キメラＭＨＣタンパク質およびそのオリゴマー
発明は少なくとも２つのキメラタンパク質を含むオリゴマーＭＨＣ複合体であって、上記キメラタンパク質はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来する第２セクションを含み、オリゴマーＭＨＣ複合体の形成が該キメラタンパク質のオリゴマー化ドメインでのオリゴマー化により生じ、そして第１セクションの少なくとも２つが同一のＭＨＣペプチド鎖に由来するオリゴマーＭＨＣ複合体に関する。発明はまたＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクション、およびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションを含むキメラタンパク質にも関する。発明は更に、請求項１から１２のいずれかによるオリゴマー化ＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および前記複合体とＴ細胞との特異的結合の存在を検出することによる、それらの抗原レセプターの特異性に基づき哺乳動物Ｔ細胞を標識および／または検出する方法にも関する。最後に発明は、上記キメラタンパク質の遺伝子工学に関するＤＮＡ配列より成るプライマーに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキメラＭＨＣタンパク質、同タンパク質をコードする発現カセット、ベクター、上記キメラタンパク質のオリゴマー、該オリゴマーを使用することにより、哺乳動物Ｔ細胞の有する抗原レセプターの特異性に従いそれらを標識、検出および分離する方法、ならびに上記キメラタンパク質を構築するのに好適なプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子は、組織の細胞の表面に見出され、細胞抗原を短い直鎖状ペプチドの形でＴ細胞に対し提示し、Ｔ細胞表面にあるＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）と相互作用させるのに重要な役割を果たしている。
【０００３】
単離形または組換え体形状のＭＨＣ−ペプチド分子は、それらＴ細胞が認識する特異的ペプチド抗原に拠ったＴ細胞の検出、分離および操作に有用であることが明らかにされている。また細胞表面を横切るＭＨＣ分子とＴＣＲｓ間の相互作用は多量体型であること、そしてあるＴＣＲに対して単一型のＭＨＣ分子の親和性が一般には低親和性であることも分かっている。
【０００４】
そのために上記応用にとってより有用な分子を作るために、多量体型の単離または組換え体ＭＨＣ−ペプチド分子を開発する努力が払われている。
【０００５】
欧州特許出願ＥＰ ８１２ ３３１号は哺乳動物Ｔ細胞をそれらが有する抗原レセプター特異性に従い標識、検出および分離するための多量体結合複合体を開示しており、このとき複合体は式（α−β−P）ｎを有する（式中の（α−β−Ｐ）はＭＨＣペプタイド分子であり、ｎは≧２であり、αはＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩクラス分子のα鎖を含み、βはＭＨＣタンパク質のβ鎖を含み、そしてＰは実質的に均質なペプチド抗原である）。ＭＨＣペプチド分子は、ＭＨＣ分子のαまたはβ鎖の一つのＣ末端をビオチン化し、ＭＨＣモノマーを４価のストレプトアビジン／アビジンと結合することにより、あるいはαまたはβ鎖の一つのＣ末端において多量体化の実体として働く対応する抗体が認識するエピトープを含むよう修飾されているＭＣＨ分子のキメラタンパク質を提供することによって多量体化される。明細書はさらに、ＴＣＲ特異性に拠る特定Ｔ細胞の検出、標識および分離へのＭＨＣオリゴマーの使用も教示する。
【０００６】
欧州特許出願ＥＰ ６６５ ２８９は特異的ペプチド、これらペプチドを結合しているＭＨＣ分子、およびそれぞれ特異的ペプチドが結合している各ＭＨＣ分子を架橋して得たオリゴマーとを開示している。オリゴマー化は、化学架橋剤を使用すること、またはＩｇＧもしくはＩｇＭのような免疫グロブリンにより認識されるエピトープを含むＭＨＣキメラタンパク質を提供することにより達成する。ＭＨＣ分子は標識を含んでもよく、そしてそれらの特異的レセプター結合に拠ったＴ細胞の標識、検出および分離に使用してもよく、実際にヒトの治療に用いてもよい。
【０００７】
国際出願ＷＯ９３／１０２２０はＭＨＣ分子の可溶性部分を含むキメラＭＨＣ分子であって、免疫グロブリン定常域と融合したクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣのいずれかであるキメラＭＨＣ分子を開示する。分子のＭＨＣ部分は、相補的なαおよび／またはβ鎖を含み、そしてペプチドはＭＣＨ分子の各結合グローブ内に結合している。２量体免疫グロブリンの存在により、これらキメラＭＨＣ−Ｉｇ分子は自己集合して２量体構造を形成する。
【０００８】
別の研究では、これまで軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のオリゴマー化ドメインは複数のタンパク質を多量体化するツールとして用いられきた。ＣＯＭＰはＥｆｉｍｏｖと共同研究者らにより記載され、特徴付けが行われている（Proteins: Structure、Function、and Genetics 24: 259〜262(1996年）参照）。ＣＯＭＰはトロンボスポンジンファミリーの５量体糖タンパク質である。５量体を形成するタンパク質の自己集合は、該タンパク質のＮ−末端６４個のアミノ酸残基を包含する５本の鎖が螺旋状の束を形成することで達成される。上記多量体化ドメインのアミノ酸配列についてはＥｆｉｍｏｖらが、FEBS Letters 341:54〜58(1994）に開示している。
【０００９】
国際特許出願ＷＯ ００／４４９０８は、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のＮ−末端領域に結合したＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、エンドスタチン、アンジオスタチン、血小板因子４またはプロラクチンの抗血管新生活性部分を含有し、その結果５量体形成が可能となったキメラタンパク質を開示している。明細書は得られたキメラタンパク質が伝達する抗血管新生作用を活用することに主に関係している。この開示によれば、キメラタンパク質はその中に含まれるＴＳＰ−ドメインが正しく折りたたまれ易くし、その結果これらキメラタンパク質はＴＳＲ配列に基づくペプチドに比べより天然のタンパク質に近い。
【００１０】
米国特許第６、２１８、５１３号は、グロブリンのオリゴマー形成に適した非天然型結合ドメインを含有するグロブリンを開示している。ＣＯＰＭオリゴマー化ドメインは、開示された結合ドメインの１つである。オリゴマー化による利点は、単量体グロブリンタンパク質に比しサイズが大きくなることによるオリゴマー化グロブリンタンパク質の半減期の延長、故に血管内分解に対する抵抗性の向上ならびに血管外溢出の減少に関係する。
【００１１】
Hollerら、Journal of Immunological Methods 237: 159〜173(2000年）は、ＩｇＧ定常領域もしくはＣＯＭＰ自己集合ドメインに融合したＴＮＦ−レセプターファミリーメンバーを含むオリゴマー化レセプターに基づくＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌの改良型可溶性インヒビターの開発を開示している。そこでは、ＴＮＦ−レセプターファミリーのオリゴマー可溶性キメラレセプターに見られる親和性の上昇は一般的な現象ではないと結論している。この様なオリゴマーキメラレセプターのそのリガンドに対する親和性は、考慮の対象となる具体的なレセプター−リガンドの組に依存しており、近い関係にある蛋白質間でさえ大きく異なることが分かっている。
【００１２】
前記ＭＨＣタンパク質の多量体化の試みには幾つかの欠点が提示されている。化学的架橋は、例えば最終的なＭＨＣオリゴマーに予想不能な構造をもたらし、それは複合体によって大きく異なると思われる。その結果、標的への結合も同様に最終的なオリゴマーの構造に応じて変化するだろう。このことは転じてオリゴマーを使用しているアッセイシステムの正確性および信頼性を損なうこともある。最悪の場合、化学的架橋が機能的ＭＨＣオリゴマーの集合形成を阻害することもあるだろう。
【００１３】
国際特許出願ＷＯ９３／１０２２０に記載されている様に、１または２本のＭＨＣポリペプチド鎖と免疫グロブリン分子の定常領域とを融合させると２量体のＭＨＣ分子複合体が出来る。２量体相互作用は複合体の親和性を上昇させるが、抗原特異的Ｔ細胞の検出またはかかる細胞を上手く活性化するといった様々な応用に求められる親和性を得るには抗イディオタイプ抗体またはプロテインＡもしくはＧを使ってさらに多量体化を進める必要があるだろう。しかしこの様な２段階の多量体化工程は実行に時間がかかり、最終生成物の均一性を制御するのが困難である。
【００１４】
ビオチン／ストレプトアビジン結合ペアの様な非ヒト性の結合パートナー、または一方に非ヒト性の抗体を使用してＭＨＣモノマーを多量体化すると、オリゴマーの中に非ヒト性タンパク質成分が取り込まれる。これにより、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での使用を想定する応用、例えばヒトの治療といった応用では、複合体が毒性を有する可能性および／または複合体のこの非ヒト部分に対する免疫反応が懸念される。それ故に、オリゴマー複合体中では非ヒト部分を回避することが望ましいだろう。
【００１５】
さらにビオチン−ストレプトアビジン相互作用に基づくＭＨＣ多量体の生成では、数回のタンパク質精製段階およびビオチン化反応を含め多数の工程段階を包含しており、それにより活性物質が大きく失われることもある。さらに単体のＭＨＣサブユニットのビオチン化効率、および最終の多量体生成物の品質を制御することは困難である。
【００１６】
当技術分野より利用可能なＭＨＣオリゴマーは、ＭＨＣモノマーそのものに比べ複合体の親和性を確かに高める。しかしながら、複合体合成の複雑度を上げることなく、一方でかかる合成により高い均一性を有した分子を確実に生成しながら、親和性をさらに高めることが強く望まれている。
【００１７】
本発明の目的は、従来技術の持つ上記欠点およびその他不利益を克服すること、ならびにＴ細胞レセプターおよびタンパク質配列への結合に同時に利用でき、非ヒト成分の含有を最小限に留める均一で高い結合価を持つＭＨＣペプチド成分を用いて容易に製造できる多量体ＭＨＣペプチド複合体を提供することである。
【００１８】
発明の概要
上記の従来技術の不利益および欠点は、ＭＨＣペプチド鎖またはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマーＭＨＣ複合体を形成するオリゴマー形成コイルドコイル（coiled-coil）タンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含む少なくとも２つのキメラタンパク質を用いることで克服される。
【００１９】
従って本発明の第一の局面は、少なくとも２つのキメラタンパク質を含むオリゴマーＭＨＣ複合体であって、前記キメラタンパク質がＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションとオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含み、オリゴマーＭＨＣ複合体の形成が該キメラタンパク質のオリゴマー化ドメインでのオリゴマー化形成により生じ、そして上記オリゴマーに含まれる全キメラタンパク質の第１セクションの少なくとも２つが同一のＭＨＣペプチド鎖に由来するもものであるオリゴマーＭＨＣ複合体に関する。
【００２０】
キメラタンパク質の第１セクションは、ＭＣＨクラスＩもしくはＩＩα鎖の細胞外部分に由来するのが好ましい。あるいは、キメラタンパク質の第１セクションはＭＨＣクラスＩもしくはＩＩβ鎖の細胞外部分に由来するものでもよい。
【００２１】
発明の好適実施態様では、キメラタンパク質の第２セクションに含まれるオリゴマー化ドメインは、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の５量体化ドメインに由来する。より好ましくは、キメラタンパク質の第２セクションに含まれるＣＯＭＰの５量体化ドメインは上記タンパク質のアミノ酸１〜１２８を、好ましくは２０〜８３を、最も好ましくは２０〜７２を含み、そしてこれらアミノ酸より成るのが好ましい。
【００２２】
好ましくは、キメラタンパク質はさらにＭＨＣペプチド鎖（第１セクション）とオリゴマー化ドメイン（第２セクション）との間に第１リンカーを含む。
【００２３】
好ましくは、オリゴマー中のキメラタンパク質の少なくとも１つは、第２リンカー、タグ化ドメインおよび精製ドメインより成る群から選択するドメインを１またはそれ以上含む。
【００２４】
発明の別の実施態様は、少なくとも２つのキメラタンパク質に対し相補的であるＭＨＣ結合ペプチド鎖をさらに含み機能的ＭＣＨ結合複合体を形成する上記オリゴマーＭＨＣ複合体に関する。
【００２５】
好ましくは、発明の第１局面によるオリゴマーＭＨＣ複合体は、クラスＩ複合体に関してはＭＨＣα１およびα２ドメイン、そしてクラスＩＩ複合体に関してはＭＨＣα１およびβ１ドメインにより形作られるグローブ内で複合体のＭＨＣ部分と結合するペプチドを含む。
【００２６】
発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は標識を含んでもよい。好ましくは、標識は光検出標識、放射活性標識、酵素、エピトープ、レクチンまたはビオチンより成る群から選択される。
【００２７】
発明の第２の局面では、ＭＨＣペプチド鎖またはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含むキメラタンパク質であって、コイルドコイルタンパク質は該オリゴマー化ドメインが由来する少なくとも２つの実質的に同一版のポリペプチド鎖が並置することでオリゴマーを形成するキメラタンパク質に関する。好ましくは、オリゴマー化ドメインはＣＯＭＰの５量体化ドメインに由来する。より好ましくは、オリゴマー化ドメインはＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、好ましくはこれらアミノ酸より成る。
【００２８】
発明の第３の局面は、上記発明のオリゴマーＭＨＣ複合体の取り込みに適した、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモータ配列を含む組換え体発現カセットに関する。
【００２９】
発明の第４の局面は、上記組換え体カセットを含むベクターに関する。
【００３０】
発明の第５の局面は、発明のオリゴマーＭＨＣ複合体を含む医薬または診断組成物に関する。
【００３１】
発明の第６の局面は、それらの抗原レセプターの特異性に基づく哺乳動物Ｔ細胞を標識および／または検出する方法であって、方法が
（ｉ）発明のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体とＴ細胞の特異的結合の存在を検出すること、
を含む方法に関する。
【００３２】
発明の第７の局面は、それらの抗原レセプターの特異性に基づく哺乳動物Ｔ細胞を分離する方法であって、方法が
（ｉ）発明のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体と結合したＴ細胞を未結合の細胞から分離すること、
を含む方法に関する。
【００３３】
発明のその他の局面では、発明はさらに上記キメラペプチドの構築に有用なプライマーにも関係する。
【００３４】
発明の詳細な説明
発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は、従来技術の不利益および欠点を解決するためのものである。より具体的には、発明者は上記オリゴマーＭＨＣ複合体が、例えばビオチンおよびストレプトアビジンを介した結合によるＭＨＣ複合体の４量体化によって得られるオリゴマーに比べて実質的に高いＴ細胞レセプターに対する親和性を獲得できることを見出した。理論と結びつける意図なしに、この親和性の上昇は３個またはそれ以上のＭＨＣ分子を実質的に同一面に配置し、全ての結合面を同一方向に向けた時に達成されると思われる。これに対し、ストレプトアビジン結合の４量体複合体は四面体配置を取っており、Ｔ細胞表面との接触に同時に利用できるＭＨＣ結合ドメインは３つまでである。発明の複合体はさらに選択した標識による活性ＭＨＣドメインへの干渉を最小限に留めたまま効率的な標識が可能であるが、これは標識がオリゴマー形成コイルドコイルドメインの反対端部に配置されるからである。
【００３５】
本発明の範囲内では「オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質」とはオリゴマー化ドメインを含むタンパク質を意味する。上記ドメインは２またはそれ以上のポリペプチドサブユニットを含むが、これらサブユニットは同一でも、または同一でなくともよい。かかるオリゴマー化ドメインの２またはそれ以上のサブユニットは互いに集合し、オリゴマー化ドメイン内の各サブユニットは集合状態の中で実質的に螺旋型の立体構造をとるが、この時オリゴマー化ドメイン内のサブユニットはある識別可能な軸に沿って配置され、そしてオリゴマー化ドメインは上記軸に沿って２つの識別可能な両端部を有し、さらに少なくとも２つのポリペプチドサブユニットは上記軸に沿った同一のアミノ〜カルボキシル方向を示す。このようなオリゴマー化ドメインおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質は、たとえば本明細書導入部に引用されている様に当分野既知である。
【００３６】
オリゴマー化ドメインはいずれかの種の好適オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質
に由来するだろう。ＭＨＣ分子はヒト型のオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインと融合するのが好ましく、この場合複合体をヒトに投与した場合でも不要な免疫反応および／または拒絶反応は最小限に留められるだろう。
【００３７】
オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質の例としては、各種タイプのコラーゲン、マンノース結合蛋白の様なＣ−レクチンのトリプルコイルドコイルドメイン；Ｃ１ｑ、ミオシン、ｐ５３に生ずる様なロイシンジッパー、ＧＣＮ４、バクテリオファージｐ２２ Ｍｎｔ６リプレッサー；およびＣＯＭＰの様なトロンボスポンジンファミリータンパク質が挙げられる。オリゴマー化ドメインは軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰに由来するのが好ましい。より好ましくは、ＭＨＣ分子は上記の理由によりヒト型ＣＯＭＰ
のオリゴマー化ドメインと融合する。
【００３８】
発明のオリゴマーＭＨＣ複合体に含まれるキメラタンパク質の数（ｎ）は、キメラタンパク質の第２セクションの起源であるオリゴマー化ドメインのタイプに主に依存しており、一般には２またはそれ以上であり、好ましくはｎ＝２〜１０、最も好ましくはｎ＝３もしくは５である。オリゴマー化するキメラタンパク質の第２セクションが、例えばＣＯＭＰの５量体化ドメインに由来する場合にはこの数は典型的には５であり、オリゴマーは５量体（ｎ＝５）であるが、これらオリゴマー化ドメインがコラーゲンに由来する場合にはこの数は３であろう（ｎ＝３）
【００３９】
従って本発明の第１の局面はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションと、オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含むキメラタンパク質を包含するオリゴマーＭＨＣ複合体に関する。第１セクションのＭＨＣペプチド鎖はキメラタンパク質のＮ末端部分を形成するのに対し、第２セクションのオリゴマー化ドメインはそのＣ末端領域内に位置しているが、両セクションはどのような順番でもよいだろう。しかしながら、好ましい配置ではＭＨＣ部分はいずれの場合でもその機能的特性を維持できるだろう。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「キメラタンパク質」は、そのアミノ酸配列の少なくとも一部は２種類の天然産タンパク質もしくはタンパク質鎖部分、本例ではＭＨＣペプチドおよび少なくともオリゴマー化ドメインの有意な部分を実質的に含むペプチドに由来する単一ペプチドタンパク質を意味する。本明細書で使用する場合、用語「その機能的部分」とは、起源となる完全長ペプチドの望まれる機能的特徴を提示し続けているペプチド鎖の一部分を意味する。従ってＭＨＣではペプチド鎖は、必要に応じて、その相補的ＭＨＣペプチド鎖により完成した時あるいは集合した時に、抗原性ペプチドを結合できるペプチド鎖を意味している。用語「相補的」ＭＣＨペプチド鎖とは、天然のＭＨＣ複合体で対を成すペプチド鎖同士を意味する。ＭＨＣ複合体のα鎖の相補的鎖はβ鎖であり、その逆もまた同じである。
【００４１】
第１実施態様によれば、キメラタンパク質内のＭＨＣペプチド鎖はＭＣＨクラスＩまたはＩＩα鎖の細胞外部分である。別の実施態様によれば、ＭＨＣペプチド鎖はＭＨＣクラスＩまたはＩＩβ鎖の細胞外部分である。ＭＨＣタンパク質は脊椎動物種、例えば霊長類種、特にヒト；マウス、ラット、ハムスターおよびウサギを含む齧歯類；ウマ、ウシ、イヌ、ネコ；等由来のものであろう。特に興味深いものはヒトＨＬＡタンパク質、およびマウスＨ２−タンパク質である。ＨＬＡタンパク質に含まれるものとしては、クラスＩＩサブユニットＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＨＬＡ−ＤＲβ、ならびにクラスＩタンパク質ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、そしてβ２−ミクログロブリンが挙げられる。マウスＨ−２サブユニットに含まれるものとしては、クラスＩ Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、ならびにクラスＩＩ Ｉ−Ａα、Ｉ−Ａβ、Ｉ−ＥαおよびＩ−Ｅβ、そしてβ２−ミクログロブリンを挙げることができる。幾つかの代表的なＭＨＣタンパク質のアミノ酸配列は欧州特許ＥＰ ８１２ ３３１号内に引用されている。
【００４２】
好適実施態様では、ＭＨＣペプチド鎖は通常膜に結合している蛋白の可溶性形態に相当する。クラスＩサブユニットの場合、可溶性形態は天然形態より膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを削除して得られる。クラスＩタンパク質では、可溶性形態はα鎖のα１、α２およびα３ドメインを含むだろう。クラスＩＩタンパク質では、可溶性形態はα鎖またはβ鎖の各α１およびα２、またはβ１およびβ２ドメインを含むだろう。
【００４３】
含まれる膜貫通ドメインのアミノ酸は約１０未満、一般には約５未満であり、好ましくは全く含まないだろう。欠失はα３ドメイン内に約１０アミノ酸程度まで及んでも良いだろう。α３ドメインのアミノ酸は欠失しないことが好ましい。欠失は、それが機能的なジスルフィド結合構造物に折りたたまれるα３ドメインの能力を妨げないものであろう。クラスＩβ鎖、β２ｍはもともと膜貫通ドメインを欠いた形態であるため、切断する必要はない。一般的には、クラスＩＩサブユニットをクラスＩサブユニットと共に使用することはない。
【００４４】
上記の欠失はクラスＩＩサブユニットにも同様に適用される。欠失はα２またはβ２ドメイン内に約１０アミノ酸まで及んでも良いが、α２またはβ２ドメインのアミノ酸は欠失しないことが望ましい。欠失は、それが機能的なジスルフィド結合構造物に折りたたまれるα２またはβ２ドメインの能力を妨げないものであろう。
【００４５】
ポリペプチド末端に少数のアミノ酸を導入することを望む場合、その数は一般的には２５を越えない、より一般的には２０を越えないであろう。アミノ酸の欠失または挿入は、一般にクローニングでの必要から、例えば有利な制限部位等を提供するため、および分子集合に於ける潜在的立体配置問題を解消するために行われる。さらに、同様の理由から１またはそれ以上のアミノ酸を別のアミノ酸と置換することが望まれる場合でも、一般に１つのドメイン内で約５を超えるアミン酸を置換することはない。
【００４６】
本発明によれば、上記キメラタンパク質の第１セクションに含まれるＭＨＣペプチド鎖は、好ましくはそのＣ末端で、オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインと融合する。ＣＯＭＰの５量体化ドメインをオリゴマー化ドメインとして用いる場合、このドメインは本発明の開示の背景技術で論じた様に、上記タンパク質のＮ末端のアミノ酸１〜１２８より、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、よりこのましくはこれらアミノ酸より成る。アミノ酸の番号の付け方に関しては、Efimovら、FEBS Letters 341: 54〜58(1994年）を参照せよ。さらに、発明のキメラタンパク質のＭＨＣ部分と同様に、オリゴマー化ドメインの自己集合が損なわれない範囲に於いて、このドメインもアミン酸置換、欠失または挿入により変更できる。
【００４７】
キメラタンパク質内での両ペプチド、即ちそれぞれＭＨＣとオリゴマー化ドメインの融合は直接的であってもよく、または図１および２に示すようにＭＨＣペプチドおよびオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を結合し、且つ隔てる第１リンカー（Ｌ１）を含有してもよい。リンカーの使用による連結が好ましい。一般に、この種のリンカーは３０を越えない、好ましくは２６を越えないアミノ酸を含むだろう。当分野では好適リンカーが知られており、例えば免疫グロブリンヒンジ領域もしくはセリングリシン反復配列が挙げられる。
【００４８】
図１および２にさらに示されている様に、発明のキメラタンパク質はさらに、好ましくはそのＣ末端に、１もしくはそれ以上の第２リンカー（Ｌ２）、ビオチン化ペプチド（ＢＰ）ならびにタグ化ドメインおよび／もしくは精製ドメイン（ＴＤ）をいずれかの順番で含んでいる。好適実施態様では、発明のキメラタンパク質は上記３種類のものを、記載の順番に含んでいる。一般に第２リンカーは２５を越えない、好ましくは２０を越えないアミノ酸を含み、前記第１リンカーに関する説明があてはまるだろう。
【００４９】
発明のキメラタンパク質に場合により含まれるタグ化ドメインは、タンパク質を標識できると見込まれるドメインであればいずれでもよい。好ましくは、タグ化ドメインは標識を含有する。この標識は抗体により認識されるエピトープ、または光検出可能もしくは放射活性標識の様な、ドメインそのものに含めることができる。好ましくは、標識はＦＩＴＣの様な蛍光マーカー、Ｒ−もしくはＢ−フィコエリスリンの様なフィコビリプロテイン、アロフィコシアニン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、発光マーカー、125Ｉもしくは32Ｐの様な放射活性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ、例えば小エビアルカリホスファターゼ（alkaline shrimp hposphatase）のような酵素、エピトープ、レクチンまたはビオチン／ストレプトアビジンより成る群から選択される。
【００５０】
標識自体がタンパク質である場合は、標識に用いるタンパク質のポリペプチド鎖をキメラタンパク質、好ましくはそのＣ末端と融合してタンパク質を標識できる。例えばグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）またはフィコビリプロテインのサブユニットの様な蛍光タンパク質をこのキメラに用いることができるだろう。ＧＦＰキメラタンパク質技術は当分野周知である。フィコビリプロテインの好適ドメインを含むキメラタンパク質は、例えば国際特許出願ＷＯ ０１／４６３９５号に記載されている。
【００５１】
あるいは、標識をタグ化ドメイン内に与えられた特異的結合部位に結合してもよい。例えばタグ化ドメインは、タグ化ドメインの部位特異的にビオチン化でき、その結果ストレプトアビジン／アビジンによる認識を可能にするビオチンタンパク質リガーゼＢｉｒＡの認識部位を含んでもよい。ＢｉｒＡの好適認識配列は欧州特許ＥＰ ７１１ ３０３号に記載されている。同様にレクチンを結合してもよく、または修飾酵素のアミノ酸認識配列を発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列内に組込むことによってその他の部位特異的酵素修飾を行ってもよい。その他の可能なタイプの酵素修飾は欧州特許ＥＰ８１２ ３３１号に記載されている。あるいは、好適に標識された抗体、または標識Ｆ（ａｂ）断片の様な抗体断片を結合させても標識できる。
【００５２】
場合により、発明のキメラタンパク質に含まれることがある精製ドメインは、例えば特異的結合特性を提供することによって発明のタンパク質の精製を支援するいずれのドメインでもよい。これに相応しい配列は当業者に知られており、それらがキメラタンパク質の機能的ＭＨＣおよびオリゴマー化ドメインを妨害しない限りにおいて利用できる。精製ドメインはヘキサヒスチジン配列であることが好ましい。
【００５３】
本発明の第１の局面によれば、発明は上記キメラタンパク質の第２セクション内にあるオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインが自己集合することでオリゴマー化し形成されるオリゴマー化ＭＨＣ複合体に関する。オリゴマー化ドメインのオリゴマー化は、一般的には自発的に起こり、キメラタンパク質の安定したオリゴマーを生ずる。典型的には、オリゴマー複合体は複数の同一モノマーサブユニット（少なくともそれらのＭＨＣ部分に於いては、オリゴマー化ドメインに依存している）より成るだろう。しかし望まれる場合には、それらのＭＨＣ部分において異なる２つ以上のキメラタンパク質をオリゴマー化前に混合してもよい。それによって均一なオリゴマーが得られてもよい。しかしながら、一般には各複合体内の少なくとも２つのキメラタンパク質は同一のＭＨＣαもしくはβサブユニットに由来する第１セクションを含むだろう。ｎ＞２の場合には、オリゴマーは各複合体内に２つのキメラタンパク質を含有し、それらタンパク質は同一のＭＨＣ分子に由来する第１セクションを含むだろう。
【００５４】
ＣＯＭＰのオリゴマー化ドメインを用いて安定したキメラタンパク質の５量体を自発的に集合させることが好ましい。
【００５５】
オリゴマーＭＨＣ複合体はさらに相補的ＭＨＣペプチド鎖を含んで上記の機能的ＭＨＣ結合複合体を形成してもよく、そしてクラスＩＭＨＣ複合体についてはＭＨＣα１およびα２ドメインにより、またクラスＩＩＭＨＣ複合体についてはＭＨＣα１およびβ１ドメインにより形作られるグローブ内に結合するペプチドを含んでもよい。ペプチドは実質的に均一であることが好ましい。
【００５６】
クラスＩＭＨＣタンパク質との複合体の場合には、抗原性ペプチドは約６〜１４アミノ酸長であり、通常は約８〜１１アミノ酸長である。クラスＩＩＭＣＨタンパク質との複合体の場合には、ペプチドは約６〜３５アミノ酸長であり、通常は１０〜２０アミノ酸長である。ペプチドは様々なタンパク質に由来する配列を有するだろう。多くの例では、Ｔ細胞エピトープとして機能するペプチドを使用することが望ましいだろう。当分野では、数多くの抗原のエピトープ配列が知られている。
【００５７】
あるいは、エピトープ配列は天然のＭＨＣタンパク質に結合したペプチドを単離して配列決定することにより、標的配列から演繹される一連の抗原性ペプチドを合成してから各種ペプチドに対するＴ細胞反応性についてアッセイすることにより、またはこれらペプチドを使って一連のＭＨＣ−ペプチド複合体を生成してＴ細胞結合を定量化することによって経験的に決定してもよい。合成ペプチドの合成、配列確認、および関連する最小抗原性配列の特定を包含するペプチド調製法は当分野既知である。いずれの場合も、オリゴマーＭＨＣ複合体に含まれるペプチドは実質的に均一であることが好ましく、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のペプチドが同一であることを意味する。
【００５８】
第２の局面では、本発明はキメラタンパク質そのものに関しており、そのキメラタンパク質は発明のオリゴマーＭＨＣ複合体にオリゴマー化できる。キメラタンパク質はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションと、オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含むが、このコイルドコイルタンパク質はオリゴマー化ドメインの起源である実質的に同一版のポリペプチド鎖が少なくとも２つ並列することでオリゴマー化する。言い換えると、本発明のキメラタンパク質内にオリゴマー化ドメインを提供するのに用いられるオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであろう。しかし一般的には、それはそのオリゴマー化ドメイン内に、オリゴマー形成時に並列する、実質的に同一であるポリペプチド鎖セクションを２またはそれ以上のコピー含んでいる。オリゴマー化ドメインはＣＯＭＰ５量体化ドメインに由来することが好ましい。好適実施態様は、オリゴマーＭＨＣ複合体そのものに関する上記実施態様に同じである。
【００５９】
第３の局面では、本発明はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分をコードしている第１ヌクレオチド配列およびＣＯＭＰのオリゴマー化ドメインのコードする第２ヌクレオチド配列とに作動可能に連結しているプロモータ配列を含む組換え体発現カセットに関する。第１実施態様では、第１ヌクレオチド配列はＭＨＣクラスＩもしくはＩＩα鎖の細胞外部分のＭＨＣペプチド鎖をコードしている。第２実施態様では、第１核酸配列はＭＨＣクラスＩもしくはＩＩβ鎖の細胞外部分のＭＨＣペプチド鎖をコードしている。好ましくは、第２ヌクレオチド配列はＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２をコードする。ＣＯＭＰ配列はヒトＣＯＭＰに由来するのが好ましい。
【００６０】
一般的には、本明細書で使用する命名方法および記載の組換え体ＤＮＡ技術での実験手法は当業者周知であり、当業界で広く用いられている。ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅およびクローニングに関しては標準的な技術を用いた。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を包含する一般的な酵素反応は、製造元の指示書に従い、製造元が供給する酵素緩衝液を用いて実施した。これらの技術および各種その他技術は当業界で知られている様に一般的に実施した。ＭＨＣ、およびＣＯＭＰの様なオリゴマー形成コイルドコイルドメインの好適ヌクレオチド配列配列は上記の如く、当分野既知である。
【００６１】
ＤＮＡ構築体は、一般的にはタンパク質をコードする配列と作動可能に連結している、本来備わっているかまたは異質のプロモータ領域を包含する発現制御ＤＮＡ配列を含んでいる。発現カセットはさらに適当な開始および停止コドン、リーダー配列をコードしている配列等を、選んだ宿主に応じて含むだろう。発現カセットは、選択した宿主を形質転換する、および／または上記宿主での安定した発現を維持するのに適したベクター内に組み入れることができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結」は１またはそれ以上のＤＮＡ配列の上流にあるプロモータと連結しており、該プロモータがＤＮＡ配列の転写を媒介することを意味する。好ましくは、発現制御配列は、希望する真核生物または非真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションできるような、ベクター内にある真核生物または非真核生物プロモータシステムである。ベクターを適当な宿主内に組込んだら、宿主をヌクレオチド配列の高レベル発現に好適な条件の下に維持し、キメラタンパク質を収集し、精製する。
【００６３】
ＣＯＭＰを含むオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来する好適オリゴマー化ドメインのＭＨＣ−ＤＮＡ配列およびＤＮＡ配列は、各種のヒトまたはその他細胞より周知な方法に従って単離できる。伝統的には希望の配列は、適当な細胞株から単離したメッセンジャーＲＮＡより調製した好適なｃＤＮＡライブラリーから増幅する。ＤＮＡ配列に好適な細胞源、ならびに発現および分泌に好適な宿主細胞は、American Type Culture Collection(ATCC）またはその他商業的供給元といった様々な供給源から得ることができる。
【００６４】
宿主細胞のトランスフェクションに用いるヌクレオチド配列または発現カセットは、標準的な技術によって変更でき、希望する様々な特性を持ったキメラ分子を生ずる。本発明の分子は、当業者周知の様々な組換え体ＤＮＡ技術を利用して容易にデザインおよび製造できる。例えば、アミノ酸の挿入、置換、欠失等によって鎖を本来ある配列の一次構造レベルで変更できる。このような変更を様々に組み合わせて用いて、最終的な変更タンパク質鎖を生成できる。一般には、キメラ分子をコードしている遺伝子の変更は、部位指定突然変異誘導といった各種周知技術により容易に達成できる。
【００６５】
上記アミノ酸配列の変異種は、キメラ分子の精製および調製を容易にする、または複合体のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）およびエクス（ｅｘ ｖｉｖｏ）での安定性を高めるために、標的Ｔ細胞に対する分子親和性を上げること、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ複合体と相互作用するそれぞれＣＤ４またはＣＤ８コレセプターに対する分子親和性を上げるか、または下げることを包含する想定される様々な目的に対し調製できる。しかし変異種はそれぞれ、一般的には本来のＭＨＣ分子と同一もしくは類似の生物活性を示し、関係するオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のもつ本来のオリゴマー化ドメインに相当するオリゴマー化特性を保持するだろう。
【００６６】
さらに、オリゴマーの調製は前進的な工程である。治療を目的とする使用では、それは哺乳動物細胞の培養、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはヒト細胞株で実施されるだろう。あるいは本発明の分子の発現には、バキュロウイルスやDrospophila melanogaster発現系を含む昆虫細胞の培養、酵母発現系、またはEscherichia coli（E.coli）の様な原核生物発現系を含む他の発現系を用いることもできる。原核生物発現系で発現を行う場合には、可溶性発現、即ち細胞質もしくはペリプラズマ内への発現、または不溶性発現、即ち封入体への発現のいずれもが可能である。
【００６７】
Ｅ．ｃｏｌｉにとって典型的なベクターは、誘導性のｌａｃオペロンに基づく系の中にバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる効率的発現を組み合わせたｐＥＴファミリーのベクターの一つであろう。対象のヌクレオチド断片を含有するベクターは、宿主細胞のタイプに応じて、周知の方法により宿主細胞内にトランスフェクションできる。例えば、原核生物細胞では一般に化学物質−もしくは電気−コンピテント細胞への形質転換が利用されるが、その他宿主細胞の場合にはリン酸カルシウム処理、陽イオン性リポソーム、またはエレクトロポレーションが用いられるだろう。哺乳動物細胞をトランスフェクションするのに用いられるその他方法としては、Polybrene、プロトプラストキメラ、マイクロプロジェクタイルおよびマイクロインジェクションの使用が挙げられる。
【００６８】
キメラタンパク質および相補的ＭＨＣαもしくはβサブユニットをそれぞれ同一細胞内で共発現してオリゴマー複合体として集合させてもよい。あるいは、これら２成分を別々に生成してから選択した抗原性ペプチド存在下にインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で会合させて安定したオリゴマーＭＨＣペプチド複合体を形作ってもよい。後者では、２成分の混合と会合は、キメラペプチドのオリゴマー形成の前または後のいずれに行ってもよい。
【００６９】
独立した成分をインビトロで会合させることの利点は、オリゴマーＭＨＣペプチド複合体を高いペプチド均一度、例えば９５％を超える、または９９％を超える均一度で獲得できることである。複合体を完全に集合した分子として発現させる場合は、対象のペプチドは、発現細胞を対象の抗原性ペプチドを含有する培地で培養するか、またはインビトロで発現している最中に対象のペプチドを内因性に結合したペプチドで交換することによって複合体内に取り込むことができるが、後者は一般的には精製した複合体を過剰量のペプチドと低もしくは高pHでインキュベーションして抗原結合ポケットを開かせることで行われる（例えば国際特許出願９３／１０２２０参照）。抗原性ペプチドはまたフォトアフィニティー標識法のような標準的な方法を用いても共有結合できる（例えば国際特許出願ＷＯ９３／１０２２０参照）。
【００７０】
あるいは、ペプチドをキメラタンパク質の発現構築体またはその相補的αもしくはβ鎖に直接結合または融合してもよい。キメラタンパク質またはその相補的αもしくはβ鎖のペプチド部分とＮ末端間に、例えばポリグリシン反復配列の様な好適リンカーを入れてもよい。ペプチドを発現構築体内にキメラペプチドとして含有させることにより、抗原性ペプチドをさらに付加することなしに、またはペプチドを交換することなしに完全なＭＨＣ−ペプチドオリゴマー複合体を発現させ、折り畳ませることができる。
【００７１】
インビトロでのサブユニットおよびキメラタンパク質の折り畳み、および会合を可能にする条件は当分野既知である。クラスＩＭＨＣペプチド複合体の集合、ならびに機能的クラスＩＩ複合体の集合は、例えば欧州特許ＥＰ ８１２ ３３１に記載されている。許容条件の一例では、ほぼ等モルの可溶化したαおよびβサブユニットを対象の抗原性ペプチドが過剰量存在する状態で、尿素溶液の中で混合する。クラスＩＩＭＨＣ分子の場合は、尿素を含まない緩衝液に希釈するか、または透析することで再折り畳み（refolding）が開始する。ペプチドを空のクラスＩＩヘテロダイマー内に約pH５〜５．５で、約１〜３日間加えてから中和し、濃縮して緩衝液を交換する。α−β−ペプチド複合体の形成と同時に、複合体のオリゴマー化が起こるはずである。あるいは２段階で５量体のαまたはβ複合体を獲得してもよい：第１段階でオリゴマー化ドメインのオリゴマー化を行い、続いて上記方法に従ってペプチド存在下に相補的αもしくはβサブユニットとさらに再折り畳みを行う。
【００７２】
発明の集合複合体、または当初分離した状態の本発明のキメラタンパク質および相補的なαもしくはβサブユニットは、硫安沈殿法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を含むカラムクロマトグラフィー法を含む当分野の標準的な方法に従って精製できる。
【００７３】
生じた本発明のペプチド鎖またはオリゴマーＭＨＣ複合体は治療目的に使用しても、あるいはアッセイ方法、免疫染色等の開発および実施に使用してもよい。本発明のオリゴマーＭＨＣ複合体の治療的使用では、特定の病気を治療するのに役立つＭＨＣハプロタイプおよび抗原を特定することが求められる。さらに本発明による複合体の治療に使用する前に、患者の組織タイプを決定することも必要となろうが、しかしこれは当分野周知の標準的な方法である。本発明は癌、感染症、自己免疫疾患の治療、および移植体拒絶の予防に特に好適である。当業者は、この様な病気の病因に関する知識、および関連の動物モデルの研究結果を基にして、この様な各種病気と関係するＭＨＣは、ハプロタイプおよび抗原を特定し、単離できる。
従って、第５の局面では、本発明は先に記載の上記オリゴマーＭＨＣ複合体を含む医薬用又は診断用組成物に関する。タンパク質を含む医薬用組成物は、例えば非経口投与、すなわち皮下内、筋肉内又は静脈内で使用できる。さらに、多くの新規な薬剤配送方法が開発されている。本発明の医薬組成物は、これらの新しい方法を使用して投与するのにも同様に適している。
【００７４】
非経口投与用組成物は、一般的には許容可能な担体、好ましくは水性担体に溶解したキメラタンパク質もしくはその５量体の溶液を含むだろう。各種水性担体、例えば緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等を用いることができる。これら溶液は無菌であり、一般には粒子状物を含まない。これら組成物は通常の、周知の滅菌技術により滅菌されるだろう。組成物は生理的状態を近づける必要がある場合には、pH調整および緩衝化剤、毒性調整剤等の医薬的に許容可能な補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有してもよい。これら製剤中のキメラタンパク質の濃度は広範囲であり、即ち約１pg/ml未満、少なくとも約０．１mg/mlから１０〜１００mg/ml程までであり、実際の投与形態に従い、液体の容積、粘度等に主に基づき選択されるだろう。
【００７５】
筋肉内注射向けの典型的な医薬組成物は、無菌緩衝水１ml、オリゴマー複合体タンパク質０．１mgを含有する様に調合されるだろう。静脈内注入向けの典型的組成物は無菌リンゲル液２５０ml、およびオリゴマー複合体タンパク質１０mgを含有する様に調合されるだろう。非経口投与可能な組成物の調合に関する実際の方法は当業者に知られているか、または自明である。
【００７６】
本発明のキメラタンパク質またはオリゴマーＭＨＣ複合体は保存のために凍結乾燥することができ、そして使用前に好適キャリアを用いて元に戻すことができる。この技術は効果的であることが示されており、一般に用いられる凍結乾燥および還元技術が利用できる。凍結乾燥および還元が様々な程度で活性を失わせること、および使用レベルを調整してこれを補償しなければならないことが当業者により認識されるだろう。
【００７７】
Ｔ細胞をそれらの抗原レセプターの特異性に基づき検出する、または分離することは、上記の如く、いずれかの既知技術を包含してもよい。好適な技術は、例えば欧州特許ＥＰ ８１２ ３３１に開示されており、そして参照によってここに組込まれている。より詳しくは、発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は浮遊液もしくはその他生物学的サンプル、例えば組織サンプル中の抗原特異的Ｔ細胞の標識化および検出に用いることができ、あるいは例えば当業者既知の常磁性もしくはその他ビーズを含む基材上に結合もしくは固定することによる、またはフローサイトメトリーによるＴ細胞の分離に使用してもよい。
【００７８】
従って本発明の複合体は、例えば特定の抗原に特異的であるＴ細胞を精製および濃縮すること、ならびにこれらＴ細胞を細胞培養で拡張および／その他操作を行った後に各種疾患状態にある患者に自家移植的に戻すことに用いることができる。あるいは、例えば自己免疫疾患またはその他不要のＴ細胞免疫反応に於いてＴ細胞を選択的に除くこともできる。
【００７９】
本発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は、特異的Ｔ細胞レセプターに対し高められた親和性を有することから、薬物の効力の改善、血清半減期の向上を可能にし、さらには薬物動態も改善できるが、後者は分子質量の増加に拠るものと思われる。
【００８０】
非真核生物系では、発明のオリゴマーＭＨＣ複合体に含まれるキメラタンパク質および相補的ＭＨＣαもしくはβ部分を発現する可能性があることから、それらはより容易かつ高収率に作製することができ、そしてそれらをサブコンポーネントとして発現した後に抗原性ペプチドの均一集団が存在する状態で互いに再折り畳みすることもできる。
【００８１】
当業者は上記説明より、これら並びにその他の利点を利用することができる。以下の実施例は例示のみを目的とするものであり、いかなる形でも発明を限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【００８２】
以下は５量体型のクラスＩＭＨＣ複合体のクローニング、発現および精製に関する詳しい例であり、複合体はβ２ｍとＣＯＭＰのキメラ融合体を含んでいる。キメラβ２ｍ−ＣＯＭＰタンパク質はＥ．ｃｏｌｉでは不溶性の封入体の中に発現し、その後インビトロで５量体のβ２ｍ−ＣＯＭＰに集合する。次にＴ細胞抗原を表す適当な合成結合ペプチド存在下にβ２ｍ−ＣＯＭＰ５量体とＨＬＡ−Ａ*０２０１として知られるヒトＭＨＣクラスＩα分子とを組み合わせる２回目の再折り畳み反応により５量体型クラスＩＭＨＣペプチド複合体を形作る。この例では、エプスタインバーウイルスＢＭＬＦ１タンパク質に由来する特性のよく分かっている抗原であるＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（アミノ酸２８９〜２９７）を使用している。得られた複合体を蛍光成分で標識し、フローサイトメトリーを用いた混合リンパ細胞集団からの抗原特異的Ｔ細胞検出の染色試薬として用いる。
【００８３】
１．β２ｍ−ＣＯＭＰ構築体の分子クローニング
作業はβ２ｍをｐＥＴ−２４ｃベクター内に連続的にクローニングすること、ｐＥＴＢＭＣ０１と称する構築体を獲得すること、続いてビオチン−タンパク質リガーゼＢｉｒＡを用いて部位特異的にビオチン化するためのビオチンアクセプター配列（ＢＰ）と共に軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のオリゴマー化ドメインを挿入すること、ｐＥＴＢＭＣ０２と称する構築体を獲得することを包含する。ポリグリシンリンカーをβ２ｍとＣＯＭＰの間にクローニングし、ｐＥＴＢＭＣ０３と称する３番目の構築体を獲得し、部位指定突然変異導入法によりセリン残基、ポリグリシンリンカーの前に置かれたセリン残基を取り除いて、目的とするｐＥＴＢＭＣ０４と称する（図３も参照）β２ｍ−ＣＯＭＰ／ｐＥＴ−２４ｃ構築体を得る。セリン残基の除去は、β２ｍ分子がＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質と会合した時に立体的な障害を起こさないように実施する。
【００８４】
１．１ ｐＥＴ−２４ｃベクター内へのβ２ｍのクローニング
β２ｍの供給源
β２ｍの細胞外部分はＤＮＡ配列の７４bp〜３７０bpにコードされる９９アミノ酸（成熟タンパク質のＩｌｅ１〜Ｍｅｔ９９に等しい）を含む。β２ｍ配列のこの領域は正常人リンパ細胞ｃＤＮＡライブラリーより、それぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を組み込んでいるプライマーＢＭＣ＃１（１μM）およびＢＭＣ＃２（１μM）を用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅した。（Sigma-Genosys、プライマー配列に関する補遺Ｉを参照）。増幅はプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Pfx、Invitrogen）（１．２５U）を用い、２mM ＭｇＳＯ4および０．２mM ｄＮＴＰｓを追加したＰｆｘ増幅緩衝液中で、次の標準的なサーマルサイクル条件で実施した。ステップ１：９４℃、４分間；ステップ２：９４℃、１分間；ステップ３：５５℃、１分間；ステップ４：７２℃、３０秒間；ステップ５：ステップ２に循環、３４回；ステップ６：７２℃、１０分間。
【００８５】
β２ｍおよびｐＥＴ−２４ｃの制限酵素消化
β２ｍＰＣＲ産物を上記混合物よりＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを、製造元指示書（Qiagen）に従い使用して精製した。精製ＰＣＲ産物２００ngおよびｐＥＴ−２４ｃベクター（Novagen）１μgをそれぞれ、製造元指示書に従ってＢａｍＨＩ（１０U）およびＮｄｅＩ（１０U）制限酵素（New England Biolabs、ＮＥＢ）で４時間、３７℃消化した。消化断片を１％アガロース（Bioline）を用いた水平式ゲル電気泳動で分離し、ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キットを製造元指示書（Qiagen）に従い用いて精製した。
【００８６】
β２ｍのｐＥＴ−２４ｃ内連結（ｐＥＴＢＭＣ０１）
ゲル精製した挿入物およびベクターＤＮＡをモル比１：３（ベクター：挿入物、５０ng：７．５ng）でＴ４ＤＮＡリガーゼ（５U；Bioline）を用いＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（添付品）中で１６時間、１６℃で連結した。
【００８７】
ｐＥＴＢＭＣ０１のＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内への形質転換
続いて連結混合物および適当なコントロールをＸＬ１−Ｂｌｕｅ株コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞内に、製造元の指示書（Stratagene）に従って形質転換した。細胞をカナマイシン３０μg/mlを含有するLuria-Bertani（ＬＢ）寒天プレート上に細胞を接種し、一晩３７℃でインキュベーションして上手く形質転換した細胞を選別した。
【００８８】
形質転換細胞のＰＣＲスクリーニング
細菌形質転換プレートから選択した単一コロニーを、クローニング部位に隣接するｐＥＴベクター領域に相補的であるＴ７プロモータ（１μM）およびＴ７ターミネータ（１μM）プライマー（Sigma Genosys、プライマー配列に関する補遺Ｉ参照）を用いたＰＣＲでスクリーニングした。増幅はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１U、Bioline）を２mM ＭｇＳＯ4および０．２mM ｄＮＴＰｓを追加したＴａｑ反応緩衝液（添付品）中に用い、上記２５サーマルサイクル反応で実施した。形質転換細胞は約５００bpのＤＮＡ断片を生成したが、これは１．５％アガロースゲル電気泳動で確認された。
【００８９】
プラスミドＤＮＡ調製
正確な大きさのＰＣＲ産物を生成した形質転換細菌細胞を無菌のＬＢ−カナマイシン培地６mlに接種し、２００rpmで振盪しながら一晩、３７℃でインキュベーションした。ｐＥＴＢＭＣ０１プラスミドＤＮＡを菌培養物より、QIAprep Spin Mini-prepキットを製造元の指示書（Qiagen）に従い用いて回収した。これらプラスミド内にβ２ｍ断片が存在することをさらに自動ＤＮＡにより確認した。ｐＥＴＢＭＣ０１の概略図を図３（ｂ）に示すが、特に制限部位を明示している。
【００９０】
１．２．ｐＥＴＢＭＣ０１内へのＣＯＭＰ−ＢＰのクローニング
ＣＯＭＰ−ＢＰカセットの構築
ＣＯＭＰのオリゴマー化ドメインの配列はGenebankデータベース（登録番号１７０５９９５）より、そしてコイルドコイルドメイン（アミノ酸２１〜８５）はＣＯＭＰの自己会合実験（Efimovら、FEBS Letters 341: 54〜58(1994年)）に基づき選択した。ビオチンアクセプタ配列「ＢＰ」；ＳＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥをＣ末端に組み入れ、さらに１４アミノ酸リンカー、即ちＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰＥＴを加えてＣＯＭＰオリゴマー化ドメインとＢＰとの間を物理的に隔てた。
【００９１】
「ＰＣＲアッセンブリ」反応に重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＢＭＣ＃３、ＢＭＣ＃４、ＢＭＣ＃５、ＢＭＣ＃６、ＢＭＣ＃７およびＢＭＣ＃８）を用いて全領域を合成した。オリゴヌクレオチド配列は補遺Ｉに示しており、Sigma-Genosysを用いて合成および精製（「PAGE-pure」）した。プライマー（４．８pmoles）をＴ４キナーゼ（１０U、Gibco）を用いて、ＡＴＰを１mM追加したフォワード反応緩衝液（添付品）に１時間、３７℃でリン酸化した。反応は８０℃で１５分間加熱して反応を停止した後、室温まで冷却してオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを１．１節と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一つに連結し、ＰＣＲに〜１０ngを用いて配列末端を「埋める」し、合成遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応はＢＭＣ＃３（１５μM）およびＢＭＣ＃８（１５μM）次のサーマルサイクル条件でフォワードおよびリバースプライマーとして用いた以外は実質的に１．１節と同様であった：ステップ１：９５℃、４分間；ステップ２、１分間；ステップ３：７０℃、１分間；ステップ４：７２℃、２分間；ステップ５：ステップ２に循環、１５回；ステップ６：７２℃、１０分間。正確なサイズのＰＣＲ産物は前述（１．１節）同様にゲル精製した。
【００９２】
ｐＥＴＢＭＣ０１内にＣＯＭＰ−ＢＰカセットを挿入してｐＥＴＢＭＣ０２を生成する
生成ＣＯＭＰ−ＢＰ２００ngおよびｐＥＴＢＭＣ０１ベクター１μgを、１．１節に記載した様にＨｉｎｄＩＩＩ（１０U）およびＸｈｏＩ（１０U）制限酵素（ＮＥＢ）を用いて、４時間、３７℃で消化した。消化産物を１．１節同様に精製、連結、形質転換およびＰＣＲスクリーニングした。スクリーニングの結果が陽性のプラスミドを精製し、１．１節同様に配列決定した。
【００９３】
制限部位を明示したｐＥＴＢＭＣ０２の概略図を図３（Ｃ）に示す。ＣＯＭＰ−ＢＰをコードするセクションはこの構築体のフレーム外にある。
【００９４】
１．３．ｐＥＴＢＭＣ０２内へのポリグリシンリンカーのクローニング
ポリグリシンリンカーの合成
ポリグリシンリンカーを、重複するオリゴヌクレオチドＢＭＣ＃９およびＢＭＣ＃１０（Sigma-Genosys、「PAGE-pure」、補遺Ｉ）をアニーリングして合成した。ポリグリシンリンカーは、正確なリーディングフレームにコードされている場合には、一文字アミノ酸コードで表される次のモチーフ：ＧＳ（ＧＧＧＧＳ）4ＧＧＫを含んでいる。先頭の２個の残基はＢａｍＨＩ制限部位によりコードされたものであり、最後の残基はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりコードされたものである。ポリグリシンリンカーのヌクレオチド配列は切断されたＢａｍＨＩ制限部位の５’突出部と切断されたＨｉｎｄＩＩＩヌクレオチド認識モチーフの３’突出部のみを組み込んでいることから、次の連結に好適な相補的な一本鎖突出部を作るためにアニーリング生成物をさらに消化する必要はない。オリゴヌクレオチドは１．２節に記載した様にリン酸化し、アニーリングした。
【００９５】
ｐＥＴＢＭＣ０２内にポリグリシンリンカーを挿入しｐＥＴＢＭＣ０３を生成する。
ｐＥＴＢＭＣ０２をＢａｍＨＩ（１０U）およびＨｉｎｄＩＩＩ（１０U）で消化した。アニーリングしたポリグリシンリンカーのｐＥＴＢＭＣ０２内への連結は、アニーリングしたオリゴヌクレオチド量を９６fmole/μlとして前述同様（１．１節）に行った。形質転換およびＰＣＲスクリーニング反応は１．１節に記した通りであるが、さらにＰＣＲスクリーニング産物を制限酵素消化してＳａｌＩ制限部位の有無を確認し、挿入されたリンカーが存在することを実証した。上手く形質転換した細胞は、プラスミドベクターの主鎖より部位が除かれているため、ＳａｌＩ消化に対し感受性ではない。ｐＥＴＢＭＣ０３の精製および自動配列決定は１．１節に記載の通りに行った。
【００９６】
ｐＥＴＢＭＣ０３の概略図を図３（ｄ）に示し、制限部位を明示した。ＢａｍＨＩ部位はポリグリシン配列直前にセリン残基をコードしている。このセリン残基は最終的に取り除かれ、３（ａ）に示す様にｐＥＴＢＭＣ０４を生ずる。
【００９７】
１．４．ポリグリシンリンカー直前にあるセリン残基の除去
ｐＥＴＢＭＣ０３の部位指定突然変異導入
ＭＨＣクラスＩ分子のＸ線結晶分析モデルの解析から、β２ｍのＣ末端はα鎖のα３ドメインに近接していることが示されている。従って、ＢａｍＨＩ制限モチーフがコードするセリン残基を取り除き、Ｇ（ＧＧＧＧＳ）4ＧＧＫを含むリンカーを作ることにより、ポリグリシンリンカーの開始点の柔軟度を最大にすることが望ましい。部位指定突然変異誘導キット（「QuickChange」、Stratagene）を製造元指示書に厳格に従って用い、ＢａｍＨＩ認識モチーフ内にセリンをコードしているＴＣＣトリプレットを取り除くことができるＰＣＲプライマーＢＭＣ＃１１およびＢＭＣ＃１２（「PAGE-pure」、補遺Ｉ）を得た。この構築物が正確なものであることは、自動配列決定（１．１節）により実証され、ｐＥＴＢＭＣ０４と命名された。
【００９８】
ｐＥＴＢＭＣ０４の概略図を図３（ａ）に示す。特にこの図はｐＥＴ２４ｃ中にある完全なβ２ｍ−ＣＯＭＰ構築物の概略図を示しており（ｐＥＴＢＭＣ０４）、制限部位が明示されている。
【００９９】
２．ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖構築物の分子クローニング
２．１ ｐＥＴ−１１ｄベクター内へのＡ*０２０１α鎖のクローニング
ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖（ＥＭＢＬ Ｍ８４３７９）の細胞外部分はメッセンジャーＲＮＡ配列の塩基７３〜９００がコードする２７６個のアミノ酸（成熟タンパク質のＧｌｙ１〜Ｐｒｏ２７６に等しい）を含む。Ａ*０２０１配列のこの領域は、正常人リンパ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、それぞれＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を組み込んだプライマーＡ２Ｓ＃１およびＡ２Ｓ＃２を用いてＰＣＲにより増幅された。Ａ*０２０１挿入物をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ−１１ｄベクター（Novagen）内にクローニングする方法は、１．１節でのβ２ｍに関する説明と実質同じである。
【０１００】
得られたプラスミドはｐＥＴＡ２ｓｏｌと名付けられ、制限部位を明示した概略図を図３（ｅ）に示す。
【０１０１】
３．β２ｍ−ＣＯＭＰおよびＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖タンパク質の発現
同じ操作を実行してβ２ｍ−ＣＯＭＰまたはＡ*０２０１α鎖タンパク質を生成した。プラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内に形質転換し、大規模に細菌調製を行った。タンパク質は細菌細胞内に不溶性の封入体として生成されるので超音波処理して回収した。精製封入体を変性緩衝液内で可溶化し、必要時まで−８０℃で保存した。特に記載しない限り、化学薬品はＳｉｇｍａより得た。
【０１０２】
３．１．組換え体タンパク質の大規模生成
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内へのｐETＢＭＣ０４およびｐＥＴＡ２ｓｏｌの形質転換
精製したプラスミドＤＮＡをＥｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換したが、この株はｐＥＴをベースとする構築物からタンパク質を発現させるのに必要なＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを持っている。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Stratagene）内への形質転換は、製造元指示書に従い、各反応について精製プラスミドＤＮＡ０．５μgを用いて、適当なコントロールと共に実施した。形質転換に成功したものを、カナマイシン３０μg/ml（ｐＥＴＢＭＣ０４）またはアンピシリン１００μg/ml（ｐＥＴＡ２ｓｏｌ）に加えてクロラムフェニコール３４μg/mlを含有するＬＢ−寒天プレートを用いて選択した。
【０１０３】
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の増殖
単一の形質転換細菌コロニーを、選択に適した抗生物質を含有する無菌ＬＢ培地６０mlに接種し、暖かな（〜２４℃）部屋に一晩放置した。一晩培養した物をＬＢ培地６リットルに加え、振盪しながら（〜２４０rpm）、対数期半ばまで（ＯＤ600＝０．３〜０．４）増殖させた。タンパク質の発現の誘導は、この段階で各フラスコに１ＭのＩＰＴＧ１mlを加えて行った。培養物はさらに振盪しながら４時間、３７℃に放置し、その後細胞を遠心分離により集め、上清を廃棄した。
【０１０４】
超音波処理およびタンパク質回収
細菌細胞の沈殿を氷上に置いた小型のガラス製ビーカーの中で氷冷した緩衝塩類溶液に懸濁してから超音波処理して（ＸＬシリーズ超音波装置；Misonix Inc.、ＵＳＡ）細胞を溶解し、タンパク質封入体を放出させた。細胞が完全に溶解した後、封入体をBeckmann高速遠心分離装置（Ｊ２シリーズ）を用いて１５，０００rpm、１０分間遠心分離を行い、５０mlのポリカーボネート製Oak Ridge遠心チューブの中に沈殿させた。次に封入体を冷したTriton洗浄緩衝液（０．５％Triton X-100、５０mM Tris、pH８．０、１００mM塩化ナトリウム、０．１％窒化ナトリウムおよび用時添加の２mMジチオスレイトール［ＤＴＴ］）で３回洗浄したが、洗浄が終わる度にハンドヘルド式のガラス製ホモジェナイザーを用いて沈殿を再懸濁した。最後に界面活性剤を含まない洗浄緩衝液で洗浄した。
【０１０５】
得られた精製タンパク質調製物を、５０mMのＭＥＳ、pH６．０、０．１mM ＥＤＴＡおよび１mM ＤＴＴを含む８Ｍ尿素緩衝液２０〜５０mlに溶かし、転倒型ローター内に一晩、４℃で放置した。不溶性粒子を遠心分離して取り除き、Brafordタンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad Laboratories）を用い、既知標準物と比較してタンパク質の収量を決定した。またサンプルを１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた垂直型電気泳動にかけ、発現および精製の質についても検証した。典型的なタンパク質収量はＬＢ培養物１リットル当たり２５〜７５mgであった。β２ｍ−ＣＯＭＰおよびＡ*０２０１α鎖タンパク質の大きさはそれぞれ約２７（kD）および３５（kD）であった。尿素溶解タンパク質は、その後の使用に備えて１０mgずつ小分けし、−８０℃に保存した。
【０１０６】
４．５量体β２ｍ−ＣＯＭＰ複合体の形成
４．１．β２ｍ−ＣＯＭＰの５量体への集合
尿素可溶化封入体からのβ２ｍ−ＣＯＭＰの集合は、０．２Ｍの塩化ナトリウムおよび１mMのＥＤＴＡを含む２０mMのＣＡＰＳ緩衝液、pH１１．０にタンパク質を希釈して最終タンパク質濃度１．５mg/mlにすることで実施した。室温にて酸化および還元グルタチオンを最終濃度がそれぞれ２０mMおよび２mMになるよう添加して、タンパク質を酸化した。一晩インキュベーションした後、１０％ビス−トリシンゲル（Invitrogen）を用いた非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてジスルフィド結合の形成について分析した。
【０１０７】
続いてタンパク質混合物の緩衝液をCentricon Plus-20 Ultra-遠心分離濃縮装置（カットオフ分子量１０kD、Millipore）を製造元指示書通りに使用して２０mMのTris、pH８．０、５０mM塩化ナトリウム（「Ｓ２００緩衝液」）に交換し、ＢｉｒＡ（Affinity、Denver、Colorado）を用いた酵素によるビオチン化に備えて最終容積を４．５mlまで濃縮した。１０倍濃度のＢｉｒＡ反応緩衝液（添付品）０．５mlを加え、最終濃度１０μMの組換え体ＢｉｒＡ酵素に１０mMのＡＴＰ、pH７．０を追加した。タンパク質を保護するためにプロテアーゼインヒビター：０．２mMのＰＭＳＦ、２μg/mlのペプスタチンおよび２μg/mlのロイペプチンも選択して使用した。反応液は室温に４時間放置した。
【０１０８】
４．２．ビオチン化β２ｍ−ＣＯＭＰ５量体の精製
ビオチン化したβ２ｍ−ＣＯＭＰ５量体は、Superdex200HR26/60カラム（Amersham Biosciences）分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用い、Ｓ２００緩衝液を流して精製した。カラムは前もって製造元指示書に従い校正してから使用し、１３５kDa領域の５量体を含有する分画を集めた。タンパク質回収量はBradfordアッセイを用いて決定し、ビオチン化効率はＨＡＢＡ試薬（Pierce）を製造元指示書に従い用いて決定した。
【０１０９】
５．再折り畳みＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ複合体の形成
５．１．ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖のビオチン化β２ｍ−ＣＯＭＰおよびペプチドの再折り畳み
再折り畳み緩衝液５００mlを次のようにして準備した：１００mM Ｔｒｉｓ、pH８．０、４００mM塩酸アルギニン、２mM ＥＤＴＡ、５mM還元グルタチオンおよび０．５mM酸化グルタチオンを脱イオン水に溶解し、４℃で攪拌し続けた。凍結乾燥した合成ペプチドＧＬＣＴＬＶＡＭＬ１５mgをジメチルスルホキシド０．５mlに溶解し、攪拌しながら再折り畳み緩衝液に加えた。ビオチン化した５量体のβ２ｍ−ＣＯＭＰ５０mgおよびＡ*０２０１α鎖３０mgを連続的に加え、適当な分散を確保するために強く攪拌している緩衝液の中に２３ゲージの皮下注射用針を通して直接注入した。再折り畳み混合液はそのまま１６時間、４℃で攪拌し続けた。
【０１１０】
５．２ 再折り畳み５量体ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ複合体の精製
続いてタンパク質再折り畳み混合液を分子量カットオフ３０kDのMini Kros中空糸限外濾過カートリッジ（Spectrum Labs、Rancho Dominguez、California）を用いて５００mlから２０mlに濃縮した。Centricon Plus-20遠心分離式濃縮装置（分子量カットオフ３０kD）を製造元指示書通りに用いて複合体を２０mlから５mlに更に濃縮し、続いて使い捨て式ＰＤ１０脱塩カラム（Amersham Biosciences）を製造元指示書通りに用いて緩衝液をＳ２００緩衝液に交換した。最終容積は７．５mlであった。濃縮したタンパク質再折り畳み混合液をまず４．２節同様にしてSuperdex 200 HR26/60ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを用いたＳＥＣにより精製した。３１０kD領域のタンパク質複合体を含有する分画を集めた。
【０１１１】
ＳＥＣで集めた分画を一つにまとめ、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、１５倍容量の２０mM Ｔｒｉｓ中０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの塩勾配液を流して更に精製した。主要ピークを集めた。タンパク質回収量はBradfordアッセイを用い決定した。
【０１１２】
５．３．精製複合体の蛍光標識化
ストレプトアビジン分子はそれぞれ最大４個までのビオチンに結合できることから、フィコエリスリン（ＰＥ）標識ストレプトアビジンを用いた最終標識化は、４．２章でβ２ｍ−ＣＯＭＰに対して行ったはじめのビオチン化効率を考慮に入れて、それぞれビオチン化５量体複合体に対するストレプトアビジンのモル比を１：０．８にして実施した。必要とされる５量体複合体全量を分割し（例えば５等分し）、ストレプトアビジン−ＰＥ内に連続的に滴下した。Ａ*０２０１の５量体−ストレプトアビジン複合体の濃度を０．０１％アジ化物および１％ＢＳＡを補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１mg/mlに調整した。こうして作製した蛍光試薬は４℃に保存した。
【０１１３】
６．抗原特異的Ｔ細胞の染色
抹消血リンパ球（ＰＢＬ）は、健康なＡ*０２０１陽性であり、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ抗原を用いて強い細胞傷害性Ｔ細胞反応を誘導されたことが前もって確認されているＥＢＶキャリアから血液サンプルを採取して得た。ＰＢＬはFicoll(Amersham Biosciences）を用いた密度勾配遠心分離により単離してからＰＢＳ溶液で洗浄し、細胞数を計測した。各染色条件について１〜２×１０6個のリンパ細胞を割り当て、細胞を１回、洗浄緩衝液（０．１％アジ化ナトリウム、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）で洗浄してから洗浄緩衝液５０□lに再浮遊した。抗ＣＤ８抗体（Dako）と組み合わせてＰＥ標識したＡ*０２０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ５量体１□ｇを用い、小分け細胞の単一群を染色して細胞傷害性Ｔ細胞集団であることを確認した。浮遊液を氷上、暗所にて少なくとも３０分間インキュベーションし、その後暗所にて細胞を洗浄緩衝液で２回洗ってから固定液（１％ウシ胎児血清、２．５％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液）内に保存した。その後サンプルを、CellQuestソフトウエアーを用い、Becton-Dickinson FACScan（商標）フローサイトメータで、当業者周知の標準的な方法に従い分析した。
【０１１４】
補遺Ｉ：ＤＮＡ構築物の合成に用いたプライマー一覧表
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】発明のオリゴマーＭＨＣクラスＩ複合体の概略図。図は完全に集合したオリゴマークラスＩキメラ複合体の複数あるサブユニットのうちの２つを示している。β２−ミクログロブリン（β２ｍ）はオリゴマー形成コイルド−コイルタンパク質のコイル状のオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）と融合しているが、このドメインとは第１リンカー（Ｌ１）によって隔てられている。該ドメインのＣ末端には別のリンカー（Ｌ２）が備えられており、さらにビオチン−タンパク質リガーゼＢｉｒＡによるビオチン化のための認識配列（ＢＰ）が続き、最後に精製および検出のためのタグ化／精製ドメイン（ＴＤ）が来ている。ビオチン化ペプチド（ＢＰ）の形態における認識配列のリジン残基と結合している、ビオチン分子（ｂｔ）も示している。ドメインα１、α２およびα３を有する相補的ＭＨＣクラスＩα鎖は、β２ｍおよび抗原性ペプチド（Ｐ）と集合する。複合体のＭＨＣ部分を安定化するジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が描かれている。オリゴマー化ドメインがＣＯＭＰに由来し、集合して安定な５量体を形成する特殊な例を図示する別のジスルフィド結合も示されているが、この場合これらジスルフィド結合が５量体内のＣＯＭＰドメインの各ペアを連結している。複合体中の各αおよびβのアミノ末端およびカルボキシル末端はそれぞれＮおよびCで表している。
【図２】発明のオリゴマーＭＨＣクラスＩＩ複合体の概略図。図では一般に図１の名称を用いているが、（β２ｍ）はドメインα１、α２を有し、リンカー（Ｌ１）を介してオリゴマー化ドメインと融合しているＭＨＣクラスＩＩα鎖に置換えられている。この場合、α鎖は、それに相補的であり、ドメインβ１、β２を有するＭＨＣクラスＩＩβ鎖と集合する。
【図３】制限部位を包含する概略マップであり、それぞれ（ａ）β２ｍ−ＣＯＭＰ発現構築体であるｐＥＴＢＭＣ０４ならびに（ｂ）〜（ｄ）β２ｍ−ＣＯＭＰ中間分子クローニング構築体であるｐＥＴＢＭＣ０１−０３、最後に（ｅ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖発現構築体であるｐＥＴＡ２ｓｏｌを示しており、後に詳しく説明する。ストップコドンは（ａ）〜（ｅ）の各構築体に於いて‘＊’で表している。
【技術分野】
【０００１】
本発明はキメラＭＨＣタンパク質、同タンパク質をコードする発現カセット、ベクター、上記キメラタンパク質のオリゴマー、該オリゴマーを使用することにより、哺乳動物Ｔ細胞の有する抗原レセプターの特異性に従いそれらを標識、検出および分離する方法、ならびに上記キメラタンパク質を構築するのに好適なプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子は、組織の細胞の表面に見出され、細胞抗原を短い直鎖状ペプチドの形でＴ細胞に対し提示し、Ｔ細胞表面にあるＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）と相互作用させるのに重要な役割を果たしている。
【０００３】
単離形または組換え体形状のＭＨＣ−ペプチド分子は、それらＴ細胞が認識する特異的ペプチド抗原に拠ったＴ細胞の検出、分離および操作に有用であることが明らかにされている。また細胞表面を横切るＭＨＣ分子とＴＣＲｓ間の相互作用は多量体型であること、そしてあるＴＣＲに対して単一型のＭＨＣ分子の親和性が一般には低親和性であることも分かっている。
【０００４】
そのために上記応用にとってより有用な分子を作るために、多量体型の単離または組換え体ＭＨＣ−ペプチド分子を開発する努力が払われている。
【０００５】
欧州特許出願ＥＰ ８１２ ３３１号は哺乳動物Ｔ細胞をそれらが有する抗原レセプター特異性に従い標識、検出および分離するための多量体結合複合体を開示しており、このとき複合体は式（α−β−P）ｎを有する（式中の（α−β−Ｐ）はＭＨＣペプタイド分子であり、ｎは≧２であり、αはＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩクラス分子のα鎖を含み、βはＭＨＣタンパク質のβ鎖を含み、そしてＰは実質的に均質なペプチド抗原である）。ＭＨＣペプチド分子は、ＭＨＣ分子のαまたはβ鎖の一つのＣ末端をビオチン化し、ＭＨＣモノマーを４価のストレプトアビジン／アビジンと結合することにより、あるいはαまたはβ鎖の一つのＣ末端において多量体化の実体として働く対応する抗体が認識するエピトープを含むよう修飾されているＭＣＨ分子のキメラタンパク質を提供することによって多量体化される。明細書はさらに、ＴＣＲ特異性に拠る特定Ｔ細胞の検出、標識および分離へのＭＨＣオリゴマーの使用も教示する。
【０００６】
欧州特許出願ＥＰ ６６５ ２８９は特異的ペプチド、これらペプチドを結合しているＭＨＣ分子、およびそれぞれ特異的ペプチドが結合している各ＭＨＣ分子を架橋して得たオリゴマーとを開示している。オリゴマー化は、化学架橋剤を使用すること、またはＩｇＧもしくはＩｇＭのような免疫グロブリンにより認識されるエピトープを含むＭＨＣキメラタンパク質を提供することにより達成する。ＭＨＣ分子は標識を含んでもよく、そしてそれらの特異的レセプター結合に拠ったＴ細胞の標識、検出および分離に使用してもよく、実際にヒトの治療に用いてもよい。
【０００７】
国際出願ＷＯ９３／１０２２０はＭＨＣ分子の可溶性部分を含むキメラＭＨＣ分子であって、免疫グロブリン定常域と融合したクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣのいずれかであるキメラＭＨＣ分子を開示する。分子のＭＨＣ部分は、相補的なαおよび／またはβ鎖を含み、そしてペプチドはＭＣＨ分子の各結合グローブ内に結合している。２量体免疫グロブリンの存在により、これらキメラＭＨＣ−Ｉｇ分子は自己集合して２量体構造を形成する。
【０００８】
別の研究では、これまで軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のオリゴマー化ドメインは複数のタンパク質を多量体化するツールとして用いられきた。ＣＯＭＰはＥｆｉｍｏｖと共同研究者らにより記載され、特徴付けが行われている（Proteins: Structure、Function、and Genetics 24: 259〜262(1996年）参照）。ＣＯＭＰはトロンボスポンジンファミリーの５量体糖タンパク質である。５量体を形成するタンパク質の自己集合は、該タンパク質のＮ−末端６４個のアミノ酸残基を包含する５本の鎖が螺旋状の束を形成することで達成される。上記多量体化ドメインのアミノ酸配列についてはＥｆｉｍｏｖらが、FEBS Letters 341:54〜58(1994）に開示している。
【０００９】
国際特許出願ＷＯ ００／４４９０８は、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のＮ−末端領域に結合したＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、エンドスタチン、アンジオスタチン、血小板因子４またはプロラクチンの抗血管新生活性部分を含有し、その結果５量体形成が可能となったキメラタンパク質を開示している。明細書は得られたキメラタンパク質が伝達する抗血管新生作用を活用することに主に関係している。この開示によれば、キメラタンパク質はその中に含まれるＴＳＰ−ドメインが正しく折りたたまれ易くし、その結果これらキメラタンパク質はＴＳＲ配列に基づくペプチドに比べより天然のタンパク質に近い。
【００１０】
米国特許第６、２１８、５１３号は、グロブリンのオリゴマー形成に適した非天然型結合ドメインを含有するグロブリンを開示している。ＣＯＰＭオリゴマー化ドメインは、開示された結合ドメインの１つである。オリゴマー化による利点は、単量体グロブリンタンパク質に比しサイズが大きくなることによるオリゴマー化グロブリンタンパク質の半減期の延長、故に血管内分解に対する抵抗性の向上ならびに血管外溢出の減少に関係する。
【００１１】
Hollerら、Journal of Immunological Methods 237: 159〜173(2000年）は、ＩｇＧ定常領域もしくはＣＯＭＰ自己集合ドメインに融合したＴＮＦ−レセプターファミリーメンバーを含むオリゴマー化レセプターに基づくＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌの改良型可溶性インヒビターの開発を開示している。そこでは、ＴＮＦ−レセプターファミリーのオリゴマー可溶性キメラレセプターに見られる親和性の上昇は一般的な現象ではないと結論している。この様なオリゴマーキメラレセプターのそのリガンドに対する親和性は、考慮の対象となる具体的なレセプター−リガンドの組に依存しており、近い関係にある蛋白質間でさえ大きく異なることが分かっている。
【００１２】
前記ＭＨＣタンパク質の多量体化の試みには幾つかの欠点が提示されている。化学的架橋は、例えば最終的なＭＨＣオリゴマーに予想不能な構造をもたらし、それは複合体によって大きく異なると思われる。その結果、標的への結合も同様に最終的なオリゴマーの構造に応じて変化するだろう。このことは転じてオリゴマーを使用しているアッセイシステムの正確性および信頼性を損なうこともある。最悪の場合、化学的架橋が機能的ＭＨＣオリゴマーの集合形成を阻害することもあるだろう。
【００１３】
国際特許出願ＷＯ９３／１０２２０に記載されている様に、１または２本のＭＨＣポリペプチド鎖と免疫グロブリン分子の定常領域とを融合させると２量体のＭＨＣ分子複合体が出来る。２量体相互作用は複合体の親和性を上昇させるが、抗原特異的Ｔ細胞の検出またはかかる細胞を上手く活性化するといった様々な応用に求められる親和性を得るには抗イディオタイプ抗体またはプロテインＡもしくはＧを使ってさらに多量体化を進める必要があるだろう。しかしこの様な２段階の多量体化工程は実行に時間がかかり、最終生成物の均一性を制御するのが困難である。
【００１４】
ビオチン／ストレプトアビジン結合ペアの様な非ヒト性の結合パートナー、または一方に非ヒト性の抗体を使用してＭＨＣモノマーを多量体化すると、オリゴマーの中に非ヒト性タンパク質成分が取り込まれる。これにより、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での使用を想定する応用、例えばヒトの治療といった応用では、複合体が毒性を有する可能性および／または複合体のこの非ヒト部分に対する免疫反応が懸念される。それ故に、オリゴマー複合体中では非ヒト部分を回避することが望ましいだろう。
【００１５】
さらにビオチン−ストレプトアビジン相互作用に基づくＭＨＣ多量体の生成では、数回のタンパク質精製段階およびビオチン化反応を含め多数の工程段階を包含しており、それにより活性物質が大きく失われることもある。さらに単体のＭＨＣサブユニットのビオチン化効率、および最終の多量体生成物の品質を制御することは困難である。
【００１６】
当技術分野より利用可能なＭＨＣオリゴマーは、ＭＨＣモノマーそのものに比べ複合体の親和性を確かに高める。しかしながら、複合体合成の複雑度を上げることなく、一方でかかる合成により高い均一性を有した分子を確実に生成しながら、親和性をさらに高めることが強く望まれている。
【００１７】
本発明の目的は、従来技術の持つ上記欠点およびその他不利益を克服すること、ならびにＴ細胞レセプターおよびタンパク質配列への結合に同時に利用でき、非ヒト成分の含有を最小限に留める均一で高い結合価を持つＭＨＣペプチド成分を用いて容易に製造できる多量体ＭＨＣペプチド複合体を提供することである。
【００１８】
発明の概要
上記の従来技術の不利益および欠点は、ＭＨＣペプチド鎖またはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマーＭＨＣ複合体を形成するオリゴマー形成コイルドコイル（coiled-coil）タンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含む少なくとも２つのキメラタンパク質を用いることで克服される。
【００１９】
従って本発明の第一の局面は、少なくとも２つのキメラタンパク質を含むオリゴマーＭＨＣ複合体であって、前記キメラタンパク質がＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションとオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含み、オリゴマーＭＨＣ複合体の形成が該キメラタンパク質のオリゴマー化ドメインでのオリゴマー化形成により生じ、そして上記オリゴマーに含まれる全キメラタンパク質の第１セクションの少なくとも２つが同一のＭＨＣペプチド鎖に由来するもものであるオリゴマーＭＨＣ複合体に関する。
【００２０】
キメラタンパク質の第１セクションは、ＭＣＨクラスＩもしくはＩＩα鎖の細胞外部分に由来するのが好ましい。あるいは、キメラタンパク質の第１セクションはＭＨＣクラスＩもしくはＩＩβ鎖の細胞外部分に由来するものでもよい。
【００２１】
発明の好適実施態様では、キメラタンパク質の第２セクションに含まれるオリゴマー化ドメインは、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の５量体化ドメインに由来する。より好ましくは、キメラタンパク質の第２セクションに含まれるＣＯＭＰの５量体化ドメインは上記タンパク質のアミノ酸１〜１２８を、好ましくは２０〜８３を、最も好ましくは２０〜７２を含み、そしてこれらアミノ酸より成るのが好ましい。
【００２２】
好ましくは、キメラタンパク質はさらにＭＨＣペプチド鎖（第１セクション）とオリゴマー化ドメイン（第２セクション）との間に第１リンカーを含む。
【００２３】
好ましくは、オリゴマー中のキメラタンパク質の少なくとも１つは、第２リンカー、タグ化ドメインおよび精製ドメインより成る群から選択するドメインを１またはそれ以上含む。
【００２４】
発明の別の実施態様は、少なくとも２つのキメラタンパク質に対し相補的であるＭＨＣ結合ペプチド鎖をさらに含み機能的ＭＣＨ結合複合体を形成する上記オリゴマーＭＨＣ複合体に関する。
【００２５】
好ましくは、発明の第１局面によるオリゴマーＭＨＣ複合体は、クラスＩ複合体に関してはＭＨＣα１およびα２ドメイン、そしてクラスＩＩ複合体に関してはＭＨＣα１およびβ１ドメインにより形作られるグローブ内で複合体のＭＨＣ部分と結合するペプチドを含む。
【００２６】
発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は標識を含んでもよい。好ましくは、標識は光検出標識、放射活性標識、酵素、エピトープ、レクチンまたはビオチンより成る群から選択される。
【００２７】
発明の第２の局面では、ＭＨＣペプチド鎖またはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含むキメラタンパク質であって、コイルドコイルタンパク質は該オリゴマー化ドメインが由来する少なくとも２つの実質的に同一版のポリペプチド鎖が並置することでオリゴマーを形成するキメラタンパク質に関する。好ましくは、オリゴマー化ドメインはＣＯＭＰの５量体化ドメインに由来する。より好ましくは、オリゴマー化ドメインはＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、好ましくはこれらアミノ酸より成る。
【００２８】
発明の第３の局面は、上記発明のオリゴマーＭＨＣ複合体の取り込みに適した、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結したプロモータ配列を含む組換え体発現カセットに関する。
【００２９】
発明の第４の局面は、上記組換え体カセットを含むベクターに関する。
【００３０】
発明の第５の局面は、発明のオリゴマーＭＨＣ複合体を含む医薬または診断組成物に関する。
【００３１】
発明の第６の局面は、それらの抗原レセプターの特異性に基づく哺乳動物Ｔ細胞を標識および／または検出する方法であって、方法が
（ｉ）発明のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体とＴ細胞の特異的結合の存在を検出すること、
を含む方法に関する。
【００３２】
発明の第７の局面は、それらの抗原レセプターの特異性に基づく哺乳動物Ｔ細胞を分離する方法であって、方法が
（ｉ）発明のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体と結合したＴ細胞を未結合の細胞から分離すること、
を含む方法に関する。
【００３３】
発明のその他の局面では、発明はさらに上記キメラペプチドの構築に有用なプライマーにも関係する。
【００３４】
発明の詳細な説明
発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は、従来技術の不利益および欠点を解決するためのものである。より具体的には、発明者は上記オリゴマーＭＨＣ複合体が、例えばビオチンおよびストレプトアビジンを介した結合によるＭＨＣ複合体の４量体化によって得られるオリゴマーに比べて実質的に高いＴ細胞レセプターに対する親和性を獲得できることを見出した。理論と結びつける意図なしに、この親和性の上昇は３個またはそれ以上のＭＨＣ分子を実質的に同一面に配置し、全ての結合面を同一方向に向けた時に達成されると思われる。これに対し、ストレプトアビジン結合の４量体複合体は四面体配置を取っており、Ｔ細胞表面との接触に同時に利用できるＭＨＣ結合ドメインは３つまでである。発明の複合体はさらに選択した標識による活性ＭＨＣドメインへの干渉を最小限に留めたまま効率的な標識が可能であるが、これは標識がオリゴマー形成コイルドコイルドメインの反対端部に配置されるからである。
【００３５】
本発明の範囲内では「オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質」とはオリゴマー化ドメインを含むタンパク質を意味する。上記ドメインは２またはそれ以上のポリペプチドサブユニットを含むが、これらサブユニットは同一でも、または同一でなくともよい。かかるオリゴマー化ドメインの２またはそれ以上のサブユニットは互いに集合し、オリゴマー化ドメイン内の各サブユニットは集合状態の中で実質的に螺旋型の立体構造をとるが、この時オリゴマー化ドメイン内のサブユニットはある識別可能な軸に沿って配置され、そしてオリゴマー化ドメインは上記軸に沿って２つの識別可能な両端部を有し、さらに少なくとも２つのポリペプチドサブユニットは上記軸に沿った同一のアミノ〜カルボキシル方向を示す。このようなオリゴマー化ドメインおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質は、たとえば本明細書導入部に引用されている様に当分野既知である。
【００３６】
オリゴマー化ドメインはいずれかの種の好適オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質
に由来するだろう。ＭＨＣ分子はヒト型のオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインと融合するのが好ましく、この場合複合体をヒトに投与した場合でも不要な免疫反応および／または拒絶反応は最小限に留められるだろう。
【００３７】
オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質の例としては、各種タイプのコラーゲン、マンノース結合蛋白の様なＣ−レクチンのトリプルコイルドコイルドメイン；Ｃ１ｑ、ミオシン、ｐ５３に生ずる様なロイシンジッパー、ＧＣＮ４、バクテリオファージｐ２２ Ｍｎｔ６リプレッサー；およびＣＯＭＰの様なトロンボスポンジンファミリータンパク質が挙げられる。オリゴマー化ドメインは軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰに由来するのが好ましい。より好ましくは、ＭＨＣ分子は上記の理由によりヒト型ＣＯＭＰ
のオリゴマー化ドメインと融合する。
【００３８】
発明のオリゴマーＭＨＣ複合体に含まれるキメラタンパク質の数（ｎ）は、キメラタンパク質の第２セクションの起源であるオリゴマー化ドメインのタイプに主に依存しており、一般には２またはそれ以上であり、好ましくはｎ＝２〜１０、最も好ましくはｎ＝３もしくは５である。オリゴマー化するキメラタンパク質の第２セクションが、例えばＣＯＭＰの５量体化ドメインに由来する場合にはこの数は典型的には５であり、オリゴマーは５量体（ｎ＝５）であるが、これらオリゴマー化ドメインがコラーゲンに由来する場合にはこの数は３であろう（ｎ＝３）
【００３９】
従って本発明の第１の局面はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションと、オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含むキメラタンパク質を包含するオリゴマーＭＨＣ複合体に関する。第１セクションのＭＨＣペプチド鎖はキメラタンパク質のＮ末端部分を形成するのに対し、第２セクションのオリゴマー化ドメインはそのＣ末端領域内に位置しているが、両セクションはどのような順番でもよいだろう。しかしながら、好ましい配置ではＭＨＣ部分はいずれの場合でもその機能的特性を維持できるだろう。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「キメラタンパク質」は、そのアミノ酸配列の少なくとも一部は２種類の天然産タンパク質もしくはタンパク質鎖部分、本例ではＭＨＣペプチドおよび少なくともオリゴマー化ドメインの有意な部分を実質的に含むペプチドに由来する単一ペプチドタンパク質を意味する。本明細書で使用する場合、用語「その機能的部分」とは、起源となる完全長ペプチドの望まれる機能的特徴を提示し続けているペプチド鎖の一部分を意味する。従ってＭＨＣではペプチド鎖は、必要に応じて、その相補的ＭＨＣペプチド鎖により完成した時あるいは集合した時に、抗原性ペプチドを結合できるペプチド鎖を意味している。用語「相補的」ＭＣＨペプチド鎖とは、天然のＭＨＣ複合体で対を成すペプチド鎖同士を意味する。ＭＨＣ複合体のα鎖の相補的鎖はβ鎖であり、その逆もまた同じである。
【００４１】
第１実施態様によれば、キメラタンパク質内のＭＨＣペプチド鎖はＭＣＨクラスＩまたはＩＩα鎖の細胞外部分である。別の実施態様によれば、ＭＨＣペプチド鎖はＭＨＣクラスＩまたはＩＩβ鎖の細胞外部分である。ＭＨＣタンパク質は脊椎動物種、例えば霊長類種、特にヒト；マウス、ラット、ハムスターおよびウサギを含む齧歯類；ウマ、ウシ、イヌ、ネコ；等由来のものであろう。特に興味深いものはヒトＨＬＡタンパク質、およびマウスＨ２−タンパク質である。ＨＬＡタンパク質に含まれるものとしては、クラスＩＩサブユニットＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＨＬＡ−ＤＲβ、ならびにクラスＩタンパク質ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、そしてβ２−ミクログロブリンが挙げられる。マウスＨ−２サブユニットに含まれるものとしては、クラスＩ Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、ならびにクラスＩＩ Ｉ−Ａα、Ｉ−Ａβ、Ｉ−ＥαおよびＩ−Ｅβ、そしてβ２−ミクログロブリンを挙げることができる。幾つかの代表的なＭＨＣタンパク質のアミノ酸配列は欧州特許ＥＰ ８１２ ３３１号内に引用されている。
【００４２】
好適実施態様では、ＭＨＣペプチド鎖は通常膜に結合している蛋白の可溶性形態に相当する。クラスＩサブユニットの場合、可溶性形態は天然形態より膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを削除して得られる。クラスＩタンパク質では、可溶性形態はα鎖のα１、α２およびα３ドメインを含むだろう。クラスＩＩタンパク質では、可溶性形態はα鎖またはβ鎖の各α１およびα２、またはβ１およびβ２ドメインを含むだろう。
【００４３】
含まれる膜貫通ドメインのアミノ酸は約１０未満、一般には約５未満であり、好ましくは全く含まないだろう。欠失はα３ドメイン内に約１０アミノ酸程度まで及んでも良いだろう。α３ドメインのアミノ酸は欠失しないことが好ましい。欠失は、それが機能的なジスルフィド結合構造物に折りたたまれるα３ドメインの能力を妨げないものであろう。クラスＩβ鎖、β２ｍはもともと膜貫通ドメインを欠いた形態であるため、切断する必要はない。一般的には、クラスＩＩサブユニットをクラスＩサブユニットと共に使用することはない。
【００４４】
上記の欠失はクラスＩＩサブユニットにも同様に適用される。欠失はα２またはβ２ドメイン内に約１０アミノ酸まで及んでも良いが、α２またはβ２ドメインのアミノ酸は欠失しないことが望ましい。欠失は、それが機能的なジスルフィド結合構造物に折りたたまれるα２またはβ２ドメインの能力を妨げないものであろう。
【００４５】
ポリペプチド末端に少数のアミノ酸を導入することを望む場合、その数は一般的には２５を越えない、より一般的には２０を越えないであろう。アミノ酸の欠失または挿入は、一般にクローニングでの必要から、例えば有利な制限部位等を提供するため、および分子集合に於ける潜在的立体配置問題を解消するために行われる。さらに、同様の理由から１またはそれ以上のアミノ酸を別のアミノ酸と置換することが望まれる場合でも、一般に１つのドメイン内で約５を超えるアミン酸を置換することはない。
【００４６】
本発明によれば、上記キメラタンパク質の第１セクションに含まれるＭＨＣペプチド鎖は、好ましくはそのＣ末端で、オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインと融合する。ＣＯＭＰの５量体化ドメインをオリゴマー化ドメインとして用いる場合、このドメインは本発明の開示の背景技術で論じた様に、上記タンパク質のＮ末端のアミノ酸１〜１２８より、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、よりこのましくはこれらアミノ酸より成る。アミノ酸の番号の付け方に関しては、Efimovら、FEBS Letters 341: 54〜58(1994年）を参照せよ。さらに、発明のキメラタンパク質のＭＨＣ部分と同様に、オリゴマー化ドメインの自己集合が損なわれない範囲に於いて、このドメインもアミン酸置換、欠失または挿入により変更できる。
【００４７】
キメラタンパク質内での両ペプチド、即ちそれぞれＭＨＣとオリゴマー化ドメインの融合は直接的であってもよく、または図１および２に示すようにＭＨＣペプチドおよびオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）を結合し、且つ隔てる第１リンカー（Ｌ１）を含有してもよい。リンカーの使用による連結が好ましい。一般に、この種のリンカーは３０を越えない、好ましくは２６を越えないアミノ酸を含むだろう。当分野では好適リンカーが知られており、例えば免疫グロブリンヒンジ領域もしくはセリングリシン反復配列が挙げられる。
【００４８】
図１および２にさらに示されている様に、発明のキメラタンパク質はさらに、好ましくはそのＣ末端に、１もしくはそれ以上の第２リンカー（Ｌ２）、ビオチン化ペプチド（ＢＰ）ならびにタグ化ドメインおよび／もしくは精製ドメイン（ＴＤ）をいずれかの順番で含んでいる。好適実施態様では、発明のキメラタンパク質は上記３種類のものを、記載の順番に含んでいる。一般に第２リンカーは２５を越えない、好ましくは２０を越えないアミノ酸を含み、前記第１リンカーに関する説明があてはまるだろう。
【００４９】
発明のキメラタンパク質に場合により含まれるタグ化ドメインは、タンパク質を標識できると見込まれるドメインであればいずれでもよい。好ましくは、タグ化ドメインは標識を含有する。この標識は抗体により認識されるエピトープ、または光検出可能もしくは放射活性標識の様な、ドメインそのものに含めることができる。好ましくは、標識はＦＩＴＣの様な蛍光マーカー、Ｒ−もしくはＢ−フィコエリスリンの様なフィコビリプロテイン、アロフィコシアニン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、発光マーカー、125Ｉもしくは32Ｐの様な放射活性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ、例えば小エビアルカリホスファターゼ（alkaline shrimp hposphatase）のような酵素、エピトープ、レクチンまたはビオチン／ストレプトアビジンより成る群から選択される。
【００５０】
標識自体がタンパク質である場合は、標識に用いるタンパク質のポリペプチド鎖をキメラタンパク質、好ましくはそのＣ末端と融合してタンパク質を標識できる。例えばグリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）またはフィコビリプロテインのサブユニットの様な蛍光タンパク質をこのキメラに用いることができるだろう。ＧＦＰキメラタンパク質技術は当分野周知である。フィコビリプロテインの好適ドメインを含むキメラタンパク質は、例えば国際特許出願ＷＯ ０１／４６３９５号に記載されている。
【００５１】
あるいは、標識をタグ化ドメイン内に与えられた特異的結合部位に結合してもよい。例えばタグ化ドメインは、タグ化ドメインの部位特異的にビオチン化でき、その結果ストレプトアビジン／アビジンによる認識を可能にするビオチンタンパク質リガーゼＢｉｒＡの認識部位を含んでもよい。ＢｉｒＡの好適認識配列は欧州特許ＥＰ ７１１ ３０３号に記載されている。同様にレクチンを結合してもよく、または修飾酵素のアミノ酸認識配列を発明のキメラタンパク質のアミノ酸配列内に組込むことによってその他の部位特異的酵素修飾を行ってもよい。その他の可能なタイプの酵素修飾は欧州特許ＥＰ８１２ ３３１号に記載されている。あるいは、好適に標識された抗体、または標識Ｆ（ａｂ）断片の様な抗体断片を結合させても標識できる。
【００５２】
場合により、発明のキメラタンパク質に含まれることがある精製ドメインは、例えば特異的結合特性を提供することによって発明のタンパク質の精製を支援するいずれのドメインでもよい。これに相応しい配列は当業者に知られており、それらがキメラタンパク質の機能的ＭＨＣおよびオリゴマー化ドメインを妨害しない限りにおいて利用できる。精製ドメインはヘキサヒスチジン配列であることが好ましい。
【００５３】
本発明の第１の局面によれば、発明は上記キメラタンパク質の第２セクション内にあるオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のオリゴマー化ドメインが自己集合することでオリゴマー化し形成されるオリゴマー化ＭＨＣ複合体に関する。オリゴマー化ドメインのオリゴマー化は、一般的には自発的に起こり、キメラタンパク質の安定したオリゴマーを生ずる。典型的には、オリゴマー複合体は複数の同一モノマーサブユニット（少なくともそれらのＭＨＣ部分に於いては、オリゴマー化ドメインに依存している）より成るだろう。しかし望まれる場合には、それらのＭＨＣ部分において異なる２つ以上のキメラタンパク質をオリゴマー化前に混合してもよい。それによって均一なオリゴマーが得られてもよい。しかしながら、一般には各複合体内の少なくとも２つのキメラタンパク質は同一のＭＨＣαもしくはβサブユニットに由来する第１セクションを含むだろう。ｎ＞２の場合には、オリゴマーは各複合体内に２つのキメラタンパク質を含有し、それらタンパク質は同一のＭＨＣ分子に由来する第１セクションを含むだろう。
【００５４】
ＣＯＭＰのオリゴマー化ドメインを用いて安定したキメラタンパク質の５量体を自発的に集合させることが好ましい。
【００５５】
オリゴマーＭＨＣ複合体はさらに相補的ＭＨＣペプチド鎖を含んで上記の機能的ＭＨＣ結合複合体を形成してもよく、そしてクラスＩＭＨＣ複合体についてはＭＨＣα１およびα２ドメインにより、またクラスＩＩＭＨＣ複合体についてはＭＨＣα１およびβ１ドメインにより形作られるグローブ内に結合するペプチドを含んでもよい。ペプチドは実質的に均一であることが好ましい。
【００５６】
クラスＩＭＨＣタンパク質との複合体の場合には、抗原性ペプチドは約６〜１４アミノ酸長であり、通常は約８〜１１アミノ酸長である。クラスＩＩＭＣＨタンパク質との複合体の場合には、ペプチドは約６〜３５アミノ酸長であり、通常は１０〜２０アミノ酸長である。ペプチドは様々なタンパク質に由来する配列を有するだろう。多くの例では、Ｔ細胞エピトープとして機能するペプチドを使用することが望ましいだろう。当分野では、数多くの抗原のエピトープ配列が知られている。
【００５７】
あるいは、エピトープ配列は天然のＭＨＣタンパク質に結合したペプチドを単離して配列決定することにより、標的配列から演繹される一連の抗原性ペプチドを合成してから各種ペプチドに対するＴ細胞反応性についてアッセイすることにより、またはこれらペプチドを使って一連のＭＨＣ−ペプチド複合体を生成してＴ細胞結合を定量化することによって経験的に決定してもよい。合成ペプチドの合成、配列確認、および関連する最小抗原性配列の特定を包含するペプチド調製法は当分野既知である。いずれの場合も、オリゴマーＭＨＣ複合体に含まれるペプチドは実質的に均一であることが好ましく、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％のペプチドが同一であることを意味する。
【００５８】
第２の局面では、本発明はキメラタンパク質そのものに関しており、そのキメラタンパク質は発明のオリゴマーＭＨＣ複合体にオリゴマー化できる。キメラタンパク質はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションと、オリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含むが、このコイルドコイルタンパク質はオリゴマー化ドメインの起源である実質的に同一版のポリペプチド鎖が少なくとも２つ並列することでオリゴマー化する。言い換えると、本発明のキメラタンパク質内にオリゴマー化ドメインを提供するのに用いられるオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであろう。しかし一般的には、それはそのオリゴマー化ドメイン内に、オリゴマー形成時に並列する、実質的に同一であるポリペプチド鎖セクションを２またはそれ以上のコピー含んでいる。オリゴマー化ドメインはＣＯＭＰ５量体化ドメインに由来することが好ましい。好適実施態様は、オリゴマーＭＨＣ複合体そのものに関する上記実施態様に同じである。
【００５９】
第３の局面では、本発明はＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分をコードしている第１ヌクレオチド配列およびＣＯＭＰのオリゴマー化ドメインのコードする第２ヌクレオチド配列とに作動可能に連結しているプロモータ配列を含む組換え体発現カセットに関する。第１実施態様では、第１ヌクレオチド配列はＭＨＣクラスＩもしくはＩＩα鎖の細胞外部分のＭＨＣペプチド鎖をコードしている。第２実施態様では、第１核酸配列はＭＨＣクラスＩもしくはＩＩβ鎖の細胞外部分のＭＨＣペプチド鎖をコードしている。好ましくは、第２ヌクレオチド配列はＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２をコードする。ＣＯＭＰ配列はヒトＣＯＭＰに由来するのが好ましい。
【００６０】
一般的には、本明細書で使用する命名方法および記載の組換え体ＤＮＡ技術での実験手法は当業者周知であり、当業界で広く用いられている。ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅およびクローニングに関しては標準的な技術を用いた。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を包含する一般的な酵素反応は、製造元の指示書に従い、製造元が供給する酵素緩衝液を用いて実施した。これらの技術および各種その他技術は当業界で知られている様に一般的に実施した。ＭＨＣ、およびＣＯＭＰの様なオリゴマー形成コイルドコイルドメインの好適ヌクレオチド配列配列は上記の如く、当分野既知である。
【００６１】
ＤＮＡ構築体は、一般的にはタンパク質をコードする配列と作動可能に連結している、本来備わっているかまたは異質のプロモータ領域を包含する発現制御ＤＮＡ配列を含んでいる。発現カセットはさらに適当な開始および停止コドン、リーダー配列をコードしている配列等を、選んだ宿主に応じて含むだろう。発現カセットは、選択した宿主を形質転換する、および／または上記宿主での安定した発現を維持するのに適したベクター内に組み入れることができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結」は１またはそれ以上のＤＮＡ配列の上流にあるプロモータと連結しており、該プロモータがＤＮＡ配列の転写を媒介することを意味する。好ましくは、発現制御配列は、希望する真核生物または非真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションできるような、ベクター内にある真核生物または非真核生物プロモータシステムである。ベクターを適当な宿主内に組込んだら、宿主をヌクレオチド配列の高レベル発現に好適な条件の下に維持し、キメラタンパク質を収集し、精製する。
【００６３】
ＣＯＭＰを含むオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来する好適オリゴマー化ドメインのＭＨＣ−ＤＮＡ配列およびＤＮＡ配列は、各種のヒトまたはその他細胞より周知な方法に従って単離できる。伝統的には希望の配列は、適当な細胞株から単離したメッセンジャーＲＮＡより調製した好適なｃＤＮＡライブラリーから増幅する。ＤＮＡ配列に好適な細胞源、ならびに発現および分泌に好適な宿主細胞は、American Type Culture Collection(ATCC）またはその他商業的供給元といった様々な供給源から得ることができる。
【００６４】
宿主細胞のトランスフェクションに用いるヌクレオチド配列または発現カセットは、標準的な技術によって変更でき、希望する様々な特性を持ったキメラ分子を生ずる。本発明の分子は、当業者周知の様々な組換え体ＤＮＡ技術を利用して容易にデザインおよび製造できる。例えば、アミノ酸の挿入、置換、欠失等によって鎖を本来ある配列の一次構造レベルで変更できる。このような変更を様々に組み合わせて用いて、最終的な変更タンパク質鎖を生成できる。一般には、キメラ分子をコードしている遺伝子の変更は、部位指定突然変異誘導といった各種周知技術により容易に達成できる。
【００６５】
上記アミノ酸配列の変異種は、キメラ分子の精製および調製を容易にする、または複合体のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）およびエクス（ｅｘ ｖｉｖｏ）での安定性を高めるために、標的Ｔ細胞に対する分子親和性を上げること、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ複合体と相互作用するそれぞれＣＤ４またはＣＤ８コレセプターに対する分子親和性を上げるか、または下げることを包含する想定される様々な目的に対し調製できる。しかし変異種はそれぞれ、一般的には本来のＭＨＣ分子と同一もしくは類似の生物活性を示し、関係するオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質のもつ本来のオリゴマー化ドメインに相当するオリゴマー化特性を保持するだろう。
【００６６】
さらに、オリゴマーの調製は前進的な工程である。治療を目的とする使用では、それは哺乳動物細胞の培養、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはヒト細胞株で実施されるだろう。あるいは本発明の分子の発現には、バキュロウイルスやDrospophila melanogaster発現系を含む昆虫細胞の培養、酵母発現系、またはEscherichia coli（E.coli）の様な原核生物発現系を含む他の発現系を用いることもできる。原核生物発現系で発現を行う場合には、可溶性発現、即ち細胞質もしくはペリプラズマ内への発現、または不溶性発現、即ち封入体への発現のいずれもが可能である。
【００６７】
Ｅ．ｃｏｌｉにとって典型的なベクターは、誘導性のｌａｃオペロンに基づく系の中にバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる効率的発現を組み合わせたｐＥＴファミリーのベクターの一つであろう。対象のヌクレオチド断片を含有するベクターは、宿主細胞のタイプに応じて、周知の方法により宿主細胞内にトランスフェクションできる。例えば、原核生物細胞では一般に化学物質−もしくは電気−コンピテント細胞への形質転換が利用されるが、その他宿主細胞の場合にはリン酸カルシウム処理、陽イオン性リポソーム、またはエレクトロポレーションが用いられるだろう。哺乳動物細胞をトランスフェクションするのに用いられるその他方法としては、Polybrene、プロトプラストキメラ、マイクロプロジェクタイルおよびマイクロインジェクションの使用が挙げられる。
【００６８】
キメラタンパク質および相補的ＭＨＣαもしくはβサブユニットをそれぞれ同一細胞内で共発現してオリゴマー複合体として集合させてもよい。あるいは、これら２成分を別々に生成してから選択した抗原性ペプチド存在下にインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で会合させて安定したオリゴマーＭＨＣペプチド複合体を形作ってもよい。後者では、２成分の混合と会合は、キメラペプチドのオリゴマー形成の前または後のいずれに行ってもよい。
【００６９】
独立した成分をインビトロで会合させることの利点は、オリゴマーＭＨＣペプチド複合体を高いペプチド均一度、例えば９５％を超える、または９９％を超える均一度で獲得できることである。複合体を完全に集合した分子として発現させる場合は、対象のペプチドは、発現細胞を対象の抗原性ペプチドを含有する培地で培養するか、またはインビトロで発現している最中に対象のペプチドを内因性に結合したペプチドで交換することによって複合体内に取り込むことができるが、後者は一般的には精製した複合体を過剰量のペプチドと低もしくは高pHでインキュベーションして抗原結合ポケットを開かせることで行われる（例えば国際特許出願９３／１０２２０参照）。抗原性ペプチドはまたフォトアフィニティー標識法のような標準的な方法を用いても共有結合できる（例えば国際特許出願ＷＯ９３／１０２２０参照）。
【００７０】
あるいは、ペプチドをキメラタンパク質の発現構築体またはその相補的αもしくはβ鎖に直接結合または融合してもよい。キメラタンパク質またはその相補的αもしくはβ鎖のペプチド部分とＮ末端間に、例えばポリグリシン反復配列の様な好適リンカーを入れてもよい。ペプチドを発現構築体内にキメラペプチドとして含有させることにより、抗原性ペプチドをさらに付加することなしに、またはペプチドを交換することなしに完全なＭＨＣ−ペプチドオリゴマー複合体を発現させ、折り畳ませることができる。
【００７１】
インビトロでのサブユニットおよびキメラタンパク質の折り畳み、および会合を可能にする条件は当分野既知である。クラスＩＭＨＣペプチド複合体の集合、ならびに機能的クラスＩＩ複合体の集合は、例えば欧州特許ＥＰ ８１２ ３３１に記載されている。許容条件の一例では、ほぼ等モルの可溶化したαおよびβサブユニットを対象の抗原性ペプチドが過剰量存在する状態で、尿素溶液の中で混合する。クラスＩＩＭＨＣ分子の場合は、尿素を含まない緩衝液に希釈するか、または透析することで再折り畳み（refolding）が開始する。ペプチドを空のクラスＩＩヘテロダイマー内に約pH５〜５．５で、約１〜３日間加えてから中和し、濃縮して緩衝液を交換する。α−β−ペプチド複合体の形成と同時に、複合体のオリゴマー化が起こるはずである。あるいは２段階で５量体のαまたはβ複合体を獲得してもよい：第１段階でオリゴマー化ドメインのオリゴマー化を行い、続いて上記方法に従ってペプチド存在下に相補的αもしくはβサブユニットとさらに再折り畳みを行う。
【００７２】
発明の集合複合体、または当初分離した状態の本発明のキメラタンパク質および相補的なαもしくはβサブユニットは、硫安沈殿法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を含むカラムクロマトグラフィー法を含む当分野の標準的な方法に従って精製できる。
【００７３】
生じた本発明のペプチド鎖またはオリゴマーＭＨＣ複合体は治療目的に使用しても、あるいはアッセイ方法、免疫染色等の開発および実施に使用してもよい。本発明のオリゴマーＭＨＣ複合体の治療的使用では、特定の病気を治療するのに役立つＭＨＣハプロタイプおよび抗原を特定することが求められる。さらに本発明による複合体の治療に使用する前に、患者の組織タイプを決定することも必要となろうが、しかしこれは当分野周知の標準的な方法である。本発明は癌、感染症、自己免疫疾患の治療、および移植体拒絶の予防に特に好適である。当業者は、この様な病気の病因に関する知識、および関連の動物モデルの研究結果を基にして、この様な各種病気と関係するＭＨＣは、ハプロタイプおよび抗原を特定し、単離できる。
従って、第５の局面では、本発明は先に記載の上記オリゴマーＭＨＣ複合体を含む医薬用又は診断用組成物に関する。タンパク質を含む医薬用組成物は、例えば非経口投与、すなわち皮下内、筋肉内又は静脈内で使用できる。さらに、多くの新規な薬剤配送方法が開発されている。本発明の医薬組成物は、これらの新しい方法を使用して投与するのにも同様に適している。
【００７４】
非経口投与用組成物は、一般的には許容可能な担体、好ましくは水性担体に溶解したキメラタンパク質もしくはその５量体の溶液を含むだろう。各種水性担体、例えば緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等を用いることができる。これら溶液は無菌であり、一般には粒子状物を含まない。これら組成物は通常の、周知の滅菌技術により滅菌されるだろう。組成物は生理的状態を近づける必要がある場合には、pH調整および緩衝化剤、毒性調整剤等の医薬的に許容可能な補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有してもよい。これら製剤中のキメラタンパク質の濃度は広範囲であり、即ち約１pg/ml未満、少なくとも約０．１mg/mlから１０〜１００mg/ml程までであり、実際の投与形態に従い、液体の容積、粘度等に主に基づき選択されるだろう。
【００７５】
筋肉内注射向けの典型的な医薬組成物は、無菌緩衝水１ml、オリゴマー複合体タンパク質０．１mgを含有する様に調合されるだろう。静脈内注入向けの典型的組成物は無菌リンゲル液２５０ml、およびオリゴマー複合体タンパク質１０mgを含有する様に調合されるだろう。非経口投与可能な組成物の調合に関する実際の方法は当業者に知られているか、または自明である。
【００７６】
本発明のキメラタンパク質またはオリゴマーＭＨＣ複合体は保存のために凍結乾燥することができ、そして使用前に好適キャリアを用いて元に戻すことができる。この技術は効果的であることが示されており、一般に用いられる凍結乾燥および還元技術が利用できる。凍結乾燥および還元が様々な程度で活性を失わせること、および使用レベルを調整してこれを補償しなければならないことが当業者により認識されるだろう。
【００７７】
Ｔ細胞をそれらの抗原レセプターの特異性に基づき検出する、または分離することは、上記の如く、いずれかの既知技術を包含してもよい。好適な技術は、例えば欧州特許ＥＰ ８１２ ３３１に開示されており、そして参照によってここに組込まれている。より詳しくは、発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は浮遊液もしくはその他生物学的サンプル、例えば組織サンプル中の抗原特異的Ｔ細胞の標識化および検出に用いることができ、あるいは例えば当業者既知の常磁性もしくはその他ビーズを含む基材上に結合もしくは固定することによる、またはフローサイトメトリーによるＴ細胞の分離に使用してもよい。
【００７８】
従って本発明の複合体は、例えば特定の抗原に特異的であるＴ細胞を精製および濃縮すること、ならびにこれらＴ細胞を細胞培養で拡張および／その他操作を行った後に各種疾患状態にある患者に自家移植的に戻すことに用いることができる。あるいは、例えば自己免疫疾患またはその他不要のＴ細胞免疫反応に於いてＴ細胞を選択的に除くこともできる。
【００７９】
本発明のオリゴマーＭＨＣ複合体は、特異的Ｔ細胞レセプターに対し高められた親和性を有することから、薬物の効力の改善、血清半減期の向上を可能にし、さらには薬物動態も改善できるが、後者は分子質量の増加に拠るものと思われる。
【００８０】
非真核生物系では、発明のオリゴマーＭＨＣ複合体に含まれるキメラタンパク質および相補的ＭＨＣαもしくはβ部分を発現する可能性があることから、それらはより容易かつ高収率に作製することができ、そしてそれらをサブコンポーネントとして発現した後に抗原性ペプチドの均一集団が存在する状態で互いに再折り畳みすることもできる。
【００８１】
当業者は上記説明より、これら並びにその他の利点を利用することができる。以下の実施例は例示のみを目的とするものであり、いかなる形でも発明を限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【００８２】
以下は５量体型のクラスＩＭＨＣ複合体のクローニング、発現および精製に関する詳しい例であり、複合体はβ２ｍとＣＯＭＰのキメラ融合体を含んでいる。キメラβ２ｍ−ＣＯＭＰタンパク質はＥ．ｃｏｌｉでは不溶性の封入体の中に発現し、その後インビトロで５量体のβ２ｍ−ＣＯＭＰに集合する。次にＴ細胞抗原を表す適当な合成結合ペプチド存在下にβ２ｍ−ＣＯＭＰ５量体とＨＬＡ−Ａ*０２０１として知られるヒトＭＨＣクラスＩα分子とを組み合わせる２回目の再折り畳み反応により５量体型クラスＩＭＨＣペプチド複合体を形作る。この例では、エプスタインバーウイルスＢＭＬＦ１タンパク質に由来する特性のよく分かっている抗原であるＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（アミノ酸２８９〜２９７）を使用している。得られた複合体を蛍光成分で標識し、フローサイトメトリーを用いた混合リンパ細胞集団からの抗原特異的Ｔ細胞検出の染色試薬として用いる。
【００８３】
１．β２ｍ−ＣＯＭＰ構築体の分子クローニング
作業はβ２ｍをｐＥＴ−２４ｃベクター内に連続的にクローニングすること、ｐＥＴＢＭＣ０１と称する構築体を獲得すること、続いてビオチン−タンパク質リガーゼＢｉｒＡを用いて部位特異的にビオチン化するためのビオチンアクセプター配列（ＢＰ）と共に軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）のオリゴマー化ドメインを挿入すること、ｐＥＴＢＭＣ０２と称する構築体を獲得することを包含する。ポリグリシンリンカーをβ２ｍとＣＯＭＰの間にクローニングし、ｐＥＴＢＭＣ０３と称する３番目の構築体を獲得し、部位指定突然変異導入法によりセリン残基、ポリグリシンリンカーの前に置かれたセリン残基を取り除いて、目的とするｐＥＴＢＭＣ０４と称する（図３も参照）β２ｍ−ＣＯＭＰ／ｐＥＴ−２４ｃ構築体を得る。セリン残基の除去は、β２ｍ分子がＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質と会合した時に立体的な障害を起こさないように実施する。
【００８４】
１．１ ｐＥＴ−２４ｃベクター内へのβ２ｍのクローニング
β２ｍの供給源
β２ｍの細胞外部分はＤＮＡ配列の７４bp〜３７０bpにコードされる９９アミノ酸（成熟タンパク質のＩｌｅ１〜Ｍｅｔ９９に等しい）を含む。β２ｍ配列のこの領域は正常人リンパ細胞ｃＤＮＡライブラリーより、それぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を組み込んでいるプライマーＢＭＣ＃１（１μM）およびＢＭＣ＃２（１μM）を用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅した。（Sigma-Genosys、プライマー配列に関する補遺Ｉを参照）。増幅はプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Pfx、Invitrogen）（１．２５U）を用い、２mM ＭｇＳＯ4および０．２mM ｄＮＴＰｓを追加したＰｆｘ増幅緩衝液中で、次の標準的なサーマルサイクル条件で実施した。ステップ１：９４℃、４分間；ステップ２：９４℃、１分間；ステップ３：５５℃、１分間；ステップ４：７２℃、３０秒間；ステップ５：ステップ２に循環、３４回；ステップ６：７２℃、１０分間。
【００８５】
β２ｍおよびｐＥＴ−２４ｃの制限酵素消化
β２ｍＰＣＲ産物を上記混合物よりＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを、製造元指示書（Qiagen）に従い使用して精製した。精製ＰＣＲ産物２００ngおよびｐＥＴ−２４ｃベクター（Novagen）１μgをそれぞれ、製造元指示書に従ってＢａｍＨＩ（１０U）およびＮｄｅＩ（１０U）制限酵素（New England Biolabs、ＮＥＢ）で４時間、３７℃消化した。消化断片を１％アガロース（Bioline）を用いた水平式ゲル電気泳動で分離し、ＱＩＡＥＸ ＩＩゲル抽出キットを製造元指示書（Qiagen）に従い用いて精製した。
【００８６】
β２ｍのｐＥＴ−２４ｃ内連結（ｐＥＴＢＭＣ０１）
ゲル精製した挿入物およびベクターＤＮＡをモル比１：３（ベクター：挿入物、５０ng：７．５ng）でＴ４ＤＮＡリガーゼ（５U；Bioline）を用いＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（添付品）中で１６時間、１６℃で連結した。
【００８７】
ｐＥＴＢＭＣ０１のＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内への形質転換
続いて連結混合物および適当なコントロールをＸＬ１−Ｂｌｕｅ株コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞内に、製造元の指示書（Stratagene）に従って形質転換した。細胞をカナマイシン３０μg/mlを含有するLuria-Bertani（ＬＢ）寒天プレート上に細胞を接種し、一晩３７℃でインキュベーションして上手く形質転換した細胞を選別した。
【００８８】
形質転換細胞のＰＣＲスクリーニング
細菌形質転換プレートから選択した単一コロニーを、クローニング部位に隣接するｐＥＴベクター領域に相補的であるＴ７プロモータ（１μM）およびＴ７ターミネータ（１μM）プライマー（Sigma Genosys、プライマー配列に関する補遺Ｉ参照）を用いたＰＣＲでスクリーニングした。増幅はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１U、Bioline）を２mM ＭｇＳＯ4および０．２mM ｄＮＴＰｓを追加したＴａｑ反応緩衝液（添付品）中に用い、上記２５サーマルサイクル反応で実施した。形質転換細胞は約５００bpのＤＮＡ断片を生成したが、これは１．５％アガロースゲル電気泳動で確認された。
【００８９】
プラスミドＤＮＡ調製
正確な大きさのＰＣＲ産物を生成した形質転換細菌細胞を無菌のＬＢ−カナマイシン培地６mlに接種し、２００rpmで振盪しながら一晩、３７℃でインキュベーションした。ｐＥＴＢＭＣ０１プラスミドＤＮＡを菌培養物より、QIAprep Spin Mini-prepキットを製造元の指示書（Qiagen）に従い用いて回収した。これらプラスミド内にβ２ｍ断片が存在することをさらに自動ＤＮＡにより確認した。ｐＥＴＢＭＣ０１の概略図を図３（ｂ）に示すが、特に制限部位を明示している。
【００９０】
１．２．ｐＥＴＢＭＣ０１内へのＣＯＭＰ−ＢＰのクローニング
ＣＯＭＰ−ＢＰカセットの構築
ＣＯＭＰのオリゴマー化ドメインの配列はGenebankデータベース（登録番号１７０５９９５）より、そしてコイルドコイルドメイン（アミノ酸２１〜８５）はＣＯＭＰの自己会合実験（Efimovら、FEBS Letters 341: 54〜58(1994年)）に基づき選択した。ビオチンアクセプタ配列「ＢＰ」；ＳＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥをＣ末端に組み入れ、さらに１４アミノ酸リンカー、即ちＰＱＰＱＰＫＰＱＰＫＰＥＰＥＴを加えてＣＯＭＰオリゴマー化ドメインとＢＰとの間を物理的に隔てた。
【００９１】
「ＰＣＲアッセンブリ」反応に重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＢＭＣ＃３、ＢＭＣ＃４、ＢＭＣ＃５、ＢＭＣ＃６、ＢＭＣ＃７およびＢＭＣ＃８）を用いて全領域を合成した。オリゴヌクレオチド配列は補遺Ｉに示しており、Sigma-Genosysを用いて合成および精製（「PAGE-pure」）した。プライマー（４．８pmoles）をＴ４キナーゼ（１０U、Gibco）を用いて、ＡＴＰを１mM追加したフォワード反応緩衝液（添付品）に１時間、３７℃でリン酸化した。反応は８０℃で１５分間加熱して反応を停止した後、室温まで冷却してオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを１．１節と同様にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一つに連結し、ＰＣＲに〜１０ngを用いて配列末端を「埋める」し、合成遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応はＢＭＣ＃３（１５μM）およびＢＭＣ＃８（１５μM）次のサーマルサイクル条件でフォワードおよびリバースプライマーとして用いた以外は実質的に１．１節と同様であった：ステップ１：９５℃、４分間；ステップ２、１分間；ステップ３：７０℃、１分間；ステップ４：７２℃、２分間；ステップ５：ステップ２に循環、１５回；ステップ６：７２℃、１０分間。正確なサイズのＰＣＲ産物は前述（１．１節）同様にゲル精製した。
【００９２】
ｐＥＴＢＭＣ０１内にＣＯＭＰ−ＢＰカセットを挿入してｐＥＴＢＭＣ０２を生成する
生成ＣＯＭＰ−ＢＰ２００ngおよびｐＥＴＢＭＣ０１ベクター１μgを、１．１節に記載した様にＨｉｎｄＩＩＩ（１０U）およびＸｈｏＩ（１０U）制限酵素（ＮＥＢ）を用いて、４時間、３７℃で消化した。消化産物を１．１節同様に精製、連結、形質転換およびＰＣＲスクリーニングした。スクリーニングの結果が陽性のプラスミドを精製し、１．１節同様に配列決定した。
【００９３】
制限部位を明示したｐＥＴＢＭＣ０２の概略図を図３（Ｃ）に示す。ＣＯＭＰ−ＢＰをコードするセクションはこの構築体のフレーム外にある。
【００９４】
１．３．ｐＥＴＢＭＣ０２内へのポリグリシンリンカーのクローニング
ポリグリシンリンカーの合成
ポリグリシンリンカーを、重複するオリゴヌクレオチドＢＭＣ＃９およびＢＭＣ＃１０（Sigma-Genosys、「PAGE-pure」、補遺Ｉ）をアニーリングして合成した。ポリグリシンリンカーは、正確なリーディングフレームにコードされている場合には、一文字アミノ酸コードで表される次のモチーフ：ＧＳ（ＧＧＧＧＳ）4ＧＧＫを含んでいる。先頭の２個の残基はＢａｍＨＩ制限部位によりコードされたものであり、最後の残基はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりコードされたものである。ポリグリシンリンカーのヌクレオチド配列は切断されたＢａｍＨＩ制限部位の５’突出部と切断されたＨｉｎｄＩＩＩヌクレオチド認識モチーフの３’突出部のみを組み込んでいることから、次の連結に好適な相補的な一本鎖突出部を作るためにアニーリング生成物をさらに消化する必要はない。オリゴヌクレオチドは１．２節に記載した様にリン酸化し、アニーリングした。
【００９５】
ｐＥＴＢＭＣ０２内にポリグリシンリンカーを挿入しｐＥＴＢＭＣ０３を生成する。
ｐＥＴＢＭＣ０２をＢａｍＨＩ（１０U）およびＨｉｎｄＩＩＩ（１０U）で消化した。アニーリングしたポリグリシンリンカーのｐＥＴＢＭＣ０２内への連結は、アニーリングしたオリゴヌクレオチド量を９６fmole/μlとして前述同様（１．１節）に行った。形質転換およびＰＣＲスクリーニング反応は１．１節に記した通りであるが、さらにＰＣＲスクリーニング産物を制限酵素消化してＳａｌＩ制限部位の有無を確認し、挿入されたリンカーが存在することを実証した。上手く形質転換した細胞は、プラスミドベクターの主鎖より部位が除かれているため、ＳａｌＩ消化に対し感受性ではない。ｐＥＴＢＭＣ０３の精製および自動配列決定は１．１節に記載の通りに行った。
【００９６】
ｐＥＴＢＭＣ０３の概略図を図３（ｄ）に示し、制限部位を明示した。ＢａｍＨＩ部位はポリグリシン配列直前にセリン残基をコードしている。このセリン残基は最終的に取り除かれ、３（ａ）に示す様にｐＥＴＢＭＣ０４を生ずる。
【００９７】
１．４．ポリグリシンリンカー直前にあるセリン残基の除去
ｐＥＴＢＭＣ０３の部位指定突然変異導入
ＭＨＣクラスＩ分子のＸ線結晶分析モデルの解析から、β２ｍのＣ末端はα鎖のα３ドメインに近接していることが示されている。従って、ＢａｍＨＩ制限モチーフがコードするセリン残基を取り除き、Ｇ（ＧＧＧＧＳ）4ＧＧＫを含むリンカーを作ることにより、ポリグリシンリンカーの開始点の柔軟度を最大にすることが望ましい。部位指定突然変異誘導キット（「QuickChange」、Stratagene）を製造元指示書に厳格に従って用い、ＢａｍＨＩ認識モチーフ内にセリンをコードしているＴＣＣトリプレットを取り除くことができるＰＣＲプライマーＢＭＣ＃１１およびＢＭＣ＃１２（「PAGE-pure」、補遺Ｉ）を得た。この構築物が正確なものであることは、自動配列決定（１．１節）により実証され、ｐＥＴＢＭＣ０４と命名された。
【００９８】
ｐＥＴＢＭＣ０４の概略図を図３（ａ）に示す。特にこの図はｐＥＴ２４ｃ中にある完全なβ２ｍ−ＣＯＭＰ構築物の概略図を示しており（ｐＥＴＢＭＣ０４）、制限部位が明示されている。
【００９９】
２．ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖構築物の分子クローニング
２．１ ｐＥＴ−１１ｄベクター内へのＡ*０２０１α鎖のクローニング
ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖（ＥＭＢＬ Ｍ８４３７９）の細胞外部分はメッセンジャーＲＮＡ配列の塩基７３〜９００がコードする２７６個のアミノ酸（成熟タンパク質のＧｌｙ１〜Ｐｒｏ２７６に等しい）を含む。Ａ*０２０１配列のこの領域は、正常人リンパ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、それぞれＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を組み込んだプライマーＡ２Ｓ＃１およびＡ２Ｓ＃２を用いてＰＣＲにより増幅された。Ａ*０２０１挿入物をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ−１１ｄベクター（Novagen）内にクローニングする方法は、１．１節でのβ２ｍに関する説明と実質同じである。
【０１００】
得られたプラスミドはｐＥＴＡ２ｓｏｌと名付けられ、制限部位を明示した概略図を図３（ｅ）に示す。
【０１０１】
３．β２ｍ−ＣＯＭＰおよびＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖タンパク質の発現
同じ操作を実行してβ２ｍ−ＣＯＭＰまたはＡ*０２０１α鎖タンパク質を生成した。プラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞内に形質転換し、大規模に細菌調製を行った。タンパク質は細菌細胞内に不溶性の封入体として生成されるので超音波処理して回収した。精製封入体を変性緩衝液内で可溶化し、必要時まで−８０℃で保存した。特に記載しない限り、化学薬品はＳｉｇｍａより得た。
【０１０２】
３．１．組換え体タンパク質の大規模生成
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内へのｐETＢＭＣ０４およびｐＥＴＡ２ｓｏｌの形質転換
精製したプラスミドＤＮＡをＥｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換したが、この株はｐＥＴをベースとする構築物からタンパク質を発現させるのに必要なＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを持っている。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Stratagene）内への形質転換は、製造元指示書に従い、各反応について精製プラスミドＤＮＡ０．５μgを用いて、適当なコントロールと共に実施した。形質転換に成功したものを、カナマイシン３０μg/ml（ｐＥＴＢＭＣ０４）またはアンピシリン１００μg/ml（ｐＥＴＡ２ｓｏｌ）に加えてクロラムフェニコール３４μg/mlを含有するＬＢ−寒天プレートを用いて選択した。
【０１０３】
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の増殖
単一の形質転換細菌コロニーを、選択に適した抗生物質を含有する無菌ＬＢ培地６０mlに接種し、暖かな（〜２４℃）部屋に一晩放置した。一晩培養した物をＬＢ培地６リットルに加え、振盪しながら（〜２４０rpm）、対数期半ばまで（ＯＤ600＝０．３〜０．４）増殖させた。タンパク質の発現の誘導は、この段階で各フラスコに１ＭのＩＰＴＧ１mlを加えて行った。培養物はさらに振盪しながら４時間、３７℃に放置し、その後細胞を遠心分離により集め、上清を廃棄した。
【０１０４】
超音波処理およびタンパク質回収
細菌細胞の沈殿を氷上に置いた小型のガラス製ビーカーの中で氷冷した緩衝塩類溶液に懸濁してから超音波処理して（ＸＬシリーズ超音波装置；Misonix Inc.、ＵＳＡ）細胞を溶解し、タンパク質封入体を放出させた。細胞が完全に溶解した後、封入体をBeckmann高速遠心分離装置（Ｊ２シリーズ）を用いて１５，０００rpm、１０分間遠心分離を行い、５０mlのポリカーボネート製Oak Ridge遠心チューブの中に沈殿させた。次に封入体を冷したTriton洗浄緩衝液（０．５％Triton X-100、５０mM Tris、pH８．０、１００mM塩化ナトリウム、０．１％窒化ナトリウムおよび用時添加の２mMジチオスレイトール［ＤＴＴ］）で３回洗浄したが、洗浄が終わる度にハンドヘルド式のガラス製ホモジェナイザーを用いて沈殿を再懸濁した。最後に界面活性剤を含まない洗浄緩衝液で洗浄した。
【０１０５】
得られた精製タンパク質調製物を、５０mMのＭＥＳ、pH６．０、０．１mM ＥＤＴＡおよび１mM ＤＴＴを含む８Ｍ尿素緩衝液２０〜５０mlに溶かし、転倒型ローター内に一晩、４℃で放置した。不溶性粒子を遠心分離して取り除き、Brafordタンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad Laboratories）を用い、既知標準物と比較してタンパク質の収量を決定した。またサンプルを１５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた垂直型電気泳動にかけ、発現および精製の質についても検証した。典型的なタンパク質収量はＬＢ培養物１リットル当たり２５〜７５mgであった。β２ｍ−ＣＯＭＰおよびＡ*０２０１α鎖タンパク質の大きさはそれぞれ約２７（kD）および３５（kD）であった。尿素溶解タンパク質は、その後の使用に備えて１０mgずつ小分けし、−８０℃に保存した。
【０１０６】
４．５量体β２ｍ−ＣＯＭＰ複合体の形成
４．１．β２ｍ−ＣＯＭＰの５量体への集合
尿素可溶化封入体からのβ２ｍ−ＣＯＭＰの集合は、０．２Ｍの塩化ナトリウムおよび１mMのＥＤＴＡを含む２０mMのＣＡＰＳ緩衝液、pH１１．０にタンパク質を希釈して最終タンパク質濃度１．５mg/mlにすることで実施した。室温にて酸化および還元グルタチオンを最終濃度がそれぞれ２０mMおよび２mMになるよう添加して、タンパク質を酸化した。一晩インキュベーションした後、１０％ビス−トリシンゲル（Invitrogen）を用いた非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてジスルフィド結合の形成について分析した。
【０１０７】
続いてタンパク質混合物の緩衝液をCentricon Plus-20 Ultra-遠心分離濃縮装置（カットオフ分子量１０kD、Millipore）を製造元指示書通りに使用して２０mMのTris、pH８．０、５０mM塩化ナトリウム（「Ｓ２００緩衝液」）に交換し、ＢｉｒＡ（Affinity、Denver、Colorado）を用いた酵素によるビオチン化に備えて最終容積を４．５mlまで濃縮した。１０倍濃度のＢｉｒＡ反応緩衝液（添付品）０．５mlを加え、最終濃度１０μMの組換え体ＢｉｒＡ酵素に１０mMのＡＴＰ、pH７．０を追加した。タンパク質を保護するためにプロテアーゼインヒビター：０．２mMのＰＭＳＦ、２μg/mlのペプスタチンおよび２μg/mlのロイペプチンも選択して使用した。反応液は室温に４時間放置した。
【０１０８】
４．２．ビオチン化β２ｍ−ＣＯＭＰ５量体の精製
ビオチン化したβ２ｍ−ＣＯＭＰ５量体は、Superdex200HR26/60カラム（Amersham Biosciences）分子篩クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用い、Ｓ２００緩衝液を流して精製した。カラムは前もって製造元指示書に従い校正してから使用し、１３５kDa領域の５量体を含有する分画を集めた。タンパク質回収量はBradfordアッセイを用いて決定し、ビオチン化効率はＨＡＢＡ試薬（Pierce）を製造元指示書に従い用いて決定した。
【０１０９】
５．再折り畳みＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ複合体の形成
５．１．ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖のビオチン化β２ｍ−ＣＯＭＰおよびペプチドの再折り畳み
再折り畳み緩衝液５００mlを次のようにして準備した：１００mM Ｔｒｉｓ、pH８．０、４００mM塩酸アルギニン、２mM ＥＤＴＡ、５mM還元グルタチオンおよび０．５mM酸化グルタチオンを脱イオン水に溶解し、４℃で攪拌し続けた。凍結乾燥した合成ペプチドＧＬＣＴＬＶＡＭＬ１５mgをジメチルスルホキシド０．５mlに溶解し、攪拌しながら再折り畳み緩衝液に加えた。ビオチン化した５量体のβ２ｍ−ＣＯＭＰ５０mgおよびＡ*０２０１α鎖３０mgを連続的に加え、適当な分散を確保するために強く攪拌している緩衝液の中に２３ゲージの皮下注射用針を通して直接注入した。再折り畳み混合液はそのまま１６時間、４℃で攪拌し続けた。
【０１１０】
５．２ 再折り畳み５量体ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ複合体の精製
続いてタンパク質再折り畳み混合液を分子量カットオフ３０kDのMini Kros中空糸限外濾過カートリッジ（Spectrum Labs、Rancho Dominguez、California）を用いて５００mlから２０mlに濃縮した。Centricon Plus-20遠心分離式濃縮装置（分子量カットオフ３０kD）を製造元指示書通りに用いて複合体を２０mlから５mlに更に濃縮し、続いて使い捨て式ＰＤ１０脱塩カラム（Amersham Biosciences）を製造元指示書通りに用いて緩衝液をＳ２００緩衝液に交換した。最終容積は７．５mlであった。濃縮したタンパク質再折り畳み混合液をまず４．２節同様にしてSuperdex 200 HR26/60ゲル濾過クロマトグラフィーカラムを用いたＳＥＣにより精製した。３１０kD領域のタンパク質複合体を含有する分画を集めた。
【０１１１】
ＳＥＣで集めた分画を一つにまとめ、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、１５倍容量の２０mM Ｔｒｉｓ中０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの塩勾配液を流して更に精製した。主要ピークを集めた。タンパク質回収量はBradfordアッセイを用い決定した。
【０１１２】
５．３．精製複合体の蛍光標識化
ストレプトアビジン分子はそれぞれ最大４個までのビオチンに結合できることから、フィコエリスリン（ＰＥ）標識ストレプトアビジンを用いた最終標識化は、４．２章でβ２ｍ−ＣＯＭＰに対して行ったはじめのビオチン化効率を考慮に入れて、それぞれビオチン化５量体複合体に対するストレプトアビジンのモル比を１：０．８にして実施した。必要とされる５量体複合体全量を分割し（例えば５等分し）、ストレプトアビジン−ＰＥ内に連続的に滴下した。Ａ*０２０１の５量体−ストレプトアビジン複合体の濃度を０．０１％アジ化物および１％ＢＳＡを補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１mg/mlに調整した。こうして作製した蛍光試薬は４℃に保存した。
【０１１３】
６．抗原特異的Ｔ細胞の染色
抹消血リンパ球（ＰＢＬ）は、健康なＡ*０２０１陽性であり、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ抗原を用いて強い細胞傷害性Ｔ細胞反応を誘導されたことが前もって確認されているＥＢＶキャリアから血液サンプルを採取して得た。ＰＢＬはFicoll(Amersham Biosciences）を用いた密度勾配遠心分離により単離してからＰＢＳ溶液で洗浄し、細胞数を計測した。各染色条件について１〜２×１０6個のリンパ細胞を割り当て、細胞を１回、洗浄緩衝液（０．１％アジ化ナトリウム、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）で洗浄してから洗浄緩衝液５０□lに再浮遊した。抗ＣＤ８抗体（Dako）と組み合わせてＰＥ標識したＡ*０２０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ５量体１□ｇを用い、小分け細胞の単一群を染色して細胞傷害性Ｔ細胞集団であることを確認した。浮遊液を氷上、暗所にて少なくとも３０分間インキュベーションし、その後暗所にて細胞を洗浄緩衝液で２回洗ってから固定液（１％ウシ胎児血清、２．５％ホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液）内に保存した。その後サンプルを、CellQuestソフトウエアーを用い、Becton-Dickinson FACScan（商標）フローサイトメータで、当業者周知の標準的な方法に従い分析した。
【０１１４】
補遺Ｉ：ＤＮＡ構築物の合成に用いたプライマー一覧表
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】発明のオリゴマーＭＨＣクラスＩ複合体の概略図。図は完全に集合したオリゴマークラスＩキメラ複合体の複数あるサブユニットのうちの２つを示している。β２−ミクログロブリン（β２ｍ）はオリゴマー形成コイルド−コイルタンパク質のコイル状のオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）と融合しているが、このドメインとは第１リンカー（Ｌ１）によって隔てられている。該ドメインのＣ末端には別のリンカー（Ｌ２）が備えられており、さらにビオチン−タンパク質リガーゼＢｉｒＡによるビオチン化のための認識配列（ＢＰ）が続き、最後に精製および検出のためのタグ化／精製ドメイン（ＴＤ）が来ている。ビオチン化ペプチド（ＢＰ）の形態における認識配列のリジン残基と結合している、ビオチン分子（ｂｔ）も示している。ドメインα１、α２およびα３を有する相補的ＭＨＣクラスＩα鎖は、β２ｍおよび抗原性ペプチド（Ｐ）と集合する。複合体のＭＨＣ部分を安定化するジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が描かれている。オリゴマー化ドメインがＣＯＭＰに由来し、集合して安定な５量体を形成する特殊な例を図示する別のジスルフィド結合も示されているが、この場合これらジスルフィド結合が５量体内のＣＯＭＰドメインの各ペアを連結している。複合体中の各αおよびβのアミノ末端およびカルボキシル末端はそれぞれＮおよびCで表している。
【図２】発明のオリゴマーＭＨＣクラスＩＩ複合体の概略図。図では一般に図１の名称を用いているが、（β２ｍ）はドメインα１、α２を有し、リンカー（Ｌ１）を介してオリゴマー化ドメインと融合しているＭＨＣクラスＩＩα鎖に置換えられている。この場合、α鎖は、それに相補的であり、ドメインβ１、β２を有するＭＨＣクラスＩＩβ鎖と集合する。
【図３】制限部位を包含する概略マップであり、それぞれ（ａ）β２ｍ−ＣＯＭＰ発現構築体であるｐＥＴＢＭＣ０４ならびに（ｂ）〜（ｄ）β２ｍ−ＣＯＭＰ中間分子クローニング構築体であるｐＥＴＢＭＣ０１−０３、最後に（ｅ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１α鎖発現構築体であるｐＥＴＡ２ｓｏｌを示しており、後に詳しく説明する。ストップコドンは（ａ）〜（ｅ）の各構築体に於いて‘＊’で表している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのキメラタンパク質を含むオリゴマーＭＨＣ複合体であって、前記キメラタンパク質がＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションを含み、オリゴマーＭＨＣ複合体の形成がキメラタンパク質のオリゴマー化ドメインでのオリゴマー化により生じ、そして第１セクションの少なくとも２つが同一のＭＨＣペプチド鎖に由来するオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項２】
キメラタンパク質の第１セクションがＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩα鎖の細胞外部分に由来する、請求項１に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項３】
キメラタンパク質の第１セクションがＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩβ鎖の細胞外部分に由来する、請求項１又は２に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項４】
キメラタンパク質の少なくとも１つの第２セクションに含まれるオリゴマー化ドメインがヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の５量体化ドメインに由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項５】
キメラタンパク質の少なくとも１つの第２セクションに含まれるＣＯＭＰの５量体化ドメインがＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、そして好ましくはこれらアミノ酸より成る請求項４に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項６】
キメラタンパク質の少なくとも１つがＭＨＣペプチド鎖とオリゴマー化ドメインとの間に第１リンカーを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項７】
キメラタンパク質の少なくとも１つが第２リンカー、タグ化ドメインおよび精製ドメインから成る群より選択される１またはそれ以上のドメインを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項８】
少なくとも２つのキメラタンパク質に相補的であるＭＨＣペプチドを更に含むことにより機能的なＭＨＣ結合複合体を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項９】
クラスＩ複合体に関してはＭＨＣαＩおよびα２ドメインにより、またはクラスＩＩ複合体に関してはＭＨＣα１およびβ１ドメインにより形作られるグローブ内に、複合体のＭＨＣ部分に結合したペプチドを更に含む、請求項８に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１０】
ペプチドが実質的に均一である、請求項９に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１１】
標識を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１２】
標識が光検出標識、放射活性標識、酵素、エピトープ、レクチンまたはビオチンより成る群から選択される、請求項１１に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１３】
ＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクション、およびオリゴマー化ドメインが由来するポリペプチド鎖と実質的に同一版である少なくとも２つのポリペプチド鎖が並置することによって、コイルドコイルタンパク質がオリゴマーを形成するオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質由来オリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含むキメラタンパク質。
【請求項１４】
ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の５量体化ドメインに由来するオリゴマー化ドメインを含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
オリゴマー化ドメインがＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、好ましくはこれらアミノ酸より成る、請求項１４に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモータ配列を含む組換え体発現カセット。
【請求項１７】
請求項１６の組換え体発現カセットを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体を、場合によって医薬的に許容可能な担体と共に含む、医薬または診断薬組成物。
【請求項１９】
抗原レセプターの特異性に基づいて哺乳動物Ｔ細胞を標識および／または検出する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体とＴ細胞との特異的結合の存在を検出することを含む方法。
【請求項２０】
抗原レセプターの特異性に基づいて哺乳動物Ｔ細胞を分離する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体に結合したＴ細胞を未結合細胞から分離することを含む方法。
【請求項２１】
ＢＭＣ＃１（配列番号１）、ＢＭＣ＃２（配列番号２）、ＢＭＣ＃３（配列番号３）、ＢＭＣ＃４（配列番号４）、ＢＭＣ＃５（配列番号５）、ＢＭＣ＃６（配列番号６）、ＢＭＣ＃７（配列番号７）、ＢＭＣ＃８（配列番号８）、ＢＭＣ＃９（配列番号９）、ＢＭＣ＃１０（配列番号１０）、ＢＭＣ＃１１（配列番号１１）、ＢＭＣ＃１２（配列番号１２）、Ａ２Ｓ＃１（配列番号１３）およびＡ２Ｓ＃２（配列番号１４）から成る群より選択されるＤＮＡ配列より成るプライマー。
【請求項１】
少なくとも２つのキメラタンパク質を含むオリゴマーＭＨＣ複合体であって、前記キメラタンパク質がＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクションおよびオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質に由来するオリゴマー化ドメインを含む第２セクションを含み、オリゴマーＭＨＣ複合体の形成がキメラタンパク質のオリゴマー化ドメインでのオリゴマー化により生じ、そして第１セクションの少なくとも２つが同一のＭＨＣペプチド鎖に由来するオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項２】
キメラタンパク質の第１セクションがＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩα鎖の細胞外部分に由来する、請求項１に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項３】
キメラタンパク質の第１セクションがＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩβ鎖の細胞外部分に由来する、請求項１又は２に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項４】
キメラタンパク質の少なくとも１つの第２セクションに含まれるオリゴマー化ドメインがヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の５量体化ドメインに由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項５】
キメラタンパク質の少なくとも１つの第２セクションに含まれるＣＯＭＰの５量体化ドメインがＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、そして好ましくはこれらアミノ酸より成る請求項４に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項６】
キメラタンパク質の少なくとも１つがＭＨＣペプチド鎖とオリゴマー化ドメインとの間に第１リンカーを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項７】
キメラタンパク質の少なくとも１つが第２リンカー、タグ化ドメインおよび精製ドメインから成る群より選択される１またはそれ以上のドメインを更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項８】
少なくとも２つのキメラタンパク質に相補的であるＭＨＣペプチドを更に含むことにより機能的なＭＨＣ結合複合体を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項９】
クラスＩ複合体に関してはＭＨＣαＩおよびα２ドメインにより、またはクラスＩＩ複合体に関してはＭＨＣα１およびβ１ドメインにより形作られるグローブ内に、複合体のＭＨＣ部分に結合したペプチドを更に含む、請求項８に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１０】
ペプチドが実質的に均一である、請求項９に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１１】
標識を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１２】
標識が光検出標識、放射活性標識、酵素、エピトープ、レクチンまたはビオチンより成る群から選択される、請求項１１に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体。
【請求項１３】
ＭＨＣペプチド鎖もしくはその機能的部分に由来する第１セクション、およびオリゴマー化ドメインが由来するポリペプチド鎖と実質的に同一版である少なくとも２つのポリペプチド鎖が並置することによって、コイルドコイルタンパク質がオリゴマーを形成するオリゴマー形成コイルドコイルタンパク質由来オリゴマー化ドメインを含む第２セクションとを含むキメラタンパク質。
【請求項１４】
ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）の５量体化ドメインに由来するオリゴマー化ドメインを含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
オリゴマー化ドメインがＣＯＭＰのアミノ酸１〜１２８、好ましくは２０〜８３、最も好ましくは２０〜７２を含み、好ましくはこれらアミノ酸より成る、請求項１４に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモータ配列を含む組換え体発現カセット。
【請求項１７】
請求項１６の組換え体発現カセットを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体を、場合によって医薬的に許容可能な担体と共に含む、医薬または診断薬組成物。
【請求項１９】
抗原レセプターの特異性に基づいて哺乳動物Ｔ細胞を標識および／または検出する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体とＴ細胞との特異的結合の存在を検出することを含む方法。
【請求項２０】
抗原レセプターの特異性に基づいて哺乳動物Ｔ細胞を分離する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーＭＨＣ複合体とＴ細胞を含む浮遊液もしくは生物学的サンプルとを混合すること、および
（ii）上記複合体に結合したＴ細胞を未結合細胞から分離することを含む方法。
【請求項２１】
ＢＭＣ＃１（配列番号１）、ＢＭＣ＃２（配列番号２）、ＢＭＣ＃３（配列番号３）、ＢＭＣ＃４（配列番号４）、ＢＭＣ＃５（配列番号５）、ＢＭＣ＃６（配列番号６）、ＢＭＣ＃７（配列番号７）、ＢＭＣ＃８（配列番号８）、ＢＭＣ＃９（配列番号９）、ＢＭＣ＃１０（配列番号１０）、ＢＭＣ＃１１（配列番号１１）、ＢＭＣ＃１２（配列番号１２）、Ａ２Ｓ＃１（配列番号１３）およびＡ２Ｓ＃２（配列番号１４）から成る群より選択されるＤＮＡ配列より成るプライマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５１６８８２（Ｐ２００６−５１６８８２Ａ）
【公表日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３０１５５（Ｐ２００４−５３０１５５）
【出願日】平成１５年８月１４日（２００３．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１８５２０
【国際公開日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（５０５０６３４６３）プロイミューン・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＩＭＭＵＮＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月１４日（２００３．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００９０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１８５２０
【国際公開日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（５０５０６３４６３）プロイミューン・リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＩＭＭＵＮＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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