エンテロウイルス感染症の診断薬および予防・治療用薬剤
【課題】ＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶの感染および増殖の阻害物質スクリーニング方法、前記ＨＥＶ感染の診断方法、および、前記ＨＥＶ感染症の予防または治療する薬剤を提供すること。
【解決手段】ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターを用い、そのＨＥＶとの結合を検出することにより、ＨＥＶの感染を診断することができる。また、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶとの結合を阻害する物質を含有する薬剤をＨＥＶ感染症の患者あるいは健常者に投与することによって、ＰＳＧＬ−１レセプターを介するＨＥＶの感染を予防あるいは治療することができる。
【解決手段】ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターを用い、そのＨＥＶとの結合を検出することにより、ＨＥＶの感染を診断することができる。また、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶとの結合を阻害する物質を含有する薬剤をＨＥＶ感染症の患者あるいは健常者に投与することによって、ＰＳＧＬ−１レセプターを介するＨＥＶの感染を予防あるいは治療することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウイルス感染症診断薬および予防・治療用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトエンテロウイルス(以下、ＨＥＶとも称する)はピコルナウイルス属エンテロウイルス科に属する。ＨＥＶ遺伝子のＰ１領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４の４つの領域から構成され、構造タンパク質（カプシド）をコードしている。ＨＥＶはそのＶＰ１領域がコードするアミノ酸の部分配列に従って、ＨＥＶ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４種に大別される（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ＨＥＶ−Ａに属するウイルスの中で、エンテロウイルス７１型（ＨＥＶ７１）およびコクサッキーウイルスＡ１６型（ＣＡ１６）は手足口病の主要原因ウイルスとして知られており、特にＨＥＶ７1はしばしば急性脳炎等の死亡に至る重篤な神経合併症をも引き起こす(例えば、非特許文献２、３参照)。ＨＥＶ７１感染症は、特に、中国、マレーシア、台湾などのアジア諸国で度々流行し、死亡例も報告されている（例えば、非特許文献２、４、５参照）。
【０００４】
しかしながら、現在までのところ、ＨＥＶ７１およびＣＡ１６の感染の迅速な診断方法、および、その感染症の有効な予防・治療薬はなく、その開発が待ち望まれている。
【非特許文献１】Oberste MS. et al., Journal of Virology, 73: 1941-1948 (1999)
【非特許文献２】McMinn PC, FEMS Microbiology Review, 26: 91-107 (2002)
【非特許文献３】Arita M. et al., Journal of Virology, 82: 1787-1797 (2008)
【非特許文献４】Cardosa M. J. et al., Emerging Infections Diseases, 9: 461-468 (2003)
【非特許文献５】Arita M. et al., Journal of Virology, 81: 9386-9395 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、エンテロウイルス感染症の診断薬、予防・治療用薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＨＥＶがＰＳＧＬ−１レセプターに特異的に結合すること、さらに、ＨＥＶがこのＰＳＧＬ−１レセプターを介して宿主細胞に感染、増殖することを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
すなわち、本発明に係る細胞はヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現していることを特徴とする。この細胞は、２９３Ｔ細胞株、あるいは、Ｌ細胞株由来であってもよい。
【０００８】
さらに、本発明に係る検出方法は、ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部とＨＥＶの結合を検出することを特徴とする。この検出方法は、上述のヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現している細胞と、ＨＥＶとを接触させ、当該細胞がＨＥＶ非感染細胞と比較して変形しているか否かを検出する工程を含んでもよい。
【０００９】
本発明に係る薬剤は、ＨＥＶ感染症を治療または予防するための薬剤である。この薬剤は、ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部、ＰＳＧL−１レセプターのＨＥＶへの結合阻害抗体、または、チロシン硫酸化阻害物質、を含有することを特徴とする。ここで、阻害抗体は、ＫＰＬ１であってもよい。
【００１０】
上記ＨＥＶは、ＨＥＶ−Ａであってもよく、さらにＨＥＶ−ＡはＨＥＶ７１またはＣＡ１６であってもよい。さらに、ＨＥＶ７１の構造タンパク質のアミノ酸配列の初めから７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であってもよく、グリシンまたはグルタミンであってもよい。なお、ここで、「構造タンパク質」とは、ＨＥＶ７１遺伝子のＰ１遺伝子領域がコードするカプシドタンパク質を指す。
【００１１】
また、本発明に係る哺乳動物は、ヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを発現していることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
＝＝ヒトエンテロウイルス＝＝
本発明の対象であるＨＥＶはＨＥＶ−Ａであることが好ましく、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であればより好ましい。ＨＥＶ７１は、天然の株であっても、人為的に株化された株であってもよいが、その構造タンパク質のアミノ酸配列の初めから７１０番目のアミノ酸（ＶＰ１遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の、初めから１４５番目該当する）がグルタミン酸以外のアミノ酸であることが好ましく、グリシンあるいはグルタミンであればより好ましい。そのようなＨＥＶ７１として、ＨＥＶ７１ ＳＫ−ＥＶ００６株、ＨＥＶ７１ Ｃ７／Ｏｓａｋａ株、ＨＥＶ７１ １０９５株、ＨＥＶ７１ ７５−Ｙａｍａｇａｔａ株が例示できる。ＨＥＶ７１ ＳＫ−ＥＶ０００６株の構造タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１６】
＝＝ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部とＨＥＶとの結合を検出する方法＝＝
本発明に係る検出方法は、ＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部とＨＥＶとの結合を検出する方法である。
【００１７】
また、この検出方法の対象となるＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部は、ＨＥＶに結合することができることから、ヒトあるいはサル由来である。
【００１８】
このＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質は、その由来・取得・調製法によって特に制限されず、天然のポリペプチドであっても、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えポリペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したポリペプチドであってもよい。天然のポリペプチドは、単離せずに用いても、タンパク質の単離・精製法を適宜組み合わせることにより、ＰＳＧＬ−１レセプターを発現している細胞から単離してもかまわない。化学合成によりＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ-ブチルオキシカルボニル法）等の当業者に周知の化学合成法に従って製造することができる。また、各種市販のペプチド合成機を利用してＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を製造することもできる。遺伝子組換え技術によりペプチドを調製する場合には、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターをコードするＤＮＡ断片を好適な発現ベクターに導入した後、培養細胞等の宿主を形質転換し、ペプチドを発現させればよい。
【００１９】
ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部は、配列番号１３における４２〜６１番目のアミノ酸配列を有する領域を含有していればよく、例えば、細胞外ドメイン、細胞外ドメイン＋膜貫通ドメインなどが挙げられる。
【００２０】
ＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部は、ペプチドタグや他のペプチドとのキメラタンパク質になっていてもよい。例えば、細胞外ドメインの少なくとも一部がヒト由来であり、このアミノ酸配列はＫＰＬ１認識領域を含むことがより好ましい。そのＣ末端側が、ヒト以外の哺乳動物のＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質のＣ末端側アミノ酸配列、あるいは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の異種タンパク質を含む。このヒト以外の哺乳動物は、キメラＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を作製できる範囲で特に制限はないが、マウスであることが好ましい。非膜結合性ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターキメラタンパク質は、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃキメラタンパク質であることがより好ましい。
【００２１】
結合の検出は、in vivoで行われても、in vitroで行われても構わない。検出に際しては、ＰＳＧＬ−１レセプターまたはその一部とＨＥＶとのいずれか一方又は両方を、ペプチドタグ、放射性同位元素、金属分子などで標識し、その標識を検出することにより、結合を検出できる。あるいは、いずれかを認識する抗体を用いても、結合を検出できる。
【００２２】
in vivoの場合、サルを感染モデルとし、その症状が現れることを示標として、結合を検出してもよい。in vitroでは、定法に従い、一方を、赤血球等の天然の担体、ラテックス等の人工の粒子、あるいはカラムなどの担持体に結合させ、標識した他方を担持体に接触させたとき、標識が担持体で検出されることを示標に、結合を検出できる。あるいは、ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現している細胞に対し、標識したＨＥＶを投与し、標識が細胞表面で検出されることを示標に、結合を検出してもよい。この場合、ＨＥＶを投与後、その細胞が非感染細胞の形態と比較して変形することを顕微鏡下で検出することによって、結合を検出してもよい。この際、「非感染細胞」は、ＨＥＶ感染前の同一の細胞であっても、非感染の非同一細胞であってもよい。ここで用いる細胞は特に限定されないが、例えば、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現させた遺伝子組み換え細胞を用いることができる。
【００２３】
外来性ＰＳＧＬ−１レセプターとは、細胞が固有に有する内在性ＰＳＧＬ−１遺伝子ではなく、人為的に遺伝子導入またはタンパク質導入によって、細胞外から導入された遺伝子またはタンパク質に由来するＰＳＧＬ−１レセプターをいう。人為的に導入されれば、その細胞の内在性ＰＳＧＬ−１遺伝子がコードするＰＳＧＬ−１タンパク質と同一のアミノ酸配列を有していてもよい。外来性ＰＳＧＬ−１レセプターのアミノ酸配列は、動物に由来する天然のアミノ酸配列そのままであっても、あるいは、ＨＥＶ結合活性を失わない範囲でアミノ酸の欠失、置換、付加があってもよい。また、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターは、タグなどのペプチドが付加された融合タンパク質であってもよい。
【００２４】
この細胞の作製に用いる細胞は、株化された培養細胞であっても、初代培養細胞であっても、外来性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を細胞表面に発現することができれば制限はない。この細胞の由来となる動物種は、特に制限されず、脊椎動物由来であっても昆虫由来であってもよいが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒトおよびサルを除く哺乳動物由来であることがより好ましく、ＨＥＶを結合するＰＳＧＬ−１レセプターを有しない動物、例えばマウス由来であればさらに好ましい。さらに、細胞が由来する組織に特に制限はない。また、用いる培養細胞としては、ＰＳＧＬ−１レセプター以外にＨＥＶとの結合能を有するレセプタータンパク質を持たない細胞が好ましいが、ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を含め一切のレセプタータンパク質を持たない細胞株がより好ましい。例えば、Ｌ細胞が例示できる。
【００２５】
外来性ＰＳＧＬ−１発現細胞を作製するには、細胞表面にＰＳＧＬ−１レセプターを発現させるため、例えば、ＰＳＧＬ−１レセプターを発現する発現ベクターを導入してもよい。あるいは、ＴＡＴペプチド等の細胞内移行ペプチド（ＰＴＤ）を用い、ＰＳＧＬ−１レセプターを直接細胞に導入してもよい。
【００２６】
このように、ＰＳＧＬ−１レセプター、または、ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部を含有させれば、ＨＥＶを結合させるための試薬として用いることができる。この試薬の、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターの状態は、ＨＥＶを結合できるようにその結合部位を露出している範囲内で特に制限はない。
【００２７】
これらの検出方法を利用して、ＨＥＶ感染の阻害物質のスクリーニングを行うことができる。例えば、候補となる阻害物質の存在下でＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶを接触させ、上記検出方法によって、それらの結合が検出されなくなる物質を同定することによって、ＨＥＶ感染の阻害物質を得ることができる。特に、細胞の変形は、ＨＥＶのＰＳＧＬ−１レセプターに対する結合だけでなく、ＨＥＶの感染および増殖を示すため、スクリーニングの際の結合の検出の示標として好ましい。
【００２８】
＝＝エンテロウイルス感染症を治療または予防する薬剤＝＝
ＨＥＶはＰＳＧＬ−１レセプターに結合することにより感染し、細胞内で増殖して疾患を発症させるため、ＨＥＶがＰＳＧＬ−１レセプターに結合することを阻害する阻害物質は、ＨＥＶ感染症を治療または予防する薬剤として用いることができる。ＨＥＶ感染の阻害物質としては、上記スクリーニングによって得ることができるが、それ以外にも、既知物質として、ＰＳＧＬ−１レセプター、ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部、ＨＥＶのヒトＰＳＧＬ−１レセプターへの結合阻害抗体、あるいは、チロシン硫酸化阻害剤、などが挙げられる。
【００２９】
ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部を含有する薬剤としては、親水性であるため非膜結合性タンパク質が好ましく、細胞内領域や疎水性の膜貫通領域などを含まないことが好ましい。
【００３０】
阻害抗体は、ヒトＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターのＨＥＶへの結合を阻害する抗体であれば制限はないが、ＰＳＧＬ−１レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸の全長または一部分を認識する抗体であることが好ましく、ＫＰＬ１であることがより好ましい。
【００３１】
また、チロシン硫酸化阻害剤は、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターの細胞外ドメインのチロシンＹ４６、Ｙ４８、Ｙ５１の硫酸化を阻害する物質であれば、特に制限がなく、これらのチロシン硫酸化のみを特異的に阻害する物質であっても、いずれのチロシンの硫酸化も非特異的に阻害する物質であってもよい。また、その阻害が直接的であっても間接的であってもよい。このチロシン硫酸化阻害剤は塩素酸ナトリウムであることが好ましい。
【００３２】
以上の薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は治療に適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよく、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、または固形注射剤等が挙げられる。本治療剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
【００３３】
ＨＥＶ感染症を治療または予防する薬剤を投与する対象の疾患は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物において、ＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶの感染または増殖によって引き起こされる疾患であれば限定されず、例えば手足口病や神経合併症であってもよく、神経合併症は脳炎であってもよい。
【００３４】
なお、ＨＥＶ感染症を治療または予防する薬剤の患者または患者動物へ、あるいは、健常人または健常動物への投与方法および投与量は、投与目的、剤形、患者の状態などに応じ、当業者が適宜選択可能である。
【００３５】
＝＝外来性ＰＳＧＬ−１レセプター発現哺乳動物＝＝
外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを発現する哺乳動物は、ＨＥＶが関与する疾患の疾患モデル動物として有用である。このモデル動物作製に用いられる、ヒトを除く哺乳動物は、ＰＳＧＬ−１レセプター結合性のＨＥＶへの感受性を持つサル以外の哺乳動物であることが好ましく、マウスであることがさらに好ましい。また、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターをキメラに発現するキメラ動物であっても、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターをゲノムに導入されたトランスジェニック動物であってもよい。
【００３６】
この疾患モデル動物作製方法は、当業者に周知の方法を用いればよい。簡潔には、受精卵、または初期胚の時期に、外来性ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質をコードするＤＮＡをインジェクターで導入することにより得られる（ＤＮＡ微量注入法）。その他、ＨＥＶ結合性ヒトＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するウイルスベクターを、４〜８細胞期胚に感染させ、胚盤胞まで発生させた後、代理母個体の子宮に戻す方法（ウイルスベクター法）、あるいは、ＤＮＡを導入したＥＳ細胞からキメラ動物を経てトランスジェニック動物を作製する方法（ＥＳ細胞法）、等を用いることができる。
【００３７】
疾患モデル動物は、例えば、ヒト臨床試験の前段階においてＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶのワクチンの安全性および有効性を検討するために用いることができる。対象となるワクチンは、ＨＥＶの予防または治療用ワクチンであれば特に制限されず、例えば不活性化ワクチンや弱毒化ワクチンでもよい。また、２つ以上の異なるワクチンを混合した混合ワクチンの評価に用いることもできる。
【実施例】
【００３８】
＝＝培養細胞株およびその培養条件＝＝
以下の実施例で用いる培養細胞株は、特記しない限り次の条件で培養する。ＲＤ細胞（米国疾病予防管理センターより分与）：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したEagle’s MEM培地（３７℃）；２９３Ｔ細胞（大阪大学・松浦善治より分与）、ＧＰ２−２９３細胞（Clontech社）：１０％ＦＣＳを添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium(ＤＭＥＭ)（３７℃）；Jurkat細胞（理研細胞バンク、RCB0806）：ＲＰＭＩ−１６４０培地（３４℃）；Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（マウス骨肉腫細胞株、Ｐ３Ｕ１）細胞（東京大学・明石博臣より分与）：ＲＰＭＩ−１６４０培地（３７℃）；マウスＬ細胞（国立感染症研究所ウイルス第三部より入手）、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１、Ｌ−ｂｓｄ細胞：５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ ＨＣｌ（Invitrogen社）および１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ（３４℃）。
【００３９】
＝＝宿主細胞へのウイルスの感染＝＝
下記の各実施例で用いられる細胞へのウイルスの感染の際、特に記載のない限り、宿主細胞を１０ ＣＣＩＤ５０／細胞 のウイルスと共に培地中で１時間インキュベートした。インキュベートは、上記のように各細胞に適した条件で行った。
【００４０】
＝＝ＨＥＶ７１結合試験およびフローサイトメトリー法＝＝
ＨＥＶ７１の結合試験のため、試験に供する細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ）緩衝液（２ｍＭＥＤＴＡ、２％ＦＣＳ、０.１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で一回洗浄後、上記培養条件に記載の培地５００μｌあたり０．１％ＮａＮ３を含むＨＥＶ７１（１×１０７ＣＣＩＤ５０）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。なお、本願実施例中で使用されるＨＥＶ７１−１０９５（国立感染症研究所ウイルス第二部萩原昭夫(元職員)より入手）は、株化されたＨＥＶ７１である。
【００４１】
インキュベーション終了後、細胞をＦＣ緩衝液で一回洗浄した。ＨＥＶ７１の検出のために、試験に供した細胞をAlexa Fluor 488 protein labeling kit (Invitrogen社)でラベルしたＭＡ１０５抗体（抗ＨＥＶ７１マウスＩｇＧ２ｂ、国立感染症研究所ウイルス第二部で作製、０．２５μg／５０μｌ）と共に氷上で３０分インキュベートした。２色フローサイトメトリーの場合には、さらに、ＰＳＧＬ−１を検出するために、細胞をZenon mouse IgG1 R-phycoerythrin labeling kit (Invitrogen社)でラベルしたＰＬ２抗体（抗ヒトＰＳＧＬ−１マウスＩｇＧ１、カタログ番号IM2091、Beckman-coulter社（０．５μg／５０μｌ）で標識した。過剰抗体を洗浄後、細胞をFACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences社）での測定に供した。 非膜結合性ＰＳＧＬ−１−Ｆｃ使用時には、前記ＦＣ緩衝液の代わりに、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２％ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳを用いた。
【００４２】
[実施例１]
本実施例では、ＨＥＶ感受性Jurkat細胞株のｃＤＮＡライブラリーからＰＳＧＬ−１レセプターを同定した。
【００４３】
＝＝ＨＥＶ７１コーティングペトリ皿の作製＝＝
１０μｇ／ｍｌ ＭＡ３５（国立感染症研究所ウイルス第二部で作製）を１０ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ ９．４）に溶解した溶液中で、ポルスチレン製ペトリ皿（Ina-optika社）を４℃で一晩インキュベートした。このペトリ皿を２％ＦＣＳ添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−２ＦＣＳ）で２回洗浄後、さらに室温で３０分、ＰＢＳ−２ＦＣＳ中でブロッキングした。このＭＡ３５コーティングペトリ皿に、１０ｍｌのＨＥＶ７１−１０９５液（１０８．６ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）を加え、室温で３０分インキュベートした。さらに、この上清を新しいＨＥＶ−１０９５液で交換し、この交換―インキュベートの工程を計３回繰り返した。その後、ペトリ皿を、１％パラホルムアルデヒドを含むＨＥＶ７１−１０９５液で３０分間、室温で固定した。
【００４４】
＝＝Jurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを保有するレトロウイルスの作製＝＝
ＨＥＶ７１結合性分子を高率で発現するJurkat細胞を選抜し、そのｃＤＮＡを保有するレトロウイルスを作製した。
【００４５】
Jurkat細胞を培地の入ったＨＥＶ７１コーティングペトリ皿に加え、１０７ 細胞／４ｍｌの密度で４℃で９０分培養した。非付着細胞は培地で洗い流し、付着細胞はさらに１週間培養を続けた。ここで、ＨＥＶ７１コーティングペトリ皿に付着したJurkat細胞はその細胞表面にＨＥＶ７１結合性分子を有する。この付着性Jurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを、Kitamura and Morikawa (Methods in Molecular Biology 134: 143-152, 2000)の方法を参考に作製した。この時、Jurkat細胞から抽出したｃＤＮＡの両端にEcoRIアダプターを接続し、pLIBベクター（Clontech社）のＥｃｏＲＩ制限酵素サイトに挿入して形質転換pLIBベクターを作製した。このベクターを、VSV-G（ウイルスエンベロープタンパク質）（Pantropic Retroviral Expression System（Clontech社））と共にＧＰ２−２９３細胞にトランスフェクトした。この共トランスフェクションにはLipofectamine 2000 regent (Invitrogen社)を使用した。このＧＰ２−２９３細胞を２日間培養し、培養液の上澄みを回収した。この上澄みにはJurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを保有するレトロウイルスが含まれる。
【００４６】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターの同定＝＝
上述のように取得したJurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを保有するレトロウイルスを、Ｐ３Ｕ１細胞に感染させた。この時、細胞に対する感染性ウイルスの相対量（Ｍ．Ｏ．Ｉ）は０．２であった。この感染Ｐ３Ｕ１細胞を前記のＨＥＶ７１をコーティングしたペトリ皿に播種し、４℃または３７℃で９０分インキュベートした。その後、ペトリ皿に付着しなかった細胞を洗い流し、付着した細胞は引き続き３７℃で６日間培養した。この培養で得られた全４つの細胞コロニーのゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、下記のpLIBベクター特異的プライマー（Sigma社にて受託合成）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この増幅ＤＮＡの配列を決定したところ、前記４つの細胞コロニーから抽出した各ＤＮＡから、ＰＳＧＬ−１レセプターの配列が得られた。
pLIB-S: agccctcactccttctctag（配列番号２）
pLIB-AS: acctacaggtggggtctttcattccc（配列番号３）
【００４７】
[実施例２]
本実施例では、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の特異的結合を示す。
【００４８】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプター発現２９３Ｔ細胞の作製＝＝
上述の、ＰＳＧＬ−１レセプター発現Ｐ３Ｕ１細胞（ＨＥＶ７１コーティングペトリ皿付着性Ｐ３Ｕ１細胞）から、DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen社、カタログ番号 69504)を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のヒトＰＳＧＬ−１レセプター特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片のサブクローニングを行った。
ＨＰＳＧＬ−１−Ｓ：tatcggtccgataaatatgcctctgcaactcctcc（配列番号４）
ＨＰＳＧＬ−１−ＡＳ：tagcggaccgctaagggaggaagctgtgca（配列番号５）
【００４９】
続いて、発現ベクターへの挿入に先立ち、上記サブクローニングにより得たＤＮＡを鋳型にし、以下のプライマーを用いて再びＰＣＲ法を行った。このＰＣＲにより、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターの遺伝子配列が本来持つＳａｎＤＩ制限酵素サイトが消去された。
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ９６Ａ−Ｓ：aagccttaggtcccctgcttgcccgggacc（配列番号６）
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ９６Ａ−ＡＳ：ggggacctaaggctttctcggcttcatctg（配列番号７）
【００５０】
さらに、以下のプライマーを用いて上記と同様にＰＣＲ法を行った。このＰＣＲにより、ＣｐｏＩ制限酵素サイトが消去された。
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ１０２６Ａ−Ｓ：tgctggcagtccgcctctcccgcaagggcc（配列番号８）
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ１０２６Ａ−ＡＳ：ggcggactgccagcaccacagtgcacacga（配列番号９）
【００５１】
次に、マウスＰＳＧＬ−１レセプターを発現する２９３Ｔ細胞を作製するため、Ｐ３Ｕ１細胞からRNeasy kit （Qiagen社）を用いてトータルＲＮＡを回収し、CDSIII/3’primer（Clontech社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、以下のマウスＰＳＧＬ−１特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片のサブクローニングを行った。
ＭＰＳＧＬ−１−Ｓ：tatcggtccgataaatatgtccccaagcttccttg（配列番号１０）
ＭＰＳＧＬ−１−ＡＳ：tagcggaccgctaagggaggaagctgtgcagggtg（配列番号１１）
【００５２】
続いて、上記サブクローニングにより得られたＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて再びＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、マウスＰＳＧＬ−１の遺伝子配列が本来持つＣｐｏＩ制限酵素サイトが消去された。
ＭＰＳＧＬ−１−Ｇ９８７Ａ−Ｓ：ggtgctggcagtccgtctgtcccgtaagac（配列番号１２）
ＭＰＳＧＬ−１−Ｇ９８７Ａ−ＡＳ：cagacggactgccagcaccactgtgcacac（配列番号１３）
【００５３】
以上のようにして得られた、ヒトおよびマウスのＰＳＧＬ−１各増幅ＤＮＡ断片の挿入に先立ち、pEF6/V5-His-B ベクター(Invitrogen社)のBamHI-XmaI領域をpcDNA3.1(+) (Invitrogen社)のBamHI-XmaI領域に置き換えて作製したプラスミドにおいて、BamHI-EcoRI領域をさらに5'-ggatcccggtccgggtcccggggaggtggaggtgactacaaggatgacgatgacaagtaacggtccggaattc-3' (BamHI+CpoI+SanDI+gg+GGGG+Flag+Stop+CpoI+EcoRI)(配列番号１４)で置き換えることにより、pEF6-Flag-3S発現ベクターを作製した。
【００５４】
このpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに、上記各増幅ＤＮＡ断片を挿入することにより、それぞれpEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクター、pEF-マウスPSGL-1組換え発現ベクターを作製した。
【００５５】
次に、ヒトＰＳＧＬ−１のアミノ酸（配列番号１５）１〜６１位（１〜４１位はシグナル配列およびプロペプチド）およびマウスＰＳＧＬ−１のアミノ酸（配列番号１６）６３〜３９７位を有するキメラＰＳＧＬ−１ｃＤＮＡを作製するため、本実施例で作製したpEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターとpEF-マウスPSGL-1組換え発現ベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いて重複伸長ＰＣＲ法を行った。
ＨＭＰＳＧＬ−１−Ｓ：gcctccagaattgctgaaaaatgtcaccaa (配列番号１７)
ＨＭＰＳＧＬ−１−ＡＳ：ttttcagcaattctggaggctccgtttctg (配列番号１８)
【００５６】
ここで得られたキメラＰＳＧＬ−１のＤＮＡ断片を、本実施例で作製したpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに挿入することにより、pEF-hm（キメラ）PSGL-1組換え発現ベクターを作製した。
【００５７】
以上のようにして得られた、pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクター、pEF-マウスPSGL-1組換え発現ベクター、pEF-hm（キメラ）PSGL-1組換え発現ベクターを、２９３Ｔ細胞に、Lipofectamine 2000（Invitrogen社）を用いて導入した後、４時間培養した後に新鮮な培地と交換した。トランスフェクションから２４時間後、ピペッティングによってヒト／マウス／ｈｍ ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を回収した。
【００５８】
陰性対照群として、挿入遺伝子を持たないpEF6-Flag-3S発現ベクターを前記試験群と同様にして２９３Ｔ細胞に導入し、ＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞を作製した。なお、２９３Ｔ細胞株は、内因性のＰＳＧＬ−１レセプターを持たないため、この陰性対照群の細胞はＰＳＧＬ−１レセプターを発現しない。
【００５９】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合の測定＝＝
上述の方法によって得られたＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞またはＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞（各５×１０５細胞）を、ＨＥＶ７１−１０９５を用いて前述のＨＥＶ７１結合試験に供した。またここで、ＨＥＶ７１非感染ＲＤ細胞を、２．５×１０６細胞／２５ml で播種して７２時間培養し、その上澄み液（５００μｌ）を得た。これを、ＨＥＶ７１−１０９５の陰性対照群として、上記試験群と同様にしてＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。その後、これらの２９３Ｔ細胞におけるＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１−１０９５との結合を、前記フローサイトメトリー法より測定した。
【００６０】
図１に示すように、ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｂ、灰色）およびｈｍＰＳＧＬ-１発現２９３Ｔ細胞（Ｄ、灰色）をＨＥＶ７１−１０９５とインキュベートした場合に結合が検出された。一方、陰性コントロールのＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞を用いた場合（Ａ）、および、ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を用いた場合であってもＨＥＶ７１非感染ＲＤ細胞の培地の上澄みと共にインキュベートした場合（Ｂ、白）、またはマウスＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞をＨＥＶ７１−１０９５とインキュベートした場合（Ｃ、灰色）には、ＨＥＶ７１−１０９５の結合は検出されなかった。
【００６１】
このように、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターは、特異的にＨＥＶに結合する。また、その結合にはヒトＰＳＧＬ−１レセプターのアミノ酸４２〜６１位があればよい。
【００６２】
[実施例３]
本実施例では、ヒトＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質Ｎ末端にあるＫＰＬ１抗体認識領域部位がＨＥＶ７1との結合に必要であることを示す。
【００６３】
実施例２の記載に従って作製したヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を、培地中で、０（対照群）、１０、２０、５０μｇ／ｍｌのいずれかの濃度の、ＭＯＰＣ−２１（マウスＩｇＧ１、カタログ番号555746、BD Biosciences社）（対照群）、ＫＰＬ１（抗ヒトＰＳＧＬ−１マウスＩｇＧ１、カタログ番号556052、BD Biosciences社）、あるいはＰＬ２と共に氷上で３０分インキュベートした。培地で過剰抗体を洗浄後、この細胞を前記ＨＥＶ７１−１０９５結合試験に供した。その後、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合を、前記フローサイトメトリー法により測定した。
【００６４】
図２に示すように、上記のように試験したＩｇＧ１、ＫＰＬ１、ＰＬ２のうち、ＫＰＬ１のみが抗体濃度依存的にヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合を阻害した。この結果は、ヒトＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質Ｎ末端にあるＫＰＬ１抗体認識領域部位がＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００６５】
[実施例４]
本実施例では、ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質のＮ末端にあるチロシン４６位、４８位、５１位の存在、およびそのチロシンの硫酸化がＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００６６】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターＮ末端領域のチロシン欠失変異体作製＝＝
pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターを鋳型とし、チロシン欠失ＰＳＧＬ−１変異体をコードするＤＮＡ増幅のため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＰＳＧＬ−１−ｄ４６５１−Ｓ：ggccaccgaagatttcctgccagaaacgga （配列番号１９）
ＰＳＧＬ−１−ｄ４６５１−ＡＳ：gcaggaaatcttcggtggcctgtctccggt（配列番号２０）
【００６７】
ここで得られたＤＮＡ断片をpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに挿入し、これを２９３Ｔ細胞に導入してチロシン欠失ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を作製した。
【００６８】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターＮ末端領域のチロシン置換ＰＳＧＬ−１変異体の作製＝＝
ＰＳＧＬ−１Ｎ末端領域のチロシンＹ４６、Ｙ４８、Ｙ５１がフェニルアラニンに置換された変異体を作製するため、pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＹ４６置換変異体（Ｙ４６Ｆ）、Ｙ４８置換変異体（Ｙ４８Ｆ）、Ｙ５１置換変異体（Ｙ５１Ｆ）、Ｙ４６−４８置換変異体（Ｙ４６４８Ｆ）、Ｙ４６−５１置換変異体（Ｙ４６５１Ｆ）、Ｙ４８−５１置換変異体（Ｙ４８５１Ｆ）、Ｙ４６−４８−５１置換変異体（ＦＦＦ）のＤＮＡを増幅した。
Ｙ４６Ｆ−Ｓ：tttgagtacctagattatgatttcctgccagaa（配列番号２１）
Ｙ４６Ｆ−ＡＳ：ataatctaggtactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号２２）
Ｙ４８Ｆ−Ｓ：tatgagttcctagattatgatttcctgccagaa（配列番号２３）
Ｙ４８Ｆ−ＡＳ：ataatctaggaactcatattcggtggcctgtctcc（配列番号２４）
Ｙ５１Ｆ−Ｓ：tatgagtacctagattttgatttcctgccagaa（配列番号２５）
Ｙ５１Ｆ−ＡＳ：aaaatctaggtactcatattcggtggcctgtctcc（配列番号２６）
Ｙ４６４８Ｆ−Ｓ：tttgagttcctagattatgatttcctgccagaa（配列番号２７）
Ｙ４６４８Ｆ−ＡＳ：ataatctaggaactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号２８）
Ｙ４６５１Ｆ−Ｓ：tttgagtacctagattttgatttcctgccagaa（配列番号２９）
Ｙ４６５１Ｆ−ＡＳ：aaaatctaggtactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号３０）
Ｙ４８５１Ｆ−Ｓ：tatgagttcctagattttgatttcctgccagaa（配列番号３１）
Ｙ４８５１Ｆ−ＡＳ：aaaatctaggaactcatattcggtggcctgtctcc（配列番号３２）
ＦＦＦ−Ｓ：tttgagttcctagattttgatttcctgccagaaac（配列番号３３）
ＦＦＦ−ＡＳ：aaaatctaggaactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号３４）
【００６９】
ここで得られたＤＮＡ断片をpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに挿入し、これを２９３Ｔ細胞に導入してチロシン欠失ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を作製した。対照群として、挿入ＤＮＡのないpEF6-Flag-3S発現ベクターを同様にして２９３Ｔ細胞に導入した。
【００７０】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合の測定＝＝
５×１０５個のチロシン欠失またはチロシン置換ＰＳＧＬ−１発現形質転換２９３Ｔ細胞を、ＨＥＶ−１０９５を用いて前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。その後、ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１−１０９５との結合を前記フローサイトメトリー法に記載の２色フローサイトメトリー法により検出した。
【００７１】
図３に示すように、ＰＳＧＬ−１を発現する２９３Ｔ細胞（陽性対照群）では結合が検出された。Ｙ４６のみ、あるいはＹ４８のみをフェニルアラニンに置換した場合には結合が減少した。しかし、これら３つのチロシンのうち２つを置換した場合には、それがいずれのチロシンであっても結合は検出されなかった。また、３つのチロシンを置換（ＦＦＦ）あるいは欠失した場合（ｄ４６−５１）にも、結合は検出されなかった。この結果は、ＰＳＧＬ−１レセプターのＮ末端側のチロシンがＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００７２】
[実施例５]
本実施例は、ＰＳＧＬ−１レセプターのＮ末端領域のチロシンの硫酸化がＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００７３】
＝＝塩素酸ナトリウムによるチロシン硫酸化の阻害＝＝
塩素酸ナトリウムは、ＰＳＧＬ−１のP-selectinへの結合を阻害するチロシン硫酸化阻害剤である（Pouyani and Seed, Cell 83: 333-343, 1995）。そこで、ＰＳＧＬ−１レセプターのチロシン硫酸化を阻害するため、０、１０、２０、５０ｍＭのいずれかの濃度の塩素酸ナトリウムを加えた培地中で２９３Ｔ細胞を１日培養した。その後、pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターをこの２９３Ｔ細胞に導入し、ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を作製した。４時間後に塩素酸ナトリウムを含む培地と交換し、このヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞をさらに２０時間培養した。
【００７４】
この細胞を、ＨＥＶ−１０９５を用いて前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。その後、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１−１０９５との結合を、前記フローサイトメトリー法により検出した。また、ＰＳＧＬ−１レセプターの発現量に対する塩素酸ナトリウムの影響を、ＰＬ２抗体を用いたフローサイトメトリー法で解析した。
【００７５】
図４に示すように、塩素酸ナトリウムの濃度は、ＰＳＧＬ−１レセプターの発現には影響しなかった（Ａ）。一方で、塩素酸ナトリウムの濃度依存的にヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合が阻害された（Ｂ）。このように、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターのＮ末端領域のチロシンの硫酸化はＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要である。
【００７６】
[実施例６]
本実施例では、ＨＥＶ７１が宿主細胞のＰＳＧＬ−１レセプターに結合することによって、ＨＥＶ７１が宿主細胞に感染することを示す。さらに、この感染がＰＳＧＬ−１特異的抗体または非膜結合性ＰＳＧＬ−１タンパク質によって阻害されることを示す。
【００７７】
＝＝Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞＝＝
ヒトＰＳＧＬ−１を発現するマウスＬ細胞株を得るため、マウスＬ細胞に前記実施例２に記載のpEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターを導入した。得られた形質転換細胞の中から、５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ ＨＣｌ（Invitrogen社）の存在下で安定な細胞を選抜した。さらに、選抜された１６コロニーの中から、ＰＳＧＬ−１発現レベルの高い３つの細胞コロニーを選抜した。最終的に、ＨＥＶ７１−１０９５が高効率で増殖する細胞株をＬ−ＰＳＧＬ−１．１とした。
【００７８】
陰性対照細胞株として、Ｌ−ｂｓｄ細胞株を用いた。この細胞株は、挿入ＤＮＡを持たないpEF6-Flag-3S発現ベクターを上記と同様にしてマウスＬ細胞に導入した後、５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ ＨＣｌにより形質転換細胞を選択して得られた細胞株である。
【００７９】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターを介するＨＥＶ７１の感染、増殖とその阻害＝＝
Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞を、ＨＥＶ−１０９５を用いて前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。このとき、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞の陰性コントロールとして、Ｌ細胞、Ｌ−ｂｓｄ細胞にも同様にしてＨＥＶ７１−１０９５を接種した。
【００８０】
ＰＳＧＬ−１レセプター特異的抗体によるＨＥＶ７１の結合阻害を試験するために、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞を１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１（陰性対照群）、ＫＰＬ１、ＰＬ２のいずれかと３４℃で１時間インキュベートし、洗浄後、さらに１０μｇ／ｍｌの前記抗体を含有する培地で培養した。この細胞に、上述と同様にＨＥＶ７１−１０９５を接種し、培養した。
【００８１】
非膜結合性キメラＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質であるＰＳＧＬ−１−Ｆｃ（カタログ番号137-PS-050、R&D Systems社）によるＨＥＶ７１の結合阻害を試験するため、ＨＥＶ７１−１０９５（１×１０５ ＣＣＩＤ５０）を１μｇ／１００μｌのＰＳＧＬ−１−Ｆｃと共に３４℃で１時間インキュベートした後、上記阻害なしの群と同様にして４×１０４個のＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞に接種した。このとき、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃの陰性対照群として、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（カタログ番号325-CT-200/CF 、R&D Systems社）を用いた。得られた感染細胞をさらにＰＳＧＬ−１−Ｆｃの存在下で３４℃で１時間インキュベートし、洗浄後、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃを含まない培地で培養した。その後、この感染細胞のウイルス力価を測定した。この測定には、ＲＤ細胞と９６穴プレートを用いたマイクロタイトレーション法を用い、各サンプルあたり３回ずつ測定した。ウイルス液を１０倍から１０８倍まで、１０倍ごとに段階希釈した。各希釈のウイルス液をプレートの１０穴に各１００μｌ入れ、次に、ＲＤ細胞（４×１０４細胞／１００μｌ）を加えた後３７℃で７日間培養し、ＣＣＩＤ５０を算出した。
【００８２】
図５Ａに示すように、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１において、ＨＥＶ７１−１０９５接種によって、ウイルス力価上昇が生じた。一方で、ＰＳＧＬ−１を発現しないＬ細胞およびＬ−ｂｓｄにおいてはＨＥＶ７１−１０９５の接種によってウイルス力価は変化しなかった。この結果は、ＨＥＶ７１の増殖には、宿主細胞のＰＳＧＬ−１レセプターが必要であることを示す。
【００８３】
また、図５Ｂに示すように、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１にＨＥＶ７１を接種した時、ＰＳＧＬ−１レセプター特異的抗体であるＫＰＬ１と共にインキュベートした場合、対照群（ＩｇＧ１、ＰＬ２）と比較してＨＥＶ７１の増殖が有意に阻害された。このように、宿主細胞（Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１）へのＨＥＶ７１の結合にＰＳＧＬ−１レセプターのＫＰＬ１認識部位が必要であり、さらに、このＫＰＬ１認識部位をＫＰＬ１抗体でブロックすることによってＨＥＶ７１の感染、増殖が抑制される。
【００８４】
図５Ｃに示すように、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１にＨＥＶ７１を接種した時、非膜結合性ＰＳＧＬ−１キメラタンパク質と共にインキュベートするとＨＥＶ７１の増殖が抑制された。このように、ＨＥＶ７１とＰＳＧＬ−１レセプターの結合に競合するＰＳＧＬ−１の非膜結合性タンパク質がＨＥＶ７１の感染、増殖の阻害物質として利用できる。
【００８５】
[実施例７]
本実施例では、ＨＥＶ７１とＰＳＧＬ−１レセプターとの結合のために、ＨＥＶ７１の構造タンパク質のアミノ酸配列の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることが好ましく、グリシンまたはグルタミンであることがさらに好ましいことを示す。
【００８６】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合性の測定＝＝
実施例２と同様に、７種の異なるＨＥＶ７１の分離株を実施例２で作製したヒトＰＳＧＬ−１レセプターを発現する２９３Ｔ細胞表面にそれぞれ結合させ、前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。また、ここで、ＨＥＶ７１非感染ＲＤ細胞（２．５×１０６細胞／２５ｍｌ）を７２時間培養し、得られた培地上澄み液（５００μｌ）を陰性対照群として、上記試験群と同様にＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。その後、これらの２９３Ｔ細胞におけるＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１各分離株の結合を、前記フローサイトメトリー法により測定した。
【００８７】
図６に示すように、試験に供したＨＥＶ７１分離株７株のうち、ＳＫ−ＥＶ００６、Ｃ７/Ｏｓａｋａ、１０９５、７５−Ｙａｍａｇａｔａの各分離株はＰＳＧＬ−１レセプターとの結合が検出された。一方、陰性対照群、およびＢｒＣｒ、Ｎａｇｏｙａ、０２３６３の各分離株はＰＳＧＬ−１レセプターとの結合が検出されなかった。
【００８８】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶ７１のアミノ酸配列の特徴＝＝
本実施例で結合性測定試験に供したＨＥＶ７１分離株のＰ１遺伝子領域がコードするアミノ酸配列を比較し、ＰＳＧＬ−１レセプターとの結合性との関連を検討した。
【００８９】
図７に示すように、ＰＳＧＬ−１レセプターと結合が検出されなかった分離株では、構造タンパク質のアミノ酸配列の７１０番目が共通してグルタミン酸であった。さらに、ＰＳＧＬ−１レセプターとの結合が検出された分離株では、この７１０番目のアミノ酸がグリシンまたはグルタミンであった。
【００９０】
以上の結果は、ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合には、ＨＥＶ７１の構造タンパク質のアミノ酸配列の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることが好ましく、グリシンあるいはグルタミンであればより好ましいことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞（Ａ、灰色）、ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｂ、灰色）、マウスＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｃ、灰色）、ｈｍＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｄ、灰色）にＨＥＶ７１−１０９５を接種した際のＨＥＶ７１結合を示すフローサイトメトリー、および、陰性対照群として各細胞にＨＥＶ７１偽感染ＲＤ細胞の培地上澄みを接種した際（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、白）のフローサイトメトリーの結果を示した図である。
【図２】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞へのＨＥＶ７１の結合試験前に、細胞をＩｇＧ（Ａ）、ＫＰＬ１（Ｂ）、ＰＬ２（Ｃ）と共にインキュベートした際のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質のＮ末端側の３つのチロシンを変異させた場合のＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞とＨＥＶ７１の結合を示すフローサイトメトリーの結果を示した図である。各変異は、ＰＳＧＬ−１非発現（ｐＥＦ、陰性対照群）、チロシン変異なしＰＳＧＬ−１（ＰＳＧＬ−１）、チロシン４６をフェニルアラニンに置換（Ｙ４６Ｆ）、チロシン４８をフェニルアラニンに置換（Ｙ４８Ｆ）、チロシン５１をフェニルアラニンに置換（Ｙ５１Ｆ）、チロシン４６と４８をフェニルアラニンに置換（Ｙ４６４８Ｆ）、チロシン４６と５１をフェニルアラニンに置換（Ｙ４６５１Ｆ）、チロシン４８と５１をフェニルアラニンに置換（Ｙ４８５１Ｆ）、チロシン４６、４８、５１をフェニルアラニンに置換（ＦＦＦ）、チロシン４６、４８、５１を含む領域の欠失（ｄ４６−５１）である。
【図４】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１レセプターの発現量に対する塩素酸ナトリウムの影響（Ａ）、およびＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞とＨＥＶ７１の結合における塩素酸ナトリウムの影響を示したフローサイトメトリーの結果である（Ｂ）。
【図５】本発明の一実施例で、宿主細胞にＨＥＶ７１を接種した際のＨＥＶ７１の力価の変化を示す図である。ＨＥＶ７１をＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞、Ｌ細胞、Ｌ−ｂｓｄに接種後のＨＥＶ７１力価の変化（Ａ）、ＩｇＧ、ＫＰＬ１、ＰＬ２と共にインキュベートし、ＨＥＶ７１をＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞に接種した後のＨＥＶ７１力価の変化（Ｂ）、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃと共にインキュベートし、ＨＥＶ７１をＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞に接種した後のＨＥＶ７1力価の変化（Ｃ）を示す。
【図６】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞へのＨＥＶ７１各分離株の結合を示すフローサイトメトリーの結果を示した図である。
【図７】本発明の一実施例で、ＨＥＶ７１各分離株の構造タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウイルス感染症診断薬および予防・治療用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトエンテロウイルス(以下、ＨＥＶとも称する)はピコルナウイルス属エンテロウイルス科に属する。ＨＥＶ遺伝子のＰ１領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４の４つの領域から構成され、構造タンパク質（カプシド）をコードしている。ＨＥＶはそのＶＰ１領域がコードするアミノ酸の部分配列に従って、ＨＥＶ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４種に大別される（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ＨＥＶ−Ａに属するウイルスの中で、エンテロウイルス７１型（ＨＥＶ７１）およびコクサッキーウイルスＡ１６型（ＣＡ１６）は手足口病の主要原因ウイルスとして知られており、特にＨＥＶ７1はしばしば急性脳炎等の死亡に至る重篤な神経合併症をも引き起こす(例えば、非特許文献２、３参照)。ＨＥＶ７１感染症は、特に、中国、マレーシア、台湾などのアジア諸国で度々流行し、死亡例も報告されている（例えば、非特許文献２、４、５参照）。
【０００４】
しかしながら、現在までのところ、ＨＥＶ７１およびＣＡ１６の感染の迅速な診断方法、および、その感染症の有効な予防・治療薬はなく、その開発が待ち望まれている。
【非特許文献１】Oberste MS. et al., Journal of Virology, 73: 1941-1948 (1999)
【非特許文献２】McMinn PC, FEMS Microbiology Review, 26: 91-107 (2002)
【非特許文献３】Arita M. et al., Journal of Virology, 82: 1787-1797 (2008)
【非特許文献４】Cardosa M. J. et al., Emerging Infections Diseases, 9: 461-468 (2003)
【非特許文献５】Arita M. et al., Journal of Virology, 81: 9386-9395 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、エンテロウイルス感染症の診断薬、予防・治療用薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＨＥＶがＰＳＧＬ−１レセプターに特異的に結合すること、さらに、ＨＥＶがこのＰＳＧＬ−１レセプターを介して宿主細胞に感染、増殖することを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
すなわち、本発明に係る細胞はヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現していることを特徴とする。この細胞は、２９３Ｔ細胞株、あるいは、Ｌ細胞株由来であってもよい。
【０００８】
さらに、本発明に係る検出方法は、ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部とＨＥＶの結合を検出することを特徴とする。この検出方法は、上述のヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現している細胞と、ＨＥＶとを接触させ、当該細胞がＨＥＶ非感染細胞と比較して変形しているか否かを検出する工程を含んでもよい。
【０００９】
本発明に係る薬剤は、ＨＥＶ感染症を治療または予防するための薬剤である。この薬剤は、ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部、ＰＳＧL−１レセプターのＨＥＶへの結合阻害抗体、または、チロシン硫酸化阻害物質、を含有することを特徴とする。ここで、阻害抗体は、ＫＰＬ１であってもよい。
【００１０】
上記ＨＥＶは、ＨＥＶ−Ａであってもよく、さらにＨＥＶ−ＡはＨＥＶ７１またはＣＡ１６であってもよい。さらに、ＨＥＶ７１の構造タンパク質のアミノ酸配列の初めから７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であってもよく、グリシンまたはグルタミンであってもよい。なお、ここで、「構造タンパク質」とは、ＨＥＶ７１遺伝子のＰ１遺伝子領域がコードするカプシドタンパク質を指す。
【００１１】
また、本発明に係る哺乳動物は、ヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを発現していることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
＝＝ヒトエンテロウイルス＝＝
本発明の対象であるＨＥＶはＨＥＶ−Ａであることが好ましく、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であればより好ましい。ＨＥＶ７１は、天然の株であっても、人為的に株化された株であってもよいが、その構造タンパク質のアミノ酸配列の初めから７１０番目のアミノ酸（ＶＰ１遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の、初めから１４５番目該当する）がグルタミン酸以外のアミノ酸であることが好ましく、グリシンあるいはグルタミンであればより好ましい。そのようなＨＥＶ７１として、ＨＥＶ７１ ＳＫ−ＥＶ００６株、ＨＥＶ７１ Ｃ７／Ｏｓａｋａ株、ＨＥＶ７１ １０９５株、ＨＥＶ７１ ７５−Ｙａｍａｇａｔａ株が例示できる。ＨＥＶ７１ ＳＫ−ＥＶ０００６株の構造タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００１６】
＝＝ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部とＨＥＶとの結合を検出する方法＝＝
本発明に係る検出方法は、ＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部とＨＥＶとの結合を検出する方法である。
【００１７】
また、この検出方法の対象となるＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部は、ＨＥＶに結合することができることから、ヒトあるいはサル由来である。
【００１８】
このＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質は、その由来・取得・調製法によって特に制限されず、天然のポリペプチドであっても、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えポリペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したポリペプチドであってもよい。天然のポリペプチドは、単離せずに用いても、タンパク質の単離・精製法を適宜組み合わせることにより、ＰＳＧＬ−１レセプターを発現している細胞から単離してもかまわない。化学合成によりＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を調製する場合には、例えばＦｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ-ブチルオキシカルボニル法）等の当業者に周知の化学合成法に従って製造することができる。また、各種市販のペプチド合成機を利用してＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を製造することもできる。遺伝子組換え技術によりペプチドを調製する場合には、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターをコードするＤＮＡ断片を好適な発現ベクターに導入した後、培養細胞等の宿主を形質転換し、ペプチドを発現させればよい。
【００１９】
ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部は、配列番号１３における４２〜６１番目のアミノ酸配列を有する領域を含有していればよく、例えば、細胞外ドメイン、細胞外ドメイン＋膜貫通ドメインなどが挙げられる。
【００２０】
ＰＳＧＬ−１レセプターまたはＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部は、ペプチドタグや他のペプチドとのキメラタンパク質になっていてもよい。例えば、細胞外ドメインの少なくとも一部がヒト由来であり、このアミノ酸配列はＫＰＬ１認識領域を含むことがより好ましい。そのＣ末端側が、ヒト以外の哺乳動物のＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質のＣ末端側アミノ酸配列、あるいは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の異種タンパク質を含む。このヒト以外の哺乳動物は、キメラＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を作製できる範囲で特に制限はないが、マウスであることが好ましい。非膜結合性ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターキメラタンパク質は、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃキメラタンパク質であることがより好ましい。
【００２１】
結合の検出は、in vivoで行われても、in vitroで行われても構わない。検出に際しては、ＰＳＧＬ−１レセプターまたはその一部とＨＥＶとのいずれか一方又は両方を、ペプチドタグ、放射性同位元素、金属分子などで標識し、その標識を検出することにより、結合を検出できる。あるいは、いずれかを認識する抗体を用いても、結合を検出できる。
【００２２】
in vivoの場合、サルを感染モデルとし、その症状が現れることを示標として、結合を検出してもよい。in vitroでは、定法に従い、一方を、赤血球等の天然の担体、ラテックス等の人工の粒子、あるいはカラムなどの担持体に結合させ、標識した他方を担持体に接触させたとき、標識が担持体で検出されることを示標に、結合を検出できる。あるいは、ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現している細胞に対し、標識したＨＥＶを投与し、標識が細胞表面で検出されることを示標に、結合を検出してもよい。この場合、ＨＥＶを投与後、その細胞が非感染細胞の形態と比較して変形することを顕微鏡下で検出することによって、結合を検出してもよい。この際、「非感染細胞」は、ＨＥＶ感染前の同一の細胞であっても、非感染の非同一細胞であってもよい。ここで用いる細胞は特に限定されないが、例えば、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現させた遺伝子組み換え細胞を用いることができる。
【００２３】
外来性ＰＳＧＬ−１レセプターとは、細胞が固有に有する内在性ＰＳＧＬ−１遺伝子ではなく、人為的に遺伝子導入またはタンパク質導入によって、細胞外から導入された遺伝子またはタンパク質に由来するＰＳＧＬ−１レセプターをいう。人為的に導入されれば、その細胞の内在性ＰＳＧＬ−１遺伝子がコードするＰＳＧＬ−１タンパク質と同一のアミノ酸配列を有していてもよい。外来性ＰＳＧＬ−１レセプターのアミノ酸配列は、動物に由来する天然のアミノ酸配列そのままであっても、あるいは、ＨＥＶ結合活性を失わない範囲でアミノ酸の欠失、置換、付加があってもよい。また、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターは、タグなどのペプチドが付加された融合タンパク質であってもよい。
【００２４】
この細胞の作製に用いる細胞は、株化された培養細胞であっても、初代培養細胞であっても、外来性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を細胞表面に発現することができれば制限はない。この細胞の由来となる動物種は、特に制限されず、脊椎動物由来であっても昆虫由来であってもよいが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒトおよびサルを除く哺乳動物由来であることがより好ましく、ＨＥＶを結合するＰＳＧＬ−１レセプターを有しない動物、例えばマウス由来であればさらに好ましい。さらに、細胞が由来する組織に特に制限はない。また、用いる培養細胞としては、ＰＳＧＬ−１レセプター以外にＨＥＶとの結合能を有するレセプタータンパク質を持たない細胞が好ましいが、ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質を含め一切のレセプタータンパク質を持たない細胞株がより好ましい。例えば、Ｌ細胞が例示できる。
【００２５】
外来性ＰＳＧＬ−１発現細胞を作製するには、細胞表面にＰＳＧＬ−１レセプターを発現させるため、例えば、ＰＳＧＬ−１レセプターを発現する発現ベクターを導入してもよい。あるいは、ＴＡＴペプチド等の細胞内移行ペプチド（ＰＴＤ）を用い、ＰＳＧＬ−１レセプターを直接細胞に導入してもよい。
【００２６】
このように、ＰＳＧＬ−１レセプター、または、ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部を含有させれば、ＨＥＶを結合させるための試薬として用いることができる。この試薬の、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターの状態は、ＨＥＶを結合できるようにその結合部位を露出している範囲内で特に制限はない。
【００２７】
これらの検出方法を利用して、ＨＥＶ感染の阻害物質のスクリーニングを行うことができる。例えば、候補となる阻害物質の存在下でＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶを接触させ、上記検出方法によって、それらの結合が検出されなくなる物質を同定することによって、ＨＥＶ感染の阻害物質を得ることができる。特に、細胞の変形は、ＨＥＶのＰＳＧＬ−１レセプターに対する結合だけでなく、ＨＥＶの感染および増殖を示すため、スクリーニングの際の結合の検出の示標として好ましい。
【００２８】
＝＝エンテロウイルス感染症を治療または予防する薬剤＝＝
ＨＥＶはＰＳＧＬ−１レセプターに結合することにより感染し、細胞内で増殖して疾患を発症させるため、ＨＥＶがＰＳＧＬ−１レセプターに結合することを阻害する阻害物質は、ＨＥＶ感染症を治療または予防する薬剤として用いることができる。ＨＥＶ感染の阻害物質としては、上記スクリーニングによって得ることができるが、それ以外にも、既知物質として、ＰＳＧＬ−１レセプター、ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部、ＨＥＶのヒトＰＳＧＬ−１レセプターへの結合阻害抗体、あるいは、チロシン硫酸化阻害剤、などが挙げられる。
【００２９】
ＨＥＶとの結合能を有するＰＳＧＬ−１レセプターの一部を含有する薬剤としては、親水性であるため非膜結合性タンパク質が好ましく、細胞内領域や疎水性の膜貫通領域などを含まないことが好ましい。
【００３０】
阻害抗体は、ヒトＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターのＨＥＶへの結合を阻害する抗体であれば制限はないが、ＰＳＧＬ−１レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸の全長または一部分を認識する抗体であることが好ましく、ＫＰＬ１であることがより好ましい。
【００３１】
また、チロシン硫酸化阻害剤は、ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプターの細胞外ドメインのチロシンＹ４６、Ｙ４８、Ｙ５１の硫酸化を阻害する物質であれば、特に制限がなく、これらのチロシン硫酸化のみを特異的に阻害する物質であっても、いずれのチロシンの硫酸化も非特異的に阻害する物質であってもよい。また、その阻害が直接的であっても間接的であってもよい。このチロシン硫酸化阻害剤は塩素酸ナトリウムであることが好ましい。
【００３２】
以上の薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は治療に適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよく、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、または固形注射剤等が挙げられる。本治療剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
【００３３】
ＨＥＶ感染症を治療または予防する薬剤を投与する対象の疾患は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物において、ＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶの感染または増殖によって引き起こされる疾患であれば限定されず、例えば手足口病や神経合併症であってもよく、神経合併症は脳炎であってもよい。
【００３４】
なお、ＨＥＶ感染症を治療または予防する薬剤の患者または患者動物へ、あるいは、健常人または健常動物への投与方法および投与量は、投与目的、剤形、患者の状態などに応じ、当業者が適宜選択可能である。
【００３５】
＝＝外来性ＰＳＧＬ−１レセプター発現哺乳動物＝＝
外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを発現する哺乳動物は、ＨＥＶが関与する疾患の疾患モデル動物として有用である。このモデル動物作製に用いられる、ヒトを除く哺乳動物は、ＰＳＧＬ−１レセプター結合性のＨＥＶへの感受性を持つサル以外の哺乳動物であることが好ましく、マウスであることがさらに好ましい。また、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターをキメラに発現するキメラ動物であっても、外来性ＰＳＧＬ−１レセプターをゲノムに導入されたトランスジェニック動物であってもよい。
【００３６】
この疾患モデル動物作製方法は、当業者に周知の方法を用いればよい。簡潔には、受精卵、または初期胚の時期に、外来性ＨＥＶ結合性ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質をコードするＤＮＡをインジェクターで導入することにより得られる（ＤＮＡ微量注入法）。その他、ＨＥＶ結合性ヒトＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するウイルスベクターを、４〜８細胞期胚に感染させ、胚盤胞まで発生させた後、代理母個体の子宮に戻す方法（ウイルスベクター法）、あるいは、ＤＮＡを導入したＥＳ細胞からキメラ動物を経てトランスジェニック動物を作製する方法（ＥＳ細胞法）、等を用いることができる。
【００３７】
疾患モデル動物は、例えば、ヒト臨床試験の前段階においてＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶのワクチンの安全性および有効性を検討するために用いることができる。対象となるワクチンは、ＨＥＶの予防または治療用ワクチンであれば特に制限されず、例えば不活性化ワクチンや弱毒化ワクチンでもよい。また、２つ以上の異なるワクチンを混合した混合ワクチンの評価に用いることもできる。
【実施例】
【００３８】
＝＝培養細胞株およびその培養条件＝＝
以下の実施例で用いる培養細胞株は、特記しない限り次の条件で培養する。ＲＤ細胞（米国疾病予防管理センターより分与）：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したEagle’s MEM培地（３７℃）；２９３Ｔ細胞（大阪大学・松浦善治より分与）、ＧＰ２−２９３細胞（Clontech社）：１０％ＦＣＳを添加したDulbecco’s modified Eagle’s medium(ＤＭＥＭ)（３７℃）；Jurkat細胞（理研細胞バンク、RCB0806）：ＲＰＭＩ−１６４０培地（３４℃）；Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（マウス骨肉腫細胞株、Ｐ３Ｕ１）細胞（東京大学・明石博臣より分与）：ＲＰＭＩ−１６４０培地（３７℃）；マウスＬ細胞（国立感染症研究所ウイルス第三部より入手）、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１、Ｌ−ｂｓｄ細胞：５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ ＨＣｌ（Invitrogen社）および１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ（３４℃）。
【００３９】
＝＝宿主細胞へのウイルスの感染＝＝
下記の各実施例で用いられる細胞へのウイルスの感染の際、特に記載のない限り、宿主細胞を１０ ＣＣＩＤ５０／細胞 のウイルスと共に培地中で１時間インキュベートした。インキュベートは、上記のように各細胞に適した条件で行った。
【００４０】
＝＝ＨＥＶ７１結合試験およびフローサイトメトリー法＝＝
ＨＥＶ７１の結合試験のため、試験に供する細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ）緩衝液（２ｍＭＥＤＴＡ、２％ＦＣＳ、０.１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で一回洗浄後、上記培養条件に記載の培地５００μｌあたり０．１％ＮａＮ３を含むＨＥＶ７１（１×１０７ＣＣＩＤ５０）と共に、氷上で３０分間インキュベートした。なお、本願実施例中で使用されるＨＥＶ７１−１０９５（国立感染症研究所ウイルス第二部萩原昭夫(元職員)より入手）は、株化されたＨＥＶ７１である。
【００４１】
インキュベーション終了後、細胞をＦＣ緩衝液で一回洗浄した。ＨＥＶ７１の検出のために、試験に供した細胞をAlexa Fluor 488 protein labeling kit (Invitrogen社)でラベルしたＭＡ１０５抗体（抗ＨＥＶ７１マウスＩｇＧ２ｂ、国立感染症研究所ウイルス第二部で作製、０．２５μg／５０μｌ）と共に氷上で３０分インキュベートした。２色フローサイトメトリーの場合には、さらに、ＰＳＧＬ−１を検出するために、細胞をZenon mouse IgG1 R-phycoerythrin labeling kit (Invitrogen社)でラベルしたＰＬ２抗体（抗ヒトＰＳＧＬ−１マウスＩｇＧ１、カタログ番号IM2091、Beckman-coulter社（０．５μg／５０μｌ）で標識した。過剰抗体を洗浄後、細胞をFACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences社）での測定に供した。 非膜結合性ＰＳＧＬ−１−Ｆｃ使用時には、前記ＦＣ緩衝液の代わりに、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２％ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳを用いた。
【００４２】
[実施例１]
本実施例では、ＨＥＶ感受性Jurkat細胞株のｃＤＮＡライブラリーからＰＳＧＬ−１レセプターを同定した。
【００４３】
＝＝ＨＥＶ７１コーティングペトリ皿の作製＝＝
１０μｇ／ｍｌ ＭＡ３５（国立感染症研究所ウイルス第二部で作製）を１０ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ ９．４）に溶解した溶液中で、ポルスチレン製ペトリ皿（Ina-optika社）を４℃で一晩インキュベートした。このペトリ皿を２％ＦＣＳ添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−２ＦＣＳ）で２回洗浄後、さらに室温で３０分、ＰＢＳ−２ＦＣＳ中でブロッキングした。このＭＡ３５コーティングペトリ皿に、１０ｍｌのＨＥＶ７１−１０９５液（１０８．６ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）を加え、室温で３０分インキュベートした。さらに、この上清を新しいＨＥＶ−１０９５液で交換し、この交換―インキュベートの工程を計３回繰り返した。その後、ペトリ皿を、１％パラホルムアルデヒドを含むＨＥＶ７１−１０９５液で３０分間、室温で固定した。
【００４４】
＝＝Jurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを保有するレトロウイルスの作製＝＝
ＨＥＶ７１結合性分子を高率で発現するJurkat細胞を選抜し、そのｃＤＮＡを保有するレトロウイルスを作製した。
【００４５】
Jurkat細胞を培地の入ったＨＥＶ７１コーティングペトリ皿に加え、１０７ 細胞／４ｍｌの密度で４℃で９０分培養した。非付着細胞は培地で洗い流し、付着細胞はさらに１週間培養を続けた。ここで、ＨＥＶ７１コーティングペトリ皿に付着したJurkat細胞はその細胞表面にＨＥＶ７１結合性分子を有する。この付着性Jurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを、Kitamura and Morikawa (Methods in Molecular Biology 134: 143-152, 2000)の方法を参考に作製した。この時、Jurkat細胞から抽出したｃＤＮＡの両端にEcoRIアダプターを接続し、pLIBベクター（Clontech社）のＥｃｏＲＩ制限酵素サイトに挿入して形質転換pLIBベクターを作製した。このベクターを、VSV-G（ウイルスエンベロープタンパク質）（Pantropic Retroviral Expression System（Clontech社））と共にＧＰ２−２９３細胞にトランスフェクトした。この共トランスフェクションにはLipofectamine 2000 regent (Invitrogen社)を使用した。このＧＰ２−２９３細胞を２日間培養し、培養液の上澄みを回収した。この上澄みにはJurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを保有するレトロウイルスが含まれる。
【００４６】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターの同定＝＝
上述のように取得したJurkat細胞のｃＤＮＡライブラリーを保有するレトロウイルスを、Ｐ３Ｕ１細胞に感染させた。この時、細胞に対する感染性ウイルスの相対量（Ｍ．Ｏ．Ｉ）は０．２であった。この感染Ｐ３Ｕ１細胞を前記のＨＥＶ７１をコーティングしたペトリ皿に播種し、４℃または３７℃で９０分インキュベートした。その後、ペトリ皿に付着しなかった細胞を洗い流し、付着した細胞は引き続き３７℃で６日間培養した。この培養で得られた全４つの細胞コロニーのゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、下記のpLIBベクター特異的プライマー（Sigma社にて受託合成）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この増幅ＤＮＡの配列を決定したところ、前記４つの細胞コロニーから抽出した各ＤＮＡから、ＰＳＧＬ−１レセプターの配列が得られた。
pLIB-S: agccctcactccttctctag（配列番号２）
pLIB-AS: acctacaggtggggtctttcattccc（配列番号３）
【００４７】
[実施例２]
本実施例では、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の特異的結合を示す。
【００４８】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプター発現２９３Ｔ細胞の作製＝＝
上述の、ＰＳＧＬ−１レセプター発現Ｐ３Ｕ１細胞（ＨＥＶ７１コーティングペトリ皿付着性Ｐ３Ｕ１細胞）から、DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen社、カタログ番号 69504)を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のヒトＰＳＧＬ−１レセプター特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片のサブクローニングを行った。
ＨＰＳＧＬ−１−Ｓ：tatcggtccgataaatatgcctctgcaactcctcc（配列番号４）
ＨＰＳＧＬ−１−ＡＳ：tagcggaccgctaagggaggaagctgtgca（配列番号５）
【００４９】
続いて、発現ベクターへの挿入に先立ち、上記サブクローニングにより得たＤＮＡを鋳型にし、以下のプライマーを用いて再びＰＣＲ法を行った。このＰＣＲにより、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターの遺伝子配列が本来持つＳａｎＤＩ制限酵素サイトが消去された。
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ９６Ａ−Ｓ：aagccttaggtcccctgcttgcccgggacc（配列番号６）
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ９６Ａ−ＡＳ：ggggacctaaggctttctcggcttcatctg（配列番号７）
【００５０】
さらに、以下のプライマーを用いて上記と同様にＰＣＲ法を行った。このＰＣＲにより、ＣｐｏＩ制限酵素サイトが消去された。
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ１０２６Ａ−Ｓ：tgctggcagtccgcctctcccgcaagggcc（配列番号８）
ＨＰＳＧＬ−１−Ｇ１０２６Ａ−ＡＳ：ggcggactgccagcaccacagtgcacacga（配列番号９）
【００５１】
次に、マウスＰＳＧＬ−１レセプターを発現する２９３Ｔ細胞を作製するため、Ｐ３Ｕ１細胞からRNeasy kit （Qiagen社）を用いてトータルＲＮＡを回収し、CDSIII/3’primer（Clontech社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、以下のマウスＰＳＧＬ−１特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片のサブクローニングを行った。
ＭＰＳＧＬ−１−Ｓ：tatcggtccgataaatatgtccccaagcttccttg（配列番号１０）
ＭＰＳＧＬ−１−ＡＳ：tagcggaccgctaagggaggaagctgtgcagggtg（配列番号１１）
【００５２】
続いて、上記サブクローニングにより得られたＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いて再びＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、マウスＰＳＧＬ−１の遺伝子配列が本来持つＣｐｏＩ制限酵素サイトが消去された。
ＭＰＳＧＬ−１−Ｇ９８７Ａ−Ｓ：ggtgctggcagtccgtctgtcccgtaagac（配列番号１２）
ＭＰＳＧＬ−１−Ｇ９８７Ａ−ＡＳ：cagacggactgccagcaccactgtgcacac（配列番号１３）
【００５３】
以上のようにして得られた、ヒトおよびマウスのＰＳＧＬ−１各増幅ＤＮＡ断片の挿入に先立ち、pEF6/V5-His-B ベクター(Invitrogen社)のBamHI-XmaI領域をpcDNA3.1(+) (Invitrogen社)のBamHI-XmaI領域に置き換えて作製したプラスミドにおいて、BamHI-EcoRI領域をさらに5'-ggatcccggtccgggtcccggggaggtggaggtgactacaaggatgacgatgacaagtaacggtccggaattc-3' (BamHI+CpoI+SanDI+gg+GGGG+Flag+Stop+CpoI+EcoRI)(配列番号１４)で置き換えることにより、pEF6-Flag-3S発現ベクターを作製した。
【００５４】
このpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに、上記各増幅ＤＮＡ断片を挿入することにより、それぞれpEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクター、pEF-マウスPSGL-1組換え発現ベクターを作製した。
【００５５】
次に、ヒトＰＳＧＬ−１のアミノ酸（配列番号１５）１〜６１位（１〜４１位はシグナル配列およびプロペプチド）およびマウスＰＳＧＬ−１のアミノ酸（配列番号１６）６３〜３９７位を有するキメラＰＳＧＬ−１ｃＤＮＡを作製するため、本実施例で作製したpEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターとpEF-マウスPSGL-1組換え発現ベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いて重複伸長ＰＣＲ法を行った。
ＨＭＰＳＧＬ−１−Ｓ：gcctccagaattgctgaaaaatgtcaccaa (配列番号１７)
ＨＭＰＳＧＬ−１−ＡＳ：ttttcagcaattctggaggctccgtttctg (配列番号１８)
【００５６】
ここで得られたキメラＰＳＧＬ−１のＤＮＡ断片を、本実施例で作製したpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに挿入することにより、pEF-hm（キメラ）PSGL-1組換え発現ベクターを作製した。
【００５７】
以上のようにして得られた、pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクター、pEF-マウスPSGL-1組換え発現ベクター、pEF-hm（キメラ）PSGL-1組換え発現ベクターを、２９３Ｔ細胞に、Lipofectamine 2000（Invitrogen社）を用いて導入した後、４時間培養した後に新鮮な培地と交換した。トランスフェクションから２４時間後、ピペッティングによってヒト／マウス／ｈｍ ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を回収した。
【００５８】
陰性対照群として、挿入遺伝子を持たないpEF6-Flag-3S発現ベクターを前記試験群と同様にして２９３Ｔ細胞に導入し、ＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞を作製した。なお、２９３Ｔ細胞株は、内因性のＰＳＧＬ−１レセプターを持たないため、この陰性対照群の細胞はＰＳＧＬ−１レセプターを発現しない。
【００５９】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合の測定＝＝
上述の方法によって得られたＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞またはＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞（各５×１０５細胞）を、ＨＥＶ７１−１０９５を用いて前述のＨＥＶ７１結合試験に供した。またここで、ＨＥＶ７１非感染ＲＤ細胞を、２．５×１０６細胞／２５ml で播種して７２時間培養し、その上澄み液（５００μｌ）を得た。これを、ＨＥＶ７１−１０９５の陰性対照群として、上記試験群と同様にしてＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。その後、これらの２９３Ｔ細胞におけるＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１−１０９５との結合を、前記フローサイトメトリー法より測定した。
【００６０】
図１に示すように、ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｂ、灰色）およびｈｍＰＳＧＬ-１発現２９３Ｔ細胞（Ｄ、灰色）をＨＥＶ７１−１０９５とインキュベートした場合に結合が検出された。一方、陰性コントロールのＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞を用いた場合（Ａ）、および、ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を用いた場合であってもＨＥＶ７１非感染ＲＤ細胞の培地の上澄みと共にインキュベートした場合（Ｂ、白）、またはマウスＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞をＨＥＶ７１−１０９５とインキュベートした場合（Ｃ、灰色）には、ＨＥＶ７１−１０９５の結合は検出されなかった。
【００６１】
このように、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターは、特異的にＨＥＶに結合する。また、その結合にはヒトＰＳＧＬ−１レセプターのアミノ酸４２〜６１位があればよい。
【００６２】
[実施例３]
本実施例では、ヒトＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質Ｎ末端にあるＫＰＬ１抗体認識領域部位がＨＥＶ７1との結合に必要であることを示す。
【００６３】
実施例２の記載に従って作製したヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を、培地中で、０（対照群）、１０、２０、５０μｇ／ｍｌのいずれかの濃度の、ＭＯＰＣ−２１（マウスＩｇＧ１、カタログ番号555746、BD Biosciences社）（対照群）、ＫＰＬ１（抗ヒトＰＳＧＬ−１マウスＩｇＧ１、カタログ番号556052、BD Biosciences社）、あるいはＰＬ２と共に氷上で３０分インキュベートした。培地で過剰抗体を洗浄後、この細胞を前記ＨＥＶ７１−１０９５結合試験に供した。その後、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合を、前記フローサイトメトリー法により測定した。
【００６４】
図２に示すように、上記のように試験したＩｇＧ１、ＫＰＬ１、ＰＬ２のうち、ＫＰＬ１のみが抗体濃度依存的にヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合を阻害した。この結果は、ヒトＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質Ｎ末端にあるＫＰＬ１抗体認識領域部位がＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００６５】
[実施例４]
本実施例では、ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質のＮ末端にあるチロシン４６位、４８位、５１位の存在、およびそのチロシンの硫酸化がＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００６６】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターＮ末端領域のチロシン欠失変異体作製＝＝
pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターを鋳型とし、チロシン欠失ＰＳＧＬ−１変異体をコードするＤＮＡ増幅のため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＰＳＧＬ−１−ｄ４６５１−Ｓ：ggccaccgaagatttcctgccagaaacgga （配列番号１９）
ＰＳＧＬ−１−ｄ４６５１−ＡＳ：gcaggaaatcttcggtggcctgtctccggt（配列番号２０）
【００６７】
ここで得られたＤＮＡ断片をpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに挿入し、これを２９３Ｔ細胞に導入してチロシン欠失ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を作製した。
【００６８】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターＮ末端領域のチロシン置換ＰＳＧＬ−１変異体の作製＝＝
ＰＳＧＬ−１Ｎ末端領域のチロシンＹ４６、Ｙ４８、Ｙ５１がフェニルアラニンに置換された変異体を作製するため、pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＹ４６置換変異体（Ｙ４６Ｆ）、Ｙ４８置換変異体（Ｙ４８Ｆ）、Ｙ５１置換変異体（Ｙ５１Ｆ）、Ｙ４６−４８置換変異体（Ｙ４６４８Ｆ）、Ｙ４６−５１置換変異体（Ｙ４６５１Ｆ）、Ｙ４８−５１置換変異体（Ｙ４８５１Ｆ）、Ｙ４６−４８−５１置換変異体（ＦＦＦ）のＤＮＡを増幅した。
Ｙ４６Ｆ−Ｓ：tttgagtacctagattatgatttcctgccagaa（配列番号２１）
Ｙ４６Ｆ−ＡＳ：ataatctaggtactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号２２）
Ｙ４８Ｆ−Ｓ：tatgagttcctagattatgatttcctgccagaa（配列番号２３）
Ｙ４８Ｆ−ＡＳ：ataatctaggaactcatattcggtggcctgtctcc（配列番号２４）
Ｙ５１Ｆ−Ｓ：tatgagtacctagattttgatttcctgccagaa（配列番号２５）
Ｙ５１Ｆ−ＡＳ：aaaatctaggtactcatattcggtggcctgtctcc（配列番号２６）
Ｙ４６４８Ｆ−Ｓ：tttgagttcctagattatgatttcctgccagaa（配列番号２７）
Ｙ４６４８Ｆ−ＡＳ：ataatctaggaactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号２８）
Ｙ４６５１Ｆ−Ｓ：tttgagtacctagattttgatttcctgccagaa（配列番号２９）
Ｙ４６５１Ｆ−ＡＳ：aaaatctaggtactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号３０）
Ｙ４８５１Ｆ−Ｓ：tatgagttcctagattttgatttcctgccagaa（配列番号３１）
Ｙ４８５１Ｆ−ＡＳ：aaaatctaggaactcatattcggtggcctgtctcc（配列番号３２）
ＦＦＦ−Ｓ：tttgagttcctagattttgatttcctgccagaaac（配列番号３３）
ＦＦＦ−ＡＳ：aaaatctaggaactcaaattcggtggcctgtctcc（配列番号３４）
【００６９】
ここで得られたＤＮＡ断片をpEF6-Flag-3S発現ベクターのＳａｎＤＩ制限酵素サイトに挿入し、これを２９３Ｔ細胞に導入してチロシン欠失ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を作製した。対照群として、挿入ＤＮＡのないpEF6-Flag-3S発現ベクターを同様にして２９３Ｔ細胞に導入した。
【００７０】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合の測定＝＝
５×１０５個のチロシン欠失またはチロシン置換ＰＳＧＬ−１発現形質転換２９３Ｔ細胞を、ＨＥＶ−１０９５を用いて前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。その後、ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１−１０９５との結合を前記フローサイトメトリー法に記載の２色フローサイトメトリー法により検出した。
【００７１】
図３に示すように、ＰＳＧＬ−１を発現する２９３Ｔ細胞（陽性対照群）では結合が検出された。Ｙ４６のみ、あるいはＹ４８のみをフェニルアラニンに置換した場合には結合が減少した。しかし、これら３つのチロシンのうち２つを置換した場合には、それがいずれのチロシンであっても結合は検出されなかった。また、３つのチロシンを置換（ＦＦＦ）あるいは欠失した場合（ｄ４６−５１）にも、結合は検出されなかった。この結果は、ＰＳＧＬ−１レセプターのＮ末端側のチロシンがＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００７２】
[実施例５]
本実施例は、ＰＳＧＬ−１レセプターのＮ末端領域のチロシンの硫酸化がＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要であることを示す。
【００７３】
＝＝塩素酸ナトリウムによるチロシン硫酸化の阻害＝＝
塩素酸ナトリウムは、ＰＳＧＬ−１のP-selectinへの結合を阻害するチロシン硫酸化阻害剤である（Pouyani and Seed, Cell 83: 333-343, 1995）。そこで、ＰＳＧＬ−１レセプターのチロシン硫酸化を阻害するため、０、１０、２０、５０ｍＭのいずれかの濃度の塩素酸ナトリウムを加えた培地中で２９３Ｔ細胞を１日培養した。その後、pEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターをこの２９３Ｔ細胞に導入し、ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞を作製した。４時間後に塩素酸ナトリウムを含む培地と交換し、このヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞をさらに２０時間培養した。
【００７４】
この細胞を、ＨＥＶ−１０９５を用いて前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。その後、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１−１０９５との結合を、前記フローサイトメトリー法により検出した。また、ＰＳＧＬ−１レセプターの発現量に対する塩素酸ナトリウムの影響を、ＰＬ２抗体を用いたフローサイトメトリー法で解析した。
【００７５】
図４に示すように、塩素酸ナトリウムの濃度は、ＰＳＧＬ−１レセプターの発現には影響しなかった（Ａ）。一方で、塩素酸ナトリウムの濃度依存的にヒトＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合が阻害された（Ｂ）。このように、ヒトＰＳＧＬ−１レセプターのＮ末端領域のチロシンの硫酸化はＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合に必要である。
【００７６】
[実施例６]
本実施例では、ＨＥＶ７１が宿主細胞のＰＳＧＬ−１レセプターに結合することによって、ＨＥＶ７１が宿主細胞に感染することを示す。さらに、この感染がＰＳＧＬ−１特異的抗体または非膜結合性ＰＳＧＬ−１タンパク質によって阻害されることを示す。
【００７７】
＝＝Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞＝＝
ヒトＰＳＧＬ−１を発現するマウスＬ細胞株を得るため、マウスＬ細胞に前記実施例２に記載のpEF-ヒトPSGL-1組換え発現ベクターを導入した。得られた形質転換細胞の中から、５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ ＨＣｌ（Invitrogen社）の存在下で安定な細胞を選抜した。さらに、選抜された１６コロニーの中から、ＰＳＧＬ−１発現レベルの高い３つの細胞コロニーを選抜した。最終的に、ＨＥＶ７１−１０９５が高効率で増殖する細胞株をＬ−ＰＳＧＬ−１．１とした。
【００７８】
陰性対照細胞株として、Ｌ−ｂｓｄ細胞株を用いた。この細胞株は、挿入ＤＮＡを持たないpEF6-Flag-3S発現ベクターを上記と同様にしてマウスＬ細胞に導入した後、５μｇ／ｍｌブラストサイジンＳ ＨＣｌにより形質転換細胞を選択して得られた細胞株である。
【００７９】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターを介するＨＥＶ７１の感染、増殖とその阻害＝＝
Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞を、ＨＥＶ−１０９５を用いて前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。このとき、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞の陰性コントロールとして、Ｌ細胞、Ｌ−ｂｓｄ細胞にも同様にしてＨＥＶ７１−１０９５を接種した。
【００８０】
ＰＳＧＬ−１レセプター特異的抗体によるＨＥＶ７１の結合阻害を試験するために、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１細胞を１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１（陰性対照群）、ＫＰＬ１、ＰＬ２のいずれかと３４℃で１時間インキュベートし、洗浄後、さらに１０μｇ／ｍｌの前記抗体を含有する培地で培養した。この細胞に、上述と同様にＨＥＶ７１−１０９５を接種し、培養した。
【００８１】
非膜結合性キメラＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質であるＰＳＧＬ−１−Ｆｃ（カタログ番号137-PS-050、R&D Systems社）によるＨＥＶ７１の結合阻害を試験するため、ＨＥＶ７１−１０９５（１×１０５ ＣＣＩＤ５０）を１μｇ／１００μｌのＰＳＧＬ−１−Ｆｃと共に３４℃で１時間インキュベートした後、上記阻害なしの群と同様にして４×１０４個のＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞に接種した。このとき、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃの陰性対照群として、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（カタログ番号325-CT-200/CF 、R&D Systems社）を用いた。得られた感染細胞をさらにＰＳＧＬ−１−Ｆｃの存在下で３４℃で１時間インキュベートし、洗浄後、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃを含まない培地で培養した。その後、この感染細胞のウイルス力価を測定した。この測定には、ＲＤ細胞と９６穴プレートを用いたマイクロタイトレーション法を用い、各サンプルあたり３回ずつ測定した。ウイルス液を１０倍から１０８倍まで、１０倍ごとに段階希釈した。各希釈のウイルス液をプレートの１０穴に各１００μｌ入れ、次に、ＲＤ細胞（４×１０４細胞／１００μｌ）を加えた後３７℃で７日間培養し、ＣＣＩＤ５０を算出した。
【００８２】
図５Ａに示すように、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１において、ＨＥＶ７１−１０９５接種によって、ウイルス力価上昇が生じた。一方で、ＰＳＧＬ−１を発現しないＬ細胞およびＬ−ｂｓｄにおいてはＨＥＶ７１−１０９５の接種によってウイルス力価は変化しなかった。この結果は、ＨＥＶ７１の増殖には、宿主細胞のＰＳＧＬ−１レセプターが必要であることを示す。
【００８３】
また、図５Ｂに示すように、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１にＨＥＶ７１を接種した時、ＰＳＧＬ−１レセプター特異的抗体であるＫＰＬ１と共にインキュベートした場合、対照群（ＩｇＧ１、ＰＬ２）と比較してＨＥＶ７１の増殖が有意に阻害された。このように、宿主細胞（Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１）へのＨＥＶ７１の結合にＰＳＧＬ−１レセプターのＫＰＬ１認識部位が必要であり、さらに、このＫＰＬ１認識部位をＫＰＬ１抗体でブロックすることによってＨＥＶ７１の感染、増殖が抑制される。
【００８４】
図５Ｃに示すように、Ｌ−ＰＳＧＬ−１．１にＨＥＶ７１を接種した時、非膜結合性ＰＳＧＬ−１キメラタンパク質と共にインキュベートするとＨＥＶ７１の増殖が抑制された。このように、ＨＥＶ７１とＰＳＧＬ−１レセプターの結合に競合するＰＳＧＬ−１の非膜結合性タンパク質がＨＥＶ７１の感染、増殖の阻害物質として利用できる。
【００８５】
[実施例７]
本実施例では、ＨＥＶ７１とＰＳＧＬ−１レセプターとの結合のために、ＨＥＶ７１の構造タンパク質のアミノ酸配列の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることが好ましく、グリシンまたはグルタミンであることがさらに好ましいことを示す。
【００８６】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１の結合性の測定＝＝
実施例２と同様に、７種の異なるＨＥＶ７１の分離株を実施例２で作製したヒトＰＳＧＬ−１レセプターを発現する２９３Ｔ細胞表面にそれぞれ結合させ、前記ＨＥＶ７１結合試験に供した。また、ここで、ＨＥＶ７１非感染ＲＤ細胞（２．５×１０６細胞／２５ｍｌ）を７２時間培養し、得られた培地上澄み液（５００μｌ）を陰性対照群として、上記試験群と同様にＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。その後、これらの２９３Ｔ細胞におけるＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１各分離株の結合を、前記フローサイトメトリー法により測定した。
【００８７】
図６に示すように、試験に供したＨＥＶ７１分離株７株のうち、ＳＫ−ＥＶ００６、Ｃ７/Ｏｓａｋａ、１０９５、７５−Ｙａｍａｇａｔａの各分離株はＰＳＧＬ−１レセプターとの結合が検出された。一方、陰性対照群、およびＢｒＣｒ、Ｎａｇｏｙａ、０２３６３の各分離株はＰＳＧＬ−１レセプターとの結合が検出されなかった。
【００８８】
＝＝ＰＳＧＬ−１レセプター結合性ＨＥＶ７１のアミノ酸配列の特徴＝＝
本実施例で結合性測定試験に供したＨＥＶ７１分離株のＰ１遺伝子領域がコードするアミノ酸配列を比較し、ＰＳＧＬ−１レセプターとの結合性との関連を検討した。
【００８９】
図７に示すように、ＰＳＧＬ−１レセプターと結合が検出されなかった分離株では、構造タンパク質のアミノ酸配列の７１０番目が共通してグルタミン酸であった。さらに、ＰＳＧＬ−１レセプターとの結合が検出された分離株では、この７１０番目のアミノ酸がグリシンまたはグルタミンであった。
【００９０】
以上の結果は、ＰＳＧＬ−１レセプターとＨＥＶ７１との結合には、ＨＥＶ７１の構造タンパク質のアミノ酸配列の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることが好ましく、グリシンあるいはグルタミンであればより好ましいことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１非発現２９３Ｔ細胞（Ａ、灰色）、ヒトＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｂ、灰色）、マウスＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｃ、灰色）、ｈｍＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞（Ｄ、灰色）にＨＥＶ７１−１０９５を接種した際のＨＥＶ７１結合を示すフローサイトメトリー、および、陰性対照群として各細胞にＨＥＶ７１偽感染ＲＤ細胞の培地上澄みを接種した際（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、白）のフローサイトメトリーの結果を示した図である。
【図２】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞へのＨＥＶ７１の結合試験前に、細胞をＩｇＧ（Ａ）、ＫＰＬ１（Ｂ）、ＰＬ２（Ｃ）と共にインキュベートした際のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１レセプタータンパク質のＮ末端側の３つのチロシンを変異させた場合のＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞とＨＥＶ７１の結合を示すフローサイトメトリーの結果を示した図である。各変異は、ＰＳＧＬ−１非発現（ｐＥＦ、陰性対照群）、チロシン変異なしＰＳＧＬ−１（ＰＳＧＬ−１）、チロシン４６をフェニルアラニンに置換（Ｙ４６Ｆ）、チロシン４８をフェニルアラニンに置換（Ｙ４８Ｆ）、チロシン５１をフェニルアラニンに置換（Ｙ５１Ｆ）、チロシン４６と４８をフェニルアラニンに置換（Ｙ４６４８Ｆ）、チロシン４６と５１をフェニルアラニンに置換（Ｙ４６５１Ｆ）、チロシン４８と５１をフェニルアラニンに置換（Ｙ４８５１Ｆ）、チロシン４６、４８、５１をフェニルアラニンに置換（ＦＦＦ）、チロシン４６、４８、５１を含む領域の欠失（ｄ４６−５１）である。
【図４】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１レセプターの発現量に対する塩素酸ナトリウムの影響（Ａ）、およびＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞とＨＥＶ７１の結合における塩素酸ナトリウムの影響を示したフローサイトメトリーの結果である（Ｂ）。
【図５】本発明の一実施例で、宿主細胞にＨＥＶ７１を接種した際のＨＥＶ７１の力価の変化を示す図である。ＨＥＶ７１をＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞、Ｌ細胞、Ｌ−ｂｓｄに接種後のＨＥＶ７１力価の変化（Ａ）、ＩｇＧ、ＫＰＬ１、ＰＬ２と共にインキュベートし、ＨＥＶ７１をＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞に接種した後のＨＥＶ７１力価の変化（Ｂ）、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＰＳＧＬ−１−Ｆｃと共にインキュベートし、ＨＥＶ７１をＬ−ＰＳＧＬ−１．１細胞に接種した後のＨＥＶ７1力価の変化（Ｃ）を示す。
【図６】本発明の一実施例で、ＰＳＧＬ−１発現２９３Ｔ細胞へのＨＥＶ７１各分離株の結合を示すフローサイトメトリーの結果を示した図である。
【図７】本発明の一実施例で、ＨＥＶ７１各分離株の構造タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現している細胞。
【請求項２】
前記細胞が、２９３Ｔ細胞株、あるいは、Ｌ細胞株由来であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはヒトエンテロウイルスとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部とヒトエンテロウイルスとの結合を検出する検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載の検出方法であって、
請求項１または２に記載の細胞とヒトエンテロウイルスとを接触させ、当該細胞がヒトエンテロウイルス非感染細胞と比較して変形しているか否かを検出する工程を含むことを特徴とする、検出方法。
【請求項５】
前記ヒトエンテロウイルスが、ＨＥＶ−Ａであることを特徴とする、請求項３または４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ＨＥＶ−Ａが、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であることを特徴とする、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記ＨＥＶ７１において、前記構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグリシンまたはグルタミンであることを特徴とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
ヒトエンテロウイルスを結合させるための試薬であって、
ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプター、または、ヒトエンテロウイルスとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部を含有することを特徴とする試薬。
【請求項１０】
前記ヒトエンテロウイルスが、ＨＥＶ−Ａであることを特徴とする、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
前記ＨＥＶ−Ａが、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であることを特徴とする、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記ＨＥＶ７１において、前記構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグリシンまたはグルタミンであることを特徴とする、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
エンテロウイルス感染症を治療または予防する薬剤であって、
ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはヒトエンテロウイルスとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部、ＰＳＧＬ−１レセプターのヒトエンテロウイルスへの結合阻害抗体、または、チロシン硫酸化阻害物質、を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項１５】
前記ヒトエンテロウイルスが、ＨＥＶ−Ａであることを特徴とする、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記ＨＥＶ−Ａが、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグリシンまたはグルタミンであることを特徴とする、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記阻害抗体がＫＰＬ１であることを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれかに記載のエンテロウイルス感染症を治療または予防する薬剤。
【請求項２０】
ヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを発現していることを特徴とする、ヒトを除く哺乳動物。
【請求項１】
ヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを細胞表面に発現している細胞。
【請求項２】
前記細胞が、２９３Ｔ細胞株、あるいは、Ｌ細胞株由来であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはヒトエンテロウイルスとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部とヒトエンテロウイルスとの結合を検出する検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載の検出方法であって、
請求項１または２に記載の細胞とヒトエンテロウイルスとを接触させ、当該細胞がヒトエンテロウイルス非感染細胞と比較して変形しているか否かを検出する工程を含むことを特徴とする、検出方法。
【請求項５】
前記ヒトエンテロウイルスが、ＨＥＶ−Ａであることを特徴とする、請求項３または４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ＨＥＶ−Ａが、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であることを特徴とする、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記ＨＥＶ７１において、前記構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグリシンまたはグルタミンであることを特徴とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
ヒトエンテロウイルスを結合させるための試薬であって、
ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプター、または、ヒトエンテロウイルスとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部を含有することを特徴とする試薬。
【請求項１０】
前記ヒトエンテロウイルスが、ＨＥＶ−Ａであることを特徴とする、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
前記ＨＥＶ−Ａが、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であることを特徴とする、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記ＨＥＶ７１において、前記構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグリシンまたはグルタミンであることを特徴とする、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
エンテロウイルス感染症を治療または予防する薬剤であって、
ヒトまたはサル由来のＰＳＧＬ−１レセプターまたはヒトエンテロウイルスとの結合能を有する前記ＰＳＧＬ−１レセプターの一部、ＰＳＧＬ−１レセプターのヒトエンテロウイルスへの結合阻害抗体、または、チロシン硫酸化阻害物質、を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項１５】
前記ヒトエンテロウイルスが、ＨＥＶ−Ａであることを特徴とする、請求項１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記ＨＥＶ−Ａが、ＨＥＶ７１またはＣＡ１６であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記ＨＥＶ７１において、構造タンパク質のアミノ酸の７１０番目がグリシンまたはグルタミンであることを特徴とする、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記阻害抗体がＫＰＬ１であることを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれかに記載のエンテロウイルス感染症を治療または予防する薬剤。
【請求項２０】
ヒトまたはサル由来の外来性ＰＳＧＬ−１レセプターを発現していることを特徴とする、ヒトを除く哺乳動物。
【図５】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１４８４４９（Ｐ２０１０−１４８４４９Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３０９８３（Ｐ２００８−３３０９８３）
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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