クラゲコラーゲンを含む免疫活性増強剤
【課題】入手が比較的容易な原料を用いて免疫活性を増強させつつ、アレルギー応答に影響を及ぼさない免疫活性増強剤を提供すること。
【解決手段】
［１］クラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤。
［２］前記免疫活性増強剤が免疫細胞数増加促進剤であって、前記免疫細胞が、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［１］に記載の免疫活性増強剤。
【解決手段】
［１］クラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤。
［２］前記免疫活性増強剤が免疫細胞数増加促進剤であって、前記免疫細胞が、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［１］に記載の免疫活性増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫活性増強剤に関し、さらに詳しくはコラーゲンを含む免疫活性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体においては、抗原が体内へ侵入したときにこれらを特異的に排除する反応が免疫系において起こる。これは免疫応答と呼ばれ、生態防御機構の１つとして知られている。
【０００３】
免疫応答には体液性免疫と細胞性免疫とがあるが、この免疫応答は、上記の抗原に特異的であること、反応し得る抗原の種類が１０９という膨大な数に上ること、一度侵入した抗原に対しての記憶が残ること（免疫記憶）、応答が自律的に終息すること、そして自らが有している抗原物質に対しては反応しないこと（免疫寛容）といった特徴を備えている。
【０００４】
例えば、個体が、ある細菌という抗原に初めて接すると、免疫系の細胞がこの抗原を認識し、この結果、この細菌に対する免疫反応が惹起されることになる。場合によっては、寛容（トレランス）になったりもする。
【０００５】
上記の細菌は一次抗原であり、一次抗原刺激に対しては、５つあるヒトの免疫グロブリン（以下、「Ｉｇ」ということがある）のクラスのうち、まず、ＩｇＭクラスの抗体が産生され（一次応答）、これが大勢を占める。一方、この細菌に次に接した場合には、これは二次抗原刺激となり、ＩｇＧクラスの抗体が優位に産生される（二次応答）ことが知られている。
【０００６】
一次応答と二次応答とを比較してみると、二次応答における抗原と抗体との親和力は、一次応答における親和力よりも遙かに高く、アフィニティ・マチュレーションが起こっている（非特許文献１）。
【０００７】
免疫応答においてこうした一次応答と二次応答とが起こることを利用した病気の予防として、各種ワクチンの接種が行われているが、 一回の接種では十分な免疫記憶が形成されないため、複数回の接種が必要とされることがある。そして、二回目の接種の際にアナフィラキシーが起こることもある。アナフィラキシーはアレルギー反応の一種であり、免疫応答の一つの表れであるが、急速で激しい症状を呈する問題がある。
【０００８】
この一方、免疫に関連するコラーゲンの活用例として、慢性関節リウマチ等の免疫系媒介疾患の治療のための粘膜結合性分子成分に結合されたコラーゲン分子成分を含んでなる自己免疫疾患治療用化合物が知られている。
【０００９】
しかしながらかかるコラーゲンは細菌のトキシン等に結合されている特殊なものである上に、慢性関節リウマチ等の特定の免疫系媒介疾患に効用が示唆されるに過ぎず、その応用範囲が限定的であるとの問題があった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表平１０−５１２５５４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】免疫学イラストレイテッド 87頁 南江堂 1986年4月25日 第6刷発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の背景に加えて疾病予防の観点から、アナフィラキシー等の望ましくない免疫応答を回避しつつ、免疫応答能、すなわち免疫活性を高めることは医療医薬分野の関係者から強く要望されている。
【００１３】
しかしながら望ましくない免疫応答を回避しつつ、免疫活性を高めることを可能とする有効成分を見つけることは容易ではなく、さらにはその有効成分が見つかったとしても、その有効成分を入手することが困難な場合や大量生産することが困難な場合にはその活用の範囲が制限されることになる。
【００１４】
本発明の目的は、入手が比較的容易な原料を用いて免疫活性を増強させつつ、アレルギー応答に影響を及ぼさない免疫活性増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討した結果、動物由来コラーゲンや植物由来コラーゲン等の中でも、クラゲコラーゲンを含む免疫活性増強剤が本発明の目的に適うことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、
［１］クラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤を提供するものである。
【００１７】
また本発明は、
［２］前記免疫活性増強剤が、免疫細胞数増加促進剤であって、
前記免疫細胞が、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［１］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００１８】
また本発明は、
［３］前記免疫活性増強剤が、免疫グロブリン産生促進剤であって、
前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭからなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［１］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、
［４］前記免疫グロブリン産生促進剤が、パイエル板リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤、腸間膜リンパ節リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤および脾臓リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［３］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、
［５］前記免疫グロブリン産生促進剤が、血液中の免疫グロブリン産生促進剤である、上記［３］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫活性増強剤を含む食品を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、
［７］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫活性増強剤からなる、食品添加剤を提供するものである。
【００２３】
また本発明は、
［８］免疫活性増強用クラゲコラーゲンを提供するものである。
【００２４】
また本発明は、
［９］クラゲコラーゲンを経口摂取させることによる、動物の免疫活性増強方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の免疫活性増強剤を経口摂取することにより、免疫細胞数として、例えば、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球、脾臓リンパ球等のリンパ球の増加を促進し、前記リンパ球や血液中のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ等の免疫グロブリンの産生を促進することができる。
【００２６】
また本発明に使用するクラゲコラーゲンは、海中から大量に安価で入手することができるクラゲから簡便に得ることができるから、本発明の免疫活性増強剤を経済効率よく大量供給することが可能である。
【００２７】
さらには、クラゲコラーゲンはアレルギー応答の促進性が低いため、安全性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】クラゲコラーゲンの添加量とパイエル板リンパ球のＩｇＡ産生量との関係を示すグラフである（実施例３）。
【図２】クラゲコラーゲンの添加量と腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ産生量との関係を示すグラフである（実施例４）。
【図３】クラゲコラーゲンの添加量と脾臓リンパ球のＩｇＧ産生量との関係を示すグラフである（実施例５）。
【図４】クラゲコラーゲンの添加量と脾臓リンパ球のＩｇＡ産生量との関係を示すグラフである（実施例６）。
【図５】クラゲコラーゲンの添加量と脾臓リンパ球のＩｇＭ産生量との関係を示すグラフである（実施例７）。
【図６】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン経口摂取による脾臓リンパ球のＩｇＧ産生量との関係を示すグラフである（実施例８）。
【図７】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン経口摂取による脾臓リンパ球のＩｇＡ産生量を示すグラフである（実施例９）。
【図８】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン経口摂取による脾臓リンパ球のＩｇＭ産生量を示すグラフである（実施例１０）。
【図９】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の脾臓リンパ球の卵白アルブミン特異的ＩｇＧ量を示すグラフである（実施例１１）。
【図１０】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の脾臓リンパ球の卵白アルブミン特異的ＩｇＡ量を示すグラフである（実施例１２）。
【図１１】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の脾臓リンパ球の卵白アルブミン特異的ＩｇＭ量を示すグラフである（実施例１３）。
【図１２】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＧ量を示すグラフである（実施例１４）。
【図１３】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＡ量を示すグラフである（実施例１５）。
【図１４】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＭ量を示すグラフである（実施例１６）。
【図１５】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＥ量を示すグラフである（比較例１７、１８）。
【図１６】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中の卵白アルブミン特異的ＩｇＥ量を示すグラフである（比較例１９、２０）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
最初に本発明に使用するクラゲについて説明する。
前記根口クラゲ目や前記旗口クラゲ目に属する食用のクラゲとしては、具体的には、タコクラゲ、エビクラゲ、ビゼンクラゲ、エチゼンクラゲ、サカサクラゲ、ミズクラゲ、ユウレイクラゲ、アカクラゲ等を挙げることができる。
【００３０】
本発明に使用する前記クラゲは、エチゼンクラゲ、ミズクラゲ、ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイプクラゲ、キャノンボールタイプクラゲ、ボールタイプクラゲ等が好ましい。
【００３１】
前記クラゲは一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００３２】
上述したクラゲは、海中から水揚げしたものをそのまま本発明の原料として使用することもできるし、水揚げ後、前記クラゲを食塩、ミョウバン、重炭酸ナトリウムを用いて処理し、最終的に塩分濃度１６〜１７％の塩蔵品としたクラゲ等を本発明の原料として使用するこもできる。
【００３３】
塩蔵品を使用する場合には、前記塩蔵品を水に漬けて塩抜きし、水切りを行い、この水切り後のクラゲを使用することが好ましい。
【００３４】
まず前記クラゲから温水によりコラーゲンを抽出する方法について説明する。
前記温水によりコラーゲンを抽出する操作の前に、前記クラゲは細かく刻んでおくことが好ましい。
前記クラゲを細かく刻む方法としては、例えば、前記クラゲを裁断機、ミンチ機、サイレン、カッター等の一種もしくは二種以上の装置を用いて行う方法を挙げることができる。
【００３５】
次に前記クラゲに対し、水切りした後の前記クラゲの重量を基準として、１／１０〜３０倍、好ましくは１／３〜１倍の範囲の重量の温水により抽出する。
前記温水の温度範囲は、６０〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃の範囲がより好ましく、９０〜１２５℃の範囲であればさらに好ましい。
１００℃以上の温水は、加圧釜等を用いて容器内部の圧力を１気圧以上に設定する等の方法により得ることができる。
【００３６】
前記クラゲから温水によりコラーゲンを抽出する時間は、５分〜６時間の範囲であることが好ましく、３０分〜２時間の範囲であればさらに好ましい。
【００３７】
上記温水による抽出操作の後、不溶分を濾過により除く。
得られた抽出液からスプレードライによる方法、凍結乾燥による方法等により水分を除去することにより、本発明に使用するクラゲコラーゲンを得ることができる。
【００３８】
前記抽出液から水分を除去する際には、予め浸透膜等を利用した逆浸透操作、蒸留操作等の方法により前記抽出液を濃縮する操作を実施することができる。
【００３９】
また上記温水による抽出操作の後、硫酸アンモニウム等の無機塩を使用して塩析によりクラゲコラーゲンを沈殿させる方法によってもクラゲコラーゲンを得ることができる。
沈殿したクラゲコラーゲンを、遠心分離、濾過等の方法により分離することができる。
【００４０】
なお、塩析に使用する硫酸アンモニウム等は飽和量を１００％として２０〜５０％の範囲の水溶液を使用することが好ましく、４５〜５０％の範囲の水溶液であればさらに好ましい。
【００４１】
この様にして得られたクラゲコラーゲンにより本発明の免疫活性増強剤を得ることができる。
【００４２】
本発明に使用するクラゲコラーゲンは、粉末状、顆粒状、ペレット状、タブレット状等に成形したり、カプセル錠等に加工したり、水溶液等の液体等として提供することができる。
【００４３】
本発明の免疫活性増強剤は、クラゲコラーゲンからなるものであってもよいし、クラゲコラーゲンと水とを含むものであってもよいし、さらにビタミン類、無機塩類等の滋養強壮成分等を含むものであってもよい。
【００４４】
前記クラゲコラーゲンは免疫活性増強用食品として使用することができる。また、加工食品や調理品等の食品に対する免疫活性増強用添加剤として前記クラゲコラーゲンを使用することもできる。
【００４５】
さらに前記クラゲコラーゲンは、人間のみならず、人間以外の動物、例えば、牛、豚、鳥、馬等の家畜動物、犬、猫等の愛玩動物、鰹、鮪、鯖、鰯等の養殖動物等に対して経口摂取させることにより、家畜動物、愛玩動物、養殖動物等の免疫細胞数を増加させ、免疫グロブリンの産生を促進することにより免疫活性を高めることもできる。
【００４６】
以下に実施例に基づき本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
水洗したミズクラゲを包丁により裁断し、さらにミキサーにより細かく裁断した後、加圧調理器に細かく裁断したミズクラゲと水を入れて、１２１℃の温度で２０分間加熱した。
【００４８】
不溶物を濾過により除去し、得られた水溶液のうち、飽和量に対して５０％の硫酸アンモニウムを加えて、クラゲコラーゲンを塩析した。沈殿物を遠心分離により分離してクラゲコラーゲンを得た。
【００４９】
次にマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に対して前記クラゲコラーゲン水溶液を一週間経口摂取させた。この量はヒトに換算すると、１０ｍｇ／ｍＬの前記クラゲコラーゲン水溶液を一日３０ｍＬ服用する量に相当する。
【００５０】
次に前記マウスから摘出したパイエル板の免疫組織から免疫細胞であるパイエル板リンパ球を分離し、前記パイエル板リンパ球数を血球計算盤にて数えた。その結果、前記パイエル板リンパ球数は３．８×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
【実施例２】
【００５２】
実施例１の場合で前記パイエル板の免疫組織に代えて、腸間膜リンパ節の免疫組織を用いて同様に実験を行った。その結果、前記腸間膜リンパ節リンパ球数は５．３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【００５３】
［比較例１］
実施例１の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲンを与えなかった他は全く同様に実験を行った。その結果、前記パイエル板リンパ球数は２．４×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【００５４】
［比較例２］
実施例１の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲンを与えなかった他は全く同様に実験を行った。その結果、前記腸間膜リンパ節リンパ球数は３．９×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【実施例３】
【００５５】
免疫グロブリン産生促進について免疫細胞を後述する条件にて培養し、免疫グロブリンの産生量を指標として評価した。免疫グロブリンの産生量は、抗ヒト免疫グロブリン抗体（バイオソース社製）等を用いた酵素抗体法により測定した。
また、この細胞の培養には、ＥＤＲＦ培地を極東製薬工業社より購入して使用した。
【００５６】
上述した実施例１で調製したクラゲコラーゲン水溶液を、図１に示される濃度になるよう、リン酸緩衝液を用いて希釈した。段階希釈した各試料１００μＬを、あらかじめ用意した９６穴培養プレートの各穴にそれぞれ分注した。
【００５７】
ついで、以下のようにして培地を調製した。すなわち、ＥＤＲＦ粉末１７．７ｇを５００ｍＬの蒸留水に溶解し、２μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡおよび５％ウシ胎児血清を添加した培地１０ｍＬ以上を用いて、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。このパイエル板リンパ球を含む培地を、上記のプレートの各穴に１００μＬずつ分注した。
【００５８】
これらのプレートを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて２４時間培養し、培養上清中のＩｇＡの産生量を、上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１に示す（図１の参照符号１）。
クラゲコラーゲンの濃度が２〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【実施例４】
【００５９】
実施例３の場合で、腸間膜リンパ節リンパ球を用いて培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図２に示す（図２の参照符号３）。
クラゲコラーゲンの濃度が２〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【００６０】
［比較例３］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例３の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１に示す（図１の参照符号２）。
【００６１】
［比較例４］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例４の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図２に示す（図２の参照符号４）。
【実施例５】
【００６２】
実施例３の場合で、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球に代えて、脾臓リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを使用した他は実施例３の場合と同様に実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図３に示す（図３の参照符号５）。
【００６３】
クラゲコラーゲンの濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＧの産生量が増加した。
【実施例６】
【００６４】
実施例３の場合で、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球に代えて、脾臓リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを使用した他は実施例３の場合と同様に実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図４に示す（図４の参照符号７）。
【００６５】
クラゲコラーゲンの濃度が１００〜８００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【実施例７】
【００６６】
実施例３の場合で、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球に代えて、脾臓リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを使用した他は実施例３の場合と同様に実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図５に示す（図５の参照符号９）。
【００６７】
クラゲコラーゲンの濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【００６８】
［比較例５］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例５の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図３に示す（図３の参照符号６）。
【００６９】
［比較例６］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例６の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図４に示す（図４の参照符号８）。
【００７０】
［比較例７］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例７の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図５に示す（図５の参照符号１０）。
【実施例８】
【００７１】
実施例５の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に脾臓を回収した。
この脾臓リンパ球の抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図６に示す（図６の参照符号１１）。
【実施例９】
【００７２】
実施例６の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に脾臓を回収した。
この脾臓リンパ球の抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図７に示す（図７の参照符号１３）。
【実施例１０】
【００７３】
実施例７の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に脾臓を回収した。
この脾臓リンパ球の抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図８に示す（図８の参照符号１５）。
【００７４】
［比較例８］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例８の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図６に示す（図６の参照符号１２）。
【００７５】
［比較例９］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例９の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図７に示す（図７の参照符号１４）。
【００７６】
［比較例１０］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１０の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図８に示す（図８の参照符号１６）。
【実施例１１】
【００７７】
実施例８の場合で、脾臓リンパ球の卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原に関する抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図９に示す（図９の参照符号１７）。図９の縦軸は吸光計の４１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【実施例１２】
【００７８】
実施例９の場合で、脾臓リンパ球の卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原に関する抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１０に示す（図１０の参照符号１９）。図１０の縦軸は吸光計の４１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【実施例１３】
【００７９】
実施例１０の場合で、脾臓リンパ球の卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原に関する抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１１に示す（図１１の参照符号２１）。図１１の縦軸は吸光計の４１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【００８０】
［比較例１１］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１１の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図９に示す（図９の参照符号１８）。
【００８１】
［比較例１２］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１２の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１０に示す（図１０の参照符号２０）。
【００８２】
［比較例１３］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１３の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１１に示す（図１１の参照符号２２）。
【実施例１４】
【００８３】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。この血液中のＩｇＧの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１２に示す（図１２の参照符号２３）。
【実施例１５】
【００８４】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。この血液中のＩｇＡの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１３に示す（図１３の参照符号２５）。
【実施例１６】
【００８５】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。この血液中のＩｇＭの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１４に示す（図１４の参照符号２７）。
【００８６】
［比較例１４］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１４の場合と全く同様の実験を行い、前記マウスの血液中のＩｇＧの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１２に示す（図１２の参照符号２４）。
【００８７】
［比較例１５］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１５の場合と全く同様の実験を行い、前記マウスの血液中のＩｇＡの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１３に示す（図１３の参照符号２６）。
【００８８】
［比較例１６］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１６の場合と全く同様の実験を行い、前記マウスの血液中のＩｇＭの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１４に示す（図１４の参照符号２８）。
【００８９】
［比較例１７］
一般には抗原としての卵白アルブミン（ＯＶＡ） により、アレルギー抗体であるＩｇＥの産生が誘発される。クラゲコラーゲンがアレルギー応答まで促進するかどうかについて確認を行った。
【００９０】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。
このマウスの血液中のＩｇＥの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１５に示す（図１５の参照符号２９）。
【００９１】
［比較例１８］
比較例１７の場合で、マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を与えなかった他は全く同様に実験を行い、マウスの血液中のＩｇＥの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１５に示す（図１５の参照符号３０）。
【００９２】
［比較例１９］
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。
このマウスの血液中のＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１６に示す（図１６の参照符号３１）。
【００９３】
［比較例２０］
比較例１９の場合で、マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を与えなかった他は全く同様に実験を行い、マウスの血液中のＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１６に示す（図１６の参照符号３２）。
【符号の説明】
【００９４】
１ 実施例３のＩｇＡ産生量
２ 比較例３のＩｇＡ産生量
３ 実施例４のＩｇＡ産生量
４ 比較例４のＩｇＡ産生量
５ 実施例５のＩｇＧ産生量
６ 比較例５のＩｇＧ産生量
７ 実施例６のＩｇＡ産生量
８ 比較例６のＩｇＡ産生量
９ 実施例７のＩｇＭ産生量
１０ 比較例７のＩｇＭ産生量
１１ 実施例８のＩｇＧ産生量
１２ 比較例８のＩｇＧ産生量
１３ 実施例９のＩｇＡ産生量
１４ 比較例９のＩｇＡ産生量
１５ 実施例１０のＩｇＭ産生量
１６ 比較例１０のＩｇＭ産生量
１７ 実施例１１のＩｇＧ産生量
１８ 比較例１１のＩｇＧ産生量
１９ 実施例１２のＩｇＡ産生量
２０ 比較例１２のＩｇＡ産生量
２１ 実施例１３のＩｇＭ産生量
２２ 比較例１３のＩｇＭ産生量
２３ 実施例１４のＩｇＧ濃度
２４ 比較例１４のＩｇＧ濃度
２５ 実施例１５のＩｇＡ濃度
２６ 比較例１５のＩｇＡ濃度
２７ 実施例１６のＩｇＭ濃度
２８ 比較例１６のＩｇＭ濃度
２９ 比較例１７のＩｇＥ濃度
３０ 比較例１８のＩｇＥ濃度
３１ 比較例１９のＩｇＥ濃度
３２ 比較例２０のＩｇＥ濃度
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫活性増強剤に関し、さらに詳しくはコラーゲンを含む免疫活性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体においては、抗原が体内へ侵入したときにこれらを特異的に排除する反応が免疫系において起こる。これは免疫応答と呼ばれ、生態防御機構の１つとして知られている。
【０００３】
免疫応答には体液性免疫と細胞性免疫とがあるが、この免疫応答は、上記の抗原に特異的であること、反応し得る抗原の種類が１０９という膨大な数に上ること、一度侵入した抗原に対しての記憶が残ること（免疫記憶）、応答が自律的に終息すること、そして自らが有している抗原物質に対しては反応しないこと（免疫寛容）といった特徴を備えている。
【０００４】
例えば、個体が、ある細菌という抗原に初めて接すると、免疫系の細胞がこの抗原を認識し、この結果、この細菌に対する免疫反応が惹起されることになる。場合によっては、寛容（トレランス）になったりもする。
【０００５】
上記の細菌は一次抗原であり、一次抗原刺激に対しては、５つあるヒトの免疫グロブリン（以下、「Ｉｇ」ということがある）のクラスのうち、まず、ＩｇＭクラスの抗体が産生され（一次応答）、これが大勢を占める。一方、この細菌に次に接した場合には、これは二次抗原刺激となり、ＩｇＧクラスの抗体が優位に産生される（二次応答）ことが知られている。
【０００６】
一次応答と二次応答とを比較してみると、二次応答における抗原と抗体との親和力は、一次応答における親和力よりも遙かに高く、アフィニティ・マチュレーションが起こっている（非特許文献１）。
【０００７】
免疫応答においてこうした一次応答と二次応答とが起こることを利用した病気の予防として、各種ワクチンの接種が行われているが、 一回の接種では十分な免疫記憶が形成されないため、複数回の接種が必要とされることがある。そして、二回目の接種の際にアナフィラキシーが起こることもある。アナフィラキシーはアレルギー反応の一種であり、免疫応答の一つの表れであるが、急速で激しい症状を呈する問題がある。
【０００８】
この一方、免疫に関連するコラーゲンの活用例として、慢性関節リウマチ等の免疫系媒介疾患の治療のための粘膜結合性分子成分に結合されたコラーゲン分子成分を含んでなる自己免疫疾患治療用化合物が知られている。
【０００９】
しかしながらかかるコラーゲンは細菌のトキシン等に結合されている特殊なものである上に、慢性関節リウマチ等の特定の免疫系媒介疾患に効用が示唆されるに過ぎず、その応用範囲が限定的であるとの問題があった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表平１０−５１２５５４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】免疫学イラストレイテッド 87頁 南江堂 1986年4月25日 第6刷発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の背景に加えて疾病予防の観点から、アナフィラキシー等の望ましくない免疫応答を回避しつつ、免疫応答能、すなわち免疫活性を高めることは医療医薬分野の関係者から強く要望されている。
【００１３】
しかしながら望ましくない免疫応答を回避しつつ、免疫活性を高めることを可能とする有効成分を見つけることは容易ではなく、さらにはその有効成分が見つかったとしても、その有効成分を入手することが困難な場合や大量生産することが困難な場合にはその活用の範囲が制限されることになる。
【００１４】
本発明の目的は、入手が比較的容易な原料を用いて免疫活性を増強させつつ、アレルギー応答に影響を及ぼさない免疫活性増強剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討した結果、動物由来コラーゲンや植物由来コラーゲン等の中でも、クラゲコラーゲンを含む免疫活性増強剤が本発明の目的に適うことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、
［１］クラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤を提供するものである。
【００１７】
また本発明は、
［２］前記免疫活性増強剤が、免疫細胞数増加促進剤であって、
前記免疫細胞が、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［１］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００１８】
また本発明は、
［３］前記免疫活性増強剤が、免疫グロブリン産生促進剤であって、
前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭからなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［１］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、
［４］前記免疫グロブリン産生促進剤が、パイエル板リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤、腸間膜リンパ節リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤および脾臓リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも一つである、上記［３］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、
［５］前記免疫グロブリン産生促進剤が、血液中の免疫グロブリン産生促進剤である、上記［３］に記載の免疫活性増強剤を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫活性増強剤を含む食品を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、
［７］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫活性増強剤からなる、食品添加剤を提供するものである。
【００２３】
また本発明は、
［８］免疫活性増強用クラゲコラーゲンを提供するものである。
【００２４】
また本発明は、
［９］クラゲコラーゲンを経口摂取させることによる、動物の免疫活性増強方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の免疫活性増強剤を経口摂取することにより、免疫細胞数として、例えば、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球、脾臓リンパ球等のリンパ球の増加を促進し、前記リンパ球や血液中のＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ等の免疫グロブリンの産生を促進することができる。
【００２６】
また本発明に使用するクラゲコラーゲンは、海中から大量に安価で入手することができるクラゲから簡便に得ることができるから、本発明の免疫活性増強剤を経済効率よく大量供給することが可能である。
【００２７】
さらには、クラゲコラーゲンはアレルギー応答の促進性が低いため、安全性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】クラゲコラーゲンの添加量とパイエル板リンパ球のＩｇＡ産生量との関係を示すグラフである（実施例３）。
【図２】クラゲコラーゲンの添加量と腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ産生量との関係を示すグラフである（実施例４）。
【図３】クラゲコラーゲンの添加量と脾臓リンパ球のＩｇＧ産生量との関係を示すグラフである（実施例５）。
【図４】クラゲコラーゲンの添加量と脾臓リンパ球のＩｇＡ産生量との関係を示すグラフである（実施例６）。
【図５】クラゲコラーゲンの添加量と脾臓リンパ球のＩｇＭ産生量との関係を示すグラフである（実施例７）。
【図６】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン経口摂取による脾臓リンパ球のＩｇＧ産生量との関係を示すグラフである（実施例８）。
【図７】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン経口摂取による脾臓リンパ球のＩｇＡ産生量を示すグラフである（実施例９）。
【図８】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン経口摂取による脾臓リンパ球のＩｇＭ産生量を示すグラフである（実施例１０）。
【図９】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の脾臓リンパ球の卵白アルブミン特異的ＩｇＧ量を示すグラフである（実施例１１）。
【図１０】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の脾臓リンパ球の卵白アルブミン特異的ＩｇＡ量を示すグラフである（実施例１２）。
【図１１】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の脾臓リンパ球の卵白アルブミン特異的ＩｇＭ量を示すグラフである（実施例１３）。
【図１２】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＧ量を示すグラフである（実施例１４）。
【図１３】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＡ量を示すグラフである（実施例１５）。
【図１４】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＭ量を示すグラフである（実施例１６）。
【図１５】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中のＩｇＥ量を示すグラフである（比較例１７、１８）。
【図１６】卵白アルブミンによる免疫感作後のマウスについてクラゲコラーゲン１ヶ月連続経口摂取後の血液中の卵白アルブミン特異的ＩｇＥ量を示すグラフである（比較例１９、２０）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
最初に本発明に使用するクラゲについて説明する。
前記根口クラゲ目や前記旗口クラゲ目に属する食用のクラゲとしては、具体的には、タコクラゲ、エビクラゲ、ビゼンクラゲ、エチゼンクラゲ、サカサクラゲ、ミズクラゲ、ユウレイクラゲ、アカクラゲ等を挙げることができる。
【００３０】
本発明に使用する前記クラゲは、エチゼンクラゲ、ミズクラゲ、ホワイトタイプクラゲ、チャイナタイプクラゲ、セミチャイナタイプクラゲ、キャノンボールタイプクラゲ、ボールタイプクラゲ等が好ましい。
【００３１】
前記クラゲは一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００３２】
上述したクラゲは、海中から水揚げしたものをそのまま本発明の原料として使用することもできるし、水揚げ後、前記クラゲを食塩、ミョウバン、重炭酸ナトリウムを用いて処理し、最終的に塩分濃度１６〜１７％の塩蔵品としたクラゲ等を本発明の原料として使用するこもできる。
【００３３】
塩蔵品を使用する場合には、前記塩蔵品を水に漬けて塩抜きし、水切りを行い、この水切り後のクラゲを使用することが好ましい。
【００３４】
まず前記クラゲから温水によりコラーゲンを抽出する方法について説明する。
前記温水によりコラーゲンを抽出する操作の前に、前記クラゲは細かく刻んでおくことが好ましい。
前記クラゲを細かく刻む方法としては、例えば、前記クラゲを裁断機、ミンチ機、サイレン、カッター等の一種もしくは二種以上の装置を用いて行う方法を挙げることができる。
【００３５】
次に前記クラゲに対し、水切りした後の前記クラゲの重量を基準として、１／１０〜３０倍、好ましくは１／３〜１倍の範囲の重量の温水により抽出する。
前記温水の温度範囲は、６０〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃の範囲がより好ましく、９０〜１２５℃の範囲であればさらに好ましい。
１００℃以上の温水は、加圧釜等を用いて容器内部の圧力を１気圧以上に設定する等の方法により得ることができる。
【００３６】
前記クラゲから温水によりコラーゲンを抽出する時間は、５分〜６時間の範囲であることが好ましく、３０分〜２時間の範囲であればさらに好ましい。
【００３７】
上記温水による抽出操作の後、不溶分を濾過により除く。
得られた抽出液からスプレードライによる方法、凍結乾燥による方法等により水分を除去することにより、本発明に使用するクラゲコラーゲンを得ることができる。
【００３８】
前記抽出液から水分を除去する際には、予め浸透膜等を利用した逆浸透操作、蒸留操作等の方法により前記抽出液を濃縮する操作を実施することができる。
【００３９】
また上記温水による抽出操作の後、硫酸アンモニウム等の無機塩を使用して塩析によりクラゲコラーゲンを沈殿させる方法によってもクラゲコラーゲンを得ることができる。
沈殿したクラゲコラーゲンを、遠心分離、濾過等の方法により分離することができる。
【００４０】
なお、塩析に使用する硫酸アンモニウム等は飽和量を１００％として２０〜５０％の範囲の水溶液を使用することが好ましく、４５〜５０％の範囲の水溶液であればさらに好ましい。
【００４１】
この様にして得られたクラゲコラーゲンにより本発明の免疫活性増強剤を得ることができる。
【００４２】
本発明に使用するクラゲコラーゲンは、粉末状、顆粒状、ペレット状、タブレット状等に成形したり、カプセル錠等に加工したり、水溶液等の液体等として提供することができる。
【００４３】
本発明の免疫活性増強剤は、クラゲコラーゲンからなるものであってもよいし、クラゲコラーゲンと水とを含むものであってもよいし、さらにビタミン類、無機塩類等の滋養強壮成分等を含むものであってもよい。
【００４４】
前記クラゲコラーゲンは免疫活性増強用食品として使用することができる。また、加工食品や調理品等の食品に対する免疫活性増強用添加剤として前記クラゲコラーゲンを使用することもできる。
【００４５】
さらに前記クラゲコラーゲンは、人間のみならず、人間以外の動物、例えば、牛、豚、鳥、馬等の家畜動物、犬、猫等の愛玩動物、鰹、鮪、鯖、鰯等の養殖動物等に対して経口摂取させることにより、家畜動物、愛玩動物、養殖動物等の免疫細胞数を増加させ、免疫グロブリンの産生を促進することにより免疫活性を高めることもできる。
【００４６】
以下に実施例に基づき本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
水洗したミズクラゲを包丁により裁断し、さらにミキサーにより細かく裁断した後、加圧調理器に細かく裁断したミズクラゲと水を入れて、１２１℃の温度で２０分間加熱した。
【００４８】
不溶物を濾過により除去し、得られた水溶液のうち、飽和量に対して５０％の硫酸アンモニウムを加えて、クラゲコラーゲンを塩析した。沈殿物を遠心分離により分離してクラゲコラーゲンを得た。
【００４９】
次にマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に対して前記クラゲコラーゲン水溶液を一週間経口摂取させた。この量はヒトに換算すると、１０ｍｇ／ｍＬの前記クラゲコラーゲン水溶液を一日３０ｍＬ服用する量に相当する。
【００５０】
次に前記マウスから摘出したパイエル板の免疫組織から免疫細胞であるパイエル板リンパ球を分離し、前記パイエル板リンパ球数を血球計算盤にて数えた。その結果、前記パイエル板リンパ球数は３．８×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
【実施例２】
【００５２】
実施例１の場合で前記パイエル板の免疫組織に代えて、腸間膜リンパ節の免疫組織を用いて同様に実験を行った。その結果、前記腸間膜リンパ節リンパ球数は５．３×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【００５３】
［比較例１］
実施例１の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲンを与えなかった他は全く同様に実験を行った。その結果、前記パイエル板リンパ球数は２．４×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【００５４】
［比較例２］
実施例１の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲンを与えなかった他は全く同様に実験を行った。その結果、前記腸間膜リンパ節リンパ球数は３．９×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を表１に示す。
【実施例３】
【００５５】
免疫グロブリン産生促進について免疫細胞を後述する条件にて培養し、免疫グロブリンの産生量を指標として評価した。免疫グロブリンの産生量は、抗ヒト免疫グロブリン抗体（バイオソース社製）等を用いた酵素抗体法により測定した。
また、この細胞の培養には、ＥＤＲＦ培地を極東製薬工業社より購入して使用した。
【００５６】
上述した実施例１で調製したクラゲコラーゲン水溶液を、図１に示される濃度になるよう、リン酸緩衝液を用いて希釈した。段階希釈した各試料１００μＬを、あらかじめ用意した９６穴培養プレートの各穴にそれぞれ分注した。
【００５７】
ついで、以下のようにして培地を調製した。すなわち、ＥＤＲＦ粉末１７．７ｇを５００ｍＬの蒸留水に溶解し、２μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡおよび５％ウシ胎児血清を添加した培地１０ｍＬ以上を用いて、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。このパイエル板リンパ球を含む培地を、上記のプレートの各穴に１００μＬずつ分注した。
【００５８】
これらのプレートを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて２４時間培養し、培養上清中のＩｇＡの産生量を、上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１に示す（図１の参照符号１）。
クラゲコラーゲンの濃度が２〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【実施例４】
【００５９】
実施例３の場合で、腸間膜リンパ節リンパ球を用いて培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図２に示す（図２の参照符号３）。
クラゲコラーゲンの濃度が２〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【００６０】
［比較例３］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例３の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１に示す（図１の参照符号２）。
【００６１】
［比較例４］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例４の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図２に示す（図２の参照符号４）。
【実施例５】
【００６２】
実施例３の場合で、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球に代えて、脾臓リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを使用した他は実施例３の場合と同様に実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図３に示す（図３の参照符号５）。
【００６３】
クラゲコラーゲンの濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＧの産生量が増加した。
【実施例６】
【００６４】
実施例３の場合で、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球に代えて、脾臓リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを使用した他は実施例３の場合と同様に実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図４に示す（図４の参照符号７）。
【００６５】
クラゲコラーゲンの濃度が１００〜８００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【実施例７】
【００６６】
実施例３の場合で、免疫細胞としてのパイエル板リンパ球に代えて、脾臓リンパ球を２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを使用した他は実施例３の場合と同様に実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図５に示す（図５の参照符号９）。
【００６７】
クラゲコラーゲンの濃度が１〜１０００μｇ／ｍＬの範囲でＩｇＡの産生量が増加した。
【００６８】
［比較例５］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例５の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図３に示す（図３の参照符号６）。
【００６９】
［比較例６］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例６の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図４に示す（図４の参照符号８）。
【００７０】
［比較例７］
前記クラゲコラーゲン水溶液を添加しなかった他は実施例７の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には３匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図５に示す（図５の参照符号１０）。
【実施例８】
【００７１】
実施例５の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に脾臓を回収した。
この脾臓リンパ球の抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図６に示す（図６の参照符号１１）。
【実施例９】
【００７２】
実施例６の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に脾臓を回収した。
この脾臓リンパ球の抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図７に示す（図７の参照符号１３）。
【実施例１０】
【００７３】
実施例７の場合で、前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に脾臓を回収した。
この脾臓リンパ球の抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図８に示す（図８の参照符号１５）。
【００７４】
［比較例８］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例８の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図６に示す（図６の参照符号１２）。
【００７５】
［比較例９］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例９の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図７に示す（図７の参照符号１４）。
【００７６】
［比較例１０］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１０の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図８に示す（図８の参照符号１６）。
【実施例１１】
【００７７】
実施例８の場合で、脾臓リンパ球の卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原に関する抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図９に示す（図９の参照符号１７）。図９の縦軸は吸光計の４１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【実施例１２】
【００７８】
実施例９の場合で、脾臓リンパ球の卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原に関する抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１０に示す（図１０の参照符号１９）。図１０の縦軸は吸光計の４１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【実施例１３】
【００７９】
実施例１０の場合で、脾臓リンパ球の卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原に関する抗体産生能について、培養液中にクラゲコラーゲン水溶液を添加せずに実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１１に示す（図１１の参照符号２１）。図１１の縦軸は吸光計の４１５ｎｍにおける吸光度を示す。
【００８０】
［比較例１１］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１１の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図９に示す（図９の参照符号１８）。
【００８１】
［比較例１２］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１２の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＡの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１０に示す（図１０の参照符号２０）。
【００８２】
［比較例１３］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１３の場合と全く同様の実験を行い、培養上清中のＯＶＡ特異的ＩｇＭの産生量を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１１に示す（図１１の参照符号２２）。
【実施例１４】
【００８３】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。この血液中のＩｇＧの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１２に示す（図１２の参照符号２３）。
【実施例１５】
【００８４】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。この血液中のＩｇＡの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１３に示す（図１３の参照符号２５）。
【実施例１６】
【００８５】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。この血液中のＩｇＭの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１４に示す（図１４の参照符号２７）。
【００８６】
［比較例１４］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１４の場合と全く同様の実験を行い、前記マウスの血液中のＩｇＧの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１２に示す（図１２の参照符号２４）。
【００８７】
［比較例１５］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１５の場合と全く同様の実験を行い、前記マウスの血液中のＩｇＡの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１３に示す（図１３の参照符号２６）。
【００８８】
［比較例１６］
前記クラゲコラーゲン水溶液をマウスに経口摂取させなかった他は、実施例１６の場合と全く同様の実験を行い、前記マウスの血液中のＩｇＭの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１４に示す（図１４の参照符号２８）。
【００８９】
［比較例１７］
一般には抗原としての卵白アルブミン（ＯＶＡ） により、アレルギー抗体であるＩｇＥの産生が誘発される。クラゲコラーゲンがアレルギー応答まで促進するかどうかについて確認を行った。
【００９０】
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。
このマウスの血液中のＩｇＥの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１５に示す（図１５の参照符号２９）。
【００９１】
［比較例１８］
比較例１７の場合で、マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を与えなかった他は全く同様に実験を行い、マウスの血液中のＩｇＥの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１５に示す（図１５の参照符号３０）。
【００９２】
［比較例１９］
前記マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を１２０μｇ／献体の量を毎日連続して経口摂取により２６日間与えた。経口摂取開始後一週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて一回目の免疫感作を行った。次に経口摂取開始後三週間目に卵白アルブミン（ＯＶＡ）０．１ｍｇ／検体を与えて二回目の免疫感作を行った。二回目の免疫感作後、５日後に血液を採取した。
このマウスの血液中のＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度を上述した抗ヒト抗体を用いた酵素抗体法により測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１６に示す（図１６の参照符号３１）。
【００９３】
［比較例２０］
比較例１９の場合で、マウスに前記クラゲコラーゲン水溶液を与えなかった他は全く同様に実験を行い、マウスの血液中のＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度を測定した。実験には６匹の前記マウスを使用した。その平均の結果を図１６に示す（図１６の参照符号３２）。
【符号の説明】
【００９４】
１ 実施例３のＩｇＡ産生量
２ 比較例３のＩｇＡ産生量
３ 実施例４のＩｇＡ産生量
４ 比較例４のＩｇＡ産生量
５ 実施例５のＩｇＧ産生量
６ 比較例５のＩｇＧ産生量
７ 実施例６のＩｇＡ産生量
８ 比較例６のＩｇＡ産生量
９ 実施例７のＩｇＭ産生量
１０ 比較例７のＩｇＭ産生量
１１ 実施例８のＩｇＧ産生量
１２ 比較例８のＩｇＧ産生量
１３ 実施例９のＩｇＡ産生量
１４ 比較例９のＩｇＡ産生量
１５ 実施例１０のＩｇＭ産生量
１６ 比較例１０のＩｇＭ産生量
１７ 実施例１１のＩｇＧ産生量
１８ 比較例１１のＩｇＧ産生量
１９ 実施例１２のＩｇＡ産生量
２０ 比較例１２のＩｇＡ産生量
２１ 実施例１３のＩｇＭ産生量
２２ 比較例１３のＩｇＭ産生量
２３ 実施例１４のＩｇＧ濃度
２４ 比較例１４のＩｇＧ濃度
２５ 実施例１５のＩｇＡ濃度
２６ 比較例１５のＩｇＡ濃度
２７ 実施例１６のＩｇＭ濃度
２８ 比較例１６のＩｇＭ濃度
２９ 比較例１７のＩｇＥ濃度
３０ 比較例１８のＩｇＥ濃度
３１ 比較例１９のＩｇＥ濃度
３２ 比較例２０のＩｇＥ濃度
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤。
【請求項２】
前記免疫活性増強剤が、免疫細胞数増加促進剤であって、
前記免疫細胞が、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項３】
前記免疫活性増強剤が、免疫グロブリン産生促進剤であって、
前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭからなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項４】
前記免疫グロブリン産生促進剤が、パイエル板リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤、腸間膜リンパ節リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤および脾臓リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項３に記載の免疫活性増強剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリン産生促進剤が、血液中の免疫グロブリン産生促進剤である、請求項３に記載の免疫活性増強剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫活性増強剤を含む食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫活性増強剤からなる、食品添加剤。
【請求項８】
免疫活性増強用クラゲコラーゲン。
【請求項９】
クラゲコラーゲンを経口摂取させることによる、動物の免疫活性増強方法。
【請求項１】
クラゲコラーゲンを含むことを特徴とする、免疫活性増強剤。
【請求項２】
前記免疫活性増強剤が、免疫細胞数増加促進剤であって、
前記免疫細胞が、パイエル板リンパ球、腸間膜リンパ節リンパ球および脾臓リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項３】
前記免疫活性増強剤が、免疫グロブリン産生促進剤であって、
前記免疫グロブリンが、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭからなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項１に記載の免疫活性増強剤。
【請求項４】
前記免疫グロブリン産生促進剤が、パイエル板リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤、腸間膜リンパ節リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤および脾臓リンパ球の免疫グロブリン産生促進剤からなる群より選ばれる少なくとも一つである、請求項３に記載の免疫活性増強剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリン産生促進剤が、血液中の免疫グロブリン産生促進剤である、請求項３に記載の免疫活性増強剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫活性増強剤を含む食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫活性増強剤からなる、食品添加剤。
【請求項８】
免疫活性増強用クラゲコラーゲン。
【請求項９】
クラゲコラーゲンを経口摂取させることによる、動物の免疫活性増強方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−１７３９３７（Ｐ２０１０−１７３９３７Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５０５９（Ｐ２００９−１５０５９）
【出願日】平成２１年１月２７日（２００９．１．２７）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２７日（２００９．１．２７）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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