ケージドペプチドの合成法
【課題】ペプチドに関するケージド化合物を提供する。
【解決手段】下記式（Ｉ）
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＧｌｙ，Ｐｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することを特徴とする、光解離性保護基を主鎖に導入したペプチドの固相合成法。
【解決手段】下記式（Ｉ）
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＧｌｙ，Ｐｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することを特徴とする、光解離性保護基を主鎖に導入したペプチドの固相合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケージドペプチドの合成法に関し、特に固相合成法によるケージドペプチドの合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、ペプチドの側鎖に光解離性保護基を導入することによって、ペプチドの生理活性を遮蔽し、光照射により、保護基を解離させ、ペプチドの生理活性を任意の時間部位で回復させることができるケージドペプチドが開発された（特許文献１）。その後、ペプチド結合に光解離性保護基を導入したタイプのケージドペプチドが開発された（非特許文献１）。
【特許文献１】特開平10-120699
【非特許文献１】Tatsu Y, Nishigaki T, Darszon A, Yumoto N. ,FEBS Lett. 2002;525(1-3):20-4.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ペプチド結合に光解離性保護基を導入できれば、側鎖に光解離性保護基が導入できないアミノ酸残基でも、ケージドペプチド化することが可能となる。しかし、Ｂａａ−Ａａａ（Ｂａａは、側鎖がＢ基であるαアミノ酸を示す。Ａａａは、側鎖がＡ基であるαアミノ酸を示す。）のペプチド結合において、Ａａａがグリシンのときのみ固相合成が進行し、その他のアミノ酸残基のケージドペプチドは合成することができなかった。
【０００４】
本発明は、グリシンとプロリン以外のアミノ酸の主鎖(ペプチド結合を構成する)アミノ基に光解離性保護基が導入されたペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｂａａ−Ａａａのペプチド結合のＡａａのαアミノ基を光解離性保護基で修飾したジペプチドを液相中で合成し、これを固相合成法に用いることで、上記課題が解決可能であることを見出した。
【０００６】
本発明は、以下のペプチドの固相合成法を提供するものである。
１． 下記式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
【０００８】
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＧｌｙ，Ｐｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することを特徴とする、光解離性保護基を主鎖に導入したペプチドの固相合成法。
２． Ｒａが２−ニトロベンジル基である項１に記載の固相合成法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の固相合成法により、グリシン、プロリン以外のアミノ酸残基のペプチド結合のアミドに光解離性保護基が導入されたケージドペプチドの合成が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、「ケージドペプチド」とは、生理活性ペプチドの主鎖に紫外線照射により除去可能な光解離性保護基が付加されたペプチドであって、それ自身は生理活性ペプチドよりも活性が減弱ないし消失したポリペプチドを意味する。ケージドペプチドの生理活性は、もとの生理活性ペプチドの５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは５％以下、特に好ましくは１％以下である。
【００１１】
ケージドペプチドに結合する光解離性保護基の数は、ケージドペプチドの生理活性が減弱ないし消失する限り特に限定されないが、例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個である。
【００１２】
光解離性保護基は、生理活性ペプチドを構成するアミノ酸の、ペプチド結合(アミド結
合)に関与するαアミノ基に結合する。光解離性保護基が結合するアミノ酸としては、グ
リシンとプロリン以外のαアミノ酸であれば特に限定されない。グリシンの場合には、アミノ基に光解離性保護基が結合していても通常の固相合成の手順に従ってペプチドの伸長を行うことができるので、本発明で使用する一般式(Ｉ)のジペプチドを使用する必要がない。また、プロリンはアミノ基に光解離性保護基が結合するとペプチド結合が形成できないので除外される。
【００１３】
一般式(Ｉ)において、「Ａ」で表される基としては、Ala、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Asp、Glu、Met、Cys、Leu、Ile、Val、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Orn（オルニチン）の
側鎖が挙げられ、「Ｂ」で表される基としては、Ala、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Asp、Glu、Met、Cys、Leu、Ile、Val、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Gly、Pro、Orn（オルニチン
）の側鎖が挙げられる。なお、A, Bで表されるアミノ酸の側鎖がNH2、SH、イミダゾリル
、グアニジノ、OH、COOH）などの官能基を有する場合には、必要に応じてペプチド合成(
特に固相合成)で通常使用される保護基で必要に応じて保護される。
【００１４】
光解離性保護基は、紫外線照射により除去される。照射される紫外線としては、光解離性保護基を除去できる限り特に限定されず、通常の紫外線ランプなどが用いられる。紫外線照射の条件は特に限定されないが、例えばＴＬＣ検出用の紫外線ハンドランプ（トプコン製、PU-2)で１時間程度処理すればよい。
【００１５】
光解離性保護基が連結される生理活性ペプチドとしては、グリシンとプロリン以外のアミノ酸を含有する限り特に限定されず、動物、植物、微生物由来のあらゆる酵素、受容体またはそのリガンド、生理活性ペプチドが対象となる。例えば、光解離性保護基がα−ヘリックス、βシートなどの二次構造を構成するアミノ酸、酵素の活性中心、受容体あるいはそのリガンドの結合部位などに導入し、これらペプチド/ポリペプチドの活性がどの程
度影響されるかを評価することで、該活性に重要なアミノ酸を同定することができる。
【００１６】
R1で表される保護基としては、Boc基、Z(Cbz)基、Fmoc基が挙げられ、Fmoc基が好まし
い。
【００１７】
生理活性ペプチドは、３〜１０００個程度、好ましくは４〜２００個程度のアミノ酸から構成される。生理活性ペプチドの具体例としては、オキシトシン、バゾプレッシン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンII、ＡＣＴＨ、ＴＲＨ、ＬＨ−ＲＨ、Ｍｅｔ−エン
ケファリン、Ｌｅｕ−エンケファリン、エンドルフィン、ガストリン、グルカゴン、ニューロペプチドＹ、セクレチン、カルシトニン、成長因子放出ホルモン（ＧＲＦ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＦ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、インシュリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ、神経ペプチドＹ等の各種のペプチドが挙げられる。
【００１８】
光解離性保護基は、紫外線照射により切断されるものであれば特に限定されないが、例えば下記式（II）
【００１９】
【化２】
【００２０】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、同一又は異なって水素原子、低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基またはシアノ基を示すか、あるいはＲ1、Ｒ2及びＲ3のいずれか２つが一緒になってメチレンジオキシ基を示す。Ｒは、水素原子又はメチ
ル基を示す。〕で表される
基が挙げられる。
【００２１】
式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3で表される低級アルキル基としては、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００２２】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルコキシ基が挙げられる。
【００２３】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２４】
好ましい式（II）の基は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、いずれか２つが水素原子で、残りの１つ
が水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基で、Ｒが水素原子で表される基である。
１）ジペプチドの合成の概略
αアミノ基に光解離性保護基を有するアミノ酸（Ａａａ）とＮ保護アミノ酸（Ｂａａ）の酸フッ化物を反応させて、目的とする一般式(Ｉ)のジペプチドを合成することができる。反応は、光解離性保護基が結合したＡａａ１モルに対し、Ｎ保護−Ｂａａ−Ｆを１モルから過剰量使用し、０℃〜１００℃程度の温度下に１分から２４時間程度反応させることにより、有利に進行する。
【００２５】
下記＜反応工程式１＞に、光解離性保護基がオルトニトロベンジル基であり、Ｂａａの保護基がＦｍｏｃである場合を例示する。オルトニトロベンジル基以外の光解離性保護基の場合も同様にして一般式(Ｉ)のジペプチドを合成することができる。
＜反応工程式１＞
【００２６】
【化３】
【００２７】
（式中、Ａ、Ｂは前記に定義されるとおりである。）
＜反応工程式１＞において、原料となるFmoc-NH-CHB-COFは、Fmoc-NH-CHB-COOHとフッ
化シアヌルを使用して常法により製造することができる。また、(o-ニトロヘ゛ンシ゛ル)-NHCHACOOHなどの光解離性保護基が導入されたアミノ酸は、Ra-Cl、Ra-BrなどのRa-(脱離基)で表される化合物と、必要に応じてCOOH基、側鎖官能基（NH2、SH、イミダゾリル、グアニジノ、OH、COOH）が保護されたαアミノ酸とを必要に応じて塩基の存在下に反応させることで得ることができる。また、光解離性保護基が一般式(II)の基の場合には、一般式(II)のベンジル位にカルボニル基を有するo-ニトロアセトフェノン誘導体又はo-ニトロベンズアルデヒド誘導体と必要に応じて保護基を有するαアミノ酸をNaBH4、NaCNBH3などの還元剤の存在下に反応させてシッフ塩基を還元させ、必要な場合には脱保護することにより、目的とする(光解離性保護基)-NH-CHA-COOHを得ることができる。
【００２８】
２）ペプチド合成の概略
固相合成により、上記ジペプチドビルディングブロックを任意の配列のペプチド鎖に導入することができる。
＜反応工程式２＞
【００２９】
【化４】
【００３０】
（式中、Ａ、Ｂは前記に定義されるとおりである。ＢＯＰは、Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphateである。固相合成用の樹脂(Resin)の末端の「H2N-CHX-」は、固相合成法における末端のアミノ酸を表す。）
固相合成の樹脂としては、ポリスチレンージ ビニルベンゼン共重合体などの公知の樹
脂を広く使用することができる。
【００３１】
また、ペプチド鎖の伸長、保護基の除去、樹脂からのペプチドの切断などは、常法に従い実施することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
参考例１：Ｎ−2-ニトロベンジル−アミノ酸（（ＮＢ）Ａａａ）の製造
＜反応工程式１＞の左辺第２項に示される化合物（Ｎ−2-ニトロベンジル−アミノ酸、（ＮＢ）Ａａａ）の合成例として、Ｎ−2-ニトロベンジル−アラニン（（ＮＢ）Ａｌａ）の合成例を記載する。
【００３３】
３００ｍｌナス型フラスコでアラニン８．９０ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１Ｎ水酸化カリウム水溶液１００ｍｌに溶解させ、氷浴に移し、エタノール１００ｍｌに溶解させた２-
ニトロベンズアルデヒド１５．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を撹拌しながら少量ずつ加えた。フラスコを氷浴に移し、水素化ホウ素ナトリウム６．０ｇ（０．１５９ｍｏｌ）を攪拌しながら少量ずつ加えた。約１５分後、エタノールをエバポレーターにより留去し、得られた懸濁液をジエチルエーテルにて洗浄後、２Ｎ塩酸水溶液を加え万能ｐＨ試験紙によりｐＨを約５に調整し、生じた沈殿を水、ジエチルエーテルにて洗浄後、真空乾燥し、Ｎ−2-ニトロベンジル−アラニン（（ＮＢ）Ａｌａ）１０．６５ｇ（０．０４７ｍｏｌ、収率４７．５％）を得た。同定は、１Ｈ−ＮＭＲによって行った。
【００３４】
同様な方法により、Ｎ−2-ニトロベンジル−フェニルアラニン、Ｎ−2-ニトロベンジル−Ｏ−ｔブチル−セリン、Ｎ−2-ニトロベンジル−Ｏ−ｔブチル−アスパラギン酸、Ｎ−2-ニトロベンジル−Ｏ−ｔブチル−グルタミン酸、Ｎ−α−2-ニトロベンジル−Ｎ−ε―ｔブチルオキシカルボニル−リジン、を得た。
【００３５】
参考例２：Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Ｎ-2-ニトロベンジル−アラニン（Fmoc-(NB)Ala）の製造
氷浴上の１００ｍｌナス型フラスコに上記参考例で得た（ＮＢ）Ａｌａ２．２４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を入れ、１０％炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）、水（７０ｍｌ）、アセトン(１０ｍｌ)を加え溶解させ、アセトン(２０ｍｌ)に溶解した9-フルオレニル-N-スク
シンイミジル炭酸塩３．８９ｇ(１５ｍｍｏｌ)を滴下ロートで滴下後、一夜撹拌した。これをエバポレーターにより、アセトンを留去した後、水相をジエチルエーテルで洗浄し、２Ｎ塩酸水溶液を加え万能ｐＨ試験紙によりｐＨを約４以下に調整した後、酢酸エチルにより抽出し、有機相を１Ｎ塩酸１回、水２回、飽和食塩水１回にて洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、ヘキサンを加え白色沈殿を析出させた。次いで、この白色沈殿を濾取し、ヘキサンで洗浄して乾燥させ、標記化合物４．０４ｇを回収した。（９．１ｍｍｏｌ、収率９１％、質量分析値：FABMS calculated for C25H22N2O6(M) 446.15, found m/z
446.13（M+H+））
【００３６】
参考例３：アミノ酸フッ化物の調整法
Fmoc-NH-CHB-COFの合成法をAla(B=CH3)を例に取り記載する。１００ｍｌナス型フラス
コにＮ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アラニン１水和物１．８１ｇ（５．５
ｍｍｏｌ）を入れ、乾燥ジクロロメタン（２５ｍｌ)を加え溶解させ、ピリジン(２２１マイクロｌ)を加え、フッ化シアヌル(３．５ｍｌ)を滴下後、一夜撹拌した。水（5０ｍｌ）を加え攪拌した。４時間後に、生じた固形物をろ別し、ジクロロメタンによる洗浄液をろ液と合わせ、水１回、飽和食塩水１回にて洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、ジクロロメタンを留去し、Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル−アラニン酸フッ化物（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｆ）の粗生成物１．７５ｇを回収した。収率１０１％。
【００３７】
同様な方法によって、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｆ（収率６１．８％）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ―Ｆ（収率８４．４％）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｆ（収率９３．１％）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｆ（収率８５．０％）、を得た。
【００３８】
参考例４：ペプチドの製造方法
自動ペプチド合成装置PSSM−8((株)島津製作所製)を使用し、この合成マニュアルに従
い粗ペプチドを合成した。レジンはTGS-RAM レジン（(株)島津製作所製）を用いた。合成スケールは、リアクションベッセル１個に対し、１００mgのレジンとFmoc化アミノ酸を２１０μmol(１０当量)加えた。ニトロベンジルが含まれていないアミノ基にペプチド結合
を生じさせるステップは、マニュアルどおり、ベンゾトリアゾリルオキシトリピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＢＯＰ、１０９ｍｇ、１０当量、
Ｎメチルモルホリン(１Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、２１０μｌ)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ、０．５Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、４２０μｌ)を次のＦｍｏｃ化アミノ酸１０当量を反応させるプログラムを選択した。合成終了後、リアクションベッセル内のペプチドレジンにメタノール及びｔ−ブチルメチルエーテルを加え順次洗浄した後、ペプチドレジンを1時間減圧乾燥した。乾燥後、クリーベッジカクテル（レ
ジン１００ｍｇのスケールに対してトリフルオロ酢酸(以下、TFAと略す)／チオアニソー
ル／エタンジチオール／水／エチルメチルスルフィド／チオフェノール／1, 2-エタンジ
チオール＝０．８ｍｌ／０．０５ml／０．０５ml／0.03 ml / 0.02 ml / 0.025 ml）をリアクションベッセル内に注入し、約8時間放置した。クリーベッジカクテルの濾液を遠沈
管に回収し、冷却したジエチルエーテルを加え、遠心操作を行い、析出した沈殿物を回収し、アルゴン気流中で乾燥し、更に減圧乾燥して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドをC18AR-IIカラム（φ20ｘ250ｍｍ、ナカライ製）を装着した逆相系液体クロマトグラフィ
ー（溶出液０．１％TFA水溶液と８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント溶出）によ
り、単離した。
【００３９】
比較例１
ＳＫＡＥＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＡ-amideの配列のペプチドの１０番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドの合成を試みた。１０番目のアミノ酸導入は、Ｆｍｏｃ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（１０当量）を用い、通常の合成プログラムで行った。９番目のアミノ酸導入は、ＦｍｏｃＡｌａ−ＯＨ(６５ｍｇ、２１０μｍｏｌ)、ジイソプロピルカルボジイミド(２５ｍｇ、２１０μｍｏｌ)、Ｎメチルモルホリン(１
Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、２１０μｌ)、をジメチルホルムアミド（５００μｌ）
に溶解したものを約３０分反応させ、同じ反応約１時間反応させた。その他のステップは参考例４の方法により行った。この結果、目的のペプチドは得られなかった。
【００４０】
比較例２
ＳＫＡＥＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＡ-amideの配列のペプチドの１０番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドの合成を試みた。１０番目のアミノ酸導入は、Ｆｍｏｃ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（１０当量）を用い、通常の合成プログラムで行った。９番目のアミノ酸導入は、ＦｍｏｃＡｌａ−Ｆ(６５ｍｇ、２２８μｍｏｌ)、Ｎメチルモルホリン(１Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、２１０μｌ)、をジメチルホルムアミド（５００μｌ）に溶解したものを約３０分反応させ、同じ反応約１時間反応させた。そのほかのステップは参考例４の方法により行った。この結果、目的のペプチドは得られなかった。
【００４１】
実施例１：ケージドジペプチド原料（Ｆｍｏｃ−Ｂａａ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ）の合成
１００ｍｌナス型フラスコに(ＮＢ)Ａｌａ（２．２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）をいれ、ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)とジイソプロピルエチルアミン（１．７１ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を加え溶解し、ここへ参考例３で調整した粗Ｆｍｏｃ−Ａｌａ-Ｆ(３．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、一夜撹拌した。不溶物をろ別後、ジメチルホルムアミドを留去し、酢酸エチル加え、を１Ｎ塩酸水溶液で１回、水で２回、飽和食塩水１回にて洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、酢酸エチルを留去し、ケージドジペプチド（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ）を回収した。この粗ケージドペプチドをC18AR-IIカラム（φ20ｘ250
ｍｍ、ナカライ製）を装着した逆相系液体クロマトグラフィー（溶出液０．１％TFA水溶
液と８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント溶出）により、目的物質Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを単離し、凍結乾燥により白色粉末を得た。質量分析値：FABMS calculated for C28H27N3O7(M) 517.18, found m/z 518（M+H+）, 540（M+Na+）。
【００４２】
同様な方法によって、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨ（質量分析値：FABMS calculated for C33H35N3O9(M) 617.24, found m/z 618（M+H+）, 640（M+N
a+））、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ―（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（質量分析値：FABMS calculated for
C31H33N3O7(M) 559.23, found m/z 560（M+H+）, 582（M+Na+））、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）―（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（質量分析値：FABMS calculated for C32H35N3O8(M)
589.24, found m/z 590（M+H+）, 612（M+Na+））、を得た。
【００４３】
実施例２：ケージドペプチドの製造１
ＳＫＡＥＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＡ-amideの配列のペプチドの１０番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドの合成を行った。９，１０番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ａｌａ−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、１４残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。その他のステップは参考例３の方法により行った。乾燥した白色粉末の目的物を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C60H99N21O20(M) 1434.6, found m/z 1437（M+H+））
【００４４】
実施例３：ケージドペプチドの製造２
神経ペプチドＹ（１１−３６）(アミノ酸配列：ＤＡＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹ
ＩＮＬＩＴＲＱＲＹ-amide)の２番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入し
たケージドペプチド（［（ＮＢ）Ａｌａ２］ＮＰＹ（１１−３６））の合成を、＜反応工程式２＞に示される方法にて行った。１，２番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、２５残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。その他のステップは参考例４の方法により行った。乾燥した白色粉末の目的物（［（ＮＢ）Ａｌａ２］ＮＰＹ（１１−３６））を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C149H224N44O42(M) 3301.7, found m/z 3302（M+H+））
【００４５】
実施例４：ケージドペプチドの製造３
神経ペプチドＹ（１１−３６）(アミノ酸配列：ＤＡＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹ
ＩＮＬＩＴＲＱＲＹ-amide)の８番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入し
たケージドペプチド（［（ＮＢ）Ａｌａ８］ＮＰＹ（１１−３６））の合成を、＜反応工程式２＞に示される方法にて行った。１，２番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、２５残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。その他のステップは参考例４の方法により行った。乾燥した白色粉末の目的物（［（ＮＢ）Ａｌａ８］ＮＰＹ（１１−３６））を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C149H224N44O42(M) 3301.7,
found m/z 3300（M+H+））
【００４６】
実施例５：ケージドペプチドの製造４
神経ペプチドＹ（１１−３６）(アミノ酸配列：ＤＡＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹ
ＩＮＬＩＴＲＱＲＹ-amide)の１３番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入
したケージドペプチド（［（ＮＢ）Ａｌａ１３］ＮＰＹ（１１−３６））の合成を、＜反応工程式２＞に示される方法にて行った。１，２番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、２５残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。乾燥した白色粉末の目的物（［（ＮＢ）Ａｌａ１３］ＮＰＹ（１１−３６））を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C149H224N44O42(M) 3301.7, found m/z 3300（M+H+））
【産業上の利用可能性】
【００４７】
光で生理活性を制御する技術（ケージド化合物）に応用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケージドペプチドの合成法に関し、特に固相合成法によるケージドペプチドの合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、ペプチドの側鎖に光解離性保護基を導入することによって、ペプチドの生理活性を遮蔽し、光照射により、保護基を解離させ、ペプチドの生理活性を任意の時間部位で回復させることができるケージドペプチドが開発された（特許文献１）。その後、ペプチド結合に光解離性保護基を導入したタイプのケージドペプチドが開発された（非特許文献１）。
【特許文献１】特開平10-120699
【非特許文献１】Tatsu Y, Nishigaki T, Darszon A, Yumoto N. ,FEBS Lett. 2002;525(1-3):20-4.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ペプチド結合に光解離性保護基を導入できれば、側鎖に光解離性保護基が導入できないアミノ酸残基でも、ケージドペプチド化することが可能となる。しかし、Ｂａａ−Ａａａ（Ｂａａは、側鎖がＢ基であるαアミノ酸を示す。Ａａａは、側鎖がＡ基であるαアミノ酸を示す。）のペプチド結合において、Ａａａがグリシンのときのみ固相合成が進行し、その他のアミノ酸残基のケージドペプチドは合成することができなかった。
【０００４】
本発明は、グリシンとプロリン以外のアミノ酸の主鎖(ペプチド結合を構成する)アミノ基に光解離性保護基が導入されたペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｂａａ−Ａａａのペプチド結合のＡａａのαアミノ基を光解離性保護基で修飾したジペプチドを液相中で合成し、これを固相合成法に用いることで、上記課題が解決可能であることを見出した。
【０００６】
本発明は、以下のペプチドの固相合成法を提供するものである。
１． 下記式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
【０００８】
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＧｌｙ，Ｐｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することを特徴とする、光解離性保護基を主鎖に導入したペプチドの固相合成法。
２． Ｒａが２−ニトロベンジル基である項１に記載の固相合成法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の固相合成法により、グリシン、プロリン以外のアミノ酸残基のペプチド結合のアミドに光解離性保護基が導入されたケージドペプチドの合成が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、「ケージドペプチド」とは、生理活性ペプチドの主鎖に紫外線照射により除去可能な光解離性保護基が付加されたペプチドであって、それ自身は生理活性ペプチドよりも活性が減弱ないし消失したポリペプチドを意味する。ケージドペプチドの生理活性は、もとの生理活性ペプチドの５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは５％以下、特に好ましくは１％以下である。
【００１１】
ケージドペプチドに結合する光解離性保護基の数は、ケージドペプチドの生理活性が減弱ないし消失する限り特に限定されないが、例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個である。
【００１２】
光解離性保護基は、生理活性ペプチドを構成するアミノ酸の、ペプチド結合(アミド結
合)に関与するαアミノ基に結合する。光解離性保護基が結合するアミノ酸としては、グ
リシンとプロリン以外のαアミノ酸であれば特に限定されない。グリシンの場合には、アミノ基に光解離性保護基が結合していても通常の固相合成の手順に従ってペプチドの伸長を行うことができるので、本発明で使用する一般式(Ｉ)のジペプチドを使用する必要がない。また、プロリンはアミノ基に光解離性保護基が結合するとペプチド結合が形成できないので除外される。
【００１３】
一般式(Ｉ)において、「Ａ」で表される基としては、Ala、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Asp、Glu、Met、Cys、Leu、Ile、Val、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Orn（オルニチン）の
側鎖が挙げられ、「Ｂ」で表される基としては、Ala、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Asp、Glu、Met、Cys、Leu、Ile、Val、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Gly、Pro、Orn（オルニチン
）の側鎖が挙げられる。なお、A, Bで表されるアミノ酸の側鎖がNH2、SH、イミダゾリル
、グアニジノ、OH、COOH）などの官能基を有する場合には、必要に応じてペプチド合成(
特に固相合成)で通常使用される保護基で必要に応じて保護される。
【００１４】
光解離性保護基は、紫外線照射により除去される。照射される紫外線としては、光解離性保護基を除去できる限り特に限定されず、通常の紫外線ランプなどが用いられる。紫外線照射の条件は特に限定されないが、例えばＴＬＣ検出用の紫外線ハンドランプ（トプコン製、PU-2)で１時間程度処理すればよい。
【００１５】
光解離性保護基が連結される生理活性ペプチドとしては、グリシンとプロリン以外のアミノ酸を含有する限り特に限定されず、動物、植物、微生物由来のあらゆる酵素、受容体またはそのリガンド、生理活性ペプチドが対象となる。例えば、光解離性保護基がα−ヘリックス、βシートなどの二次構造を構成するアミノ酸、酵素の活性中心、受容体あるいはそのリガンドの結合部位などに導入し、これらペプチド/ポリペプチドの活性がどの程
度影響されるかを評価することで、該活性に重要なアミノ酸を同定することができる。
【００１６】
R1で表される保護基としては、Boc基、Z(Cbz)基、Fmoc基が挙げられ、Fmoc基が好まし
い。
【００１７】
生理活性ペプチドは、３〜１０００個程度、好ましくは４〜２００個程度のアミノ酸から構成される。生理活性ペプチドの具体例としては、オキシトシン、バゾプレッシン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンII、ＡＣＴＨ、ＴＲＨ、ＬＨ−ＲＨ、Ｍｅｔ−エン
ケファリン、Ｌｅｕ−エンケファリン、エンドルフィン、ガストリン、グルカゴン、ニューロペプチドＹ、セクレチン、カルシトニン、成長因子放出ホルモン（ＧＲＦ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＦ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、インシュリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ、神経ペプチドＹ等の各種のペプチドが挙げられる。
【００１８】
光解離性保護基は、紫外線照射により切断されるものであれば特に限定されないが、例えば下記式（II）
【００１９】
【化２】
【００２０】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、同一又は異なって水素原子、低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基またはシアノ基を示すか、あるいはＲ1、Ｒ2及びＲ3のいずれか２つが一緒になってメチレンジオキシ基を示す。Ｒは、水素原子又はメチ
ル基を示す。〕で表される
基が挙げられる。
【００２１】
式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3で表される低級アルキル基としては、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００２２】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどの炭素数１〜４の直鎖又は分枝を有するアルコキシ基が挙げられる。
【００２３】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２４】
好ましい式（II）の基は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、いずれか２つが水素原子で、残りの１つ
が水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基で、Ｒが水素原子で表される基である。
１）ジペプチドの合成の概略
αアミノ基に光解離性保護基を有するアミノ酸（Ａａａ）とＮ保護アミノ酸（Ｂａａ）の酸フッ化物を反応させて、目的とする一般式(Ｉ)のジペプチドを合成することができる。反応は、光解離性保護基が結合したＡａａ１モルに対し、Ｎ保護−Ｂａａ−Ｆを１モルから過剰量使用し、０℃〜１００℃程度の温度下に１分から２４時間程度反応させることにより、有利に進行する。
【００２５】
下記＜反応工程式１＞に、光解離性保護基がオルトニトロベンジル基であり、Ｂａａの保護基がＦｍｏｃである場合を例示する。オルトニトロベンジル基以外の光解離性保護基の場合も同様にして一般式(Ｉ)のジペプチドを合成することができる。
＜反応工程式１＞
【００２６】
【化３】
【００２７】
（式中、Ａ、Ｂは前記に定義されるとおりである。）
＜反応工程式１＞において、原料となるFmoc-NH-CHB-COFは、Fmoc-NH-CHB-COOHとフッ
化シアヌルを使用して常法により製造することができる。また、(o-ニトロヘ゛ンシ゛ル)-NHCHACOOHなどの光解離性保護基が導入されたアミノ酸は、Ra-Cl、Ra-BrなどのRa-(脱離基)で表される化合物と、必要に応じてCOOH基、側鎖官能基（NH2、SH、イミダゾリル、グアニジノ、OH、COOH）が保護されたαアミノ酸とを必要に応じて塩基の存在下に反応させることで得ることができる。また、光解離性保護基が一般式(II)の基の場合には、一般式(II)のベンジル位にカルボニル基を有するo-ニトロアセトフェノン誘導体又はo-ニトロベンズアルデヒド誘導体と必要に応じて保護基を有するαアミノ酸をNaBH4、NaCNBH3などの還元剤の存在下に反応させてシッフ塩基を還元させ、必要な場合には脱保護することにより、目的とする(光解離性保護基)-NH-CHA-COOHを得ることができる。
【００２８】
２）ペプチド合成の概略
固相合成により、上記ジペプチドビルディングブロックを任意の配列のペプチド鎖に導入することができる。
＜反応工程式２＞
【００２９】
【化４】
【００３０】
（式中、Ａ、Ｂは前記に定義されるとおりである。ＢＯＰは、Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphateである。固相合成用の樹脂(Resin)の末端の「H2N-CHX-」は、固相合成法における末端のアミノ酸を表す。）
固相合成の樹脂としては、ポリスチレンージ ビニルベンゼン共重合体などの公知の樹
脂を広く使用することができる。
【００３１】
また、ペプチド鎖の伸長、保護基の除去、樹脂からのペプチドの切断などは、常法に従い実施することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
参考例１：Ｎ−2-ニトロベンジル−アミノ酸（（ＮＢ）Ａａａ）の製造
＜反応工程式１＞の左辺第２項に示される化合物（Ｎ−2-ニトロベンジル−アミノ酸、（ＮＢ）Ａａａ）の合成例として、Ｎ−2-ニトロベンジル−アラニン（（ＮＢ）Ａｌａ）の合成例を記載する。
【００３３】
３００ｍｌナス型フラスコでアラニン８．９０ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１Ｎ水酸化カリウム水溶液１００ｍｌに溶解させ、氷浴に移し、エタノール１００ｍｌに溶解させた２-
ニトロベンズアルデヒド１５．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を撹拌しながら少量ずつ加えた。フラスコを氷浴に移し、水素化ホウ素ナトリウム６．０ｇ（０．１５９ｍｏｌ）を攪拌しながら少量ずつ加えた。約１５分後、エタノールをエバポレーターにより留去し、得られた懸濁液をジエチルエーテルにて洗浄後、２Ｎ塩酸水溶液を加え万能ｐＨ試験紙によりｐＨを約５に調整し、生じた沈殿を水、ジエチルエーテルにて洗浄後、真空乾燥し、Ｎ−2-ニトロベンジル−アラニン（（ＮＢ）Ａｌａ）１０．６５ｇ（０．０４７ｍｏｌ、収率４７．５％）を得た。同定は、１Ｈ−ＮＭＲによって行った。
【００３４】
同様な方法により、Ｎ−2-ニトロベンジル−フェニルアラニン、Ｎ−2-ニトロベンジル−Ｏ−ｔブチル−セリン、Ｎ−2-ニトロベンジル−Ｏ−ｔブチル−アスパラギン酸、Ｎ−2-ニトロベンジル−Ｏ−ｔブチル−グルタミン酸、Ｎ−α−2-ニトロベンジル−Ｎ−ε―ｔブチルオキシカルボニル−リジン、を得た。
【００３５】
参考例２：Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Ｎ-2-ニトロベンジル−アラニン（Fmoc-(NB)Ala）の製造
氷浴上の１００ｍｌナス型フラスコに上記参考例で得た（ＮＢ）Ａｌａ２．２４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を入れ、１０％炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）、水（７０ｍｌ）、アセトン(１０ｍｌ)を加え溶解させ、アセトン(２０ｍｌ)に溶解した9-フルオレニル-N-スク
シンイミジル炭酸塩３．８９ｇ(１５ｍｍｏｌ)を滴下ロートで滴下後、一夜撹拌した。これをエバポレーターにより、アセトンを留去した後、水相をジエチルエーテルで洗浄し、２Ｎ塩酸水溶液を加え万能ｐＨ試験紙によりｐＨを約４以下に調整した後、酢酸エチルにより抽出し、有機相を１Ｎ塩酸１回、水２回、飽和食塩水１回にて洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、ヘキサンを加え白色沈殿を析出させた。次いで、この白色沈殿を濾取し、ヘキサンで洗浄して乾燥させ、標記化合物４．０４ｇを回収した。（９．１ｍｍｏｌ、収率９１％、質量分析値：FABMS calculated for C25H22N2O6(M) 446.15, found m/z
446.13（M+H+））
【００３６】
参考例３：アミノ酸フッ化物の調整法
Fmoc-NH-CHB-COFの合成法をAla(B=CH3)を例に取り記載する。１００ｍｌナス型フラス
コにＮ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アラニン１水和物１．８１ｇ（５．５
ｍｍｏｌ）を入れ、乾燥ジクロロメタン（２５ｍｌ)を加え溶解させ、ピリジン(２２１マイクロｌ)を加え、フッ化シアヌル(３．５ｍｌ)を滴下後、一夜撹拌した。水（5０ｍｌ）を加え攪拌した。４時間後に、生じた固形物をろ別し、ジクロロメタンによる洗浄液をろ液と合わせ、水１回、飽和食塩水１回にて洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、ジクロロメタンを留去し、Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル−アラニン酸フッ化物（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｆ）の粗生成物１．７５ｇを回収した。収率１０１％。
【００３７】
同様な方法によって、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｆ（収率６１．８％）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ―Ｆ（収率８４．４％）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｆ（収率９３．１％）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｆ（収率８５．０％）、を得た。
【００３８】
参考例４：ペプチドの製造方法
自動ペプチド合成装置PSSM−8((株)島津製作所製)を使用し、この合成マニュアルに従
い粗ペプチドを合成した。レジンはTGS-RAM レジン（(株)島津製作所製）を用いた。合成スケールは、リアクションベッセル１個に対し、１００mgのレジンとFmoc化アミノ酸を２１０μmol(１０当量)加えた。ニトロベンジルが含まれていないアミノ基にペプチド結合
を生じさせるステップは、マニュアルどおり、ベンゾトリアゾリルオキシトリピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＢＯＰ、１０９ｍｇ、１０当量、
Ｎメチルモルホリン(１Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、２１０μｌ)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ、０．５Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、４２０μｌ)を次のＦｍｏｃ化アミノ酸１０当量を反応させるプログラムを選択した。合成終了後、リアクションベッセル内のペプチドレジンにメタノール及びｔ−ブチルメチルエーテルを加え順次洗浄した後、ペプチドレジンを1時間減圧乾燥した。乾燥後、クリーベッジカクテル（レ
ジン１００ｍｇのスケールに対してトリフルオロ酢酸(以下、TFAと略す)／チオアニソー
ル／エタンジチオール／水／エチルメチルスルフィド／チオフェノール／1, 2-エタンジ
チオール＝０．８ｍｌ／０．０５ml／０．０５ml／0.03 ml / 0.02 ml / 0.025 ml）をリアクションベッセル内に注入し、約8時間放置した。クリーベッジカクテルの濾液を遠沈
管に回収し、冷却したジエチルエーテルを加え、遠心操作を行い、析出した沈殿物を回収し、アルゴン気流中で乾燥し、更に減圧乾燥して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドをC18AR-IIカラム（φ20ｘ250ｍｍ、ナカライ製）を装着した逆相系液体クロマトグラフィ
ー（溶出液０．１％TFA水溶液と８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント溶出）によ
り、単離した。
【００３９】
比較例１
ＳＫＡＥＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＡ-amideの配列のペプチドの１０番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドの合成を試みた。１０番目のアミノ酸導入は、Ｆｍｏｃ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（１０当量）を用い、通常の合成プログラムで行った。９番目のアミノ酸導入は、ＦｍｏｃＡｌａ−ＯＨ(６５ｍｇ、２１０μｍｏｌ)、ジイソプロピルカルボジイミド(２５ｍｇ、２１０μｍｏｌ)、Ｎメチルモルホリン(１
Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、２１０μｌ)、をジメチルホルムアミド（５００μｌ）
に溶解したものを約３０分反応させ、同じ反応約１時間反応させた。その他のステップは参考例４の方法により行った。この結果、目的のペプチドは得られなかった。
【００４０】
比較例２
ＳＫＡＥＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＡ-amideの配列のペプチドの１０番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドの合成を試みた。１０番目のアミノ酸導入は、Ｆｍｏｃ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（１０当量）を用い、通常の合成プログラムで行った。９番目のアミノ酸導入は、ＦｍｏｃＡｌａ−Ｆ(６５ｍｇ、２２８μｍｏｌ)、Ｎメチルモルホリン(１Ｍ ジメチルホルムアミド溶液、２１０μｌ)、をジメチルホルムアミド（５００μｌ）に溶解したものを約３０分反応させ、同じ反応約１時間反応させた。そのほかのステップは参考例４の方法により行った。この結果、目的のペプチドは得られなかった。
【００４１】
実施例１：ケージドジペプチド原料（Ｆｍｏｃ−Ｂａａ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ）の合成
１００ｍｌナス型フラスコに(ＮＢ)Ａｌａ（２．２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）をいれ、ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)とジイソプロピルエチルアミン（１．７１ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を加え溶解し、ここへ参考例３で調整した粗Ｆｍｏｃ−Ａｌａ-Ｆ(３．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、一夜撹拌した。不溶物をろ別後、ジメチルホルムアミドを留去し、酢酸エチル加え、を１Ｎ塩酸水溶液で１回、水で２回、飽和食塩水１回にて洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、酢酸エチルを留去し、ケージドジペプチド（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ）を回収した。この粗ケージドペプチドをC18AR-IIカラム（φ20ｘ250
ｍｍ、ナカライ製）を装着した逆相系液体クロマトグラフィー（溶出液０．１％TFA水溶
液と８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント溶出）により、目的物質Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを単離し、凍結乾燥により白色粉末を得た。質量分析値：FABMS calculated for C28H27N3O7(M) 517.18, found m/z 518（M+H+）, 540（M+Na+）。
【００４２】
同様な方法によって、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨ（質量分析値：FABMS calculated for C33H35N3O9(M) 617.24, found m/z 618（M+H+）, 640（M+N
a+））、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ―（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（質量分析値：FABMS calculated for
C31H33N3O7(M) 559.23, found m/z 560（M+H+）, 582（M+Na+））、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）―（ＮＢ）Ａｌａ−ＯＨ（質量分析値：FABMS calculated for C32H35N3O8(M)
589.24, found m/z 590（M+H+）, 612（M+Na+））、を得た。
【００４３】
実施例２：ケージドペプチドの製造１
ＳＫＡＥＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＡ-amideの配列のペプチドの１０番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドの合成を行った。９，１０番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ａｌａ−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、１４残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。その他のステップは参考例３の方法により行った。乾燥した白色粉末の目的物を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C60H99N21O20(M) 1434.6, found m/z 1437（M+H+））
【００４４】
実施例３：ケージドペプチドの製造２
神経ペプチドＹ（１１−３６）(アミノ酸配列：ＤＡＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹ
ＩＮＬＩＴＲＱＲＹ-amide)の２番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入し
たケージドペプチド（［（ＮＢ）Ａｌａ２］ＮＰＹ（１１−３６））の合成を、＜反応工程式２＞に示される方法にて行った。１，２番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、２５残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。その他のステップは参考例４の方法により行った。乾燥した白色粉末の目的物（［（ＮＢ）Ａｌａ２］ＮＰＹ（１１−３６））を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C149H224N44O42(M) 3301.7, found m/z 3302（M+H+））
【００４５】
実施例４：ケージドペプチドの製造３
神経ペプチドＹ（１１−３６）(アミノ酸配列：ＤＡＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹ
ＩＮＬＩＴＲＱＲＹ-amide)の８番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入し
たケージドペプチド（［（ＮＢ）Ａｌａ８］ＮＰＹ（１１−３６））の合成を、＜反応工程式２＞に示される方法にて行った。１，２番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、２５残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。その他のステップは参考例４の方法により行った。乾燥した白色粉末の目的物（［（ＮＢ）Ａｌａ８］ＮＰＹ（１１−３６））を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C149H224N44O42(M) 3301.7,
found m/z 3300（M+H+））
【００４６】
実施例５：ケージドペプチドの製造４
神経ペプチドＹ（１１−３６）(アミノ酸配列：ＤＡＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＨＹ
ＩＮＬＩＴＲＱＲＹ-amide)の１３番目のアラニンのアミノ基にニトロベンジル基を導入
したケージドペプチド（［（ＮＢ）Ａｌａ１３］ＮＰＹ（１１−３６））の合成を、＜反応工程式２＞に示される方法にて行った。１，２番目のアミノ酸導入は、実施例１で製造したケージドジペプチドＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−（ＮＢ）Ａｌａ―ＯＨを用い、２５残基アミノ酸のペプチド合成として、通常の合成プログラムで行った。乾燥した白色粉末の目的物（［（ＮＢ）Ａｌａ１３］ＮＰＹ（１１−３６））を得た。（質量分析値：MALDI-TOFMS calculated for C149H224N44O42(M) 3301.7, found m/z 3300（M+H+））
【産業上の利用可能性】
【００４７】
光で生理活性を制御する技術（ケージド化合物）に応用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＧｌｙ，Ｐｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することを特徴とする、光解離性保護基を主鎖に導入したペプチドの固相合成法。
【請求項２】
Ｒａが２−ニトロベンジル基である請求項１に記載の固相合成法。
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１はアミノ基の保護基を示す。ＡはＧｌｙ，Ｐｒｏ以外のペプチドを構成するαアミノ酸の側鎖を示す。Ｂはαアミノ酸の側鎖を示す。Ｒａは光解離性保護基を示す。）で表されるＮ保護ジペプチド化合物を、固相合成においてＮ保護アミノ酸の代わりに使用することを特徴とする、光解離性保護基を主鎖に導入したペプチドの固相合成法。
【請求項２】
Ｒａが２−ニトロベンジル基である請求項１に記載の固相合成法。
【公開番号】特開２００７−３３２０４２（Ｐ２００７−３３２０４２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６２３８５（Ｐ２００６−１６２３８５）
【出願日】平成１８年６月１２日（２００６．６．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度 独立行政法人科学技術振興機構「ケージドペプチドの合成法の開発」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１２日（２００６．６．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度 独立行政法人科学技術振興機構「ケージドペプチドの合成法の開発」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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