成る群より選択される。更に他の具体的な態様では、アンタゴニスト化合物は、１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、及び１０１．１０から成る群より選択される。
【００３１】
更に他の態様では、本発明は、ａ）アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸを含むペプチド（式中Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される）；及びペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性を維持するａ）の誘導体から成る群より選択される、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性を有する単離化合物に関するものである。本発明は、当然ながら、そのような修飾を１つのみ、又は２つのみ有するそのような誘導体にも関するものである。そのようなアンタゴニストの例は、ペプチド１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、１０１．１０、１０１．１０６、１０１．１１６、１０１．１０８、１０１．１３５、１０１．１２８、１０１．９、１０１．１０５、１０１．１２９、１０１．１１、１０１．１２、及び１０１．１３２を含み、より好ましくはペプチド１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、及び１０１．１０を含む。
【００３２】
１つの特定の態様では、本発明は、以下の一般式によって特徴付けられる配列を含む、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチドに関するものである：
Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5 式Ｉ
式中、Ｘ、ａａ1、ａａ2、ａａ3−ａａ4、及びａａ5は、独立して選択され、
Ｘは、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ａ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ａ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ａ4、Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ｒ3Ｙ4、Ｚ3Ｙ4、Ｒ3Ｆ4、及びＹ4から選択され、式中、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、及びＦは対応のアミノ酸を表し、数はＡ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4配列中のアミノ酸の位置を表し、Ｚはシトルリンである；
Ａ1は、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、及びφから成る群より選択され、φは、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロヘキシルアラニン、アリルグリシンなどの疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する；
Ｐ2は、プロリン、アラニン、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（ＭｅＡｌａ）、トランス−４−ヒドロキシプロリン、ジエチルチアゾリジン カルボン酸（Ｄｔｃ）、及びΩから成る群より選択され、Ωは構造制約を生ずるアミノ酸を定義する（Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，Ｓら、１９９７；Ｈａｌａｂら、２０００；Ｃｌｕｚｅａｕ及びＬｕｂｅｌｌ、２００４；Ｆｅｎｇ及びＬｕｂｅｌｌ、２００１）；その非限定的な例には、アゼチジン−２−カルボン酸、ピペコリン酸、イソニペコチン酸、４−（アミノメチル）安息香酸、２−アミノ安息香酸、ニペコチン酸が含まれる；
Ｒ3は、ヒスチジン、リジン、アラニン、オルニチン、シトルリン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、及び限定されるものではないが４−アミジノフェニルアセチル、４−アミジノフェニルプロピオニル、４−アミジノフェニルグリシル、４−アミジノフェニルメチルグリシル、４−グアニジノフェニルアセチル、４−グアニジノフェニルプロピオニル、４−グアニジノフェニルグリシル、４−グアニジノフェニルメチルグリシルなどのアルギニン代用物から成る群より選択される（Ｍａｓｉｃ及びＫｉｋｅｌｊ、２００１；Ｆｅｎｇ及びＬｕｂｅｌｌ、２００１）；
Ｙ4は、残基なし、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、及びΣから成る群より選択され、Σは疎水性側鎖Σ又は芳香族側鎖を有するα−アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロヘキシルアラニン、アリルグリシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、ヒスチジン、チロシンが含まれる；
ａａ1は、スレオニン、セリン、バリン、及びηから成る群より選択され、ηは中性親水性アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ヒドロキシバリン、Ｄｅｔｔｗｉｌｅｒ及びＬｕｂｅｌｌ、２００４に記載のようなβ，β−ジアルキルセリン、ホモセリン、アロスレオニン、ヒドロキシプロリンが含まれる；
ａａ2は、イソロイシン、ロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン チアゾリジン−ａ−カルボン酸、及びφから成る群より選択され、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する（上記を参照されたい）；
ａａ3は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、α−アミノアジピン酸、及びΨから成る群より選択され、Ψは疎水性側鎖、芳香族アミン、脂肪族アミン、及び１級アリールアルキルアミンを有する３−アミノ−５−フェニルペンタン酸−α−アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、２，２−ジフェニルエチルアミン、４−フェニル−ベンジルアミンが含まれる；
ａａ4は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから選択され、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロヘキシアラニン、アリルグリシン；限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン；限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、及びフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンが含まれる。
【００３３】
他の特定の態様では、本発明は、本発明による精製されたペプチドアンタゴニスト又はその誘導体に関する。
更に他の特定の態様では、本発明は、以下の一般式のうちの１つによって特徴付けられる配列を含む、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチド又はその誘導体に関する：
Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5− 式ＩＩ
−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2 式ＩＩＩ
Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2 式ＩＶ
式中：
Ｇ1はペプチドのアミノ末端に付着し、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、アシル基（ＲＣＯ）（アセチル、メチル、エチルなど）、プロピアノイル、ブタノイル、イソプロピアノイル、イソブタノイル、又は３級アミン（ジアルキルアミノ基又はモノアルキルアミノ基）から成る群より選択される；
Ｇ2はペプチドのカルボキシ末端に付着し、残基なし、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン（限定されるものではないが、メチルアミンなど）、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミン、芳香族アミン、又はアリールアルキルアミン（限定されるものではないが、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、フェニルエチルアミンなど）、及び／又は３級アミン（ジアルキルアミノ基又はモノアルキルアミノ基）から成る群より選択される。
【００３４】
本発明の更に他の態様では、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチド又はその誘導体は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶによって定義される一般式のうちの１つによって特徴付けられる配列を有する。
【００３５】
本発明の更なる態様では、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰペプチド又はその誘導体は比較的小さな分子である。１つの態様では、ペプチドのサイズは５〜２５アミノ酸であり、より具体的には５〜１６アミノ酸であり、より具体的には５〜１０アミノ酸であり、更により具体的には５〜９アミノ酸である。
【００３６】
他の特定の態様では、本発明は、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗する、式Ｉ及び式ＩＶに由来するペプチド模倣薬に関する。より特定の態様では、本発明のペプチド模倣薬は、図２０及び図２１に表される構造によって定義される。
【００３７】
本発明によれば、下記一般式のペプチド模倣アンタゴニストが提供される
Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2
式中、Ｒ1、ａａ1、ａａ2、ａａ3、ａａ4、ａａ5、ａａ6、ａａ7、及びＲ2は独立して選択される。
【００３８】
Ｒ1は、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、アシル基（ＲＣＯ−）（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）から成る群より選択される。Ｒの非限定的な例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、及びイソブチルが含まれる。
【００３９】
ａａ1は、残基なし、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、限定されるものではないが４−アミジノフェニルアセチル、４−アミジノフェニルプロピオニル、４−アミジノフェニルグリシル、４−アミジノフェニルメチルグリシル、４−グアニジノフェニルアセチル、４−グアニジノフェニルプロピオニル、４−グアニジノフェニルグリシル、４−グアニジノフェニルメチルグリシルなどのアルギニン代用物から成る群より選択される。
【００４０】
ａａ2は、残基なし、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、トリプトファン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、及び４−クロロフェニルアラニンから成る群より選択される。
【００４１】
ａａ3は、残基なし、スレオニン、セリン、β−ヒドロキシバリン、アロスレオニン、バリン、ｔｅｒｔ−ブチルロイシン、ロイシン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、及びアラニンから成る群より選択される。
【００４２】
ａａ4は、残基なし、バリン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、及び２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸から成る群より選択される。
【００４３】
他の態様では、一体となったａａ3−ａａ4は、３−アミノインドリジジン−２−オン ９−カルボン酸、３−アミノピロリジジン−２−オン ８−カルボン酸、３−アミノキノリジジン−２−オン １０−カルボン酸、８−アミノインドリジジン−９−オン ２−カルボン酸、ジペプチド代用物、又は限定されるものではないがＨａｎｅｓｓｉａｎらに概説されている例などのβ−ターン模倣体から成ることができる。
【００４４】
ａａ5は、残基なし、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、及びα−アミノアジピン酸から成る群より選択される。
【００４５】
ａａ6は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン、限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、又はフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンから成る群より選択される。
【００４６】
ａａ7は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン、限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、又はフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンから成る群より選択される。
【００４７】
Ｒ2は、残基なし、水素、ＮＨ2、限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン、限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、フェニルエチルアミンなどの芳香族アミン及びアリールアルキルアミンから成る群より選択される。
【００４８】
一般配列Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2の残基のキラル中心の立体化学的立体配置は、Ｒ−立体配置及びＳ−立体配置、Ｄ−立体配置及びＬ−立体配置であり得ることに注目されたい。好ましい態様では、ペプチドは、全てのＤ−異性体から成る。オレフィンは、シス配置及びトランス配置であり得る。一般配列Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2のアミノ酸残基は、限定されるものではないがアザアラニン、アザチロシン、アザフェニルアラニンなどの、キラルα炭素が窒素で置換されたアザアミノ酸対応物でもよい。
【００４９】
本発明を図２０及び図２１の特定のペプチド模倣薬、並びに図２６〜図３０に例示されたものによって例示するが、本発明はあまり限定的ではない。本明細書の開示に基づいて、当該技術分野に熟練した者は、ＩＬ−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するペプチド模倣薬を容易に得、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体阻害化合物を更に同定し、又は本明細書に例示したものを改善することができる。本発明のペプチド模倣薬は、内在プロテアーゼによる分解に対する感受性が低く、したがってｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長い。
【００５０】
本発明の１つの具体的態様では、ＩＬ−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するペプチド模倣薬は、ＴＴＩ−１０１．１４０、ＴＴＩ−１０１．１４１、ＴＴＩ−１０１．１２５、ＴＴＩ−１０１．１１０、ＴＴＩ−１０１．１１１、ＴＴＩ−１０１．１３６、及びＴＴＩ−１０１．１４３から成る群より選択される。好ましい態様では、ペプチド模倣薬は、ＴＴＩ−１０１．１４０、ＴＴＩ−１０１．１４１、ＴＴＩ−１０１．１２５、及びＴＴＩ−１０１．１１０から成る群より選択される。
【００５１】
本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＩＬ−１、並びにＩＬ−１産生及びそのＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰへの結合に影響を及ぼし、そして影響される多くの因子の生物学的役割を理解するための独特の道具として有用である。本発明のペプチドアンタゴニストは、開発を容易にする、構造と活性との関係に関する重要な情報を提供するため、本発明のアンタゴニストは、ＩＬ−１受容体に結合する他の化合物の開発においても有用である。
【００５２】
本発明のアンタゴニストは、細胞表面のＩＬ−１Ｒ受容体の発現を測定するためのアッセイにおいてプローブとして用いることもできる。そのようなアッセイは、例えば組織感染又は障害に対する細胞炎症反応の程度の測定に有用であり得る。典型的には、試験対象の細胞を本発明のペプチド又はペプチド模倣に曝して細胞表面に存在する受容体に結合させ、反応した細胞を可視化する（例えば洗浄後、細胞選別、親和性クロマトグラフィ、免疫組織化学、オートラジオグラフィなど）。
【００５３】
化合物は、類似の新規ペプチド受容体アンタゴニストをスクリーニングし、又は特徴付けるためのアッセイにおいて競合的阻害剤として用いることができる。そのようなアッセイ、及びＩＬ−１Ｒ発現を測定するためのアッセイでは、本発明のペプチド又はペプチド模倣薬は修飾することなく用いることができ、又は標識することができる（即ち、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供する部分に共有結合的又は非共有結合的に連結させる）。標識の例には、125Ｉ、14Ｃ、及び3Ｈなどの放射性標識、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識（米国特許第３，６４５，０９０号）、ビオチン、アビジンなどのリガンド標識、生物発光、リン光、化学発光を含めた発光化合物、又は蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）が含まれる。
【００５４】
本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−１Ｒ反応に対するＩＬ−１α又はＩＬ−１βの効果を完全に又は部分的に阻害するように被験者に投与することができる。したがって、本発明の方法は、ＩＬ−１関連障害の治療的処置に有用である。例えば、本発明の組成物は、ＩＬ−１の不適切な産生又はＩＬ−１に対する不適切な反応に関連した症状（例えば関節リウマチ及び炎症性大腸炎）を治療するのに治療的に有効な量で投与することができる。
【００５５】
明細書及び特許請求の範囲において用いた用語について、そのような用語を与えるべき範囲を含めて明確且つ一貫した理解を提供するために、以下に多くの定義を提供する。
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いた科学用語及び技術用語並びに命名は、本発明が関連する分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるのと同一の意味を有する。分子生物用語の一般に理解される定義は、例えば、『微生物学及び分子生物学辞典』、第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、１９９４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州）、『Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓの生物学事典』（Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、１９９１、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ニューヨーク、ニューヨーク州）、Ｒｉｅｇｅｒら、『遺伝学用語解説：古典と分子』、第５版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９９１；Ａｌｂｅｒｔｓら、『細胞の分子生物学』、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、２００２；並びにＬｅｗｉｎ、『遺伝子 ＶＩＩ』、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、２０００に見出すことができる。一般に、細胞培養、感染、分子生物法のなどの手順は、当該技術分野において一般に用いられている方法である。そのような標準技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０００、『分子クローニング−実験室マニュアル』、第３版、コールドスプリングハーバー研究所）；及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４、『分子生物学の最新プロトコール』、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）などの参考書に見出すことができる。
【００５６】
本明細書において、２０の天然アミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法にしたがう。α，α−２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非慣用的アミノ酸のような立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も本発明のポリペプチドの好適な成分であり得る。非慣用的アミノ酸の例には、限定されるものではないが、シトルリン、オルニチン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチルスレオニン（ＭｅＢｍｔ）、Ｎ−メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、アミノイソ酪酸、スタチン、Ｎ−メチル−アラニン（ＭｅＡｌａ）が含まれる。
【００５７】
本明細書において芳香族アミンという用語は、６〜１０炭素原子の環を有する分子であると理解され、例には、限定されるものではないが、フェニルメチルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミン、及び飽和又は不飽和炭化水素鎖を含むアミンが含まれる。
【００５８】
本明細書において、アリールアルキルアミンという用語は、飽和又は不飽和炭化水素鎖を含むアミンであると理解される。１級アリールアルキルアミンは６〜１０炭素原子の環で構成され、例には、限定されるものではないが、フェニル、トリル、アルコキシフェニル、アルコキシカルボニルフェニル、及びハロフェニルが含まれる。
【００５９】
本明細書において、「アリール」という用語は、フェニル、１−ナフチル、及び２−ナフチルであると理解される。本明細書において、「置換アリール」という用語は、フェニル、ヘテロアリール、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、アミノ、−ＮＨ（低級アルキル）、及び−Ｎ（低級アルキル）2から成る群より選択される置換基を有するフェニル、１−ナフチル、及び２−ナフチル、並びにメチル、メトキシ、メチルチオ、ハロ、ヒドロキシ、及びアミノから成る群より選択される置換基を含む１−、２−、及び３−置換フェニル、１−ナフチル、及び２−ナフチルであると理解される。
【００６０】
本明細書において、「アルキル」という用語は、８以下の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖ラジカルであると理解される。本明細書において、「低級アルキル」という用語は、４以下の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖ラジカルであると理解され、「アルキル」という用語の好ましい下位群である。
【００６１】
本明細書において、「置換アルキル」という用語は、１以上の、好ましくは１つ、２つ、又は３つの水素原子が、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、トリフルオロメチル、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）2、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、及びカルボキシ、アリール及びヘテロアリールから成る群より選択される置換基によって置換されている、８以下の炭素原子を有するそのような直鎖又は分岐鎖ラジカルであると理解される。
【００６２】
特に断りのない限り、「ＩＬ−１」は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βのいずれか又は両方を表す。「ＩＬ」という用語は、インターロイキンの広範なファミリーを表す。
上記のように、本明細書において、２０の天然Ｌ−アミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法にしたがう。本明細書で用いたポリペプチド表記法では、標準的用法及び慣例にしたがい、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。本明細書において、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、非常の多数のアミノ酸又はイミノ酸（又はそれらの同等物）をペプチド結合によって含む高分子を表し、ポリペプチドは翻訳後修飾を含んでいても欠失していてもよい。したがって、ペプチドという用語には、改変がＩＬ−１受容体活性の調整能を変化させない限り、ＩＬ−１受容体Ｄ−アミノ酸アンタゴニストペプチド及びペプチドの他の改変型が含まれる。本発明の全てのアンタゴニストペプチドは、ＩＬ−１受容体活性の調整能を共有する。改変の非限定的な例には、Ｎ末端アセチル化、グリコシル化、及びビオチン化が含まれる。本発明によるペプチドの具体的な改変型を以下に更に記載する。
【００６３】
本明細書において、「逆Ｄペプチド」という用語は、Ｌ−アミノ酸を含有するペプチドに対して逆配列に配置されたＤ−アミノ酸を含有するペプチドを表す。したがって、Ｌ−アミノ酸ペプチドのＣ末端残基はＤ−アミノ酸ペプチドのＮ末端になる、などである。逆Ｄ−ペプチドはＬ−アミノ酸ペプチドと同一の３次構造を保持し、したがって同一活性を保持することが多いが、酵素的分解に対してはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでオリジナルのペプチドより安定であり、したがって治療効果が大きい（Ｂｒａｄｙ及びＤｏｄｓｏｎ、１９９４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９４）。
【００６４】
本明細書において、「機能性誘導体」の意味は、アミノ酸配列の機能性誘導体の文脈ではオリジナル配列と実質的に類似する生物活性（機能的又は構造的）を保持する分子を示す。この機能性誘導体又は同等物は天然であっても合成してもよい。そのような誘導体には、タンパク質の生物活性が保存されるという条件で（例えばＩＬ−１受容体の非競合的アンタゴニストとして作用する）、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列が含まれる。置換するアミノ酸は、通常、置換されたアミノ酸と類似の物理化学特性を有する。類似の物理化学特性には、電荷、かさ高、疎水性、親水性などにおける類似性が含まれる。「機能性誘導体」という用語は、本発明の主題の「セグメント」、「変異体」、「アナログ」、又は「化学的誘導体」を含むことが意図される。
【００６５】
「生物活性」又は「ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ活性」又は「受容体活性」という用語は、ＩＬ−１若しくはＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの遺伝子又はタンパク質の検出可能な生物活性を表す。細胞内シグナル伝達におけるＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰタンパク質の特定の生物活性を含むことができる。これには、ＰＧＥ2産生の測定、増殖アッセイ、並びに遺伝子及びタンパク質の発現変化（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＯＸ酵素）が含まれる。しかしながら、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ活性は、これらの重要な生物活性に限定されるものではない。生物活性には、例えば、化合物、基質、相互作用タンパク質などによるＩＬ−１Ｒへの単純な結合も含まれる。例えば、ＩＬ−１反応又はＩＬ−１Ｒの結合若しくは相互作用を阻害能又は増加能（例えば調整能）に対する試験化合物の効果を測定することは、本明細書において、本発明によるＩＬ−１Ｒの生物活性を測定することとみなされる。概して、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬の非存在下と存在下とを対比した受容体サブユニット（例えばＩＬ−１Ｒ及びＩＬ−１ＲａｃＰ）の分子内又は分子間結合は、本発明による生物活性の更に他の例である。ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性には、この受容体の生化学的測定値、立体構造変化、リン酸化状態、及び受容体のシグナル伝達の下流効果、例えばタンパク質リン酸化（又は他の翻訳後修飾、例えばユビキチン化、ユビキチン様タンパク質による修飾、パルミチン酸化、プレニル化など）、キナーゼ作用、又は当該技術分野に公知の技術を用いて測定できるタンパク質の他の特徴なども含まれる。最後に、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性には、細胞構築、細胞増殖、又は所定の受容体に対するリガンド（即ちＩＬ−１）の作用によって調節される他の細胞現象における検出可能な変化が含まれる。
【００６６】
本明細書において「変異体」という用語は、構造及び生物活性においてそのタンパク質と実質的に類似し、少なくとも１つの生物活性を維持するタンパク質を表す。したがって、２つの分子が共通の活性を有し、互いに置換できるという条件において、たとえ１つの分子の組成、又は２次構造、３次構造、若しくは４次構造が他に見られるものと同一でない場合であっても、あるいはアミノ酸配列又は核酸配列が同一でない場合でも、本明細書において用いるように、それらは変異体であるとみなされる。本発明はペプチド配列並びにそれらの誘導体及び変異体に関するものであるが、遺伝学的にコードされたアミノ酸から成る本発明のペプチドアンタゴニストを発現するように核酸配列をデザインできることを理解すべきである。発現ベクター、調節配列（例えばプロモーター）、リーダー配列、並びにそれらを作製する方法及びそれらを細胞へ導入する方法は号外技術分野において周知である。したがって、１つの態様では、本発明のそのようなアンタゴニストペプチドは、組換え技術によって細胞で発現される。１つの態様では、細胞は原核細胞であり、そのようなペプチドを作製し精製する役割を果たす。他の態様では、真核細胞は、ＩＬ−１活性を調節する必要がある特定の真核細胞である。
【００６７】
本発明の機能性誘導体は、化学的に合成することも組換えＤＮＡ技術で作製することもできる。これらの方法は全て当該技術分野において周知である。
本明細書において「被験者」又は「患者」という用語は、治療、観察、又は実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを表す。
【００６８】
「阻害」、「減少」、又は「予防」という用語、あるいはこれらの用語の変形には、特許請求の範囲及び／又は明細書で用いる場合、所望の結果を達成するための受容体活性の測定可能な減少又は完全な阻害が含まれる。例えば、ペプチドは、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬で処理した後、これらのペプチドの非存在下と比較してＰＧＥ2産生の減少が測定される場合、ＩＬ−１活性を阻害すると言われる。
【００６９】
本明細書において「精製された」という用語は、それがもともと存在していた組成物の成分から分離された分子（例えばＩＬ−１受容体、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、核酸、タンパク質など）を表す。したがって、例えば、「精製されたＩＬ−１受容体」は、天然には観られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」分子は、他の成分の大部分を喪失した（例えば混入物質の３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が存在しない）分子である。逆に、「粗製」という用語は、それが存在していたもともとの組成物の成分から分離されていない分子を意味する。したがって、「分離する」又は「精製する」という用語は、生体サンプルの１以上の成分が、サンプルの１以上の他の成分から取り除かれる方法を表す。サンプル成分には、タンパク質、炭水化物、又は脂質などの他の成分を含み得る通常水溶液中の核酸が含まれる。分離工程又は精製工程は、少なくとも約７０％（例えば７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）、より好ましくは少なくとも約９０％（例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）、更により好ましくは少なくとも約９５％（例えば９５、９６、９７、９８、９９、１００％）のサンプル中に存在する他の成分を所望の成分から除去することが好ましい。簡潔にするために、単位（例えば６６、６７．．．８１、８２、．．．９１、９２％．．．．）が系統的に列挙されていないが、それでも本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７０】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、化合物の活性成分の生物活性の有効性を妨げず、投与される宿主（例えば患者）に対して毒性がない担体媒体を表す。
本明細書において「治療的に又は医薬的に有効な量」とは、所望の効果を誘導するのに十分な本発明の組成物の量を表す。そのような結果は、疾患の徴候、症状、若しくは原因の緩和又は軽減、あるいは標的生理系の他の所望の変化であり得る。例えば、炎症性疾患の場合（例えば関節炎及び炎症性大腸炎）、典型的な結果は炎症反応及び免疫反応の低下を包含するであろう。
【００７１】
本明細書において、「分子」、「化合物」、「物質」、又は「リガンド」という用語は、互換的に用いられ、天然、合成、又は半合成の分子又は化合物を広く表す。したがって、「分子」という用語は、例えば化学物質、高分子、細胞又は組織の抽出物（植物又は動物由来）などを意味する。分子の非限定的な例には、ペプチド、抗体、炭水化物、及び医薬物質が含まれる。物質は、ランダムスクリーニング、合理的選択を含めたさまざまな手段によって、及び例えばコンピュータモデリングなどのタンパク質又はリガンドのモデリング法を用いた合理的デザインによって選択し、スクリーニングすることができる。「合理的に選択された」又は「合理的にデザインされた」という用語は、本発明の相互作用ドメインの立体配置に基づいて、あるいは本発明のアンタゴニストペプチド及び／又はペプチド模倣薬の立体配置に基づいて選択されている化合物を定義することを意味する。通常の技術を有する者に理解されるように、非天然修飾を有する高分子も「分子」という用語の範囲内である。例えば、医薬産業において周知であり、通常ペプチドアナログといわれるペプチド模倣薬は、上記のようなモデリングによって作製することができる。同様に、好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、安定性を高めるために修飾される。多くの場合、この修飾は相互作用ドメインの生物活性を変えるべきでないことが理解されるはずである。本発明の教示にしたがい同定される分子は、細胞及び／又は組織の生理機能又はホメオスタシスがＩＬ−１の産生又は反応における欠陥によって傷つけられている疾患又は病態に治療価値を有する。そのような疾患又は病態の非限定的な例には、関節リウマチ、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、変形性関節症、乾癬、敗血症、脳炎、及び呼吸窮迫症候群などの急性及び慢性の炎症性疾患、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、及び多くの自己免疫疾患が含まれる。化合物は、本明細書において、「ＡＰＩ−Ｘ」、「ＴＴＩ−Ｘ」として、又は単に化合物番号によって互換的に記載されることが理解されるであろう（例えば：「１０１．１０」、「ＡＰＩ−１０１．１０」、又は「ＴＴＩ−１０１．１０」）。
【００７２】
本明細書において、「アンタゴニスト」、「ペプチドアンタゴニスト」、又は「ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト」は、ＩＬ−１又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性を阻害可能（完全に又は部分的に）な分子を表す。「アンタゴニスト」、「ペプチドアンタゴニスト」、又は「ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト」という用語には、公知化合物の、アンタゴニスト特性を有する増強剤も含まれる。
【００７３】
本明細書において、「模倣体」「模倣薬」「ペプチド模倣薬」などの専門用語は、互換的に用いられる。
「１つの（a）」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む（comprising）」という用語とともに用いる場合、「１」を意味することができるが、「１以上」、「少なくとも１つ」、及び「１以上」の意味とも一致する。
【００７４】
本願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いる装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
特許請求の範囲における「又は」という用語は、本明細書の開示は代替物のみ及び「及び/又は」を表す定義を支持しているが、代替物のみを表すことが明確に示されていないか、又は代替物が互いに排他的でない場合は、「及び/又は」を意味するために用いられる。
【００７５】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprising）」(及び含むの変形)、「有する（having）」(及び有するの変形)、「含めた（including）」(及び含めたの変形)、又は「含有する（containing）」(及び含有するの変形)という語は、包括的又は非制限的であり、追加の、引用されていない要素又は方法工程を排除するものではない。
【００７６】
「短いペプチド」という用語は、約６〜２５アミノ酸の配列を意味することを意図する。
本明細書において、「精製された」という用語は、それが元々含有されていた組成物の成分から分離されている化合物を表す。したがって、例えば、「精製されたペプチド」又は「ペプチドの精製された組成物」は、天然に見られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」粗化合物は、他の成分の大部分を喪失した化合物である（例えば混入物質の３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が存在しない）。逆に、「粗製」という用語は、それが存在したオリジナル組成物の成分から分離されていない化合物を意味する。簡潔にするために、単位（例えば６６、６７．．．８１、８２、．．．９１、９２％．．．．）を具体的に列挙しないが、それでも本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７７】
「単離ペプチド」又は「単離化合物」は、その天然のｉｎ ｖｉｖｏ状態、又は初期段階においてそれが他の成とともに存在する状態から（例えば合成から）精製される。
本明細書において考察される態様は、本発明の方法又は組成物に関して実施でき、逆もまた同様であることが意図される。更に、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を達成するために使用できる。
【００７８】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の具体的態様を示しているが、当該技術分野に熟練した者にはこの詳細な説明から本発明の精神及び範囲内でさまざまな改変及び修飾が明らかとなるため、説明のためにのみ提供するものであることが理解されるはずである。
【００７９】
図面の簡単な説明
このように本発明を一般的に記載する上で、具体的態様を説明するためにのみ示す添付の図面を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
具体的態様の説明
本発明の１つの目的は、ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質の生体機能を阻害可能なペプチド及びペプチド模倣化合物のファミリーについて記載することである、したがって、非常に多くの病的状態に有用であろう。
【００８１】
開示を明確にするために、そして限定するためでなく、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分割する：
Ｉ． 本発明のペプチドを同定するためのアッセイ
ＩＩ． ペプチドの調製
ＩＩＩ． ペプチド誘導体とペプチド模倣薬
ＩＶ． ペプチド模倣薬を同定するためのアッセイ
Ｖ． 医薬組成物。
【００８２】
Ｉ． 本発明のペプチドを同定するためのアッセイ
候補化合物のＩＬ−１受容体活性の阻害能を試験するための方法を本明細書に提示する。本発明はさほど限定されないことが理解されるであろう。実際、本発明の非競合的細胞外アゴニスト又はアンタゴニストを同定するために、当該技術分野に周知の他のアッセイを用いることができる。
【００８３】
通常、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト（即ち、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子、又は他の薬物のような候補若しくは試験化合物又は物質）のスクリーニングは、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性を測定するアッセイに基づくことができる。本発明のアッセイは、天然又は組換えＩＬ−１受容体を使用する。ＩＬ−１活性のアンタゴニストに関する細胞画分又は無細胞系スクリーニングアッセイは、精製されたＩＬ−１受容体、又は精製された組換えＩＬ−１受容体をｉｎ ｓｉｔｕで用いることができる。細胞に基づいたアッセイは、ＩＬ−１受容体を天然に発現する細胞、又は組換えＩＬ−１受容体を含有する細胞を使用することができる。全ての場合において、ＩＬ−１受容体の生物活性は直接的又は間接的に測定することができる；したがって、ＩＬ−１受容体活性の阻害剤又は活性化剤を同定することができる。標準的コンビナトリアル化学技術によって阻害剤又は活性化剤自体を更に修飾し、最初に同定された化合物の改良型アナログを提供することもできる。
【００８４】
１つの態様では、アッセイは細胞に基づいたアッセイであり、天然又は組換え由来であるＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体複合体又はその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体生物活性の調製能、例えばＰＧＥ2産生、増殖アッセイ、ＩＬ−１Ｒの結合パートナー（ＩＬ−１ＲａｃＰ）への結合、又はＩＬ−１受容体の他の測定可能な生物活性の調節を測定する。
【００８５】
別の態様では、試験化合物のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体複合体の活性調整能の測定は、試験化合物のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体標的分子の下流エフェクターの活性調整能を測定することによって達成することができる。例えば、試験化合物のエフェクター分子に対する活性を測定することができる。そのような下流エフェクターの非限定的な例には、インターロイキン受容体活性化キナーゼ（ＩＲＡＫ）；ＴＲＡＦ、ＮＩ−ＫＢ（例えばｐ６５）の活性化、変異原性活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）が含まれる。本発明の化合物の調節活性（アゴニスト又はアンタゴニスト）を規定するためにアッセイされるであろうエフェクター分子の他の例はＳｉｍｓら、２００２；及びＫａｓｈｉｗａｍｕｒａら、２００２に記載されている。
【００８６】
本発明の上記アッセイ法の１以上の態様では、相互作用タンパク質の一方又は両方の非複合体から複合体を容易に分離するため、及びアッセイの自動化に対応するために、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１ＲａｃＰ、又は本発明の相互作用ペプチド若しくはペプチド模倣薬を固定することが望ましい。候補化合物の存在下及び非存在下における試験化合物のＩＬ−１Ｒタンパク質への結合、又はＩＬ−１Ｒタンパク質と標的分子（例えばＩＬ−１ＲａｃＰ）との相互作用は、反応物質を含有するのに好適な容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠心管が含まれる。１つの態様では、タンパク質の一方又は両方をマトリックスに結合させるドメインを追加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＩＬ−１Ｒ融合タンパク質、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＩＬ−１ＲａｃＰ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ州）、又はグルタチオン被覆マイクロタイタープレートに吸着させることができる。次に、それらを、試験化合物、及び非吸着標的タンパク質又はＩＬ−１Ｒタンパク質と組み合わせ、複合体形成を誘導する条件下（例えば塩及びｐＨに関し生理的条件）で混合物をインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去し、例えば上記のようにして複合体形成を直接的又は間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＩＬ−１Ｒの結合レベル又は活性レベルを標準技術を用いて測定することができる。
【００８７】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術（当該技術分野で周知である）を本発明のスクリーニングアッセイに用いることもできる。例えば、ＩＬ−１Ｒタンパク質又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子（例えばＩＬ−１、ＩＬ−１ＲａｃＰ）を、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を用いて固定することができる。ビオチン化ＩＬ−１Ｒタンパク質又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、当該技術分野に公知の技術（例えばビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロックフォード、イリノイ州）を用いて調製し、ストレプトアビジンを被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定することができる。あるいは、ＩＬ−１Ｒタンパク質又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子と反応するが、ＩＬ−１Ｒタンパク質のＩＬ−１Ｒ相互作用分子への結合は妨げない抗体をプレートのウェルに被覆し、未結合の標的又はＩＬ−１Ｒタンパク質を抗体結合によってウェルに捕捉することができる。ＧＳＴ固定化複合体に関して上記したものに加えて、そのような複合体の検出法には、ＩＬ−１Ｒタンパク質又は標的分子に反応する抗体、及びＩＬ−１Ｒ又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子に関連した酵素活性の検出に依拠する酵素結合アッセイを用いた複合体の免疫検出が含まれる。
【００８８】
本明細書に記載し、例示したようなｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの実施に用いることもできることが理解されるであろう。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
１つの態様では、ＩＬ−１受容体の細胞増殖調整能の活性化能又は阻害能に関し、3Ｈ−チミジン取り込み法で候補ペプチドを試験する。更に他の態様では、ＩＬ−１受容体の細胞増殖調整能の活性化能又は阻害能に関し、例えば（Ｂａｋｅｒら、１９９５；Ｃｈｅｖｉｒｏｎ、Ｇｒｉｌｌｏｎら、１９９６）；（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９９；Ｈｕら、１９９９）に記載のアッセイを用いて候補ペプチドを試験する。
【００８９】
他の態様では、ＩＬ−１Ｒ若しくはその部分、又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ経路の上流若しくは下流の標的タンパク質のリン酸化状態の調整能に関し、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを用いて候補ペプチドを試験する。
【００９０】
他の態様では、ＰＧＥ2レベル、ＩＬ−６若しくはコラーゲナーゼの発現、又は軟骨細胞及び線維芽細胞などのＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１ＲａｃＰ発現細胞においてＩＬ−１刺激後に修飾されるレベルを有する他の分子に関し、ＩＬ−１Ｒを標的とする候補ペプチドを試験する。
【００９１】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
上記アッセイは、更に開発するための有望なリード化合物を検出するための初期又は１次スクリーニングとして用いることができる：リードペプチドは、追加の、異なるスクリーニングで更に評価されるであろう。したがって、本発明は、これらの受容体を発現する哺乳動物細胞株又は他のアッセイを利用したさまざまなアッセイを包含し得る２次ＩＬ−１Ｒスクリーニングも包含する。
【００９２】
３級スクリーニングは、臨床症状に関する動物モデルにおいて同定した阻害剤の試験を包含することができる。したがって、本明細書に記載したようにして、ラット又はマウスのような適切な動物モデルにおいて同定された物質（ペプチド又はペプチド模倣薬）を更に使用することは本発明の範囲内である。例えば、ペプチドを動物モデルに用いて、そのような物質による処理の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載したようにして同定した物質を動物モデルに用いて、そのような物質の作用機序を決定することができる。更に、本発明は、明細書に記載のように、処置（例えば、ＩＬ−１受容体の脱制御又は機能不良に関連したさまざまな種類の障害の処置）に関する上記スクリーニングアッセイで同定された新規物質の使用に関係する。そのようなアッセイに使用できる非限定的な動物モデルには、コラーゲンで誘発されたラット関節炎、急性ＩＢＤの動物モデル、免疫抑制マウスにおける腫瘍増殖、新生児マウスの気道の感作、及びトランスジェニック動物を含めた他の公知の動物モデルが含まれる。
【００９３】
ＩＩ． ペプチドの調製
本発明のペプチド又はペプチド誘導体は、合成技術（例えば排他的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、古典的液相合成）及び組換え技術を含めた、当該技術分野に熟練した者に公知のペプチド合成法によって得られる。例えば、ペプチド又はペプチド誘導体は、手短にはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂（例えばベンズヒドリルアミン樹脂、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂）にカップリングさせ、続いてＮ−α保護アミノ酸を加えることから成る固相ペプチド合成によって得ることができる。保護基は当該技術分野に公知の如何なる基でもよい。個々の新たなアミノ酸を伸びている鎖に加える前に、鎖に加えた前のアミノ酸の保護基を除去する。そのような固相合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｖａｌｅら；１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１３：１３９４−１３９７によって、そして米国特許第４，３０５，８７２号及び第４，３１６，８９１号、Ｂｏｄｏｎｓｋｙら、１９６６、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（ロンドン）、３８：１５９７；Ｐｉｅｔｔａ及びＭａｒｓｈａｌｌ、１９７０、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．６５０に記載されている。アミノ酸の適切な樹脂へのカップリングも当該技術分野に周知であり、米国特許第４，２４４，９４６号に記載されている。（Ｈｏｕｖｅｒ−Ｗｅｙｌ、『有機化学法』、Ｖｏｌ．Ｅ２２ａ、「ペプチドとペプチド模倣薬の合成」、Ｍｕｒｒａｙ Ｇｏｏｄｍａｎ、編集長、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ニューヨーク、２００２に概説されている）。
【００９４】
本発明の化合物の調製工程のあいだ、関係する分子上の感受性反応基を保護することは必要及び／又は望ましいかもしれない。これは、『有機合成における保護基』、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、１９９１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；並びに『ペプチド：化学と生物学』、Ｓｅｗａｌｄ及びＪａｋｕｂｋｅ、２００２、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｈｅｉｎｈｅｉｍ、ｐ．１４２に記載のような慣用の保護基によって達成することができる。例えば、αアミノ保護基には、アシル型保護基（例えばトリフルオロアセチル、ホルミル、アセチル）、脂肪族ウレタン型保護基（例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、シクロヘキシルオキシカルボニル）、芳香族ウレタン型保護基（例えばフルオレニル−９−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、Ｃｂｚ誘導体）、及びアルキル型保護基（例えばトリフェニルメチル、ベンジル）が含まれる。アミノ酸側鎖の保護基には、ベンジル（Ｔｈｒ及びＳｅｒ用）、Ｃｂｚ（Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、メチル エチル、シクロヘキシル（Ａｓｐ、Ｈｉｓ）、Ｂｏｃ（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ）などが含まれる。保護基は、都合のよいその後の段階で、当該技術分野に公知の方法を用いて除去することができる。
【００９５】
１つの態様では、アナログ及び他の修飾変異体を含めた本発明のペプチドは、通常、ＦＭＯＣプロトコールにしたがい、保護基を用いて有機相で合成することができる。それらは、ＨＰＬＣを用いて、Ｃ１８カラムで、１０〜６０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出させて、収率７０％で精製することができる。次に、分子量を質量分析（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．『固相ペプチド合成』、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２８９巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７に概説されている）で確認することができる。
【００９６】
あるいは、遺伝的にコードされたアミノ酸から成る本発明のペプチドは、ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて組換えシステムで調製することができる。本発明のペプチドは、１より多い上記修飾を同一ペプチド内に含有できることが理解される。本発明のペプチド又はその誘導体の医薬的に許容可能な塩複合体も本発明に包含される。
【００９７】
合成したペプチド又はペプチド誘導体の精製は、クロマトグラフィ（例えばイオン交換、サイズ排除、親和性）、遠心、沈殿、又はペプチド及びペプチド誘導体を精製するための標準技術を含めた標準法によって行う。１つの態様では、薄層クロマトグラフィを使用する。他の態様では、逆相ＨＰＬＣを使用する。当該技術分野に周知で、ペプチドの単離及び精製に好適な他の精製技術を本発明に用いてもよい。
【００９８】
本発明による化合物の調製工程が立体異性体の混合物を生じさせる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィなどの慣用技術によって分離することができる。化合物は、ラセミ体で調製することができ、あるいはエナンチオ特異的合成又は分割によって個々のエナンチオマーを調製することもできる。化合物は、例えば、光学活性酸との塩形成後、分別再結晶及び遊離塩基の再生によってジアステレオ異性体対を形成するなどの標準技術によってエナンチオマー成分に分割することができる。化合物は、ジアステレオマーのエステル又はアミドを形成した後、キラル補助基を除去することによって分割することもできる。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割することができる。
【００９９】
ＩＩＩ． ペプチド誘導体とペプチド模倣薬
天然アミノ酸のみから成るペプチドに加えて、ペプチド模倣薬又はペプチドアナログも本発明に包含される。ペプチドアナログは医薬産業において、鋳型ペプチドと類似した特性を有する非ペプチド薬として一般に用いられている。非ペプチド化合物の類型は、「ペプチド模倣体」又はペプチド模倣薬と呼ばれている（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．１９８６、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；Ｅｖａｎｓら、１９８７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）。治療的に有用なペプチドと構造的に関連したペプチド模倣体は、同等の若しくは増強された治療効果又は予防効果を生ずるために用いることができる。一般に、ペプチド模倣薬は、天然受容体結合ポリペプチドのようなパラダイムポリペプチドと構造的に類似する（即ち、生物活性又は薬理活性を有するポリペプチド）が、当該技術分野に周知の方法で場合により−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＨ2ＳＯ−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＯＣＨ2−などのような結合によって置換された１以上のペプチド結合を有する（Ｓｐａｔｏｌａ Ａ．Ｆ．、ペプチド骨格修飾、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ、Ｍａｒｃｈ １９８３、１（３）：２６７；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、１９８６、３８：１２４３−１２４９；Ｈｕｄｓｏｎ Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１９７９、１４：１７７−１８５；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ．Ｂ．、１９８３、『アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の化学と生化学』、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ監修、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）。そのようなペプチド模倣体は、天然ポリペプチドよりも、経済的生産向上、化学的安定性の増加、薬理特性（例えば、半減期、吸収、効能、効率など）の増大、抗原性の減少などを含めた顕著な利点を有するかもしれない。
【０１００】
ペプチドは野生型ＩＬ−１のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害に有効であるが、それらのｉｎ ｖｉｖｏ有効性はプロテアーゼの存在により弱められるであろう。血清プロテアーゼには特異的基質要求性がある。基質は、Ｌ−アミノ酸と、切断のためのペプチド結合とを有する必要がある。更に、血清プロテアーゼ活性の最も顕著な成分を表すエクソペプチダーゼは、ペプチドの最初のペプチド結合に通常作用し、遊離Ｎ末端を必要とする（Ｐｏｗｅｌｌら、１９９３）。これを考慮すると、ペプチドアナログ又は誘導体とも呼ばれる修飾型ペプチドを使用することは有益であることが多い。修飾ペプチドは、ＩＬ−１に関して生物活性を付与するオリジナルＬ−アミノ酸ペプチドの構造特性を保持するが、有利にも、プロテアーゼ及び／又はエクソペプチダーゼによって容易に切断されない。
【０１０１】
保存配列の１以上のアミノ酸の、同種のＤ−アミノ酸による体系的な置換（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。したがって、本発明のペプチド誘導体又はペプチド模倣薬は、全てＬ、全てＤ、又はＤ、Ｌを混合したペプチドでもよい。好ましい態様では、ペプチドは全てＤ−アミノ酸から成る。Ｄ−アミノ酸のＮ末端又はＣ末端の存在は、ペプチダーゼはＤ−アミノ酸を基質として使用できないため、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を高める（Ｐｏｗｅｌｌら、１９９３）。逆Ｄ−ペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含有するペプチドに対して逆配列に配置された、Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドである。したがって、Ｌ−アミノ酸ペプチドのＣ末端残基は、Ｄ−アミノ酸ペプチドのＮ末端になる、などである。逆Ｄ−ペプチドは、Ｌ−アミノ酸ペプチドと同一の３次構造を保持し、したがって同一活性を保持するが、酵素分解に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでより安定であるため、オリジナルペプチドよりも治療効果が大きい（Ｂｒａｄｙ及びＤｏｄｓｏｎ １９９４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９４）。逆Ｄ−ペプチドに加えて、保存配列、又は実質的に同一の配列の変形を含む制約されたペプチドを、当該技術分野に周知の方法で、例えばペプチドを環化するジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基を付加することによって作製することができる（Ｒｉｚｏ ｅｔ Ｇｉｅｒａｓｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２、６１：３８７）。環状ペプチドには遊離のＮ末端もＣ末端もない。したがって、それらは当然エンドペプチダーゼの影響を受けやすいが、ペプチド末端を切断しないエクソペプチダーゼによるタンパク質分解を受けにくい。したがって、Ｎ末端又はＣ末端のＤ−アミノ酸を有するペプチド、及び環状ペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、Ｎ末端又はＣ末端のＤ−アミノ酸残基の存在、あるいはその環状構造以外は、対応するペプチドの配列と通常同一である。
【０１０２】
分子間ジスルフィド結合を含有する環状誘導体は、慣用の固相合成法で、アミノ末端及びカルボキシ末端のような環化のために選択された位置に好適なＳ−保護システイン又はホモシステイン残基を組み込みながら調製することができる（ＳａｈＭら、１９９６、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１９７）。鎖の組み立てが終了した後、（１）Ｓ−保護基を選択的に除去し、その結果、対応する２つの遊離ＳＨ−官能基を支持体上で酸化させてＳ−Ｓ結合を形成し、その後、支持体から産物を簡便に除去し、適切な精製手順を実施することによって；又は、（２）側鎖の完全な脱保護とともに支持体からペプチドを除去し、その後、高度に希釈した水溶液中で遊離のＳＨ−官能基を酸化することによって環化を行うことができる。
【０１０３】
分子内アミド結合を含有する環状誘導体は、慣用の固相合成法で、環化のために選択された位置に好適なアミノ及びカルボキシ側鎖が保護されたアミノ酸誘導体を組み込みながら調製することができる。分子内−Ｓ−アルキル結合を含有する環状誘導体は、慣用の固相合成法で、環化のために選択された位置に好適なアミノ−保護側鎖と好適なＳ−保護システイン又はホモシステイン残基を有するアミノ酸残基を組み込みながら調製することができる。
【０１０４】
ペプチドの部分配列の天然アミノ酸を非天然アミノ酸に置換することで、タンパク質分解に対する耐性を付与することもできる。そのような置換は、例えば、Ｎ末端に作用するエクソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性を付与することができる。そのような置換は記載されており、これらの置換は生物活性に影響を及ぼさない。非天然アミノ酸の例には、α，α−２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、及びβ−メチルアミノ酸が含まれる。本発明において有用なアミノ酸アナログには、限定されるものではないが、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、及び他の特殊なアミノ酸を含めることができる。更に、非天然アミノ酸を用いたペプチド合成は、当該技術分野において日常的な公知のものである。
【０１０５】
ペプチドのＮ末端又はＣ末端残基に作用するペプチダーゼに対する耐性を付与するための他の有効なアプローチの１つは、改変ペプチドがもはやペプチダーゼの基質ではなくなるようにペプチド末端に化学基を付加することである。そのような化学修飾の１つは、１端又は両端のペプチドのグリコシル化である。特定の化学修飾、特にＮ末端グリコシル化は、ヒト血清ペプチドの安定性を増加させることが知られている（Ｐｏｗｅｌｌら、１９９３）。血清安定性を高める他の化学修飾には、限定されるものではないが、アセチル基などの炭素数１〜２０の低級アルキルから成るＮ−末端アルキル基の付加、及び／又はＣ−末端アミド若しくは置換アミド基の付加が含まれる。特に、本発明には、Ｎ−末端アセチル基及び／又はＣ末端アミド基を有するペプチドから成る改変ペプチドが含まれる。
【０１０６】
通常ペプチドの部分ではない追加の化学部分を含有する他の種類のペプチド誘導体も、誘導体がペプチドの所望の機能活性を保持する限り本発明に含まれる。そのような誘導体の例には、（ｉ）アミノ末端又は他の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、ここで、アシル基はアルカノイル基（例えばアセチル、ヘキサノイル、オクタノイル）、アロイル基（例えばベンゾイル）、又はＦ−ｍｏｃ（フルオレニルメチル−Ｏ−ＣＯ−）などの保護基であり得る；（ｉｉ）カルボキシ末端又は他の遊離カルボキシ基又はヒドロキシル基のエステル；（ｉｉｉ）アンモニア又は好適なアミンとの反応により作製されるカルボキシ末端又は他の遊離カルボキシル基のアミド；（ｉｖ）リン酸化誘導体；（ｖ）抗体又は他の生体リガンドに結合した誘導体、及び他の種類の誘導体が含まれる。
【０１０７】
余分のアミノ酸残基を本発明のペプチドに付加することで生ずる長いペプチド配列は、それらは上記ペプチドと同一の生物活性（ＩＬ−１受容体の阻害活性）を有するはずであるため、本発明に包含される。相当数の追加のアミノ酸を有するペプチドは除外するが、大きなポリペプチドには、有効な配列をつくってＩＬ−１Ｒへの結合を妨げる立体配置を想定し得るものもあることが理解されるであろう。これらの誘導体は、競合的アンタゴニストとして作用し、本発明から除外される。したがって、本発明は延長鎖を有するペプチド又は誘導体を包含するが、そのように長いペプチドは、ペプチド又は誘導体の調節活性を破壊しないように選択する必要がある。
【０１０８】
本発明に包含される他の誘導体は、直接的に又はスペーサーを介して、例えばアラニン残基の短いストレッチによって、又は推定タンパク質分解部位によって（例えばカテプシンによって、米国特許第５，１２６，２４９号及び欧州特許第４９５，０４９号を参照されたい）、互いに共有結合的に連結した本発明の２つの同一又は異なるペプチドから成る２重ペプチドである。本発明のペプチドのマルチマーは、同一若しくは異なるペプチド又はその誘導体から形成される分子のポリマーから成る。
【０１０９】
他の態様では、本発明のペプチド誘導体は、そのアミノ末端若しくはカルボキシ末端で又は両方で異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結した、本発明のペプチド若しくはその断片を含むキメラ又は融合タンパク質である。そのようなキメラ又は融合タンパク質は、タンパク質をコードする核酸の組換え発現によって作製することができる。１つの態様では、そのようなキメラ又は融合タンパク質は、本発明のペプチドの少なくとも６アミノ酸を含有し、本発明のペプチドと同等又はそれより大きい機能活性を有する。
【０１１０】
本発明のペプチド誘導体は、所望により機能的に同等な分子、又は機能的に増強されたか若しくは弱められた分子を提供する置換、付加、又は欠失によりアミノ酸配列を変えることで作製することができる。本発明の誘導体には、限定されるものではないが、配列内の同等物が機能的に同等なアミノ酸残基に置換された改変配列を含めた本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を１次アミノ酸配列として含有するものが含まれる。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する、極性が類似する他のアミノ酸で置換することができ、サイレント変化を生ずる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。非極性（疎水性）アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれる。非荷電極性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含まれる。アミノ酸のグリシンは、非極性アミノ酸ファミリーに含まれることもあれば、非荷電（中性）極性アミノ酸ファミリーに含まれることもある。アミノ酸ファミリー内でなされる置換は、通常、保存的置換であることが理解される。
【０１１１】
本発明の１つの具体的態様では、アンタゴニストペプチドは、配列ＴＴＩ−１０１．１４０、ＴＴＩ−１０１．１４１、ＴＴＩ−１０１．１２５、ＴＴＩ−１０１．１１０、ＴＴＩ−１０１．１１１、ＴＴＩ−１０１．１３６、及びＴＴＩ−１０１．１４３を含む。
【０１１２】
ＩＶ． ペプチド模倣薬を同定するためのアッセイ
上記のように、本発明の方法で同定されたペプチドの骨格配置とファーマコフォアの呈示（ペプチド模倣薬）を複製するように作製された非ペプチジル化合物は、代謝安定性が高く、効能が高く、作用期間が長く、そしてバイオアベイラビリティがよいという特質を有することが多い。
【０１１３】
本発明のペプチド模倣薬化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレル固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；及び親和性クロマトグラフィ選択を用いた合成ライブラリー法を含めた当該技術分野に公知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は小分子のライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５、１９９７）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；及び同文献２０６１；並びにＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、又はビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４；８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４；５５５−５５６）、細菌若しくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）で提供することができる。分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）上記；Ｅｒｂら（１９９４）上記；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９４）上記；Ｃｈｏら（１９９３）上記；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）上記に見出すことができ、又は適切な基質による生成物への変換を測定することによって検出されるルシフェラーゼ、及び酵素標識であることができる。
【０１１４】
いったん本発明のペプチドを同定すれば、限定されるものではないが、示差溶解度（即ち沈殿）、遠心、クロマトグラフィ（親和性、イオン交換、サイズ排除など）、又はペプチド、ペプチド模倣薬、又はタンパク質の精製に用いられる他の標準技術を含めた多くの標準法で単離・精製することができる。同定された目的ペプチドの機能特性は、当該技術分野に公知の機能アッセイを用いて評価することができる。１つの態様では、細胞内シグナル伝達における下流受容体機能を評価するためのアッセイが用いられる（例えばＰＧＥ2合成）。
【０１１５】
１つの態様では、本発明のペプチド模倣化合物は、以下の３相工程で得られる：１）本発明のペプチドをスキャニングしてＩＬ−１受容体の認識とそれに対する活性に必要な２次構造領域を同定すること；２）配座固定されたジペプチド代用物を用いて骨格配置を絞り込み、これらの代用物に対応する有機プラットホームを提供すること；そして３）最高の有機プラットホームを用いて、天然ペプチドの所望の活性を最小にするようにデザインされた候補のライブラリーにおいて有機ファーマコフォアを呈示すること。より詳細には、３相は以下の通りである。第１相では、リードペプチドをスキャンしてそれらの構造を短くし、活性に対する要求を同定すること。オリジナルに対する一連のペプチドアナログを合成する。第２相では、配座固定されたジペプチド代用物を用いて最高のペプチドアナログを調査する。インドリジジン−２−オン、インドリジジン−９−オン、及びキノリジジノンアミノ酸（それぞれＩ2ａａ、Ｉ9ａａ、及びＱａａ）を最高のペプチド候補の骨格配置を試験するためのプラットホームとして用いる。これら及び関連するプラットホーム（Ｈａｌａｂ，Ｌｉ；Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｆ；Ｌｕｂｅｌｌ，ＷＤ；Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．５５、１０１−１２２、２０００；Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，Ｓ．Ｊ．、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ Ｇ；Ｌｏｍｂａｒｔ，Ｈ−Ｇ．；Ｌｕｂｅｌｌ，Ｗ．Ｄ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｖｏｌ．５３、１２７８９−１２８５４、１９９７に概説されている）は、ファーマコフォアを異なる方向に向けるためにペプチドの特定領域に組み込むことができる。これらのアナログの生物学的評価により、活性に対する幾何学的要求を最小にする改良されたリードを同定する。第３相では、最も活性なリード由来のプラットホームを用いて、天然ペプチドの活性に関与するファーマコフォアの有機代用物を呈示する。平行合成形式でファーマコフォアと骨格とを組み合わせる。当然ながら、ペプチドの誘導ひいてはさまざまな相は、当該技術分野に公知の他の手段及び方法によって行うことができる。
【０１１６】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、又は他の小分子から決定された構造機能関係を用いて同様の又はより良い特性を有する類似の分子構造を絞り込み、調製することができる。したがって、具体的に開示したものに加えて、本明細書に例示した特定の態様の構造、極性、電荷の特徴、及び側鎖特性を共有する分子も本発明の範囲内である。
【０１１７】
結論として、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、又は他の小分子は機能的に活性である（即ち、本発明のペプチドに関連した１以上の同定された機能活性を発揮可能である）。例えば、所望の特性（例えばＩＬ−１ＲａｃＰのタンパク質パートナー又はリガンドへの結合）を阻害するそのようなペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、又はアナログは、そのような特性及びその生理的に関連するものの阻害剤として用いることができる。ペプチド、誘導体、ペプチド模倣薬、又は本発明のペプチドアナログは、当該技術分野において公知の機能アッセイ（例えばＰＧＥ２合成）によって、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体を介した細胞内シグナル伝達の阻害に関して試験することができる。
【０１１８】
Ｖ． 医薬組成物
本発明は、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬との相互作用を介したＩＬ−１受容体活性の阻害方法に関するものである。動物の数多くの経路及び病態におけるＩＬ−１及び／又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ１ＲａｃＰ受容体機能の重要性に鑑みると、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬は、ＩＬ−１反応（例えばＩＬ−１過剰発現又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ１−ＲａｃＰを介した異常なシグナル伝達）に関連した病態又は疾患の治療に有用である。
【０１１９】
したがって、本発明の方法は、それを必要とする被験者又はそれを必要とする危険性のある被験者に、有効量のペプチド、ペプチド誘導体、若しくはペプチド模倣薬、又はペプチド、ペプチド誘導体、若しくはペプチド模倣薬を含む組成物を投与し、ＩＬ−１Ｒ／ＲａｃＰ生物活性を阻害することを含む。１つの態様では、ペプチド又はそのペプチド誘導体と、好適な医薬担体とを含む有効量の治療用組成物を被験者に投与し、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害し、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰを介した異常なシグナル伝達（例えばＩＬ−１／ＩＬ−１ＲａｃＰリガンドの過剰産生を介した、又は構成的に活性な受容体若しくは他の欠陥を介したＩＬ−Ｉ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体の過剰刺激）に関連した症状を予防、改善するか、又は障害、疾患、若しくは病態を治療する。１つの態様では、被験者は動物である。他の態様では、被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【０１２０】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模薬は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性の阻害が有益である病態又は障害の症状の治療、予防、又は改善に有用である。本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬が有益であり得る疾患、病態、又は障害には、限定されるものではないが、以下の例が含まれる：関節リウマチ、炎症性大腸炎のような慢性及び急性の炎症性疾患、敗血症、変形性関節症、乾癬、脳炎、糸球体腎炎、呼吸窮迫症候群、及びライター症候群。他の病態には、全身性エリテマトーデス、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性関節疾患、ある種の白血病の悪液質、アルツハイマー病、数多くの種類のがん、若年型糖尿病、肺高血圧症、卒中、脳室周囲白血球減少症、及び髄膜炎が含まれる。
【０１２１】
本発明の範囲内の組成物は、活性物質（例えばペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬）を、不都合な副作用を回避しながら所望の治療効果を達成するのに有効な量で含有する必要がある。活性物質の医薬的に許容可能な製剤及び塩は本発明の範囲内であり、当該技術分野において周知である。ポリペプチドアンタゴニストなどを投与するには、不都合な副作用を回避するように投与量を選択する必要がある。具体的な疾患、障害、又は病態の治療に有効な治療用組成物又は医薬組成物の量は、疾患の性質及び重篤度、作用の標的部位、患者の体重、患者の特別食、最近用いた投薬、投与経路、及び当該技術分野に熟練した者に認識される他の要因に依存するであろう。用量は、疾患の程度及び患者に由来するさまざまなパラメータのような慣例的要因にしたがい、臨床医によって適合されるであろう。典型的には、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日が被験者に投与されるであろう。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線から推定することができる。例えば、ラットの研究から得られたデータに基づいてヒトに対する有効なｍｇ／ｋｇ用量を得るには、ラットの有効なｍｇ／ｋｇ用量を６で割る。
【０１２２】
さまざまな送達システムが公知であり、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬、又は医薬組成物の投与に用いることができる。本発明の医薬組成物は、静脈内若しくは筋肉内注射、脳室内若しくは髄膜注射（中枢神経系投与のため）、経口、局所、皮下、結膜下、経鼻、皮内、舌下、経膣、直腸内、又は硬膜外経路を含めた好適な経路で投与することができる。
【０１２３】
当該技術分野において周知の他の送達システムを用いて、例えば水溶液、マイクロ粒子への封入、又はマイクロカプセルを介して、本発明の医薬組成物を送達することができる。
【０１２４】
更に他の態様では、本発明の医薬組成物は、制御放出システムで送達することができる。１つの態様では、ポリマー材料を用いることができる（Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ、『制御された薬物バイオアベイラビリティ、製剤のデザインと性能』、１９８４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒａｎａｄｅ及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ、『薬物送達システム、薬理学と毒物学シリーズ』、２００３、第２版、ＣＲＲＣ出版を参照されたい）。他の態様では、ポンプを用いることができる（Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。
【０１２５】
本発明の化合物は、化合物分子がそれにカップリングした個別の担体としてモノクローナル抗体を使用することによって送達することもできる。本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラスにカップリングさせることもでき、非限定的な例には：ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋した両親媒性ブロックコポリマー及びヒドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリジヒドロピランが含まれる。
【０１２６】
上記のように、本発明の医薬組成物は、ペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬を、医薬的に許容可能な担体と組み合わせて含む。担体という用語は、ペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬と一緒に投与する希釈剤、補助剤、充填剤又は結合剤などの賦形剤、崩壊剤、滑剤、シリカ フローコンディショナー、安定化剤、又はビヒクルを表す。そのような医薬担体には、水、又は鉱油、植物油（例えばピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、ナタネ油）、動物油、若しくは合成油を含めたオイルのような滅菌液が含まれる。グリセロール及びデキストロース水溶液、並びに生理食塩水溶液を本発明の医薬組成物の液体担体として用いることもできる。当然ながら、担体の選択は、ペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬の性質、その溶解度、及び他の生理的特性、並びに送達及び適用の標的部位に依存する。例えば、血液脳関門を浸透できる担体は、中枢神経系の疾患又は病態（例えば炎症）の症状の治療、予防、又は改善に用いられる。好適な医薬担体の例は、『レミントン：薬学の科学と実践』、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、２００３、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０１２７】
更に、本発明の医薬製剤に組み込むことができる医薬的に好適な材料には、吸収促進剤、ｐＨ調製剤及び緩衝剤、浸透圧調製剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、界面活性剤、増粘剤、皮膚軟化剤、分散剤、香料、着色剤、並びに湿潤剤が含まれる。
【０１２８】
好適な医薬賦形剤の例には、水、グルコース、ショ糖、乳糖、グリコール、エタノール、モノステアリン酸グリセロール、ゼラチン、コメ、デンプン粉末、粉乳、ステアリン酸ナトリウム、モルト、塩化ナトリウムなどが含まれる。本発明の医薬組成物は、溶液、カプセル、錠剤、クリーム、ジェル、粉末、徐放性製剤などの形態を採ることができる。組成物は、トリグリセリドのような慣用の結合材及び担体とともに座剤として製剤化することができる（『レミントン：薬学の科学と実践』、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、２００３、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。そのような組成物は、被験者に正確に投与するための形態を提供するように、治療的に有効量の治療用組成物を、好適量の担体とともに含有する。製剤は、投与様式及び作用の標的部位（例えば具体的な臓器又は細胞種）に適するようにデザインされる。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、中性又は塩の形態で製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩には、遊離アミノ基とともに形成するもの、及び遊離カルボキシル基と反応するものが含まれる。医薬産業において一般に用いられる非毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及びアンモニウム塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、及びプロタミン亜鉛の塩が含まれ、当該技術分野に周知の方法で調整される。塩には、通常、本発明の化合物を好適な有機酸又は無機酸と反応させることによって調製される非毒性の酸付加塩も含まれる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、吉草酸塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ｔｙｓｏｌａｔｅ、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、ナプシル酸塩などが含まれる。
【０１３０】
本発明にしたがい使用できる充填剤又は結合剤の例には、アカシア、アルギン酸、リン酸カルシウム(２塩基性)、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストリン、デキストレート、ショ糖、チロース、α−デンプン、硫酸カルシウム、アミロース、グリシン、ベントナイト、マルトース、ソルビトール、エチルセルロース、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２ナトリウム、ピロ亜硫酸２ナトリウム、ポリビニルアルコール、ゼラチン、グルコース、ガーゴム、液体グルコース、圧縮糖、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、マルトデキストリン、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、トラガガント、微晶性セルロース、デンプン、及びゼインが含まれる。他の最も好ましい充填剤又は結合剤は、微晶性セルロースから成る。
【０１３１】
使用できる崩壊剤の例には、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（低置換）、微晶性セルロース、粉末セルロース、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、メチルセルロース、ポラクリリンカリウム、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、２亜硫酸２ナトリウム、エダタミル２ナトリウム、エデト酸２ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）２ナトリウム架橋ポリビニルピロリジン、α−デンプン、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、微晶性セルロースが含まれる。
【０１３２】
滑剤の例には、ステアリン酸カルシウム、ナタネ油、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化植物油（Ｉ型）、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸フマル酸ナトリウム、ステアリン酸、タルク、及びステアリン酸亜鉛、ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｂｅｈａｐａｔｅ、ラウリル硫酸マグネシウム、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム／酢酸ナトリウム（混合）、ＤＬ−ロイシンが含まれる
シリカ フローコンディショナーの例には、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、及びガーゴムが含まれる。他の最も好適なシリカ フローコンディショナーは二酸化ケイ素から成る。
【０１３３】
安定化在の例には、アカシア、アルブミン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、ベントナイト、リン酸２カルシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、コロイド状二酸化ケイ素、シクロデキストリン、モノステアリン酸グリセリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、３ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、カルナウバワックス、キサンタンゴム、デンプン、ステアリン酸塩、ステアリン酸、ステアリン酸モノグリセリド、及びステアリルアルコールが含まれる。
【０１３４】
本発明は、被験者にいったん投与すると、より安定な（即ち、いったん投与すると、未修飾型よりも半減期が長いか、又は有効期間が長い）ペプチド又はペプチド誘導体の修飾物も提供する。そのような修飾は、本発明が関連する分野に熟練した者に周知である（例え、ＰＥＧ化としても知られるポリエチレングリコール誘導体化、マイクロカプセル化など）。
【０１３５】
本発明のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニストは、単独で投与してもよいし、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰに関与する疾患又は病態の症状の治療、予防、又は改善に有用な他の活性物質と組み合わせて投与してもよい。したがって、本発明の組成物及び方法は、ＩＬ−１活性（例えば合成、放出及び／又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰへの結合）の調整能、又はＩＬ−１関連疾患（例えば関節リウマチ及び炎症性大腸炎）の症状の軽減能を発揮する他の物質と組み合わせて用いることができる。そのような物質の例には、限定されるものではないが、抗リウマチ薬、例えばクロロキン、オーラノフィン（リドーラ（商標））、デキサメサゾン、金チオリンゴ酸ナトリウム、メトトレキセート（Ｌｅｅら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、８５：１２０４を参照されたい）、プロブコール（Ｋｕら、１９８８、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６２：７７８を参照されたい）、ペントキシフィリン（例えばＳｕｌｌｉｖａｎら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７２２）、ジスルフィラム（Ｍａｒｘ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：２５７を参照されたい）、抗酸化剤、例えばノルジヒドログアヤレト酸（Ｌｅｅら、１９８８、Ｉｎｔ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．、１０：３８５）、ＩＬ−１トラップ（例えば２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖ．Ｄｒｕｇｓ、４（５）：５９３−５９７を参照されたい）、アナキンラ（キネレット（商標）、ＰＣＴ出願ＷＯ００／２３６１５２号）、レフルノミド、コルチコステロイド（メドロール（商標）、デルタゾン（商標）、Ｏｒａｓｏｎｅ（商標））、及び他の物質、例えばＢｅｎｄｅｒ及びＬｅｅ（１９８９）『医化学年報』、第２０章：「ＩＬ−１の薬理学的調節」：１８５−１９３）に記載のものが含まれる。抗炎症薬、例えば非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ、例えばロフェコキシブ（ビオックス（商標））、セレコキシブ（セレブレックス（商標））、バルデコキシブ（ベクストラ（商標））、アルピリン（商標）、アドビル（商標））、抗ＴＮＦ−α薬（インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ）、コラーゲナーゼ阻害剤、その他のような他の薬物を本発明の化合物と組み合わせて用いることもできる。当然ながら、２以上のペプチド、誘導体、及びペプチド模倣体の組み合わせ、並びに１以上の薬物とそれらの組み合わせを、あらゆる組み合わせで用いることもできる（例えば、１以上のペプチドと１以上の模倣体、１以上の模倣体と１以上の誘導体、１以上のペプチドと１以上の薬物など）。
【０１３６】
本発明を以下の非限定的な実施例によって更に詳細に説明する。実施例は具体的な説明のためにのみ提供するのであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１３７】
ＡＰＩ−１０１ペプチドの効果
本発明の化合物及び方法の有効性の１例を、同定したペプチドＡＰＩ−１０１（配列番号１：ＡＰＲＹＴＶＥＬＡ）を用いて得た結果によって表す。
【０１３８】
以下の実施例に記載した全てのペプチドは、保護基を有する有機相中の固相合成法のＦＭＯＣプロトコールにしたがい合成した。それらを、ＨＰＬＣを用い、Ｃ１８カラムにて、アセトニトリル濃度勾配１０〜６０％で溶離させて収率７０％に精製した。質量分析によって分子量を検証した。当然ながら、上記のように、天然アミノ酸を用いる場合、当該技術分野に公知の遺伝子操作技術によって得ることができる。
【０１３９】
3Ｈ−チミジン取り込み法を用いて、ペプチドＡＰＩ−１０１（配列番号１）及びＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、Ａ５４９がん細胞においてＩＬ−１の増殖作用を測定した。ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（３７℃）で２４時間刺激する前、Ａ５４９細胞をさまざまな濃度のペプチドとプレインキュベーションした（４５分間）；ＩＬ−１βによる刺激の２４時間前にウシ胎仔血清を除いて他の分裂促進剤の増殖作用を回避した。次に3Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）を２４時間加え、その後、１０％冷ＴＣＡで細胞を３回洗浄し、０．１Ｎ ＮａＯＨ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶解させた。シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。実験を２重で３回繰り返した。図１に見られるように、ペプチドは、ＩＣ50 １０-6ＭでＩＬ−１による増殖阻害を完全に無効にした。
【０１４０】
ＩＬ−１がプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の合成を内皮細胞及び／又は軟骨細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導することは当該技術分野において周知である。したがって、ヒト軟骨細胞及びコブタ脳微小血管内皮細胞をペプチドＡＰＩ−１０１（１０-6Ｍ）とともに４５〜６０分間、３７℃でプレインキュベーションし、ヒトＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を増殖培地に加えた。２４時間のインキュベーション後、増殖培地を除去して蒸発させた。市販のキット（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）を用いてＲＩＡアッセイにてＰＧＥ2値を測定した。
【０１４１】
図２は、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）によって誘導されたＰＧＥ2合成が、１０-6Ｍの濃度のＡＰＩ−１０１（配列番号１）で、ＩＣ50 １０-6Ｍにて５０％以上顕著に減少したことを示している（図３）。
【０１４２】
生体外特性
他の実験では、コブタ軟膜血管で血管運動性試験を行い、ＩＬ−１βの血管拡張作用に対するＡＰＩ−１０１（配列番号１）の具体的効果を更に評価した。
【０１４３】
脳血管に対する生体外血管運動反応を記載の通りに行った（Ｌｉら、１９９６；Ｈｏｕら、２０００；Ｈｏｕら、２００１；Ｈｏｕら、２００３）。ヨークシャーコブタから脳を取り出した。軟膜血管を露出した皮質切片を、９５％Ｏ2、５％ＣＯ2で平衡化し、３７℃に維持したクレブスバッファー（ｐＨ７．４）を含有する２０ｍｌ浴のワックス基剤に対して固定した。解剖顕微鏡に取り付けられたビデオカメラで微小血管を可視化し、記録した。デジタル画像解析機で血管径を測定した。プレ収縮剤Ｕ４６６１９（１０-7Ｍ）の局所投与前後に血管径を記録した。標本の安定化後、安定な血管拡張が検出されるまでリガンド（ＩＬ−１β、７５ｎｇ／ｍｌ）を加えた。続いてペプチドを、１０-10〜１０-5Ｍのさまざまな濃度で加えた。先に記載された通りに血管拡張の逆転を可視化して測定した（Ｈｏｕら、２０００；Ｈｏｕら、２００１；Ｈｏｕら、２００３）；２匹の動物について３重測定を行った。
【０１４４】
図４からわかるように、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）は、ＩＬ−１β（７５ｎｇ／ｍｌ）によって誘導された血管拡張をＩＣ50 １８２ｎＭにて防ぐことができた。
要約すれば、これらの結果は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１Ｒａｃｐ受容体を標的にすることで、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）はＩＬ−１の生体反応の阻害に有効であったことを示している。
【実施例２】
【０１４５】
アラニンスキャンによって得たＡＰＩ−１０１誘導体の効果
ＡＰＩ−１０１（配列番号１）アンタゴニストの顕著な効果を実証するために、ＡＰＩ−１０１と誘導体に関する構造機能関係データを提供するための実験を行い、活性に関して最も重要な領域を同定した。したがって、アラニンスキャン変異をＡＰＩ−１０１（配列番号１）について行った（ペプチド配列に関しては図１７を参照されたい）。当然ながら、アラニンの代わりに他のアミノ酸を用いてスキャン実験を行うこともできたであろう。
【０１４６】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
実施した変異に応じた結果の表の概要を図１７に示す。
変異ペプチドの効率及び阻害活性をＩＬ−１誘導性ＰＧＥ2合成の阻害を測定することによって決定した（上記実施例１の実験プロトコールを参照されたい）。ＡＰＩ−１０１．１（配列番号２）のみが親ペプチドＡＰＩ−１０１（配列番号１）と比較して内皮細胞及び軟骨細胞においてわずかに効率が上昇していた。一方、ＡＰＩ−１０１．５（配列番号６）、−１０１．６（配列番号７）、及び−１０１．７（配列番号８）は両細胞種においてほとんど全ての活性を失っていた。このことは、標的としたＶＥＬＡ領域がペプチドの活性に重要であることを示唆している。図５は、このシリーズの最も有効なペプチドについてグラフ表示したものである。全てのペプチドは１０-6Ｍの濃度で試験した。
【０１４７】
生体外特性
ＡＰＩ−１０１のアラニンスキャンペプチドについても血管運動性試験を行った（実施例１の実験プロトコールを参照されたい）。図６は、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）、−１０１．１、−１０１．３、及び−１０１．６（それぞれ配列番号２、４、及び７）はいずれもＩＬ−１β（７５ｎｇ／ｍｌ）で誘導される血管拡張を逆転させ、そしてＡＰＩ−１０１．１（配列番号２）はＡＰＩ−１０１よりもわずかに阻害活性が上昇し、血管拡張を７０％止めたことを示している。
【０１４８】
全体的に見て、変異も置換もペプチド誘導体の活性をＡＰＩ−１０１（配列番号１）より顕著に増加させなかったが、ペプチドの活性に重要な領域に関する情報が得られた。
【実施例３】
【０１４９】
ＡＰＩ−１０１の更なる最適化による活性改善効果
活性を更に改善し、その活性に重要なＡＰＩ−１０１内の領域について得たアラニンスキャンの結論を評価するために、ペプチドのＮ末端アミノ酸を徐々に切断した。図７は、新たなペプチドの配列、及びＡＰＩ−１０１について採用した最適化の一般的パターンを示す
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
ＩＬ−１βはヒト線維芽細胞の増殖を誘導する。3Ｈ−チミジン取り込みプロトコール（実施例１のプロトコールを参照されたい）を用いて、ＩＬ−１β誘導性ＷＩ−３８（ヒト肺線維芽細胞）増殖に関し短鎖型ペプチドをアッセイした。
【０１５０】
ＩＬ−１Ｒ誘導性増殖の６５％を止めるＡＰＩ−１０１（配列番号１）に対し、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）及びＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）はＩＬ−１β誘導性増殖を１００％止める（図８）。
【０１５１】
ＡＰＩ−１０１短鎖型誘導体についてもＩＬ−１誘導性ＰＧＥ２合成の測定を行った。図１８は、さまざまなペプチドの効能及び効果の概要を示す。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は最も有効で強力な短鎖型ペプチドであり、ＷＩ−３８細胞及び内皮細胞に対するＩＣ50が、ＡＰＩ−１０１（７９０ｎＭ及び２２０ｎＭ）と比較して、０．２ｎＭ及び１．２ｎＭであった。ＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）及び１２（配列番号１２）は効能及び効果が減少しており、アルギニンの後のペプチド切断はその効能及び効果に影響を及ぼすことを示していた。
【０１５２】
細胞障害性
ＡＰＩ−１０１の最新誘導体の細胞障害性も２つの細胞種：ＷＩ−３８及び脳微小血管内皮細胞について測定した。先に記載された通りに細胞生存率をアッセイした（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、２００１；Ｂｒａｕｌｔら、２００３）。内皮細胞及び線維芽細胞をさまざまな濃度のペプチドとともに３７℃で２４時間インキュベーションした。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）のＰＢＳ溶液を終濃度５０μｇ／ｍｌで増殖培地に加えた。細胞をＭＴＴとともに３７℃で２時間インキュベーションした。次に増殖培地を吸引し、イソプロパノール：１Ｎ ＨＣｌ ２４：１の溶液２００μｌを各ウェルに加えて細胞を溶解させた。生存細胞はＭＴＴ産物（ミトコンドリアを介して）をホルマザンと呼ばれる測定可能比色（青色）産物に変換する。ホルマザン産生（及び細胞生存率）を、溶解物１００μｌの光学密度を６００ｎｍで測定することによって決定した。
【０１５３】
図９に示すように、１０-5Ｍペプチドに２４時間曝したとき、細胞は毒性を示さなかった。
生体外特性
ＩＬ−１誘導性血管拡張に対するＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）の効果を評価するため（ｉｎ ｖｉｔｒｏで最高活性を示したペプチド）、血管運動性実験も行った（プロトコールについては実施例１を参照されたい）。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は１０．８ｎＭで最高のＩＣ50を示し、ＡＰＩ−１０１（１８２ｎＭ）よりも１００倍強力であった（図１８）。ペプチド１０１．９（配列番号９）、１０１．１１（配列番号１１）、及び１０１．１２（配列番号１２）は、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）よりも良好なＩＣ５０を示した（図１８及び図１０）。図１０のペプチドの濃度範囲は１０-10Ｍ〜１０-5Ｍであった。したがって、生体外実験では、ＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）及びＡＰＩ−１０１．１２（配列番号１２）が親ペプチドと比較して顕著に改善された阻害活性を示した。
【０１５４】
ｉｎ ｖｉｖｏ特性
ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰペプチドアンタゴニストの全身作用
誘導体を頚部又は直接胃に注射することによって天然リガンドの生理作用をｉｎ ｖｉｖｏで逆転できるかどうか評価するため（消化管を介したペプチドの安定性を証明するため）、ＡＰＩ−１０１誘導体のＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）（及びその他）を試験した。スプラーグ・ドーリーラット（３００ｇ）をイソフルラン（２．５〜４％）で麻酔した。天然リガンド（ＩＬ−１β）又はビヒクル（生理食塩水）を頚静脈から注射した（５μｇ／ｋｇ）。その後のＰＧＥ2測定のために、各注射の前及び１０分後に頚動脈から採血した。頚静脈又は直接胃にペプチドを投与した（ＩＣ50値に基づいた用量、及び細胞外空間と同等な分布量）（静脈内（ｉｖ）で用いた５回用量）。動脈圧及び心拍数を持続的にモニターし（Ｇｏｕｌｄ）、一方、日常的な解析で体温及び血液ガス（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）を先に記載された通りに測定した（Ｌｉら、１９９７；Ｈａｒｄｙら、１９９９；Ｎａｊａｒｉａｎら、２０００）。実験は３回繰り返した。
【０１５５】
上記方法のいずれかでラットに投与したとき、ＩＬ−１β誘導性の重篤な低血圧を観察した。以下のペプチドは、低血圧をｉｎ ｖｉｖｏで防ぐことができる例示アンタゴニストを構成する：
１． ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）：ＩＬ−１βの注射後（５μｇ／ｋｇ）に頚部注射によって投与した場合、１０-8Ｍの濃度で低血圧を９５％防いだ（即ち、ＩＬ−１誘導性低血圧を和らげた）。ＡＰＩ−１０１．９（配列番号９）のような他の誘導体も、このＩＬ−１βの生体作用を防いだが、生理食塩水対照（図１１Ａ）よりも顕著に良好であったものの、ペプチドＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）、１０１．１０１（配列番号１３）、又はペプチド模倣薬１０１．１０９、１０１．１１１、及び１１．１１２（図２０）よりも効果が小さかった。これは、ペプチドが動物においてＩＬ−１βの効果を逆転させることによってｉｎ ｖｉｖｏで血圧上昇効果を有することを明確に立証している。
２． １０-5Ｍの濃度で胃に直接投与した場合、ペプチドはＩＬ−１βによる低血圧を６０％減少させた。この結果は、１０１．１０（配列番号１０）ペプチドの腸内投与がＩＬ−１β誘導性低血圧の主要な効果を依然として維持し（図１２Ａ）、したがって消化管に沿って効果及び安定性を維持できることを立証した。
【０１５６】
本発明のＩＬ−１受容体アンタゴニストのＩＬ−１Ｒ活性に対する効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価する他の方法は、ラット血清のＰＧＥ2レベルを測定することである。
本発明のＩＬ−１Ｒ受容体アンタゴニストが低血圧をｉｎ ｖｉｖｏで防止できる場合、ＰＧＥ2の合成も予防できるはずである。したがって、上記実験に用いたラット血清のＰＧＥ2を測定した（例えば動脈圧変動測定）。短鎖型ＡＰＩ−１０１誘導体ペプチドを用いて得た結果の例を以下に記載する。
【０１５７】
再度、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は、ペプチドを頚部に注射したとき、ＰＧＥ2合成（６０％）の防止について試験したＡＰＩ−１０１誘導体の中で最も有効であることを示した。ペプチドを直接胃に注射したとき、更に高い阻害が得られた（図１１Ｂ及び図１２Ｂ）。
【０１５８】
ＡＰＩ−１０１．１０の更なる最適化
最適化の最終ラウンドから、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）を最高のペプチド誘導体として同定した。したがって、ＡＰＩ−１０１をＮ端から９〜７アミノ酸切断することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏ効果を傷つけることなく、効能を改善させることができるであろう。
【０１５９】
図１５は、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）について行った次の変異を示す。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）のアルギニンをシトルリンに置換した −Ｎ端付近でグアニジンからウレア基に改変。他の変異（例えば、ＡＰＩ−１０１．１０２（配列番号１４）及び１０１．１０３（配列番号１５）においてＥからＱへ）及びＣ端の短鎖型ペプチド（ＡＰＩ−１０１．１０８（配列番号２０））も行ってペプチドの効能及び効果を改善させた。
【０１６０】
図１５は、これらのペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を示す。コブタ脳微小血管内皮細胞及びＷＩ−３８ヒト線維芽細胞を用いてＰＧＥ2を測定した。変異のいくつかは有益であり、効能に主要な増加を与えた。例えば、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）及び１０１．１０７（配列番号１９）は、１０００倍を越える良好な効能を示し、ヒトＷＩ−３８細胞におけるＩＣ50が０．０５ｐＭ及び０．１ｐＭであった。
【０１６１】
次に、これらの新たに生成されたペプチドに関し、生体外実験を行った。脳組織をペプチド及びＩＬ−１βとともにインキュベーションし、市販のキット（アマシャムバイオサイエンス、ｃＧＭＰアッセイｂｉｏｔｒａｃｋ（商標）システム）でｃＧＭＰを測定した。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は既に８５％のＩＬ−１β誘導性ｃＧＭＰ産生を阻害し（１０-6Ｍ）、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）及び１０１．１０６（配列番号１８）は９０％を越えるｃＧＭＰ産生を阻害した（結果は示していない）。したがって、グルタミン酸の陰電荷の除去とスレオニンの除去によりアンタゴニストの効能を改善できるようである。注目すべきは、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）の活性がアムジェンの薬物キネレット（商標）よりも優れていることが示されたことである（データは示していない）。
【０１６２】
総合すれば、本発明は、ＡＰ１−１０１は強力で有効なＩＬ−１受容体アンタゴニストであることを明確に立証している。更に、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）から出発して、本発明者らは、系統的様式で更により強力で有効なアンタゴニストを生成することができたことを明確に立証している（ＡＰＩ−１０１及び１０１．１００シリーズの誘導体のＩＣ50と比較して示すように）。したがって、本発明は、新規ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−ＲａｃＰ受容体アンタゴニストを同定する手段、及びＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−ＲａｃＰが関与する経路における欠陥に関連する疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。当該技術分野において通常の技術を有する者は、本発明の教示と当該技術分野における一般常識の水準に基づいて、以下に記載のように、ペプチド模倣薬及び他の誘導体を生成することもできる。
【実施例４】
【０１６３】
ラット炎症性大腸炎（ＩＢＤ）モデルにおけるＡＰＩ−１０１の効率
ＩＢＤはヒト集団において罹患率の高い胃腸管の慢性炎症である。ペプチドＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）が、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で誘発したＩＢＤ動物モデルにおいて、更に他の炎症プロセスを防げるかどうかを実証するために本実験を行った。ＴＮＢＳは、急性腸炎及びクローン病に典型的な好中球及びマクロファージの経壁浸潤、亀裂潰瘍形成、並びに粘膜下線維症を特徴とするＩＬ−１２介在ＴH−１反応を引き起こす（Ｂｏｕｍａ及びＳｔｒｏｂｅｒ、２００３）。
【０１６４】
炎症性大腸炎モデル
結腸炎症は、雄性スプラーグ・ドーリーラット（１７５〜２００ｇ）にハプテンであるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を直腸内／結腸投与することによって誘導した（Ｂｏｕｍａ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ、２００３；Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９８９）。イソフルランで動物を麻酔し、ＴＮＢＳを５０％エタノール（容量／容量）に溶解した。１２０ｍｇ／ｍｌ（ＴＮＢＳ）をポリエチレンチューブ（ＰＥ５０）を用いて結腸に投与した（ラットあたり合計量０．２５ｍｌ）。肛門から８ｃｍのところにカニューレを挿入し、溶液の排出を防ぐためにＴＮＢＳ投与後少なくとも１５分間適当な位置に維持した。ＴＮＢＳ投与前２時間に、ＡＰＩ−１０１誘導体ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０、１．１ｍｇ／ｋｇ）又は０．９％生理食塩水を尾静脈から静脈内投与した（合計量０．３ｍｌ）。次に、プライム腹腔内ａｌｚｅｔポンプを用いてＡＰＩ−１０１．１０（２．２ｍｇ／ｋｇ、さまざまなペプチドのｔ1/2＝２〜３時間に基づいて血圧実験に用いた６回用量）又は０．９％生理食塩水を持続注入した。第３群（対照）にはＴＮＢＳを注射しなかった。ＴＮＢＳ投与後６日目に、ＣＯ2吸入によってラットを屠殺した。第７日目までに自然な組織再生が始まり、これは試験ペプチド又はペプチド誘導体の治療効果を覆い隠すことができるため、第６日目を終点として選択した。結腸を取り出し、巨視的に（癒着、潰瘍形成、変色、及び出血）及び組織学的に（好中球浸潤、上皮傷害、陰窩変形、及び潰瘍形成）調べた（Ａｎｔｈｏｎｙら、１９９５；Ｐａｄｏｌら、２０００；Ｄｉｅｌｅｍａｎ，ＬＡら、１９９７；Ｔｏｒｒｅｓ ＭＩら、１９９９）。１群あたり２匹の動物を試験した。
【０１６５】
近位肛門領域から４〜６ｃｍのところで組織横断切片を切り出し、ヘマトキシリン／エオジン法で染色した。
炎症性大腸炎のＴＮＢＳモデルは、（例えばヒトにおける）クローン病の炎症特性及び組織傷害を再現する。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、ＴＮＢＳを注射した動物の結腸は、形態的に腸壁の肥厚、浮腫、及び変色を呈示し、顕著な炎症を示した。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）で前処理した動物の結腸の巨視的特徴は対照動物のものと（図１４Ｃ）似ていた。組織学的特徴は、上皮層及び陰窩への好中球浸潤（図１６Ｂを参照されたい）、上皮層傷害、並びに陰窩の喪失（図１６Ｂ）から成っていた。動物をＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）で前処理することにより、ＴＮＢＳで誘発された結腸損傷が妨げられた。図１６では、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）で処理した結腸における陰窩の組織化と完全性は、たとえ依然として炎症が存在しても保存されることが理解できるであろう（巨視的解析実験と比較して、ＡＰＩ−１０１．１０の用量の半分を用いた）。図１６Ｂに示す上皮層の傷は、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）処理動物において完全に妨げられる（図１６Ｃ）。したがって、本発明のＩＬ−１Ｒアンタゴニストは炎症性大腸炎動物モデルにおいても非常に有効である。
【実施例５】
【０１６６】
ペプチド模倣薬ＡＰＩ−１０１．１０９、ＡＰＩ−１０１．１１０
本発明のアンタゴニストの効果及び効能を更に改善するために、ペプチド模倣薬をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、スクリーニングした。１つの態様では、ペプチド模倣薬はＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）又はＡＰＩ−１０１．１０７（配列番号１９）に由来し、１次構造は：ＡＰＩ−１０１．１０９はＲＹ（ＨｙＶａｌ）ＰＥＬＡであり（図２０）、ＡＰＩ−１０１．１１０はＲＹ（Ｉ2ａａ）ＥＬＡである（図２１）。ここで、ＨｙＶａｌはβ−ヒドロキシバリンであり、Ｉ2ａａはインドリジジン−２−オン アミノ酸（２−オキソ−３−アミノ−アザビシクロ［４．３．０］ノナン−９−カルボン酸である。これらのペプチド模倣薬もＤ−ペプチドである。
【０１６７】
手順：
固体支持体の調製
ベンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩（２ｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、ロット番号１１９８８、１００〜２００メッシュ、添加１．２ミリモル／ｇ）を、１０ｍｌ／ｇの以下のそれぞれの試薬：５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2；ＣＨ2Ｃｌ2；ＤＭＦで１分間×３回洗浄した。樹脂を、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）アミノカプロン酸（１．２７ｇ、３．６ミリモル、１５０モル％）、ＴＢＴＵ（１．２７ｇ、３．９６ミリモル、１６５モル％）、ＤＩＥＡ（６９０μＬ、３．９６ミリモル、１６５モル％）、及びＨＯＢｔ（５３５ｍｇ、３．９６ミリモル、１６５モル％）のＤＭＦ（２０ｍｌ、１０ｍｌ／ｇの樹脂）溶液で処理し、カイザー試験が陰性になるまで１時間撹拌した。樹脂を１０ｍｌ／ｇの以下の溶液で交互に洗浄した：ＤＭＦ（３×１分）及びイソプロピルアルコール（３×１分）。次に樹脂をピペリジンのＤＭＦ液で処理し（２０％ｖ／ｖ、２０ｍｌ、１×２分、１×３分、１×１０分）、続いて１０ｍｌ／ｇのＤＭＦ（３×１分）とイソプロピルアルコール（３×１分）で交互に処理した。樹脂を、４−［（Ｒ，Ｓ）−α−１（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシ−ホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｋｎｏｒｒリンカー、１．９４ｇ、３．６ミリモル、１５０モル％）、ＴＢＴＵ（１．２７ｇ、３．９６ミリモル、１６５モル％）、及びＤＩＥＡ（６９０μＬ、３．９６ミリモル、１６５モル％）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液で１時間撹拌した。樹脂を１０ｍｌ／ｇの以下の溶液で連続的に洗浄した：ＤＭＦ（３×２分）、イソプロピルアルコール（３×２分）、及びＣＨ2Ｃｌ2（３×２分）。高真空下で樹脂を一晩乾燥させて３．６６ｇの樹脂を得た。
【０１６８】
添加の決定
ピペリジン（２０ｇ）とＤＭＦ（２０ｇ）を混合した。サンプルバイアル中の一定量のこの溶液に（２０ｍｌ、１８．０８ｇ）乾燥樹脂（２０ｍｇ）を加え、アルゴン気流の通過によって懸濁液を穏やかに撹拌した。５０分後、樹脂を安定させた。溶液のアリコート（１ｍｌ）をエタノールで５０倍希釈し、吸光度を３０１ｎＭにて測定した（Ｎ−（９−フルオレニル−メチル）ピペリジン ＵＶ λmax ２６７ｎＭ（ε１７５００）、２９０（５８００）、及び３０１（７８００）。２回の個別の測定（平均化）はＡ301＝０．０７８５であった。下式：［ｃ（ミリモル／ｇ）＝（ＯＤ×５０×１０2）／７８００］より、ｃ＝０．５０ミリモル／ｇであった（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒら、１９７９）。
【０１６９】
ペプチド合成
アミノ酸はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ（ルイビル、ケンタッキー州）から購入し、以下の誘導体として用いた：Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ・Ｈ2Ｏ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ。（Ｒ）−β−ヒドロキシ−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）バリンを、（Ｒ）−β−ヒドロキシ−Ｎ−（Ｂｏｃ）バリンから（Ｄｅｔｔｗｉｌｅｒら、２００３）、Ｂｏｃ基を除去し（１：１ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＣＨ2Ｃｌ2）、含水アセトン中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ及びＮａＨＣＯ3で保護し（Ｃａｐａｔｓａｎｉｓら、１９８３）、続いてクロマトグラフィによりシリカゲルに対して精製し（１：１：９８ ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／ＣＨＣｌ3）、含水アセトニトリルから凍結乾燥することによって調製した（収率７８％）。（３Ｒ，６Ｒ，９Ｒ）−２−オキソ−３−［Ｎ−（Ｆｍｏｃ）アミノ］−１−アザビシクロ［４．３．０］−ノナン−９−カルボン酸を、（３Ｒ，６Ｒ，９Ｒ）−２−オキソ−３−アミノ−１−アザビシクロ［４．３．０］−ノナン−９−カルボン酸メチルから、含水アセトン中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ及びＮａＨＣＯ3でＦｍｏｃ−保護し（Ｃａｐａｔｓａｎｉｓら、１９８３）、続いてメチルエステルを選択的加水分解することによって（Ｐａｓｃａｌら、１９９８）調製した（Ｄ−グルタミン酸から順に調製（Ｌｏｍｂａｒｔら、１９９６））。ペプチド合成を０．１ミリモルスケールで行い（２００ｍｇ樹脂）、ＤＭＦ中のピペリジンで脱保護し（１０ｍｌ／ｇ樹脂、２０％ｖ／ｖ、１×２分、１×３分、１×１０分）、続いてＤＭＦで洗浄（１０ｍｌ／ｇ樹脂、５×１分）することによって実施した。ＴＢＴＵのＤＭＦ（０．２５Ｍ、２ｍｌ）溶液に溶解したＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．５ミリモル、５００モル％）を樹脂に加えた。樹脂を撹拌後（５分）、ＤＩＥＡ（０．６ミリモル、６００モル％）を加え、撹拌を１時間継続した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（１０ｍｌ／ｇ樹脂、５×１分）、カイザー試験でカップリング効率を測定した。カップリングのあいだ、樹脂を機械的なボルテックス装置で撹拌し、リンスし、配列を脱保護した。Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８カラム（寸法２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で、アセトニトリル／水／ＴＦＡ混合物を用いてＲｐ−ＨＰＬＣ解析を行った。ここで、溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡである（以下を参照されたい）。流速は０．５ｍｌ／分であり２１４ｎＭで検出した。
【０１７０】
ペプチド模倣薬ＡＰＩ−１０１．１０９（ＫＨ−Ｃ２９０９９）
樹脂を、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、フェノール（５％）、及びトリエチルシラン（２．５％）を含有する２０ｍｌ／ｇのカクテルで処理し、機械的なボルテックス装置で１時間室温にて撹拌することによって、樹脂（１８０ｍｇ）からの切断を、同時に起こる側鎖の脱保護とともに行った。その後、ろ過し、ＴＦＡでリンスし（２×１ｍｌ）、０℃でＥｔ2Ｏ中に沈殿させてペプチドを得た。ＨＣｌ溶液（１Ｍ）からの凍結乾燥によって粗製ペプチドを２塩酸塩として単離し、白色粉末（１８ｍｇ）を得た。これは、Ａ中５〜４０％Ｂの溶離液を用いた２０分にわたるｒｐ−ＨＰＬＣ（ＲＴ＝１４．６分）により純度９０％以上を示した。Ｃ39Ｈ64Ｎ11Ｏ11（ＭＨ+）に対するＬＲＭＳの計算値は８６２、実測値８６２であった。
【０１７１】
ペプチド模倣薬ＡＰＩ−１０１．１１０（ＫＨ−Ｃ５０１１０）
樹脂を、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、フェノール（５％）、及びトリエチルシラン（２．５％）を含有する２０ｍｌ／ｇのカクテルで処理し、機械的なボルテックス装置で１時間室温にて撹拌することによって、樹脂（２２ｍｇ）からの切断を、同時に起こる側鎖の脱保護とともに行った。その後、ろ過し、ＴＦＡでリンスし（２×１ｍｌ）、０℃でＥｔ2Ｏ中に沈殿させてペプチドを得た。ＨＣｌ溶液（１Ｍ）からの凍結乾燥によって粗製ペプチドを２塩酸塩として単離し、白色粉末（５．７ｍｇ）を得た。これは、Ａ中５〜４０％Ｂの溶離液を用いた２０分にわたるｒｐ−ＨＰＬＣ（ＲＴ＝１９．８分）により純度８５％以上を示した。Ｃ38Ｈ60Ｎ11Ｏ10（ＭＨ+）に対するＬＲＭＳの計算値は８３０、実測値８３０であった。
【０１７２】
結果：
ペプチド模倣薬のスクリーニングアッセイとして、内皮細胞におけるＩＬ−１誘導性ＰＧＥ2合成アッセイを用いた。ペプチド模倣化合物ＡＰＩ−１０１．１１０（図２１）の効能はＩＣ50 ０．２ｐＭであり、これは、ＡＰＩ−１０１．１０７（配列番号１９）よりも１０倍高く、後者の効果の２倍である。化合物ＡＰＩ−１０１．１０９（図２０）もＰＧＥ2の阻害（ＩＣ50）において効能が向上していた（図１９）が、そのＫＤは有効な薬物であるには高すぎる。
【実施例６】
【０１７３】
ラット炎症性大腸炎（ＩＢＤ）モデルにおけるＡＰＩ−１０１．１０、ＡＰＩ−１０１．１０７、及びＡＰＩ−１０１．１１３の効率
これまではＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）と呼んでいたリードペプチドＴＴＩ−１０１．１０、ＴＴＩ−１０１．１０７及びＴＴＩ−１０１．１１３（それぞれ１０１．１０７及び１０１．１１３；又はそれぞれＡＰＩ−１０１．１０７及びＡＰＩ−１０１．１１３ともいう）が実施例４に記載の動物ＩＢＤモデルの炎症特徴を防ぐことができるかどうかを検証するために更なる実験を行った。結腸炎症は、実施例４に記載のように、ハプテンであるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内／結腸投与によって誘発した。ＴＮＢＳ投与前２時間に、ペプチド、ペプチド模倣薬、又は０．９％生理食塩水を尾静脈から静脈内投与した（ｉｖ）（各種濃度、ｍｇ／ｋｇ／日）（合計量０．３ｍｌ）。持続注入の場合、ＡＰＩ−１０１．１０（又は他のペプチド若しくはペプチド模倣薬）（２．２ｍｇ／ｋｇ、さまざまなペプチドのｔ1/2＝２〜３時間に基づいて血圧実験に用いた４回用量）又は０．９％生理食塩水をプライム腹腔内ａｌｚｅｔポンプを用いて持続注入した。第３群（対照）にはＴＮＢＳを注射しなかった。間欠投与の場合、ＴＮＢＳ投与後１５分に１０１．１０（０．２５〜１ｍｇ／ｋｇ）、１０１．１０７（０．２ｍｇ／ｋｇ）、１０１．１１３（０．０５〜１ｍｇ／ｋｇ）を間欠腹腔内注射（ｉｐ）によって投与した。また、これらのＩＬ−１Ｒアンタゴニストは１日２回（ＢＩＤ）投与した；レミケード（登録商標）（抗ＴＮＦα）（１０ｍｇ／ｋｇ）及びデキサメサゾン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与したが、これらは１日１回（ｑｄ）のみである。１０１．１０、１０１．１１３（１及び２．５ｍｇ／ｋｇ）、及び５−ＡＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）をＴＮＢＳ投与後１時間に直腸内投与（ｉｒ）した。５−ＡＳＡは１日１回で、他は１日２回である。最後に、１０１．１０（１〜５ｍｇ／ｋｇ）も１日２回、強制経口投与した（ｐｏ）。ＴＮＢＳ投与後４８時間にＣＯ2吸入によってラットを屠殺した。結腸を取り出し、巨視的に（癒着、潰瘍形成、変色、及び出血）及び組織学的に（好中球浸潤、上皮傷害、陰窩変形、及び潰瘍形成）評価した。処理により、１群あたり１〜７匹の動物を試験した。組織溶解物についてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定した。
【０１７４】
結果：
前述のように、ＴＮＢＳ動物モデルは、クローン病の炎症特徴及び組織傷害を再現するため、ヒトの炎症性疾患の、より詳細には炎症性大腸炎（ＩＢＤ）の有効なｉｎ ｖｉｖｏモデルである。表２に示すように、さまざまな用量で本発明のアンタゴニスト（例えばペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬）を腹腔内持続注射及び間欠注射することにより、潰瘍の形成、陰窩の喪失、及び上皮層傷害などの炎症による組織損傷を妨げた。
【０１７５】
１０１．１０及び１０１．１０７を含有する腹腔内浸透圧ポンプ（持続注入）を受けた動物は、ＭＰＯ活性の顕著な低下、巨視的及び組織学的スコア、キネレットに対する効果の優位性又は同等性を実証した（表２）。１０１．１０、１０１．１０７（１濃度のみ）、及び１０１．１１３の間欠投与は、１日２回投与の用量依存性効果を示した。これは、ＩＢＤに対して近年用いられている薬剤、即ちデキサメサゾン、レミケード（登録商標）、及び５−ＡＳＡによって観察される効果を上回っている。結腸傷害の巨視的観察を採点したところ（４人の盲検観察者）、ペプチドで処理した（ＢＩＤ）動物は癒着及び潰瘍形成が少なかった（ＴＮＢＳ処理動物と比較して５０％未満）。動物は、かなり活力があるようにも見えた。
【０１７６】
【表２】
【０１７７】
【表３】
【０１７８】
図２２は、１つの特定濃度に関する全てのペプチドの巨視的採点と、評価した特徴のリストを図示している。また、図２３からわかるように、ペプチドの間欠注射を受けた動物は、ＴＮＢＳ対照と比較して、好中球浸潤（ミエロペルオキシダーゼアッセイ）が２０〜５０％少なかった。組織切片の検査は、ペプチドで処理した動物は炎症によって誘発された結腸傷害の特徴が少ないことを示した。用いた組織学的傷害採点システムを表３に示し、結果を図２４に図式化する。当然ながら、本発明が関連する分野の熟練技術者によって他の採点システムを用いて適合させることができるであろう。したがって、図２５のパネルＣ及びＤにおける潰瘍及び上皮層傷害の量が、炎症組織を示すパネルＢと比較して減少していることが認識できる。更に、ＴＮＢＳ誘導後１２時間に本発明の物質（例えばペプチド）を投与しても、結腸炎症の減少を示した。残留する高ミエロペルオキシダーゼ活性は、処置前に好中球浸潤が既に発生しているという事実によるものである。
【０１７９】
本発明のペプチド及びペプチド模倣薬は他の手段で投与でき、ＴＮＢＳによって生じた炎症を低下させることを実証するために、ＡＰＩ−１０１．１０及びＡＰＩ−１０１．１１３を直腸内注射した。炎症レベルを上記のように巨視的及び組織学的に評価した。表２からわかるように、２。５ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１０１．１０は、実質的に（５０％）ＭＰＯ活性を低下させ、結腸の組織損傷を部分的に防いだ。
【０１８０】
ＡＰＩ−１０１．１０を他の手段：強制（１日２回）でも投与し、消化管を通るペプチドの安定性を実証した。５．０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度のＡＰＩ−１０１．１０は実質的に炎症特徴を軽減し、ＭＰＯ活性を低下させ、本発明の化合物の安定性を立証した。
【実施例７】
【０１８１】
ＴＴＩ−１０１．１０７ペプチド誘導体及び模倣体
ＴＴＩ−１０１．１０７（配列番号１９及び図１５；ＩＣ50 １．２ｐＭ）をリードペプチドとして用い、いくつかのアナログシリーズをデザインし、合成し、試験して、各残基の重要性を証明した。
【０１８２】
構造と活性の対比：
表４からわかるように、末端Ｄ−アルギニンをアセチル化して化合物ＴＴＩ−１０１．１２１（配列番号２９）を生じた場合、ペプチドの活性は完全に消失した。一方、アルギニン残基をオルニチン又はリジンで置換することもでき、得られたペプチドはその活性を維持する（ＴＴＩ−１０１．１１４、配列番号２２；及びＴＴＩ−１０１．１１５、配列番号２３）。したがって、アルギニンのグアニジン基は（オルニチンが有するように）、ペプチド活性に重要であると思われる。
【０１８３】
ペプチドＴＴＩ−１０１．１０５（配列番号１７）及び１０１．１０６（配列番号８）、並びにペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１．１０９を用いて、上記Ｄ−スレオニン残基及びＤ−バリン残基の置換によって得たデータ（図１５及び図１９を参照されたい）から、これらの残基について曲がった領域の可能性の仮説を立て、（３Ｒ，６Ｒ，９Ｒ；ＴＴＩ−１０１．１１０）及び（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ；ＴＴＩ−１０１．１１２）−インドリジジン−２−オン アミノ酸（Ｒ−及びＳ−Ｉ2ａａ）を導入することによって２つのペプチド模倣体を作製した。図２６に示すこれらのペプチド模倣薬は、それぞれＩＩ型及びＩＩ’型βターンを模倣する。ペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１．１１０は、それが由来するペプチド１０１．１０７と比較して、１０ｐＭの活性を示した（図２６）。
【０１８４】
それぞれグルタミン酸をアスパラギン酸、アスパラギン、及びアラニンに置換したＴＴＩ−１０１．１１７（配列番号２５）、ＴＴＩ−１０１．１１８（配列番号２６）、及びＴＴＩ−１０１．１２３（配列番号３１）を用いてグルタミン酸位置の重要性に取り組んだ。結果は、カルボン酸又はカルボキサミドの除去はペプチド機能に有害であることを示している（表４）。
【０１８５】
Ｃ末端Ｄ−ロイシニル−Ｄ−アラニン残基の検査により、欠失及び置換を有する一連の誘導体を作製した：ＴＴＩ−１０１．１１３（配列番号２１）；ＴＴＩ−１０１．１１９（配列番号２７）、及びＴＴＩ−１０１．１２０（配列番号２８）。Ｄ−アラニン残基の欠失により、７〜３０ｐＭの活性を有するヘキサペプチドＴＴＩ−１０１．１１３（（配列番号２１）表４）を生じた。ロイシン残基の修飾により活性範囲が消失した。
【０１８６】
上記データに基づいて、２つの他の模倣体化合物を合成した（図２６を参照されたい）：ＴＴＩ−１０１．１２４（ＩＣ50 ２．４μＭ及び効果１００％を示したｒｙ［Ｒ−Ｉ2ａａ］ｅｌ；図２６）及びＴＴＩ−１０１．１２５（ＩＣ50 ９０ｐＭ及び効果１００％を示した（Ｄ−ｏｒｎ）ｙ［Ｒ−Ｉ2ａａ］ｅｌａ；図２６）。
【０１８７】
１０１．１１３ペプチドの誘導体
リードペプチド（１０１．１０７ ｒｙｔｐｅｌａ（配列番号１９）、１０１．１０ ｒｙｔｖｅｌａ（配列番号１０）、及び１０１．１１３ ｒｙｔｐｅｌ（配列番号２１））に基づいて、他のアナログシリーズを作製し、ペプチドと誘導体の構造−活性関係（構造−機能関係）を更に試験した。
【０１８８】
塩基性アミノ酸の末端アルギニンの重要性を探究したところ、一連のアナログは、グアニジン部分を塩基性アミンに置換すると活性が比較的低下したことを示した。実際、化合物ＴＴＩ−１０１．１２６（配列番号３２）、ＴＴＩ−１０１．１３３（配列番号３７）、及びＴＴＩ−１０１．１３４（配列番号３８）は、ほとんど又は全く活性を示さなかった（表５）。ＴＴＩ−１０１．１３５（配列番号３９）のように立体化学を反転させた場合、配列番号２１のＤ−アミノ酸とは対照的にアルギニン「Ｒ」はＬ−アミノ酸であるが、活性が低下したが完全には消失しなかった（表５）。
【０１８９】
表５に更に示すように、ペプチド１０１．１１３の活性も、フェノール基を有する芳香族残基チロシンを芳香族残基のフェニルアラニン（１０１．１３２；配列番号３６）又はトリプトファン（１０１．１２８；配列番号３４）で置換すると比較的低下した。ＴＴＩ−１０１．１２７（配列番号３３）のヒドロキシル基を除去するとペプチドの活性は完全に無効になったが、チロシンをトリプトファンで置換すると低下したが活性を維持した。
【０１９０】
Ｃ末端のロイシンをバリンで置換しても活性が低下した。これは、ＴＴＩ−１０１．１２９（配列番号３５）（ｒｙｔｐｅｖ ４００ｎＭ；５０％）を用いた表５において見られるように、疎水性残基の長さの重要性を実証している。
【０１９１】
リードペプチド模倣薬（ＴＴＩ−１０１．１２５；図２６）に基づいて、他の模倣薬シリーズを調製し、本発明の化合物の構造−活性を更に探究した。
チロシンをロイシン及びアラニン残基にそれぞれ置換するためにアザ−アミノ酸残基を用いて、１０１．１３６〜１０１．１４０と１０１．１４１〜１０１．１４４のシリーズを調製した（図２７及び２８）。アザ−アミノ酸は酵素分解に対するペプチドの耐性を改善することができるため、特定のアナログにおける活性の維持はそのｉｎ ｖｉｖｏ作用期間を延長させるための１つの手段を例示する。こうした最後の修飾により、化合物ＴＴＩ−１０１．１４０の開発をもたらした。図２９及び図３０は、ペプチド模倣薬１０１．１２５、１０１．１３６〜１０１．１４４の構造と活性、特に活性が増加した模倣薬１０１−１４０の効能と効果を示す。
【０１９２】
【表４】
【０１９３】
【表５】
【０１９４】
結論
要約すると、本発明は、インターロイキン１のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏの効果を無効にできる、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体の効率的且つ強力なアンタゴニストについて記載する。これらのペプチドは、さまざまな細胞種及びさまざまな生体効果（増殖及びＰＧＥ2合成）に対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有効であり、ＩＬ−１の軟膜血管に対する血管運動作用及び新鮮なサンプル組織のＰＧＥ2合成を無効にすることによってｅｘ ｖｉｖｏで有効であった。更に、これらのＡＰＩ−１０１誘導体は、全身投与及び胃に直接投与したときｉｎ ｖｉｖｏでも非常に有効であった。胃への送達によって得た最後の結果は、本発明のペプチドは経口投与したとき活性である可能性があることを示している。これは、強制経口投与したときに実際に証明された。より重要なのは、確立されたラット炎症性大腸炎（ＩＢＤ）モデルにおいて、ＡＰＩ−１０１．１０が、ラットにＴＮＢＳを注射して誘発した結腸損傷を防ぐことができたことである。他の誘導体（１０１．１００シリーズ）による結果に基づいて、これらのペプチド誘導体及びそのペプチド模倣薬は、ラットにＴＮＢＳを注射して誘発した結腸損傷を防ぐ役割によって証明されたように、強力な抗炎症剤であることが証明されている。
【０１９５】
本発明は、本発明のペプチド及びペプチド模倣体は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰに関与する多くの経路に対して明らかな効果を有することを示している。したがって、本発明の治療的及び予防的な可能性は、一般に動物に、より詳細には哺乳動物、特にヒトに広く影響を及ぼす。
【０１９６】
本明細書の開示に基づいて、当該技術分野に熟練した者は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体阻害化合物の更なる同定に有用な、ペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬のスクリーニングアッセイを開発することができ、あるいは本明細書に例示したものを改良することができる。本発明のアッセイは、ロースループット、ハイスループット、又はウルトラハイスループットのスクリーニング形式のために開発することができる。当然ながら、本発明のアッセイには自動化しやすいアッセイが含まれる。
【０１９７】
したがって、天然アミノ酸を有するペプチドを用いた研究により、本発明は、それらが強力で有効な化合物であることをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験で証明する（例えば、ＴＴＩ−１０１．１０７（配列番号１９）及び１１３（配列番号２１））。更に、本発明は、活性に必要なファーマコフォア及び立体構造、ペプチド及びそれらから生じた模倣薬について初めて記載する。
【０１９８】
注目すべきは、本発明は、非常に顕著な活性（７．４ｐＭ；効果８０％）を有するヘキサペプチドリード：ＴＴＩ−１０１．１１３（ｒｙｔｐｅｌ［配列番号２１］）を提供することである。更に、中央のＤ−スレオニン−ｄ−バリン（Ｄ−Ｐｒｏ）領域を置換するためにインドリジジノンアミノ酸を用いて模倣体又は模倣薬を作製し、それによってリード模倣体ＴＴＩ−１０１．１２５及びＴＴＩ−１０１．１４０の同定を可能にした。
【０１９９】
当然ながら、本発明のアンタゴニストの組み合わせ、又は本発明のアンタゴニストと公知薬物との組み合わせは、本発明の医学的、臨床的、及び薬剤開発の可能性を更に増加させるであろう。
【０２００】
本発明をその具体的態様によって説明しているが、当該技術分野に熟練した者には、本明細書の開示を読むことで、添付の特許請求の範囲に定義したような本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、形態及び細部においてさまざまな改変がなされ得ることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下におけるがん細胞（Ａ５４９）の増殖アッセイを示す。細胞をさまざまな濃度の抗ＩＬ−１Ｒ ＡＰＩ−１０１（配列番号１）ペプチドとともにプレインキュベーションし、次に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで２４時間処理した。次に3Ｈ−チミジンを加えた。２４時間後、細胞を回収し、溶解し、3Ｈ−チミジンを計数した。
【図２】図２は、ＩＬ−１で誘発された微小血管内皮細胞によるＰＧＥ2合成に対する抗ＩＬ−１Ｒペプチドの阻害活性を示す。細胞をペプチドと共に４５分間プレインキュベーションし、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト組換えＩＬ−Ｉβと共にインキュベーションした。ＰＧＥ2合成は増殖培地中で測定した。
【図３】図３は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの存在下、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）ペプチドを用いた微小血管内皮細胞のＰＧＥ2合成の用量反応曲線を示す。
【図４】図４は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β並びに抗ＩＬ−１Ｒ ＡＰＩ−１０１（配列番号１）及びＡＰＩ−１０８ペプチド存在下における軟膜微小血管の血管拡張の用量反応曲線を示す。
【図５】図５は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）及びアラニンをスキャンしたペプチド（１０-6Ｍ）の存在下におけるブタ微小血管内皮細胞（Ａ）及びヒト軟骨細胞（Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＧＥ2合成を示す。
【図６】図６は、ＩＬ−１βによって誘発される（１００ｎｇ／ｍｌ）軟膜微小血管の血管拡張の、最も活性なＡＰＩ−１０１（配列番号１）のアラニンをスキャンしたペプチドを用いたｅｘ ｖｉｖｏ逆転を示す。
【図７】図７は、ＡＰＩペプチドに関する最適化スキームの説明を示す。
【図８】図８は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）及び短鎖型ＡＰＩ−１０１（配列番号１）誘導体の存在下、ヒト肺線維芽細胞（ＷＩ−３８）に対して行った増殖アッセイを示す。
【図９】図９は、ＡＰＩ−１０１ペプチドの誘導体の、ＷＩ−３８細胞（Ａ）；及び脳微小血管内皮細胞（Ｂ）に対する細胞障害性を示す（１０-5Ｍ、ＭＴＴアッセイ）。
【図１０】図１０は、ＩＬ−１β（７５ｎｇ／ｍｌ）で誘発されたラット動脈血管拡張の、ＡＰＩ−１０１誘導体：ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）及びＡＰＩ−１０１．１２（配列番号１２）を両ペプチドとも１０-5Ｍ〜１０-10Ｍの濃度範囲で用いた存在下における用量反応曲線を示す。
【図１１】図１１は、ラットにおけるＡＰＩ−１０１ペプチドの全身投与によるＩＬ−１βで誘発された全身性低血圧及び血清ＰＧＥ2合成のｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す。（Ａ）平均血圧（ＭＢＰ）はＩＬ−１β及び／又はペプチド１０１．１０（１０-5Ｍ）の存在下で減少する。（Ｂ）ＩＬ−１β及びペプチド１０１．１０（１０-5Ｍ）の存在下で血清ＰＧＥ2合成の調節が増加する。
【図１２】図１２は、ラットにおけるＡＰＩ−１０１．１０の腸内注射の、ＩＬ−１βで誘発された低血圧及びＰＧＥ2合成に対する効果を示す。Ａ）平均血圧（ＭＢＰ）はＩＬ−１β及び／又はペプチド１０１．１０の存在下で低下する。Ｂ）ＩＬ−１β及びペプチド１０１．１０の存在下で血清ＰＧＥ2合成の調節が増す。
【図１３】図１３は、更なる最適化のためにデザインされたＡＰＩ−１０１．１０ペプチド誘導体の配列を示す。
【図１４】図１４は、ラット炎症性大腸炎モデルにおけるＡＰＩ−１０１．１０ペプチドの効果を示す（全身）（肉眼検査）。（Ａ）生理食塩水、（Ｂ）ＴＮＢＳ＋生理食塩水、及び（Ｃ）ＴＮＢＳ＋ＡＰＩ−１０１．１０（２．２ｍｇ／ｋｇ／日）。
【図１５】図１５は、微小血管内皮細胞及びＷＩ−３８ヒト線維芽細胞におけるＩＬ−１βで誘発されたＰＧＥ2合成のｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド阻害による１０１．１０ペプチド誘導体の特性を示す（ＩＣ50及び最大効率（Ｅmax）を示す）。
【図１６】図１６は、ＴＮＢＳで誘発されたラット炎症性大腸炎モデルにおけるＡＰＩ−１０１．１０の治療効果を示す（組織学）。（Ａ）生理食塩水、（Ｂ）ＴＮＢＳ（１２０ｍｇ／ｍｌ）＋生理食塩水、（Ｃ）ＴＮＢＳ＋ＡＰＩ−１０１．１０（１．１ｍｇ／ｋｇ／日）。
【図１７】図１７は、ブタの内皮細胞及び軟骨細胞におけるＡＰＩ−１０１誘導体の特性（ＩＬ−１βで誘発されたＰＧＥ2産生に対する阻害活性）を示す。
【図１８】図１８は、ＡＰＩ−１０１誘導体の特性（ＩＣ50及び最大効率）を示す。
【図１９】図１９は、ブタ微小血管内皮細胞において、さまざまなペプチド模倣体の存在下、ＩＬ−１で誘発されたＰＧＥ2合成に関する用量反応アッセイを示す。
【図２０】図２０は、ＡＰＩ−１０１．１０９（「Ｃ２０９９」ｒｙ（ＨｙＶａｌ）ｐｅｌａ）及びＡＰＩ−１０１．１１１ペプチド模倣体の構造を示す。
【図２１】図２１は、ＡＰＩ−１０１．１１０ペプチド模倣体の構造を示す。
【図２２】図２２は、ラット炎症性大腸炎モデルにおけるペプチド１０１．１０、１０１．１０７、及び１０１．１１３の腹腔内注射に反応した結腸損傷の巨視的評価を示す。
【図２３】図２３は、ラット炎症性大腸炎モデル（４８：００）における腹腔内注射されたペプチド１０１．１０、１０１．１０７、及び１０１．１１３の、組織好中球浸潤（ＭＰＯアッセイ）に対する効果を示す。
【図２４】図２４は、ＴＮＢＳで誘発されたラット炎症性大腸炎モデルにおけるペプチド１０１．１０、１０１．１０７、及び１０１．１１３の腹腔内注射に反応した組織学的評価及び組織損傷の採点を示す。
【図２５】図２５は、ＴＮＢＳ並びにＴＴＩ−１０１．１０及び１０１．１０７で処理した結腸組織の組織切片の写真を示す。パネルＡ） 対照（未処理）；Ｂ） ＴＮＢＳで処理した動物；Ｃ） ＴＮＢＳで処理し、１０１．１０（１．０ｍｇ／ｋｇ／日）ペプチドを腹腔内注射した動物；Ｄ） １０１．１０７（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射した動物。
【図２６Ａ】図２６は、ＴＴＩ−１０１．１１０の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２６Ｂ】図２６は、ＴＴＩ−１０１．１１０の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２７Ａ】図２７は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造を示す。
【図２７Ｂ】図２７は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造を示す。
【図２８Ａ】図２８は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造を示す。
【図２８Ｂ】図２８は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造を示す。
【図２９−１】図２９は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２９−２】図２９は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２９−３】図２９は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図３０−１】図３０は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図３０−２】図３０は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図３０−３】図３０は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、及びそれを用いたＩＬ−１受容体活性の調節方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞外非競合的ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲＡｃＰ）ペプチド及びペプチド模倣アンタゴニスト、それらの同定及び治療用途に関する。より具体的には、本発明は、関節リウマチ及び炎症性大腸炎などのＩＬ−１関連疾患の治療に使用するためのペプチド及びペプチド模倣アンタゴニストに関する。本発明は、生化学及び医薬品化学の分野へ応用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
サイトカインは、生物学的に活性なホルモン様タンパク質（インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、成長因子）を示す総称であり、受容体のスーパーファミリーによってその効果を介在する。サイトカイン及びその受容体は強力な制御ネットワークを構成しており、それによって細胞はシグナルを送り、細胞増殖及び分化、細胞死及び生存を調整する。サイトカインは、具体的に、非常に強力な生物活性を有する低分子量ペプチドであり得る。それらの作用メカニズムは、通常、オートクリン及びパラクリンであり、最終的に遺伝子発現を調節することによって作用する。
【０００３】
ポリペプチドホルモンのインターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーは、単球（ＩＬ−１の顕著な供給源である）、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞、星状細胞、上皮細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び数多くのがん細胞を含めたさまざまな細胞種によって発現されるサイトカインの重要なクラスを表す。このサイトカインファミリーは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１８を含めた７つを越える異なるが構造的に関連のある分子から成り、これらは、生物学的反応、及び天然に産生される受容体アンタゴニストであるＩＬ−１ｒａを顕在化する（Ｋｕｍａｒら、２０００）。
【０００４】
ＩＬ−１α遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子はともに２番染色体に局在する。それぞれの遺伝子は７つのエクソンを含有し、第６エクソンの領域が相同である。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βはいずれも、初めに３１ｋＤａの前駆体として産生されるが、プロテアーゼによってプロセシングされて１７、５ｋＤａの成熟タンパク質を生ずる。ＩＬ−１受容体はα型もβ型も認識し、いずれの形態も類似の生物学的特性を有する。ＩＬ−１αはマウスで顕著な形態であるが、ＩＬ−１βはヒトで顕著なサイトカインである。ＩＬ−１の生物学的特性は数多くあり、感染及び損傷に対する多くの免疫反応及び炎症反応を介在することが含まれる。
【０００５】
感染及び損傷への生体反応に対するその正常な有益効果にもかかわらず、ＩＬ−１の作用が有害な状況が明らかになっている。例えば、ＩＬ−１の不適切な産生又は反応が、関節リウマチ、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、変形性関節症、乾癬、敗血症、脳炎、及び呼吸窮迫症候群などの多くの急性及び慢性の炎症性疾患において示されている。ＩＬ−１は、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、及び多くの自己免疫疾患を含めたいくつかの他の病気において役割を果たすことが示されている。
【０００６】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、ＩＬ−６、プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2；ＣＯＸ−２及びＰＧＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）の発現誘導を介する）、及びそれ自体のような炎症性メディエーターの産生を刺激することによって、炎症の調節の上流において主要な役割を果たし、したがって、炎症プロセスを促進する。ＩＬ−１の他の生物活性は、Ｔ細胞のような数多くの細胞種の増殖及び活性化を誘導することである（Ｃｕｌｌｉｎａｎら、１９９８；Ｄｕｎｎｅ及びＯ’Ｎｅｉｌｌ、２００３）。ＩＬ−１は、関節においてコラーゲナーゼレベルを増加させることもでき、関節リウマチの免疫病理学の急性期及び慢性期に関係している。ＩＬ−１は、内皮細胞機能を変化させ、リンパ球及び白血球の滑膜組織への走化性を指示し、並びに軟骨細胞及び線維芽細胞による潜在的コラーゲナーゼの分泌を誘導することに関与することができる。ＩＬ−１は、ＴＮＦとともに、炎症性サイトカインの代表例であると考えられている。しかしながら、ＩＬ−１の効果は炎症に限定されず、このサイトカインは骨形成及びリモデリング、インスリン分泌、並びに発熱誘導においても役割を果たす。
【０００７】
主要な炎症性サイトカインとして、ＩＬ−１は、関節炎などの関節軟骨損傷のような疾患における治療行為のための潜在的に強力な標的である。北米では、変形性関節症や関節リウマチは、心疾患に次いで２番目に勤労不能を引き起こし、その罹患率は年齢と共に劇的に増加する（Ｈａｌｌｅｇｕａ及びＷｅｉｓｍａｎ、２００２）。
【０００８】
２つの異なるＩＬ−１受容体がクローニングされ、特徴付けられている：ＩＬ−１の生体作用を生ずるＩＬ−１ＲＩ（Ｓｉｍｓら、１９８９）と、ＩＬ−１ＲＩＩである。更に、受容体複合体の推定シグナル伝達サブユニットである受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）が同定されている。ＩＬ−１ＲＩ型は主にＴ細胞、表皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、及び上皮細胞に見出される。生体作用を生ずるには、ＩＬ−１ＲはＩＬ−１に結合し、続いてＩＬ−１ＲａｃＰに結合してシグナル伝達を誘引する必要がある。ＩＬ−１Ｒの細胞外部分は、ＩＬ−１に結合する３つのＩｇ様ドメインを含有する（Ｖｉｇｅｒｓら、１９９７；Ｖｉｇｅｒｓら、２０００）。ＩＬ−１Ｒ受容体サブユニットとは対照的に、そしてＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質の細胞外部分に対する抗体に関与する研究によれば、後者はサイトカインと相互作用しない（Ｃｕｌｌｉｎａｎら、１９９８；Ｌａｙｅら、１９９８；Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｙら、１９９８；Ｃａｓａｄｉｏら、２００１）。
【０００９】
ＩＬ−１が結合した後のシグナル伝達の最初のイベントは、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ複合体の形成であり、これは、複合体へのＩＲＡＫ（ＩＬ−１受容体結合キナーゼ）動員、及びキナーゼによるリン酸化カスケードをもたらし、ＮＦκＢ及びＡＰ−１を含めた転写因子の活性化を引き起こす。ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ複合体は、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのようなキナーゼを動員して活性化することもでき、シグナル伝達のＰＬＣ／ＰＫＣ経路の活性化をもたらすこともできる（Ｄａｕｎ及びＦｅｎｔｏｎ、２０００）。
【００１０】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの２つの主要な臨床応用は、関節炎及び炎症性大腸炎（ＩＢＤ）の治療である。これらの病状に利用可能な治療は現在限られている。それらは毒性及び副次的効果を生ずることが多い。したがって、より安全で標的化した治療に対する医学界の要求は無視できない。
【００１１】
ＩＢＤ及び関節リウマチ療法の分野における最近のアプローチには、可溶性受容体、ＩＬ−１Ｒ及びＴＮＦＲに対するモノクローナル抗体、サイトカイン模倣薬、アンチセンス技術、並びにキナーゼ阻害剤の開発が含まれる（Ｖｉｇｅｒｓら、１９９７；Ｖｉｇｅｒｓら、２０００；Ｈａｌｌｅｇｕａ及びＷｅｉｓｍａｎ、２００２；Ｂｏｕｍａ及びＳｔｒｏｂｅｒ、２００３）。ＩＬ−１の具体的な場合では、天然可溶性受容体ＩＬ−１Ｒａ模倣薬であるアナキンラ（一般名キネレット（商標））が、メトトレキセート（ジヒドロ葉酸（葉酸）還元酵素阻害剤）の代わりに重症の活性な関節リウマチを治療するためにアムジェンによって開発された。他の主要な炎症性サイトカイン受容体ＴＮＦＲの場合、２つのアンタゴニスト エタネルセプト（エンブレル（商標）、アムジェン）及びインフリキシマブ（レミケード（商標）、シェーリングプラウ)が開発されている。
【００１２】
先行技術のアンタゴニストはいずれも競合的であり（例えば可溶性受容体、抗体、サイトカイン模倣薬）、多くの場合製造費用がかかるか又はｉｎ ｖｉｖｏで適用困難である（例えばアンチセンス）。リガンドは受容体濃度を遙かに超えているため、ＩＬ−１とその天然受容体との相互作用を阻害するために要する競合的阻害剤の濃度は相当量であることが多い。
【００１３】
したがって、ＩＬ−１によって介在される活性を下方制御できる新規療法に対する必要性が残されている。
本発明は、これらの必要性及び他の必要性を満たすことを求めている。
【００１４】
本明細書は、多くの文献を参照し、それらの内容は本明細書にその全体が援用される。
【非特許文献１】Ａｎｔｈｏｎｙ Ｄ．、Ｓａｖａｇｅ Ｆ．ら（１９９５）．「ウサギ炎症性大腸炎モデルの特徴」．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ ７６：２１５−２２４．
【非特許文献２】Ａｓａｄｕｌｌａｈ Ｋ、Ｓａｂａｔ Ｒ、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍ、Ｖｏｌｋ ＨＤ、Ｓｔｅｒｒｙ Ｗ．「インターロイキン−１０：乾癬に対して主要な影響を及ぼす重要な免疫調節サイトカイン」Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ．２００４ Ｊｕｎ；３（２）：１８５−９２．
【非特許文献３】Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ ＣＪ、Ｔｏｍｂｒａｎ−Ｔｉｎｋ Ｊ．「眼におけるＰＥＤＦの神経保護作用と抗血管新生作用：分子標的と治療可能性」Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００４．Ｓｅｐ ２３（５）５６１−７７．
【非特許文献４】Ｂａｋｅｒ，Ｆ．Ｌ．、Ｌ．Ｊ．Ｓａｎｇｅｒら（１９９５）．「ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける正常組織とがん組織の細胞増殖速度：静止生殖細胞とサイクリング生殖性画分」Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆ ２８（１）：１−１５．
【非特許文献５】Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｍ．Ｈ．、Ａ．Ｋ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｅｒｍｕｄｅｚら（２００１）．「酸素で誘発された網膜症の網膜微小血管変性におけるトロンボキサンの役割」Ｊ ＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ ９０（６）：２２７９−８８．
【非特許文献６】Ｂｏｕｍａ，Ｇ．及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００３）．「炎症性大腸炎の免疫学的及び遺伝学的根拠」Ｎａｔ Ｒｅｖ ｌｍｍｕｎｏｌ ３（７）：５２１−３３．
【非特許文献７】Ｂｒａｄｙ，Ｌ．及びＧ．Ｄｏｄｓｏｎ（１９９４）．「薬物デザイン．ペプチドへの反映」Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７３）：６９２−３．
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【非特許文献９】Ｃａｓａｄｉｏ，Ｒ．、Ｅ．Ｆｒｉｇｉｍｅｌｉｃａら（２００１）．「ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質ＩＬ−１ＲＡｃＰとＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒ（Ｉ）複合体との相互作用モデル」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４９９（１−２）：６５−８．
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【非特許文献４７】Ｐｏｌｙａｋ，Ｆ、Ｌｕｂｅｌｌ ＷＤ．「ペプチド骨格配置の模倣とヘテロ原子側鎖の機能性：アルコール、酸、及びアミン官能基を有するエナンチオピュアなインドリジジン−２−オン アミノ酸の合成」Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：１１７１−１１８０．
【非特許文献４８】Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．、Ｔ．Ｓｔｅｗａｒｔら（１９９３）．「薬物開発におけるペプチド安定性。ＩＩ．単一アミノ酸置換及びグリコシル化のヒト血清中のペプチド反応性に対する効果」Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １０（９）：１２６８−７３．
【非特許文献４９】Ｓｃｈｕｅｒｗｅｇｈ，ＡＪら「炎症性（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＨＦ−α、ＩＦＮ−γ）及び抗炎症性（ＩＬ−４）サイトカインの軟骨細胞機能に対する影響」
【非特許文献５０】Ｓｉｍｓ，Ｊ．Ｅ．「ＩＬ−１受容体とＩＬ−１８受容体、及びその拡張ファミリー」Ｃｕｒｒｅｎ Ｏｐｉｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２．Ｆｅｂ １４（１）１１７−１２２．
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【非特許文献５２】Ｔｏｒｒｅｓ ＭＩ、Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎ Ｍ．ら（１９９９）．「トリニトロベンゼンスルホン酸によって誘導された実験的大腸炎。微細構造的組織化学的研究」Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．４４：Ｎｏ．１２：２５２３−２５２９．
【非特許文献５３】Ｖｉｇｅｒｓ，Ｇ．Ｐ．、Ｌ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９９７）．「インターロイキン−１βと複合体を形成したＩ型インターロイキン−１受容体の結晶構造」Ｎａｔｕｒｅ、３８６（６６２１）：１９０−４．
【非特許文献５４】Ｖｉｇｅｒｓ，Ｇ．Ｐ．、Ｄ．Ｊ．Ｄｒｉｐｐｓら（２０００）．「インターロイキン−１ １型受容体に結合した小さなアンタゴニストペプチドのＸ線結晶構造」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（４７）：３６９２７−３３．
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
したがって、本発明は、非競合的な、効率的且つ選択的細胞外ＩＬ−１受容体アンタゴニストに関するものであり、先行技術のＩＬ−１受容体アンタゴニストの１以上の欠点を克服する。
【００１６】
また、本発明は、本発明の非競合的且つ選択的アンタゴニストの、ＩＬ−１関連疾患における使用に関するものである。
１つの態様では、本発明の化合物は、ＩＬ−１Ｒの生物活性を阻害し、受容体を介したシグナル伝達を妨げることによってサイトカイン活性を阻害するペプチド及びペプチド模倣薬である。したがって、ＩＬ−１介在イベントの阻害は、例えば、いくつかある炎症性疾患並びにＩＬ−１機能に関連した疾患及び病態の中で、関節リウマチ及び炎症性大腸炎などのさまざまな慢性及び急性の炎症性疾患の予防又は治療に有益な抗炎症性反応をもたらす。
【００１７】
細胞外標的を狙うようにデザインすることにより、ＩＬ−１受容体の細胞内領域を標的とする、ある公知の薬物候補とは異なり、本発明のアンタゴニストは、薬理反応を生ずるように標的細胞へ接近するために細胞膜を前もって透過性にすること又は他の破壊を必要としない。
【００１８】
それらは非競合的アンタゴニストとして機能するため、本発明のアンタゴニストは、それらが標的とする受容体を阻害するのに必要な量が競合的阻害剤と比較して少ない。
関連する態様では、本発明のアンタゴニストは有利に簡便に合成される。
【００１９】
本発明のペプチド、その誘導体及びペプチド模倣薬は、受容体活性を阻害するようにＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体複合体の特定細胞外ドメインと相互作用する。重要なことには、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬は、ＩＬ−１ＲサブユニットのＩＬ−１結合部位と相互作用せず、したがって、非競合的ペプチドアンタゴニストであると考えられる。本発明のアンタゴニストは、表示がある場合以外は全てＤ−アミノ酸である、以下のＡＰＩ−１０１配列：ＡＰＲＹＴＶＥＬＡ（配列番号１）に由来する（配列番号１３５のアスタリスクは、残基（Ｒ）がＬ−アミノ酸であることを示している、表１を参照されたい）。
【００２０】
【表１】
【００２１】
特定の理論に限定されることなく、ＩＬ−１受容体アンタゴニストは、ＩＬ−１受容体の具体的立体構造を助成し又は安定化することができ、受容体活性の阻害を生ずる。本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬はＩＬ−１依存性細胞内シグナル伝達を非競合的な方法で阻害する。これらのペプチドは、ＩＬ−１受容体のシグナル伝達に関与する細胞内受容体ドメインの活性化を有効に妨げる。疾患の発現に部分的に関与する分子（例えばサイトカイン、サイトカイン受容体、プロスタグランジン、コラーゲナーゼ分泌などのような炎症性分子）の発現をもたらすその後の細胞シグナル伝達イベントは、それによって妨げられる。
【００２２】
これらの化合物には、リード化合物、及びリード化合物と同一若しくは類似の分子構造又は形状を有するが、加水分解若しくはタンパク質分解に対する感受性、又は生物学的特性（例えば受容体に対する親和性増加）に関してリード化合物とは異なるように構築された誘導体化合物が含まれる。また、本発明は、不適切なＩＬ−１産生若しくはＩＬ−１反応に関連した病態、疾患、又は障害の治療又は予防に有用な化合物及び組成物に関する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の１以上の化合物と生理的に許容可能な担体とを含む医薬組成物にも関する。これらの医薬組成物は、経口剤形、局所クリーム、坐薬、鼻腔用スプレー、及び吸入器、並びに注射液及び輸液を含めたさまざまな形態であり得る。医薬組成物の調整方法は、『レミントンの薬学』、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イートン、ペンシルバニア州、米国が参照されるように、当該技術分野に周知である。
【００２４】
本発明の治療方法は、予防的であり、ＩＬ−１に関連する疾患又は病態を発症する危険性を低下させることができ、そして病態の緩和又は回避に用いることができる。治療剤は、好適な担体中の医薬的に許容可能な形態で、治療的に許容可能な用量で投与することができる。
【００２５】
動物の数多くの経路及び病態におけるＩＬ−１及び／又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体の機能の重要性に鑑みると、本発明は、ＩＬ−１の反応に関連した病態又は疾患の同定、検証、及び治療に対して広範な影響を及ぼす（例えばＩＬ−１の過剰発現又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰを介した異常なシグナル伝達）。
【００２６】
また、本発明は、非競合的、効率的、且つ選択的な細胞外受容体アゴニストに関するものである。更に、本発明は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）が既に炎症活性又は他の活性を示しているインターロイキン関連疾患の治療における、本発明の非競合的且つ選択的アゴニストの使用に関するものであり、１以上の本発明のアゴニストは上記の抗炎症作用又は他の活性を有するＩＬの活性を上昇させる。関連する態様では、本発明のアゴニストは、有利に簡便に合成される。本発明によるアゴニストの非限定的な例には、ペプチドＴＴＩ−１０１．１０１（配列番号１３）及びＴＴＩ−１０１．１０２（配列番号１４）、並びにペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１−１３７及びＴＴＩ−１０１−１４２（それぞれ図２９及び３０）が含まれる。
【００２７】
本発明のアゴニストが治療用途を見出すことができるサイトカイン受容体の非限定的な例には、以下が含まれる：
（１） 色素上皮由来因子。ＰＥＤＦは網膜の色素上皮細胞によって合成される、網膜の抗血管新生因子である。また、酸化ストレス及びグルタミン酸の外毒性から神経細胞を保護する。したがって、本発明のアゴニストは、網膜及び腫瘍増殖（例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、及びがん；Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅら、２００４）における異常な血管新生の症例に治療可能性を有するであろう。
（２） ＩＬ−４受容体：ＩＬ−４は、単球によるＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αのような炎症性分子の産生、及びＴ細胞によるＴＮＦ−αの産生を炎症部位で阻害できる抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−４は、結腸癌及び乳癌の増殖も阻害する。関節リウマチでは、軟骨細胞に対する保護作用及び炎症性メディエーターの産生阻害によって、抗炎症性サイトカインとしても作用する（Ｓｃｈｕｅｒｗｅｇｈら）。
（３） ＩＬ−１０サイトカインファミリー：このファミリーは全て炎症部位に対して有益な効果を有し、その抗炎症作用は創傷治癒、炎症性大腸炎、及び乾癬の症例において記載されている。ＩＬ−１０は、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γのような炎症性因子の産生をＴｈ１細胞において低下させる。ＩＬ−１０は、腫瘍部位においてマクロファージの浸潤を阻害することにより腫瘍増殖を低下させる（Ｌｉら、２００４；Ａｓａｄｕｌｌａｈら、２００４）。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、ａ）ＩＬ−１Ｒに結合し、又はＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を有する、アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＡを含むペプチド、又は単離ペプチド（式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、及びＡは対応のアミノ酸を表し、ペプチドはＩＬ−１Ｒに結合できるか、又はＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を有する）；及びｂ）１つ〜４つのアミノ酸の付加、欠失、又は置換を組み込み、且つＩＬ−１Ｒへの結合に関してａ）のペプチドと競合するか、又はそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を維持するａ）の誘導体から成る群より選択される単離化合物に関する。１つの具体的な態様では、そのような誘導体は、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸の付加、欠失、又は置換を組み込む。
【００２９】
１つの更なる態様では、本発明は、一般式：ＲＹＴＰＥＬＸによって特徴付けられる配列を含む、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチド、又は単離ペプチドに関するものであり、式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、及びＬは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される。また、本発明は、ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ ペプチドＲＹＴＰＥＬＸのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性（例えばＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性）を維持する、この一般式の誘導体に関するものである。通常、アミノ酸の置換は、類似アミノ酸又は保存アミノ酸を用いてなされる。以下を参照されたい。
【００３０】
１つの更なる態様では、誘導体は、アミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される２以下のアミノ酸修飾をペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分に含む。１つの具体的な態様では、そのようなペプチド、単離ペプチド、又はそれらの誘導体は、１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、１０１．１０、１０１．１０６、１０１．１１６、１０１．１０８、１０１．１３５、１０１．１２８、１０１．９、１０１．１０５、１０１．１２９、１０１．１１、１０１．１２、及び１０１．１３２から成る群より選択される。更に他の具体的な態様では、アンタゴニスト化合物は、１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、及び１０１．１０から成る群より選択される。
【００３１】
更に他の態様では、本発明は、ａ）アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸを含むペプチド（式中Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される）；及びペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性を維持するａ）の誘導体から成る群より選択される、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト活性を有する単離化合物に関するものである。本発明は、当然ながら、そのような修飾を１つのみ、又は２つのみ有するそのような誘導体にも関するものである。そのようなアンタゴニストの例は、ペプチド１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、１０１．１０、１０１．１０６、１０１．１１６、１０１．１０８、１０１．１３５、１０１．１２８、１０１．９、１０１．１０５、１０１．１２９、１０１．１１、１０１．１２、及び１０１．１３２を含み、より好ましくはペプチド１０１−１１３、１０１−１０３、１０１−１１４、１０１−１１７、及び１０１．１０を含む。
【００３２】
１つの特定の態様では、本発明は、以下の一般式によって特徴付けられる配列を含む、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチドに関するものである：
Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5 式Ｉ
式中、Ｘ、ａａ1、ａａ2、ａａ3−ａａ4、及びａａ5は、独立して選択され、
Ｘは、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ａ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ａ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ａ4、Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ｒ3Ｙ4、Ｚ3Ｙ4、Ｒ3Ｆ4、及びＹ4から選択され、式中、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、及びＦは対応のアミノ酸を表し、数はＡ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4配列中のアミノ酸の位置を表し、Ｚはシトルリンである；
Ａ1は、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、及びφから成る群より選択され、φは、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロヘキシルアラニン、アリルグリシンなどの疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する；
Ｐ2は、プロリン、アラニン、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（ＭｅＡｌａ）、トランス−４−ヒドロキシプロリン、ジエチルチアゾリジン カルボン酸（Ｄｔｃ）、及びΩから成る群より選択され、Ωは構造制約を生ずるアミノ酸を定義する（Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，Ｓら、１９９７；Ｈａｌａｂら、２０００；Ｃｌｕｚｅａｕ及びＬｕｂｅｌｌ、２００４；Ｆｅｎｇ及びＬｕｂｅｌｌ、２００１）；その非限定的な例には、アゼチジン−２−カルボン酸、ピペコリン酸、イソニペコチン酸、４−（アミノメチル）安息香酸、２−アミノ安息香酸、ニペコチン酸が含まれる；
Ｒ3は、ヒスチジン、リジン、アラニン、オルニチン、シトルリン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、及び限定されるものではないが４−アミジノフェニルアセチル、４−アミジノフェニルプロピオニル、４−アミジノフェニルグリシル、４−アミジノフェニルメチルグリシル、４−グアニジノフェニルアセチル、４−グアニジノフェニルプロピオニル、４−グアニジノフェニルグリシル、４−グアニジノフェニルメチルグリシルなどのアルギニン代用物から成る群より選択される（Ｍａｓｉｃ及びＫｉｋｅｌｊ、２００１；Ｆｅｎｇ及びＬｕｂｅｌｌ、２００１）；
Ｙ4は、残基なし、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、及びΣから成る群より選択され、Σは疎水性側鎖Σ又は芳香族側鎖を有するα−アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロヘキシルアラニン、アリルグリシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、ヒスチジン、チロシンが含まれる；
ａａ1は、スレオニン、セリン、バリン、及びηから成る群より選択され、ηは中性親水性アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ヒドロキシバリン、Ｄｅｔｔｗｉｌｅｒ及びＬｕｂｅｌｌ、２００４に記載のようなβ，β−ジアルキルセリン、ホモセリン、アロスレオニン、ヒドロキシプロリンが含まれる；
ａａ2は、イソロイシン、ロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン チアゾリジン−ａ−カルボン酸、及びφから成る群より選択され、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する（上記を参照されたい）；
ａａ3は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、α−アミノアジピン酸、及びΨから成る群より選択され、Ψは疎水性側鎖、芳香族アミン、脂肪族アミン、及び１級アリールアルキルアミンを有する３−アミノ−５−フェニルペンタン酸−α−アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、２，２−ジフェニルエチルアミン、４−フェニル−ベンジルアミンが含まれる；
ａａ4は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから選択され、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義し、例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロヘキシアラニン、アリルグリシン；限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン；限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、及びフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンが含まれる。
【００３３】
他の特定の態様では、本発明は、本発明による精製されたペプチドアンタゴニスト又はその誘導体に関する。
更に他の特定の態様では、本発明は、以下の一般式のうちの１つによって特徴付けられる配列を含む、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチド又はその誘導体に関する：
Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5− 式ＩＩ
−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2 式ＩＩＩ
Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2 式ＩＶ
式中：
Ｇ1はペプチドのアミノ末端に付着し、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、アシル基（ＲＣＯ）（アセチル、メチル、エチルなど）、プロピアノイル、ブタノイル、イソプロピアノイル、イソブタノイル、又は３級アミン（ジアルキルアミノ基又はモノアルキルアミノ基）から成る群より選択される；
Ｇ2はペプチドのカルボキシ末端に付着し、残基なし、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン（限定されるものではないが、メチルアミンなど）、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミン、芳香族アミン、又はアリールアルキルアミン（限定されるものではないが、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、フェニルエチルアミンなど）、及び／又は３級アミン（ジアルキルアミノ基又はモノアルキルアミノ基）から成る群より選択される。
【００３４】
本発明の更に他の態様では、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗するペプチド又はその誘導体は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、又は式ＩＶによって定義される一般式のうちの１つによって特徴付けられる配列を有する。
【００３５】
本発明の更なる態様では、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰペプチド又はその誘導体は比較的小さな分子である。１つの態様では、ペプチドのサイズは５〜２５アミノ酸であり、より具体的には５〜１６アミノ酸であり、より具体的には５〜１０アミノ酸であり、更により具体的には５〜９アミノ酸である。
【００３６】
他の特定の態様では、本発明は、ＩＬ−１Ｒの生物活性に拮抗する、式Ｉ及び式ＩＶに由来するペプチド模倣薬に関する。より特定の態様では、本発明のペプチド模倣薬は、図２０及び図２１に表される構造によって定義される。
【００３７】
本発明によれば、下記一般式のペプチド模倣アンタゴニストが提供される
Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2
式中、Ｒ1、ａａ1、ａａ2、ａａ3、ａａ4、ａａ5、ａａ6、ａａ7、及びＲ2は独立して選択される。
【００３８】
Ｒ1は、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、アシル基（ＲＣＯ−）（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）から成る群より選択される。Ｒの非限定的な例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、及びイソブチルが含まれる。
【００３９】
ａａ1は、残基なし、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、限定されるものではないが４−アミジノフェニルアセチル、４−アミジノフェニルプロピオニル、４−アミジノフェニルグリシル、４−アミジノフェニルメチルグリシル、４−グアニジノフェニルアセチル、４−グアニジノフェニルプロピオニル、４−グアニジノフェニルグリシル、４−グアニジノフェニルメチルグリシルなどのアルギニン代用物から成る群より選択される。
【００４０】
ａａ2は、残基なし、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、トリプトファン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、及び４−クロロフェニルアラニンから成る群より選択される。
【００４１】
ａａ3は、残基なし、スレオニン、セリン、β−ヒドロキシバリン、アロスレオニン、バリン、ｔｅｒｔ−ブチルロイシン、ロイシン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、及びアラニンから成る群より選択される。
【００４２】
ａａ4は、残基なし、バリン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、及び２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸から成る群より選択される。
【００４３】
他の態様では、一体となったａａ3−ａａ4は、３−アミノインドリジジン−２−オン ９−カルボン酸、３−アミノピロリジジン−２−オン ８−カルボン酸、３−アミノキノリジジン−２−オン １０−カルボン酸、８−アミノインドリジジン−９−オン ２−カルボン酸、ジペプチド代用物、又は限定されるものではないがＨａｎｅｓｓｉａｎらに概説されている例などのβ−ターン模倣体から成ることができる。
【００４４】
ａａ5は、残基なし、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、及びα−アミノアジピン酸から成る群より選択される。
【００４５】
ａａ6は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン、限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、又はフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンから成る群より選択される。
【００４６】
ａａ7は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン、限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、又はフェニルエチルアミンなどの芳香族アミン又はアリールアルキルアミンから成る群より選択される。
【００４７】
Ｒ2は、残基なし、水素、ＮＨ2、限定されるものではないがメチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、シクロヘキシルアミンなどの炭素数１〜１０の脂肪族アミン、限定されるものではないがアニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、フェニルエチルアミンなどの芳香族アミン及びアリールアルキルアミンから成る群より選択される。
【００４８】
一般配列Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2の残基のキラル中心の立体化学的立体配置は、Ｒ−立体配置及びＳ−立体配置、Ｄ−立体配置及びＬ−立体配置であり得ることに注目されたい。好ましい態様では、ペプチドは、全てのＤ−異性体から成る。オレフィンは、シス配置及びトランス配置であり得る。一般配列Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2のアミノ酸残基は、限定されるものではないがアザアラニン、アザチロシン、アザフェニルアラニンなどの、キラルα炭素が窒素で置換されたアザアミノ酸対応物でもよい。
【００４９】
本発明を図２０及び図２１の特定のペプチド模倣薬、並びに図２６〜図３０に例示されたものによって例示するが、本発明はあまり限定的ではない。本明細書の開示に基づいて、当該技術分野に熟練した者は、ＩＬ−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するペプチド模倣薬を容易に得、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体阻害化合物を更に同定し、又は本明細書に例示したものを改善することができる。本発明のペプチド模倣薬は、内在プロテアーゼによる分解に対する感受性が低く、したがってｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長い。
【００５０】
本発明の１つの具体的態様では、ＩＬ−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するペプチド模倣薬は、ＴＴＩ−１０１．１４０、ＴＴＩ−１０１．１４１、ＴＴＩ−１０１．１２５、ＴＴＩ−１０１．１１０、ＴＴＩ−１０１．１１１、ＴＴＩ−１０１．１３６、及びＴＴＩ−１０１．１４３から成る群より選択される。好ましい態様では、ペプチド模倣薬は、ＴＴＩ−１０１．１４０、ＴＴＩ−１０１．１４１、ＴＴＩ−１０１．１２５、及びＴＴＩ−１０１．１１０から成る群より選択される。
【００５１】
本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＩＬ−１、並びにＩＬ−１産生及びそのＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰへの結合に影響を及ぼし、そして影響される多くの因子の生物学的役割を理解するための独特の道具として有用である。本発明のペプチドアンタゴニストは、開発を容易にする、構造と活性との関係に関する重要な情報を提供するため、本発明のアンタゴニストは、ＩＬ−１受容体に結合する他の化合物の開発においても有用である。
【００５２】
本発明のアンタゴニストは、細胞表面のＩＬ−１Ｒ受容体の発現を測定するためのアッセイにおいてプローブとして用いることもできる。そのようなアッセイは、例えば組織感染又は障害に対する細胞炎症反応の程度の測定に有用であり得る。典型的には、試験対象の細胞を本発明のペプチド又はペプチド模倣に曝して細胞表面に存在する受容体に結合させ、反応した細胞を可視化する（例えば洗浄後、細胞選別、親和性クロマトグラフィ、免疫組織化学、オートラジオグラフィなど）。
【００５３】
化合物は、類似の新規ペプチド受容体アンタゴニストをスクリーニングし、又は特徴付けるためのアッセイにおいて競合的阻害剤として用いることができる。そのようなアッセイ、及びＩＬ−１Ｒ発現を測定するためのアッセイでは、本発明のペプチド又はペプチド模倣薬は修飾することなく用いることができ、又は標識することができる（即ち、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供する部分に共有結合的又は非共有結合的に連結させる）。標識の例には、125Ｉ、14Ｃ、及び3Ｈなどの放射性標識、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識（米国特許第３，６４５，０９０号）、ビオチン、アビジンなどのリガンド標識、生物発光、リン光、化学発光を含めた発光化合物、又は蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）が含まれる。
【００５４】
本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−１Ｒ反応に対するＩＬ−１α又はＩＬ−１βの効果を完全に又は部分的に阻害するように被験者に投与することができる。したがって、本発明の方法は、ＩＬ−１関連障害の治療的処置に有用である。例えば、本発明の組成物は、ＩＬ−１の不適切な産生又はＩＬ−１に対する不適切な反応に関連した症状（例えば関節リウマチ及び炎症性大腸炎）を治療するのに治療的に有効な量で投与することができる。
【００５５】
明細書及び特許請求の範囲において用いた用語について、そのような用語を与えるべき範囲を含めて明確且つ一貫した理解を提供するために、以下に多くの定義を提供する。
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いた科学用語及び技術用語並びに命名は、本発明が関連する分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるのと同一の意味を有する。分子生物用語の一般に理解される定義は、例えば、『微生物学及び分子生物学辞典』、第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、１９９４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州）、『Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓの生物学事典』（Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、１９９１、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ニューヨーク、ニューヨーク州）、Ｒｉｅｇｅｒら、『遺伝学用語解説：古典と分子』、第５版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９９１；Ａｌｂｅｒｔｓら、『細胞の分子生物学』、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ ｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、２００２；並びにＬｅｗｉｎ、『遺伝子 ＶＩＩ』、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、２０００に見出すことができる。一般に、細胞培養、感染、分子生物法のなどの手順は、当該技術分野において一般に用いられている方法である。そのような標準技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０００、『分子クローニング−実験室マニュアル』、第３版、コールドスプリングハーバー研究所）；及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４、『分子生物学の最新プロトコール』、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）などの参考書に見出すことができる。
【００５６】
本明細書において、２０の天然アミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法にしたがう。α，α−２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非慣用的アミノ酸のような立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も本発明のポリペプチドの好適な成分であり得る。非慣用的アミノ酸の例には、限定されるものではないが、シトルリン、オルニチン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチルスレオニン（ＭｅＢｍｔ）、Ｎ−メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、アミノイソ酪酸、スタチン、Ｎ−メチル−アラニン（ＭｅＡｌａ）が含まれる。
【００５７】
本明細書において芳香族アミンという用語は、６〜１０炭素原子の環を有する分子であると理解され、例には、限定されるものではないが、フェニルメチルアミン、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミン、及び飽和又は不飽和炭化水素鎖を含むアミンが含まれる。
【００５８】
本明細書において、アリールアルキルアミンという用語は、飽和又は不飽和炭化水素鎖を含むアミンであると理解される。１級アリールアルキルアミンは６〜１０炭素原子の環で構成され、例には、限定されるものではないが、フェニル、トリル、アルコキシフェニル、アルコキシカルボニルフェニル、及びハロフェニルが含まれる。
【００５９】
本明細書において、「アリール」という用語は、フェニル、１−ナフチル、及び２−ナフチルであると理解される。本明細書において、「置換アリール」という用語は、フェニル、ヘテロアリール、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、アミノ、−ＮＨ（低級アルキル）、及び−Ｎ（低級アルキル）2から成る群より選択される置換基を有するフェニル、１−ナフチル、及び２−ナフチル、並びにメチル、メトキシ、メチルチオ、ハロ、ヒドロキシ、及びアミノから成る群より選択される置換基を含む１−、２−、及び３−置換フェニル、１−ナフチル、及び２−ナフチルであると理解される。
【００６０】
本明細書において、「アルキル」という用語は、８以下の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖ラジカルであると理解される。本明細書において、「低級アルキル」という用語は、４以下の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖ラジカルであると理解され、「アルキル」という用語の好ましい下位群である。
【００６１】
本明細書において、「置換アルキル」という用語は、１以上の、好ましくは１つ、２つ、又は３つの水素原子が、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、トリフルオロメチル、−ＮＨ（低級アルキル）、−Ｎ（低級アルキル）2、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、及びカルボキシ、アリール及びヘテロアリールから成る群より選択される置換基によって置換されている、８以下の炭素原子を有するそのような直鎖又は分岐鎖ラジカルであると理解される。
【００６２】
特に断りのない限り、「ＩＬ−１」は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βのいずれか又は両方を表す。「ＩＬ」という用語は、インターロイキンの広範なファミリーを表す。
上記のように、本明細書において、２０の天然Ｌ−アミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法にしたがう。本明細書で用いたポリペプチド表記法では、標準的用法及び慣例にしたがい、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。本明細書において、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、非常の多数のアミノ酸又はイミノ酸（又はそれらの同等物）をペプチド結合によって含む高分子を表し、ポリペプチドは翻訳後修飾を含んでいても欠失していてもよい。したがって、ペプチドという用語には、改変がＩＬ−１受容体活性の調整能を変化させない限り、ＩＬ−１受容体Ｄ−アミノ酸アンタゴニストペプチド及びペプチドの他の改変型が含まれる。本発明の全てのアンタゴニストペプチドは、ＩＬ−１受容体活性の調整能を共有する。改変の非限定的な例には、Ｎ末端アセチル化、グリコシル化、及びビオチン化が含まれる。本発明によるペプチドの具体的な改変型を以下に更に記載する。
【００６３】
本明細書において、「逆Ｄペプチド」という用語は、Ｌ−アミノ酸を含有するペプチドに対して逆配列に配置されたＤ−アミノ酸を含有するペプチドを表す。したがって、Ｌ−アミノ酸ペプチドのＣ末端残基はＤ−アミノ酸ペプチドのＮ末端になる、などである。逆Ｄ−ペプチドはＬ−アミノ酸ペプチドと同一の３次構造を保持し、したがって同一活性を保持することが多いが、酵素的分解に対してはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでオリジナルのペプチドより安定であり、したがって治療効果が大きい（Ｂｒａｄｙ及びＤｏｄｓｏｎ、１９９４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９４）。
【００６４】
本明細書において、「機能性誘導体」の意味は、アミノ酸配列の機能性誘導体の文脈ではオリジナル配列と実質的に類似する生物活性（機能的又は構造的）を保持する分子を示す。この機能性誘導体又は同等物は天然であっても合成してもよい。そのような誘導体には、タンパク質の生物活性が保存されるという条件で（例えばＩＬ−１受容体の非競合的アンタゴニストとして作用する）、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するアミノ酸配列が含まれる。置換するアミノ酸は、通常、置換されたアミノ酸と類似の物理化学特性を有する。類似の物理化学特性には、電荷、かさ高、疎水性、親水性などにおける類似性が含まれる。「機能性誘導体」という用語は、本発明の主題の「セグメント」、「変異体」、「アナログ」、又は「化学的誘導体」を含むことが意図される。
【００６５】
「生物活性」又は「ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ活性」又は「受容体活性」という用語は、ＩＬ−１若しくはＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの遺伝子又はタンパク質の検出可能な生物活性を表す。細胞内シグナル伝達におけるＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰタンパク質の特定の生物活性を含むことができる。これには、ＰＧＥ2産生の測定、増殖アッセイ、並びに遺伝子及びタンパク質の発現変化（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＯＸ酵素）が含まれる。しかしながら、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ活性は、これらの重要な生物活性に限定されるものではない。生物活性には、例えば、化合物、基質、相互作用タンパク質などによるＩＬ−１Ｒへの単純な結合も含まれる。例えば、ＩＬ−１反応又はＩＬ−１Ｒの結合若しくは相互作用を阻害能又は増加能（例えば調整能）に対する試験化合物の効果を測定することは、本明細書において、本発明によるＩＬ−１Ｒの生物活性を測定することとみなされる。概して、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬の非存在下と存在下とを対比した受容体サブユニット（例えばＩＬ−１Ｒ及びＩＬ−１ＲａｃＰ）の分子内又は分子間結合は、本発明による生物活性の更に他の例である。ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性には、この受容体の生化学的測定値、立体構造変化、リン酸化状態、及び受容体のシグナル伝達の下流効果、例えばタンパク質リン酸化（又は他の翻訳後修飾、例えばユビキチン化、ユビキチン様タンパク質による修飾、パルミチン酸化、プレニル化など）、キナーゼ作用、又は当該技術分野に公知の技術を用いて測定できるタンパク質の他の特徴なども含まれる。最後に、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性には、細胞構築、細胞増殖、又は所定の受容体に対するリガンド（即ちＩＬ−１）の作用によって調節される他の細胞現象における検出可能な変化が含まれる。
【００６６】
本明細書において「変異体」という用語は、構造及び生物活性においてそのタンパク質と実質的に類似し、少なくとも１つの生物活性を維持するタンパク質を表す。したがって、２つの分子が共通の活性を有し、互いに置換できるという条件において、たとえ１つの分子の組成、又は２次構造、３次構造、若しくは４次構造が他に見られるものと同一でない場合であっても、あるいはアミノ酸配列又は核酸配列が同一でない場合でも、本明細書において用いるように、それらは変異体であるとみなされる。本発明はペプチド配列並びにそれらの誘導体及び変異体に関するものであるが、遺伝学的にコードされたアミノ酸から成る本発明のペプチドアンタゴニストを発現するように核酸配列をデザインできることを理解すべきである。発現ベクター、調節配列（例えばプロモーター）、リーダー配列、並びにそれらを作製する方法及びそれらを細胞へ導入する方法は号外技術分野において周知である。したがって、１つの態様では、本発明のそのようなアンタゴニストペプチドは、組換え技術によって細胞で発現される。１つの態様では、細胞は原核細胞であり、そのようなペプチドを作製し精製する役割を果たす。他の態様では、真核細胞は、ＩＬ−１活性を調節する必要がある特定の真核細胞である。
【００６７】
本発明の機能性誘導体は、化学的に合成することも組換えＤＮＡ技術で作製することもできる。これらの方法は全て当該技術分野において周知である。
本明細書において「被験者」又は「患者」という用語は、治療、観察、又は実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを表す。
【００６８】
「阻害」、「減少」、又は「予防」という用語、あるいはこれらの用語の変形には、特許請求の範囲及び／又は明細書で用いる場合、所望の結果を達成するための受容体活性の測定可能な減少又は完全な阻害が含まれる。例えば、ペプチドは、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬で処理した後、これらのペプチドの非存在下と比較してＰＧＥ2産生の減少が測定される場合、ＩＬ−１活性を阻害すると言われる。
【００６９】
本明細書において「精製された」という用語は、それがもともと存在していた組成物の成分から分離された分子（例えばＩＬ−１受容体、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、核酸、タンパク質など）を表す。したがって、例えば、「精製されたＩＬ−１受容体」は、天然には観られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」分子は、他の成分の大部分を喪失した（例えば混入物質の３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が存在しない）分子である。逆に、「粗製」という用語は、それが存在していたもともとの組成物の成分から分離されていない分子を意味する。したがって、「分離する」又は「精製する」という用語は、生体サンプルの１以上の成分が、サンプルの１以上の他の成分から取り除かれる方法を表す。サンプル成分には、タンパク質、炭水化物、又は脂質などの他の成分を含み得る通常水溶液中の核酸が含まれる。分離工程又は精製工程は、少なくとも約７０％（例えば７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）、より好ましくは少なくとも約９０％（例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）、更により好ましくは少なくとも約９５％（例えば９５、９６、９７、９８、９９、１００％）のサンプル中に存在する他の成分を所望の成分から除去することが好ましい。簡潔にするために、単位（例えば６６、６７．．．８１、８２、．．．９１、９２％．．．．）が系統的に列挙されていないが、それでも本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７０】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、化合物の活性成分の生物活性の有効性を妨げず、投与される宿主（例えば患者）に対して毒性がない担体媒体を表す。
本明細書において「治療的に又は医薬的に有効な量」とは、所望の効果を誘導するのに十分な本発明の組成物の量を表す。そのような結果は、疾患の徴候、症状、若しくは原因の緩和又は軽減、あるいは標的生理系の他の所望の変化であり得る。例えば、炎症性疾患の場合（例えば関節炎及び炎症性大腸炎）、典型的な結果は炎症反応及び免疫反応の低下を包含するであろう。
【００７１】
本明細書において、「分子」、「化合物」、「物質」、又は「リガンド」という用語は、互換的に用いられ、天然、合成、又は半合成の分子又は化合物を広く表す。したがって、「分子」という用語は、例えば化学物質、高分子、細胞又は組織の抽出物（植物又は動物由来）などを意味する。分子の非限定的な例には、ペプチド、抗体、炭水化物、及び医薬物質が含まれる。物質は、ランダムスクリーニング、合理的選択を含めたさまざまな手段によって、及び例えばコンピュータモデリングなどのタンパク質又はリガンドのモデリング法を用いた合理的デザインによって選択し、スクリーニングすることができる。「合理的に選択された」又は「合理的にデザインされた」という用語は、本発明の相互作用ドメインの立体配置に基づいて、あるいは本発明のアンタゴニストペプチド及び／又はペプチド模倣薬の立体配置に基づいて選択されている化合物を定義することを意味する。通常の技術を有する者に理解されるように、非天然修飾を有する高分子も「分子」という用語の範囲内である。例えば、医薬産業において周知であり、通常ペプチドアナログといわれるペプチド模倣薬は、上記のようなモデリングによって作製することができる。同様に、好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、安定性を高めるために修飾される。多くの場合、この修飾は相互作用ドメインの生物活性を変えるべきでないことが理解されるはずである。本発明の教示にしたがい同定される分子は、細胞及び／又は組織の生理機能又はホメオスタシスがＩＬ−１の産生又は反応における欠陥によって傷つけられている疾患又は病態に治療価値を有する。そのような疾患又は病態の非限定的な例には、関節リウマチ、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、変形性関節症、乾癬、敗血症、脳炎、及び呼吸窮迫症候群などの急性及び慢性の炎症性疾患、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、及び多くの自己免疫疾患が含まれる。化合物は、本明細書において、「ＡＰＩ−Ｘ」、「ＴＴＩ−Ｘ」として、又は単に化合物番号によって互換的に記載されることが理解されるであろう（例えば：「１０１．１０」、「ＡＰＩ−１０１．１０」、又は「ＴＴＩ−１０１．１０」）。
【００７２】
本明細書において、「アンタゴニスト」、「ペプチドアンタゴニスト」、又は「ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト」は、ＩＬ−１又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性を阻害可能（完全に又は部分的に）な分子を表す。「アンタゴニスト」、「ペプチドアンタゴニスト」、又は「ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト」という用語には、公知化合物の、アンタゴニスト特性を有する増強剤も含まれる。
【００７３】
本明細書において、「模倣体」「模倣薬」「ペプチド模倣薬」などの専門用語は、互換的に用いられる。
「１つの（a）」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む（comprising）」という用語とともに用いる場合、「１」を意味することができるが、「１以上」、「少なくとも１つ」、及び「１以上」の意味とも一致する。
【００７４】
本願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いる装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
特許請求の範囲における「又は」という用語は、本明細書の開示は代替物のみ及び「及び/又は」を表す定義を支持しているが、代替物のみを表すことが明確に示されていないか、又は代替物が互いに排他的でない場合は、「及び/又は」を意味するために用いられる。
【００７５】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprising）」(及び含むの変形)、「有する（having）」(及び有するの変形)、「含めた（including）」(及び含めたの変形)、又は「含有する（containing）」(及び含有するの変形)という語は、包括的又は非制限的であり、追加の、引用されていない要素又は方法工程を排除するものではない。
【００７６】
「短いペプチド」という用語は、約６〜２５アミノ酸の配列を意味することを意図する。
本明細書において、「精製された」という用語は、それが元々含有されていた組成物の成分から分離されている化合物を表す。したがって、例えば、「精製されたペプチド」又は「ペプチドの精製された組成物」は、天然に見られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」粗化合物は、他の成分の大部分を喪失した化合物である（例えば混入物質の３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％が存在しない）。逆に、「粗製」という用語は、それが存在したオリジナル組成物の成分から分離されていない化合物を意味する。簡潔にするために、単位（例えば６６、６７．．．８１、８２、．．．９１、９２％．．．．）を具体的に列挙しないが、それでも本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７７】
「単離ペプチド」又は「単離化合物」は、その天然のｉｎ ｖｉｖｏ状態、又は初期段階においてそれが他の成とともに存在する状態から（例えば合成から）精製される。
本明細書において考察される態様は、本発明の方法又は組成物に関して実施でき、逆もまた同様であることが意図される。更に、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を達成するために使用できる。
【００７８】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の具体的態様を示しているが、当該技術分野に熟練した者にはこの詳細な説明から本発明の精神及び範囲内でさまざまな改変及び修飾が明らかとなるため、説明のためにのみ提供するものであることが理解されるはずである。
【００７９】
図面の簡単な説明
このように本発明を一般的に記載する上で、具体的態様を説明するためにのみ示す添付の図面を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
具体的態様の説明
本発明の１つの目的は、ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質の生体機能を阻害可能なペプチド及びペプチド模倣化合物のファミリーについて記載することである、したがって、非常に多くの病的状態に有用であろう。
【００８１】
開示を明確にするために、そして限定するためでなく、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分割する：
Ｉ． 本発明のペプチドを同定するためのアッセイ
ＩＩ． ペプチドの調製
ＩＩＩ． ペプチド誘導体とペプチド模倣薬
ＩＶ． ペプチド模倣薬を同定するためのアッセイ
Ｖ． 医薬組成物。
【００８２】
Ｉ． 本発明のペプチドを同定するためのアッセイ
候補化合物のＩＬ−１受容体活性の阻害能を試験するための方法を本明細書に提示する。本発明はさほど限定されないことが理解されるであろう。実際、本発明の非競合的細胞外アゴニスト又はアンタゴニストを同定するために、当該技術分野に周知の他のアッセイを用いることができる。
【００８３】
通常、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニスト（即ち、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子、又は他の薬物のような候補若しくは試験化合物又は物質）のスクリーニングは、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰの生物活性を測定するアッセイに基づくことができる。本発明のアッセイは、天然又は組換えＩＬ−１受容体を使用する。ＩＬ−１活性のアンタゴニストに関する細胞画分又は無細胞系スクリーニングアッセイは、精製されたＩＬ−１受容体、又は精製された組換えＩＬ−１受容体をｉｎ ｓｉｔｕで用いることができる。細胞に基づいたアッセイは、ＩＬ−１受容体を天然に発現する細胞、又は組換えＩＬ−１受容体を含有する細胞を使用することができる。全ての場合において、ＩＬ−１受容体の生物活性は直接的又は間接的に測定することができる；したがって、ＩＬ−１受容体活性の阻害剤又は活性化剤を同定することができる。標準的コンビナトリアル化学技術によって阻害剤又は活性化剤自体を更に修飾し、最初に同定された化合物の改良型アナログを提供することもできる。
【００８４】
１つの態様では、アッセイは細胞に基づいたアッセイであり、天然又は組換え由来であるＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体複合体又はその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体生物活性の調製能、例えばＰＧＥ2産生、増殖アッセイ、ＩＬ−１Ｒの結合パートナー（ＩＬ−１ＲａｃＰ）への結合、又はＩＬ−１受容体の他の測定可能な生物活性の調節を測定する。
【００８５】
別の態様では、試験化合物のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体複合体の活性調整能の測定は、試験化合物のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体標的分子の下流エフェクターの活性調整能を測定することによって達成することができる。例えば、試験化合物のエフェクター分子に対する活性を測定することができる。そのような下流エフェクターの非限定的な例には、インターロイキン受容体活性化キナーゼ（ＩＲＡＫ）；ＴＲＡＦ、ＮＩ−ＫＢ（例えばｐ６５）の活性化、変異原性活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）が含まれる。本発明の化合物の調節活性（アゴニスト又はアンタゴニスト）を規定するためにアッセイされるであろうエフェクター分子の他の例はＳｉｍｓら、２００２；及びＫａｓｈｉｗａｍｕｒａら、２００２に記載されている。
【００８６】
本発明の上記アッセイ法の１以上の態様では、相互作用タンパク質の一方又は両方の非複合体から複合体を容易に分離するため、及びアッセイの自動化に対応するために、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１ＲａｃＰ、又は本発明の相互作用ペプチド若しくはペプチド模倣薬を固定することが望ましい。候補化合物の存在下及び非存在下における試験化合物のＩＬ−１Ｒタンパク質への結合、又はＩＬ−１Ｒタンパク質と標的分子（例えばＩＬ−１ＲａｃＰ）との相互作用は、反応物質を含有するのに好適な容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、及びマイクロ遠心管が含まれる。１つの態様では、タンパク質の一方又は両方をマトリックスに結合させるドメインを追加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＩＬ−１Ｒ融合タンパク質、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＩＬ−１ＲａｃＰ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ州）、又はグルタチオン被覆マイクロタイタープレートに吸着させることができる。次に、それらを、試験化合物、及び非吸着標的タンパク質又はＩＬ−１Ｒタンパク質と組み合わせ、複合体形成を誘導する条件下（例えば塩及びｐＨに関し生理的条件）で混合物をインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去し、例えば上記のようにして複合体形成を直接的又は間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＩＬ−１Ｒの結合レベル又は活性レベルを標準技術を用いて測定することができる。
【００８７】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術（当該技術分野で周知である）を本発明のスクリーニングアッセイに用いることもできる。例えば、ＩＬ−１Ｒタンパク質又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子（例えばＩＬ−１、ＩＬ−１ＲａｃＰ）を、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を用いて固定することができる。ビオチン化ＩＬ−１Ｒタンパク質又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、当該技術分野に公知の技術（例えばビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロックフォード、イリノイ州）を用いて調製し、ストレプトアビジンを被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定することができる。あるいは、ＩＬ−１Ｒタンパク質又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子と反応するが、ＩＬ−１Ｒタンパク質のＩＬ−１Ｒ相互作用分子への結合は妨げない抗体をプレートのウェルに被覆し、未結合の標的又はＩＬ−１Ｒタンパク質を抗体結合によってウェルに捕捉することができる。ＧＳＴ固定化複合体に関して上記したものに加えて、そのような複合体の検出法には、ＩＬ−１Ｒタンパク質又は標的分子に反応する抗体、及びＩＬ−１Ｒ又はＩＬ−１Ｒ相互作用分子に関連した酵素活性の検出に依拠する酵素結合アッセイを用いた複合体の免疫検出が含まれる。
【００８８】
本明細書に記載し、例示したようなｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの実施に用いることもできることが理解されるであろう。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
１つの態様では、ＩＬ−１受容体の細胞増殖調整能の活性化能又は阻害能に関し、3Ｈ−チミジン取り込み法で候補ペプチドを試験する。更に他の態様では、ＩＬ−１受容体の細胞増殖調整能の活性化能又は阻害能に関し、例えば（Ｂａｋｅｒら、１９９５；Ｃｈｅｖｉｒｏｎ、Ｇｒｉｌｌｏｎら、１９９６）；（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９９；Ｈｕら、１９９９）に記載のアッセイを用いて候補ペプチドを試験する。
【００８９】
他の態様では、ＩＬ−１Ｒ若しくはその部分、又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ経路の上流若しくは下流の標的タンパク質のリン酸化状態の調整能に関し、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを用いて候補ペプチドを試験する。
【００９０】
他の態様では、ＰＧＥ2レベル、ＩＬ−６若しくはコラーゲナーゼの発現、又は軟骨細胞及び線維芽細胞などのＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１ＲａｃＰ発現細胞においてＩＬ−１刺激後に修飾されるレベルを有する他の分子に関し、ＩＬ−１Ｒを標的とする候補ペプチドを試験する。
【００９１】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
上記アッセイは、更に開発するための有望なリード化合物を検出するための初期又は１次スクリーニングとして用いることができる：リードペプチドは、追加の、異なるスクリーニングで更に評価されるであろう。したがって、本発明は、これらの受容体を発現する哺乳動物細胞株又は他のアッセイを利用したさまざまなアッセイを包含し得る２次ＩＬ−１Ｒスクリーニングも包含する。
【００９２】
３級スクリーニングは、臨床症状に関する動物モデルにおいて同定した阻害剤の試験を包含することができる。したがって、本明細書に記載したようにして、ラット又はマウスのような適切な動物モデルにおいて同定された物質（ペプチド又はペプチド模倣薬）を更に使用することは本発明の範囲内である。例えば、ペプチドを動物モデルに用いて、そのような物質による処理の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載したようにして同定した物質を動物モデルに用いて、そのような物質の作用機序を決定することができる。更に、本発明は、明細書に記載のように、処置（例えば、ＩＬ−１受容体の脱制御又は機能不良に関連したさまざまな種類の障害の処置）に関する上記スクリーニングアッセイで同定された新規物質の使用に関係する。そのようなアッセイに使用できる非限定的な動物モデルには、コラーゲンで誘発されたラット関節炎、急性ＩＢＤの動物モデル、免疫抑制マウスにおける腫瘍増殖、新生児マウスの気道の感作、及びトランスジェニック動物を含めた他の公知の動物モデルが含まれる。
【００９３】
ＩＩ． ペプチドの調製
本発明のペプチド又はペプチド誘導体は、合成技術（例えば排他的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、古典的液相合成）及び組換え技術を含めた、当該技術分野に熟練した者に公知のペプチド合成法によって得られる。例えば、ペプチド又はペプチド誘導体は、手短にはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂（例えばベンズヒドリルアミン樹脂、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂）にカップリングさせ、続いてＮ−α保護アミノ酸を加えることから成る固相ペプチド合成によって得ることができる。保護基は当該技術分野に公知の如何なる基でもよい。個々の新たなアミノ酸を伸びている鎖に加える前に、鎖に加えた前のアミノ酸の保護基を除去する。そのような固相合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｖａｌｅら；１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１３：１３９４−１３９７によって、そして米国特許第４，３０５，８７２号及び第４，３１６，８９１号、Ｂｏｄｏｎｓｋｙら、１９６６、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．（ロンドン）、３８：１５９７；Ｐｉｅｔｔａ及びＭａｒｓｈａｌｌ、１９７０、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．６５０に記載されている。アミノ酸の適切な樹脂へのカップリングも当該技術分野に周知であり、米国特許第４，２４４，９４６号に記載されている。（Ｈｏｕｖｅｒ−Ｗｅｙｌ、『有機化学法』、Ｖｏｌ．Ｅ２２ａ、「ペプチドとペプチド模倣薬の合成」、Ｍｕｒｒａｙ Ｇｏｏｄｍａｎ、編集長、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ニューヨーク、２００２に概説されている）。
【００９４】
本発明の化合物の調製工程のあいだ、関係する分子上の感受性反応基を保護することは必要及び／又は望ましいかもしれない。これは、『有機合成における保護基』、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、１９９１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；並びに『ペプチド：化学と生物学』、Ｓｅｗａｌｄ及びＪａｋｕｂｋｅ、２００２、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｈｅｉｎｈｅｉｍ、ｐ．１４２に記載のような慣用の保護基によって達成することができる。例えば、αアミノ保護基には、アシル型保護基（例えばトリフルオロアセチル、ホルミル、アセチル）、脂肪族ウレタン型保護基（例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、シクロヘキシルオキシカルボニル）、芳香族ウレタン型保護基（例えばフルオレニル−９−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、Ｃｂｚ誘導体）、及びアルキル型保護基（例えばトリフェニルメチル、ベンジル）が含まれる。アミノ酸側鎖の保護基には、ベンジル（Ｔｈｒ及びＳｅｒ用）、Ｃｂｚ（Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、メチル エチル、シクロヘキシル（Ａｓｐ、Ｈｉｓ）、Ｂｏｃ（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ）などが含まれる。保護基は、都合のよいその後の段階で、当該技術分野に公知の方法を用いて除去することができる。
【００９５】
１つの態様では、アナログ及び他の修飾変異体を含めた本発明のペプチドは、通常、ＦＭＯＣプロトコールにしたがい、保護基を用いて有機相で合成することができる。それらは、ＨＰＬＣを用いて、Ｃ１８カラムで、１０〜６０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出させて、収率７０％で精製することができる。次に、分子量を質量分析（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．『固相ペプチド合成』、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２８９巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７に概説されている）で確認することができる。
【００９６】
あるいは、遺伝的にコードされたアミノ酸から成る本発明のペプチドは、ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて組換えシステムで調製することができる。本発明のペプチドは、１より多い上記修飾を同一ペプチド内に含有できることが理解される。本発明のペプチド又はその誘導体の医薬的に許容可能な塩複合体も本発明に包含される。
【００９７】
合成したペプチド又はペプチド誘導体の精製は、クロマトグラフィ（例えばイオン交換、サイズ排除、親和性）、遠心、沈殿、又はペプチド及びペプチド誘導体を精製するための標準技術を含めた標準法によって行う。１つの態様では、薄層クロマトグラフィを使用する。他の態様では、逆相ＨＰＬＣを使用する。当該技術分野に周知で、ペプチドの単離及び精製に好適な他の精製技術を本発明に用いてもよい。
【００９８】
本発明による化合物の調製工程が立体異性体の混合物を生じさせる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィなどの慣用技術によって分離することができる。化合物は、ラセミ体で調製することができ、あるいはエナンチオ特異的合成又は分割によって個々のエナンチオマーを調製することもできる。化合物は、例えば、光学活性酸との塩形成後、分別再結晶及び遊離塩基の再生によってジアステレオ異性体対を形成するなどの標準技術によってエナンチオマー成分に分割することができる。化合物は、ジアステレオマーのエステル又はアミドを形成した後、キラル補助基を除去することによって分割することもできる。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割することができる。
【００９９】
ＩＩＩ． ペプチド誘導体とペプチド模倣薬
天然アミノ酸のみから成るペプチドに加えて、ペプチド模倣薬又はペプチドアナログも本発明に包含される。ペプチドアナログは医薬産業において、鋳型ペプチドと類似した特性を有する非ペプチド薬として一般に用いられている。非ペプチド化合物の類型は、「ペプチド模倣体」又はペプチド模倣薬と呼ばれている（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．１９８６、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；Ｅｖａｎｓら、１９８７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）。治療的に有用なペプチドと構造的に関連したペプチド模倣体は、同等の若しくは増強された治療効果又は予防効果を生ずるために用いることができる。一般に、ペプチド模倣薬は、天然受容体結合ポリペプチドのようなパラダイムポリペプチドと構造的に類似する（即ち、生物活性又は薬理活性を有するポリペプチド）が、当該技術分野に周知の方法で場合により−ＣＨ2ＮＨ−、−ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＨ2ＳＯ−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＯＣＨ2−などのような結合によって置換された１以上のペプチド結合を有する（Ｓｐａｔｏｌａ Ａ．Ｆ．、ペプチド骨格修飾、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ、Ｍａｒｃｈ １９８３、１（３）：２６７；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、１９８６、３８：１２４３−１２４９；Ｈｕｄｓｏｎ Ｄ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１９７９、１４：１７７−１８５；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ．Ｂ．、１９８３、『アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の化学と生化学』、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ監修、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）。そのようなペプチド模倣体は、天然ポリペプチドよりも、経済的生産向上、化学的安定性の増加、薬理特性（例えば、半減期、吸収、効能、効率など）の増大、抗原性の減少などを含めた顕著な利点を有するかもしれない。
【０１００】
ペプチドは野生型ＩＬ−１のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害に有効であるが、それらのｉｎ ｖｉｖｏ有効性はプロテアーゼの存在により弱められるであろう。血清プロテアーゼには特異的基質要求性がある。基質は、Ｌ−アミノ酸と、切断のためのペプチド結合とを有する必要がある。更に、血清プロテアーゼ活性の最も顕著な成分を表すエクソペプチダーゼは、ペプチドの最初のペプチド結合に通常作用し、遊離Ｎ末端を必要とする（Ｐｏｗｅｌｌら、１９９３）。これを考慮すると、ペプチドアナログ又は誘導体とも呼ばれる修飾型ペプチドを使用することは有益であることが多い。修飾ペプチドは、ＩＬ−１に関して生物活性を付与するオリジナルＬ−アミノ酸ペプチドの構造特性を保持するが、有利にも、プロテアーゼ及び／又はエクソペプチダーゼによって容易に切断されない。
【０１０１】
保存配列の１以上のアミノ酸の、同種のＤ−アミノ酸による体系的な置換（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。したがって、本発明のペプチド誘導体又はペプチド模倣薬は、全てＬ、全てＤ、又はＤ、Ｌを混合したペプチドでもよい。好ましい態様では、ペプチドは全てＤ−アミノ酸から成る。Ｄ−アミノ酸のＮ末端又はＣ末端の存在は、ペプチダーゼはＤ−アミノ酸を基質として使用できないため、ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を高める（Ｐｏｗｅｌｌら、１９９３）。逆Ｄ−ペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含有するペプチドに対して逆配列に配置された、Ｄ−アミノ酸を含有するペプチドである。したがって、Ｌ−アミノ酸ペプチドのＣ末端残基は、Ｄ−アミノ酸ペプチドのＮ末端になる、などである。逆Ｄ−ペプチドは、Ｌ−アミノ酸ペプチドと同一の３次構造を保持し、したがって同一活性を保持するが、酵素分解に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでより安定であるため、オリジナルペプチドよりも治療効果が大きい（Ｂｒａｄｙ及びＤｏｄｓｏｎ １９９４；Ｊａｍｅｓｏｎら、１９９４）。逆Ｄ−ペプチドに加えて、保存配列、又は実質的に同一の配列の変形を含む制約されたペプチドを、当該技術分野に周知の方法で、例えばペプチドを環化するジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基を付加することによって作製することができる（Ｒｉｚｏ ｅｔ Ｇｉｅｒａｓｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２、６１：３８７）。環状ペプチドには遊離のＮ末端もＣ末端もない。したがって、それらは当然エンドペプチダーゼの影響を受けやすいが、ペプチド末端を切断しないエクソペプチダーゼによるタンパク質分解を受けにくい。したがって、Ｎ末端又はＣ末端のＤ−アミノ酸を有するペプチド、及び環状ペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、Ｎ末端又はＣ末端のＤ−アミノ酸残基の存在、あるいはその環状構造以外は、対応するペプチドの配列と通常同一である。
【０１０２】
分子間ジスルフィド結合を含有する環状誘導体は、慣用の固相合成法で、アミノ末端及びカルボキシ末端のような環化のために選択された位置に好適なＳ−保護システイン又はホモシステイン残基を組み込みながら調製することができる（ＳａｈＭら、１９９６、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１９７）。鎖の組み立てが終了した後、（１）Ｓ−保護基を選択的に除去し、その結果、対応する２つの遊離ＳＨ−官能基を支持体上で酸化させてＳ−Ｓ結合を形成し、その後、支持体から産物を簡便に除去し、適切な精製手順を実施することによって；又は、（２）側鎖の完全な脱保護とともに支持体からペプチドを除去し、その後、高度に希釈した水溶液中で遊離のＳＨ−官能基を酸化することによって環化を行うことができる。
【０１０３】
分子内アミド結合を含有する環状誘導体は、慣用の固相合成法で、環化のために選択された位置に好適なアミノ及びカルボキシ側鎖が保護されたアミノ酸誘導体を組み込みながら調製することができる。分子内−Ｓ−アルキル結合を含有する環状誘導体は、慣用の固相合成法で、環化のために選択された位置に好適なアミノ−保護側鎖と好適なＳ−保護システイン又はホモシステイン残基を有するアミノ酸残基を組み込みながら調製することができる。
【０１０４】
ペプチドの部分配列の天然アミノ酸を非天然アミノ酸に置換することで、タンパク質分解に対する耐性を付与することもできる。そのような置換は、例えば、Ｎ末端に作用するエクソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性を付与することができる。そのような置換は記載されており、これらの置換は生物活性に影響を及ぼさない。非天然アミノ酸の例には、α，α−２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、及びβ−メチルアミノ酸が含まれる。本発明において有用なアミノ酸アナログには、限定されるものではないが、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、及び他の特殊なアミノ酸を含めることができる。更に、非天然アミノ酸を用いたペプチド合成は、当該技術分野において日常的な公知のものである。
【０１０５】
ペプチドのＮ末端又はＣ末端残基に作用するペプチダーゼに対する耐性を付与するための他の有効なアプローチの１つは、改変ペプチドがもはやペプチダーゼの基質ではなくなるようにペプチド末端に化学基を付加することである。そのような化学修飾の１つは、１端又は両端のペプチドのグリコシル化である。特定の化学修飾、特にＮ末端グリコシル化は、ヒト血清ペプチドの安定性を増加させることが知られている（Ｐｏｗｅｌｌら、１９９３）。血清安定性を高める他の化学修飾には、限定されるものではないが、アセチル基などの炭素数１〜２０の低級アルキルから成るＮ−末端アルキル基の付加、及び／又はＣ−末端アミド若しくは置換アミド基の付加が含まれる。特に、本発明には、Ｎ−末端アセチル基及び／又はＣ末端アミド基を有するペプチドから成る改変ペプチドが含まれる。
【０１０６】
通常ペプチドの部分ではない追加の化学部分を含有する他の種類のペプチド誘導体も、誘導体がペプチドの所望の機能活性を保持する限り本発明に含まれる。そのような誘導体の例には、（ｉ）アミノ末端又は他の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、ここで、アシル基はアルカノイル基（例えばアセチル、ヘキサノイル、オクタノイル）、アロイル基（例えばベンゾイル）、又はＦ−ｍｏｃ（フルオレニルメチル−Ｏ−ＣＯ−）などの保護基であり得る；（ｉｉ）カルボキシ末端又は他の遊離カルボキシ基又はヒドロキシル基のエステル；（ｉｉｉ）アンモニア又は好適なアミンとの反応により作製されるカルボキシ末端又は他の遊離カルボキシル基のアミド；（ｉｖ）リン酸化誘導体；（ｖ）抗体又は他の生体リガンドに結合した誘導体、及び他の種類の誘導体が含まれる。
【０１０７】
余分のアミノ酸残基を本発明のペプチドに付加することで生ずる長いペプチド配列は、それらは上記ペプチドと同一の生物活性（ＩＬ−１受容体の阻害活性）を有するはずであるため、本発明に包含される。相当数の追加のアミノ酸を有するペプチドは除外するが、大きなポリペプチドには、有効な配列をつくってＩＬ−１Ｒへの結合を妨げる立体配置を想定し得るものもあることが理解されるであろう。これらの誘導体は、競合的アンタゴニストとして作用し、本発明から除外される。したがって、本発明は延長鎖を有するペプチド又は誘導体を包含するが、そのように長いペプチドは、ペプチド又は誘導体の調節活性を破壊しないように選択する必要がある。
【０１０８】
本発明に包含される他の誘導体は、直接的に又はスペーサーを介して、例えばアラニン残基の短いストレッチによって、又は推定タンパク質分解部位によって（例えばカテプシンによって、米国特許第５，１２６，２４９号及び欧州特許第４９５，０４９号を参照されたい）、互いに共有結合的に連結した本発明の２つの同一又は異なるペプチドから成る２重ペプチドである。本発明のペプチドのマルチマーは、同一若しくは異なるペプチド又はその誘導体から形成される分子のポリマーから成る。
【０１０９】
他の態様では、本発明のペプチド誘導体は、そのアミノ末端若しくはカルボキシ末端で又は両方で異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結した、本発明のペプチド若しくはその断片を含むキメラ又は融合タンパク質である。そのようなキメラ又は融合タンパク質は、タンパク質をコードする核酸の組換え発現によって作製することができる。１つの態様では、そのようなキメラ又は融合タンパク質は、本発明のペプチドの少なくとも６アミノ酸を含有し、本発明のペプチドと同等又はそれより大きい機能活性を有する。
【０１１０】
本発明のペプチド誘導体は、所望により機能的に同等な分子、又は機能的に増強されたか若しくは弱められた分子を提供する置換、付加、又は欠失によりアミノ酸配列を変えることで作製することができる。本発明の誘導体には、限定されるものではないが、配列内の同等物が機能的に同等なアミノ酸残基に置換された改変配列を含めた本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部を１次アミノ酸配列として含有するものが含まれる。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する、極性が類似する他のアミノ酸で置換することができ、サイレント変化を生ずる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。非極性（疎水性）アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれる。非荷電極性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含まれる。アミノ酸のグリシンは、非極性アミノ酸ファミリーに含まれることもあれば、非荷電（中性）極性アミノ酸ファミリーに含まれることもある。アミノ酸ファミリー内でなされる置換は、通常、保存的置換であることが理解される。
【０１１１】
本発明の１つの具体的態様では、アンタゴニストペプチドは、配列ＴＴＩ−１０１．１４０、ＴＴＩ−１０１．１４１、ＴＴＩ−１０１．１２５、ＴＴＩ−１０１．１１０、ＴＴＩ−１０１．１１１、ＴＴＩ−１０１．１３６、及びＴＴＩ−１０１．１４３を含む。
【０１１２】
ＩＶ． ペプチド模倣薬を同定するためのアッセイ
上記のように、本発明の方法で同定されたペプチドの骨格配置とファーマコフォアの呈示（ペプチド模倣薬）を複製するように作製された非ペプチジル化合物は、代謝安定性が高く、効能が高く、作用期間が長く、そしてバイオアベイラビリティがよいという特質を有することが多い。
【０１１３】
本発明のペプチド模倣薬化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレル固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；及び親和性クロマトグラフィ選択を用いた合成ライブラリー法を含めた当該技術分野に公知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は小分子のライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５、１９９７）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；及び同文献２０６１；並びにＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、又はビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４；８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４；５５５−５５６）、細菌若しくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）で提供することができる。分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）上記；Ｅｒｂら（１９９４）上記；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９４）上記；Ｃｈｏら（１９９３）上記；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）上記に見出すことができ、又は適切な基質による生成物への変換を測定することによって検出されるルシフェラーゼ、及び酵素標識であることができる。
【０１１４】
いったん本発明のペプチドを同定すれば、限定されるものではないが、示差溶解度（即ち沈殿）、遠心、クロマトグラフィ（親和性、イオン交換、サイズ排除など）、又はペプチド、ペプチド模倣薬、又はタンパク質の精製に用いられる他の標準技術を含めた多くの標準法で単離・精製することができる。同定された目的ペプチドの機能特性は、当該技術分野に公知の機能アッセイを用いて評価することができる。１つの態様では、細胞内シグナル伝達における下流受容体機能を評価するためのアッセイが用いられる（例えばＰＧＥ2合成）。
【０１１５】
１つの態様では、本発明のペプチド模倣化合物は、以下の３相工程で得られる：１）本発明のペプチドをスキャニングしてＩＬ−１受容体の認識とそれに対する活性に必要な２次構造領域を同定すること；２）配座固定されたジペプチド代用物を用いて骨格配置を絞り込み、これらの代用物に対応する有機プラットホームを提供すること；そして３）最高の有機プラットホームを用いて、天然ペプチドの所望の活性を最小にするようにデザインされた候補のライブラリーにおいて有機ファーマコフォアを呈示すること。より詳細には、３相は以下の通りである。第１相では、リードペプチドをスキャンしてそれらの構造を短くし、活性に対する要求を同定すること。オリジナルに対する一連のペプチドアナログを合成する。第２相では、配座固定されたジペプチド代用物を用いて最高のペプチドアナログを調査する。インドリジジン−２−オン、インドリジジン−９−オン、及びキノリジジノンアミノ酸（それぞれＩ2ａａ、Ｉ9ａａ、及びＱａａ）を最高のペプチド候補の骨格配置を試験するためのプラットホームとして用いる。これら及び関連するプラットホーム（Ｈａｌａｂ，Ｌｉ；Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｆ；Ｌｕｂｅｌｌ，ＷＤ；Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．５５、１０１−１２２、２０００；Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，Ｓ．Ｊ．、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ Ｇ；Ｌｏｍｂａｒｔ，Ｈ−Ｇ．；Ｌｕｂｅｌｌ，Ｗ．Ｄ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ｖｏｌ．５３、１２７８９−１２８５４、１９９７に概説されている）は、ファーマコフォアを異なる方向に向けるためにペプチドの特定領域に組み込むことができる。これらのアナログの生物学的評価により、活性に対する幾何学的要求を最小にする改良されたリードを同定する。第３相では、最も活性なリード由来のプラットホームを用いて、天然ペプチドの活性に関与するファーマコフォアの有機代用物を呈示する。平行合成形式でファーマコフォアと骨格とを組み合わせる。当然ながら、ペプチドの誘導ひいてはさまざまな相は、当該技術分野に公知の他の手段及び方法によって行うことができる。
【０１１６】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、又は他の小分子から決定された構造機能関係を用いて同様の又はより良い特性を有する類似の分子構造を絞り込み、調製することができる。したがって、具体的に開示したものに加えて、本明細書に例示した特定の態様の構造、極性、電荷の特徴、及び側鎖特性を共有する分子も本発明の範囲内である。
【０１１７】
結論として、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、又は他の小分子は機能的に活性である（即ち、本発明のペプチドに関連した１以上の同定された機能活性を発揮可能である）。例えば、所望の特性（例えばＩＬ−１ＲａｃＰのタンパク質パートナー又はリガンドへの結合）を阻害するそのようなペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣薬、又はアナログは、そのような特性及びその生理的に関連するものの阻害剤として用いることができる。ペプチド、誘導体、ペプチド模倣薬、又は本発明のペプチドアナログは、当該技術分野において公知の機能アッセイ（例えばＰＧＥ２合成）によって、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体を介した細胞内シグナル伝達の阻害に関して試験することができる。
【０１１８】
Ｖ． 医薬組成物
本発明は、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬との相互作用を介したＩＬ−１受容体活性の阻害方法に関するものである。動物の数多くの経路及び病態におけるＩＬ−１及び／又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ１ＲａｃＰ受容体機能の重要性に鑑みると、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬は、ＩＬ−１反応（例えばＩＬ−１過剰発現又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ１−ＲａｃＰを介した異常なシグナル伝達）に関連した病態又は疾患の治療に有用である。
【０１１９】
したがって、本発明の方法は、それを必要とする被験者又はそれを必要とする危険性のある被験者に、有効量のペプチド、ペプチド誘導体、若しくはペプチド模倣薬、又はペプチド、ペプチド誘導体、若しくはペプチド模倣薬を含む組成物を投与し、ＩＬ−１Ｒ／ＲａｃＰ生物活性を阻害することを含む。１つの態様では、ペプチド又はそのペプチド誘導体と、好適な医薬担体とを含む有効量の治療用組成物を被験者に投与し、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害し、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰを介した異常なシグナル伝達（例えばＩＬ−１／ＩＬ−１ＲａｃＰリガンドの過剰産生を介した、又は構成的に活性な受容体若しくは他の欠陥を介したＩＬ−Ｉ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体の過剰刺激）に関連した症状を予防、改善するか、又は障害、疾患、若しくは病態を治療する。１つの態様では、被験者は動物である。他の態様では、被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【０１２０】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模薬は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性の阻害が有益である病態又は障害の症状の治療、予防、又は改善に有用である。本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬が有益であり得る疾患、病態、又は障害には、限定されるものではないが、以下の例が含まれる：関節リウマチ、炎症性大腸炎のような慢性及び急性の炎症性疾患、敗血症、変形性関節症、乾癬、脳炎、糸球体腎炎、呼吸窮迫症候群、及びライター症候群。他の病態には、全身性エリテマトーデス、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性関節疾患、ある種の白血病の悪液質、アルツハイマー病、数多くの種類のがん、若年型糖尿病、肺高血圧症、卒中、脳室周囲白血球減少症、及び髄膜炎が含まれる。
【０１２１】
本発明の範囲内の組成物は、活性物質（例えばペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬）を、不都合な副作用を回避しながら所望の治療効果を達成するのに有効な量で含有する必要がある。活性物質の医薬的に許容可能な製剤及び塩は本発明の範囲内であり、当該技術分野において周知である。ポリペプチドアンタゴニストなどを投与するには、不都合な副作用を回避するように投与量を選択する必要がある。具体的な疾患、障害、又は病態の治療に有効な治療用組成物又は医薬組成物の量は、疾患の性質及び重篤度、作用の標的部位、患者の体重、患者の特別食、最近用いた投薬、投与経路、及び当該技術分野に熟練した者に認識される他の要因に依存するであろう。用量は、疾患の程度及び患者に由来するさまざまなパラメータのような慣例的要因にしたがい、臨床医によって適合されるであろう。典型的には、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日が被験者に投与されるであろう。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線から推定することができる。例えば、ラットの研究から得られたデータに基づいてヒトに対する有効なｍｇ／ｋｇ用量を得るには、ラットの有効なｍｇ／ｋｇ用量を６で割る。
【０１２２】
さまざまな送達システムが公知であり、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬、又は医薬組成物の投与に用いることができる。本発明の医薬組成物は、静脈内若しくは筋肉内注射、脳室内若しくは髄膜注射（中枢神経系投与のため）、経口、局所、皮下、結膜下、経鼻、皮内、舌下、経膣、直腸内、又は硬膜外経路を含めた好適な経路で投与することができる。
【０１２３】
当該技術分野において周知の他の送達システムを用いて、例えば水溶液、マイクロ粒子への封入、又はマイクロカプセルを介して、本発明の医薬組成物を送達することができる。
【０１２４】
更に他の態様では、本発明の医薬組成物は、制御放出システムで送達することができる。１つの態様では、ポリマー材料を用いることができる（Ｓｍｏｌｅｎ及びＢａｌｌ、『制御された薬物バイオアベイラビリティ、製剤のデザインと性能』、１９８４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒａｎａｄｅ及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ、『薬物送達システム、薬理学と毒物学シリーズ』、２００３、第２版、ＣＲＲＣ出版を参照されたい）。他の態様では、ポンプを用いることができる（Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。
【０１２５】
本発明の化合物は、化合物分子がそれにカップリングした個別の担体としてモノクローナル抗体を使用することによって送達することもできる。本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラスにカップリングさせることもでき、非限定的な例には：ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋した両親媒性ブロックコポリマー及びヒドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリジヒドロピランが含まれる。
【０１２６】
上記のように、本発明の医薬組成物は、ペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬を、医薬的に許容可能な担体と組み合わせて含む。担体という用語は、ペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬と一緒に投与する希釈剤、補助剤、充填剤又は結合剤などの賦形剤、崩壊剤、滑剤、シリカ フローコンディショナー、安定化剤、又はビヒクルを表す。そのような医薬担体には、水、又は鉱油、植物油（例えばピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、ナタネ油）、動物油、若しくは合成油を含めたオイルのような滅菌液が含まれる。グリセロール及びデキストロース水溶液、並びに生理食塩水溶液を本発明の医薬組成物の液体担体として用いることもできる。当然ながら、担体の選択は、ペプチド、ペプチド誘導体、又はペプチド模倣薬の性質、その溶解度、及び他の生理的特性、並びに送達及び適用の標的部位に依存する。例えば、血液脳関門を浸透できる担体は、中枢神経系の疾患又は病態（例えば炎症）の症状の治療、予防、又は改善に用いられる。好適な医薬担体の例は、『レミントン：薬学の科学と実践』、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、２００３、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０１２７】
更に、本発明の医薬製剤に組み込むことができる医薬的に好適な材料には、吸収促進剤、ｐＨ調製剤及び緩衝剤、浸透圧調製剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、界面活性剤、増粘剤、皮膚軟化剤、分散剤、香料、着色剤、並びに湿潤剤が含まれる。
【０１２８】
好適な医薬賦形剤の例には、水、グルコース、ショ糖、乳糖、グリコール、エタノール、モノステアリン酸グリセロール、ゼラチン、コメ、デンプン粉末、粉乳、ステアリン酸ナトリウム、モルト、塩化ナトリウムなどが含まれる。本発明の医薬組成物は、溶液、カプセル、錠剤、クリーム、ジェル、粉末、徐放性製剤などの形態を採ることができる。組成物は、トリグリセリドのような慣用の結合材及び担体とともに座剤として製剤化することができる（『レミントン：薬学の科学と実践』、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、２００３、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。そのような組成物は、被験者に正確に投与するための形態を提供するように、治療的に有効量の治療用組成物を、好適量の担体とともに含有する。製剤は、投与様式及び作用の標的部位（例えば具体的な臓器又は細胞種）に適するようにデザインされる。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、中性又は塩の形態で製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩には、遊離アミノ基とともに形成するもの、及び遊離カルボキシル基と反応するものが含まれる。医薬産業において一般に用いられる非毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及びアンモニウム塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム、及びプロタミン亜鉛の塩が含まれ、当該技術分野に周知の方法で調整される。塩には、通常、本発明の化合物を好適な有機酸又は無機酸と反応させることによって調製される非毒性の酸付加塩も含まれる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、吉草酸塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ｔｙｓｏｌａｔｅ、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、ナプシル酸塩などが含まれる。
【０１３０】
本発明にしたがい使用できる充填剤又は結合剤の例には、アカシア、アルギン酸、リン酸カルシウム(２塩基性)、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストリン、デキストレート、ショ糖、チロース、α−デンプン、硫酸カルシウム、アミロース、グリシン、ベントナイト、マルトース、ソルビトール、エチルセルロース、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２ナトリウム、ピロ亜硫酸２ナトリウム、ポリビニルアルコール、ゼラチン、グルコース、ガーゴム、液体グルコース、圧縮糖、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、マルトデキストリン、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、トラガガント、微晶性セルロース、デンプン、及びゼインが含まれる。他の最も好ましい充填剤又は結合剤は、微晶性セルロースから成る。
【０１３１】
使用できる崩壊剤の例には、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（低置換）、微晶性セルロース、粉末セルロース、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、メチルセルロース、ポラクリリンカリウム、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、２亜硫酸２ナトリウム、エダタミル２ナトリウム、エデト酸２ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）２ナトリウム架橋ポリビニルピロリジン、α−デンプン、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、微晶性セルロースが含まれる。
【０１３２】
滑剤の例には、ステアリン酸カルシウム、ナタネ油、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化植物油（Ｉ型）、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸フマル酸ナトリウム、ステアリン酸、タルク、及びステアリン酸亜鉛、ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｂｅｈａｐａｔｅ、ラウリル硫酸マグネシウム、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム／酢酸ナトリウム（混合）、ＤＬ−ロイシンが含まれる
シリカ フローコンディショナーの例には、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、及びガーゴムが含まれる。他の最も好適なシリカ フローコンディショナーは二酸化ケイ素から成る。
【０１３３】
安定化在の例には、アカシア、アルブミン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、ベントナイト、リン酸２カルシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、コロイド状二酸化ケイ素、シクロデキストリン、モノステアリン酸グリセリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、３ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、カルナウバワックス、キサンタンゴム、デンプン、ステアリン酸塩、ステアリン酸、ステアリン酸モノグリセリド、及びステアリルアルコールが含まれる。
【０１３４】
本発明は、被験者にいったん投与すると、より安定な（即ち、いったん投与すると、未修飾型よりも半減期が長いか、又は有効期間が長い）ペプチド又はペプチド誘導体の修飾物も提供する。そのような修飾は、本発明が関連する分野に熟練した者に周知である（例え、ＰＥＧ化としても知られるポリエチレングリコール誘導体化、マイクロカプセル化など）。
【０１３５】
本発明のＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰアンタゴニストは、単独で投与してもよいし、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰに関与する疾患又は病態の症状の治療、予防、又は改善に有用な他の活性物質と組み合わせて投与してもよい。したがって、本発明の組成物及び方法は、ＩＬ−１活性（例えば合成、放出及び／又はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰへの結合）の調整能、又はＩＬ−１関連疾患（例えば関節リウマチ及び炎症性大腸炎）の症状の軽減能を発揮する他の物質と組み合わせて用いることができる。そのような物質の例には、限定されるものではないが、抗リウマチ薬、例えばクロロキン、オーラノフィン（リドーラ（商標））、デキサメサゾン、金チオリンゴ酸ナトリウム、メトトレキセート（Ｌｅｅら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、８５：１２０４を参照されたい）、プロブコール（Ｋｕら、１９８８、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６２：７７８を参照されたい）、ペントキシフィリン（例えばＳｕｌｌｉｖａｎら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７２２）、ジスルフィラム（Ｍａｒｘ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：２５７を参照されたい）、抗酸化剤、例えばノルジヒドログアヤレト酸（Ｌｅｅら、１９８８、Ｉｎｔ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．、１０：３８５）、ＩＬ−１トラップ（例えば２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖ．Ｄｒｕｇｓ、４（５）：５９３−５９７を参照されたい）、アナキンラ（キネレット（商標）、ＰＣＴ出願ＷＯ００／２３６１５２号）、レフルノミド、コルチコステロイド（メドロール（商標）、デルタゾン（商標）、Ｏｒａｓｏｎｅ（商標））、及び他の物質、例えばＢｅｎｄｅｒ及びＬｅｅ（１９８９）『医化学年報』、第２０章：「ＩＬ−１の薬理学的調節」：１８５−１９３）に記載のものが含まれる。抗炎症薬、例えば非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ、例えばロフェコキシブ（ビオックス（商標））、セレコキシブ（セレブレックス（商標））、バルデコキシブ（ベクストラ（商標））、アルピリン（商標）、アドビル（商標））、抗ＴＮＦ−α薬（インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ）、コラーゲナーゼ阻害剤、その他のような他の薬物を本発明の化合物と組み合わせて用いることもできる。当然ながら、２以上のペプチド、誘導体、及びペプチド模倣体の組み合わせ、並びに１以上の薬物とそれらの組み合わせを、あらゆる組み合わせで用いることもできる（例えば、１以上のペプチドと１以上の模倣体、１以上の模倣体と１以上の誘導体、１以上のペプチドと１以上の薬物など）。
【０１３６】
本発明を以下の非限定的な実施例によって更に詳細に説明する。実施例は具体的な説明のためにのみ提供するのであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１３７】
ＡＰＩ−１０１ペプチドの効果
本発明の化合物及び方法の有効性の１例を、同定したペプチドＡＰＩ−１０１（配列番号１：ＡＰＲＹＴＶＥＬＡ）を用いて得た結果によって表す。
【０１３８】
以下の実施例に記載した全てのペプチドは、保護基を有する有機相中の固相合成法のＦＭＯＣプロトコールにしたがい合成した。それらを、ＨＰＬＣを用い、Ｃ１８カラムにて、アセトニトリル濃度勾配１０〜６０％で溶離させて収率７０％に精製した。質量分析によって分子量を検証した。当然ながら、上記のように、天然アミノ酸を用いる場合、当該技術分野に公知の遺伝子操作技術によって得ることができる。
【０１３９】
3Ｈ−チミジン取り込み法を用いて、ペプチドＡＰＩ−１０１（配列番号１）及びＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、Ａ５４９がん細胞においてＩＬ−１の増殖作用を測定した。ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（３７℃）で２４時間刺激する前、Ａ５４９細胞をさまざまな濃度のペプチドとプレインキュベーションした（４５分間）；ＩＬ−１βによる刺激の２４時間前にウシ胎仔血清を除いて他の分裂促進剤の増殖作用を回避した。次に3Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）を２４時間加え、その後、１０％冷ＴＣＡで細胞を３回洗浄し、０．１Ｎ ＮａＯＨ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶解させた。シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。実験を２重で３回繰り返した。図１に見られるように、ペプチドは、ＩＣ50 １０-6ＭでＩＬ−１による増殖阻害を完全に無効にした。
【０１４０】
ＩＬ−１がプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の合成を内皮細胞及び／又は軟骨細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導することは当該技術分野において周知である。したがって、ヒト軟骨細胞及びコブタ脳微小血管内皮細胞をペプチドＡＰＩ−１０１（１０-6Ｍ）とともに４５〜６０分間、３７℃でプレインキュベーションし、ヒトＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を増殖培地に加えた。２４時間のインキュベーション後、増殖培地を除去して蒸発させた。市販のキット（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）を用いてＲＩＡアッセイにてＰＧＥ2値を測定した。
【０１４１】
図２は、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）によって誘導されたＰＧＥ2合成が、１０-6Ｍの濃度のＡＰＩ−１０１（配列番号１）で、ＩＣ50 １０-6Ｍにて５０％以上顕著に減少したことを示している（図３）。
【０１４２】
生体外特性
他の実験では、コブタ軟膜血管で血管運動性試験を行い、ＩＬ−１βの血管拡張作用に対するＡＰＩ−１０１（配列番号１）の具体的効果を更に評価した。
【０１４３】
脳血管に対する生体外血管運動反応を記載の通りに行った（Ｌｉら、１９９６；Ｈｏｕら、２０００；Ｈｏｕら、２００１；Ｈｏｕら、２００３）。ヨークシャーコブタから脳を取り出した。軟膜血管を露出した皮質切片を、９５％Ｏ2、５％ＣＯ2で平衡化し、３７℃に維持したクレブスバッファー（ｐＨ７．４）を含有する２０ｍｌ浴のワックス基剤に対して固定した。解剖顕微鏡に取り付けられたビデオカメラで微小血管を可視化し、記録した。デジタル画像解析機で血管径を測定した。プレ収縮剤Ｕ４６６１９（１０-7Ｍ）の局所投与前後に血管径を記録した。標本の安定化後、安定な血管拡張が検出されるまでリガンド（ＩＬ−１β、７５ｎｇ／ｍｌ）を加えた。続いてペプチドを、１０-10〜１０-5Ｍのさまざまな濃度で加えた。先に記載された通りに血管拡張の逆転を可視化して測定した（Ｈｏｕら、２０００；Ｈｏｕら、２００１；Ｈｏｕら、２００３）；２匹の動物について３重測定を行った。
【０１４４】
図４からわかるように、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）は、ＩＬ−１β（７５ｎｇ／ｍｌ）によって誘導された血管拡張をＩＣ50 １８２ｎＭにて防ぐことができた。
要約すれば、これらの結果は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１Ｒａｃｐ受容体を標的にすることで、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）はＩＬ−１の生体反応の阻害に有効であったことを示している。
【実施例２】
【０１４５】
アラニンスキャンによって得たＡＰＩ−１０１誘導体の効果
ＡＰＩ−１０１（配列番号１）アンタゴニストの顕著な効果を実証するために、ＡＰＩ−１０１と誘導体に関する構造機能関係データを提供するための実験を行い、活性に関して最も重要な領域を同定した。したがって、アラニンスキャン変異をＡＰＩ−１０１（配列番号１）について行った（ペプチド配列に関しては図１７を参照されたい）。当然ながら、アラニンの代わりに他のアミノ酸を用いてスキャン実験を行うこともできたであろう。
【０１４６】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
実施した変異に応じた結果の表の概要を図１７に示す。
変異ペプチドの効率及び阻害活性をＩＬ−１誘導性ＰＧＥ2合成の阻害を測定することによって決定した（上記実施例１の実験プロトコールを参照されたい）。ＡＰＩ−１０１．１（配列番号２）のみが親ペプチドＡＰＩ−１０１（配列番号１）と比較して内皮細胞及び軟骨細胞においてわずかに効率が上昇していた。一方、ＡＰＩ−１０１．５（配列番号６）、−１０１．６（配列番号７）、及び−１０１．７（配列番号８）は両細胞種においてほとんど全ての活性を失っていた。このことは、標的としたＶＥＬＡ領域がペプチドの活性に重要であることを示唆している。図５は、このシリーズの最も有効なペプチドについてグラフ表示したものである。全てのペプチドは１０-6Ｍの濃度で試験した。
【０１４７】
生体外特性
ＡＰＩ−１０１のアラニンスキャンペプチドについても血管運動性試験を行った（実施例１の実験プロトコールを参照されたい）。図６は、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）、−１０１．１、−１０１．３、及び−１０１．６（それぞれ配列番号２、４、及び７）はいずれもＩＬ−１β（７５ｎｇ／ｍｌ）で誘導される血管拡張を逆転させ、そしてＡＰＩ−１０１．１（配列番号２）はＡＰＩ−１０１よりもわずかに阻害活性が上昇し、血管拡張を７０％止めたことを示している。
【０１４８】
全体的に見て、変異も置換もペプチド誘導体の活性をＡＰＩ−１０１（配列番号１）より顕著に増加させなかったが、ペプチドの活性に重要な領域に関する情報が得られた。
【実施例３】
【０１４９】
ＡＰＩ−１０１の更なる最適化による活性改善効果
活性を更に改善し、その活性に重要なＡＰＩ−１０１内の領域について得たアラニンスキャンの結論を評価するために、ペプチドのＮ末端アミノ酸を徐々に切断した。図７は、新たなペプチドの配列、及びＡＰＩ−１０１について採用した最適化の一般的パターンを示す
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
ＩＬ−１βはヒト線維芽細胞の増殖を誘導する。3Ｈ−チミジン取り込みプロトコール（実施例１のプロトコールを参照されたい）を用いて、ＩＬ−１β誘導性ＷＩ−３８（ヒト肺線維芽細胞）増殖に関し短鎖型ペプチドをアッセイした。
【０１５０】
ＩＬ−１Ｒ誘導性増殖の６５％を止めるＡＰＩ−１０１（配列番号１）に対し、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）及びＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）はＩＬ−１β誘導性増殖を１００％止める（図８）。
【０１５１】
ＡＰＩ−１０１短鎖型誘導体についてもＩＬ−１誘導性ＰＧＥ２合成の測定を行った。図１８は、さまざまなペプチドの効能及び効果の概要を示す。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は最も有効で強力な短鎖型ペプチドであり、ＷＩ−３８細胞及び内皮細胞に対するＩＣ50が、ＡＰＩ−１０１（７９０ｎＭ及び２２０ｎＭ）と比較して、０．２ｎＭ及び１．２ｎＭであった。ＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）及び１２（配列番号１２）は効能及び効果が減少しており、アルギニンの後のペプチド切断はその効能及び効果に影響を及ぼすことを示していた。
【０１５２】
細胞障害性
ＡＰＩ−１０１の最新誘導体の細胞障害性も２つの細胞種：ＷＩ−３８及び脳微小血管内皮細胞について測定した。先に記載された通りに細胞生存率をアッセイした（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、２００１；Ｂｒａｕｌｔら、２００３）。内皮細胞及び線維芽細胞をさまざまな濃度のペプチドとともに３７℃で２４時間インキュベーションした。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）のＰＢＳ溶液を終濃度５０μｇ／ｍｌで増殖培地に加えた。細胞をＭＴＴとともに３７℃で２時間インキュベーションした。次に増殖培地を吸引し、イソプロパノール：１Ｎ ＨＣｌ ２４：１の溶液２００μｌを各ウェルに加えて細胞を溶解させた。生存細胞はＭＴＴ産物（ミトコンドリアを介して）をホルマザンと呼ばれる測定可能比色（青色）産物に変換する。ホルマザン産生（及び細胞生存率）を、溶解物１００μｌの光学密度を６００ｎｍで測定することによって決定した。
【０１５３】
図９に示すように、１０-5Ｍペプチドに２４時間曝したとき、細胞は毒性を示さなかった。
生体外特性
ＩＬ−１誘導性血管拡張に対するＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）の効果を評価するため（ｉｎ ｖｉｔｒｏで最高活性を示したペプチド）、血管運動性実験も行った（プロトコールについては実施例１を参照されたい）。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は１０．８ｎＭで最高のＩＣ50を示し、ＡＰＩ−１０１（１８２ｎＭ）よりも１００倍強力であった（図１８）。ペプチド１０１．９（配列番号９）、１０１．１１（配列番号１１）、及び１０１．１２（配列番号１２）は、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）よりも良好なＩＣ５０を示した（図１８及び図１０）。図１０のペプチドの濃度範囲は１０-10Ｍ〜１０-5Ｍであった。したがって、生体外実験では、ＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）及びＡＰＩ−１０１．１２（配列番号１２）が親ペプチドと比較して顕著に改善された阻害活性を示した。
【０１５４】
ｉｎ ｖｉｖｏ特性
ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰペプチドアンタゴニストの全身作用
誘導体を頚部又は直接胃に注射することによって天然リガンドの生理作用をｉｎ ｖｉｖｏで逆転できるかどうか評価するため（消化管を介したペプチドの安定性を証明するため）、ＡＰＩ−１０１誘導体のＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）（及びその他）を試験した。スプラーグ・ドーリーラット（３００ｇ）をイソフルラン（２．５〜４％）で麻酔した。天然リガンド（ＩＬ−１β）又はビヒクル（生理食塩水）を頚静脈から注射した（５μｇ／ｋｇ）。その後のＰＧＥ2測定のために、各注射の前及び１０分後に頚動脈から採血した。頚静脈又は直接胃にペプチドを投与した（ＩＣ50値に基づいた用量、及び細胞外空間と同等な分布量）（静脈内（ｉｖ）で用いた５回用量）。動脈圧及び心拍数を持続的にモニターし（Ｇｏｕｌｄ）、一方、日常的な解析で体温及び血液ガス（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）を先に記載された通りに測定した（Ｌｉら、１９９７；Ｈａｒｄｙら、１９９９；Ｎａｊａｒｉａｎら、２０００）。実験は３回繰り返した。
【０１５５】
上記方法のいずれかでラットに投与したとき、ＩＬ−１β誘導性の重篤な低血圧を観察した。以下のペプチドは、低血圧をｉｎ ｖｉｖｏで防ぐことができる例示アンタゴニストを構成する：
１． ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）：ＩＬ−１βの注射後（５μｇ／ｋｇ）に頚部注射によって投与した場合、１０-8Ｍの濃度で低血圧を９５％防いだ（即ち、ＩＬ−１誘導性低血圧を和らげた）。ＡＰＩ−１０１．９（配列番号９）のような他の誘導体も、このＩＬ−１βの生体作用を防いだが、生理食塩水対照（図１１Ａ）よりも顕著に良好であったものの、ペプチドＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）、１０１．１０１（配列番号１３）、又はペプチド模倣薬１０１．１０９、１０１．１１１、及び１１．１１２（図２０）よりも効果が小さかった。これは、ペプチドが動物においてＩＬ−１βの効果を逆転させることによってｉｎ ｖｉｖｏで血圧上昇効果を有することを明確に立証している。
２． １０-5Ｍの濃度で胃に直接投与した場合、ペプチドはＩＬ−１βによる低血圧を６０％減少させた。この結果は、１０１．１０（配列番号１０）ペプチドの腸内投与がＩＬ−１β誘導性低血圧の主要な効果を依然として維持し（図１２Ａ）、したがって消化管に沿って効果及び安定性を維持できることを立証した。
【０１５６】
本発明のＩＬ−１受容体アンタゴニストのＩＬ−１Ｒ活性に対する効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価する他の方法は、ラット血清のＰＧＥ2レベルを測定することである。
本発明のＩＬ−１Ｒ受容体アンタゴニストが低血圧をｉｎ ｖｉｖｏで防止できる場合、ＰＧＥ2の合成も予防できるはずである。したがって、上記実験に用いたラット血清のＰＧＥ2を測定した（例えば動脈圧変動測定）。短鎖型ＡＰＩ−１０１誘導体ペプチドを用いて得た結果の例を以下に記載する。
【０１５７】
再度、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は、ペプチドを頚部に注射したとき、ＰＧＥ2合成（６０％）の防止について試験したＡＰＩ−１０１誘導体の中で最も有効であることを示した。ペプチドを直接胃に注射したとき、更に高い阻害が得られた（図１１Ｂ及び図１２Ｂ）。
【０１５８】
ＡＰＩ−１０１．１０の更なる最適化
最適化の最終ラウンドから、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）を最高のペプチド誘導体として同定した。したがって、ＡＰＩ−１０１をＮ端から９〜７アミノ酸切断することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏ効果を傷つけることなく、効能を改善させることができるであろう。
【０１５９】
図１５は、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）について行った次の変異を示す。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）のアルギニンをシトルリンに置換した −Ｎ端付近でグアニジンからウレア基に改変。他の変異（例えば、ＡＰＩ−１０１．１０２（配列番号１４）及び１０１．１０３（配列番号１５）においてＥからＱへ）及びＣ端の短鎖型ペプチド（ＡＰＩ−１０１．１０８（配列番号２０））も行ってペプチドの効能及び効果を改善させた。
【０１６０】
図１５は、これらのペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を示す。コブタ脳微小血管内皮細胞及びＷＩ−３８ヒト線維芽細胞を用いてＰＧＥ2を測定した。変異のいくつかは有益であり、効能に主要な増加を与えた。例えば、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）及び１０１．１０７（配列番号１９）は、１０００倍を越える良好な効能を示し、ヒトＷＩ−３８細胞におけるＩＣ50が０．０５ｐＭ及び０．１ｐＭであった。
【０１６１】
次に、これらの新たに生成されたペプチドに関し、生体外実験を行った。脳組織をペプチド及びＩＬ−１βとともにインキュベーションし、市販のキット（アマシャムバイオサイエンス、ｃＧＭＰアッセイｂｉｏｔｒａｃｋ（商標）システム）でｃＧＭＰを測定した。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）は既に８５％のＩＬ−１β誘導性ｃＧＭＰ産生を阻害し（１０-6Ｍ）、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）及び１０１．１０６（配列番号１８）は９０％を越えるｃＧＭＰ産生を阻害した（結果は示していない）。したがって、グルタミン酸の陰電荷の除去とスレオニンの除去によりアンタゴニストの効能を改善できるようである。注目すべきは、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）の活性がアムジェンの薬物キネレット（商標）よりも優れていることが示されたことである（データは示していない）。
【０１６２】
総合すれば、本発明は、ＡＰ１−１０１は強力で有効なＩＬ−１受容体アンタゴニストであることを明確に立証している。更に、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）から出発して、本発明者らは、系統的様式で更により強力で有効なアンタゴニストを生成することができたことを明確に立証している（ＡＰＩ−１０１及び１０１．１００シリーズの誘導体のＩＣ50と比較して示すように）。したがって、本発明は、新規ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−ＲａｃＰ受容体アンタゴニストを同定する手段、及びＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−ＲａｃＰが関与する経路における欠陥に関連する疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。当該技術分野において通常の技術を有する者は、本発明の教示と当該技術分野における一般常識の水準に基づいて、以下に記載のように、ペプチド模倣薬及び他の誘導体を生成することもできる。
【実施例４】
【０１６３】
ラット炎症性大腸炎（ＩＢＤ）モデルにおけるＡＰＩ−１０１の効率
ＩＢＤはヒト集団において罹患率の高い胃腸管の慢性炎症である。ペプチドＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）が、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で誘発したＩＢＤ動物モデルにおいて、更に他の炎症プロセスを防げるかどうかを実証するために本実験を行った。ＴＮＢＳは、急性腸炎及びクローン病に典型的な好中球及びマクロファージの経壁浸潤、亀裂潰瘍形成、並びに粘膜下線維症を特徴とするＩＬ−１２介在ＴH−１反応を引き起こす（Ｂｏｕｍａ及びＳｔｒｏｂｅｒ、２００３）。
【０１６４】
炎症性大腸炎モデル
結腸炎症は、雄性スプラーグ・ドーリーラット（１７５〜２００ｇ）にハプテンであるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を直腸内／結腸投与することによって誘導した（Ｂｏｕｍａ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ、２００３；Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１９８９）。イソフルランで動物を麻酔し、ＴＮＢＳを５０％エタノール（容量／容量）に溶解した。１２０ｍｇ／ｍｌ（ＴＮＢＳ）をポリエチレンチューブ（ＰＥ５０）を用いて結腸に投与した（ラットあたり合計量０．２５ｍｌ）。肛門から８ｃｍのところにカニューレを挿入し、溶液の排出を防ぐためにＴＮＢＳ投与後少なくとも１５分間適当な位置に維持した。ＴＮＢＳ投与前２時間に、ＡＰＩ−１０１誘導体ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０、１．１ｍｇ／ｋｇ）又は０．９％生理食塩水を尾静脈から静脈内投与した（合計量０．３ｍｌ）。次に、プライム腹腔内ａｌｚｅｔポンプを用いてＡＰＩ−１０１．１０（２．２ｍｇ／ｋｇ、さまざまなペプチドのｔ1/2＝２〜３時間に基づいて血圧実験に用いた６回用量）又は０．９％生理食塩水を持続注入した。第３群（対照）にはＴＮＢＳを注射しなかった。ＴＮＢＳ投与後６日目に、ＣＯ2吸入によってラットを屠殺した。第７日目までに自然な組織再生が始まり、これは試験ペプチド又はペプチド誘導体の治療効果を覆い隠すことができるため、第６日目を終点として選択した。結腸を取り出し、巨視的に（癒着、潰瘍形成、変色、及び出血）及び組織学的に（好中球浸潤、上皮傷害、陰窩変形、及び潰瘍形成）調べた（Ａｎｔｈｏｎｙら、１９９５；Ｐａｄｏｌら、２０００；Ｄｉｅｌｅｍａｎ，ＬＡら、１９９７；Ｔｏｒｒｅｓ ＭＩら、１９９９）。１群あたり２匹の動物を試験した。
【０１６５】
近位肛門領域から４〜６ｃｍのところで組織横断切片を切り出し、ヘマトキシリン／エオジン法で染色した。
炎症性大腸炎のＴＮＢＳモデルは、（例えばヒトにおける）クローン病の炎症特性及び組織傷害を再現する。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、ＴＮＢＳを注射した動物の結腸は、形態的に腸壁の肥厚、浮腫、及び変色を呈示し、顕著な炎症を示した。ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）で前処理した動物の結腸の巨視的特徴は対照動物のものと（図１４Ｃ）似ていた。組織学的特徴は、上皮層及び陰窩への好中球浸潤（図１６Ｂを参照されたい）、上皮層傷害、並びに陰窩の喪失（図１６Ｂ）から成っていた。動物をＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）で前処理することにより、ＴＮＢＳで誘発された結腸損傷が妨げられた。図１６では、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）で処理した結腸における陰窩の組織化と完全性は、たとえ依然として炎症が存在しても保存されることが理解できるであろう（巨視的解析実験と比較して、ＡＰＩ−１０１．１０の用量の半分を用いた）。図１６Ｂに示す上皮層の傷は、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）処理動物において完全に妨げられる（図１６Ｃ）。したがって、本発明のＩＬ−１Ｒアンタゴニストは炎症性大腸炎動物モデルにおいても非常に有効である。
【実施例５】
【０１６６】
ペプチド模倣薬ＡＰＩ−１０１．１０９、ＡＰＩ−１０１．１１０
本発明のアンタゴニストの効果及び効能を更に改善するために、ペプチド模倣薬をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、スクリーニングした。１つの態様では、ペプチド模倣薬はＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）又はＡＰＩ−１０１．１０７（配列番号１９）に由来し、１次構造は：ＡＰＩ−１０１．１０９はＲＹ（ＨｙＶａｌ）ＰＥＬＡであり（図２０）、ＡＰＩ−１０１．１１０はＲＹ（Ｉ2ａａ）ＥＬＡである（図２１）。ここで、ＨｙＶａｌはβ−ヒドロキシバリンであり、Ｉ2ａａはインドリジジン−２−オン アミノ酸（２−オキソ−３−アミノ−アザビシクロ［４．３．０］ノナン−９−カルボン酸である。これらのペプチド模倣薬もＤ−ペプチドである。
【０１６７】
手順：
固体支持体の調製
ベンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩（２ｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、ロット番号１１９８８、１００〜２００メッシュ、添加１．２ミリモル／ｇ）を、１０ｍｌ／ｇの以下のそれぞれの試薬：５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2；ＣＨ2Ｃｌ2；ＤＭＦで１分間×３回洗浄した。樹脂を、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）アミノカプロン酸（１．２７ｇ、３．６ミリモル、１５０モル％）、ＴＢＴＵ（１．２７ｇ、３．９６ミリモル、１６５モル％）、ＤＩＥＡ（６９０μＬ、３．９６ミリモル、１６５モル％）、及びＨＯＢｔ（５３５ｍｇ、３．９６ミリモル、１６５モル％）のＤＭＦ（２０ｍｌ、１０ｍｌ／ｇの樹脂）溶液で処理し、カイザー試験が陰性になるまで１時間撹拌した。樹脂を１０ｍｌ／ｇの以下の溶液で交互に洗浄した：ＤＭＦ（３×１分）及びイソプロピルアルコール（３×１分）。次に樹脂をピペリジンのＤＭＦ液で処理し（２０％ｖ／ｖ、２０ｍｌ、１×２分、１×３分、１×１０分）、続いて１０ｍｌ／ｇのＤＭＦ（３×１分）とイソプロピルアルコール（３×１分）で交互に処理した。樹脂を、４−［（Ｒ，Ｓ）−α−１（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシ−ホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸（Ｋｎｏｒｒリンカー、１．９４ｇ、３．６ミリモル、１５０モル％）、ＴＢＴＵ（１．２７ｇ、３．９６ミリモル、１６５モル％）、及びＤＩＥＡ（６９０μＬ、３．９６ミリモル、１６５モル％）のＤＭＦ（２０ｍｌ）溶液で１時間撹拌した。樹脂を１０ｍｌ／ｇの以下の溶液で連続的に洗浄した：ＤＭＦ（３×２分）、イソプロピルアルコール（３×２分）、及びＣＨ2Ｃｌ2（３×２分）。高真空下で樹脂を一晩乾燥させて３．６６ｇの樹脂を得た。
【０１６８】
添加の決定
ピペリジン（２０ｇ）とＤＭＦ（２０ｇ）を混合した。サンプルバイアル中の一定量のこの溶液に（２０ｍｌ、１８．０８ｇ）乾燥樹脂（２０ｍｇ）を加え、アルゴン気流の通過によって懸濁液を穏やかに撹拌した。５０分後、樹脂を安定させた。溶液のアリコート（１ｍｌ）をエタノールで５０倍希釈し、吸光度を３０１ｎＭにて測定した（Ｎ−（９−フルオレニル−メチル）ピペリジン ＵＶ λmax ２６７ｎＭ（ε１７５００）、２９０（５８００）、及び３０１（７８００）。２回の個別の測定（平均化）はＡ301＝０．０７８５であった。下式：［ｃ（ミリモル／ｇ）＝（ＯＤ×５０×１０2）／７８００］より、ｃ＝０．５０ミリモル／ｇであった（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒら、１９７９）。
【０１６９】
ペプチド合成
アミノ酸はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ（ルイビル、ケンタッキー州）から購入し、以下の誘導体として用いた：Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ・Ｈ2Ｏ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ。（Ｒ）−β−ヒドロキシ−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）バリンを、（Ｒ）−β−ヒドロキシ−Ｎ−（Ｂｏｃ）バリンから（Ｄｅｔｔｗｉｌｅｒら、２００３）、Ｂｏｃ基を除去し（１：１ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＣＨ2Ｃｌ2）、含水アセトン中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ及びＮａＨＣＯ3で保護し（Ｃａｐａｔｓａｎｉｓら、１９８３）、続いてクロマトグラフィによりシリカゲルに対して精製し（１：１：９８ ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／ＣＨＣｌ3）、含水アセトニトリルから凍結乾燥することによって調製した（収率７８％）。（３Ｒ，６Ｒ，９Ｒ）−２−オキソ−３−［Ｎ−（Ｆｍｏｃ）アミノ］−１−アザビシクロ［４．３．０］−ノナン−９−カルボン酸を、（３Ｒ，６Ｒ，９Ｒ）−２−オキソ−３−アミノ−１−アザビシクロ［４．３．０］−ノナン−９−カルボン酸メチルから、含水アセトン中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ及びＮａＨＣＯ3でＦｍｏｃ−保護し（Ｃａｐａｔｓａｎｉｓら、１９８３）、続いてメチルエステルを選択的加水分解することによって（Ｐａｓｃａｌら、１９９８）調製した（Ｄ−グルタミン酸から順に調製（Ｌｏｍｂａｒｔら、１９９６））。ペプチド合成を０．１ミリモルスケールで行い（２００ｍｇ樹脂）、ＤＭＦ中のピペリジンで脱保護し（１０ｍｌ／ｇ樹脂、２０％ｖ／ｖ、１×２分、１×３分、１×１０分）、続いてＤＭＦで洗浄（１０ｍｌ／ｇ樹脂、５×１分）することによって実施した。ＴＢＴＵのＤＭＦ（０．２５Ｍ、２ｍｌ）溶液に溶解したＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．５ミリモル、５００モル％）を樹脂に加えた。樹脂を撹拌後（５分）、ＤＩＥＡ（０．６ミリモル、６００モル％）を加え、撹拌を１時間継続した。樹脂をＤＭＦで洗浄し（１０ｍｌ／ｇ樹脂、５×１分）、カイザー試験でカップリング効率を測定した。カップリングのあいだ、樹脂を機械的なボルテックス装置で撹拌し、リンスし、配列を脱保護した。Ａｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８カラム（寸法２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で、アセトニトリル／水／ＴＦＡ混合物を用いてＲｐ−ＨＰＬＣ解析を行った。ここで、溶媒Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡである（以下を参照されたい）。流速は０．５ｍｌ／分であり２１４ｎＭで検出した。
【０１７０】
ペプチド模倣薬ＡＰＩ−１０１．１０９（ＫＨ−Ｃ２９０９９）
樹脂を、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、フェノール（５％）、及びトリエチルシラン（２．５％）を含有する２０ｍｌ／ｇのカクテルで処理し、機械的なボルテックス装置で１時間室温にて撹拌することによって、樹脂（１８０ｍｇ）からの切断を、同時に起こる側鎖の脱保護とともに行った。その後、ろ過し、ＴＦＡでリンスし（２×１ｍｌ）、０℃でＥｔ2Ｏ中に沈殿させてペプチドを得た。ＨＣｌ溶液（１Ｍ）からの凍結乾燥によって粗製ペプチドを２塩酸塩として単離し、白色粉末（１８ｍｇ）を得た。これは、Ａ中５〜４０％Ｂの溶離液を用いた２０分にわたるｒｐ−ＨＰＬＣ（ＲＴ＝１４．６分）により純度９０％以上を示した。Ｃ39Ｈ64Ｎ11Ｏ11（ＭＨ+）に対するＬＲＭＳの計算値は８６２、実測値８６２であった。
【０１７１】
ペプチド模倣薬ＡＰＩ−１０１．１１０（ＫＨ−Ｃ５０１１０）
樹脂を、ＴＦＡ（８２．５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、フェノール（５％）、及びトリエチルシラン（２．５％）を含有する２０ｍｌ／ｇのカクテルで処理し、機械的なボルテックス装置で１時間室温にて撹拌することによって、樹脂（２２ｍｇ）からの切断を、同時に起こる側鎖の脱保護とともに行った。その後、ろ過し、ＴＦＡでリンスし（２×１ｍｌ）、０℃でＥｔ2Ｏ中に沈殿させてペプチドを得た。ＨＣｌ溶液（１Ｍ）からの凍結乾燥によって粗製ペプチドを２塩酸塩として単離し、白色粉末（５．７ｍｇ）を得た。これは、Ａ中５〜４０％Ｂの溶離液を用いた２０分にわたるｒｐ−ＨＰＬＣ（ＲＴ＝１９．８分）により純度８５％以上を示した。Ｃ38Ｈ60Ｎ11Ｏ10（ＭＨ+）に対するＬＲＭＳの計算値は８３０、実測値８３０であった。
【０１７２】
結果：
ペプチド模倣薬のスクリーニングアッセイとして、内皮細胞におけるＩＬ−１誘導性ＰＧＥ2合成アッセイを用いた。ペプチド模倣化合物ＡＰＩ−１０１．１１０（図２１）の効能はＩＣ50 ０．２ｐＭであり、これは、ＡＰＩ−１０１．１０７（配列番号１９）よりも１０倍高く、後者の効果の２倍である。化合物ＡＰＩ−１０１．１０９（図２０）もＰＧＥ2の阻害（ＩＣ50）において効能が向上していた（図１９）が、そのＫＤは有効な薬物であるには高すぎる。
【実施例６】
【０１７３】
ラット炎症性大腸炎（ＩＢＤ）モデルにおけるＡＰＩ−１０１．１０、ＡＰＩ−１０１．１０７、及びＡＰＩ−１０１．１１３の効率
これまではＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）と呼んでいたリードペプチドＴＴＩ−１０１．１０、ＴＴＩ−１０１．１０７及びＴＴＩ−１０１．１１３（それぞれ１０１．１０７及び１０１．１１３；又はそれぞれＡＰＩ−１０１．１０７及びＡＰＩ−１０１．１１３ともいう）が実施例４に記載の動物ＩＢＤモデルの炎症特徴を防ぐことができるかどうかを検証するために更なる実験を行った。結腸炎症は、実施例４に記載のように、ハプテンであるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内／結腸投与によって誘発した。ＴＮＢＳ投与前２時間に、ペプチド、ペプチド模倣薬、又は０．９％生理食塩水を尾静脈から静脈内投与した（ｉｖ）（各種濃度、ｍｇ／ｋｇ／日）（合計量０．３ｍｌ）。持続注入の場合、ＡＰＩ−１０１．１０（又は他のペプチド若しくはペプチド模倣薬）（２．２ｍｇ／ｋｇ、さまざまなペプチドのｔ1/2＝２〜３時間に基づいて血圧実験に用いた４回用量）又は０．９％生理食塩水をプライム腹腔内ａｌｚｅｔポンプを用いて持続注入した。第３群（対照）にはＴＮＢＳを注射しなかった。間欠投与の場合、ＴＮＢＳ投与後１５分に１０１．１０（０．２５〜１ｍｇ／ｋｇ）、１０１．１０７（０．２ｍｇ／ｋｇ）、１０１．１１３（０．０５〜１ｍｇ／ｋｇ）を間欠腹腔内注射（ｉｐ）によって投与した。また、これらのＩＬ−１Ｒアンタゴニストは１日２回（ＢＩＤ）投与した；レミケード（登録商標）（抗ＴＮＦα）（１０ｍｇ／ｋｇ）及びデキサメサゾン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与したが、これらは１日１回（ｑｄ）のみである。１０１．１０、１０１．１１３（１及び２．５ｍｇ／ｋｇ）、及び５−ＡＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）をＴＮＢＳ投与後１時間に直腸内投与（ｉｒ）した。５−ＡＳＡは１日１回で、他は１日２回である。最後に、１０１．１０（１〜５ｍｇ／ｋｇ）も１日２回、強制経口投与した（ｐｏ）。ＴＮＢＳ投与後４８時間にＣＯ2吸入によってラットを屠殺した。結腸を取り出し、巨視的に（癒着、潰瘍形成、変色、及び出血）及び組織学的に（好中球浸潤、上皮傷害、陰窩変形、及び潰瘍形成）評価した。処理により、１群あたり１〜７匹の動物を試験した。組織溶解物についてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定した。
【０１７４】
結果：
前述のように、ＴＮＢＳ動物モデルは、クローン病の炎症特徴及び組織傷害を再現するため、ヒトの炎症性疾患の、より詳細には炎症性大腸炎（ＩＢＤ）の有効なｉｎ ｖｉｖｏモデルである。表２に示すように、さまざまな用量で本発明のアンタゴニスト（例えばペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬）を腹腔内持続注射及び間欠注射することにより、潰瘍の形成、陰窩の喪失、及び上皮層傷害などの炎症による組織損傷を妨げた。
【０１７５】
１０１．１０及び１０１．１０７を含有する腹腔内浸透圧ポンプ（持続注入）を受けた動物は、ＭＰＯ活性の顕著な低下、巨視的及び組織学的スコア、キネレットに対する効果の優位性又は同等性を実証した（表２）。１０１．１０、１０１．１０７（１濃度のみ）、及び１０１．１１３の間欠投与は、１日２回投与の用量依存性効果を示した。これは、ＩＢＤに対して近年用いられている薬剤、即ちデキサメサゾン、レミケード（登録商標）、及び５−ＡＳＡによって観察される効果を上回っている。結腸傷害の巨視的観察を採点したところ（４人の盲検観察者）、ペプチドで処理した（ＢＩＤ）動物は癒着及び潰瘍形成が少なかった（ＴＮＢＳ処理動物と比較して５０％未満）。動物は、かなり活力があるようにも見えた。
【０１７６】
【表２】
【０１７７】
【表３】
【０１７８】
図２２は、１つの特定濃度に関する全てのペプチドの巨視的採点と、評価した特徴のリストを図示している。また、図２３からわかるように、ペプチドの間欠注射を受けた動物は、ＴＮＢＳ対照と比較して、好中球浸潤（ミエロペルオキシダーゼアッセイ）が２０〜５０％少なかった。組織切片の検査は、ペプチドで処理した動物は炎症によって誘発された結腸傷害の特徴が少ないことを示した。用いた組織学的傷害採点システムを表３に示し、結果を図２４に図式化する。当然ながら、本発明が関連する分野の熟練技術者によって他の採点システムを用いて適合させることができるであろう。したがって、図２５のパネルＣ及びＤにおける潰瘍及び上皮層傷害の量が、炎症組織を示すパネルＢと比較して減少していることが認識できる。更に、ＴＮＢＳ誘導後１２時間に本発明の物質（例えばペプチド）を投与しても、結腸炎症の減少を示した。残留する高ミエロペルオキシダーゼ活性は、処置前に好中球浸潤が既に発生しているという事実によるものである。
【０１７９】
本発明のペプチド及びペプチド模倣薬は他の手段で投与でき、ＴＮＢＳによって生じた炎症を低下させることを実証するために、ＡＰＩ−１０１．１０及びＡＰＩ−１０１．１１３を直腸内注射した。炎症レベルを上記のように巨視的及び組織学的に評価した。表２からわかるように、２。５ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１０１．１０は、実質的に（５０％）ＭＰＯ活性を低下させ、結腸の組織損傷を部分的に防いだ。
【０１８０】
ＡＰＩ−１０１．１０を他の手段：強制（１日２回）でも投与し、消化管を通るペプチドの安定性を実証した。５．０ｍｇ／ｋｇ／日の濃度のＡＰＩ−１０１．１０は実質的に炎症特徴を軽減し、ＭＰＯ活性を低下させ、本発明の化合物の安定性を立証した。
【実施例７】
【０１８１】
ＴＴＩ−１０１．１０７ペプチド誘導体及び模倣体
ＴＴＩ−１０１．１０７（配列番号１９及び図１５；ＩＣ50 １．２ｐＭ）をリードペプチドとして用い、いくつかのアナログシリーズをデザインし、合成し、試験して、各残基の重要性を証明した。
【０１８２】
構造と活性の対比：
表４からわかるように、末端Ｄ−アルギニンをアセチル化して化合物ＴＴＩ−１０１．１２１（配列番号２９）を生じた場合、ペプチドの活性は完全に消失した。一方、アルギニン残基をオルニチン又はリジンで置換することもでき、得られたペプチドはその活性を維持する（ＴＴＩ−１０１．１１４、配列番号２２；及びＴＴＩ−１０１．１１５、配列番号２３）。したがって、アルギニンのグアニジン基は（オルニチンが有するように）、ペプチド活性に重要であると思われる。
【０１８３】
ペプチドＴＴＩ−１０１．１０５（配列番号１７）及び１０１．１０６（配列番号８）、並びにペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１．１０９を用いて、上記Ｄ−スレオニン残基及びＤ−バリン残基の置換によって得たデータ（図１５及び図１９を参照されたい）から、これらの残基について曲がった領域の可能性の仮説を立て、（３Ｒ，６Ｒ，９Ｒ；ＴＴＩ−１０１．１１０）及び（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ；ＴＴＩ−１０１．１１２）−インドリジジン−２−オン アミノ酸（Ｒ−及びＳ−Ｉ2ａａ）を導入することによって２つのペプチド模倣体を作製した。図２６に示すこれらのペプチド模倣薬は、それぞれＩＩ型及びＩＩ’型βターンを模倣する。ペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１．１１０は、それが由来するペプチド１０１．１０７と比較して、１０ｐＭの活性を示した（図２６）。
【０１８４】
それぞれグルタミン酸をアスパラギン酸、アスパラギン、及びアラニンに置換したＴＴＩ−１０１．１１７（配列番号２５）、ＴＴＩ−１０１．１１８（配列番号２６）、及びＴＴＩ−１０１．１２３（配列番号３１）を用いてグルタミン酸位置の重要性に取り組んだ。結果は、カルボン酸又はカルボキサミドの除去はペプチド機能に有害であることを示している（表４）。
【０１８５】
Ｃ末端Ｄ−ロイシニル−Ｄ−アラニン残基の検査により、欠失及び置換を有する一連の誘導体を作製した：ＴＴＩ−１０１．１１３（配列番号２１）；ＴＴＩ−１０１．１１９（配列番号２７）、及びＴＴＩ−１０１．１２０（配列番号２８）。Ｄ−アラニン残基の欠失により、７〜３０ｐＭの活性を有するヘキサペプチドＴＴＩ−１０１．１１３（（配列番号２１）表４）を生じた。ロイシン残基の修飾により活性範囲が消失した。
【０１８６】
上記データに基づいて、２つの他の模倣体化合物を合成した（図２６を参照されたい）：ＴＴＩ−１０１．１２４（ＩＣ50 ２．４μＭ及び効果１００％を示したｒｙ［Ｒ−Ｉ2ａａ］ｅｌ；図２６）及びＴＴＩ−１０１．１２５（ＩＣ50 ９０ｐＭ及び効果１００％を示した（Ｄ−ｏｒｎ）ｙ［Ｒ−Ｉ2ａａ］ｅｌａ；図２６）。
【０１８７】
１０１．１１３ペプチドの誘導体
リードペプチド（１０１．１０７ ｒｙｔｐｅｌａ（配列番号１９）、１０１．１０ ｒｙｔｖｅｌａ（配列番号１０）、及び１０１．１１３ ｒｙｔｐｅｌ（配列番号２１））に基づいて、他のアナログシリーズを作製し、ペプチドと誘導体の構造−活性関係（構造−機能関係）を更に試験した。
【０１８８】
塩基性アミノ酸の末端アルギニンの重要性を探究したところ、一連のアナログは、グアニジン部分を塩基性アミンに置換すると活性が比較的低下したことを示した。実際、化合物ＴＴＩ−１０１．１２６（配列番号３２）、ＴＴＩ−１０１．１３３（配列番号３７）、及びＴＴＩ−１０１．１３４（配列番号３８）は、ほとんど又は全く活性を示さなかった（表５）。ＴＴＩ−１０１．１３５（配列番号３９）のように立体化学を反転させた場合、配列番号２１のＤ−アミノ酸とは対照的にアルギニン「Ｒ」はＬ−アミノ酸であるが、活性が低下したが完全には消失しなかった（表５）。
【０１８９】
表５に更に示すように、ペプチド１０１．１１３の活性も、フェノール基を有する芳香族残基チロシンを芳香族残基のフェニルアラニン（１０１．１３２；配列番号３６）又はトリプトファン（１０１．１２８；配列番号３４）で置換すると比較的低下した。ＴＴＩ−１０１．１２７（配列番号３３）のヒドロキシル基を除去するとペプチドの活性は完全に無効になったが、チロシンをトリプトファンで置換すると低下したが活性を維持した。
【０１９０】
Ｃ末端のロイシンをバリンで置換しても活性が低下した。これは、ＴＴＩ−１０１．１２９（配列番号３５）（ｒｙｔｐｅｖ ４００ｎＭ；５０％）を用いた表５において見られるように、疎水性残基の長さの重要性を実証している。
【０１９１】
リードペプチド模倣薬（ＴＴＩ−１０１．１２５；図２６）に基づいて、他の模倣薬シリーズを調製し、本発明の化合物の構造−活性を更に探究した。
チロシンをロイシン及びアラニン残基にそれぞれ置換するためにアザ−アミノ酸残基を用いて、１０１．１３６〜１０１．１４０と１０１．１４１〜１０１．１４４のシリーズを調製した（図２７及び２８）。アザ−アミノ酸は酵素分解に対するペプチドの耐性を改善することができるため、特定のアナログにおける活性の維持はそのｉｎ ｖｉｖｏ作用期間を延長させるための１つの手段を例示する。こうした最後の修飾により、化合物ＴＴＩ−１０１．１４０の開発をもたらした。図２９及び図３０は、ペプチド模倣薬１０１．１２５、１０１．１３６〜１０１．１４４の構造と活性、特に活性が増加した模倣薬１０１−１４０の効能と効果を示す。
【０１９２】
【表４】
【０１９３】
【表５】
【０１９４】
結論
要約すると、本発明は、インターロイキン１のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏの効果を無効にできる、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体の効率的且つ強力なアンタゴニストについて記載する。これらのペプチドは、さまざまな細胞種及びさまざまな生体効果（増殖及びＰＧＥ2合成）に対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有効であり、ＩＬ−１の軟膜血管に対する血管運動作用及び新鮮なサンプル組織のＰＧＥ2合成を無効にすることによってｅｘ ｖｉｖｏで有効であった。更に、これらのＡＰＩ−１０１誘導体は、全身投与及び胃に直接投与したときｉｎ ｖｉｖｏでも非常に有効であった。胃への送達によって得た最後の結果は、本発明のペプチドは経口投与したとき活性である可能性があることを示している。これは、強制経口投与したときに実際に証明された。より重要なのは、確立されたラット炎症性大腸炎（ＩＢＤ）モデルにおいて、ＡＰＩ−１０１．１０が、ラットにＴＮＢＳを注射して誘発した結腸損傷を防ぐことができたことである。他の誘導体（１０１．１００シリーズ）による結果に基づいて、これらのペプチド誘導体及びそのペプチド模倣薬は、ラットにＴＮＢＳを注射して誘発した結腸損傷を防ぐ役割によって証明されたように、強力な抗炎症剤であることが証明されている。
【０１９５】
本発明は、本発明のペプチド及びペプチド模倣体は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰに関与する多くの経路に対して明らかな効果を有することを示している。したがって、本発明の治療的及び予防的な可能性は、一般に動物に、より詳細には哺乳動物、特にヒトに広く影響を及ぼす。
【０１９６】
本明細書の開示に基づいて、当該技術分野に熟練した者は、ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体阻害化合物の更なる同定に有用な、ペプチド、ペプチド誘導体、及びペプチド模倣薬のスクリーニングアッセイを開発することができ、あるいは本明細書に例示したものを改良することができる。本発明のアッセイは、ロースループット、ハイスループット、又はウルトラハイスループットのスクリーニング形式のために開発することができる。当然ながら、本発明のアッセイには自動化しやすいアッセイが含まれる。
【０１９７】
したがって、天然アミノ酸を有するペプチドを用いた研究により、本発明は、それらが強力で有効な化合物であることをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験で証明する（例えば、ＴＴＩ−１０１．１０７（配列番号１９）及び１１３（配列番号２１））。更に、本発明は、活性に必要なファーマコフォア及び立体構造、ペプチド及びそれらから生じた模倣薬について初めて記載する。
【０１９８】
注目すべきは、本発明は、非常に顕著な活性（７．４ｐＭ；効果８０％）を有するヘキサペプチドリード：ＴＴＩ−１０１．１１３（ｒｙｔｐｅｌ［配列番号２１］）を提供することである。更に、中央のＤ−スレオニン−ｄ−バリン（Ｄ−Ｐｒｏ）領域を置換するためにインドリジジノンアミノ酸を用いて模倣体又は模倣薬を作製し、それによってリード模倣体ＴＴＩ−１０１．１２５及びＴＴＩ−１０１．１４０の同定を可能にした。
【０１９９】
当然ながら、本発明のアンタゴニストの組み合わせ、又は本発明のアンタゴニストと公知薬物との組み合わせは、本発明の医学的、臨床的、及び薬剤開発の可能性を更に増加させるであろう。
【０２００】
本発明をその具体的態様によって説明しているが、当該技術分野に熟練した者には、本明細書の開示を読むことで、添付の特許請求の範囲に定義したような本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、形態及び細部においてさまざまな改変がなされ得ることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下におけるがん細胞（Ａ５４９）の増殖アッセイを示す。細胞をさまざまな濃度の抗ＩＬ−１Ｒ ＡＰＩ−１０１（配列番号１）ペプチドとともにプレインキュベーションし、次に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで２４時間処理した。次に3Ｈ−チミジンを加えた。２４時間後、細胞を回収し、溶解し、3Ｈ−チミジンを計数した。
【図２】図２は、ＩＬ−１で誘発された微小血管内皮細胞によるＰＧＥ2合成に対する抗ＩＬ−１Ｒペプチドの阻害活性を示す。細胞をペプチドと共に４５分間プレインキュベーションし、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト組換えＩＬ−Ｉβと共にインキュベーションした。ＰＧＥ2合成は増殖培地中で測定した。
【図３】図３は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの存在下、ＡＰＩ−１０１（配列番号１）ペプチドを用いた微小血管内皮細胞のＰＧＥ2合成の用量反応曲線を示す。
【図４】図４は、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β並びに抗ＩＬ−１Ｒ ＡＰＩ−１０１（配列番号１）及びＡＰＩ−１０８ペプチド存在下における軟膜微小血管の血管拡張の用量反応曲線を示す。
【図５】図５は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）及びアラニンをスキャンしたペプチド（１０-6Ｍ）の存在下におけるブタ微小血管内皮細胞（Ａ）及びヒト軟骨細胞（Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＧＥ2合成を示す。
【図６】図６は、ＩＬ−１βによって誘発される（１００ｎｇ／ｍｌ）軟膜微小血管の血管拡張の、最も活性なＡＰＩ−１０１（配列番号１）のアラニンをスキャンしたペプチドを用いたｅｘ ｖｉｖｏ逆転を示す。
【図７】図７は、ＡＰＩペプチドに関する最適化スキームの説明を示す。
【図８】図８は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）及び短鎖型ＡＰＩ−１０１（配列番号１）誘導体の存在下、ヒト肺線維芽細胞（ＷＩ−３８）に対して行った増殖アッセイを示す。
【図９】図９は、ＡＰＩ−１０１ペプチドの誘導体の、ＷＩ−３８細胞（Ａ）；及び脳微小血管内皮細胞（Ｂ）に対する細胞障害性を示す（１０-5Ｍ、ＭＴＴアッセイ）。
【図１０】図１０は、ＩＬ−１β（７５ｎｇ／ｍｌ）で誘発されたラット動脈血管拡張の、ＡＰＩ−１０１誘導体：ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）及びＡＰＩ−１０１．１２（配列番号１２）を両ペプチドとも１０-5Ｍ〜１０-10Ｍの濃度範囲で用いた存在下における用量反応曲線を示す。
【図１１】図１１は、ラットにおけるＡＰＩ−１０１ペプチドの全身投与によるＩＬ−１βで誘発された全身性低血圧及び血清ＰＧＥ2合成のｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す。（Ａ）平均血圧（ＭＢＰ）はＩＬ−１β及び／又はペプチド１０１．１０（１０-5Ｍ）の存在下で減少する。（Ｂ）ＩＬ−１β及びペプチド１０１．１０（１０-5Ｍ）の存在下で血清ＰＧＥ2合成の調節が増加する。
【図１２】図１２は、ラットにおけるＡＰＩ−１０１．１０の腸内注射の、ＩＬ−１βで誘発された低血圧及びＰＧＥ2合成に対する効果を示す。Ａ）平均血圧（ＭＢＰ）はＩＬ−１β及び／又はペプチド１０１．１０の存在下で低下する。Ｂ）ＩＬ−１β及びペプチド１０１．１０の存在下で血清ＰＧＥ2合成の調節が増す。
【図１３】図１３は、更なる最適化のためにデザインされたＡＰＩ−１０１．１０ペプチド誘導体の配列を示す。
【図１４】図１４は、ラット炎症性大腸炎モデルにおけるＡＰＩ−１０１．１０ペプチドの効果を示す（全身）（肉眼検査）。（Ａ）生理食塩水、（Ｂ）ＴＮＢＳ＋生理食塩水、及び（Ｃ）ＴＮＢＳ＋ＡＰＩ−１０１．１０（２．２ｍｇ／ｋｇ／日）。
【図１５】図１５は、微小血管内皮細胞及びＷＩ−３８ヒト線維芽細胞におけるＩＬ−１βで誘発されたＰＧＥ2合成のｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド阻害による１０１．１０ペプチド誘導体の特性を示す（ＩＣ50及び最大効率（Ｅmax）を示す）。
【図１６】図１６は、ＴＮＢＳで誘発されたラット炎症性大腸炎モデルにおけるＡＰＩ−１０１．１０の治療効果を示す（組織学）。（Ａ）生理食塩水、（Ｂ）ＴＮＢＳ（１２０ｍｇ／ｍｌ）＋生理食塩水、（Ｃ）ＴＮＢＳ＋ＡＰＩ−１０１．１０（１．１ｍｇ／ｋｇ／日）。
【図１７】図１７は、ブタの内皮細胞及び軟骨細胞におけるＡＰＩ−１０１誘導体の特性（ＩＬ−１βで誘発されたＰＧＥ2産生に対する阻害活性）を示す。
【図１８】図１８は、ＡＰＩ−１０１誘導体の特性（ＩＣ50及び最大効率）を示す。
【図１９】図１９は、ブタ微小血管内皮細胞において、さまざまなペプチド模倣体の存在下、ＩＬ−１で誘発されたＰＧＥ2合成に関する用量反応アッセイを示す。
【図２０】図２０は、ＡＰＩ−１０１．１０９（「Ｃ２０９９」ｒｙ（ＨｙＶａｌ）ｐｅｌａ）及びＡＰＩ−１０１．１１１ペプチド模倣体の構造を示す。
【図２１】図２１は、ＡＰＩ−１０１．１１０ペプチド模倣体の構造を示す。
【図２２】図２２は、ラット炎症性大腸炎モデルにおけるペプチド１０１．１０、１０１．１０７、及び１０１．１１３の腹腔内注射に反応した結腸損傷の巨視的評価を示す。
【図２３】図２３は、ラット炎症性大腸炎モデル（４８：００）における腹腔内注射されたペプチド１０１．１０、１０１．１０７、及び１０１．１１３の、組織好中球浸潤（ＭＰＯアッセイ）に対する効果を示す。
【図２４】図２４は、ＴＮＢＳで誘発されたラット炎症性大腸炎モデルにおけるペプチド１０１．１０、１０１．１０７、及び１０１．１１３の腹腔内注射に反応した組織学的評価及び組織損傷の採点を示す。
【図２５】図２５は、ＴＮＢＳ並びにＴＴＩ−１０１．１０及び１０１．１０７で処理した結腸組織の組織切片の写真を示す。パネルＡ） 対照（未処理）；Ｂ） ＴＮＢＳで処理した動物；Ｃ） ＴＮＢＳで処理し、１０１．１０（１．０ｍｇ／ｋｇ／日）ペプチドを腹腔内注射した動物；Ｄ） １０１．１０７（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射した動物。
【図２６Ａ】図２６は、ＴＴＩ−１０１．１１０の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２６Ｂ】図２６は、ＴＴＩ−１０１．１１０の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２７Ａ】図２７は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造を示す。
【図２７Ｂ】図２７は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造を示す。
【図２８Ａ】図２８は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造を示す。
【図２８Ｂ】図２８は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造を示す。
【図２９−１】図２９は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２９−２】図２９は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図２９−３】図２９は、ＴＴＩ−１０１．１２５の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図３０−１】図３０は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図３０−２】図３０は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【図３０−３】図３０は、ＴＴＩ−１０１．１２５の他の模倣誘導体の構造及び特性の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を有する単離化合物であって：
（ａ）アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸを含むペプチド、式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される；及び
（ｂ）ペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を維持する（ａ）の誘導体、
から成る群より選択される、前記化合物。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を有する単離化合物であって：
（ａ）アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸから成るペプチド、式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される；及び
（ｂ）ペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を維持する、（ａ）の誘導体、
から成る群より選択される、前記化合物。
【請求項３】
配列番号１（ＡＰＩ−１０１）、配列番号２（ＡＰＩ−１０１．１）、配列番号３（ＡＰＩ−１０１．２）、配列番号４（ＡＰＩ−１０１．３）、配列番号５（ＡＰＩ−１０１．４）、配列番号６（ＡＰＩ−１０１．５）、配列番号７（ＡＰＩ−１０１．６）、配列番号８（ＡＰＩ−１０１．７）、配列番号９（ＡＰＩ−１０１．９）、配列番号１０（ＡＰＩ−１０１．１０）、配列番号１１（ＡＰＩ−１０１．１１）、配列番号１３（ＡＰＩ−１０１．１０１）、配列番号１４（ＡＰＩ−１０１．１０２）、配列番号１５（ＡＰＩ−１０１．１０３）、配列番号１６（ＡＰＩ−１０１．１０４）、配列番号１７（ＡＰＩ−１０１．１０５）、配列番号１８（ＡＰＩ−１０１．１０６）、配列番号１９（ＡＰＩ−１０１．１０７）、配列番号２０（ＡＰＩ−１０１．１０８）、配列番号２１（ＡＰＩ−１０１．１１３）、配列番号２２（ＡＰＩ−１０１．１１４）、配列番号２３（ＡＰＩ−１０１．１１５）、配列番号２４（ＡＰＩ−１０１．１１６）、配列番号２５（ＡＰＩ−１０１．１１７）、配列番号２６（ＡＰＩ−１０１．１１８）、配列番号２７（ＡＰＩ−１０１．１１９）、配列番号２８（ＡＰＩ−１０１．１２０）、配列番号２９（ＡＰＩ−１０１．１２１）、配列番号３０（ＡＰＩ−１０１．１２２）、配列番号３１（ＡＰＩ−１０１．１２３）、配列番号３２（ＡＰＩ−１０１．１２６）、配列番号３３（ＡＰＩ−１０１．１２７）、配列番号３４（ＡＰＩ−１０１．１２８）、配列番号３５（ＡＰＩ−１０１．１２９）、配列番号３６（ＡＰＩ−１０１．１３２）、配列番号３７（ＡＰＩ−１０１．１３３）、配列番号３８（ＡＰＩ−１０１．１３４）、配列番号３９（ＡＰＩ−１０１．１３５）から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
アミノ酸配列が、ＡＰＩ−１０１．１１３（配列番号２１）、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）、ＡＰＩ−１０１．１１４（配列番号２２）、ＡＰＩ−１０１．１１７（配列番号２５）、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）、ＡＰＩ−１０１．１０６（配列番号１８）、ＡＰＩ−１０１．１１６（配列番号２４）、ＡＰＩ−１０１．１０８（配列番号２０）、ＡＰＩ−１０１．１３５（配列番号３９）、ＡＰＩ−１０１．１２８（配列番号３４）、ＡＰＩ−１０１．９（配列番号９）、ＡＰＩ−１０１．１０５（配列番号７）、ＡＰＩ−１０１．１２９（配列番号３５）、ＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）、ＡＰＩ−１０１．１２（配列番号１２）、及びＡＰＩ−１０１．１３２（配列番号３６）から成る群より選択される、請求項３に記載の単離化合物。
【請求項５】
アミノ酸配列が、ＡＰＩ−１０１．１１３（配列番号２１）、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）、ＡＰＩ−１０１．１１４（配列番号２２）、ＡＰＩ−１０１．１１７（配列番号２５）、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）から成る群より選択される、請求項４に記載の単離化合物。
【請求項６】
アミノ酸配列が配列番号２１（ＡＰＩ−１０１．１１３）の配列である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ活性に関与するシグナル伝達経路の異常に関連する動物の疾患又は病態を治療又は予防するための方法であって、動物に治療的に有効量の請求項１又は２に記載のペプチドアンタゴニスト又はその誘導体を投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体活性に関与するシグナル伝達経路の異常に関連する動物の疾患又は病態を治療又は予防するための医薬組成物であって、有効量の請求項１又は２に記載のペプチドアンタゴニスト又はその誘導体を、医薬的に許容可能な賦形剤とともに含む、前記医薬組成物。
【請求項９】
治療的に有効量の少なくとも１つの請求項１又は２に記載のペプチドを、医薬的に許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項１０】
疾患又は病態がＩＬ−１関連疾患又は病態である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
疾患又は病態が炎症性疾患又は病態である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、変形性関節症、乾癬、及び敗血症から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
疾患が、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、多発性硬化症、脳炎、及び自己免疫疾患から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
動物がヒトの患者である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
動物がヒトの患者である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
疾患又は病態が、ＩＬ−１関連疾患又は病態である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
アンタゴニストが、ＩＬ−１で誘導されるＰＧＥ2産生を阻害する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項１８】
ペプチド又はその誘導体が少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項１９】
ペプチド又はその誘導体のアミノ酸配列が、天然又は逆の立体配置であり、ペプチド又はその誘導体が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、及びその混合物から成る群より選択されるアミノ酸を含有する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項２０】
ペプチド又はその誘導体が、非競合的、効率的、及び選択的である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項２１】
一般式Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2を有するＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰのペプチド模倣薬アンタゴニストであって、式中、
Ｒ1は、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、及びＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）から成る群より選択され；
ａａ1は、残基なし、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、及びアルギニン代用物から成る群より選択され；
ａａ2は、残基なし、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、トリプトファン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、及び４−クロロフェニルアラニンから成る群より選択され；
ａａ3は、残基なし、スレオニン、セリン、β−ヒドロキシバリン、アロスレオニン、バリン、ｔｅｒｔ−ブチルロイシン、ロイシン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、及びアラニンから成る群より選択され；
ａａ4は、残基なし、バリン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、及び２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸から成る群より選択され；
ａａ5は、残基なし、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、及びα−アミノアジピン酸から成る群より選択され；
ａａ6は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
ａａ7は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
Ｒ2は、残基なし、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され、
ペプチド模倣薬はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害する、前記アンタゴニスト。
【請求項２２】
一般式Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2を有するペプチド模倣薬アンタゴニストであって、式中、
Ｒ1は、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、及びＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）から成る群より選択され；
ａａ1は、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、及びアルギニン代用物から成る群より選択され；
ａａ2は、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、トリプトファン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、及び４−クロロフェニルアラニンから成る群より選択され；
ａａ3は、スレオニン、セリン、β−ヒドロキシバリン、アロスレオニン、バリン、ｔｅｒｔ−ブチルロイシン、ロイシン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、及びアラニンから成る群より選択され；
ａａ4は、バリン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、及び２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸から成る群より選択され；
ａａ5は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、及びα−アミノアジピン酸から成る群より選択され；
ａａ6は、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
ａａ7は、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
Ｒ2は、残基なし、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され、
ペプチド模倣薬はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害する、請求項２１に記載のアンタゴニスト。
【請求項２３】
Ｒ1のＲＣＯ−基が、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、イソプロパノイル、及びイソブタノイルから成る群より選択される、請求項２１又は２２に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２４】
アルギニン代用物が、４−アミジノフェニルアセチル、４−アミジノフェニルプロピオニル、４−アミジノフェニルグリシル、４−アミジノフェニルメチルグリシル、４−グアニジノフェニルアセチル、４−グアニジノフェニルプロピオニル、４−グアニジノフェニルグリシル、及び４−グアニジノフェニルメチルグリシルから成る群より選択される、請求項２１、２２、又は２３に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２５】
一体となったａａ3−ａａ4が、３−アミノインドリジジン−２−オン ９−カルボン酸、３−アミノピロリジジン−２−オン ８−カルボン酸、３−アミノキノリジジン−２−オン １０−カルボン酸、８−アミノインドリジジン−９−オン ２−カルボン酸、ジペプチド代用物、及びβ−ターン模倣体から成る群より選択される、請求項２１、２２、２３、又は２４に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２６】
ａａ6、ａａ7、及びＲ2の脂肪族アミンが、独立して、メチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、及びシクロヘキシルアミンから成る群より選択される、請求項２１、２２、２３、２４、又は２５に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２７】
ａａ6及びａａ7の芳香族アミン又はアリールアルキルアミンが、独立して、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、及びフェニルエチルアミンから成る群より選択される、請求項２１、２２、２３、２４、２５、又は２６に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２８】
Ｒ−立体配置及びＳ−立体配置から成る群より選択される立体化学的立体配置を有する、請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２９】
オレフィンが、シス配置又はトランス配置である、請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３０】
一般配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、キラルα炭素が窒素で置換された、そのアザアミノ酸対応物である、請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３１】
アザアミノ酸対応物が、アザアラニン、アザチロシン、及びアザフェニルアラニンから成る群より選択される、請求項３０に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３２】
図２０、２１、２６、２７、２８、２９、又は３０のうちの１つに示した構造を有する、請求項２１に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３３】
ペプチド模倣薬が、図２５、２６、又は２９に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１２５；図２９に示した構造を有するペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１．１４０；図３０に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１４１；図２６に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１１０；図２０に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１１１；図２７又は２９に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１３６；図３０に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１４３から成る群より選択される、請求項３２に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３４】
ＴＴ１−１０１．１４０、ＴＴ１−１０１．１４１、ＴＴ１−１０１．１２５、ＴＴ１−１０１．１４０；及びＴＴ１−１０１．１１０から成る群より選択される、請求項３３に記載のペプチド模倣薬。
【請求項３５】
式Ｉ：Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5
に記載のアミノ酸配列を含むＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１ＲａｃＰペプチドアンタゴニスト又はその誘導体であって、式中、
Ｘは、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ａ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ａ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ａ4、Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ｒ3Ｙ4、ＺＹ4、Ｒ3Ｆ4、及びＹ4から成る群より選択され（式中、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、及びＦは対応のアミノ酸を表し、数はＡ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4配列中のアミノ酸の位置を表し、Ｚはシトルリンである）；
ａ）Ａ1は、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、及びφから成る群より選択され（ここで、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する）；
ｂ）Ｐ2は、プロリン、アラニン、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（ＭｅＡｌａ）、トランス−４−ヒドロキシプロリン、ジエチルチアゾリジン カルボン酸（Ｄｔｃ）、及びΩから成る群より選択され（ここで、Ωは構造制約を生じるアミノ酸を定義する）；
ｃ）Ｒ3は、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、４−ピリジルアラニン、及びアルギニン代用物から成る群より選択され；
ｄ）Ｙ4は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、４−シクロフェニルアラニン、及びΣから成る群より選択され（ここで、Σは疎水性側鎖又は芳香族側鎖を有するα−アミノ酸を定義する）；
ａａ1は、スレオニン、セリン、バリン、及びηから成る群より選択され（ここで、ηは中性親水性アミノ酸を定義する）；
ａａ2は、イソロイシン、ロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸、及びφから成る群より選択され（ここで、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する）；
ａａ3は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、α−アミノアジピン酸、芳香族アミン、及びΨから成る群より選択され（ここで、Ψは疎水性側鎖を有する３−アミノ−５−フェニルペンタン酸−α−アミノ酸）；
ａａ4は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから成る群より選択され（ここで、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義する）；
ａａ5は、残基なし、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから成る群より選択され（ここで、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義する）、
ペプチド又はその誘導体はＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害する、前記ペプチドアンタゴニスト又はその誘導体。
【請求項３６】
式ＩＩ：Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5
に記載のアミノ酸配列を含むペプチドアンタゴニストであって、
式中、Ｇ1は、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、ＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）、及び３級アミンから成る群より選択される、請求項３５に記載のペプチドアンタゴニスト。
【請求項３７】
式ＩＩＩ：Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2
に記載のアミノ酸配列を含むペプチドアンタゴニストであって、
式中、Ｇ2は、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、アリールアルキルアミン、及び３級アミンから成る群より選択される、請求項３５に記載のペプチドアンタゴニスト。
【請求項３８】
式ＩＶ：Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2
に記載のアミノ酸配列を含むペプチドアンタゴニストであって、
式中、Ｇ1は、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、ＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）、３級アミンから成る群より選択より選択され、Ｇ2は、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、アリールアルキルアミン、及び３級アミンから成る群より選択される、請求項３５に記載のペプチドアンタゴニスト。
【請求項１】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を有する単離化合物であって：
（ａ）アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸを含むペプチド、式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される；及び
（ｂ）ペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を維持する（ａ）の誘導体、
から成る群より選択される、前記化合物。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を有する単離化合物であって：
（ａ）アミノ酸配列ＲＹＴＰＥＬＸから成るペプチド、式中、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｐ、Ｅ、Ｌは対応のアミノ酸を表し、Ｘはアミノ酸なし及びアラニン（Ａ）から選択される；及び
（ｂ）ペプチドのＲＹＴＰＥＬ部分にアミノ酸の付加、欠失、又は置換から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸修飾を組み込み、且つそのＩＬ−１Ｒアンタゴニスト活性を維持する、（ａ）の誘導体、
から成る群より選択される、前記化合物。
【請求項３】
配列番号１（ＡＰＩ−１０１）、配列番号２（ＡＰＩ−１０１．１）、配列番号３（ＡＰＩ−１０１．２）、配列番号４（ＡＰＩ−１０１．３）、配列番号５（ＡＰＩ−１０１．４）、配列番号６（ＡＰＩ−１０１．５）、配列番号７（ＡＰＩ−１０１．６）、配列番号８（ＡＰＩ−１０１．７）、配列番号９（ＡＰＩ−１０１．９）、配列番号１０（ＡＰＩ−１０１．１０）、配列番号１１（ＡＰＩ−１０１．１１）、配列番号１３（ＡＰＩ−１０１．１０１）、配列番号１４（ＡＰＩ−１０１．１０２）、配列番号１５（ＡＰＩ−１０１．１０３）、配列番号１６（ＡＰＩ−１０１．１０４）、配列番号１７（ＡＰＩ−１０１．１０５）、配列番号１８（ＡＰＩ−１０１．１０６）、配列番号１９（ＡＰＩ−１０１．１０７）、配列番号２０（ＡＰＩ−１０１．１０８）、配列番号２１（ＡＰＩ−１０１．１１３）、配列番号２２（ＡＰＩ−１０１．１１４）、配列番号２３（ＡＰＩ−１０１．１１５）、配列番号２４（ＡＰＩ−１０１．１１６）、配列番号２５（ＡＰＩ−１０１．１１７）、配列番号２６（ＡＰＩ−１０１．１１８）、配列番号２７（ＡＰＩ−１０１．１１９）、配列番号２８（ＡＰＩ−１０１．１２０）、配列番号２９（ＡＰＩ−１０１．１２１）、配列番号３０（ＡＰＩ−１０１．１２２）、配列番号３１（ＡＰＩ−１０１．１２３）、配列番号３２（ＡＰＩ−１０１．１２６）、配列番号３３（ＡＰＩ−１０１．１２７）、配列番号３４（ＡＰＩ−１０１．１２８）、配列番号３５（ＡＰＩ−１０１．１２９）、配列番号３６（ＡＰＩ−１０１．１３２）、配列番号３７（ＡＰＩ−１０１．１３３）、配列番号３８（ＡＰＩ−１０１．１３４）、配列番号３９（ＡＰＩ−１０１．１３５）から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
アミノ酸配列が、ＡＰＩ−１０１．１１３（配列番号２１）、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）、ＡＰＩ−１０１．１１４（配列番号２２）、ＡＰＩ−１０１．１１７（配列番号２５）、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）、ＡＰＩ−１０１．１０６（配列番号１８）、ＡＰＩ−１０１．１１６（配列番号２４）、ＡＰＩ−１０１．１０８（配列番号２０）、ＡＰＩ−１０１．１３５（配列番号３９）、ＡＰＩ−１０１．１２８（配列番号３４）、ＡＰＩ−１０１．９（配列番号９）、ＡＰＩ−１０１．１０５（配列番号７）、ＡＰＩ−１０１．１２９（配列番号３５）、ＡＰＩ−１０１．１１（配列番号１１）、ＡＰＩ−１０１．１２（配列番号１２）、及びＡＰＩ−１０１．１３２（配列番号３６）から成る群より選択される、請求項３に記載の単離化合物。
【請求項５】
アミノ酸配列が、ＡＰＩ−１０１．１１３（配列番号２１）、ＡＰＩ−１０１．１０３（配列番号１５）、ＡＰＩ−１０１．１１４（配列番号２２）、ＡＰＩ−１０１．１１７（配列番号２５）、ＡＰＩ−１０１．１０（配列番号１０）から成る群より選択される、請求項４に記載の単離化合物。
【請求項６】
アミノ酸配列が配列番号２１（ＡＰＩ−１０１．１１３）の配列である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ活性に関与するシグナル伝達経路の異常に関連する動物の疾患又は病態を治療又は予防するための方法であって、動物に治療的に有効量の請求項１又は２に記載のペプチドアンタゴニスト又はその誘導体を投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
ＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ受容体活性に関与するシグナル伝達経路の異常に関連する動物の疾患又は病態を治療又は予防するための医薬組成物であって、有効量の請求項１又は２に記載のペプチドアンタゴニスト又はその誘導体を、医薬的に許容可能な賦形剤とともに含む、前記医薬組成物。
【請求項９】
治療的に有効量の少なくとも１つの請求項１又は２に記載のペプチドを、医薬的に許容可能な賦形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項１０】
疾患又は病態がＩＬ−１関連疾患又は病態である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
疾患又は病態が炎症性疾患又は病態である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、変形性関節症、乾癬、及び敗血症から成る群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
疾患が、アルツハイマー病、脳室周囲白質軟化症、髄膜炎、卒中、多発性硬化症、脳炎、及び自己免疫疾患から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
動物がヒトの患者である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
動物がヒトの患者である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
疾患又は病態が、ＩＬ−１関連疾患又は病態である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
アンタゴニストが、ＩＬ−１で誘導されるＰＧＥ2産生を阻害する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項１８】
ペプチド又はその誘導体が少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項１９】
ペプチド又はその誘導体のアミノ酸配列が、天然又は逆の立体配置であり、ペプチド又はその誘導体が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、及びその混合物から成る群より選択されるアミノ酸を含有する、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項２０】
ペプチド又はその誘導体が、非競合的、効率的、及び選択的である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項２１】
一般式Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2を有するＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰのペプチド模倣薬アンタゴニストであって、式中、
Ｒ1は、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、及びＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）から成る群より選択され；
ａａ1は、残基なし、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、及びアルギニン代用物から成る群より選択され；
ａａ2は、残基なし、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、トリプトファン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、及び４−クロロフェニルアラニンから成る群より選択され；
ａａ3は、残基なし、スレオニン、セリン、β−ヒドロキシバリン、アロスレオニン、バリン、ｔｅｒｔ−ブチルロイシン、ロイシン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、及びアラニンから成る群より選択され；
ａａ4は、残基なし、バリン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、及び２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸から成る群より選択され；
ａａ5は、残基なし、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、及びα−アミノアジピン酸から成る群より選択され；
ａａ6は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
ａａ7は、残基なし、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
Ｒ2は、残基なし、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され、
ペプチド模倣薬はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害する、前記アンタゴニスト。
【請求項２２】
一般式Ｒ1−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−ａａ6−ａａ7−Ｒ2を有するペプチド模倣薬アンタゴニストであって、式中、
Ｒ1は、残基なし、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、及びＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）から成る群より選択され；
ａａ1は、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、及びアルギニン代用物から成る群より選択され；
ａａ2は、チロシン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、トリプトファン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、及び４−クロロフェニルアラニンから成る群より選択され；
ａａ3は、スレオニン、セリン、β−ヒドロキシバリン、アロスレオニン、バリン、ｔｅｒｔ−ブチルロイシン、ロイシン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、及びアラニンから成る群より選択され；
ａａ4は、バリン、プロリン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、及び２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸から成る群より選択され；
ａａ5は、アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、及びα−アミノアジピン酸から成る群より選択され；
ａａ6は、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
ａａ7は、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され；
Ｒ2は、残基なし、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、及びアリールアルキルアミンから成る群より選択され、
ペプチド模倣薬はＩＬ−１Ｒ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害する、請求項２１に記載のアンタゴニスト。
【請求項２３】
Ｒ1のＲＣＯ−基が、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、イソプロパノイル、及びイソブタノイルから成る群より選択される、請求項２１又は２２に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２４】
アルギニン代用物が、４−アミジノフェニルアセチル、４−アミジノフェニルプロピオニル、４−アミジノフェニルグリシル、４−アミジノフェニルメチルグリシル、４−グアニジノフェニルアセチル、４−グアニジノフェニルプロピオニル、４−グアニジノフェニルグリシル、及び４−グアニジノフェニルメチルグリシルから成る群より選択される、請求項２１、２２、又は２３に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２５】
一体となったａａ3−ａａ4が、３−アミノインドリジジン−２−オン ９−カルボン酸、３−アミノピロリジジン−２−オン ８−カルボン酸、３−アミノキノリジジン−２−オン １０−カルボン酸、８−アミノインドリジジン−９−オン ２−カルボン酸、ジペプチド代用物、及びβ−ターン模倣体から成る群より選択される、請求項２１、２２、２３、又は２４に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２６】
ａａ6、ａａ7、及びＲ2の脂肪族アミンが、独立して、メチルアミン、イソブチルアミン、イソバレリルアミン、及びシクロヘキシルアミンから成る群より選択される、請求項２１、２２、２３、２４、又は２５に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２７】
ａａ6及びａａ7の芳香族アミン又はアリールアルキルアミンが、独立して、アニリン、ナフチルアミン、ベンジルアミン、シンナミルアミン、及びフェニルエチルアミンから成る群より選択される、請求項２１、２２、２３、２４、２５、又は２６に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２８】
Ｒ−立体配置及びＳ−立体配置から成る群より選択される立体化学的立体配置を有する、請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項２９】
オレフィンが、シス配置又はトランス配置である、請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３０】
一般配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、キラルα炭素が窒素で置換された、そのアザアミノ酸対応物である、請求項２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３１】
アザアミノ酸対応物が、アザアラニン、アザチロシン、及びアザフェニルアラニンから成る群より選択される、請求項３０に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３２】
図２０、２１、２６、２７、２８、２９、又は３０のうちの１つに示した構造を有する、請求項２１に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３３】
ペプチド模倣薬が、図２５、２６、又は２９に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１２５；図２９に示した構造を有するペプチド模倣薬ＴＴＩ−１０１．１４０；図３０に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１４１；図２６に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１１０；図２０に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１１１；図２７又は２９に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１３６；図３０に示した構造を有するＴＴＩ−１０１．１４３から成る群より選択される、請求項３２に記載のペプチド模倣薬アンタゴニスト。
【請求項３４】
ＴＴ１−１０１．１４０、ＴＴ１−１０１．１４１、ＴＴ１−１０１．１２５、ＴＴ１−１０１．１４０；及びＴＴ１−１０１．１１０から成る群より選択される、請求項３３に記載のペプチド模倣薬。
【請求項３５】
式Ｉ：Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5
に記載のアミノ酸配列を含むＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１ＲａｃＰペプチドアンタゴニスト又はその誘導体であって、式中、
Ｘは、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ａ2Ｒ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ａ3Ｙ4、Ａ1Ｐ2Ｒ3Ａ4、Ｐ2Ｒ3Ｙ4、Ｒ3Ｙ4、ＺＹ4、Ｒ3Ｆ4、及びＹ4から成る群より選択され（式中、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｙ、及びＦは対応のアミノ酸を表し、数はＡ1Ｐ2Ｒ3Ｙ4配列中のアミノ酸の位置を表し、Ｚはシトルリンである）；
ａ）Ａ1は、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、及びφから成る群より選択され（ここで、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する）；
ｂ）Ｐ2は、プロリン、アラニン、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（ＭｅＡｌａ）、トランス−４−ヒドロキシプロリン、ジエチルチアゾリジン カルボン酸（Ｄｔｃ）、及びΩから成る群より選択され（ここで、Ωは構造制約を生じるアミノ酸を定義する）；
ｃ）Ｒ3は、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、リジン、オルニチン、シトルリン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、炭素数２〜８のω−アミノアシル基、炭素数２〜６のω−グアニジニルアシル基、４−ピリジルアラニン、及びアルギニン代用物から成る群より選択され；
ｄ）Ｙ4は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン ナフチルアラニン、ヒスチジン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、フェニルグリシン、ピリジルアラニン、ホモセリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、４−シクロフェニルアラニン、及びΣから成る群より選択され（ここで、Σは疎水性側鎖又は芳香族側鎖を有するα−アミノ酸を定義する）；
ａａ1は、スレオニン、セリン、バリン、及びηから成る群より選択され（ここで、ηは中性親水性アミノ酸を定義する）；
ａａ2は、イソロイシン、ロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、ピペコリン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、ヒドロキシプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸、２，２−ジメチルチアゾリジン−４−カルボン酸、及びφから成る群より選択され（ここで、φは疎水性側鎖を有するα−アミノ酸を定義する）；
ａａ3は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、ヒスチジン、ホモセリン、β−ロイシン、β−フェニルアラニン、α−アミノアジピン酸、芳香族アミン、及びΨから成る群より選択され（ここで、Ψは疎水性側鎖を有する３−アミノ−５−フェニルペンタン酸−α−アミノ酸）；
ａａ4は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから成る群より選択され（ここで、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義する）；
ａａ5は、残基なし、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びΛから成る群より選択され（ここで、Λは中性脂肪族アミノ酸を定義する）、
ペプチド又はその誘導体はＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１ＲａｃＰ生物活性を阻害する、前記ペプチドアンタゴニスト又はその誘導体。
【請求項３６】
式ＩＩ：Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5
に記載のアミノ酸配列を含むペプチドアンタゴニストであって、
式中、Ｇ1は、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、ＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）、及び３級アミンから成る群より選択される、請求項３５に記載のペプチドアンタゴニスト。
【請求項３７】
式ＩＩＩ：Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2
に記載のアミノ酸配列を含むペプチドアンタゴニストであって、
式中、Ｇ2は、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、アリールアルキルアミン、及び３級アミンから成る群より選択される、請求項３５に記載のペプチドアンタゴニスト。
【請求項３８】
式ＩＶ：Ｇ1−Ｘ−ａａ1−ａａ2−ａａ3−ａａ4−ａａ5−Ｇ2
に記載のアミノ酸配列を含むペプチドアンタゴニストであって、
式中、Ｇ1は、水素、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基、ＲＣＯ−基（式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖アルキル基である）、３級アミンから成る群より選択より選択され、Ｇ2は、水素、ＮＨ2、炭素数１〜１０の脂肪族アミン、芳香族アミン、アリールアルキルアミン、及び３級アミンから成る群より選択される、請求項３５に記載のペプチドアンタゴニスト。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図２９−３】
【図３０−１】
【図３０−２】
【図３０−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図２９−３】
【図３０−１】
【図３０−２】
【図３０−３】
【公表番号】特表２００８−５０２５９８（Ｐ２００８−５０２５９８Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１８０４（Ｐ２００７−５１１８０４）
【出願日】平成１７年５月５日（２００５．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５８３０
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０４２５５０５４）ヴァロリザーシヨン−ルシェルシュ，ソシエテ・アン・コマンディット (1)
【出願人】（５０６３６８６３７）ヴァロリザーシヨン・アッシュエスジ，ソシエテ・アン・コマンディット (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月５日（２００５．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００６９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５８３０
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０４２５５０５４）ヴァロリザーシヨン−ルシェルシュ，ソシエテ・アン・コマンディット (1)
【出願人】（５０６３６８６３７）ヴァロリザーシヨン・アッシュエスジ，ソシエテ・アン・コマンディット (1)
【Ｆターム（参考）】
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