エシェリヒア属又はバチルス属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法
エシェリヒア属又はバチルス属のいずれかに属し、ｙｅａＳ（ｌｅｕＥ）遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を高めることにより、プリンヌクレオシド生産能が高められた細菌を使用して、イノシン及びグアノシン等のプリンヌクレオシドを製造する方法及び５’−イノシン酸又は５’−グアニル酸等の５’−プリンヌクレオチドを製造する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−イノシン酸又は５’−グアニル酸等の５’−プリンヌクレオチドの合成における原料物質として重要なプリンヌクレオシドを製造する方法と、その製造に使用する新規の微生物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、イノシン、グアノシン及びキサントシン等のプリンヌクレオシドは、アデニン栄養要求性株を用いた発酵によって工業的に生産される。あるいは、このような株はさらに、プリン類似体及びスルファグアニジン等の様々な薬剤に対する薬剤耐性を与えられ得る。これらの株としては、バチルス属（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８）、又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）（コリネバクテリウム（Corynebacterium））属（特許文献９、特許文献１０、及び非特許文献１）、又はエシェリヒア属（特許文献１１）等に属するものが挙げられる。
【０００３】
このような突然変異株を得るのに典型的な方法は、ＵＶ照射によって又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で処理することによって微生物の突然変異を誘発させること、及び好適な培地を用いて突然変異株を選択することを含む。また他方で、遺伝子工学技術を使用したこのような突然変異株の育種は、バチルス属（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、及び特許文献２１）、ブレビバクテリウム（コリネバクテリウム）属（特許文献２２）、又はエシェリヒア属（特許文献１１）に属する株で実施されている。
【０００４】
プリンヌクレオシド産生株の生産性は、プリンヌクレオシド排出活性を増大させることでさらに向上させることができる。細胞膜を通る代謝物の浸透は通常、特異的な排出輸送タンパク質によって媒介されることが一般的に考えられている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。本発明者らは以前に、ｒｈｔＡ（ｙｂｉＦ）遺伝子によってコードされたＲｈｔＡタンパク質の活性が高い、エシェリヒア属又はバチルス属に属するイノシン産生株又はキサントシン産生株が、親株より多くのイノシン又はキサントシンを産生することを示した（特許文献２３）。さらに、ｙｉｊＥ遺伝子、ｙｄｅＤ遺伝子又はｙｉｃＭ遺伝子によってコードされたＹｉｊＥタンパク質、ＹｄｅＤタンパク質、又はＹｉｃＭタンパク質の活性が高い、エシェリヒア属に属するイノシン産生株が、親株よりも多くのイノシンを産生した（それぞれ、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６）。
【０００５】
本発明者らは以前に、エシェリヒア・コリ（E. coli）のｙｅａＳ（ｌｅｕＥ）遺伝子が、ＲｈｔＢファミリーに属し、且つアミノ酸の排出に関与する膜タンパク質をコードすることを見出した（非特許文献５）。具体的に、この遺伝子は、ロイシン、ヒスチジン及びメチオニンのエクスポータをコードする（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭３８−２３０３９号公報（１９６３）
【特許文献２】特公昭５４−１７０３３号公報（１９７９）
【特許文献３】特公昭５５−２９５６号公報（１９８０）
【特許文献４】特公昭５５−４５１９９号公報（１９８０）
【特許文献５】特開昭５６−１６２９９８号公報（１９８１）
【特許文献６】特公昭５７−１４１６０号公報（１９８２）
【特許文献７】特公昭５７−４１９１５号公報（１９８２）
【特許文献８】特開昭５９−４２８９５号公報（１９８４）
【特許文献９】特公昭５１−５０７５号公報（１９７６）
【特許文献１０】特公昭５８−１７５９２号公報（１９７２）
【特許文献１１】国際公開第９９／０３９８８号パンフレット
【特許文献１２】特開昭５８−１５８１９７号公報（１９８３）
【特許文献１３】特開昭５８−１７５４９３号公報（１９８３）
【特許文献１４】特開昭５９−２８４７０号公報（１９８４）
【特許文献１５】特開昭６０−１５６３８８号公報（１９８５）
【特許文献１６】特開平１−２７４７７号公報（１９８９）
【特許文献１７】特開平１−１７４３８５号公報（１９８９）
【特許文献１８】特開平３−５８７８７号公報（１９９１）
【特許文献１９】特開平３−１６４１８５号公報（１９９１）
【特許文献２０】特開平５−８４０６７号公報（１９９３）
【特許文献２１】特開平５−１９２１６４号公報（１９９３）
【特許文献２２】特開昭６３−２４８３９４（１９８８）
【特許文献２３】ロシア国特許第２２３９６５６号
【特許文献２４】ロシア国特許第２２４４００３号
【特許文献２５】ロシア国特許第２２４４００４号
【特許文献２６】ロシア国特許第２２７１３９１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 42, 399（1978）
【非特許文献２】Pao et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34,（1998）
【非特許文献３】Paulsen et al., J. Mol. Biol., 277, 573-592（1998）
【非特許文献４】Saier et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279（1999）
【非特許文献５】Aleshin et al., TIBS, 1999
【非特許文献６】Kutukova et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、プリンヌクレオシド産生株によるプリンヌクレオシドの生産性を高めること、及びこれらの株を使用したプリンヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、ｙｅａＳ遺伝子を同定することによって達成された。この遺伝子は、多コピーベクター上の野生型対立遺伝子として株に導入されると、プリン塩基類似体、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン及び６−チオグアニンに対する耐性を与える推定アミノ酸エクスポーターをコードする。さらに、ｙｅａＳ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で、エシェリヒア属又はバチルス属に属する各プリンヌクレオシド産生株の細胞に導入されると、プリンヌクレオシド産生を高めることができる。このようにして、本発明が完成した。
【００１０】
したがって本発明は、プリンヌクレオシド生産能を有する、エシェリヒア属又はバチルス属に属する微生物を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明は、微生物外へのプリンヌクレオシドの輸送に関与すると予想され
るタンパク質の活性増大に基づいてプリンヌクレオシド生産能が向上した微生物を提供する。より具体的には本発明は、プリンヌクレオシド排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現増大に基づいてプリンヌクレオシド生産能が向上した微生物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、発酵によるプリンヌクレオシドの製造方法であって、培地中で上記微生物を培養すること、及び培地からプリンヌクレオシドを回収することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、培地中で本発明の細菌を培養すること、イノシン又はグアノシン等のプリンヌクレオシドをリン酸化すること、及び５’−プリンヌクレオチドを回収することを含む、５’−イノシン酸又は５’−グアニル酸等の５’−プリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の目的は、プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア細菌又はバチルス細菌であって、該細菌中で下記タンパク質の活性が高められた細菌を提供することである。Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を含み、前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有する、タンパク質。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡと、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１と相補的な塩基配列、又は配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとハイブリダイズすることができ、且つ前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とするタンパク質をコードするＤＮＡとから成る群から選択されるＤＮＡによってコードされる、上記の細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、前記ストリンジェントな条件が、６０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄工程を含む、上記の細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、前記タンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換すること、又は該ＤＮＡの発現を高めるように、前記細菌の染色体上の該ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより、該タンパク質の活性が高められた、上記の細菌を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、前記ＤＮＡが多コピーベクター上に位置する、上記の細菌を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンである、上記の細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、上記の細菌を培養する工程、及び該培地から該プリンヌクレオシドを回収する工程を含む、プリンヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、前記細菌が、プリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、上記の方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記プリンヌクレオシドがイノシン又はグアノシンである、上記の方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記の細菌を培養して、プリンヌクレオシドを産生する工程、該プリンヌクレオシドをリン酸化して、プリンヌクレオチドを生成する工程、及び該５’−プリンヌクレオチドを回収する工程を含む、５’−プリンヌクレオチドの製造方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、前記細菌がプリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、上記の方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンであり、前記５’−プリンヌクレオチドがイノシン酸及び／又はグアニル酸である、上記の方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＰｎｌｐＤ−ｙｅａＳ構築物の構造を示す図である。
【図２】ｐＬＦ−ＹｅａＳプラスミドの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を、以下で詳細に説明する。
【００２８】
１． 本発明の細菌
本発明の細菌は、プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属又はバチルス属に属する細菌であって、下記タンパク質の活性が高められた細菌である。該タンパク質は、配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２で示すアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、且つ、細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有するタンパク質であり得る。用語「エシェリヒア属又はバチルス属に属する細菌」又は「エシェリヒア細菌又はバチルス細菌」は、この細菌が、微生物学における当業者に既知の分類法に従ってエシェリヒア属又はバチルス属に分類されることを意味する。エシェリヒア属に属する微生物の例は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である。バチルス属に属する微生物の例としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、及びバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）が挙げられる。バチルス・サブチリスの例としては、バチルス・サブチリス１６８マールブルグ株（ＡＴＣＣ６０５１）及びバチルス・サブチリスＰＹ７９株（Plasmid, 1984, 12, 1-9）が挙げられる。バチルス・アミロリクエファシエンスの例としては、バチルス・アミロリクエファシエンスＴ株（ＡＴＣＣ２３８４２）及びバチルス・アミロリクエファシエンスＮ株（ＡＴＣＣ２３８４５）が挙げられる。バチルス・サブチリス１６８マールブルグ株（ＡＴＣＣ６０５１）、バチルス・アミロリクエファシエンスＴ株（ＡＴＣＣ２３８４２）及びバチルス・アミロリクエファシエンスＮ株（ＡＴＣＣ２３８４５）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110-2209, U.S.A.）から入手することができる。
【００２９】
「プリンヌクレオシド生産能」という用語は、培地中でイノシン、グアノシン、キサントシン又はアデノシンを産生し、蓄積する能力を意味する。「プリンヌクレオシド生産能を有する」という用語は、エシェリヒア属又はバチルス属に属する微生物が、培地中でエシェリヒア・コリの野生型株（エシェリヒア・コリＷ３１１０及びＭＧ１６５５等）又はバチルス・アミロリクエファシエンスの野生型株（バチルス・アミロリクエファシエンス
Ｋ等）より大量のイノシン、グアノシン、キサントシン又はアデノシンを産生し、蓄積することができることを意味する。このことは、微生物が、培地中で好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以上のプリンヌクレオシド（イノシン、グアノシン、キサントシン又はアデノシン等）を産生し、集積を引き起こすことができることを意味する。
【００３０】
「タンパク質の活性を高める」という用語は、細胞におけるタンパク質分子の数を増やすこと、又は１つのタンパク質分子当たりの活性を増大させることを意味する。「活性」という用語は、細菌が、活性が高まっていない株に比べて、その細菌で活性が高まると、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性になることを意味する。
【００３１】
本発明のタンパク質は、以下で規定されるものを含む：
（Ａ）配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、該タンパク質が、細菌を、８−アザアデニン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有するタンパク質。本発明のタンパク質は、ＹｅａＳタンパク質とも呼ばれ得る。ＹｅａＳタンパク質は、典型的に２１２個のアミノ酸から成り、６個の予測膜貫通セグメントを含有する疎水性が高いタンパク質であるが、このタンパク質の機能は知られていない（http://ecocyc.org、http://www.tcdb.org）。ＹｅａＳタンパク質は、ｙｅａＳ遺伝子でコードされる。ｙｅａＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３の配列における番号１８７８１４５〜１８７８７８３）は、ｙｅａＲ遺伝子とｙｅａＴ遺伝子との間のエシェリヒア・コリ染色体上に位置している。ｙｅａＳ（現在ｌｅｕＥと改称されている）遺伝子は、アミノ酸排出に関与するタンパク質をコードし得る（ロシア国特許第２１７５３５１号明細書、Aleshin et al., TIBS, 1999、Kutukova et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005）。
【００３２】
欠失、置換、挿入又は付加される「複数の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造における位置、又はアミノ酸の種類に応じて変わり得る。この数は、配列番号２で示すタンパク質においては、１〜２７、好ましくは１〜１５、及びより好ましくは１〜５であり得る。
【００３３】
「８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して高まった耐性」という用語は、野生株又は親株が増殖することができない濃度で８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する最小培地で細菌が増殖することができることを意味する。この用語は、細菌が、その野生型株又は親株よりも迅速に、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する培地で増殖することができることも意味し得る。プリン塩基類似体の濃度は概して、１０〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００３４】
本発明のタンパク質の活性を高める技術、特に細胞におけるタンパク質分子の数を増やす技術としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変すること、及び／又は遺伝子のコピー数を増やすことが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変することは、強力なプロモーターの制御下にＤＮＡを置くことによって達成することができる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰLプロモーター、ｐＬＦ２２プラスミド上のｒｅｐＡ遺伝子のプロモー
ターが、強力なプロモーターとして知られている。代替的に、例えばプロモーターに突然変異を導入し、これによりプロモーターを高めることができ、プロモーターの下流に位置する構造遺伝子の転写レベルを増大させることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ領域に突然変異を導入することによって、ｍＲＮＡからの翻訳効率を高めることができる。例えば、開始コドンの前にある３つのヌクレオチドの種類に応じて、２０倍に及ぶ発現レベルが見出された（Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981、Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984）。さらに、バチルスの細胞における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現は、バチルスに特異的なＲＢＳ（例えばバチルス・サブチリスｐｕｒＥ遺伝子のＲＢＳ）下にＤＮＡを置くことによって達成することができる（実施例４を参照されたい）。
【００３６】
さらに、遺伝子の転写レベルを増大させるために、エンハンサーを導入してもよい。遺伝子又はプロモーターのいずれかを含有するＤＮＡの染色体への導入は、例えば特開平１−２１５２８０号公報（１９８９）に記載されている。
【００３７】
代替的に、遺伝子のコピー数は、遺伝子を多コピーベクターに挿入した後、ベクターを微生物に導入することによって増やすことができる。使用することができるベクターとしては、ｐＭＷ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂ等のエシェリヒア・コリプラスミドベクター、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＧＫ１２、ｐＬＦ１４、又はｐＬＦ２２等のエシェリヒア・コリ−バチルス・サブチリスシャトルベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９等のファージベクター、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）等、及びトランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417（1983））（Ｍｕ、Ｔｎ１０又はＴｎ５等）が挙げられる。また、プラスミド又はトランスポゾン等を利用した相同組み換えによって、遺伝子を染色体に融合することによって、遺伝子のコピー数を増やすことが可能である。
【００３８】
強力なプロモーター又はエンハンサーを使用する技術は、遺伝子コピーの増加に基づく技術と組み合わせることができる。
【００３９】
染色体ＤＮＡを調製する方法、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、及びプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等は、当業者に周知の一般的な方法であり得る。これらの方法は、Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）等に記載されている。
【００４０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現が増大したエシェリヒア属に属する微生物を育種するのに必要な遺伝子領域は、エシェリヒア・コリの遺伝子に関する入手可能な情報に基づき、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。例えば、ｙｅａＳ遺伝子（トランスポータをコードすると考えられる）は、ＰＣＲを使用して、エシェリヒア・コリＫ１２ Ｗ３１１０又はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡからクローニングすることができる。染色体ＤＮＡは、任意の他のエシェリヒア・コリ株由来であっても、又はそれから得てもよい。
【００４１】
本発明のタンパク質は、依然としてＹｅａＳタンパク質の機能的特性を保有することができれば、即ち少なくとも８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対する耐性を与えることができれば、天然の多様性によって存在するＹｅａＳタンパク質の突然変異体及び変異体を含む。突然変異体及び変異体をコードするＤＮＡは、ｙｅｓＳ遺伝子（配列番号１）の相補的ＤＮＡ又は該遺伝子の一部と相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つプリンヌクレオ
シド産生を高めるタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって得ることができる。「ストリンジェントな条件」という用語は、いわゆる特異的なハイブリッドを形成し、非特異的なハイブリッドは形成されない条件を意味する。例えば、ストリンジェントな条件は、例えば７０％、８０％、９０％又は９５％以上の相同性を有するＤＮＡのような相同性が高いＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件を含む。代替的に、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件（例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）である条件によって例示される。変異体をコードし、且つｙｅａＳ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡのプローブとして、配列番号１の塩基配列の部分配列も使用することができる。このようなプローブは、プライマーとして配列番号１の塩基配列に基づき産生されたオリゴヌクレオチド、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡ断片を使用したＰＣＲによって調製することができる。長さが約３００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションにおける洗浄条件は例えば、５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳであり得る。
【００４２】
ＹｅａＳタンパク質の活性が維持されている限り、ＹｅａＳは、配列番号２のアミノ酸配列において、１つ又は複数の位置で、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてもよい。本明細書中では、用語「複数」は、タンパク質の三次元構造内のアミノ酸残基の種類及び位置によって変わるが、１〜２７、好ましくは１〜１５、及びより好ましくは１〜５を意味する。
【００４３】
配列番号２のアミノ酸配列における上記の突然変異は、タンパク質の活性を損なわない保存的突然変異であるのが好ましい。置換は、アミノ酸配列において少なくとも１つの残基が取り除かれ、その位置に１つ又は複数の残基が挿入される突然変異を意味する。保存的置換としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、ＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００４４】
本発明の細菌は、本来的にプリンヌクレシドの生産能を有する細菌において、本発明のタンパク質の活性を高めることによって得ることができる。代替的に、本発明の細菌は、既に該タンパク質の活性を高めた細菌にプリンヌクレオシド生産能を与えることによって得ることができる。
【００４５】
プリンヌクレオシドを産生し、且つ本発明のタンパク質の活性が高められる親株は、エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ株（ｐＭＷＫＱ（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット））であり得る。この株は、既知のＷ３１１０株の誘導体であり、これはＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦ遺伝子、プリンリプレッサをコードするｐｕｒＲ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするａｄｄ遺伝子、６−ホスホグルコネートデヒドラーゼをコードするｅｄｄ遺伝子（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）に突然変異が導入され、且つＧＭＰ
に対して非感受性であるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦＫＱ遺伝子を含むｐＭＷＫＱプラスミドを含む（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）。
【００４６】
本発明に使用され得るバチルス属に属する親株の例は、バチルス・サブチリス（B．subtilis）株ＫＭＢＳ１６−１である。この株は、イノシン産生株であるバチルス・サブチリスＫＭＢＳ１６（米国特許出願公開第２００４−０１６６５７５号）の変異体であり、ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ突然変異がｐｕｒＡ：：ｃａｔ突然変異に変わっている。また、バチルス・サブチリスＫＭＢＳ１６は、既知のバチルス・サブチリスｔｒｐＣ２の変異体であり、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）、プリンリプレッサをコードするｐｕｒＲ遺伝子（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）、及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）に突然変異が導入されている（ロシア国特許第２２３９６５６号）。本発明に使用され得るバチルス属に属する他の親株としては、バチルス属に属するイノシン産生細菌株、例えばバチルス・サブチリス株ＡＪ１２７０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５１）（特願昭６１１３８７６号公報）、バチルス・サブチリス株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ−Ｐ ２５５５）（特願昭６２０１４７９４号公報）、バチルス・プミルスＮＡ−１１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８９）、バチルス・サブチリスＮＡ−６０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）、「バチルス・サブチリス」Ｇ１１３６Ａ（米国特許第３，５７５，８０９号）（バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ＶＫＰＭ Ｂ−８９９４、国際公開第２００５０９５６２７号パンフレット）としてＶＫＰＭ（工業用微生物のロシアナショナルコレクション（the Russian National Collection of Industrial Microorganisms）, Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）に２００５年３月１０日に寄託された）、バチルス・サブチリスＮＡ−６０１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）（米国特許第４，７０１，４１３号）、バチルス・プミルスGottheil番号３２１８（ＡＴＣＣ番号２１００５）（米国特許第３，６１６，２０６号）、又はバチルス・アミロリクエファシエンス株ＡＳ１１５−７（ＶＫＰＭ Ｂ−６１３４）（ロシア国特許第２００３６７８号）等が挙げられる。
【００４７】
１つのタンパク質分子当たりの活性を増大させるために、本発明のタンパク質の構造遺伝子に突然変異を導入し、遺伝子によってコードされたタンパク質の特異的な活性を増大することも可能である。遺伝子に突然変異を導入するために、部位特異的突然変異誘発法（Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350（1987））、組み換えＰＣＲ（PCR Technology, Stockton Press（1989））、ＤＮＡの特定部分の化学合成、対象の遺伝子のヒドロキシルアミン処理、及びＵＶ照射又はニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の化学物質による対象の遺伝子を有する微生物株の処理等を使用することができる。タンパク質の活性が高められた微生物は、非変性株又は野生型株が増殖することができない量の８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する最小培地中で候補株を増殖することによって選択することができる。代替的に、該タンパク質の活性が高められた微生物は、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する培地中で、その微生物の非変異株又は野生型株よりも迅速に増殖する株を同定することによって選択することができる。
【００４８】
本発明の細菌は、プリン生合成に関与する１つ又は複数の遺伝子の発現を高めることによってさらに改良され得る。このような遺伝子としては、エシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロン（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）、又はバチルス・サブチリスのｐｕｒ−オペロン（Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria. Editor in Chief:
A.L. Sonenshein. ASM Press, Washington D.C., 1993）が挙げられる。ＧＭＰ及びＡＭＰによるフィードバック阻害を受けない、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードす
る突然変異ｐｕｒＦ遺伝子、及びプリンヌクレオチド生合成系においてリプレッサをコードするｐｕｒＲ遺伝子不活化する遺伝子を有するイノシン産生エシェリヒア・コリ株が記載されている（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）。
【００４９】
本発明のタンパク質の活性を高めることによって、細菌によるプリンヌクレオシド産生が高められる機構は、標的となるプリンヌクレオシドの排出増大の結果であり得る。
【００５０】
２． イノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、イノシン及び／又はグアノシン等のヌクレオシドを製造する方法を含み、該方法は培地中で本発明の細菌を培養し、培地中でヌクレオシドを産生させ、蓄積させ、そして、培地からヌクレオシドを回収する工程とを含む。
【００５１】
本発明において、培養、培地からのプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、プリンヌクレオシドを微生物を使用して産生する従来の発酵と同じように行うことができる。プリンヌクレオシド産生のための培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機成分を含有する通常の培地であり得る。炭素源として、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース及びデンプンの加水分解物等の単糖類；グリセロール、マンニトール及びソルビトール等のアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸及びコハク酸等の有機酸等を使用することができる。窒素源として、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩；ダイズ加水分解物等の有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。ビタミンＢ１等のビタミン類、必要とされる物質、例えばアデニン及びＲＮＡ等の核酸のような有機栄養素、又は酵母抽出物等は、適切な量又は微量な量でも存在し得ることが望ましい。これら以外に必要であれば、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を添加してもよい。
【００５２】
培養は、１６時間〜７２時間、好気条件下で行うのが好ましく、培養中の培養温度は、３０℃〜４５℃内に調整するのが好ましく、ｐＨは、５〜８内に調整するのが好ましい。無機又は有機の酸性物質又はアルカリ性物質やアンモニアガスを使用することによって、ｐＨを調整することができる。
【００５３】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、液体培地から細胞等の固体を取り除くことができ、それからイオン交換樹脂と析出の使用等の従来技術の任意の組合せによって、発酵液から標的となるプリンヌクレオシドを回収することができる。
【００５４】
３． ５’−イノシン酸及び／又は５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを製造する方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養して、プリンヌクレオシドを産生する工程と、プリンヌクレオシドをリン酸化して、５’−プリンヌクレオチドを生成する工程と、５’−プリンヌクレオチドを回収する工程とを含む、プリンヌクレオチドの製造方法を含む。
【００５５】
本明細書で使用される「５’−ヌクレオチド」という語句としては、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−キサンチル酸、及び５’−アデニル酸、好ましくは５’−イノシン酸及び／又は５’−グアニル酸が挙げられる。イノシン、キサントシン、グアノシン及びアデノシンをリン酸化して、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−キサンチル酸、及び５’−アデニル酸が生成される。
【００５６】
本発明において、培養、培地からのイノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、イノシン及び／又はグアノシンを微生物を使用して産生する従
来の発酵と同じように行うことができる。さらに本発明において、イノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドのリン酸化、及び５’−プリンヌクレオチドイノシン酸及び／又は５’−グアニル酸の回収は、５’−イノシン酸及び／又は５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドをイノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドから産生する従来の発酵法と同じように行うことができる。
【００５７】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、様々なホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、若しくはヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用して酵素的に行ってもよく、又はＰＯＣｌ3等のリン酸化剤を使用して化学的に行ってもよい。ピロホスフェートのＣ−５’位でのホスホリル基のヌクレオシドへの選択的移動を触媒することができるホスファターゼを使用してもよい（Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated
acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816）。また、リン酸供与体としてポリ−リン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）、又はカルバミルリン酸（塩）を利用する酸ホスファターゼ（国際公開第９６３７６０３号パンフレット）等を使用してもよい。また、基質として、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600）、無機ホスフェート（特開昭４２−１１８６号公報）、又はアセチルホスフェート（特開昭６１−４１５５５号公報）等を利用した、ヌクレオシドのＣ−２’位、Ｃ−３’位、又はＣ−５’位へのホスホリル基の移動を触媒することができるホスファターゼを使用してもよい。エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナーゼ（Mori et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926、国際公開第９１０８２８６号パンフレット）等を使用してもよい。Hammer-Jespersen, K.（Nucleoside catabolism, p. 203-258.
In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）によって記載されたヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用してもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3等のリン酸化剤を使用して行うことができる（Yoshikawa et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508）。
【００５８】
また本発明の方法において、細菌を改変し、プリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現を高めてもよい。
【実施例】
【００５９】
実施例１：強力な構成的ＰnlpDプロモーター下へのｙｅａＳ遺伝子のクローニング及びクローニング構築物の染色体への融合
エシェリヒア・コリＫ−１２株の全塩基配列が報告されている（Science, 277, 1453-1474, 1997）。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索によって、少なくとも４つのｒｈｔＢパラログ（paralogues）（ｙｅａＳ遺伝子を含む）がエシェリヒア・コリＫ−１２のゲノムに存在することが示されている。ｙｅａＳ遺伝子は、機能が未知の膜貫通タンパク質をコードする。
【００６０】
報告された塩基配列に基づき、配列番号３で表されるプライマー（プライマー１）及び配列番号４で表されるプライマー（プライマー２）を合成した。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを従来方法によって調製した。「Perkin ElmerのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００」を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った：Ｔａｑポリメラーゼ（Fermentas）によって、９５℃で４０秒、４７℃で４０秒、７２℃で４０秒を３０サイクル。ＰＣＲ断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＭＩＶ−ＰnlpDのＳａｌＩ及びＸｂａＩ部位へクローニングして、エシェリヒア・コリｎｌｐＤ遺伝子プロモーターの制御下に置いた。ｃａｔ遺伝子、プロモーター、及びｐＭ１のＭｕ−ファージ
付着部位間の推定外膜リポタンパク質をコードするｎｌｐＤ遺伝子のＲＢＳの連続クローニングによって、ｐＭＩＶ−ＰnlpDを得た（ロシア国特許第２２１２４４７号、Kutukova
et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005）。このｃａｔ−ＰnlpD−ｙｅａＳカセット（図１）のエシェリヒア・コリＴＧ１（Ｋ１２、ｄｅｌ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺｄｅｌＭ１５）の染色体への融合は、ロシア国特許第２２１２４４７号で記載されるにように、ヘルパープラスミドｐＭＨ１０を使用して、Ｍｕ融合系によって行った。エシェリヒア・コリＴＧ１株は、ＤＳＭＺ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstrase 7B, 38124, Braunschweig, Germany）から得ることができる。
【００６１】
このようにして、ＴＧ１：：ＰnlpD−ｙｅａＳ株を得た。
【００６２】
実施例２：エシェリヒア・コリＴＧ１株のプリン塩基類似体への耐性に対するｙｅａＳ遺伝子の過剰発現の効果
ＴＧ１：：ＰnlpD−ｙｅａＳ及び親株ＴＧ１に対するプリン塩基類似体の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、濃度勾配を有する阻害剤を含有するＭ９グルコース最小寒天プレートで測定した。最小培地で一晩培養した培養物由来の１０5個〜１０6個の細胞をプレートにスポットした。培養は、３７℃で４４時間のインキュベート後に評価した。結果を表１に示す。
【００６３】
表１から分かるように、ｙｅａＳ遺伝子の過剰発現によって、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン及び６−チオグアニンに対する細胞の耐性が増大した。ｙｅａＳ（ｌｅｕＥ）遺伝子は、アミノ酸の排出に関与する膜タンパク質をコードすることが知られている（ロシア国特許第２１７５３５１号、Aleshin et al., TIBS, 1999、Kutukova et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005）。したがって、ＹｅａＳタンパク質は、広い特異性を有し、且つプリン誘導体の排出にも関与する。
【００６４】
【表１】
【００６５】
実施例３：エシェリヒア・コリ イノシン産生株によるイノシン産生に対するｙｅａＳ遺伝子の過剰発現の効果
イノシン産生株エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）を、ＴＧ１：：ＰnlpD−ｙｅａＳ株で増殖したＰ１ファージによって形質導入した。１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上で形質導入株を選択した。このようにして、エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ：：＿ＰnlpD−ｙｅａＳ（ｐＭＷＫＱ）株を得た。この株及び親株エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）をそれぞれ、７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＬ−ブロス中で３７℃で１８時間培養し、２０×２００ｍｍ容の試験管中の７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地３ｍｌに培養物０．３ｍｌを接種し、回転振盪器で３７℃で７２時間培養した。
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母抽出物 ８．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【００６６】
グルコース及び硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾燥加熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。滅菌後、抗生物質を培地に導入する。
【００６７】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量をＨＰＬＣで測定した。培地のサンプル（５００μｌ）を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで４倍希釈し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析の条件：カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５ｕ（Phenomenex, USA）。バッファー：２％（ｖ／ｖ）Ｃ2Ｈ5ＯＨ；０．８％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン；０．５％（ｖ／ｖ）（氷）酢酸；ｐＨ４．５。温度：３０℃。流速：０．３ｍｌ／分。注入量：５μｌ。検出：ＵＶ２５０ｎｍ。
保持時間（分）：
キサントシン １３．７
イノシン ９．６
グアノシン １１．４
アデノシン ２８．２
【００６８】
結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
表２から分かるように、ｙｅａＳ遺伝子の過剰発現によって、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）株のイノシン生産性が向上した。
【００７１】
実施例４：単一レプリコンシャトルベクターｐＬＦ２２へのｙｅａＳ遺伝子のクローニング
バチルス株でｙｅａＳ遺伝子を発現するために、プラスミド上に存在するｒｅｐＡＢ遺伝子プロモーター及びバチルス・サブチリスリボソーム結合部位のｐｕｒＥ遺伝子の制御下で、ｙｅａＳ遺伝子を単一レプリコンシャトルベクターｐＬＦ２２にクローニングした（Tarakanov et al., Expression vector pLF22 for the lactic acid bacteria. Mikrobiologiia（Rus）. 73（2）, 211-217, （2004））。このために、プライマー３（配列番号５）及びプライマー４（配列番号６）は、鋳型としてＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲに使用した。プライマー３は、バチルス・サブチリスｐｕｒＥ遺伝子のリボソーム結合部位を含有する。得られた断片をＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｒｅｐＡＢ遺伝子プロモーターの制御下で、プラスミドｐＬＦ２２のＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。このようにして、ｐＬＦ−ＹｅａＳプラスミドを得た。
【００７２】
実施例５：バチルス・アミロリクエファシエンスのイノシン−グアノシン産生株によるイノシン及びグアノシン産生に対するｙｅａＳ遺伝子の過剰発現の効果
形質転換によって、ｐＬＦ２２プラスミド及びｐＬＦ−ＹｅａＳプラスミドをバチルス・サブチリス１６８株に導入し、形質転換株をそれぞれ、バチルス・サブチリス（ｐＬＦ２２）及びバチルス・サブチリス（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）と称した。それから、これらの株で増殖したＥ４０ファージを使用して、バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ＡＴＣＣ番号１９２２２、ＶＫＰＭ Ｂ−８９９４）株に形質導入した（米国特許第３，５７５，８０９号明細書）。形質導入株を、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢで選択した。このようにして、バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ２２）株及びバチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）株を得た。
【００７３】
バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）株及びバチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ２２）対照株をそれぞれ、Ｌ−ブロス中で３４℃で１８時間培養した。それから、２０×２００ｍｍ容の試験管中の発酵培地３ｍｌに培養物０．３ｍＬを接種し、回転振盪器で３４℃で７２時間培養した。
【００７４】
発酵培地の組成は以下の通りである：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
ＮＨ4Ｃｌ １５．０
アデニン ０．３
（豆濃（Mameno）形態の*）全窒素 ０．８
ＣａＣＯ3 ２５．０
*：ダイズ加水分解物
【００７５】
グルコース及び硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾燥加熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。
【００７６】
培養後、上記のように、培地中に集積したイノシン及びグアノシンの量をＨＰＬＣで測定した。結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
表３から、ｙｅａＳ遺伝子の過剰発現は、バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）株のイノシン及びグアノシンの生産性を向上させたということになる。
【００７９】
本発明は、その好ましい実施形態で詳細に説明されているが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行い、同等物を利用することができることは当業者にとって明らかである。上述の文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌によるプリンヌクレオシドの産生を高めることができる。産生されたプリンヌクレオシドは、例えば５’−プリンヌクレオチドの産生に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−イノシン酸又は５’−グアニル酸等の５’−プリンヌクレオチドの合成における原料物質として重要なプリンヌクレオシドを製造する方法と、その製造に使用する新規の微生物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、イノシン、グアノシン及びキサントシン等のプリンヌクレオシドは、アデニン栄養要求性株を用いた発酵によって工業的に生産される。あるいは、このような株はさらに、プリン類似体及びスルファグアニジン等の様々な薬剤に対する薬剤耐性を与えられ得る。これらの株としては、バチルス属（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８）、又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）（コリネバクテリウム（Corynebacterium））属（特許文献９、特許文献１０、及び非特許文献１）、又はエシェリヒア属（特許文献１１）等に属するものが挙げられる。
【０００３】
このような突然変異株を得るのに典型的な方法は、ＵＶ照射によって又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で処理することによって微生物の突然変異を誘発させること、及び好適な培地を用いて突然変異株を選択することを含む。また他方で、遺伝子工学技術を使用したこのような突然変異株の育種は、バチルス属（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、及び特許文献２１）、ブレビバクテリウム（コリネバクテリウム）属（特許文献２２）、又はエシェリヒア属（特許文献１１）に属する株で実施されている。
【０００４】
プリンヌクレオシド産生株の生産性は、プリンヌクレオシド排出活性を増大させることでさらに向上させることができる。細胞膜を通る代謝物の浸透は通常、特異的な排出輸送タンパク質によって媒介されることが一般的に考えられている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。本発明者らは以前に、ｒｈｔＡ（ｙｂｉＦ）遺伝子によってコードされたＲｈｔＡタンパク質の活性が高い、エシェリヒア属又はバチルス属に属するイノシン産生株又はキサントシン産生株が、親株より多くのイノシン又はキサントシンを産生することを示した（特許文献２３）。さらに、ｙｉｊＥ遺伝子、ｙｄｅＤ遺伝子又はｙｉｃＭ遺伝子によってコードされたＹｉｊＥタンパク質、ＹｄｅＤタンパク質、又はＹｉｃＭタンパク質の活性が高い、エシェリヒア属に属するイノシン産生株が、親株よりも多くのイノシンを産生した（それぞれ、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６）。
【０００５】
本発明者らは以前に、エシェリヒア・コリ（E. coli）のｙｅａＳ（ｌｅｕＥ）遺伝子が、ＲｈｔＢファミリーに属し、且つアミノ酸の排出に関与する膜タンパク質をコードすることを見出した（非特許文献５）。具体的に、この遺伝子は、ロイシン、ヒスチジン及びメチオニンのエクスポータをコードする（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭３８−２３０３９号公報（１９６３）
【特許文献２】特公昭５４−１７０３３号公報（１９７９）
【特許文献３】特公昭５５−２９５６号公報（１９８０）
【特許文献４】特公昭５５−４５１９９号公報（１９８０）
【特許文献５】特開昭５６−１６２９９８号公報（１９８１）
【特許文献６】特公昭５７−１４１６０号公報（１９８２）
【特許文献７】特公昭５７−４１９１５号公報（１９８２）
【特許文献８】特開昭５９−４２８９５号公報（１９８４）
【特許文献９】特公昭５１−５０７５号公報（１９７６）
【特許文献１０】特公昭５８−１７５９２号公報（１９７２）
【特許文献１１】国際公開第９９／０３９８８号パンフレット
【特許文献１２】特開昭５８−１５８１９７号公報（１９８３）
【特許文献１３】特開昭５８−１７５４９３号公報（１９８３）
【特許文献１４】特開昭５９−２８４７０号公報（１９８４）
【特許文献１５】特開昭６０−１５６３８８号公報（１９８５）
【特許文献１６】特開平１−２７４７７号公報（１９８９）
【特許文献１７】特開平１−１７４３８５号公報（１９８９）
【特許文献１８】特開平３−５８７８７号公報（１９９１）
【特許文献１９】特開平３−１６４１８５号公報（１９９１）
【特許文献２０】特開平５−８４０６７号公報（１９９３）
【特許文献２１】特開平５−１９２１６４号公報（１９９３）
【特許文献２２】特開昭６３−２４８３９４（１９８８）
【特許文献２３】ロシア国特許第２２３９６５６号
【特許文献２４】ロシア国特許第２２４４００３号
【特許文献２５】ロシア国特許第２２４４００４号
【特許文献２６】ロシア国特許第２２７１３９１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 42, 399（1978）
【非特許文献２】Pao et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34,（1998）
【非特許文献３】Paulsen et al., J. Mol. Biol., 277, 573-592（1998）
【非特許文献４】Saier et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279（1999）
【非特許文献５】Aleshin et al., TIBS, 1999
【非特許文献６】Kutukova et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、プリンヌクレオシド産生株によるプリンヌクレオシドの生産性を高めること、及びこれらの株を使用したプリンヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、ｙｅａＳ遺伝子を同定することによって達成された。この遺伝子は、多コピーベクター上の野生型対立遺伝子として株に導入されると、プリン塩基類似体、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン及び６−チオグアニンに対する耐性を与える推定アミノ酸エクスポーターをコードする。さらに、ｙｅａＳ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で、エシェリヒア属又はバチルス属に属する各プリンヌクレオシド産生株の細胞に導入されると、プリンヌクレオシド産生を高めることができる。このようにして、本発明が完成した。
【００１０】
したがって本発明は、プリンヌクレオシド生産能を有する、エシェリヒア属又はバチルス属に属する微生物を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明は、微生物外へのプリンヌクレオシドの輸送に関与すると予想され
るタンパク質の活性増大に基づいてプリンヌクレオシド生産能が向上した微生物を提供する。より具体的には本発明は、プリンヌクレオシド排出に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現増大に基づいてプリンヌクレオシド生産能が向上した微生物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、発酵によるプリンヌクレオシドの製造方法であって、培地中で上記微生物を培養すること、及び培地からプリンヌクレオシドを回収することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、培地中で本発明の細菌を培養すること、イノシン又はグアノシン等のプリンヌクレオシドをリン酸化すること、及び５’−プリンヌクレオチドを回収することを含む、５’−イノシン酸又は５’−グアニル酸等の５’−プリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の目的は、プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア細菌又はバチルス細菌であって、該細菌中で下記タンパク質の活性が高められた細菌を提供することである。Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を含み、前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有する、タンパク質。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡと、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１と相補的な塩基配列、又は配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとハイブリダイズすることができ、且つ前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とするタンパク質をコードするＤＮＡとから成る群から選択されるＤＮＡによってコードされる、上記の細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、前記ストリンジェントな条件が、６０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄工程を含む、上記の細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、前記タンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換すること、又は該ＤＮＡの発現を高めるように、前記細菌の染色体上の該ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより、該タンパク質の活性が高められた、上記の細菌を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、前記ＤＮＡが多コピーベクター上に位置する、上記の細菌を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンである、上記の細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、上記の細菌を培養する工程、及び該培地から該プリンヌクレオシドを回収する工程を含む、プリンヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、前記細菌が、プリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、上記の方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、前記プリンヌクレオシドがイノシン又はグアノシンである、上記の方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記の細菌を培養して、プリンヌクレオシドを産生する工程、該プリンヌクレオシドをリン酸化して、プリンヌクレオチドを生成する工程、及び該５’−プリンヌクレオチドを回収する工程を含む、５’−プリンヌクレオチドの製造方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、前記細菌がプリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、上記の方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンであり、前記５’−プリンヌクレオチドがイノシン酸及び／又はグアニル酸である、上記の方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＰｎｌｐＤ−ｙｅａＳ構築物の構造を示す図である。
【図２】ｐＬＦ−ＹｅａＳプラスミドの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を、以下で詳細に説明する。
【００２８】
１． 本発明の細菌
本発明の細菌は、プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属又はバチルス属に属する細菌であって、下記タンパク質の活性が高められた細菌である。該タンパク質は、配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２で示すアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、且つ、細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有するタンパク質であり得る。用語「エシェリヒア属又はバチルス属に属する細菌」又は「エシェリヒア細菌又はバチルス細菌」は、この細菌が、微生物学における当業者に既知の分類法に従ってエシェリヒア属又はバチルス属に分類されることを意味する。エシェリヒア属に属する微生物の例は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である。バチルス属に属する微生物の例としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、及びバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）が挙げられる。バチルス・サブチリスの例としては、バチルス・サブチリス１６８マールブルグ株（ＡＴＣＣ６０５１）及びバチルス・サブチリスＰＹ７９株（Plasmid, 1984, 12, 1-9）が挙げられる。バチルス・アミロリクエファシエンスの例としては、バチルス・アミロリクエファシエンスＴ株（ＡＴＣＣ２３８４２）及びバチルス・アミロリクエファシエンスＮ株（ＡＴＣＣ２３８４５）が挙げられる。バチルス・サブチリス１６８マールブルグ株（ＡＴＣＣ６０５１）、バチルス・アミロリクエファシエンスＴ株（ＡＴＣＣ２３８４２）及びバチルス・アミロリクエファシエンスＮ株（ＡＴＣＣ２３８４５）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110-2209, U.S.A.）から入手することができる。
【００２９】
「プリンヌクレオシド生産能」という用語は、培地中でイノシン、グアノシン、キサントシン又はアデノシンを産生し、蓄積する能力を意味する。「プリンヌクレオシド生産能を有する」という用語は、エシェリヒア属又はバチルス属に属する微生物が、培地中でエシェリヒア・コリの野生型株（エシェリヒア・コリＷ３１１０及びＭＧ１６５５等）又はバチルス・アミロリクエファシエンスの野生型株（バチルス・アミロリクエファシエンス
Ｋ等）より大量のイノシン、グアノシン、キサントシン又はアデノシンを産生し、蓄積することができることを意味する。このことは、微生物が、培地中で好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以上のプリンヌクレオシド（イノシン、グアノシン、キサントシン又はアデノシン等）を産生し、集積を引き起こすことができることを意味する。
【００３０】
「タンパク質の活性を高める」という用語は、細胞におけるタンパク質分子の数を増やすこと、又は１つのタンパク質分子当たりの活性を増大させることを意味する。「活性」という用語は、細菌が、活性が高まっていない株に比べて、その細菌で活性が高まると、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性になることを意味する。
【００３１】
本発明のタンパク質は、以下で規定されるものを含む：
（Ａ）配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２で示すアミノ酸配列を有するタンパク質において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、該タンパク質が、細菌を、８−アザアデニン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有するタンパク質。本発明のタンパク質は、ＹｅａＳタンパク質とも呼ばれ得る。ＹｅａＳタンパク質は、典型的に２１２個のアミノ酸から成り、６個の予測膜貫通セグメントを含有する疎水性が高いタンパク質であるが、このタンパク質の機能は知られていない（http://ecocyc.org、http://www.tcdb.org）。ＹｅａＳタンパク質は、ｙｅａＳ遺伝子でコードされる。ｙｅａＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３の配列における番号１８７８１４５〜１８７８７８３）は、ｙｅａＲ遺伝子とｙｅａＴ遺伝子との間のエシェリヒア・コリ染色体上に位置している。ｙｅａＳ（現在ｌｅｕＥと改称されている）遺伝子は、アミノ酸排出に関与するタンパク質をコードし得る（ロシア国特許第２１７５３５１号明細書、Aleshin et al., TIBS, 1999、Kutukova et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005）。
【００３２】
欠失、置換、挿入又は付加される「複数の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造における位置、又はアミノ酸の種類に応じて変わり得る。この数は、配列番号２で示すタンパク質においては、１〜２７、好ましくは１〜１５、及びより好ましくは１〜５であり得る。
【００３３】
「８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して高まった耐性」という用語は、野生株又は親株が増殖することができない濃度で８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する最小培地で細菌が増殖することができることを意味する。この用語は、細菌が、その野生型株又は親株よりも迅速に、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する培地で増殖することができることも意味し得る。プリン塩基類似体の濃度は概して、１０〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００３４】
本発明のタンパク質の活性を高める技術、特に細胞におけるタンパク質分子の数を増やす技術としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変すること、及び／又は遺伝子のコピー数を増やすことが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変することは、強力なプロモーターの制御下にＤＮＡを置くことによって達成することができる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰLプロモーター、ｐＬＦ２２プラスミド上のｒｅｐＡ遺伝子のプロモー
ターが、強力なプロモーターとして知られている。代替的に、例えばプロモーターに突然変異を導入し、これによりプロモーターを高めることができ、プロモーターの下流に位置する構造遺伝子の転写レベルを増大させることができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ領域に突然変異を導入することによって、ｍＲＮＡからの翻訳効率を高めることができる。例えば、開始コドンの前にある３つのヌクレオチドの種類に応じて、２０倍に及ぶ発現レベルが見出された（Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981、Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984）。さらに、バチルスの細胞における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現は、バチルスに特異的なＲＢＳ（例えばバチルス・サブチリスｐｕｒＥ遺伝子のＲＢＳ）下にＤＮＡを置くことによって達成することができる（実施例４を参照されたい）。
【００３６】
さらに、遺伝子の転写レベルを増大させるために、エンハンサーを導入してもよい。遺伝子又はプロモーターのいずれかを含有するＤＮＡの染色体への導入は、例えば特開平１−２１５２８０号公報（１９８９）に記載されている。
【００３７】
代替的に、遺伝子のコピー数は、遺伝子を多コピーベクターに挿入した後、ベクターを微生物に導入することによって増やすことができる。使用することができるベクターとしては、ｐＭＷ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂ等のエシェリヒア・コリプラスミドベクター、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＧＫ１２、ｐＬＦ１４、又はｐＬＦ２２等のエシェリヒア・コリ−バチルス・サブチリスシャトルベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９等のファージベクター、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）等、及びトランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417（1983））（Ｍｕ、Ｔｎ１０又はＴｎ５等）が挙げられる。また、プラスミド又はトランスポゾン等を利用した相同組み換えによって、遺伝子を染色体に融合することによって、遺伝子のコピー数を増やすことが可能である。
【００３８】
強力なプロモーター又はエンハンサーを使用する技術は、遺伝子コピーの増加に基づく技術と組み合わせることができる。
【００３９】
染色体ＤＮＡを調製する方法、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及びライゲーション、形質転換、及びプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等は、当業者に周知の一般的な方法であり得る。これらの方法は、Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）等に記載されている。
【００４０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現が増大したエシェリヒア属に属する微生物を育種するのに必要な遺伝子領域は、エシェリヒア・コリの遺伝子に関する入手可能な情報に基づき、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。例えば、ｙｅａＳ遺伝子（トランスポータをコードすると考えられる）は、ＰＣＲを使用して、エシェリヒア・コリＫ１２ Ｗ３１１０又はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡからクローニングすることができる。染色体ＤＮＡは、任意の他のエシェリヒア・コリ株由来であっても、又はそれから得てもよい。
【００４１】
本発明のタンパク質は、依然としてＹｅａＳタンパク質の機能的特性を保有することができれば、即ち少なくとも８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対する耐性を与えることができれば、天然の多様性によって存在するＹｅａＳタンパク質の突然変異体及び変異体を含む。突然変異体及び変異体をコードするＤＮＡは、ｙｅｓＳ遺伝子（配列番号１）の相補的ＤＮＡ又は該遺伝子の一部と相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つプリンヌクレオ
シド産生を高めるタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって得ることができる。「ストリンジェントな条件」という用語は、いわゆる特異的なハイブリッドを形成し、非特異的なハイブリッドは形成されない条件を意味する。例えば、ストリンジェントな条件は、例えば７０％、８０％、９０％又は９５％以上の相同性を有するＤＮＡのような相同性が高いＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件を含む。代替的に、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件（例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）である条件によって例示される。変異体をコードし、且つｙｅａＳ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡのプローブとして、配列番号１の塩基配列の部分配列も使用することができる。このようなプローブは、プライマーとして配列番号１の塩基配列に基づき産生されたオリゴヌクレオチド、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡ断片を使用したＰＣＲによって調製することができる。長さが約３００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションにおける洗浄条件は例えば、５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳであり得る。
【００４２】
ＹｅａＳタンパク質の活性が維持されている限り、ＹｅａＳは、配列番号２のアミノ酸配列において、１つ又は複数の位置で、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてもよい。本明細書中では、用語「複数」は、タンパク質の三次元構造内のアミノ酸残基の種類及び位置によって変わるが、１〜２７、好ましくは１〜１５、及びより好ましくは１〜５を意味する。
【００４３】
配列番号２のアミノ酸配列における上記の突然変異は、タンパク質の活性を損なわない保存的突然変異であるのが好ましい。置換は、アミノ酸配列において少なくとも１つの残基が取り除かれ、その位置に１つ又は複数の残基が挿入される突然変異を意味する。保存的置換としては、ＡｌａのＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇのＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎのＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕのＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙのＰｒｏへの置換、ＨｉｓのＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅのＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕのＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓのＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔのＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅのＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒのＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒのＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐのＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒのＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、ＶａｌのＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００４４】
本発明の細菌は、本来的にプリンヌクレシドの生産能を有する細菌において、本発明のタンパク質の活性を高めることによって得ることができる。代替的に、本発明の細菌は、既に該タンパク質の活性を高めた細菌にプリンヌクレオシド生産能を与えることによって得ることができる。
【００４５】
プリンヌクレオシドを産生し、且つ本発明のタンパク質の活性が高められる親株は、エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ株（ｐＭＷＫＱ（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット））であり得る。この株は、既知のＷ３１１０株の誘導体であり、これはＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦ遺伝子、プリンリプレッサをコードするｐｕｒＲ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするａｄｄ遺伝子、６−ホスホグルコネートデヒドラーゼをコードするｅｄｄ遺伝子（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）に突然変異が導入され、且つＧＭＰ
に対して非感受性であるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦＫＱ遺伝子を含むｐＭＷＫＱプラスミドを含む（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）。
【００４６】
本発明に使用され得るバチルス属に属する親株の例は、バチルス・サブチリス（B．subtilis）株ＫＭＢＳ１６−１である。この株は、イノシン産生株であるバチルス・サブチリスＫＭＢＳ１６（米国特許出願公開第２００４−０１６６５７５号）の変異体であり、ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ突然変異がｐｕｒＡ：：ｃａｔ突然変異に変わっている。また、バチルス・サブチリスＫＭＢＳ１６は、既知のバチルス・サブチリスｔｒｐＣ２の変異体であり、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）、プリンリプレッサをコードするｐｕｒＲ遺伝子（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）、及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）に突然変異が導入されている（ロシア国特許第２２３９６５６号）。本発明に使用され得るバチルス属に属する他の親株としては、バチルス属に属するイノシン産生細菌株、例えばバチルス・サブチリス株ＡＪ１２７０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５１）（特願昭６１１３８７６号公報）、バチルス・サブチリス株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ−Ｐ ２５５５）（特願昭６２０１４７９４号公報）、バチルス・プミルスＮＡ−１１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８９）、バチルス・サブチリスＮＡ−６０１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）、「バチルス・サブチリス」Ｇ１１３６Ａ（米国特許第３，５７５，８０９号）（バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ＶＫＰＭ Ｂ−８９９４、国際公開第２００５０９５６２７号パンフレット）としてＶＫＰＭ（工業用微生物のロシアナショナルコレクション（the Russian National Collection of Industrial Microorganisms）, Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）に２００５年３月１０日に寄託された）、バチルス・サブチリスＮＡ−６０１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）（米国特許第４，７０１，４１３号）、バチルス・プミルスGottheil番号３２１８（ＡＴＣＣ番号２１００５）（米国特許第３，６１６，２０６号）、又はバチルス・アミロリクエファシエンス株ＡＳ１１５−７（ＶＫＰＭ Ｂ−６１３４）（ロシア国特許第２００３６７８号）等が挙げられる。
【００４７】
１つのタンパク質分子当たりの活性を増大させるために、本発明のタンパク質の構造遺伝子に突然変異を導入し、遺伝子によってコードされたタンパク質の特異的な活性を増大することも可能である。遺伝子に突然変異を導入するために、部位特異的突然変異誘発法（Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350（1987））、組み換えＰＣＲ（PCR Technology, Stockton Press（1989））、ＤＮＡの特定部分の化学合成、対象の遺伝子のヒドロキシルアミン処理、及びＵＶ照射又はニトロソグアニジン若しくは亜硝酸等の化学物質による対象の遺伝子を有する微生物株の処理等を使用することができる。タンパク質の活性が高められた微生物は、非変性株又は野生型株が増殖することができない量の８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する最小培地中で候補株を増殖することによって選択することができる。代替的に、該タンパク質の活性が高められた微生物は、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンを含有する培地中で、その微生物の非変異株又は野生型株よりも迅速に増殖する株を同定することによって選択することができる。
【００４８】
本発明の細菌は、プリン生合成に関与する１つ又は複数の遺伝子の発現を高めることによってさらに改良され得る。このような遺伝子としては、エシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロン（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）、又はバチルス・サブチリスのｐｕｒ−オペロン（Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria. Editor in Chief:
A.L. Sonenshein. ASM Press, Washington D.C., 1993）が挙げられる。ＧＭＰ及びＡＭＰによるフィードバック阻害を受けない、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードす
る突然変異ｐｕｒＦ遺伝子、及びプリンヌクレオチド生合成系においてリプレッサをコードするｐｕｒＲ遺伝子不活化する遺伝子を有するイノシン産生エシェリヒア・コリ株が記載されている（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）。
【００４９】
本発明のタンパク質の活性を高めることによって、細菌によるプリンヌクレオシド産生が高められる機構は、標的となるプリンヌクレオシドの排出増大の結果であり得る。
【００５０】
２． イノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、イノシン及び／又はグアノシン等のヌクレオシドを製造する方法を含み、該方法は培地中で本発明の細菌を培養し、培地中でヌクレオシドを産生させ、蓄積させ、そして、培地からヌクレオシドを回収する工程とを含む。
【００５１】
本発明において、培養、培地からのプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、プリンヌクレオシドを微生物を使用して産生する従来の発酵と同じように行うことができる。プリンヌクレオシド産生のための培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機成分を含有する通常の培地であり得る。炭素源として、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース及びデンプンの加水分解物等の単糖類；グリセロール、マンニトール及びソルビトール等のアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸及びコハク酸等の有機酸等を使用することができる。窒素源として、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩；ダイズ加水分解物等の有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。ビタミンＢ１等のビタミン類、必要とされる物質、例えばアデニン及びＲＮＡ等の核酸のような有機栄養素、又は酵母抽出物等は、適切な量又は微量な量でも存在し得ることが望ましい。これら以外に必要であれば、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を添加してもよい。
【００５２】
培養は、１６時間〜７２時間、好気条件下で行うのが好ましく、培養中の培養温度は、３０℃〜４５℃内に調整するのが好ましく、ｐＨは、５〜８内に調整するのが好ましい。無機又は有機の酸性物質又はアルカリ性物質やアンモニアガスを使用することによって、ｐＨを調整することができる。
【００５３】
培養後、遠心分離又は膜濾過によって、液体培地から細胞等の固体を取り除くことができ、それからイオン交換樹脂と析出の使用等の従来技術の任意の組合せによって、発酵液から標的となるプリンヌクレオシドを回収することができる。
【００５４】
３． ５’−イノシン酸及び／又は５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを製造する方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養して、プリンヌクレオシドを産生する工程と、プリンヌクレオシドをリン酸化して、５’−プリンヌクレオチドを生成する工程と、５’−プリンヌクレオチドを回収する工程とを含む、プリンヌクレオチドの製造方法を含む。
【００５５】
本明細書で使用される「５’−ヌクレオチド」という語句としては、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−キサンチル酸、及び５’−アデニル酸、好ましくは５’−イノシン酸及び／又は５’−グアニル酸が挙げられる。イノシン、キサントシン、グアノシン及びアデノシンをリン酸化して、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−キサンチル酸、及び５’−アデニル酸が生成される。
【００５６】
本発明において、培養、培地からのイノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、イノシン及び／又はグアノシンを微生物を使用して産生する従
来の発酵と同じように行うことができる。さらに本発明において、イノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドのリン酸化、及び５’−プリンヌクレオチドイノシン酸及び／又は５’−グアニル酸の回収は、５’−イノシン酸及び／又は５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドをイノシン及び／又はグアノシン等のプリンヌクレオシドから産生する従来の発酵法と同じように行うことができる。
【００５７】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、様々なホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、若しくはヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用して酵素的に行ってもよく、又はＰＯＣｌ3等のリン酸化剤を使用して化学的に行ってもよい。ピロホスフェートのＣ−５’位でのホスホリル基のヌクレオシドへの選択的移動を触媒することができるホスファターゼを使用してもよい（Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated
acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816）。また、リン酸供与体としてポリ−リン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）、又はカルバミルリン酸（塩）を利用する酸ホスファターゼ（国際公開第９６３７６０３号パンフレット）等を使用してもよい。また、基質として、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600）、無機ホスフェート（特開昭４２−１１８６号公報）、又はアセチルホスフェート（特開昭６１−４１５５５号公報）等を利用した、ヌクレオシドのＣ−２’位、Ｃ−３’位、又はＣ−５’位へのホスホリル基の移動を触媒することができるホスファターゼを使用してもよい。エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナーゼ（Mori et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926、国際公開第９１０８２８６号パンフレット）等を使用してもよい。Hammer-Jespersen, K.（Nucleoside catabolism, p. 203-258.
In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）によって記載されたヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用してもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3等のリン酸化剤を使用して行うことができる（Yoshikawa et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508）。
【００５８】
また本発明の方法において、細菌を改変し、プリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現を高めてもよい。
【実施例】
【００５９】
実施例１：強力な構成的ＰnlpDプロモーター下へのｙｅａＳ遺伝子のクローニング及びクローニング構築物の染色体への融合
エシェリヒア・コリＫ−１２株の全塩基配列が報告されている（Science, 277, 1453-1474, 1997）。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索によって、少なくとも４つのｒｈｔＢパラログ（paralogues）（ｙｅａＳ遺伝子を含む）がエシェリヒア・コリＫ−１２のゲノムに存在することが示されている。ｙｅａＳ遺伝子は、機能が未知の膜貫通タンパク質をコードする。
【００６０】
報告された塩基配列に基づき、配列番号３で表されるプライマー（プライマー１）及び配列番号４で表されるプライマー（プライマー２）を合成した。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを従来方法によって調製した。「Perkin ElmerのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００」を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った：Ｔａｑポリメラーゼ（Fermentas）によって、９５℃で４０秒、４７℃で４０秒、７２℃で４０秒を３０サイクル。ＰＣＲ断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＭＩＶ−ＰnlpDのＳａｌＩ及びＸｂａＩ部位へクローニングして、エシェリヒア・コリｎｌｐＤ遺伝子プロモーターの制御下に置いた。ｃａｔ遺伝子、プロモーター、及びｐＭ１のＭｕ−ファージ
付着部位間の推定外膜リポタンパク質をコードするｎｌｐＤ遺伝子のＲＢＳの連続クローニングによって、ｐＭＩＶ−ＰnlpDを得た（ロシア国特許第２２１２４４７号、Kutukova
et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005）。このｃａｔ−ＰnlpD−ｙｅａＳカセット（図１）のエシェリヒア・コリＴＧ１（Ｋ１２、ｄｅｌ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺｄｅｌＭ１５）の染色体への融合は、ロシア国特許第２２１２４４７号で記載されるにように、ヘルパープラスミドｐＭＨ１０を使用して、Ｍｕ融合系によって行った。エシェリヒア・コリＴＧ１株は、ＤＳＭＺ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstrase 7B, 38124, Braunschweig, Germany）から得ることができる。
【００６１】
このようにして、ＴＧ１：：ＰnlpD−ｙｅａＳ株を得た。
【００６２】
実施例２：エシェリヒア・コリＴＧ１株のプリン塩基類似体への耐性に対するｙｅａＳ遺伝子の過剰発現の効果
ＴＧ１：：ＰnlpD−ｙｅａＳ及び親株ＴＧ１に対するプリン塩基類似体の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、濃度勾配を有する阻害剤を含有するＭ９グルコース最小寒天プレートで測定した。最小培地で一晩培養した培養物由来の１０5個〜１０6個の細胞をプレートにスポットした。培養は、３７℃で４４時間のインキュベート後に評価した。結果を表１に示す。
【００６３】
表１から分かるように、ｙｅａＳ遺伝子の過剰発現によって、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン及び６−チオグアニンに対する細胞の耐性が増大した。ｙｅａＳ（ｌｅｕＥ）遺伝子は、アミノ酸の排出に関与する膜タンパク質をコードすることが知られている（ロシア国特許第２１７５３５１号、Aleshin et al., TIBS, 1999、Kutukova et al., FEBS Letters, 579, 4629-4534, 2005）。したがって、ＹｅａＳタンパク質は、広い特異性を有し、且つプリン誘導体の排出にも関与する。
【００６４】
【表１】
【００６５】
実施例３：エシェリヒア・コリ イノシン産生株によるイノシン産生に対するｙｅａＳ遺伝子の過剰発現の効果
イノシン産生株エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）（国際公開第９９／０３９８８号パンフレット）を、ＴＧ１：：ＰnlpD−ｙｅａＳ株で増殖したＰ１ファージによって形質導入した。１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上で形質導入株を選択した。このようにして、エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ：：＿ＰnlpD−ｙｅａＳ（ｐＭＷＫＱ）株を得た。この株及び親株エシェリヒア・コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）をそれぞれ、７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを有するＬ−ブロス中で３７℃で１８時間培養し、２０×２００ｍｍ容の試験管中の７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地３ｍｌに培養物０．３ｍｌを接種し、回転振盪器で３７℃で７２時間培養した。
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母抽出物 ８．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【００６６】
グルコース及び硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾燥加熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。滅菌後、抗生物質を培地に導入する。
【００６７】
培養後、培地中に蓄積したイノシン量をＨＰＬＣで測定した。培地のサンプル（５００μｌ）を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで４倍希釈し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析の条件：カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５ｕ（Phenomenex, USA）。バッファー：２％（ｖ／ｖ）Ｃ2Ｈ5ＯＨ；０．８％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン；０．５％（ｖ／ｖ）（氷）酢酸；ｐＨ４．５。温度：３０℃。流速：０．３ｍｌ／分。注入量：５μｌ。検出：ＵＶ２５０ｎｍ。
保持時間（分）：
キサントシン １３．７
イノシン ９．６
グアノシン １１．４
アデノシン ２８．２
【００６８】
結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
表２から分かるように、ｙｅａＳ遺伝子の過剰発現によって、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）株のイノシン生産性が向上した。
【００７１】
実施例４：単一レプリコンシャトルベクターｐＬＦ２２へのｙｅａＳ遺伝子のクローニング
バチルス株でｙｅａＳ遺伝子を発現するために、プラスミド上に存在するｒｅｐＡＢ遺伝子プロモーター及びバチルス・サブチリスリボソーム結合部位のｐｕｒＥ遺伝子の制御下で、ｙｅａＳ遺伝子を単一レプリコンシャトルベクターｐＬＦ２２にクローニングした（Tarakanov et al., Expression vector pLF22 for the lactic acid bacteria. Mikrobiologiia（Rus）. 73（2）, 211-217, （2004））。このために、プライマー３（配列番号５）及びプライマー４（配列番号６）は、鋳型としてＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲに使用した。プライマー３は、バチルス・サブチリスｐｕｒＥ遺伝子のリボソーム結合部位を含有する。得られた断片をＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｒｅｐＡＢ遺伝子プロモーターの制御下で、プラスミドｐＬＦ２２のＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。このようにして、ｐＬＦ−ＹｅａＳプラスミドを得た。
【００７２】
実施例５：バチルス・アミロリクエファシエンスのイノシン−グアノシン産生株によるイノシン及びグアノシン産生に対するｙｅａＳ遺伝子の過剰発現の効果
形質転換によって、ｐＬＦ２２プラスミド及びｐＬＦ−ＹｅａＳプラスミドをバチルス・サブチリス１６８株に導入し、形質転換株をそれぞれ、バチルス・サブチリス（ｐＬＦ２２）及びバチルス・サブチリス（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）と称した。それから、これらの株で増殖したＥ４０ファージを使用して、バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ＡＴＣＣ番号１９２２２、ＶＫＰＭ Ｂ−８９９４）株に形質導入した（米国特許第３，５７５，８０９号明細書）。形質導入株を、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢで選択した。このようにして、バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ２２）株及びバチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）株を得た。
【００７３】
バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）株及びバチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ２２）対照株をそれぞれ、Ｌ−ブロス中で３４℃で１８時間培養した。それから、２０×２００ｍｍ容の試験管中の発酵培地３ｍｌに培養物０．３ｍＬを接種し、回転振盪器で３４℃で７２時間培養した。
【００７４】
発酵培地の組成は以下の通りである：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
ＮＨ4Ｃｌ １５．０
アデニン ０．３
（豆濃（Mameno）形態の*）全窒素 ０．８
ＣａＣＯ3 ２５．０
*：ダイズ加水分解物
【００７５】
グルコース及び硫酸マグネシウムを別々に滅菌する。ＣａＣＯ3を１８０℃で２時間、乾燥加熱滅菌する。ｐＨを７．０に調整する。
【００７６】
培養後、上記のように、培地中に集積したイノシン及びグアノシンの量をＨＰＬＣで測定した。結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
表３から、ｙｅａＳ遺伝子の過剰発現は、バチルス・アミロリクエファシエンスＡＪ１９９１（ｐＬＦ−ＹｅａＳ）株のイノシン及びグアノシンの生産性を向上させたということになる。
【００７９】
本発明は、その好ましい実施形態で詳細に説明されているが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行い、同等物を利用することができることは当業者にとって明らかである。上述の文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌によるプリンヌクレオシドの産生を高めることができる。産生されたプリンヌクレオシドは、例えば５’−プリンヌクレオチドの産生に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア細菌又はバチルス細菌であって、該細菌中で下記Ａ及びＢから選択されるタンパク質の活性が高められた細菌。
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を含み、前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１と相補的な塩基配列、又は配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとハイブリダイズすることができ、且つ前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とするタンパク質をコードするＤＮＡ、
から成る群から選択されるＤＮＡによってコードされる、
請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記ストリンジェントな条件が、６０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄工程を含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
前記タンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換すること、又は該ＤＮＡの発現を高めるように、前記細菌の染色体上の該ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより、該タンパク質の活性が高められた、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
前記ＤＮＡが多コピーベクター上に位置する、請求項４に記載の細菌。
【請求項６】
前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項７】
培地中で請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程、及び該培地から該プリンヌクレオシドを回収する工程を含む、プリンヌクレオシドの製造方法。
【請求項８】
前記細菌が、プリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プリンヌクレオシドがイノシン又はグアノシンである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
培地中で請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌を培養し、プリンヌクレオシドを産生する工程、該プリンヌクレオシドをリン酸化して、プリンヌクレオチドを生成する工程、及び該５’−プリンヌクレオチドを回収する工程を含む、５’−プリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１１】
前記細菌がプリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンであり、前記５’−プリンヌ
クレオチドがイノシン酸及び／又はグアニル酸である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１】
プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア細菌又はバチルス細菌であって、該細菌中で下記Ａ及びＢから選択されるタンパク質の活性が高められた細菌。
Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列を含み、前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とする活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１と相補的な塩基配列、又は配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとハイブリダイズすることができ、且つ前記細菌中で活性が高まると、エシェリヒア細菌又はバチルス細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン又は６−チオグアニンに対して耐性とするタンパク質をコードするＤＮＡ、
から成る群から選択されるＤＮＡによってコードされる、
請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記ストリンジェントな条件が、６０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄工程を含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
前記タンパク質をコードするＤＮＡで前記細菌を形質転換すること、又は該ＤＮＡの発現を高めるように、前記細菌の染色体上の該ＤＮＡの発現制御配列を改変することにより、該タンパク質の活性が高められた、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
前記ＤＮＡが多コピーベクター上に位置する、請求項４に記載の細菌。
【請求項６】
前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項７】
培地中で請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程、及び該培地から該プリンヌクレオシドを回収する工程を含む、プリンヌクレオシドの製造方法。
【請求項８】
前記細菌が、プリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プリンヌクレオシドがイノシン又はグアノシンである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
培地中で請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌を培養し、プリンヌクレオシドを産生する工程、該プリンヌクレオシドをリン酸化して、プリンヌクレオチドを生成する工程、及び該５’−プリンヌクレオチドを回収する工程を含む、５’−プリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１１】
前記細菌がプリンヌクレオシド生合成に関与する遺伝子の発現が高まるように改変された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プリンヌクレオシドがイノシン及び／又はグアノシンであり、前記５’−プリンヌ
クレオチドがイノシン酸及び／又はグアニル酸である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５１２７３２（Ｐ２０１０−５１２７３２Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２５８４２（Ｐ２００９−５２５８４２）
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４６２９
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４６２９
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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