ケンペロールの調製方法
本発明は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法に関し、さらに詳しくは、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とするケンペロールの調製方法に関する。上記ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とし、上記植物抽出物は、緑茶種または緑茶葉に由来するものであることを特徴とする。本発明によるケンペロールの調製方法によれば、植物、特に、緑茶種または緑茶葉から主な生理活性物質としてのケンペロールを大量に生産することが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケンペロール(Kaempferol)は下記化学式１で表されるものであり、フラボノイド(flavonoid)の一種であるフラボノール(flavonol)の代表的な成分の一つとして植物の花または葉に広く分布している。
【０００３】
【化１】
【０００４】
フラボノールとしては１００以上のものが既に知られており、ケンペロール、ケルセチン(quercetin) およびミリセチン(myricetin)の３種類が最も多く存在していることが知られている。
【０００５】
特に、ケンペロールは、抗酸化、抗炎症などの生理活性に優れた物質であって、その種々の効能に関する研究がなされており、種々の分野への適用がなされている。しかしながら、現在使用中のケンペロールの大半は植物抽出物の形であり、その含量が僅か数ppmから数十ppmに過ぎないことから、ケンペロールの実質的な効能が発現されているとは言い難い面がある。このような問題点は、ケンペロールを多量に含有する植物があまり見つけられないこと、しかも、高含量のケンペロールを調製するための分離精製には経済性からみてこれといったメリットがないことに起因し、これらの理由から、ケンペロールの大量生産に関する研究はほとんどなされていないのが現状である。
【０００６】
緑茶は世界最古の歴史を有している飲料であって、近年、緑茶に対する関心が高まるに伴い、茶の成分とその薬理効果に関する研究が盛んに行われている。緑茶には、他の食品に比べてスレアミン(threamine)とポリフェノール(polyphenol)類が多量に含有されている。緑茶の効能成分は、多葉中のポリフェノール類に属するフラバン−３−オール(flavan-3-ol)を主体とするカテキン(catechin)であって、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン(epicatechin)、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート(epigallocatechin-3-gallate)、（−）−ガロカテキン (gallocatechin)などが主成分であることが知られている。特に、緑茶中に含まれているポリフェノール類は、血中コレステロールを低下させるとともに、抗酸化作用、抗ガン作用、解毒作用、抗菌作用、虫歯予防作用、老化抑制作用、美白効果および香り成分などがあることが報告されている。また、緑茶中に含まれているポリフェノール類は、痛風予防はもとより、過酸化脂質を抑制し、老化を遅延させるとともに、中世脂質の生成を抑制することから、肥満を防止し、毛細血管の抵抗力を増進させることが報告されている。
【０００７】
しかしながら、かかる種々の効能を有している緑茶の大半は、その葉を使用しており、これとほぼ同じ効能物質を含有している緑茶種については、栽培目的以外にはあまり使用されていないのが現状である。さらに、関心と研究のほとんどが緑茶葉のカテキン類、特に、エピガロカテキン ガラート(ＥＧＣＧ：epigallocatechin gallate)に集中している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、緑茶のうち特に、特別な用途に用いられていない緑茶種とＥＧＣＧに焦点が合わせられている緑茶葉には、カテキン類の他にケンペロール母核を有するケンペロール配糖体、特に、ケンペロールに３つの糖が付いているカメリアシドＡ(camelliaside A) 、カメリアシドＢなどの配糖体が多量に含有されていることを見出し、これより生理活性に優れたアグリコン(aglycone)型のケンペロールを大量に調製可能な方法を鋭意研究した結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
そこで、本発明が解決しようとする技術的な課題は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離し調製する方法を提供することにあり、植物、特に、緑茶種または緑茶葉に多量に含有されているケンペロール配糖体、特に、カメリアシドＡ、カメリアシドＢなどの配糖体からケンペロールを分離し調製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によるケンペロールの調製方法は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とする。
【００１１】
さらに詳しくは、上記ケンペロールの調製方法は、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とする。
【００１２】
上記において、ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする。
【００１３】
上記第一の段階において、植物抽出物は、緑茶種または緑茶葉に由来のものであることを特徴とする。
【００１４】
また、上記有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水との混合溶媒、好ましくは８０％のエタノールを用いることができる。
【００１５】
上記酸としては、塩酸、硫酸および硝酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の酸、または、これらの酸とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることができる。このとき、使用可能な酸の濃度は０．１Ｎ〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は１０〜５０％であり、反応温度は５０〜１００℃であり、そして反応時間は０．５〜８時間である。
【００１６】
上記塩基としては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の塩基、または、これらの塩基とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることができる。このとき、使用可能な塩基の濃度は０．１Ｎ〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は１０〜５０％であり、反応温度は５０〜１００℃であり、そして反応時間は０．５〜２４時間である。
【００１７】
上記酵素または酵素を生み出す微生物としては、糖結合を分解する酵素または糖結合を分解する酵素を生み出す微生物を用い、上記酵素は、ケンペロール配糖体から糖部分を除去してケンペロールを分離するものであることを特徴とし、上記ケンペロール配糖体は、好ましくは、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする。
【００１８】
さらに、上記酵素は、より好ましくは、グルコシダーゼ(glucosidase)、アラビノシダーゼ(arabinosidase) 、ラムノシダーゼ(rhamnosidase) 、キシロシダーゼ(xylosidase) 、セルラーゼ(cellulase)、ヘスペリジナーゼ(hesperidinase) 、ナリギナーゼ(naringinase)、グルクロニダーゼ(glucuronidase) 、ペクチナーゼ(pectinase) 、ガラクトシダーゼ(galactosidase) およびアミログルコシダーゼ(amyloglucosidase) よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする。
【００１９】
さらに、上記酵素を生み出す微生物としては、アスペルギルス(aspergillus)属 、バチルス(bacillus) 属、ペニシリウム(penicillium) 属、クモノカスビ(rhizopus) 属、リゾムコール(rhizomucor)属、タラロマイセス(talaromyces) 属、ビフィドバクテリウム(bifidobacterium) 属、モルティエラ(mortierella)属、クリプトコッカス(cryptococcus) 属およびミクロバクテリウム(microbacterium) 属よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法によれば、植物、特に、緑茶種または緑茶葉からケンペロール配糖体、特に、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含む植物抽出物を得た後、酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解することにより、主な生理活性物質の一種であるケンペロールを大量に生産することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ケンペロールの調製方法は、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とする。
【００２２】
上記第一の段階において、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体であるカメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含有する植物抽出物を得るために、植物に約１〜６倍、好ましくは、約３倍の水またはエタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムを含む群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水との混合溶媒を注ぎ、常温下で１〜５回撹拌しながら抽出して脱脂する。次いで、脱脂された植物に約１〜８倍、好ましくは、約４倍の水または有機溶媒を注ぎ、１〜５回にわたって還流抽出した後、１０〜２０℃の温度下で１〜３日間沈積し、次いで、ろ過と遠心分離により残渣とろ液を分離する。この後、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁させた後、エーテルなどを用いて色素を除去し、次いで、水層をブタノールなどを用いて１〜５回にわたって抽出する。次いで、得られた有機溶媒を減圧濃縮してブタノールなどのエキスを得た後、これを少量のメタノールなどに溶かし、次いで、大量のエチルアセテートなどを加えて生成された沈澱物を乾燥させることにより、本発明による植物抽出物が得られる。
【００２３】
上記第二の段階において、植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを調製する。
【００２４】
このとき、酸を用いる場合、植物抽出物に０．１Ｎ〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の酸、または酸およびアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％のエタノール混合溶媒）を加えた後、５０〜１００℃、好ましくは８０℃の水浴中で１〜４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解することにより反応液が得られる。
【００２５】
塩基を用いる場合、植物抽出物を溶かした後、０．１Ｎ〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の塩基、または塩基およびアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％のブタノール混合溶媒）を加えて５０〜１００℃、好ましくは１００℃の水浴中で１〜４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解することにより反応液が得られる。
【００２６】
酵素を用いる場合、植物抽出物を５〜２０倍、好ましくは、約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、酵素を加えて約３７℃の水浴中で約４０〜５５時間、好ましくは、約４８時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィにより基質の消失率を確かめ、基質が完全に消失した時点で熱水（８０〜１００℃）中で５〜１５分間加熱して加水分解反応を終了することにより反応液が得られる。
【００２７】
上記酵素を生み出す微生物を用いる場合、植物抽出物を５〜１０倍、好ましくは、約１０倍のイオン水に溶解させた後、約１２１℃の温度下で３０分間滅菌して約３０℃まで冷却し、次いで、予め培養した微生物を液体量に対して５〜１０％接種して３０℃の温度下で２〜５日、好ましくは、５日間培養する。この後、薄層クロマトグラフィにより基質の消失率を確かめ、基質が完全に消失した時点で加水分解反応を終了し、培養液を５０００〜１００００rpmにて遠心分離して回収した沈澱物を蒸留水により３回洗浄した後、遠心分離して沈澱物として反応液が得られる。
【００２８】
上記のように、酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解した後、得られた反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回撹拌し、次いで、沈澱させた塩をろ過により除去し、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、その後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロールが得られる。
【実施例１】
【００２９】
以下、実施例および実験例を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれら実施例および実験例に限定されるものではない。
【００３０】
緑茶種抽出物の調製
緑茶種２ｋｇにヘキサン６リットルを入れ、常温下で３回撹拌抽出して脱脂した後、脱脂された緑茶種１ｋｇに８０％のメタノール４リットルを注ぎ、３回還流抽出し、次いで、１５℃の温度下で１日間沈積させた。この後、ろ過布によるろ過と遠心分離により残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテル１リットルにより５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ミリリットルを用いて３回抽出した。これにより得られた１−ブタノール層の全体を減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、得られたエキスを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに加えて沈澱物を得、生成された沈澱物を乾燥することにより、緑茶種抽出物２５０ｇを得た。
【実施例２】
【００３１】
緑茶葉抽出物の調製
緑茶葉２ｋｇにヘキサン６リットルを入れ、常温下で３回撹拌抽出して脱脂した後、脱脂された緑茶葉１ｋｇに８０％のメタノール４リットルを注ぎ、３回還流抽出し、次いで、１５℃の温度下で１日間沈積させた。この後、ろ過布によるろ過と遠心分離により残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテル１リットルにより５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ミリリットルを用いて３回抽出した。これにより得られた１−ブタノール層の全体を減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、得られたエキスを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに加えて沈澱物を得、生成された沈澱物を乾燥することにより、緑茶葉抽出物１５０ｇを得た。
【実施例３】
【００３２】
酸加水分解方法によるケンペロールの調製
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｎ濃度の塩酸５０％のメタノール溶液（ｖ／ｖ）を加え、８０℃の水浴中で８時間加熱還流させて、カメリアシドＡとカメリアシドＢに結合された糖を加水分解した。次いで、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌（３回）した後、沈澱した塩をろ過により除去した。この後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール０．９５ｇを得た。
【実施例４】
【００３３】
塩基加水分解方法によるケンペロールの調製
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇを乾燥ピリジン（５００ミリリットル）に溶かし、これにナトリウムメトキシド（粉末、１０ｇ）を加えて水浴中で８時間加熱還流させて、カメリアシドＡとカメリアシドＢに結合された糖を加水分解した。次いで、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌（３回した後、沈澱した塩をろ過により除去した。この後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール０．２５ｇを得た。
【実施例５】
【００３４】
酵素分解方法によるケンペロールの調製
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇを１００ミリリットルの０．１モルの酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解し、これに酵素２．５ｇ（ヘスペリジナーゼ０．５ｇ、ナリギナーゼ０．５ｇ、セルラーゼ０．５ｇ、β−グルクロニダーゼ０．２ｇ、β−ガラクトシダーゼ０．５ｇ、アミログルコシダーゼ０．３ｇ；シグマ社製）を加えて３７℃の水浴中で４８時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィにより周期的に調べて、基質（カメリアシドＡとカメリアシドＢ）が完全に消失した時点で熱水（８０〜１００℃）中で１０分間加熱して反応を終了した後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去した。次いで、残渣にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌し（３回）、沈澱物をろ過により除去した後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール１．０２ｇを得た。
【実施例６】
【００３５】
微生物を用いたケンペロールの調製
上記実施例２に従って得られた緑茶葉抽出物１０ｇを１００ミリリットルのイオン水に溶解し、１２１℃の温度下で３０分間滅菌して３０℃まで冷却した後、予め培養したアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)KCCM 11885を液体量に対して５〜１０％接種して３０℃の温度下で５日間培養した。次いで、薄層クロマトグラフィにより基質の消失率を調べて、基質が完全に消失した時点で加水分解反応を終了し、培養液を５０００〜１００００rpmにて遠心分離して回収した沈澱物を蒸留水により３回洗浄した後、遠心分離して沈澱物として反応液を得た。この後、上記沈澱物にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌し（３回）、沈澱物をろ過により除去した後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール０．６２ｇを得た。
【実験例１】
【００３６】
カメリアシドＡおよびカメリアシドＢの同定
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル１００ｇ充填）により精製した。このとき、展開溶媒としてはクロロホルムとメタノールを用い、クロロホルム対メタノールの比を１０対１から２対１まで濃度勾配を高めて分別物質を得、この分別物質から，０．８２ｇのカメリアシドＡと１．２４ｇのカメリアシドＢを得た。こうして得られた両物質を同定した結果（Varian Gemini 2000, 300MHz；Varian社製の器具による）、下記表１のごとき特性を示したため、カメリアシドＡおよびカメリアシドＢであると同定した。
〈カメリアシドＡの物理化学的な性状〉
性状：薄い緑黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：７５６．９［Ｍ＋Ｈ］
〈カメリアシドＢの物理化学的な性状〉
性状：薄い緑黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：７２６．９［Ｍ＋Ｈ］
【００３７】
【表１】
【実験例２】
【００３８】
ケンペロールの同定
上記実施例３ないし６に従って調製された物質は下記のごとき特性を示したため、ケンペロールであると同定した（Varian Gemini 2000, 300MHz；Varian社製の器具による）。
〈ケンペロールの物理化学的な性状〉
性状：薄い緑黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：２８７［Ｍ＋Ｈ］＋
1H−NMR:6.1(1H,d,1.8Hz),6.3(1H,d,1.8Hz),6.8(2H,dd,9Hz),8.0(2H,dd,9Hz)
13C−NMR :94,467,99.248,104.518,116.265,123.710,130.649,137.069,147.970,158.200,160.480, 162.446,165.519,177.285
【実験例３】
【００３９】
加水分解（酵素分解）後におけるケンペロールの含量変化
緑茶種抽出物を上記実施例１の方法に従って調製した後、上記実施例３の方法によって酵素による加水分解を行い、その後、加水分解反応前と加水分解反応後における変化を高速液体クロマトグラフィを用いて測定した。なお、加水分解反応前における緑茶種抽出物中に含有されているカメリアシドＡおよびカメリアシドＢの含量を測定した結果を図１に示し、加水分解反応後におけるケンペロールの含量を測定した結果を図２に示す。
【００４０】
図１および図２に示すように、加水分解反応後において、カメリアシドＡおよびカメリアシドＢのほとんどがケンペロールに変っていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明に係るケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法によれば、植物、特に、緑茶種または緑茶葉からケンペロール配糖体、特に、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含む植物抽出物を得た後、酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解することにより、主な生理活性物質の一種であるケンペロールを大量に生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例１における緑茶種抽出物を実施例３の方法により酵素を用いて加水分解する前における緑茶種抽出物中のカメリアシドＡおよびカメリアシドＢの含量を高速液体クロマトグラフィを用いて測定した結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１における緑茶種抽出物を実施例３の方法により酵素を用いて加水分解した後における緑茶種抽出物中のケンペロールの含量を高速液体クロマトグラフィを用いて測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケンペロール(Kaempferol)は下記化学式１で表されるものであり、フラボノイド(flavonoid)の一種であるフラボノール(flavonol)の代表的な成分の一つとして植物の花または葉に広く分布している。
【０００３】
【化１】
【０００４】
フラボノールとしては１００以上のものが既に知られており、ケンペロール、ケルセチン(quercetin) およびミリセチン(myricetin)の３種類が最も多く存在していることが知られている。
【０００５】
特に、ケンペロールは、抗酸化、抗炎症などの生理活性に優れた物質であって、その種々の効能に関する研究がなされており、種々の分野への適用がなされている。しかしながら、現在使用中のケンペロールの大半は植物抽出物の形であり、その含量が僅か数ppmから数十ppmに過ぎないことから、ケンペロールの実質的な効能が発現されているとは言い難い面がある。このような問題点は、ケンペロールを多量に含有する植物があまり見つけられないこと、しかも、高含量のケンペロールを調製するための分離精製には経済性からみてこれといったメリットがないことに起因し、これらの理由から、ケンペロールの大量生産に関する研究はほとんどなされていないのが現状である。
【０００６】
緑茶は世界最古の歴史を有している飲料であって、近年、緑茶に対する関心が高まるに伴い、茶の成分とその薬理効果に関する研究が盛んに行われている。緑茶には、他の食品に比べてスレアミン(threamine)とポリフェノール(polyphenol)類が多量に含有されている。緑茶の効能成分は、多葉中のポリフェノール類に属するフラバン−３−オール(flavan-3-ol)を主体とするカテキン(catechin)であって、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン(epicatechin)、（−）−エピガロカテキン−３−ガラート(epigallocatechin-3-gallate)、（−）−ガロカテキン (gallocatechin)などが主成分であることが知られている。特に、緑茶中に含まれているポリフェノール類は、血中コレステロールを低下させるとともに、抗酸化作用、抗ガン作用、解毒作用、抗菌作用、虫歯予防作用、老化抑制作用、美白効果および香り成分などがあることが報告されている。また、緑茶中に含まれているポリフェノール類は、痛風予防はもとより、過酸化脂質を抑制し、老化を遅延させるとともに、中世脂質の生成を抑制することから、肥満を防止し、毛細血管の抵抗力を増進させることが報告されている。
【０００７】
しかしながら、かかる種々の効能を有している緑茶の大半は、その葉を使用しており、これとほぼ同じ効能物質を含有している緑茶種については、栽培目的以外にはあまり使用されていないのが現状である。さらに、関心と研究のほとんどが緑茶葉のカテキン類、特に、エピガロカテキン ガラート(ＥＧＣＧ：epigallocatechin gallate)に集中している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、緑茶のうち特に、特別な用途に用いられていない緑茶種とＥＧＣＧに焦点が合わせられている緑茶葉には、カテキン類の他にケンペロール母核を有するケンペロール配糖体、特に、ケンペロールに３つの糖が付いているカメリアシドＡ(camelliaside A) 、カメリアシドＢなどの配糖体が多量に含有されていることを見出し、これより生理活性に優れたアグリコン(aglycone)型のケンペロールを大量に調製可能な方法を鋭意研究した結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
そこで、本発明が解決しようとする技術的な課題は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離し調製する方法を提供することにあり、植物、特に、緑茶種または緑茶葉に多量に含有されているケンペロール配糖体、特に、カメリアシドＡ、カメリアシドＢなどの配糖体からケンペロールを分離し調製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によるケンペロールの調製方法は、ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とする。
【００１１】
さらに詳しくは、上記ケンペロールの調製方法は、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とする。
【００１２】
上記において、ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする。
【００１３】
上記第一の段階において、植物抽出物は、緑茶種または緑茶葉に由来のものであることを特徴とする。
【００１４】
また、上記有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水との混合溶媒、好ましくは８０％のエタノールを用いることができる。
【００１５】
上記酸としては、塩酸、硫酸および硝酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の酸、または、これらの酸とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることができる。このとき、使用可能な酸の濃度は０．１Ｎ〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は１０〜５０％であり、反応温度は５０〜１００℃であり、そして反応時間は０．５〜８時間である。
【００１６】
上記塩基としては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の塩基、または、これらの塩基とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることができる。このとき、使用可能な塩基の濃度は０．１Ｎ〜２Ｎであり、混合溶媒のアルコール含量は１０〜５０％であり、反応温度は５０〜１００℃であり、そして反応時間は０．５〜２４時間である。
【００１７】
上記酵素または酵素を生み出す微生物としては、糖結合を分解する酵素または糖結合を分解する酵素を生み出す微生物を用い、上記酵素は、ケンペロール配糖体から糖部分を除去してケンペロールを分離するものであることを特徴とし、上記ケンペロール配糖体は、好ましくは、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする。
【００１８】
さらに、上記酵素は、より好ましくは、グルコシダーゼ(glucosidase)、アラビノシダーゼ(arabinosidase) 、ラムノシダーゼ(rhamnosidase) 、キシロシダーゼ(xylosidase) 、セルラーゼ(cellulase)、ヘスペリジナーゼ(hesperidinase) 、ナリギナーゼ(naringinase)、グルクロニダーゼ(glucuronidase) 、ペクチナーゼ(pectinase) 、ガラクトシダーゼ(galactosidase) およびアミログルコシダーゼ(amyloglucosidase) よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする。
【００１９】
さらに、上記酵素を生み出す微生物としては、アスペルギルス(aspergillus)属 、バチルス(bacillus) 属、ペニシリウム(penicillium) 属、クモノカスビ(rhizopus) 属、リゾムコール(rhizomucor)属、タラロマイセス(talaromyces) 属、ビフィドバクテリウム(bifidobacterium) 属、モルティエラ(mortierella)属、クリプトコッカス(cryptococcus) 属およびミクロバクテリウム(microbacterium) 属よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法によれば、植物、特に、緑茶種または緑茶葉からケンペロール配糖体、特に、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含む植物抽出物を得た後、酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解することにより、主な生理活性物質の一種であるケンペロールを大量に生産することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ケンペロールの調製方法は、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とする。
【００２２】
上記第一の段階において、植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体であるカメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含有する植物抽出物を得るために、植物に約１〜６倍、好ましくは、約３倍の水またはエタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムを含む群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水との混合溶媒を注ぎ、常温下で１〜５回撹拌しながら抽出して脱脂する。次いで、脱脂された植物に約１〜８倍、好ましくは、約４倍の水または有機溶媒を注ぎ、１〜５回にわたって還流抽出した後、１０〜２０℃の温度下で１〜３日間沈積し、次いで、ろ過と遠心分離により残渣とろ液を分離する。この後、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁させた後、エーテルなどを用いて色素を除去し、次いで、水層をブタノールなどを用いて１〜５回にわたって抽出する。次いで、得られた有機溶媒を減圧濃縮してブタノールなどのエキスを得た後、これを少量のメタノールなどに溶かし、次いで、大量のエチルアセテートなどを加えて生成された沈澱物を乾燥させることにより、本発明による植物抽出物が得られる。
【００２３】
上記第二の段階において、植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを調製する。
【００２４】
このとき、酸を用いる場合、植物抽出物に０．１Ｎ〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の酸、または酸およびアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％のエタノール混合溶媒）を加えた後、５０〜１００℃、好ましくは８０℃の水浴中で１〜４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解することにより反応液が得られる。
【００２５】
塩基を用いる場合、植物抽出物を溶かした後、０．１Ｎ〜２Ｎ濃度、好ましくは、１Ｎ濃度の塩基、または塩基およびアルコールの混合溶媒（好ましくは、５０％のブタノール混合溶媒）を加えて５０〜１００℃、好ましくは１００℃の水浴中で１〜４８時間、好ましくは、８時間加熱還流させて加水分解することにより反応液が得られる。
【００２６】
酵素を用いる場合、植物抽出物を５〜２０倍、好ましくは、約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、酵素を加えて約３７℃の水浴中で約４０〜５５時間、好ましくは、約４８時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィにより基質の消失率を確かめ、基質が完全に消失した時点で熱水（８０〜１００℃）中で５〜１５分間加熱して加水分解反応を終了することにより反応液が得られる。
【００２７】
上記酵素を生み出す微生物を用いる場合、植物抽出物を５〜１０倍、好ましくは、約１０倍のイオン水に溶解させた後、約１２１℃の温度下で３０分間滅菌して約３０℃まで冷却し、次いで、予め培養した微生物を液体量に対して５〜１０％接種して３０℃の温度下で２〜５日、好ましくは、５日間培養する。この後、薄層クロマトグラフィにより基質の消失率を確かめ、基質が完全に消失した時点で加水分解反応を終了し、培養液を５０００〜１００００rpmにて遠心分離して回収した沈澱物を蒸留水により３回洗浄した後、遠心分離して沈澱物として反応液が得られる。
【００２８】
上記のように、酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解した後、得られた反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回撹拌し、次いで、沈澱させた塩をろ過により除去し、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、その後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロールが得られる。
【実施例１】
【００２９】
以下、実施例および実験例を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれら実施例および実験例に限定されるものではない。
【００３０】
緑茶種抽出物の調製
緑茶種２ｋｇにヘキサン６リットルを入れ、常温下で３回撹拌抽出して脱脂した後、脱脂された緑茶種１ｋｇに８０％のメタノール４リットルを注ぎ、３回還流抽出し、次いで、１５℃の温度下で１日間沈積させた。この後、ろ過布によるろ過と遠心分離により残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテル１リットルにより５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ミリリットルを用いて３回抽出した。これにより得られた１−ブタノール層の全体を減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、得られたエキスを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに加えて沈澱物を得、生成された沈澱物を乾燥することにより、緑茶種抽出物２５０ｇを得た。
【実施例２】
【００３１】
緑茶葉抽出物の調製
緑茶葉２ｋｇにヘキサン６リットルを入れ、常温下で３回撹拌抽出して脱脂した後、脱脂された緑茶葉１ｋｇに８０％のメタノール４リットルを注ぎ、３回還流抽出し、次いで、１５℃の温度下で１日間沈積させた。この後、ろ過布によるろ過と遠心分離により残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテル１リットルにより５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ミリリットルを用いて３回抽出した。これにより得られた１−ブタノール層の全体を減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、得られたエキスを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに加えて沈澱物を得、生成された沈澱物を乾燥することにより、緑茶葉抽出物１５０ｇを得た。
【実施例３】
【００３２】
酸加水分解方法によるケンペロールの調製
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｎ濃度の塩酸５０％のメタノール溶液（ｖ／ｖ）を加え、８０℃の水浴中で８時間加熱還流させて、カメリアシドＡとカメリアシドＢに結合された糖を加水分解した。次いで、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌（３回）した後、沈澱した塩をろ過により除去した。この後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール０．９５ｇを得た。
【実施例４】
【００３３】
塩基加水分解方法によるケンペロールの調製
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇを乾燥ピリジン（５００ミリリットル）に溶かし、これにナトリウムメトキシド（粉末、１０ｇ）を加えて水浴中で８時間加熱還流させて、カメリアシドＡとカメリアシドＢに結合された糖を加水分解した。次いで、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌（３回した後、沈澱した塩をろ過により除去した。この後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール０．２５ｇを得た。
【実施例５】
【００３４】
酵素分解方法によるケンペロールの調製
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇを１００ミリリットルの０．１モルの酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解し、これに酵素２．５ｇ（ヘスペリジナーゼ０．５ｇ、ナリギナーゼ０．５ｇ、セルラーゼ０．５ｇ、β−グルクロニダーゼ０．２ｇ、β−ガラクトシダーゼ０．５ｇ、アミログルコシダーゼ０．３ｇ；シグマ社製）を加えて３７℃の水浴中で４８時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィにより周期的に調べて、基質（カメリアシドＡとカメリアシドＢ）が完全に消失した時点で熱水（８０〜１００℃）中で１０分間加熱して反応を終了した後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去した。次いで、残渣にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌し（３回）、沈澱物をろ過により除去した後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール１．０２ｇを得た。
【実施例６】
【００３５】
微生物を用いたケンペロールの調製
上記実施例２に従って得られた緑茶葉抽出物１０ｇを１００ミリリットルのイオン水に溶解し、１２１℃の温度下で３０分間滅菌して３０℃まで冷却した後、予め培養したアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)KCCM 11885を液体量に対して５〜１０％接種して３０℃の温度下で５日間培養した。次いで、薄層クロマトグラフィにより基質の消失率を調べて、基質が完全に消失した時点で加水分解反応を終了し、培養液を５０００〜１００００rpmにて遠心分離して回収した沈澱物を蒸留水により３回洗浄した後、遠心分離して沈澱物として反応液を得た。この後、上記沈澱物にエタノール（２００ミリリットル）を加えて撹拌し（３回）、沈澱物をろ過により除去した後、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム対メタノール＝８対１ないし４対１）で分離することによりケンペロール０．６２ｇを得た。
【実験例１】
【００３６】
カメリアシドＡおよびカメリアシドＢの同定
上記実施例１に従って得られた緑茶種抽出物１０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィ（シリカゲル１００ｇ充填）により精製した。このとき、展開溶媒としてはクロロホルムとメタノールを用い、クロロホルム対メタノールの比を１０対１から２対１まで濃度勾配を高めて分別物質を得、この分別物質から，０．８２ｇのカメリアシドＡと１．２４ｇのカメリアシドＢを得た。こうして得られた両物質を同定した結果（Varian Gemini 2000, 300MHz；Varian社製の器具による）、下記表１のごとき特性を示したため、カメリアシドＡおよびカメリアシドＢであると同定した。
〈カメリアシドＡの物理化学的な性状〉
性状：薄い緑黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：７５６．９［Ｍ＋Ｈ］
〈カメリアシドＢの物理化学的な性状〉
性状：薄い緑黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：７２６．９［Ｍ＋Ｈ］
【００３７】
【表１】
【実験例２】
【００３８】
ケンペロールの同定
上記実施例３ないし６に従って調製された物質は下記のごとき特性を示したため、ケンペロールであると同定した（Varian Gemini 2000, 300MHz；Varian社製の器具による）。
〈ケンペロールの物理化学的な性状〉
性状：薄い緑黄色の微細結晶
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：２８７［Ｍ＋Ｈ］＋
1H−NMR:6.1(1H,d,1.8Hz),6.3(1H,d,1.8Hz),6.8(2H,dd,9Hz),8.0(2H,dd,9Hz)
13C−NMR :94,467,99.248,104.518,116.265,123.710,130.649,137.069,147.970,158.200,160.480, 162.446,165.519,177.285
【実験例３】
【００３９】
加水分解（酵素分解）後におけるケンペロールの含量変化
緑茶種抽出物を上記実施例１の方法に従って調製した後、上記実施例３の方法によって酵素による加水分解を行い、その後、加水分解反応前と加水分解反応後における変化を高速液体クロマトグラフィを用いて測定した。なお、加水分解反応前における緑茶種抽出物中に含有されているカメリアシドＡおよびカメリアシドＢの含量を測定した結果を図１に示し、加水分解反応後におけるケンペロールの含量を測定した結果を図２に示す。
【００４０】
図１および図２に示すように、加水分解反応後において、カメリアシドＡおよびカメリアシドＢのほとんどがケンペロールに変っていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明に係るケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法によれば、植物、特に、緑茶種または緑茶葉からケンペロール配糖体、特に、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含む植物抽出物を得た後、酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解することにより、主な生理活性物質の一種であるケンペロールを大量に生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例１における緑茶種抽出物を実施例３の方法により酵素を用いて加水分解する前における緑茶種抽出物中のカメリアシドＡおよびカメリアシドＢの含量を高速液体クロマトグラフィを用いて測定した結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１における緑茶種抽出物を実施例３の方法により酵素を用いて加水分解した後における緑茶種抽出物中のケンペロールの含量を高速液体クロマトグラフィを用いて測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法。
【請求項２】
植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、
前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とする請求項１に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項３】
ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項４】
第一の段階における植物抽出物は、緑茶種または緑茶葉に由来のものであることを特徴とする請求項２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項５】
有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水との混合溶媒を用いることを特徴とする請求項２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項６】
酸としては、塩酸、硫酸および硝酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の酸、または、これらの酸とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項７】
塩基としては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の塩基、または、これらの塩基とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項８】
酵素は、ケンペロール配糖体から糖部分を除去してケンペロールを分離するものであることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項９】
ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする請求項８に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項１０】
酵素としては、グルコシダーゼ、アラビノシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、セルラーゼ、ヘスペリジナーゼ、ナリギナーゼ(naringinase)、グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼおよびアミログルコシダーゼよりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする請求項８に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項１１】
酵素を生み出す微生物としては、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属、クモノカスビ属(rhizopus sp.) 、リゾムコール属、タラロマイセス属、ビフィドバクテリウム属、モルティエラ属(mortierella sp.)、クリプトコッカス属およびミクロバクテリウム属よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項１】
ケンペロール配糖体から酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いてケンペロールを分離することを特徴とするケンペロールの調製方法。
【請求項２】
植物から水または有機溶媒を用いてケンペロール配糖体を含有する植物抽出物を得る第一の段階と、
前記植物抽出物を酸、塩基、酵素または前記酵素を生み出す微生物を用いて加水分解してケンペロールを分離する第二の段階とを含むことを特徴とする請求項１に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項３】
ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項４】
第一の段階における植物抽出物は、緑茶種または緑茶葉に由来のものであることを特徴とする請求項２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項５】
有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテートおよびクロロホルムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、または、これらの有機溶媒と水との混合溶媒を用いることを特徴とする請求項２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項６】
酸としては、塩酸、硫酸および硝酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の酸、または、これらの酸とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項７】
塩基としては、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の塩基、または、これらの塩基とエタノール、メタノールおよびブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項８】
酵素は、ケンペロール配糖体から糖部分を除去してケンペロールを分離するものであることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項９】
ケンペロール配糖体は、カメリアシドＡまたはカメリアシドＢを含むものであることを特徴とする請求項８に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項１０】
酵素としては、グルコシダーゼ、アラビノシダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、セルラーゼ、ヘスペリジナーゼ、ナリギナーゼ(naringinase)、グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼおよびアミログルコシダーゼよりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする請求項８に記載のケンペロールの調製方法。
【請求項１１】
酵素を生み出す微生物としては、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属、クモノカスビ属(rhizopus sp.) 、リゾムコール属、タラロマイセス属、ビフィドバクテリウム属、モルティエラ属(mortierella sp.)、クリプトコッカス属およびミクロバクテリウム属よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いることを特徴とする請求項１または２に記載のケンペロールの調製方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５２６２５０（Ｐ２００８−５２６２５０Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５１１８０（Ｐ２００７−５５１１８０）
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１５９７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９３３６８
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０５１１８７１８）アモーレパシフィック コーポレイション (21)
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１５９７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９３３６８
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０５１１８７１８）アモーレパシフィック コーポレイション (21)
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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