ガラクトースの資化能を増大させるポリヌクレオチド、これを含む組み換えベクター、及びこれらを導入した組み換え微生物
【課題】ガラクトースの資化に関与する遺伝子（ＤＮＡ）であって、当該遺伝子の塩基配列を改変することで、ガラクトースの資化能を増大可能な新規のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、及びこれがコードするポリペプチド（タンパク質）を提供する。また、上記の新規なポリヌクレオチド（ＤＮＡ）で形質転換した微生物を利用して、ガラクトースを含む炭素源からバイオアルコールの生産性を増大させうる手段を提供する。
【解決手段】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【解決手段】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトースの資化能を増大させるポリヌクレオチド、これを含む組み換えベクター、及びこれらを導入した組み換え微生物に関する。より具体的には、ガラクトース代謝系遺伝子（以下、「ガラクトースの代謝を促進する遺伝子」ともいう）の発現を抑制するドメインのうち少なくとも一部のアミノ酸配列を欠くタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に化石燃料を過剰に使用することによる資源枯渇及び環境汚染という虞が増大しつつある。このような状況の下で、安定的且つ持続的にエネルギーを生産・供給可能な、新たな再生エネルギーの登場が求められている。このような代替エネルギー開発の一環として、バイオマスからエネルギーを生産する技術が注目されている。
【０００３】
近年、このようなバイオマスを実現し得る生物として、海藻類に対する関心が高まっている。かかる潜在的な生物と言える海藻類の特長は、自然界に豊富に存在し、且つライフサイクルが短いという点にある。また、海藻類は、二酸化炭素を消費して酸素を排出するという代謝を行うため、エネルギー生産と環境問題とを共に解決できるという長所を有する。しかし、海藻類を広く利用し、代替エネルギーとして一般に供給可能な程度までエネルギーを生産できていないのが現状である。
【０００４】
一方、海藻類（特に紅藻類）由来のバイオマスの加水分解物には、ガラクトースが豊富に存在する。したがって、海藻類由来のバイオマスの加水分解物を、酵母を利用して有用物質へと転換することを実現するためには、加水分解物に多量に含有されているガラクトースの効果的な利用が最先に実現されなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７３９３６６９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bro C, Knudsen S, Regenberg B, Olsson L, Nielsen J. 2005. Improvement of galactose uptake in Saccharomyces cerevisiae through overexpression of phosphoglucomutase: example of transcript analysis as a tool in inverse metabolic engineering. Appl. Environ. Microbiol. 71(11):6465-72
【非特許文献２】Ostergaard S, Walloe KO, Gomes SG, Olsson L, Nielsen J. 2001. The impact of GAL6, GAL80, and MIG1 on glucose control of the GAL system in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 1(1):47-55.
【非特許文献３】Ostergaard S, Olsson L, Johnston M, Nielsen J. Increasing galactose consumption by Saccharomyces cerevisiae through metabolic engineering of the GAL gene regulatory network. 2000. Nat. Biotechnol. 18(12):1283-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、自然界に存在する酵母の場合、ガラクトース代謝はするものの、その代謝速度はグルコースに比べて顕著に小さいため、実用化には程遠いという問題がある。
【０００８】
そこで本発明は、ガラクトースの資化に関与する遺伝子（ＤＮＡ）であって、当該遺伝子の塩基配列を改変することで、ガラクトースの資化能を増大可能な新規のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、及びこれがコードするポリペプチド（タンパク質）を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、上記の新規なポリヌクレオチド（ＤＮＡ）で形質転換した微生物を利用して、ガラクトースを含む炭素源からバイオアルコールの生産性を増大させうる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑みて、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対し、所定の改変を施すことによって、結果的にガラクトース代謝系遺伝子の発現量を有意に向上させうることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、上記目的を達成するための本発明に係る単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する点に特徴を有する。
【００１２】
また、上記目的を達成するための本発明に係る単離されたポリペプチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなる点に特徴を有する。
【００１３】
また、上記目的を達成するための本発明に係る組み換えベクターは、上記のポリヌクレオチドを含む点に特徴を有する。
【００１４】
また、上記目的を達成するための本発明に係る組み換え微生物は、上記のポリヌクレオチド、または上記の組み換えベクターを含む点に特徴を有する。
【００１５】
また、上記目的を達成するための本発明に係るエタノールの製造方法は、ガラクトースを含む炭素源からのエタノールの製造方法であって、エタノールが製造されるように、前記炭素源中で上記の組み換え微生物を培養することを含む点に特徴を有する。
【００１６】
また、上記目的を達成するための本発明に係る組み換え微生物の製造方法は、微生物を上記の組み換えベクターで形質転換させることを含む点に特徴を有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対し、所定の改変を施すことによって、結果的にガラクトース代謝系遺伝子の発現量を有意に向上させることができる。これにより、ガラクトースの資化性が著しく増大し、同時にエタノールの生産性も顕著に増大させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１実施形態における、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を示した模式図である
【図２】本発明の実施形態によるＣ末端抑制ドメインが遺失されたＴＵＰ１を示した模式図である。
【図３】本発明の第５実施形態による遺伝子の選別方法を示した模式図である。
【図４】ＴＵＰ１の短縮タンパク質のコード遺伝子を含む遺伝子地図を表す模式図である（酵母ＤＮＡの第３染色体の位置２６１５９４〜２６３３９６）。
【図５】本発明の実施例１で、コントロールである野生型株における、混合糖（２％グルコース及び２％ガラクトース）の資化能を観察したグラフである。
【図６】本発明の実施例１で、ＴＵＰ１短縮タンパク質の過剰発現株における、混合糖（２％グルコース及び２％ガラクトース）の資化能の向上効果を観察したグラフである。
【図７】本発明の実施例２で、コントロールである野生型株における、４％ガラクトースの資化能を観察したグラフである。
【図８】本発明の実施例２で、ＴＵＰ１短縮タンパク質の過剰発現株における、４％ガラクトースの資化能の向上効果を観察したグラフである。
【図９】本発明の実施例３で、コントロールである野生型株における、１０％ガラクトースの資化能を観察したグラフである。
【図１０】本発明の実施例３で、ＴＵＰ１短縮タンパク質の過剰発現株における、１０％ガラクトースの資化能の向上効果を観察したグラフである。
【図１１】本発明の実施例４で、コントロールである野生型株、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株、野生型のＴＵＰ１過剰発現株、及びＴＵＰ１ノックアウト株における、ガラクトースの資化能の向上効果を対比観察したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。本発明の利点、特徴、及びこれを実現するための筋道は、以下の各実施形態における詳細な説明及び添付された図面を参照することにより、さらに容易に理解できる。しかしながら、本発明は、本明細書における説明以外の多様な形態で実施することもできる。したがって、本明細書で言及した実施形態のみに限定されることはない。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００２０】
［第１実施形態：遺伝子及び組み換えタンパク質］
本発明に係る第１実施形態は、（Ａ）配列番号：３で示される塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入、付加または欠損された塩基配列よりなるポリヌクレオチド；及び（Ｂ）配列番号：３で示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列よりなる遺伝子；からなる群より選択されるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドのコードするタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠くポリヌクレオチドに係る。また、好ましくは、前記ポリヌクレオチドのコードするタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠き、且つコリプレッサーとして働くドメインの機能を有するポリヌクレオチドに係る。
【００２１】
また、本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または欠損されたアミノ酸配列からなり、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠く。好ましくは、本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または欠損されたアミノ酸配列からなり、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠き、且つコリプレッサーとして働くドメインの機能を有する。
【００２２】
上記した、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠くタンパク質をコードする遺伝子とは、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増大させることを助けるものである。
【００２３】
上記のガラクトース代謝系遺伝子、すなわち、ガラクトースの代謝を促進する遺伝子としては、以下に限定されることはないが、例えば、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ５（ＰＧＭ１、ＰＧＭ２）などが挙げられる。
【００２４】
ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する遺伝子としては、以下に限定されることはないが、例えば、ＴＵＰ１（配列番号：３で示される塩基配列からなる）、ＧＡＬ４、ＧＡＬ３、ＧＡＬ８０、ＧＡＬ６、ＭＩＧ１、ＳＳＮ６などが挙げられる。したがって、このようなガラクトース代謝を抑制する遺伝子を種々の方法により操作することによって、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増大させることができる。例えば、ガラクトース代謝の抑制遺伝子から、活性部位の発現を抑制するドメインを欠損したり、変形する等の操作を通じて、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増加させることができる。換言すれば、ＴＵＰ１の組み換えタンパク質は、Ｃ末端抑制ドメインの少なくとも一部が欠ける（欠失または欠損する）ことによって、グルコース代謝系遺伝子の発現を阻害する活性を有しなくなる。これにより、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が促進される結果がもたらされる。
【００２５】
一例として、上記の抑制遺伝子は配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「ＴＵＰ１タンパク質」ともいう）をコードする、配列番号：３で示される塩基配列からなる遺伝子であり得る。
【００２６】
図１は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を示した模式図である。図中、上側の数字はアミノ酸の配列番号を示し、下側の数字はＴＵＰ１タンパク質が有するドメインを示す。また、図中の点線は、かかる点線（第２８５番目のアミノ酸配列）からカルボキシル末端側（第３８９番目のアミノ酸配列）までのアミノ酸配列を欠損（または欠失）させることを示すものである。すなわち、ＴＵＰ１タンパク質は、７１３個のアミノ酸からなり、そのアミノ末端側から順に、ＳＳＮ６相互作用ドメイン１、アミノ末端抑制ドメイン２、及びカルボキシル末端抑制ドメイン３を有する。そして、ＳＳＮ６相互作用ドメイン１は第１番目〜第７２番目のアミノ酸配列からなり、アミノ末端抑制ドメイン２は第７２番目〜第２００番目のアミノ酸配列からなり、カルボキシル末端抑制ドメイン３は第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列からなる。各ドメインについては後述する。
【００２７】
上記のＴＵＰ１タンパク質は、酵母内で一般的（非特異的）な抑制因子（リプレッサー）の役割を果たすことが知られており、併せてガラクトース代謝系遺伝子の抑制にも関与することが知られている。特に、サッカロマイセス セレビシエのＴＵＰ１タンパク質（Williams, F. E. et al., Mol. Cell. Biol. 10:6500-6511(1990)）は、ＣＹＳ８（ＳＳＮ６）タンパク質と複合体（コリプレッサー）を形成するタンパク質として発見され、グルコース、酸素及びＤＮＡの損傷により調節される遺伝子の転写抑制に必要なものと知られている(Tzamarias, D. et al., Genes Dev.9:821-831(1995))。かかるコリプレッサーを形成する際、ＴＵＰ１タンパク質においてはＳＳＮ６相互作用ドメイン１が作用する。
【００２８】
上記のＴＵＰ１タンパク質やＣＹＳ８（ＳＳＮ６）タンパク質は、ＤＮＡと直接結合しない。しかし、α２、ＭＩＧ１、ＲＯＸ１及びＡ１のような特定のＤＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる。このようにして、上記のＴＵＰ１タンパク質は、ＳＳＮ６タンパク質と結合して抑制ドメインを形成し、上記したＲＯＸ１等のＤＮＡ結合タンパク質に誘導されて、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を阻害することとなる。かかる阻害の機構について具体的に説明すると、ガラクトース代謝系遺伝子（例えば、ＡＴＦ１遺伝子）の上流（５’側）プロモーターに結合し、かかるプロモーターの働きが阻害される。その結果、ＡＴＦ１遺伝子の発現が有意に抑制される。このとき、ＴＵＰ１タンパク質は、ＲＯＸ１等のＤＮＡ結合タンパク質と結合し、ＲＯＸ１タンパク質のプロモーターへの結合及びその後の阻害作用を促進する、コリプレッサーの構成要素として作用する（Tzamarias, D. et al., Genes Dev.9 : 821-831(1995) 等）。
【００２９】
ここで、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する機能を有する、ＴＵＰ１等のタンパク質中のドメインが、少なくとも一部のアミノ酸配列を欠く場合、前記ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制できなくなることがある。上記した、少なくとも一部のアミノ酸配列を欠く場合とは、例えば、遺伝子発現を抑制するドメインの一部が欠失または欠損される等して短縮した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）場合があり得る。以下、上記した遺伝子発現を抑制するのに重要なドメインの一部を欠いたタンパク質を、「短縮タンパク質」（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称する。
【００３０】
したがって、上記の短縮タンパク質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）が過剰発現すると、ガラクトース代謝系遺伝子の発現抑制機構が正常に進まなくなるため、結果として、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が増大しうる。
【００３１】
本実施形態に係るタンパク質は、上記の遺伝子発現を抑制するドメインを全部欠いたタンパク質であってもよいし、一部のみを欠いたタンパク質であってもよい。また、本実施形態に係るタンパク質は、遺伝子発現を抑制するドメインが二つ以上存在する場合、一以上の任意のドメインについて少なくとも一部を欠いたタンパク質であればよく、特に制限されることはない。
【００３２】
具体的にいえば、上記の遺伝子発現を抑制するドメインは、カルボキシル末端のリプレッサードメインであり得る。当該ドメインがカルボキシル末端（以下、「Ｃ末端」ともいう）である場合、たとえ当該ドメインが全部欠けたとしても、他のよりアミノ末端（以下、「Ｎ末端」ともいう）側に存在するドメインにはほとんど影響がないものと推測される。かかる原理の推測は、ＴＵＰ１において実証した点（後述の実施例等において実証する）、及びタンパク質構造においてＣ末端側アミノ酸配列の短縮による影響が比較的小さい点に基づく。加えて、上述のように、かかるリプレッサードメインの短縮に起因して、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増大させることができる。
【００３３】
図２は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を示した模式図である。本図の見方は、上記の図１と同様であるため、説明を省略する。図２で示されるアミノ酸配列は、図１中の点線からカルボキシル末端までのアミノ酸配列を欠損（または欠失）させたものに相当する。すなわち、図２に示されるアミノ酸配列は、ＴＵＰ１タンパク質のうちＣ末端抑制ドメインを完全に欠損したものに対応する。なお、図２に示したアミノ酸配列についてより正確にいえば、Ｃ末端抑制ドメインを含むＣ末端側のアミノ酸配列が切断されて全て欠いている。図２を見れば、ＴＵＰ１の短縮タンパク質は、ＴＵＰ１タンパク質（正常なタンパク質）中のドメインのうち、Ｃ末端抑制ドメイン３を欠くのみであって、ＳＳＮ６相互作用ドメイン１及びＮ末端抑制ドメイン２は完全な形で正常に有している。したがって、配列番号：２で示されるＴＵＰ１の短縮タンパク質であっても、正常なＳＳＮ６相互作用ドメイン１を介して、ＳＳＮ６タンパク質と相互作用することはできると考えられる。しかしながら、当該短縮タンパク質はＣ末端抑制ドメイン３を欠くため、コリプレッサーとしての機能は有しないと推測される。したがって、ＴＵＰ１の短縮タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質（ＲＯＸ１等）と結合した場合であっても、ＲＯＸ１等による、ガラクトース代謝系遺伝子の阻害作用を抑制ないし阻害することができると推測される。さらに、ＲＯＸ１等はＴＵＰ１タンパク質以外の（コ）リプレッサーとも結合し得るが、ＴＵＰ１の短縮タンパク質の作用に起因した、いわばＲＯＸ１等の「無駄使い」によって、ガラクトース代謝系遺伝子の阻害作用を生体レベルで効果的に阻害することができるものと推測される。
【００３４】
ここで、本明細書における「Ｃ末端ドメイン」とは、カルボキシル末端側のドメインであり、換言すれば、遺伝子の３’末端側に位置する塩基配列（二重鎖若しくは単一鎖）によってコードされたアミノ酸配列を意味する。
【００３５】
上記の推測的な原理を実証する、ＴＵＰ１遺伝子・タンパク質について、以下、詳細に説明する。本実施形態に係る遺伝子は、ＴＵＰ１タンパク質中の遺伝子発現を抑制するＣ末端ドメインのうち、少なくとも一部を欠いたタンパク質をコードする遺伝子であり得る。換言すれば、本実施形態は、ＴＵＰ１タンパク質からＣ末端抑制ドメイン（Ｃ末端側のドメインであってリプレッサーとして機能するドメイン）の少なくとも一部が欠けたＴＵＰ１の組み換えタンパク質を提供する。
【００３６】
前記Ｃ末端ドメインは、一つのポリペプチドの最後のアミノ酸から１／３までの（ポリ）ペプチドを含む。前記タンパク質またはポリペプチドに対応する遺伝子（ＤＮＡ）の３’末端は、ポリＡテール(poly A tail)を含まない。
【００３７】
ここで、本明細書における、タンパク質またはポリペプチドの「Ｃ末端ドメイン」とは、３個以上３５０個以下のアミノ酸長であり得る。以下に制限されないが、例えば、５個、１０個、２０個、２５個、５０個、１００個または２００個のアミノ酸を含み得る。
【００３８】
上記のＴＵＰ１タンパク質のＣ末端側半分は、ＷＤ−４０またはβ−トランスデューシン反復配列として知られた、アスパラギン酸及びトリプトファンの多い４３個のアミノ酸配列からなる６つの反復配列を有する（Williams, F. E. et al., Mol. Cell. Biol. 10:6500-6511(1990); Fong, H.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2162-2166(1986)）。このようなＷＤ−４０の反復配列は多くのタンパク質で確認されており、タンパク質同士の相互作用に働く。
【００３９】
したがって、上記のＴＵＰ１タンパク質を短縮したＣ末端の抑制ドメインはＷＤ−４０の反復配列を含みうる。
【００４０】
本実施形態に係るポリヌクレオチドは、ガラクトース代謝系遺伝子（例えばＡＴＦ１遺伝子）の発現を抑制するＴＵＰ１タンパク質のうち、第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列を欠いたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。前記「第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列」は、ＴＵＰ１タンパク質中のＣ末端抑制ドメインに相当する。したがって、上記のポリヌクレオチドは、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する、ＴＵＰ１タンパク質中のＣ末端ドメインを完全に欠くタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００４１】
さらに、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「組み換えタンパク質」ともいう）は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるＴＵＰ１タンパク質のうち第２８５番目〜第３８９番目のアミノ酸配列を欠いているため、ＴＵＰ１タンパク質中のＣ末端ドメインを完全に欠くタンパク質に含まれる。そして、配列番号：１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（組み換えられたポリヌクレオチド）は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。すなわち、上記のＴＵＰ１の組み換えタンパク質は、配列番号：１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であり得る。なお、本明細書では、以下、上記の第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列を欠いたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを「短縮ポリヌクレオチド」（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とも称する。
【００４２】
ここで、配列番号：１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）からなるポリヌクレオチドは、（Ａ）配列番号：３で示される塩基配列において複数個の塩基が欠失または欠損された塩基配列よりなるポリヌクレオチドに該当し、また、（Ｂ）配列番号：３で示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列よりなるポリヌクレオチドにも該当する。なぜなら、配列番号：３で示される塩基配列のうち、欠失または欠損された塩基配列以外の配列（より５’側の塩基配列）は、配列番号：１で示される塩基配列と同一であるためである。
【００４３】
さらに、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠く。好ましくは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠き、且つコリプレッサーとして働くドメインの機能を有する。上記のＣ末端抑制ドメインを完全に欠いたＴＵＰ１タンパク質は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなり得る。すなわち、上記したＴＵＰ１の組み換えタンパク質は配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。より具体的にいえば、上記の短縮したＴＵＰ１タンパク質は、アミノ酸配列のうち、第２８５番目以降のアミノ酸が欠失または欠損されて、第１番目〜第２８４番目のアミノ酸配列を含むものであり得る。上記の配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、そのＮ末端側に、ＳＳＮ６タンパク質とともにコリプレッサーを形成する際に機能するドメイン（以下、「ＳＳＮ６相互作用ドメイン」ともいう）を含む。また、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、第７２番目〜第２００番目のアミノ酸配列にＮ末端抑制ドメイン（Ｎ末端ドメインであってリプレッサーとして機能するドメイン）を含む。
【００４４】
［第２実施形態：組み換えベクター及び組み換え微生物］
本発明の第２実施形態は、上記第１実施形態のポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに係る。すなわち、上記第１実施形態で述べた遺伝子発現を抑制するドメインの少なくとも一部が欠けたＴＵＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。なお、以下において、上記第１実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００４５】
本明細書における「ベクター」とは、連結された核酸断片を運搬するのに利用可能な核酸分子を意味する。かかる利用可能なベクターとして、特に制限されることはないが、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス及び挿入可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同組み換えにより宿主細胞ゲノム内に挿入可能な断片）を含むことが好ましい。ここで、ベクターの一種である「プラスミド」とは、内部に追加的にＤＮＡ断片を連結されることができる環型の二重鎖ＤＮＡループを意味する。また、「ウイルスベクター」を用いれば、付加したＤＮＡをウイルスゲノム内に連結させることができる。上記したベクターのなかでもより好ましくはプラスミドである。
【００４６】
ここで、前記ベクターは、目的タンパク質をコードする連結されたポリヌクレオチドの発現を指示できるが、このようなベクターを特に、「発現ベクター」という。一般的に、組み換えＤＮＡ技術の利用において、発現ベクターはプラスミドの形態であるため、本明細書で「プラスミド」と記載している場合、「ベクター」と同義でありうる。しかし、ウイルスベクターのように同一の機能を果たす、プラスミド以外の形態の発現ベクターも含むことができることはいうまでもない。
【００４７】
上記の発現ベクターは、酵母内で発現可能であり、遺伝子（ポリヌクレオチド）がベクター中に連結・挿入されるものである。このような発現ベクターの例としては、２ミクロン、pBM272、pBR322-6、pBR322-8、pCS19、pDW227、pDW229、pDW232、pEMBLYe23、pEMBLYe24、pEMBLYi21、pEMBLYi22、pEMBLYi32、pEMBLYr25、pFL2、pFL26、pFL34、pFL35、pFL36、pFL38、pFL39、pFL40、pFL44L、pFL44S、pFL45L、pFL45S、pFL46L、pFL46S、pFL59、pFL59+、pFL64-、pFL64+、pG6、pG63、pGAD10、pGAD424、pGBT9、pGKl2、pJRD171、pKD1、pNKY2003、pNKY3、pNN414、pON163、pON3、pPM668、pRAJ275、pRS200、pRS303、pRS304、pRS305、pRS306、pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426、pRSS56、pSG424、pSKS104、pSKS105、pSKS106、pSZ62、pSZ62、pUC-URA3、pUT332、pYAC2、pYAC3、pYAC4、pYAC5、pYAC55、pYACneo、pYAC-RC、pYES2、pYESHisA、pYESHisB、pYESHisC、pYEUra3、rpSE937、YCp50、YCpGAL0、YCpGAL1、YCplac111、YCplac22、YCplac33、YDp-H、YDp-K、YDp-L、YDp-U、YDp-W、YEp13、YEp213、YEp24、YEp351、YEp352、YEp353、YEp354、YEp355、YEp356、YEp356R、YEp357、YEp357R、YEp358、YEp358R、YEplac112、YEplac181、YEplac195、YIp30、YIp31、YIp351、YIp352、YIp353、YIp354、YIp355、YIp356、YIp356R、YIp357、YIp357R、YIp358、YIp358R、YIp5、YIplac128、YIplac204、YIplac211、YRp12、YRp17、YRp7、pAL19、paR3、pBG1、pDBlet、pDB248X、pEA500、pFL20、pIRT2、pIRT2U、pIRT2-CAN1、pJK148、pJK210、pON163、pNPT/ADE1-3、pSP1、pSP2、pSP3、pSP4、pUR18、pUR19、pZA57、pWH5、pART1、pCHY21、pEVP11、REP1、REP3、REP4、REP41、REP42、REP81、REP82、RIP、REP3X、REP4X、REP41X、REP81X、REP42X、REP82X、RIP3X/s、RIP4X/s、pYZ1N、pYZ41N、pYZ81N、pSLF101、pSLF102、pSLF104、pSM1/2、p2UG、pART1/N795、pYGTなどが挙げられるが、これに限定されるものではない（http://genome-www2.stanford.edu/vectordb/vector.html、及びhttp://pingu.salk.edu/~forsburg/vectors.html参照）。
【００４８】
また、前記ベクターは、下記の開裂地図に示されたプラスミド（ｐＲＳ４２４）であることが好ましい。
【００４９】
【化１】
【００５０】
上記のベクターは、宿主細胞内に導入されて、上記第１実施形態に係るポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質（融合タンパク質を含む）またはペプチドを生産できる。所望により、上記のベクターは宿主生物体により認知されるプロモーターを備えてもよい。かようなプロモーターの配列は、原核生物、真核生物またはウイルス起源であり得る。酵母に適切なプロモーターとして、以下に制限されることはないが、GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10などが挙げられる。
【００５１】
上記のベクターは更なる調節配列を含むことができる。調節配列の例として、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン−ダルガノ配列及びバクテリオファージラムダのｃＩＩのシャイン−ダルガノ配列が代表的なものとして挙げられる。このように、上記ポリヌクレオチドは、発現調節配列に作動可能なように連結されていることが好ましい。また、発現ベクターは形質転換された宿主細胞を選別するのに必要且つ適切なマーカーを含んでもよい。宿主における形質転換は、当業界において公知の多様な技術やＳａｍｂｒｏｏｋの文献に記述されている技術を使用して行われ得る。
【００５２】
［第３実施形態：第２実施形態の組み換えベクターを導入した組み換え微生物］
第３実施形態に係る組み換え微生物は、上記した第２実施形態の組み換えベクターを利用して形質転換されたものである。なお、以下において、上記第１実施形態及び第２実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００５３】
本実施形態に係る微生物は、バクテリア、カビまたは酵母であることが好ましく、各々の具体的な種や属については、当業界に公知のものであればいずれも使用され得る。なかでも、本発明に係るＤＮＡ（遺伝子）が酵母由来のものであることから、形質転換の容易性などを鑑みれば、前記微生物は酵母であることがより好ましい。
【００５４】
前記酵母は、以下に制限されることはないが、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、パチソレン(Pachysolen)属、クラビスポラ(Clavispora)属、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、シュワニオミセス(Schwanniomyces)属、カンジダ(Candida)属、ピキア(Pichia)属及びデッケラ(Dekkera)属からなる群より選ばれることが好ましく、サッカロマイセス(Saccharomyces)属から選ばれることがより好ましい。
【００５５】
このような組み換え酵母菌株は、第１実施形態に係る組み換えタンパク質（ＴＵＰ１の短縮タンパク質を含む）をコードするポリヌクレオチドの導入によって、ＴＵＰ１等のタンパク質の本来有する抑制活性が阻害される。その結果、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する機能が正常に働かない。これにより、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が促進されるため、グルコース及びガラクトースの混合糖（混合物）、またはガラクトースを唯一の炭素源とする培地中で、ガラクトースを迅速にバイオアルコール（エタノール）に転換（代謝分解）することができる。したがって、このような組み換え酵母菌株を、ガラクトースを含む培地からバイオアルコールを生産する工程に用いると、バイオアルコール（エタノール）の生産性向上をもたらしうる。
【００５６】
本実施形態の組み換え微生物としては、ガラクトースの資化率（代謝能）、すなわちバイオアルコールの生産性（例えば、エタノールの製造量）が、前記ポリヌクレオチドを過剰発現させずに前記組み換え微生物を培養する場合と比較して高いものであることが好ましく、３０％以上増大させることができるものであることがより好ましく、５０％以上増大させることができるものであることがさらに好ましい。
【００５７】
本発明の他の実施形態として、微生物を上記の組み換えベクターで形質転換させることを含む、組み換え微生物の製造方法もまた、提供されうる。この際、
上述のように、本発明で用いられうる酵母の形質転換法は、一般的な形質転換手法であるため、当業者であれば容易に実施可能である。例えば、上記の組み換えベクターの酵母への形質転換過程は、公知の方法に従って実施され得る（Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.）。
【００５８】
例えば、異種遺伝子を含むベクターを、サッカロマイセス セレビシエ（S. cerevisiae） CEN.PK2-1Dに導入して形質転換するために、Yeast Spheroplast Transformation Kit（Bio 101, Vista、カリフォルニア州）を使用することができる。そして、形質転換株は、２０ｇ／ｌのグルコースを含むＹＳＣ（yeast synthetic complete）培地で培養できる。その後、ガラクトース代謝能（資化能）が向上した菌株を、４％ガラクトースを含むＹＳＣ培地で連続培養した後に、固体平板培地中で選別することができる。
【００５９】
また、本実施形態に係る微生物は、受託番号ＫＣＴＣ １１３８７ ＢＰの組み換え微生物を用いることが好ましい。かかる受託された組み換え微生物は、ガラクトースの資化能に優れた菌株として本発明者らが選別したものである。そして、大韓民国大田市儒城区に在る韓国生命工学研究院遺伝子銀行に、２００８年９月４日付でサッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１と命名して受託し、受託番号：ＫＣＴＣ １１３８７ ＢＰが付与されたものである。
【００６０】
［第４実施形態：バイオアルコールの製造方法］
第４実施形態に係るバイオアルコールの製造方法は、ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含み、ガラクトースの資化性（資化能）を向上（増大）するために、上記第１実施形態に係るポリヌクレオチド若しくは組み換えタンパク質、上記第２実施形態に係る組み換えベクター、または上記第３実施形態に係る組み換え微生物を利用することを特徴とする。なお、以下において、上記の第１〜第３実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００６１】
本実施形態に係るバイオアルコールの製造方法においては、上記第１実施形態に係るポリヌクレオチドが過剰発現されることによって、バイオアルコールの生産性が増大し得る。
【００６２】
本実施形態に係る製造方法は、短縮タンパク質（例えばＴＵＰ１短縮タンパク質）をコードするポリヌクレオチドによって、正常タンパク質（ＴＵＰ１タンパク質）における遺伝子発現を抑制する活性が阻害される。そのため、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する機能が正常に作動できない。したがって、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が顕著に促進される。これにより、ガラクトースを含む炭素源からガラクトースを迅速にバイオアルコールへと転換（代謝分解）させることができる。
【００６３】
上記のバイオアルコールの例として、エタノール、プロパノールもしくはブタノール等のアルコール、またはアセトンが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００６４】
上記のガラクトースを含む炭素源は、ガラクトースを４％以上含むものであることが好ましい。より好ましい形態として、当該炭素源は、ガラクトースのみからなるか、またはガラクトース及びグルコースの混合糖からなりうる。後者の場合、混合比率は特に制限されることはないが、ガラクトースを４０％以上含むことが好ましく、５０％以上含むことがより好ましい。このような条件の培地中で、本実施形態に係る生産方法を実施した場合、バイオアルコールの生産性を有意に向上させることができる。
【００６５】
本発明者等が遂行した実験によると、グルコース及びガラクトースの混合糖を炭素源とする培地、並びにガラクトースを唯一の炭素源とする培地で、それぞれ上記のＴＵＰ１の短縮ポリヌクレオチドの過剰発現によって、アルコールの生産性が、既存の酵母菌株に比べて有意に増大することを確認した。
【００６６】
上記のガラクトースを含む炭素源（生物資源）は、海藻類バイオマスの加水分解物であり得る。
【００６７】
上記の海藻類は、以下に制限されることはないが、紅藻類（例えば、ノリ(Porphyra yezoensis Ueda）、褐藻類（例えば、コンブ（Laminariaceae科の藻類）、ワカメ（Undaria pinnatifida）またはヒジキ（Hizikia fusiforme））及び緑藻類（例えば、アオノリ(Enteromorpha属）を含みうる。
【００６８】
上記の紅藻類は、例えば天草（Gelidium amansii）、オゴノリ（Gracilaria verrucosa）、ウシケノリ（Bangia atropurpurea）、マルバアマノリ（Porphyra suborbiculata）、スサビノリ（Porphyra yezoensis）、ヒラガラガラ（Galaxaura falcate）、フサノリ（Scinaia japonica）、ヒメテングサ（Gelidium divaricatum）、オオブサ（Gelidium pacificum）、ヒライボ（Lithophylum okamurae）、クサノカキ（Lithothammion cystocarpideum）、カニノテ（Amphiroa anceps）、アンピロアベアヴォイシ（Amphiroa beauvoisii）、サンゴモ（Corallina officinalis）、ピリヒバ（Corallina pilulifera）、フサカニノテ（Marginisporum aberrans）、コメノリ（Carpopeltis prolifera）、ムカデノリ（Grateloupia filicina）、タンバノリ（Grateloupia elliptica）、フダラク（Grateloupia lanceolanta）、ツルツル（Grateloupia turtuturu）、キジノオ（Phacelocarpus japonicus）、フクロフノリ（Gloiopeltis furcata）、イバラノリ（Hypnea charoides）、カギイバラノリ（Hypnea japonica）、サイダイバラ（Hypnea saidana）、コンドロスクリスプス（Chondrus cripspus）、スギノリ（Chondracanthus tenellus）、カバノリ（Gracilaria textorii）、フシツナギ（Lomentaria catenata）、イソハギ（Heterosiphonia japonica）、ユナ（Chondria crassicaulis）、イソムラサキ（Symphyocladia latiuscula）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
海藻類バイオマスを利用してバイオアルコールを製造する方法は特に制限されることはなく、当業界で公知の方法により行える。例えば、紅藻類バイオマスを利用する方法を見てみると、紅藻類を直接糖化させる直接糖化工程や、紅藻類から寒天または繊維素を抽出した後、得られた抽出物を糖化させてガラクトースまたはグルコースを得る間接糖化工程などが利用できる。上記の糖化工程は、ガラクトシダーゼ酵素などを利用した酵素加水分解法または酸加水分解用の触媒を使用する酸加水分解法などが使用され得るが、これに限定されることはない。その後、所定の微生物発酵を通してエタノール、ブタノールなどのアルコール、またはアセトンなどのバイオアルコールを製造することができる。
【００７０】
このように、自然界に豊富に存在する海藻類バイオマスを利用してバイオ燃料を製造する場合、原料の受給が安定的で前処理工程を経る必要がないため、生産効率に大変優れている。
【００７１】
本実施形態のバイオアルコールの製造方法は、上述した工程以外の従来公知の工程をさらに含んでもよい。かような追加の工程としては、例えば、製造されたエタノールなどのバイオアルコールを回収する工程が挙げられる。なお、バイオアルコールの回収手段は特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。
【００７２】
［第５実施形態：酵母の原因遺伝子の選別方法］
第５実施形態に係る酵母の原因遺伝子の選別方法は、遺伝子を過剰発現させてガラクトースの資化能を増大させる方法であって、トリプトファン（ｔｒｐ）を含むマルチコピープラスミドを利用して酵母のゲノムＤＮＡのライブラリーを構築する段階と、構築した前記ライブラリー中のゲノムＤＮＡを酵母に形質転換させ、酵母の全遺伝子を過剰発現させて、形質転換酵母のライブラリーを製作する段階と、製作した前記ライブラリー中の形質転換酵母を、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培地中で連続継代培養(Serial subculture)し、巨大コロニーを形成する、形質転換酵母を選別する段階と、選別した前記形質転換酵母からプラスミドを単離（回収）し、単離（回収）したプラスミドを導入した酵母の遺伝子配列を確認する段階とを含む。なお、以下において、上記の第１〜第４実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００７３】
図３は、本実施形態で使用可能な遺伝子の選別方法を模式的に示した図である。図３を参照することにより、本実施形態に係る遺伝子の選別方法の一例を具体的に理解することができる。
【００７４】
上記の酵母は、サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄであり得、上記のマルチコピープラスミドはｐＲＳ４２４であり得る。
【００７５】
上記酵母のゲノムＤＮＡライブラリーの製造は、制限酵素などを利用してサッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤゲノムＤＮＡを切断する段階と、切断されたＤＮＡ断片をマルチコピープラスミド（ｐＲＳ４２４）に導入する段階と、製造されたプラスミドを大腸菌（E. coli）で増幅させる段階とからなり得る。
【００７６】
上記の形質転換酵母ライブラリーの製造において、上記の酵母への形質転換は、一般的な方法（例えば、Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.）によって行える。
【００７７】
その後、連続継代培養を通して巨大コロニーを形成するガラクトースの資化能が増大した形質転換酵母を選別した後、巨大コロニーから単離した形質転換酵母からプラスミドに挿入された遺伝子配列を確認する。このとき、遺伝子配列の確認は、Ｇｅｌ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｇｅｌ ｄｏｃ）装置またはＨｙｄｒａ装置などを利用して行える。
【００７８】
また、本実施形態に係る遺伝子の選別方法は、下記の段階を更に含んでもよい。すなわち、酵母のゲノムの塩基配列、及びプラスミドに挿入した遺伝子の両末端に存在する所定の長さの遺伝子の塩基配列を比較し、挿入遺伝子の酵母ゲノム上での位置を追跡することにより、過剰発現した遺伝子を確認する段階、並びに／または、確認した前記遺伝子を含むプラスミドを酵母に再び形質転換し、ガラクトースの資化能の増大が前記遺伝子の過剰発現によるものであることを確認する段階である。
【００７９】
上記の追加可能な段階により、選別された遺伝子を明らかにし、ガラクトースの資化能の増大が誘発したことを再び確認することができる。
【００８０】
［第６実施形態：第５実施形態の選別方法により選別された遺伝子］
第６実施形態に係る遺伝子は、上記の第５実施形態に係る選別方法により選別された、過剰発現によってガラクトースの資化性を増大させるものである。また、本実施形態の遺伝子は、Ｃ末端抑制ドメインの少なくとも一部を欠いたＴＵＰ１の短縮タンパク質をコードする遺伝子であり得る。さらに、本実施形態の遺伝子は、Ｃ末端抑制ドメイン（第２８８番目〜第３８９番目）のアミノ酸配列を完全に欠いた、ＴＵＰ１の短縮タンパク質をコードする遺伝子であり得る。なお、上記の第１〜第５実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。すなわち、かかる遺伝子は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＴＵＰ１の短縮タンパク質）をコードする、配列番号：１で示される塩基配列よりなるポリヌクレオチドであり得る。
【００８１】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００８２】
［製造例１］
ＴＵＰ１タンパク質のうち第１番目〜第２８４番目のアミノ酸からなるＴＵＰ１の短縮タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ（第３染色体の位置２６１５９４〜２６３３９６）を、マルチコピープラスミドｐＲＳ４２４（上記の化学式１参照）に挿入した。ここで、図４は、ＴＵＰ１の短縮タンパク質のコードポリヌクレオチドを含む遺伝子地図を表す模式図である。換言すれば、図４に示したものは、ｐＲＳ４２４に挿入した酵母の第３染色体の位置２６１５９４〜２６３３９６に相当するＤＮＡである。なお、ゲノミックライブラリーを構築する際、ｐＲＳ４２４を制限酵素（ＢａｍＨＩ）で切断した後、Ｆｉｌｌ−ｉｎ反応を通じて切断した両端を平滑末端（Ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）とした。そして、単離（分離）したゲノムＤＮＡを超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して断片化した後、上記のように調製しておいたｐＲＳ４２４とブラントエンドのライゲーションを行うことにより、ｐＲＳ４２４に目的ＤＮＡ（上記）を挿入した。
【００８３】
続いて、上記により得られた目的ポリヌクレオチドを挿入したプラスミド（ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１）を、サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄに導入して形質転換した。その際、Yeast Spheroplast Transformation Kit（Bio 101, Vista、カリフォルニア州）を使用し、形質転換株（サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１）は、炭素源として２０ｇ／ｌのグルコースを含み、ＹＳＣ（yeast synthetic complete）培地で培養し、必要最小量のアミノ酸及びヌクレオチドを培地に供給した。
【００８４】
［実施例１］
上記の製造例１で製作された形質転換株を利用して、初期の酵母接種量を約ＯＤ２５とし、挿入ポリヌクレオチドの無いベクター（empty vector）を含む野生型株（コントロール）と、ＴＵＰ１の短縮タンパク質が導入された形質転換株（以下、「ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株」ともいう）とを、炭素源として、２％グルコース及び２％ガラクトースの混合糖を含む最小培地で培養した。このようにして、双方の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図５、６及び下記の表１に示した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
その結果、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方が、コントロールの菌株と比較して、ガラクトースの資化能（発酵能）の点で有意に向上したことを確認した。特に、２％ガラクトースを資化（消失）するのにかかった時間（所要時間）については、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株では１０時間かかった。他方、野生型株（コントロール）では２４時間もかかった。最終のエタノール生成濃度についても、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は１８．９ｇ／Ｌと比較的高い値を示した反面、野生型株（コントロール）は１６．５ｇ／Ｌであった。そして、エタノールの生産性は、表１より、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールよりも約２．７５倍優れていることを確認した。
【００８７】
［実施例２］
４％ガラクトースを唯一の炭素源とする最小培地で培養した以外は、実施例１と同様の方法で双方の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図７、８及び下記の表２に示した。
【００８８】
【表２】
【００８９】
その結果、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールの菌株と比較して、ガラクトースの資化能（発酵能）の点で有意に向上することを確認した。初発のガラクトース添加濃度（添加量）が双方同一であるにもかかわらず、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は１４時間で４％ガラクトースを全て資化し、エタノール生成濃度は１８．７ｇ／Ｌであった。他方、コントロールの菌株では、２６時間経過後のエタノール生成濃度が１７．８ｇ／Ｌであった。そして、エタノールの生産性（糖類の資化能）は、表２より、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールよりも約１．９６倍優れていることを確認した。
【００９０】
［実施例３]
１０％ガラクトースを唯一の炭素源とする最小培地で培養した以外は、実施例１と同様の方法で双方の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図９、１０及び下記の表３に示した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
その結果、実施例３でもＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールの菌株と比較して、ガラクトースの資化能（発酵能）の点で有意に向上することを確認した。初発のガラクトース添加濃度（添加量）が双方同一であるにもかかわらず、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は８０時間の発酵後に５ｇ／Ｌのガラクトースのみを資化しきれずに残し、３８ｇ／Ｌのエタノールを生産した。これに対し、コントロールの菌株は８０時間の発酵後に２３ｇ／Ｌものガラクトースを資化しきれずに残し、たった２５ｇ／Ｌのエタノールしか生産できなかった。そして、エタノールの生産性（糖類の資化能）は、表３より、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールよりも約１．５３倍優れていることを確認した。
【００９３】
［実施例４]
２％グルコース及び２％ガラクトースの混合糖を含む最小培地１Ｌ中で、野生型株（コントロール）、上記のＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株、野生型のＴＵＰ１過剰発現株(overexpression)、及びＴＵＰ１をノックアウトした酵母（ＴＵＰ１ノックアウト株）をそれぞれ培養して、各区分の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図１１及び下記の表４に示した。なお、本実施例で使用した酵母は、いずれもサッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄで同一である。
【００９４】
【表４】
【００９５】
その結果、炭素源として、ガラクトース及びグルコースが存在する場合、野生型のＴＵＰ１過剰発現株やＴＵＰ１ノックアウト株のエタノールの生産性は、野生型株（コントロール）と同等であることを確認した。これに対し、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は、２４時間発酵後に、約１６．５ｇ／Ｌのエタノールを生産することができ、野生型株（コントロール）等と比較して約１．４３倍と、エタノールの生産量を著しく向上することができることを見出した。
【００９６】
この実施例４の驚くべき結果は、上述した、本発明に係る遺伝子及び組み換えタンパク質が関与する原理・メカニズムの推測を実証するものである。
【００９７】
本発明の属する分野における通常の知識を有する者であれば、上記の内容に基づき、本発明の範囲内で多種多様な応用や変形を行うことが可能である。
【符号の説明】
【００９８】
１ ＳＳＮ６相互作用ドメイン、
２ アミノ末端抑制ドメイン、Ｎ末端抑制ドメイン、
３ カルボキシル末端抑制ドメイン、Ｃ末端抑制ドメイン。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号：１
ＴＵＰ１の短縮ポリヌクレオチド（truncated TUP1 polynucleotide）の塩基配列
配列番号：２
ＴＵＰ１の短縮タンパク質（truncated TUP1 protein）のアミノ酸配列
配列番号：３
ＴＵＰ１遺伝子（TUP1 gene）の塩基配列
配列番号：４
ＴＵＰ１タンパク質（truncated TUP1 protein）のアミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトースの資化能を増大させるポリヌクレオチド、これを含む組み換えベクター、及びこれらを導入した組み換え微生物に関する。より具体的には、ガラクトース代謝系遺伝子（以下、「ガラクトースの代謝を促進する遺伝子」ともいう）の発現を抑制するドメインのうち少なくとも一部のアミノ酸配列を欠くタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的に化石燃料を過剰に使用することによる資源枯渇及び環境汚染という虞が増大しつつある。このような状況の下で、安定的且つ持続的にエネルギーを生産・供給可能な、新たな再生エネルギーの登場が求められている。このような代替エネルギー開発の一環として、バイオマスからエネルギーを生産する技術が注目されている。
【０００３】
近年、このようなバイオマスを実現し得る生物として、海藻類に対する関心が高まっている。かかる潜在的な生物と言える海藻類の特長は、自然界に豊富に存在し、且つライフサイクルが短いという点にある。また、海藻類は、二酸化炭素を消費して酸素を排出するという代謝を行うため、エネルギー生産と環境問題とを共に解決できるという長所を有する。しかし、海藻類を広く利用し、代替エネルギーとして一般に供給可能な程度までエネルギーを生産できていないのが現状である。
【０００４】
一方、海藻類（特に紅藻類）由来のバイオマスの加水分解物には、ガラクトースが豊富に存在する。したがって、海藻類由来のバイオマスの加水分解物を、酵母を利用して有用物質へと転換することを実現するためには、加水分解物に多量に含有されているガラクトースの効果的な利用が最先に実現されなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７３９３６６９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bro C, Knudsen S, Regenberg B, Olsson L, Nielsen J. 2005. Improvement of galactose uptake in Saccharomyces cerevisiae through overexpression of phosphoglucomutase: example of transcript analysis as a tool in inverse metabolic engineering. Appl. Environ. Microbiol. 71(11):6465-72
【非特許文献２】Ostergaard S, Walloe KO, Gomes SG, Olsson L, Nielsen J. 2001. The impact of GAL6, GAL80, and MIG1 on glucose control of the GAL system in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 1(1):47-55.
【非特許文献３】Ostergaard S, Olsson L, Johnston M, Nielsen J. Increasing galactose consumption by Saccharomyces cerevisiae through metabolic engineering of the GAL gene regulatory network. 2000. Nat. Biotechnol. 18(12):1283-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、自然界に存在する酵母の場合、ガラクトース代謝はするものの、その代謝速度はグルコースに比べて顕著に小さいため、実用化には程遠いという問題がある。
【０００８】
そこで本発明は、ガラクトースの資化に関与する遺伝子（ＤＮＡ）であって、当該遺伝子の塩基配列を改変することで、ガラクトースの資化能を増大可能な新規のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、及びこれがコードするポリペプチド（タンパク質）を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、上記の新規なポリヌクレオチド（ＤＮＡ）で形質転換した微生物を利用して、ガラクトースを含む炭素源からバイオアルコールの生産性を増大させうる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑みて、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対し、所定の改変を施すことによって、結果的にガラクトース代謝系遺伝子の発現量を有意に向上させうることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、上記目的を達成するための本発明に係る単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する点に特徴を有する。
【００１２】
また、上記目的を達成するための本発明に係る単離されたポリペプチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなる点に特徴を有する。
【００１３】
また、上記目的を達成するための本発明に係る組み換えベクターは、上記のポリヌクレオチドを含む点に特徴を有する。
【００１４】
また、上記目的を達成するための本発明に係る組み換え微生物は、上記のポリヌクレオチド、または上記の組み換えベクターを含む点に特徴を有する。
【００１５】
また、上記目的を達成するための本発明に係るエタノールの製造方法は、ガラクトースを含む炭素源からのエタノールの製造方法であって、エタノールが製造されるように、前記炭素源中で上記の組み換え微生物を培養することを含む点に特徴を有する。
【００１６】
また、上記目的を達成するための本発明に係る組み換え微生物の製造方法は、微生物を上記の組み換えベクターで形質転換させることを含む点に特徴を有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対し、所定の改変を施すことによって、結果的にガラクトース代謝系遺伝子の発現量を有意に向上させることができる。これにより、ガラクトースの資化性が著しく増大し、同時にエタノールの生産性も顕著に増大させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１実施形態における、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を示した模式図である
【図２】本発明の実施形態によるＣ末端抑制ドメインが遺失されたＴＵＰ１を示した模式図である。
【図３】本発明の第５実施形態による遺伝子の選別方法を示した模式図である。
【図４】ＴＵＰ１の短縮タンパク質のコード遺伝子を含む遺伝子地図を表す模式図である（酵母ＤＮＡの第３染色体の位置２６１５９４〜２６３３９６）。
【図５】本発明の実施例１で、コントロールである野生型株における、混合糖（２％グルコース及び２％ガラクトース）の資化能を観察したグラフである。
【図６】本発明の実施例１で、ＴＵＰ１短縮タンパク質の過剰発現株における、混合糖（２％グルコース及び２％ガラクトース）の資化能の向上効果を観察したグラフである。
【図７】本発明の実施例２で、コントロールである野生型株における、４％ガラクトースの資化能を観察したグラフである。
【図８】本発明の実施例２で、ＴＵＰ１短縮タンパク質の過剰発現株における、４％ガラクトースの資化能の向上効果を観察したグラフである。
【図９】本発明の実施例３で、コントロールである野生型株における、１０％ガラクトースの資化能を観察したグラフである。
【図１０】本発明の実施例３で、ＴＵＰ１短縮タンパク質の過剰発現株における、１０％ガラクトースの資化能の向上効果を観察したグラフである。
【図１１】本発明の実施例４で、コントロールである野生型株、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株、野生型のＴＵＰ１過剰発現株、及びＴＵＰ１ノックアウト株における、ガラクトースの資化能の向上効果を対比観察したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。本発明の利点、特徴、及びこれを実現するための筋道は、以下の各実施形態における詳細な説明及び添付された図面を参照することにより、さらに容易に理解できる。しかしながら、本発明は、本明細書における説明以外の多様な形態で実施することもできる。したがって、本明細書で言及した実施形態のみに限定されることはない。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００２０】
［第１実施形態：遺伝子及び組み換えタンパク質］
本発明に係る第１実施形態は、（Ａ）配列番号：３で示される塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入、付加または欠損された塩基配列よりなるポリヌクレオチド；及び（Ｂ）配列番号：３で示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列よりなる遺伝子；からなる群より選択されるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドのコードするタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠くポリヌクレオチドに係る。また、好ましくは、前記ポリヌクレオチドのコードするタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠き、且つコリプレッサーとして働くドメインの機能を有するポリヌクレオチドに係る。
【００２１】
また、本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または欠損されたアミノ酸配列からなり、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠く。好ましくは、本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または欠損されたアミノ酸配列からなり、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠き、且つコリプレッサーとして働くドメインの機能を有する。
【００２２】
上記した、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠くタンパク質をコードする遺伝子とは、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増大させることを助けるものである。
【００２３】
上記のガラクトース代謝系遺伝子、すなわち、ガラクトースの代謝を促進する遺伝子としては、以下に限定されることはないが、例えば、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ５（ＰＧＭ１、ＰＧＭ２）などが挙げられる。
【００２４】
ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する遺伝子としては、以下に限定されることはないが、例えば、ＴＵＰ１（配列番号：３で示される塩基配列からなる）、ＧＡＬ４、ＧＡＬ３、ＧＡＬ８０、ＧＡＬ６、ＭＩＧ１、ＳＳＮ６などが挙げられる。したがって、このようなガラクトース代謝を抑制する遺伝子を種々の方法により操作することによって、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増大させることができる。例えば、ガラクトース代謝の抑制遺伝子から、活性部位の発現を抑制するドメインを欠損したり、変形する等の操作を通じて、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増加させることができる。換言すれば、ＴＵＰ１の組み換えタンパク質は、Ｃ末端抑制ドメインの少なくとも一部が欠ける（欠失または欠損する）ことによって、グルコース代謝系遺伝子の発現を阻害する活性を有しなくなる。これにより、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が促進される結果がもたらされる。
【００２５】
一例として、上記の抑制遺伝子は配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「ＴＵＰ１タンパク質」ともいう）をコードする、配列番号：３で示される塩基配列からなる遺伝子であり得る。
【００２６】
図１は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を示した模式図である。図中、上側の数字はアミノ酸の配列番号を示し、下側の数字はＴＵＰ１タンパク質が有するドメインを示す。また、図中の点線は、かかる点線（第２８５番目のアミノ酸配列）からカルボキシル末端側（第３８９番目のアミノ酸配列）までのアミノ酸配列を欠損（または欠失）させることを示すものである。すなわち、ＴＵＰ１タンパク質は、７１３個のアミノ酸からなり、そのアミノ末端側から順に、ＳＳＮ６相互作用ドメイン１、アミノ末端抑制ドメイン２、及びカルボキシル末端抑制ドメイン３を有する。そして、ＳＳＮ６相互作用ドメイン１は第１番目〜第７２番目のアミノ酸配列からなり、アミノ末端抑制ドメイン２は第７２番目〜第２００番目のアミノ酸配列からなり、カルボキシル末端抑制ドメイン３は第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列からなる。各ドメインについては後述する。
【００２７】
上記のＴＵＰ１タンパク質は、酵母内で一般的（非特異的）な抑制因子（リプレッサー）の役割を果たすことが知られており、併せてガラクトース代謝系遺伝子の抑制にも関与することが知られている。特に、サッカロマイセス セレビシエのＴＵＰ１タンパク質（Williams, F. E. et al., Mol. Cell. Biol. 10:6500-6511(1990)）は、ＣＹＳ８（ＳＳＮ６）タンパク質と複合体（コリプレッサー）を形成するタンパク質として発見され、グルコース、酸素及びＤＮＡの損傷により調節される遺伝子の転写抑制に必要なものと知られている(Tzamarias, D. et al., Genes Dev.9:821-831(1995))。かかるコリプレッサーを形成する際、ＴＵＰ１タンパク質においてはＳＳＮ６相互作用ドメイン１が作用する。
【００２８】
上記のＴＵＰ１タンパク質やＣＹＳ８（ＳＳＮ６）タンパク質は、ＤＮＡと直接結合しない。しかし、α２、ＭＩＧ１、ＲＯＸ１及びＡ１のような特定のＤＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる。このようにして、上記のＴＵＰ１タンパク質は、ＳＳＮ６タンパク質と結合して抑制ドメインを形成し、上記したＲＯＸ１等のＤＮＡ結合タンパク質に誘導されて、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を阻害することとなる。かかる阻害の機構について具体的に説明すると、ガラクトース代謝系遺伝子（例えば、ＡＴＦ１遺伝子）の上流（５’側）プロモーターに結合し、かかるプロモーターの働きが阻害される。その結果、ＡＴＦ１遺伝子の発現が有意に抑制される。このとき、ＴＵＰ１タンパク質は、ＲＯＸ１等のＤＮＡ結合タンパク質と結合し、ＲＯＸ１タンパク質のプロモーターへの結合及びその後の阻害作用を促進する、コリプレッサーの構成要素として作用する（Tzamarias, D. et al., Genes Dev.9 : 821-831(1995) 等）。
【００２９】
ここで、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する機能を有する、ＴＵＰ１等のタンパク質中のドメインが、少なくとも一部のアミノ酸配列を欠く場合、前記ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制できなくなることがある。上記した、少なくとも一部のアミノ酸配列を欠く場合とは、例えば、遺伝子発現を抑制するドメインの一部が欠失または欠損される等して短縮した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）場合があり得る。以下、上記した遺伝子発現を抑制するのに重要なドメインの一部を欠いたタンパク質を、「短縮タンパク質」（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称する。
【００３０】
したがって、上記の短縮タンパク質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）が過剰発現すると、ガラクトース代謝系遺伝子の発現抑制機構が正常に進まなくなるため、結果として、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が増大しうる。
【００３１】
本実施形態に係るタンパク質は、上記の遺伝子発現を抑制するドメインを全部欠いたタンパク質であってもよいし、一部のみを欠いたタンパク質であってもよい。また、本実施形態に係るタンパク質は、遺伝子発現を抑制するドメインが二つ以上存在する場合、一以上の任意のドメインについて少なくとも一部を欠いたタンパク質であればよく、特に制限されることはない。
【００３２】
具体的にいえば、上記の遺伝子発現を抑制するドメインは、カルボキシル末端のリプレッサードメインであり得る。当該ドメインがカルボキシル末端（以下、「Ｃ末端」ともいう）である場合、たとえ当該ドメインが全部欠けたとしても、他のよりアミノ末端（以下、「Ｎ末端」ともいう）側に存在するドメインにはほとんど影響がないものと推測される。かかる原理の推測は、ＴＵＰ１において実証した点（後述の実施例等において実証する）、及びタンパク質構造においてＣ末端側アミノ酸配列の短縮による影響が比較的小さい点に基づく。加えて、上述のように、かかるリプレッサードメインの短縮に起因して、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を増大させることができる。
【００３３】
図２は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を示した模式図である。本図の見方は、上記の図１と同様であるため、説明を省略する。図２で示されるアミノ酸配列は、図１中の点線からカルボキシル末端までのアミノ酸配列を欠損（または欠失）させたものに相当する。すなわち、図２に示されるアミノ酸配列は、ＴＵＰ１タンパク質のうちＣ末端抑制ドメインを完全に欠損したものに対応する。なお、図２に示したアミノ酸配列についてより正確にいえば、Ｃ末端抑制ドメインを含むＣ末端側のアミノ酸配列が切断されて全て欠いている。図２を見れば、ＴＵＰ１の短縮タンパク質は、ＴＵＰ１タンパク質（正常なタンパク質）中のドメインのうち、Ｃ末端抑制ドメイン３を欠くのみであって、ＳＳＮ６相互作用ドメイン１及びＮ末端抑制ドメイン２は完全な形で正常に有している。したがって、配列番号：２で示されるＴＵＰ１の短縮タンパク質であっても、正常なＳＳＮ６相互作用ドメイン１を介して、ＳＳＮ６タンパク質と相互作用することはできると考えられる。しかしながら、当該短縮タンパク質はＣ末端抑制ドメイン３を欠くため、コリプレッサーとしての機能は有しないと推測される。したがって、ＴＵＰ１の短縮タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質（ＲＯＸ１等）と結合した場合であっても、ＲＯＸ１等による、ガラクトース代謝系遺伝子の阻害作用を抑制ないし阻害することができると推測される。さらに、ＲＯＸ１等はＴＵＰ１タンパク質以外の（コ）リプレッサーとも結合し得るが、ＴＵＰ１の短縮タンパク質の作用に起因した、いわばＲＯＸ１等の「無駄使い」によって、ガラクトース代謝系遺伝子の阻害作用を生体レベルで効果的に阻害することができるものと推測される。
【００３４】
ここで、本明細書における「Ｃ末端ドメイン」とは、カルボキシル末端側のドメインであり、換言すれば、遺伝子の３’末端側に位置する塩基配列（二重鎖若しくは単一鎖）によってコードされたアミノ酸配列を意味する。
【００３５】
上記の推測的な原理を実証する、ＴＵＰ１遺伝子・タンパク質について、以下、詳細に説明する。本実施形態に係る遺伝子は、ＴＵＰ１タンパク質中の遺伝子発現を抑制するＣ末端ドメインのうち、少なくとも一部を欠いたタンパク質をコードする遺伝子であり得る。換言すれば、本実施形態は、ＴＵＰ１タンパク質からＣ末端抑制ドメイン（Ｃ末端側のドメインであってリプレッサーとして機能するドメイン）の少なくとも一部が欠けたＴＵＰ１の組み換えタンパク質を提供する。
【００３６】
前記Ｃ末端ドメインは、一つのポリペプチドの最後のアミノ酸から１／３までの（ポリ）ペプチドを含む。前記タンパク質またはポリペプチドに対応する遺伝子（ＤＮＡ）の３’末端は、ポリＡテール(poly A tail)を含まない。
【００３７】
ここで、本明細書における、タンパク質またはポリペプチドの「Ｃ末端ドメイン」とは、３個以上３５０個以下のアミノ酸長であり得る。以下に制限されないが、例えば、５個、１０個、２０個、２５個、５０個、１００個または２００個のアミノ酸を含み得る。
【００３８】
上記のＴＵＰ１タンパク質のＣ末端側半分は、ＷＤ−４０またはβ−トランスデューシン反復配列として知られた、アスパラギン酸及びトリプトファンの多い４３個のアミノ酸配列からなる６つの反復配列を有する（Williams, F. E. et al., Mol. Cell. Biol. 10:6500-6511(1990); Fong, H.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2162-2166(1986)）。このようなＷＤ−４０の反復配列は多くのタンパク質で確認されており、タンパク質同士の相互作用に働く。
【００３９】
したがって、上記のＴＵＰ１タンパク質を短縮したＣ末端の抑制ドメインはＷＤ−４０の反復配列を含みうる。
【００４０】
本実施形態に係るポリヌクレオチドは、ガラクトース代謝系遺伝子（例えばＡＴＦ１遺伝子）の発現を抑制するＴＵＰ１タンパク質のうち、第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列を欠いたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。前記「第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列」は、ＴＵＰ１タンパク質中のＣ末端抑制ドメインに相当する。したがって、上記のポリヌクレオチドは、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する、ＴＵＰ１タンパク質中のＣ末端ドメインを完全に欠くタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００４１】
さらに、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「組み換えタンパク質」ともいう）は、配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるＴＵＰ１タンパク質のうち第２８５番目〜第３８９番目のアミノ酸配列を欠いているため、ＴＵＰ１タンパク質中のＣ末端ドメインを完全に欠くタンパク質に含まれる。そして、配列番号：１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（組み換えられたポリヌクレオチド）は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。すなわち、上記のＴＵＰ１の組み換えタンパク質は、配列番号：１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）からなるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であり得る。なお、本明細書では、以下、上記の第２８８番目〜第３８９番目のアミノ酸配列を欠いたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを「短縮ポリヌクレオチド」（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とも称する。
【００４２】
ここで、配列番号：１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）からなるポリヌクレオチドは、（Ａ）配列番号：３で示される塩基配列において複数個の塩基が欠失または欠損された塩基配列よりなるポリヌクレオチドに該当し、また、（Ｂ）配列番号：３で示される塩基配列と相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列よりなるポリヌクレオチドにも該当する。なぜなら、配列番号：３で示される塩基配列のうち、欠失または欠損された塩基配列以外の配列（より５’側の塩基配列）は、配列番号：１で示される塩基配列と同一であるためである。
【００４３】
さらに、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠く。好ましくは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制するドメインの機能を欠き、且つコリプレッサーとして働くドメインの機能を有する。上記のＣ末端抑制ドメインを完全に欠いたＴＵＰ１タンパク質は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなり得る。すなわち、上記したＴＵＰ１の組み換えタンパク質は配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。より具体的にいえば、上記の短縮したＴＵＰ１タンパク質は、アミノ酸配列のうち、第２８５番目以降のアミノ酸が欠失または欠損されて、第１番目〜第２８４番目のアミノ酸配列を含むものであり得る。上記の配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、そのＮ末端側に、ＳＳＮ６タンパク質とともにコリプレッサーを形成する際に機能するドメイン（以下、「ＳＳＮ６相互作用ドメイン」ともいう）を含む。また、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、第７２番目〜第２００番目のアミノ酸配列にＮ末端抑制ドメイン（Ｎ末端ドメインであってリプレッサーとして機能するドメイン）を含む。
【００４４】
［第２実施形態：組み換えベクター及び組み換え微生物］
本発明の第２実施形態は、上記第１実施形態のポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに係る。すなわち、上記第１実施形態で述べた遺伝子発現を抑制するドメインの少なくとも一部が欠けたＴＵＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに関する。なお、以下において、上記第１実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００４５】
本明細書における「ベクター」とは、連結された核酸断片を運搬するのに利用可能な核酸分子を意味する。かかる利用可能なベクターとして、特に制限されることはないが、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス及び挿入可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同組み換えにより宿主細胞ゲノム内に挿入可能な断片）を含むことが好ましい。ここで、ベクターの一種である「プラスミド」とは、内部に追加的にＤＮＡ断片を連結されることができる環型の二重鎖ＤＮＡループを意味する。また、「ウイルスベクター」を用いれば、付加したＤＮＡをウイルスゲノム内に連結させることができる。上記したベクターのなかでもより好ましくはプラスミドである。
【００４６】
ここで、前記ベクターは、目的タンパク質をコードする連結されたポリヌクレオチドの発現を指示できるが、このようなベクターを特に、「発現ベクター」という。一般的に、組み換えＤＮＡ技術の利用において、発現ベクターはプラスミドの形態であるため、本明細書で「プラスミド」と記載している場合、「ベクター」と同義でありうる。しかし、ウイルスベクターのように同一の機能を果たす、プラスミド以外の形態の発現ベクターも含むことができることはいうまでもない。
【００４７】
上記の発現ベクターは、酵母内で発現可能であり、遺伝子（ポリヌクレオチド）がベクター中に連結・挿入されるものである。このような発現ベクターの例としては、２ミクロン、pBM272、pBR322-6、pBR322-8、pCS19、pDW227、pDW229、pDW232、pEMBLYe23、pEMBLYe24、pEMBLYi21、pEMBLYi22、pEMBLYi32、pEMBLYr25、pFL2、pFL26、pFL34、pFL35、pFL36、pFL38、pFL39、pFL40、pFL44L、pFL44S、pFL45L、pFL45S、pFL46L、pFL46S、pFL59、pFL59+、pFL64-、pFL64+、pG6、pG63、pGAD10、pGAD424、pGBT9、pGKl2、pJRD171、pKD1、pNKY2003、pNKY3、pNN414、pON163、pON3、pPM668、pRAJ275、pRS200、pRS303、pRS304、pRS305、pRS306、pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426、pRSS56、pSG424、pSKS104、pSKS105、pSKS106、pSZ62、pSZ62、pUC-URA3、pUT332、pYAC2、pYAC3、pYAC4、pYAC5、pYAC55、pYACneo、pYAC-RC、pYES2、pYESHisA、pYESHisB、pYESHisC、pYEUra3、rpSE937、YCp50、YCpGAL0、YCpGAL1、YCplac111、YCplac22、YCplac33、YDp-H、YDp-K、YDp-L、YDp-U、YDp-W、YEp13、YEp213、YEp24、YEp351、YEp352、YEp353、YEp354、YEp355、YEp356、YEp356R、YEp357、YEp357R、YEp358、YEp358R、YEplac112、YEplac181、YEplac195、YIp30、YIp31、YIp351、YIp352、YIp353、YIp354、YIp355、YIp356、YIp356R、YIp357、YIp357R、YIp358、YIp358R、YIp5、YIplac128、YIplac204、YIplac211、YRp12、YRp17、YRp7、pAL19、paR3、pBG1、pDBlet、pDB248X、pEA500、pFL20、pIRT2、pIRT2U、pIRT2-CAN1、pJK148、pJK210、pON163、pNPT/ADE1-3、pSP1、pSP2、pSP3、pSP4、pUR18、pUR19、pZA57、pWH5、pART1、pCHY21、pEVP11、REP1、REP3、REP4、REP41、REP42、REP81、REP82、RIP、REP3X、REP4X、REP41X、REP81X、REP42X、REP82X、RIP3X/s、RIP4X/s、pYZ1N、pYZ41N、pYZ81N、pSLF101、pSLF102、pSLF104、pSM1/2、p2UG、pART1/N795、pYGTなどが挙げられるが、これに限定されるものではない（http://genome-www2.stanford.edu/vectordb/vector.html、及びhttp://pingu.salk.edu/~forsburg/vectors.html参照）。
【００４８】
また、前記ベクターは、下記の開裂地図に示されたプラスミド（ｐＲＳ４２４）であることが好ましい。
【００４９】
【化１】
【００５０】
上記のベクターは、宿主細胞内に導入されて、上記第１実施形態に係るポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質（融合タンパク質を含む）またはペプチドを生産できる。所望により、上記のベクターは宿主生物体により認知されるプロモーターを備えてもよい。かようなプロモーターの配列は、原核生物、真核生物またはウイルス起源であり得る。酵母に適切なプロモーターとして、以下に制限されることはないが、GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10などが挙げられる。
【００５１】
上記のベクターは更なる調節配列を含むことができる。調節配列の例として、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン−ダルガノ配列及びバクテリオファージラムダのｃＩＩのシャイン−ダルガノ配列が代表的なものとして挙げられる。このように、上記ポリヌクレオチドは、発現調節配列に作動可能なように連結されていることが好ましい。また、発現ベクターは形質転換された宿主細胞を選別するのに必要且つ適切なマーカーを含んでもよい。宿主における形質転換は、当業界において公知の多様な技術やＳａｍｂｒｏｏｋの文献に記述されている技術を使用して行われ得る。
【００５２】
［第３実施形態：第２実施形態の組み換えベクターを導入した組み換え微生物］
第３実施形態に係る組み換え微生物は、上記した第２実施形態の組み換えベクターを利用して形質転換されたものである。なお、以下において、上記第１実施形態及び第２実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００５３】
本実施形態に係る微生物は、バクテリア、カビまたは酵母であることが好ましく、各々の具体的な種や属については、当業界に公知のものであればいずれも使用され得る。なかでも、本発明に係るＤＮＡ（遺伝子）が酵母由来のものであることから、形質転換の容易性などを鑑みれば、前記微生物は酵母であることがより好ましい。
【００５４】
前記酵母は、以下に制限されることはないが、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、パチソレン(Pachysolen)属、クラビスポラ(Clavispora)属、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、シュワニオミセス(Schwanniomyces)属、カンジダ(Candida)属、ピキア(Pichia)属及びデッケラ(Dekkera)属からなる群より選ばれることが好ましく、サッカロマイセス(Saccharomyces)属から選ばれることがより好ましい。
【００５５】
このような組み換え酵母菌株は、第１実施形態に係る組み換えタンパク質（ＴＵＰ１の短縮タンパク質を含む）をコードするポリヌクレオチドの導入によって、ＴＵＰ１等のタンパク質の本来有する抑制活性が阻害される。その結果、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する機能が正常に働かない。これにより、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が促進されるため、グルコース及びガラクトースの混合糖（混合物）、またはガラクトースを唯一の炭素源とする培地中で、ガラクトースを迅速にバイオアルコール（エタノール）に転換（代謝分解）することができる。したがって、このような組み換え酵母菌株を、ガラクトースを含む培地からバイオアルコールを生産する工程に用いると、バイオアルコール（エタノール）の生産性向上をもたらしうる。
【００５６】
本実施形態の組み換え微生物としては、ガラクトースの資化率（代謝能）、すなわちバイオアルコールの生産性（例えば、エタノールの製造量）が、前記ポリヌクレオチドを過剰発現させずに前記組み換え微生物を培養する場合と比較して高いものであることが好ましく、３０％以上増大させることができるものであることがより好ましく、５０％以上増大させることができるものであることがさらに好ましい。
【００５７】
本発明の他の実施形態として、微生物を上記の組み換えベクターで形質転換させることを含む、組み換え微生物の製造方法もまた、提供されうる。この際、
上述のように、本発明で用いられうる酵母の形質転換法は、一般的な形質転換手法であるため、当業者であれば容易に実施可能である。例えば、上記の組み換えベクターの酵母への形質転換過程は、公知の方法に従って実施され得る（Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.）。
【００５８】
例えば、異種遺伝子を含むベクターを、サッカロマイセス セレビシエ（S. cerevisiae） CEN.PK2-1Dに導入して形質転換するために、Yeast Spheroplast Transformation Kit（Bio 101, Vista、カリフォルニア州）を使用することができる。そして、形質転換株は、２０ｇ／ｌのグルコースを含むＹＳＣ（yeast synthetic complete）培地で培養できる。その後、ガラクトース代謝能（資化能）が向上した菌株を、４％ガラクトースを含むＹＳＣ培地で連続培養した後に、固体平板培地中で選別することができる。
【００５９】
また、本実施形態に係る微生物は、受託番号ＫＣＴＣ １１３８７ ＢＰの組み換え微生物を用いることが好ましい。かかる受託された組み換え微生物は、ガラクトースの資化能に優れた菌株として本発明者らが選別したものである。そして、大韓民国大田市儒城区に在る韓国生命工学研究院遺伝子銀行に、２００８年９月４日付でサッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１と命名して受託し、受託番号：ＫＣＴＣ １１３８７ ＢＰが付与されたものである。
【００６０】
［第４実施形態：バイオアルコールの製造方法］
第４実施形態に係るバイオアルコールの製造方法は、ガラクトースを含む炭素源を微生物に資化させることを含み、ガラクトースの資化性（資化能）を向上（増大）するために、上記第１実施形態に係るポリヌクレオチド若しくは組み換えタンパク質、上記第２実施形態に係る組み換えベクター、または上記第３実施形態に係る組み換え微生物を利用することを特徴とする。なお、以下において、上記の第１〜第３実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００６１】
本実施形態に係るバイオアルコールの製造方法においては、上記第１実施形態に係るポリヌクレオチドが過剰発現されることによって、バイオアルコールの生産性が増大し得る。
【００６２】
本実施形態に係る製造方法は、短縮タンパク質（例えばＴＵＰ１短縮タンパク質）をコードするポリヌクレオチドによって、正常タンパク質（ＴＵＰ１タンパク質）における遺伝子発現を抑制する活性が阻害される。そのため、ガラクトース代謝系遺伝子の発現を抑制する機能が正常に作動できない。したがって、ガラクトース代謝系遺伝子の発現が顕著に促進される。これにより、ガラクトースを含む炭素源からガラクトースを迅速にバイオアルコールへと転換（代謝分解）させることができる。
【００６３】
上記のバイオアルコールの例として、エタノール、プロパノールもしくはブタノール等のアルコール、またはアセトンが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００６４】
上記のガラクトースを含む炭素源は、ガラクトースを４％以上含むものであることが好ましい。より好ましい形態として、当該炭素源は、ガラクトースのみからなるか、またはガラクトース及びグルコースの混合糖からなりうる。後者の場合、混合比率は特に制限されることはないが、ガラクトースを４０％以上含むことが好ましく、５０％以上含むことがより好ましい。このような条件の培地中で、本実施形態に係る生産方法を実施した場合、バイオアルコールの生産性を有意に向上させることができる。
【００６５】
本発明者等が遂行した実験によると、グルコース及びガラクトースの混合糖を炭素源とする培地、並びにガラクトースを唯一の炭素源とする培地で、それぞれ上記のＴＵＰ１の短縮ポリヌクレオチドの過剰発現によって、アルコールの生産性が、既存の酵母菌株に比べて有意に増大することを確認した。
【００６６】
上記のガラクトースを含む炭素源（生物資源）は、海藻類バイオマスの加水分解物であり得る。
【００６７】
上記の海藻類は、以下に制限されることはないが、紅藻類（例えば、ノリ(Porphyra yezoensis Ueda）、褐藻類（例えば、コンブ（Laminariaceae科の藻類）、ワカメ（Undaria pinnatifida）またはヒジキ（Hizikia fusiforme））及び緑藻類（例えば、アオノリ(Enteromorpha属）を含みうる。
【００６８】
上記の紅藻類は、例えば天草（Gelidium amansii）、オゴノリ（Gracilaria verrucosa）、ウシケノリ（Bangia atropurpurea）、マルバアマノリ（Porphyra suborbiculata）、スサビノリ（Porphyra yezoensis）、ヒラガラガラ（Galaxaura falcate）、フサノリ（Scinaia japonica）、ヒメテングサ（Gelidium divaricatum）、オオブサ（Gelidium pacificum）、ヒライボ（Lithophylum okamurae）、クサノカキ（Lithothammion cystocarpideum）、カニノテ（Amphiroa anceps）、アンピロアベアヴォイシ（Amphiroa beauvoisii）、サンゴモ（Corallina officinalis）、ピリヒバ（Corallina pilulifera）、フサカニノテ（Marginisporum aberrans）、コメノリ（Carpopeltis prolifera）、ムカデノリ（Grateloupia filicina）、タンバノリ（Grateloupia elliptica）、フダラク（Grateloupia lanceolanta）、ツルツル（Grateloupia turtuturu）、キジノオ（Phacelocarpus japonicus）、フクロフノリ（Gloiopeltis furcata）、イバラノリ（Hypnea charoides）、カギイバラノリ（Hypnea japonica）、サイダイバラ（Hypnea saidana）、コンドロスクリスプス（Chondrus cripspus）、スギノリ（Chondracanthus tenellus）、カバノリ（Gracilaria textorii）、フシツナギ（Lomentaria catenata）、イソハギ（Heterosiphonia japonica）、ユナ（Chondria crassicaulis）、イソムラサキ（Symphyocladia latiuscula）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
海藻類バイオマスを利用してバイオアルコールを製造する方法は特に制限されることはなく、当業界で公知の方法により行える。例えば、紅藻類バイオマスを利用する方法を見てみると、紅藻類を直接糖化させる直接糖化工程や、紅藻類から寒天または繊維素を抽出した後、得られた抽出物を糖化させてガラクトースまたはグルコースを得る間接糖化工程などが利用できる。上記の糖化工程は、ガラクトシダーゼ酵素などを利用した酵素加水分解法または酸加水分解用の触媒を使用する酸加水分解法などが使用され得るが、これに限定されることはない。その後、所定の微生物発酵を通してエタノール、ブタノールなどのアルコール、またはアセトンなどのバイオアルコールを製造することができる。
【００７０】
このように、自然界に豊富に存在する海藻類バイオマスを利用してバイオ燃料を製造する場合、原料の受給が安定的で前処理工程を経る必要がないため、生産効率に大変優れている。
【００７１】
本実施形態のバイオアルコールの製造方法は、上述した工程以外の従来公知の工程をさらに含んでもよい。かような追加の工程としては、例えば、製造されたエタノールなどのバイオアルコールを回収する工程が挙げられる。なお、バイオアルコールの回収手段は特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。
【００７２】
［第５実施形態：酵母の原因遺伝子の選別方法］
第５実施形態に係る酵母の原因遺伝子の選別方法は、遺伝子を過剰発現させてガラクトースの資化能を増大させる方法であって、トリプトファン（ｔｒｐ）を含むマルチコピープラスミドを利用して酵母のゲノムＤＮＡのライブラリーを構築する段階と、構築した前記ライブラリー中のゲノムＤＮＡを酵母に形質転換させ、酵母の全遺伝子を過剰発現させて、形質転換酵母のライブラリーを製作する段階と、製作した前記ライブラリー中の形質転換酵母を、ガラクトースを唯一の炭素源として含む培地中で連続継代培養(Serial subculture)し、巨大コロニーを形成する、形質転換酵母を選別する段階と、選別した前記形質転換酵母からプラスミドを単離（回収）し、単離（回収）したプラスミドを導入した酵母の遺伝子配列を確認する段階とを含む。なお、以下において、上記の第１〜第４実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。
【００７３】
図３は、本実施形態で使用可能な遺伝子の選別方法を模式的に示した図である。図３を参照することにより、本実施形態に係る遺伝子の選別方法の一例を具体的に理解することができる。
【００７４】
上記の酵母は、サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄであり得、上記のマルチコピープラスミドはｐＲＳ４２４であり得る。
【００７５】
上記酵母のゲノムＤＮＡライブラリーの製造は、制限酵素などを利用してサッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＤゲノムＤＮＡを切断する段階と、切断されたＤＮＡ断片をマルチコピープラスミド（ｐＲＳ４２４）に導入する段階と、製造されたプラスミドを大腸菌（E. coli）で増幅させる段階とからなり得る。
【００７６】
上記の形質転換酵母ライブラリーの製造において、上記の酵母への形質転換は、一般的な方法（例えば、Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.）によって行える。
【００７７】
その後、連続継代培養を通して巨大コロニーを形成するガラクトースの資化能が増大した形質転換酵母を選別した後、巨大コロニーから単離した形質転換酵母からプラスミドに挿入された遺伝子配列を確認する。このとき、遺伝子配列の確認は、Ｇｅｌ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ｇｅｌ ｄｏｃ）装置またはＨｙｄｒａ装置などを利用して行える。
【００７８】
また、本実施形態に係る遺伝子の選別方法は、下記の段階を更に含んでもよい。すなわち、酵母のゲノムの塩基配列、及びプラスミドに挿入した遺伝子の両末端に存在する所定の長さの遺伝子の塩基配列を比較し、挿入遺伝子の酵母ゲノム上での位置を追跡することにより、過剰発現した遺伝子を確認する段階、並びに／または、確認した前記遺伝子を含むプラスミドを酵母に再び形質転換し、ガラクトースの資化能の増大が前記遺伝子の過剰発現によるものであることを確認する段階である。
【００７９】
上記の追加可能な段階により、選別された遺伝子を明らかにし、ガラクトースの資化能の増大が誘発したことを再び確認することができる。
【００８０】
［第６実施形態：第５実施形態の選別方法により選別された遺伝子］
第６実施形態に係る遺伝子は、上記の第５実施形態に係る選別方法により選別された、過剰発現によってガラクトースの資化性を増大させるものである。また、本実施形態の遺伝子は、Ｃ末端抑制ドメインの少なくとも一部を欠いたＴＵＰ１の短縮タンパク質をコードする遺伝子であり得る。さらに、本実施形態の遺伝子は、Ｃ末端抑制ドメイン（第２８８番目〜第３８９番目）のアミノ酸配列を完全に欠いた、ＴＵＰ１の短縮タンパク質をコードする遺伝子であり得る。なお、上記の第１〜第５実施形態で説明した事項を本実施形態で説明することは省略する。すなわち、かかる遺伝子は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＴＵＰ１の短縮タンパク質）をコードする、配列番号：１で示される塩基配列よりなるポリヌクレオチドであり得る。
【００８１】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されることはない。
【実施例】
【００８２】
［製造例１］
ＴＵＰ１タンパク質のうち第１番目〜第２８４番目のアミノ酸からなるＴＵＰ１の短縮タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ（第３染色体の位置２６１５９４〜２６３３９６）を、マルチコピープラスミドｐＲＳ４２４（上記の化学式１参照）に挿入した。ここで、図４は、ＴＵＰ１の短縮タンパク質のコードポリヌクレオチドを含む遺伝子地図を表す模式図である。換言すれば、図４に示したものは、ｐＲＳ４２４に挿入した酵母の第３染色体の位置２６１５９４〜２６３３９６に相当するＤＮＡである。なお、ゲノミックライブラリーを構築する際、ｐＲＳ４２４を制限酵素（ＢａｍＨＩ）で切断した後、Ｆｉｌｌ−ｉｎ反応を通じて切断した両端を平滑末端（Ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）とした。そして、単離（分離）したゲノムＤＮＡを超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して断片化した後、上記のように調製しておいたｐＲＳ４２４とブラントエンドのライゲーションを行うことにより、ｐＲＳ４２４に目的ＤＮＡ（上記）を挿入した。
【００８３】
続いて、上記により得られた目的ポリヌクレオチドを挿入したプラスミド（ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１）を、サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄに導入して形質転換した。その際、Yeast Spheroplast Transformation Kit（Bio 101, Vista、カリフォルニア州）を使用し、形質転換株（サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１）は、炭素源として２０ｇ／ｌのグルコースを含み、ＹＳＣ（yeast synthetic complete）培地で培養し、必要最小量のアミノ酸及びヌクレオチドを培地に供給した。
【００８４】
［実施例１］
上記の製造例１で製作された形質転換株を利用して、初期の酵母接種量を約ＯＤ２５とし、挿入ポリヌクレオチドの無いベクター（empty vector）を含む野生型株（コントロール）と、ＴＵＰ１の短縮タンパク質が導入された形質転換株（以下、「ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株」ともいう）とを、炭素源として、２％グルコース及び２％ガラクトースの混合糖を含む最小培地で培養した。このようにして、双方の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図５、６及び下記の表１に示した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
その結果、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方が、コントロールの菌株と比較して、ガラクトースの資化能（発酵能）の点で有意に向上したことを確認した。特に、２％ガラクトースを資化（消失）するのにかかった時間（所要時間）については、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株では１０時間かかった。他方、野生型株（コントロール）では２４時間もかかった。最終のエタノール生成濃度についても、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は１８．９ｇ／Ｌと比較的高い値を示した反面、野生型株（コントロール）は１６．５ｇ／Ｌであった。そして、エタノールの生産性は、表１より、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールよりも約２．７５倍優れていることを確認した。
【００８７】
［実施例２］
４％ガラクトースを唯一の炭素源とする最小培地で培養した以外は、実施例１と同様の方法で双方の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図７、８及び下記の表２に示した。
【００８８】
【表２】
【００８９】
その結果、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールの菌株と比較して、ガラクトースの資化能（発酵能）の点で有意に向上することを確認した。初発のガラクトース添加濃度（添加量）が双方同一であるにもかかわらず、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は１４時間で４％ガラクトースを全て資化し、エタノール生成濃度は１８．７ｇ／Ｌであった。他方、コントロールの菌株では、２６時間経過後のエタノール生成濃度が１７．８ｇ／Ｌであった。そして、エタノールの生産性（糖類の資化能）は、表２より、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールよりも約１．９６倍優れていることを確認した。
【００９０】
［実施例３]
１０％ガラクトースを唯一の炭素源とする最小培地で培養した以外は、実施例１と同様の方法で双方の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図９、１０及び下記の表３に示した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
その結果、実施例３でもＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールの菌株と比較して、ガラクトースの資化能（発酵能）の点で有意に向上することを確認した。初発のガラクトース添加濃度（添加量）が双方同一であるにもかかわらず、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は８０時間の発酵後に５ｇ／Ｌのガラクトースのみを資化しきれずに残し、３８ｇ／Ｌのエタノールを生産した。これに対し、コントロールの菌株は８０時間の発酵後に２３ｇ／Ｌものガラクトースを資化しきれずに残し、たった２５ｇ／Ｌのエタノールしか生産できなかった。そして、エタノールの生産性（糖類の資化能）は、表３より、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株の方がコントロールよりも約１．５３倍優れていることを確認した。
【００９３】
［実施例４]
２％グルコース及び２％ガラクトースの混合糖を含む最小培地１Ｌ中で、野生型株（コントロール）、上記のＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株、野生型のＴＵＰ１過剰発現株(overexpression)、及びＴＵＰ１をノックアウトした酵母（ＴＵＰ１ノックアウト株）をそれぞれ培養して、各区分の糖類の資化能（代謝利用率）、すなわちエタノールの生産性を比較し、その結果を図１１及び下記の表４に示した。なお、本実施例で使用した酵母は、いずれもサッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄで同一である。
【００９４】
【表４】
【００９５】
その結果、炭素源として、ガラクトース及びグルコースが存在する場合、野生型のＴＵＰ１過剰発現株やＴＵＰ１ノックアウト株のエタノールの生産性は、野生型株（コントロール）と同等であることを確認した。これに対し、ＴＵＰ１短縮タンパク質形質転換株は、２４時間発酵後に、約１６．５ｇ／Ｌのエタノールを生産することができ、野生型株（コントロール）等と比較して約１．４３倍と、エタノールの生産量を著しく向上することができることを見出した。
【００９６】
この実施例４の驚くべき結果は、上述した、本発明に係る遺伝子及び組み換えタンパク質が関与する原理・メカニズムの推測を実証するものである。
【００９７】
本発明の属する分野における通常の知識を有する者であれば、上記の内容に基づき、本発明の範囲内で多種多様な応用や変形を行うことが可能である。
【符号の説明】
【００９８】
１ ＳＳＮ６相互作用ドメイン、
２ アミノ末端抑制ドメイン、Ｎ末端抑制ドメイン、
３ カルボキシル末端抑制ドメイン、Ｃ末端抑制ドメイン。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号：１
ＴＵＰ１の短縮ポリヌクレオチド（truncated TUP1 polynucleotide）の塩基配列
配列番号：２
ＴＵＰ１の短縮タンパク質（truncated TUP1 protein）のアミノ酸配列
配列番号：３
ＴＵＰ１遺伝子（TUP1 gene）の塩基配列
配列番号：４
ＴＵＰ１タンパク質（truncated TUP1 protein）のアミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：１で示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換えベクター。
【請求項５】
プラスミドである、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項６】
前記プラスミドがｐＲＳ４２４を含む、請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、発現調節配列に作動可能なように連結されている、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、または請求項４〜７のいずれか１項に記載の組み換えベクターを含む、組み換え微生物。
【請求項９】
酵母である、請求項８に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
前記酵母が、サッカロマイセス属、パチソレン属、クラビスポラ属、クリヴェロミセス属、デバリオミセス属、シュワニオミセス属、カンジダ属、ピキア属、及びデッケラ属から選択される、請求項９に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
前記酵母が、サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１（受託番号ＫＣＴＣ １１３８７ ＢＰ）である、請求項１０に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
ガラクトースを含む炭素源からのエタノールの製造方法であって、
エタノールが製造されるように、前記炭素源中で請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組み換え微生物を培養することを含む、エタノールの製造方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドの過剰発現によってエタノールの製造を増加させる、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドを過剰発現させずに前記組み換え微生物を培養する場合と比較して、エタノールの製造が３０％以上増加する、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記炭素源が、ガラクトースのみからなる、またはグルコースとガラクトースとの混合物からなる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記炭素源が、４％以上のガラクトースを含有する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
エタノールを回収することをさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
微生物を請求項４〜７のいずれか１項に記載の組み換えベクターで形質転換させることを含む、組み換え微生物の製造方法。
【請求項１９】
前記組み換え微生物によるガラクトース代謝能が、形質転換されていない前記微生物よりも高い、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
形質転換された前記微生物のガラクトースを炭素源として用いた培地からのエタノールの製造量が、形質転換されていない前記微生物よりも多い、請求項１８または１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記微生物が、サッカロマイセス属、パチソレン属、クラビスポラ属、クリヴェロミセス属、デバリオミセス属、シュワニオミセス属、カンジダ属、ピキア属、及びデッケラ属から選択される酵母である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記酵母が、サッカロマイセス属の酵母である、請求項２１に記載の製造方法。
【請求項１】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：１で示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２で示されるアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換えベクター。
【請求項５】
プラスミドである、請求項４に記載の組み換えベクター。
【請求項６】
前記プラスミドがｐＲＳ４２４を含む、請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、発現調節配列に作動可能なように連結されている、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、または請求項４〜７のいずれか１項に記載の組み換えベクターを含む、組み換え微生物。
【請求項９】
酵母である、請求項８に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
前記酵母が、サッカロマイセス属、パチソレン属、クラビスポラ属、クリヴェロミセス属、デバリオミセス属、シュワニオミセス属、カンジダ属、ピキア属、及びデッケラ属から選択される、請求項９に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
前記酵母が、サッカロマイセス セレビシエ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ／ｐＲＳ４２４−トランケイティッドＴＵＰ１（受託番号ＫＣＴＣ １１３８７ ＢＰ）である、請求項１０に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
ガラクトースを含む炭素源からのエタノールの製造方法であって、
エタノールが製造されるように、前記炭素源中で請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組み換え微生物を培養することを含む、エタノールの製造方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドの過剰発現によってエタノールの製造を増加させる、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドを過剰発現させずに前記組み換え微生物を培養する場合と比較して、エタノールの製造が３０％以上増加する、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記炭素源が、ガラクトースのみからなる、またはグルコースとガラクトースとの混合物からなる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記炭素源が、４％以上のガラクトースを含有する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
エタノールを回収することをさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
微生物を請求項４〜７のいずれか１項に記載の組み換えベクターで形質転換させることを含む、組み換え微生物の製造方法。
【請求項１９】
前記組み換え微生物によるガラクトース代謝能が、形質転換されていない前記微生物よりも高い、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
形質転換された前記微生物のガラクトースを炭素源として用いた培地からのエタノールの製造量が、形質転換されていない前記微生物よりも多い、請求項１８または１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記微生物が、サッカロマイセス属、パチソレン属、クラビスポラ属、クリヴェロミセス属、デバリオミセス属、シュワニオミセス属、カンジダ属、ピキア属、及びデッケラ属から選択される酵母である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記酵母が、サッカロマイセス属の酵母である、請求項２１に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−１０４３５９（Ｐ２０１０−１０４３５９Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１０９７１（Ｐ２００９−１１０９７１）
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＭＳＵＮＧ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】４１６，Ｍａｅｔａｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ ４４２−７４２（ＫＲ）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（３９００１９８３９）三星電子株式会社 (8,520)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＭＳＵＮＧ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】４１６，Ｍａｅｔａｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ−ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ ４４２−７４２（ＫＲ）
【Ｆターム（参考）】
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