カルシウム結晶化阻害タンパク質
【課題】カルシウム結晶化阻害効果を有するポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。さらに、該遺伝子を用いたカルシウム結晶化阻害効果を有するポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を提供する。
【解決手段】体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進するカルシウム結晶化阻害活性を有するタンパク質、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質の製造方法、ならびにこれを含有してなる飲食物並びに飼料。
【解決手段】体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進するカルシウム結晶化阻害活性を有するタンパク質、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質の製造方法、ならびにこれを含有してなる飲食物並びに飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の菌体から得られるタンパク質の新規な用途に関し、より具体的には、カルシウム結晶化阻害効果を有する、細菌の菌体から得られるタンパク質及びその用途に関する。また、本発明は、カルシウム結晶化阻害効果を有するポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。さらに、該遺伝子を用いたカルシウム結晶化阻害効果を有するポリペプチドの遺伝子工学的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体を構成する無機質の中で最も多く存在するのはカルシウムといわれており、その９９％が骨や歯の構成に利用されており、残りの１％は各種酵素の活性の発現、筋肉の収納、細胞の興奮の沈静あるいは血液凝固作用等の生命活動にとって重要な役割を演じている。 例えば、人間の膵臓で作られ消化作用を助ける膵液の中には、高濃度のカルシウム成分が含まれているが、何らかの理由で生体のバランスが崩れると、炭酸カルシウムの結晶化が起きて結石ができる。また、膵臓以外にも体内では種々の臓器にカルシウム結石が生じ、それが人体に悪影響を及ぼすことから、結石の予防及び治療に利用し得るカルシウムの結晶化を抑制する物質の開発が待たれている。
【０００３】
このように重要なカルシウムではあるが、その摂取量を見てみれば、日本人に必要とされる所要量は成人１日当たり６００ｍｇといわれているが、厚生省保健医療局による平成６年国民栄養調査の結果報告によれば、実際の摂取量は５４５ｍｇと必要量を下回っているのが実状である。カルシウムの摂取不足は、骨粗鬆症、高血圧等の重大な疾病を引き起こすことが知られており、カルシウムの摂取不足は、社会的問題となっている。さらに、食物として胃腸管内で摂取されるカルシウムは、複雑な機構で腸管から血液内に吸収されるが、カルシウム塩やカルシウム剤の腸管内における吸収率は５０％以下であり、半分以上が吸収されずに体外に排出されるという報告もある。そのため、腸管内でのカルシウムの吸収性を高める物質の開発も行われている。
【０００４】
その１つとして、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）が開発されている。ＣＰＰは、カゼインにトリプシンを作用させ、加水分解した分解物中に得られるホスホペプチドであり、カルシウムと結合して可溶性複合体を形成する。このため、水溶液中でカルシウムが沈殿するのを抑制することでカルシウムを可溶化し、カルシウムの吸収率を高めると考えられている（非特許文献１、特許文献１、２）。しかしながら、ＣＰＰは、カゼインの酵素分解物であるため、原料であるカゼインを酵素反応させる必要があり、また酵素分解の副産物であるペプチドが苦味を呈するため、飲食品へ混合する場合にはこの苦味ペプチドを十分に分離する必要がある等幾つかの問題点を有しており、また価格も高価である。
ポリ−Ｌ−グルタミン酸も腸管内でカルシウムの吸収率を高める作用（非特許文献２）を有することが知られているが、これは合成品であるため食品添加物として許可されておらず、安全性等のため利用されていない。また、微生物により産生されるポリ−γ−グルタミン酸（特許文献３）は、カルシウム結晶化抑制活性が低く、かつ溶液の粘度が極めて高いため、取扱いが不便である。
さらに、カルシウムの吸収を促進する物質としては、骨由来のペプチド（特許文献４）、酪酸を基本成分とするもの（特許文献５）があるが、これらは製造上並びに利用上の問題があり実用化には至っていない。
【特許文献１】特開昭５８−１７０４４公報
【特許文献２】特開平７−２４１１７２公報
【特許文献３】特開平３−３０６４８公報
【特許文献４】特開平４−１６１６５公報
【特許文献５】特開平４−１０８３６０公報
【非特許文献１】ジャパンフードサイエンス、第１巻、第２１〜３２頁、１９９０年
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５８巻、第１６６２〜１６６５頁、１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進するカルシウム結晶化阻害活性を有するタンパク質、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質の製造方法、ならびに上記タンパク質を含有してなる飲食物並びに飼料の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進するカルシウム結晶化阻害活性を有するタンパク質を得ることを目的として鋭意研究、探索の結果、目的に適した性質を有するタンパク質を生産する微生物を見出すことに成功し、該微生物よりタンパク質を単離することに成功した。
さらに、本発明者らは、上記のタンパク質をコードする遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子を用いる遺伝子工学的手法により、本発明のカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドを簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕以下の（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド；
（３）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上２１個以下のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド。
〔２〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕以下の（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（１）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列表の配列番号２に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（３）配列表の配列番号２に示される塩基配列において、１個以上６５個以下の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われた塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（４）配列表の配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（５）請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
〔４〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる〔３〕記載のＤＮＡ。
〔５〕〔３〕記載のＤＮＡを含むベクター。
〔６〕〔５〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔７〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを培養する工程、および培養物から〔１〕に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔１〕記載のポリペプチドの製造方法。
〔８〕〔６〕記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物から〔１〕に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔１〕に記載のポリペプチドの製造方法。
〔９〕〔１〕記載のポリペプチドを有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化阻害・吸収促進剤。
〔１０〕〔９〕記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物。
〔１１〕〔９〕記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料。
〔１２〕さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする〔１０〕記載の飲食物。
〔１３〕さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする〔１１〕記載の飼料。
【０００８】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本明細書において、カルシウム結晶化阻害とは、炭酸カルシウム結晶やリン酸カルシウム結晶の析出を抑制する効果のことをいい、その１例としては、炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３水溶液）と塩化カルシウム水溶液（ＣａＣｌ２水溶液）の反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用したカルシウム結晶化阻害で判定できる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１１０（１）、ｐ６９〜７４、１９８３年）。すなわち、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）にタンパク質抽出液を３０μｌ添加し、スターラーで良く攪拌して、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した塩化カルシウム水溶液（１．５ｍｌ）を添加し、２５℃において反応させた場合、炭酸カルシウムの結晶の析出がほとんど検出されず、反応開始から１０分後の波長５７０ｎｍにおける吸光度の変化量が、タンパク質抽出物を添加しないものと比べて１／１０以下である場合、本明細書において、そのタンパク質はカルシウム結晶化阻害活性を有する。
【０００９】
本発明のカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド（タンパク質）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、上記アミノ酸配列において１個以上２１個以下のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われたアミノ酸配列を含み、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドも本発明の一つの様態であり、上記改変のアミノ酸の数は、好ましくは１４個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下である。
また、本発明のポリペプチドには、上記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するものが含まれる。配列同一性は、公知の方法で計算することが出来、この計算を行なうための任意コンピュータプログラムを用いて計算することが出来るが、本明細書においては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。
このように、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、カルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドは、例えば、ＢＬＡＳＴで検索して得られた情報を元に、当該配列を有する生物種からＰＣＲ等により増幅した遺伝子や、人工的に合成ＤＮＡ等を用いて作製した遺伝子を用いて組換え発現させることで作製することができる。
本発明のカルシウム結晶化阻害効果を有するタンパク質は、例えば炭酸カルシウム結晶やリン酸カルシウム結晶の析出を抑制する効果を有するタンパク質である。このような性質を有しているものであれば本発明のタンパク質に特に限定はないが、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓが生産するカルシウム結晶化阻害タンパク質が挙げられる。
本発明のカルシウム結晶化阻害効果を有するタンパク質のカルシウム結晶化阻害様式に特に限定はなく、例えば、炭酸カルシウム結晶やリン酸カルシウム結晶の析出を抑制する効果が挙げられる。
【００１０】
なお、下記に示すように上記タンパク質をコードする遺伝子は単離されており、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列も決定されている。該遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示す。
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株を培養し、該培養物から精製することができる。上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手することができる。
また、本発明のタンパク質は、上記ＮＢＲＣ１４１４１株の他に、ＮＢＲＣ１４１４１株の自然的または人為的変異株、その他ＮＢＲＣ１４１４１株と同じ属に属する微生物であって、本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質の産生能を有する微生物から得ることが出来る。人為的変異株は、放射線、紫外線照射や変異誘起剤処理等公知の方法により取得することができる。一般に、同じ属に属する微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列間の相同性は約９９％以上であることが知られている。従って、ＮＢＲＣ１４１４１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９９％以上相同な配列を有する微生物を微生物ＮＢＲＣ１４１４１株と同様に本発明において使用することができる。
上記微生物の培養に用いる培地には、当該微生物が利用し得る窒素源、無機物等を含み、グルコース等を炭素源として含むものを用いることができる。グルコースは、市販のものを用いることができる。窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源はグルコース以外の炭素源としても使用できる。さらに、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いることができる。また、上記培地中に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウムを培地中に添加することでカルシウム結晶化阻害タンパク質を誘導することも可能である。
【００１１】
培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、例えば、培養温度は２０〜４０℃、培地のｐＨはｐＨ６．０〜８．０、培養時間は１２〜７２時間の条件で培養することが出来る。
以上のようにして培養中に産生された本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質は、菌体内に蓄積されるので、培養終了後、遠心分離等により菌体を得ることができる。
得られた菌体を、凍結乾燥等を用いて濃縮した液状酵素として、あるいは凍結乾燥法、噴霧乾燥法等により粉状タンパク質として粗酵素標品を調製することができる。また、通常用いられる精製方法、例えば硫酸アンモニウム塩析、溶媒沈澱法により本発明のタンパク質を部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
【００１２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株から単離された、本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質の活性測定方法および理化学的性質、酵素化学的性質を以下に示す。
（１）酵素化学的測定方法
本発明のカルシウム結晶化阻害効果の活性測定は、以下の通りである。
炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３水溶液）と塩化カルシウム水溶液（ＣａＣｌ２水溶液）の反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用して測定する。本発明のタンパク質を添加した場合、炭酸カルシウムの結晶の析出はほとんど検出されず、波長５７０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した結果、ほとんど検出されなかった。
（２）熱安定性
４０℃から１００℃で一定時間処理した酵素標品の残存活性を測定した結果、本発明のタンパク質は１００℃、６０分間処理で１００％の活性を示した。
（３）分子量
１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、本発明のタンパク質の分子量は約１６ｋＤａと推定された。
（４）エドマン分解法によるアミノ酸配列
エドマン分解法により決定されたＮ末端アミノ酸配列はＫＮＬＶＥＫＳＭＮＴＱＬＳＮＷＦＩＬＹＳＫＬであった。この配列は、配列番号１の１〜２２番目のアミノ酸配列と同じ配列である。
【００１３】
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入が行われたアミノ酸を有し、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包合する。
また、本発明のＤＮＡには、配列表の配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡが包含され、さらに上記の塩基配列において１個以上６５個以下の塩基の置換、欠失、付加または挿入が行われた塩基配列を有し、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも包含される。上記改変の塩基の数は、好ましくは４３個以下、より好ましくは２１個以下、更に好ましくは１０個以下である。
また、本発明のＤＮＡには、配列表の配列番号２に示される塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。本明細書において、配列同一性の計算はＢＬＡＳＴにより行い、配列番号２に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、カルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列は、ＢＬＡＳＴ検索で得られた情報を元に、当該配列を有する生物種からＰＣＲ等により増幅して作製したり、人工的に合成ＤＮＡ等を用いて作製したりすることができる。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも包合される。ハイブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．）に記載の方法により実施することができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件があげられる。好ましくは６５℃、０．５×ＳＳＣで洗浄、より好ましくは６５℃、０．２×ＳＳＣで洗浄、更に好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣで洗浄する条件である。
以上のようにハイブリダイゼーションの条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１４】
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子のクローニングは、例えば、以下のようにして行なうことが出来る。
上述のカルシウム結晶化阻害タンパク質を生産する微生物よりゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡは適当な公知の方法に従って調製でき、例えば、リゾチーム処理、プロテアーゼ処理、ＲＮａｓｅ処理、フェノール処理、エタノール沈殿等の公知の操作を組合わせて調製することが出来る。このようにして得られたゲノムＤＮＡを適当な公知の方法、例えば、超音波処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで、該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。組み換えＤＮＡ分子の作製、形質転換等の操作は、通常用いられる方法、例えば、上記したモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクター、宿主に応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体を含むゲノムライブラリーが得られる。
【００１５】
つぎに、上記のゲノムライブラリーをスクリーニングし、カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体を選択する。当該形質転換体よりカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を単離することが出来る。スクリーニングの方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
（１）カルシウム結晶化阻害活性の発現を指標にしたスクリーニング
ゲノムライブラリーを寒天プレート上で増殖させる。カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体は、カルシウム結晶化阻害活性を持つポリペプチドを発現し、そのカルシウム結晶化阻害活性の有無を測定しコロニーまたはプラークを選択する。
（２）抗体を用いたスクリーニング
カルシウム結晶化阻害タンパク質の粗酵素標品、部分精製酵素標品、精製酵素標品を前記した方法に従って調製し、これらの何れかを抗原として常法に従って抗カルシウム結晶化阻害タンパク質抗体を調製する。
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取る。発現された組み換えタンパク質はコロニー、プラークと共にフィルターに移し取られる。フィルター上の組み換えタンパク質と上記の抗カルシウム結晶化阻害タンパク質抗体を反応させ、該抗体と反応するクローンを同定する。
抗体と反応するクローンの同定は、公知の方法に従って、例えば、抗カルシウム結晶化阻害タンパク質抗体を反応させたフィルターを、パーオキシダーゼ結合二次抗体と反応させた後、発色基質とインキュベートし、発色を検出することによって行なうことが出来る。
なお、上記（１）、（２）の方法に用いるゲノムライブラリーの作製に、ベクターに組み込まれたＤＮＡ上の遺伝子が高発現されるような発現ベクターを用いた場合には、容易に目的の遺伝子を有する形質転換体を選択することが出来る。
（３）ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取り、変性処理によりＤＮＡをフィルターに固定する。このフィルター上のＤＮＡと標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするクローンを同定する。
本スクリーニングに用いられるプローブとしては、上記したカルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、その他のアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、またはこれらのアミノ酸配列の情報から作製したプライマーによって増幅したＰＣＲ断片等が挙げられる。これらのプローブの標識は特に限定はないが、例えば、ラジオアイソトープ標識、蛍光色素標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識等が挙げられる。
スクリーニングに用いるゲノムライブラリーとしては、以下の方法で作製したカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーを使用しても良い。
【００１６】
カルシウム結晶化阻害タンパク質を生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロンまたはニトロセルロースのフィルターにブロッティングする。このフィルター上のＤＮＡと上記の標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出、精製する。
【００１７】
こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクターに応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーが得られる。
該ゲノムライブラリーを用いることにより、より効率の良いスクリーニングを行なうことが出来る。
【００１８】
上記（１）〜（３）の方法は、何れも形質転換体をスクリーニングして目的の遺伝子をクローニングする方法であるが、ＰＣＲ法を用いることによって、形質転換体を利用することなくｉｎ ｖｉｔｒｏでクローニングを行なうことが出来る。
カルシウム結晶化阻害タンパク質を生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型として、カルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ酸配列の情報をもとに作製したプライマー対を用いたＰＣＲを行い、カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることが出来る。さらに、該断片をプローブとしたハイブリダイゼーションや、該断片の塩基配列をもとに作製されたプライマーを用いたＰＣＲ等により、カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子の全長を得ることが出来る。このようにして得られた遺伝子の塩基配列は、公知の方法に従って決定することが出来る。該クローンがカルシウム結晶化阻害タンパク質のポリペプチド全長をコードしていない場合は、解読された塩基配列をもとに新たなプローブを作製し、該プローブを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、新たなクローンを得る操作を繰り返すことにより、カルシウム結晶化阻害タンパク質のオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、以下ＯＲＦと示す）全体が解読される。その情報をもとに、例えば、カルシウム結晶化阻害タンパク質をコードするＯＲＦ全体を含むクローンを作製することが出来る。
【００１９】
以上のようにして得られたカルシウム結晶化阻害タンパク質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに連結することにより、カルシウム結晶化阻害タンパク質活性を有するポリペプチドを遺伝子工学的に大量に製造することが出来る。
また、公知の方法でカルシウム結晶化阻害タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入することにより、変異を導入したカルシウム結晶化阻害タンパク質を製造することも出来る。変異の導入方法としては特に限定はなく、例えばオリゴヌクレオチドダブルアンバー法〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．；Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７５（１９９５）〕、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法〔Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０（１９８７）〕、Ｋｕｎｋｅｌ法〔Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７（１９８７）〕等を用いることが出来る。
【００２０】
また、発現させようとするカルシウム結晶化阻害タンパク質のＮ末端側にシグナル配列を付加したものをコードする遺伝子を発現させれば、目的のカルシウム結晶化阻害タンパク質を形質転換体外に分泌させることが出来る。
上記の組換えＤＮＡ分子の作製に使用されるベクターは、特に限定するものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することが出来、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。カルシウム結晶化阻害タンパク質の生産を目的として組換えＤＮＡ分子を作製する場合には、プロモーターやその他の発現調節のための領域を含むベクターが好適である。そのようなプラスミドベクターとしては、特に限定はないが、例えば、ｐＥＴベクター等が挙げられる。また、形質転換体の作製に使用される宿主も、特に限定するものではなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、哺乳動物、魚類、昆虫等の培養細胞等を使用することが出来る。形質転換体の作製には、宿主に適したベクターで作製された組換えＤＮＡ分子が使用される。
以下に、カルシウム結晶化阻害タンパク質を遺伝子工学的に製造する方法についてその概略を説明する。例えば、配列表の配列番号１のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクター、例えばｐＥＴベクター等に挿入したプラスミドを構築する。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌、例えば大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等を適当な液体培地中で培養し、必要に応じてＩＰＴＧ等による誘導を行い、各プラスミド上の挿入ＤＮＡ断片にコードされているポリペプチドを発現させる。これらの形質転換体の発現する単位培養液あたりのカルシウム結晶化阻害活性は、通常、野生株より高い値を示す。
【００２１】
以上のようにして遺伝子工学的に生産させた本発明のカルシウム結晶化阻害活性をもつタンパク質は、通常用いられる精製方法、例えば硫酸アンモニウム塩析、溶媒沈澱法により本発明のタンパク質を部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
上記の方法によって得られた本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質はカルシウムの結晶化を抑制し、その結果、本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質は、カルシウムの吸収促進を目的として骨粗鬆症の予防や治療に使用したり、歯の再石灰化を促進して初期の虫歯の予防や治療に使用することができる。
【００２２】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤は、上記方法で調製したものをそのまま使用してもよいが、一般には適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、または適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、所望する場合にはさらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、漫透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、液剤、注射剤、カプセル剤、錠剤、粉剤、シロップ剤等の製剤の形で、カルシウムの吸収促進剤として、或いはリン酸カルシウムの結晶成長剤として使用することができる。
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤は、上記カルシウム結晶化阻害活性をもつタンパク質を、０．００１重量％以上含有するのが好ましい。
【００２３】
また、本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物としては、各種飲食物、例えば、清涼飲料水、果汁飲料、醗酵飲料並びに牛乳等の飲料、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、ビスケット並びにチョコレート等の菓子、アイスクリーム、氷菓等の冷菓、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、ハム、ソーセージ等の畜肉製品、カマボコ、チクワ等の魚肉練り製品、パン、ホットケーキ、各種惣菜類、プリン、スープ等があげられる。
【００２４】
さらには、本発明のドッグフード、キャットフード等のペットフード；家畜（産卵鶏等）の餌等の飼料は、上記カルシウム吸収促進剤、リン酸カルシウム結晶成長剤を含有してなる飼料である。
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤は、上記飲食物、飼料中に、０．００１〜１重量％添加するのが好ましい。
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を、特にカルシウムの吸収促進を目的として使用する場合には、カルシウムを含有する原料、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品に配合するか、又は、カルシウムと共に配合することで、カルシウムの吸収促進効果を一層促進することができる。
カルシウムを含有する原料やカルシウムを本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤とともに飲食物や飼料に配合する場合、カルシウム結晶化抑制・吸収促進剤に対して、カルシウム換算で０．００１〜１０重量％配合するのが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、カルシウム結晶化阻害活性を有する新規タンパク質が提供され、この新規タンパク質を含むカルシウム結晶化阻害・吸収促進剤、上記カルシウム結晶化阻害・吸収促進剤を含有してなる飲食物、飼料を利用して、体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
＜実施例１＞活性測定法
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質の精製を行なうにあたって実施した活性測定は以下のように行った。
ＮａＨＣＯ３水溶液とＣａＣｌ２水溶液との反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用して、カルシウム結晶化抑制効果を判定した。すなわち、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）に、タンパク質抽出液を３０μｌ添加し、スターラーで良く攪拌した。その後、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した塩化カルシウム水溶液（１．５ｍｌ）を添加し、２５℃において反応させた。反応過程中、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。
【００２７】
＜実施例２＞カルシウム結晶化阻害タンパク質の精製
１０ｍｌのＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地、ディフコ社製）にＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｒｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。得られた培養液を前培養液とした。
本培養は、以下の手順で行った。５００ｍｌ容の坂口フラスコにＮＢ培地、１００ｍｌを調製し（２０本）、ＣａＣｌ２を終濃度０．４％（ｗ／ｖ）になるように添加した。これに上記の前培養液１０ｍｌを接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで４０時間培養し、４，７００×ｇ、３０分間の遠心分離により菌体を除いた約５，０００ｍｌの上清を回収した。
これより以降の操作は４℃以下で行った。
上記菌体を５０ｍｌの緩衝液Ｉ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５）で懸濁し、マルチビースショッカー（安井機械社製）で破砕した。その後、９，８００×ｇ、３０分間の遠心分離により上清を回収し、緩衝液Ｉで透析を行い、脱塩を行った。これを６０℃で１時間処理し、１１，９００×ｇ、２５分間の遠心分離により上清を回収し、これを予め緩衝液で平衡化した金属アフィニティー担体であるＩＰＡＣ（エプロージェン社製）に添加し、２０分間攪拌後、３，０００×ｇ、１０分間遠心することにより、非吸着画分を除去した。その後、同様にして１２５ｍｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ１（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．２Ｍ塩化カルシウム、２．０Ｍ塩化ナトリウム）、その後、１２５ｍｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ２（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．６Ｍ硫酸ナトリウム、２．０Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄した後、最後に１２５ｍｌのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｅｒ（ｐＨ６．９）（０．２Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物、０．２Ｍリン酸カリウム、３．０Ｍ塩化ナトリウム）で吸着画分を回収した。得られた吸着画分を１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．５）で透析後、ＥＤＴＡを除くために１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５で透析に対して透析して脱塩を行った。これを遠心限外濾過膜ＣＥＮＴＲＩＣＵＴ（ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて約１ｍｌに濃縮した。
この精製タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したところ、ほぼ単一に精製されており、これを最終タンパク質濃度が０．０４μｇ／ｍｌになるようにして実施例１の測定方法で活性測定を行った結果、図１に示すように炭酸カルシウム塩結晶化阻害活性が確認された（この際のコントロールには緩衝液Ｉを用いた。
【００２８】
＜実施例３＞ クローニング
（３−１）［アミノ末端アミノ酸配列］
カルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。それぞれ約１０ｐｍｏｌ相当の酵素タンパクを含むカルシウム結晶化阻害タンパク質の精製酵素標品溶液を１０〜２０％ ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲル上で分離された酵素をプロブロット（アプライドバイオシステムズ社製）なる膜にブロッティングし、酵素が吸着した部分の膜をプロテインシークエンサー（Ｇ１０００Ａ、ヒューレット・パッカード社製）を用いて分析した。この結果、決定された両酵素のアミノ末端アミノ酸配列はＫＮＬＶＥＫＳＭＮＴＱＬＳＮＷＦＩＬＹＳＫＬであった。
【００２９】
（３−２）［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからの染色体ＤＮＡの調製］
２ｍｌのＮＢ培地にＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株をグリセロールストックより１０μｌを植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液の１ｍｌを１００ｍｌの同培地へ植菌し、同じく３７℃で一晩培養し、８，０００×ｇ、１０分間遠心することにより菌体を回収した。その菌体を１０ｍｌの緩衝液Ａ［１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）］に懸濁し、０．２５ｍｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３７℃、１時間インキュベートした。次に２．５ｍｌの５．０％ ＳＤＳ含有緩衝液Ａを加えた後、６０℃で２０分間振とうしながらインキュベートし、１．５ｍｌのプロテアーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。その後、３７℃で一晩インキュベートし、その溶液に対してほぼ等量のフェノールを加えて室温で約１０分間穏やかに振とうした。２，０００×ｇ、１０分間遠心し、その上清を冷エタノールに移し、染色体ＤＮＡをガラス棒で巻き取った。染色体ＤＮＡを巻き取った後の溶液に、再びほぼ等量のフェノールを加え、同様の操作を行なって再度染色体ＤＮＡを巻き取った。得られた染色体ＤＮＡを１０μｌの緩衝液Ａに懸濁し、ここに５０μｌのＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、３７℃で１０分間インキュベートした。この溶液から染色体ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、５ｍｌの緩衝液Ｂ［１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）］に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し、約５．０ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。その純度をＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで検定したところ、両方共に約１．８であり、以下のクローニングに使用した。
【００３０】
（３−３）［カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子のクローニング］
（３−１）で明らかにされたカルシウム結晶化阻害タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列により、配列表の配列番号３〜６、７〜１０で表わされる混合プライマー１−１〜１−４、２−１〜２−４をデザインし、ＤＮＡ合成機で合成し、精製した。これらのプライマーを用いてＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）によりカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子のクローニングを行なった。
一次ＰＣＲ反応は以下のように行なった。染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化し、その末端にＨｉｎｄＩＩＩアダプターをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにとり、５μｌの１０×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌの混合プライマー１（プライマー１−１〜１−４の混合物）、１μｌのプライマーＣ１（ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマー）、０．５μｌのＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとしたものを用いた。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は９４℃で５分間変性を行なった後、９４℃で３０秒間（変性）→４５℃で３０秒間（プライマーのアニーリング）→７２℃で１０秒間（合成反応）のサイクルを３０サイクル行なった。
【００３１】
次にこの反応液をテンプレートとして用い、２次ＰＣＲを行なった。１次ＰＣＲ後の反応液１μｌをテンプレートとし、混合プライマー２（プライマー２−１〜２−４の混合物）とプライマーＣ２（ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマー）の組み合わせで１次ＰＣＲと同様の条件でＰＣＲを行なった後、上層のミネラルオイルを除去し、次いで５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約１．４ｋｂのＤＮＡフラグメントが確認され、該ＤＮＡフラグメントをＣａ１と命名した。
この増幅フラグメントＣａ１をアガロースゲルより切り出し、ｐＣＲ２．１に連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体から調製したプラスミドをもとにして、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定した。その結果、１４５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦが見出された。
該ＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
なお、Ｎ末端アミノ酸配列は、配列番号１の１〜２２番目のアミノ酸に相当する配列であった。
【００３２】
（３−４）［カルシウム結晶化阻害タンパク質を発現するプラスミドの構築］
プライマー３（配列番号１１）は、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に持ち、さらにアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３５に持つ合成ＤＮＡである。このプライマー３と、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号６〜１１にもち、染色体上のカルシウム結晶化阻害タンパク質の読み枠から約３００ｂｐ下流の相補鎖にハイブリダイズするプライマー４（配列番号１２）を用いて、以下のようにＰＣＲを行った。０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにプライマー５、６を１０ｐｍｏｌずつ、テンプレートとして（３−２）で調製した染色体ＤＮＡ １０ｎｇ、５μｌの１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間→５５℃で２分間→７２℃で２分間のサイクルを２５サイクル行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈澱により濃縮、脱塩し、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製した。この精製したものと同酵素で消化したｐＥＴ１１ａ（宝酒造社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。白色を呈したコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンシングを行い、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＮＢ１０１と命名した。ｐＮＢ１０１は、カルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１〜１４５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
【００３３】
（３−５）［発現テスト］
上記（３−４）で得られた、このｐＮＢ１０１を含む形質転換体を２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を新たに２．５ｍｌの同培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、培養温度を２０℃にしてさらに２時間培養して目的タンパク質を発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、１５０μｌの細胞破砕溶液［１０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に再懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みの抽出液と沈澱とに分離した。それぞれを試料として炭酸カルシウム結晶化阻害活性を測定したところ、上清抽出液に活性が確認された。なお、この活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株のもつ活性の約２５倍であった。
【００３４】
下記に、カルシウム吸収促進を目的として、カルシウムと共に本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有した飲食物及び飼料の実施例を記載する。
【００３５】
実施例４
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％
砂糖 ５５．０％
ブドウ糖 ２３．０％
軟化剤 １．０％
炭酸カルシウム ０．５％
抽出タンパク質 ０．５％
【００３６】
実施例５
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％
砂糖 ７５．０％
還元麦芽糖 ３．６％
軟化剤 １．０％
第二リン酸カルシウム ０．２％
抽出タンパク質 ０．２％
【００３７】
実施例６
下記の処方に従って錠菓を調製した。
砂糖 ７４．０％
乳糖 ２０．０％
グリセリン脂肪酸エステル ０．２％
香料 ０．４％
炭酸カルシウム ０．８％
抽出タンパク質 ０．３％
精製水 ４．５％
【００３８】
実施例７
下記の処方に従ってチョコレートを調製した。
砂糖 ４１．０％
カカオマス １５．０％
全脂粉乳 ２５．０％
ココアバター １８．０％
炭酸カルシウム ０．３％
乳化剤 ０．３％
香料 ０．２％
抽出タンパク質 ０．２％
【００３９】
実施例８
下記の処方に従って飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ５．００％
砂糖 ４．５０％
酸味料 １．２７％
香料 ０．２０％
抽出タンパク質 ０．０２％
塩化カルシウム ０．０１％
精製水 ８９．００％
【００４０】
実施例９
下記の処方に従って飲料を調製した。
オレンジ果汁 ８５．２０％
砂糖 １１．７０％
クエン酸 ２．００％
香料 １．００％
塩化カルシウム ０．０５％
抽出タンパク質 ０．０５％
【００４１】
実施例１０
下記の処方に従ってアイスクリームを調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ０．３％
砂糖 ８．７％
酸味料 １．０％
香料 ０．２％
精製水 ８９．０％
安定剤 ０．３％
塩化カルシウム ０．２％
抽出タンパク質 ０．３％
【００４２】
実施例１１
下記の処方に従って産卵鶏用飼料を調製した。
トウモロコシ ５１．０％
マイロ １５．３％
大豆粕 １７．０％
魚粉 ３．３％
米ぬか ８．２％
食塩 ０．２％
動物性油脂 ３．０％
ビタミンミックス ０．２％
乳酸カルシウム １．０％
抽出タンパク質 ０．８％
【００４３】
実施例１２
下記の処方に従ってカプセル剤を調製した。
抽出タンパク質 ５０．０％
乳糖 ４７．０％
第二リン酸カルシウム １．０％
ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末をハードカプセルに充填した。
【００４４】
実施例１３
下記の処方に従って注射剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．０５％
ブドウ糖 １．００％
第二リン醸カルシウム １．００％
注射用水 ９７．００％
上記混合溶液をメンブランフィルターで濾過後に再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填した後、密封して注射剤とした。
【００４５】
実施例１４
下記の処方に従って錠剤を調製した。
抽出タンパク質 ２０．０％
直打用微粒Ｎｏ．２０９（富士化学社製） ３７．０％
結晶セルロース ３３．０％
ＣＭＣカルシウム ８．０％
ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。
直打用微粒Ｎｏ．２０９（メタケイ酸アルミン酸マグネシウム２０％、トウモロコシデンプン３０％、乳糖５０％）
【００４６】
実施例１５
下記の処方に従ってシロップ剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．１％
単シロップ ３０．０％
精製水 ６９．８％
炭酸カルシウム ０．１％
抽出タンパク質を、精製水で完全に溶解し、シロップを加えて混合し、シロップ剤とした。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例２で得られたタンパク質について、実施例１に記載の測定方法でカルシウム結晶化阻害活性測定を行った結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の菌体から得られるタンパク質の新規な用途に関し、より具体的には、カルシウム結晶化阻害効果を有する、細菌の菌体から得られるタンパク質及びその用途に関する。また、本発明は、カルシウム結晶化阻害効果を有するポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。さらに、該遺伝子を用いたカルシウム結晶化阻害効果を有するポリペプチドの遺伝子工学的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体を構成する無機質の中で最も多く存在するのはカルシウムといわれており、その９９％が骨や歯の構成に利用されており、残りの１％は各種酵素の活性の発現、筋肉の収納、細胞の興奮の沈静あるいは血液凝固作用等の生命活動にとって重要な役割を演じている。 例えば、人間の膵臓で作られ消化作用を助ける膵液の中には、高濃度のカルシウム成分が含まれているが、何らかの理由で生体のバランスが崩れると、炭酸カルシウムの結晶化が起きて結石ができる。また、膵臓以外にも体内では種々の臓器にカルシウム結石が生じ、それが人体に悪影響を及ぼすことから、結石の予防及び治療に利用し得るカルシウムの結晶化を抑制する物質の開発が待たれている。
【０００３】
このように重要なカルシウムではあるが、その摂取量を見てみれば、日本人に必要とされる所要量は成人１日当たり６００ｍｇといわれているが、厚生省保健医療局による平成６年国民栄養調査の結果報告によれば、実際の摂取量は５４５ｍｇと必要量を下回っているのが実状である。カルシウムの摂取不足は、骨粗鬆症、高血圧等の重大な疾病を引き起こすことが知られており、カルシウムの摂取不足は、社会的問題となっている。さらに、食物として胃腸管内で摂取されるカルシウムは、複雑な機構で腸管から血液内に吸収されるが、カルシウム塩やカルシウム剤の腸管内における吸収率は５０％以下であり、半分以上が吸収されずに体外に排出されるという報告もある。そのため、腸管内でのカルシウムの吸収性を高める物質の開発も行われている。
【０００４】
その１つとして、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）が開発されている。ＣＰＰは、カゼインにトリプシンを作用させ、加水分解した分解物中に得られるホスホペプチドであり、カルシウムと結合して可溶性複合体を形成する。このため、水溶液中でカルシウムが沈殿するのを抑制することでカルシウムを可溶化し、カルシウムの吸収率を高めると考えられている（非特許文献１、特許文献１、２）。しかしながら、ＣＰＰは、カゼインの酵素分解物であるため、原料であるカゼインを酵素反応させる必要があり、また酵素分解の副産物であるペプチドが苦味を呈するため、飲食品へ混合する場合にはこの苦味ペプチドを十分に分離する必要がある等幾つかの問題点を有しており、また価格も高価である。
ポリ−Ｌ−グルタミン酸も腸管内でカルシウムの吸収率を高める作用（非特許文献２）を有することが知られているが、これは合成品であるため食品添加物として許可されておらず、安全性等のため利用されていない。また、微生物により産生されるポリ−γ−グルタミン酸（特許文献３）は、カルシウム結晶化抑制活性が低く、かつ溶液の粘度が極めて高いため、取扱いが不便である。
さらに、カルシウムの吸収を促進する物質としては、骨由来のペプチド（特許文献４）、酪酸を基本成分とするもの（特許文献５）があるが、これらは製造上並びに利用上の問題があり実用化には至っていない。
【特許文献１】特開昭５８−１７０４４公報
【特許文献２】特開平７−２４１１７２公報
【特許文献３】特開平３−３０６４８公報
【特許文献４】特開平４−１６１６５公報
【特許文献５】特開平４−１０８３６０公報
【非特許文献１】ジャパンフードサイエンス、第１巻、第２１〜３２頁、１９９０年
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５８巻、第１６６２〜１６６５頁、１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進するカルシウム結晶化阻害活性を有するタンパク質、該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質の製造方法、ならびに上記タンパク質を含有してなる飲食物並びに飼料の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進するカルシウム結晶化阻害活性を有するタンパク質を得ることを目的として鋭意研究、探索の結果、目的に適した性質を有するタンパク質を生産する微生物を見出すことに成功し、該微生物よりタンパク質を単離することに成功した。
さらに、本発明者らは、上記のタンパク質をコードする遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子を用いる遺伝子工学的手法により、本発明のカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドを簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕以下の（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド；
（３）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上２１個以下のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド。
〔２〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕以下の（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（１）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列表の配列番号２に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（３）配列表の配列番号２に示される塩基配列において、１個以上６５個以下の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われた塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（４）配列表の配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（５）請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
〔４〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる〔３〕記載のＤＮＡ。
〔５〕〔３〕記載のＤＮＡを含むベクター。
〔６〕〔５〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔７〕Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを培養する工程、および培養物から〔１〕に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔１〕記載のポリペプチドの製造方法。
〔８〕〔６〕記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物から〔１〕に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする〔１〕に記載のポリペプチドの製造方法。
〔９〕〔１〕記載のポリペプチドを有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化阻害・吸収促進剤。
〔１０〕〔９〕記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物。
〔１１〕〔９〕記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料。
〔１２〕さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする〔１０〕記載の飲食物。
〔１３〕さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする〔１１〕記載の飼料。
【０００８】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
本明細書において、カルシウム結晶化阻害とは、炭酸カルシウム結晶やリン酸カルシウム結晶の析出を抑制する効果のことをいい、その１例としては、炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３水溶液）と塩化カルシウム水溶液（ＣａＣｌ２水溶液）の反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用したカルシウム結晶化阻害で判定できる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１１０（１）、ｐ６９〜７４、１９８３年）。すなわち、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）にタンパク質抽出液を３０μｌ添加し、スターラーで良く攪拌して、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した塩化カルシウム水溶液（１．５ｍｌ）を添加し、２５℃において反応させた場合、炭酸カルシウムの結晶の析出がほとんど検出されず、反応開始から１０分後の波長５７０ｎｍにおける吸光度の変化量が、タンパク質抽出物を添加しないものと比べて１／１０以下である場合、本明細書において、そのタンパク質はカルシウム結晶化阻害活性を有する。
【０００９】
本発明のカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド（タンパク質）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、上記アミノ酸配列において１個以上２１個以下のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われたアミノ酸配列を含み、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドも本発明の一つの様態であり、上記改変のアミノ酸の数は、好ましくは１４個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下である。
また、本発明のポリペプチドには、上記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するものが含まれる。配列同一性は、公知の方法で計算することが出来、この計算を行なうための任意コンピュータプログラムを用いて計算することが出来るが、本明細書においては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。
このように、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、カルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドは、例えば、ＢＬＡＳＴで検索して得られた情報を元に、当該配列を有する生物種からＰＣＲ等により増幅した遺伝子や、人工的に合成ＤＮＡ等を用いて作製した遺伝子を用いて組換え発現させることで作製することができる。
本発明のカルシウム結晶化阻害効果を有するタンパク質は、例えば炭酸カルシウム結晶やリン酸カルシウム結晶の析出を抑制する効果を有するタンパク質である。このような性質を有しているものであれば本発明のタンパク質に特に限定はないが、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓが生産するカルシウム結晶化阻害タンパク質が挙げられる。
本発明のカルシウム結晶化阻害効果を有するタンパク質のカルシウム結晶化阻害様式に特に限定はなく、例えば、炭酸カルシウム結晶やリン酸カルシウム結晶の析出を抑制する効果が挙げられる。
【００１０】
なお、下記に示すように上記タンパク質をコードする遺伝子は単離されており、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列も決定されている。該遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示す。
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株を培養し、該培養物から精製することができる。上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手することができる。
また、本発明のタンパク質は、上記ＮＢＲＣ１４１４１株の他に、ＮＢＲＣ１４１４１株の自然的または人為的変異株、その他ＮＢＲＣ１４１４１株と同じ属に属する微生物であって、本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質の産生能を有する微生物から得ることが出来る。人為的変異株は、放射線、紫外線照射や変異誘起剤処理等公知の方法により取得することができる。一般に、同じ属に属する微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列間の相同性は約９９％以上であることが知られている。従って、ＮＢＲＣ１４１４１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９９％以上相同な配列を有する微生物を微生物ＮＢＲＣ１４１４１株と同様に本発明において使用することができる。
上記微生物の培養に用いる培地には、当該微生物が利用し得る窒素源、無機物等を含み、グルコース等を炭素源として含むものを用いることができる。グルコースは、市販のものを用いることができる。窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源はグルコース以外の炭素源としても使用できる。さらに、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いることができる。また、上記培地中に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウムを培地中に添加することでカルシウム結晶化阻害タンパク質を誘導することも可能である。
【００１１】
培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、例えば、培養温度は２０〜４０℃、培地のｐＨはｐＨ６．０〜８．０、培養時間は１２〜７２時間の条件で培養することが出来る。
以上のようにして培養中に産生された本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質は、菌体内に蓄積されるので、培養終了後、遠心分離等により菌体を得ることができる。
得られた菌体を、凍結乾燥等を用いて濃縮した液状酵素として、あるいは凍結乾燥法、噴霧乾燥法等により粉状タンパク質として粗酵素標品を調製することができる。また、通常用いられる精製方法、例えば硫酸アンモニウム塩析、溶媒沈澱法により本発明のタンパク質を部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
【００１２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株から単離された、本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質の活性測定方法および理化学的性質、酵素化学的性質を以下に示す。
（１）酵素化学的測定方法
本発明のカルシウム結晶化阻害効果の活性測定は、以下の通りである。
炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３水溶液）と塩化カルシウム水溶液（ＣａＣｌ２水溶液）の反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用して測定する。本発明のタンパク質を添加した場合、炭酸カルシウムの結晶の析出はほとんど検出されず、波長５７０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した結果、ほとんど検出されなかった。
（２）熱安定性
４０℃から１００℃で一定時間処理した酵素標品の残存活性を測定した結果、本発明のタンパク質は１００℃、６０分間処理で１００％の活性を示した。
（３）分子量
１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、本発明のタンパク質の分子量は約１６ｋＤａと推定された。
（４）エドマン分解法によるアミノ酸配列
エドマン分解法により決定されたＮ末端アミノ酸配列はＫＮＬＶＥＫＳＭＮＴＱＬＳＮＷＦＩＬＹＳＫＬであった。この配列は、配列番号１の１〜２２番目のアミノ酸配列と同じ配列である。
【００１３】
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入が行われたアミノ酸を有し、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸をも包合する。
また、本発明のＤＮＡには、配列表の配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡが包含され、さらに上記の塩基配列において１個以上６５個以下の塩基の置換、欠失、付加または挿入が行われた塩基配列を有し、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも包含される。上記改変の塩基の数は、好ましくは４３個以下、より好ましくは２１個以下、更に好ましくは１０個以下である。
また、本発明のＤＮＡには、配列表の配列番号２に示される塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。本明細書において、配列同一性の計算はＢＬＡＳＴにより行い、配列番号２に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、カルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列は、ＢＬＡＳＴ検索で得られた情報を元に、当該配列を有する生物種からＰＣＲ等により増幅して作製したり、人工的に合成ＤＮＡ等を用いて作製したりすることができる。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも包合される。ハイブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．）に記載の方法により実施することができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件があげられる。好ましくは６５℃、０．５×ＳＳＣで洗浄、より好ましくは６５℃、０．２×ＳＳＣで洗浄、更に好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣで洗浄する条件である。
以上のようにハイブリダイゼーションの条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１４】
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子のクローニングは、例えば、以下のようにして行なうことが出来る。
上述のカルシウム結晶化阻害タンパク質を生産する微生物よりゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡは適当な公知の方法に従って調製でき、例えば、リゾチーム処理、プロテアーゼ処理、ＲＮａｓｅ処理、フェノール処理、エタノール沈殿等の公知の操作を組合わせて調製することが出来る。このようにして得られたゲノムＤＮＡを適当な公知の方法、例えば、超音波処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで、該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。組み換えＤＮＡ分子の作製、形質転換等の操作は、通常用いられる方法、例えば、上記したモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクター、宿主に応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体を含むゲノムライブラリーが得られる。
【００１５】
つぎに、上記のゲノムライブラリーをスクリーニングし、カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体を選択する。当該形質転換体よりカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を単離することが出来る。スクリーニングの方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
（１）カルシウム結晶化阻害活性の発現を指標にしたスクリーニング
ゲノムライブラリーを寒天プレート上で増殖させる。カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体は、カルシウム結晶化阻害活性を持つポリペプチドを発現し、そのカルシウム結晶化阻害活性の有無を測定しコロニーまたはプラークを選択する。
（２）抗体を用いたスクリーニング
カルシウム結晶化阻害タンパク質の粗酵素標品、部分精製酵素標品、精製酵素標品を前記した方法に従って調製し、これらの何れかを抗原として常法に従って抗カルシウム結晶化阻害タンパク質抗体を調製する。
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取る。発現された組み換えタンパク質はコロニー、プラークと共にフィルターに移し取られる。フィルター上の組み換えタンパク質と上記の抗カルシウム結晶化阻害タンパク質抗体を反応させ、該抗体と反応するクローンを同定する。
抗体と反応するクローンの同定は、公知の方法に従って、例えば、抗カルシウム結晶化阻害タンパク質抗体を反応させたフィルターを、パーオキシダーゼ結合二次抗体と反応させた後、発色基質とインキュベートし、発色を検出することによって行なうことが出来る。
なお、上記（１）、（２）の方法に用いるゲノムライブラリーの作製に、ベクターに組み込まれたＤＮＡ上の遺伝子が高発現されるような発現ベクターを用いた場合には、容易に目的の遺伝子を有する形質転換体を選択することが出来る。
（３）ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取り、変性処理によりＤＮＡをフィルターに固定する。このフィルター上のＤＮＡと標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするクローンを同定する。
本スクリーニングに用いられるプローブとしては、上記したカルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、その他のアミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、またはこれらのアミノ酸配列の情報から作製したプライマーによって増幅したＰＣＲ断片等が挙げられる。これらのプローブの標識は特に限定はないが、例えば、ラジオアイソトープ標識、蛍光色素標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識等が挙げられる。
スクリーニングに用いるゲノムライブラリーとしては、以下の方法で作製したカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーを使用しても良い。
【００１６】
カルシウム結晶化阻害タンパク質を生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵素で消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイロンまたはニトロセルロースのフィルターにブロッティングする。このフィルター上のＤＮＡと上記の標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行い、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出、精製する。
【００１７】
こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベクターに応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリーが得られる。
該ゲノムライブラリーを用いることにより、より効率の良いスクリーニングを行なうことが出来る。
【００１８】
上記（１）〜（３）の方法は、何れも形質転換体をスクリーニングして目的の遺伝子をクローニングする方法であるが、ＰＣＲ法を用いることによって、形質転換体を利用することなくｉｎ ｖｉｔｒｏでクローニングを行なうことが出来る。
カルシウム結晶化阻害タンパク質を生産する微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型として、カルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ酸配列の情報をもとに作製したプライマー対を用いたＰＣＲを行い、カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることが出来る。さらに、該断片をプローブとしたハイブリダイゼーションや、該断片の塩基配列をもとに作製されたプライマーを用いたＰＣＲ等により、カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子の全長を得ることが出来る。このようにして得られた遺伝子の塩基配列は、公知の方法に従って決定することが出来る。該クローンがカルシウム結晶化阻害タンパク質のポリペプチド全長をコードしていない場合は、解読された塩基配列をもとに新たなプローブを作製し、該プローブを用いてゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、新たなクローンを得る操作を繰り返すことにより、カルシウム結晶化阻害タンパク質のオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、以下ＯＲＦと示す）全体が解読される。その情報をもとに、例えば、カルシウム結晶化阻害タンパク質をコードするＯＲＦ全体を含むクローンを作製することが出来る。
【００１９】
以上のようにして得られたカルシウム結晶化阻害タンパク質をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに連結することにより、カルシウム結晶化阻害タンパク質活性を有するポリペプチドを遺伝子工学的に大量に製造することが出来る。
また、公知の方法でカルシウム結晶化阻害タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入することにより、変異を導入したカルシウム結晶化阻害タンパク質を製造することも出来る。変異の導入方法としては特に限定はなく、例えばオリゴヌクレオチドダブルアンバー法〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．；Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７５（１９９５）〕、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法〔Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０（１９８７）〕、Ｋｕｎｋｅｌ法〔Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７（１９８７）〕等を用いることが出来る。
【００２０】
また、発現させようとするカルシウム結晶化阻害タンパク質のＮ末端側にシグナル配列を付加したものをコードする遺伝子を発現させれば、目的のカルシウム結晶化阻害タンパク質を形質転換体外に分泌させることが出来る。
上記の組換えＤＮＡ分子の作製に使用されるベクターは、特に限定するものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することが出来、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。カルシウム結晶化阻害タンパク質の生産を目的として組換えＤＮＡ分子を作製する場合には、プロモーターやその他の発現調節のための領域を含むベクターが好適である。そのようなプラスミドベクターとしては、特に限定はないが、例えば、ｐＥＴベクター等が挙げられる。また、形質転換体の作製に使用される宿主も、特に限定するものではなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、哺乳動物、魚類、昆虫等の培養細胞等を使用することが出来る。形質転換体の作製には、宿主に適したベクターで作製された組換えＤＮＡ分子が使用される。
以下に、カルシウム結晶化阻害タンパク質を遺伝子工学的に製造する方法についてその概略を説明する。例えば、配列表の配列番号１のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクター、例えばｐＥＴベクター等に挿入したプラスミドを構築する。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌、例えば大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等を適当な液体培地中で培養し、必要に応じてＩＰＴＧ等による誘導を行い、各プラスミド上の挿入ＤＮＡ断片にコードされているポリペプチドを発現させる。これらの形質転換体の発現する単位培養液あたりのカルシウム結晶化阻害活性は、通常、野生株より高い値を示す。
【００２１】
以上のようにして遺伝子工学的に生産させた本発明のカルシウム結晶化阻害活性をもつタンパク質は、通常用いられる精製方法、例えば硫酸アンモニウム塩析、溶媒沈澱法により本発明のタンパク質を部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。
上記の方法によって得られた本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質はカルシウムの結晶化を抑制し、その結果、本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質は、カルシウムの吸収促進を目的として骨粗鬆症の予防や治療に使用したり、歯の再石灰化を促進して初期の虫歯の予防や治療に使用することができる。
【００２２】
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤は、上記方法で調製したものをそのまま使用してもよいが、一般には適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、または適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、所望する場合にはさらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、漫透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、液剤、注射剤、カプセル剤、錠剤、粉剤、シロップ剤等の製剤の形で、カルシウムの吸収促進剤として、或いはリン酸カルシウムの結晶成長剤として使用することができる。
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤は、上記カルシウム結晶化阻害活性をもつタンパク質を、０．００１重量％以上含有するのが好ましい。
【００２３】
また、本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物としては、各種飲食物、例えば、清涼飲料水、果汁飲料、醗酵飲料並びに牛乳等の飲料、チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、ビスケット並びにチョコレート等の菓子、アイスクリーム、氷菓等の冷菓、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、ハム、ソーセージ等の畜肉製品、カマボコ、チクワ等の魚肉練り製品、パン、ホットケーキ、各種惣菜類、プリン、スープ等があげられる。
【００２４】
さらには、本発明のドッグフード、キャットフード等のペットフード；家畜（産卵鶏等）の餌等の飼料は、上記カルシウム吸収促進剤、リン酸カルシウム結晶成長剤を含有してなる飼料である。
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤は、上記飲食物、飼料中に、０．００１〜１重量％添加するのが好ましい。
本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を、特にカルシウムの吸収促進を目的として使用する場合には、カルシウムを含有する原料、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ等の乳製品に配合するか、又は、カルシウムと共に配合することで、カルシウムの吸収促進効果を一層促進することができる。
カルシウムを含有する原料やカルシウムを本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤とともに飲食物や飼料に配合する場合、カルシウム結晶化抑制・吸収促進剤に対して、カルシウム換算で０．００１〜１０重量％配合するのが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、カルシウム結晶化阻害活性を有する新規タンパク質が提供され、この新規タンパク質を含むカルシウム結晶化阻害・吸収促進剤、上記カルシウム結晶化阻害・吸収促進剤を含有してなる飲食物、飼料を利用して、体内でのカルシウムの結晶化を抑制し、カルシウムの腸管内での吸収を促進する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
＜実施例１＞活性測定法
本発明のカルシウム結晶化阻害タンパク質の精製を行なうにあたって実施した活性測定は以下のように行った。
ＮａＨＣＯ３水溶液とＣａＣｌ２水溶液との反応からＣａＣＯ３が析出する反応（ＮａＨＣＯ３＋ＣａＣｌ２→ＣａＣＯ３＋ＨＣｌ＋ＮａＣｌ）を利用して、カルシウム結晶化抑制効果を判定した。すなわち、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した炭酸水素ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）に、タンパク質抽出液を３０μｌ添加し、スターラーで良く攪拌した。その後、２０ｍＭ、ｐＨ８．７に調整した塩化カルシウム水溶液（１．５ｍｌ）を添加し、２５℃において反応させた。反応過程中、波長５７０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。
【００２７】
＜実施例２＞カルシウム結晶化阻害タンパク質の精製
１０ｍｌのＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地、ディフコ社製）にＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｒｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。得られた培養液を前培養液とした。
本培養は、以下の手順で行った。５００ｍｌ容の坂口フラスコにＮＢ培地、１００ｍｌを調製し（２０本）、ＣａＣｌ２を終濃度０．４％（ｗ／ｖ）になるように添加した。これに上記の前培養液１０ｍｌを接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで４０時間培養し、４，７００×ｇ、３０分間の遠心分離により菌体を除いた約５，０００ｍｌの上清を回収した。
これより以降の操作は４℃以下で行った。
上記菌体を５０ｍｌの緩衝液Ｉ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５）で懸濁し、マルチビースショッカー（安井機械社製）で破砕した。その後、９，８００×ｇ、３０分間の遠心分離により上清を回収し、緩衝液Ｉで透析を行い、脱塩を行った。これを６０℃で１時間処理し、１１，９００×ｇ、２５分間の遠心分離により上清を回収し、これを予め緩衝液で平衡化した金属アフィニティー担体であるＩＰＡＣ（エプロージェン社製）に添加し、２０分間攪拌後、３，０００×ｇ、１０分間遠心することにより、非吸着画分を除去した。その後、同様にして１２５ｍｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ１（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．２Ｍ塩化カルシウム、２．０Ｍ塩化ナトリウム）、その後、１２５ｍｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ２（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．６Ｍ硫酸ナトリウム、２．０Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄した後、最後に１２５ｍｌのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｅｒ（ｐＨ６．９）（０．２Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物、０．２Ｍリン酸カリウム、３．０Ｍ塩化ナトリウム）で吸着画分を回収した。得られた吸着画分を１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．５）で透析後、ＥＤＴＡを除くために１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５で透析に対して透析して脱塩を行った。これを遠心限外濾過膜ＣＥＮＴＲＩＣＵＴ（ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて約１ｍｌに濃縮した。
この精製タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したところ、ほぼ単一に精製されており、これを最終タンパク質濃度が０．０４μｇ／ｍｌになるようにして実施例１の測定方法で活性測定を行った結果、図１に示すように炭酸カルシウム塩結晶化阻害活性が確認された（この際のコントロールには緩衝液Ｉを用いた。
【００２８】
＜実施例３＞ クローニング
（３−１）［アミノ末端アミノ酸配列］
カルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。それぞれ約１０ｐｍｏｌ相当の酵素タンパクを含むカルシウム結晶化阻害タンパク質の精製酵素標品溶液を１０〜２０％ ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ゲル上で分離された酵素をプロブロット（アプライドバイオシステムズ社製）なる膜にブロッティングし、酵素が吸着した部分の膜をプロテインシークエンサー（Ｇ１０００Ａ、ヒューレット・パッカード社製）を用いて分析した。この結果、決定された両酵素のアミノ末端アミノ酸配列はＫＮＬＶＥＫＳＭＮＴＱＬＳＮＷＦＩＬＹＳＫＬであった。
【００２９】
（３−２）［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからの染色体ＤＮＡの調製］
２ｍｌのＮＢ培地にＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＢＲＣ１４１４１株をグリセロールストックより１０μｌを植菌し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液の１ｍｌを１００ｍｌの同培地へ植菌し、同じく３７℃で一晩培養し、８，０００×ｇ、１０分間遠心することにより菌体を回収した。その菌体を１０ｍｌの緩衝液Ａ［１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）］に懸濁し、０．２５ｍｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３７℃、１時間インキュベートした。次に２．５ｍｌの５．０％ ＳＤＳ含有緩衝液Ａを加えた後、６０℃で２０分間振とうしながらインキュベートし、１．５ｍｌのプロテアーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。その後、３７℃で一晩インキュベートし、その溶液に対してほぼ等量のフェノールを加えて室温で約１０分間穏やかに振とうした。２，０００×ｇ、１０分間遠心し、その上清を冷エタノールに移し、染色体ＤＮＡをガラス棒で巻き取った。染色体ＤＮＡを巻き取った後の溶液に、再びほぼ等量のフェノールを加え、同様の操作を行なって再度染色体ＤＮＡを巻き取った。得られた染色体ＤＮＡを１０μｌの緩衝液Ａに懸濁し、ここに５０μｌのＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、３７℃で１０分間インキュベートした。この溶液から染色体ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、５ｍｌの緩衝液Ｂ［１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）］に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し、約５．０ｍｇの染色体ＤＮＡを得た。その純度をＯＤ２６０ｎｍ／２８０ｎｍで検定したところ、両方共に約１．８であり、以下のクローニングに使用した。
【００３０】
（３−３）［カルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子のクローニング］
（３−１）で明らかにされたカルシウム結晶化阻害タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列により、配列表の配列番号３〜６、７〜１０で表わされる混合プライマー１−１〜１−４、２−１〜２−４をデザインし、ＤＮＡ合成機で合成し、精製した。これらのプライマーを用いてＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）によりカルシウム結晶化阻害タンパク質遺伝子のクローニングを行なった。
一次ＰＣＲ反応は以下のように行なった。染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化し、その末端にＨｉｎｄＩＩＩアダプターをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにとり、５μｌの１０×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌの混合プライマー１（プライマー１−１〜１−４の混合物）、１μｌのプライマーＣ１（ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマー）、０．５μｌのＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとしたものを用いた。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は９４℃で５分間変性を行なった後、９４℃で３０秒間（変性）→４５℃で３０秒間（プライマーのアニーリング）→７２℃で１０秒間（合成反応）のサイクルを３０サイクル行なった。
【００３１】
次にこの反応液をテンプレートとして用い、２次ＰＣＲを行なった。１次ＰＣＲ後の反応液１μｌをテンプレートとし、混合プライマー２（プライマー２−１〜２−４の混合物）とプライマーＣ２（ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）に添付のプライマー）の組み合わせで１次ＰＣＲと同様の条件でＰＣＲを行なった後、上層のミネラルオイルを除去し、次いで５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約１．４ｋｂのＤＮＡフラグメントが確認され、該ＤＮＡフラグメントをＣａ１と命名した。
この増幅フラグメントＣａ１をアガロースゲルより切り出し、ｐＣＲ２．１に連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体から調製したプラスミドをもとにして、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定した。その結果、１４５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦが見出された。
該ＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
なお、Ｎ末端アミノ酸配列は、配列番号１の１〜２２番目のアミノ酸に相当する配列であった。
【００３２】
（３−４）［カルシウム結晶化阻害タンパク質を発現するプラスミドの構築］
プライマー３（配列番号１１）は、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に持ち、さらにアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３５に持つ合成ＤＮＡである。このプライマー３と、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号６〜１１にもち、染色体上のカルシウム結晶化阻害タンパク質の読み枠から約３００ｂｐ下流の相補鎖にハイブリダイズするプライマー４（配列番号１２）を用いて、以下のようにＰＣＲを行った。０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブにプライマー５、６を１０ｐｍｏｌずつ、テンプレートとして（３−２）で調製した染色体ＤＮＡ １０ｎｇ、５μｌの１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間→５５℃で２分間→７２℃で２分間のサイクルを２５サイクル行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈澱により濃縮、脱塩し、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製した。この精製したものと同酵素で消化したｐＥＴ１１ａ（宝酒造社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。白色を呈したコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンシングを行い、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＮＢ１０１と命名した。ｐＮＢ１０１は、カルシウム結晶化阻害タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１〜１４５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
【００３３】
（３−５）［発現テスト］
上記（３−４）で得られた、このｐＮＢ１０１を含む形質転換体を２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を新たに２．５ｍｌの同培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、培養温度を２０℃にしてさらに２時間培養して目的タンパク質を発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、１５０μｌの細胞破砕溶液［１０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）］に再懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みの抽出液と沈澱とに分離した。それぞれを試料として炭酸カルシウム結晶化阻害活性を測定したところ、上清抽出液に活性が確認された。なお、この活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株のもつ活性の約２５倍であった。
【００３４】
下記に、カルシウム吸収促進を目的として、カルシウムと共に本発明のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有した飲食物及び飼料の実施例を記載する。
【００３５】
実施例４
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％
砂糖 ５５．０％
ブドウ糖 ２３．０％
軟化剤 １．０％
炭酸カルシウム ０．５％
抽出タンパク質 ０．５％
【００３６】
実施例５
下記の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース ２０．０％
砂糖 ７５．０％
還元麦芽糖 ３．６％
軟化剤 １．０％
第二リン酸カルシウム ０．２％
抽出タンパク質 ０．２％
【００３７】
実施例６
下記の処方に従って錠菓を調製した。
砂糖 ７４．０％
乳糖 ２０．０％
グリセリン脂肪酸エステル ０．２％
香料 ０．４％
炭酸カルシウム ０．８％
抽出タンパク質 ０．３％
精製水 ４．５％
【００３８】
実施例７
下記の処方に従ってチョコレートを調製した。
砂糖 ４１．０％
カカオマス １５．０％
全脂粉乳 ２５．０％
ココアバター １８．０％
炭酸カルシウム ０．３％
乳化剤 ０．３％
香料 ０．２％
抽出タンパク質 ０．２％
【００３９】
実施例８
下記の処方に従って飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ５．００％
砂糖 ４．５０％
酸味料 １．２７％
香料 ０．２０％
抽出タンパク質 ０．０２％
塩化カルシウム ０．０１％
精製水 ８９．００％
【００４０】
実施例９
下記の処方に従って飲料を調製した。
オレンジ果汁 ８５．２０％
砂糖 １１．７０％
クエン酸 ２．００％
香料 １．００％
塩化カルシウム ０．０５％
抽出タンパク質 ０．０５％
【００４１】
実施例１０
下記の処方に従ってアイスクリームを調製した。
果糖ブドウ糖液糖 ０．３％
砂糖 ８．７％
酸味料 １．０％
香料 ０．２％
精製水 ８９．０％
安定剤 ０．３％
塩化カルシウム ０．２％
抽出タンパク質 ０．３％
【００４２】
実施例１１
下記の処方に従って産卵鶏用飼料を調製した。
トウモロコシ ５１．０％
マイロ １５．３％
大豆粕 １７．０％
魚粉 ３．３％
米ぬか ８．２％
食塩 ０．２％
動物性油脂 ３．０％
ビタミンミックス ０．２％
乳酸カルシウム １．０％
抽出タンパク質 ０．８％
【００４３】
実施例１２
下記の処方に従ってカプセル剤を調製した。
抽出タンパク質 ５０．０％
乳糖 ４７．０％
第二リン酸カルシウム １．０％
ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末をハードカプセルに充填した。
【００４４】
実施例１３
下記の処方に従って注射剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．０５％
ブドウ糖 １．００％
第二リン醸カルシウム １．００％
注射用水 ９７．００％
上記混合溶液をメンブランフィルターで濾過後に再び除菌濾過を行い、その濾過液を無菌的にバイアルに分注し、窒素ガスを充填した後、密封して注射剤とした。
【００４５】
実施例１４
下記の処方に従って錠剤を調製した。
抽出タンパク質 ２０．０％
直打用微粒Ｎｏ．２０９（富士化学社製） ３７．０％
結晶セルロース ３３．０％
ＣＭＣカルシウム ８．０％
ステアリン酸マグネシウム ２．０％
上記成分を均一に混合し、その混合末を打錠して、１錠２００ｍｇの錠剤とした。
直打用微粒Ｎｏ．２０９（メタケイ酸アルミン酸マグネシウム２０％、トウモロコシデンプン３０％、乳糖５０％）
【００４６】
実施例１５
下記の処方に従ってシロップ剤を調製した。
抽出タンパク質 ０．１％
単シロップ ３０．０％
精製水 ６９．８％
炭酸カルシウム ０．１％
抽出タンパク質を、精製水で完全に溶解し、シロップを加えて混合し、シロップ剤とした。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例２で得られたタンパク質について、実施例１に記載の測定方法でカルシウム結晶化阻害活性測定を行った結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド；
（３）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上２１個以下のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（１）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列表の配列番号２に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（３）配列表の配列番号２に示される塩基配列において、１個以上６５個以下の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われた塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（４）配列表の配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（５）請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを培養する工程、および培養物から請求項１に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求項６記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物から請求項１に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１記載のポリペプチドを有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化阻害・吸収促進剤。
【請求項１０】
請求項９記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物。
【請求項１１】
請求項９記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料。
【請求項１２】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項１０記載の飲食物。
【請求項１３】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項１１記載の飼料。
【請求項１】
以下の（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（２）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド；
（３）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個以上２１個以下のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われたアミノ酸配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の（１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（１）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡ；
（２）配列表の配列番号２に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（３）配列表の配列番号２に示される塩基配列において、１個以上６５個以下の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも１つが行われた塩基配列からなり、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（４）配列表の配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルシウム結晶化阻害活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（５）請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓより得ることのできる請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを培養する工程、および培養物から請求項１に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求項６記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物から請求項１に記載のポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１記載のポリペプチドを有効成分とすることを特徴とするカルシウム結晶化阻害・吸収促進剤。
【請求項１０】
請求項９記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飲食物。
【請求項１１】
請求項９記載のカルシウム結晶化抑制・吸収促進剤を含有してなる飼料。
【請求項１２】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項１０記載の飲食物。
【請求項１３】
さらにカルシウムが配合されていることを特徴とする請求項１１記載の飼料。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２７９３９（Ｐ２００９−２７９３９Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９２５４５（Ｐ２００７−１９２５４５）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（３９９０３００６０）学校法人 関西大学 (208)
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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