ウイルスｍｉＲＮＡおよびウイルス関連ｍｉＲＮＡならびにその使用
本明細書にはウイルス感染に関連する新規なポリヌクレオチドが記載される。このポリヌクレオチドはｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ前駆体である。医学的状態の診断、予後診断および治療に用いることのできる、関連する方法および組成物が開示される。また、本明細書には、ウイルス感染の調節因子を同定するために用いることのできる方法も記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ウイルスのマイクロＲＮＡ分子およびウイルス感染に関連するヒトマイクロＲＮＡ分子の群、ならびにそれと関連するかまたはそれに由来する種々の核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの短いＲＮＡオリゴヌクレオチドであって、遺伝子制御に関与する。マイクロＲＮＡは、切断または翻訳抑制のためのｍＲＮＡを標的とすることにより遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびヒトをはじめとする広範囲の種に存在するが、これらはごく最近になって同定されたものである。より重要なことに、疾患の発生および進行におけるｍｉＲＮＡの役割はごく最近になって認識されるようになった。
【０００３】
サイズが小さいことから、ｍｉＲＮＡは今まで標準的な方法論を用いて同定するのが困難であった。限られた数のｍｉＲＮＡが、大量のＲＮＡを抽出することにより同定されている。また、ｍｉＲＮＡは、視覚によって識別可能な表現型の提示に寄与していることが確認されている。発現アレイデータにより、ｍｉＲＮＡが異なる発生段階、または異なる組織で発現することが示されている。ｍｉＲＮＡが、ある種の組織または限定された発生段階に限られていることは、現在までに同定されているｍｉＲＮＡが全ｍｉＲＮＡのごく小さな一部分である可能性が高いことを示している。
【０００４】
近年、ゲノムの残りのｍｉＲＮＡを同定するためのコンピュータによるアプローチが開発された。ＭｉＲｓｃａｎおよびＭｉＲｓｅｅｋｅｒなどのツールがｍｉＲＮＡを同定し、ｍｉＲＮＡは後に実験によって確認された。これらのコンピュータツールに基づいて、ヒトゲノムには２００〜２５５のｍｉＲＮＡ遺伝子が含まれると推定されている。しかし、これらの推定値は、これから同定される残りのｍｉＲＮＡが既に同定されたｍｉＲＮＡと同じ特性を持つであろうという仮説に基づいている。哺乳類の生物学および疾患におけるｍｉＲＮＡの根本的な重要性を踏まえて、未知のｍｉＲＮＡを同定するための技術が必要である。本発明はこの必要を満たし、多数のｍｉＲＮＡおよびその使用を提供する。現在まで、ウイルスのｍｉＲＮＡは全く検出されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、診断目的のため、また標的遺伝子発現の改変のために有用であり得る、ウイルスｍｉＲＮＡおよびウイルス関連ｍｉＲＮＡの核酸配列、その前駆体、その標的配列および関連配列を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合部位、またはその変異体の配列を含む、単離された核酸に関する。該核酸は、配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３；表１、１１〜１２、もしくは２１〜２３に参照される前駆体の配列；配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；配列番号：１１４２４１７〜４０９７７２０；表４、１０もしくは１５〜１６に参照される標的遺伝子結合部位の配列；その相補物；またはそれと少なくとも７０％同一の、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む配列を含みうる。単離された核酸は、５〜２５０ヌクレオチド長でありうる。
【０００７】
また、本発明は前記核酸を含むプローブにも関する。該プローブは、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡ、またはその変異体と相補的な、少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含みうる。また、該プローブは、ウイルス感染で差次的に発現するヒトｍｉＲＮＡ、またはその変異体と相補的な少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含みうる。
【０００８】
また、本発明は、複数個の前記プローブにも関する。該複数個のプローブには少なくとも１０個の前記プローブが含まれうる。また、該複数個のプローブには少なくとも１００個の前記プローブが含まれていてもよい。また、本発明は、１個のプローブまたは複数個のプローブを含む組成物に関する。また、本発明は固体基板を含むバイオチップにも関し、前記基板は複数個の前記プローブを含む。各々のプローブは、空間的に定義されたアドレスにおいて該基板に付着させることができる。バイオチップは、ウイルスｍｉＲＮＡと相補的なプローブを含みうる。また、該バイオチップはウイルス感染中の発現により特徴付けられるヒトｍｉＲＮＡと相補的であるプローブを含みうる。
【０００９】
また、本発明は、疾患に関連したｍｉＲＮＡの差次的発現を検出する方法にも関する。生体試料を用意し、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照される配列；またはその変異体と少なくとも７０％同一である核酸のレベルを測定する。対照区と比較した核酸のレベルの違いが差次的発現を示す。
【００１０】
また、本発明は、病理状態を調節する化合物を同定する方法にも関する。配列番号：１〜１１４２４１６；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体と少なくとも７０％同一である核酸を発現することのできる細胞を準備する。この細胞を候補調節因子と接触させた後、核酸の発現レベルを測定する。対照と比較した核酸のレベルの違いで、化合物を核酸に関連する病理状態の調節因子であると同定する。
【００１１】
また、本発明は、細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法にも関する。核酸は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で細胞へ導入される。標的遺伝子は、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位、またはその変異体と実質的に同一な結合部位を含みうる。核酸は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５の一部分；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体を含みうる。標的遺伝子の発現は、インビトロでもインビボでも阻害させることができる。
【００１２】
また、本発明は、細胞において標的遺伝子の発現を増加させる方法にも関する。核酸は、標的遺伝子の発現を増加させるのに十分な量で細胞へ導入される。標的遺伝子は、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位、またはその変異体と実質的に同一な結合部位を含みうる。核酸の一部分は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体と実質的に相補的でありうる。標的遺伝子の発現は、インビトロでもインビボでも阻害されうる。標的遺伝子の発現は、インビトロでもインビボでも増加させることができる。
【００１３】
また、本発明は、配列番号：１〜７６０６１６の配列；表１０に示される配列；表１７に示される配列；またはその変異体を含む核酸を、それを必要とする患者へ投与する段階を含む、表６に示される疾患を有する患者を治療する方法にも関する。
【００１４】
また、本発明は、その核酸の一部分が、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体と実質的に相補的である核酸を、それを必要とする患者へ投与する段階を含む、ウイルス感染患者またはウイルス感染に関連する状態の患者を治療する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ウイルスｍｉＲＮＡおよびウイルス関連ｍｉＲＮＡの核酸配列、その前駆体、その標的および関連配列を提供する。このような核酸は診断用途に、また標的遺伝子発現の改変に有用である。本発明の他の態様は、以下の本発明の記述により当業者に明らかとなるであろう。
【００１６】
１．定義
本発明の化合物、産物および組成物ならびに方法を開示および記載する前に、本明細書において用いられる用語が、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであって、限定を目的とするものではないことを理解されたい。本明細書および添付の請求項において用いられるように、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈中で明確に別に指示がない限り、複数の指示物を含むことを留意しなければならない。さらに、「および」と「または」という語は、文脈中で明確に別に指示がない限り、接続的な意味と離接的な意味の双方を包含する可能性があることを留意しなければならない。
【００１７】
本明細書において「動物」は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、雌ウシ、サルおよびヒトを意味しうる。
【００１８】
本明細書において、プローブおよび固相支持体に言及して「付着した」または「固定化した」とは、プローブと固相支持体との間の結合が、結合、洗浄、分析、および除去という条件下で安定しているのに十分であることを意味する。結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。共有結合は、プローブと固相支持体との間で直接形成されるか、あるいは架橋剤によるか、または固相支持体もしくはプローブのいずれかまたは双方の分子の特異的反応性基の封入により形成されうる。非共有結合は静電相互作用、親水性相互作用、および疎水性相互作用のうちの１種類以上であってよい。非共有結合に含まれるものは、ストレプトアビジンなどの分子の支持体への共有結合、およびビオチン化プローブのストレプトアビジンとの非共有結合である。また、固定化には、共有相互作用と非共有相互作用の組合せが含まれうる。
【００１９】
本明細書において用いられる「生体試料」は、核酸を含む生体組織または生体液の試料を意味しうる。このような試料としては、動物から単離された組織が挙げられるが、これらに限定されない。また、生体試料としては生検および剖検試料などの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛髪、および皮膚が挙げられる。また、生体試料としては、患者組織に由来する外植片ならびに一次細胞培養および／または形質転換細胞培養が挙げられる。生体試料は、動物から細胞の試料を取り出すことにより準備することができるが、既に単離された細胞（例えば、別の人物から単離された、別の時間に単離された、および／または別の目的のために単離された細胞）を用いることによるか、あるいは本発明の方法をインビボで行うことにより達成することもできる。保存用組織、例えば治療または転帰履歴を有するものなどを用いてもよい。
【００２０】
本明細書において用いられる「相補物」または「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間の、ワトソン−クリック塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成を意味しうる。
【００２１】
「差次的発現（Differential expression）」とは、細胞内および細胞間ならびに組織内および組織間での、時間的および／または細胞の遺伝子発現パターンにおける定性的または定量的差異を意味しうる。従って、差次的に発現した遺伝子は、例えば正常組織か疾患組織での活性化または不活性化をはじめ、定性的にその発現を変化させることができる。遺伝子は、別の状態と比較して特定の状態でスイッチを入れたり切ったりすることができるため、２つまたはそれ以上の状態を比較することができる。定性的に制御された遺伝子は、１つの状態または細胞種内で、標準的な技術により検出可能な１つの発現パターンを提示する。いくつかの遺伝子は、１つの状態または細胞種内で発現するが、双方ともには発現しない。あるいは、発現の差異は、例えば、発現が調節されていると、上方制御されてその結果転写物の量が増加するか、または下方制御されてその結果転写物の量が減少するという点で定量的でありうる。発現の異なる程度は、標準的な特性化技術、例えば発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン解析、およびＲＮａｓｅ保護などを介して定量化するために十分なほど大きくさえあればよい。
【００２２】
本明細書において用いられる「遺伝子」とは、転写および／もしくは翻訳制御配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子でありうる。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能性ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列でありうる。また、遺伝子は、所望によりそれと結合している５’−または３’−非翻訳配列を含むコード領域（例えば、エキソンおよびｍｉＲＮＡ）に相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでもありうる。また、遺伝子は、コード領域および／またはそれと結合している５’−または３’−非翻訳配列の全てまたは一部を含む、インビトロで作製された核酸分子を増幅させてもよい。
【００２３】
本明細書において用いられる「宿主細胞」は、ベクターを含有してベクターの複製を支持する、天然に存在する細胞または形質転換細胞でありうる。宿主細胞は、培養細胞、外植片、インビボ細胞、その他でありうる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくは哺乳類細胞などの真核細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａなどでありうる。
【００２４】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で用いられる「同一」または「同一性」とは、これらの配列が、特定の領域に関して同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸を特定の割合で有することを意味する。この割合は、２つの配列を最適にアラインして比較することにより計算することができ、特定領域の２つの配列を比較し、双方の配列において同一残基の現れる位置の数を測定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定領域中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより配列同一性の割合を得る。２つの配列が異なる長さであるか、アラインメントによりねじれた末端が生じて特定の比較領域に単一の配列しか含まれない場合、単一の配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とを同等とみなす。同一性の確認は、手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いて行ってよい。
【００２５】
本明細書において用いられる「阻害する」とは、防ぐ、抑制する、減らすまたは除去することを意味しうる。
【００２６】
本明細書において用いられる「標識」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段により検出可能な組成物を意味しうる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度の試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられているようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン類および検出可能とすることのできる他の存在物が挙げられる。標識は、核酸およびタンパク質のどの位置に組み入れてもよい。
【００２７】
本明細書において用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも２個の互いに共有結合したヌクレオチドを意味しうる。当業者には明らかなように、一本鎖に関する描写は相補鎖の配列も規定する。従って、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。また、当業者には明らかなように、核酸の多くの変異体を同じ目的のために所与の核酸として用いることができる。従って、核酸は、実質的に同一な核酸およびその相補物も包含する。また、当業者には明らかなように、一本鎖から、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズしうるプローブのためのプローブがもたらされる。従って、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２８】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってよく、または二本鎖と一本鎖双方の配列の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡであるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、その際核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンをはじめとする塩基の組合せを含んでよい。これらの核酸は、化学的な合成法または組換え法により得ることができる。
【００２９】
核酸は一般にリン酸ジエステル結合を含有するが、少なくとも１つの異なる結合、例えば、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合、およびペプチド核酸骨格および結合を有しうる核酸類似体も含み得る。他の核酸類似体としては、陽性骨格；非イオン性骨格、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号に記載されているものを含むリボースを含まない骨格を有するものが挙げられる。また、１以上の天然に存在しないヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含有する核酸も核酸の１つの定義に含められる。修飾されたヌクレオチド類似体は、例えば核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置しうる。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖修飾または骨格修飾リボヌクレオチドから選択されうる。しかし、注意すべきは、核酸塩基を修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、５位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；ジアザヌクレオチド、例えば７−ジアザ−アデノシン；Ｏ−アルキル化およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどの、天然に存在する核酸塩基の代わりに天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドも適している。２’−ＯＨ−基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2またはＣＮ（但し、ＲはＣ1−Ｃ6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）から選択される基で置換することができる。リボース−リン酸骨格の修飾は、種々の理由、例えば、生理環境でこのような分子の安定性および半減期を増加させるため、またはバイオチップでのプローブとするためになされうる。天然に存在する核酸と類似体の混合物を作成してもよい；あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物を作成してもよい。
【００３０】
本明細書において用いられる「作動可能なように連結された」とは、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結したプロモーターの制御下にあることを意味しうる。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置しうる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターの由来する遺伝子においてプロモーターが遺伝子を制御するプロモーターと遺伝子との間の距離とほぼ同じでありうる。当技術分野で公知のように、この距離における変動にはプロモーター機能を損なうことなく適応することができる。
【００３１】
本明細書において用いられる「プローブ」とは、１種類以上の化学結合によって、通常相補的塩基対形成によって、通常水素結合形成によって、相補配列の標的核酸と結合可能なオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列と結合する可能性がある。標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨げることのある塩基対のミスマッチは何個もありうる。しかし、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下であってさえもハイブリダイゼーションが起こらないほど突然変異の数が多い場合、配列は相補的な標的配列ではない。プローブは一本鎖でもあってもよいし、または部分的に一本鎖かつ部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖の数（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は標的配列の構造、組成、および特性の影響を受ける。プローブは、後にストレプトアビジン複合体と結合するビオチンなどで直接的に標識してもよいし、間接的に標識してもよい。
【００３２】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、細胞において核酸の発現をもたらし、活性化させ、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味しうる。プロモーターは、その発現をさらに増強するため、かつ／またはその空間的な発現および／もしくは時間的な発現を改変するための、１個以上の特異的な調節エレメントを含みうる。また、プロモーターは、末端のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含むことができ、これは転写開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来しうる。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構成的に制御するか、あるいは、発現の起こる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現の起こる発生段階に関して差次的に制御するか、あるいは、生理的ストレス、病原体、金属イオン、または誘発剤などの外部刺激に応答して制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３３】
本明細書において用いられる「選択マーカー」とは、それが発現する細胞に、遺伝子構築物でトランスフェクトしたかまたは形質転換した細胞の同定および／または選択を促進するための表現型を付与する任意の遺伝子を意味しうる。選択マーカーの代表的な例としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr）、細菌性のカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎr）、ゼオシン耐性遺伝子、抗生物質オーレオバシジンＡに対する耐性を付与するＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００３４】
本明細書において用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複合混合物中などで、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を意味しうる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、環境が異れば該条件も異なるであろう。一般的には、ストリンジェントな条件は、ある決められたイオン強度ｐＨで特定の配列の熱融解温度（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるよう選択される。Ｔmは、標的と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下での）でありうる（標的配列が過剰に存在するため、Ｔmでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍナトリウムイオン未満、一般に約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃でありうる。また、ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されうる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、少なくともハイブリダイゼーションバックグラウンドの２〜１０倍でありうる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、以下の条件が挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣ中で洗浄、および６５℃で０．１％ＳＤＳ。
【００３５】
本明細書において用いられる「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に関して第２の配列の相補物と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味しうる。
【００３６】
本明細書において用いられる「実質的に同一」とは、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸領域に関して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、または核酸に関して、第１の配列が実質的に第２の配列の相補物と相補的である場合を意味しうる。
【００３７】
本明細書において用いられる「標的」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で１以上のプローブにより結合されうるポリヌクレオチドを意味しうる。
【００３８】
本明細書において用いられる「ターミネーター」とは、転写の終結を知らせる転写単位の末端の配列を意味しうる。ターミネーターは、ポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳ＤＮＡ配列であってよく、これはポリアデニル酸配列の一次転写産物の３’末端への添加を促進しうる。ターミネーターは、ウイルス、細菌、菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来しうる。ターミネーターの代表的な例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナル、ＣＹＣ１ターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＳＰＡターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネーター、トウモロコシ由来のゼイン遺伝子ターミネーター、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット遺伝子（ＳＳＵ）遺伝子ターミネーター配列、サブクローバー萎縮ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子配列ターミネーター、ロー因子非依存性大腸菌ターミネーター、およびｌａｃＺ αターミネーターが挙げられる。
【００３９】
本明細書においてある状態からの動物の保護に言及する際に用いられる「治療」または「治療すること」とは、その状態を予防すること、抑制すること、抑圧すること、または除去することを意味する。状態を予防することは、状態の発生より前に本発明の組成物を動物へ投与することを伴う。状態を抑制することは、状態の誘導後であるがその臨床上の出現の前に本発明の組成物を動物へ投与することを伴う。状態を抑圧することは、状態が臨床上出現した後にその状態を緩和させるかまたは悪化を防ぐように本発明の組成物を動物へ投与することを伴う。状態の除去は、状態が臨床上出現した後に動物がそれ以上当該状態に苦しまないように本発明の組成物を動物へ投与する工程を伴う。
【００４０】
本明細書において用いられる「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味しうる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターでありうる。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってもよく、宿主ゲノムへ組み込まれるベクターであってもよい。
【００４１】
２．マイクロＲＮＡ
哺乳類ｍｉＲＮＡの成熟についての現在のモデルを図１に示すが、理論に束縛されるのではない。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、転写されてｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られるｍｉＲＮＡ前駆体の産生をもたらす。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、複数のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含むポリシストロニックＲＮＡの一部でありうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ステムおよびループを有するヘアピンを形成しうる。図１に示されるように、ステムにはミスマッチした塩基が含まれうる。
【００４２】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａに認識されうる。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの末端のループを認識し、ステムの中へ入っておよそ螺旋２回転分を切断してｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ｎｔの前駆体を産生する。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼにはよくある切断部のねじれた状態で切断して５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングをもつｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループが得られる。Ｄｒｏｓｈａの切断部位から伸びるステムのおよそ螺旋１回転分（約１０ヌクレオチド）は、効果的なプロセシングに必須でありうる。その後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはＲａｎ−ＧＴＰおよび輸送受容体Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５により核から細胞質へと活発に移送される。
【００４３】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、これもまたＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるダイサーに認識されうる。ダイサーはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムを認識しうる。また、ダイサーは、ステムループの基部の５’リン酸および３’オーバーハングを認識しうる。ダイサーは、ステムループの基部から末端のループを螺旋２回転分切断して、さらなる５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す。得られたｓｉＲＮＡ様の二重鎖は、ミスマッチを含みうるが、成熟ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*として知られる同様のサイズの断片を含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの反対側のアームに由来しうる。ｍｉＲＮＡ*配列は、クローン化ｍｉＲＮＡのライブラリーに見出すことができるが、一般にｍｉＲＮＡよりも頻度が低い。
【００４４】
最初はｍｉＲＮＡ*を含む二本鎖種として存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的に一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボヌクレオタンパク質複合体へ組み込まれる。種々のタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、それらのタンパク質がｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ*二重鎖、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制または活性化）に対する特異性に可変性をもたらし得、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ*二重鎖のどちらの鎖もＲＩＳＣへ組み込まれる。
【００４５】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ*二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣへ組み込まれる場合、ｍｉＲＮＡ*は除去されて分解されうる。ＲＩＳＣへ組み込まれているｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ*二重鎖の鎖は、その５’末端があまり緊密に対形成されていない鎖でありうる。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ*の双方の末端がほぼ同等の５’対を形成している場合、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ*の双方は遺伝子サイレンシング活性を有しうる。
【００４６】
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高レベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８により標的核酸を同定することができる。動物においてｍｉＲＮＡとその標的との間の相互作用がｍｉＲＮＡの全長に沿っていた例が一つだけ報告されている。これは、ｍｉｒ−１９６とＨｏｘ Ｂ８に関して示され、さらにｍｉｒ−１９６がＨｏｘ Ｂ８ ｍＲＮＡの切断を媒介することが示された（Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４）。それ以外では、このような相互作用は植物でしか知られていない（Ｂａｒｔｅｌ ＆ Ｂａｒｔｅｌ ２００３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３２−７０９）。
【００４７】
多数の研究が、効率的な翻訳の阻害を達成するために、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対形成の必要条件に目を向けてきた（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６−２８１に総説されている）。哺乳類細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要である可能性がある（Ｄｏｅｎｃｈ ＆ Ｓｈａｒｐ ２００４ ＧｅｎｅｓＤｅｖ ２００４−５０４）。しかし、マイクロＲＮＡの他の部分もｍＲＮＡ結合に関与する可能性がある。さらに、３’での十分な塩基対形成は５’での不十分な対形成を補い得る（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ａｔ ａｌ，２００５ ＰＬｏＳ ３−ｅ８５）。ｍｉＲＮＡ結合を全ゲノムで解析する評価研究から、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’の塩基２〜７の特異的役割が示唆されているが、通常「Ａ」であると見出される最初のヌクレオチドの役割も認識された（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｔ ２００５ Ｃｅｌｌ １２０−１５）。同様に、ヌクレオチド１〜７または２〜８が、Ｋｒｅｋらにより標的の同定および確認に用いられた（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７−４９５）。
【００４８】
ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ中、３’ＵＴＲ中またはコード領域中でありうる。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが同一または複数の部位を認識することにより同じｍＲＮＡ標的を制御しうる。大部分の遺伝学的に同定された標的中に複数のｍｉＲＮＡ相補部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの協同的な作用により最も効率的な翻訳阻害がもたらされることが示されうる。
【００４９】
ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに命令して２つの機構：ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制、のいずれかにより遺伝子発現を下方制御し得る。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対してある程度の相補性を有する場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指示し得る。ｍｉＲＮＡが切断を導く場合、該切断はｍｉＲＮＡの残基１０および１１と対形成しているヌクレオチド間でありうる。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有さない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制しうる。動物はより低度の相補性を有し得るため、翻訳抑制は動物においてより優勢であろう。
【００５０】
注意すべきは、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ*の任意の対の５’末端および３’末端には可変性がありうるということである。この可変性は、切断の部位に関してＤｒｏｓｈａおよびダイサーの酵素によるプロセッシングの可変性に起因しうる。また、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*の５’末端および３’末端の可変性は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因しうる。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造からなる集団をもたらしうる。また、ステム構造における可変性も、Ｄｒｏｓｈａおよびダイサーによる切断の産物の可変性につながる。
【００５１】
３．核酸
本発明は、配列番号：１〜４２０４９１５に参照される核酸配列、表１、４、１０〜１４および２１〜２３に参照される配列、ならびにその変異体を含む、単離された核酸に関する。該変異体は、参照された核酸配列の相補物でありうる。また、該変異体は、参照される核酸配列またはその相補物と実質的に同一な核酸配列でありうる。また、該変異体は、ストリンジェントな条件下で、参照される核酸配列、その相補物、またはそれと実質的に同一の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列でありうる。
【００５２】
核酸は、１０〜１００ヌクレオチド長でありうる。核酸は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９，３０、３５、４０、４５、５０，６０、７０、８０または９０ヌクレオチド長でありうる。核酸は、合成されるかまたは以下に記載する合成遺伝子を用いて細胞内（インビトロまたはインビボ）で発現される。核酸は、一本鎖分子として合成され、実質的に相補的な核酸とハイブリダイズされて二重鎖を形成しうるが、これを本発明の核酸とみなす。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖の形態で、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，５５９号に記載されるものをはじめとする、当業者に公知の方法を用いて合成遺伝子により発現させることのできる形態で、細胞、組織または器官へ導入することができる。
【００５３】
ａ．Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列またはその変異体を含みうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜２５０、５５〜２００、７０〜１５０または８０〜１００ヌクレオチドを含みうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、以下に述べるようにｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*を含みうる。また、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ*およびその相補物、ならびにその変異体を含みうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、少なくとも１９％のアデノシンヌクレオチド、少なくとも１６％のシトシンヌクレオチド、少なくとも２３％のチミンヌクレオチドおよび少なくとも１９％のグアニンヌクレオチドを含みうる。
【００５４】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造を形成しうる。このヘアピン構造には、実質的に相補的である第１の核酸配列と第２の核酸配列が含まれうる。第１および第２の核酸配列は、３７〜５０ヌクレオチドでありうる。第１および第２の核酸配列は、８〜１２ヌクレオチドの第３の配列によって隔てられうる。このヘアピン構造は、その内容が本明細書に組み込まれるＨｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ １２５：１６７−１８８（１９９４）に記載されるように、Ｖｉｅｎｎａアルゴリズムにより初期値のパラメータを用いて算出される−２５Ｋｃａｌ／モル未満の自由エネルギーを有しうる。このヘアピンは、４〜２０、８〜１２または１０ヌクレオチドの末端ループを有しうる。
【００５５】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３、表１に参照される前駆体、表１１〜１２および２１〜２３に参照される配列の配列、またはその変異体を含みうる。
【００５６】
ｂ．Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列またはその変異体をも含みうる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０、６０〜８０または６０〜７０ヌクレオチドを含みうる。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、以下に述べるようにｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*を含みうる。また、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ*およびその相補物、ならびにその変異体を含みうる。また、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端から０〜１６０ヌクレオチドを除くｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列でありうる。
【００５７】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３、表１に参照される前駆体、表１１〜１２および２１〜２３に参照される配列の配列、またはその変異体を含みうる。
【００５８】
ｃ．ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はまた、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*またはその変異体の配列を含みうる。ｍｉＲＮＡ配列は、１３〜３３、１８〜２４または２１〜２３ヌクレオチドを含みうる。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドでありうる。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３ヌクレオチドでありうる。
【００５９】
ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、表１に参照されるｍｉＲＮＡ、表１１〜１２および２１〜２３に参照される配列の配列、またはその変異体を含みうる。
【００６０】
ｄ．抗ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はまた、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ*の活性を阻害することの可能な抗ｍｉＲＮＡの配列をも含みうる。抗ｍｉＲＮＡは、合計５〜１００または１０〜６０ヌクレオチドを含みうる。また、抗ｍｉＲＮＡは、少なくとも合計５、６、７，８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含みうる。抗ｍｉＲＮＡの配列は、（ａ）ｍｉＲＮＡの５’と実質的に同一である少なくとも５ヌクレオチド、および前記ｍｉＲＮＡの５’末端から標的部位の隣接領域に対して実質的に相補的である少なくとも５〜１２ヌクレオチド、または（ｂ）ｍｉＲＮＡの３’と実質的に同一である少なくとも５〜１２ヌクレオチド、および前記ｍｉＲＮＡの３’末端から標的部位の隣接領域に対して実質的に相補的である少なくとも５ヌクレオチドを含みうる。
【００６１】
抗ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５の相補物、表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、またはその変異体を含みうる。
【００６２】
ｅ．標的の結合部位
本発明の核酸はまた、標的ｍｉＲＮＡ結合部位の配列、またはその変異体をも含みうる。標的部位配列は、合計５〜１００または１０〜６０ヌクレオチドを含みうる。標的部位配列は、配列番号：１１４２４１７〜４０９７７２０の少なくとも５ヌクレオチド、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される標的遺伝子結合部位の配列、またはその変異体を含みうる。
【００６３】
４．合成遺伝子
本発明はまた、転写制御配列および／または翻訳制御配列と作動可能なように連結された本発明の核酸を含む合成遺伝子にも関する。合成遺伝子は、本発明の核酸の結合部位を含む標的遺伝子の発現を修飾することが可能であり得る。標的遺伝子の発現は、細胞、組織または器官において修飾されうる。合成遺伝子は、合成されるか、または標準的な組換え技術により天然に存在する遺伝子から得ることができる。また、合成遺伝子は、合成遺伝子配列の転写単位の３’末端のターミネーターを含みうる。また、合成遺伝子は、選択マーカーを含みうる。
【００６４】
５．ベクター
本発明はまた、本発明の合成遺伝子を含むベクターにも関する。ベクターは、発現ベクターでありうる。発現ベクターは、さらなる要素を含みうる。例えば、この発現ベクターは、それが２種類の生物中で維持される、例えば、発現用の哺乳類もしくは昆虫細胞中、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物宿主中で維持されることを可能とする２つの複製系を有しうる。複数の発現ベクターを統合するため、この発現ベクターには、少なくとも１つの宿主細胞ゲノムに相同な配列、および好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列が含まれうる。組み込み型ベクターは、ベクター内へ封入するための適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞中の特定の遺伝子座に向けることができる。また、ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含みうる。
【００６５】
６．宿主細胞
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞にも関する。細胞は、細菌、菌、植物、昆虫または動物細胞であってよい。
【００６６】
７．プローブ
本発明は、本発明の核酸を含むプローブにも関する。プローブは、下に概説されるように、スクリーニングおよび診断法に用いられうる。プローブは、固体基板、例えばバイオチップへ付着または固定化することができる。
【００６７】
プローブは、８〜５００、１０〜１００または２０〜６０ヌクレオチド長でありうる。また、プローブは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００ヌクレオチド長でありうる。プローブは、１０〜６０ヌクレオチドのリンカー配列をさらに含みうる。
【００６８】
８．バイオチップ
本発明はバイオチップにも関する。バイオチップは、本発明のプローブもしくは複数個のプローブを付着させて含む固体基板を含みうる。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズ可能でありうる。プローブは、空間的に定義されたアドレスで基板上に付着されうる。１つの標的配列につき、１以上のプローブを用いることができ、それはオーバーラップするプローブかまたは特定の標的配列の異なる切片に対するプローブでありうる。プローブは、単一の疾患に関連する標的配列とハイブリダイズ可能でありうる。
【００６９】
プローブは、当業者に理解されるように、多様な方法でバイオチップへ付着させることができる。プローブは、最初に合成した後、バイオチップへ付着させてもよいし、または直接バイオチップ上で合成してもよい。
【００７０】
固体基板は、プローブの付着もしくは会合に適切な分離した別個の部位を含むよう修正することができ、かつ、少なくとも１つの検出法に敏感に反応する材料でありうる。基板の代表的な例としては、ガラスおよび修飾ガラスもしくは機能性ガラス、プラスチック類（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊ、その他を含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリコンおよび修飾シリコンを含むシリカ系材料、カーボン、金属、無機ガラス類および無機プラスチック類が挙げられる。基板は、認めうるほど蛍光発光させなくても光学的検出を可能にさせうる。
【００７１】
基板は平面であってよいが、他の基板の配置も同様に用いてよい。例えば、流動試料の分析のために、プローブを管の内面上に設置して試料容積を最小化してもよい。同様に、特殊なプラスチック製の独立気泡を含む、軟質フォームなどのように、基板は柔軟であってよい。
【００７２】
バイオチップおよびプローブは、化学官能基で誘導体化した後、両者を付着させることができる。例えば、バイオチップを、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基をはじめとする化学官能基を用いて誘導体化することができるが、これらに限定されるものではない。これらの官能基を用いて、リンカーを用いて直接または間接にプローブ上の官能基を用いてプローブを付着させることができる。プローブは、５’末端、３’末端、または内部ヌクレオチドを介するかのいずれかにより固相支持体へ付着されうる。
【００７３】
また、プローブは非共有結合的に固相支持体へ付着されうる。例えば、それをストレプトアビジンで共有結合的にコートされた表面と結合し得る、ビオチン化オリゴヌクレオチドを作出し、付着させることができる。あるいは、光重合およびフォトリソグラフィなどの技術を用いてプローブを表面上に合成することができる。
【００７４】
９．ｍｉＲＮＡ発現解析
また、本発明は、疾患、またはウイルス感染などの病理状態に関連するｍｉＲＮＡを同定する方法に関し、その方法は、生体試料を本発明のプローブまたはバイオチップと接触させる工程、およびハイブリダイゼーションの量を検出する工程を含む。高い感受性をもたらしうる、試料中の核酸を増幅させるＰＣＲを用いることも可能である。
【００７５】
病理細胞において対照区と比較してより過剰に発現されている、またはより発現が低度であるｍｉＲＮＡを同定する能力は、診断学、治療学、薬剤開発、薬理遺伝学、バイオセンサ開発の分野、および他の関連分野において使用可能な、高解像度、高感受性のデータセットをもたらし得る。この方法により生成された発現プロフィールは、ｍｉＲＮＡの数に関する試料の状態の「フィンガープリント」でありうる。２つの状態に同様に発現した特定のｍｉＲＮＡがなくとも、ｍｉＲＮＡの数の評価により、細胞の状態に特有な遺伝子発現プロフィールが同時に生成される。つまり、正常組織を罹患組織と区別することができる。既知の異なる疾患状態における組織の発現プロフィールを比較することにより、どのｍｉＲＮＡがこれらの状態に関連しているかに関する情報を得ることができる。その後、診断を行うかまたは確認して組織試料の有する発現プロフィールが正常組織のものであるか疾患組織のものであるかどうかを判定することができる。これによって、関連条件の分子診断を提供することができる。
【００７６】
１０．発現レベルの決定
本発明はまた、生体試料を本発明のプローブまたはバイオチップと接触させる工程およびハイブリダイゼーションの量を測定する工程を含む、疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定する方法にも関する。疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルは多くの点で役立つ情報である。例えば、対照と比較した疾患関連ｍｉＲＮＡの差次的発現は、患者が疾患に罹っている診断として用いることができる。また、疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルは、患者の治療および疾患の状態をモニターするために用いることができる。さらに、疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルによって、特定の発現プロフィールを変更するためまたは疾患に関連する発現プロフィールを抑制するための候補薬剤のスクリーニングが可能となりうる。
【００７７】
標的核酸は、標的核酸を含む試料を、標的核酸と十分に相補的な付着プローブを含むバイオチップと接触させること、及び、対照レベルを超えるプローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより検出することができる。
【００７８】
また、標的核酸は、試験する核酸をナイロンメンブレンなどの固相支持体に固定化すること、及び、標識したプローブを該試料とハイブリダイズさせることにより検出することができる。同様に、標識したプローブを固相支持体へ固定化すること、および標識した標的核酸を含有する試料をハイブリダイズすることにより標的核酸を検出することもできる。洗浄して非特異的ハイブリダイゼーションを除去した後、標識を検出すればよい。
【００７９】
また、浸透化した（permeabilized）細胞または組織試料を、標識したプローブと接触させて標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にすることにより、標的核酸をｉｎ ｓｉｔｕで検出することもできる。洗浄して非特異的結合したプローブを除去した後、標識を検出すればよい。
【００８０】
これらのアッセイは、直接ハイブリダイゼーションアッセイであり得るかまたは、一般に米国特許第５，６８１，７０２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５９４，１１７号；同第５，５９１，５８４号；同第５，５７１，６７０号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５７１，６７０号；同第５，５９１，５８４号；同第５，６２４，８０２号；同第５，６３５，３５２号；同第５，５９４，１１８号；同第５，３５９，１００号；同第５，１２４，２４６号；および同第５，６８１，６９７号に概説されるように、複数個のプローブの使用を含むサンドイッチアッセイを含み得る。前記文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
上記に概説したように、高、中および低ストリンジェンシー条件を含む種々のハイブリダイゼーション条件が用いられうる。アッセイは、プローブのハイブリダイゼーションを標的とのみ可能にするストリンジェンシー条件下で行われうる。ストリンジェンシーは、これらに限定されないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、または有機溶媒濃度をはじめとする熱力学的変数である、ステップパラメータを変化させることにより制御することができる。
【００８２】
ハイブリダイゼーション反応は、種々の方法で達成されうる。該反応の成分は、同時に、または異なる順序で順次、添加されうる。さらに、反応には種々の他の試薬が含まれ得、これらとしては、塩、バッファー、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などが挙げられ、これらは最適なハイブリダイゼーションおよび検出を促進するため、かつ／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンドの相互作用を減らすために用いられうる。その他のアッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤および抗菌剤も、試料の調製方法および標的の純度に応じて適切に用いることができる。
【００８３】
ａ．診断
本発明はまた、生体試料において疾患関連ｍｉＲＮＡまたは感染関連ｍｉＲＮＡの差次的な発現レベルを検出する工程を含む診断の方法にも関する。該ｍｉＲＮＡは、感染した被験体で発現しうるウイルスｍｉＲＮＡでありうる。また、該ｍｉＲＮＡは、被験体由来の、ウイルス感染のためにその発現レベルが改変されているものでありうる。試料は患者に由来するものであってよい。患者における疾患状態の診断は、予後診断および治療戦略の選択を可能とする。さらに、一時的に発現したｍｉＲＮＡ分子を判定することにより細胞の発生段階を分類し得る。
【００８４】
標識したプローブの組織アレイとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われうる。個体と標品との間でフィンガープリントを比較すれば、当業者であれば知見に基づいて診断、予後診断、または予測を行うことができる。さらに、診断を示す遺伝子は予後を示す遺伝子とは異なる可能性があり、細胞の状態の分子プロファイリングが反応性もしくは不応性の状態の区別を導くか、または結果を予測させうることが理解される。
【００８５】
ｂ．薬物スクリーニング
本発明はまた、疾患関連ｍｉＲＮＡを発現させることのできる病理細胞を候補治療薬と接触させる工程、及び疾患関連ｍｉＲＮＡの発現プロフィールへの候補薬物の効果を評価する工程を含む、治療薬をスクリーニングする方法にも関する。差次的に発現したｍｉＲＮＡを同定した後、種々のアッセイを実行することができる。試験化合物を、疾患関連ｍｉＲＮＡの遺伝子発現を調節する能力についてスクリーニングすることができる。調節には、遺伝子発現の低下および増加の双方が含まれる。
【００８６】
試験化合物または候補薬物は、疾患関連ｍｉＲＮＡの疾患表現型もしくは発現を直接または間接に変更する能力について試験される任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド、その他でありうる。候補薬剤には、多数の化学的クラス、例えば分子量が１００より大きく約５００、１，０００、１，５００、２，０００もしくは２，５００ダルトン未満である有機小分子が包含される。候補化合物は、タンパク質との構造上の構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基、および一般に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、好ましくはこれらの官能性化学基のうちの少なくとも２つを含みうる。候補薬剤は、環状炭素もしくは複素環構造および／または上記官能基の１種類以上で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含みうる。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはその組合せを含む生体分子にも見出される。
【００８７】
調節因子となる可能性のある物質からなる組合せライブラリーを、疾患関連ｍｉＲＮＡと結合する能力またはその活性を調節する能力についてスクリーニングすることができる。組合せライブラリーは、試薬などの多数の化学的基礎単位を組み合わせることによる、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより作製された、様々な化学物質の収集物でありうる。化学的な組合せライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者に周知である。このような化学的組合せライブラリーとしては、限定されるものではないが、ペプチドがコードされたペプチドライブラリー、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、ビニル性ポリペプチド、小さな化合物ライブラリーの類似有機合成物、オリゴカルバミン酸、および／またはホスホン酸ペプチジル（ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー、抗体ライブラリー、炭水化物ライブラリー、および有機小分子ライブラリーが挙げられる。
【００８８】
１１．遺伝子サイレンシング
本発明はまた、本発明の核酸を用いて細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を減少させる方法にも関する。標的遺伝子の発現は、標的ｍＲＮＡの１以上の結合部位と実質的に相補的な配列を含む本発明の核酸を発現させることにより減少させることができる。核酸はｍｉＲＮＡまたはその変異体でありうる。また、核酸は、プロセシングされてｍｉＲＮＡを生じうるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはその変異体でありうる。発現したｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの実質的に相補的な結合部位とハイブリダイズすることができ、それはＲＩＳＣに媒介される遺伝子サイレンシングの活性化を引き起こしうる。ｍｉＲＮＡの過剰発現を用いる研究の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４である。当業者であれば、本発明の核酸が、当技術分野で周知のアンチセンス法、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号に記載されるＲＮＡｉ法を用いて標的遺伝子の発現を阻害するために用いられうることが理解されよう。
【００８９】
標的遺伝子は、ウイルスｍｉＲＮＡまたはヒトｍｉＲＮＡを発現することにより減少しうるウイルス遺伝子でありうる。また、標的遺伝子は、ウイルス感染で発現し、ウイルスｍｉＲＮＡまたはヒトｍｉＲＮＡを発現することにより減少しうるヒト遺伝子でありうる。遺伝子サイレンシングの標的は、第２のタンパク質のサイレンシングを引き起こすタンパク質でありうる。標的遺伝子の発現を抑制することにより、第２のタンパク質の発現を増加させうる。ｍｉＲＮＡ発現の効率的な抑制の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｓａｕ ｅｔ ａｌ ２００４ ＪＢＣ ２７５−５２３６１；およびＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３−１２９０による研究である。
【００９０】
１２．遺伝子の増強
本発明はまた、本発明の核酸を用いて細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を増加させる方法にも関する。標的遺伝子の発現は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその変異体と実質的に相補的な配列を含む本発明の核酸を発現させることにより増加する可能性がある。核酸は、抗ｍｉＲＮＡでありうる。抗ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得、その結果として遺伝子抑制活性を低下させ得る。また、標的遺伝子の発現は、本発明の核酸と標的遺伝子の結合部位の結合によりｍｉＲＮＡ結合が回避されうるように、標的遺伝子の結合部位の一部と実質的に相補的な本発明の核酸を発現させることにより増加する可能性がある。
【００９１】
標的遺伝子はウイルス遺伝子であってよく、それが発現するとウイルスの感染力を低下させうる。また、標的遺伝子はヒト遺伝子であってよく、それが発現するとウイルスの感染力を低下させるかまたはウイルス感染に対する耐性もしくは免疫性を増大させうる。
【００９２】
１３．治療
本発明はまた、ウイルス感染に関連するものなどの疾患もしくは障害の調節因子もしくは標的として本発明の核酸を用いる方法にも関する。通常、本発明の請求の範囲の核酸分子は、前記核酸と少なくとも一部分相補的な遺伝子の発現の調節因子として用いられうる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子は治療用スクリーニング手順の標的として働く可能性があり、例えばｍｉＲＮＡ分子の阻害または活性化が細胞の分化過程、例えばアポトーシスを調節するかもしれない。
【００９３】
さらに、既存のｍｉＲＮＡ分子を、その標的特異性を修飾するために配列を修飾したｍｉＲＮＡ分子（例えば癌遺伝子、多剤耐性遺伝子もしくは別の治療標的遺伝子）の製造のための出発物質として用いることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子がプロセシングされた後、治療上関連のある標的に対し再び向けられる二本鎖ｓｉＲＮＡとして生成されるように、ｍｉＲＮＡ分子を修飾することができる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子を組織の再プログラミング手順に用いることができる。例えばｍｉＲＮＡ分子の発現により、分化した細胞株を異なる細胞種または幹細胞へ形質転換させることができるかもしれない。
【００９４】
１４．組成物
本発明はまた、本発明の核酸を含み、また所望により製薬上許容される担体をも含み得る医薬組成物にも関する。組成物は診断用途または治療用途に用いることができる。医薬組成物の投与は、核酸をインビトロまたはインビボで所望の標的細胞へ導入する、既知の方法で行ってよい。通常に使用される遺伝子導入技術としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス法および陽イオン性リポソームが挙げられる。
【００９５】
１５．キット
本発明はまた、本発明の核酸とともに以下：アッセイ試薬、バッファー、プローブおよび／もしくはプライマー、ならびに滅菌生理食塩水もしくは他の製薬上許容されるエマルジョンおよび懸濁性基剤、のいずれかまたは全てを含むキットにも関する。さらに、該キットには、本発明の方法を実行するための使用法（例えば、プロトコール）を含む指導書が含まれうる。
【実施例１】
【００９６】
ｍｉＲＮＡの予測
本発明者らは、ｍｉＲＮＡを予測するため、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号に記載されるものに類似する３つのコンピュータによるアプローチを用いて、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の可能性について多数のウイルスゲノムを調査した。予測されたヘアピンおよび有望なｍｉＲＮＡを、熱力学的安定性、ならびに構造上および状況上の特徴により評価した。有効であったＳａｎｇｅｒデータベース中のｍｉＲＮＡを用いてアルゴリズムを修正した。
【００９７】
１．１回目および２回目の選別
表１１および１２は、１回目のコンピュータによる選別から予測された各ヘアピンに関する配列（「ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）、配列識別子（「ＰＲＥＣＵＲ ＳＥＱ−ＩＤ」）および由来生物（「ＧＡＭ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）を、予測ｍｉＲＮＡ（「ＧＡＭ ＮＡＭＥ」）とともに示す。表１３および１４は、各ｍｉＲＮＡ（「ＧＡＭ ＮＡＭＥ」）に関する配列（「ＧＡＭ ＲＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）および配列識別子（「ＧＡＭ ＳＥＱ−ＩＤ」）を、由来生物（「ＧＡＭ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）およびダイサーの切断位置（「ＧＡＭ ＰＯＳ」）とともに示す。
【００９８】
２．３回目の選別
表１には、特定のウイルスゲノム（「Ｖ」；表１０も参照）の３回目のコンピュータによる選別の各予測ヘアピン（「ＨＩＤ」）に関する配列番号が列挙されている。また、表１には、各ヘアピンのゲノムにおける位置（「Ｈａｉｒｐｉｎ Ｌｏｃａｔｉｏｎ（Hairpin Loc.）」）が列挙されている。ゲノム位置の形式は、＜鎖（strand）＞＜開始位置（start position）＞の連続した形である。遺伝子の位置は、ＮＣＢＩ−Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースに基づいている。Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ、およびＰＤＢを含む数個の供給源から配列の収集物である。表１０はこの選別で用いた各々のゲノムに関する受託番号および構築物（版）を示す。
【００９９】
また、表１には各予測ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*に関する配列番号（「ＭＩＤ」）が列挙されている。また、表１には、Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ １２５：１６７−１８８，１９９４に記載されるように、各ヘアピンについて０〜１段階の（最も確実なヘアピンが１）予測スコアの等級（「Ｐ」）が列挙されている。また、表１には、各Ｐスコアの値についてバックグラウンドヘアピンから計算したｐ値（「Ｐｖａｌ」）が列挙されている。全てのｐ値は０．０５よりも有意に低い。表１に示されるように、Ｐｖａｌが０．０である場合が少数ある。これらの各々の場合では、この値は０．０００１未満である。ｐ値は、ヘアピンの事前選択を行わずに、試験したヘアピンのパルグレード（ｐａｌｇｒａｄｅ）と他の配列のパルグレードを比較することにより計算した。
【０１００】
また、表１には、表２に詳述されるように、ｍｉＲＮＡが発現解析（「Ｅ」）によって有効であったか否かが列挙されている（Ｙ＝有効、Ｎ＝否）。また、表１には、表３に詳述されるように、ｍｉＲＮＡが配列決定（「Ｓ」）により有効であったか否かが列挙されている（Ｙ＝有効、Ｎ＝否）。もし予測ｍｉＲＮＡと配列決定されたｍｉＲＮＡとの間の配列に違いがある場合は、配列決定された配列が提示されている。注意すべきは、ｍｉＲＮＡの配列決定または発現の検出に失敗しても、それが必ずしもｍｉＲＮＡが存在しないことを意味するものではないということである。このような検出されないｍｉＲＮＡは、被験組織以外の組織で発現する可能性がある。さらに、このような検出されないｍｉＲＮＡは、被験組織で発現するが、実験細胞とは異なる段階または異なる条件下で発現する可能性がある。
【０１０１】
また、表１には、表２に詳述されるように、ｍｉＲＮＡが少なくとも１つの疾患において、差次的発現（「Ｄ」）を示したかどうかが列挙されている（Ｙ＝示した、Ｎ＝否）。また、表１には、ヒトもしくはマウスで検出されたかまたはヒトにおいて予測されたように、Ｓａｎｇｅｒ ＤＢリリース６．０（２００５年４月）（ｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／）中にｍｉＲＮＡが存在したかどうか（「Ｆ」）が列挙されている（Ｙ＝存在、Ｎ＝否）。以上に考察したように、Ｓａｎｇｅｒデータベース中に収載されるｍｉＲＮＡは、予測アルゴリズムの構成要素であり、また結果の対照である。
【０１０２】
また、表１には、特定のウイルスの互いに１，０００ヌクレオチド以内のヘアピンに関する遺伝子位置クラスター（「ＬＣ」）が列挙されている。同じＬＣを有する各々のｍｉＲＮＡは同じ遺伝子クラスターを共有する。オーバーラップするヘアピンはクラスター化していない。また、表１には、供給源ウイルスにかかわらず、完全な一致に基づいてその２〜７のシードを単位としてｍｉＲＮＡをグループ化するためのシードクラスター（「ＳＣ」）が列挙されている。同じＳＣを有する各々のｍｉＲＮＡは同じシードを有する。６ヌクレオチド長のシードに関する考察については、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０；１５−２０（２００５）参照。
【０１０３】
実施例２
標的遺伝子の予測
次に、実施例１の３回のコンピュータによる選別から予測されたｍｉＲＮＡを用いて、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号、に記載されるものに類似の、ｍｉＲＮＡを予測するための２つの計算論的アプローチを用いて、ヒトおよびウイルス標的遺伝子ならびにそれらの結合部位を予測した。
【０１０４】
１．１回目および２回目の選別
表１５および１６には、１回目のコンピュータによる選別から得られた予測標的遺伝子（「ＴＡＲＧＥＴ」）および結合部位配列（「ＴＡＲＧＥＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）および結合部位配列識別子（「ＴＡＲＧＥＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ ＳＥＱ−ＩＤ」）、ならびに標的の由来生物（「ＴＡＲＧＥＴ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）が列挙されている。
【０１０５】
２．３回目の選別
ａ．ヒト標的遺伝子
表４には、３回目のコンピュータによる選別から得られた、特定のウイルス（Ｖ）およびそのヘアピン（ＨＩＤ）から各ｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）に関して予測されたヒト標的遺伝子が列挙されている。標的遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ参照配列リリース９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３（１）：Ｄ５０１−Ｄ５０４，２００５；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１６（１）：４４−４７，２０００；およびＴａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１５（７−８）：５３６−４３，１９９９）から得た。標的遺伝子を、７ヌクレオチドのｍｉＲＮＡシード（位置２〜８）およびＵＴＲ上のＡ（合計８ヌクレオチド）が完全に相補的に一致していることにより同定した。標的遺伝子を同定する際の考察に関しては、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０：１５−２０，（２００５）参照。ｍｉＲＮＡとＵＴＲとの結合に十分なシードの考察に関しては、Ｌｉｍ Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ ２００５）およびＢｒｅｎｎｅｃｋ ｅｔ ａｌ，（ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００５）参照。
【０１０６】
結合部位の選別は、ＵＴＲごとに最初の４０００ヌクレオチドのみを考慮に入れ、１遺伝子につき数個の転写物がある場合は最も長い転写物を考慮に入れた。フィルタリングにより転写物の総数は２３６２６から１４２３９に減少した。表４には、各標的遺伝子に関する予測結合部位の配列番号が列挙されている。結合部位の配列は、スプライスされたｍＲＮＡ上に位置するので、結合部位の５’および３’の２０ヌクレオチドを含む。結合部位が２つのエキソンからなる場合には、双方のエキソンの５’末端および３’末端双方から２０ヌクレオチドが含まれる。
【０１０７】
表５は、ヒト標的遺伝子ごとの特定のウイルス（Ｖ）のｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）／ヘアピン（ＨＩＤ）と疾患との間の関係を示す。疾患の名称はＯＭＩＭから得た。ヘアピンの位置する宿主遺伝子と疾患とを結びつける理論的根拠の考察に関しては、Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ，１１：２４１−２４７（２００５）およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１４：１９０２−１９１０（２００４）参照。表５は、疾患に関連しているｍｉＲＮＡ標的遺伝子の数（「Ｎ」）を示す。また、表５は、ｍｉＲＮＡの結合部位を有すると予測された遺伝子から得られる、疾患に関連している遺伝子の総数（「Ｔ」）を示す。また、表５はＴのうちのＮの割合および超幾何学的解析のｐ値（「Ｐｖａｌ」）を示す。ｐｖａｌが０．０として記載されている場合、その値が０．０００１未満であることを示している。超幾何学的解析の参照には、Ｓｃｈａｕｍ’ｓ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＩＩ：Ｉｎｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ参照。表７は表５および６の疾患コードを示す。
【０１０８】
ｂ．ウイルス標的遺伝子
上記の表４に現在までヒト標的遺伝子に関して記載されるものに類似して、表１０には、３回目のコンピュータによる選別から得られた、同じ特定のウイルス（Ｖ）およびそのヘアピン（ＨＩＤ）から各ｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）に関して予測されたウイルス標的遺伝子が列挙されている。ウイルス結合部位の予測には、上記の表１０のヒト標的遺伝子に関する方法で、表４のようにＵＴＲでなく完全な遺伝子が用いられた。候補標的遺伝子がウイルス生活環における役割を有することが知られている場合には、その候補標的遺伝子を選別に含めた。ウイルス生活環に役割を果たすウイルス遺伝子上に結合部位を有するｍｉＲＮＡは、ウイルスに関連する可能性のある疾患に影響しうる。
【０１０９】
ヒトヘルペスウイルス１および２は、ヘルペスウイルスに引き起こされるいくつかの炎症性疾患のいずれかに関連し、ある例では腰から上の皮膚または粘膜の水疱群（口および唇のものなど）が顕著であり、また他の例ではこのような水疱が生殖器に顕著である。ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン−バーウイルス）は伝染性単核症を引き起こし、バーキットリンパ腫および上咽頭癌に関連している。ＨＩＶ株は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関与している。Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスは肝臓の炎症を引き起こす。
【０１１０】
実施例３
ｍｉＲＮＡの検認
実施例１において予測されたヘアピンおよびｍｉＲＮＡを確かめるため、本発明者らはその内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号に記載されるものに類似のハイスループットマイクロアレイを用いて種々の組織で発現を検出した。各々の予測前駆体ｍｉＲＮＡについて、ヘアピンの双方のステムに由来する成熟ｍｉＲＮＡを試験した。
【０１１１】
１．発現解析−セット１およびセット２
表１７〜１９には、ｍｉＲＮＡ配列を検出するためのマイクロアレイ発現解析の結果が列挙されている（「ＧＡＭ ＲＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）。
【０１１２】
２．発現解析−セット３
表２は、特定のウイルス（「Ｖ」）から関連ｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）の発現を検出することにより有効であると確認された、３回目の予測セットのヘアピン（「ＨＩＤ」）、ならびに発現の検出された組織のコード（「Ｔｉｓｓｕｅ」）を示す。同じ組織中の同じｍｉＲＮＡから１以上のスコアが得られる場合は、高い方のスコアのみが示されている。
【０１１３】
組織および疾患コードは、それぞれ表６および表７に列挙されている。表８は遺伝子と疾患との関係を示す。これは全てのｍｉＲＮＡと疾患との結びつきを可能にする。表４では、少なくとも１つの標的遺伝子が各ｍｉＲＮＡに割り当てられている。表５は、表４の統計解析の結果およびＯＭＩＭを示してｍｉＲＮＡと疾患の有意な関係を表している。表８は基本的にＯＭＩＭの縮約版である。表８には、各遺伝子に関して該遺伝子に関連する疾患の全ての数字コードが列挙されている。
【０１１４】
開示された全ての組織がウイルス性疾患の指標をもたらす。ウイルスの有意な発現が測定されたということは、この組織において組織がウイルス性疾患に関与しうることを意味する。例えばＨＩＶのｍｉｒがＴ細胞系統で発現した場合、それはＡＩＤＳへの影響を有しうる。当然、細胞系統は組織が器官で機能する際に組織の特徴のサブセットしか表さないが、細胞系統において測定される発現から推定が可能である。
【０１１５】
また、表２は、チップの発現スコアの等級（５００〜６５０００の範囲）（「Ｓ」）を示す。閾値の５００を用いて有意でないシグナルを除去し、スコアを異なる実験から得たＭｉｒＣｈｉｐプローブシグナルで標準化した。実験間の蛍光材料の強度の変動は、ＲＮＡ調製物または標識効率の可変性に起因しうる。本発明者らは、各試料におけるｍｉＲＮＡの総量は比較的一定しているとの仮説に基づいて標準化した。最初に本発明者らは、各プローブの生のシグナルからバックグラウンドシグナルを引いた（バックグラウンドシグナルは４００として定義された）。次に、本発明者らは各ｍｉＲＮＡプローブシグナルを全ｍｉＲＮＡの平均のシグナルで割り、その結果に１００００を掛けてバックグラウンドシグナルの４００を加えて戻した。従って、定義によれば、各々の実験の全ｍｉＲＮＡプローブシグナルの合計は１０４００である。
【０１１６】
また、表２は、標準化したスコアをもとに算出された標準化されたシグナルの統計解析を示す（「Ｓｐｖａｌ」）。各ｍｉＲＮＡについて、本発明者らは、完全な予測ｍｉＲＮＡリストから関連対照群を用いた。各ｍｉＲＮＡはミスマッチを含むプローブの内部対照を有する。関連対照群には、類似したＴｍを持たせるために、類似したＣおよびＧの割合（差分絶対値＜５％）をもつプローブを含めた。プローブシグナルのＰ値は、同じまたは高いシグナルをもつ関連対照群プローブに対する比である。結果は、ｐ値≦０．０５であり、スコアは５００超である。ＳＰＶａｌが０．０として記載される場合、この値は０．０００１未満である。
【０１１７】
３．配列決定−セット３
２回目の予測のヘアピン（「ＨＩＤ」）をさらに検認するため、多数のｍｉＲＮＡを、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号に記載されるものに類似の配列決定法により有効性を確認した。表３は、示された組織（「Ｔｉｓｓｕｅ」）においてウイルス（「Ｖ」）のｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）を配列決定することにより有効であると確認されたヘアピン（「ＨＩＤ」）を示す。
【０１１８】
４．ノーザン解析
ｍｉＲＮＡの群を、図２および３に示されるようにノーザン解析により検認した。
【０１１９】
実施例４
ｍｉＲＮＡの差次的発現
１．ウイルスｍｉＲＮＡ
表２０には、健康なヒト組織またはヒト由来細胞系統と比較して罹患組織で差次的に発現することが実証された有効なウイルスｍｉＲＮＡが記載されている。全てのｍｉＲＮＡ配列が、上記のようにｍｉＲＮＡマイクロアレイを用いて有効であると確認された。アルツハイマー病（Alzheimer）には、罹患した、ならびに健康な、ヒト扁桃体、帯状皮質、尾状核、淡蒼球、後頭頂葉、および上頭頂皮質、アルツハイマー症状により軽度、中度、または重度に影響することが示されている脳の全ての領域由来の、組織の混合物におけるＧＡＭ ＲＮＡ発現が研究された。パーキンソン病（Parkinson）には、罹患したおよび健康なヒト組織由来の黒質組織におけるＧＡＭ ＲＮＡ発現が研究された。ＭＴ２細胞系統を、クレードＡヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴ細胞指向性臨床分離株で感染させたが、一方で健康な対照区は感染させなかった。ｃＭａｇｉ細胞系統を、マクロファージ指向性クレードＢ ＨＩＶで感染させたが、一方で健康な対照区は感染させなかった。ヒト繊維芽細胞（ＴＣ）を、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２で感染させるか、または感染させずに対照区とした。ＧＡＭ ＲＮＡＳＥＱＵＥＮＣＥ：成熟した、「ダイサーにより切断された（ｄｉｃｅｄ）」ＧＡＭ ＲＮＡの配列（５’から３’）。ＣＨＩＰ ＳＥＱＵＥＮＣＥは、マイクロアレイ上に設置された予測ＧＡＭ ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドの配列である（マイクロアレイ表面とのセパレーターとして用いられる非ゲノム配列は含まない）。ＤＩＳＥＡＳＥ：ＧＡＭ ＲＮＡが差次的に発現した疾患―ＢＡＬはマクロファージ指向性ＨＩＶ１サブタイプＢ、ｌａｂ株をさし、ＢＬＡＩはＴ細胞指向性ＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１）、サブタイプＢをさす；ＳＩＧＮＡＬ（ＨＥＡＬＴＨＹ）：指定される疾患に罹患していないヒト組織またはヒト由来細胞系統からなる試料中のＧＡＭ ＲＮＡに関するマイクロアレイ上のシグナル；ＳＩＧＮＡＬ（ＤＩＳＥＡＳＥ）：指定される疾患に罹患しているヒト組織またはヒト由来細胞系統からなる試料中のＧＡＭ ＲＮＡに関するマイクロアレイ上のシグナル。
【０１２０】
２．ヒトｍｉＲＮＡ
表２１には、以下のｍｉＲＮＡの発現データが列挙されている。ＨＩＤ：ヘアピン配列番号、ＭＩＤ：ｍｉＲＮＡ配列番号、Tissue：被験組織、Ｓ：チップ発現スコアの等級（範囲＝１００〜６５０００）、Ｄｉｓ．Ｄｉｆｆ．Ｅｘｐ．：疾患関連差次的発現およびそれを試験する組織、Ｒ：疾患関連発現の比（範囲＝０．０１〜９９．９９）、および略語：Ｂｒａｉｎ Ｍｉｘ Ａ−アルツハイマーに影響を及ぼす脳組織の混合物；Ｂｒａｉｎ Ｍｉｘ Ｂ−脳の全ての組織の混合物；ならびにＢｒａｉｎ ＳＮ−黒質。表２２および２３には、差次的に発現したｍｉＲＮＡに関する以下の詳細が記載されている。ＨＩＤ：ヘアピン配列番号、Ｈａｉｒｐｉｎ＿Ｌｏｃ：＜ｃｈｒ＿ｉｄ＞＜鎖＞スペース＜開始位置＞の連続した形のヘアピンゲノムの位置（例えば、１９＋１３５４６００００はｃｈｒ１９＋鎖、開始位置１３５４６００００を意味する）、Ｃ：進化過程での保存（有／無、および、データが該当しない場合は「−」；有−保存レベルは０．７の閾値を上回る）、Ｔ：ゲノムの種類、遺伝子間領域（Ｇ）、イントロン（Ｉ）、エキソン（Ｅ）、ＭＩＤ：ｍｉＲＮＡ配列番号；Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ，Ｄｉｓｅａｓｅ：標的遺伝子（ＨＵＧＯデータベース）および関連疾患（ＯＭＩＭデータベース）、Ｐ：予測スコア等級（０〜９の範囲）、Ｅ：チップ発現情報−有効／否（Ｙ／Ｎ）、Ｓ：配列決定による検認−有効／否（Ｙ／Ｎ）、ＨＩＤ：ヘアピン配列番号。表２４には、表２１〜２３中に言及される配列が記載される。
【０１２１】
実施例５
ＥＢＶ ｍｉＲＮＡの解析
１．発現の検認
図４は、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）ｍｉＲＮＡにおいて予測されたｍｉＲＮＡの発現の検認を示す；発現検認。３つの細胞株が試験された。２つは感染させてすぐの正常Ｂ細胞（ＰＢＭＣ−１／２−ＥＢＶ）であり、１つはＥＢＶ−形質転換細胞株（Ｂ−９５−８）であった。３つの細胞株は同程度のＥＢＶ感染度合いを示した（図４Ａ）。しかし、感染させてすぐのＢ細胞に対して、ＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−１およびＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−２はＢ−９５−８細胞系統において高度に発現した（図４Ｂ）。
【０１２２】
２．発現のノックアウト
図５は、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡのノックアウトを示す。２−Ｏ−メチルをＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−１に対抗して得られたＢ−９５−８細胞株へ添加すると、ＥＢＶ抗原を発現している細胞が劇的に減少する。２−Ｏ−メチルをＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−２に対抗して得られたＢ−９５−８へ添加すると、僅かにＥＢＶ発現を増加させる、中程度の効果があった。
【０１２３】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる、２００４年５月２６日出願の米国特許出願第１０／７０９，７３９号の一部継続出願であり、２００４年１０月４日出願の米国特許仮出願第６０／５２２，４５９号および２００５年５月２５日出願の米国特許仮出願第６０／６６５，０９４号の恩典を主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ｍｉＲＮＡの成熟のモデルを示す図である。
【図２Ａ】２つの予測ｍｉＲＮＡ（太字）を含有するＨＩＶ１の５’ＵＴＲ（Ｕ５Ｒ）を示す。成熟ｍｉＲＮＡに下線が引かれている。
【図２Ｂ】２つの予測ｍｉＲＮＡ（太字）を含有するＨＩＶ１の５’ＵＴＲ（Ｕ５Ｒ）における成熟ｍｉＲＮＡ（図２Ａ中の下線部）の、５’末端の近くにある１つを示す。
【図２Ｃ】２つの予測ｍｉＲＮＡ（太字）を含有するＨＩＶ１の５’ＵＴＲ（Ｕ５Ｒ）における成熟ｍｉＲＮＡ（図２Ａ中の下線部）の、３’末端の近くにあるもう１つを示す。最も５’側のｍｉＲＮＡは、ＴＡＴタンパク質と結合するＴＡＲ（Ｎａｔｕｒｅ １９８７．３３０：４８９−９３）という既知のＨＩＶ１ ＲＮＡ構造に一致する。また、類似したｍｉＲＮＡ（ＧＡＭ ＮＡＭＥ ５０６０３３）もチップ上で輝いた。このｍｉＲＮＡプローブは、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１）、サブタイプＢの配列を基に設計されており、図２Ｂに示したｍｉＲＮＡとは異なる１つのヌクレオチドである。図２Ｂおよび図２Ｃは、Ｕ５Ｒ中に存在し、予測成熟ｍｉＲＮＡプローブとハイブリダイズしたｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのノーザンブロット解析を表す。上の矢印は全３５５ｎｔのＵ５Ｒ転写物の分子サイズを示す。２つのＧＡＭ ＲＮＡの予測分子サイズはそれぞれ２２ｎｔおよび１７ｎｔである。下の矢印は２２ｎｔの細胞マーカーを示す。レーン：１− Ｈｅｌａライセート；２− インキュベートを行わないＨｅＬａライセート中のＵ５Ｒ転写物；および３− ２４時間ＨｅｌａライセートでインキュベートしたＵ５Ｒ転写物。
【図２Ｄ】予測成熟ＨＩＶ１ ｍｉＲＮＡプローブと反応したＨＩＶ１ ＲＮＡの部分転写物を示す。
【図２Ｅ】予測成熟ＨＩＶ１ ｍｉＲＮＡプローブと反応したＨＩＶ１ ＲＮＡの部分転写物を示す。図２Ｄ及び図２Ｅのそれぞれの図には実験転写配列が示され、予測成熟ｍｉＲＮＡに下線が引かれている。ｍｉＲＮＡ前駆体のノーザンブロット解析を示す。１つのｍｉＲＮＡ前駆体転写物が１６３ｎｔであり、もう１つのｍｉＲＮＡ前駆体転写物が２００ｎｔであることが実証される。成熟ｍｉＲＮＡの予測分子サイズは双方とも２４ｎｔである。２２ｎｔ細胞マーカーが示されている。レーン：１− インキュベートを行わないＨｅＬａライセート中の転写物、および２− ２４時間ＨｅＬａライセートでインキュベートした転写物。
【図３】ノーザンブロットの結果を示す。ＥＢＶ感染（Ｂ９５／８ ＥＢＶ）および非感染（ｐＢＭＣ）細胞におけるＧＡＭ５０６３３３およびＧＡＭ５０６３３６の発現プロフィールを示す。これらのｍｉＲＮＡの発現は、ＥＢＶに感染したＢ−９５／８細胞株のＲＮＡとハイブリダイズしたｍｉＲＮＡマイクロアレイで実証された。これらの有効なｍｉＲＮＡ予測物に対するプローブをノーザンブロットで全ＲＮＡとハイブリダイズした。ノーザンブロットにより、マイクロアレイ上の感染細胞においてこれら２つのｍｉＲＮＡの発現の高いことが確認された。
【図４】ＥＢＶにより発現したｍｉＲＮＡの検認を示す。
【図５】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡのノックアウトを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ウイルスのマイクロＲＮＡ分子およびウイルス感染に関連するヒトマイクロＲＮＡ分子の群、ならびにそれと関連するかまたはそれに由来する種々の核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの短いＲＮＡオリゴヌクレオチドであって、遺伝子制御に関与する。マイクロＲＮＡは、切断または翻訳抑制のためのｍＲＮＡを標的とすることにより遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびヒトをはじめとする広範囲の種に存在するが、これらはごく最近になって同定されたものである。より重要なことに、疾患の発生および進行におけるｍｉＲＮＡの役割はごく最近になって認識されるようになった。
【０００３】
サイズが小さいことから、ｍｉＲＮＡは今まで標準的な方法論を用いて同定するのが困難であった。限られた数のｍｉＲＮＡが、大量のＲＮＡを抽出することにより同定されている。また、ｍｉＲＮＡは、視覚によって識別可能な表現型の提示に寄与していることが確認されている。発現アレイデータにより、ｍｉＲＮＡが異なる発生段階、または異なる組織で発現することが示されている。ｍｉＲＮＡが、ある種の組織または限定された発生段階に限られていることは、現在までに同定されているｍｉＲＮＡが全ｍｉＲＮＡのごく小さな一部分である可能性が高いことを示している。
【０００４】
近年、ゲノムの残りのｍｉＲＮＡを同定するためのコンピュータによるアプローチが開発された。ＭｉＲｓｃａｎおよびＭｉＲｓｅｅｋｅｒなどのツールがｍｉＲＮＡを同定し、ｍｉＲＮＡは後に実験によって確認された。これらのコンピュータツールに基づいて、ヒトゲノムには２００〜２５５のｍｉＲＮＡ遺伝子が含まれると推定されている。しかし、これらの推定値は、これから同定される残りのｍｉＲＮＡが既に同定されたｍｉＲＮＡと同じ特性を持つであろうという仮説に基づいている。哺乳類の生物学および疾患におけるｍｉＲＮＡの根本的な重要性を踏まえて、未知のｍｉＲＮＡを同定するための技術が必要である。本発明はこの必要を満たし、多数のｍｉＲＮＡおよびその使用を提供する。現在まで、ウイルスのｍｉＲＮＡは全く検出されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、診断目的のため、また標的遺伝子発現の改変のために有用であり得る、ウイルスｍｉＲＮＡおよびウイルス関連ｍｉＲＮＡの核酸配列、その前駆体、その標的配列および関連配列を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合部位、またはその変異体の配列を含む、単離された核酸に関する。該核酸は、配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３；表１、１１〜１２、もしくは２１〜２３に参照される前駆体の配列；配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；配列番号：１１４２４１７〜４０９７７２０；表４、１０もしくは１５〜１６に参照される標的遺伝子結合部位の配列；その相補物；またはそれと少なくとも７０％同一の、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む配列を含みうる。単離された核酸は、５〜２５０ヌクレオチド長でありうる。
【０００７】
また、本発明は前記核酸を含むプローブにも関する。該プローブは、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡ、またはその変異体と相補的な、少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含みうる。また、該プローブは、ウイルス感染で差次的に発現するヒトｍｉＲＮＡ、またはその変異体と相補的な少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含みうる。
【０００８】
また、本発明は、複数個の前記プローブにも関する。該複数個のプローブには少なくとも１０個の前記プローブが含まれうる。また、該複数個のプローブには少なくとも１００個の前記プローブが含まれていてもよい。また、本発明は、１個のプローブまたは複数個のプローブを含む組成物に関する。また、本発明は固体基板を含むバイオチップにも関し、前記基板は複数個の前記プローブを含む。各々のプローブは、空間的に定義されたアドレスにおいて該基板に付着させることができる。バイオチップは、ウイルスｍｉＲＮＡと相補的なプローブを含みうる。また、該バイオチップはウイルス感染中の発現により特徴付けられるヒトｍｉＲＮＡと相補的であるプローブを含みうる。
【０００９】
また、本発明は、疾患に関連したｍｉＲＮＡの差次的発現を検出する方法にも関する。生体試料を用意し、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照される配列；またはその変異体と少なくとも７０％同一である核酸のレベルを測定する。対照区と比較した核酸のレベルの違いが差次的発現を示す。
【００１０】
また、本発明は、病理状態を調節する化合物を同定する方法にも関する。配列番号：１〜１１４２４１６；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体と少なくとも７０％同一である核酸を発現することのできる細胞を準備する。この細胞を候補調節因子と接触させた後、核酸の発現レベルを測定する。対照と比較した核酸のレベルの違いで、化合物を核酸に関連する病理状態の調節因子であると同定する。
【００１１】
また、本発明は、細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法にも関する。核酸は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で細胞へ導入される。標的遺伝子は、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位、またはその変異体と実質的に同一な結合部位を含みうる。核酸は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５の一部分；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体を含みうる。標的遺伝子の発現は、インビトロでもインビボでも阻害させることができる。
【００１２】
また、本発明は、細胞において標的遺伝子の発現を増加させる方法にも関する。核酸は、標的遺伝子の発現を増加させるのに十分な量で細胞へ導入される。標的遺伝子は、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位、またはその変異体と実質的に同一な結合部位を含みうる。核酸の一部分は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体と実質的に相補的でありうる。標的遺伝子の発現は、インビトロでもインビボでも阻害されうる。標的遺伝子の発現は、インビトロでもインビボでも増加させることができる。
【００１３】
また、本発明は、配列番号：１〜７６０６１６の配列；表１０に示される配列；表１７に示される配列；またはその変異体を含む核酸を、それを必要とする患者へ投与する段階を含む、表６に示される疾患を有する患者を治療する方法にも関する。
【００１４】
また、本発明は、その核酸の一部分が、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５；表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；またはその変異体と実質的に相補的である核酸を、それを必要とする患者へ投与する段階を含む、ウイルス感染患者またはウイルス感染に関連する状態の患者を治療する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ウイルスｍｉＲＮＡおよびウイルス関連ｍｉＲＮＡの核酸配列、その前駆体、その標的および関連配列を提供する。このような核酸は診断用途に、また標的遺伝子発現の改変に有用である。本発明の他の態様は、以下の本発明の記述により当業者に明らかとなるであろう。
【００１６】
１．定義
本発明の化合物、産物および組成物ならびに方法を開示および記載する前に、本明細書において用いられる用語が、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであって、限定を目的とするものではないことを理解されたい。本明細書および添付の請求項において用いられるように、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈中で明確に別に指示がない限り、複数の指示物を含むことを留意しなければならない。さらに、「および」と「または」という語は、文脈中で明確に別に指示がない限り、接続的な意味と離接的な意味の双方を包含する可能性があることを留意しなければならない。
【００１７】
本明細書において「動物」は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、雌ウシ、サルおよびヒトを意味しうる。
【００１８】
本明細書において、プローブおよび固相支持体に言及して「付着した」または「固定化した」とは、プローブと固相支持体との間の結合が、結合、洗浄、分析、および除去という条件下で安定しているのに十分であることを意味する。結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。共有結合は、プローブと固相支持体との間で直接形成されるか、あるいは架橋剤によるか、または固相支持体もしくはプローブのいずれかまたは双方の分子の特異的反応性基の封入により形成されうる。非共有結合は静電相互作用、親水性相互作用、および疎水性相互作用のうちの１種類以上であってよい。非共有結合に含まれるものは、ストレプトアビジンなどの分子の支持体への共有結合、およびビオチン化プローブのストレプトアビジンとの非共有結合である。また、固定化には、共有相互作用と非共有相互作用の組合せが含まれうる。
【００１９】
本明細書において用いられる「生体試料」は、核酸を含む生体組織または生体液の試料を意味しうる。このような試料としては、動物から単離された組織が挙げられるが、これらに限定されない。また、生体試料としては生検および剖検試料などの組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛髪、および皮膚が挙げられる。また、生体試料としては、患者組織に由来する外植片ならびに一次細胞培養および／または形質転換細胞培養が挙げられる。生体試料は、動物から細胞の試料を取り出すことにより準備することができるが、既に単離された細胞（例えば、別の人物から単離された、別の時間に単離された、および／または別の目的のために単離された細胞）を用いることによるか、あるいは本発明の方法をインビボで行うことにより達成することもできる。保存用組織、例えば治療または転帰履歴を有するものなどを用いてもよい。
【００２０】
本明細書において用いられる「相補物」または「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間の、ワトソン−クリック塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成を意味しうる。
【００２１】
「差次的発現（Differential expression）」とは、細胞内および細胞間ならびに組織内および組織間での、時間的および／または細胞の遺伝子発現パターンにおける定性的または定量的差異を意味しうる。従って、差次的に発現した遺伝子は、例えば正常組織か疾患組織での活性化または不活性化をはじめ、定性的にその発現を変化させることができる。遺伝子は、別の状態と比較して特定の状態でスイッチを入れたり切ったりすることができるため、２つまたはそれ以上の状態を比較することができる。定性的に制御された遺伝子は、１つの状態または細胞種内で、標準的な技術により検出可能な１つの発現パターンを提示する。いくつかの遺伝子は、１つの状態または細胞種内で発現するが、双方ともには発現しない。あるいは、発現の差異は、例えば、発現が調節されていると、上方制御されてその結果転写物の量が増加するか、または下方制御されてその結果転写物の量が減少するという点で定量的でありうる。発現の異なる程度は、標準的な特性化技術、例えば発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン解析、およびＲＮａｓｅ保護などを介して定量化するために十分なほど大きくさえあればよい。
【００２２】
本明細書において用いられる「遺伝子」とは、転写および／もしくは翻訳制御配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−および３’−非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子でありうる。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能性ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列でありうる。また、遺伝子は、所望によりそれと結合している５’−または３’−非翻訳配列を含むコード領域（例えば、エキソンおよびｍｉＲＮＡ）に相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでもありうる。また、遺伝子は、コード領域および／またはそれと結合している５’−または３’−非翻訳配列の全てまたは一部を含む、インビトロで作製された核酸分子を増幅させてもよい。
【００２３】
本明細書において用いられる「宿主細胞」は、ベクターを含有してベクターの複製を支持する、天然に存在する細胞または形質転換細胞でありうる。宿主細胞は、培養細胞、外植片、インビボ細胞、その他でありうる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくは哺乳類細胞などの真核細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａなどでありうる。
【００２４】
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で用いられる「同一」または「同一性」とは、これらの配列が、特定の領域に関して同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸を特定の割合で有することを意味する。この割合は、２つの配列を最適にアラインして比較することにより計算することができ、特定領域の２つの配列を比較し、双方の配列において同一残基の現れる位置の数を測定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定領域中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることにより配列同一性の割合を得る。２つの配列が異なる長さであるか、アラインメントによりねじれた末端が生じて特定の比較領域に単一の配列しか含まれない場合、単一の配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とを同等とみなす。同一性の確認は、手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いて行ってよい。
【００２５】
本明細書において用いられる「阻害する」とは、防ぐ、抑制する、減らすまたは除去することを意味しうる。
【００２６】
本明細書において用いられる「標識」とは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段により検出可能な組成物を意味しうる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度の試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられているようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン類および検出可能とすることのできる他の存在物が挙げられる。標識は、核酸およびタンパク質のどの位置に組み入れてもよい。
【００２７】
本明細書において用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも２個の互いに共有結合したヌクレオチドを意味しうる。当業者には明らかなように、一本鎖に関する描写は相補鎖の配列も規定する。従って、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。また、当業者には明らかなように、核酸の多くの変異体を同じ目的のために所与の核酸として用いることができる。従って、核酸は、実質的に同一な核酸およびその相補物も包含する。また、当業者には明らかなように、一本鎖から、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズしうるプローブのためのプローブがもたらされる。従って、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２８】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってよく、または二本鎖と一本鎖双方の配列の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡであるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、その際核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンをはじめとする塩基の組合せを含んでよい。これらの核酸は、化学的な合成法または組換え法により得ることができる。
【００２９】
核酸は一般にリン酸ジエステル結合を含有するが、少なくとも１つの異なる結合、例えば、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合、およびペプチド核酸骨格および結合を有しうる核酸類似体も含み得る。他の核酸類似体としては、陽性骨格；非イオン性骨格、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号に記載されているものを含むリボースを含まない骨格を有するものが挙げられる。また、１以上の天然に存在しないヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含有する核酸も核酸の１つの定義に含められる。修飾されたヌクレオチド類似体は、例えば核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置しうる。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖修飾または骨格修飾リボヌクレオチドから選択されうる。しかし、注意すべきは、核酸塩基を修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、５位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；ジアザヌクレオチド、例えば７−ジアザ−アデノシン；Ｏ−アルキル化およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどの、天然に存在する核酸塩基の代わりに天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドも適している。２’−ＯＨ−基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2またはＣＮ（但し、ＲはＣ1−Ｃ6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）から選択される基で置換することができる。リボース−リン酸骨格の修飾は、種々の理由、例えば、生理環境でこのような分子の安定性および半減期を増加させるため、またはバイオチップでのプローブとするためになされうる。天然に存在する核酸と類似体の混合物を作成してもよい；あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物を作成してもよい。
【００３０】
本明細書において用いられる「作動可能なように連結された」とは、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結したプロモーターの制御下にあることを意味しうる。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置しうる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターの由来する遺伝子においてプロモーターが遺伝子を制御するプロモーターと遺伝子との間の距離とほぼ同じでありうる。当技術分野で公知のように、この距離における変動にはプロモーター機能を損なうことなく適応することができる。
【００３１】
本明細書において用いられる「プローブ」とは、１種類以上の化学結合によって、通常相補的塩基対形成によって、通常水素結合形成によって、相補配列の標的核酸と結合可能なオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列と結合する可能性がある。標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨げることのある塩基対のミスマッチは何個もありうる。しかし、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下であってさえもハイブリダイゼーションが起こらないほど突然変異の数が多い場合、配列は相補的な標的配列ではない。プローブは一本鎖でもあってもよいし、または部分的に一本鎖かつ部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖の数（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は標的配列の構造、組成、および特性の影響を受ける。プローブは、後にストレプトアビジン複合体と結合するビオチンなどで直接的に標識してもよいし、間接的に標識してもよい。
【００３２】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、細胞において核酸の発現をもたらし、活性化させ、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味しうる。プロモーターは、その発現をさらに増強するため、かつ／またはその空間的な発現および／もしくは時間的な発現を改変するための、１個以上の特異的な調節エレメントを含みうる。また、プロモーターは、末端のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含むことができ、これは転写開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来しうる。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構成的に制御するか、あるいは、発現の起こる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現の起こる発生段階に関して差次的に制御するか、あるいは、生理的ストレス、病原体、金属イオン、または誘発剤などの外部刺激に応答して制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３３】
本明細書において用いられる「選択マーカー」とは、それが発現する細胞に、遺伝子構築物でトランスフェクトしたかまたは形質転換した細胞の同定および／または選択を促進するための表現型を付与する任意の遺伝子を意味しうる。選択マーカーの代表的な例としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐr）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr）、細菌性のカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎr）、ゼオシン耐性遺伝子、抗生物質オーレオバシジンＡに対する耐性を付与するＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質コード遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００３４】
本明細書において用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複合混合物中などで、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を意味しうる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、環境が異れば該条件も異なるであろう。一般的には、ストリンジェントな条件は、ある決められたイオン強度ｐＨで特定の配列の熱融解温度（Ｔm）より約５〜１０℃低くなるよう選択される。Ｔmは、標的と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下での）でありうる（標的配列が過剰に存在するため、Ｔmでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍナトリウムイオン未満、一般に約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃でありうる。また、ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されうる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルは、少なくともハイブリダイゼーションバックグラウンドの２〜１０倍でありうる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、以下の条件が挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣ中で洗浄、および６５℃で０．１％ＳＤＳ。
【００３５】
本明細書において用いられる「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に関して第２の配列の相補物と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味しうる。
【００３６】
本明細書において用いられる「実質的に同一」とは、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸領域に関して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、または核酸に関して、第１の配列が実質的に第２の配列の相補物と相補的である場合を意味しうる。
【００３７】
本明細書において用いられる「標的」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で１以上のプローブにより結合されうるポリヌクレオチドを意味しうる。
【００３８】
本明細書において用いられる「ターミネーター」とは、転写の終結を知らせる転写単位の末端の配列を意味しうる。ターミネーターは、ポリアデニル化シグナルを含有する３’非翻訳ＤＮＡ配列であってよく、これはポリアデニル酸配列の一次転写産物の３’末端への添加を促進しうる。ターミネーターは、ウイルス、細菌、菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来しうる。ターミネーターの代表的な例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナル、ＣＹＣ１ターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＳＰＡターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネーター、トウモロコシ由来のゼイン遺伝子ターミネーター、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット遺伝子（ＳＳＵ）遺伝子ターミネーター配列、サブクローバー萎縮ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子配列ターミネーター、ロー因子非依存性大腸菌ターミネーター、およびｌａｃＺ αターミネーターが挙げられる。
【００３９】
本明細書においてある状態からの動物の保護に言及する際に用いられる「治療」または「治療すること」とは、その状態を予防すること、抑制すること、抑圧すること、または除去することを意味する。状態を予防することは、状態の発生より前に本発明の組成物を動物へ投与することを伴う。状態を抑制することは、状態の誘導後であるがその臨床上の出現の前に本発明の組成物を動物へ投与することを伴う。状態を抑圧することは、状態が臨床上出現した後にその状態を緩和させるかまたは悪化を防ぐように本発明の組成物を動物へ投与することを伴う。状態の除去は、状態が臨床上出現した後に動物がそれ以上当該状態に苦しまないように本発明の組成物を動物へ投与する工程を伴う。
【００４０】
本明細書において用いられる「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味しうる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターでありうる。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってもよく、宿主ゲノムへ組み込まれるベクターであってもよい。
【００４１】
２．マイクロＲＮＡ
哺乳類ｍｉＲＮＡの成熟についての現在のモデルを図１に示すが、理論に束縛されるのではない。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、転写されてｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られるｍｉＲＮＡ前駆体の産生をもたらす。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、複数のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含むポリシストロニックＲＮＡの一部でありうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ステムおよびループを有するヘアピンを形成しうる。図１に示されるように、ステムにはミスマッチした塩基が含まれうる。
【００４２】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａに認識されうる。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの末端のループを認識し、ステムの中へ入っておよそ螺旋２回転分を切断してｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ｎｔの前駆体を産生する。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼにはよくある切断部のねじれた状態で切断して５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングをもつｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループが得られる。Ｄｒｏｓｈａの切断部位から伸びるステムのおよそ螺旋１回転分（約１０ヌクレオチド）は、効果的なプロセシングに必須でありうる。その後、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはＲａｎ−ＧＴＰおよび輸送受容体Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５により核から細胞質へと活発に移送される。
【００４３】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、これもまたＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるダイサーに認識されうる。ダイサーはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムを認識しうる。また、ダイサーは、ステムループの基部の５’リン酸および３’オーバーハングを認識しうる。ダイサーは、ステムループの基部から末端のループを螺旋２回転分切断して、さらなる５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す。得られたｓｉＲＮＡ様の二重鎖は、ミスマッチを含みうるが、成熟ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*として知られる同様のサイズの断片を含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの反対側のアームに由来しうる。ｍｉＲＮＡ*配列は、クローン化ｍｉＲＮＡのライブラリーに見出すことができるが、一般にｍｉＲＮＡよりも頻度が低い。
【００４４】
最初はｍｉＲＮＡ*を含む二本鎖種として存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的に一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボヌクレオタンパク質複合体へ組み込まれる。種々のタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、それらのタンパク質がｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ*二重鎖、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制または活性化）に対する特異性に可変性をもたらし得、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ*二重鎖のどちらの鎖もＲＩＳＣへ組み込まれる。
【００４５】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ*二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣへ組み込まれる場合、ｍｉＲＮＡ*は除去されて分解されうる。ＲＩＳＣへ組み込まれているｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ*二重鎖の鎖は、その５’末端があまり緊密に対形成されていない鎖でありうる。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ*の双方の末端がほぼ同等の５’対を形成している場合、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ*の双方は遺伝子サイレンシング活性を有しうる。
【００４６】
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高レベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８により標的核酸を同定することができる。動物においてｍｉＲＮＡとその標的との間の相互作用がｍｉＲＮＡの全長に沿っていた例が一つだけ報告されている。これは、ｍｉｒ−１９６とＨｏｘ Ｂ８に関して示され、さらにｍｉｒ−１９６がＨｏｘ Ｂ８ ｍＲＮＡの切断を媒介することが示された（Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４）。それ以外では、このような相互作用は植物でしか知られていない（Ｂａｒｔｅｌ ＆ Ｂａｒｔｅｌ ２００３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３２−７０９）。
【００４７】
多数の研究が、効率的な翻訳の阻害を達成するために、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対形成の必要条件に目を向けてきた（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６−２８１に総説されている）。哺乳類細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要である可能性がある（Ｄｏｅｎｃｈ ＆ Ｓｈａｒｐ ２００４ ＧｅｎｅｓＤｅｖ ２００４−５０４）。しかし、マイクロＲＮＡの他の部分もｍＲＮＡ結合に関与する可能性がある。さらに、３’での十分な塩基対形成は５’での不十分な対形成を補い得る（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ａｔ ａｌ，２００５ ＰＬｏＳ ３−ｅ８５）。ｍｉＲＮＡ結合を全ゲノムで解析する評価研究から、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’の塩基２〜７の特異的役割が示唆されているが、通常「Ａ」であると見出される最初のヌクレオチドの役割も認識された（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｔ ２００５ Ｃｅｌｌ １２０−１５）。同様に、ヌクレオチド１〜７または２〜８が、Ｋｒｅｋらにより標的の同定および確認に用いられた（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７−４９５）。
【００４８】
ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ中、３’ＵＴＲ中またはコード領域中でありうる。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが同一または複数の部位を認識することにより同じｍＲＮＡ標的を制御しうる。大部分の遺伝学的に同定された標的中に複数のｍｉＲＮＡ相補部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの協同的な作用により最も効率的な翻訳阻害がもたらされることが示されうる。
【００４９】
ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣに命令して２つの機構：ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制、のいずれかにより遺伝子発現を下方制御し得る。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対してある程度の相補性を有する場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指示し得る。ｍｉＲＮＡが切断を導く場合、該切断はｍｉＲＮＡの残基１０および１１と対形成しているヌクレオチド間でありうる。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有さない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制しうる。動物はより低度の相補性を有し得るため、翻訳抑制は動物においてより優勢であろう。
【００５０】
注意すべきは、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ*の任意の対の５’末端および３’末端には可変性がありうるということである。この可変性は、切断の部位に関してＤｒｏｓｈａおよびダイサーの酵素によるプロセッシングの可変性に起因しうる。また、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*の５’末端および３’末端の可変性は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因しうる。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造からなる集団をもたらしうる。また、ステム構造における可変性も、Ｄｒｏｓｈａおよびダイサーによる切断の産物の可変性につながる。
【００５１】
３．核酸
本発明は、配列番号：１〜４２０４９１５に参照される核酸配列、表１、４、１０〜１４および２１〜２３に参照される配列、ならびにその変異体を含む、単離された核酸に関する。該変異体は、参照された核酸配列の相補物でありうる。また、該変異体は、参照される核酸配列またはその相補物と実質的に同一な核酸配列でありうる。また、該変異体は、ストリンジェントな条件下で、参照される核酸配列、その相補物、またはそれと実質的に同一の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列でありうる。
【００５２】
核酸は、１０〜１００ヌクレオチド長でありうる。核酸は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９，３０、３５、４０、４５、５０，６０、７０、８０または９０ヌクレオチド長でありうる。核酸は、合成されるかまたは以下に記載する合成遺伝子を用いて細胞内（インビトロまたはインビボ）で発現される。核酸は、一本鎖分子として合成され、実質的に相補的な核酸とハイブリダイズされて二重鎖を形成しうるが、これを本発明の核酸とみなす。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖の形態で、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，５５９号に記載されるものをはじめとする、当業者に公知の方法を用いて合成遺伝子により発現させることのできる形態で、細胞、組織または器官へ導入することができる。
【００５３】
ａ．Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列またはその変異体を含みうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜２５０、５５〜２００、７０〜１５０または８０〜１００ヌクレオチドを含みうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、以下に述べるようにｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*を含みうる。また、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ*およびその相補物、ならびにその変異体を含みうる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、少なくとも１９％のアデノシンヌクレオチド、少なくとも１６％のシトシンヌクレオチド、少なくとも２３％のチミンヌクレオチドおよび少なくとも１９％のグアニンヌクレオチドを含みうる。
【００５４】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造を形成しうる。このヘアピン構造には、実質的に相補的である第１の核酸配列と第２の核酸配列が含まれうる。第１および第２の核酸配列は、３７〜５０ヌクレオチドでありうる。第１および第２の核酸配列は、８〜１２ヌクレオチドの第３の配列によって隔てられうる。このヘアピン構造は、その内容が本明細書に組み込まれるＨｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ １２５：１６７−１８８（１９９４）に記載されるように、Ｖｉｅｎｎａアルゴリズムにより初期値のパラメータを用いて算出される−２５Ｋｃａｌ／モル未満の自由エネルギーを有しうる。このヘアピンは、４〜２０、８〜１２または１０ヌクレオチドの末端ループを有しうる。
【００５５】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３、表１に参照される前駆体、表１１〜１２および２１〜２３に参照される配列の配列、またはその変異体を含みうる。
【００５６】
ｂ．Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列またはその変異体をも含みうる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０、６０〜８０または６０〜７０ヌクレオチドを含みうる。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、以下に述べるようにｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*を含みうる。また、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ*およびその相補物、ならびにその変異体を含みうる。また、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端から０〜１６０ヌクレオチドを除くｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列でありうる。
【００５７】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３、表１に参照される前駆体、表１１〜１２および２１〜２３に参照される配列の配列、またはその変異体を含みうる。
【００５８】
ｃ．ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はまた、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*またはその変異体の配列を含みうる。ｍｉＲＮＡ配列は、１３〜３３、１８〜２４または２１〜２３ヌクレオチドを含みうる。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドでありうる。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３ヌクレオチドでありうる。
【００５９】
ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、表１に参照されるｍｉＲＮＡ、表１１〜１２および２１〜２３に参照される配列の配列、またはその変異体を含みうる。
【００６０】
ｄ．抗ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はまた、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ*の活性を阻害することの可能な抗ｍｉＲＮＡの配列をも含みうる。抗ｍｉＲＮＡは、合計５〜１００または１０〜６０ヌクレオチドを含みうる。また、抗ｍｉＲＮＡは、少なくとも合計５、６、７，８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含みうる。抗ｍｉＲＮＡの配列は、（ａ）ｍｉＲＮＡの５’と実質的に同一である少なくとも５ヌクレオチド、および前記ｍｉＲＮＡの５’末端から標的部位の隣接領域に対して実質的に相補的である少なくとも５〜１２ヌクレオチド、または（ｂ）ｍｉＲＮＡの３’と実質的に同一である少なくとも５〜１２ヌクレオチド、および前記ｍｉＲＮＡの３’末端から標的部位の隣接領域に対して実質的に相補的である少なくとも５ヌクレオチドを含みうる。
【００６１】
抗ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５の相補物、表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、またはその変異体を含みうる。
【００６２】
ｅ．標的の結合部位
本発明の核酸はまた、標的ｍｉＲＮＡ結合部位の配列、またはその変異体をも含みうる。標的部位配列は、合計５〜１００または１０〜６０ヌクレオチドを含みうる。標的部位配列は、配列番号：１１４２４１７〜４０９７７２０の少なくとも５ヌクレオチド、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される標的遺伝子結合部位の配列、またはその変異体を含みうる。
【００６３】
４．合成遺伝子
本発明はまた、転写制御配列および／または翻訳制御配列と作動可能なように連結された本発明の核酸を含む合成遺伝子にも関する。合成遺伝子は、本発明の核酸の結合部位を含む標的遺伝子の発現を修飾することが可能であり得る。標的遺伝子の発現は、細胞、組織または器官において修飾されうる。合成遺伝子は、合成されるか、または標準的な組換え技術により天然に存在する遺伝子から得ることができる。また、合成遺伝子は、合成遺伝子配列の転写単位の３’末端のターミネーターを含みうる。また、合成遺伝子は、選択マーカーを含みうる。
【００６４】
５．ベクター
本発明はまた、本発明の合成遺伝子を含むベクターにも関する。ベクターは、発現ベクターでありうる。発現ベクターは、さらなる要素を含みうる。例えば、この発現ベクターは、それが２種類の生物中で維持される、例えば、発現用の哺乳類もしくは昆虫細胞中、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物宿主中で維持されることを可能とする２つの複製系を有しうる。複数の発現ベクターを統合するため、この発現ベクターには、少なくとも１つの宿主細胞ゲノムに相同な配列、および好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列が含まれうる。組み込み型ベクターは、ベクター内へ封入するための適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞中の特定の遺伝子座に向けることができる。また、ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含みうる。
【００６５】
６．宿主細胞
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞にも関する。細胞は、細菌、菌、植物、昆虫または動物細胞であってよい。
【００６６】
７．プローブ
本発明は、本発明の核酸を含むプローブにも関する。プローブは、下に概説されるように、スクリーニングおよび診断法に用いられうる。プローブは、固体基板、例えばバイオチップへ付着または固定化することができる。
【００６７】
プローブは、８〜５００、１０〜１００または２０〜６０ヌクレオチド長でありうる。また、プローブは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００ヌクレオチド長でありうる。プローブは、１０〜６０ヌクレオチドのリンカー配列をさらに含みうる。
【００６８】
８．バイオチップ
本発明はバイオチップにも関する。バイオチップは、本発明のプローブもしくは複数個のプローブを付着させて含む固体基板を含みうる。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズ可能でありうる。プローブは、空間的に定義されたアドレスで基板上に付着されうる。１つの標的配列につき、１以上のプローブを用いることができ、それはオーバーラップするプローブかまたは特定の標的配列の異なる切片に対するプローブでありうる。プローブは、単一の疾患に関連する標的配列とハイブリダイズ可能でありうる。
【００６９】
プローブは、当業者に理解されるように、多様な方法でバイオチップへ付着させることができる。プローブは、最初に合成した後、バイオチップへ付着させてもよいし、または直接バイオチップ上で合成してもよい。
【００７０】
固体基板は、プローブの付着もしくは会合に適切な分離した別個の部位を含むよう修正することができ、かつ、少なくとも１つの検出法に敏感に反応する材料でありうる。基板の代表的な例としては、ガラスおよび修飾ガラスもしくは機能性ガラス、プラスチック類（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊ、その他を含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリコンおよび修飾シリコンを含むシリカ系材料、カーボン、金属、無機ガラス類および無機プラスチック類が挙げられる。基板は、認めうるほど蛍光発光させなくても光学的検出を可能にさせうる。
【００７１】
基板は平面であってよいが、他の基板の配置も同様に用いてよい。例えば、流動試料の分析のために、プローブを管の内面上に設置して試料容積を最小化してもよい。同様に、特殊なプラスチック製の独立気泡を含む、軟質フォームなどのように、基板は柔軟であってよい。
【００７２】
バイオチップおよびプローブは、化学官能基で誘導体化した後、両者を付着させることができる。例えば、バイオチップを、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基をはじめとする化学官能基を用いて誘導体化することができるが、これらに限定されるものではない。これらの官能基を用いて、リンカーを用いて直接または間接にプローブ上の官能基を用いてプローブを付着させることができる。プローブは、５’末端、３’末端、または内部ヌクレオチドを介するかのいずれかにより固相支持体へ付着されうる。
【００７３】
また、プローブは非共有結合的に固相支持体へ付着されうる。例えば、それをストレプトアビジンで共有結合的にコートされた表面と結合し得る、ビオチン化オリゴヌクレオチドを作出し、付着させることができる。あるいは、光重合およびフォトリソグラフィなどの技術を用いてプローブを表面上に合成することができる。
【００７４】
９．ｍｉＲＮＡ発現解析
また、本発明は、疾患、またはウイルス感染などの病理状態に関連するｍｉＲＮＡを同定する方法に関し、その方法は、生体試料を本発明のプローブまたはバイオチップと接触させる工程、およびハイブリダイゼーションの量を検出する工程を含む。高い感受性をもたらしうる、試料中の核酸を増幅させるＰＣＲを用いることも可能である。
【００７５】
病理細胞において対照区と比較してより過剰に発現されている、またはより発現が低度であるｍｉＲＮＡを同定する能力は、診断学、治療学、薬剤開発、薬理遺伝学、バイオセンサ開発の分野、および他の関連分野において使用可能な、高解像度、高感受性のデータセットをもたらし得る。この方法により生成された発現プロフィールは、ｍｉＲＮＡの数に関する試料の状態の「フィンガープリント」でありうる。２つの状態に同様に発現した特定のｍｉＲＮＡがなくとも、ｍｉＲＮＡの数の評価により、細胞の状態に特有な遺伝子発現プロフィールが同時に生成される。つまり、正常組織を罹患組織と区別することができる。既知の異なる疾患状態における組織の発現プロフィールを比較することにより、どのｍｉＲＮＡがこれらの状態に関連しているかに関する情報を得ることができる。その後、診断を行うかまたは確認して組織試料の有する発現プロフィールが正常組織のものであるか疾患組織のものであるかどうかを判定することができる。これによって、関連条件の分子診断を提供することができる。
【００７６】
１０．発現レベルの決定
本発明はまた、生体試料を本発明のプローブまたはバイオチップと接触させる工程およびハイブリダイゼーションの量を測定する工程を含む、疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定する方法にも関する。疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルは多くの点で役立つ情報である。例えば、対照と比較した疾患関連ｍｉＲＮＡの差次的発現は、患者が疾患に罹っている診断として用いることができる。また、疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルは、患者の治療および疾患の状態をモニターするために用いることができる。さらに、疾患関連ｍｉＲＮＡの発現レベルによって、特定の発現プロフィールを変更するためまたは疾患に関連する発現プロフィールを抑制するための候補薬剤のスクリーニングが可能となりうる。
【００７７】
標的核酸は、標的核酸を含む試料を、標的核酸と十分に相補的な付着プローブを含むバイオチップと接触させること、及び、対照レベルを超えるプローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより検出することができる。
【００７８】
また、標的核酸は、試験する核酸をナイロンメンブレンなどの固相支持体に固定化すること、及び、標識したプローブを該試料とハイブリダイズさせることにより検出することができる。同様に、標識したプローブを固相支持体へ固定化すること、および標識した標的核酸を含有する試料をハイブリダイズすることにより標的核酸を検出することもできる。洗浄して非特異的ハイブリダイゼーションを除去した後、標識を検出すればよい。
【００７９】
また、浸透化した（permeabilized）細胞または組織試料を、標識したプローブと接触させて標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にすることにより、標的核酸をｉｎ ｓｉｔｕで検出することもできる。洗浄して非特異的結合したプローブを除去した後、標識を検出すればよい。
【００８０】
これらのアッセイは、直接ハイブリダイゼーションアッセイであり得るかまたは、一般に米国特許第５，６８１，７０２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５９４，１１７号；同第５，５９１，５８４号；同第５，５７１，６７０号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５７１，６７０号；同第５，５９１，５８４号；同第５，６２４，８０２号；同第５，６３５，３５２号；同第５，５９４，１１８号；同第５，３５９，１００号；同第５，１２４，２４６号；および同第５，６８１，６９７号に概説されるように、複数個のプローブの使用を含むサンドイッチアッセイを含み得る。前記文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
上記に概説したように、高、中および低ストリンジェンシー条件を含む種々のハイブリダイゼーション条件が用いられうる。アッセイは、プローブのハイブリダイゼーションを標的とのみ可能にするストリンジェンシー条件下で行われうる。ストリンジェンシーは、これらに限定されないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、または有機溶媒濃度をはじめとする熱力学的変数である、ステップパラメータを変化させることにより制御することができる。
【００８２】
ハイブリダイゼーション反応は、種々の方法で達成されうる。該反応の成分は、同時に、または異なる順序で順次、添加されうる。さらに、反応には種々の他の試薬が含まれ得、これらとしては、塩、バッファー、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などが挙げられ、これらは最適なハイブリダイゼーションおよび検出を促進するため、かつ／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンドの相互作用を減らすために用いられうる。その他のアッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤および抗菌剤も、試料の調製方法および標的の純度に応じて適切に用いることができる。
【００８３】
ａ．診断
本発明はまた、生体試料において疾患関連ｍｉＲＮＡまたは感染関連ｍｉＲＮＡの差次的な発現レベルを検出する工程を含む診断の方法にも関する。該ｍｉＲＮＡは、感染した被験体で発現しうるウイルスｍｉＲＮＡでありうる。また、該ｍｉＲＮＡは、被験体由来の、ウイルス感染のためにその発現レベルが改変されているものでありうる。試料は患者に由来するものであってよい。患者における疾患状態の診断は、予後診断および治療戦略の選択を可能とする。さらに、一時的に発現したｍｉＲＮＡ分子を判定することにより細胞の発生段階を分類し得る。
【００８４】
標識したプローブの組織アレイとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われうる。個体と標品との間でフィンガープリントを比較すれば、当業者であれば知見に基づいて診断、予後診断、または予測を行うことができる。さらに、診断を示す遺伝子は予後を示す遺伝子とは異なる可能性があり、細胞の状態の分子プロファイリングが反応性もしくは不応性の状態の区別を導くか、または結果を予測させうることが理解される。
【００８５】
ｂ．薬物スクリーニング
本発明はまた、疾患関連ｍｉＲＮＡを発現させることのできる病理細胞を候補治療薬と接触させる工程、及び疾患関連ｍｉＲＮＡの発現プロフィールへの候補薬物の効果を評価する工程を含む、治療薬をスクリーニングする方法にも関する。差次的に発現したｍｉＲＮＡを同定した後、種々のアッセイを実行することができる。試験化合物を、疾患関連ｍｉＲＮＡの遺伝子発現を調節する能力についてスクリーニングすることができる。調節には、遺伝子発現の低下および増加の双方が含まれる。
【００８６】
試験化合物または候補薬物は、疾患関連ｍｉＲＮＡの疾患表現型もしくは発現を直接または間接に変更する能力について試験される任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド、その他でありうる。候補薬剤には、多数の化学的クラス、例えば分子量が１００より大きく約５００、１，０００、１，５００、２，０００もしくは２，５００ダルトン未満である有機小分子が包含される。候補化合物は、タンパク質との構造上の構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基、および一般に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、好ましくはこれらの官能性化学基のうちの少なくとも２つを含みうる。候補薬剤は、環状炭素もしくは複素環構造および／または上記官能基の１種類以上で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含みうる。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはその組合せを含む生体分子にも見出される。
【００８７】
調節因子となる可能性のある物質からなる組合せライブラリーを、疾患関連ｍｉＲＮＡと結合する能力またはその活性を調節する能力についてスクリーニングすることができる。組合せライブラリーは、試薬などの多数の化学的基礎単位を組み合わせることによる、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより作製された、様々な化学物質の収集物でありうる。化学的な組合せライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者に周知である。このような化学的組合せライブラリーとしては、限定されるものではないが、ペプチドがコードされたペプチドライブラリー、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）、ビニル性ポリペプチド、小さな化合物ライブラリーの類似有機合成物、オリゴカルバミン酸、および／またはホスホン酸ペプチジル（ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー、抗体ライブラリー、炭水化物ライブラリー、および有機小分子ライブラリーが挙げられる。
【００８８】
１１．遺伝子サイレンシング
本発明はまた、本発明の核酸を用いて細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を減少させる方法にも関する。標的遺伝子の発現は、標的ｍＲＮＡの１以上の結合部位と実質的に相補的な配列を含む本発明の核酸を発現させることにより減少させることができる。核酸はｍｉＲＮＡまたはその変異体でありうる。また、核酸は、プロセシングされてｍｉＲＮＡを生じうるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはその変異体でありうる。発現したｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの実質的に相補的な結合部位とハイブリダイズすることができ、それはＲＩＳＣに媒介される遺伝子サイレンシングの活性化を引き起こしうる。ｍｉＲＮＡの過剰発現を用いる研究の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４である。当業者であれば、本発明の核酸が、当技術分野で周知のアンチセンス法、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号に記載されるＲＮＡｉ法を用いて標的遺伝子の発現を阻害するために用いられうることが理解されよう。
【００８９】
標的遺伝子は、ウイルスｍｉＲＮＡまたはヒトｍｉＲＮＡを発現することにより減少しうるウイルス遺伝子でありうる。また、標的遺伝子は、ウイルス感染で発現し、ウイルスｍｉＲＮＡまたはヒトｍｉＲＮＡを発現することにより減少しうるヒト遺伝子でありうる。遺伝子サイレンシングの標的は、第２のタンパク質のサイレンシングを引き起こすタンパク質でありうる。標的遺伝子の発現を抑制することにより、第２のタンパク質の発現を増加させうる。ｍｉＲＮＡ発現の効率的な抑制の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｓａｕ ｅｔ ａｌ ２００４ ＪＢＣ ２７５−５２３６１；およびＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３−１２９０による研究である。
【００９０】
１２．遺伝子の増強
本発明はまた、本発明の核酸を用いて細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を増加させる方法にも関する。標的遺伝子の発現は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその変異体と実質的に相補的な配列を含む本発明の核酸を発現させることにより増加する可能性がある。核酸は、抗ｍｉＲＮＡでありうる。抗ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得、その結果として遺伝子抑制活性を低下させ得る。また、標的遺伝子の発現は、本発明の核酸と標的遺伝子の結合部位の結合によりｍｉＲＮＡ結合が回避されうるように、標的遺伝子の結合部位の一部と実質的に相補的な本発明の核酸を発現させることにより増加する可能性がある。
【００９１】
標的遺伝子はウイルス遺伝子であってよく、それが発現するとウイルスの感染力を低下させうる。また、標的遺伝子はヒト遺伝子であってよく、それが発現するとウイルスの感染力を低下させるかまたはウイルス感染に対する耐性もしくは免疫性を増大させうる。
【００９２】
１３．治療
本発明はまた、ウイルス感染に関連するものなどの疾患もしくは障害の調節因子もしくは標的として本発明の核酸を用いる方法にも関する。通常、本発明の請求の範囲の核酸分子は、前記核酸と少なくとも一部分相補的な遺伝子の発現の調節因子として用いられうる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子は治療用スクリーニング手順の標的として働く可能性があり、例えばｍｉＲＮＡ分子の阻害または活性化が細胞の分化過程、例えばアポトーシスを調節するかもしれない。
【００９３】
さらに、既存のｍｉＲＮＡ分子を、その標的特異性を修飾するために配列を修飾したｍｉＲＮＡ分子（例えば癌遺伝子、多剤耐性遺伝子もしくは別の治療標的遺伝子）の製造のための出発物質として用いることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子がプロセシングされた後、治療上関連のある標的に対し再び向けられる二本鎖ｓｉＲＮＡとして生成されるように、ｍｉＲＮＡ分子を修飾することができる。さらに、ｍｉＲＮＡ分子を組織の再プログラミング手順に用いることができる。例えばｍｉＲＮＡ分子の発現により、分化した細胞株を異なる細胞種または幹細胞へ形質転換させることができるかもしれない。
【００９４】
１４．組成物
本発明はまた、本発明の核酸を含み、また所望により製薬上許容される担体をも含み得る医薬組成物にも関する。組成物は診断用途または治療用途に用いることができる。医薬組成物の投与は、核酸をインビトロまたはインビボで所望の標的細胞へ導入する、既知の方法で行ってよい。通常に使用される遺伝子導入技術としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス法および陽イオン性リポソームが挙げられる。
【００９５】
１５．キット
本発明はまた、本発明の核酸とともに以下：アッセイ試薬、バッファー、プローブおよび／もしくはプライマー、ならびに滅菌生理食塩水もしくは他の製薬上許容されるエマルジョンおよび懸濁性基剤、のいずれかまたは全てを含むキットにも関する。さらに、該キットには、本発明の方法を実行するための使用法（例えば、プロトコール）を含む指導書が含まれうる。
【実施例１】
【００９６】
ｍｉＲＮＡの予測
本発明者らは、ｍｉＲＮＡを予測するため、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号に記載されるものに類似する３つのコンピュータによるアプローチを用いて、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の可能性について多数のウイルスゲノムを調査した。予測されたヘアピンおよび有望なｍｉＲＮＡを、熱力学的安定性、ならびに構造上および状況上の特徴により評価した。有効であったＳａｎｇｅｒデータベース中のｍｉＲＮＡを用いてアルゴリズムを修正した。
【００９７】
１．１回目および２回目の選別
表１１および１２は、１回目のコンピュータによる選別から予測された各ヘアピンに関する配列（「ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）、配列識別子（「ＰＲＥＣＵＲ ＳＥＱ−ＩＤ」）および由来生物（「ＧＡＭ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）を、予測ｍｉＲＮＡ（「ＧＡＭ ＮＡＭＥ」）とともに示す。表１３および１４は、各ｍｉＲＮＡ（「ＧＡＭ ＮＡＭＥ」）に関する配列（「ＧＡＭ ＲＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）および配列識別子（「ＧＡＭ ＳＥＱ−ＩＤ」）を、由来生物（「ＧＡＭ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）およびダイサーの切断位置（「ＧＡＭ ＰＯＳ」）とともに示す。
【００９８】
２．３回目の選別
表１には、特定のウイルスゲノム（「Ｖ」；表１０も参照）の３回目のコンピュータによる選別の各予測ヘアピン（「ＨＩＤ」）に関する配列番号が列挙されている。また、表１には、各ヘアピンのゲノムにおける位置（「Ｈａｉｒｐｉｎ Ｌｏｃａｔｉｏｎ（Hairpin Loc.）」）が列挙されている。ゲノム位置の形式は、＜鎖（strand）＞＜開始位置（start position）＞の連続した形である。遺伝子の位置は、ＮＣＢＩ−Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースに基づいている。Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ、およびＰＤＢを含む数個の供給源から配列の収集物である。表１０はこの選別で用いた各々のゲノムに関する受託番号および構築物（版）を示す。
【００９９】
また、表１には各予測ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ*に関する配列番号（「ＭＩＤ」）が列挙されている。また、表１には、Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ １２５：１６７−１８８，１９９４に記載されるように、各ヘアピンについて０〜１段階の（最も確実なヘアピンが１）予測スコアの等級（「Ｐ」）が列挙されている。また、表１には、各Ｐスコアの値についてバックグラウンドヘアピンから計算したｐ値（「Ｐｖａｌ」）が列挙されている。全てのｐ値は０．０５よりも有意に低い。表１に示されるように、Ｐｖａｌが０．０である場合が少数ある。これらの各々の場合では、この値は０．０００１未満である。ｐ値は、ヘアピンの事前選択を行わずに、試験したヘアピンのパルグレード（ｐａｌｇｒａｄｅ）と他の配列のパルグレードを比較することにより計算した。
【０１００】
また、表１には、表２に詳述されるように、ｍｉＲＮＡが発現解析（「Ｅ」）によって有効であったか否かが列挙されている（Ｙ＝有効、Ｎ＝否）。また、表１には、表３に詳述されるように、ｍｉＲＮＡが配列決定（「Ｓ」）により有効であったか否かが列挙されている（Ｙ＝有効、Ｎ＝否）。もし予測ｍｉＲＮＡと配列決定されたｍｉＲＮＡとの間の配列に違いがある場合は、配列決定された配列が提示されている。注意すべきは、ｍｉＲＮＡの配列決定または発現の検出に失敗しても、それが必ずしもｍｉＲＮＡが存在しないことを意味するものではないということである。このような検出されないｍｉＲＮＡは、被験組織以外の組織で発現する可能性がある。さらに、このような検出されないｍｉＲＮＡは、被験組織で発現するが、実験細胞とは異なる段階または異なる条件下で発現する可能性がある。
【０１０１】
また、表１には、表２に詳述されるように、ｍｉＲＮＡが少なくとも１つの疾患において、差次的発現（「Ｄ」）を示したかどうかが列挙されている（Ｙ＝示した、Ｎ＝否）。また、表１には、ヒトもしくはマウスで検出されたかまたはヒトにおいて予測されたように、Ｓａｎｇｅｒ ＤＢリリース６．０（２００５年４月）（ｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／）中にｍｉＲＮＡが存在したかどうか（「Ｆ」）が列挙されている（Ｙ＝存在、Ｎ＝否）。以上に考察したように、Ｓａｎｇｅｒデータベース中に収載されるｍｉＲＮＡは、予測アルゴリズムの構成要素であり、また結果の対照である。
【０１０２】
また、表１には、特定のウイルスの互いに１，０００ヌクレオチド以内のヘアピンに関する遺伝子位置クラスター（「ＬＣ」）が列挙されている。同じＬＣを有する各々のｍｉＲＮＡは同じ遺伝子クラスターを共有する。オーバーラップするヘアピンはクラスター化していない。また、表１には、供給源ウイルスにかかわらず、完全な一致に基づいてその２〜７のシードを単位としてｍｉＲＮＡをグループ化するためのシードクラスター（「ＳＣ」）が列挙されている。同じＳＣを有する各々のｍｉＲＮＡは同じシードを有する。６ヌクレオチド長のシードに関する考察については、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０；１５−２０（２００５）参照。
【０１０３】
実施例２
標的遺伝子の予測
次に、実施例１の３回のコンピュータによる選別から予測されたｍｉＲＮＡを用いて、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号、に記載されるものに類似の、ｍｉＲＮＡを予測するための２つの計算論的アプローチを用いて、ヒトおよびウイルス標的遺伝子ならびにそれらの結合部位を予測した。
【０１０４】
１．１回目および２回目の選別
表１５および１６には、１回目のコンピュータによる選別から得られた予測標的遺伝子（「ＴＡＲＧＥＴ」）および結合部位配列（「ＴＡＲＧＥＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）および結合部位配列識別子（「ＴＡＲＧＥＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ ＳＥＱ−ＩＤ」）、ならびに標的の由来生物（「ＴＡＲＧＥＴ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）が列挙されている。
【０１０５】
２．３回目の選別
ａ．ヒト標的遺伝子
表４には、３回目のコンピュータによる選別から得られた、特定のウイルス（Ｖ）およびそのヘアピン（ＨＩＤ）から各ｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）に関して予測されたヒト標的遺伝子が列挙されている。標的遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ参照配列リリース９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３（１）：Ｄ５０１−Ｄ５０４，２００５；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１６（１）：４４−４７，２０００；およびＴａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１５（７−８）：５３６−４３，１９９９）から得た。標的遺伝子を、７ヌクレオチドのｍｉＲＮＡシード（位置２〜８）およびＵＴＲ上のＡ（合計８ヌクレオチド）が完全に相補的に一致していることにより同定した。標的遺伝子を同定する際の考察に関しては、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２０：１５−２０，（２００５）参照。ｍｉＲＮＡとＵＴＲとの結合に十分なシードの考察に関しては、Ｌｉｍ Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ ２００５）およびＢｒｅｎｎｅｃｋ ｅｔ ａｌ，（ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００５）参照。
【０１０６】
結合部位の選別は、ＵＴＲごとに最初の４０００ヌクレオチドのみを考慮に入れ、１遺伝子につき数個の転写物がある場合は最も長い転写物を考慮に入れた。フィルタリングにより転写物の総数は２３６２６から１４２３９に減少した。表４には、各標的遺伝子に関する予測結合部位の配列番号が列挙されている。結合部位の配列は、スプライスされたｍＲＮＡ上に位置するので、結合部位の５’および３’の２０ヌクレオチドを含む。結合部位が２つのエキソンからなる場合には、双方のエキソンの５’末端および３’末端双方から２０ヌクレオチドが含まれる。
【０１０７】
表５は、ヒト標的遺伝子ごとの特定のウイルス（Ｖ）のｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）／ヘアピン（ＨＩＤ）と疾患との間の関係を示す。疾患の名称はＯＭＩＭから得た。ヘアピンの位置する宿主遺伝子と疾患とを結びつける理論的根拠の考察に関しては、Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ，１１：２４１−２４７（２００５）およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１４：１９０２−１９１０（２００４）参照。表５は、疾患に関連しているｍｉＲＮＡ標的遺伝子の数（「Ｎ」）を示す。また、表５は、ｍｉＲＮＡの結合部位を有すると予測された遺伝子から得られる、疾患に関連している遺伝子の総数（「Ｔ」）を示す。また、表５はＴのうちのＮの割合および超幾何学的解析のｐ値（「Ｐｖａｌ」）を示す。ｐｖａｌが０．０として記載されている場合、その値が０．０００１未満であることを示している。超幾何学的解析の参照には、Ｓｃｈａｕｍ’ｓ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＩＩ：Ｉｎｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ参照。表７は表５および６の疾患コードを示す。
【０１０８】
ｂ．ウイルス標的遺伝子
上記の表４に現在までヒト標的遺伝子に関して記載されるものに類似して、表１０には、３回目のコンピュータによる選別から得られた、同じ特定のウイルス（Ｖ）およびそのヘアピン（ＨＩＤ）から各ｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）に関して予測されたウイルス標的遺伝子が列挙されている。ウイルス結合部位の予測には、上記の表１０のヒト標的遺伝子に関する方法で、表４のようにＵＴＲでなく完全な遺伝子が用いられた。候補標的遺伝子がウイルス生活環における役割を有することが知られている場合には、その候補標的遺伝子を選別に含めた。ウイルス生活環に役割を果たすウイルス遺伝子上に結合部位を有するｍｉＲＮＡは、ウイルスに関連する可能性のある疾患に影響しうる。
【０１０９】
ヒトヘルペスウイルス１および２は、ヘルペスウイルスに引き起こされるいくつかの炎症性疾患のいずれかに関連し、ある例では腰から上の皮膚または粘膜の水疱群（口および唇のものなど）が顕著であり、また他の例ではこのような水疱が生殖器に顕著である。ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン−バーウイルス）は伝染性単核症を引き起こし、バーキットリンパ腫および上咽頭癌に関連している。ＨＩＶ株は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関与している。Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスは肝臓の炎症を引き起こす。
【０１１０】
実施例３
ｍｉＲＮＡの検認
実施例１において予測されたヘアピンおよびｍｉＲＮＡを確かめるため、本発明者らはその内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号に記載されるものに類似のハイスループットマイクロアレイを用いて種々の組織で発現を検出した。各々の予測前駆体ｍｉＲＮＡについて、ヘアピンの双方のステムに由来する成熟ｍｉＲＮＡを試験した。
【０１１１】
１．発現解析−セット１およびセット２
表１７〜１９には、ｍｉＲＮＡ配列を検出するためのマイクロアレイ発現解析の結果が列挙されている（「ＧＡＭ ＲＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）。
【０１１２】
２．発現解析−セット３
表２は、特定のウイルス（「Ｖ」）から関連ｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）の発現を検出することにより有効であると確認された、３回目の予測セットのヘアピン（「ＨＩＤ」）、ならびに発現の検出された組織のコード（「Ｔｉｓｓｕｅ」）を示す。同じ組織中の同じｍｉＲＮＡから１以上のスコアが得られる場合は、高い方のスコアのみが示されている。
【０１１３】
組織および疾患コードは、それぞれ表６および表７に列挙されている。表８は遺伝子と疾患との関係を示す。これは全てのｍｉＲＮＡと疾患との結びつきを可能にする。表４では、少なくとも１つの標的遺伝子が各ｍｉＲＮＡに割り当てられている。表５は、表４の統計解析の結果およびＯＭＩＭを示してｍｉＲＮＡと疾患の有意な関係を表している。表８は基本的にＯＭＩＭの縮約版である。表８には、各遺伝子に関して該遺伝子に関連する疾患の全ての数字コードが列挙されている。
【０１１４】
開示された全ての組織がウイルス性疾患の指標をもたらす。ウイルスの有意な発現が測定されたということは、この組織において組織がウイルス性疾患に関与しうることを意味する。例えばＨＩＶのｍｉｒがＴ細胞系統で発現した場合、それはＡＩＤＳへの影響を有しうる。当然、細胞系統は組織が器官で機能する際に組織の特徴のサブセットしか表さないが、細胞系統において測定される発現から推定が可能である。
【０１１５】
また、表２は、チップの発現スコアの等級（５００〜６５０００の範囲）（「Ｓ」）を示す。閾値の５００を用いて有意でないシグナルを除去し、スコアを異なる実験から得たＭｉｒＣｈｉｐプローブシグナルで標準化した。実験間の蛍光材料の強度の変動は、ＲＮＡ調製物または標識効率の可変性に起因しうる。本発明者らは、各試料におけるｍｉＲＮＡの総量は比較的一定しているとの仮説に基づいて標準化した。最初に本発明者らは、各プローブの生のシグナルからバックグラウンドシグナルを引いた（バックグラウンドシグナルは４００として定義された）。次に、本発明者らは各ｍｉＲＮＡプローブシグナルを全ｍｉＲＮＡの平均のシグナルで割り、その結果に１００００を掛けてバックグラウンドシグナルの４００を加えて戻した。従って、定義によれば、各々の実験の全ｍｉＲＮＡプローブシグナルの合計は１０４００である。
【０１１６】
また、表２は、標準化したスコアをもとに算出された標準化されたシグナルの統計解析を示す（「Ｓｐｖａｌ」）。各ｍｉＲＮＡについて、本発明者らは、完全な予測ｍｉＲＮＡリストから関連対照群を用いた。各ｍｉＲＮＡはミスマッチを含むプローブの内部対照を有する。関連対照群には、類似したＴｍを持たせるために、類似したＣおよびＧの割合（差分絶対値＜５％）をもつプローブを含めた。プローブシグナルのＰ値は、同じまたは高いシグナルをもつ関連対照群プローブに対する比である。結果は、ｐ値≦０．０５であり、スコアは５００超である。ＳＰＶａｌが０．０として記載される場合、この値は０．０００１未満である。
【０１１７】
３．配列決定−セット３
２回目の予測のヘアピン（「ＨＩＤ」）をさらに検認するため、多数のｍｉＲＮＡを、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／５２２，４５９号、同第１０／７０９，５７７号および同第１０／７０９，５７２号に記載されるものに類似の配列決定法により有効性を確認した。表３は、示された組織（「Ｔｉｓｓｕｅ」）においてウイルス（「Ｖ」）のｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）を配列決定することにより有効であると確認されたヘアピン（「ＨＩＤ」）を示す。
【０１１８】
４．ノーザン解析
ｍｉＲＮＡの群を、図２および３に示されるようにノーザン解析により検認した。
【０１１９】
実施例４
ｍｉＲＮＡの差次的発現
１．ウイルスｍｉＲＮＡ
表２０には、健康なヒト組織またはヒト由来細胞系統と比較して罹患組織で差次的に発現することが実証された有効なウイルスｍｉＲＮＡが記載されている。全てのｍｉＲＮＡ配列が、上記のようにｍｉＲＮＡマイクロアレイを用いて有効であると確認された。アルツハイマー病（Alzheimer）には、罹患した、ならびに健康な、ヒト扁桃体、帯状皮質、尾状核、淡蒼球、後頭頂葉、および上頭頂皮質、アルツハイマー症状により軽度、中度、または重度に影響することが示されている脳の全ての領域由来の、組織の混合物におけるＧＡＭ ＲＮＡ発現が研究された。パーキンソン病（Parkinson）には、罹患したおよび健康なヒト組織由来の黒質組織におけるＧＡＭ ＲＮＡ発現が研究された。ＭＴ２細胞系統を、クレードＡヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴ細胞指向性臨床分離株で感染させたが、一方で健康な対照区は感染させなかった。ｃＭａｇｉ細胞系統を、マクロファージ指向性クレードＢ ＨＩＶで感染させたが、一方で健康な対照区は感染させなかった。ヒト繊維芽細胞（ＴＣ）を、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２で感染させるか、または感染させずに対照区とした。ＧＡＭ ＲＮＡＳＥＱＵＥＮＣＥ：成熟した、「ダイサーにより切断された（ｄｉｃｅｄ）」ＧＡＭ ＲＮＡの配列（５’から３’）。ＣＨＩＰ ＳＥＱＵＥＮＣＥは、マイクロアレイ上に設置された予測ＧＡＭ ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドの配列である（マイクロアレイ表面とのセパレーターとして用いられる非ゲノム配列は含まない）。ＤＩＳＥＡＳＥ：ＧＡＭ ＲＮＡが差次的に発現した疾患―ＢＡＬはマクロファージ指向性ＨＩＶ１サブタイプＢ、ｌａｂ株をさし、ＢＬＡＩはＴ細胞指向性ＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１）、サブタイプＢをさす；ＳＩＧＮＡＬ（ＨＥＡＬＴＨＹ）：指定される疾患に罹患していないヒト組織またはヒト由来細胞系統からなる試料中のＧＡＭ ＲＮＡに関するマイクロアレイ上のシグナル；ＳＩＧＮＡＬ（ＤＩＳＥＡＳＥ）：指定される疾患に罹患しているヒト組織またはヒト由来細胞系統からなる試料中のＧＡＭ ＲＮＡに関するマイクロアレイ上のシグナル。
【０１２０】
２．ヒトｍｉＲＮＡ
表２１には、以下のｍｉＲＮＡの発現データが列挙されている。ＨＩＤ：ヘアピン配列番号、ＭＩＤ：ｍｉＲＮＡ配列番号、Tissue：被験組織、Ｓ：チップ発現スコアの等級（範囲＝１００〜６５０００）、Ｄｉｓ．Ｄｉｆｆ．Ｅｘｐ．：疾患関連差次的発現およびそれを試験する組織、Ｒ：疾患関連発現の比（範囲＝０．０１〜９９．９９）、および略語：Ｂｒａｉｎ Ｍｉｘ Ａ−アルツハイマーに影響を及ぼす脳組織の混合物；Ｂｒａｉｎ Ｍｉｘ Ｂ−脳の全ての組織の混合物；ならびにＢｒａｉｎ ＳＮ−黒質。表２２および２３には、差次的に発現したｍｉＲＮＡに関する以下の詳細が記載されている。ＨＩＤ：ヘアピン配列番号、Ｈａｉｒｐｉｎ＿Ｌｏｃ：＜ｃｈｒ＿ｉｄ＞＜鎖＞スペース＜開始位置＞の連続した形のヘアピンゲノムの位置（例えば、１９＋１３５４６００００はｃｈｒ１９＋鎖、開始位置１３５４６００００を意味する）、Ｃ：進化過程での保存（有／無、および、データが該当しない場合は「−」；有−保存レベルは０．７の閾値を上回る）、Ｔ：ゲノムの種類、遺伝子間領域（Ｇ）、イントロン（Ｉ）、エキソン（Ｅ）、ＭＩＤ：ｍｉＲＮＡ配列番号；Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ，Ｄｉｓｅａｓｅ：標的遺伝子（ＨＵＧＯデータベース）および関連疾患（ＯＭＩＭデータベース）、Ｐ：予測スコア等級（０〜９の範囲）、Ｅ：チップ発現情報−有効／否（Ｙ／Ｎ）、Ｓ：配列決定による検認−有効／否（Ｙ／Ｎ）、ＨＩＤ：ヘアピン配列番号。表２４には、表２１〜２３中に言及される配列が記載される。
【０１２１】
実施例５
ＥＢＶ ｍｉＲＮＡの解析
１．発現の検認
図４は、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）ｍｉＲＮＡにおいて予測されたｍｉＲＮＡの発現の検認を示す；発現検認。３つの細胞株が試験された。２つは感染させてすぐの正常Ｂ細胞（ＰＢＭＣ−１／２−ＥＢＶ）であり、１つはＥＢＶ−形質転換細胞株（Ｂ−９５−８）であった。３つの細胞株は同程度のＥＢＶ感染度合いを示した（図４Ａ）。しかし、感染させてすぐのＢ細胞に対して、ＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−１およびＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−２はＢ−９５−８細胞系統において高度に発現した（図４Ｂ）。
【０１２２】
２．発現のノックアウト
図５は、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡのノックアウトを示す。２−Ｏ−メチルをＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−１に対抗して得られたＢ−９５−８細胞株へ添加すると、ＥＢＶ抗原を発現している細胞が劇的に減少する。２−Ｏ−メチルをＥＢＶ−ｍｉＲ−ＲＧ−２に対抗して得られたＢ−９５−８へ添加すると、僅かにＥＢＶ発現を増加させる、中程度の効果があった。
【０１２３】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる、２００４年５月２６日出願の米国特許出願第１０／７０９，７３９号の一部継続出願であり、２００４年１０月４日出願の米国特許仮出願第６０／５２２，４５９号および２００５年５月２５日出願の米国特許仮出願第６０／６６５，０９４号の恩典を主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ｍｉＲＮＡの成熟のモデルを示す図である。
【図２Ａ】２つの予測ｍｉＲＮＡ（太字）を含有するＨＩＶ１の５’ＵＴＲ（Ｕ５Ｒ）を示す。成熟ｍｉＲＮＡに下線が引かれている。
【図２Ｂ】２つの予測ｍｉＲＮＡ（太字）を含有するＨＩＶ１の５’ＵＴＲ（Ｕ５Ｒ）における成熟ｍｉＲＮＡ（図２Ａ中の下線部）の、５’末端の近くにある１つを示す。
【図２Ｃ】２つの予測ｍｉＲＮＡ（太字）を含有するＨＩＶ１の５’ＵＴＲ（Ｕ５Ｒ）における成熟ｍｉＲＮＡ（図２Ａ中の下線部）の、３’末端の近くにあるもう１つを示す。最も５’側のｍｉＲＮＡは、ＴＡＴタンパク質と結合するＴＡＲ（Ｎａｔｕｒｅ １９８７．３３０：４８９−９３）という既知のＨＩＶ１ ＲＮＡ構造に一致する。また、類似したｍｉＲＮＡ（ＧＡＭ ＮＡＭＥ ５０６０３３）もチップ上で輝いた。このｍｉＲＮＡプローブは、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１）、サブタイプＢの配列を基に設計されており、図２Ｂに示したｍｉＲＮＡとは異なる１つのヌクレオチドである。図２Ｂおよび図２Ｃは、Ｕ５Ｒ中に存在し、予測成熟ｍｉＲＮＡプローブとハイブリダイズしたｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのノーザンブロット解析を表す。上の矢印は全３５５ｎｔのＵ５Ｒ転写物の分子サイズを示す。２つのＧＡＭ ＲＮＡの予測分子サイズはそれぞれ２２ｎｔおよび１７ｎｔである。下の矢印は２２ｎｔの細胞マーカーを示す。レーン：１− Ｈｅｌａライセート；２− インキュベートを行わないＨｅＬａライセート中のＵ５Ｒ転写物；および３− ２４時間ＨｅｌａライセートでインキュベートしたＵ５Ｒ転写物。
【図２Ｄ】予測成熟ＨＩＶ１ ｍｉＲＮＡプローブと反応したＨＩＶ１ ＲＮＡの部分転写物を示す。
【図２Ｅ】予測成熟ＨＩＶ１ ｍｉＲＮＡプローブと反応したＨＩＶ１ ＲＮＡの部分転写物を示す。図２Ｄ及び図２Ｅのそれぞれの図には実験転写配列が示され、予測成熟ｍｉＲＮＡに下線が引かれている。ｍｉＲＮＡ前駆体のノーザンブロット解析を示す。１つのｍｉＲＮＡ前駆体転写物が１６３ｎｔであり、もう１つのｍｉＲＮＡ前駆体転写物が２００ｎｔであることが実証される。成熟ｍｉＲＮＡの予測分子サイズは双方とも２４ｎｔである。２２ｎｔ細胞マーカーが示されている。レーン：１− インキュベートを行わないＨｅＬａライセート中の転写物、および２− ２４時間ＨｅＬａライセートでインキュベートした転写物。
【図３】ノーザンブロットの結果を示す。ＥＢＶ感染（Ｂ９５／８ ＥＢＶ）および非感染（ｐＢＭＣ）細胞におけるＧＡＭ５０６３３３およびＧＡＭ５０６３３６の発現プロフィールを示す。これらのｍｉＲＮＡの発現は、ＥＢＶに感染したＢ−９５／８細胞株のＲＮＡとハイブリダイズしたｍｉＲＮＡマイクロアレイで実証された。これらの有効なｍｉＲＮＡ予測物に対するプローブをノーザンブロットで全ＲＮＡとハイブリダイズした。ノーザンブロットにより、マイクロアレイ上の感染細胞においてこれら２つのｍｉＲＮＡの発現の高いことが確認された。
【図４】ＥＢＶにより発現したｍｉＲＮＡの検認を示す。
【図５】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡのノックアウトを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３；
（ｂ）表１、１１〜１２および２１〜２３で参照される前駆体の配列；
（ｃ）配列番号：１〜１１４２４１６または４２０４９１４〜４２０４９１５；
（ｄ）表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；
（ｅ）配列番号：１１４２４１７〜４０９７７２０；
（ｆ）表４、１０および１５〜１６で参照される標的遺伝子結合部位の配列；
（ｇ）（ａ）〜（ｈ）の相補物；
（ｈ）（ａ）〜（ｈ）と少なくとも７０％同一の、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列；
からなる群から選択される配列の一部を含む単離された核酸であって、５〜２５０ヌクレオチド長である、該単離された核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含むプローブ。
【請求項３】
核酸が、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡ、またはその変異体と相補的な、少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
核酸が、ウイルス感染において差次的に発現したヒトｍｉＲＮＡと相補的な、少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載のプローブ。
【請求項５】
請求項３または４に記載のプローブからなる群から選択される複数個のプローブ。
【請求項６】
少なくとも１０個のプローブを含む請求項５に記載の複数個のプローブ。
【請求項７】
少なくとも１００個のプローブを含む請求項５に記載の複数個のプローブ。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の複数個のプローブを含む組成物。
【請求項９】
固体基板を含むバイオチップであって、該基板が請求項５〜７のいずれか１項に記載の複数個のプローブを含み、各該プローブが空間的に定義されたアドレスにおいて該基板に付着している、該バイオチップ。
【請求項１０】
（ａ）生体試料を準備する工程；および
（ｂ）（ｉ）配列番号１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と少なくとも７０％同一である核酸のレベルを測定する工程;
を含む、ウイルス感染関連ｍｉＲＮＡの差次的発現を検出するための方法であって、対照区と比較した核酸のレベルの違いが差次的発現を示す、該方法。
【請求項１１】
（ａ）（ｉ）配列番号１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と少なくとも７０％同一である核酸を発現することのできる細胞を準備する段階；
（ｂ）細胞を候補調節因子と接触させる段階；
（ｃ）核酸の発現のレベルを測定する段階;
を含む、ウイルス感染を調節する化合物を同定するための方法であって、対照区と比較した核酸のレベルの違いで、化合物をその核酸に関連する病理状態の調節因子として同定する、該方法。
【請求項１２】
核酸を、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で細胞へ導入する工程を含む、細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、該標的遺伝子が、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位と実質的に同一の結合部位、またはその変異体を含み、核酸が（ｉ）配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体、の一部を含む、該方法。
【請求項１３】
インビトロまたはインビボで発現が阻害される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸を、標的遺伝子の発現を増加させるのに十分な量で細胞へ導入する段階を含む、細胞において標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、該標的遺伝子が表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位と実質的に同一の結合部位、またはその変異体を含み、核酸の一部分が（ｉ）配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と実質的に相補的である、該方法。
【請求項１５】
インビトロまたはインビボで発現が阻害される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸を必要とする患者へ該核酸を投与する工程を含む、ウイルス感染患者またはウイルス感染に関連する状態の患者を治療する方法であって、該核酸の一部分が（ｉ）配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と実質的に相補的である、該方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号：４０９７７２１〜４２０４９１３；
（ｂ）表１、１１〜１２および２１〜２３で参照される前駆体の配列；
（ｃ）配列番号：１〜１１４２４１６または４２０４９１４〜４２０４９１５；
（ｄ）表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列；
（ｅ）配列番号：１１４２４１７〜４０９７７２０；
（ｆ）表４、１０および１５〜１６で参照される標的遺伝子結合部位の配列；
（ｇ）（ａ）〜（ｈ）の相補物；
（ｈ）（ａ）〜（ｈ）と少なくとも７０％同一の、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列；
からなる群から選択される配列の一部を含む単離された核酸であって、５〜２５０ヌクレオチド長である、該単離された核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含むプローブ。
【請求項３】
核酸が、配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡ、またはその変異体と相補的な、少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
核酸が、ウイルス感染において差次的に発現したヒトｍｉＲＮＡと相補的な、少なくとも８〜２２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載のプローブ。
【請求項５】
請求項３または４に記載のプローブからなる群から選択される複数個のプローブ。
【請求項６】
少なくとも１０個のプローブを含む請求項５に記載の複数個のプローブ。
【請求項７】
少なくとも１００個のプローブを含む請求項５に記載の複数個のプローブ。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の複数個のプローブを含む組成物。
【請求項９】
固体基板を含むバイオチップであって、該基板が請求項５〜７のいずれか１項に記載の複数個のプローブを含み、各該プローブが空間的に定義されたアドレスにおいて該基板に付着している、該バイオチップ。
【請求項１０】
（ａ）生体試料を準備する工程；および
（ｂ）（ｉ）配列番号１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と少なくとも７０％同一である核酸のレベルを測定する工程;
を含む、ウイルス感染関連ｍｉＲＮＡの差次的発現を検出するための方法であって、対照区と比較した核酸のレベルの違いが差次的発現を示す、該方法。
【請求項１１】
（ａ）（ｉ）配列番号１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４および２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と少なくとも７０％同一である核酸を発現することのできる細胞を準備する段階；
（ｂ）細胞を候補調節因子と接触させる段階；
（ｃ）核酸の発現のレベルを測定する段階;
を含む、ウイルス感染を調節する化合物を同定するための方法であって、対照区と比較した核酸のレベルの違いで、化合物をその核酸に関連する病理状態の調節因子として同定する、該方法。
【請求項１２】
核酸を、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で細胞へ導入する工程を含む、細胞において標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、該標的遺伝子が、表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位と実質的に同一の結合部位、またはその変異体を含み、核酸が（ｉ）配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体、の一部を含む、該方法。
【請求項１３】
インビトロまたはインビボで発現が阻害される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸を、標的遺伝子の発現を増加させるのに十分な量で細胞へ導入する段階を含む、細胞において標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、該標的遺伝子が表４、１０もしくは１５〜１６に参照される結合部位と実質的に同一の結合部位、またはその変異体を含み、核酸の一部分が（ｉ）配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と実質的に相補的である、該方法。
【請求項１５】
インビトロまたはインビボで発現が阻害される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸を必要とする患者へ該核酸を投与する工程を含む、ウイルス感染患者またはウイルス感染に関連する状態の患者を治療する方法であって、該核酸の一部分が（ｉ）配列番号：１〜１１４２４１６もしくは４２０４９１４〜４２０４９１５、（ｉｉ）表１、１３〜１４もしくは２１〜２３に参照されるｍｉＲＮＡの配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の変異体と実質的に相補的である、該方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５０００３９（Ｐ２００８−５０００３９Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１４２１６（Ｐ２００７−５１４２１６）
【出願日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２３５２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１６２５０
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６３８１８７６）ロゼッタ ジノミクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２３５２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１６２５０
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（５０６３８１８７６）ロゼッタ ジノミクス リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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