エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤及びその用途
【課題】アテローム性動脈硬化症をはじめとする炎症性疾患の診断及び／又は治療薬の開発に役立つ新規な研究方法及びそのためのツールを提供する。
【解決手段】エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤。
【解決手段】エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフォリン及びエフォリン受容体（エフ）による炎症細胞の調節及びそれを利用した炎症の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症は、主要な疾患であり、心臓発作及び脳梗塞のような突然の死亡を起こすことから、その予防は世界的に重要な医療問題となってきている。動脈硬化症については高コレステロール血症のような危険因子が公知であるが、近年、炎症は、アテローム性動脈硬化症の発症及び進行において重要な役割を果たすことがわかってきた。
【０００３】
マクロファージは、脂質を担持した泡沫細胞及び脂肪小滴が平滑筋細胞及びコラーゲンの豊富なマトリックスのキャップによって囲まれているコア領域を形成する動脈硬化症病変部（プラーク）で優勢である。これらのプラークの破壊及びその後の塞栓症は、突然の動脈の閉塞を起こし、急性の臨床的事象をもたらす。したがって、アテローム性動脈硬化症プラークの発生に関わるメカニズムの解明は、臨床的事象を予防するために重要である。しかし、ヒト動脈硬化症におけるマクロファージとＴ−リンパ球とをつなぐ分子ネットワークは未だ未解明である。
【０００４】
受容体チロシンキナーゼであるエフ（Eph）は、そのリガンドであるエフォリン（ephrin）によって活性化され、胎生期における細胞の接着及び移動を制御する分子群として知られている。分子の形態により、エフォリン及びエフは、Ａ群及びＢ群に大別されている（Ａ群：エフォリン−Ａ１〜−Ａ５及びエフＡ１〜Ａ８；Ｂ群：エフォリン−Ｂ１〜−Ｂ３及びエフＢ１〜Ｂ４、Ｂ６）。これらの分子は、一部でガン発生との関連が指摘されているが、動脈硬化症を含むその他の種々の炎症性疾患との関係が指摘されたことはこれまでなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Yusuf, S. et al. (2001) Circulation 104, 2746-2753.
【非特許文献２】Naghavi, M. et al. (2003) Circulation 108, 1664-1672.
【非特許文献３】Libby, P. (2002) Nature 420, 868-874.
【非特許文献４】Hansson, G. K. (2005) N Engl J Med 352, 1685-1695.
【非特許文献５】Lucas, A. D. & Greaves, D. R. (2001) Expert Rev Mol Med 2001, 1-18.
【非特許文献６】Daugherty, A. et al. (2005) J Lipid Res 46, 1812-1822.
【非特許文献７】Higashikata T. et al. (2004) Atherosclerosis 177, 353-360.
【非特許文献８】Lutgens E. et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol 23, 2123-2130.
【非特許文献９】Stary, H. C. et al. (1995) Circulation 92, 1355-1374.
【非特許文献１０】Terui, Y. et al. (1996) J Immunol 156, 1981-1988.
【非特許文献１１】Palmer, A. & Klein, R. (2003) Genes Dev 17, 1429-1450.
【非特許文献１２】Murai, K. K. & Pasquale, E. B. (2003) J Cell Sci 116, 2823-2832.
【非特許文献１３】Taylor, P. R. et al. (2005) Annu Rev Immunol 23, 901-944.
【非特許文献１４】Armstrong, P. J. et al. (2002) J Vasc Surg 35, 346-355.
【非特許文献１５】Fenteany, G. & Glogauer, M. (2004) Curr Opin Hematol 11, 15-24.
【非特許文献１６】Rao, K. M. (2001) J Leukoc Biol 69, 3-10.
【非特許文献１７】Ojaniemi, M. et al. (1997) J Biol Chem 272, 3780-3787.
【非特許文献１８】Yeung, Y. G. et al. (1998) J Biol Chem 273, 17128-17137.
【非特許文献１９】Sharfe, N. et al. (2002) Eur J Immunol 32, 3745-3755.
【非特許文献２０】Aasheim, H. C. et al. (2005) Blood 105, 2869-2876.
【非特許文献２１】Yu, G. et al. (2004) J Biol Chem 279, 55531-55539.
【非特許文献２２】Luo, H. et al. (2002) J Clin Invest 110, 1141-1150.
【非特許文献２３】Lu, Q. et al. (2001) Cell 105, 69-79.
【非特許文献２４】Chen, X. et al. (2003) Clin Cancer Res 9, 3115-3123.
【非特許文献２５】Bouloumie, A. et al. (2005) Curr Opin Clin Nutr Metab Care 8, 347-354.
【非特許文献２６】Ma, Y. & Pope, R. M. (2005) Curr Pharm Des 11, 569-580.
【非特許文献２７】Barnes, P. J. (2004) Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 50 Online Pub, OL627-OL637.
【非特許文献２８】Grip, O. et al. (2003) Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2, 155-160.
【非特許文献２９】Hendriks, J. J. et al. (2005) Brain Res Brain Res Rev 48, 185-195.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、アテローム性動脈硬化症をはじめとする炎症性疾患の診断及び／又は治療薬の開発に役立つ新規な研究方法及びそのためのツールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ｃＤＮＡアレイ技術を用いてヒトアテローム性動脈硬化症プラークの発生に関与する新規な分子ネットワークを探索した結果、従来は発生分化遺伝子群と考えられてきたエフォリン遺伝子及びその同族受容体遺伝子が動脈硬化症プラーク領域（病変部）において高発現することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、
〔１〕エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤；
〔２〕炎症細胞がＴ−リンパ球、単球及びそれらに由来する株細胞から選択される、前記〔１〕記載の化学遊走調節剤；
〔３〕エフォリン及び／又はエフが、Ｂ群エフォリン及びエフから選択される、前記〔１〕又は〔２〕記載の化学遊走調節剤；
〔４〕インビトロで炎症細胞にエフォリン及び／又はエフを添加することを含む、炎症細胞の化学遊走を抑制する方法；
〔５〕炎症細胞を化学遊走が起こり得る条件下でエフォリン及び／又はエフと被検物質との存在下でインビトロで培養する工程、及び前記炎症細胞の化学遊走の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べる方法；
〔６〕炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器であって、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面にエフォリン及び／又はエフが固定化されていることを特徴とする培養容器からなる、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具；
〔７〕炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び／又はエフを含むコーティング溶液、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液を含む、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験キット；
〔８〕増幅される領域が１つのエクソンの一部又は全部に相当するように設計されている、エフォリン又はエフ遺伝子群、又はその転写物に由来する核酸を増幅するためのプライマー対；
〔９〕プライマー対の各プライマーが、以下の配列の対からなる群から選択される配列を有する、請求項８記載のプライマー対：配列表の配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び４２、配列番号４９及び５０、配列番号５１及び５２；
〔１０〕前記〔８〕又は〔９〕記載のプライマー対と、鋳型として細胞又は組織由来ＲＮＡとを用いてＰＣＲ法を行なうことを特徴とする、エフォリン及び／又はエフの発現に基づいて前記細胞又は組織における炎症の有無又は程度を評価する方法、
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、エフォリン及び／又はエフを用いて炎症細胞の化学遊走を調節することが可能となる。これにより、被検物質から、炎症細胞の化学遊走を調節する能力を有するものを選択することができる。炎症は、炎症細胞の遊走及び組織侵入により発生又は重症化すると考えられることから、このような炎症細胞の化学遊走調節能、特に化学遊走抑制能を有する物質は、抗炎症剤として使用される可能性がある。
【００１０】
また、本発明によれば、エフォリン及び／又はエフの遺伝子の発現を指標として、炎症の有無又は程度を調べることができる。特に、本発明のプライマーを用いれば、ＰＣＲの鋳型としてｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのいずれを用いても同一の増幅産物が得られるように設計されているため、ＰＣＲにおいて容易に入手可能なヒトゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いられるエフォリン及びエフは、後述するような試験によって炎症細胞の化学遊走を調節（抑制又は促進）する能力を有する限りにおいて、公知のいずれのものであってもよい。エフォリン及びエフとしては、好ましくはＢ群に属するもの又は化学遊走を抑制する能力を有するものであり、それらの中では特にエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２が好ましい。
【００１２】
炎症細胞は、一般に生体の炎症反応局所に集積することが知られている細胞であり、例えば好中球、単球、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、組織球、血小板などを含む。本発明に関しては、それらに加えて、炎症細胞に由来する培養細胞（株細胞等）も含む。被検物質の化学遊走調節能を試験する場合、個別の調製の手間が省け、また、調製物ごとの変動が回避できるために結果の解釈が容易になることから、培養細胞を用いることが好ましい。
【００１３】
本発明の化学遊走抑制方法は、インビトロで炎症細胞にエフォリン及び／又はエフを添加する工程を含む。炎症細胞をエフォリン及び／又はエフと接触させることによって、炎症細胞の化学遊走の程度を調節することができる。また、この系に被検物質を共存させた場合、その被検物質がエフォリン及び／エフによる化学遊走の調節に与える影響を調べることができる。
【００１４】
本発明者らは、エフォリン及びエフが、動脈硬化病変部（プラーク）のマクロファージ及びＴ−リンパ球において高発現されている一方、健常人の末梢血中の単球及びＴ−リンパ球並びに血管内皮細胞においても発現しており、さらにエフォリン及びエフは、炎症細胞の自発遊走及び化学遊走を抑制することを見出した。これらの知見に基づいて、正常血管において内皮細胞に発現するエフォリン及びエフは炎症細胞の組織への侵入を防御していると考えられる。したがって、本発明によって、エフォリン及び／又はエフによる化学遊走を抑制する能力に関して、アゴニストとして作用する被検物質を見出すことにより、その被検物質を抗炎症薬の候補として選択すること（スクリーニング）ができる。そのようなアゴニストとしては、例えばエフォリンの細胞外ドメインを免疫グロブリンのＦｃ部分と融合させた組換えタンパク質が挙げられる。また、エフォリン及び／又はエフによる化学遊走を抑制する能力に関して、アンタゴニストとして作用する被検物質が見出されれば、それは炎症を悪化させる可能性があるものとして選別することができる。
【００１５】
このような被検物質の能力を調べる方法としては、具体的には、まず、化学遊走が起こり得る系においてインビトロで炎症細胞をエフォリン及び／又はエフの存在下で培養する。この培養の前又は培養と同時に被検物質を培地に添加し、エフォリン及び／又はエフと被検物質とが共存する状態で炎症細胞を一定時間培養する。その後、炎症細胞の化学遊走の程度を測定する。この測定結果を、同じ系において被検物質を添加しなかった場合と比較して、被検物質を添加した場合において遊走の程度が低減していればアゴニストとして作用する能力、増大していればアンタゴニストとして作用する能力を被検物質が有すると判定することができる。
【００１６】
上記の方法は、細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器を用いることによって有利に行なうことができる。複数の区画は、水平に設けられていてもよく、垂直（上下）に配置されていてもよい。材質は細胞の培養に関して有害でない限り特に制限はなく、隔壁としては、例えば有孔のプラスチック製の板、ポリエステル又はポリカーボネート製の多孔質膜などであってもよい。孔のサイズとしては、使用する炎症細胞が通過できるものであればよく、一般的には約３〜１２μm程度であることが好ましい。このような培養容器は公知であり、例えばTranswell（登録商標）（Corning）などが市販されている。
【００１７】
本発明の方法における使用のためには、このような培養容器は、エフォリン及び／又はエフを一方の区画の内壁（側面及び底面を含む）又は隔壁に予め固定化しておき、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具として提供することができる。同様に、本発明の方法を実施するために、上記のような培養容器と、隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び／又はエフを含むコーティング溶液と、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液とを、キットの形態で提供することができる。キットには、さらに希釈用緩衝液（例えば後述するような化学遊走用緩衝液）のような、本発明の方法の実施に際して使用する他の構成要素を含ませることができる。
【００１８】
このような試験具又はキットを用いる場合、使用の際に、一方の区画にケモカイン、他方の区画（内壁にエフォリン及び／又はエフがコーティングされている場合はその側）に炎症細胞を入れ、所定の時間培養し、隔壁を通過してケモカインの側に移動した細胞の数を調べることによって、化学遊走の増減を容易に測定・評価することが可能である。
【００１９】
細胞又は組織におけるエフォリン又はエフの発現の有無又は量は、細胞又は組織からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、それを鋳型として、公知のＰＣＲ方法を行なうことにより調べることができる。本発明の増幅用プライマーセット（対）は、エフォリン又はエフ遺伝子の１つのエクソン内の領域が増幅されるように設計されているので、ゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることができ、試験の有効性を簡単に確認することができる。即ち、サンプルからのｃＤＮＡを鋳型とした場合と、ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とで、同一の増幅産物が得られるので有利である。
【００２０】
表１に、このような本発明のエフォリン及びエフ核酸増幅用プライマーの配列の具体例を示す。カッコ内は増幅されるエクソン（Ｅｘ）の番号を示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
ＰＣＲ条件の設定は、当業者が適宜選択することができる。具体的な条件は、以下の例において挙げるが、それに限らない。
【実施例】
【００２３】
下記の試料、試薬、方法は、いくつかの例において共通して使用された。
【００２４】
ヒト頚動脈組織
発作歴がある１０人のアテローマ性動脈硬化症患者（平均年齢５８．２歳、男性）から、国立循環器病センターで頚動脈血管内膜切除術（ＣＥＡ）により切除された頚動脈を得た。国立循環器病センターの倫理委員会によって確立された基準にしたがってすべての患者からインフォームド・コンセントを得た。
【００２５】
得られた頚動脈は、９０％以上が管腔内の狭窄を有しており、そのすべてが米国心臓病学会分類（American Heart Association classification）による第VI段階に属していた。採取後直ちに検体の半分をヒストチョイス（Histochoice）（商品名、Amresco, Solon, OH）で固定した。残りの半分から、動脈硬化症プラーク領域（「Ｐｌ」）及びプラークのない動脈内領域を切り出し、後者を比較的正常な領域（「ｒＮ」）と名付けた。ＰｌとｒＮの両方を液体窒素中で凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００２６】
抗体
以下の抗体を使用した：モノクローナル抗ＣＤ６８（クローンＫＰ１）及び抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ、クローン１Ａ４）、DAKO（Kyoto,Japan）から入手；モノクローナル抗ＣＤ４（クローン１Ｆ６）及び抗ＣＤ８（クローン４Ｂ１１）、Novocastra（Newcastle, UK）から入手。ポリクローナルウサギ抗エフォリン−Ｂ１抗体、Santa Cruz（Santa Cruz, CA）から入手。ポリクローナルヤギ抗エフＢ２抗体及びポリクローナルウサギ抗ＣＸＣＲ４抗体、Sigma（St. Louis, MO）から入手。ビオチン化ブタ抗ヤギＩｇＧ抗体、DAKOから入手。Alexa 546−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体、Alexa 488−コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ抗体及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ヤギＩｇＧ抗体、Molecular Probes（Eugene,OR）から入手。
【００２７】
統計学的処理
ｒＮ及びＰｌの間の各標的遺伝子の標準化された発現レベルの統計学的な比較は、スタットビュー（StatView） Ver.5.0 ソフトウェア（商品名、SAS Institute Inc, Cary, NC）を用いて対応のあるｔ−検定（paired Student’s t-test）によって行なった。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると判定した。
【００２８】
例１．ｃＤＮＡマクロアレイ解析によるヒト頚動脈動脈硬化症プラークにおけるアップレギュレートされた遺伝子の同定及びクラスター化
アイソジェン（Isogen）試薬（商品名、Nippon Gene, Tokyo, Japan）を製造業者の指示書どおりに用いて、ＣＥＡ検体の１０対のｒＮ及びＰｌ部分から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの濃度を分光光度計で測定し、その質を、サイバー・グリーン色素（Sybr Green dye）（Molecular Probes）で染色した１．２％変性アガロースゲル電気泳動で肉眼で確認した。
【００２９】
ｃＤＮＡマクロアレイ解析を、４対の適当な量の全ＲＮＡについて行なった。ｃＤＮＡ膜マクロアレイについては、サイトカイン／受容体及び心血管アトラスアレイ（Cytokines/Receptors and Cardiovascular Atlas Arrays）（BD Biosciences, Palo Alto, CA）を用いた。これは、全部で５２２の独立の遺伝子（既知のサイトカイン及び心血管関連遺伝子）を網羅する。ｃＤＮＡ合成プライマーミックス及び［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いて２μgの各全ＲＮＡからｃＤＮＡプローブ混合物を合成し、製造業者の指示書にしたがって膜アレイとハイブリダイズさせた。充分に洗浄した後、これらの１６枚の膜のすべてをストームイメージ解析装置（STORM phosphorimaging device）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）で走査した。
【００３０】
アレイ・ビジョン・プログラム（Array Vision program）（Amersham Biosciences）を用いて、各スポットｃＤＮＡからのシグナル密度を決定し、グリセロアルデヒド−３’−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して標準化した。対にした膜の各々について、５２２のｃＤＮＡの標準化したシグナルをｒＮ及びＰｌ間で比較した。Ｐｌにおいてアップレギュレートされた遺伝子を含む機能的及び物理的な分子ネットワークは、インジェニュイティ・パスウェイ・アナリシス・プログラム（Ingenuity Pathway Analysis program）（Ingenuity, Mountain View, CA）を用いて予測した。動脈硬化症に関してのこれらの潜在的な分子ネットワークの新規性を、PubMedデータベースによって調べた。
【００３１】
結果は、１０個のＣＥＡ検体のｒＮ又はＰｌ部分から単離されたＲＮＡのすべては、アガロースゲル電気泳動上で良好な完全性を維持していた。ハウスキーピング遺伝子は常に強いハイブリダイゼーションシグナルを示したが、陰性対照スポットは全くハイブリダイズしなかった。Ｐｌにおいてアップレギュレートされている遺伝子についてのスクリーニング感度を最大にするために、以下の緩い基準を満たす１５１の候補遺伝子を選択した：少なくとも１つのＰｌ検体における３倍を超えるアップレギュレーション及びすべてのＰｌ検体における３分の１未満のダウレギュレーション。
【００３２】
これらの候補遺伝子について、インジェニュイティ・パスウェイ・アナリシス・プログラムを用いて２９の分子ネットワークを企図し、動脈硬化症との関係におけるそれらの新規性をPubMedデータベースによって検索した。ネットワークの大部分は、動脈硬化症と充分に関連づけられた遺伝子、例えばａｐｏＥ及び脂肪酸結合タンパクのような脂質代謝関連遺伝子；インターロイキン８のようなサイトカイン遺伝子；インスリン様成長因子１及び肝細胞成長因子を含む成長因子遺伝子；マトリックスメタロプロテアーゼ９及びトロンボモジュリンのようなその他のものであったが、マクロファージ−リンパ球相互作用及びアテローム発生において認識されたことが全くなかったエフォリン及びエフ、特にエフォリン−Ｂ類及びそれらの同族受容体であるエフＢ類からなるネットワークが発見された。
【００３３】
例２．定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子アップレギュレーションの確認
１０対のＣＥＡ検体すべてについて、１μgの全ＲＮＡをＤＮＡフリー（DNA-free）（Ambion, Austin, TX）で処理し、ランダムプライマー及びスーパースクリプト（SuperScript）II逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡに変換した（Higashikata et al., Atheroselerosis 177, 353-360(2004)）。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（ABI Prism 7700 Sequence Detection System）（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行なった。各標的遺伝子の発現レベルを、ＧＡＰＤＨのそれらに対して標準化した（Higashikata et al., Atheroselerosis 177, 353-360(2004)）。２つのケモカイン受容体、即ちＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４についてのプライマーセット及びＴａｑＭａｎプローブは、コンピュータプログラム「プライマー・エクスプレス（Primer Express）２．０」（PE Applied Biosystems）を用いて以下のように設計した：
【００３４】
ＣＸＣＲ２
フォワードプライマー：５’−ＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡ−３’（配列番号４３）；
リバースプライマー：５’−ＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡ−３’ （配列番号４４）；
ＴａｑＭａｎプローブ：５’−ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴ−３’）（配列番号４５）；及び
ＣＸＣＲ４
フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号４６）；
リバースプライマー：５’−ＡＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号４７）；
ＴａｑＭａｎプローブ：５’−ＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号４８）。
【００３５】
アッセイ・オン・デマンド（Assay-on-Demand）カクテルを、エフォリン−Ｂ１（Hs00270004_m1）、エフォリン−Ｂ２（Hs00187950_m1）、エフＢ１（Hs00174725_m1）、エフＢ２（Hs00362096_m1）、エフＢ３（Hs00177903_m1）及びエフＢ４（Hs00174752_m1）について用いた。各標的遺伝子について、２回の独立したアッセイを三連で行ない、平均発現レベルを算出した。
【００３６】
結果を図１に示す。ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４の２つのケモカイン受容体遺伝子の発現は、共にｒＮと比較してＰｌにおいて有意に高められていた（図１、パネルＡ）。したがって、これらの１０対のｒＮ及びＰｌｃＤＮＡが動脈硬化症関連遺伝子発現に関する非常に信頼できるデータを提供することが示された。
【００３７】
エフォリン−Ｂ類及びエフＢ類についての遺伝子発現レベルについては、エフォリン−Ｂ１（同、パネルＢ）及びエフＢ２（同、パネルＣ）は、ｒＮと比較してＰｌにおいて有意にアップレギュレートされていた。相対発現レベルは以下のとおりであった（ｒＮ対Ｐ１、ｎ＝１０）：エフォリン−Ｂ１について、０．６３８±０．１０６対０．８３１±０．１５２、ｐ＜０．０５；エフＢ２について１．２９６±０．２８１対２．２３３±０．５０６、ｐ＜０．０５。したがって、プラーク領域におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を解析した。
【００３８】
例３．免疫組織化学による動脈硬化症プラークにおけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の局在
固定したＣＥＡ検体をパラフィン包埋し、厚さ３μmの切片を作製した。調製物の完全性の評価のために、これらの切片を、マウス抗ＣＤ６８抗体（１：３００希釈）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ共役エンビジョン・システム（Envision system）（PO-Envision, DAKO）及び基質として３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた間接法により染色した。
【００３９】
エフォリン−Ｂ１及びＣＤ６８の二重免疫組織化学染色のためには、まず切片を抗ＣＤ６８抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて褐色の沈澱物として染色した。続いて、同じ切片を、ウサギ抗エフォリン−Ｂ１抗体（１：３００希釈）と共にインキュベートし、アルカリホスファターゼ共役エンビジョン・システム（AP-Envision, DAKO）及び基質としてニュー・フクシン（New Fuchsin）（DAKO）を用いて赤色の沈殿物として染色した。エフォリン−Ｂ１及びＣＸＣＲ４の二重免疫染色のためには、まず切片を抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。同じ切片を、次にウサギ抗ＣＸＣＲ４抗体（１：１００希釈）と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。エフォリン−Ｂ１及びＳＭＡの二重免疫染色のためには、まず切片を抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。同じ切片を、次にマウス抗ＳＭＡ抗体（１：３００希釈）と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。エフォリン−Ｂ１及びＣＤ４、又はエフォリン−Ｂ１及びＣＤ８の二重免疫染色のためには、切片を０．０１mol／Lクエン酸緩衝液（pH６．０）中で１２１℃で５分間オートクレーブ処理し、ＣＤ４又はＣＤ８抗原を露出させた。露出させた切片を、抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。同じ切片を、次にマウス抗ＣＤ４抗体（１：４０希釈）又はマウス抗ＣＤ８抗体（１：４０希釈）と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。
【００４０】
エフＢ２及びＣＤ６８の二重免疫染色のためには、切片を、まずヤギ抗エフＢ２抗体（１：５０希釈）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ共役ヒストファイン・マックス−（Ｇ）・システム（Histofine MAX-(G) system）（Nichirei, Tokyo, Japan）及びＤＡＢで処理した。同じ切片を、次に抗ＣＤ６８抗体と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。エフＢ２及びＣＤ４、又はエフＢ２及びＣＤ８の二重免疫染色のためには、露出された切片を、まず抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。次に、同じ切片を、まずヤギ抗エフＢ２抗体と、後にビオチン化ブタ抗ヤギＩｇＧ抗体（１：１００希釈）と共にインキュベートし、アルカリホスファターゼ共役ＬＳＡＢ２キット（DAKO）及びNew Fuchsinを用いて処理した。これらのすべての調製物は、ヘマトキシリンで対染色し、アクシオカム（AxioCam）ＣＣＤカメラを装着したアクシオフォト２（Axiophot2）光学顕微鏡（Carl Zeiss, Hallbergmoos, Germany）で検査した。
【００４１】
結果を図２及び図３に示す。全単球／マクロファージについてのマーカーであるＣＤ６８についての単独染色によって、コレステロール・クレフト（cholesterol clefts）をとりまくＣＤ６８陽性泡沫細胞が見出された（図２、パネル(Ａ)）。したがって、検体が典型的なアテローム性動脈硬化症の特徴を有し、それを維持していることが示された。
単独染色によって種々の形態の細胞においてエフォリン−Ｂ１又はエフＢ２様の免疫反応性が見出されたので、二重免疫組織化学染色を行なってエフォリン−Ｂ１又はエフＢ２を発現する正確な細胞タイプを明らかにした。
【００４２】
エフォリン−Ｂ１免疫反応性は、以下の細胞タイプにおいて見出された：マクロファージ様細胞及びＣＤ６８陽性泡沫細胞（同、パネル（Ｂ））；ＳＭＡ（平滑筋細胞のマーカー）陽性長型細胞（elongated cells）（同、パネル（Ｄ））；ＣＤ４（ヘルパーＴ−リンパ球のマーカー）陽性小細胞（small cells）（同、パネル（Ｅ））；ＣＤ８（キラー又はサプレッサーＴ−リンパ球のマーカー）陽性小細胞（同、パネル（Ｆ））。
【００４３】
一方、エフＢ２についての免疫反応性は、以下の細胞タイプにおいて見出された：マクロファージ様細胞及びＣＤ６８陽性泡沫細胞（図３、パネル（Ａ））；ＣＤ４陽性小細胞（同、パネル（Ｂ））；ＣＤ８陽性小細胞（同、パネル（Ｃ））。
【００４４】
即ち、エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の両方が、プラーク領域内でマクロファージ及びＴ−リンパ球において見出された。また、エフォリン−Ｂ１及びＣＸＣＲ４の両方を発現する多くのマクロファージ様細胞（図２、パネル（Ｃ））及びリンパ球様細胞も見出された（データは示していない）。
【００４５】
例４．健常ヒト成人の末梢血単球及びＴ−リンパ球におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現
健常ヒト成人の末梢血中に循環している静止状態の（resting）単球及びＴ−リンパ球においてもエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２が発現されているかどうかを調べた。単核細胞を、健常成人志願者の全血（２００mL）からリンフォプレップ（Lymphoprep）試薬（Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway）を用いて分離し、以前記載されたように、対流遠心エルトリエーション（counterflow centrifugal elutriation）（R5E elutriation system, 日立工機、茨城県）に供した(Terui et al., J. Immunol. 156, 1981-1988(1996))。この単球富化（enriched）画分からの細胞を、マウス抗ＣＤ６８抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 488−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。これらの細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI; Molecular Probes）で対染色し、Axiophot2 落斜蛍光（epifluorescence）顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて単球の純度について調べた。
【００４６】
ＣＤ６８及びエフォリン−Ｂ１の二重免疫染色のために、この単球富化細胞をまずマウス抗ＣＤ６８抗体及びウサギ抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 546−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体（１：６００希釈）及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ抗体（１：６００希釈）と共にインキュベートした。ＣＤ６８及びエフＢ２の二重免疫蛍光染色のためには、これらの細胞を、まずマウス抗ＣＤ６８抗体及びヤギ抗エフＢ２抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 546−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ヤギＩｇＧ抗体（１：６００希釈）と共にインキュベートした。
【００４７】
これらの単球富化細胞からｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった：
【００４８】
エフォリン−Ｂ１
フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号４９）；
リバースプライマー：５’−ＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＡＣ−３’配列番号５０）；
エフＢ２
フォワードプライマー：５’−ＧＡＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣ−３’（配列番号５１）；
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＣＧＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号５２）；及び
ＧＡＰＤＨ
フォワードプライマー：５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号５３）；
リバースプライマー：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号５４）。
【００４９】
ＰＣＲは、以下の条件下でＥｘＴａｑ（Takara, Tokyo, Japan）を用いて行なった：プレヒート、９４℃、２分間；３５サイクルの増幅、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で４０秒。フォワード及びリバースプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによるゲノムの増幅を排除するように各標的遺伝子の分離したエクソン中で設計した。
【００５０】
リンパ球富化細胞フラクションについて、ＣＤ４及びエフォリン−Ｂ１、ＣＤ４及びエフＢ２、ＣＤ８及びエフォリン−Ｂ１、及びＣＤ８及びエフＢ２に関する二重免疫蛍光試験を同様に行なった。
【００５１】
結果を図４及び図５に示す。健常成人志願者由来の単球は、対流遠心エルトリエーションシステムによって＞９０％の純度まで富化された（図４、パネル（Ａ））。エフォリン−Ｂ１（同、パネル（Ｂ））及びエフＢ２（同、パネル（Ｃ））の両方についての免疫反応性が、ＣＤ６８陽性細胞において観察された。また、ＲＴ−ＰＣＲによってこの単球富化ｃＤＮＡからエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の確固たる生成物が得られた（同、パネル（Ｄ））。Ｔ−リンパ球については、ＣＤ４陽性細胞は、エフォリン−Ｂ１（図５、パネル（Ａ））及びエフＢ２（同、パネル（Ｂ））の両方を発現した。ＣＤ８陽性Ｔ−リンパ球もまた、エフォリン−Ｂ１（同、パネル（Ｃ））及びエフＢ２（同、パネル（Ｄ））の両方を発現した。これらのデータは、エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の両方が健常ヒト成人の末梢血中の循環している単球及びＴ−リンパ球において発現されることを明らかに示した。
【００５２】
例５．ＲＴ−ＰＣＲによる炎症細胞におけるエフォリン遺伝子群の発現の検出
ＰＣＲ反応における鋳型として、ＴＨＰ−１細胞、Jurkat細胞、内皮細胞の各々からＲＮＡを抽出し、クオンティテクト逆転写（QuantiTect Reverse Transcription）キット（QIAGEN、カタログNo.205311）を用いて逆転写酵素を添加して又は添加せずにｃＤＮＡを作製した。具体的には、各ＲＮＡを、０．５mLのチューブ中で合計１４μL（７×ｇＤＮＡ Wipeout Buffer ２．０μL、ＲＮａｓｅ無含有水とＲＮＡ（１０pg〜１μg）との合計１２μL）の反応液中で４２℃で２分間インキュベートした後、氷冷し、ＤＮａｓｅ処理した。次に、ＤＮａｓｅ処理後のチューブに反応液のカクテル（５×Quantiscript RT Buffer ４μL、RT Primer Mix １．０μL、Quantiscript Reverse Transcriptase １．０μLの合計６μL）を入れて、ｃＤＮＡ合成を行なった。ｃＤＮＡ合成を行なわない逆転写酵素なし（ＲＴ（−））にはＤＥＰＣ水を６μL加え、合計２０μLにした。この反応液を４２℃で１５分間インキュベートした後、９５℃で３分間加熱して酵素を不活化した。
【００５３】
この各ｃＤＮＡをサンプルとして使用して、ＰＣＲを行なった。反応液の組成は、オートクレーブ水 ６．６５μL、Ex Buffer １．０μL、ｄＮＴＰ ０．８μL、以下に示す各プライマー対（１０μM） １．０μL、サンプル ０．５μL、Ex Taq ０．０５μL（合計１０μL）であった。陽性対照として、Ｈｅｌａ細胞由来のヒトゲノムＤＮＡ ５０ng／μLを用いて同様に反応を行なった（反応液組成：オートクレーブ水 ６．１５μL、Ex Buffer １．０μL、ｄＮＴＰ ０．８μL、各プライマー対（１０μM） １．０μL、サンプル １．０μL、Ex Taq ０．０５μL；合計１０μL）。
【００５４】
以下のいずれかのＰＣＲ条件を用いた。［１］：９４℃、２分（熱変性）の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回又は３５回行ない、４℃で保存する；［２］：９４℃で２分（熱変性）の後、９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回又は３５回行ない、４℃で保存する。
【００５５】
［１］の条件で用いたプライマーは、
ephrin-A1 F及びR（配列番号１及び２）
ephrin-A2 F3及びR3（配列番号３及び４）
ephrin-A3 F2及びR（配列番号５及び６）
ephrin-A4 F及びR（配列番号７及び８）
ephrin-A5 F及びR（配列番号９及び１０）
EphA1 F及びR（配列番号１１及び１２）
EphA4 F及びR（配列番号１７及び１８）
EphA5 F及びR（配列番号１９及び２０）
EphA6 F及びR（配列番号２１及び２２）
Ephrin-B1 F及びR（配列番号２７及び２８）
EphB4 F及びR（配列番号３９及び４０）；
【００５６】
［２］の条件で用いたプライマーは、
EphA2 F及びR（配列番号１３及び１４）
EphA3 F及びR（配列番号１５及び１６）
EphA7 F及びR（配列番号２３及び２４）
EphA8 F及びR（配列番号２５及び２６）
ephrin-B2 F及びR（配列番号２９及び３０）
ephrin-B3 F及びR（配列番号３１及び３２）
EphB1 F及びR（配列番号３３及び３４）
EphB2 F及びR（配列番号３５及び３６）
EphB3 F及びR（配列番号３７及び３８）
EphB6 F及びR（配列番号４１及び４２）
であった（Ｆ＝フォワード、Ｒ＝リバース）。
【００５７】
ＰＣＲ産物は、４％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して確認した（泳動前、３００ｖ、４００mAで３０分プレランした後、３００ｖ、４００mAで３５分泳動した。）
【００５８】
結果を図６〜１１に示す。図６〜１１において、×３０及び×３５はＰＣＲのサイクル（それぞれ３０回及び３５回）を示している。×３０でバンドを認めたものは高発現、×３５でもバンドを認めないものは検出限界以下、と考えることができる。
【００５９】
図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＡ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。ＴＨＰ−１細胞において、エフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ２、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフォリン−Ａ５、エフＡ１、エフＡ２、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ７は発現し、中でもエフォリン−Ａ４、エフＡ６は高発現していると考えられる。
【００６０】
図７は、ＴＨＰ−１細胞におけるＢ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。ＴＨＰ−１細胞において、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ３、エフＢ４、エフＢ６は発現し、中でもエフォリン−Ｂ１、エフＢ１、エフＢ４、エフＢ６は高発現していると考えられる。
【００６１】
図８は、Jurkat細胞におけるＡ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。Jurkat細胞において、エフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフＡ１、エフＡ２、エフＡ３、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ８は発現し、中でもエフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフＡ１、エフＡ３は高発現していると考えられる。
【００６２】
図９は、Jurkat細胞におけるＢ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。Jurkat細胞において、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ３、エフＢ４、エフＢ６が発現し、中でも、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ４、エフＢ６は高発現していると考えられる。
【００６３】
図１０は、冠動脈由来の血管内皮細胞におけるＡ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。血管内皮細胞において、エフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ２、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフォリン−Ａ５、エフＡ２、エフＡ３、エフＡ４、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ７、エフＡ８は発現し、中でもエフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフォリン−Ａ５、エフＡ２、エフＡ４、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ７、エフＡ８は高発現していると考えられる。
【００６４】
図１１は、冠動脈由来の血管内皮細胞におけるＢ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。血管内皮細胞において、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ４、エフＢ６は発現し、中でもエフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ４、エフＢ６は高発現していると考えられる。
【００６５】
例６．化学遊走調節能の試験
実験の前日に、ヒト単球由来のＴＨＰ−１細胞を、４×１０５個／mL（２．４×１０６個／dish）の濃度で直径１０cmの丸シャーレに播いた。実験までの培養時間は約１５時間であった。
【００６６】
一方、フィルターのコーティングは以下のようにして行なった。Transwell（Corning、カタログ番号３４２１、ウェルの直径６．５cm、小孔の大きさ５．０μm）を必要枚数取り出し、中央のウェルにあるフィルターを外側のウェルにピンセットで移動させた。フィルターの中に、５μg／mLのＩｇＧ−Ｆｃ（Athens Research Technology, Athens, GA, USA）、エフォリン−Ｂ１（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）又はエフＢ２（R&D Systems）を含むコーティング溶液（各々ストック溶液（それぞれ３．３９mg／mL、５００μg／mL又は５００μg／mL）をＰＢＳで希釈したもの）を１００μL／well入れた。ＵＶ照射したクリーンベンチの中で、室温で一晩コーティングした。
【００６７】
翌日、コーティングしたTranswellのフィルターを、ＰＢＳで３回リンスした。０．１μg／mLのケモカイン（ＳＤＦ−１；１０μg／mLのストック溶液を化学遊走用緩衝液（Chemotaxis Buffer：ＲＰＭＩ１６４０／０．１％ＢＳＡ）で１００倍希釈したもの）を、Transwellの下層ウェルに６００μL／well分注した。対照として化学遊走用緩衝液を６００μL／well分注したウェルも用意した。これらの下層ウェルに、フィルターをフィルターの下に空気が入らないように静かにのせた。このフィルターの中（上層ウェル）に、コールターカウンターで計測し、１×１０５個／１００μLの濃度に調整した細胞を１００μL／well分注した。
【００６８】
３７℃のＣＯ２インキュベータに入れ、２時間静置し、細胞を遊走させた。その後、上層ウェルの細胞液（遊走しなかった細胞を含む）を１００μL／well静かに除き、別のウェルに移した。フィルターはそのままで、Transwellプレートをボルテックス（vortex）ミキサーに１０秒間かけ（目盛は３．５でＯＮにし、動いているvortexにプレートをのせる）フィルターの穴に入っている細胞を落とした。さらに、Transwellプレートを２０００rpmで２分間遠心分離し、フィルターに付着している細胞を落とした後、下層に移動した細胞の総数をコールターカウンターを用いて、計数した。
【００６９】
結果を図１２に示す。図１２は、ヒト単球由来の細胞株であるＴＨＰ−１細胞の化学遊走に及ぼすエフォリン−Ｂ１とエフＢ２の影響を示したものである。下層の培養液にＳＤＦ−１を添加した場合、エフォリン−Ｂ１とエフＢ２は共にＴＨＰ−１細胞のＳＤＦ−１による化学遊走を有意に抑制した。なお、ＳＤＦ−１を添加しない場合（自発遊走）についても同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ヒト頚動脈動脈内切除術検体から調製したｃＤＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。（Ａ）はケモカイン受容体、（Ｂ）はエフォリン−Ｂ類、（Ｃ）はエフＢ類を表す。データは、三連で行なった２回の独立した実験における平均±ＳＥを表す。Ｐ値は対応のあるｔ−検定(ｎ＝１０）により算出した。ｒＮ＝比較的正常な領域、Ｐｌ＝動脈硬化症プラーク。
【図２】図２は、ヒト頚動脈の動脈硬化症プラークにおけるエフォリン−Ｂ１の局在を示す図である。単独の（パネル（Ａ））又は二重の（パネル（Ｂ）〜（Ｆ））免疫組織化学染色は実施例に記載したとおりに行なった。（Ａ）：多数のＣＤ６８（褐色）陽性泡沫細胞がcholesterol cleftsの周囲に観察された。（Ｂ）：エフォリン−Ｂ１（赤色）及びＣＤ６８（褐色）。（Ｃ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＣＸＣＲ４（赤色）。矢印は、内弾性板を示す。（Ｄ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＳＭＡ（赤色）。（Ｅ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＣＤ４（赤色）。ＮＣ＝壊死中核（necrotic core）。（Ｆ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＣＤ８（赤色）。ＮＣ＝necrotic core。各パネルについて、矢印によって示す高倍率の図を囲みの中に示す。バーは２０μmである。
【図３】図３は、ヒト頚動脈の動脈硬化症プラークにおけるエフＢ２の局在を示す図である。二重免疫組織化学染色は実施例に記載したとおりに行なった。（Ａ）：エフＢ２（褐色）及びＣＤ６８（赤色）。（Ｂ）：エフＢ２（赤色）及びＣＤ４（褐色）。（Ｃ）：エフＢ２（赤色）及びＣＤ８（褐色）。各パネルについて、矢印によって示す高倍率の図を囲みの中に示す。バーは２０μmである。
【図４】図４は、健常ヒトからの末梢血単球におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を示す図である。対流遠心エルトリエーションシステムを用いて健常志願者の末梢血単球を富化した。（Ａ）：ＣＤ６８は、ＤＡＰＩで染色した細胞の＞９０％で陽性であった。バーは２０μmである。（Ｂ）、（Ｃ）：エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を二重免疫蛍光試験によって解析したもの。(左)＝ＣＤ６８。（中央）＝エフォリン−Ｂ１（Ｂ）及びエフＢ２（Ｃ）。（右）＝ＣＤ６８及びエフォリン−Ｂ１（Ｂ）又はＣＤ６８及びエフＢ２（Ｃ）についての結合した像。バーは２０μmである。（Ｄ）：エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＭＯ＝単球富化細胞、ＮＣ＝陰性対照（鋳型なし）、ＰＣ＝陽性対照(動脈硬化症プラーク)。生成物のサイズは、エフォリン−Ｂ１が５０２塩基対（bp）、エフＢ２が５１５bp、ＧＡＰＤＨが４５２bpであった。
【図５】図５は、健常ヒトからの末梢血Ｔ−リンパ球におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を示す図である。エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現は、二重免疫蛍光試験によって解析した。（Ａ）、（Ｂ）：（左）＝ＣＤ４。（中央）＝エフォリン−Ｂ１（Ａ）及びエフＢ２（Ｂ）。（右）＝ＣＤ４及びエフォリン−Ｂ１（Ａ）又はＣＤ４及びエフＢ２（Ｂ）についての結合した像。（Ｃ）、（Ｄ）：（左）＝ＣＤ８。（中央）＝エフォリン−Ｂ１（Ｃ）及びエフＢ２（Ｄ）。（右）＝ＣＤ８及びエフォリン−Ｂ１（Ｃ）又はＣＤ８及びエフＢ２（Ｄ）についての結合した像。バーは２０μmである。
【図６】図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＡ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。以下の説明は図６〜１１について共通である。プライマーとしては、各パネルの左側に記したプライマー対を使用した。各パネルにおいて、レーン「１」＝ｃＤＮＡ、レーン「２」＝鋳型なし（逆転写酵素なし；ＤＮａｓｅ処理）のＲＮＡ、レーン「３」＝ゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型として用いた。「×３０」及び「×３５」はＰＣＲにおける温度サイクルがそれぞれ３０回及び３５回であることを表す。
【図７】図７は、ＴＨＰ−１細胞におけるＢ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図８】図８は、Jurkat細胞におけるＡ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図９】図９は、Jurkat細胞におけるＢ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図１０】図１０は、内皮細胞におけるＡ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図１１】図１１は、内皮細胞におけるＢ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図１２】図１２は、ＴＨＰ−１細胞を用いた化学遊走試験の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフォリン及びエフォリン受容体（エフ）による炎症細胞の調節及びそれを利用した炎症の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症は、主要な疾患であり、心臓発作及び脳梗塞のような突然の死亡を起こすことから、その予防は世界的に重要な医療問題となってきている。動脈硬化症については高コレステロール血症のような危険因子が公知であるが、近年、炎症は、アテローム性動脈硬化症の発症及び進行において重要な役割を果たすことがわかってきた。
【０００３】
マクロファージは、脂質を担持した泡沫細胞及び脂肪小滴が平滑筋細胞及びコラーゲンの豊富なマトリックスのキャップによって囲まれているコア領域を形成する動脈硬化症病変部（プラーク）で優勢である。これらのプラークの破壊及びその後の塞栓症は、突然の動脈の閉塞を起こし、急性の臨床的事象をもたらす。したがって、アテローム性動脈硬化症プラークの発生に関わるメカニズムの解明は、臨床的事象を予防するために重要である。しかし、ヒト動脈硬化症におけるマクロファージとＴ−リンパ球とをつなぐ分子ネットワークは未だ未解明である。
【０００４】
受容体チロシンキナーゼであるエフ（Eph）は、そのリガンドであるエフォリン（ephrin）によって活性化され、胎生期における細胞の接着及び移動を制御する分子群として知られている。分子の形態により、エフォリン及びエフは、Ａ群及びＢ群に大別されている（Ａ群：エフォリン−Ａ１〜−Ａ５及びエフＡ１〜Ａ８；Ｂ群：エフォリン−Ｂ１〜−Ｂ３及びエフＢ１〜Ｂ４、Ｂ６）。これらの分子は、一部でガン発生との関連が指摘されているが、動脈硬化症を含むその他の種々の炎症性疾患との関係が指摘されたことはこれまでなかった。
【０００５】
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【非特許文献２９】Hendriks, J. J. et al. (2005) Brain Res Brain Res Rev 48, 185-195.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、アテローム性動脈硬化症をはじめとする炎症性疾患の診断及び／又は治療薬の開発に役立つ新規な研究方法及びそのためのツールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ｃＤＮＡアレイ技術を用いてヒトアテローム性動脈硬化症プラークの発生に関与する新規な分子ネットワークを探索した結果、従来は発生分化遺伝子群と考えられてきたエフォリン遺伝子及びその同族受容体遺伝子が動脈硬化症プラーク領域（病変部）において高発現することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、
〔１〕エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤；
〔２〕炎症細胞がＴ−リンパ球、単球及びそれらに由来する株細胞から選択される、前記〔１〕記載の化学遊走調節剤；
〔３〕エフォリン及び／又はエフが、Ｂ群エフォリン及びエフから選択される、前記〔１〕又は〔２〕記載の化学遊走調節剤；
〔４〕インビトロで炎症細胞にエフォリン及び／又はエフを添加することを含む、炎症細胞の化学遊走を抑制する方法；
〔５〕炎症細胞を化学遊走が起こり得る条件下でエフォリン及び／又はエフと被検物質との存在下でインビトロで培養する工程、及び前記炎症細胞の化学遊走の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べる方法；
〔６〕炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器であって、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面にエフォリン及び／又はエフが固定化されていることを特徴とする培養容器からなる、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具；
〔７〕炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び／又はエフを含むコーティング溶液、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液を含む、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験キット；
〔８〕増幅される領域が１つのエクソンの一部又は全部に相当するように設計されている、エフォリン又はエフ遺伝子群、又はその転写物に由来する核酸を増幅するためのプライマー対；
〔９〕プライマー対の各プライマーが、以下の配列の対からなる群から選択される配列を有する、請求項８記載のプライマー対：配列表の配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び４２、配列番号４９及び５０、配列番号５１及び５２；
〔１０〕前記〔８〕又は〔９〕記載のプライマー対と、鋳型として細胞又は組織由来ＲＮＡとを用いてＰＣＲ法を行なうことを特徴とする、エフォリン及び／又はエフの発現に基づいて前記細胞又は組織における炎症の有無又は程度を評価する方法、
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、エフォリン及び／又はエフを用いて炎症細胞の化学遊走を調節することが可能となる。これにより、被検物質から、炎症細胞の化学遊走を調節する能力を有するものを選択することができる。炎症は、炎症細胞の遊走及び組織侵入により発生又は重症化すると考えられることから、このような炎症細胞の化学遊走調節能、特に化学遊走抑制能を有する物質は、抗炎症剤として使用される可能性がある。
【００１０】
また、本発明によれば、エフォリン及び／又はエフの遺伝子の発現を指標として、炎症の有無又は程度を調べることができる。特に、本発明のプライマーを用いれば、ＰＣＲの鋳型としてｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのいずれを用いても同一の増幅産物が得られるように設計されているため、ＰＣＲにおいて容易に入手可能なヒトゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いられるエフォリン及びエフは、後述するような試験によって炎症細胞の化学遊走を調節（抑制又は促進）する能力を有する限りにおいて、公知のいずれのものであってもよい。エフォリン及びエフとしては、好ましくはＢ群に属するもの又は化学遊走を抑制する能力を有するものであり、それらの中では特にエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２が好ましい。
【００１２】
炎症細胞は、一般に生体の炎症反応局所に集積することが知られている細胞であり、例えば好中球、単球、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、組織球、血小板などを含む。本発明に関しては、それらに加えて、炎症細胞に由来する培養細胞（株細胞等）も含む。被検物質の化学遊走調節能を試験する場合、個別の調製の手間が省け、また、調製物ごとの変動が回避できるために結果の解釈が容易になることから、培養細胞を用いることが好ましい。
【００１３】
本発明の化学遊走抑制方法は、インビトロで炎症細胞にエフォリン及び／又はエフを添加する工程を含む。炎症細胞をエフォリン及び／又はエフと接触させることによって、炎症細胞の化学遊走の程度を調節することができる。また、この系に被検物質を共存させた場合、その被検物質がエフォリン及び／エフによる化学遊走の調節に与える影響を調べることができる。
【００１４】
本発明者らは、エフォリン及びエフが、動脈硬化病変部（プラーク）のマクロファージ及びＴ−リンパ球において高発現されている一方、健常人の末梢血中の単球及びＴ−リンパ球並びに血管内皮細胞においても発現しており、さらにエフォリン及びエフは、炎症細胞の自発遊走及び化学遊走を抑制することを見出した。これらの知見に基づいて、正常血管において内皮細胞に発現するエフォリン及びエフは炎症細胞の組織への侵入を防御していると考えられる。したがって、本発明によって、エフォリン及び／又はエフによる化学遊走を抑制する能力に関して、アゴニストとして作用する被検物質を見出すことにより、その被検物質を抗炎症薬の候補として選択すること（スクリーニング）ができる。そのようなアゴニストとしては、例えばエフォリンの細胞外ドメインを免疫グロブリンのＦｃ部分と融合させた組換えタンパク質が挙げられる。また、エフォリン及び／又はエフによる化学遊走を抑制する能力に関して、アンタゴニストとして作用する被検物質が見出されれば、それは炎症を悪化させる可能性があるものとして選別することができる。
【００１５】
このような被検物質の能力を調べる方法としては、具体的には、まず、化学遊走が起こり得る系においてインビトロで炎症細胞をエフォリン及び／又はエフの存在下で培養する。この培養の前又は培養と同時に被検物質を培地に添加し、エフォリン及び／又はエフと被検物質とが共存する状態で炎症細胞を一定時間培養する。その後、炎症細胞の化学遊走の程度を測定する。この測定結果を、同じ系において被検物質を添加しなかった場合と比較して、被検物質を添加した場合において遊走の程度が低減していればアゴニストとして作用する能力、増大していればアンタゴニストとして作用する能力を被検物質が有すると判定することができる。
【００１６】
上記の方法は、細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器を用いることによって有利に行なうことができる。複数の区画は、水平に設けられていてもよく、垂直（上下）に配置されていてもよい。材質は細胞の培養に関して有害でない限り特に制限はなく、隔壁としては、例えば有孔のプラスチック製の板、ポリエステル又はポリカーボネート製の多孔質膜などであってもよい。孔のサイズとしては、使用する炎症細胞が通過できるものであればよく、一般的には約３〜１２μm程度であることが好ましい。このような培養容器は公知であり、例えばTranswell（登録商標）（Corning）などが市販されている。
【００１７】
本発明の方法における使用のためには、このような培養容器は、エフォリン及び／又はエフを一方の区画の内壁（側面及び底面を含む）又は隔壁に予め固定化しておき、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具として提供することができる。同様に、本発明の方法を実施するために、上記のような培養容器と、隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び／又はエフを含むコーティング溶液と、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液とを、キットの形態で提供することができる。キットには、さらに希釈用緩衝液（例えば後述するような化学遊走用緩衝液）のような、本発明の方法の実施に際して使用する他の構成要素を含ませることができる。
【００１８】
このような試験具又はキットを用いる場合、使用の際に、一方の区画にケモカイン、他方の区画（内壁にエフォリン及び／又はエフがコーティングされている場合はその側）に炎症細胞を入れ、所定の時間培養し、隔壁を通過してケモカインの側に移動した細胞の数を調べることによって、化学遊走の増減を容易に測定・評価することが可能である。
【００１９】
細胞又は組織におけるエフォリン又はエフの発現の有無又は量は、細胞又は組織からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、それを鋳型として、公知のＰＣＲ方法を行なうことにより調べることができる。本発明の増幅用プライマーセット（対）は、エフォリン又はエフ遺伝子の１つのエクソン内の領域が増幅されるように設計されているので、ゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることができ、試験の有効性を簡単に確認することができる。即ち、サンプルからのｃＤＮＡを鋳型とした場合と、ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合とで、同一の増幅産物が得られるので有利である。
【００２０】
表１に、このような本発明のエフォリン及びエフ核酸増幅用プライマーの配列の具体例を示す。カッコ内は増幅されるエクソン（Ｅｘ）の番号を示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
ＰＣＲ条件の設定は、当業者が適宜選択することができる。具体的な条件は、以下の例において挙げるが、それに限らない。
【実施例】
【００２３】
下記の試料、試薬、方法は、いくつかの例において共通して使用された。
【００２４】
ヒト頚動脈組織
発作歴がある１０人のアテローマ性動脈硬化症患者（平均年齢５８．２歳、男性）から、国立循環器病センターで頚動脈血管内膜切除術（ＣＥＡ）により切除された頚動脈を得た。国立循環器病センターの倫理委員会によって確立された基準にしたがってすべての患者からインフォームド・コンセントを得た。
【００２５】
得られた頚動脈は、９０％以上が管腔内の狭窄を有しており、そのすべてが米国心臓病学会分類（American Heart Association classification）による第VI段階に属していた。採取後直ちに検体の半分をヒストチョイス（Histochoice）（商品名、Amresco, Solon, OH）で固定した。残りの半分から、動脈硬化症プラーク領域（「Ｐｌ」）及びプラークのない動脈内領域を切り出し、後者を比較的正常な領域（「ｒＮ」）と名付けた。ＰｌとｒＮの両方を液体窒素中で凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。
【００２６】
抗体
以下の抗体を使用した：モノクローナル抗ＣＤ６８（クローンＫＰ１）及び抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ、クローン１Ａ４）、DAKO（Kyoto,Japan）から入手；モノクローナル抗ＣＤ４（クローン１Ｆ６）及び抗ＣＤ８（クローン４Ｂ１１）、Novocastra（Newcastle, UK）から入手。ポリクローナルウサギ抗エフォリン−Ｂ１抗体、Santa Cruz（Santa Cruz, CA）から入手。ポリクローナルヤギ抗エフＢ２抗体及びポリクローナルウサギ抗ＣＸＣＲ４抗体、Sigma（St. Louis, MO）から入手。ビオチン化ブタ抗ヤギＩｇＧ抗体、DAKOから入手。Alexa 546−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体、Alexa 488−コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ抗体及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ヤギＩｇＧ抗体、Molecular Probes（Eugene,OR）から入手。
【００２７】
統計学的処理
ｒＮ及びＰｌの間の各標的遺伝子の標準化された発現レベルの統計学的な比較は、スタットビュー（StatView） Ver.5.0 ソフトウェア（商品名、SAS Institute Inc, Cary, NC）を用いて対応のあるｔ−検定（paired Student’s t-test）によって行なった。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると判定した。
【００２８】
例１．ｃＤＮＡマクロアレイ解析によるヒト頚動脈動脈硬化症プラークにおけるアップレギュレートされた遺伝子の同定及びクラスター化
アイソジェン（Isogen）試薬（商品名、Nippon Gene, Tokyo, Japan）を製造業者の指示書どおりに用いて、ＣＥＡ検体の１０対のｒＮ及びＰｌ部分から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの濃度を分光光度計で測定し、その質を、サイバー・グリーン色素（Sybr Green dye）（Molecular Probes）で染色した１．２％変性アガロースゲル電気泳動で肉眼で確認した。
【００２９】
ｃＤＮＡマクロアレイ解析を、４対の適当な量の全ＲＮＡについて行なった。ｃＤＮＡ膜マクロアレイについては、サイトカイン／受容体及び心血管アトラスアレイ（Cytokines/Receptors and Cardiovascular Atlas Arrays）（BD Biosciences, Palo Alto, CA）を用いた。これは、全部で５２２の独立の遺伝子（既知のサイトカイン及び心血管関連遺伝子）を網羅する。ｃＤＮＡ合成プライマーミックス及び［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いて２μgの各全ＲＮＡからｃＤＮＡプローブ混合物を合成し、製造業者の指示書にしたがって膜アレイとハイブリダイズさせた。充分に洗浄した後、これらの１６枚の膜のすべてをストームイメージ解析装置（STORM phosphorimaging device）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）で走査した。
【００３０】
アレイ・ビジョン・プログラム（Array Vision program）（Amersham Biosciences）を用いて、各スポットｃＤＮＡからのシグナル密度を決定し、グリセロアルデヒド−３’−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して標準化した。対にした膜の各々について、５２２のｃＤＮＡの標準化したシグナルをｒＮ及びＰｌ間で比較した。Ｐｌにおいてアップレギュレートされた遺伝子を含む機能的及び物理的な分子ネットワークは、インジェニュイティ・パスウェイ・アナリシス・プログラム（Ingenuity Pathway Analysis program）（Ingenuity, Mountain View, CA）を用いて予測した。動脈硬化症に関してのこれらの潜在的な分子ネットワークの新規性を、PubMedデータベースによって調べた。
【００３１】
結果は、１０個のＣＥＡ検体のｒＮ又はＰｌ部分から単離されたＲＮＡのすべては、アガロースゲル電気泳動上で良好な完全性を維持していた。ハウスキーピング遺伝子は常に強いハイブリダイゼーションシグナルを示したが、陰性対照スポットは全くハイブリダイズしなかった。Ｐｌにおいてアップレギュレートされている遺伝子についてのスクリーニング感度を最大にするために、以下の緩い基準を満たす１５１の候補遺伝子を選択した：少なくとも１つのＰｌ検体における３倍を超えるアップレギュレーション及びすべてのＰｌ検体における３分の１未満のダウレギュレーション。
【００３２】
これらの候補遺伝子について、インジェニュイティ・パスウェイ・アナリシス・プログラムを用いて２９の分子ネットワークを企図し、動脈硬化症との関係におけるそれらの新規性をPubMedデータベースによって検索した。ネットワークの大部分は、動脈硬化症と充分に関連づけられた遺伝子、例えばａｐｏＥ及び脂肪酸結合タンパクのような脂質代謝関連遺伝子；インターロイキン８のようなサイトカイン遺伝子；インスリン様成長因子１及び肝細胞成長因子を含む成長因子遺伝子；マトリックスメタロプロテアーゼ９及びトロンボモジュリンのようなその他のものであったが、マクロファージ−リンパ球相互作用及びアテローム発生において認識されたことが全くなかったエフォリン及びエフ、特にエフォリン−Ｂ類及びそれらの同族受容体であるエフＢ類からなるネットワークが発見された。
【００３３】
例２．定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子アップレギュレーションの確認
１０対のＣＥＡ検体すべてについて、１μgの全ＲＮＡをＤＮＡフリー（DNA-free）（Ambion, Austin, TX）で処理し、ランダムプライマー及びスーパースクリプト（SuperScript）II逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡに変換した（Higashikata et al., Atheroselerosis 177, 353-360(2004)）。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩプリズム７７００配列検出システム（ABI Prism 7700 Sequence Detection System）（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行なった。各標的遺伝子の発現レベルを、ＧＡＰＤＨのそれらに対して標準化した（Higashikata et al., Atheroselerosis 177, 353-360(2004)）。２つのケモカイン受容体、即ちＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４についてのプライマーセット及びＴａｑＭａｎプローブは、コンピュータプログラム「プライマー・エクスプレス（Primer Express）２．０」（PE Applied Biosystems）を用いて以下のように設計した：
【００３４】
ＣＸＣＲ２
フォワードプライマー：５’−ＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡ−３’（配列番号４３）；
リバースプライマー：５’−ＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡ−３’ （配列番号４４）；
ＴａｑＭａｎプローブ：５’−ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴ−３’）（配列番号４５）；及び
ＣＸＣＲ４
フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号４６）；
リバースプライマー：５’−ＡＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号４７）；
ＴａｑＭａｎプローブ：５’−ＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＡ−３’（配列番号４８）。
【００３５】
アッセイ・オン・デマンド（Assay-on-Demand）カクテルを、エフォリン−Ｂ１（Hs00270004_m1）、エフォリン−Ｂ２（Hs00187950_m1）、エフＢ１（Hs00174725_m1）、エフＢ２（Hs00362096_m1）、エフＢ３（Hs00177903_m1）及びエフＢ４（Hs00174752_m1）について用いた。各標的遺伝子について、２回の独立したアッセイを三連で行ない、平均発現レベルを算出した。
【００３６】
結果を図１に示す。ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４の２つのケモカイン受容体遺伝子の発現は、共にｒＮと比較してＰｌにおいて有意に高められていた（図１、パネルＡ）。したがって、これらの１０対のｒＮ及びＰｌｃＤＮＡが動脈硬化症関連遺伝子発現に関する非常に信頼できるデータを提供することが示された。
【００３７】
エフォリン−Ｂ類及びエフＢ類についての遺伝子発現レベルについては、エフォリン−Ｂ１（同、パネルＢ）及びエフＢ２（同、パネルＣ）は、ｒＮと比較してＰｌにおいて有意にアップレギュレートされていた。相対発現レベルは以下のとおりであった（ｒＮ対Ｐ１、ｎ＝１０）：エフォリン−Ｂ１について、０．６３８±０．１０６対０．８３１±０．１５２、ｐ＜０．０５；エフＢ２について１．２９６±０．２８１対２．２３３±０．５０６、ｐ＜０．０５。したがって、プラーク領域におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を解析した。
【００３８】
例３．免疫組織化学による動脈硬化症プラークにおけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の局在
固定したＣＥＡ検体をパラフィン包埋し、厚さ３μmの切片を作製した。調製物の完全性の評価のために、これらの切片を、マウス抗ＣＤ６８抗体（１：３００希釈）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ共役エンビジョン・システム（Envision system）（PO-Envision, DAKO）及び基質として３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた間接法により染色した。
【００３９】
エフォリン−Ｂ１及びＣＤ６８の二重免疫組織化学染色のためには、まず切片を抗ＣＤ６８抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて褐色の沈澱物として染色した。続いて、同じ切片を、ウサギ抗エフォリン−Ｂ１抗体（１：３００希釈）と共にインキュベートし、アルカリホスファターゼ共役エンビジョン・システム（AP-Envision, DAKO）及び基質としてニュー・フクシン（New Fuchsin）（DAKO）を用いて赤色の沈殿物として染色した。エフォリン−Ｂ１及びＣＸＣＲ４の二重免疫染色のためには、まず切片を抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。同じ切片を、次にウサギ抗ＣＸＣＲ４抗体（１：１００希釈）と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。エフォリン−Ｂ１及びＳＭＡの二重免疫染色のためには、まず切片を抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。同じ切片を、次にマウス抗ＳＭＡ抗体（１：３００希釈）と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。エフォリン−Ｂ１及びＣＤ４、又はエフォリン−Ｂ１及びＣＤ８の二重免疫染色のためには、切片を０．０１mol／Lクエン酸緩衝液（pH６．０）中で１２１℃で５分間オートクレーブ処理し、ＣＤ４又はＣＤ８抗原を露出させた。露出させた切片を、抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。同じ切片を、次にマウス抗ＣＤ４抗体（１：４０希釈）又はマウス抗ＣＤ８抗体（１：４０希釈）と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。
【００４０】
エフＢ２及びＣＤ６８の二重免疫染色のためには、切片を、まずヤギ抗エフＢ２抗体（１：５０希釈）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ共役ヒストファイン・マックス−（Ｇ）・システム（Histofine MAX-(G) system）（Nichirei, Tokyo, Japan）及びＤＡＢで処理した。同じ切片を、次に抗ＣＤ６８抗体と共にインキュベートし、AP-Envision及びNew Fuchsinを用いて処理した。エフＢ２及びＣＤ４、又はエフＢ２及びＣＤ８の二重免疫染色のためには、露出された切片を、まず抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体と共にインキュベートし、PO-Envision及びＤＡＢを用いて処理した。次に、同じ切片を、まずヤギ抗エフＢ２抗体と、後にビオチン化ブタ抗ヤギＩｇＧ抗体（１：１００希釈）と共にインキュベートし、アルカリホスファターゼ共役ＬＳＡＢ２キット（DAKO）及びNew Fuchsinを用いて処理した。これらのすべての調製物は、ヘマトキシリンで対染色し、アクシオカム（AxioCam）ＣＣＤカメラを装着したアクシオフォト２（Axiophot2）光学顕微鏡（Carl Zeiss, Hallbergmoos, Germany）で検査した。
【００４１】
結果を図２及び図３に示す。全単球／マクロファージについてのマーカーであるＣＤ６８についての単独染色によって、コレステロール・クレフト（cholesterol clefts）をとりまくＣＤ６８陽性泡沫細胞が見出された（図２、パネル(Ａ)）。したがって、検体が典型的なアテローム性動脈硬化症の特徴を有し、それを維持していることが示された。
単独染色によって種々の形態の細胞においてエフォリン−Ｂ１又はエフＢ２様の免疫反応性が見出されたので、二重免疫組織化学染色を行なってエフォリン−Ｂ１又はエフＢ２を発現する正確な細胞タイプを明らかにした。
【００４２】
エフォリン−Ｂ１免疫反応性は、以下の細胞タイプにおいて見出された：マクロファージ様細胞及びＣＤ６８陽性泡沫細胞（同、パネル（Ｂ））；ＳＭＡ（平滑筋細胞のマーカー）陽性長型細胞（elongated cells）（同、パネル（Ｄ））；ＣＤ４（ヘルパーＴ−リンパ球のマーカー）陽性小細胞（small cells）（同、パネル（Ｅ））；ＣＤ８（キラー又はサプレッサーＴ−リンパ球のマーカー）陽性小細胞（同、パネル（Ｆ））。
【００４３】
一方、エフＢ２についての免疫反応性は、以下の細胞タイプにおいて見出された：マクロファージ様細胞及びＣＤ６８陽性泡沫細胞（図３、パネル（Ａ））；ＣＤ４陽性小細胞（同、パネル（Ｂ））；ＣＤ８陽性小細胞（同、パネル（Ｃ））。
【００４４】
即ち、エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の両方が、プラーク領域内でマクロファージ及びＴ−リンパ球において見出された。また、エフォリン−Ｂ１及びＣＸＣＲ４の両方を発現する多くのマクロファージ様細胞（図２、パネル（Ｃ））及びリンパ球様細胞も見出された（データは示していない）。
【００４５】
例４．健常ヒト成人の末梢血単球及びＴ−リンパ球におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現
健常ヒト成人の末梢血中に循環している静止状態の（resting）単球及びＴ−リンパ球においてもエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２が発現されているかどうかを調べた。単核細胞を、健常成人志願者の全血（２００mL）からリンフォプレップ（Lymphoprep）試薬（Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway）を用いて分離し、以前記載されたように、対流遠心エルトリエーション（counterflow centrifugal elutriation）（R5E elutriation system, 日立工機、茨城県）に供した(Terui et al., J. Immunol. 156, 1981-1988(1996))。この単球富化（enriched）画分からの細胞を、マウス抗ＣＤ６８抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 488−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。これらの細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI; Molecular Probes）で対染色し、Axiophot2 落斜蛍光（epifluorescence）顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて単球の純度について調べた。
【００４６】
ＣＤ６８及びエフォリン−Ｂ１の二重免疫染色のために、この単球富化細胞をまずマウス抗ＣＤ６８抗体及びウサギ抗エフォリン−Ｂ１抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 546−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体（１：６００希釈）及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ抗体（１：６００希釈）と共にインキュベートした。ＣＤ６８及びエフＢ２の二重免疫蛍光染色のためには、これらの細胞を、まずマウス抗ＣＤ６８抗体及びヤギ抗エフＢ２抗体と共にインキュベートし、次にAlexa 546−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体及びAlexa 488−コンジュゲート化抗ヤギＩｇＧ抗体（１：６００希釈）と共にインキュベートした。
【００４７】
これらの単球富化細胞からｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった：
【００４８】
エフォリン−Ｂ１
フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号４９）；
リバースプライマー：５’−ＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＣＡＡＣ−３’配列番号５０）；
エフＢ２
フォワードプライマー：５’−ＧＡＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣ−３’（配列番号５１）；
リバースプライマー：５’−ＴＴＧＣＧＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号５２）；及び
ＧＡＰＤＨ
フォワードプライマー：５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号５３）；
リバースプライマー：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号５４）。
【００４９】
ＰＣＲは、以下の条件下でＥｘＴａｑ（Takara, Tokyo, Japan）を用いて行なった：プレヒート、９４℃、２分間；３５サイクルの増幅、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で４０秒。フォワード及びリバースプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによるゲノムの増幅を排除するように各標的遺伝子の分離したエクソン中で設計した。
【００５０】
リンパ球富化細胞フラクションについて、ＣＤ４及びエフォリン−Ｂ１、ＣＤ４及びエフＢ２、ＣＤ８及びエフォリン−Ｂ１、及びＣＤ８及びエフＢ２に関する二重免疫蛍光試験を同様に行なった。
【００５１】
結果を図４及び図５に示す。健常成人志願者由来の単球は、対流遠心エルトリエーションシステムによって＞９０％の純度まで富化された（図４、パネル（Ａ））。エフォリン−Ｂ１（同、パネル（Ｂ））及びエフＢ２（同、パネル（Ｃ））の両方についての免疫反応性が、ＣＤ６８陽性細胞において観察された。また、ＲＴ−ＰＣＲによってこの単球富化ｃＤＮＡからエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の確固たる生成物が得られた（同、パネル（Ｄ））。Ｔ−リンパ球については、ＣＤ４陽性細胞は、エフォリン−Ｂ１（図５、パネル（Ａ））及びエフＢ２（同、パネル（Ｂ））の両方を発現した。ＣＤ８陽性Ｔ−リンパ球もまた、エフォリン−Ｂ１（同、パネル（Ｃ））及びエフＢ２（同、パネル（Ｄ））の両方を発現した。これらのデータは、エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の両方が健常ヒト成人の末梢血中の循環している単球及びＴ−リンパ球において発現されることを明らかに示した。
【００５２】
例５．ＲＴ−ＰＣＲによる炎症細胞におけるエフォリン遺伝子群の発現の検出
ＰＣＲ反応における鋳型として、ＴＨＰ−１細胞、Jurkat細胞、内皮細胞の各々からＲＮＡを抽出し、クオンティテクト逆転写（QuantiTect Reverse Transcription）キット（QIAGEN、カタログNo.205311）を用いて逆転写酵素を添加して又は添加せずにｃＤＮＡを作製した。具体的には、各ＲＮＡを、０．５mLのチューブ中で合計１４μL（７×ｇＤＮＡ Wipeout Buffer ２．０μL、ＲＮａｓｅ無含有水とＲＮＡ（１０pg〜１μg）との合計１２μL）の反応液中で４２℃で２分間インキュベートした後、氷冷し、ＤＮａｓｅ処理した。次に、ＤＮａｓｅ処理後のチューブに反応液のカクテル（５×Quantiscript RT Buffer ４μL、RT Primer Mix １．０μL、Quantiscript Reverse Transcriptase １．０μLの合計６μL）を入れて、ｃＤＮＡ合成を行なった。ｃＤＮＡ合成を行なわない逆転写酵素なし（ＲＴ（−））にはＤＥＰＣ水を６μL加え、合計２０μLにした。この反応液を４２℃で１５分間インキュベートした後、９５℃で３分間加熱して酵素を不活化した。
【００５３】
この各ｃＤＮＡをサンプルとして使用して、ＰＣＲを行なった。反応液の組成は、オートクレーブ水 ６．６５μL、Ex Buffer １．０μL、ｄＮＴＰ ０．８μL、以下に示す各プライマー対（１０μM） １．０μL、サンプル ０．５μL、Ex Taq ０．０５μL（合計１０μL）であった。陽性対照として、Ｈｅｌａ細胞由来のヒトゲノムＤＮＡ ５０ng／μLを用いて同様に反応を行なった（反応液組成：オートクレーブ水 ６．１５μL、Ex Buffer １．０μL、ｄＮＴＰ ０．８μL、各プライマー対（１０μM） １．０μL、サンプル １．０μL、Ex Taq ０．０５μL；合計１０μL）。
【００５４】
以下のいずれかのＰＣＲ条件を用いた。［１］：９４℃、２分（熱変性）の後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回又は３５回行ない、４℃で保存する；［２］：９４℃で２分（熱変性）の後、９４℃で２０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回又は３５回行ない、４℃で保存する。
【００５５】
［１］の条件で用いたプライマーは、
ephrin-A1 F及びR（配列番号１及び２）
ephrin-A2 F3及びR3（配列番号３及び４）
ephrin-A3 F2及びR（配列番号５及び６）
ephrin-A4 F及びR（配列番号７及び８）
ephrin-A5 F及びR（配列番号９及び１０）
EphA1 F及びR（配列番号１１及び１２）
EphA4 F及びR（配列番号１７及び１８）
EphA5 F及びR（配列番号１９及び２０）
EphA6 F及びR（配列番号２１及び２２）
Ephrin-B1 F及びR（配列番号２７及び２８）
EphB4 F及びR（配列番号３９及び４０）；
【００５６】
［２］の条件で用いたプライマーは、
EphA2 F及びR（配列番号１３及び１４）
EphA3 F及びR（配列番号１５及び１６）
EphA7 F及びR（配列番号２３及び２４）
EphA8 F及びR（配列番号２５及び２６）
ephrin-B2 F及びR（配列番号２９及び３０）
ephrin-B3 F及びR（配列番号３１及び３２）
EphB1 F及びR（配列番号３３及び３４）
EphB2 F及びR（配列番号３５及び３６）
EphB3 F及びR（配列番号３７及び３８）
EphB6 F及びR（配列番号４１及び４２）
であった（Ｆ＝フォワード、Ｒ＝リバース）。
【００５７】
ＰＣＲ産物は、４％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して確認した（泳動前、３００ｖ、４００mAで３０分プレランした後、３００ｖ、４００mAで３５分泳動した。）
【００５８】
結果を図６〜１１に示す。図６〜１１において、×３０及び×３５はＰＣＲのサイクル（それぞれ３０回及び３５回）を示している。×３０でバンドを認めたものは高発現、×３５でもバンドを認めないものは検出限界以下、と考えることができる。
【００５９】
図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＡ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。ＴＨＰ−１細胞において、エフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ２、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフォリン−Ａ５、エフＡ１、エフＡ２、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ７は発現し、中でもエフォリン−Ａ４、エフＡ６は高発現していると考えられる。
【００６０】
図７は、ＴＨＰ−１細胞におけるＢ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。ＴＨＰ−１細胞において、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ３、エフＢ４、エフＢ６は発現し、中でもエフォリン−Ｂ１、エフＢ１、エフＢ４、エフＢ６は高発現していると考えられる。
【００６１】
図８は、Jurkat細胞におけるＡ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。Jurkat細胞において、エフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフＡ１、エフＡ２、エフＡ３、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ８は発現し、中でもエフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフＡ１、エフＡ３は高発現していると考えられる。
【００６２】
図９は、Jurkat細胞におけるＢ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。Jurkat細胞において、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ３、エフＢ４、エフＢ６が発現し、中でも、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ４、エフＢ６は高発現していると考えられる。
【００６３】
図１０は、冠動脈由来の血管内皮細胞におけるＡ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。血管内皮細胞において、エフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ２、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフォリン−Ａ５、エフＡ２、エフＡ３、エフＡ４、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ７、エフＡ８は発現し、中でもエフォリン−Ａ１、エフォリン−Ａ３、エフォリン−Ａ４、エフォリン−Ａ５、エフＡ２、エフＡ４、エフＡ５、エフＡ６、エフＡ７、エフＡ８は高発現していると考えられる。
【００６４】
図１１は、冠動脈由来の血管内皮細胞におけるＢ群のエフォリンとエフの発現を検討したものである。血管内皮細胞において、エフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフォリン−Ｂ３、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ４、エフＢ６は発現し、中でもエフォリン−Ｂ１、エフォリン−Ｂ２、エフＢ１、エフＢ２、エフＢ４、エフＢ６は高発現していると考えられる。
【００６５】
例６．化学遊走調節能の試験
実験の前日に、ヒト単球由来のＴＨＰ−１細胞を、４×１０５個／mL（２．４×１０６個／dish）の濃度で直径１０cmの丸シャーレに播いた。実験までの培養時間は約１５時間であった。
【００６６】
一方、フィルターのコーティングは以下のようにして行なった。Transwell（Corning、カタログ番号３４２１、ウェルの直径６．５cm、小孔の大きさ５．０μm）を必要枚数取り出し、中央のウェルにあるフィルターを外側のウェルにピンセットで移動させた。フィルターの中に、５μg／mLのＩｇＧ−Ｆｃ（Athens Research Technology, Athens, GA, USA）、エフォリン−Ｂ１（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）又はエフＢ２（R&D Systems）を含むコーティング溶液（各々ストック溶液（それぞれ３．３９mg／mL、５００μg／mL又は５００μg／mL）をＰＢＳで希釈したもの）を１００μL／well入れた。ＵＶ照射したクリーンベンチの中で、室温で一晩コーティングした。
【００６７】
翌日、コーティングしたTranswellのフィルターを、ＰＢＳで３回リンスした。０．１μg／mLのケモカイン（ＳＤＦ−１；１０μg／mLのストック溶液を化学遊走用緩衝液（Chemotaxis Buffer：ＲＰＭＩ１６４０／０．１％ＢＳＡ）で１００倍希釈したもの）を、Transwellの下層ウェルに６００μL／well分注した。対照として化学遊走用緩衝液を６００μL／well分注したウェルも用意した。これらの下層ウェルに、フィルターをフィルターの下に空気が入らないように静かにのせた。このフィルターの中（上層ウェル）に、コールターカウンターで計測し、１×１０５個／１００μLの濃度に調整した細胞を１００μL／well分注した。
【００６８】
３７℃のＣＯ２インキュベータに入れ、２時間静置し、細胞を遊走させた。その後、上層ウェルの細胞液（遊走しなかった細胞を含む）を１００μL／well静かに除き、別のウェルに移した。フィルターはそのままで、Transwellプレートをボルテックス（vortex）ミキサーに１０秒間かけ（目盛は３．５でＯＮにし、動いているvortexにプレートをのせる）フィルターの穴に入っている細胞を落とした。さらに、Transwellプレートを２０００rpmで２分間遠心分離し、フィルターに付着している細胞を落とした後、下層に移動した細胞の総数をコールターカウンターを用いて、計数した。
【００６９】
結果を図１２に示す。図１２は、ヒト単球由来の細胞株であるＴＨＰ−１細胞の化学遊走に及ぼすエフォリン−Ｂ１とエフＢ２の影響を示したものである。下層の培養液にＳＤＦ−１を添加した場合、エフォリン−Ｂ１とエフＢ２は共にＴＨＰ−１細胞のＳＤＦ−１による化学遊走を有意に抑制した。なお、ＳＤＦ−１を添加しない場合（自発遊走）についても同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ヒト頚動脈動脈内切除術検体から調製したｃＤＮＡの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。（Ａ）はケモカイン受容体、（Ｂ）はエフォリン−Ｂ類、（Ｃ）はエフＢ類を表す。データは、三連で行なった２回の独立した実験における平均±ＳＥを表す。Ｐ値は対応のあるｔ−検定(ｎ＝１０）により算出した。ｒＮ＝比較的正常な領域、Ｐｌ＝動脈硬化症プラーク。
【図２】図２は、ヒト頚動脈の動脈硬化症プラークにおけるエフォリン−Ｂ１の局在を示す図である。単独の（パネル（Ａ））又は二重の（パネル（Ｂ）〜（Ｆ））免疫組織化学染色は実施例に記載したとおりに行なった。（Ａ）：多数のＣＤ６８（褐色）陽性泡沫細胞がcholesterol cleftsの周囲に観察された。（Ｂ）：エフォリン−Ｂ１（赤色）及びＣＤ６８（褐色）。（Ｃ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＣＸＣＲ４（赤色）。矢印は、内弾性板を示す。（Ｄ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＳＭＡ（赤色）。（Ｅ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＣＤ４（赤色）。ＮＣ＝壊死中核（necrotic core）。（Ｆ）：エフォリン−Ｂ１（褐色）及びＣＤ８（赤色）。ＮＣ＝necrotic core。各パネルについて、矢印によって示す高倍率の図を囲みの中に示す。バーは２０μmである。
【図３】図３は、ヒト頚動脈の動脈硬化症プラークにおけるエフＢ２の局在を示す図である。二重免疫組織化学染色は実施例に記載したとおりに行なった。（Ａ）：エフＢ２（褐色）及びＣＤ６８（赤色）。（Ｂ）：エフＢ２（赤色）及びＣＤ４（褐色）。（Ｃ）：エフＢ２（赤色）及びＣＤ８（褐色）。各パネルについて、矢印によって示す高倍率の図を囲みの中に示す。バーは２０μmである。
【図４】図４は、健常ヒトからの末梢血単球におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を示す図である。対流遠心エルトリエーションシステムを用いて健常志願者の末梢血単球を富化した。（Ａ）：ＣＤ６８は、ＤＡＰＩで染色した細胞の＞９０％で陽性であった。バーは２０μmである。（Ｂ）、（Ｃ）：エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を二重免疫蛍光試験によって解析したもの。(左)＝ＣＤ６８。（中央）＝エフォリン−Ｂ１（Ｂ）及びエフＢ２（Ｃ）。（右）＝ＣＤ６８及びエフォリン−Ｂ１（Ｂ）又はＣＤ６８及びエフＢ２（Ｃ）についての結合した像。バーは２０μmである。（Ｄ）：エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＭＯ＝単球富化細胞、ＮＣ＝陰性対照（鋳型なし）、ＰＣ＝陽性対照(動脈硬化症プラーク)。生成物のサイズは、エフォリン−Ｂ１が５０２塩基対（bp）、エフＢ２が５１５bp、ＧＡＰＤＨが４５２bpであった。
【図５】図５は、健常ヒトからの末梢血Ｔ−リンパ球におけるエフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現を示す図である。エフォリン−Ｂ１及びエフＢ２の発現は、二重免疫蛍光試験によって解析した。（Ａ）、（Ｂ）：（左）＝ＣＤ４。（中央）＝エフォリン−Ｂ１（Ａ）及びエフＢ２（Ｂ）。（右）＝ＣＤ４及びエフォリン−Ｂ１（Ａ）又はＣＤ４及びエフＢ２（Ｂ）についての結合した像。（Ｃ）、（Ｄ）：（左）＝ＣＤ８。（中央）＝エフォリン−Ｂ１（Ｃ）及びエフＢ２（Ｄ）。（右）＝ＣＤ８及びエフォリン−Ｂ１（Ｃ）又はＣＤ８及びエフＢ２（Ｄ）についての結合した像。バーは２０μmである。
【図６】図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＡ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。以下の説明は図６〜１１について共通である。プライマーとしては、各パネルの左側に記したプライマー対を使用した。各パネルにおいて、レーン「１」＝ｃＤＮＡ、レーン「２」＝鋳型なし（逆転写酵素なし；ＤＮａｓｅ処理）のＲＮＡ、レーン「３」＝ゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型として用いた。「×３０」及び「×３５」はＰＣＲにおける温度サイクルがそれぞれ３０回及び３５回であることを表す。
【図７】図７は、ＴＨＰ−１細胞におけるＢ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図８】図８は、Jurkat細胞におけるＡ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図９】図９は、Jurkat細胞におけるＢ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図１０】図１０は、内皮細胞におけるＡ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図１１】図１１は、内皮細胞におけるＢ群のエフォリン及びエフ遺伝子の増幅を示す図である。
【図１２】図１２は、ＴＨＰ−１細胞を用いた化学遊走試験の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤。
【請求項２】
炎症細胞がＴ−リンパ球、単球及びそれらに由来する株細胞から選択される、請求項１記載の化学遊走調節剤。
【請求項３】
エフォリン及び／又はエフが、Ｂ群エフォリン及びエフから選択される、請求項１又は２記載の化学遊走調節剤。
【請求項４】
インビトロで炎症細胞にエフォリン及び／又はエフを添加することを含む、炎症細胞の化学遊走を抑制する方法。
【請求項５】
炎症細胞を化学遊走が起こり得る条件下でエフォリン及び／又はエフと被検物質との存在下でインビトロで培養する工程、及び前記炎症細胞の化学遊走の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べる方法。
【請求項６】
炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器であって、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面にエフォリン及び／又はエフが固定化されていることを特徴とする培養容器からなる、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具。
【請求項７】
炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び／又はエフを含むコーティング溶液、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液を含む、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験キット。
【請求項８】
増幅される領域が１つのエクソンの一部又は全部に相当するように設計されている、エフォリン又はエフ遺伝子群、又はその転写物に由来する核酸を増幅するためのプライマー対。
【請求項９】
プライマー対の各プライマーが、以下の配列の対からなる群から選択される配列を有する、請求項８記載のプライマー対：配列表の配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び４２、配列番号４９及び５０、配列番号５１及び５２。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のプライマー対と、鋳型として細胞又は組織由来ＲＮＡとを用いてＰＣＲ法を行なうことを特徴とする、エフォリン及び／又はエフの発現に基づいて前記細胞又は組織における炎症の有無又は程度を評価する方法。
【請求項１】
エフォリン及び／又はエフからなる炎症細胞の化学遊走調節剤。
【請求項２】
炎症細胞がＴ−リンパ球、単球及びそれらに由来する株細胞から選択される、請求項１記載の化学遊走調節剤。
【請求項３】
エフォリン及び／又はエフが、Ｂ群エフォリン及びエフから選択される、請求項１又は２記載の化学遊走調節剤。
【請求項４】
インビトロで炎症細胞にエフォリン及び／又はエフを添加することを含む、炎症細胞の化学遊走を抑制する方法。
【請求項５】
炎症細胞を化学遊走が起こり得る条件下でエフォリン及び／又はエフと被検物質との存在下でインビトロで培養する工程、及び前記炎症細胞の化学遊走の程度を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べる方法。
【請求項６】
炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器であって、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面にエフォリン及び／又はエフが固定化されていることを特徴とする培養容器からなる、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験具。
【請求項７】
炎症細胞の通過が可能な隔壁によって区分された少なくとも２つの培養区画を有する培養容器、前記隔壁の表面又は一方の培養区画の表面に固定化するためのエフォリン及び／又はエフを含むコーティング溶液、他方の培養区画に添加するためのケモカイン溶液を含む、被検物質による炎症細胞の化学遊走調節能を調べるための試験キット。
【請求項８】
増幅される領域が１つのエクソンの一部又は全部に相当するように設計されている、エフォリン又はエフ遺伝子群、又はその転写物に由来する核酸を増幅するためのプライマー対。
【請求項９】
プライマー対の各プライマーが、以下の配列の対からなる群から選択される配列を有する、請求項８記載のプライマー対：配列表の配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４、配列番号１５及び１６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０、配列番号２１及び２２、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０、配列番号３１及び３２、配列番号３３及び３４、配列番号３５及び３６、配列番号３７及び３８、配列番号３９及び４０、配列番号４１及び４２、配列番号４９及び５０、配列番号５１及び５２。
【請求項１０】
請求項８又は９記載のプライマー対と、鋳型として細胞又は組織由来ＲＮＡとを用いてＰＣＲ法を行なうことを特徴とする、エフォリン及び／又はエフの発現に基づいて前記細胞又は組織における炎症の有無又は程度を評価する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−２５９８２９（Ｐ２００７−２５９８２９Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９２７１５（Ｐ２００６−９２７１５）
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本循環器学会、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．７０ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ、 ２００６年３月１日
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本循環器学会、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．７０ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ、 ２００６年３月１日
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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