ウィルス感染細胞抑制剤
【課題】本発明は、ウィルス感染細胞抑制剤を提供する。
【解決手段】フェノキサジン誘導体又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有するウィルス感染細胞抑制剤を提供する。
【解決手段】フェノキサジン誘導体又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有するウィルス感染細胞抑制剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルス感染細胞抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス感染細胞が原因である腫瘍が大きな問題となっている。当該腫瘍として、バーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌及び成人ヒトＴ細胞白血病（以下、ＡＴＬという）等が挙げられる。このうち、成人ヒトＴ細胞白血病は、ヒトＴ細胞白血病ウィルスＩ型（以下、ＨＴＬＶ−１という）の感染が原因となって起こる疾患である。ＨＴＬＶ−１キャリア（ＨＴＬＶ−１に感染した者で、上記のＨＴＬＶ−１が引き起こす疾患を発症していない者）は日本国内で１２０万人と推定されている。そして、ＨＴＬＶ−１キャリアの１０００人に１人が、感染から平均５０年後にＡＴＬを発症すると言われている。ＨＴＬＶ−１感染は、発症率は非常に低いがひとたび発症するときわめて短期間で重篤な結果もたらすといわれている。ＨＴＬＶ−Ｉ感染によるＡＴＬは、一旦発症すると、病状は急激に悪化し、その治療は困難を極めているのが現状である。従来の治療法としては、悪性リンパ腫に準じた化学療法或いは放射線療法などがある。しかし、それらの療法は、一時的な対症療法に過ぎず、残念ながら本質的な治療法とはなっていない。さらに、ＡＴＬの発症を予防する手立てはない。
【０００３】
また、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症及びＨＴＬＶ−１ぶどう膜炎も、ＨＴＬＶ−１による疾患として挙げられる。これらについても、本質的な治療法はない。また、その発症を予防する手立てもない。
【０００４】
下記特許文献１は、フェノキサジン誘導体の抗腫瘍効果を記載する。
【０００５】
下記特許文献２は、フェノキサジン誘導体の抗ウィルス効果を記載する。
【０００６】
下記特許文献３は、ホンダワラ由来のフコキサンチンまたはフコキサンチノールを有効成分とするウィルス関連悪性腫瘍治療剤を記載する。
【０００７】
下記特許文献４は、ローズマリー加工処理物を有効成分とする成人Ｔ細胞性白血病治療剤を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０２−１９３９８４号公報
【特許文献２】特許第３９５７１８８号公報
【特許文献３】特開２００８−１９１７４号公報
【特許文献４】特開２００８−２４７７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ウィルス感染細胞抑制剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記式1で表されるフェノキサジン誘導体又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有するウィルス感染細胞抑制剤を提供する。ここで、式1中、
Ｒ１は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ２は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ３は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ４は、アミノ基又はオキソ基であり、及び
Ｒ５は、アミノ基又はオキソ基である。
【００１１】
式1
【化１】
【発明の効果】
【００１２】
本発明の剤は、ウィルス感染細胞を抑制する効果を有する。その抑制効果は、ウィルス感染細胞の増殖抑制及び／又は生存抑制、該細胞に対するアポトーシス誘導、該細胞の細胞周期停止及び／又は該細胞のシンシチウム形成抑制を含む。さらに、本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、ウィルスに感染した細胞に対して選択的にその効果を発揮するので、正常細胞に対する副作用が少ない。
上記効果によって、ウィルス感染細胞に起因する疾病に対して本質的な治療又は予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＭＴ−１細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｂ】ＨＵＴ−１０２細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｃ】ＭＴ−２細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｄ】ＸＣ細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｅ】ＰＢＭＣに対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図２】ＭＴ−１細胞のアポトーシスを検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼファミリー及びＡｐａｆ−１のｍＲＮＡレベルに対するフェノキサジン誘導体の効果を示す図である。
【図４】ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼ３活性に対するフェノキサジン誘導体の効果を示す図である。
【図５】Ｐｈｘ−３により処理されたＭＴ−１細胞の細胞周期分析結果を示す図である。
【図６】ＭＴ−２細胞とＸＣ細胞との間のシンシチウム形成細胞の確認結果を示す図である。
【図７】ＭＴ−２細胞とＸＣ細胞との間のシンシチウム形成の数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、下記式1で表されるフェノキサジン誘導体又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含む。
【００１５】
【化２】
【００１６】
式1において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択される。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシメチル基、エトキシメチル基から選択される。さらに好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に、水素原子又はメチル基である。
式ＩにおいてＲ４及びＲ５は互いに独立に、アミノ基又はオキソ基から選ばれる。
【００１７】
好ましい実施態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がアミノ基であり且つＲ５がオキソ基である（以下、Ｐｈｘ−１という）。本実施態様における化学式は以下のとおりである。
【００１８】
【化３】
【００１９】
他の好ましい実施態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がオキソ基であり且つＲ５がアミノ基である（以下、Ｐｈｘ−２という）。本実施態様における化学式は以下のとおりである。
【００２０】
【化４】
【００２１】
他の好ましい実施態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４がアミノ基であり且つＲ５がオキソ基である（以下、Ｐｈｘ−３という）。本実施態様における化学式は以下のとおりである。
【００２２】
【化５】
【００２３】
好ましい実施態様において、該ウィルスはレトロウィルス科のウィルスであり、より好ましくはオンコウィルス亜科のウィルスであり、さらにより好ましくはＨＴＬＶ−１である。
【００２４】
本発明において「ウィルス感染細胞」とは、ウィルスに感染した細胞をいう。好ましい実施態様において、該ウィルス感染細胞はＨＴＬＶ−１に感染したヒト細胞であり、特にはＨＴＬＶ−１に感染したヒトＴ細胞である。本発明において「ウィルス感染細胞」は、ウィルス、ウィルスＤＮＡ、ウィルスＲＮＡ、ウィルス構成成分を含む細胞を包含する。本発明において「ウィルス感染細胞」は、プロウィルスを有するが疾患を発症していない細胞も包含する。
【００２５】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤により治療及び／又は予防される疾患として、ウィルス感染に起因するがんが挙げられ、特にはバーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌及び成人ヒトＴ細胞白血病が挙げられる。また、当該疾患の例として、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症及びＨＴＬＶ−１ぶどう膜炎も挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
本発明におけるウィルスは以下を包含するが、これらに限定されない。以下、本発明におけるウィルスについて説明する。
【００２７】
ウィルスは、核酸がＲＮＡかＤＮＡかにより分けられる。夫々、ＲＮＡウィルス及びＤＮＡウィルスと呼ばれる。
１）ＲＮＡウィルスには１本鎖ＲＮＡウィルス及びＲＮＡ−ＤＮＡウィルスが含まれる。このうち、１本鎖ＲＮＡウィルスにはプラス鎖ＲＮＡウィルス及びマイナス鎖ＲＮＡウィルスに分けられる。プラス鎖ＲＮＡウィルスには、ポリオウィルス（Polio virus）、シンドビスウィルス（Sindbis virus）、風疹ウィルス(Rubella virus)などを含むトガウィルス科（Togaviridae）、日本脳炎ウィルス(Japanese encephalitis virus)、黄熱ウィルス（Yellowfever virus）、Ｃ型肝炎ウィルス（Hepatitis C virus）などを含むピコルナウィルス科（Picornaviridae）、フラビウィルス科（Flaviviridae）、及びコロナウィルス科（Coronaviridae）などが含まれる。マイナス鎖ＲＮＡウィルスには、狂犬病ウィルス(Rabiesvirus)、水疱性口内炎ウィルス（Vesicular stomatitis virus）などを含むラブドウィルス科（Rhabdoviridae）、エボラウィルス（Ebola virus）、マルブルグウィルス（Marburg virus）などを含むフィロウィルス科（Filoviridae）、センダイウィルス（Hemagglutinating virus of Japan）、はしかウィルス（Measlesvirus）、ＲＳウィルス（RS virus）、おたふくかぜウィルス（Mumpus virus）などを含むパラミキソウィルス科（Paramyxoviridae）、インフルエンザウィルス(Human influenza virus) などを含むオルソミキソウィルス科（Orthomyxoviridae）、腎症候性出血熱ウィルス（Hantaan virus）などを含むブニヤウィルス科（Bunyaviridae）、及びリンパ性脈絡髄膜炎ウィルス(Lymphocytic choriomeningitis virus)などを含むアレナウィルス科（Arenaviridae）などが含まれる。ＲＮＡ−ＤＮＡウィルスには、ヒトＴ細胞白血病ウィルスI型（Human T-cell leukemia virus type I、ＨＴＬＶ−１）、ヒト後天性免疫不全ウィルス(Human immunodeficiency syndrome virus、ＨＩＶ)などを含むレトロウィルス科(Retroviridae)などが含まれる。レトロウィルス科は、オンコウィルス亜科及びレンチウィルス亜科並びにその他のウィルス亜科に分類される。ＨＴＬＶ−１はオンコウィルス亜科に含まれる。また、ＨＩＶはレンチウィルス亜科に含まれる。
２）ＤＮＡウィルスではＤＮＡが２本鎖として存在する。ＤＮＡウィルスには、単純ヘルペスウィルス１型(Herpes simplex virus 1)、単純ヘルペスウィルス２型(Herpes simplex virus 2)、水痘帯状疱疹ウィルス（varicella-zoster virus）を含むαヘルペスウィルス亜科、サイトメガロウィルス(cytomegalo virus)、ヒトヘルペスウィルス６（human herpesvirus 6）、ヒトヘルペスウィルス７（human herpes virus 7）を含むβヘルペスウィルス亜科、ＥＢウィルス(Epstein-Barr virus)、ヒトヘルペスウィルス８（human herpes virus 8）などを含むγヘルペスウィルス亜科などから構成されるヘルペスウィルス科（Herpesviridae）、ワクチニアウィルス(vaccinia virus)、伝染性軟属腫ウィルス（Molluscum contagiosum virus）などを含むポックスウィルス科(Poxviridae)、及びイリドウィルス科(Iridoviridae)などが含まれる。
【００２８】
本発明において「ウィルス感染細胞抑制」とは、ウィルス感染細胞を抑制することをいい、ウィルス感染細胞の生存を抑制すること、ウィルス感染細胞の増殖を抑制すること、ウィルス感染細胞のアポトーシスを誘導すること及び／又はウィルス感染細胞の細胞周期を停止することを含む。また、「ウィルス感染細胞の抑制」は、ウィルス感染細胞が増える為のシンシチウム形成を抑制することも含む。当該シンシチウム形成により、上記ウィルス（又はその構成成分、例えばウィルスＤＮＡ及び／ウィルスＲＮＡ）がウィルス感染細胞から、ウィルスに感染していない細胞に移動し、その結果としてウィルスに感染していない細胞がウィルス感染細胞になる。なお、ウィルス感染細胞の生存及び／又は増殖の抑制は、アポトーシス誘導、細胞周期停止及び／又はシンシチウム形成抑制に基づくこともあり、またその逆もありうる。
【００２９】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の作用機構は明らかではないが、下記の実施例から、ウィルス感染細胞の選択的なアポトーシス誘導、ウィルス感染細胞の選択的な細胞周期停止、ウィルス感染細胞の選択的な増殖抑制、ウィルス感染細胞の選択的な生存抑制、並びにウィルス感染細胞の選択的なシンシチウム形成抑制が作用機構の一部として考えられる。
【００３０】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、ウィルス感染細胞の腫瘍化を予防する為、ウィルス感染細胞の増大を防ぐ為、ウィルス感染細胞による疾患の発症を予防する為、ウィルス感染細胞の体内での増殖及び／若しくは生存を抑制する為、ウィルス感染細胞のアポトーシスを誘発する為、並びに／又はウィルス感染細胞のシンシチウム形成を抑制する為の剤として用いることもできる。例えば、ウィルス感染細胞の悪性腫瘍化を予防する為、ウィルス感染細胞の増大を防ぐ為、ウィルス感染細胞にアポトーシスを誘導する為、腫瘍を治療する為、腫瘍の拡大を防ぐ為、腫瘍細胞を殺す為及び／若しくは腫瘍を縮小する為等の剤としても使用されうるが、生物個体にとって好ましい目的であれば、これらに限定されない。また、本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、ウィルス感染の故に異常である細胞を抑制する剤として用いることもできる。「異常」とは、生物個体にとって好ましくない挙動を示す細胞をいう。当該異常細胞は、ウィルス感染細胞及び腫瘍細胞を含む。
【００３１】
更に、本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、他の薬剤とのセットで用いられる。該薬剤としては、本発明のウィルス感染細胞抑制剤以外のウィルス感染細胞抑制剤、抗ウィルス剤、免疫抑制剤、抗がん剤、抗ＨＩＶ薬、抗生物質、抗真菌薬、酵素剤、酵素阻害剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、ヒト成長ホルモン、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤あるいはラジカルスカベンジャーなどが挙げられる。
【００３２】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤で使用しうる塩は、例えば無機塩として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；銅塩、亜鉛塩などの金属塩類；有機塩として、ジエタノールアミン塩、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール塩、トリエタノールアミン塩などのアルカノールアミン塩；モルホリン塩、ピペラジン塩、ピペリジン塩などのヘテロ環アミン塩；アンモニウム塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩などの塩基性アミノ酸塩を挙げることができる。ここで、塩基性アミノ酸は、Ｄ−体、Ｌ−体或いはこれらの混合物であってもよい。
【００３３】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤で使用しうるエステルとしては例えば、蟻酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステルを挙げることができる。
【００３４】
式Iで表される化合物は、好ましくは特許第３２９０１７２号公報、特開平０２−１９３９８４号公報に記載の方法に従い製造されるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、一般的な医薬製剤の形態として用いられうる。該製剤には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤、或いは賦形剤を配合することができる。本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとして、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤などの注射剤、点眼剤、または軟膏剤が挙げられる。
【００３６】
錠剤の形態に成形する担体としては、慣用されている各種の担体を使用することができる。例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、塩化ナトリウム、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤を使用できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或いは二重錠、多層錠とすることができる。
【００３７】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。その例としては、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤を使用できる。
【００３８】
カプセル剤は、常法に従い、通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調製される。
【００３９】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用できる。その例としては、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライドなどを挙げることができる。
【００４０】
注射剤として調製される場合、液剤、乳剤及び懸濁剤は殺菌され、かつ血液となど張であるのが好ましい。これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものをすべて使用できる。例えば、水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを使用できる。なお、この場合など張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖またはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。
【００４１】
軟膏剤として調製される場合には、この分野で従来公知の油性基剤を広く使用することができる。例えば、ラッカセイ油、ゴマ油、ダイズ油、サフラワー油、アボカド油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、ナタネ油、メンジツ油、ヒマシ油、ツバキ油、ヤシ油、オリーブ油、ケシ油、カカオ油、牛脂、豚脂、羊毛油などの油脂類；ワセリン、パラフィン、シリコン油、スクワランなどの鉱物油；イソプロピルミリステート、ｎ−ブチルミリステート、イソプロピルリノレート、アセチルリシノレート、ステアリルリシノレート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルアジペート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、サラシミツロウ、鯨ロウ、木ロウなどの高級脂肪酸エステル、高級脂肪族アルコール及びワックス類、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの高級脂肪酸；炭素原子数１２〜１８の飽和又は不飽和脂肪酸のモノ−、ジ−、トリグリセライド混合物である。本発明のウィルス感染細胞抑制剤では、これら基剤を１種単独で或いは２種以上混合して使用してもよい。
【００４２】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤には、慣用の添加剤、例えば金属石鹸、動物・植物抽出物、ビタミン剤、ホルモン剤、アミノ酸などの薬効剤、界面活性剤、色素、染料、顔料、香料、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４３】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の配合量は、その効能効果を有する限り特に限定されないが、通常、本発明のウィルス感染細胞抑制剤を含む組成物中に０．０００１〜１００重量％程度、好ましくは０．００１〜５０重量％程度配合させるのがよい。配合量は、処置すべき対象に応じて適宜調節される。
【００４４】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の使用方法は、特に制限はなく、各種製剤形態、患者又は使用者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じた方法で使用される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には、経口投与される。また注射剤の場合には単独で又はブドウ糖、アミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。
【００４５】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の使用量は、用法、対象となる患者又は動物或いは、使用者或いは動物の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などにより適宜選択されるが通常、有効成分化合物の量が、一日当たり体重１ｋｇ当たり、約１〜２０ｍｇ程度となるようにするのがよく、１日に１〜３回程度に分けて使用されるのがよい。
【００４６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４７】
実施例で使用した化合物、細胞株の製造法並びに細胞培養について以下に示す。
【００４８】
Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の製造
Ｐｈｘ−1、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が、ウシヘモグロビンを用いて既出の方法により製造された（特許第３９５７１８８号公報、Shimizu S, Suzuki M, Tomoda A, Arai S, Taguchi H, Hanawa T, Kamiya S. Phenoxazine compounds produced by the reactions with bovine hemoglobin show antimicrobial activity against non-tuberculosis mycobacteria. Tohoku J Exp Med.2004; 203: 47-52.、Tomoda A, Arai S, Ishida R, Shimamoto T, Ohyashiki K. An improved method for the rapid preparation of 2-amino-4,4α-dihydro-4α,7-dimethyl-3H-phenoxazine-3-one,a novel anti-tumor agent. Biorg Med Chem Lett. 2002; 11: 1057-1058）。Ｐｈｘ−1、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の構造は夫々、上記に示されたとおり、式２、式３及び式４で表される。
【００４９】
上記により製造されたＰｈｘ−1、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が夫々、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエチルアルコールの３：１（体積比）混合物を溶媒として、５ｍｇ／ｍｌになるように溶解された。これらの溶液は培養培地中において終濃度０．１、１及び１０μｇ／ｍｌとなるように、培養培地に添加された。培養培地中における該溶媒の最終的な体積割合は、Ｐｈｘ−1、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３フリーの細胞並びにＰｈｘ−1、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３処理された細胞の間で等しかった（０．２％（ｖ／ｖ））。
【００５０】
細胞株及び細胞培養
ＭＴ−１は、ＡＴＬ患者から樹立された白血病細胞由来のＴ細胞株である。
ＭＴ−２は、ＨＴＬＶ−１により形質転換されたＴ細胞株であり、且つ、Ｔａｘを含むウィルス遺伝子を恒常的に発現する。
ＨＵＴ−１０２は、ＡＴＬの患者から樹立されたＴ細胞株であり、且つ、ウィルス遺伝子を恒常的に発現する。
ＸＣは、ラット肉腫細胞株である。
すなわち、ＭＴ−１、ＭＴ−２及びＨＵＴ−１０２は、ＨＴＬＶ−１に感染したＴ細胞株であり、他方、ＸＣは、ＨＴＬＶ−１に感染していない細胞株である。
５％のＣＯ２及び９５％の空気を有する加湿されたインキュベーター中、３７℃で、１０％（ｗ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び８０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン（和光純薬工業株式会社）を追加されたＲＰＭＩ １６４０培地（和光純薬工業株式会社）（以下、ＰＲＭＩ培地に上記のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン及び硫酸カナマイシンが追加されたものを「ＲＰＭＩ−１６４０培地」という）中において、これら４種の細胞株が培養された。
末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣという）は、健康成人からの採血により得られた血について密度勾配遠心を行うことにより単離された。該細胞は、１０Ｕ／ｍｌのインターロイキン（以下、ＩＬ−２という）（塩野義製薬株式会社）及び５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（以下、ＰＨＡという）（生化学工業株式会社）と一緒に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び８０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを補われたＲＰＭＩ １６４０培地中で、予め１週間、５％のＣＯ２及び９５％の空気を有する加湿されたインキュベーター中、３７℃で、培養された。
上記細胞株（ＭＴ−１、ＭＴ−２、ＨＵＴ−１０２、ＸＣ及びＰＢＭＣ）は、いずれも千葉工業大学工学部生命環境科学科遺伝子治療学・生態防御学研究室より提供された。また、ＭＴ−１、ＭＴ−２及びＨＵＴ−１０２については夫々、Miyoshi I, Kubonishi I, Sumida M, Hiraki S, Tsubota T, Kimura I, Miyamoto K, Sato J. A novel T-cell linederived from adult T-cell leukemia. Gann 1980;71:155−156、Miyoshi I, Kubonishi I, Yoshimoto S,Akagi T, Ohtsuki Y, shiraishi Y, Natata K, Hinuma Y. Type C virus particles in a cord T-cell line derived by co-cultivating normal human cord leukocytes and human leukaemic T cells. Nature. 1981;294:770−771、及び、Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, BunnPA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1980;77: 7415−7419も参照されたい。
【実施例１】
【００５１】
細胞増殖アッセイ及び細胞生存率アッセイ
ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＭＴ−１細胞、ＨＵＴ−１０２細胞及びＭＴ−２細胞（いずれも５×１０４細胞／２ｍｌ）、並びにＸＣ細胞（３×１０３細胞／２ｍｌ）、並びにＰＢＭＣ（１×１０５細胞／２ｍｌ）が、２４ウェルプレートの夫々のウェルに撒かれ、５％ＣＯ２と９５％の空気を含む加湿されたインキュベーター中、３７℃で７２時間培養された。当該培養は、種々の濃度（０、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）のＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の存在下で行われた。試料が、２４、４８及び７２時間で回収され、そして細胞増殖及び生存率の測定の為に用いられた。
【００５２】
細胞増殖は、血球計（パーキンエルマー社）を用いて、倒立方位相差顕微鏡下で細胞の数を数えることにより測定された。細胞生存率は、トリパンブルーにより処理された生存細胞の数を顕微鏡下で数えることにより測定された。簡潔に言うと、０、２４、４８及び７２時間での細胞の回収後、夫々のウェルの培地が、１００μｌのトリパンブルーを含む１ｍｌの新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地により交換された。次に、生存細胞の数が顕微鏡下で計数された。実験は３回行われた。
【００５３】
結果
図１Ａは、ＭＴ−１細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３それぞれの種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。これらのフェノキサジンは、ＭＴ−１細胞の増殖及び生存率を時間依存的及び用量依存的に抑制した。特に１０μｇ／ｍｌでの７２時間における生存率が、Ｐｈｘ−１については約６０％抑制され、Ｐｈｘ−２については約８０％抑制され、Ｐｈｘ−３については約７０％抑制された。１μｇ／ｍｌ以下では、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により処理されたＭＴ−１細胞の生存率は、全く影響されなかった。他方、細胞の増殖は、７２時間の間で、時間依存的に及び用量依存的に有意に抑制された。
図１Ｂは、ＨＵＴ−１０２細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。ＨＵＴ−１０２は、１０μｇ／ｍｌのこれらのフェノキサジンに対して感受性であり、すなわち細胞増殖及び細胞生存率が時間依存的及び用量依存的に広範に抑制された。
図１Ｃは、ＭＴ−２細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。１０μｇ／ｍｌの用量のＰｈｘ−３により、生存率が完全に抑制されたが、Ｐｈｘ−１及びＰｈｘ−２によっては、この用量では抑制されなかった。細胞増殖は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３により抑制された。これらのフェノキサジンのなかで、Ｐｈｘ−３が１０μｇ／ｍｌの用量で、ＭＴ−２細胞の細胞増殖及び生存率を最も強力に抑制した。
図１Ｄは、ＸＣ細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。ＸＣ細胞は、細胞増殖が１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により、７２時間で、非常に抑制されたが、細胞生存率はこれらのフェノキサジンによっては影響されなかった。
図１Ｅは、ＰＢＭＣの増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１及びＰｈｘ−２により、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの生存率は抑制されなかったが、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−３に対しては中程度に感受性であった。他方、ＰＢＭＣの増殖は、これらのフェノキサジンにより、時間依存的及び用量依存的に有意に抑制された。これは、細胞生存率の点において、ＰＢＭＣが、ＡＴＬ細胞株よりも、これらのフェノキサジンに対してはるかに耐性であることを示す。
【００５４】
考察
上記の結果は、ＨＴＬＶ−１陽性Ｔ細胞が、細胞増殖及び細胞生存率の点において、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及び特にはＰｈｘ−３に対して感受性であることを示す。
他方、ＸＣ細胞株は、細胞生存率の点において、フェノキサジン処理に対して感受性でないが、細胞増殖の点において、１０μｇ／ｍｌの用量で、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３によって非常に抑制された。この結果は、ＸＣ細胞が、ＨＴＬＶ−１陽性細胞（宿主細胞）及びＨＴＬＶ−１陰性細胞（標的細胞）の間でのシンシチウム形成を研究する為に適当な細胞であることを示唆する。
ＰＨＡにより活性化されたＰＢＭＣの生存率は、Ｐｈｘ−１又はＰｈｘ−２によって影響されなかったが、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−３によって中程度に（約４０％）減少した。これは、正常Ｔ細胞を含むＰＢＭＣが、これらのフェノキサジンに対して比較的耐性であることを示す。
この事実は、非常に重要である。なぜならば、ＨＴＬＶ−１に冒されたＡＴＬ細胞の選択的なアポトーシス誘導が、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の投与によって可能であるからである。さらに、該投与によって正常細胞に対する有害な作用（副作用）は何ら引き起こされないからである。
ＰＢＭＣの細胞増殖は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により時間依存的に及び用量依存的に非常に抑制された。
【実施例２】
【００５５】
アポトーシス及びネクローシスの検出
アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｃ．、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（商標））を用いて、フローサイトメトリーにより、アポトーシス及びネクローシスの検出が実施された。ＭＴ−１細胞（５×１０５細胞／２ｍｌ）が、０、０．１、１及び１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により、６ウェルの平底プレートのウェル内で処理された。該処理の２４、４８、及び７２時間後に、細胞が回収され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ ７．４）により該回収した細胞が１回洗浄され、そして５００μｌの結合バッファー中に再懸濁された。なお、該バッファー中には、１．２５μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化アネキシンＶ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ）及び１０μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が予め添加されている。これらの試料が、暗所で、５分間、室温でインキュベートされた。次に、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）により、該試料が分析された。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合及びＰＩ染色が、ＦＩＴＣシグナル検出器（ＦＬ１、５１８ｎｍ）及びフィコエリトリン発光シグナル検出器（ＦＬ２、６２０ｎｍ）を用いて夫々モニターされた。
【００５６】
ＲＮＡ精製及びＲＴ−ＰＣＲ
ＭＴ−１細胞（５×１０５細胞／２ｍｌ）が、０、０．１、１、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により処理された。２４時間後、細胞が回収され、そして該回収した細胞から、全細胞ＲＮＡが、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）哺乳動物用ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）により抽出された。次に、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析が、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて実施された。カスパーゼファミリー（カスパーゼ−３、−５、−８及び−９、Ａｐａｆ−１）のｍＲＮＡレベルが、アポトーシス遺伝子セット−５についてのＭＰＣＲキット（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）により分析された。細胞内でのＲＮＡ発現の程度を分析する為に、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＲＮＡ由来の産物が、ＴＡＥバッファー中で、非変性２％アガロースゲルによって電気泳動され、そしてエチジウムブロマイド（Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ．、ダルムシュタット、ドイツ）により染色された。カスパーゼ−３、−５、−８及び−９、Ａｐａｆ−１について結果が、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）により定量され、そして正規化された。
【００５７】
カスパーゼ３活性のアッセイ
ＭＴ−１細胞中のカスパーゼ３の活性が、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）による反応によって測定された。簡潔に言うと、ＭＴ−１細胞（５×１０５細胞／２ｍｌ）が、培地中に懸濁され、そして、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の存在下又は不在下において、５％ＣＯ２及び９５％空気を有する加湿されたインキュベーター中で、３７℃で、６ウェル平底プレートのウェル内でインキュベートされた。次に、該細胞が回収され、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１回洗浄され、１μｌアリコットのＦＩＴＣ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫにより処理され、そして、暗所で３７℃で１時間インキュベートされた。次に、該細胞は、洗浄バッファーにより２回洗浄され、そして９６ウェル平底プレートのウェルへと移された。これらの試料は、マルチディテクションマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｅ ＸＳ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏ．）を用いて、４８５ｎｍ励起／５３５ｎｍ発光の波長で分析された。カスパーゼ３の活性は３回評価され、そしてタンパク質含有量に基づき補正された。
【００５８】
細胞周期分析
ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＭＴ−１細胞（１．５×１０５細胞／ｍｌ）が、１２ウェル平底プレートのウェル内で、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２及び９５％の空気を有する加湿されたインキュベーター中で、３７℃で、インキュベートされた。上清が、２ｍｌの新鮮培地により交換され、そして終濃度１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３が夫々のウェルに添加された。指示された時間（２４時間、４８時間及び７２時間）で細胞を回収する２時間前に、細胞はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）により標識化され、そしてさらに２時間インキュベートされた。ＢｒｄＵにより標識化された細胞が、該指示された時間で集められ、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）バッファー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）により固定化されそして浸透処理された。次に、該細胞は、ＤＮａｓｅにより３７℃で１時間処理され、そしてＦＩＴＣ標識化抗ＢｒｄＵ抗体により染色された。細胞は室温で２０分間暗所に置かれ、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）バッファーにより洗浄され、そしてアクチノマイシンＤにより処理された。細胞の細胞周期は、ＦＩＴＣ ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）を用いてフローサイトメーターにより分析された。
【００５９】
結果：アポトーシスの検出
ＭＴ−１の増殖と生存率は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により有意に影響されたので（図１Ａ）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合及びＰＩ染色方法を用いたフローサイトメトリーにより、ＭＴ−１細胞のアポトーシスがこれらのフェノキサジンにより引き起こされうるのかどうかを調査した（図２）。結果として、アネキシンＶ陰性且つＰＩ陰性の細胞（生存細胞：左下象限にプロットされる）の数は、２４〜７２時間の間で、溶媒だけにより処理された対照細胞において、主に観察された（図２）。アネキシンＶ陽性且つＰＩ陰性の細胞（早期段階アポトーシス細胞：右下象限にプロットされる）の数、及びアネキシンＶ陽性且つＰＩ陽性細胞（後期段階アポトーシス／ネクローシス細胞（アポトーシス細胞とネクローシス細胞とが混合したものである、以下同じ）、実際は培養ウェル中の浮遊性死細胞として検出される：右上象限にプロットされる）の数は１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により処理されたＭＴ−１細胞において増加した（図２）。後期段階アポトーシス／ネクローシス細胞の増加の速度は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３による夫々の試料において時間依存的であった。これらの結果は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が、ＭＴ−１細胞のアポトーシスを誘導することを示唆する。
【００６０】
結果：カスパーゼ３活性
２４時間での、ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼファミリー及びＡｐａｆ−１の転写レベルに対するＰｈｘ−３の影響を調査した（図３）。カスパーゼ−３、−５、−８及び−９、Ａｐａｆ−１のｍＲＮＡレベルは１０μｇ／ｍｌのｐｈｘ−３の存在下で２４時間後においてさえ、変化しなかった。この結果にもかかわらず、細胞が、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３と一緒に１６時間インキュベートされたときに、ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼ３の活性は、非常に増強された（図４）。なお、図４の結果は、３回のアッセイ結果の平均値である。これらの結果は、フェノキサジンにより引き起こされたＭＴ−１細胞内のカスパーゼ３の活性化が、図２において示されたとおりＭＴ−１細胞におけるアポトーシスの結果と矛盾しないことを示唆する。さらには、カスパーゼ３の活性化を含む翻訳後の現象が、アポトーシス誘発にとって必須であることを示唆する。
【００６１】
結果：細胞周期分析
抗がん剤によるがん細胞のアポトーシス細胞死は細胞周期停止を伴うことが示唆されたので、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の存在下におけるＭＴ−１細胞の細胞周期停止の誘発を研究した。図５に示されるとおり、細胞がこれらのフェノキサジンと一緒に７２時間インキュベートされたときに、ＭＴ−１細胞の細胞周期停止が示された。細胞周期停止における大きな変化は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３が添加されたＭＴ−１細胞において、７２時間後に示された。すなわち、７２時間後で、ｓｕｂ Ｇ０／Ｇ１期停止の割合が、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３と一緒の夫々のＭＴ−１細胞について、８０％、５０％及び７０％であったが、他方で、これらのフェノキサジンが添加されていないＭＴ−１細胞（対照）についてのｓｕｂ Ｇ０／Ｇ１期停止の割合は、わずか２０％であった。この結果は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が、ＭＴ−１のアポトーシスを引き起こすことを実証する。また、この結果は図２における結果と一致する。しかしながら、Ｓ期の割合における違いは、対照のＭＴ−１及びフェノキサジンが添加されたＭＴ−１の間でほとんどなかった。
【００６２】
考察
ＨＴＬＶ−１のプロウィルスは、ＡＴＬ細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれている。上記の結果に記載されたとおりの、細胞周期停止及びアポトーシス誘導は、ＨＴＬＶ−１のプロウィルスの伝播を防ぎうる。これは、ＨＴＬＶ−１プロウィルスの複製を抑制することにより及び／又はＨＴＬＶ−１陽性ＡＴＬ細胞を選択的に排除することによりなされると考えられる。
【実施例３】
【００６３】
シンシチウム形成アッセイ
シンシチウム形成アッセイは、ＨＴＬＶ−１を有するＭＴ―２細胞と指標細胞ＸＣ細胞との共培養により行った。ＸＣ細胞は、１ｍＭのＥＤＴＡ中の０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンによる処理後に集められ、次にＰＢＳにより３回洗浄され、そして抗生物質を有するＲＰＭＩー１６４０培地中に再懸濁された。細胞（３×１０３細胞／ｍｌ）は、２４ウェル平底プレートのウェル内で、２４時間、５％ＣＯ２及び９５％空気を有する加湿されたインキュベーター中、３７℃で、インキュベートされた。次に、該培地が除去され、そして３×１０３細胞／ｍｌのＭＴ−２細胞が夫々のウェルに添加された。Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３が、別個のウェルに、終濃度０．１、１．０及び１０μｇ／ｍｌで、ＸＣ細胞とＭＣ−２細胞との共培養の開始で、添加された。２４、４８及び７２時間後に、細胞がＰＢＳにより１回洗浄され、そして、メタノール中の０．５％メチレンブルー及び０．１２５％クリスタルバイオレット（和光純薬工業株式会社）による染色を伴う又は伴わない顕微鏡分析に付された。シンシチウムが、位相差倒立顕微鏡（倍率：×１００）により、無作為に、５箇所の視野において数えられた。５超の核を有するシンシチウムが、倒立顕微鏡下で数えられた。なお、このアッセイ系において、ＨＴＬＶ−１を有する細胞株ＭＴ−２は通常、１０５の指標ＸＣ細胞当たり、５００〜８００のシンシチウムを通常に形成する。全ての実験は３回行われた。
【００６４】
結果：Ｐｈｘ−３のＨＴＬＶ−１の細胞間伝達に対する抑制
ＨＴＬＶ−１が細胞から細胞へという様式でＡＴＬの患者において伝播すること、及び、ＨＴＬＶ−１感染細胞とＨＴＬＶ−１非感染細胞とのシンシチウム形成がウィルス伝播の特徴であることが実証されている。図６Ａ−Ｈは、フェノキサジン無しの対照実験（図６Ａ及びＢ）、Ｐｈｘ−１による実験（図６Ｃ及びＤ）、Ｐｈｘ−２による実験（図６Ｅ及びＦ）又はＰｈｘ−３による実験（図６Ｇ及びＨ）における、ＨＴＬＶ−１陽性ＭＴ−２細胞とＨＴＬＶ−１陰性ＸＣ細胞との間のシンシチウム形成の顕微鏡分析を示す。図６Ａにおいて示されるとおり、染色無しの試料において（倍率：１００倍）、これらの細胞の間で５つのシンシチウム形成が観察された。試料が、メチレンブルー及びクリスタルバイオレットにより染色されたときに、これらのシンシチウム形成は、より明白に示された（図６Ｂ）。ＸＣ細胞及びＭＴ−２細胞が、Ｐｈｘ−１（図６Ｃ及びＤ）、Ｐｈｘ−２（図６Ｅ及びＦ）又はＰｈｘ−３（図６Ｇ及びＨ）と一緒に共培養されたときに、シンシチウム形成は非常に減少された。これらの結果は、図７において示されるヒストグラムとして示される。なお、図７の結果は、３回の実験結果の平均値である。Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の存在下において、ＭＴ−２細胞及びＸＣ細胞の間のシンシチウム形成は、非常に抑制されそして用量依存的に抑制された。これは、細胞から細胞へのＨＴＬＶ−１伝達が、これらのフェノキサジンにより抑制されたことを示す。
【００６５】
考察
ＨＴＬＶ−１は、ＨＴＬＶ−１を有する細胞と標的細胞との間の細胞間相互作用を通じて伝達される。上記細胞間相互作用が、シンシチウムの形成を引き起こす。上記シンシチウム形成では、ＨＴＬＶ−１を有する細胞上に発現されるエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４６−１９７と標的細胞表面に発現される７１ｋＤａ熱ショック同族（ＨＳＣ）タンパク質とが相互作用する。それ故に、シンシチウム形成についての試験は、ＨＴＬＶ−１伝達の抑制因子を評価する為に重要である。上記の結果は、ＨＴＬＶ−１陽性ＭＴ−２細胞とＨＴＬＶ−１陰性ＸＣ細胞との間でシンシチウム形成が観察されたこと、及び、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の添加により、時間依存的に且つ用量依存的に、シンシチウム形成が有意に抑制されたことを示す。これは特に、これらのフェノキサジンが１０μｇ／ｍｌで添加されたときに顕著であった。これらの結果は、ＨＴＬＶ−１の、宿主細胞から標的細胞への伝達が、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により、抑制されうることを示唆する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルス感染細胞抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス感染細胞が原因である腫瘍が大きな問題となっている。当該腫瘍として、バーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌及び成人ヒトＴ細胞白血病（以下、ＡＴＬという）等が挙げられる。このうち、成人ヒトＴ細胞白血病は、ヒトＴ細胞白血病ウィルスＩ型（以下、ＨＴＬＶ−１という）の感染が原因となって起こる疾患である。ＨＴＬＶ−１キャリア（ＨＴＬＶ−１に感染した者で、上記のＨＴＬＶ−１が引き起こす疾患を発症していない者）は日本国内で１２０万人と推定されている。そして、ＨＴＬＶ−１キャリアの１０００人に１人が、感染から平均５０年後にＡＴＬを発症すると言われている。ＨＴＬＶ−１感染は、発症率は非常に低いがひとたび発症するときわめて短期間で重篤な結果もたらすといわれている。ＨＴＬＶ−Ｉ感染によるＡＴＬは、一旦発症すると、病状は急激に悪化し、その治療は困難を極めているのが現状である。従来の治療法としては、悪性リンパ腫に準じた化学療法或いは放射線療法などがある。しかし、それらの療法は、一時的な対症療法に過ぎず、残念ながら本質的な治療法とはなっていない。さらに、ＡＴＬの発症を予防する手立てはない。
【０００３】
また、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症及びＨＴＬＶ−１ぶどう膜炎も、ＨＴＬＶ−１による疾患として挙げられる。これらについても、本質的な治療法はない。また、その発症を予防する手立てもない。
【０００４】
下記特許文献１は、フェノキサジン誘導体の抗腫瘍効果を記載する。
【０００５】
下記特許文献２は、フェノキサジン誘導体の抗ウィルス効果を記載する。
【０００６】
下記特許文献３は、ホンダワラ由来のフコキサンチンまたはフコキサンチノールを有効成分とするウィルス関連悪性腫瘍治療剤を記載する。
【０００７】
下記特許文献４は、ローズマリー加工処理物を有効成分とする成人Ｔ細胞性白血病治療剤を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０２−１９３９８４号公報
【特許文献２】特許第３９５７１８８号公報
【特許文献３】特開２００８−１９１７４号公報
【特許文献４】特開２００８−２４７７９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ウィルス感染細胞抑制剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記式1で表されるフェノキサジン誘導体又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含有するウィルス感染細胞抑制剤を提供する。ここで、式1中、
Ｒ１は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ２は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ３は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ４は、アミノ基又はオキソ基であり、及び
Ｒ５は、アミノ基又はオキソ基である。
【００１１】
式1
【化１】
【発明の効果】
【００１２】
本発明の剤は、ウィルス感染細胞を抑制する効果を有する。その抑制効果は、ウィルス感染細胞の増殖抑制及び／又は生存抑制、該細胞に対するアポトーシス誘導、該細胞の細胞周期停止及び／又は該細胞のシンシチウム形成抑制を含む。さらに、本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、ウィルスに感染した細胞に対して選択的にその効果を発揮するので、正常細胞に対する副作用が少ない。
上記効果によって、ウィルス感染細胞に起因する疾病に対して本質的な治療又は予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＭＴ−１細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｂ】ＨＵＴ−１０２細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｃ】ＭＴ−２細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｄ】ＸＣ細胞に対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図１Ｅ】ＰＢＭＣに対するフェノキサジン誘導体の増殖抑制効果及び生存抑制効果を示す図である。
【図２】ＭＴ−１細胞のアポトーシスを検出するためのフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼファミリー及びＡｐａｆ−１のｍＲＮＡレベルに対するフェノキサジン誘導体の効果を示す図である。
【図４】ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼ３活性に対するフェノキサジン誘導体の効果を示す図である。
【図５】Ｐｈｘ−３により処理されたＭＴ−１細胞の細胞周期分析結果を示す図である。
【図６】ＭＴ−２細胞とＸＣ細胞との間のシンシチウム形成細胞の確認結果を示す図である。
【図７】ＭＴ−２細胞とＸＣ細胞との間のシンシチウム形成の数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、下記式1で表されるフェノキサジン誘導体又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含む。
【００１５】
【化２】
【００１６】
式1において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択される。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシメチル基、エトキシメチル基から選択される。さらに好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は互いに独立に、水素原子又はメチル基である。
式ＩにおいてＲ４及びＲ５は互いに独立に、アミノ基又はオキソ基から選ばれる。
【００１７】
好ましい実施態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がアミノ基であり且つＲ５がオキソ基である（以下、Ｐｈｘ−１という）。本実施態様における化学式は以下のとおりである。
【００１８】
【化３】
【００１９】
他の好ましい実施態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がオキソ基であり且つＲ５がアミノ基である（以下、Ｐｈｘ−２という）。本実施態様における化学式は以下のとおりである。
【００２０】
【化４】
【００２１】
他の好ましい実施態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４がアミノ基であり且つＲ５がオキソ基である（以下、Ｐｈｘ−３という）。本実施態様における化学式は以下のとおりである。
【００２２】
【化５】
【００２３】
好ましい実施態様において、該ウィルスはレトロウィルス科のウィルスであり、より好ましくはオンコウィルス亜科のウィルスであり、さらにより好ましくはＨＴＬＶ−１である。
【００２４】
本発明において「ウィルス感染細胞」とは、ウィルスに感染した細胞をいう。好ましい実施態様において、該ウィルス感染細胞はＨＴＬＶ−１に感染したヒト細胞であり、特にはＨＴＬＶ−１に感染したヒトＴ細胞である。本発明において「ウィルス感染細胞」は、ウィルス、ウィルスＤＮＡ、ウィルスＲＮＡ、ウィルス構成成分を含む細胞を包含する。本発明において「ウィルス感染細胞」は、プロウィルスを有するが疾患を発症していない細胞も包含する。
【００２５】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤により治療及び／又は予防される疾患として、ウィルス感染に起因するがんが挙げられ、特にはバーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌及び成人ヒトＴ細胞白血病が挙げられる。また、当該疾患の例として、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症及びＨＴＬＶ−１ぶどう膜炎も挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
本発明におけるウィルスは以下を包含するが、これらに限定されない。以下、本発明におけるウィルスについて説明する。
【００２７】
ウィルスは、核酸がＲＮＡかＤＮＡかにより分けられる。夫々、ＲＮＡウィルス及びＤＮＡウィルスと呼ばれる。
１）ＲＮＡウィルスには１本鎖ＲＮＡウィルス及びＲＮＡ−ＤＮＡウィルスが含まれる。このうち、１本鎖ＲＮＡウィルスにはプラス鎖ＲＮＡウィルス及びマイナス鎖ＲＮＡウィルスに分けられる。プラス鎖ＲＮＡウィルスには、ポリオウィルス（Polio virus）、シンドビスウィルス（Sindbis virus）、風疹ウィルス(Rubella virus)などを含むトガウィルス科（Togaviridae）、日本脳炎ウィルス(Japanese encephalitis virus)、黄熱ウィルス（Yellowfever virus）、Ｃ型肝炎ウィルス（Hepatitis C virus）などを含むピコルナウィルス科（Picornaviridae）、フラビウィルス科（Flaviviridae）、及びコロナウィルス科（Coronaviridae）などが含まれる。マイナス鎖ＲＮＡウィルスには、狂犬病ウィルス(Rabiesvirus)、水疱性口内炎ウィルス（Vesicular stomatitis virus）などを含むラブドウィルス科（Rhabdoviridae）、エボラウィルス（Ebola virus）、マルブルグウィルス（Marburg virus）などを含むフィロウィルス科（Filoviridae）、センダイウィルス（Hemagglutinating virus of Japan）、はしかウィルス（Measlesvirus）、ＲＳウィルス（RS virus）、おたふくかぜウィルス（Mumpus virus）などを含むパラミキソウィルス科（Paramyxoviridae）、インフルエンザウィルス(Human influenza virus) などを含むオルソミキソウィルス科（Orthomyxoviridae）、腎症候性出血熱ウィルス（Hantaan virus）などを含むブニヤウィルス科（Bunyaviridae）、及びリンパ性脈絡髄膜炎ウィルス(Lymphocytic choriomeningitis virus)などを含むアレナウィルス科（Arenaviridae）などが含まれる。ＲＮＡ−ＤＮＡウィルスには、ヒトＴ細胞白血病ウィルスI型（Human T-cell leukemia virus type I、ＨＴＬＶ−１）、ヒト後天性免疫不全ウィルス(Human immunodeficiency syndrome virus、ＨＩＶ)などを含むレトロウィルス科(Retroviridae)などが含まれる。レトロウィルス科は、オンコウィルス亜科及びレンチウィルス亜科並びにその他のウィルス亜科に分類される。ＨＴＬＶ−１はオンコウィルス亜科に含まれる。また、ＨＩＶはレンチウィルス亜科に含まれる。
２）ＤＮＡウィルスではＤＮＡが２本鎖として存在する。ＤＮＡウィルスには、単純ヘルペスウィルス１型(Herpes simplex virus 1)、単純ヘルペスウィルス２型(Herpes simplex virus 2)、水痘帯状疱疹ウィルス（varicella-zoster virus）を含むαヘルペスウィルス亜科、サイトメガロウィルス(cytomegalo virus)、ヒトヘルペスウィルス６（human herpesvirus 6）、ヒトヘルペスウィルス７（human herpes virus 7）を含むβヘルペスウィルス亜科、ＥＢウィルス(Epstein-Barr virus)、ヒトヘルペスウィルス８（human herpes virus 8）などを含むγヘルペスウィルス亜科などから構成されるヘルペスウィルス科（Herpesviridae）、ワクチニアウィルス(vaccinia virus)、伝染性軟属腫ウィルス（Molluscum contagiosum virus）などを含むポックスウィルス科(Poxviridae)、及びイリドウィルス科(Iridoviridae)などが含まれる。
【００２８】
本発明において「ウィルス感染細胞抑制」とは、ウィルス感染細胞を抑制することをいい、ウィルス感染細胞の生存を抑制すること、ウィルス感染細胞の増殖を抑制すること、ウィルス感染細胞のアポトーシスを誘導すること及び／又はウィルス感染細胞の細胞周期を停止することを含む。また、「ウィルス感染細胞の抑制」は、ウィルス感染細胞が増える為のシンシチウム形成を抑制することも含む。当該シンシチウム形成により、上記ウィルス（又はその構成成分、例えばウィルスＤＮＡ及び／ウィルスＲＮＡ）がウィルス感染細胞から、ウィルスに感染していない細胞に移動し、その結果としてウィルスに感染していない細胞がウィルス感染細胞になる。なお、ウィルス感染細胞の生存及び／又は増殖の抑制は、アポトーシス誘導、細胞周期停止及び／又はシンシチウム形成抑制に基づくこともあり、またその逆もありうる。
【００２９】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の作用機構は明らかではないが、下記の実施例から、ウィルス感染細胞の選択的なアポトーシス誘導、ウィルス感染細胞の選択的な細胞周期停止、ウィルス感染細胞の選択的な増殖抑制、ウィルス感染細胞の選択的な生存抑制、並びにウィルス感染細胞の選択的なシンシチウム形成抑制が作用機構の一部として考えられる。
【００３０】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、ウィルス感染細胞の腫瘍化を予防する為、ウィルス感染細胞の増大を防ぐ為、ウィルス感染細胞による疾患の発症を予防する為、ウィルス感染細胞の体内での増殖及び／若しくは生存を抑制する為、ウィルス感染細胞のアポトーシスを誘発する為、並びに／又はウィルス感染細胞のシンシチウム形成を抑制する為の剤として用いることもできる。例えば、ウィルス感染細胞の悪性腫瘍化を予防する為、ウィルス感染細胞の増大を防ぐ為、ウィルス感染細胞にアポトーシスを誘導する為、腫瘍を治療する為、腫瘍の拡大を防ぐ為、腫瘍細胞を殺す為及び／若しくは腫瘍を縮小する為等の剤としても使用されうるが、生物個体にとって好ましい目的であれば、これらに限定されない。また、本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、ウィルス感染の故に異常である細胞を抑制する剤として用いることもできる。「異常」とは、生物個体にとって好ましくない挙動を示す細胞をいう。当該異常細胞は、ウィルス感染細胞及び腫瘍細胞を含む。
【００３１】
更に、本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、他の薬剤とのセットで用いられる。該薬剤としては、本発明のウィルス感染細胞抑制剤以外のウィルス感染細胞抑制剤、抗ウィルス剤、免疫抑制剤、抗がん剤、抗ＨＩＶ薬、抗生物質、抗真菌薬、酵素剤、酵素阻害剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、免疫賦活剤、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、ヒト成長ホルモン、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメデイエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤あるいはラジカルスカベンジャーなどが挙げられる。
【００３２】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤で使用しうる塩は、例えば無機塩として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；銅塩、亜鉛塩などの金属塩類；有機塩として、ジエタノールアミン塩、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール塩、トリエタノールアミン塩などのアルカノールアミン塩；モルホリン塩、ピペラジン塩、ピペリジン塩などのヘテロ環アミン塩；アンモニウム塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩などの塩基性アミノ酸塩を挙げることができる。ここで、塩基性アミノ酸は、Ｄ−体、Ｌ−体或いはこれらの混合物であってもよい。
【００３３】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤で使用しうるエステルとしては例えば、蟻酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステルを挙げることができる。
【００３４】
式Iで表される化合物は、好ましくは特許第３２９０１７２号公報、特開平０２−１９３９８４号公報に記載の方法に従い製造されるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、一般的な医薬製剤の形態として用いられうる。該製剤には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤、或いは賦形剤を配合することができる。本発明のウィルス感染細胞抑制剤は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとして、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤などの注射剤、点眼剤、または軟膏剤が挙げられる。
【００３６】
錠剤の形態に成形する担体としては、慣用されている各種の担体を使用することができる。例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、塩化ナトリウム、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤を使用できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或いは二重錠、多層錠とすることができる。
【００３７】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。その例としては、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤を使用できる。
【００３８】
カプセル剤は、常法に従い、通常有効成分化合物を上記で例示した各種の担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調製される。
【００３９】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用できる。その例としては、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライドなどを挙げることができる。
【００４０】
注射剤として調製される場合、液剤、乳剤及び懸濁剤は殺菌され、かつ血液となど張であるのが好ましい。これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものをすべて使用できる。例えば、水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを使用できる。なお、この場合など張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖またはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。
【００４１】
軟膏剤として調製される場合には、この分野で従来公知の油性基剤を広く使用することができる。例えば、ラッカセイ油、ゴマ油、ダイズ油、サフラワー油、アボカド油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、ナタネ油、メンジツ油、ヒマシ油、ツバキ油、ヤシ油、オリーブ油、ケシ油、カカオ油、牛脂、豚脂、羊毛油などの油脂類；ワセリン、パラフィン、シリコン油、スクワランなどの鉱物油；イソプロピルミリステート、ｎ−ブチルミリステート、イソプロピルリノレート、アセチルリシノレート、ステアリルリシノレート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルアジペート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、サラシミツロウ、鯨ロウ、木ロウなどの高級脂肪酸エステル、高級脂肪族アルコール及びワックス類、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの高級脂肪酸；炭素原子数１２〜１８の飽和又は不飽和脂肪酸のモノ−、ジ−、トリグリセライド混合物である。本発明のウィルス感染細胞抑制剤では、これら基剤を１種単独で或いは２種以上混合して使用してもよい。
【００４２】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤には、慣用の添加剤、例えば金属石鹸、動物・植物抽出物、ビタミン剤、ホルモン剤、アミノ酸などの薬効剤、界面活性剤、色素、染料、顔料、香料、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４３】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の配合量は、その効能効果を有する限り特に限定されないが、通常、本発明のウィルス感染細胞抑制剤を含む組成物中に０．０００１〜１００重量％程度、好ましくは０．００１〜５０重量％程度配合させるのがよい。配合量は、処置すべき対象に応じて適宜調節される。
【００４４】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の使用方法は、特に制限はなく、各種製剤形態、患者又は使用者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じた方法で使用される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には、経口投与される。また注射剤の場合には単独で又はブドウ糖、アミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。
【００４５】
本発明のウィルス感染細胞抑制剤の使用量は、用法、対象となる患者又は動物或いは、使用者或いは動物の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などにより適宜選択されるが通常、有効成分化合物の量が、一日当たり体重１ｋｇ当たり、約１〜２０ｍｇ程度となるようにするのがよく、１日に１〜３回程度に分けて使用されるのがよい。
【００４６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４７】
実施例で使用した化合物、細胞株の製造法並びに細胞培養について以下に示す。
【００４８】
Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の製造
Ｐｈｘ−1、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が、ウシヘモグロビンを用いて既出の方法により製造された（特許第３９５７１８８号公報、Shimizu S, Suzuki M, Tomoda A, Arai S, Taguchi H, Hanawa T, Kamiya S. Phenoxazine compounds produced by the reactions with bovine hemoglobin show antimicrobial activity against non-tuberculosis mycobacteria. Tohoku J Exp Med.2004; 203: 47-52.、Tomoda A, Arai S, Ishida R, Shimamoto T, Ohyashiki K. An improved method for the rapid preparation of 2-amino-4,4α-dihydro-4α,7-dimethyl-3H-phenoxazine-3-one,a novel anti-tumor agent. Biorg Med Chem Lett. 2002; 11: 1057-1058）。Ｐｈｘ−1、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の構造は夫々、上記に示されたとおり、式２、式３及び式４で表される。
【００４９】
上記により製造されたＰｈｘ−1、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が夫々、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエチルアルコールの３：１（体積比）混合物を溶媒として、５ｍｇ／ｍｌになるように溶解された。これらの溶液は培養培地中において終濃度０．１、１及び１０μｇ／ｍｌとなるように、培養培地に添加された。培養培地中における該溶媒の最終的な体積割合は、Ｐｈｘ−1、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３フリーの細胞並びにＰｈｘ−1、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３処理された細胞の間で等しかった（０．２％（ｖ／ｖ））。
【００５０】
細胞株及び細胞培養
ＭＴ−１は、ＡＴＬ患者から樹立された白血病細胞由来のＴ細胞株である。
ＭＴ−２は、ＨＴＬＶ−１により形質転換されたＴ細胞株であり、且つ、Ｔａｘを含むウィルス遺伝子を恒常的に発現する。
ＨＵＴ−１０２は、ＡＴＬの患者から樹立されたＴ細胞株であり、且つ、ウィルス遺伝子を恒常的に発現する。
ＸＣは、ラット肉腫細胞株である。
すなわち、ＭＴ−１、ＭＴ−２及びＨＵＴ−１０２は、ＨＴＬＶ−１に感染したＴ細胞株であり、他方、ＸＣは、ＨＴＬＶ−１に感染していない細胞株である。
５％のＣＯ２及び９５％の空気を有する加湿されたインキュベーター中、３７℃で、１０％（ｗ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び８０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン（和光純薬工業株式会社）を追加されたＲＰＭＩ １６４０培地（和光純薬工業株式会社）（以下、ＰＲＭＩ培地に上記のＦＢＳ、Ｌ−グルタミン及び硫酸カナマイシンが追加されたものを「ＲＰＭＩ−１６４０培地」という）中において、これら４種の細胞株が培養された。
末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣという）は、健康成人からの採血により得られた血について密度勾配遠心を行うことにより単離された。該細胞は、１０Ｕ／ｍｌのインターロイキン（以下、ＩＬ−２という）（塩野義製薬株式会社）及び５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（以下、ＰＨＡという）（生化学工業株式会社）と一緒に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び８０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシンを補われたＲＰＭＩ １６４０培地中で、予め１週間、５％のＣＯ２及び９５％の空気を有する加湿されたインキュベーター中、３７℃で、培養された。
上記細胞株（ＭＴ−１、ＭＴ−２、ＨＵＴ−１０２、ＸＣ及びＰＢＭＣ）は、いずれも千葉工業大学工学部生命環境科学科遺伝子治療学・生態防御学研究室より提供された。また、ＭＴ−１、ＭＴ−２及びＨＵＴ−１０２については夫々、Miyoshi I, Kubonishi I, Sumida M, Hiraki S, Tsubota T, Kimura I, Miyamoto K, Sato J. A novel T-cell linederived from adult T-cell leukemia. Gann 1980;71:155−156、Miyoshi I, Kubonishi I, Yoshimoto S,Akagi T, Ohtsuki Y, shiraishi Y, Natata K, Hinuma Y. Type C virus particles in a cord T-cell line derived by co-cultivating normal human cord leukocytes and human leukaemic T cells. Nature. 1981;294:770−771、及び、Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, BunnPA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1980;77: 7415−7419も参照されたい。
【実施例１】
【００５１】
細胞増殖アッセイ及び細胞生存率アッセイ
ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＭＴ−１細胞、ＨＵＴ−１０２細胞及びＭＴ−２細胞（いずれも５×１０４細胞／２ｍｌ）、並びにＸＣ細胞（３×１０３細胞／２ｍｌ）、並びにＰＢＭＣ（１×１０５細胞／２ｍｌ）が、２４ウェルプレートの夫々のウェルに撒かれ、５％ＣＯ２と９５％の空気を含む加湿されたインキュベーター中、３７℃で７２時間培養された。当該培養は、種々の濃度（０、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）のＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の存在下で行われた。試料が、２４、４８及び７２時間で回収され、そして細胞増殖及び生存率の測定の為に用いられた。
【００５２】
細胞増殖は、血球計（パーキンエルマー社）を用いて、倒立方位相差顕微鏡下で細胞の数を数えることにより測定された。細胞生存率は、トリパンブルーにより処理された生存細胞の数を顕微鏡下で数えることにより測定された。簡潔に言うと、０、２４、４８及び７２時間での細胞の回収後、夫々のウェルの培地が、１００μｌのトリパンブルーを含む１ｍｌの新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地により交換された。次に、生存細胞の数が顕微鏡下で計数された。実験は３回行われた。
【００５３】
結果
図１Ａは、ＭＴ−１細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３それぞれの種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。これらのフェノキサジンは、ＭＴ−１細胞の増殖及び生存率を時間依存的及び用量依存的に抑制した。特に１０μｇ／ｍｌでの７２時間における生存率が、Ｐｈｘ−１については約６０％抑制され、Ｐｈｘ−２については約８０％抑制され、Ｐｈｘ−３については約７０％抑制された。１μｇ／ｍｌ以下では、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により処理されたＭＴ−１細胞の生存率は、全く影響されなかった。他方、細胞の増殖は、７２時間の間で、時間依存的に及び用量依存的に有意に抑制された。
図１Ｂは、ＨＵＴ−１０２細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。ＨＵＴ−１０２は、１０μｇ／ｍｌのこれらのフェノキサジンに対して感受性であり、すなわち細胞増殖及び細胞生存率が時間依存的及び用量依存的に広範に抑制された。
図１Ｃは、ＭＴ−２細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。１０μｇ／ｍｌの用量のＰｈｘ−３により、生存率が完全に抑制されたが、Ｐｈｘ−１及びＰｈｘ−２によっては、この用量では抑制されなかった。細胞増殖は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３により抑制された。これらのフェノキサジンのなかで、Ｐｈｘ−３が１０μｇ／ｍｌの用量で、ＭＴ−２細胞の細胞増殖及び生存率を最も強力に抑制した。
図１Ｄは、ＸＣ細胞の増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。ＸＣ細胞は、細胞増殖が１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により、７２時間で、非常に抑制されたが、細胞生存率はこれらのフェノキサジンによっては影響されなかった。
図１Ｅは、ＰＢＭＣの増殖及び生存率に対する、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の種々の濃度の効果を示す。結果は、３回の平均値である。１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１及びＰｈｘ−２により、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの生存率は抑制されなかったが、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−３に対しては中程度に感受性であった。他方、ＰＢＭＣの増殖は、これらのフェノキサジンにより、時間依存的及び用量依存的に有意に抑制された。これは、細胞生存率の点において、ＰＢＭＣが、ＡＴＬ細胞株よりも、これらのフェノキサジンに対してはるかに耐性であることを示す。
【００５４】
考察
上記の結果は、ＨＴＬＶ−１陽性Ｔ細胞が、細胞増殖及び細胞生存率の点において、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及び特にはＰｈｘ−３に対して感受性であることを示す。
他方、ＸＣ細胞株は、細胞生存率の点において、フェノキサジン処理に対して感受性でないが、細胞増殖の点において、１０μｇ／ｍｌの用量で、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３によって非常に抑制された。この結果は、ＸＣ細胞が、ＨＴＬＶ−１陽性細胞（宿主細胞）及びＨＴＬＶ−１陰性細胞（標的細胞）の間でのシンシチウム形成を研究する為に適当な細胞であることを示唆する。
ＰＨＡにより活性化されたＰＢＭＣの生存率は、Ｐｈｘ−１又はＰｈｘ−２によって影響されなかったが、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−３によって中程度に（約４０％）減少した。これは、正常Ｔ細胞を含むＰＢＭＣが、これらのフェノキサジンに対して比較的耐性であることを示す。
この事実は、非常に重要である。なぜならば、ＨＴＬＶ−１に冒されたＡＴＬ細胞の選択的なアポトーシス誘導が、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の投与によって可能であるからである。さらに、該投与によって正常細胞に対する有害な作用（副作用）は何ら引き起こされないからである。
ＰＢＭＣの細胞増殖は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により時間依存的に及び用量依存的に非常に抑制された。
【実施例２】
【００５５】
アポトーシス及びネクローシスの検出
アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｃ．、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（商標））を用いて、フローサイトメトリーにより、アポトーシス及びネクローシスの検出が実施された。ＭＴ−１細胞（５×１０５細胞／２ｍｌ）が、０、０．１、１及び１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により、６ウェルの平底プレートのウェル内で処理された。該処理の２４、４８、及び７２時間後に、細胞が回収され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ ７．４）により該回収した細胞が１回洗浄され、そして５００μｌの結合バッファー中に再懸濁された。なお、該バッファー中には、１．２５μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化アネキシンＶ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ）及び１０μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が予め添加されている。これらの試料が、暗所で、５分間、室温でインキュベートされた。次に、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）により、該試料が分析された。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合及びＰＩ染色が、ＦＩＴＣシグナル検出器（ＦＬ１、５１８ｎｍ）及びフィコエリトリン発光シグナル検出器（ＦＬ２、６２０ｎｍ）を用いて夫々モニターされた。
【００５６】
ＲＮＡ精製及びＲＴ−ＰＣＲ
ＭＴ−１細胞（５×１０５細胞／２ｍｌ）が、０、０．１、１、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により処理された。２４時間後、細胞が回収され、そして該回収した細胞から、全細胞ＲＮＡが、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）哺乳動物用ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）により抽出された。次に、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析が、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて実施された。カスパーゼファミリー（カスパーゼ−３、−５、−８及び−９、Ａｐａｆ−１）のｍＲＮＡレベルが、アポトーシス遺伝子セット−５についてのＭＰＣＲキット（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）により分析された。細胞内でのＲＮＡ発現の程度を分析する為に、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＲＮＡ由来の産物が、ＴＡＥバッファー中で、非変性２％アガロースゲルによって電気泳動され、そしてエチジウムブロマイド（Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ．、ダルムシュタット、ドイツ）により染色された。カスパーゼ−３、−５、−８及び−９、Ａｐａｆ−１について結果が、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）により定量され、そして正規化された。
【００５７】
カスパーゼ３活性のアッセイ
ＭＴ−１細胞中のカスパーゼ３の活性が、ＣａｓｐＧＬＯＷ（商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）による反応によって測定された。簡潔に言うと、ＭＴ−１細胞（５×１０５細胞／２ｍｌ）が、培地中に懸濁され、そして、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の存在下又は不在下において、５％ＣＯ２及び９５％空気を有する加湿されたインキュベーター中で、３７℃で、６ウェル平底プレートのウェル内でインキュベートされた。次に、該細胞が回収され、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により１回洗浄され、１μｌアリコットのＦＩＴＣ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫにより処理され、そして、暗所で３７℃で１時間インキュベートされた。次に、該細胞は、洗浄バッファーにより２回洗浄され、そして９６ウェル平底プレートのウェルへと移された。これらの試料は、マルチディテクションマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｅ ＸＳ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｏ．）を用いて、４８５ｎｍ励起／５３５ｎｍ発光の波長で分析された。カスパーゼ３の活性は３回評価され、そしてタンパク質含有量に基づき補正された。
【００５８】
細胞周期分析
ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＭＴ−１細胞（１．５×１０５細胞／ｍｌ）が、１２ウェル平底プレートのウェル内で、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２及び９５％の空気を有する加湿されたインキュベーター中で、３７℃で、インキュベートされた。上清が、２ｍｌの新鮮培地により交換され、そして終濃度１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３が夫々のウェルに添加された。指示された時間（２４時間、４８時間及び７２時間）で細胞を回収する２時間前に、細胞はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）により標識化され、そしてさらに２時間インキュベートされた。ＢｒｄＵにより標識化された細胞が、該指示された時間で集められ、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）バッファー（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）により固定化されそして浸透処理された。次に、該細胞は、ＤＮａｓｅにより３７℃で１時間処理され、そしてＦＩＴＣ標識化抗ＢｒｄＵ抗体により染色された。細胞は室温で２０分間暗所に置かれ、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）バッファーにより洗浄され、そしてアクチノマイシンＤにより処理された。細胞の細胞周期は、ＦＩＴＣ ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）を用いてフローサイトメーターにより分析された。
【００５９】
結果：アポトーシスの検出
ＭＴ−１の増殖と生存率は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により有意に影響されたので（図１Ａ）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合及びＰＩ染色方法を用いたフローサイトメトリーにより、ＭＴ−１細胞のアポトーシスがこれらのフェノキサジンにより引き起こされうるのかどうかを調査した（図２）。結果として、アネキシンＶ陰性且つＰＩ陰性の細胞（生存細胞：左下象限にプロットされる）の数は、２４〜７２時間の間で、溶媒だけにより処理された対照細胞において、主に観察された（図２）。アネキシンＶ陽性且つＰＩ陰性の細胞（早期段階アポトーシス細胞：右下象限にプロットされる）の数、及びアネキシンＶ陽性且つＰＩ陽性細胞（後期段階アポトーシス／ネクローシス細胞（アポトーシス細胞とネクローシス細胞とが混合したものである、以下同じ）、実際は培養ウェル中の浮遊性死細胞として検出される：右上象限にプロットされる）の数は１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により処理されたＭＴ−１細胞において増加した（図２）。後期段階アポトーシス／ネクローシス細胞の増加の速度は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３による夫々の試料において時間依存的であった。これらの結果は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が、ＭＴ−１細胞のアポトーシスを誘導することを示唆する。
【００６０】
結果：カスパーゼ３活性
２４時間での、ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼファミリー及びＡｐａｆ−１の転写レベルに対するＰｈｘ−３の影響を調査した（図３）。カスパーゼ−３、−５、−８及び−９、Ａｐａｆ−１のｍＲＮＡレベルは１０μｇ／ｍｌのｐｈｘ−３の存在下で２４時間後においてさえ、変化しなかった。この結果にもかかわらず、細胞が、１０μｇ／ｍｌのＰｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３と一緒に１６時間インキュベートされたときに、ＭＴ−１細胞におけるカスパーゼ３の活性は、非常に増強された（図４）。なお、図４の結果は、３回のアッセイ結果の平均値である。これらの結果は、フェノキサジンにより引き起こされたＭＴ−１細胞内のカスパーゼ３の活性化が、図２において示されたとおりＭＴ−１細胞におけるアポトーシスの結果と矛盾しないことを示唆する。さらには、カスパーゼ３の活性化を含む翻訳後の現象が、アポトーシス誘発にとって必須であることを示唆する。
【００６１】
結果：細胞周期分析
抗がん剤によるがん細胞のアポトーシス細胞死は細胞周期停止を伴うことが示唆されたので、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の存在下におけるＭＴ−１細胞の細胞周期停止の誘発を研究した。図５に示されるとおり、細胞がこれらのフェノキサジンと一緒に７２時間インキュベートされたときに、ＭＴ−１細胞の細胞周期停止が示された。細胞周期停止における大きな変化は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３が添加されたＭＴ−１細胞において、７２時間後に示された。すなわち、７２時間後で、ｓｕｂ Ｇ０／Ｇ１期停止の割合が、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３と一緒の夫々のＭＴ−１細胞について、８０％、５０％及び７０％であったが、他方で、これらのフェノキサジンが添加されていないＭＴ−１細胞（対照）についてのｓｕｂ Ｇ０／Ｇ１期停止の割合は、わずか２０％であった。この結果は、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３が、ＭＴ−１のアポトーシスを引き起こすことを実証する。また、この結果は図２における結果と一致する。しかしながら、Ｓ期の割合における違いは、対照のＭＴ−１及びフェノキサジンが添加されたＭＴ−１の間でほとんどなかった。
【００６２】
考察
ＨＴＬＶ−１のプロウィルスは、ＡＴＬ細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれている。上記の結果に記載されたとおりの、細胞周期停止及びアポトーシス誘導は、ＨＴＬＶ−１のプロウィルスの伝播を防ぎうる。これは、ＨＴＬＶ−１プロウィルスの複製を抑制することにより及び／又はＨＴＬＶ−１陽性ＡＴＬ細胞を選択的に排除することによりなされると考えられる。
【実施例３】
【００６３】
シンシチウム形成アッセイ
シンシチウム形成アッセイは、ＨＴＬＶ−１を有するＭＴ―２細胞と指標細胞ＸＣ細胞との共培養により行った。ＸＣ細胞は、１ｍＭのＥＤＴＡ中の０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンによる処理後に集められ、次にＰＢＳにより３回洗浄され、そして抗生物質を有するＲＰＭＩー１６４０培地中に再懸濁された。細胞（３×１０３細胞／ｍｌ）は、２４ウェル平底プレートのウェル内で、２４時間、５％ＣＯ２及び９５％空気を有する加湿されたインキュベーター中、３７℃で、インキュベートされた。次に、該培地が除去され、そして３×１０３細胞／ｍｌのＭＴ−２細胞が夫々のウェルに添加された。Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３が、別個のウェルに、終濃度０．１、１．０及び１０μｇ／ｍｌで、ＸＣ細胞とＭＣ−２細胞との共培養の開始で、添加された。２４、４８及び７２時間後に、細胞がＰＢＳにより１回洗浄され、そして、メタノール中の０．５％メチレンブルー及び０．１２５％クリスタルバイオレット（和光純薬工業株式会社）による染色を伴う又は伴わない顕微鏡分析に付された。シンシチウムが、位相差倒立顕微鏡（倍率：×１００）により、無作為に、５箇所の視野において数えられた。５超の核を有するシンシチウムが、倒立顕微鏡下で数えられた。なお、このアッセイ系において、ＨＴＬＶ−１を有する細胞株ＭＴ−２は通常、１０５の指標ＸＣ細胞当たり、５００〜８００のシンシチウムを通常に形成する。全ての実験は３回行われた。
【００６４】
結果：Ｐｈｘ−３のＨＴＬＶ−１の細胞間伝達に対する抑制
ＨＴＬＶ−１が細胞から細胞へという様式でＡＴＬの患者において伝播すること、及び、ＨＴＬＶ−１感染細胞とＨＴＬＶ−１非感染細胞とのシンシチウム形成がウィルス伝播の特徴であることが実証されている。図６Ａ−Ｈは、フェノキサジン無しの対照実験（図６Ａ及びＢ）、Ｐｈｘ−１による実験（図６Ｃ及びＤ）、Ｐｈｘ−２による実験（図６Ｅ及びＦ）又はＰｈｘ−３による実験（図６Ｇ及びＨ）における、ＨＴＬＶ−１陽性ＭＴ−２細胞とＨＴＬＶ−１陰性ＸＣ細胞との間のシンシチウム形成の顕微鏡分析を示す。図６Ａにおいて示されるとおり、染色無しの試料において（倍率：１００倍）、これらの細胞の間で５つのシンシチウム形成が観察された。試料が、メチレンブルー及びクリスタルバイオレットにより染色されたときに、これらのシンシチウム形成は、より明白に示された（図６Ｂ）。ＸＣ細胞及びＭＴ−２細胞が、Ｐｈｘ−１（図６Ｃ及びＤ）、Ｐｈｘ−２（図６Ｅ及びＦ）又はＰｈｘ−３（図６Ｇ及びＨ）と一緒に共培養されたときに、シンシチウム形成は非常に減少された。これらの結果は、図７において示されるヒストグラムとして示される。なお、図７の結果は、３回の実験結果の平均値である。Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２及びＰｈｘ−３の存在下において、ＭＴ−２細胞及びＸＣ細胞の間のシンシチウム形成は、非常に抑制されそして用量依存的に抑制された。これは、細胞から細胞へのＨＴＬＶ−１伝達が、これらのフェノキサジンにより抑制されたことを示す。
【００６５】
考察
ＨＴＬＶ−１は、ＨＴＬＶ−１を有する細胞と標的細胞との間の細胞間相互作用を通じて伝達される。上記細胞間相互作用が、シンシチウムの形成を引き起こす。上記シンシチウム形成では、ＨＴＬＶ−１を有する細胞上に発現されるエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４６−１９７と標的細胞表面に発現される７１ｋＤａ熱ショック同族（ＨＳＣ）タンパク質とが相互作用する。それ故に、シンシチウム形成についての試験は、ＨＴＬＶ−１伝達の抑制因子を評価する為に重要である。上記の結果は、ＨＴＬＶ−１陽性ＭＴ−２細胞とＨＴＬＶ−１陰性ＸＣ細胞との間でシンシチウム形成が観察されたこと、及び、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３の添加により、時間依存的に且つ用量依存的に、シンシチウム形成が有意に抑制されたことを示す。これは特に、これらのフェノキサジンが１０μｇ／ｍｌで添加されたときに顕著であった。これらの結果は、ＨＴＬＶ−１の、宿主細胞から標的細胞への伝達が、Ｐｈｘ−１、Ｐｈｘ−２又はＰｈｘ−３により、抑制されうることを示唆する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式1
【化１】
（ここで式1中、
Ｒ１は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ２は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ３は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ４は、アミノ基又はオキソ基であり、及び
Ｒ５は、アミノ基又はオキソ基である）の化合物又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含むウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｒ２及びＲ３が互いに独立に、水素原子、メチル基、エチル基及びアセチル基から成る群から任意に選択される、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項３】
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がアミノ基であり及びＲ５がオキソ基である、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項４】
Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がオキソ基であり及びＲ５がアミノ基である、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項５】
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４がアミノ基であり及びＲ５がオキソ基である、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項６】
該ウィルスがレトロウィルス科のウィルスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項７】
該ウィルスがオンコウィルス亜科のウィルスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項８】
該ウィルスがＨＴＬＶ−１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項９】
該ウィルス感染細胞が、ＨＴＬＶ−１に感染したヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項１０】
該ウィルス感染細胞が、ＨＴＬＶ−１に感染したヒトＴ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項１】
式1
【化１】
（ここで式1中、
Ｒ１は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ２は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ３は、水素原子、炭素原子数１〜４の低級アルキル基、炭素原子数１〜４のアシル基及び炭素原子数１〜４のアシルオキシ基から成る群から任意に選択され、
Ｒ４は、アミノ基又はオキソ基であり、及び
Ｒ５は、アミノ基又はオキソ基である）の化合物又はその医薬的に許容される塩若しくはエステルを有効成分として含むウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｒ２及びＲ３が互いに独立に、水素原子、メチル基、エチル基及びアセチル基から成る群から任意に選択される、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項３】
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がメチル基であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がアミノ基であり及びＲ５がオキソ基である、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項４】
Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がメチル基であり、Ｒ４がオキソ基であり及びＲ５がアミノ基である、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項５】
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ４がアミノ基であり及びＲ５がオキソ基である、請求項１に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項６】
該ウィルスがレトロウィルス科のウィルスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項７】
該ウィルスがオンコウィルス亜科のウィルスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項８】
該ウィルスがＨＴＬＶ−１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項９】
該ウィルス感染細胞が、ＨＴＬＶ−１に感染したヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【請求項１０】
該ウィルス感染細胞が、ＨＴＬＶ−１に感染したヒトＴ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のウィルス感染細胞抑制剤。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１６８３１５（Ｐ２０１０−１６８３１５Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２８７８（Ｐ２００９−１２８７８）
【出願日】平成２１年１月２３日（２００９．１．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１１月２０日 ＢＭＢ２００８（第３１回日本分子生物学会年会・第８１回日本生化学会大会合同大会）発行の「第８１回日本生化学会大会第３１回日本分子生物学会年会合同大会プログラム・講演要旨集」（ＣＤ−ＲＯＭ）に発表
【出願人】（５０９０２５０６１）
【出願人】（５０９０２５０７２）
【出願人】（５９７０３２９８５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２３日（２００９．１．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年１１月２０日 ＢＭＢ２００８（第３１回日本分子生物学会年会・第８１回日本生化学会大会合同大会）発行の「第８１回日本生化学会大会第３１回日本分子生物学会年会合同大会プログラム・講演要旨集」（ＣＤ−ＲＯＭ）に発表
【出願人】（５０９０２５０６１）
【出願人】（５０９０２５０７２）
【出願人】（５９７０３２９８５）
【Ｆターム（参考）】
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