オリゴ糖鎖の生産方法
【課題】 効率的なオリゴ糖鎖の調製方法を提供する。
【解決手段】 糖鎖合成及び分解に関連する遺伝子を導入した組み換え微生物に糖鎖プライマーを投与し、微生物内で糖鎖修飾を行わせ、オリゴ糖鎖を生産する。
【解決手段】 糖鎖合成及び分解に関連する遺伝子を導入した組み換え微生物に糖鎖プライマーを投与し、微生物内で糖鎖修飾を行わせ、オリゴ糖鎖を生産する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬・医療・研究用素材などに利用されるオリゴ糖鎖の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
糖鎖は、天然に存在する他、合成することも可能である。糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成方法（例えば特許文献１）などがある。
【０００４】
これまで動物細胞の機能を利用した糖鎖合成において、糖鎖生産に利用できる細胞に制約がある、或いは培養コストが高い、スケールアップが技術的に困難であることや、得られるオリゴ糖鎖は細胞依存し、目的のオリゴ糖鎖が得るには生産に適した細胞を探索しなくてはならない。また、糖鎖プライマーからの目的とするオリゴ糖鎖の生産効率が低いといった課題がある。
【０００５】
また、酵素を用いた方法では、酵素を精製する必要や、酵素を作用させる反応条件を最適化する必要がある。また、固定化酵素を用いる場合、固定化方法も検討する必要があり、コストや時間がかかる。
【特許文献１】特開２００３−２７４９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の動物細胞を用いた糖鎖プライマー法によりオリゴ糖鎖の生産では、生産効率が低いことや、目的とするオリゴ糖鎖を生産する細胞の探索や培養条件の検討が必要である。また、酵素法による生産では、酵素を精製する必要や、大量に生産するには非常にコストがかかる。そこで、本発明では、医薬・医療・研究用素材などに利用される多様なオリゴ糖鎖を、目的の糖鎖修飾を行う糖鎖合成系酵素の遺伝子を導入した組み換え微生物に糖鎖プライマーを投与し、効率的に種々のオリゴ糖鎖を生産させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに組み換え微生物に対し、糖鎖プライマーを投与することによりオリゴ糖鎖を効率的に生産する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、目的とする糖鎖修飾酵素遺伝子を導入した組み換え微生物に糖鎖プライマーを投与し、糖鎖修飾を行う方法であって、オリゴ糖鎖を効率的に生産する方法を提供する。
【０００９】
上記生産方法において、各種糖鎖修飾酵素遺伝子に対する、種々の組み換え微生物を作製することにより、コンビナトリアルに、糖鎖合成することも可能となる。
【発明の効果】
【００１０】
以上のように、本発明によって、迅速で簡便に、かつ大量の目的となるオリゴ糖鎖を微生物の培養系に糖鎖プライマーを投与することで生産することができることが明らかとなった。更に、動物細胞では少量しか出来ないものや、毒性のあるものをも含む、種々のオリゴ糖鎖をコンビナトリアルに合成することができるため、これまでは不可能であった天然物以外のあらゆるバリエーションを取り揃えることが可能になる。またこのような特徴を有することから、オリゴ糖鎖アレイを作製することも極めて容易である。従って、容易に大量且つ、多種多様のオリゴ糖鎖の生産ができ、様々なオリゴ糖鎖素材を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
本発明の方法では、糖鎖プライマーを用いたオリゴ糖鎖の生産において、生産したい目的のオリゴ糖鎖に適したプライマーと、修飾したい目的物を得るために最適な酵素遺伝子を導入した組み換え微生物を用いることにより、目的のオリゴ糖鎖を安価且つ、効率的に生産させる。
【００１３】
ここで、微生物とは、主に、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、コリネ型細菌または酵母などを指す。また、遺伝子の導入法であるが、宿主-ベクター系が構築されている場合は、ベクターを用いる方法が利用できる。また、相同性組み換えにより導入することも可能である。 このような目的の糖鎖修飾に適した酵素遺伝子の組み換え微生物の培養時において、目的の糖鎖化合物が得られるようなプライマーを、培地中に添加することで行うことができる。糖鎖修飾酵素遺伝子は特に限定されず、所望の対象のオリゴ糖鎖合成に適した様々な酵素遺伝子が用いられ得る。糖鎖修飾酵素遺伝子の例としては、グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、キシロース転移酵素、マンノース転移酵素、シアル酸転移酵素、グルクロン酸転移酵素、グリコサミノグリカン合成酵素などの糖転移酵素遺伝子、或いは、シアリダーゼなどの加水分解酵素の遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定はされない。
【００１４】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の組み換え微生物を、導入した遺伝子が発現する条件で、糖鎖プライマーを添加して培養しながら反応を行い、糖鎖修飾を行うことなどである。
【００１５】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：
（Ｇ1）x（Ｇ2）y（Ｇ3）z−Ｌ−Ｘ
で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2）m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。Ｘは、−Ｎ3、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００１７】
このような糖鎖プライマーを各種微生物の培地に添加して細胞を培養すると、微生物は、糖鎖プライマーを取り込み、微生物体内で発現している酵素が作用し、その糖鎖部分の修飾が行われ、その修飾生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。この糖鎖プライマーからの糖鎖修飾化合物を、培地中から回収及び精製を行うことによりオリゴ糖鎖を得ることができる。
【００１８】
この微生物を用いた、糖鎖プライマー法におけるオリゴ糖鎖の生産において、細胞内での糖鎖合成経路について考察し、糖鎖プライマーへの糖付加の際に糖供与体として原料となる糖ヌクレオチドや、糖ヌクレオチドの前駆体を培地中に添加したり、あるいは糖ヌクレオチド合成系酵素遺伝子を微生物に導入しておくことができる。糖供与体として原料となる糖ヌクレオチドとしては、例えば、ＵＤＰ糖としてＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−N−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−N−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−キシロース、ＵＤＰ−グルクロン酸、GＤＰ糖として、GＤＰ−マンノース、GＤＰ−フコース、ＣＭＰ糖として、ＣＭＰ−N−アセチルノイラミン酸、ＣＭＰ−N−グリコリルノイラミン酸などがあげられる。また、糖ヌクレオチドの前駆体としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ラフィノーズ、ガラクチノール、マルトース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルマンノサミン、N−アセチルマンノサミン６−リン酸、N−アセチルノイラミン酸９−リン酸、N−アセチルノイラミン酸、N−グリコリルノイラミン酸、N−アセチルグルコサミン１−リン酸、フコース１−リン酸、マンノース６−リン酸、マンノース１リン酸、ガラクトース１−リン酸、グルコース１−リン酸、フルクトース６−リン酸などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
この微生物の基質の透過性を向上させるために、ＣＨＡＰＳやＴｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の界面活性剤を加えたり、微生物を乾燥処理することもできる。
【００２０】
精製方法は、特に限定はされないが、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する、液液分配クロマトグラフィなどを用いておこなうことができる。液液分配クロマトグラフィには、さらに、遠心液液分配クロマトグラフィ(ＣＰＣ)、高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）などが含まれる。
【００２１】
液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。
【００２３】
糖脂質類似化合物を含有する試料から酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合、二相溶媒系が、アルコール類、酸、および水を混和して調製されることが好ましい。より好ましくは、アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である。あるいは、二相溶媒系を、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和することで調製することも好ましい。この場合、より好ましくは、二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製されるものである。
【００２４】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。
【００２５】
精製工程には、その他、Sep-Pak C-18カラムを使用した精製、強イオン交換カートリッジカラム、固体吸着剤として、スチレン系合成吸着体、メタクリル系合成吸着体、およびフェノール系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である吸着剤を使用する方法が含まれる。培養物中または培養上清中の糖鎖化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。
【００２６】
強イオン交換カートリッジカラムを使用する場合には、四級アンモニウム基などの官能基を有する充填剤など、当業者に公知のいずれの強イオン交換樹脂も使用することができる。溶出に用いる溶媒系は、クロロホルム、酢酸アンモニウム、アルコール類、エーテル類、および水からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性糖脂質の抽出には、クロロホルム、メタノール、酢酸アンモニウム水溶液の混和液が特に好ましい。
【００２７】
コンビナトリアルにオリゴ糖鎖を生産する方法とは、多種多様な酵素に関連する遺伝子を導入した組み換え微生物を準備し、単段階もしくは多段階に反応させることにより、多種類のオリゴ糖鎖を合成し、バリエーションを揃えることを指す。 またこの方法により、動物細胞などでは発現が抑えられている、わずかしか出来ない糖鎖や天然に存在しないような糖鎖をつくることができる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)と、アルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー（１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
次に下記の方法で、ＧＭ３型糖鎖を得た。
５００ｍＬ容量のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて培養及び、糖鎖伸長反応を行った。バスケットに１０ｇのフィブラセルディスクを保持させた容器に５００ｍｌのＰＢＳを入れ、オートクレーブに滅菌した（１２１℃、２０分）。その後、容器中の液を５００ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地（インビトロジェン社）に置換し、2×１０８ｃｅｌｌｓのベロ細胞を接種し、５０ｒｐｍの回転数で１時間撹拌した。その後、１００ｒｐｍの回転数に上げて、８日間培養を続けた。その間、２〜３日おきに培地を交換した。
その後、１％ ＩＴＳＸ（ＧＩＢＣＯ社製）と、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ のドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて９６時間培養した。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳＸと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し４８時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００２９】
８０枚の１００ｍｍのディッシュに各々、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのベロ細胞を７ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、培養した。培養後、１％ ＩＴＳＸと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間し、糖鎖伸長反応を行った。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳＸと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し９６時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００３０】
上記のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット、及び１００ｍｍのディッシュを用いて培養することによって得られた約３Ｌの培地上清に対し、５０ｇのポリスチレン系の合成吸着剤ＨＰ２０（三菱化学社製）を加え、２時間以上振盪し、糖鎖化合物を吸着剤に吸着させた。吸着後、水洗しメタノールで溶出した。更に、得られた溶出液を、減圧下で濃縮、乾燥させた。乾燥物を３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、濃縮液を調製した。
【００３１】
ＣＰＣにより、濃縮物から生成物の分離精製を行った。条件としては、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い、上層を固定相とし、下層を上から下へ通液させる、下降法にて行った。また、ローターの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３２】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。
溶出されてこない画分を、反転溶出、つまり、固定相を下から上へ通液させることにより、固定相を押し出すことにより、回収した。同様に、溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した。ＧＭ３型糖鎖化合物を含むフラクションを集め、乾燥させた後、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解した後、ＣＰＣにより、n−ブタノール／エタノール／１％酢酸水溶液（４：１：５）を二層系の溶媒として用いて、下降法にて分離を行った。ローターの回転速度は１２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３３】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを２００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析し、ＧＭ３型糖鎖化合物を含む全フラクションを集め、減圧下で乾燥させた。
【００３４】
また、次に示す方法で、シアリダーゼ高生産大腸菌株を作製した。
【００３５】
Arthrobacter ureafaciens由来のL型及びM1型シアリダーゼ遺伝子を取得するためのプライマーとして、Ｐｒｉｍｅｒ-１：TTTTTCATATGAGATCCAACAGCACCTCCG、Ｐｒｉｍｅｒ-２：TTTTTCTCGAGTTAATCGCGGACCAACAGGTCCAC、および、Ｐｒｉｍｅｒ-３：TTTTTCTCGAGTTACGAAATCAGGCCATCCCGCAGを合成し、Arthrobacter ureafaciensの染色体ＤＮＡを鋳型として、L型シアリダーゼ酵素遺伝子はＰｒｉｍｅｒ-１と２、M1型シアリダーゼ酵素遺伝子はＰｒｉｍｅｒ-１と３を用いて、ＰＣＲ法により遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をpT7Blue T-Vectorとライゲートし、E. coliＤＨ５αに形質転換することにより、各々の遺伝子をクローニングした。遺伝子配列は、非特許文献１を参考にした。シーケンス解析により、遺伝子配列を確認した後、得られた各プラスミドを調製した後、制限酵素ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで切断した後、これらの制限酵素で切断したｐＥＴ１９ｂとライゲートし、E. coliＤＨ５αに形質転換することによりｐＥＴ−ＮｅｕＬ及びｐＥＴ−ＮｅｕＭ１を作製した。
【００３６】
ｐＥＴ−ＮｅｕＬ及びｐＥＴ−ＮｅｕＭ１を用いて、E. coli BL21(DE3)pLysSを形質転換し、大腸菌のＬ型及びＭ１型シアリダーゼ高生産株を得た。
（Ｏｈｔａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０６， １０８６−１０８９（１９８９））
Ｌ型及びＭ１型シアリダーゼ高生産大腸菌株を、３７℃にて、100 μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（2 ml）でＯＤ６００＝０．６まで培養した後、最終濃度0.4mMとなるように100mM IPTGを添加し、それと同時に、最終濃度が２５０及び １０００ μMになるようにＧＭ３型糖鎖化合物を添加した。さらに、３時間培養を行うことにより、糖鎖修飾を行った。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＴ１９ｂを導入した大腸菌株を用いて、同様の実験を行った。
【００３７】
糖鎖修飾反応後、培地と細胞を分けて回収した。培地を回収し、更に、細胞は１ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。洗浄液も培地画分に加えた後、培地上清中に含まれる糖脂質化合物については、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。細胞中の糖脂質化合物については、1ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）、１ｍｌのクロロホルム／イソプロパノール／水（７：１１：２）を順に用いて、抽出した。それぞれの溶媒での抽出液を合わせ、溶媒を除去し乾固させ、総脂質抽出物とした。
【００３８】
上記の操作により得られた、培地画分及び菌体画分から調製した、総脂質抽出物を、それぞれ２５μｌ（ＧＭ３型糖鎖化合物２５０μM添加時）或いは２５０μｌ（ＧＭ３型糖鎖化合物１０００μM添加時）のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣに供した。ＨＰＴＬＣの結果を図１に示す。また、ＨＰＴＬＣの結果から、未反応のＧＭ３型糖鎖化合物と、反応後の産物であるＬａｃｔｏｓｅ型糖鎖化合物を定量した結果を図２示す。
【００３９】
シアリダーゼ非導入株においては、菌体内から基質として加えたＧＭ３型糖鎖化合物が検出され、更にはシアリダーゼ高生産株において、培地中のＧＭ３型糖鎖化合物がシアリダーゼ非導入株よりも顕著に減少し、シアリダーゼにより生成するＬａｃｔｏｓｅ型糖鎖化合物が増加していることから、動物細胞を用いた場合と同様に、微生物を用いて糖鎖プライマー法によりオリゴ糖鎖を修飾できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】糖鎖プライマー法により組み換え大腸菌を用いた糖鎖修飾反応を行った後の菌体および培地中に存在する糖鎖化合物のHPTLCによる分析結果を示す。
【図２】糖鎖プライマー法により組み換え大腸菌を用いて修飾した糖鎖化合物及び残存する基質を定量分析した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬・医療・研究用素材などに利用されるオリゴ糖鎖の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
糖鎖は、天然に存在する他、合成することも可能である。糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成方法（例えば特許文献１）などがある。
【０００４】
これまで動物細胞の機能を利用した糖鎖合成において、糖鎖生産に利用できる細胞に制約がある、或いは培養コストが高い、スケールアップが技術的に困難であることや、得られるオリゴ糖鎖は細胞依存し、目的のオリゴ糖鎖が得るには生産に適した細胞を探索しなくてはならない。また、糖鎖プライマーからの目的とするオリゴ糖鎖の生産効率が低いといった課題がある。
【０００５】
また、酵素を用いた方法では、酵素を精製する必要や、酵素を作用させる反応条件を最適化する必要がある。また、固定化酵素を用いる場合、固定化方法も検討する必要があり、コストや時間がかかる。
【特許文献１】特開２００３−２７４９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の動物細胞を用いた糖鎖プライマー法によりオリゴ糖鎖の生産では、生産効率が低いことや、目的とするオリゴ糖鎖を生産する細胞の探索や培養条件の検討が必要である。また、酵素法による生産では、酵素を精製する必要や、大量に生産するには非常にコストがかかる。そこで、本発明では、医薬・医療・研究用素材などに利用される多様なオリゴ糖鎖を、目的の糖鎖修飾を行う糖鎖合成系酵素の遺伝子を導入した組み換え微生物に糖鎖プライマーを投与し、効率的に種々のオリゴ糖鎖を生産させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに組み換え微生物に対し、糖鎖プライマーを投与することによりオリゴ糖鎖を効率的に生産する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、目的とする糖鎖修飾酵素遺伝子を導入した組み換え微生物に糖鎖プライマーを投与し、糖鎖修飾を行う方法であって、オリゴ糖鎖を効率的に生産する方法を提供する。
【０００９】
上記生産方法において、各種糖鎖修飾酵素遺伝子に対する、種々の組み換え微生物を作製することにより、コンビナトリアルに、糖鎖合成することも可能となる。
【発明の効果】
【００１０】
以上のように、本発明によって、迅速で簡便に、かつ大量の目的となるオリゴ糖鎖を微生物の培養系に糖鎖プライマーを投与することで生産することができることが明らかとなった。更に、動物細胞では少量しか出来ないものや、毒性のあるものをも含む、種々のオリゴ糖鎖をコンビナトリアルに合成することができるため、これまでは不可能であった天然物以外のあらゆるバリエーションを取り揃えることが可能になる。またこのような特徴を有することから、オリゴ糖鎖アレイを作製することも極めて容易である。従って、容易に大量且つ、多種多様のオリゴ糖鎖の生産ができ、様々なオリゴ糖鎖素材を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
本発明の方法では、糖鎖プライマーを用いたオリゴ糖鎖の生産において、生産したい目的のオリゴ糖鎖に適したプライマーと、修飾したい目的物を得るために最適な酵素遺伝子を導入した組み換え微生物を用いることにより、目的のオリゴ糖鎖を安価且つ、効率的に生産させる。
【００１３】
ここで、微生物とは、主に、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、コリネ型細菌または酵母などを指す。また、遺伝子の導入法であるが、宿主-ベクター系が構築されている場合は、ベクターを用いる方法が利用できる。また、相同性組み換えにより導入することも可能である。 このような目的の糖鎖修飾に適した酵素遺伝子の組み換え微生物の培養時において、目的の糖鎖化合物が得られるようなプライマーを、培地中に添加することで行うことができる。糖鎖修飾酵素遺伝子は特に限定されず、所望の対象のオリゴ糖鎖合成に適した様々な酵素遺伝子が用いられ得る。糖鎖修飾酵素遺伝子の例としては、グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、キシロース転移酵素、マンノース転移酵素、シアル酸転移酵素、グルクロン酸転移酵素、グリコサミノグリカン合成酵素などの糖転移酵素遺伝子、或いは、シアリダーゼなどの加水分解酵素の遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定はされない。
【００１４】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の組み換え微生物を、導入した遺伝子が発現する条件で、糖鎖プライマーを添加して培養しながら反応を行い、糖鎖修飾を行うことなどである。
【００１５】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：
（Ｇ1）x（Ｇ2）y（Ｇ3）z−Ｌ−Ｘ
で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2）m−、−Ｓ−（ＣＨ2）m−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2）m−から選択される連結基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、mは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。Ｘは、−Ｎ3、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００１７】
このような糖鎖プライマーを各種微生物の培地に添加して細胞を培養すると、微生物は、糖鎖プライマーを取り込み、微生物体内で発現している酵素が作用し、その糖鎖部分の修飾が行われ、その修飾生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。この糖鎖プライマーからの糖鎖修飾化合物を、培地中から回収及び精製を行うことによりオリゴ糖鎖を得ることができる。
【００１８】
この微生物を用いた、糖鎖プライマー法におけるオリゴ糖鎖の生産において、細胞内での糖鎖合成経路について考察し、糖鎖プライマーへの糖付加の際に糖供与体として原料となる糖ヌクレオチドや、糖ヌクレオチドの前駆体を培地中に添加したり、あるいは糖ヌクレオチド合成系酵素遺伝子を微生物に導入しておくことができる。糖供与体として原料となる糖ヌクレオチドとしては、例えば、ＵＤＰ糖としてＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−N−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−N−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−キシロース、ＵＤＰ−グルクロン酸、GＤＰ糖として、GＤＰ−マンノース、GＤＰ−フコース、ＣＭＰ糖として、ＣＭＰ−N−アセチルノイラミン酸、ＣＭＰ−N−グリコリルノイラミン酸などがあげられる。また、糖ヌクレオチドの前駆体としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、ラフィノーズ、ガラクチノール、マルトース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルマンノサミン、N−アセチルマンノサミン６−リン酸、N−アセチルノイラミン酸９−リン酸、N−アセチルノイラミン酸、N−グリコリルノイラミン酸、N−アセチルグルコサミン１−リン酸、フコース１−リン酸、マンノース６−リン酸、マンノース１リン酸、ガラクトース１−リン酸、グルコース１−リン酸、フルクトース６−リン酸などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
この微生物の基質の透過性を向上させるために、ＣＨＡＰＳやＴｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等の界面活性剤を加えたり、微生物を乾燥処理することもできる。
【００２０】
精製方法は、特に限定はされないが、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する、液液分配クロマトグラフィなどを用いておこなうことができる。液液分配クロマトグラフィには、さらに、遠心液液分配クロマトグラフィ(ＣＰＣ)、高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）などが含まれる。
【００２１】
液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。
【００２３】
糖脂質類似化合物を含有する試料から酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合、二相溶媒系が、アルコール類、酸、および水を混和して調製されることが好ましい。より好ましくは、アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である。あるいは、二相溶媒系を、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和することで調製することも好ましい。この場合、より好ましくは、二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製されるものである。
【００２４】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。
【００２５】
精製工程には、その他、Sep-Pak C-18カラムを使用した精製、強イオン交換カートリッジカラム、固体吸着剤として、スチレン系合成吸着体、メタクリル系合成吸着体、およびフェノール系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である吸着剤を使用する方法が含まれる。培養物中または培養上清中の糖鎖化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。
【００２６】
強イオン交換カートリッジカラムを使用する場合には、四級アンモニウム基などの官能基を有する充填剤など、当業者に公知のいずれの強イオン交換樹脂も使用することができる。溶出に用いる溶媒系は、クロロホルム、酢酸アンモニウム、アルコール類、エーテル類、および水からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性糖脂質の抽出には、クロロホルム、メタノール、酢酸アンモニウム水溶液の混和液が特に好ましい。
【００２７】
コンビナトリアルにオリゴ糖鎖を生産する方法とは、多種多様な酵素に関連する遺伝子を導入した組み換え微生物を準備し、単段階もしくは多段階に反応させることにより、多種類のオリゴ糖鎖を合成し、バリエーションを揃えることを指す。 またこの方法により、動物細胞などでは発現が抑えられている、わずかしか出来ない糖鎖や天然に存在しないような糖鎖をつくることができる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）
触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)と、アルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー（１２−ａｚｉｄｏｄｏｄｅｃｙｌ β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
次に下記の方法で、ＧＭ３型糖鎖を得た。
５００ｍＬ容量のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて培養及び、糖鎖伸長反応を行った。バスケットに１０ｇのフィブラセルディスクを保持させた容器に５００ｍｌのＰＢＳを入れ、オートクレーブに滅菌した（１２１℃、２０分）。その後、容器中の液を５００ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地（インビトロジェン社）に置換し、2×１０８ｃｅｌｌｓのベロ細胞を接種し、５０ｒｐｍの回転数で１時間撹拌した。その後、１００ｒｐｍの回転数に上げて、８日間培養を続けた。その間、２〜３日おきに培地を交換した。
その後、１％ ＩＴＳＸ（ＧＩＢＣＯ社製）と、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ のドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて９６時間培養した。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳＸと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し４８時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００２９】
８０枚の１００ｍｍのディッシュに各々、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのベロ細胞を７ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、培養した。培養後、１％ ＩＴＳＸと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間し、糖鎖伸長反応を行った。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳＸと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し９６時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００３０】
上記のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット、及び１００ｍｍのディッシュを用いて培養することによって得られた約３Ｌの培地上清に対し、５０ｇのポリスチレン系の合成吸着剤ＨＰ２０（三菱化学社製）を加え、２時間以上振盪し、糖鎖化合物を吸着剤に吸着させた。吸着後、水洗しメタノールで溶出した。更に、得られた溶出液を、減圧下で濃縮、乾燥させた。乾燥物を３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、濃縮液を調製した。
【００３１】
ＣＰＣにより、濃縮物から生成物の分離精製を行った。条件としては、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い、上層を固定相とし、下層を上から下へ通液させる、下降法にて行った。また、ローターの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３２】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。
溶出されてこない画分を、反転溶出、つまり、固定相を下から上へ通液させることにより、固定相を押し出すことにより、回収した。同様に、溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した。ＧＭ３型糖鎖化合物を含むフラクションを集め、乾燥させた後、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解した後、ＣＰＣにより、n−ブタノール／エタノール／１％酢酸水溶液（４：１：５）を二層系の溶媒として用いて、下降法にて分離を行った。ローターの回転速度は１２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３３】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを２００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析し、ＧＭ３型糖鎖化合物を含む全フラクションを集め、減圧下で乾燥させた。
【００３４】
また、次に示す方法で、シアリダーゼ高生産大腸菌株を作製した。
【００３５】
Arthrobacter ureafaciens由来のL型及びM1型シアリダーゼ遺伝子を取得するためのプライマーとして、Ｐｒｉｍｅｒ-１：TTTTTCATATGAGATCCAACAGCACCTCCG、Ｐｒｉｍｅｒ-２：TTTTTCTCGAGTTAATCGCGGACCAACAGGTCCAC、および、Ｐｒｉｍｅｒ-３：TTTTTCTCGAGTTACGAAATCAGGCCATCCCGCAGを合成し、Arthrobacter ureafaciensの染色体ＤＮＡを鋳型として、L型シアリダーゼ酵素遺伝子はＰｒｉｍｅｒ-１と２、M1型シアリダーゼ酵素遺伝子はＰｒｉｍｅｒ-１と３を用いて、ＰＣＲ法により遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をpT7Blue T-Vectorとライゲートし、E. coliＤＨ５αに形質転換することにより、各々の遺伝子をクローニングした。遺伝子配列は、非特許文献１を参考にした。シーケンス解析により、遺伝子配列を確認した後、得られた各プラスミドを調製した後、制限酵素ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで切断した後、これらの制限酵素で切断したｐＥＴ１９ｂとライゲートし、E. coliＤＨ５αに形質転換することによりｐＥＴ−ＮｅｕＬ及びｐＥＴ−ＮｅｕＭ１を作製した。
【００３６】
ｐＥＴ−ＮｅｕＬ及びｐＥＴ−ＮｅｕＭ１を用いて、E. coli BL21(DE3)pLysSを形質転換し、大腸菌のＬ型及びＭ１型シアリダーゼ高生産株を得た。
（Ｏｈｔａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０６， １０８６−１０８９（１９８９））
Ｌ型及びＭ１型シアリダーゼ高生産大腸菌株を、３７℃にて、100 μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（2 ml）でＯＤ６００＝０．６まで培養した後、最終濃度0.4mMとなるように100mM IPTGを添加し、それと同時に、最終濃度が２５０及び １０００ μMになるようにＧＭ３型糖鎖化合物を添加した。さらに、３時間培養を行うことにより、糖鎖修飾を行った。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＴ１９ｂを導入した大腸菌株を用いて、同様の実験を行った。
【００３７】
糖鎖修飾反応後、培地と細胞を分けて回収した。培地を回収し、更に、細胞は１ｍｌのＰＢＳ（−）で２回洗浄した。洗浄液も培地画分に加えた後、培地上清中に含まれる糖脂質化合物については、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。細胞中の糖脂質化合物については、1ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）、１ｍｌのクロロホルム／イソプロパノール／水（７：１１：２）を順に用いて、抽出した。それぞれの溶媒での抽出液を合わせ、溶媒を除去し乾固させ、総脂質抽出物とした。
【００３８】
上記の操作により得られた、培地画分及び菌体画分から調製した、総脂質抽出物を、それぞれ２５μｌ（ＧＭ３型糖鎖化合物２５０μM添加時）或いは２５０μｌ（ＧＭ３型糖鎖化合物１０００μM添加時）のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣに供した。ＨＰＴＬＣの結果を図１に示す。また、ＨＰＴＬＣの結果から、未反応のＧＭ３型糖鎖化合物と、反応後の産物であるＬａｃｔｏｓｅ型糖鎖化合物を定量した結果を図２示す。
【００３９】
シアリダーゼ非導入株においては、菌体内から基質として加えたＧＭ３型糖鎖化合物が検出され、更にはシアリダーゼ高生産株において、培地中のＧＭ３型糖鎖化合物がシアリダーゼ非導入株よりも顕著に減少し、シアリダーゼにより生成するＬａｃｔｏｓｅ型糖鎖化合物が増加していることから、動物細胞を用いた場合と同様に、微生物を用いて糖鎖プライマー法によりオリゴ糖鎖を修飾できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】糖鎖プライマー法により組み換え大腸菌を用いた糖鎖修飾反応を行った後の菌体および培地中に存在する糖鎖化合物のHPTLCによる分析結果を示す。
【図２】糖鎖プライマー法により組み換え大腸菌を用いて修飾した糖鎖化合物及び残存する基質を定量分析した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の培養系に糖鎖プライマーを投与して、オリゴ糖鎖を生産する方法。
【請求項２】
前記培養系において、糖鎖合成及び分解に関連する遺伝子を導入した、組み換え微生物を利用して、オリゴ糖鎖を生産する方法。
【請求項３】
1種以上の遺伝子を導入した組み換え微生物を使ってコンビナトリアルにオリゴ糖鎖を生産する請求項１，２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって得られたオリゴ糖鎖。
【請求項１】
微生物の培養系に糖鎖プライマーを投与して、オリゴ糖鎖を生産する方法。
【請求項２】
前記培養系において、糖鎖合成及び分解に関連する遺伝子を導入した、組み換え微生物を利用して、オリゴ糖鎖を生産する方法。
【請求項３】
1種以上の遺伝子を導入した組み換え微生物を使ってコンビナトリアルにオリゴ糖鎖を生産する請求項１，２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって得られたオリゴ糖鎖。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２９１１２０（Ｐ２００９−２９１１２０Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４７３６４（Ｐ２００８−１４７３６４）
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月４日（２００８．６．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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