キメラタンパク質およびその使用
本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを異常に高レベルで発現している細胞を殺すか、または改変できるキメラタンパク質であって、該レセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含み、エフェクター分子に結合されたキメラタンパク質を提供する。さらに本発明は、前記キメラタンパク質を含有する医薬組成物およびその使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフェクター分子を、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのリガンドを発現している細胞に特異的に送達し、それによって前記細胞を選択的に殺すか、または改変するための、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン類は、通常防御を増強するために働く。しかしながら、過剰に働いた場合、これらは、大きな障害を引き起こし得、これは、病原体が引き起こし得るものに勝るとも劣らない。事実、多くの疾患において、サイトカインの好まれない効果が、主要な病原となる。
【０００３】
ＴＮＦファミリーのサイトカインは、先天性型および獲得性型両方の、広い範囲の異なる免疫防御機構を調節する。ＴＮＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｘ０１３９３）、Ｆａｓリガンド（ＴＮＦＳＦ６、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｕ１１８２１）、ＣＤ４０リガンド（ＴＮＦＳＦ５、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｘ６７８７８）などを含む、数種のサイトカイン類の過剰な機能が、種々の疾患の病因に関連してきた。特に、広範囲の疾患：マラリアおよび敗血症のような感染疾患、リウマチ関節のような自己免疫疾患、炎症性腸疾患および乾癬、および特定の癌において、ＴＮＦの主要な病因的役割が広範囲に証明されている。事実、抗−ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦレセプターのような手段によって、ＴＮＦ活性を阻害することによって、このような状態における治療が提供されることがわかった［１］［２］［３］。関節リウマチおよびクローン病を含むいくつかの病的状態において、多くの有意な割合の患者が、抗−ＴＮＦ治療に好ましく応答する。しかしながら、これらの方法にはほとんど反応しないような疾患の患者も存在し、治療に対する追加的なアプローチを定義する必要が提起される［４］。
【０００４】
サイトカイン−産生細胞によるそれらの分泌に続いて、可溶性タンパク質として単独で働く多くの他のサイトカインとは違い、ＴＮＦファミリーのリガンドは（可溶性分泌タンパク質として産生される、リンホトキシン（ＬＴＡ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｘ０１３９３）を除いて）、細胞−結合ＩＩ型膜貫通タンパク質として産生される。これらは、その形態で効果を発揮することができ、リガンド産生細胞に隣接して局在する細胞にのみ影響を与える（ジャクスタクリン調節）。これらの多くは、循環する可溶性分子を形成し流動している。たとえばＴＮＦなど、これらの可溶性リガンドの一部は、可溶性サイトカインとして働き、パラクリン調節物（リガンド産生細胞に比較的近く局在する細胞に影響を与える）およびエンドクリン調節物（遠くの細胞に影響を与える）として働く能力がある。ＴＮＦファミリーの他のリガンド、たとえばＦａｓリガンドは、その流動形態（shed form）では効果的に働かず、この形態では、まさに細胞結合形態に対するアンタゴニストとして働き得る［５］［６］。
【０００５】
産生細胞の表面上での、ＴＮＦファミリーのリガンドの存在によって、これらのリガンド産生細胞を特異的に標的化するための潜在的な方法が提供される。そのような方法によって、リガンドが病原的な役割を果たす状況にて、リガンド産生細胞の選択的な抑制または削除さえ可能になり得る。
【０００６】
いくつかの観点において、サイトカインを産生する細胞の破壊が、サイトカイン分子の機能の正に直接の抑制よりも、このサイトカインの病原性の効果に対するよい防御を提供するようになり得る。
【０００７】
サイトカイン−産生細胞の崩壊により、サイトカインのさらなる合成が防止され、したがって、すでに合成されたサイトカイン分子の効果をただ抑制することによって得られたものよりも、より耐久性のある保護が提供され得る。
【０００８】
サイトカインを産生する細胞はしばしば、特定の型の免疫応答を引き出すために一緒に働く他のサイトカインを同時に産生する。よく知られている例は、それぞれ、異なる型の免疫防御を引き出すために働く、異なる群のサイトカインを産生するリンパ球である、Ｔｈ１−およびＴｈ２型Ｔリンパ球がある［７］。サイトカインを産生している細胞を破壊することによって、したがって、特定のサイトカインの合成の停止に加えて、その病原性効果において、前者を補助する種々の他のサイトカインの合成も停止させることになる。
【０００９】
循環サイトカインの抑制が全身に影響を与える一方、サイトカイン−産生細胞を殺すことは、これらの細胞が存在する体の特定の場所に制限可能であり、したがって、他の場所でのサイトカインの利益ある効果を維持する一方で、特定の部位での、サイトカインの有害な効果が避けられる。
【００１０】
クローン病における、抗−ＴＮＦ治療の効果の研究によって、ＴＮＦ−産生細胞を殺すことによって、いくつかの病的状況において実際に、単にＴＮＦを阻害することによって得られるよりも、効果的な治療が提供され得ることが示唆されている。この疾患における、抗−ＴＮＦ抗体の治療効果が、抗体によるＴＮＦ−産生細胞の死の早期誘導と相関することがわかった［８］［９］［１０］。したがって、ＴＮＦ、またはＴＮＦファミリーの他のリガンドを産生する細胞の効果的かつ選択的標的化のための方法を設計する必要がある。
【００１１】
細胞表面構成物に結合する標的化分子に連結したサイトトキシンが、強力な細胞殺傷試薬として機能し得る。細胞型特異的表面構成物を認識する標的化部位を選択することによって、インビボにおける特定の細胞の選択的破壊に対して、そのような細胞毒性キメラを適用することが可能である。たとえば、シュードモナスエクソトキシン（ＰＥ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）に融合した癌特異的エピトープに対する抗体からなる融合タンパク質が、癌細胞を特異的に標的化し、殺すことが可能である。毒素が、そのレセプターが特定の腫瘍にて現れる、ＩＬ２、ＩＬ４またはＩＬ１３のようなリガンドまたはホルモンに融合したキメラでも、そのような抗癌効果が得られてきた。同様に、サイトトキシン−含有キメラが、病原体被災細胞に対して標的化されるように設計された。たとえば、ＨＩＶ−感染細胞を、シュードモナスエクソトキシンに結合した、ｇｐ１２０の保存ＣＤ４結合部位に指向する抗−ｇｐ１２０またはＣＤ４からなる免疫毒素を用いて、選択的に破壊することができる［１１］［１２］［１３］。
【００１２】
ＴＮＦファミリーのリガンドを発現する細胞に対して、サイトトキシン類または他の調節薬剤を標的化するための可能性ある方法の１つの種類は、これらのリガンドに対する抗体である。実際、ＣＤ４０リガンドに対する抗体が、ＣＤ４０リガンド産生細胞に対して毒素を標的化するために適用された（欧州特許第１００５３７２号）。しかしながら、特定のリガンドに対して産生された抗体の一部分のみが、このリガンドの、そしてこれらの細胞結合形態に対して効果的に結合するのみであり、一旦これらがリガンドに結合したならば、一部分のみがレセプター分子（可溶性または細胞関連）と競合可能であり得る。そのような抗体のスクリーニングは、大規模な試みと期間が必要であり得る。通常マウスである抗体の他の不利な点は、これらが、患者における免疫応答を喚起することである。
【００１３】
したがって、ＴＮＦファミリーのリガンドを産生する細胞を効果的に標的化可能であるタンパク質の産生のための、一般的なアプローチを定義することが望ましい。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、異常に高レベルのＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを発現している細胞を殺すこと、または改変することが可能なキメラタンパク質であって、該レセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含むキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分に関し、該ポリペプチドは、エフェクター分子に連結されている。
【００１５】
本発明の１つの実施様態において、前記キメラタンパク質のポリペプチドは、ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＦａｓの細胞外部分からなる。
【００１６】
本発明の他の実施様態において、キメラタンパク質のポリペプチドは、ＴＮＦ結合タンパク質−１（ＴＢＰＩ）のような、ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分からなる。
【００１７】
本発明の１つの観点において、キメラタンパク質中のエフェクター分子は、シュードモナスエクソトキシン、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニン、またはこれらの断片のような細胞傷害性分子である。
【００１８】
本発明の１つの観点において、キメラタンパク質中のエフェクター分子は、配列番号：３のアミノ酸配列に相当する、本明細書でＰＥと呼ばれる断片のような、シュードモナスエクソトキシンの断片である。
【００１９】
さらなる実施様態において、本発明は、本明細書でＴＢＰ−ＰＥとして記述される、配列番号：２のアミノ酸配列を持つキメラタンパク質、または変異導入体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、その活性断片または塩を提供する。
【００２０】
本発明の１つの観点において、キメラタンパク質中のエフェクター分子は、蛍光組成物、放射活性組成物、Ｂａｘ、Ｂａｋのような、哺乳動物細胞死タンパク質、ＤＮＡ断片化因子４０、シクロスポリン含有リポソーム、免疫抑制サイトカインのようなサイトカイン、増殖因子、腫瘍細胞抗原に特異的であり得る抗体、またはＢｃｌｘ、ＣＡＤ−タンパク質、カスパーゼ、ＩｋＢのような細胞内調節タンパク質である。
【００２１】
１つの実施様態において、本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列、たとえば、配列番号：１のヌクレオチド配列、ＴＢＰ−ＰＥまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分をコードするＤＮＡを提供し、任意に、前記単離ＤＮＡはさらに、真核細胞中での分泌のための、シグナルペプチドをコードする。
【００２２】
さらなる実施様態において、本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
【００２３】
また他の実施様態において、本発明は、そのような前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、たとえば、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＴＨＰＩ、酵母および昆虫細胞のような、真核細胞または原核細胞であり得る。
【００２４】
１つの観点において、本発明は、前記発現ベクターを含む前記宿主細胞を培養すること、および産生されたキメラタンパク質を単離すること、を含む、ＴＢＰ−ＰＥのようなキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分を産生するための方法を提供する。
【００２５】
他の観点において、本発明は、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２６】
さらなる観点において、本発明は、共に本発明のキメラタンパク質をコードする前記ＤＮＡまたは前記ベクターと、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２７】
１つの実施様態において、本発明は、疾患の治療のための医薬品の製造における、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用に関する。
【００２８】
１つの実施様態において、キメラタンパク質を自己免疫疾患において使用する。
【００２９】
本発明の他の実施様態において、キメラタンパク質を、ＴＮＦのような、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドが、疾患、たとえば、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核のような急性疾患、または慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬のような慢性疾患の発病および／または経過に関与する疾患において使用する。
【００３０】
本発明のまた他の実施様態において、キメラタンパク質を癌にて使用し、前記キメラタンパク質が、癌細胞によって発現されたＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドに結合する。たとえば、ＴＮＦレセプターの細胞外部分を含むキメラタンパク質を、ＴＮＦを発現している乳癌のような上皮由来の癌で使用可能である。
【００３１】
また他の実施様態において、本発明はまた、キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している有害な細胞を殺すための、自己移植前に癌患者の幹細胞を治療するための、医薬品の製造における、本発明のキメラタンパク質の使用に関する。たとえば、キメラタンパク質を、幹細胞の採取の前に患者に投与してよく、または患者より取り出した細胞を、移植の前に治療するために使用してよい。
【００３２】
また他の実施様態において、本発明は、ＴＮＦを発現している上皮細胞が、疾患の発病および／または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用に関する。たとえば、乳癌、移植片対宿主疾患（ＧＶＨ）、乾癬、およびクローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患（ＩＢＤｓ）においてである。
【００３３】
１つの観点において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む自己免疫疾患の治療方法を提供する。
【００３４】
他の観点において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンド、たとえばＴＮＦの活性が、前記疾患の発病または経過に関与する疾患の治療方法を提供する。たとえば、ＴＮＦは、以下の疾患の発病および／または経過に関与する。敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核のような急性疾患、または、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬のような慢性疾患。
【００３５】
１つの実施様態において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、癌細胞が、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンド、たとえばＴＮＦを発現しているような、癌の治療方法を提供する。
【００３６】
本発明のさらなる実施様態において、前記癌は上皮由来であり、たとえば乳癌である。
【００３７】
他の実施様態において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量の本発明のキメラタンパク質を投与することを含む、自己移植の前に、ＴＮＦを発現している有害な骨髄細胞を殺すための方法に関する。たとえば、キメラタンパク質を、骨髄細胞の採取の前に必要としている対象に投与してよい。
【００３８】
また他の実施様態において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、ＴＮＦを発現している上皮細胞が、前記疾患の発病および／または経過に関与する、乳癌、移植片−対−宿主疾患、乾癬および炎症性腸疾患のような疾患の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、前記ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含む、異常に高レベルのＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを発現している細胞を殺すか、または改変可能であるキメラタンパク質、またはムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または細胞毒性調節およびレセプター分子からなる群から選択されたエフェクター分子に連結されたそれらの活性断片に関する。
【００４０】
本発明によって、エフェクター分子を、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの細胞結合リガンドを発現している細胞に対して標的化（または特異的に送達）可能である。
【００４１】
本発明は、エフェクター分子としてｐ５５ ＴＮＦレセプター（ＴＢＰＩ）の可溶性形態、シュードモナスエクソトキシンの移行ドメインおよびＡＤＰ−リボシル化ドメインを含むポリペプチドを含む、配列番号：２（図１Ｄ）でのアミノ酸配列に相当する、本明細書でＴＢＰ−ＰＥと示される、キメラタンパク質で得られた結果に基づいている。実験結果によって、ＴＢＰＩ−ＰＥが、ＴＢＰＩと同様のＴＮＦ−結合活性を十分に持つこと、これらの細胞においてのみ、タンパク質合成の阻害を引き起こす、細胞表面ＴＮＦ−αを発現している細胞内へのみ浸透し、細胞死を引き起こすことを示している。
【００４２】
ｐ５５ ＴＮＦレセプター（ＴＢＰＩ）の細胞外部分、シュードモナスエクソトキシンのドメインＩＩ、ＩｂおよびＩＩＩからなる、シュードモナスエクソトキシン（ＰＥ）の４０ｋＤａ断片を含む、キメラ遺伝子ＴＢＰ−ＰＥを、ＰＣＲ増幅によって調製した。ＴＢＰ−ＰＥタンパク質を、ＴＢＰ−ＰＥベクター（ｐＴＢＰ−ＰＥ）で形質導入した原核細胞ＢＬ２１中で産生させた。ほとんどの組換え体タンパク質を含む、封入体を、変性溶液中に溶解し、変性させた。細菌細胞中で産生された折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質は、５７ｋＤａの正しい大きさを持った。
【００４３】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥをさらに、抗ＴＢＰ−Ｉ架橋でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【００４４】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質のＡＤＰ−リボシル化活性を、インビトロにて調査した。ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化が、（実施例２の変性封入体からの）再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質によって誘導された。再折りたたみタンパク質のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性が、反応で使用した再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量に関連して増加した。
【００４５】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量を、ＴＢＰＩに対して特異的な抗体を用いて、酵素結合免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって推定した。さらに、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥのＴＮＦ結合活性を、ＣＨＯ細胞において産生される精製ＴＢＰＩの、ＴＮＦへのＴＮＦ結合活性と比較した。本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって推定されたＴＢＰ−ＰＥの濃度が、Ｂｒａｄｆｏｒｄによって見られたものと同様であることを発見し、これは、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥおよびＴＢＰＩが、同様の効果で、抗−ＴＢＰＩ抗体によって認識されることを示している。（ＥＬＩＳＡによって測定され得たような）同様の量の（原核細胞から精製した）ＴＢＰＩまたは再折りたたみＴＢＰＩ−ＰＥの、ＴＮＦへの結合を、ＴＮＦコートプレートにて調査した。本発明者らは、ＴＢＰＩの活性を１００％ＴＮＦとして使用して、少なくとも５０％の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＮＦ結合活性を持つことを発見した。
【００４６】
融合タンパク質ＴＢＰ−ＰＥ（および対照として、可溶性ＴＮＦレセプターのみ）の細胞毒性活性を、上皮中、または単球様ＬＰＳ−処理細胞中で試験した。ＨｅＬａ−Ｍ９細胞は、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、＋２の位置でのアルギニンと、＋３の位置でのセリンが、スレオニンに置換される、ヒトＴＮＦ変異導入ｃＤＮＡを一貫して発現する、上皮ＨｅＬａ子宮頸癌のクローンである。これらの変異導入によって、２６ｋＤａ表面ＴＮの開裂速度が約１０倍減少した。細胞を、１０％ Ｆｅｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含む、ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【００４７】
（膜結合ＴＮＦを過剰発現している）ＨｅＬａ−Ｍ９またはＨｅＬａ細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、異なる濃度のＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩとともにインキュベートし、培養液の生存を、ニュートラルレッド染色を用いて査定した。いくつかのウェルで、ＴＢＰＩを、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に適用して、膜−結合ＴＮＦ−αを介して誘導されたＴＢＰ−ＰＥ活性の特異性を調査するために、ＴＮＦに関して競合させた。
【００４８】
本発明者らは、６００ｎｇ／ｍｌのＴＢＰ−ＰＥが、その表面上にＴＮＦ−αを過剰発現している、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞の死を引き起こすが、ＨｅＬａ細胞には影響を与えなかったことを発見した。ＴＢＰＩは１０倍過剰で適用する時に、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果を特異的に抑制した。ＴＢＰＩのみは、７６ｍｇ／ｍｌまでの濃度で、細胞変性効果を引き起こさなかった。２つの異なるバッチのＴＢＰ−ＰＥを試験し、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞に対して同様の細胞毒性があることがわかった。ＴＢＰ−ＰＥは、６００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＨｅＬａＭ９にて、９０％を超える細胞死を引き起こした。ＴＢＰ−ＰＥのバッチの１つが、非常に活性であり、０．０６ｍｇ／ｍｌでの濃度でも細胞毒性であり、ほぼ６５％のＨｅＬａＭ９細胞を殺した。
【００４９】
ＴＢＰ−ＰＥは、ＨｅＬａ−Ｍ９におけるタンパク質合成を劇的に抑制するが、ＨｅＬａ細胞のタンパク質合成においては、阻害効果を欠くことがわかった。ＴＢＰＩは、１０倍過剰で、ＴＢＰ−ＰＥと一緒に加えたときに、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞中で、ＴＢＰ−ＰＥの効果を抑制することがわかった。ＴＢＰＩのみは、ＨｅＬａ−Ｍ９内、またはＨｅＬａ細胞内で、タンパク質の合成に影響を与えなかった。
【００５０】
ＴＢＰ−ＰＥの効果を、細胞表面ＴＮＦを過剰発現している、活性化単球様細胞株（ＴＨＰＩ）または活性化初代マクロファージ両方でも探索した。本発明者らは、ＨｅＬａＭ９細胞にて、細胞毒性を引き起こす濃度（６０および６００ｎｇ／ｍｌ）で試験したＴＢＰ−ＰＥが、活性化ＴＨＰＩ株、および活性化初代マクロファージにおける細胞毒性活性を欠き、後者の細胞におけるＴＮＦ分泌を阻害しなかったことを発見し、これは、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果が、細胞結合ＴＮＦを過剰発現している上皮細胞に対して特異的であることを示している。
【００５１】
本発明の１つの実施様態において、ＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａＭ９のような、膜ＴＮＦを過剰発現している上皮腫瘍細胞に対して細胞毒性性であるが、膜ＴＮＦを過剰発現している、単球の形をしている活性化細胞株、または初代マクロファージの活性化培養液の両方に対して細胞毒性ではないことが示された。
【００５２】
Ｄｉｅｂｅｌら（J Trauma.2005 58(5):995-1001）は、腸上皮細胞のアポトーシスが、腸に対する低流速状態の後の腸不全に関与することを示唆した。Ｄｉｅｂｅｌらは、細菌と低酸素−再酸素化のような、混合損傷に曝露した後の、上皮Ｃａｃｏ２腸細胞株が、ＴＮＦを産生し、続いてこれらにおけるアポトーシスを誘導したことを示した。
【００５３】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、腸炎症疾患（ＢＩＤ）潰瘍性大腸炎およびクローン病のような、腸の条件下でのアポトーシスに関与する、ＴＮＦを過剰発現している腸上皮細胞を特異的に殺すために使用し得る。
【００５４】
Ｋｏｎｏｕｒら（Br J Dermatol.2005;152(6):1134-42）は、ケラチノサイト、または腸上皮細胞のアポトーシスが、急性移植片−対−宿主（ＧＶＨ）疾患のあいだの、器官の障害の重要な病理生態学的機構であることを示唆した。Ｋｏｎｏｕｒらは、それぞれが、主要組織適合性複合体ミスマッチ白血病培養と混合した、ケラチノサイトまたはヒト皮膚移植培養を含む、ＧＶＨのインビトロモデルにおける、ＧＶＨでのアポトーシスを誘導することに関するメディエーターを探索した。Ｋｏｎｏｕｒらによって得られた結果は、ケラチノサイトおよびヒト皮膚移植培養から産生されたＩＦＮガンマおよびＴＮＦが、ＧＶＨでのアポトーシスのメディエーターであることを示している。
【００５５】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、ＧＶＨを予防または最小化するために、ＴＮＦを産生しているケラチノサイトまたは腸上皮細胞を特異的に殺すために、移植を受ける患者に投与してよい。
【００５６】
ケラチノサイトおよびＴ細胞両方が、乾癬において、十分な量のＴＮＦαを分泌し、この疾患の発病における、１つのこれらの型の細胞の一般的な重要性は明確ではない（Kupper T.S.,Immunologic Targets in_Psoriasis.N.Engl.J.Med.,2003,v.349,pp.1987-1990;Asadullah K.ら,Novel Immunotherapies for psoriasis.TRENDS in Immunology,2002,v.23,No1,pp.47-53）。Ｈｏｎｇ Ｋ．らが、ＩＮＦ−ガンマとは独立して、ＩＬ−１２が、マウス乾癬様皮膚疾患の発病において、重要な役割を果たすことを示している（J.Immunology,1999,v.162;pp.7480-7491）。Ｈｏｎｇらが、インターフェロンガンマ−／−表現系の皮膚由来炎症細胞が、マウスにおいて、多量のＴＮＦ−αを分泌したが、抗ＩＬ−１２の存在下では分泌しなかったことを指摘した。
【００５７】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、ＴＮＦを産生している皮膚由来の炎症細胞を特異的に殺すために、乾癬患者に投与してよい。
【００５８】
Ｓｔｕｅｌｔｅｎら（J Cell Sci.2005 15;118(Pt10),2143-53）が、乳癌細胞の悪性化可能性を増加させる機構における、腫瘍−間質相互作用を探索した。この目的のために、Ｓｔｕｅｌｔｅｎは、繊維芽細胞（たとえば間質細胞）と悪性化の可能性が高いヒト腫瘍乳上皮細胞を含む２Ｄ−共培養液を使用した。Ｓｔｕｅｌｔｅｎらは、繊維芽細胞における（腫瘍転移を促進することが知られている）ＭＭＰ−９の発現が、腫瘍によって分泌されるＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−ベータの活性によって誘導されることを示した。
【００５９】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、腫瘍増殖および転移を予防するために、上皮乳癌、またはＴＮＦ−αを産生している上皮由来の他の癌を効果的に殺すために使用してよい。
【００６０】
すべてにおいて、膜結合ＴＮＦを過剰発現している細胞においてのみ、特定の効果を示している、ＴＢＰ−ＰＥで得た結果によって、ＴＢＰ−ＰＥならびに本発明の他のキメラタンパク質が、治療的な目的のために探索可能で活用可能であることが示される。
【００６１】
本発明にしたがって、ＴＮＦファミリーのリガンドを標的化するための、非常の効果的であり、選択的な一般的方法が、結合するレセプターの細胞外部分によって提供される。これらのリガンドに対するいくつかのレセプターが、細胞結合形態でだけでなく、これらのレセプターの細胞外部分またはドメインに相当する可溶性形態でも、天然に存在する。これらの可溶性形態のいくつかが、それらの細胞表面レセプターとのリガンドの相互作用を阻害させる程度まで、それらのそれぞれのリガンドに対して、効果的に結合することが示されてきた。さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの特定のレセプター（たとえばＯＰＧ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｕ９４３３２）が、可溶性分子としてのみ産生され、この形態で、相互作用するリガンドの、他の細胞表面のファミリーのレセプターとの結合を効果的に阻害する。
【００６２】
ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＦａｓのような、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのレセプターの細胞外部分が、本発明にしたがって企図される。ＴＮＦファミリーのレセプターの可溶性形態を含むキメラ分子が、可溶性レセプターの、特異的に細胞結合リガンド分子に標的化する能力を維持するために、他の部位に融合してよい。その上、これらは、可溶性レセプターが融合する部位によって与えられる追加的な活性を持ち得、たとえば、ＴＮＦレセプターの可溶性形態の、免疫グロブリンのＦｃ部位またはポリエチレングリコールへの融合が、本来の可溶性レセプター分子のものよりも、より長いクリアランス時間を持って、キメラに寄与し得る。２つの可溶性レセプター分子の、免疫グロブリン分子のＦｃ部分への融合がまた、これらのレセプター分子に、それらのリガンドに結合するより大きな効果を与え得る。
【００６３】
「エフェクター分子（effector molecules）」は、標的細胞の近くまたは内に配置したときに、その上に、望む機能的または表現系的変化を強要可能であるタンパク質または化学物質である。細胞内の機能的変化には、限定はしないが、細胞死、およびリガンド発現のダウンレギュレーションが含まれる。表現系変化には、限定はしないが、細胞蛍光および放射活性の変化が含まれる。
【００６４】
１つの実施様態において、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの細胞外部分が、シュードモナスエクソトキシン（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンなどのような、天然または改変細胞毒素である、エフェクター物質に融合（または連結）される。
【００６５】
他の実施様態において、レセプターの細胞外部分を、哺乳動物細胞−死タンパク質、たとえば、Ｂｃｌ２−関連タンパク質ＢａｘまたはＢａｋ、またはＤＮＡ断片化因子４０に融合（または連結）可能である［１４］。
【００６６】
他の実施様態において、エフェクター分子は、薬理学的試薬、または薬理学的試薬を含む賦形剤であってよい。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの細胞外部分を、たとえば蛍光組成物に連結してよく、これによって、このレセプターが結合するリガンドを産生している細胞のイメージングが可能になる。また、リガンド産生細胞のイメージングのため、またはそれらの分解のために使用してよい、放射活性化合物に連結してもよい。可溶性レセプターを、好ましく活性化Ｔ−リンパ球に影響を与える薬物である、リソソーム−含有シクロスポリンに連結することによって、レセプターによって認識されるリガンドを産生するＴリンパ球の機能の選択的阻害を可能にし得る。
【００６７】
また他の実施様態において、エフェクター分子は、増殖因子またはサイトカインであり得る。たとえば、免疫抑制サイトカインであってよく、レセプターに対するリガンドを発現している細胞へ、このサイトカインを特異的に送達可能である。
【００６８】
また他の実施様態において、エフェクター分子は、抗体、たとえば、腫瘍−細胞特異的抗原に対する抗体であり得る。そのような抗体と、ＴＮＦに対する可溶性レセプターからなるキメラが、ＴＮＦ−産生細胞の、腫瘍細胞との相互作用を刺激し、したがって、ＴＮＦによる腫瘍細胞の分解を指令する。
【００６９】
他の実施様態において、エフェクター分子は、Ｂｃｌｘ、ＣＡＤ−タンパク質、カスパーゼ−８およびＩκＢのようなカスパーゼのような、細胞内調節タンパク質であり得る。
【００７０】
レセプターの可溶性形態の天然の発生が、ＴＮＦの２つのレセプター（ＴＮＦＲ５５およびＴＮＦＲ７５）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、Ｆａｓおよび他を含む、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのほとんどすべてのメンバーに関して記述されてきている。キメラタンパク質には、天然に存在するか、または人工いずれかの、このファミリーのレセプターの可溶性形態が含まれ得る。ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの任意の特定のレセプターの全細胞外ドメイン、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体またはその活性画分であり得る。
【００７１】
語句「キメラタンパク質（chimeric protein）」および「共役物（conjugate）」は、本明細書内で相互互換的である。
【００７２】
本明細書で使用するところの語句「ムテイン（muteins）」は、本来のタンパク質と比較して、得られる産物の活性が著しく変化しないで、天然に存在するタンパク質の成分の、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換されるか、または欠損するか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、タンパク質の本来の配列に加えられる、タンパク質の類似体を意味する。これらのムテインは、公知の合成によって、および／または部位特異的変異導入技術、または好適な任意の他の公知の技術によって調製される。
【００７３】
本発明によるムテインには、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされた、ストリンジェントな条件下で、本発明にしたがって、タンパク質をコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリッド形成する、タンパク質が含まれる。語句「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」は、ハイブリッド形成と、それに続く洗浄条件を意味し、当業者によって「ストリンジェント」と呼ばれる。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，上記、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§§６．３および６．４（１９８７、１９９２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。
【００７４】
限定はせずに、ストリンジェントな条件の例には、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、１５分間、試験ハイブリッドの計算Ｔｍより１２°〜２０℃下；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、３７℃にて３０〜６０分間、ついで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ、６８℃、３０〜６０分間の洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件がまた、ＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基のような）オリゴヌクレオチドプローブ、または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに、テトラメチル塩化アンモニア（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ、上記を参照のこと。
【００７５】
任意のそのようなムテインは、好ましくは、本発明のタンパク質に対して、本質的に同様の、またはよりよい活性を持つような、本発明の可溶性レセプターのものと本質的に複製的であるアミノ酸の配列を持つ。たとえば、ＴＢＰの１つの特徴的な活性は、ＴＮＦへの結合のその能力である。ＴＮＦの結合を測定するための、ＥＬＩＳＡ型アッセイを、以下の実施例で記述している。ムテインが、本発明の可溶性レセプターに対する十分な結合活性を持つ限り、本発明の可溶性レセプターに対する、本質的に同様の活性を持つと考えることが可能である。したがって、任意のムテインが、可溶性レセプターと少なくとも本質的に同様の活性を持つかどうかを、そのようなムテインを、たとえば、以下の実施例にてＴＢＰおよびＴＮＦに関して記述したように、そのリガンドに結合するかどうかを決定するために、単純な結合アッセイにかけることを含む、通常の実験方法によって、決定可能である。
【００７６】
好ましい実施様態において、任意のそのようなムテインは、ＴＢＰのアミノ酸配列と、少なくとも４０％同一性または類似性を持つ。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはもっとも好ましくは、少なくとも９０％同一性または相同性を持つ。
【００７７】
同一性は、配列を比較することによって決定する、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列、または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の相関を反映する。一般的に、同一性は、比較している配列の長さにわたる、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、実際のヌクレオチドのヌクレオチドに対する、またはアミノ酸のアミノ酸に対する相関を意味する。
【００７８】
実際の相関がない配列に関して、「パーセント同一性（percent identity）」を測定し得る。一般的に、比較すべき２つの配列を、その配列間の最大相関を得るために、並べる。これには、アライメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列いずれかでの、「ギャップ」の挿入が含まれる。パーセント同一性は、同一、または非常に類似の長さの配列に対してとりわけ好適である、比較している配列のそれぞれの全配列にわたり（グローバルアライメントと呼ばれる）、または等しくない長さの配列により好適である、より短い、定義された長さにわたって（ローカルアライメントと呼ばれる）、決定してよい。
【００７９】
２つまたはそれ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が、本発明分野でよく知られている。したがって、たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Devereux Jら,1984,Nucleic Acids Res.1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95）にて使用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用してよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（J Theor Biol.1981 Jul 21;91(2):379-80およびJ Mol Biol.1981 Mar 25;147(1)195-7.1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最適な単独領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた、本技術分野で公知であり、たとえば、プログラムのＢＬＡＳＴファミリー（www.ncbi.nlm.nih.govにて、ＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能、Altschul D Sら,1990 J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3)403-10,Proc Natl Acad Sci USA.1990 Jul;87(14):5509-13, Altschul S Fら,Nucleic Acids Res.1997 Sep 1;25(17):3389-402)およびFASTA(Pearson W R,Methods Enzymol.1990;183:63-98.Pearson J Mol Biol.1998 Feb 13;276(1):71-84）がある。
【００８０】
本発明にしたがって使用可能である、可溶性レセプターのムテイン、またはそれをコードする核酸には、本明細書で表された教義およびガイダンスに基づいて、必要ない実験なしに、当業者によって通常得ることが可能である、置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして、本質的に相当する配列の限定組が含まれる。
【００８１】
本発明にしたがったムテインに関する好ましい変化は、「保存的（conservative）」置換として知られているものである。本発明の可溶性レセプターの保存的アミノ酸置換には、基のメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存する、十分に類似の生理化学的特性を有する基内の同義アミノ酸が含まれ得る（Ｇｒａｎｔｈａｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７４ Ｓｅｐ ６；１８５（４１５４）：８６２−４）。アミノ酸の挿入および欠損がまた、それらの機能を変化することなく、好ましくは挿入または欠損が、数個のアミノ酸、たとえば１３以下、好ましくは１０以下にのみ関連し、機能的配座に対して必須であるアミノ酸、たとえばシステイン残基を除去または置換しない、以上で定義した配列で実施してよい。そのような欠損および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインが、本発明の範囲内である。
【００８２】
好ましくは、同義アミノ酸基は、表１で定義されたものである。より好ましくは、同義アミノ酸基は、表２で定義されたものであり、もっとも好ましくは、同義アミノ酸基は表３で定義したものである。
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
本発明での使用のための、本発明の可溶性レセプターのムテインを得るために使用可能である、タンパク質内のアミノ酸置換の産生の例には、Ｍａｒｋらに付与された米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらに付与された第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらに付与された第４，９６５，１９５号、Ｃｈｏｎｇらに付与された第４，８７９，１１１号、Ｌｅｅらに付与された第５，０１７，６９１号で表されたような任意の公知の方法段階、および米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）にて表されたリジン置換タンパク質が含まれる。
【００８７】
本明細書で使用するところの「機能的誘導体（functional derivatives）」は、残基上の側鎖として存在するか、本技術分野で公知の方法によって、Ｎ−またはＣ−末端基への添加物である官能基から調製し、薬理学的許容性を維持する限り、すなわち本発明の可溶性レセプターの活性と本質的に同様のタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性特性を与えない限り、本発明に含まれる、本発明の可溶性レセプターの誘導体、およびそれらのムテインをカバーしている。
【００８８】
「機能的誘導体」にはまた、変化が、任意の従来の方法によって、可溶性レセプターを作製するアミノ酸の配列内に導入された、可溶性レセプターを作るマルチマーが含まれる。これらの変化には、可溶性レセプター分子の延長または切断、または可溶性レセプターを作製している１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠損または置換が含まれ得る。以上の変化のどれもが、可溶性レセプターの結合特性に影響を与えないことが理解される。
【００８９】
これらの誘導体には、たとえば、抗原部位をマスクし、体液中の本発明の可溶性レセプターの残余をのばし得る、ポリエチレングリコール側鎖が含まれ得る。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級または二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部位と形成したアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえばアルカノイルまたはカルボン酸アロイル基）、またはアシル部位と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえばセリルまたはスレオニル基のもの）が含まれる。
【００９０】
本発明にしたがった「活性画分（active fraction）」は、たとえば、本発明の可溶性レセプターの断片であり得る。語句断片は、任意の分子のサブセットを意味し、すなわち、より好ましい生物学的活性、たとえばリガンドへの結合を残した、より短いペプチドである。断片は、可溶性レセプター分子のいずれかの末端からアミノ酸を取り除き、ＴＮＦへ結合するその特性に関して、得られた断片を試験するために調製し得る。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端いずれかから、一度に１つのアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが知られており、望む生物学的活性を残す、そのようにして決定された断片が、従来の実験のみによって生じる。
【００９１】
本発明の可溶性レセプターの活性画分、そのムテインおよび融合タンパク質として、本発明はさらに、画分が、本質的に、本発明の可溶性レセプターと本質的に等しい活性を持つという条件で、単独で、または結合する関連分子または残基、たとえば糖またはリン酸残基と結合した、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体、またはそれらによる、タンパク質分子または糖残基の凝集物をさらに、カバーしている。
【００９２】
またさらなる実施様態において、本発明にしたがった基質には、免疫グロブリン融合物が含まれ、すなわち、本発明にしたがった分子が、免疫グロブリンのすべてまたは一部に融合する。免疫グロブリン融合タンパク質を作製するための方法は、たとえば、国際公開第０１／０３７３７号パンフレットで記述されたもののように、本技術分野でよく知られている。当業者は、得られた本発明の融合タンパク質が、キメラタンパク質の生物学的活性を維持することを理解するであろう。得られた融合タンパク質は、理想的に、体液中の残留時間の延長（半減期）、特定の活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製の促進のような、改善された特性を持つ。
【００９３】
好ましくは、本発明にしたがった基質は、Ｉｇ分子の定常領域に融合する。たとえばヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような、重鎖領域に融合し得る。たとえば、アイソマーＩｇＧ２またはＩｇＧ４、またはＩｇＭまたはＩｇＡのような他のＩｇクラスのような、Ｉｇ分子の他のアイソマーもまた、本発明にしたがった融合タンパク質の産生のために好適である。融合タンパク質は、一量体または多量体、ヘテロまたはホモ多量体であり得る。
【００９４】
本明細書での語句「塩」は、可溶性レセプター分子またはその類似物の、カルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸添加塩両方を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野で公知の方法によって形成され、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩などの無機塩、トリエタノールアミンのような、アミンと形成されたもの、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどの有機塩基との塩が含まれる。酸添加塩には、たとえば、塩酸または硫酸のような、ミネラル酸との塩、およびたとえば酢酸またはオキサロ酸のような有機酸との塩が含まれる。もちろん、任意のそのような塩は、ＴＢＰの生物学的活性、すなわちＴＮＦに結合する能力を維持しなければならない。
【００９５】
本明細書で使用するところの語句「円順列（circularly permuted）」は、末端が、直接またはリンカーを介してのいずれかで互いに結合し、環状分子を形成し、この環状分子が、他の部分で開裂し、本来の分子中の末端からはことなる末端を持つ、新たな直鎖分子を産生する、直鎖分子を意味する。環状置換には、その構造が、環状化し、開裂した分子と等しい分子が含まれる。したがって、環状置換分子は、ｄｅ ｎｏｖｏで、直鎖分子として合成し、環状化および開裂段階を介さなくてよい。分子の特定の環状置換が、そのあいだのペプチド結合が消去されるアミノ酸残基を含むブラケットによって設計される。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む、環状置換分子は、一本鎖分子であり、しばしばリンカーと結合した、その通常の末端を持ち、他の部位で新規の末端を持つ。両方が本明細書で参考文献によって含まれている、ＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６５：４０７−４１３（１９８３）およびＰａｎらＧｅｎｅ １２５：１１１−１１４（１９９３）を参照のこと。環状置換は、機能的に、直鎖分子をとること、末端を融合して環状分子を形成すること、ついで環状分子を異なる部位で切断し、異なる末端を持つ、新規の直鎖分子を形成すること、と等価である。環状置換はしたがって、異なる場所にて新規の末端を形成する一方で、タンパク質のアミノ酸の配列と同一性を本質的に保存する効果を持つ。
【００９６】
可溶性レセプターを、エフェクター分子にエフェクターするための手順は、後者の化学的構造にしたがって変化し得る。好ましい実施様態において、エフェクター分子は、タンパク質であり、標的化可溶性レセプターに対するその融合（または結合）が、組換え体法によって好ましく実施され得る。２つのタンパク質をコードする遺伝子を、ｃＤＮＡとして、または当業者に公知の任意のクローニング手順によってゲノムの形態で、単離可能である。可溶性レセプターおよびエフェクタータンパク質はまた、化学的にエフェクター可能である。これは、ピアス ケミカル カンパニー（Pierce Chemical Company）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩＩから入手可能なもの（たとえば、ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）のような、二機能性リンカー分子を用いて実施可能である。
【００９７】
可溶性レセプターとエフェクター分子間のカップリング（または連結）は、直接、または連結分子および／またはたとえばアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド、スルフィジル基、ポリマーなどのような、任意の種類のリンカーであり得るスペーサーを介してであり得る。
【００９８】
リンカーは、キメラの局在化または内部化に際して、破壊され得る分子であり得る。
【００９９】
１つの実施様態において、本発明のキメラ分子は、組換え体ＤＮＡ法を用いて合成（または産生）される。一般的に、これには、キメラタンパク質をコードする、任意に原核細胞内での分泌のためのシグナルペプチドもまたコードする、ＤＮＡ配列を作製すること、このＤＮＡを特定のプロモーターの制御下で、発現カセット中に入れること、真核細胞（たとえば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３、ＴＨＰＩ、酵母細胞および昆虫細胞）、または原核細胞（たとえば大腸菌細胞）のような、組換え体培養宿主細胞内でタンパク質を発現させること、発現したタンパク質を単離すること、および必要であれば、タンパク質を再変性させること、が含まれる。
【０１００】
キメラタンパク質をコードする核酸配列は、種々の宿主細胞内で発現させ得る。細胞毒性部位を含むキメラタンパク質の場合、細胞毒性部位の細胞破壊効果に耐性の宿主細胞が選択される。
【０１０１】
いったん発現したならば、組換え体キメラタンパク質を、硫酸アンモニア沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、本技術分野で標準の手順にしたがって精製可能である。
【０１０２】
発現および精製の後、キメラは、構成ポリペプチドの天然の配座とは本質的に異なった配座を持ち得る。この場合、ポリペプチドを変性および還元し、ついで、ポリペプチドを好ましい配座に再折りたたみさせる必要があり得る。
【０１０３】
変性は、組換え体タンパク質を含む未精製物質を、カオトロピック試薬（たとえば尿素＜またはグアニジンＨＣｌ）、還元剤および高ｐＨの組み合わせに曝露することによって達成する。これらの条件によって通常、封入体内のタンパク質の可溶化および変性が起こる。結果として、タンパク質の透明な溶液が得られる。この段階で、タンパク質は、二次または三次構造を持たずに、完全に開裂する。次の段階は、ｐＨ、還元試薬およびカオトロピック試薬の極端な条件を緩やかにし、タンパク質の折りたたみを可能にすることである。タンパク質のその天然の三次構造へ折りたたまれる能力は、その一次構造によって示唆される。したがって、カオトロピックおよび還元試薬濃度を低下させること、ｐＨを下げることが通常十分である。しかしながら、ときおり、条件の適正化が必要となる。
【０１０４】
本発明は、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０５】
本発明は、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩をコードするＤＮＡまたは発現ベクターと、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０６】
組換え体キメラタンパク質、および本発明のキメラタンパク質を含む医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内のためにとりわけ有用である。非経口投与のための組成物は、一般的に、キメラタンパク質の溶液、または許容可能な担体、好ましくは水性担体内に溶解したそのカクテルを含む。種々の水性担体、たとえば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水などが使用可能である。
【０１０７】
基質は、種々の方法にて、必要としている患者に投与可能である。投与経路には、肝臓内、皮内、経皮（たとえば、徐放処方中）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮内、経口、硬膜外、局所および鼻内経路が含まれる。たとえば上皮または内皮組織を介した吸収、またはインビボにてキメラタンパク質が発現し、分泌する、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ分子を（たとえばベクターを介して）患者に投与する遺伝子治療によっての、任意の他の治療的に効果的な投与経路を使用可能である。さらに、基質を、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、希釈液および担体のような、生物学的に活性な試薬の他の成分と一緒に投与可能である。
【０１０８】
非経口（たとえば静脈内、皮内、筋肉内）投与のために、キメラタンパク質を、薬学的に許容され得る非経口担体（たとえば水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性（たとえばマンニトール）または化学安定性（たとえば保存剤および緩衝液）を維持する添加物との組み合わせで、溶液、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末として処方可能である。処方は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
【０１０９】
「薬学的に許容され得る（pharmaceutically acceptable）」の定義は、活性成分の生物学的活性の効果に干渉せず、投与される宿主に対して毒性でない、任意の担体を含むことを意味する。たとえば、非経口投与のために、基質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液のような賦形剤中で、注射のためのユニット投与形態中に処方可能である。
【０１１０】
任意に薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＴＢＰ−ＰＥのようなキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を、必要としている患者に投与することを含む、疾患を治療するために方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【０１１１】
組成物の単独または多重投与を、患者によって必要とされ、認容される用量および頻度に依存して投与し得る。これらの処方中のキメラ分子の濃度が、治療効果を得るために十分な量の分子を、体に送達するように設計される。自己免疫疾患の場合、組成物を、自己免疫疾患の経過および重傷度に影響を与えるのに十分な量のキメラを送達し、患者の状態を改善するように設計し、疾患の減退または緩和を導く。有効量は、投与経路、治療される疾患、患者の状態に依存する。
【０１１２】
本発明のキメラタンパク質の種々の使用のなかで、タンパク質の毒性活性によって削除され得る、特定のヒト細胞によって引き起こされる疾患または状態のような、疾患の治療のための医薬品の製造においての使用がある。１つのアプローチは、敗血性ショック、移植片−対−宿主疾患（ＧＶＨＤ）、マラリア、感染性肝炎、結核のような急性疾患、ならびに、慢性ＧＶＨＤ、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患および乾癬のような慢性疾患を含む、ＴＮＦが病原的役割を果たすか、疾患の経過に関与する疾患の治療である。他のアプローチは、キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している悪性細胞によって引き起こされる、癌の治療のためのものである。キメラタンパク質をまた、インビトロまたはインビボで、たとえば、自己移植前に骨髄からまたは自己末梢血細胞からの、有害な細胞の除去のために、使用してよい。
【０１１３】
本発明が、その特定の実施様態に関して記述されているが、さらなる改変の可能性があることが理解される。本明細書は、一般的に本発明の原理にしたがって、付随する請求項の目的内にしたがって、本発明が属する技術分野内での公知または一般的な実施内にあり、本明細書以上で列記された必須の特徴に適用可能であるように、本開示物からの逸脱を含んで、本発明の任意のバリエーション、使用または適合をカバーする意図がある。
【０１１４】
雑誌記事または要約、公示されたまたは公示されていない米国または外国特許明細書、付与された米国または外国特許、または他の任意の参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献が、引用された参考文献内で示されたすべてのデータ、表、図および文書を含んで、本明細書で参考文献によってすべてが組み込まれている。さらに、本明細書でで引用された参考文献内にて引用された参考文献のすべての内容もまた、参考文献によってすべてが組み込まれている。
【０１１５】
公知の方法段階、従来の方法段階、公知の方法または従来の方法に対する参照は、本発明の任意に観点、記述または実施様態が、関連技術分野で開示、教授または指摘された許可ではない。
【０１１６】
特定の実施様態の以上の記述によって、（本明細書で引用した参考文献の内容を含む）本技術分野内の知識を適用することによって、本発明の一般的なコンセプトから逸脱することなしに、不必要な実験なしに、種々の適用に対して、そのような特定の実施様態を簡単に改変および／または適合可能である、本発明の一般的な特徴を完全に明らかにする。したがって、そのような適合および改変が、本明細書で示された教義およびガイダンスに依存して、開示された実施様態の等価物の範囲の意味の範囲内であることが意図される。本明細書の用語または語法が、記述の目的であり、制限の目的ではなく、本明細書の語法および語句が、当業者の知識と組み合わせで、本明細書で示された教義およびガイダンスに関して、当業者によって解釈されることが理解されるべきである。
【０１１７】
本発明はここで、以下の非限定実施例および付随する図面にて、より詳細に記述される。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分（ＴＢＰＩ）、およびシュードモナスエクソトキシンのドメインＩＩ、ＩｂおよびＩＩＩを含む、シュードモナスエクソトキシン４０ｋＤａ断片を含む、キメラ遺伝子（本明細書でＴＢＰ−ＰＥと呼ぶ）の構築
図１Ａにて略図的に示したように、キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子（図１Ｃ、配列番号：１）を調製するために、ＴＢＰ（ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分）およびシュードモナスエクソトキシンのドメインＩＩ、ＩｂおよびＩＩＩを含む、ＰＥ（シュードモナスエクソトキシンの４０ｋＤａ断片）をコードする各ＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって増幅し、融合させた。
【０１１９】
ｐ５５ ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｍ７５８６６）の可溶性形態のアミノ酸配列は、ヒト尿から単離されたこのレセプターの可溶性形態（ＴＢＰＩ）の主要な種類のもの（米国特許第５，８１１，２６１号）に相当し、レセプターの細胞外ドメイン中Ａｓｐ４１〜Ａｓｎ２０１まで伸びる（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ−受け入れ番号：Ｐ１９４３８）。
【０１２０】
ＴＢＰＩを、全長ＴＮＦＲＩ（プラスミドｐｃ５５）を鋳型として（Ｎｏｐｈａｒら、１９９０にて記述された、プラスミドｐｃ５５）そして以下のプライマーを使用して、（べーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）からのＨｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑポリメラーゼでの）ＰＣＲ（１）増幅によって単離した。
【０１２１】
このプライマーは、ＮｄｅＩ制限部位（発現ベクター内にキメラ遺伝子を挿入するために、後に必要である）、続いてＴＢＰＩの５’末端と重なる２０ヌクレオチドを持つ（コード配列をイタリック体で示す）。
【０１２２】
このプライマーは、ＴＢＰＩの通常３’末端と重なる２２ヌクレオチドと、続いてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードするヌクレオチド（ＴＢＰＩをコードするＤＮＡを、ＰＥをコードするＤＮＡにライゲーションするために後に必要である）を持つ。
【０１２３】
シュードモナス アエルギノーサ（Pseudomonas aeroginosa）エクソトキシンＡ型遺伝子（受け入れ番号Ｋ０１３９７、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）のヌクレオチド１５７７−２６５９に相当するＰＥをコードするＤＮＡ（図１Ｅ、配列番号：３）を、シュードモナス アエルギノーサのセロタイプ６１のゲノムＤＮＡ（Leitner G.Kimron Veterinary Institute,Israel）を鋳型として、そして以下のプライマーを使用して（べーリンガーマンハイムからのＨｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑポリメラーゼでの）ＰＣＲ２増幅によって単離した。
【０１２４】
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（イタリック体）を含み、６アミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕのリンカー、およびＰＥトランスロケートドメインのヌクレオチド１５７７−１６０３（太字）をコードする。
【０１２５】
ＥｃｏＲＩ制限部位（イタリック体）、終止コドン（ｔｔａ）およびＰＥ ＡＤＰ−リボシル化ドメインのヌクレオチド２６５９−２６７９（太字）を含む。
【０１２６】
１０５８ｂｐのＰＣＲ２産物が得られた。
【０１２７】
キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子を得るために、ＰＥを含むＰＣＲ２断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を介して、ＴＢＰＩを含むＰＣＲ１断片の３’−末端にライゲートした。キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位で、ｐＥＴ５−ベクター内に挿入した。本明細書でｐＴＢＰ−ＰＥと呼ぶ、キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子をコードするベクターを、大腸菌株（ＤＨ５α）内に形質導入し、増幅した。
【０１２８】
実施例２：細菌細胞内でのＴＢＰ−ＰＥの産生
ＴＢＰ−ＰＥベクター（ｐＴＢＰ−ＰＥ）を含む、細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓを、０．４％グルコース、１．６８ｍＭ ＭｇＳＯ4および１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む１リットルのＳｕｐｅｒブロス中で、３７℃にて培養した。６００ｎｍでの吸収が、２．６にｎ達したときに、組換え体タンパク質発現の誘導を、培養液に、最終濃度１ｍＭで、ＩＰＴＧ（イソプロピル ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）を、約９０分間添加することによって実施した。細菌細胞を、４℃にて１０分間、７５００×ｇにて遠心することによって、培養液から回収し、細胞ペレットを、−７０℃にて１６時間凍結した。
【０１２９】
凍結した細胞ペレットを、氷上で溶かし、２２０ｍｌの緩衝液Ａ［カルシウムおよびマグネシウムなしのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳｗ／ｏ）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＳＯ4、完全プロテアーゼカクテルの４錠（ロッシュ（Roche）、３０ｍｇ／ｌ ＤＮａｓｅＩ（シグマ（Sigma））中に再懸濁させた。
【０１３０】
細胞クランプを絶縁するために、細菌懸濁液を、椎間板１８Ｇニードルを介して通した。細菌溶解物および封入体単離を、以下の方法のいずれかによって実施した。
【０１３１】
方法Ｉ：５０００ｐｓｉで、ついで１５０００ｐｓｉにて２回、最初のＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ３×３５ｍｌの細胞。ついで溶解した細胞を、ＳＳ−３４ローターを用いて、Ｓｏｒｖａｌ遠心上、１５，０００ｒｐｍにて、４℃５０分（２７，０００×ｇ）で遠心した。ペレットを、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１６０ｍｌの「ＰＢＳ ｗ／ｏ」中に懸濁し、２２ｍｌの２０％ トリトンを添加し、室温にて５〜１０分間インキュベートした。封入体を、２７，０００×ｇにて４℃５０分間の遠心によって沈殿させた。トリトンでの封入体の洗浄を２回繰り返し、トリトンなしで、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１６０ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄した。
【０１３２】
方法ＩＩ：８１ｍｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／２０ｍｌ ＰＢＳ（２０ｍｌのＰＢＳ中Ｌｙｓｏｚｙｍｅの４０５％溶液）を、１１０ｍｌの細菌細胞に添加した。細胞を３０分間室温にて攪拌し、氷に移し、１分間３回超音波処理した。１６ｍｌの２０％トリトン（３％最終濃度）を添加し、封入体を単離し、方法Ｉでのように洗浄した。
【０１３３】
（ＳＤＳＰＡＧＥおよびＡＤＰリボシラーゼ活性によって判断した、それぞれ図２および３）ほとんどの組換え体タンパク質を含む封入体を、５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む、８Ｍ 尿素、ｐＨ１２〜１２．８を含む変性溶液中に溶解した。使用した変性溶液の容量は、封入体湿重量の４４３倍と等しかった。封入体の完全な溶解を促進するために、激しくボルテックスして、超音波処理した。
【０１３４】
タンパク質を、ｐＨ９．５での５０ｍＭホウ酸緩衝液で、約１０〜２０倍希釈し、緩やかに攪拌しながら（２００ｒｐｍ）、４℃にて１８〜２０時間インキュベートすることによって再変性させた。
【０１３５】
２．５リットルの再折りたたみタンパク質を、超濾紙ＰＭ３０（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を介した超遠心によって１５倍に濃縮し、濃縮したタンパク質の最終濃度は、約１７０ｍｌであった。再折りたたみ未精製タンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬で推定し、約７０μｇ／ｍｌであった。ＴＢＰ−ＰＥキメラタンパク質は、（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質バンドのデンシトメトリーより）再折りたたみ未精製タンパク質の約６０％であると推定された。したがって、１リットルの細菌培養液から、約７．６５ｍｇのＴＢＰ−ＰＥキメラが得られ、または５００ｍｇ封入体から、３％の再折りたたみ未精製タンパク質がえられ、そのうち６０％が、ＴＢＰ−ＰＥキメラであった。
【０１３６】
図２Ａは、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質が、アミノ酸配列から推測される、約５７ｋＤａの正確な大きさをもったことを示している。
【０１３７】
実施例３：ＴＢＰ−ＰＥキメラのアフィニティー精製
ＴＢＰ−ＰＥキメラを、抗ＴＢＰ−１架橋カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって、実施例２のＴＢＰ−ＰＥを含む再折りたたみ未精製抽出物から精製した。
【０１３８】
抗ＴＢＰ−Ｉ架橋カラムを調製するために、２ｍｌｓ．のタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（またはウサギ抗体のためにタンパク質Ａ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を、５０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．５〜８．０）で３回洗浄した。２０ｍｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．５−８．０中の６ｍｇのモノクローナル抗−ＴＢＰＩ抗体クローン２０．１１（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２５６（２４）１４４９７−５０４ １９９０）（４００μｌのストック １６．７ｍｇ／ｍｌ）を、洗浄したタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加し、約２２℃にて１．５時間攪拌しながらインキュベートし、１０容量の０．２Ｍ ホウ酸緩衝液（ＮａＯＨにてｐＨ９．０）で２回洗浄した。４ｍｌホウ酸緩衝液中の１００μｇ架橋剤（ＤＭＰ、ＰＩＥＲＣＥ）（抗体に対して、架橋剤が、３０倍モル過剰）を、Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅと抗体溶液に添加し、３０分間インキュベートした。２０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を、反応を停止するために添加し、溶液を捨てた。２０ｍｌの同様の緩衝液を１５分間添加し、溶液を捨て、２０ｍｌの同一の緩衝液を１５分間、氷上で添加した。Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５中の１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、ついで、ｐＨ２．０で緩衝液で洗浄し、タンパク質Ｇに共有的に結合しなかった、抗体を除去した。
【０１３９】
ｐＨ８．８での１０ｍＭ Ｔｒｉｓの溶液を使用して、ＴＢＰ−ＰＥの精製のためのカラムを保存した。
【０１４０】
実施例２からのホウ酸緩衝液中の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥを、アフィニティークロマトグラフィーカラムにのせ、カラムを１０倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。タンパク質を、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５中の１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。０．５〜１ｍｌの画分を回収し、光学密度を、２８０ｎｍで測定した。図２Ｂは、抗ＴＢＰＩモノクローナル抗体で検出した、溶出画分からの（２０ｕｌμｌ）試料のウェスタンブロット解析を示している。図２Ｂで要約した結果は、ＴＢＰＩのアミノ酸配列から予想されたＭＷは１７ｋＤａであるが、ＴＢＰＩの見かけのＭＷは、この真核細胞（ＣＨＯ）中で産生されたＴＢＰ−Ｉ標準のグリコシル化によって、より高く、約３４ｋＤａであったことを示している（図２Ｂ、ライン８）。抗ＴＢＰＩ抗体が、アフィニティークロマトグラフィーカラムに対して、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質を認識し、結合すること、およびＴＢＰ−ＰＥの実際の分子量が約５７ｋＤａであることが示された（図２Ｂ、ライン１〜７）。
【０１４１】
実施例４：インビトロでの、ＴＢＰ−ＰＥタンパク質のＡＤＰ−リボシル化活性
実施例を実施することにおいて、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＢＰＩ抗体によって認識されることが示された。以下の実験は、ＴＢＰ−ＰＥが、伸張因子ＩＩ（ＥＦ−２）をＡＤＰ−リボシル化可能であるかどうかを評価するために実施した。シュードモナスエクソトキシンの毒性は、タンパク質合成を阻害するエクソトキシンの能力による。エクソトキシンは、ＮＡＤ+が存在する条件で、アミノ酸のタンパク質内への取り込みをすばやく阻害する。シュードモナスエクソトキシンの存在において、ＮＡＤ+の二リン酸アデノシンリボース部位が、伸張因子ＩＩ（ＥＦ−２）との共有結合内に移され、因子の不活性誘導体が産生される。毒素は、この反応において触媒的に働く。
【０１４２】
ＮＡＤ+＋ＥＦ−２→ＡＤＰ−リボース−ＥＦ−２＋ニコチンアミド＋Ｈ+（Collier R.J.ら.1971）
ＴＢＰ−ＰＥキメラのＡＤＰ−リボシル化活性を調査するために、再折りたたみキメラ、または封入体の分離前後の未精製大腸菌溶解物を含む試料を、２００μｌのＴＥ−５０（Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ、ｐＨ８）および２０μｌの小麦麦芽からのＥＦ−２（シグマ）を含む溶液中でインキュベートした。ついで１０μｌのＮＡＤ+−14Ｃを添加し、反応混合液を短くボルテックスし、３７℃にて２０分間インキュベートして、すべてのＮＡＤ+−14Ｃを、ＴＢＰ−ＰＥによって誘導されたＥＦ−２に組み込ませた。２０分のインキュベーションに続いて、タンパク質を、０．５ｍｌの１０％ＴＣＡの添加（ボルテックス）と遠心（４℃にて５分間、３０００ｒｐｍ）によって沈殿させた。上清を捨てたのち、ペレットを１ｍｌの１０％ＴＣＡで洗浄し、１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨを１０分間添加し、頻繁に混合し（ボルテックス）、ペレットを溶解させた。１０分後、０．４ｍｌの０．４Ｍ酢酸を添加し、混合した。放射活性ラベルのタンパク質内への組み込みを、ガンマ計数器中で、４ｍｌのシンチレーション溶液中で測定した。
【０１４３】
図３で示したように、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化が、１０μｌの（可溶性タンパク質および封入体を含む）未精製組換え体大腸菌溶解物タンパク質によって誘導され、約半分の活性が、２倍の同様の未精製溶解物を用いて観察された。非常に低いＡＤＰ−リボシル化活性が、可溶性タンパク質画分（Ｆｒｅｎｃｈプレスの後に得た上清）にて観察可能であった。この結果は、ほとんどのキメラタンパク質が、封入体内に存在することを確認した。
【０１４４】
図３で要約した、得られた結果は、（実施例２の変性封入体からの）再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質が、ＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性を有することを示している。折りたたみタンパク質のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性のレベルが、（可溶性タンパク質および封入体両方を含む）未精製溶解物のものと同等であった。しかしながら、未精製溶解物のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性とは反対に、再折りたたみタンパク質のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性が、反応中で使用した再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量とともに増加した。
【０１４５】
実施例５：酵素結合免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）による再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの定量と、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥのＴＮＦに対する結合活性
未精製ＴＢＰ−ＰＥの濃度をまず、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬で推定し、約７０μｇ／ｍｌであるとわかり（実施例２を参照のこと）、ついでウェスタンブロットのデンシトメトリー解析（図２Ａ）によって、約４５μｇ／ｍｌであるとわかった。
【０１４６】
ＴＢＰ−ＰＥの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。この目的のために、ＰＶＣマイクロタイタープレートを、５０μｌのモノクローナル抗−ＴＢＰＩ抗体（ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）クローン２０でコートした（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２６５（２４）１４４９７−５０４ １９９０）。３７℃にて２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳにて三回洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにて、３７℃にて２時間ブロックした。ＴＢＰＩの試料（組換え体ＣＨＯ細胞から調整、要確認）、またはＴＢＰ１−ＰＥの試料を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１％ヘモグロビン、０．６５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％ ＮＰ４０を含むＰＢＳ中で連続希釈した。５０μｌの希釈試料をウェルあたりに、三重で適用し、３７℃にて１時間インキュベートし、ブロット（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄した。１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ＴＢＰＩ抗体を、３７℃にて１時間、または４℃にて一晩、ブロット中に適用し、同様の溶液で５回洗浄した。１：２０００希釈した二次抗体、抗−ウサギ−ＨＲＰを、３７℃にて１時間ウェルに適用し、ウェルをブロットにて５回洗浄した。０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含む、１００μｌの新鮮に調製したＡＢＴＳ溶液（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸、シグマ、カタログＡ−１８８８）をウェルに添加し、３７℃にて３０分間インキュベートし、発達した緑色の密度を４０５ｎｍで測定した。
【０１４７】
得られ、図４Ａで要約した結果が、ＥＬＩＳＡによって７５μｇ／ｍｌとわかったＴＢＰ−ＰＥの濃度が、Ｂｒａｄｆｏｒｄによってわかった、約４５μｇ／ｍｌの濃度と近かったこと、および再折りたたみＴＢＰ−ＰＥおよびＴＢＰＩが、同様の効果で、抗−ＴＢＰＩ抗体によって認識されたこと、を示している。
【０１４８】
以下の実験で、ＴＢＰＩおよびＴＢＰＩ−ＰＥのＴＮＦコートプレートへの結合を比較した。ＰＶＣ９６−ウェルマイクロタイタープレートを、４℃にて１６時間、０．０２％ ＮａＮ3を含む０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ９．６中の、２μｇ／ｍｌの純粋なヒトＴＮＦ−α（ベイト−ハエメック（Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ）の溶液で、プレートをインキュベーションすることによって、ＴＮＦでコートした。ついでプレートをＰＢＳでリンスし、０．２ｍｌ／ウェルの、３％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3（ブロッキング溶液）を含むＰＢＳで、３７℃にて３時間インキュベートした。５０μｌの再折りたたみＴＢＰ−ＰＥ（４５μｇ／ｍｌ）またはヒトＴＢＰＩ（７６μｇ／ｍｌ）の試料を、三重に、ウェルあたり適用し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。必要な場合に、試料を、ブロッキング溶液で希釈した。１時間のインキュベーションの後、プレートをブロッキング溶液で３回洗浄した。ブロッキング溶液中１：１０００で希釈した、５０μｌのウサギ抗−ＴＢＰＩ抗体をウェルに添加し、１時間３７℃、または４℃にて一晩、インキュベートし、ブロッキング溶液で３回洗浄した。１：２０，０００希釈での、５０μｌの二次抗体、抗−ウサギ−ＨＲＰをウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートし、ブロッキング溶液で３回洗浄した。０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含む１００μｌの新鮮に調製した溶液ＡＢＴＳを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。ＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩの、プレートに対する結合を、その強度を４０５ｎｍにて測定した、緑色の発現によって測定した。
【０１４９】
図５Ａ〜Ｂにて要約したＴＮＦ−結合アッセイの結果が、２０ｎｇの未精製再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、５ｎｇのＴＢＰＩとほぼ同様の活性であることを示している（図５Ａ）。図５Ｂは、ＴＮＦ結合活性を持っている、未精製再折りたたみキメラタンパク質の割合を示している。ＴＢＰＩの活性を１００％ＴＮＦ結合として使用すると、少なくとも５０％の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＮＦ結合活性を持つことがわかった。
【０１５０】
実施例６：その表面上にＴＮＦを過剰発現している細胞株
２つの細胞株を、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果を探索するために使用した。（ａ）（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅから得た）ヒト急性単球性白血病ＴＨＰＩ細胞。これらの細胞の単球性分化を、ホルボールミリスチル酸酢酸（ＰＭＡ）で誘導可能である。これらの細胞を、１０％Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸、１％ 非必須アミノ酸、９ｍｇ／ｍｌ インスリン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含む、ＲＰＭＩ１６４０培養中、０．３〜１×１０6／ｍｌの細胞密度範囲で培養する。細胞表面ＴＮＦ発現を促進するために、（１６〜２０時間、１００ｎｇ／ｍｌ）ＰＭＡにて活性化したこれらの細胞を、ＬＰＳ（１ｍｋｇ／ｍｌ、１．５時間）で処理し、１０μｇ／ｍｌ メタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））で、試験の前に２時間処理した。
【０１５１】
ｂ）ＨｅＬａ−Ｍ９細胞、位置＋２でのアルギニンおよび位置＋３でのセリンが、スレオニンに置換されているヒトＴＮＦムテインｃＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、構成的に発現する、上皮ＨｅＬａ子宮頸癌のクローン。これらの変異によって、２６ｋＤａ ＴＮＦの開裂速度が、約１０倍減少する。細胞を、１０％ Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１５２】
ＴＨＰＩ細胞の細胞表面上のＴＮＦ−発現を、ＴＮＦ−αの削減を防止するために、メタロプロテアーゼＧＭ６００１の阻害剤、１０ｍｇ／ｍｌ（カルビオケム）の存在下で、ＦＡＣＳによって査定した。５×１０5細胞の試料を、インスリン、１ｍｋｇ／ｍｌ、トランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌ、Ｎａセレン、１ｎｇ／ｍｌ、Ｎａピルビン酸、非必須アミノ酸、グルタミン、ＰＭＡ５０〜１００ｎｇ／ｍｌを含むＦｃｓを含まないＲＰＭＩ中で１６時間インキュベートした。ついで、ＬＰＳ大腸菌０１１１−Ｂ４を濃度１ｍｇ／ｍｌでＧＭ６００１、１０ｍｇ／ｍｌと一緒に、２時間添加した。細胞表面上でのＴＮＦ−発現のＦＡＣＳ解析のために、細胞を、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含む、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中にて４℃で洗浄し、ＦＩＴＣ−抗−ヒトＴＮＦ抗体とインキュベートした。解析は、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン．ディッキントン（Ｂｅｃｔｏｎ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって実施した。少なくとも３０％の細胞が、その表面上にＴＮＦ−αを発現することがわかった。
【０１５３】
実施例７：ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性
キメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥ（および対照として、可溶性ＴＮＦレセプターのみ）の細胞毒性活性を、両方が膜結合ＴＮＦを過剰発現している、２つの種類の細胞、上皮細胞および単球様細胞で試験した。
【０１５４】
ＨｅＬａ−Ｍ９細胞は、位置＋２でのアルギニンおよび位置＋３でのセリンが、スレオニンに置換されているヒトＴＮＦムテインｃＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、構成的に発現する、上皮ＨｅＬａ子宮頸癌のクローン株である。これらの変異導入によって、２６ｋＤａ表面ＴＮＦの開裂速度が、約１０倍減少する。細胞を、１０％ Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１５５】
ＨｅＬａ−Ｍ９、またはＨｅＬａを、ウェルあたり４×１０4細胞の密度にて、９６−ウェルプレート中にまいた。異なる濃度のＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩを、３時間ウェルに添加した。いくつかのウェルに、ＴＢＰＩを、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に適用して、ＴＮＦと競合させ、膜ＴＮＦ−αを介したＴＢＰ−ＰＥ活性の特異性を試験した。３時間のインキュベーションの後、培地を、組換え体タンパク質なしの培地のみで置換し、細胞を２４時間増殖させ、培養液の生存を、ニュートラルレッドを用いて査定した。
【０１５６】
得られた結果を図６Ａにて要約しており、６００ｎｇ／ｍｌのＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａ細胞に対して細胞毒性ではないが、その表面にＴＮＦ−αを過剰発現しているＨｅＬａ−Ｍ９細胞の死亡を引き起こしたことを示している。ＴＢＰＩは、１０倍過剰で適用したときに、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果を特異的にブロックした。ＴＢＰＩのみでは、７６μｇ／ｍｌまでの濃度で、細胞変性効果を引き起こさなかった。ＴＢＰ−ＰＥの２つの異なるバッチを試験し、同様の細胞毒性であることがわかった。図６Ａで示した結果が、ＴＢＰ−ＰＥが、６００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＨｅＬａＭ９細胞にて、９０％を超える細胞死を引き起こしたことを示している。ＴＢＰ−ＰＥの１つのバッチが、非常に活性であり、０．０６ｍｇ／ｍｌの低濃度で、細胞毒性であり、およそ６５％近くのＨｅＬａＭ９細胞を殺した。
【０１５７】
活性化単球様細胞株におけるキメラＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性を調査するために、ＴＨＰＩ（実施例６を参照のこと）を、（単球様表現系およびＬＰＳレセプターの曝露を誘導するために）インスリン、１ｍｋｇ／ｍｌ、トランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌ、Ｎａセレン、１ｎｇ／ｍｌ、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸、グルタミン、ＰＭＡ５０〜１００ｍｇ／ｍｌを含む、ウシ胎児血清（Ｆｃｓ）を含まないＲＰＭＩ中、９６−ウェルプレート中、ウェルあたり２００，０００細胞の密度で、１６時間まいた。ついで、大腸菌ＬＰＳ（０１１１−Ｂ４）を濃度１ｍｇ／ｍｌで、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でのＧＭ６００１（細胞表面からのＴＮＦの削除を予防するためのメタロプロテイナーゼ阻害剤）と一緒に、１〜１．５時間添加した。得られたＰＭＡ−ＬＰＳ−ＧＭ６００１−処理ＴＨＰＩ細胞が、多量の表面ＴＮＦを持つ単球細胞の表現系特性を示している。これらの単球様細胞株を、約２０時間、６０および６００ｎｇ／ｍｌの再折りたたみＴＢＰ−ＰＥとインキュベートし、生存を見積もるために、ナチュラルレッドで染色した．示唆した時点で、組換え体ヒトＴＢＰ−１を、細胞表面ＴＮＦへの結合に関して競合するように、再折りたたみキメラタンパク質の直前に添加した。
【０１５８】
図６Ｂにて要約した結果で示したように、ＨｅＬａＭ９細胞の細胞毒性を引き起こしている濃度（６０および６００ｎｇ／ｍｌ）で使用した、ＴＢＰ−ＰＥが、活性化ＴＨＰＩの細胞死を引き起こさなかったことがわかった。
【０１５９】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの活性を、ＬＰＳ−活性化初代マクロファージ中でも試験した。初代マクロファージの調製のために、メスマウスＣ５７ＢＬ／６を、４日間、１．５ｍｌ無菌Ｂｒｅｗｅｒチオグリコレートブロス（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））とともに、腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。腹腔浸出物（＞８５％マクロファージ）を４日目に回収し、遠心によって、ＰＢＳにて洗浄し、１０％熱不活性化Ｆｃｓを含むＲＰＭＩ中、１×１００，０００マクロファージ／ウェルにて、９６−ウェル平底プレート中にまいた。細胞を１８時間接着させた。非接着細胞を、暖かい培地で洗浄して除去した。
【０１６０】
マクロファージ活性化を誘導するために、マクロファージ単層を、図６Ｃにて示した濃度（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）にて１時間、５ｍｇ／ｍｌ ＧＭ６００１（カルビオケム）の存在下で、ＬＰＳ（大腸菌ＬＰＳ０１１：Ｂ４）で処理した。ＬＰＳ処理の後、細胞を、６０００および１５０００ｎｇ／ｍｌ再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの存在下、または存在しない状態で、２時間以上インキュベートした。次に、培地を、同様の濃度のＬＰＳを含むが、ＧＭ６００１を含まない、ＲＰＭＩ＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＦｃｓ）で置換し、ＴＮＦ−αの細胞培養培地への分泌を可能にさせた。一晩培養したマクロファージの細胞培養培地を回収して、培地中のＴＮＦ−αをバイオアッセイによって測定した（以下および図６Ｄを参照のこと）。
【０１６１】
得られ、図６Ｃで要約した結果は、ＴＢＰ−ＰＥが、活性化初代マクロファージに対して細胞毒性ではなかったことを示している。
【０１６２】
ＴＢＰ−ＰＥで処理した、または未処理のＬＰＳ−活性化初代マクロファージの増殖培地中に分泌されたＴＮＦのレベルを査定した（図６Ｄ）。活性初代マクロファージの培地を回収し、新鮮な培地で、２、４および８倍（それぞれ０．５、０．２５、０．１２５）希釈し、（９６−ウェルプレート上）ウェルあたり、１×１０5細胞の密度でまいた、ＴＮＦ感受性細胞（Ｌ９２９）の単層に適用した。バイオアッセイを、１０ｍｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下で実施した。Ｌ９２９細胞（マウス結合組織クローンＬ９２９ ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を、活性化マクロファージの条件培地でインキュベートし、２０時間インキュベートした。Ｌ９２９細胞毒性のレベルが、条件培地中に存在するＴＮＦの濃度に比例した。
【０１６３】
図６Ｄで見られるように、チオグリコレート−処理マウスからのマクロファージが、ＴＮＦ−αを産生した。たとえば、チオグリコレート処理腹腔マクロファージの２または４倍希釈培地が、４０％を超えるＴＮＦ−感受性Ｌ９２９細胞の死を引き起こした。しかしながら、ＬＰＳによるさらなるマクロファージ活性化が、ＴＮＦ分泌を増加させた。たとえば、Ｌ９２９細胞死は、ＬＰＳ活性化マクロファージの細胞を高い（８倍）希釈条件培地に曝露したときに、６０％より高かった（図６Ｄ）。ＴＢＰ−ＰＥで処理した活性化初代マクロファージの条件培地が、ＴＢＰ−ＰＥ処理なしでの活性化マクロファージの条件培地と、Ｌ９２９に対して等しい毒性であることがわかった（図６Ｄ）。この結果によって、ＴＢＰ−ＰＥが、初代活性化マクロファージ中のＴＮＦ分泌を阻害しないことが示される。
【０１６４】
これらの結果は、ＴＢＰ−ＰＥが、活性化初代マクロファージの死を引き起こさず、ＬＰＳ活性化初代マクロファージにおけるＴＮＦ分泌を阻害しないことを示している。
【０１６５】
すべてにおいて、得られた結果が、ＴＢＰ−ＰＥが、治療的目的のために使用可能であり、とりわけ、ＴＮＦを過剰発現している上皮細胞を特異的に殺すことを示している。
【０１６６】
実施例８：ＴＢＰ−ＰＥによって仲介された、ＨｅＬａ Ｍ９細胞中でのタンパク質合成の阻害
ＨｅＬａ−Ｍ９およびＨｅＬａ細胞を、ウェルあたり、４×１０4の密度にて、９６−ウェル組織培養液プレート中に、アッセイの１日前にまいた。６００ｎｇ／ｍｌの濃度でのＴＢＰ−ＰＥを、３時間細胞に添加した。いくつかのウェルで、ＴＢＰＩを、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に適用して、ＴＮＦ結合に関して競合させた。３時間のインキュベーションの後、培地をＤＭＥＭ＋１０％Ｆｃｓで置換し、細胞を、１６時間さらに増殖させた。細胞をＰＢＳにて１回洗浄し、Ｍｅｔ、Ｃｉｓ−を含まないＲＰＭＩ中で１０分間、そして、１００ｍｌの３５Ｓ−Ｍｅｔ−含有、Ｍｅｔ、Ｃｉｓ−を含まないＲＰＭＩ（５５ｍｃＣｉ／１００μｌの35Ｓ−Ｍｅｔ）中で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション後、培地を除去し、細胞をＭｅｔ、Ｃｉｓ−を含まないＲＰＭＩにて３回洗浄し、２００μｌ ＳＤＳ−緩衝液［ＰＢＳ中１％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＥＤＴＡ］中で溶解し、１００℃まで前加熱した。細胞溶解物をマイクロチューブに移し、５分間ゆで、５分間遠心した。上清（約１００μｌ容量）中のタンパク質を、ＴＣＡ沈殿にかけた。
【０１６７】
ＴＣＡ沈殿のために、０．５ｍｌ １０％の氷冷ＴＣＡおよび２０μｌの３％ ＢＳＡを、上清を含む試料に添加した。試料を１５分間、氷上で沈殿させ、５分間、４℃、３０００ｒｐｍにて遠心した。ＴＣＡ沈殿物を、１ｍｌ ＴＣＡおよび１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、１０分間インキュベートし、ボルテックスした。ペレットを完全に溶解させるために、０．４ｍｌの０．４Ｍの酢酸を溶液に添加し、激しく混合した。放射活性を、４ｍｌシンチレーション溶液中で測定し、ベータ−計数器中でモニタした。
【０１６８】
図７で示したように、６００ｎｇ／ｍｌほどのＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞中の約７０％のタンパク質合成を阻害するが、一方で、同量のＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａ細胞内のタンパク質の合成を減じなかった。ＴＢＰＩが、ＴＢＰＩをＴＢＰ−ＰＥと一緒に１０倍過剰で添加した時に、タンパク質合成において、ＴＢＰ−ＰＥの阻害効果を阻害することがわかった。ＴＢＰＩのみは、ＨｅＬａ−Ｍ９中またはＨｅＬａ細胞中いずれでもタンパク質の合成に影響を与えなかった。
【０１６９】
実施例９：内部化アッセイ
ＴＮＦ−α発現細胞（ＨｅＬａ Ｍ９または他）を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む培地中で、３７℃にて、［125Ｉ］−共役物（１μｇ／ｍｌ）で標識化した。ついで細胞をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％プロナーゼ中で再懸濁し、ジブチルフタレートを介する遠心の前に２Ｃにて４０分間維持した。エンドサイトーシス効率を、取り込み３０分後の、細胞関連［125Ｉ］−共役物のプロナーゼ−耐性割合として表す（Taupiac M-P.ら, 1999から変性された）。
【０１７０】
実施例１０：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
遠心によって回収した細胞ペレットを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶解させた。試料を、０．１％ＳＤＳ、１０％アクリルアミドスラブゲルに適用する前に５分間沸騰させた。ゲルをクーマシーブルーによって、または銀染色によって染色可能である。
【０１７１】
免疫ブロッティングのために、電気泳動後の試料を、ニトロセルロース紙にうつし、続いて、毒素に対する、またはＴＮＦレセプターの可溶性形態に対する抗体と反応させ、ついで（毒素−ヤギ抗−ウサギ抗体のため、可溶性ＴＮＦレセプター−ヤギ抗マウス抗体のため）ＨＲＰに連結した二次抗体を適用し、染色を、ＨＲＰ基質で実施した。可溶性ＴＮＦレセプターに対するモノクローナル抗体は記述したようである［１５］［１６］。
【０１７２】
実施例１１：動物毒性
６ヵ月齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．１μｇ／マウス〜４０μｇ／マウスの範囲で、種々の用量のキメラタンパク質（および、対照として、キメラタンパク質に組み込まれた毒素および可溶性ＴＮＦレセプター）を腹腔内に注射した。マウスの生存を、４８時間以降査定した。
【０１７３】
実施例１２：インビボでの、それらの表面上でＴＮＦを発現している腫瘍細胞に対するキメラタンパク質の活性
キメラタンパク質の、（そして対照として、キメラタンパク質に組み込まれた毒素の、および可溶性ＴＮＦレセプターの）インビボ細胞殺傷活性を、細胞結合ＴＮＦを産生する腫瘍を持つマウス中で査定した。ＨｅＬａ−Ｍ９細胞のコンフルエント培養を、ＰＢＳ中５ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、懸濁して、ＰＢＳにて２回洗浄した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（７〜８週齢、２０〜２１ｇ体重）に、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞（１×１０7細胞／０．１ｍｌ／マウス）で、フランク領域内で、皮下に移植した。５日後、マウスに、種々の用量の試験したキメラタンパク質を腹腔内に注射し、ついで、毎週１回再び注射した。細胞の移植部位での発生、大きさおよび質量を１１週後に査定した。
【０１７４】
実施例１３：関節炎の突発性発達に関するマウスモデルにおける、キメラタンパク質の治療活性
その発現の翻訳調節を提供する、３’非コード領域が、β−グロブリン遺伝子のものとともに発現した［１７］、ヒトＴＮＦトランスジーンを発現しているトランスジェニックマウスを使用した。生誕の２週間後、マウスに、種々の用量の試験したキメラタンパク質を腹腔内に注射し（以下を、対照としてマウスに注射するために使用する。毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみ）、ついで、９週間の間隔で、１週間に１回、再び注射した。マウスの後ろ足首関節の腫れを、関節の直径を決定することによって、定期的に査定する。関節構造に関連する損傷／変化：関節鞘、関節空間、滑膜、関節軟骨および軟骨下骨を組織学的に評価した。
【０１７５】
実施例１４：抗原−誘導関節に関するマウスモデルにおける、キメラタンパク質の治療活性
Ｌｅｗｉｓラットを、完全フロイドアジュバント中の０．５ｍｇ メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）で、後ろ脇腹中で免疫した。２１日後（０日）、動物に、ピローゲンを含まない生理食塩水中の５０μｇ ｍＢＳＡを、両後ろ膝関節中に注射した。ラットに、その日、および続く２日間（０、１および２日）、両膝関節中に、試験タンパク質を関節内に注射した（対照として、毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみを注射した）。膝関節幅を、治療に相対して、０〜６日で毎日測定する。６日目に回収した関節の組織病理学実験を実施した。関節構造に関連する損傷／変化：関節鞘、関節空間、滑膜、関節軟骨および軟骨下骨を組織学的に評価した。
【０１７６】
実施例１５：抗原−誘導関節に対するマウスモデルにおけるキメラタンパク質の治療活性
オスＤＢＡ／１マウス（８〜１２週齢）を、尾の根本での皮内注射によって、ＦＣＡ内（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で乳化させたＩＩ型コラーゲン、１００μｇで免役した。免疫の時間から開始して、マウスに、臨床的関節炎の開始まで、ＰＢＳ中の試料タンパク質を、１週間に２回、腹腔内に注射した（対照として、毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみを注射した）。免疫後１５日から、マウスを１０日間、２つの臨床パラメータ、足のふくらみと臨床スコアを用いて、疾患の開始に関して毎日試験した。足のふくらみは、カリパスで最初に影響を受けた後ろ足の厚さを測定することによって査定した。
【０１７７】
実施例１６：結腸炎に対するマウスモデルにおける、キメラタンパク質の治療活性
Ｈａｒｌａｎ ＵＫにて購入した、ＩＬ−１０ノックアウトマウスを、ＩＬ１０遺伝子欠損に関するマウス同型を産生するために交雑し、その尾ＤＮＡにて実施したＰＣＲによて同型に関してスクリーンした。４週齢で開始して、マウスに、２０週齢まで、ＰＢＳ中の試験タンパク質を毎週３回腹腔内に注射した（対照として、毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみを注射した）。臨床スコア、腸の組織学的解析、スツール中の炎症性サイトカインの含量を、［１８］で示したように評価した。
【０１７８】
実施例１７：ｐ７５ ＴＮＦレセプターの可溶性形態の共役物の発現に関するプラスミドの構築
共役物内に組み込まれたｐ７５ ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｍ３２３１５）の可溶性系列の配列は、レセプターの細胞外ドメインの前配列（Ｌｅｕ１からＡｓｐ２３５まで）に相当する。この配列を、ＰＥの配列に融合させ、実施例１で記述したようにｐＥＴ−ベクター内に挿入した。
【０１７９】
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＴＢＰ−ＰＥキメラタンパク質（Ａ）およびシュードモナスエクソトキシン（Ｂ）の略図表を示している。シュードモナスエクソトキシン（Ｂ）は、レセプターが仲介するエンドサイトーシスによって細胞内に進入し、細胞プロテアーゼ（フリン−様）によって開裂され、移行活性およびＡＤＰ−リボシル化活性を含む４０ｋＤａ断片（ＰＥ）を産生する。タンパク質分解の後、ＰＥが、エンドプラスマリチクラムに到達し、細胞質へトランスロケートし、伸張因子２（ＥＦ２）のＡＤＰ−リボシル化によって、タンパク質合成を阻害する。ＴＢＰ−ＰＥキメラタンパク質（Ａ）には、ＴＢＰ１またはＴＮＦ−結合タンパク質１（ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分）、およびシュードモナスエクソトキシンのＰＥ断片が含まれる。
【図１Ｃ−Ｄ】Ｃ〜Ｄは、キメラＴＢＰ−ＰＥタンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ｃ 配列番号：１）、および相当するアミノ酸配列（Ｄ、配列番号：２）を示している。
【図１Ｅ−Ｆ】Ｅ〜Ｆは、ＰＥのＤＮＡ配列（Ｅ、配列番号：３）、シュードモナスエクソトキシンそのドメインＩＩおよびＩＩＩをコードする断片、および相当するアミノ酸配列（Ｆ、配列番号：４）を示している。
【図１Ｇ−Ｈ】Ｇ〜Ｈは、ＴＢＰＩとＰＥ部位を連結しているリンカーペプチドのＤＮＡ配列（Ｇ、配列番号：５）および相当するアミノ酸配列（Ｈ、配列番号：６）を示している。
【図２Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分解された細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現された、キメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥを示している。大腸菌細胞ＢＬ−２１ ｐＬｙｓに、ｐＴＢＰ−ＰＥ、ＴＢＰ−ＰＥキメラ遺伝子にライゲートしたｐＥＴ−５を含む発現ベクターを形質導入した。ｐＴＢＰ−ＰＥの形質導入、およびイソプロピルβ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導の後、大腸菌形質導入株を溶解し、溶解物（「未精製」）を、実施例２で記述したように可溶性タンパク質と不溶性封入体（「ＩＢ」）に画分化した。封入体を、実施例２で示したように、８Ｍ尿素（「尿素」）中に溶解し、再折りたたみさせた（「再折りたたみ」）。未精製、ＩＢ、尿素および再折りたたみ画分の試料（レーンあたり２０μｌ）（Ａ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上で分解し、ゲルをクーマシーブルー溶液で染色した。本図は、主にＩＢ画分で見られる、キメラＴＢＰ−ＰＥタンパク質が、およそ５７ｋＤａ．ＭＷ−分子量標準の見かけの分子量で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に移動したことを示している。実施例２の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥおよびＡを、タンパク質Ｇ−抗−ＴＢＰ−Ｉ架橋アフィニティークロマトグラフィーカラムにのせた。カラムに結合したＴＢＰ−ＰＥを、実施例３で示したように、ｐＨを還元することによって溶出した。溶出した画分を回収し、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ２８０）を測定した。ＴＢＰ−ＰＥを含む溶出した画分の試料（レーンあたり２０μｌ）（Ｂ中ライン１〜７）および精製した、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生された、非キメラＴＢＰ−１標準（Ｂ中ライン８）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上にのせ、ウェスタンブロット解析にかけて、抗ＴＢＰ−Ｉにて検出した。ＴＢＰＩのアミノ酸配列から予想されるＭＶは１７ｋＤａであるが、ＴＢＰＩの見かけのＭＷは、より高く、約３４ｋＤａで観察され（Ｂ、ライン８）、これは真核細胞（ＣＨＯ）中で産生されたこのＴＢＰ−Ｉ標準のグリコシル化による。抗ＴＢＰＩ抗体はまた、約５７ｋＤａの実際の分子量の、キメラＴＢＰ−ＰＥを検出した（Ｂ、ライン７）。
【図３】図３は、ＴＢＰ−ＰＥによる、伸張因子２（ＥＦ２）のＡＤＰ−リボシル化を示している。シュードモナスエクソトキシンは、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化によって仲介されたタンパク質合成の阻害を誘導する。１０〜５０μｌの、キメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥのＡＤＰ−リボシル化活性を試験するために、ＴＢＰ−ＰＥを産生している形質導入大腸菌細胞からの溶解物（「総溶解物」、棒３）、封入体の分離後の細胞溶解物（「可溶性タンパク質」棒２）、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥ（実施例２より、棒４）、または緩衝液（棒１）を、実施例４で示したように、ＥＦ−２およびＮＡＤ+−14Ｃを含む溶液中でインキュベートした。ＴＢＰ−ＰＥによって仲介される、ＮＡＤ+−14ＣのＥＦ−２への組み込みを、実施例４で示したように測定した。この図は、ＴＢＰ−ＰＥが、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化を誘導することを示している（棒１と比較して棒３および４を参照のこと）。非常に低いＡＤＰ−リボシル化活性が、可溶性タンパク質の試料中で観察され（棒２）、これは、ほとんどのＴＢＰ−ＰＥが、封入体内に存在することを示唆している。（可溶性タンパク質および封入体両方を含む）総細胞溶解物画分の１０μｌの試料が、５０μｌの同様の画分よりも活性を誘導し、これは、未精製細菌溶解物中に、阻害活性が存在することを示唆している。反対に、ＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性が、反応液に添加した、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量にともなって増加したことが認められる（棒４、１０および５０μｌの活性を比較）。
【図４Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、酵素結合免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって実施した、ＴＢＰＩ−ＰＥ（Ａ）およびＴＢＰＩ（Ｂ）の定量を示している。モノクローナル抗−ＴＢＰＩでコートしたマイクロタイタープレートに、連続希釈ＴＢＰ１（ＣＨＯ細胞より精製した）または再折りたたみＴＢＰＩ−ＰＥの試料を三重に適用した。３７℃にて１時間のプレートのインキュベーションと、続く未結合タンパク質を取り除くための洗浄の後、結合したＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩを、ポリクローナルウサギ抗−ＴＢＰＩ、抗−ウサギ−ＨＲＰ共役物、およびＨＲＰ基質を用いて、実施例５で記述したように検出した。ＴＢＰＩ／ＴＢＰ−ＰＥ濃度の指標である、緑色の強度を、４０５ｎｍにて測定した。Ｂで示したＥＬＩＳＡにしたがって、０．３のＯ．Ｄ．が直線範囲であり、７６μｇ／ｍｌＴＢＰＩの濃度に相当し、再折りたたみＴＢＰＩ−ＰＥの外挿濃度が、約４５μｇ／ｍｌに相当する（Ａ）。図４で要約した結果によって、ＴＢＰ−ＰＥが正確に再折りたたみされ、抗−ＴＢＰ抗体が、非キメラＴＢＰＩタンパク質を認識するのと同様に、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥを認識するので、その濃度が、抗ＴＢＰ抗体を用いるＥＬＩＳＡによって定量可能であることが示されている。
【図５Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＴＢＰ−１のＴＮＦ結合活性に対するＴＢＰ−ＰＥのＴＮＦ結合活性を示している。示した量の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥ、または非キメラＨＰＬＣ−精製ＴＢＰ−１（ＣＨＯ細胞中で産生された）を、ＴＮＦコートプレートにのせ、プレートへの結合を、モノクローナル抗ＴＢＰ−１抗体で検出した。Ｂは、ＴＮＦ結合活性を持つ未精製再折りたたみキメラタンパク質の割合を示している。ＴＢＰ−１の活性を１００％ＴＮＦ結合として用いると、少なくとも５０％の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＮＦ結合活性を持つことがわかった。
【図６Ａ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。ＴＢＰ−ＰＥの細胞傷害性活性を、ＨｅＬａ細胞中、または表面ＴＮＦを過剰発現するように遺伝子工学的に改変した（Poscsik ら,1995）ＨｅＬａ−Ｍ９細胞株で試験した。細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、示した濃度のＴＢＰ−ＰＥ、またはＴＢＰＩ（対照として）で試験した。処理２４時間後の細胞の増殖と生存性を、実施例７で示したように査定した。いくつかのウェルで、細胞を、ＴＢＰＩとＴＢＰＩ−ＰＥの組み合わせで処理して、細胞表面ＴＮＦ−αの結合を介したＴＢＰＩ−ＰＥ細胞毒性の特異性を査定した。本発明者らは、ＴＢＰ−ＰＥの６０および６００ｎｇ／ｍｌの２つの異なるバッチが、ＨｅＬａＭ９にて細胞毒性効果を持つこと、細胞毒性が、ＴＢＰ−１との競合によって完全に阻害されたことから、細胞毒性効果が、膜結合ＴＮＦ−αを介して特異的に誘導されたことを発見した。
【図６Ｂ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。ＴＢＰ−ＰＥの細胞傷害性活性を、ＨｅＬａ細胞中、または活性化単球様細胞株中で試験した。細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、示した濃度のＴＢＰ−ＰＥ、またはＴＢＰＩ（対照として）で試験した。処理２４時間後の細胞の増殖と生存性を、実施例７で示したように査定した。いくつかのウェルで、細胞を、ＴＢＰＩとＴＢＰＩ−ＰＥの組み合わせで処理して、細胞表面ＴＮＦ−αの結合を介したＴＢＰＩ−ＰＥ細胞毒性の特異性を査定した。本発明者らは、上皮細胞株ＨｅＬａＭ９中の細胞毒性を誘導する同様の濃度のＴＢＰ−ＰＥ（図６Ａ）が、活性化単球様ＴＨＰＩ細胞株に関して細胞毒性ではなかったことを発見した。
【図６Ｃ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。ＴＢＰ−ＰＥの細胞傷害性活性を、ＨｅＬａ細胞中、または活性化初代マクロファージ細胞中で試験した。細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、示した濃度のＴＢＰ−ＰＥ、またはＴＢＰＩ（対照として）で試験した。処理２４時間後の細胞の増殖と生存性を、実施例７で示したように査定した。いくつかのウェルで、細胞を、ＴＢＰＩとＴＢＰＩ−ＰＥの組み合わせで処理して、細胞表面ＴＮＦ−αの結合を介したＴＢＰＩ−ＰＥ細胞毒性の特異性を査定した。本発明者らは、上皮細胞株ＨｅＬａＭ９中の細胞毒性を誘導する同様の濃度のＴＢＰ−ＰＥが（図６Ａ）、１または１０ｎｇ ＬＰＳでの大腸菌の処理によって活性化した初代マクロファージに関して細胞毒性ではなかったことを発見した。
【図６Ｄ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。活性化マクロファージによるＴＮＦの分泌における、ＴＢＰ−ＰＥの効果もまた調査した。６００および１５００ｎｇ／ｍｌの濃度でのＴＢＰ−ＰＥで処理した、または未処理の活性化マクロファージの培養培地を回収し、２、４および８倍に新鮮な培地で希釈し、Ｌ９２９細胞に適用し、ＴＮＦ濃度の指標である、細胞のＴＮＦ依存死をモニタした。本発明者らは、活性化マクロファージによるＴＮＦ分泌が、ＴＢＰ−ＰＥによって阻害されなかったことを発見した。
【図７】図７は、ＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａＭ９細胞中のタンパク質合成を阻害することを示している。ＨｅＬａＭ９およびＨｅＬａ細胞を、（６００ｎｇ／ｍｌ）ＴＢＰ−ＰＥで処理するか、未処理のまま残し（「緩衝液」）、35Ｓ−Ｍｅｔでの放射活性標識にかけた。１つの実験群にて、ＴＢＰＩを、細胞表面ＴＮＦと競合させるために、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に細胞に適用した（「ＴＢＰ−ＰＥ＋ＴＢＰ」）。処理の後、細胞を溶解し、ＴＣＡ−沈殿タンパク質の放射活性を、実施例８で記述したように測定した。本図は、６００ｎｇ／ｍｌのＴＢＰ−ＰＥが、少なくとも７５％細胞に関して、ＨｅＬａＭ９中でのタンパク質合成を阻害するが、ＨｅＬａ細胞内でのタンパク質合成を減じないことを示している。ＴＢＰＩは、１０倍過剰で添加した時に、ＨｅＬａ−Ｍ９におけるＴＢＰ−ＰＥの効果を完全に阻害した。ＴＢＰＩのみは、ＨｅＬａ−Ｍ９中、またはＨｅＬａ細胞中両方で、タンパク質合成に影響を与えなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフェクター分子を、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのリガンドを発現している細胞に特異的に送達し、それによって前記細胞を選択的に殺すか、または改変するための、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン類は、通常防御を増強するために働く。しかしながら、過剰に働いた場合、これらは、大きな障害を引き起こし得、これは、病原体が引き起こし得るものに勝るとも劣らない。事実、多くの疾患において、サイトカインの好まれない効果が、主要な病原となる。
【０００３】
ＴＮＦファミリーのサイトカインは、先天性型および獲得性型両方の、広い範囲の異なる免疫防御機構を調節する。ＴＮＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｘ０１３９３）、Ｆａｓリガンド（ＴＮＦＳＦ６、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｕ１１８２１）、ＣＤ４０リガンド（ＴＮＦＳＦ５、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｘ６７８７８）などを含む、数種のサイトカイン類の過剰な機能が、種々の疾患の病因に関連してきた。特に、広範囲の疾患：マラリアおよび敗血症のような感染疾患、リウマチ関節のような自己免疫疾患、炎症性腸疾患および乾癬、および特定の癌において、ＴＮＦの主要な病因的役割が広範囲に証明されている。事実、抗−ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦレセプターのような手段によって、ＴＮＦ活性を阻害することによって、このような状態における治療が提供されることがわかった［１］［２］［３］。関節リウマチおよびクローン病を含むいくつかの病的状態において、多くの有意な割合の患者が、抗−ＴＮＦ治療に好ましく応答する。しかしながら、これらの方法にはほとんど反応しないような疾患の患者も存在し、治療に対する追加的なアプローチを定義する必要が提起される［４］。
【０００４】
サイトカイン−産生細胞によるそれらの分泌に続いて、可溶性タンパク質として単独で働く多くの他のサイトカインとは違い、ＴＮＦファミリーのリガンドは（可溶性分泌タンパク質として産生される、リンホトキシン（ＬＴＡ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｘ０１３９３）を除いて）、細胞−結合ＩＩ型膜貫通タンパク質として産生される。これらは、その形態で効果を発揮することができ、リガンド産生細胞に隣接して局在する細胞にのみ影響を与える（ジャクスタクリン調節）。これらの多くは、循環する可溶性分子を形成し流動している。たとえばＴＮＦなど、これらの可溶性リガンドの一部は、可溶性サイトカインとして働き、パラクリン調節物（リガンド産生細胞に比較的近く局在する細胞に影響を与える）およびエンドクリン調節物（遠くの細胞に影響を与える）として働く能力がある。ＴＮＦファミリーの他のリガンド、たとえばＦａｓリガンドは、その流動形態（shed form）では効果的に働かず、この形態では、まさに細胞結合形態に対するアンタゴニストとして働き得る［５］［６］。
【０００５】
産生細胞の表面上での、ＴＮＦファミリーのリガンドの存在によって、これらのリガンド産生細胞を特異的に標的化するための潜在的な方法が提供される。そのような方法によって、リガンドが病原的な役割を果たす状況にて、リガンド産生細胞の選択的な抑制または削除さえ可能になり得る。
【０００６】
いくつかの観点において、サイトカインを産生する細胞の破壊が、サイトカイン分子の機能の正に直接の抑制よりも、このサイトカインの病原性の効果に対するよい防御を提供するようになり得る。
【０００７】
サイトカイン−産生細胞の崩壊により、サイトカインのさらなる合成が防止され、したがって、すでに合成されたサイトカイン分子の効果をただ抑制することによって得られたものよりも、より耐久性のある保護が提供され得る。
【０００８】
サイトカインを産生する細胞はしばしば、特定の型の免疫応答を引き出すために一緒に働く他のサイトカインを同時に産生する。よく知られている例は、それぞれ、異なる型の免疫防御を引き出すために働く、異なる群のサイトカインを産生するリンパ球である、Ｔｈ１−およびＴｈ２型Ｔリンパ球がある［７］。サイトカインを産生している細胞を破壊することによって、したがって、特定のサイトカインの合成の停止に加えて、その病原性効果において、前者を補助する種々の他のサイトカインの合成も停止させることになる。
【０００９】
循環サイトカインの抑制が全身に影響を与える一方、サイトカイン−産生細胞を殺すことは、これらの細胞が存在する体の特定の場所に制限可能であり、したがって、他の場所でのサイトカインの利益ある効果を維持する一方で、特定の部位での、サイトカインの有害な効果が避けられる。
【００１０】
クローン病における、抗−ＴＮＦ治療の効果の研究によって、ＴＮＦ−産生細胞を殺すことによって、いくつかの病的状況において実際に、単にＴＮＦを阻害することによって得られるよりも、効果的な治療が提供され得ることが示唆されている。この疾患における、抗−ＴＮＦ抗体の治療効果が、抗体によるＴＮＦ−産生細胞の死の早期誘導と相関することがわかった［８］［９］［１０］。したがって、ＴＮＦ、またはＴＮＦファミリーの他のリガンドを産生する細胞の効果的かつ選択的標的化のための方法を設計する必要がある。
【００１１】
細胞表面構成物に結合する標的化分子に連結したサイトトキシンが、強力な細胞殺傷試薬として機能し得る。細胞型特異的表面構成物を認識する標的化部位を選択することによって、インビボにおける特定の細胞の選択的破壊に対して、そのような細胞毒性キメラを適用することが可能である。たとえば、シュードモナスエクソトキシン（ＰＥ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）に融合した癌特異的エピトープに対する抗体からなる融合タンパク質が、癌細胞を特異的に標的化し、殺すことが可能である。毒素が、そのレセプターが特定の腫瘍にて現れる、ＩＬ２、ＩＬ４またはＩＬ１３のようなリガンドまたはホルモンに融合したキメラでも、そのような抗癌効果が得られてきた。同様に、サイトトキシン−含有キメラが、病原体被災細胞に対して標的化されるように設計された。たとえば、ＨＩＶ−感染細胞を、シュードモナスエクソトキシンに結合した、ｇｐ１２０の保存ＣＤ４結合部位に指向する抗−ｇｐ１２０またはＣＤ４からなる免疫毒素を用いて、選択的に破壊することができる［１１］［１２］［１３］。
【００１２】
ＴＮＦファミリーのリガンドを発現する細胞に対して、サイトトキシン類または他の調節薬剤を標的化するための可能性ある方法の１つの種類は、これらのリガンドに対する抗体である。実際、ＣＤ４０リガンドに対する抗体が、ＣＤ４０リガンド産生細胞に対して毒素を標的化するために適用された（欧州特許第１００５３７２号）。しかしながら、特定のリガンドに対して産生された抗体の一部分のみが、このリガンドの、そしてこれらの細胞結合形態に対して効果的に結合するのみであり、一旦これらがリガンドに結合したならば、一部分のみがレセプター分子（可溶性または細胞関連）と競合可能であり得る。そのような抗体のスクリーニングは、大規模な試みと期間が必要であり得る。通常マウスである抗体の他の不利な点は、これらが、患者における免疫応答を喚起することである。
【００１３】
したがって、ＴＮＦファミリーのリガンドを産生する細胞を効果的に標的化可能であるタンパク質の産生のための、一般的なアプローチを定義することが望ましい。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、異常に高レベルのＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを発現している細胞を殺すこと、または改変することが可能なキメラタンパク質であって、該レセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含むキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分に関し、該ポリペプチドは、エフェクター分子に連結されている。
【００１５】
本発明の１つの実施様態において、前記キメラタンパク質のポリペプチドは、ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＦａｓの細胞外部分からなる。
【００１６】
本発明の他の実施様態において、キメラタンパク質のポリペプチドは、ＴＮＦ結合タンパク質−１（ＴＢＰＩ）のような、ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分からなる。
【００１７】
本発明の１つの観点において、キメラタンパク質中のエフェクター分子は、シュードモナスエクソトキシン、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニン、またはこれらの断片のような細胞傷害性分子である。
【００１８】
本発明の１つの観点において、キメラタンパク質中のエフェクター分子は、配列番号：３のアミノ酸配列に相当する、本明細書でＰＥと呼ばれる断片のような、シュードモナスエクソトキシンの断片である。
【００１９】
さらなる実施様態において、本発明は、本明細書でＴＢＰ−ＰＥとして記述される、配列番号：２のアミノ酸配列を持つキメラタンパク質、または変異導入体、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、その活性断片または塩を提供する。
【００２０】
本発明の１つの観点において、キメラタンパク質中のエフェクター分子は、蛍光組成物、放射活性組成物、Ｂａｘ、Ｂａｋのような、哺乳動物細胞死タンパク質、ＤＮＡ断片化因子４０、シクロスポリン含有リポソーム、免疫抑制サイトカインのようなサイトカイン、増殖因子、腫瘍細胞抗原に特異的であり得る抗体、またはＢｃｌｘ、ＣＡＤ−タンパク質、カスパーゼ、ＩｋＢのような細胞内調節タンパク質である。
【００２１】
１つの実施様態において、本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列、たとえば、配列番号：１のヌクレオチド配列、ＴＢＰ−ＰＥまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分をコードするＤＮＡを提供し、任意に、前記単離ＤＮＡはさらに、真核細胞中での分泌のための、シグナルペプチドをコードする。
【００２２】
さらなる実施様態において、本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
【００２３】
また他の実施様態において、本発明は、そのような前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、たとえば、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＴＨＰＩ、酵母および昆虫細胞のような、真核細胞または原核細胞であり得る。
【００２４】
１つの観点において、本発明は、前記発現ベクターを含む前記宿主細胞を培養すること、および産生されたキメラタンパク質を単離すること、を含む、ＴＢＰ−ＰＥのようなキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分を産生するための方法を提供する。
【００２５】
他の観点において、本発明は、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２６】
さらなる観点において、本発明は、共に本発明のキメラタンパク質をコードする前記ＤＮＡまたは前記ベクターと、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００２７】
１つの実施様態において、本発明は、疾患の治療のための医薬品の製造における、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用に関する。
【００２８】
１つの実施様態において、キメラタンパク質を自己免疫疾患において使用する。
【００２９】
本発明の他の実施様態において、キメラタンパク質を、ＴＮＦのような、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドが、疾患、たとえば、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核のような急性疾患、または慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬のような慢性疾患の発病および／または経過に関与する疾患において使用する。
【００３０】
本発明のまた他の実施様態において、キメラタンパク質を癌にて使用し、前記キメラタンパク質が、癌細胞によって発現されたＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドに結合する。たとえば、ＴＮＦレセプターの細胞外部分を含むキメラタンパク質を、ＴＮＦを発現している乳癌のような上皮由来の癌で使用可能である。
【００３１】
また他の実施様態において、本発明はまた、キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している有害な細胞を殺すための、自己移植前に癌患者の幹細胞を治療するための、医薬品の製造における、本発明のキメラタンパク質の使用に関する。たとえば、キメラタンパク質を、幹細胞の採取の前に患者に投与してよく、または患者より取り出した細胞を、移植の前に治療するために使用してよい。
【００３２】
また他の実施様態において、本発明は、ＴＮＦを発現している上皮細胞が、疾患の発病および／または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用に関する。たとえば、乳癌、移植片対宿主疾患（ＧＶＨ）、乾癬、およびクローン病または潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患（ＩＢＤｓ）においてである。
【００３３】
１つの観点において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む自己免疫疾患の治療方法を提供する。
【００３４】
他の観点において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンド、たとえばＴＮＦの活性が、前記疾患の発病または経過に関与する疾患の治療方法を提供する。たとえば、ＴＮＦは、以下の疾患の発病および／または経過に関与する。敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核のような急性疾患、または、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬のような慢性疾患。
【００３５】
１つの実施様態において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、癌細胞が、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンド、たとえばＴＮＦを発現しているような、癌の治療方法を提供する。
【００３６】
本発明のさらなる実施様態において、前記癌は上皮由来であり、たとえば乳癌である。
【００３７】
他の実施様態において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量の本発明のキメラタンパク質を投与することを含む、自己移植の前に、ＴＮＦを発現している有害な骨髄細胞を殺すための方法に関する。たとえば、キメラタンパク質を、骨髄細胞の採取の前に必要としている対象に投与してよい。
【００３８】
また他の実施様態において、本発明は、必要としている対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、ＴＮＦを発現している上皮細胞が、前記疾患の発病および／または経過に関与する、乳癌、移植片−対−宿主疾患、乾癬および炎症性腸疾患のような疾患の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、前記ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含む、異常に高レベルのＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを発現している細胞を殺すか、または改変可能であるキメラタンパク質、またはムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、または細胞毒性調節およびレセプター分子からなる群から選択されたエフェクター分子に連結されたそれらの活性断片に関する。
【００４０】
本発明によって、エフェクター分子を、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの細胞結合リガンドを発現している細胞に対して標的化（または特異的に送達）可能である。
【００４１】
本発明は、エフェクター分子としてｐ５５ ＴＮＦレセプター（ＴＢＰＩ）の可溶性形態、シュードモナスエクソトキシンの移行ドメインおよびＡＤＰ−リボシル化ドメインを含むポリペプチドを含む、配列番号：２（図１Ｄ）でのアミノ酸配列に相当する、本明細書でＴＢＰ−ＰＥと示される、キメラタンパク質で得られた結果に基づいている。実験結果によって、ＴＢＰＩ−ＰＥが、ＴＢＰＩと同様のＴＮＦ−結合活性を十分に持つこと、これらの細胞においてのみ、タンパク質合成の阻害を引き起こす、細胞表面ＴＮＦ−αを発現している細胞内へのみ浸透し、細胞死を引き起こすことを示している。
【００４２】
ｐ５５ ＴＮＦレセプター（ＴＢＰＩ）の細胞外部分、シュードモナスエクソトキシンのドメインＩＩ、ＩｂおよびＩＩＩからなる、シュードモナスエクソトキシン（ＰＥ）の４０ｋＤａ断片を含む、キメラ遺伝子ＴＢＰ−ＰＥを、ＰＣＲ増幅によって調製した。ＴＢＰ−ＰＥタンパク質を、ＴＢＰ−ＰＥベクター（ｐＴＢＰ−ＰＥ）で形質導入した原核細胞ＢＬ２１中で産生させた。ほとんどの組換え体タンパク質を含む、封入体を、変性溶液中に溶解し、変性させた。細菌細胞中で産生された折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質は、５７ｋＤａの正しい大きさを持った。
【００４３】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥをさらに、抗ＴＢＰ−Ｉ架橋でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【００４４】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質のＡＤＰ−リボシル化活性を、インビトロにて調査した。ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化が、（実施例２の変性封入体からの）再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質によって誘導された。再折りたたみタンパク質のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性が、反応で使用した再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量に関連して増加した。
【００４５】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量を、ＴＢＰＩに対して特異的な抗体を用いて、酵素結合免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって推定した。さらに、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥのＴＮＦ結合活性を、ＣＨＯ細胞において産生される精製ＴＢＰＩの、ＴＮＦへのＴＮＦ結合活性と比較した。本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって推定されたＴＢＰ−ＰＥの濃度が、Ｂｒａｄｆｏｒｄによって見られたものと同様であることを発見し、これは、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥおよびＴＢＰＩが、同様の効果で、抗−ＴＢＰＩ抗体によって認識されることを示している。（ＥＬＩＳＡによって測定され得たような）同様の量の（原核細胞から精製した）ＴＢＰＩまたは再折りたたみＴＢＰＩ−ＰＥの、ＴＮＦへの結合を、ＴＮＦコートプレートにて調査した。本発明者らは、ＴＢＰＩの活性を１００％ＴＮＦとして使用して、少なくとも５０％の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＮＦ結合活性を持つことを発見した。
【００４６】
融合タンパク質ＴＢＰ−ＰＥ（および対照として、可溶性ＴＮＦレセプターのみ）の細胞毒性活性を、上皮中、または単球様ＬＰＳ−処理細胞中で試験した。ＨｅＬａ−Ｍ９細胞は、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、＋２の位置でのアルギニンと、＋３の位置でのセリンが、スレオニンに置換される、ヒトＴＮＦ変異導入ｃＤＮＡを一貫して発現する、上皮ＨｅＬａ子宮頸癌のクローンである。これらの変異導入によって、２６ｋＤａ表面ＴＮの開裂速度が約１０倍減少した。細胞を、１０％ Ｆｅｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含む、ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【００４７】
（膜結合ＴＮＦを過剰発現している）ＨｅＬａ−Ｍ９またはＨｅＬａ細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、異なる濃度のＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩとともにインキュベートし、培養液の生存を、ニュートラルレッド染色を用いて査定した。いくつかのウェルで、ＴＢＰＩを、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に適用して、膜−結合ＴＮＦ−αを介して誘導されたＴＢＰ−ＰＥ活性の特異性を調査するために、ＴＮＦに関して競合させた。
【００４８】
本発明者らは、６００ｎｇ／ｍｌのＴＢＰ−ＰＥが、その表面上にＴＮＦ−αを過剰発現している、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞の死を引き起こすが、ＨｅＬａ細胞には影響を与えなかったことを発見した。ＴＢＰＩは１０倍過剰で適用する時に、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果を特異的に抑制した。ＴＢＰＩのみは、７６ｍｇ／ｍｌまでの濃度で、細胞変性効果を引き起こさなかった。２つの異なるバッチのＴＢＰ−ＰＥを試験し、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞に対して同様の細胞毒性があることがわかった。ＴＢＰ−ＰＥは、６００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＨｅＬａＭ９にて、９０％を超える細胞死を引き起こした。ＴＢＰ−ＰＥのバッチの１つが、非常に活性であり、０．０６ｍｇ／ｍｌでの濃度でも細胞毒性であり、ほぼ６５％のＨｅＬａＭ９細胞を殺した。
【００４９】
ＴＢＰ−ＰＥは、ＨｅＬａ−Ｍ９におけるタンパク質合成を劇的に抑制するが、ＨｅＬａ細胞のタンパク質合成においては、阻害効果を欠くことがわかった。ＴＢＰＩは、１０倍過剰で、ＴＢＰ−ＰＥと一緒に加えたときに、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞中で、ＴＢＰ−ＰＥの効果を抑制することがわかった。ＴＢＰＩのみは、ＨｅＬａ−Ｍ９内、またはＨｅＬａ細胞内で、タンパク質の合成に影響を与えなかった。
【００５０】
ＴＢＰ−ＰＥの効果を、細胞表面ＴＮＦを過剰発現している、活性化単球様細胞株（ＴＨＰＩ）または活性化初代マクロファージ両方でも探索した。本発明者らは、ＨｅＬａＭ９細胞にて、細胞毒性を引き起こす濃度（６０および６００ｎｇ／ｍｌ）で試験したＴＢＰ−ＰＥが、活性化ＴＨＰＩ株、および活性化初代マクロファージにおける細胞毒性活性を欠き、後者の細胞におけるＴＮＦ分泌を阻害しなかったことを発見し、これは、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果が、細胞結合ＴＮＦを過剰発現している上皮細胞に対して特異的であることを示している。
【００５１】
本発明の１つの実施様態において、ＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａＭ９のような、膜ＴＮＦを過剰発現している上皮腫瘍細胞に対して細胞毒性性であるが、膜ＴＮＦを過剰発現している、単球の形をしている活性化細胞株、または初代マクロファージの活性化培養液の両方に対して細胞毒性ではないことが示された。
【００５２】
Ｄｉｅｂｅｌら（J Trauma.2005 58(5):995-1001）は、腸上皮細胞のアポトーシスが、腸に対する低流速状態の後の腸不全に関与することを示唆した。Ｄｉｅｂｅｌらは、細菌と低酸素−再酸素化のような、混合損傷に曝露した後の、上皮Ｃａｃｏ２腸細胞株が、ＴＮＦを産生し、続いてこれらにおけるアポトーシスを誘導したことを示した。
【００５３】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、腸炎症疾患（ＢＩＤ）潰瘍性大腸炎およびクローン病のような、腸の条件下でのアポトーシスに関与する、ＴＮＦを過剰発現している腸上皮細胞を特異的に殺すために使用し得る。
【００５４】
Ｋｏｎｏｕｒら（Br J Dermatol.2005;152(6):1134-42）は、ケラチノサイト、または腸上皮細胞のアポトーシスが、急性移植片−対−宿主（ＧＶＨ）疾患のあいだの、器官の障害の重要な病理生態学的機構であることを示唆した。Ｋｏｎｏｕｒらは、それぞれが、主要組織適合性複合体ミスマッチ白血病培養と混合した、ケラチノサイトまたはヒト皮膚移植培養を含む、ＧＶＨのインビトロモデルにおける、ＧＶＨでのアポトーシスを誘導することに関するメディエーターを探索した。Ｋｏｎｏｕｒらによって得られた結果は、ケラチノサイトおよびヒト皮膚移植培養から産生されたＩＦＮガンマおよびＴＮＦが、ＧＶＨでのアポトーシスのメディエーターであることを示している。
【００５５】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、ＧＶＨを予防または最小化するために、ＴＮＦを産生しているケラチノサイトまたは腸上皮細胞を特異的に殺すために、移植を受ける患者に投与してよい。
【００５６】
ケラチノサイトおよびＴ細胞両方が、乾癬において、十分な量のＴＮＦαを分泌し、この疾患の発病における、１つのこれらの型の細胞の一般的な重要性は明確ではない（Kupper T.S.,Immunologic Targets in_Psoriasis.N.Engl.J.Med.,2003,v.349,pp.1987-1990;Asadullah K.ら,Novel Immunotherapies for psoriasis.TRENDS in Immunology,2002,v.23,No1,pp.47-53）。Ｈｏｎｇ Ｋ．らが、ＩＮＦ−ガンマとは独立して、ＩＬ−１２が、マウス乾癬様皮膚疾患の発病において、重要な役割を果たすことを示している（J.Immunology,1999,v.162;pp.7480-7491）。Ｈｏｎｇらが、インターフェロンガンマ−／−表現系の皮膚由来炎症細胞が、マウスにおいて、多量のＴＮＦ−αを分泌したが、抗ＩＬ−１２の存在下では分泌しなかったことを指摘した。
【００５７】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、ＴＮＦを産生している皮膚由来の炎症細胞を特異的に殺すために、乾癬患者に投与してよい。
【００５８】
Ｓｔｕｅｌｔｅｎら（J Cell Sci.2005 15;118(Pt10),2143-53）が、乳癌細胞の悪性化可能性を増加させる機構における、腫瘍−間質相互作用を探索した。この目的のために、Ｓｔｕｅｌｔｅｎは、繊維芽細胞（たとえば間質細胞）と悪性化の可能性が高いヒト腫瘍乳上皮細胞を含む２Ｄ−共培養液を使用した。Ｓｔｕｅｌｔｅｎらは、繊維芽細胞における（腫瘍転移を促進することが知られている）ＭＭＰ−９の発現が、腫瘍によって分泌されるＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−ベータの活性によって誘導されることを示した。
【００５９】
したがって、ＴＢＰ−ＰＥを、腫瘍増殖および転移を予防するために、上皮乳癌、またはＴＮＦ−αを産生している上皮由来の他の癌を効果的に殺すために使用してよい。
【００６０】
すべてにおいて、膜結合ＴＮＦを過剰発現している細胞においてのみ、特定の効果を示している、ＴＢＰ−ＰＥで得た結果によって、ＴＢＰ−ＰＥならびに本発明の他のキメラタンパク質が、治療的な目的のために探索可能で活用可能であることが示される。
【００６１】
本発明にしたがって、ＴＮＦファミリーのリガンドを標的化するための、非常の効果的であり、選択的な一般的方法が、結合するレセプターの細胞外部分によって提供される。これらのリガンドに対するいくつかのレセプターが、細胞結合形態でだけでなく、これらのレセプターの細胞外部分またはドメインに相当する可溶性形態でも、天然に存在する。これらの可溶性形態のいくつかが、それらの細胞表面レセプターとのリガンドの相互作用を阻害させる程度まで、それらのそれぞれのリガンドに対して、効果的に結合することが示されてきた。さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの特定のレセプター（たとえばＯＰＧ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｕ９４３３２）が、可溶性分子としてのみ産生され、この形態で、相互作用するリガンドの、他の細胞表面のファミリーのレセプターとの結合を効果的に阻害する。
【００６２】
ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＦａｓのような、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのレセプターの細胞外部分が、本発明にしたがって企図される。ＴＮＦファミリーのレセプターの可溶性形態を含むキメラ分子が、可溶性レセプターの、特異的に細胞結合リガンド分子に標的化する能力を維持するために、他の部位に融合してよい。その上、これらは、可溶性レセプターが融合する部位によって与えられる追加的な活性を持ち得、たとえば、ＴＮＦレセプターの可溶性形態の、免疫グロブリンのＦｃ部位またはポリエチレングリコールへの融合が、本来の可溶性レセプター分子のものよりも、より長いクリアランス時間を持って、キメラに寄与し得る。２つの可溶性レセプター分子の、免疫グロブリン分子のＦｃ部分への融合がまた、これらのレセプター分子に、それらのリガンドに結合するより大きな効果を与え得る。
【００６３】
「エフェクター分子（effector molecules）」は、標的細胞の近くまたは内に配置したときに、その上に、望む機能的または表現系的変化を強要可能であるタンパク質または化学物質である。細胞内の機能的変化には、限定はしないが、細胞死、およびリガンド発現のダウンレギュレーションが含まれる。表現系変化には、限定はしないが、細胞蛍光および放射活性の変化が含まれる。
【００６４】
１つの実施様態において、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの細胞外部分が、シュードモナスエクソトキシン（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニンなどのような、天然または改変細胞毒素である、エフェクター物質に融合（または連結）される。
【００６５】
他の実施様態において、レセプターの細胞外部分を、哺乳動物細胞−死タンパク質、たとえば、Ｂｃｌ２−関連タンパク質ＢａｘまたはＢａｋ、またはＤＮＡ断片化因子４０に融合（または連結）可能である［１４］。
【００６６】
他の実施様態において、エフェクター分子は、薬理学的試薬、または薬理学的試薬を含む賦形剤であってよい。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの細胞外部分を、たとえば蛍光組成物に連結してよく、これによって、このレセプターが結合するリガンドを産生している細胞のイメージングが可能になる。また、リガンド産生細胞のイメージングのため、またはそれらの分解のために使用してよい、放射活性化合物に連結してもよい。可溶性レセプターを、好ましく活性化Ｔ−リンパ球に影響を与える薬物である、リソソーム−含有シクロスポリンに連結することによって、レセプターによって認識されるリガンドを産生するＴリンパ球の機能の選択的阻害を可能にし得る。
【００６７】
また他の実施様態において、エフェクター分子は、増殖因子またはサイトカインであり得る。たとえば、免疫抑制サイトカインであってよく、レセプターに対するリガンドを発現している細胞へ、このサイトカインを特異的に送達可能である。
【００６８】
また他の実施様態において、エフェクター分子は、抗体、たとえば、腫瘍−細胞特異的抗原に対する抗体であり得る。そのような抗体と、ＴＮＦに対する可溶性レセプターからなるキメラが、ＴＮＦ−産生細胞の、腫瘍細胞との相互作用を刺激し、したがって、ＴＮＦによる腫瘍細胞の分解を指令する。
【００６９】
他の実施様態において、エフェクター分子は、Ｂｃｌｘ、ＣＡＤ−タンパク質、カスパーゼ−８およびＩκＢのようなカスパーゼのような、細胞内調節タンパク質であり得る。
【００７０】
レセプターの可溶性形態の天然の発生が、ＴＮＦの２つのレセプター（ＴＮＦＲ５５およびＴＮＦＲ７５）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、Ｆａｓおよび他を含む、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのほとんどすべてのメンバーに関して記述されてきている。キメラタンパク質には、天然に存在するか、または人工いずれかの、このファミリーのレセプターの可溶性形態が含まれ得る。ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの任意の特定のレセプターの全細胞外ドメイン、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能性誘導体、円順列誘導体またはその活性画分であり得る。
【００７１】
語句「キメラタンパク質（chimeric protein）」および「共役物（conjugate）」は、本明細書内で相互互換的である。
【００７２】
本明細書で使用するところの語句「ムテイン（muteins）」は、本来のタンパク質と比較して、得られる産物の活性が著しく変化しないで、天然に存在するタンパク質の成分の、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換されるか、または欠損するか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、タンパク質の本来の配列に加えられる、タンパク質の類似体を意味する。これらのムテインは、公知の合成によって、および／または部位特異的変異導入技術、または好適な任意の他の公知の技術によって調製される。
【００７３】
本発明によるムテインには、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされた、ストリンジェントな条件下で、本発明にしたがって、タンパク質をコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリッド形成する、タンパク質が含まれる。語句「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」は、ハイブリッド形成と、それに続く洗浄条件を意味し、当業者によって「ストリンジェント」と呼ばれる。Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，上記、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§§６．３および６．４（１９８７、１９９２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。
【００７４】
限定はせずに、ストリンジェントな条件の例には、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、１５分間、試験ハイブリッドの計算Ｔｍより１２°〜２０℃下；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、３７℃にて３０〜６０分間、ついで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ、６８℃、３０〜６０分間の洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件がまた、ＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基のような）オリゴヌクレオチドプローブ、または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに、テトラメチル塩化アンモニア（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ、上記を参照のこと。
【００７５】
任意のそのようなムテインは、好ましくは、本発明のタンパク質に対して、本質的に同様の、またはよりよい活性を持つような、本発明の可溶性レセプターのものと本質的に複製的であるアミノ酸の配列を持つ。たとえば、ＴＢＰの１つの特徴的な活性は、ＴＮＦへの結合のその能力である。ＴＮＦの結合を測定するための、ＥＬＩＳＡ型アッセイを、以下の実施例で記述している。ムテインが、本発明の可溶性レセプターに対する十分な結合活性を持つ限り、本発明の可溶性レセプターに対する、本質的に同様の活性を持つと考えることが可能である。したがって、任意のムテインが、可溶性レセプターと少なくとも本質的に同様の活性を持つかどうかを、そのようなムテインを、たとえば、以下の実施例にてＴＢＰおよびＴＮＦに関して記述したように、そのリガンドに結合するかどうかを決定するために、単純な結合アッセイにかけることを含む、通常の実験方法によって、決定可能である。
【００７６】
好ましい実施様態において、任意のそのようなムテインは、ＴＢＰのアミノ酸配列と、少なくとも４０％同一性または類似性を持つ。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはもっとも好ましくは、少なくとも９０％同一性または相同性を持つ。
【００７７】
同一性は、配列を比較することによって決定する、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列、または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の相関を反映する。一般的に、同一性は、比較している配列の長さにわたる、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、実際のヌクレオチドのヌクレオチドに対する、またはアミノ酸のアミノ酸に対する相関を意味する。
【００７８】
実際の相関がない配列に関して、「パーセント同一性（percent identity）」を測定し得る。一般的に、比較すべき２つの配列を、その配列間の最大相関を得るために、並べる。これには、アライメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列いずれかでの、「ギャップ」の挿入が含まれる。パーセント同一性は、同一、または非常に類似の長さの配列に対してとりわけ好適である、比較している配列のそれぞれの全配列にわたり（グローバルアライメントと呼ばれる）、または等しくない長さの配列により好適である、より短い、定義された長さにわたって（ローカルアライメントと呼ばれる）、決定してよい。
【００７９】
２つまたはそれ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が、本発明分野でよく知られている。したがって、たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Devereux Jら,1984,Nucleic Acids Res.1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95）にて使用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用してよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（J Theor Biol.1981 Jul 21;91(2):379-80およびJ Mol Biol.1981 Mar 25;147(1)195-7.1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最適な単独領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた、本技術分野で公知であり、たとえば、プログラムのＢＬＡＳＴファミリー（www.ncbi.nlm.nih.govにて、ＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能、Altschul D Sら,1990 J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3)403-10,Proc Natl Acad Sci USA.1990 Jul;87(14):5509-13, Altschul S Fら,Nucleic Acids Res.1997 Sep 1;25(17):3389-402)およびFASTA(Pearson W R,Methods Enzymol.1990;183:63-98.Pearson J Mol Biol.1998 Feb 13;276(1):71-84）がある。
【００８０】
本発明にしたがって使用可能である、可溶性レセプターのムテイン、またはそれをコードする核酸には、本明細書で表された教義およびガイダンスに基づいて、必要ない実験なしに、当業者によって通常得ることが可能である、置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして、本質的に相当する配列の限定組が含まれる。
【００８１】
本発明にしたがったムテインに関する好ましい変化は、「保存的（conservative）」置換として知られているものである。本発明の可溶性レセプターの保存的アミノ酸置換には、基のメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存する、十分に類似の生理化学的特性を有する基内の同義アミノ酸が含まれ得る（Ｇｒａｎｔｈａｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７４ Ｓｅｐ ６；１８５（４１５４）：８６２−４）。アミノ酸の挿入および欠損がまた、それらの機能を変化することなく、好ましくは挿入または欠損が、数個のアミノ酸、たとえば１３以下、好ましくは１０以下にのみ関連し、機能的配座に対して必須であるアミノ酸、たとえばシステイン残基を除去または置換しない、以上で定義した配列で実施してよい。そのような欠損および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインが、本発明の範囲内である。
【００８２】
好ましくは、同義アミノ酸基は、表１で定義されたものである。より好ましくは、同義アミノ酸基は、表２で定義されたものであり、もっとも好ましくは、同義アミノ酸基は表３で定義したものである。
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
本発明での使用のための、本発明の可溶性レセプターのムテインを得るために使用可能である、タンパク質内のアミノ酸置換の産生の例には、Ｍａｒｋらに付与された米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらに付与された第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらに付与された第４，９６５，１９５号、Ｃｈｏｎｇらに付与された第４，８７９，１１１号、Ｌｅｅらに付与された第５，０１７，６９１号で表されたような任意の公知の方法段階、および米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）にて表されたリジン置換タンパク質が含まれる。
【００８７】
本明細書で使用するところの「機能的誘導体（functional derivatives）」は、残基上の側鎖として存在するか、本技術分野で公知の方法によって、Ｎ−またはＣ−末端基への添加物である官能基から調製し、薬理学的許容性を維持する限り、すなわち本発明の可溶性レセプターの活性と本質的に同様のタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性特性を与えない限り、本発明に含まれる、本発明の可溶性レセプターの誘導体、およびそれらのムテインをカバーしている。
【００８８】
「機能的誘導体」にはまた、変化が、任意の従来の方法によって、可溶性レセプターを作製するアミノ酸の配列内に導入された、可溶性レセプターを作るマルチマーが含まれる。これらの変化には、可溶性レセプター分子の延長または切断、または可溶性レセプターを作製している１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠損または置換が含まれ得る。以上の変化のどれもが、可溶性レセプターの結合特性に影響を与えないことが理解される。
【００８９】
これらの誘導体には、たとえば、抗原部位をマスクし、体液中の本発明の可溶性レセプターの残余をのばし得る、ポリエチレングリコール側鎖が含まれ得る。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級または二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部位と形成したアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえばアルカノイルまたはカルボン酸アロイル基）、またはアシル部位と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえばセリルまたはスレオニル基のもの）が含まれる。
【００９０】
本発明にしたがった「活性画分（active fraction）」は、たとえば、本発明の可溶性レセプターの断片であり得る。語句断片は、任意の分子のサブセットを意味し、すなわち、より好ましい生物学的活性、たとえばリガンドへの結合を残した、より短いペプチドである。断片は、可溶性レセプター分子のいずれかの末端からアミノ酸を取り除き、ＴＮＦへ結合するその特性に関して、得られた断片を試験するために調製し得る。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端いずれかから、一度に１つのアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが知られており、望む生物学的活性を残す、そのようにして決定された断片が、従来の実験のみによって生じる。
【００９１】
本発明の可溶性レセプターの活性画分、そのムテインおよび融合タンパク質として、本発明はさらに、画分が、本質的に、本発明の可溶性レセプターと本質的に等しい活性を持つという条件で、単独で、または結合する関連分子または残基、たとえば糖またはリン酸残基と結合した、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体、またはそれらによる、タンパク質分子または糖残基の凝集物をさらに、カバーしている。
【００９２】
またさらなる実施様態において、本発明にしたがった基質には、免疫グロブリン融合物が含まれ、すなわち、本発明にしたがった分子が、免疫グロブリンのすべてまたは一部に融合する。免疫グロブリン融合タンパク質を作製するための方法は、たとえば、国際公開第０１／０３７３７号パンフレットで記述されたもののように、本技術分野でよく知られている。当業者は、得られた本発明の融合タンパク質が、キメラタンパク質の生物学的活性を維持することを理解するであろう。得られた融合タンパク質は、理想的に、体液中の残留時間の延長（半減期）、特定の活性の増加、発現レベルの増加、または融合タンパク質の精製の促進のような、改善された特性を持つ。
【００９３】
好ましくは、本発明にしたがった基質は、Ｉｇ分子の定常領域に融合する。たとえばヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような、重鎖領域に融合し得る。たとえば、アイソマーＩｇＧ２またはＩｇＧ４、またはＩｇＭまたはＩｇＡのような他のＩｇクラスのような、Ｉｇ分子の他のアイソマーもまた、本発明にしたがった融合タンパク質の産生のために好適である。融合タンパク質は、一量体または多量体、ヘテロまたはホモ多量体であり得る。
【００９４】
本明細書での語句「塩」は、可溶性レセプター分子またはその類似物の、カルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸添加塩両方を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野で公知の方法によって形成され、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩などの無機塩、トリエタノールアミンのような、アミンと形成されたもの、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどの有機塩基との塩が含まれる。酸添加塩には、たとえば、塩酸または硫酸のような、ミネラル酸との塩、およびたとえば酢酸またはオキサロ酸のような有機酸との塩が含まれる。もちろん、任意のそのような塩は、ＴＢＰの生物学的活性、すなわちＴＮＦに結合する能力を維持しなければならない。
【００９５】
本明細書で使用するところの語句「円順列（circularly permuted）」は、末端が、直接またはリンカーを介してのいずれかで互いに結合し、環状分子を形成し、この環状分子が、他の部分で開裂し、本来の分子中の末端からはことなる末端を持つ、新たな直鎖分子を産生する、直鎖分子を意味する。環状置換には、その構造が、環状化し、開裂した分子と等しい分子が含まれる。したがって、環状置換分子は、ｄｅ ｎｏｖｏで、直鎖分子として合成し、環状化および開裂段階を介さなくてよい。分子の特定の環状置換が、そのあいだのペプチド結合が消去されるアミノ酸残基を含むブラケットによって設計される。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む、環状置換分子は、一本鎖分子であり、しばしばリンカーと結合した、その通常の末端を持ち、他の部位で新規の末端を持つ。両方が本明細書で参考文献によって含まれている、ＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６５：４０７−４１３（１９８３）およびＰａｎらＧｅｎｅ １２５：１１１−１１４（１９９３）を参照のこと。環状置換は、機能的に、直鎖分子をとること、末端を融合して環状分子を形成すること、ついで環状分子を異なる部位で切断し、異なる末端を持つ、新規の直鎖分子を形成すること、と等価である。環状置換はしたがって、異なる場所にて新規の末端を形成する一方で、タンパク質のアミノ酸の配列と同一性を本質的に保存する効果を持つ。
【００９６】
可溶性レセプターを、エフェクター分子にエフェクターするための手順は、後者の化学的構造にしたがって変化し得る。好ましい実施様態において、エフェクター分子は、タンパク質であり、標的化可溶性レセプターに対するその融合（または結合）が、組換え体法によって好ましく実施され得る。２つのタンパク質をコードする遺伝子を、ｃＤＮＡとして、または当業者に公知の任意のクローニング手順によってゲノムの形態で、単離可能である。可溶性レセプターおよびエフェクタータンパク質はまた、化学的にエフェクター可能である。これは、ピアス ケミカル カンパニー（Pierce Chemical Company）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩＩから入手可能なもの（たとえば、ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）のような、二機能性リンカー分子を用いて実施可能である。
【００９７】
可溶性レセプターとエフェクター分子間のカップリング（または連結）は、直接、または連結分子および／またはたとえばアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド、スルフィジル基、ポリマーなどのような、任意の種類のリンカーであり得るスペーサーを介してであり得る。
【００９８】
リンカーは、キメラの局在化または内部化に際して、破壊され得る分子であり得る。
【００９９】
１つの実施様態において、本発明のキメラ分子は、組換え体ＤＮＡ法を用いて合成（または産生）される。一般的に、これには、キメラタンパク質をコードする、任意に原核細胞内での分泌のためのシグナルペプチドもまたコードする、ＤＮＡ配列を作製すること、このＤＮＡを特定のプロモーターの制御下で、発現カセット中に入れること、真核細胞（たとえば、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３、ＴＨＰＩ、酵母細胞および昆虫細胞）、または原核細胞（たとえば大腸菌細胞）のような、組換え体培養宿主細胞内でタンパク質を発現させること、発現したタンパク質を単離すること、および必要であれば、タンパク質を再変性させること、が含まれる。
【０１００】
キメラタンパク質をコードする核酸配列は、種々の宿主細胞内で発現させ得る。細胞毒性部位を含むキメラタンパク質の場合、細胞毒性部位の細胞破壊効果に耐性の宿主細胞が選択される。
【０１０１】
いったん発現したならば、組換え体キメラタンパク質を、硫酸アンモニア沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、本技術分野で標準の手順にしたがって精製可能である。
【０１０２】
発現および精製の後、キメラは、構成ポリペプチドの天然の配座とは本質的に異なった配座を持ち得る。この場合、ポリペプチドを変性および還元し、ついで、ポリペプチドを好ましい配座に再折りたたみさせる必要があり得る。
【０１０３】
変性は、組換え体タンパク質を含む未精製物質を、カオトロピック試薬（たとえば尿素＜またはグアニジンＨＣｌ）、還元剤および高ｐＨの組み合わせに曝露することによって達成する。これらの条件によって通常、封入体内のタンパク質の可溶化および変性が起こる。結果として、タンパク質の透明な溶液が得られる。この段階で、タンパク質は、二次または三次構造を持たずに、完全に開裂する。次の段階は、ｐＨ、還元試薬およびカオトロピック試薬の極端な条件を緩やかにし、タンパク質の折りたたみを可能にすることである。タンパク質のその天然の三次構造へ折りたたまれる能力は、その一次構造によって示唆される。したがって、カオトロピックおよび還元試薬濃度を低下させること、ｐＨを下げることが通常十分である。しかしながら、ときおり、条件の適正化が必要となる。
【０１０４】
本発明は、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０５】
本発明は、ＴＢＰ−ＰＥのような本発明のキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩をコードするＤＮＡまたは発現ベクターと、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０６】
組換え体キメラタンパク質、および本発明のキメラタンパク質を含む医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈内のためにとりわけ有用である。非経口投与のための組成物は、一般的に、キメラタンパク質の溶液、または許容可能な担体、好ましくは水性担体内に溶解したそのカクテルを含む。種々の水性担体、たとえば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水などが使用可能である。
【０１０７】
基質は、種々の方法にて、必要としている患者に投与可能である。投与経路には、肝臓内、皮内、経皮（たとえば、徐放処方中）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮内、経口、硬膜外、局所および鼻内経路が含まれる。たとえば上皮または内皮組織を介した吸収、またはインビボにてキメラタンパク質が発現し、分泌する、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ分子を（たとえばベクターを介して）患者に投与する遺伝子治療によっての、任意の他の治療的に効果的な投与経路を使用可能である。さらに、基質を、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、希釈液および担体のような、生物学的に活性な試薬の他の成分と一緒に投与可能である。
【０１０８】
非経口（たとえば静脈内、皮内、筋肉内）投与のために、キメラタンパク質を、薬学的に許容され得る非経口担体（たとえば水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性（たとえばマンニトール）または化学安定性（たとえば保存剤および緩衝液）を維持する添加物との組み合わせで、溶液、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末として処方可能である。処方は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
【０１０９】
「薬学的に許容され得る（pharmaceutically acceptable）」の定義は、活性成分の生物学的活性の効果に干渉せず、投与される宿主に対して毒性でない、任意の担体を含むことを意味する。たとえば、非経口投与のために、基質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液のような賦形剤中で、注射のためのユニット投与形態中に処方可能である。
【０１１０】
任意に薬学的に許容され得る担体と一緒に、ＴＢＰ−ＰＥのようなキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を、必要としている患者に投与することを含む、疾患を治療するために方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【０１１１】
組成物の単独または多重投与を、患者によって必要とされ、認容される用量および頻度に依存して投与し得る。これらの処方中のキメラ分子の濃度が、治療効果を得るために十分な量の分子を、体に送達するように設計される。自己免疫疾患の場合、組成物を、自己免疫疾患の経過および重傷度に影響を与えるのに十分な量のキメラを送達し、患者の状態を改善するように設計し、疾患の減退または緩和を導く。有効量は、投与経路、治療される疾患、患者の状態に依存する。
【０１１２】
本発明のキメラタンパク質の種々の使用のなかで、タンパク質の毒性活性によって削除され得る、特定のヒト細胞によって引き起こされる疾患または状態のような、疾患の治療のための医薬品の製造においての使用がある。１つのアプローチは、敗血性ショック、移植片−対−宿主疾患（ＧＶＨＤ）、マラリア、感染性肝炎、結核のような急性疾患、ならびに、慢性ＧＶＨＤ、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患および乾癬のような慢性疾患を含む、ＴＮＦが病原的役割を果たすか、疾患の経過に関与する疾患の治療である。他のアプローチは、キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している悪性細胞によって引き起こされる、癌の治療のためのものである。キメラタンパク質をまた、インビトロまたはインビボで、たとえば、自己移植前に骨髄からまたは自己末梢血細胞からの、有害な細胞の除去のために、使用してよい。
【０１１３】
本発明が、その特定の実施様態に関して記述されているが、さらなる改変の可能性があることが理解される。本明細書は、一般的に本発明の原理にしたがって、付随する請求項の目的内にしたがって、本発明が属する技術分野内での公知または一般的な実施内にあり、本明細書以上で列記された必須の特徴に適用可能であるように、本開示物からの逸脱を含んで、本発明の任意のバリエーション、使用または適合をカバーする意図がある。
【０１１４】
雑誌記事または要約、公示されたまたは公示されていない米国または外国特許明細書、付与された米国または外国特許、または他の任意の参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献が、引用された参考文献内で示されたすべてのデータ、表、図および文書を含んで、本明細書で参考文献によってすべてが組み込まれている。さらに、本明細書でで引用された参考文献内にて引用された参考文献のすべての内容もまた、参考文献によってすべてが組み込まれている。
【０１１５】
公知の方法段階、従来の方法段階、公知の方法または従来の方法に対する参照は、本発明の任意に観点、記述または実施様態が、関連技術分野で開示、教授または指摘された許可ではない。
【０１１６】
特定の実施様態の以上の記述によって、（本明細書で引用した参考文献の内容を含む）本技術分野内の知識を適用することによって、本発明の一般的なコンセプトから逸脱することなしに、不必要な実験なしに、種々の適用に対して、そのような特定の実施様態を簡単に改変および／または適合可能である、本発明の一般的な特徴を完全に明らかにする。したがって、そのような適合および改変が、本明細書で示された教義およびガイダンスに依存して、開示された実施様態の等価物の範囲の意味の範囲内であることが意図される。本明細書の用語または語法が、記述の目的であり、制限の目的ではなく、本明細書の語法および語句が、当業者の知識と組み合わせで、本明細書で示された教義およびガイダンスに関して、当業者によって解釈されることが理解されるべきである。
【０１１７】
本発明はここで、以下の非限定実施例および付随する図面にて、より詳細に記述される。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分（ＴＢＰＩ）、およびシュードモナスエクソトキシンのドメインＩＩ、ＩｂおよびＩＩＩを含む、シュードモナスエクソトキシン４０ｋＤａ断片を含む、キメラ遺伝子（本明細書でＴＢＰ−ＰＥと呼ぶ）の構築
図１Ａにて略図的に示したように、キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子（図１Ｃ、配列番号：１）を調製するために、ＴＢＰ（ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分）およびシュードモナスエクソトキシンのドメインＩＩ、ＩｂおよびＩＩＩを含む、ＰＥ（シュードモナスエクソトキシンの４０ｋＤａ断片）をコードする各ＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって増幅し、融合させた。
【０１１９】
ｐ５５ ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｍ７５８６６）の可溶性形態のアミノ酸配列は、ヒト尿から単離されたこのレセプターの可溶性形態（ＴＢＰＩ）の主要な種類のもの（米国特許第５，８１１，２６１号）に相当し、レセプターの細胞外ドメイン中Ａｓｐ４１〜Ａｓｎ２０１まで伸びる（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ−受け入れ番号：Ｐ１９４３８）。
【０１２０】
ＴＢＰＩを、全長ＴＮＦＲＩ（プラスミドｐｃ５５）を鋳型として（Ｎｏｐｈａｒら、１９９０にて記述された、プラスミドｐｃ５５）そして以下のプライマーを使用して、（べーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）からのＨｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑポリメラーゼでの）ＰＣＲ（１）増幅によって単離した。
【０１２１】
このプライマーは、ＮｄｅＩ制限部位（発現ベクター内にキメラ遺伝子を挿入するために、後に必要である）、続いてＴＢＰＩの５’末端と重なる２０ヌクレオチドを持つ（コード配列をイタリック体で示す）。
【０１２２】
このプライマーは、ＴＢＰＩの通常３’末端と重なる２２ヌクレオチドと、続いてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードするヌクレオチド（ＴＢＰＩをコードするＤＮＡを、ＰＥをコードするＤＮＡにライゲーションするために後に必要である）を持つ。
【０１２３】
シュードモナス アエルギノーサ（Pseudomonas aeroginosa）エクソトキシンＡ型遺伝子（受け入れ番号Ｋ０１３９７、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）のヌクレオチド１５７７−２６５９に相当するＰＥをコードするＤＮＡ（図１Ｅ、配列番号：３）を、シュードモナス アエルギノーサのセロタイプ６１のゲノムＤＮＡ（Leitner G.Kimron Veterinary Institute,Israel）を鋳型として、そして以下のプライマーを使用して（べーリンガーマンハイムからのＨｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑポリメラーゼでの）ＰＣＲ２増幅によって単離した。
【０１２４】
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（イタリック体）を含み、６アミノ酸Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕのリンカー、およびＰＥトランスロケートドメインのヌクレオチド１５７７−１６０３（太字）をコードする。
【０１２５】
ＥｃｏＲＩ制限部位（イタリック体）、終止コドン（ｔｔａ）およびＰＥ ＡＤＰ−リボシル化ドメインのヌクレオチド２６５９−２６７９（太字）を含む。
【０１２６】
１０５８ｂｐのＰＣＲ２産物が得られた。
【０１２７】
キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子を得るために、ＰＥを含むＰＣＲ２断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を介して、ＴＢＰＩを含むＰＣＲ１断片の３’−末端にライゲートした。キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位で、ｐＥＴ５−ベクター内に挿入した。本明細書でｐＴＢＰ−ＰＥと呼ぶ、キメラＴＢＰ−ＰＥ遺伝子をコードするベクターを、大腸菌株（ＤＨ５α）内に形質導入し、増幅した。
【０１２８】
実施例２：細菌細胞内でのＴＢＰ−ＰＥの産生
ＴＢＰ−ＰＥベクター（ｐＴＢＰ−ＰＥ）を含む、細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓを、０．４％グルコース、１．６８ｍＭ ＭｇＳＯ4および１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む１リットルのＳｕｐｅｒブロス中で、３７℃にて培養した。６００ｎｍでの吸収が、２．６にｎ達したときに、組換え体タンパク質発現の誘導を、培養液に、最終濃度１ｍＭで、ＩＰＴＧ（イソプロピル ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）を、約９０分間添加することによって実施した。細菌細胞を、４℃にて１０分間、７５００×ｇにて遠心することによって、培養液から回収し、細胞ペレットを、−７０℃にて１６時間凍結した。
【０１２９】
凍結した細胞ペレットを、氷上で溶かし、２２０ｍｌの緩衝液Ａ［カルシウムおよびマグネシウムなしのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳｗ／ｏ）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＳＯ4、完全プロテアーゼカクテルの４錠（ロッシュ（Roche）、３０ｍｇ／ｌ ＤＮａｓｅＩ（シグマ（Sigma））中に再懸濁させた。
【０１３０】
細胞クランプを絶縁するために、細菌懸濁液を、椎間板１８Ｇニードルを介して通した。細菌溶解物および封入体単離を、以下の方法のいずれかによって実施した。
【０１３１】
方法Ｉ：５０００ｐｓｉで、ついで１５０００ｐｓｉにて２回、最初のＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ３×３５ｍｌの細胞。ついで溶解した細胞を、ＳＳ−３４ローターを用いて、Ｓｏｒｖａｌ遠心上、１５，０００ｒｐｍにて、４℃５０分（２７，０００×ｇ）で遠心した。ペレットを、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１６０ｍｌの「ＰＢＳ ｗ／ｏ」中に懸濁し、２２ｍｌの２０％ トリトンを添加し、室温にて５〜１０分間インキュベートした。封入体を、２７，０００×ｇにて４℃５０分間の遠心によって沈殿させた。トリトンでの封入体の洗浄を２回繰り返し、トリトンなしで、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１６０ｍｌのＰＢＳにて３回洗浄した。
【０１３２】
方法ＩＩ：８１ｍｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ／２０ｍｌ ＰＢＳ（２０ｍｌのＰＢＳ中Ｌｙｓｏｚｙｍｅの４０５％溶液）を、１１０ｍｌの細菌細胞に添加した。細胞を３０分間室温にて攪拌し、氷に移し、１分間３回超音波処理した。１６ｍｌの２０％トリトン（３％最終濃度）を添加し、封入体を単離し、方法Ｉでのように洗浄した。
【０１３３】
（ＳＤＳＰＡＧＥおよびＡＤＰリボシラーゼ活性によって判断した、それぞれ図２および３）ほとんどの組換え体タンパク質を含む封入体を、５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む、８Ｍ 尿素、ｐＨ１２〜１２．８を含む変性溶液中に溶解した。使用した変性溶液の容量は、封入体湿重量の４４３倍と等しかった。封入体の完全な溶解を促進するために、激しくボルテックスして、超音波処理した。
【０１３４】
タンパク質を、ｐＨ９．５での５０ｍＭホウ酸緩衝液で、約１０〜２０倍希釈し、緩やかに攪拌しながら（２００ｒｐｍ）、４℃にて１８〜２０時間インキュベートすることによって再変性させた。
【０１３５】
２．５リットルの再折りたたみタンパク質を、超濾紙ＰＭ３０（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を介した超遠心によって１５倍に濃縮し、濃縮したタンパク質の最終濃度は、約１７０ｍｌであった。再折りたたみ未精製タンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬で推定し、約７０μｇ／ｍｌであった。ＴＢＰ−ＰＥキメラタンパク質は、（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質バンドのデンシトメトリーより）再折りたたみ未精製タンパク質の約６０％であると推定された。したがって、１リットルの細菌培養液から、約７．６５ｍｇのＴＢＰ−ＰＥキメラが得られ、または５００ｍｇ封入体から、３％の再折りたたみ未精製タンパク質がえられ、そのうち６０％が、ＴＢＰ−ＰＥキメラであった。
【０１３６】
図２Ａは、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質が、アミノ酸配列から推測される、約５７ｋＤａの正確な大きさをもったことを示している。
【０１３７】
実施例３：ＴＢＰ−ＰＥキメラのアフィニティー精製
ＴＢＰ−ＰＥキメラを、抗ＴＢＰ−１架橋カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって、実施例２のＴＢＰ−ＰＥを含む再折りたたみ未精製抽出物から精製した。
【０１３８】
抗ＴＢＰ−Ｉ架橋カラムを調製するために、２ｍｌｓ．のタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（またはウサギ抗体のためにタンパク質Ａ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を、５０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．５〜８．０）で３回洗浄した。２０ｍｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．５−８．０中の６ｍｇのモノクローナル抗−ＴＢＰＩ抗体クローン２０．１１（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２５６（２４）１４４９７−５０４ １９９０）（４００μｌのストック １６．７ｍｇ／ｍｌ）を、洗浄したタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加し、約２２℃にて１．５時間攪拌しながらインキュベートし、１０容量の０．２Ｍ ホウ酸緩衝液（ＮａＯＨにてｐＨ９．０）で２回洗浄した。４ｍｌホウ酸緩衝液中の１００μｇ架橋剤（ＤＭＰ、ＰＩＥＲＣＥ）（抗体に対して、架橋剤が、３０倍モル過剰）を、Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅと抗体溶液に添加し、３０分間インキュベートした。２０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を、反応を停止するために添加し、溶液を捨てた。２０ｍｌの同様の緩衝液を１５分間添加し、溶液を捨て、２０ｍｌの同一の緩衝液を１５分間、氷上で添加した。Ｇ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５中の１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、ついで、ｐＨ２．０で緩衝液で洗浄し、タンパク質Ｇに共有的に結合しなかった、抗体を除去した。
【０１３９】
ｐＨ８．８での１０ｍＭ Ｔｒｉｓの溶液を使用して、ＴＢＰ−ＰＥの精製のためのカラムを保存した。
【０１４０】
実施例２からのホウ酸緩衝液中の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥを、アフィニティークロマトグラフィーカラムにのせ、カラムを１０倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。タンパク質を、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５中の１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。０．５〜１ｍｌの画分を回収し、光学密度を、２８０ｎｍで測定した。図２Ｂは、抗ＴＢＰＩモノクローナル抗体で検出した、溶出画分からの（２０ｕｌμｌ）試料のウェスタンブロット解析を示している。図２Ｂで要約した結果は、ＴＢＰＩのアミノ酸配列から予想されたＭＷは１７ｋＤａであるが、ＴＢＰＩの見かけのＭＷは、この真核細胞（ＣＨＯ）中で産生されたＴＢＰ−Ｉ標準のグリコシル化によって、より高く、約３４ｋＤａであったことを示している（図２Ｂ、ライン８）。抗ＴＢＰＩ抗体が、アフィニティークロマトグラフィーカラムに対して、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質を認識し、結合すること、およびＴＢＰ−ＰＥの実際の分子量が約５７ｋＤａであることが示された（図２Ｂ、ライン１〜７）。
【０１４１】
実施例４：インビトロでの、ＴＢＰ−ＰＥタンパク質のＡＤＰ−リボシル化活性
実施例を実施することにおいて、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＢＰＩ抗体によって認識されることが示された。以下の実験は、ＴＢＰ−ＰＥが、伸張因子ＩＩ（ＥＦ−２）をＡＤＰ−リボシル化可能であるかどうかを評価するために実施した。シュードモナスエクソトキシンの毒性は、タンパク質合成を阻害するエクソトキシンの能力による。エクソトキシンは、ＮＡＤ+が存在する条件で、アミノ酸のタンパク質内への取り込みをすばやく阻害する。シュードモナスエクソトキシンの存在において、ＮＡＤ+の二リン酸アデノシンリボース部位が、伸張因子ＩＩ（ＥＦ−２）との共有結合内に移され、因子の不活性誘導体が産生される。毒素は、この反応において触媒的に働く。
【０１４２】
ＮＡＤ+＋ＥＦ−２→ＡＤＰ−リボース−ＥＦ−２＋ニコチンアミド＋Ｈ+（Collier R.J.ら.1971）
ＴＢＰ−ＰＥキメラのＡＤＰ−リボシル化活性を調査するために、再折りたたみキメラ、または封入体の分離前後の未精製大腸菌溶解物を含む試料を、２００μｌのＴＥ−５０（Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ、ｐＨ８）および２０μｌの小麦麦芽からのＥＦ−２（シグマ）を含む溶液中でインキュベートした。ついで１０μｌのＮＡＤ+−14Ｃを添加し、反応混合液を短くボルテックスし、３７℃にて２０分間インキュベートして、すべてのＮＡＤ+−14Ｃを、ＴＢＰ−ＰＥによって誘導されたＥＦ−２に組み込ませた。２０分のインキュベーションに続いて、タンパク質を、０．５ｍｌの１０％ＴＣＡの添加（ボルテックス）と遠心（４℃にて５分間、３０００ｒｐｍ）によって沈殿させた。上清を捨てたのち、ペレットを１ｍｌの１０％ＴＣＡで洗浄し、１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨを１０分間添加し、頻繁に混合し（ボルテックス）、ペレットを溶解させた。１０分後、０．４ｍｌの０．４Ｍ酢酸を添加し、混合した。放射活性ラベルのタンパク質内への組み込みを、ガンマ計数器中で、４ｍｌのシンチレーション溶液中で測定した。
【０１４３】
図３で示したように、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化が、１０μｌの（可溶性タンパク質および封入体を含む）未精製組換え体大腸菌溶解物タンパク質によって誘導され、約半分の活性が、２倍の同様の未精製溶解物を用いて観察された。非常に低いＡＤＰ−リボシル化活性が、可溶性タンパク質画分（Ｆｒｅｎｃｈプレスの後に得た上清）にて観察可能であった。この結果は、ほとんどのキメラタンパク質が、封入体内に存在することを確認した。
【０１４４】
図３で要約した、得られた結果は、（実施例２の変性封入体からの）再折りたたみＴＢＰ−ＰＥタンパク質が、ＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性を有することを示している。折りたたみタンパク質のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性のレベルが、（可溶性タンパク質および封入体両方を含む）未精製溶解物のものと同等であった。しかしながら、未精製溶解物のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性とは反対に、再折りたたみタンパク質のＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性が、反応中で使用した再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量とともに増加した。
【０１４５】
実施例５：酵素結合免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）による再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの定量と、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥのＴＮＦに対する結合活性
未精製ＴＢＰ−ＰＥの濃度をまず、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬で推定し、約７０μｇ／ｍｌであるとわかり（実施例２を参照のこと）、ついでウェスタンブロットのデンシトメトリー解析（図２Ａ）によって、約４５μｇ／ｍｌであるとわかった。
【０１４６】
ＴＢＰ−ＰＥの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。この目的のために、ＰＶＣマイクロタイタープレートを、５０μｌのモノクローナル抗−ＴＢＰＩ抗体（ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）クローン２０でコートした（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２６５（２４）１４４９７−５０４ １９９０）。３７℃にて２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳにて三回洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにて、３７℃にて２時間ブロックした。ＴＢＰＩの試料（組換え体ＣＨＯ細胞から調整、要確認）、またはＴＢＰ１−ＰＥの試料を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１％ヘモグロビン、０．６５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％ ＮＰ４０を含むＰＢＳ中で連続希釈した。５０μｌの希釈試料をウェルあたりに、三重で適用し、３７℃にて１時間インキュベートし、ブロット（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄した。１：１０００に希釈したポリクローナルウサギ抗ＴＢＰＩ抗体を、３７℃にて１時間、または４℃にて一晩、ブロット中に適用し、同様の溶液で５回洗浄した。１：２０００希釈した二次抗体、抗−ウサギ−ＨＲＰを、３７℃にて１時間ウェルに適用し、ウェルをブロットにて５回洗浄した。０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含む、１００μｌの新鮮に調製したＡＢＴＳ溶液（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸、シグマ、カタログＡ−１８８８）をウェルに添加し、３７℃にて３０分間インキュベートし、発達した緑色の密度を４０５ｎｍで測定した。
【０１４７】
得られ、図４Ａで要約した結果が、ＥＬＩＳＡによって７５μｇ／ｍｌとわかったＴＢＰ−ＰＥの濃度が、Ｂｒａｄｆｏｒｄによってわかった、約４５μｇ／ｍｌの濃度と近かったこと、および再折りたたみＴＢＰ−ＰＥおよびＴＢＰＩが、同様の効果で、抗−ＴＢＰＩ抗体によって認識されたこと、を示している。
【０１４８】
以下の実験で、ＴＢＰＩおよびＴＢＰＩ−ＰＥのＴＮＦコートプレートへの結合を比較した。ＰＶＣ９６−ウェルマイクロタイタープレートを、４℃にて１６時間、０．０２％ ＮａＮ3を含む０．１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ９．６中の、２μｇ／ｍｌの純粋なヒトＴＮＦ−α（ベイト−ハエメック（Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ）の溶液で、プレートをインキュベーションすることによって、ＴＮＦでコートした。ついでプレートをＰＢＳでリンスし、０．２ｍｌ／ウェルの、３％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3（ブロッキング溶液）を含むＰＢＳで、３７℃にて３時間インキュベートした。５０μｌの再折りたたみＴＢＰ−ＰＥ（４５μｇ／ｍｌ）またはヒトＴＢＰＩ（７６μｇ／ｍｌ）の試料を、三重に、ウェルあたり適用し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。必要な場合に、試料を、ブロッキング溶液で希釈した。１時間のインキュベーションの後、プレートをブロッキング溶液で３回洗浄した。ブロッキング溶液中１：１０００で希釈した、５０μｌのウサギ抗−ＴＢＰＩ抗体をウェルに添加し、１時間３７℃、または４℃にて一晩、インキュベートし、ブロッキング溶液で３回洗浄した。１：２０，０００希釈での、５０μｌの二次抗体、抗−ウサギ−ＨＲＰをウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートし、ブロッキング溶液で３回洗浄した。０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含む１００μｌの新鮮に調製した溶液ＡＢＴＳを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。ＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩの、プレートに対する結合を、その強度を４０５ｎｍにて測定した、緑色の発現によって測定した。
【０１４９】
図５Ａ〜Ｂにて要約したＴＮＦ−結合アッセイの結果が、２０ｎｇの未精製再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、５ｎｇのＴＢＰＩとほぼ同様の活性であることを示している（図５Ａ）。図５Ｂは、ＴＮＦ結合活性を持っている、未精製再折りたたみキメラタンパク質の割合を示している。ＴＢＰＩの活性を１００％ＴＮＦ結合として使用すると、少なくとも５０％の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＮＦ結合活性を持つことがわかった。
【０１５０】
実施例６：その表面上にＴＮＦを過剰発現している細胞株
２つの細胞株を、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果を探索するために使用した。（ａ）（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅから得た）ヒト急性単球性白血病ＴＨＰＩ細胞。これらの細胞の単球性分化を、ホルボールミリスチル酸酢酸（ＰＭＡ）で誘導可能である。これらの細胞を、１０％Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸、１％ 非必須アミノ酸、９ｍｇ／ｍｌ インスリン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含む、ＲＰＭＩ１６４０培養中、０．３〜１×１０6／ｍｌの細胞密度範囲で培養する。細胞表面ＴＮＦ発現を促進するために、（１６〜２０時間、１００ｎｇ／ｍｌ）ＰＭＡにて活性化したこれらの細胞を、ＬＰＳ（１ｍｋｇ／ｍｌ、１．５時間）で処理し、１０μｇ／ｍｌ メタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））で、試験の前に２時間処理した。
【０１５１】
ｂ）ＨｅＬａ−Ｍ９細胞、位置＋２でのアルギニンおよび位置＋３でのセリンが、スレオニンに置換されているヒトＴＮＦムテインｃＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、構成的に発現する、上皮ＨｅＬａ子宮頸癌のクローン。これらの変異によって、２６ｋＤａ ＴＮＦの開裂速度が、約１０倍減少する。細胞を、１０％ Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１５２】
ＴＨＰＩ細胞の細胞表面上のＴＮＦ−発現を、ＴＮＦ−αの削減を防止するために、メタロプロテアーゼＧＭ６００１の阻害剤、１０ｍｇ／ｍｌ（カルビオケム）の存在下で、ＦＡＣＳによって査定した。５×１０5細胞の試料を、インスリン、１ｍｋｇ／ｍｌ、トランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌ、Ｎａセレン、１ｎｇ／ｍｌ、Ｎａピルビン酸、非必須アミノ酸、グルタミン、ＰＭＡ５０〜１００ｎｇ／ｍｌを含むＦｃｓを含まないＲＰＭＩ中で１６時間インキュベートした。ついで、ＬＰＳ大腸菌０１１１−Ｂ４を濃度１ｍｇ／ｍｌでＧＭ６００１、１０ｍｇ／ｍｌと一緒に、２時間添加した。細胞表面上でのＴＮＦ−発現のＦＡＣＳ解析のために、細胞を、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含む、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中にて４℃で洗浄し、ＦＩＴＣ−抗−ヒトＴＮＦ抗体とインキュベートした。解析は、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン．ディッキントン（Ｂｅｃｔｏｎ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって実施した。少なくとも３０％の細胞が、その表面上にＴＮＦ−αを発現することがわかった。
【０１５３】
実施例７：ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性
キメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥ（および対照として、可溶性ＴＮＦレセプターのみ）の細胞毒性活性を、両方が膜結合ＴＮＦを過剰発現している、２つの種類の細胞、上皮細胞および単球様細胞で試験した。
【０１５４】
ＨｅＬａ−Ｍ９細胞は、位置＋２でのアルギニンおよび位置＋３でのセリンが、スレオニンに置換されているヒトＴＮＦムテインｃＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、構成的に発現する、上皮ＨｅＬａ子宮頸癌のクローン株である。これらの変異導入によって、２６ｋＤａ表面ＴＮＦの開裂速度が、約１０倍減少する。細胞を、１０％ Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１５５】
ＨｅＬａ−Ｍ９、またはＨｅＬａを、ウェルあたり４×１０4細胞の密度にて、９６−ウェルプレート中にまいた。異なる濃度のＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩを、３時間ウェルに添加した。いくつかのウェルに、ＴＢＰＩを、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に適用して、ＴＮＦと競合させ、膜ＴＮＦ−αを介したＴＢＰ−ＰＥ活性の特異性を試験した。３時間のインキュベーションの後、培地を、組換え体タンパク質なしの培地のみで置換し、細胞を２４時間増殖させ、培養液の生存を、ニュートラルレッドを用いて査定した。
【０１５６】
得られた結果を図６Ａにて要約しており、６００ｎｇ／ｍｌのＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａ細胞に対して細胞毒性ではないが、その表面にＴＮＦ−αを過剰発現しているＨｅＬａ−Ｍ９細胞の死亡を引き起こしたことを示している。ＴＢＰＩは、１０倍過剰で適用したときに、ＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性効果を特異的にブロックした。ＴＢＰＩのみでは、７６μｇ／ｍｌまでの濃度で、細胞変性効果を引き起こさなかった。ＴＢＰ−ＰＥの２つの異なるバッチを試験し、同様の細胞毒性であることがわかった。図６Ａで示した結果が、ＴＢＰ−ＰＥが、６００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＨｅＬａＭ９細胞にて、９０％を超える細胞死を引き起こしたことを示している。ＴＢＰ−ＰＥの１つのバッチが、非常に活性であり、０．０６ｍｇ／ｍｌの低濃度で、細胞毒性であり、およそ６５％近くのＨｅＬａＭ９細胞を殺した。
【０１５７】
活性化単球様細胞株におけるキメラＴＢＰ−ＰＥの細胞毒性を調査するために、ＴＨＰＩ（実施例６を参照のこと）を、（単球様表現系およびＬＰＳレセプターの曝露を誘導するために）インスリン、１ｍｋｇ／ｍｌ、トランスフェリン、１ｍｇ／ｍｌ、Ｎａセレン、１ｎｇ／ｍｌ、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸、グルタミン、ＰＭＡ５０〜１００ｍｇ／ｍｌを含む、ウシ胎児血清（Ｆｃｓ）を含まないＲＰＭＩ中、９６−ウェルプレート中、ウェルあたり２００，０００細胞の密度で、１６時間まいた。ついで、大腸菌ＬＰＳ（０１１１−Ｂ４）を濃度１ｍｇ／ｍｌで、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でのＧＭ６００１（細胞表面からのＴＮＦの削除を予防するためのメタロプロテイナーゼ阻害剤）と一緒に、１〜１．５時間添加した。得られたＰＭＡ−ＬＰＳ−ＧＭ６００１−処理ＴＨＰＩ細胞が、多量の表面ＴＮＦを持つ単球細胞の表現系特性を示している。これらの単球様細胞株を、約２０時間、６０および６００ｎｇ／ｍｌの再折りたたみＴＢＰ−ＰＥとインキュベートし、生存を見積もるために、ナチュラルレッドで染色した．示唆した時点で、組換え体ヒトＴＢＰ−１を、細胞表面ＴＮＦへの結合に関して競合するように、再折りたたみキメラタンパク質の直前に添加した。
【０１５８】
図６Ｂにて要約した結果で示したように、ＨｅＬａＭ９細胞の細胞毒性を引き起こしている濃度（６０および６００ｎｇ／ｍｌ）で使用した、ＴＢＰ−ＰＥが、活性化ＴＨＰＩの細胞死を引き起こさなかったことがわかった。
【０１５９】
再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの活性を、ＬＰＳ−活性化初代マクロファージ中でも試験した。初代マクロファージの調製のために、メスマウスＣ５７ＢＬ／６を、４日間、１．５ｍｌ無菌Ｂｒｅｗｅｒチオグリコレートブロス（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））とともに、腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。腹腔浸出物（＞８５％マクロファージ）を４日目に回収し、遠心によって、ＰＢＳにて洗浄し、１０％熱不活性化Ｆｃｓを含むＲＰＭＩ中、１×１００，０００マクロファージ／ウェルにて、９６−ウェル平底プレート中にまいた。細胞を１８時間接着させた。非接着細胞を、暖かい培地で洗浄して除去した。
【０１６０】
マクロファージ活性化を誘導するために、マクロファージ単層を、図６Ｃにて示した濃度（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）にて１時間、５ｍｇ／ｍｌ ＧＭ６００１（カルビオケム）の存在下で、ＬＰＳ（大腸菌ＬＰＳ０１１：Ｂ４）で処理した。ＬＰＳ処理の後、細胞を、６０００および１５０００ｎｇ／ｍｌ再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの存在下、または存在しない状態で、２時間以上インキュベートした。次に、培地を、同様の濃度のＬＰＳを含むが、ＧＭ６００１を含まない、ＲＰＭＩ＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＦｃｓ）で置換し、ＴＮＦ−αの細胞培養培地への分泌を可能にさせた。一晩培養したマクロファージの細胞培養培地を回収して、培地中のＴＮＦ−αをバイオアッセイによって測定した（以下および図６Ｄを参照のこと）。
【０１６１】
得られ、図６Ｃで要約した結果は、ＴＢＰ−ＰＥが、活性化初代マクロファージに対して細胞毒性ではなかったことを示している。
【０１６２】
ＴＢＰ−ＰＥで処理した、または未処理のＬＰＳ−活性化初代マクロファージの増殖培地中に分泌されたＴＮＦのレベルを査定した（図６Ｄ）。活性初代マクロファージの培地を回収し、新鮮な培地で、２、４および８倍（それぞれ０．５、０．２５、０．１２５）希釈し、（９６−ウェルプレート上）ウェルあたり、１×１０5細胞の密度でまいた、ＴＮＦ感受性細胞（Ｌ９２９）の単層に適用した。バイオアッセイを、１０ｍｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下で実施した。Ｌ９２９細胞（マウス結合組織クローンＬ９２９ ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を、活性化マクロファージの条件培地でインキュベートし、２０時間インキュベートした。Ｌ９２９細胞毒性のレベルが、条件培地中に存在するＴＮＦの濃度に比例した。
【０１６３】
図６Ｄで見られるように、チオグリコレート−処理マウスからのマクロファージが、ＴＮＦ−αを産生した。たとえば、チオグリコレート処理腹腔マクロファージの２または４倍希釈培地が、４０％を超えるＴＮＦ−感受性Ｌ９２９細胞の死を引き起こした。しかしながら、ＬＰＳによるさらなるマクロファージ活性化が、ＴＮＦ分泌を増加させた。たとえば、Ｌ９２９細胞死は、ＬＰＳ活性化マクロファージの細胞を高い（８倍）希釈条件培地に曝露したときに、６０％より高かった（図６Ｄ）。ＴＢＰ−ＰＥで処理した活性化初代マクロファージの条件培地が、ＴＢＰ−ＰＥ処理なしでの活性化マクロファージの条件培地と、Ｌ９２９に対して等しい毒性であることがわかった（図６Ｄ）。この結果によって、ＴＢＰ−ＰＥが、初代活性化マクロファージ中のＴＮＦ分泌を阻害しないことが示される。
【０１６４】
これらの結果は、ＴＢＰ−ＰＥが、活性化初代マクロファージの死を引き起こさず、ＬＰＳ活性化初代マクロファージにおけるＴＮＦ分泌を阻害しないことを示している。
【０１６５】
すべてにおいて、得られた結果が、ＴＢＰ−ＰＥが、治療的目的のために使用可能であり、とりわけ、ＴＮＦを過剰発現している上皮細胞を特異的に殺すことを示している。
【０１６６】
実施例８：ＴＢＰ−ＰＥによって仲介された、ＨｅＬａ Ｍ９細胞中でのタンパク質合成の阻害
ＨｅＬａ−Ｍ９およびＨｅＬａ細胞を、ウェルあたり、４×１０4の密度にて、９６−ウェル組織培養液プレート中に、アッセイの１日前にまいた。６００ｎｇ／ｍｌの濃度でのＴＢＰ−ＰＥを、３時間細胞に添加した。いくつかのウェルで、ＴＢＰＩを、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に適用して、ＴＮＦ結合に関して競合させた。３時間のインキュベーションの後、培地をＤＭＥＭ＋１０％Ｆｃｓで置換し、細胞を、１６時間さらに増殖させた。細胞をＰＢＳにて１回洗浄し、Ｍｅｔ、Ｃｉｓ−を含まないＲＰＭＩ中で１０分間、そして、１００ｍｌの３５Ｓ−Ｍｅｔ−含有、Ｍｅｔ、Ｃｉｓ−を含まないＲＰＭＩ（５５ｍｃＣｉ／１００μｌの35Ｓ−Ｍｅｔ）中で３０分間インキュベートした。３０分のインキュベーション後、培地を除去し、細胞をＭｅｔ、Ｃｉｓ−を含まないＲＰＭＩにて３回洗浄し、２００μｌ ＳＤＳ−緩衝液［ＰＢＳ中１％ ＳＤＳ、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ ＥＤＴＡ］中で溶解し、１００℃まで前加熱した。細胞溶解物をマイクロチューブに移し、５分間ゆで、５分間遠心した。上清（約１００μｌ容量）中のタンパク質を、ＴＣＡ沈殿にかけた。
【０１６７】
ＴＣＡ沈殿のために、０．５ｍｌ １０％の氷冷ＴＣＡおよび２０μｌの３％ ＢＳＡを、上清を含む試料に添加した。試料を１５分間、氷上で沈殿させ、５分間、４℃、３０００ｒｐｍにて遠心した。ＴＣＡ沈殿物を、１ｍｌ ＴＣＡおよび１００μｌの１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、１０分間インキュベートし、ボルテックスした。ペレットを完全に溶解させるために、０．４ｍｌの０．４Ｍの酢酸を溶液に添加し、激しく混合した。放射活性を、４ｍｌシンチレーション溶液中で測定し、ベータ−計数器中でモニタした。
【０１６８】
図７で示したように、６００ｎｇ／ｍｌほどのＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞中の約７０％のタンパク質合成を阻害するが、一方で、同量のＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａ細胞内のタンパク質の合成を減じなかった。ＴＢＰＩが、ＴＢＰＩをＴＢＰ−ＰＥと一緒に１０倍過剰で添加した時に、タンパク質合成において、ＴＢＰ−ＰＥの阻害効果を阻害することがわかった。ＴＢＰＩのみは、ＨｅＬａ−Ｍ９中またはＨｅＬａ細胞中いずれでもタンパク質の合成に影響を与えなかった。
【０１６９】
実施例９：内部化アッセイ
ＴＮＦ−α発現細胞（ＨｅＬａ Ｍ９または他）を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む培地中で、３７℃にて、［125Ｉ］−共役物（１μｇ／ｍｌ）で標識化した。ついで細胞をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％プロナーゼ中で再懸濁し、ジブチルフタレートを介する遠心の前に２Ｃにて４０分間維持した。エンドサイトーシス効率を、取り込み３０分後の、細胞関連［125Ｉ］−共役物のプロナーゼ−耐性割合として表す（Taupiac M-P.ら, 1999から変性された）。
【０１７０】
実施例１０：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
遠心によって回収した細胞ペレットを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶解させた。試料を、０．１％ＳＤＳ、１０％アクリルアミドスラブゲルに適用する前に５分間沸騰させた。ゲルをクーマシーブルーによって、または銀染色によって染色可能である。
【０１７１】
免疫ブロッティングのために、電気泳動後の試料を、ニトロセルロース紙にうつし、続いて、毒素に対する、またはＴＮＦレセプターの可溶性形態に対する抗体と反応させ、ついで（毒素−ヤギ抗−ウサギ抗体のため、可溶性ＴＮＦレセプター−ヤギ抗マウス抗体のため）ＨＲＰに連結した二次抗体を適用し、染色を、ＨＲＰ基質で実施した。可溶性ＴＮＦレセプターに対するモノクローナル抗体は記述したようである［１５］［１６］。
【０１７２】
実施例１１：動物毒性
６ヵ月齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．１μｇ／マウス〜４０μｇ／マウスの範囲で、種々の用量のキメラタンパク質（および、対照として、キメラタンパク質に組み込まれた毒素および可溶性ＴＮＦレセプター）を腹腔内に注射した。マウスの生存を、４８時間以降査定した。
【０１７３】
実施例１２：インビボでの、それらの表面上でＴＮＦを発現している腫瘍細胞に対するキメラタンパク質の活性
キメラタンパク質の、（そして対照として、キメラタンパク質に組み込まれた毒素の、および可溶性ＴＮＦレセプターの）インビボ細胞殺傷活性を、細胞結合ＴＮＦを産生する腫瘍を持つマウス中で査定した。ＨｅＬａ−Ｍ９細胞のコンフルエント培養を、ＰＢＳ中５ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、懸濁して、ＰＢＳにて２回洗浄した。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（７〜８週齢、２０〜２１ｇ体重）に、ＨｅＬａ−Ｍ９細胞（１×１０7細胞／０．１ｍｌ／マウス）で、フランク領域内で、皮下に移植した。５日後、マウスに、種々の用量の試験したキメラタンパク質を腹腔内に注射し、ついで、毎週１回再び注射した。細胞の移植部位での発生、大きさおよび質量を１１週後に査定した。
【０１７４】
実施例１３：関節炎の突発性発達に関するマウスモデルにおける、キメラタンパク質の治療活性
その発現の翻訳調節を提供する、３’非コード領域が、β−グロブリン遺伝子のものとともに発現した［１７］、ヒトＴＮＦトランスジーンを発現しているトランスジェニックマウスを使用した。生誕の２週間後、マウスに、種々の用量の試験したキメラタンパク質を腹腔内に注射し（以下を、対照としてマウスに注射するために使用する。毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみ）、ついで、９週間の間隔で、１週間に１回、再び注射した。マウスの後ろ足首関節の腫れを、関節の直径を決定することによって、定期的に査定する。関節構造に関連する損傷／変化：関節鞘、関節空間、滑膜、関節軟骨および軟骨下骨を組織学的に評価した。
【０１７５】
実施例１４：抗原−誘導関節に関するマウスモデルにおける、キメラタンパク質の治療活性
Ｌｅｗｉｓラットを、完全フロイドアジュバント中の０．５ｍｇ メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）で、後ろ脇腹中で免疫した。２１日後（０日）、動物に、ピローゲンを含まない生理食塩水中の５０μｇ ｍＢＳＡを、両後ろ膝関節中に注射した。ラットに、その日、および続く２日間（０、１および２日）、両膝関節中に、試験タンパク質を関節内に注射した（対照として、毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみを注射した）。膝関節幅を、治療に相対して、０〜６日で毎日測定する。６日目に回収した関節の組織病理学実験を実施した。関節構造に関連する損傷／変化：関節鞘、関節空間、滑膜、関節軟骨および軟骨下骨を組織学的に評価した。
【０１７６】
実施例１５：抗原−誘導関節に対するマウスモデルにおけるキメラタンパク質の治療活性
オスＤＢＡ／１マウス（８〜１２週齢）を、尾の根本での皮内注射によって、ＦＣＡ内（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で乳化させたＩＩ型コラーゲン、１００μｇで免役した。免疫の時間から開始して、マウスに、臨床的関節炎の開始まで、ＰＢＳ中の試料タンパク質を、１週間に２回、腹腔内に注射した（対照として、毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみを注射した）。免疫後１５日から、マウスを１０日間、２つの臨床パラメータ、足のふくらみと臨床スコアを用いて、疾患の開始に関して毎日試験した。足のふくらみは、カリパスで最初に影響を受けた後ろ足の厚さを測定することによって査定した。
【０１７７】
実施例１６：結腸炎に対するマウスモデルにおける、キメラタンパク質の治療活性
Ｈａｒｌａｎ ＵＫにて購入した、ＩＬ−１０ノックアウトマウスを、ＩＬ１０遺伝子欠損に関するマウス同型を産生するために交雑し、その尾ＤＮＡにて実施したＰＣＲによて同型に関してスクリーンした。４週齢で開始して、マウスに、２０週齢まで、ＰＢＳ中の試験タンパク質を毎週３回腹腔内に注射した（対照として、毒素のみまたは可溶性ＴＮＦレセプターのみを注射した）。臨床スコア、腸の組織学的解析、スツール中の炎症性サイトカインの含量を、［１８］で示したように評価した。
【０１７８】
実施例１７：ｐ７５ ＴＮＦレセプターの可溶性形態の共役物の発現に関するプラスミドの構築
共役物内に組み込まれたｐ７５ ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｍ３２３１５）の可溶性系列の配列は、レセプターの細胞外ドメインの前配列（Ｌｅｕ１からＡｓｐ２３５まで）に相当する。この配列を、ＰＥの配列に融合させ、実施例１で記述したようにｐＥＴ−ベクター内に挿入した。
【０１７９】
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＴＢＰ−ＰＥキメラタンパク質（Ａ）およびシュードモナスエクソトキシン（Ｂ）の略図表を示している。シュードモナスエクソトキシン（Ｂ）は、レセプターが仲介するエンドサイトーシスによって細胞内に進入し、細胞プロテアーゼ（フリン−様）によって開裂され、移行活性およびＡＤＰ−リボシル化活性を含む４０ｋＤａ断片（ＰＥ）を産生する。タンパク質分解の後、ＰＥが、エンドプラスマリチクラムに到達し、細胞質へトランスロケートし、伸張因子２（ＥＦ２）のＡＤＰ−リボシル化によって、タンパク質合成を阻害する。ＴＢＰ−ＰＥキメラタンパク質（Ａ）には、ＴＢＰ１またはＴＮＦ−結合タンパク質１（ｐ５５ ＴＮＦレセプターの細胞外部分）、およびシュードモナスエクソトキシンのＰＥ断片が含まれる。
【図１Ｃ−Ｄ】Ｃ〜Ｄは、キメラＴＢＰ−ＰＥタンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ｃ 配列番号：１）、および相当するアミノ酸配列（Ｄ、配列番号：２）を示している。
【図１Ｅ−Ｆ】Ｅ〜Ｆは、ＰＥのＤＮＡ配列（Ｅ、配列番号：３）、シュードモナスエクソトキシンそのドメインＩＩおよびＩＩＩをコードする断片、および相当するアミノ酸配列（Ｆ、配列番号：４）を示している。
【図１Ｇ−Ｈ】Ｇ〜Ｈは、ＴＢＰＩとＰＥ部位を連結しているリンカーペプチドのＤＮＡ配列（Ｇ、配列番号：５）および相当するアミノ酸配列（Ｈ、配列番号：６）を示している。
【図２Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分解された細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現された、キメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥを示している。大腸菌細胞ＢＬ−２１ ｐＬｙｓに、ｐＴＢＰ−ＰＥ、ＴＢＰ−ＰＥキメラ遺伝子にライゲートしたｐＥＴ−５を含む発現ベクターを形質導入した。ｐＴＢＰ−ＰＥの形質導入、およびイソプロピルβ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導の後、大腸菌形質導入株を溶解し、溶解物（「未精製」）を、実施例２で記述したように可溶性タンパク質と不溶性封入体（「ＩＢ」）に画分化した。封入体を、実施例２で示したように、８Ｍ尿素（「尿素」）中に溶解し、再折りたたみさせた（「再折りたたみ」）。未精製、ＩＢ、尿素および再折りたたみ画分の試料（レーンあたり２０μｌ）（Ａ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上で分解し、ゲルをクーマシーブルー溶液で染色した。本図は、主にＩＢ画分で見られる、キメラＴＢＰ−ＰＥタンパク質が、およそ５７ｋＤａ．ＭＷ−分子量標準の見かけの分子量で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に移動したことを示している。実施例２の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥおよびＡを、タンパク質Ｇ−抗−ＴＢＰ−Ｉ架橋アフィニティークロマトグラフィーカラムにのせた。カラムに結合したＴＢＰ−ＰＥを、実施例３で示したように、ｐＨを還元することによって溶出した。溶出した画分を回収し、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ２８０）を測定した。ＴＢＰ−ＰＥを含む溶出した画分の試料（レーンあたり２０μｌ）（Ｂ中ライン１〜７）および精製した、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生された、非キメラＴＢＰ−１標準（Ｂ中ライン８）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上にのせ、ウェスタンブロット解析にかけて、抗ＴＢＰ−Ｉにて検出した。ＴＢＰＩのアミノ酸配列から予想されるＭＶは１７ｋＤａであるが、ＴＢＰＩの見かけのＭＷは、より高く、約３４ｋＤａで観察され（Ｂ、ライン８）、これは真核細胞（ＣＨＯ）中で産生されたこのＴＢＰ−Ｉ標準のグリコシル化による。抗ＴＢＰＩ抗体はまた、約５７ｋＤａの実際の分子量の、キメラＴＢＰ−ＰＥを検出した（Ｂ、ライン７）。
【図３】図３は、ＴＢＰ−ＰＥによる、伸張因子２（ＥＦ２）のＡＤＰ−リボシル化を示している。シュードモナスエクソトキシンは、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化によって仲介されたタンパク質合成の阻害を誘導する。１０〜５０μｌの、キメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥのＡＤＰ−リボシル化活性を試験するために、ＴＢＰ−ＰＥを産生している形質導入大腸菌細胞からの溶解物（「総溶解物」、棒３）、封入体の分離後の細胞溶解物（「可溶性タンパク質」棒２）、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥ（実施例２より、棒４）、または緩衝液（棒１）を、実施例４で示したように、ＥＦ−２およびＮＡＤ+−14Ｃを含む溶液中でインキュベートした。ＴＢＰ−ＰＥによって仲介される、ＮＡＤ+−14ＣのＥＦ−２への組み込みを、実施例４で示したように測定した。この図は、ＴＢＰ−ＰＥが、ＥＦ２のＡＤＰ−リボシル化を誘導することを示している（棒１と比較して棒３および４を参照のこと）。非常に低いＡＤＰ−リボシル化活性が、可溶性タンパク質の試料中で観察され（棒２）、これは、ほとんどのＴＢＰ−ＰＥが、封入体内に存在することを示唆している。（可溶性タンパク質および封入体両方を含む）総細胞溶解物画分の１０μｌの試料が、５０μｌの同様の画分よりも活性を誘導し、これは、未精製細菌溶解物中に、阻害活性が存在することを示唆している。反対に、ＥＦ２ ＡＤＰ−リボシル化活性が、反応液に添加した、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥの量にともなって増加したことが認められる（棒４、１０および５０μｌの活性を比較）。
【図４Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、酵素結合免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって実施した、ＴＢＰＩ−ＰＥ（Ａ）およびＴＢＰＩ（Ｂ）の定量を示している。モノクローナル抗−ＴＢＰＩでコートしたマイクロタイタープレートに、連続希釈ＴＢＰ１（ＣＨＯ細胞より精製した）または再折りたたみＴＢＰＩ−ＰＥの試料を三重に適用した。３７℃にて１時間のプレートのインキュベーションと、続く未結合タンパク質を取り除くための洗浄の後、結合したＴＢＰ−ＰＥまたはＴＢＰＩを、ポリクローナルウサギ抗−ＴＢＰＩ、抗−ウサギ−ＨＲＰ共役物、およびＨＲＰ基質を用いて、実施例５で記述したように検出した。ＴＢＰＩ／ＴＢＰ−ＰＥ濃度の指標である、緑色の強度を、４０５ｎｍにて測定した。Ｂで示したＥＬＩＳＡにしたがって、０．３のＯ．Ｄ．が直線範囲であり、７６μｇ／ｍｌＴＢＰＩの濃度に相当し、再折りたたみＴＢＰＩ−ＰＥの外挿濃度が、約４５μｇ／ｍｌに相当する（Ａ）。図４で要約した結果によって、ＴＢＰ−ＰＥが正確に再折りたたみされ、抗−ＴＢＰ抗体が、非キメラＴＢＰＩタンパク質を認識するのと同様に、再折りたたみＴＢＰ−ＰＥを認識するので、その濃度が、抗ＴＢＰ抗体を用いるＥＬＩＳＡによって定量可能であることが示されている。
【図５Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｂは、ＴＢＰ−１のＴＮＦ結合活性に対するＴＢＰ−ＰＥのＴＮＦ結合活性を示している。示した量の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥ、または非キメラＨＰＬＣ−精製ＴＢＰ−１（ＣＨＯ細胞中で産生された）を、ＴＮＦコートプレートにのせ、プレートへの結合を、モノクローナル抗ＴＢＰ−１抗体で検出した。Ｂは、ＴＮＦ結合活性を持つ未精製再折りたたみキメラタンパク質の割合を示している。ＴＢＰ−１の活性を１００％ＴＮＦ結合として用いると、少なくとも５０％の再折りたたみＴＢＰ−ＰＥが、ＴＮＦ結合活性を持つことがわかった。
【図６Ａ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。ＴＢＰ−ＰＥの細胞傷害性活性を、ＨｅＬａ細胞中、または表面ＴＮＦを過剰発現するように遺伝子工学的に改変した（Poscsik ら,1995）ＨｅＬａ−Ｍ９細胞株で試験した。細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、示した濃度のＴＢＰ−ＰＥ、またはＴＢＰＩ（対照として）で試験した。処理２４時間後の細胞の増殖と生存性を、実施例７で示したように査定した。いくつかのウェルで、細胞を、ＴＢＰＩとＴＢＰＩ−ＰＥの組み合わせで処理して、細胞表面ＴＮＦ−αの結合を介したＴＢＰＩ−ＰＥ細胞毒性の特異性を査定した。本発明者らは、ＴＢＰ−ＰＥの６０および６００ｎｇ／ｍｌの２つの異なるバッチが、ＨｅＬａＭ９にて細胞毒性効果を持つこと、細胞毒性が、ＴＢＰ−１との競合によって完全に阻害されたことから、細胞毒性効果が、膜結合ＴＮＦ−αを介して特異的に誘導されたことを発見した。
【図６Ｂ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。ＴＢＰ−ＰＥの細胞傷害性活性を、ＨｅＬａ細胞中、または活性化単球様細胞株中で試験した。細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、示した濃度のＴＢＰ−ＰＥ、またはＴＢＰＩ（対照として）で試験した。処理２４時間後の細胞の増殖と生存性を、実施例７で示したように査定した。いくつかのウェルで、細胞を、ＴＢＰＩとＴＢＰＩ−ＰＥの組み合わせで処理して、細胞表面ＴＮＦ−αの結合を介したＴＢＰＩ−ＰＥ細胞毒性の特異性を査定した。本発明者らは、上皮細胞株ＨｅＬａＭ９中の細胞毒性を誘導する同様の濃度のＴＢＰ−ＰＥ（図６Ａ）が、活性化単球様ＴＨＰＩ細胞株に関して細胞毒性ではなかったことを発見した。
【図６Ｃ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。ＴＢＰ−ＰＥの細胞傷害性活性を、ＨｅＬａ細胞中、または活性化初代マクロファージ細胞中で試験した。細胞を、９６−ウェルプレート中にまき、示した濃度のＴＢＰ−ＰＥ、またはＴＢＰＩ（対照として）で試験した。処理２４時間後の細胞の増殖と生存性を、実施例７で示したように査定した。いくつかのウェルで、細胞を、ＴＢＰＩとＴＢＰＩ−ＰＥの組み合わせで処理して、細胞表面ＴＮＦ−αの結合を介したＴＢＰＩ−ＰＥ細胞毒性の特異性を査定した。本発明者らは、上皮細胞株ＨｅＬａＭ９中の細胞毒性を誘導する同様の濃度のＴＢＰ−ＰＥが（図６Ａ）、１または１０ｎｇ ＬＰＳでの大腸菌の処理によって活性化した初代マクロファージに関して細胞毒性ではなかったことを発見した。
【図６Ｄ】ＴＢＰ−ＰＥが、膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞、とりわけ、上皮型の膜結合ＴＮＦを過剰に発現している細胞に対して細胞傷害性であることを示す。活性化マクロファージによるＴＮＦの分泌における、ＴＢＰ−ＰＥの効果もまた調査した。６００および１５００ｎｇ／ｍｌの濃度でのＴＢＰ−ＰＥで処理した、または未処理の活性化マクロファージの培養培地を回収し、２、４および８倍に新鮮な培地で希釈し、Ｌ９２９細胞に適用し、ＴＮＦ濃度の指標である、細胞のＴＮＦ依存死をモニタした。本発明者らは、活性化マクロファージによるＴＮＦ分泌が、ＴＢＰ−ＰＥによって阻害されなかったことを発見した。
【図７】図７は、ＴＢＰ−ＰＥが、ＨｅＬａＭ９細胞中のタンパク質合成を阻害することを示している。ＨｅＬａＭ９およびＨｅＬａ細胞を、（６００ｎｇ／ｍｌ）ＴＢＰ−ＰＥで処理するか、未処理のまま残し（「緩衝液」）、35Ｓ−Ｍｅｔでの放射活性標識にかけた。１つの実験群にて、ＴＢＰＩを、細胞表面ＴＮＦと競合させるために、ＴＢＰＩ−ＰＥと同時に細胞に適用した（「ＴＢＰ−ＰＥ＋ＴＢＰ」）。処理の後、細胞を溶解し、ＴＣＡ−沈殿タンパク質の放射活性を、実施例８で記述したように測定した。本図は、６００ｎｇ／ｍｌのＴＢＰ−ＰＥが、少なくとも７５％細胞に関して、ＨｅＬａＭ９中でのタンパク質合成を阻害するが、ＨｅＬａ細胞内でのタンパク質合成を減じないことを示している。ＴＢＰＩは、１０倍過剰で添加した時に、ＨｅＬａ−Ｍ９におけるＴＢＰ−ＰＥの効果を完全に阻害した。ＴＢＰＩのみは、ＨｅＬａ−Ｍ９中、またはＨｅＬａ細胞中両方で、タンパク質合成に影響を与えなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを異常に高レベルで発現している細胞を殺すか、または改変できるキメラタンパク質であって、該レセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、エフェクター分子に連結されているキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＦａｓからなる群より選択されるレセプターの細胞外部分からなる請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ＴＮＦレセプターの細胞外部分からなる請求項２記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
ＴＮＦレセプターが、ｐ５５ ＴＮＦレセプターであり、細胞外部分が、ＴＮＦ結合タンパク質−１（ＴＢＰＩ）である請求項３記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記エフェクター分子が、シュードモナスエクソトキシン、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニン、またはそれらの断片からなる群より選択される細胞傷害性分子である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記エフェクター分子が、シュードモナスエクソトキシンの断片である請求項５記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
本明細書でＰＥと表記する、シュードモナスエクソトキシンの前記断片が、配列番号：３のアミノ酸配列に相当する請求項６記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
配列番号：２のアミノ酸配列に相当する、本明細書でＴＢＰ−ＰＥと表記する請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分または塩。
【請求項９】
前記エフェクター分子が、哺乳動物細胞死タンパク質である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞死タンパク質が、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＤＮＡフラグメンテーション因子４０からなる群より選択される請求項９記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記エフェクター分子が、蛍光組成物または放射活性組成物である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記エフェクター分子が、シクロスポリン含有リポソームである請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記エフェクター分子がサイトカインである請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記サイトカインが免疫抑制性である請求項１３記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記エフェクター分子が増殖因子である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記エフェクター分子が抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記抗体が、腫瘍細胞抗原に対して特異的である請求項１６記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
前記エフェクター分子が、Ｂｃｌｘ、ＣＡＤ−タンパク質、カスパーゼおよびＩκＢからなる群より選択された細胞内調節タンパク質である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項２０】
さらに、真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをコードする請求項１９記載のＤＮＡ配列。
【請求項２１】
ＴＢＰ−ＰＥまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分のアミノ酸配列をコードする請求項１９または２０記載のＤＮＡ、。
【請求項２２】
配列番号：１のヌクレオチド配列に相当する請求項２１記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
前記細胞が真核細胞である請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記真核細胞が、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＴＨＰＩ、酵母および昆虫細胞からなる群から選択される請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記細胞が原核細胞である請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること、および産生されたキメラタンパク質を単離すること、を含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の製造方法。
【請求項２９】
産生された前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩である請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２３に記載のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３４】
疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項３５】
前記疾患が自己免疫疾患である請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドが、疾患の発病および／または経過に関与する、疾患の治療のための請求項３４記載の使用。
【請求項３８】
前記疾患の発病および／または経過に関与する前記リガンドが、ＴＮＦである請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
前記疾患が、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、関節性肝炎および結核からなる群より選択される急性疾患である請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
疾患が、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬からなる群より選択される慢性疾患である請求項３８記載の使用。
【請求項４１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記疾患が癌であり、前記キメラタンパク質が、癌細胞によって発現されるＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドに結合する請求項３４記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項４３】
前記リガンドがＴＮＦである請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
前記癌が上皮由来である請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
前記癌が乳癌である請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している有害な細胞を殺すための、自己移植前に癌患者の幹細胞を治療するための医薬品の製造における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項４８】
前記キメラタンパク質が、幹細胞の採取前に患者に投与される請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
ＴＮＦを発現している上皮細胞が、疾患の発病および／または経過に関与している疾患の治療のための医薬品の製造における、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用。
【請求項５０】
前記疾患が、乳癌、移植片対宿主疾患（ＧＶＨ）、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなる群より選択される請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
必要としている対象に、治療的に有効量の、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項５３】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
必要とする対象に、治療的に有効量の、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドの活性が、前記疾患の発病、または経過に関与する、疾患の治療方法。
【請求項５５】
前記疾患の発病または経過に関与する前記リガンドが、ＴＮＦである請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核からなる群より選択される急性疾患である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
疾患が、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬からなる群より選択される慢性疾患である請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
必要とする対象に、治療的に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、前記癌細胞が、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを発現する癌の治療方法。
【請求項６０】
前記リガンドがＴＮＦである請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項５９または６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記癌が上皮由来である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記癌が乳癌である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
必要とする対象に、治療的に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、自己移植の前に、ＴＮＦを発現している骨髄および／または動員末梢血細胞有害な細胞を殺すための方法。
【請求項６５】
前記キメラタンパク質を、骨髄細胞または動員末梢血細胞の採取前に必要な対象に投与する請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
必要な対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、ＴＮＦを発現している上皮細胞が、前記疾患の発病および／または経過に関与する疾患の治療方法。
【請求項６７】
前記疾患が、乳癌、移植片対宿主疾患、乾癬および炎症性腸疾患からなる群より選択される請求項６６記載の方法。
【請求項１】
ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを異常に高レベルで発現している細胞を殺すか、または改変できるキメラタンパク質であって、該レセプターの細胞外部分からなる少なくとも１つのポリペプチドのアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、エフェクター分子に連結されているキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ＴＮＦレセプター、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＦａｓからなる群より選択されるレセプターの細胞外部分からなる請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ＴＮＦレセプターの細胞外部分からなる請求項２記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
ＴＮＦレセプターが、ｐ５５ ＴＮＦレセプターであり、細胞外部分が、ＴＮＦ結合タンパク質−１（ＴＢＰＩ）である請求項３記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
前記エフェクター分子が、シュードモナスエクソトキシン、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニン、またはそれらの断片からなる群より選択される細胞傷害性分子である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
前記エフェクター分子が、シュードモナスエクソトキシンの断片である請求項５記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
本明細書でＰＥと表記する、シュードモナスエクソトキシンの前記断片が、配列番号：３のアミノ酸配列に相当する請求項６記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
配列番号：２のアミノ酸配列に相当する、本明細書でＴＢＰ−ＰＥと表記する請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分または塩。
【請求項９】
前記エフェクター分子が、哺乳動物細胞死タンパク質である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞死タンパク質が、Ｂａｘ、ＢａｋおよびＤＮＡフラグメンテーション因子４０からなる群より選択される請求項９記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
前記エフェクター分子が、蛍光組成物または放射活性組成物である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
前記エフェクター分子が、シクロスポリン含有リポソームである請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
前記エフェクター分子がサイトカインである請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
前記サイトカインが免疫抑制性である請求項１３記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
前記エフェクター分子が増殖因子である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
前記エフェクター分子が抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記抗体が、腫瘍細胞抗原に対して特異的である請求項１６記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
前記エフェクター分子が、Ｂｃｌｘ、ＣＡＤ−タンパク質、カスパーゼおよびＩκＢからなる群より選択された細胞内調節タンパク質である請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項２０】
さらに、真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをコードする請求項１９記載のＤＮＡ配列。
【請求項２１】
ＴＢＰ−ＰＥまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分のアミノ酸配列をコードする請求項１９または２０記載のＤＮＡ、。
【請求項２２】
配列番号：１のヌクレオチド配列に相当する請求項２１記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
前記細胞が真核細胞である請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記真核細胞が、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＴＨＰＩ、酵母および昆虫細胞からなる群から選択される請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記細胞が原核細胞である請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること、および産生されたキメラタンパク質を単離すること、を含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の製造方法。
【請求項２９】
産生された前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩である請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項２３に記載のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３４】
疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項３５】
前記疾患が自己免疫疾患である請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドが、疾患の発病および／または経過に関与する、疾患の治療のための請求項３４記載の使用。
【請求項３８】
前記疾患の発病および／または経過に関与する前記リガンドが、ＴＮＦである請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
前記疾患が、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、関節性肝炎および結核からなる群より選択される急性疾患である請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
疾患が、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬からなる群より選択される慢性疾患である請求項３８記載の使用。
【請求項４１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記疾患が癌であり、前記キメラタンパク質が、癌細胞によって発現されるＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドに結合する請求項３４記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項４３】
前記リガンドがＴＮＦである請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
前記癌が上皮由来である請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
前記癌が乳癌である請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している有害な細胞を殺すための、自己移植前に癌患者の幹細胞を治療するための医薬品の製造における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項４８】
前記キメラタンパク質が、幹細胞の採取前に患者に投与される請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
ＴＮＦを発現している上皮細胞が、疾患の発病および／または経過に関与している疾患の治療のための医薬品の製造における、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用。
【請求項５０】
前記疾患が、乳癌、移植片対宿主疾患（ＧＶＨ）、乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなる群より選択される請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
必要としている対象に、治療的に有効量の、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項５３】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
必要とする対象に、治療的に有効量の、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドの活性が、前記疾患の発病、または経過に関与する、疾患の治療方法。
【請求項５５】
前記疾患の発病または経過に関与する前記リガンドが、ＴＮＦである請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核からなる群より選択される急性疾患である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
疾患が、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬からなる群より選択される慢性疾患である請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
必要とする対象に、治療的に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、前記癌細胞が、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプターのリガンドを発現する癌の治療方法。
【請求項６０】
前記リガンドがＴＮＦである請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項５９または６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記癌が上皮由来である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記癌が乳癌である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
必要とする対象に、治療的に有効量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、自己移植の前に、ＴＮＦを発現している骨髄および／または動員末梢血細胞有害な細胞を殺すための方法。
【請求項６５】
前記キメラタンパク質を、骨髄細胞または動員末梢血細胞の採取前に必要な対象に投与する請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
必要な対象に、治療的に有効量のＴＢＰ−ＰＥ、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、ＴＮＦを発現している上皮細胞が、前記疾患の発病および／または経過に関与する疾患の治療方法。
【請求項６７】
前記疾患が、乳癌、移植片対宿主疾患、乾癬および炎症性腸疾患からなる群より選択される請求項６６記載の方法。
【図１Ａ−Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２Ａ−Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２Ａ−Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５０４８１０（Ｐ２００８−５０４８１０Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７６５４（Ｐ２００７−５１７６５４）
【出願日】平成１７年６月２８日（２００５．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００６８９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００１０２３
【国際公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２８日（２００５．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００５／０００６８９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００１０２３
【国際公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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