コペポーダ種由来の蛍光たんぱく質および該たんぱく質の使用方法
本発明は、蛍光たんぱく質並びにその変異体、ホモログおよび誘導体をコード化する核酸分子、並びにこれらの核酸によってコード化されたたんぱく質およびペプチドを提供する。興味ある核酸分子およびたんぱく質は、カイアシ種から分離する。上述の特定のたんぱく質と実質的に同様なたんぱく質、またはその誘導体、ホモログもしくは変異体も興味がある。また、上記核酸のフラグメントおよびそれによってコード化されるペプチド、並びに本発明のたんぱく質およびペプチドに対し特異性の抗体も提供する。さらに、上述の核酸分子を含む宿主細胞、安定な細胞系およびトランスジェニック生物体も提供する。本発明のたんぱく質および核酸組成物は、種々の異なる用途および方法における、とりわけ生体分子、細胞または細胞オルガネラの標識化においての使用を見出している。最後に、そのような方法および用途において使用するキットも提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、生物学および化学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、蛍光たんぱく質に関する。
【０００２】
発明の背景
興味あるたんぱく質、細胞または生物体の標識化は、多くの生化学、分子生物学および医療診断用途において卓越した役割を果たしている。放射性ラベル、色素ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベル等のような種々の異なるラベルが、種々の特性および最適の用途でもって、当該技術において開発され使用されている。しかしながら、新たなラベル類を開発する興味は、存続している。とりわけ興味があるのは、蛍光たんぱく質ラベルのような新しいたんぱく質ラベルの開発である。蛍光たんぱく質またはフルオロたんぱく質は、適切な励起波長の光で照射したときに低い、中程度のまたは強い蛍光を発するたんぱく質である。これらたんぱく質の蛍光特性は、当該たんぱく質の２個以上のアミノ酸残基の相互作用に起因し１個のアミノ酸残基には起因しない特性である。そのようなものとして、蛍光たんぱく質は、固有の蛍光体としてそれ自体で作用する残基、即ち、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンからのみ蛍光を発するたんぱく質を含まない。本明細書において使用するとき、用語“蛍光たんぱく質”は、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ類を含まない。
【０００３】
緑色蛍光たんぱく質(GFP)、その変異体およびアナログ類は、Lippincott-SchwartzおよびPattersonによりScience (2003) 300(5616):87-91に詳述されている生物医学サイエンスにおける生体内蛍光マーカーとしての集中的な使用により、今日では広く知られている。ヒドロクラゲ目オワンクラゲ科オワンクラゲ(hydromedusa Aequorea aequorea) (A. victoriaと同義)に由来するGFPは、J Cell Comp Physiol. (1962), 60:85-1-4においてJohnson等によって発見され、GFPが光たんぱく質エクオリンからの青色光を緑色光に転換する二次発光体の役割を奏するクラゲの生体発光系の１部として見出された。オワンクラゲGFPをコード化するcDNAは、Prasher等によってクローン化された(Gene (1992), 111(2):229-33)。結局は、この遺伝子は、GFPがそれ自体でフルオロフォアを形成する特異な能力基づき実際に異種構造的に発現した任意の生物体であり得ることが判明した(Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805)。この知見により、遺伝子的にコード化された蛍光ラベルとしての細胞生物学におけるGFPの使用についての広汎な展望が開かれている。
GFPは、遺伝子発現およびたんぱく質局在化の研究(Chalfe et al., Science 263 (1994), 802-805；および Heim et al., in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504)を含む広範囲の用途において、細胞内の非細胞性オルガネラ類の可視化(Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642)のための、さらには、分泌経路に沿うたんぱく質輸送の可視化(Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271)のための手段として応用された。
【０００４】
相当量の研究が、GFPの性質を改善するためさらには種々の研究目的において有用で且つ最適化されたGFP試薬を製造するためになされている。“ヒト化”GFP DNAのような新たな種類のGFPも開発されており、そのたんぱく質生成物は、哺乳動物細胞における合成を増大させている(Haas、 et al., Current Biology (1996), 6: 315-324；Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593)。１つのそのようなヒト化たんぱく質は、２個のアミノ酸置換基：F64LおよびS65Tを有するGFPの“増強緑色蛍光たんぱく質”(EGFP)突然変異体である(Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664)。GFPに対する他の突然変異は、青色-、シアン色-および黄緑色発光種をもたらしている。
しかしながら、GFPの多大な有用性にもかかわらず、GFPと同様なまたは異なる特性を有する他の蛍光たんぱく質も当該技術において有用であろう。とりわけ、新規な蛍光たんぱく質の利益としては、より大きな励起による新たなスペクトルおよびより良好な適合性に基づく蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の実現性がある。1999年において、GFPホモログ類が非生体発光性花虫類(Anthozoa)種からクローニングされた(Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973)。この発見により、これらのたんぱく質は生体発光機構の必要成分ではないことが実証された。花虫類由来GFP様たんぱく質は、シアン色、緑色、黄色、赤色蛍光たんぱく質および紫青色非蛍光色素たんぱく質(CP)を含む大きなスペクトル多様性を示していた(Matz et al., Bioessays (2002), 24(10): 953-959)。その後、GFPホモログ類のcDNAが、ヒトモシクラゲ(Aequorea macrodactyla) (GenBank受託番号AF435427〜AF435433)およびオワンクラゲ(Aequorea Coerulescens) (Gurskaya et al., Biochem J. (2003), 373(pt2): 403-408)のような数種のヒドロイドクラゲ(Hydroid medusae)からクローニングされた。これまでの、GFP研究40年の歴史は、２種類の刺胞類(Cnidaria)群：ヒドロ虫類および花虫類内のみのGFP様たんぱく質類を明らかにしているに過ぎない。
【０００５】
蛍光たんぱく質の分子生物学における手段としての有用性は、既知の蛍光たんぱく質に比較して異なる且つ改良された性質を有する他の蛍光たんぱく質についての研究を促している。即ち、本発明の目的は、限られた数の既知の蛍光たんぱく質においては現在のところ利用し得ない特性を示す新規な蛍光たんぱく質並びに既知のGFPの不利益を被らないこれら新規な蛍光たんぱく質をコード化するDNA類を提供することである。
【０００６】
発明の要約
本発明は、新規な蛍光たんぱく質をコード化する核酸分子、その変異体および誘導体を提供する。該核酸は、その非天然環境において分離され、合成され或いは存在し得る。
ある実施態様においては、本発明の核酸は、カイアシ(copepod)類 (節足動物(Arthropoda)門、甲殻類(Crustacea)亜門、アゴアシ(Maxillopoda)綱、コペポーダ(Copepoda)亜綱)またはその変異体もしくは誘導体から分離される。
ある実施態様においては、本発明の核酸は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28からなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するたんぱく質をコード化する。ある実施態様においては、該核酸は、上記たんぱく質のホモログ、変異体、誘導体、擬態物またはフラグメントをコード化する。
ある実施態様においては、本発明の核酸は、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27からなる群から選ばれた、またはこれらと相同性の、実質的に同じ、または同一であるヌクレオチド配列を有する。遺伝子コードの縮退のため本発明の上記核酸配列と異なるまたは本発明の上記核酸配列にハイブリッド化している核酸配列も、本発明の範囲に属する。
【０００７】
もう１つの実施態様においては、本発明は、上記本発明の核酸によってコード化されたたんぱく質、または該たんぱく質に実質的に同じもしくはその相同物、誘導体もしくは変異体に関し、或いは本発明の上記たんぱく質を含む融合たんぱく質に関する。
また、本発明の核酸のフラグメントおよび本発明の核酸に緊縮条件下でハイブリッド化している核酸も提供する。
さらに他の実施態様においては、本発明の核酸を含むベクターを提供する。さらに、本発明は、本発明の核酸を含む発現カセットおよび所望の宿主細胞において上記核酸を発現するのに必要な調節要素を提供する。
さらにもう１つの実施態様においては、適切な宿主細胞においてたんぱく質を発現させ、その宿主細胞から該たんぱく質を分離することを含む、本発明の蛍光たんぱく質の産生方法を提供する。該方法は、(a) 適切な発現調節要素に作動可能に結合させた蛍光たんぱく質をコード化する本発明の核酸分子を調製し、(b) 該核酸分子から蛍光たんぱく質を発現させ、そして、(c)他のたんぱく質を実質的に含まない蛍光たんぱく質を分離することを含む。
さらに、本発明のたんぱく質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体も提供する。
【０００８】
さらに、本発明の核酸、ベクターまたは発現カセットを含む宿主細胞、安定な細胞系、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物も提供する。
さらにもう１つの実施態様においては、上記本発明の核酸にハイブリッド化し得るヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプローブも提供する。
また、本発明の蛍光たんぱく質および該たんぱく質をコード化する核酸を使用する方法も提供する。
好ましい実施態様においては、生物学的分子の標識化方法を提供し、該方法は、当該生物学的分子を本発明のたんぱく質にカップリングさせることを含む。
もう１つの好ましい実施態様においては、細胞の標識化方法も提供し、該方法は、本発明のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む。
もう１つの好ましい実施態様においては、細胞オルガネラの標識化方法も提供し、該方法は、適切な非細胞性局在化シグナルに融合させた本発明のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む。
さらにもう１つの好ましい実施態様においては、生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法を提供し、該方法は、本発明のたんぱく質からの蛍光シグナルを検出することを含む。
さらにもう１つの好ましい実施態様においては、生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法を提供し、該方法は、本発明の核酸分子を細胞中に発現させることを含む。
さらに、本発明の核酸、該核酸を導入したベクターもしくは発現カセット、または本発明のたんぱく質を含むキットも提供する。
【０００９】
上記で要約したように、本発明は、蛍光たんぱく質並びにその変形体、変異体および誘導体をコード化する核酸分子、並びにこれらの核酸によってコード化されたたんぱく質およびペプチドに関する。上記興味ある核酸分子およびたんぱく質は、カイアシ類種から分離する。興味あるたんぱく質としては、緑色蛍光たんぱく質であるppluGFP1 (SEQ ID NO：2)、ppluGFP2 (即ち、CopGFP、SEQ ID NO：4)、laesGFP (SEQ ID NO：6)、pmeaGFP1 (SEQ ID NO：8)、pmeaGFP2 (SEQ ID NO：10)、pdae1GFP (SEQ ID NO：16)、pmedGFP1 (SEQ ID NO：12)およびpmedGFP2 (SEQ ID NO：14)がある。また、上述の特定のたんぱく質と実質的に同様なたんぱく質、またはその誘導体、ホモログもしくは変異体も興味がある。また、上記核酸のフラグメントおよび上記核酸によってコード化されたペプチド、並びに本発明のたんぱく質およびペプチドに対して特異的な抗体も提供する。さらに、上述の核酸分子を含む宿主細胞、安定な細胞系およびトランスジェニック生物体も提供する。上記本発明のたんぱく質および核酸の組成物は、種々の異なる用途および方法、とりわけたんぱく質標識化用途における使用を見出している。最後に、そのような方法および用途において使用するキットも提供する。
【００１０】
核酸分子
本発明は、カイアシ類由来の蛍光たんぱく質、これらたんぱく質の誘導体、変異体およびホモログ、並びにこれらのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。本発明において使用する核酸分子は、ゲノムDNA分子もしくはcDNA分子のようなDNA分子、またはmRNA分子のようなRAM分子である。とりわけ、上記核酸分子は、本発明のカイアシ類蛍光たんぱく質またはそのフラグメントをコード化し、適切な条件下において、本発明に従う蛍光たんぱく質またはたんぱく質フラグメント(ペプチド)として発現し得るオープンリーディングフレームを有するcDNA分子である。また、本発明は、本発明のたんぱく質またはたんぱく質フラグメントをコード化する核酸と相同性であり、実質的に同様であり、同一であり、それら核酸から誘導されたまたはそれら核酸の擬態物である核酸にも及ぶ。本発明の核酸は、その天然環境以外の環境において存在する；例えば、これらの核酸は、分離され、濃縮量で存在し、或いは生体外またはその天然産環境以外の細胞もしくは生物体中に存在するまたは発現させる。
興味ある特定の核酸分子は、節足動物門から、好ましくは甲殻類亜門から、より好ましくはアゴアシ綱から、より好ましくはコペポーダ亜綱から、より好ましくはカラヌス(Calanoida)目、さらにより好ましくはポンテラ(Pontellidae)科からの生物体から分離される。
興味ある特定の核酸分子としては、下記のカイアシ類緑色蛍光たんぱく質類(およびそれらのホモログ/誘導体/変異体類)をコード化する核酸分子がある：ppluGFP1、ポンテリナ プルマタ(Pontellina plumata)由来のppluGFP2たんぱく質、ラビドセラ エスチバ(Labidocera aestiva)由来のlaesGFP、ポンテラ メアジ ホイーラー(Pontella meadi Wheeler)由来のpmeaGFP1およびpmeaGFP2、ポンテラ メジテラニア(Pontella mediterranea)由来のpmedGFP1およびpmedGFP2、および未同定ポンテラ種由来のpdae1GFPがある。これら興味ある特定のタイプの核酸分子の各々については、下記の実験の部においてより詳細に説明する。下記の実験の部においてより詳細に説明するCopCFP、CopGFP-NA1〜3のようなこれらたんぱく質のホモログ/誘導体/変異体類も、とりわけ興味のあるものである。これらのたんぱく質における推定野生タイプcDNAコード配列は、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15に示されている。
【００１１】
また、上述の核酸分子のホモログ類も興味がある。相同性核酸源は、任意の植物または動物種であり得、核酸擬態物を含むその配列は、全体的にまたは部分的に合成し得る。ある実施態様においては、本発明の核酸は、少なくとも約40％、好ましくは約50％、55％、60％、65％、70％またはそれ以上(75％、80％、85％、90％および95％またはそれ以上のような)のヌクレオチドまたはアミノ酸レベルにおいて、相応するホモログ類と同一の配列を有する。参照配列は、普通少なくとも約30個のヌクレオチド長、より普通には少なくとも約60個のヌクレオチド長であり得、比較する完全配列まで及び得る。配列類似性は、参照配列に基づいて算出する。配列解析のためのアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990)に記載されているBLASTのように、当該技術において公知である(例えば、デフォルト設定、即ち、パラメーター W=4およびT=17を使用して)。
ホモログ類は、多くの方法のいずれかの方法によって同定する。本発明のcDNAフラグメントを、ターゲット生物体からのcDNAライブラリーに対するハイブリッド化プローブとして、低緊縮条件を使用することによって使用し得る。上記プローブは、大きいフラグメントまたは1以上の短い縮退プライマーであり得る。配列類似性を有する核酸は、低緊縮条件下での、例えば、50℃および6×SSC (0.9M 塩化ナトリウム/0.9M クエン酸ナトリウム)でのハイブリッド化およびその後の1×SSC (150mM 塩化ナトリウム/15mM クエン酸ナトリウム)で55℃の洗浄によって検出する。配列同一性は、高緊縮条件下での、例えば、50℃以上および0.1×SSC (15mM 塩化ナトリウム/1.5mM クエン酸ナトリウム)でのハイブリッド化により判定し得る。与えられた配列と実質的同一の領域を有する核酸、例えば、対立遺伝子変異体、当該核酸の遺伝子的改変種等は、高緊縮ハイブリッド化条件下において与えられた配列に結合する。プローブ類、とりわけDNA配列の標識化プローブを使用することにより、相同性のまたは関連する遺伝子を分離することができる。
【００１２】
また、上述の核酸に、緊縮条件下、好ましくは高緊縮条件下でハイブリッド化する核酸(即ち、前述の核酸の補体)も提供する。緊縮条件の例は、50℃以上および0.1×SSC (15mM 塩化ナトリウム/1.5mM クエン酸ナトリウム)でのハイブリッド化である。高緊縮ハイブリッド化条件のもう１つの例は、50％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸デストラン(destran)および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAの溶液中42℃での１夜インキュベーション、およびその後の0.1×SSC中約65℃での洗浄である。他の高緊縮ハイブリッド化条件は、当該技術において公知であり、これらも本発明の核酸を同定するのに使用し得る。
また、本発明のたんぱく質の変形体、変異体または誘導体をコード化する核酸も提供する。変異体または誘導体は、上述の核酸から選ばれたテンプレート核酸上に、該テンプレート配列中で1個以上のヌクレオチドを修飾し、欠落させまたは付加させ或いはこれらを組合せて、該テンプレート核酸の変形体を生成させることによって、生成させ得る。修飾、付加または欠落は、変異性PCR、シュフリング(shuffling)、オリゴヌクレオチド特異性変異誘発、集合PCR、雌雄PCR変異誘発、生体内変異誘発、カセット変異誘発、反復アンサンブル変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)、指数アンサンブル変異誘発、部位特異性変異誘発、ランダム変異誘発、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和変異誘発(GSSM)、合成ライゲーション再構築(SLR)またはこれらの組合せのような当該技術において公知の任意の方法よって導入し得る(例えば、Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22；Barany, Gene (1985) 37: 111-123；および、Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108)を参照されたい)。また、修飾、付加または欠落は、組換え、反復配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異誘発、ウラシル含有テンプレート変異誘発、ギャップド二本鎖変異誘発、ポイントミスマッチ修復変異誘発、修復欠損宿主株変異誘発、化学変異誘発、放射能変異誘発、欠落変異誘発、制限-選択変異誘発、制限-精製変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル変異誘発、キメラ核酸多重体形成およびこれらの組合せを含む方法によっても導入し得る。幾つかの実施態様においては、変異体または誘導核酸によってコード化された蛍光たんぱく質は、野生タイプの蛍光たんぱく質と同じ蛍光または生化学特性を有している。他の実施態様においては、変異体または誘導核酸は、下記で変異体CopCFP、CopGFP-NA1〜３についてより詳細に説明しているように、改変された特性を有する蛍光たんぱく質をコード化している。
【００１３】
さらに、本発明のたんぱく質をコード化する核酸の縮退変異体も提供する。核酸の縮退変異体は、核酸のコドンの同じアミノ酸をコード化している他のコドンによる置換を含む。とりわけ、核酸の縮退変異体は、宿主細胞中でのその発現を増大させるように生成させる。この実施態様においては、宿主細胞の遺伝子内の好ましくないまたはあまり好ましくない核酸のコドンを、宿主細胞の遺伝子内のコード配列中に過発現しているコドンにより置換し、この置換コドンが同じアミノ酸をコード化する。本発明の核酸のヒト化形は、といわけ興味を有する。本明細書において使用するとき、用語“ヒト化”とは、哺乳動物(ヒト)細胞中でのたんぱく質の発現に対してコドンを最適化するように核酸配列になされた変更を称する(Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593)。また、たんぱく質類のヒト化を記載している米国特許第5,795,737号も参照されたい、該米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。興味ある縮退変異体の例は、下記の実験の部においてもっと詳細に説明する。
本明細書において使用するときの用語“cDNA”とは、天然成熟mRNA種中に見出される配列要素の配列を占める核酸を含むものとし、配列要素はエクソン並びに5'および3'非コード領域である。通常、mRNA種は隣接エクソンを有し、介入イントロンは、存在する場合、核RNA開裂により除去され、上記たんぱく質をコード化する連続オープンリーディングフレームを生成する。
興味あるゲノム配列は、天然染色体中に通常存在するイントロンの全てを含む、列挙した配列に定義されているような開始コドンと停止コドンとの間に存在する核酸を含み得る。興味あるゲノム配列は、成熟mRNA中に見出される5'および3'非翻訳領域、並びに転写領域の5'および3'末端のいずれかでの約1kb(それ以上であり得る)のフランキングゲノムDNAのようなプロモーター、エンハンサー等のような特定の転写および翻訳調節配列をさらに含み得る。
【００１４】
本発明の核酸分子は、本発明のたんぱく質の全てまたは１部をコード化し得る。二本鎖または一本鎖フラグメントは、オリゴヌクレオチドを、通常の方法に従い、制限酵素消化、PCR増幅等により化学合成することによって、上記DNA配列から得ることができる。殆どの部分において、DNAフラグメントは、長さにおいて少なくとも約15個のヌクレオチド、通常は長さにおいて少なくとも約18個のヌクレオチドまたは長さにおいて約25個のヌクレオチドであろうし、長さにおいて少なくとも約50個のヌクレオチドであり得る。幾つかの実施態様においては、上記本発明のヌクレオチド酸分子は、長さにおいて約100個、約200個、約300個、約400個、約500個、約600個、約700個のヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。本発明の核酸は、本発明のたんぱく質のフラグメントまたは全長たんぱく質をコード化し得る；例えば、本発明の核酸は、約25個のアミノ酸、約50個、約75個、約100個、約125個、約150個、約200個のアミノ酸のポリペプチドから全長たんぱく質までをコード化し得る。
本発明の核酸は、実質的に精製形で分離し得ることができる。実質的に精製形とは、当該核酸が少なくとも約50％純粋、通常は少なくとも約90％純粋であり、典型的に“組換え体”であること、即ち、その天然宿主生物体中の天然産生染色体上に通常結合していない1個以上のヌクレオチドによってフランキングされていることを意味する。
例えば、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27の配列を有する本発明の核酸、相応するcDNA、全長遺伝子および構築物は、当業者にとって公知の多くの種々のプロトコールにより合成的に生成させ得る。適切な核酸構築物は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されているような標準の組換えDNA技術を使用し、例えば、United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Researchに記載されている調節下に精製し得る。
【００１５】
また、下記でより詳細に説明する本発明のたんぱく質またはそのフラグメントを含む融合たんぱく質をコード化する核酸も提供する。
また、本発明の核酸を含むベクターおよび他の核酸構築物も提供する。適切なベクターとしては、ウイルスおよび非ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ等、好ましくはベクターがあり、適切な宿主中での本発明の核酸配列のクローニング、増幅、発現、伝達等において使用する。適切なベクターの選択については当業者が精通していることであり、多くのそのようなベクターは、商業的に入手可能である。構築物を製造するためには、部分長または全長核酸を、ベクター中に、典型的にはベクター内の開裂制限酵素部位へのDNAリガーゼ結合によって挿入する。また、所望のヌクレオチド配列を、生体内相同性組換えにより、典型的にはベクターに対し相同性の領域を所望ヌクレオチド配列の側面上に結合させることによっても挿入させ得る。相同性の領域は、オリゴヌクレオチドのライゲーションにより、或いは、例えば、相同性の領域と所望のヌクレオチド配列部分の双方を含むプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により付加させる。
本発明の色原体もしくは蛍光たんぱく質またはその融合たんぱく質の製造において或いは本発明の核酸分子の複製においてとりわけ使用する発現カセットまたは発現系も提供する。発現カセットは、染色体外要素として存在し得、或いは細胞のゲノム中に、上記発現カセットの細胞中への導入の結果として、組込み得る。発現においては、本発明の核酸によってコード化された遺伝子産生物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両性類または哺乳動物系のような任意の好都合な発現系中で発現させる。発現ベクターにおいては、本発明の核酸を、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、レプレッサーおよびインジューサーを含み得る調節配列に作動可能に結合させる。所望産生物を発現し得る発現カセットまたは系の製造方法は、当業者にとって公知である。
本発明のたんぱく質を安定的に発現する細胞系は、当該技術において公知の方法によって選択し得る(例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ヒグロマイシンのような選択性マーカーと一緒の同時移入は、ゲノム中に組み込んだ遺伝子を含有する移入細胞の同定および分離を可能にする)。
【００１６】
上記の所望発現系は、原核生物または真核生物宿主において使用し得る。大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、サッカロミセス セレヴィシエ(S. cerevisiae)、バキュロウイルスベクターと組合せた昆虫細胞、または脊柱動物のような高級生物体の細胞、例えば、COS 7細胞、HEK 293、CHO、アフリカツメガエル卵母細胞等のような宿主細胞を上記たんぱく質の産生において使用し得る。
上述の宿主細胞のいずれかまたは他の適切な宿主細胞もしくは生物体を使用して本発明の核酸を複製および/または発現させた場合、得られる複製核酸、発現たんぱく質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物体の産生物として、本発明の範囲に属する。産生物は、当該技術において公知の適切な手段によって回収し得る。
また、本発明のゲノム配列のプロモーター配列も興味があり、例えば、その5'フランキング領域の配列を、本発明のたんぱく質遺伝子を発現させる細胞/組織中での発現の調節を行うエンハンサー結合部位のようなプロモーター要素において使用し得る。
また、PCR用のプライマー、ハイブリッド化スクリーニングプローブ等として有用である本発明の核酸の小さいDNAフラグメントも興味がある。より大きめのDNAフラグメントは、前述したようなコード化ポリペプチドの産生において有用である。しかしながら、幾何学的PCRのような幾何学的増幅反応における使用においては、対の小さいDNAフラグメント、即ち、プライマーを使用するであろう。プライマー配列の正確な組成は本発明において重要ではないが、殆どの用途において、プライマーは、、当該技術において知られているように、緊縮条件下で本発明の配列にハイブリッド化するであろう。少なくとも約50個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100個のヌクレオチドの増幅産生物を生成させ、完全配列の核酸にまで及び得る対のプライマーを選択するのが好ましい。プライマー配列選択のためのアルゴリズムは、一般に既知であり、市販のソフトウェアパッケージにおいて入手し得る。増幅プライマーは、DNAの相補ストランドにハイブリッド化し、互いに対して開始するであろう。
【００１７】
また、本発明の核酸分子は、生物学的試験標本における遺伝子の発現を同定するのにも使用し得る。ゲノムDNAまたはRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在について細胞を精査する方法は、当該技術において良好に確立されている。要するに、DNAまたはmRNAを細胞サンプルから分離する。mRNAは、逆転写酵素を使用して相補DNAストランドを形成させるRT-PCRにより、さらにその後の本発明のDNA配列に対して特異性のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅により、増幅させ得る。また、mRNAサンプルをゲル電気泳動により分離し、適切な支持体、例えば、ニトロセルロース、ナイロン等に移し、その後、プローブとしての本発明のDNAのフラグメントによって精査する。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、現場ハイブリッド化、および固形チップ上に配列させたDNAプローブへのハイブリッド化のような他の方法も使用し得る。本発明の配列にハイブリッド化するmRNAの検出は、サンプル中での遺伝子発現を指標し得る。
フランキングプロモーター領域およびコード領域を含む本発明の核酸は、当該技術において公知の種々の方法で変異させて、プロモーター強度の目標とする変化を発生させ、或いはコード化されたたんぱく質の配列またはコード化されたたんぱく質の蛍光特性を含むコード化されたたんぱく質の性質を変えることはできる。
【００１８】
たんぱく質
また、本発明によれば、全長たんぱく質を包含するカイアシ類蛍光たんぱく質、その誘導体および変異体、並びにその１部またはフラグメントも提供される。また、下記でより詳細に説明するような、天然産生たんぱく質の変形体(そのような変形体は、天然産たんぱく質と相同性であるかまたは実質的に類似している)、および天然産生たんぱく質の変異体も提供される。
多くの実施態様においては、本発明のたんぱく質は、約300nm〜700nm、通常約350nm〜550nm、より通常は約450nm〜550nm、多くの場合約470nm〜520nm、例えば、470〜500nmの吸光度最高値を有し、一方、本発明たんぱく質の発光スペクトルは、典型的には約400nm〜700nm、通常約450nm〜650nm、より通常は約480nm〜600nmの範囲であるが、多くの実施態様においては、この発光スペクトルは、約480〜550nm、例えば、490〜520nmまたは490〜510nmの範囲である。本発明のたんぱく質は、約25,000〜150,000、通常約45,000〜120,000、例えば、50,000〜100,000の範囲である最高吸光係数を一般に有する。本発明のたんぱく質は、典型的に約150〜300個のアミノ酸、通常約200〜300個のアミノ酸残基の長さ範囲であり、約15〜35kDa、通常約17.5〜32.5kDa範囲の分子量を一般に有する。
ある実施態様においては、本発明のたんぱく質は光輝性であり、光輝性とは、当該色素および蛍光たんぱく質を一般的な方法(例えば、目視スクリーニング、分光測定、分光蛍光分析、蛍光顕微鏡測定、FACS装置による等)によって検出し得ることを意味する。特定の蛍光たんぱく質の蛍光輝度は、最高吸光係数を乗じたその量子収率によって決定する。色素たんぱく質の輝度は、その最高吸光係数によって表し得る。
【００１９】
ある実施態様においては、本発明のたんぱく質は、宿主細胞内での発現後に急速に産生停止する。急速に産生停止(rapidly folding)とは、当該たんぱく質がその発色または蛍光性をもたらすその三次構造を短時間で達成することを意味する。これらの実施態様においては、上記たんぱく質は、一般に約3日を越えない、通常は約2日を越えない、より通常は約1日を越えない時間内で産生停止する。
興味ある特定のたんぱく質は、節足動物門から、好ましくは甲殻類亜門から、より好ましくはアゴアシ綱から、より好ましくはコペポーダ亜綱から、より好ましくはカラヌス目から、さらにより好ましくはポンテラ科からのフルオロたんぱく質(並びにそのホモログ、変異体および誘導体)である。
興味ある特定のたんぱく質としては、下記のカイアシ類緑色蛍光たんぱく質(およびそのホモログ/誘導体/変異体)がある：ppluGFP1、ポンテリナ プルマタ由来のppluGFP2たんぱく質、ラビドセラ エスチバ由来のlaesGFP、ポンテラ メアジ ホイーラー由来のpmeaGFP1およびpmeaGFP2、ポンテラ メジテラニア由来のpmedGFP1およびpmedGFP2、および未同定ポンテラ種由来のpdae1GFPがある。これら興味ある特定のたんぱく質の各々については、下記の実験の部においてより詳細に説明する。これらのたんぱく質における野生タイプのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16に示されている。下記の実験の部においてより詳細に説明するCopCFP、CopGFP-NA1、CopGFP-NA2、CopGFP-NA3のようなこれらたんぱく質のホモログ/誘導体/変異体類も、とりわけ興味のあるものである。
【００２０】
ホモログ類、即ち、本発明の前記で提示した特定のアミノ酸配列、即ち、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28から配列において変化するたんぱく質類も提供する。ホモログとは、D.G. Higgins and P.M. Sharp, “Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer,” CABIOS, 5 pp. 151-3 (1989)に記載されているようなMegAlign, DNAstar clustalアルゴリズムを使用して測定したときに(パラメーター ktuple 1、ギャップペナルティー 3、ウィンドウ 5およびセーブ対角線 5を使用して)、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28のアミノ酸配列に対し少なくとも約50％、通常少なくとも約55％、より通常は少なくとも約60％のアミノ酸配列同一性を有するたんぱく質を意味する。多くの実施態様において、興味あるホモログ類は、とりわけ上記たんぱく質の官能性領域を提供するアミノ酸配列に対してはるかに高い、例えば、70％、75％、80％、85％、90％(例えば、92％、93％、94％)またはそれ以上の、例えば、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％の配列同一性を有する。
また、野生タイプのたんぱく質と実質的に同一であるたんぱく質も提供し、実質的同一とは、当該たんぱく質が少なくとも約60％、通常少なくとも約65％、より通常は少なくとも70％の野生タイプたんぱく質の配列に対するアミノ酸配列同一性を有することを意味し、ある場合には、その同一性は、はるかに高く、例えば、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上であり得る。
また、上述の天然産生性たんぱく質の誘導体または変異体であるたんぱく質も提供する。変異体および誘導体類は、野生タイプ(例えば、天然産生)たんぱく質の生物学的特性を保持し得、或いは野生タイプたんぱく質と異なる生物学的特性を有し得る。本発明のたんぱく質の“生物学的特性”なる用語は、限定するものではないが、吸光度最高値、発光最高値、最高吸光係数、輝度 (例えば、野生タイプたんぱく質、またはオワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱく質(GFP)のような他の参照たんぱく質と比較して)等のようなスペクトル特性；生体内および/または生体外安定性(例えば、半減期)のような生化学特性；成熟速度、凝集性向およびオリゴマー化性向；並びに他のそのような特性を称する。変異には、1個のアミノ酸交換、１個以上のアミノ酸の欠落または挿入、N-末端切り取りまたは延長、C-末端切り取りまたは延長等がある。
【００２１】
変異体および誘導体は、上記の“核酸分子”の章で詳細に説明したような標準の分子生物学的方法を使用して生成させ得る。数種の変異体を本明細書において説明する。実施例に提示した手引きを考慮し、標準方法を使用するならば、当業者であれば、広範囲のさらなる変異体を生成させ、生物学的(例えば、生化学、スペクトル等の)特性が改変されたかどうかを試験することは容易になし得る。例えば、蛍光強度は、種々の励起波長において分光測定計を使用して測定し得る。
また、誘導体は、RNAエディテイング、化学修飾、翻訳後および転写後修飾等を含む標準方法を使用しても生成させ得る。例えば、誘導体は、修正リン酸化、グリコシル化、アセチル化、脂質化のような方法によりまたは種々のタイプの成熟開裂等により生成させ得る。
天然産生たんぱく質である本発明のたんぱく質は、非天然産生環境において存在し、例えば、それらたんぱく質の天然産生環境から分離する。例えば、精製たんぱく質が提供され、“精製”とは、当該たんぱく質が興味ある非色原性または蛍光たんぱく質を実質的に含まない混合物中に存在することを意味し、“実質的に含まない”とは、混合物含有分の90％未満、通常60％未満、より通常は50％未満が非色原性または蛍光たんぱく質またはその変異体であることを意味する。また、本発明のたんぱく質は、分離形でも存在し得、分離形とは、当該たんぱく質が他のたんぱく質およびそのオリゴ糖、核酸およびフラグメント等のような他の天然産生生物学的分子を実質的に含まないことを意味し、この場合の用語“実質的に含まない”とは、分離たんぱく質を含有する組成物の70％未満、通常60％未満、より通常は50％未満がある種の他の天然産生生物学的分子であることを意味する。ある実施態様においては、上記たんぱく質は実質的に精製形で存在し、“実質的に精製形”とは、少なくとも95％、通常少なくとも97％、より通常は少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００２２】
また、天然産生たんぱく質並びに上述したたんぱく質の変異体および誘導体のフラグメントも提供する。生物学的に活性なフラグメントおよび/または官能性ドメインに相当するフラグメント等は、とりわけ興味のあるものである。興味あるフラグメントは、典型的には長さにおいて少なくとも約30個のアミノ酸、通常長さにおいて少なくとも約50個のアミノ酸、好ましくは長さにおいて少なくとも約75個または100個のアミノ酸であり、長さにおいて300個のアミノ酸ほどの長いまたはそれ以上であり得るが、通常は長さにおいて約250個のアミノ酸を越えないポリペプチドであり、該フラグメントは、長さにおいて、本発明のたんぱく質の少なくとも約25個のアミノ酸、通常は少なくとも約45個のアミノ酸、多くの実施態様においては少なくとも50個のアミノ酸と同一であるアミノ酸ストレッチを有するであろう。幾つかの実施態様においては、本発明のポリペプチドは、長さにおいて、約25個のアミノ酸、約50個、約75個、約100個、約125個、約150個、約200個または約250個のアミノ酸から上記たんぱく質の全長までである。幾つかの実施態様においては、たんぱく質フラグメントは、野生タイプのたんぱく質の特異的性質の全てまたは実質的に全てを保持している。
本発明のたんぱく質およびポリペプチドは、天然産生源から取得し得、或いは合成的に生成させ得る。例えば、野生タイプのたんぱく質は、上記たんぱく質を発現する生物学的源、例えば、前記した特定の種のようなカイアシ種に由来し得る。また、本発明のたんぱく質は、合成手段により、例えば、興味あるたんぱく質をコード化する組換え核酸コード配列を、適切な宿主中で、前述するようにして発現させることによっても誘導し得る。任意の好都合なたんぱく質精製手法を使用し得、適切なたんぱく質精製方法論は、Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990)に記載されている。例えば、溶解物を起原源から調製し、HPLC、除外クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等を使用して精製する。
【００２３】
また、例えば、分解配列、非細胞性局在化配列(例えば、核局在化シグナル、ペルオキシマル(peroximal)ターゲッティングシグナル、ゴルジ装置ターゲッティング配列、ミトコンドリアターゲッティング配列等)、シグナルペプチド、または興味ある任意のたんぱく質もしくはポリペプチドに融合させた本発明のたんぱく質またはそのフラグメントを含む融合たんぱく質も提供する。融合たんぱく質は、例えば、本発明の蛍光たんぱく質のポリペプチドと該蛍光たんぱく質のN-末端および/またはC-末端で枠内融合させた第２のポリペプチド(“融合パートナー”)とを含み得る。融合パートナーとしては、限定するものではないが、融合パートナーに対し特異的な抗体を結合し得るポリペプチド類(例えば、エピトープタグ類)、抗体またはその結合性フラグメント、触媒機能を与えるかまたは細胞応答を誘発させるポリペプチド類、リガンドもしくはレセプター類またはこれらの擬態物等がある。そのような融合たんぱく質においては、融合パートナーは、一般に、融合たんぱく質のフルオロ/色素たんぱく質部分と天然には結合してなく、典型的に、本発明のカイアシ類蛍光たんぱく質またはその誘導体/フラグメントではない；即ち、融合パートナーは、カイアシ種中で見出せない。
また、本発明の蛍光または色素たんぱく質に特異的に結合する抗体も提供する。適切な抗体は、当該技術において公知の方法を使用して産生させ得る。例えば、ポリクローナル抗体は、(Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載されているようにして得ることができ、モノクローナル抗体は、 (Goding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3rd edition, (1996) Academic Press) に記載されているようにして得ることができる。また、ヒト化抗体のようなキメラ抗体、並びに一本鎖抗体および抗体フラグメント、例えば、Fv、F(ab')2およびFabも興味がある。
【００２４】
形質転換体
本発明の核酸は、トランスジェニック生物体または細胞系内での部位特異性遺伝子修飾のような形質転換体を生成させるのに使用し得る。本発明のトランスジェニック細胞は、トランス遺伝子として存在する本発明に従う１種以上の核酸を含む。本発明の目的においては、原核(例えば、大腸菌、ストレプトミセス sp.、枯草菌、アシドフィルス菌(Lactobacillus acidophilus)等)または真核宿主細胞のような任意の適切な宿主細胞を使用し得る。本発明のトランスジェニック生物体は、細菌、シアノバクテリア、真菌、植物および動物のような原核または真核生物体であり得、生物体の１種以上の細胞が当該技術において周知の遺伝子組換え法によるようなヒトの介入によって導入された本発明の異質核酸を含有する。
本発明の分離された核酸は、当該技術において公知の方法、例えば、感染、移入、形質転換またはトランス接合によって宿主中に導入し得る。上記核酸分子(即ち、DNA)をそのような生物体に移送する方法は、広く知られており、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)のような文献に提示されている。
１つの実施態様においては、トランスジェニック生物体は、原核生物体であり得る。原核宿主の形質転換に関する方法は、当該技術において十分に立証されている(例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press；および Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Incを参照されたい)。
もう１つの実施態様においては、トランスジェニック生物体は、真菌、例えば、酵母であり得る。酵母は、異質遺伝子発現におけるビヒクルとして広汎に使用されている(例えば、Goodey et al Yeast biotechnology, D R Berry et al, eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp 401-429；および King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp 107-133を参照されたい)。維持のために宿主ゲノムによる組換えを必要とする組込みベクターおよび自己複製プラスミドベクターのような数タイプの酵母ベクターが入手可能である。
【００２５】
もう１つの宿主生物体は動物である。トランスジェニック動物は、当該技術において周知であり、Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press；Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory；Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association；Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000)のような文献に提示されている遺伝子導入方法によって得ることができる。例えば、トランスジェニック動物は、相同性組換えにより得ることができ、内生座が改変される。また、核酸構築物は、ゲノム中にランダムに組込む。安定な組込み用ベクターとしては、プラスミド類、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス類、YAC類等がある。
核酸は、細胞プレカーサー中への導入により、マイクロインジェクションによるような意図的な遺伝子操作により、或いは組換えウイルスまたは組換えウイルスベクター等による感染により、直接または間接的に細胞中に導入し得る。遺伝子操作なる用語は、古典的な交雑育種または生体外受精を含まないが、むしろ組換え核酸分子の導入に関する。この核酸分子は染色体内に組込んでもよく、或いは染色体外複製性DNAであってもよい。
相同性組換え用のDNA構築物は、本発明の核酸の少なくとも１部を含み、その遺伝子は、所望の遺伝子修飾(１以上)を有し且つターゲット座に対する相同性の領域を含む。ランダム組込み用のDNA構築物は、組換えを介在するための相同性の領域を含む必要はない。好都合なことに、正および負選択のためのマーカーを含ませ得る。相同性組換えによるターゲット遺伝子修飾を有する細胞の産生方法は、当該技術において公知である。哺乳動物細胞の種々の移入方法については、Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537を参照されたい。
【００２６】
胚幹(ES)細胞においては、ES細胞系を使用し得、或いは胚細胞を、マウス、ラット、モルモット等のような宿主から新鮮に得ることができる。そのような細胞は、適切な線維芽細胞供給体層上で増殖させるかまたは白血病抑制因子(LIF)の存在下に増殖させる。形質転換ESまたは胚細胞は、当該技術において記載されている適切な方法を使用して、トランスジェニック動物の生成に使用し得る。
トランスジェニック動物は、非ヒト動物(例えば、マウス、ラット)、鳥類または両性類等のような非ヒト動物であり得、機能性試験、薬物スクリーニング等において使用できる。トランスジェニック動物使用の代表的な例としては、下記に説明する例がある。
また、トランスジェニック植物も生成させ得る。トランスジェニック植物細胞および植物を調製する方法は、米国特許第5,767,367号；第5,750,870号；第5,739,409号；第5,689,049号；第5,689,045号；第5,674,731号；第5,656,466号；第5,633,155号；第5,629,470号；第5,595,896号；第5,576,198号；第5,538,879号；第5,484,956号に記載されており、これら米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。トランスジェニック植物を生成させる方法は、Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp. 275-295において、さらに Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) 719 pにおいても見受けられる。
例えば、体細胞を含む胚形成性外植片は、トランスジェニック宿主の調製において使用し得る。細胞または組織の収穫後、興味ある外来DNAを該植物細胞中に導入する；そのような導入においては、種々の異なる方法が利用可能である。分離されたプロトプラストにより、このプロトプラストの裸DNAと一緒のインキュベーションのようなDNA介在遺伝子伝達プロトコールによる導入(そのようなプラスミドは、多価カチオン(例えば、PEGまたはPLO)の存在下での興味ある外来コード配列を含む)；或いは、興味ある外来配列を含む裸DNAの存在下での上記プロトプラストのエレクトロポレーションの機会が生ずる。その後、外来DNAを成功裏に取込んだプロトプラストを選択し、カルス中に増殖させ、最終的には、適切な量と比率のオーキシン類およびサイトカイニン類のような刺激因子との接触により、トランスジェニック植物中に増殖させる。
当業者において利用し得る“遺伝子銃”法またはアグロバクテリウム介在形質転換のような他の適切な植物産生方法も使用し得る。
【００２７】
使用方法
本発明の蛍光たんぱく質(並びに前述した本発明の他の成分)は、種々の異なる用途での使用を見出している。例えば、本発明の蛍光たんぱく質は、生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの標識化、分析または検出方法において使用し得る。これらのタイプのたんぱく質の各々についての代表的な使用を以下に説明するが、以下で説明する使用は、単なる例示であって、如何なる形でも、本発明のたんぱく質の使用を説明した使用に限定することを意味しない。
生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの標識化方法に関する好ましい実施態様においては、本発明のたんぱく質は、細胞および分子の生物学的アッセイにおける生体内ラベル(またはレポーター分子)としての使用を見出している。興味あるアッセイとしては、限定するものではないが、遺伝子発現、たんぱく質局在化および同時局在化、たんぱく質-たんぱく質相互作用、たんぱく質-核酸相互作用、核酸-核酸相互作用、細胞および細胞オルガネラの局在化および相互作用等についてのアッセイがある。本発明の蛍光たんぱく質は、生存および固定細胞中での生体分子ラベルまたは細胞オルガネララベルとして、細胞またはオルガネラ融合中のマーカーとして、細胞またはオルガネラの完全性マーカーとして、移入マーカーとして(例えば、少なくとも１種の本発明の蛍光たんぱく質をコード化する発現ベクターを含有する移入細胞選択のためのラベルとして)、近生理学的濃度で作動するリアルタイムプローブとして等の用途を見出している。
【００２８】
さらにまた、本発明のたんぱく質は、生物学的分子の分析方法においても使用し得る。例えば、本発明のたんぱく質は、生物学的物質中での興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現の同定および/または測定においての使用を見出している。この方法は、i) 細胞中に、本発明に従う蛍光たんぱく質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子(該核酸分子は、上記興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現を調節する発現制御配列と作動可能に結合されて、その制御下にある)を導入し；ii) 上記核酸を適切な条件下で発現させ；そして、iii)上記興味あるたんぱく質発現を測定する手段として上記蛍光たんぱく質の蛍光発光量を検出することを含む。
とりわけ、本発明のたんぱく質は、生物学的物質中での興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現および/または局在化の同定および/または測定においての使用を見出している。この方法は、i) 細胞中に、本発明に従う蛍光たんぱく質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子(該核酸分子は、興味あるたんぱく質またはポリペプチドをコード化する配列と融合させており、上記興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現を調節する発現制御配列と作動可能に結合されて、その制御下にある)を導入し；ii) 上記細胞を、上記興味あるたんぱく質の発現に適する条件下で培養し；そして、iii)上記興味あるたんぱく質の発現/局在化を測定する手段として上記蛍光たんぱく質の蛍光発光量を検出することを含む。
【００２９】
興味ある用途としては、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法における本発明のたんぱく質の使用がある。これらの方法においては、本発明のたんぱく質は、第２の蛍光たんぱく質または染料、例えば、Matz et al., Nature Biotechnology 17:969-973 (1999)に記載されているような蛍光たんぱく質；例えば、米国特許第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号に記載されているようなオワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱく質の赤色移行変異体(これらの米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる)；クマリンおよびその誘導体、7-アミノ-4-メチルクマリンおよびアミノクマリンのような他の蛍光染料；ボディピー(bodipy)染料；カスケードブルー；フルオレセインイソチオシアネートおよびオレゴングリーンのようなフルオレセインおよびその誘導体；テキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン類およびエリトロシン類のようなローダミン染料；Cy3およびCy5のようなシアニン染料；クワンタム(quantum)染料のようなレンタニンド(lenthaninde)イオンの大環状キレート類；並びに米国特許第5,843,746号；第5,700,673号；第5,674,713号；第5,618,722号；第5,418,155号；第5,330,906号；第5,229,285号；第5,221,623号；第5,182,202号に記載されているもののような、ルシフェラーゼ類のような化学発光染料(これらの米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる)と一緒に、供与体および/または受容体として作動する。
本発明の蛍光たんぱく質を使用するFRETアッセイを使用し得る特定の例としては、限定するものではないが、ペプチドまたはたんぱく質が本発明の蛍光たんぱく質を含むFRET蛍光混合物と共有結合し、該結合ペプチドまたはたんぱく質が、例えば、カスパーゼ介在開裂におけるプロテアーゼ特異性基質、PKA調節ドメイン(cAMPセンサー)のような、FRETを増大または低下させるシグナルを受けるときに立体配座変化を受けるペプチド、リン酸化部位(例えば、リン酸化部位は当該ペプチド中に存在し、又は当該ペプチドは他のたんぱく質のリン酸化/脱リン酸化ドメインに対して結合特異性を有する)であり、或いは上記ペプチドがCa2+結合ドメインを有する場合のような、多くの種々の事象のバイオセンサーとして、哺乳動物2-ハイブリッド系、転写因子二量体化、膜たんぱく質多量体化、多たんぱく質複合体形成におけるようなたんぱく質-たんぱく質相互作用の検出がある。さらに、本発明のたんぱく質が使用を見出している蛍光共鳴エネルギー移動即ちFRET用途としては、限定するものではないが、米国特許第6,008,373号；第5,998,146号；第5,981,200号；第5,945,526号；第5,945,283号；第5,911,952号；第5,869,255号；第5,866,336号；第5,863,727号；5,728,528号；第5,707,804号；第5,688,648号、第5,439,797号に記載されている用途がある；これらの米国特許は、参考として本明細書に合体させる。
【００３０】
本発明の蛍光たんぱく質は、細胞中での１種以上の興味あるたんぱく質の発現および/または転座の調節に対する試験物質の効果の検出方法における使用を見出している。または、本発明の蛍光たんぱく質は、興味あるたんぱく質の発現および発現制御配列の試験物質に応答しての同時活性の検出方法における使用も見出している。上記蛍光たんぱく質は、細胞中での２種以上の発現制御配列の試験物質に応答しての活性を比較する方法における使用も見出している。そのような方法は、プロセスにおける効果を測定すべき試験物質の存在下または不存在下において実施し得る。
また、本発明の蛍光たんぱく質は、蛍光指示基を発現する細胞アレーの顕微鏡画像形成および電子分析による自動化スクリーニングに関連する用途における使用も見出している。スクリーニングは薬物発見においてまた機能性ゲノムの分野において使用し得、本発明のたんぱく質は、例えば、内皮細胞による多細胞細管の形成(血管形成)、Fluoroblok Insertシステム(Becton Dickinson社)による細胞移動、創傷治癒または神経突起伸張における多細胞再組織化および移動の変化を検出する細胞全体のマーカーとして使用する。スクリーニングは、本発明のたんぱく質を、刺激時のキナーゼおよび転写因子転座のような、例えばシグナル形質導入における細胞活性についての指示薬として細胞内位置の変化を検出するペプチド(ターゲッティング配列のような)またはたんぱく質に融合させたマーカーとして使用する場合も、使用し得る。例としては、たんぱく質キナーゼC、たんぱく質キナーセA、転写因子NFkBおよびNFAT；サイクリンA，サイクリンB1およびサイクリンEのような細胞環状たんぱく質；開裂基質のその後の移動を伴うプロテアーゼ開裂；小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、核心、核小体、原形質膜、ヒストン類、エンドソーム、リソソームまたは微細管のような細胞内構造体用のマーカーを含むリン脂質がある。
【００３１】
また、本発明のたんぱく質は、局在化マーカーによる他の蛍光融合たんぱく質の同時局在化を検出する高容量スクリーニングにおいて、細胞内蛍光たんぱく質/ペプチドの移動の指示薬としてまたは単独のマーカーとしても使用し得る。本発明の蛍光たんぱく質が使用を見出している細胞アレーの自動化スクリーニングに関連する用途の例には、米国特許第5,989,835号；並びにWO 0017624号；WO 00/26408号；WO 00/17643号；およびWO 00/03246号がある；これら特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。
本発明の蛍光たんぱく質は、高処理量スクリーニングアッセイにおける使用も見出している。本発明の蛍光たんぱく質は、24時間よりも長い半減期を有する安定なたんぱく質である。また、薬物発見における転写レポーターとして使用し得る、短縮した半減期を有する本発明たんぱく質の不安定化形も提供される。例えば、本発明に従うたんぱく質は、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、マウスサイクリンB1破壊ボックスまたはユビキチン等由来のPEST配列のような、短めの半減期を有するたんぱく質から誘導された推定たんぱく質分解性シグナル配列と融合させ得る。不安定化たんぱく質およびこれを生成させるのに使用し得るベクターの説明については、例えば、米国特許第6,130,313号を参照されたい；該米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。シグナル形質導入経路におけるプロモーターは、例えば、AP1、NFAT、NFkB、Smad、STAT、p53、E2F、Rb、myc、CRE、ER、GRおよびTRE等のような薬物スクリーニングにおいて、本発明の蛍光たんぱく質の不安定化形を使用して検出し得る。
本発明のたんぱく質は、本発明のたんぱく質をPKCガンマCa結合ドメイン、PKCガンマDAG結合ドメイン、SH2ドメインまたはSH3ドメイン等のような特定のドメインに融合させることによって、第２のメッセンジャー検出体として使用し得る。
種々の異なる用途において同様に使用し得る本発明たんぱく質の分泌形は、分泌性リーディング配列を本発明のたんぱく質に融合させることによって調製し得る。
また、本発明のたんぱく質は、蛍光活性化細胞分別(FACS)用途における使用も見出している。そのような用途においては、本発明の蛍光たんぱく質を細胞集団をマークするラベルとして使用し、その後、得られた標識化細胞集団を、蛍光活性化細胞分別装置により、当該技術において公知のようにして分別する。FACS法は、米国特許第5,968,738号および第5,804,387号に記載されており、これらの米国特許の開示は参考として本明細書に合体させる。
【００３２】
また、本発明のたんぱく質は、トランスジェニック動物における生体内ラベルとしての使用も見出している。例えば、本発明のたんぱく質の発現は、組織特異性プロモーターによって誘導し得、そのような方法は、他の用途の中で、トランスジェニック発現の有効性を試験するような、遺伝子治療の研究における使用を見出している。そのような用途を例示するトランスジェニック動物における蛍光たんぱく質の代表的な用途は、WO 00/02997号において見出され、その開示は参考として本明細書に合体させる。
本発明のたんぱく質の更なる用途としては、細胞または動物中への注入後のマーカーとしておよび定量測定における較正において；細胞生存性モニタリング用の酸素バイオセンサー装置におけるマーカーまたはレポーターとして；動物類、ペット類、おもちゃ類、食品等のマーカーまたはラベルとしての使用がある。
また、本発明の蛍光たんぱく質は、プロテアーゼ開裂アッセイにおける使用も見出している。例えば、開裂不活化蛍光アッセイは本発明のたんぱく質を使用して展開し得、本発明のたんぱく質を、該たんぱく質の蛍光特性を破壊するすることなくプロテアーゼ特異性開裂配列を含むように操作する。活性化プロテアーゼによる蛍光たんぱく質の開裂時には、蛍光は、官能性発色団の破壊により鋭敏に減少するであろう。また、開裂活性化蛍光は、本発明のたんぱく質を使用するして展開し得、該たんぱく質を、発色団の近くまたはその内部で更なるスペーサー配列を含有するように操作する。この変異体は、官能性発色団の１部がスペーサーによって分割されるので、その蛍光活性を有意に低下させる。スペーサーは、２つの同一プロテアーゼ特異性開裂部位によって枠組みされる。活性化プロテアーゼによる開裂時に、スペーサーを切断し、蛍光たんぱく質の２つの残留“サブユニット”を再構築して官能性蛍光たんぱく質を生成し得るであろう。上記の用途の双方は、カスパーゼ等のような種々のタイプの異なるプロテアーゼについてのアッセイにおいて展開し得るであろう。
【００３３】
また、本発明のたんぱく質は、生物学的膜中のリン脂質組成を測定するアッセイにおいても使用し得る。例えば、特定のリン脂質に結合して生物学的膜中のリン脂質分布像の局在化/可視化を可能にし、また特定のリン脂質基盤(raft)中の膜たんぱく質の同時局在化も可能にする本発明たんぱく質の融合たんぱく質(または本発明たんぱく質の任意の他の種の共有または非共有修飾体)は、本発明のたんぱく質によって達成され得る。
また、本発明の蛍光たんぱく質は、Ca2+イオン指示薬；pH指示薬；リン酸化指示薬；またはマグネシウム、ナトリウム、カリウム、クロライドおよびハライドのような他のイオンの指示薬のような、原核および真核細胞におけるバイオセンサーとしての使用を見出している。また、蛍光たんぱく質のバイオセンサーとしての使用方法としては、米国特許第5,972,638号；第5,824,485号および第5,650,135号(並びに本明細書において引用した文献)に記載されている方法がある；これら米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。
前述した本発明の抗体も、本発明のたんぱく質の他の蛍光たんぱく質からの区別化のような多くの用途おける使用を見出している。
【００３４】
キット
また、本発明によれば、上述の用途の１つ以上を実施するのに使用するキットも提供される。好ましい実施態様においては、キットは、生物学的分子の標識化において使用し得る。キットは、本発明のそのままのたんぱく質、または本発明のたんぱく質をコード化する核酸を、好ましくは本発明のたんぱく質の発現のための要素、例えば、本発明のたんぱく質をコード化する核酸を含むベクターのような構築物と一緒に含む。また、本発明は、そのようなキット成分を製造する手段にも及ぶ。該手段としては、カイアシ類由来のcDNAおよび本発明の核酸を、例えば、PCRにより産生させるためのオリゴヌクレオチドプライマー対があり得、或いは、該手段としては、連結させたときに本発明の蛍光たんぱく質をコード化する核酸を産生し得る多くの核酸フラグメント等があり得る。キット成分は、典型的には適切な容器内の、緩衝液ような適切な保存媒質中に典型的に存在する。キット中には、提供されるたんぱく質に対し特異性の抗体も存在し得る。ある実施態様においては、キットは、各々が本発明のたんぱく質をコード化する複数の異なるベクターを含み、各ベクターは、異なる環境においておよび/または異なる条件下での発現、例えば、ベクターが哺乳動物細胞での発現のための強力プロモーターを含むかまたはプロモーターの通例挿入のための複数のクローニング部位を有する無プロモーターベクターである場合の構成的発現および調整発現など用に設計されている。
上記の各成分以外に、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための使用説明書をさらに含む。これらの使用説明書は、種々の形で本発明のキット中に存在し得、その形状の1つ以上がキット中に存在し得る。
【００３５】
以下の実施例は、例示のために提示し、限定のためではない。
実施例
実施例１
カイアシ種由来の蛍光たんぱく質cDNAのクローニング
明緑色蛍光を有する数種の小(約0.5〜1mm長)コペポーダ試験標本(節足動物門；甲殻類亜門；アゴアシ綱；コペポーダ亜綱；カラヌス目；ポンテラ科)を、プランクトンサンプルから選択した。
これらカイアシ類由来の蛍光たんぱく質について研究するために、大腸菌中の発現cDNAライブラリーのスクリーニングに基づく戦略を使用した。全RNAは、単一生物体から、NucleoSpin RNA IIキット(Clontech社)により分離した。増幅cDNAサンプルは、SMART cDNA増幅キット(Clontech社)を使用して調製し、PCR-Scriptベクター(Stratagene社)中にクローニングした。約5×104の組換えクローンを、蛍光立体顕微鏡を使用して目視スクリーニングした。結果として、数種の密接に関連した(63％よりも高い同一性、表１参照)新規なGFP様たんぱく質を同定した：ポンテリナ プルマタ由来のppluGFP1 (SEQ ID NO：1および2)およびppluGFP2 (SEQ ID NO：3および4)；ラビドセラ エスチバ由来のlaesGFP (SEQ ID NO：5および6)；ポンテラ メアジ ホイーラー由来のpmeaGFP1 (SEQ ID NO：7および8)およびpmeaGFP2 (SEQ ID NO：9および10)；ポンテラ メジテラニア由来のpmedGFP1 (SEQ ID NO：11および12)およびpmedGFP2 (SEQ ID NO：13および14)；および未同定カイアシ種由来のpdae1GFP (SEQ ID NO：15および16)。各カイアシ類GFPは、DsRedおよびオワンクラゲGFPそれぞれと約25％と18％のアミノ酸同一性を有していた(図１)。
【００３６】
表１：各カイアシ類GFP間のアミノ酸同一性レベル
【００３７】
実施例２
カイアシ類蛍光たんぱく質の特性決定
カイアシ類蛍光たんぱく質の配列をコードする核酸を、実施例１で説明したようにして取得し、pQE30発現ベクター(Qiagen社)中にクローニングして、組換えたんぱく質がそのN-末端で6個ヒスチジンのタグを含有するようにした。大腸菌中での発現後、たんぱく質を金属アフィニティー樹脂TALON (Clontech社)によって精製し、特性決定した。
全てのたんぱく質が、緑色蛍光を示し、それぞれ、482〜495および502〜507nmにおいて、類似するが同一ではない励起-発光スペクトルピークを有していた(図２〜８)。野生タイプオワンクラゲGFPとは対照的に、各新規なたんぱく質は、１つのみの吸光-励起ピークを有しており、これは、おそらく脱プロトン化発色団状態に相応している。
ppluGFP2をさらに詳細に精査した。精製ppluGFP2は、70,000 M-1cm-1のモル吸光係数と0.60の蛍光量子収率を有していた。モル吸光係数測定においては、成熟発色団濃度を評価した。たんぱく質を等容量の2M NaOHでアルカリ変性した。これらの条件下で、GFP様発色団は446 nmで吸光し、そのモル吸光係数は44,000 M-1cm-1である(Ward, W.W., Bioluminescence and Chemiluminescence (1981), Academic Press, 235-242)。未変性およびアルカリ変性ppluGFP2の吸収スペクトルを測定した。未変性状態のたんぱく質のモル吸光係数は、変性たんぱく質の吸収に基づき評価した。量子収率測定においては、ppluGFP2の蛍光を量子収率0.60を有する同等の吸収性のEGFP (Patterson, G., et al., J. Cell. Sci. (2001) 114:837-838)と比較した。
ゲル濾過試験の結果は、ppluGFP2は、ppluGFP2がEGFPと同じ移動性を示したことから、単量体たんぱく質であることを示唆していた。精製たんぱく質サンプル(約1 mg/ml)をSephadex-100カラム(0.7×60cm)上に負荷させ、50 mMリン酸緩衝液(pH7)と100 mM NaClとの溶液で溶出させた。EGFP、HcRed1およびDsRed2 (Clontech社)を、それぞれ、モノマー、ダイマーおよびテトラマー標準として使用した。
【００３８】
実施例３
ppluGFP2変異体および誘導体の調製
野生タイプppluGFP2核酸コード配列を実施例１に記載したようにして得た。哺乳動物細胞中での発現を増強するために、哺乳動物最適化コドン(SEQ ID NO：17および18)を使用して、ppluGFP2の“ヒト化”形を合成した。サッカロミセス セレヴィシエ中での発現を増強するために、ppluGFP2の酵母最適化形を、S. セレヴィシエ最適化コドン(SEQ ID NO：19および20)を使用して合成した。
ppluGFP2の“ヒト化”形を部位特異性変異誘発に供してたんぱく質のシアン光発光形を得た。置換基Y58Wを有するたんぱく質をコード化する変異体核酸を、更なるランダム変異誘発において使用し、たんぱく質の成熟速度および蛍光輝度を改善した。Diversity PCR Random Mutagenesisキット(CLONTECH社)を、1000 bp当り5〜6の変異に対して最適の条件下において使用した。変異体たんぱく質を発現している大腸菌コロニーを、蛍光立体顕微鏡 SZX-12 (Olympus社)により、目視スクリーニングした。最明色クローンCopCFPをさらに特性決定した。総体的に、この変異体は、3個の置換基：Y58W、H143R、I119Tを担持していた(SEQ ID NO：21および22)。このたんぱく質における励起-発光スペクトルは、それぞれ、417および477nmでのピークを有していた(図９)。
ppluGFP2は生体外溶液中および長時間細胞培養において単独で発現させたときの双方で凝集を形成する性向を示したので、抑制された凝集能力を有する延長形のたんぱく質を生成させた。ppluGFP2のヒト化形を非凝集性変異体産生用のテンプレートとして使用した。第１形(CopGFP-NA1、SEQ ID NO：23および24)は、K5E置換基(ナンバーリングは野生タイプに基づく)と、ppluGFP2バレルの外側界面上の正電荷をシールドして他のppluGFP2たんぱく質分子との電荷相互作用を阻止しているたんぱく質N-末端での延長負荷電アミノ酸尾部とを含有している。第２形(CopGFP-NA2、SEQ ID NO：25および26)は、C-末端で更なる尾部を含有している。第３形のCopGFP-NA3は、CopGFP-NA1およびCopGFP-NA2形に存在する全ての変化を含む(SEQ ID NO：27および28)。全ての形が生体内および生体外試験において凝集能力の低下を示している。
【００３９】
実施例４
ポリクローナル抗体調製
実施例１で説明したようにして調製したppluGFP2の核酸のコード領域をpQE30発現ベクター(Qiagen社)中にクローニングして、組換えたんぱく質がそのN-末端で6個ヒスチジンのタグを含有するようにした。大腸菌中での発現後、たんぱく質を金属アフィニティー樹脂TALON (Clontech社)によって変性条件下で精製した。ウサギを、完全フロイントアジュバント中に乳化させた組換えポリペプチドにより、免疫化し、月毎の間隔で4回ブースターした。各ブースターの10日または11日後に、動物を採血した。ポリクローナル抗血清を組換えたんぱく質上でELISAおよびウェスタンイムノブロッティングにより試験した。
【００４０】
実施例５
ppluGFP2を使用しての哺乳動物細胞標識化
真核細胞の蛍光標識化においては、実施例３において説明したようにして調製したppluGFP2のヒト化形をpEGFP-C1ベクター(CLONTECH社)中にAgeIとBglII制限部位との間でクローニングした(EGFPコード領域の代りに)。以下の細胞系を使用した：293Tヒト腎臓上皮細胞、3T3マウス胚線維芽細胞、L929ネズミ皮下線維芽細胞、Veroアフリカミドリザル腎臓上皮細胞およびCOS1アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞。各細胞を、LipofectAMINE試薬(Invitrogen社)を使用して移入し、移入後20時間で試験した。CCDカメラ(DP-50、Olympus社)を備えたOlympus CK40蛍光顕微鏡を使用して細胞画像を形成した。各種細胞系中でのppluGFP2の発現は、明緑色シグナルをもたらした。蛍光は、移入24時間後で明らかに検出可能であった。細胞毒性は、観察されなかった。
【００４１】
実施例６
ppluGFP2を使用してのたんぱく質標識化およびたんぱく質局在化分析
実施例３において説明したようにして調製したppluGFP2のヒト化形を、ヒト細胞質ベータ-アクチンおよびヒト核小体たんぱく質、フィブリラリン(fibrillarin)に融合させた。ppluGFP2タグ付け融合構築物を発現するプラスミドによる293Tヒト腎臓上皮細胞の移入は、相応する融合パートナーに特徴的なパターンを明白にした明色蛍光をもたらしていた。
【００４２】
実施例７
ppluGFP2を使用しての細胞オルガネラ標識化
実施例３において説明したようにして調製したppluGFP2のヒト化形を以下の非細胞性局在化シグナルに融合させた：ヒトシトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIII由来のミトコンドリアターゲッティング配列(MTS)；ヒトベータ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼのN-末端81個のアミノ酸をコード化する配列(GT; Watzele & Berger (1990) Nucleic Acids. Res. 18:7174)；ペルオキシマルターゲッティングシグナル1 (Gould et al., J. Biol. Chem. (1989) 108:1657-1664；Gould et al., EMBO J. (1990) 9:85-90；Monosov et al. J. Histo. Cytochem. (1996) 44:581-589)；そのC-末端で融合させたシミアン・ウイルス40ラージT-抗原の核局在化シグナル(NLS)の3種の複写体(Kalderon et al. Cell (1984) 39:499-509；Lanford et al. Cell (1986) 46:575-782)。
ppluGFP2タグ付け融合構築物を発現するプラスミドによる293Tヒト腎臓上皮細胞の移入は、宿主細胞の相応するオルガネラへの有効なたんぱく質転座をもたらした。蛍光は、移入24時間後、明らかに検出可能であった。
【００４３】
本明細書において引用した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願について参考として合体させるように特定的に且つ個々に指摘していたように、参考として本明細書に合体させる。いずれの刊行物の引用も本発明の背景と理解を提供するものであり、そのような刊行物のいずれもが従来技術であるという是認と解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】オワンクラゲGFPおよびDsRedを含む新規なカイアシ類蛍光たんぱく質の配列構造を示す。ナンバリングはGFPに基づく。導入ギャップはドットで示す。カイアシ類GFPをppluGFP1と比較している：これらの配列中、ppluGFP1中の相応するアミノ酸と同一の残基は、ダッシュで示している。
【図２】野生タイプのppluGFP１における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する(ppluGFP2は、本質的に同じスペクトルを有する)。
【図３】野生タイプのlaesGFPにおける励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図４】野生タイプのpmeaGFP1における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図５】野生タイプのpmeaGFP2における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図６】野生タイプのpmedGFP1における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図７】野生タイプのpmedGFP2における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図８】野生タイプのpdae1GFPにおける励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図９】CopCFPにおける励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、生物学および化学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、蛍光たんぱく質に関する。
【０００２】
発明の背景
興味あるたんぱく質、細胞または生物体の標識化は、多くの生化学、分子生物学および医療診断用途において卓越した役割を果たしている。放射性ラベル、色素ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベル等のような種々の異なるラベルが、種々の特性および最適の用途でもって、当該技術において開発され使用されている。しかしながら、新たなラベル類を開発する興味は、存続している。とりわけ興味があるのは、蛍光たんぱく質ラベルのような新しいたんぱく質ラベルの開発である。蛍光たんぱく質またはフルオロたんぱく質は、適切な励起波長の光で照射したときに低い、中程度のまたは強い蛍光を発するたんぱく質である。これらたんぱく質の蛍光特性は、当該たんぱく質の２個以上のアミノ酸残基の相互作用に起因し１個のアミノ酸残基には起因しない特性である。そのようなものとして、蛍光たんぱく質は、固有の蛍光体としてそれ自体で作用する残基、即ち、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンからのみ蛍光を発するたんぱく質を含まない。本明細書において使用するとき、用語“蛍光たんぱく質”は、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ類を含まない。
【０００３】
緑色蛍光たんぱく質(GFP)、その変異体およびアナログ類は、Lippincott-SchwartzおよびPattersonによりScience (2003) 300(5616):87-91に詳述されている生物医学サイエンスにおける生体内蛍光マーカーとしての集中的な使用により、今日では広く知られている。ヒドロクラゲ目オワンクラゲ科オワンクラゲ(hydromedusa Aequorea aequorea) (A. victoriaと同義)に由来するGFPは、J Cell Comp Physiol. (1962), 60:85-1-4においてJohnson等によって発見され、GFPが光たんぱく質エクオリンからの青色光を緑色光に転換する二次発光体の役割を奏するクラゲの生体発光系の１部として見出された。オワンクラゲGFPをコード化するcDNAは、Prasher等によってクローン化された(Gene (1992), 111(2):229-33)。結局は、この遺伝子は、GFPがそれ自体でフルオロフォアを形成する特異な能力基づき実際に異種構造的に発現した任意の生物体であり得ることが判明した(Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805)。この知見により、遺伝子的にコード化された蛍光ラベルとしての細胞生物学におけるGFPの使用についての広汎な展望が開かれている。
GFPは、遺伝子発現およびたんぱく質局在化の研究(Chalfe et al., Science 263 (1994), 802-805；および Heim et al., in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504)を含む広範囲の用途において、細胞内の非細胞性オルガネラ類の可視化(Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642)のための、さらには、分泌経路に沿うたんぱく質輸送の可視化(Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271)のための手段として応用された。
【０００４】
相当量の研究が、GFPの性質を改善するためさらには種々の研究目的において有用で且つ最適化されたGFP試薬を製造するためになされている。“ヒト化”GFP DNAのような新たな種類のGFPも開発されており、そのたんぱく質生成物は、哺乳動物細胞における合成を増大させている(Haas、 et al., Current Biology (1996), 6: 315-324；Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593)。１つのそのようなヒト化たんぱく質は、２個のアミノ酸置換基：F64LおよびS65Tを有するGFPの“増強緑色蛍光たんぱく質”(EGFP)突然変異体である(Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664)。GFPに対する他の突然変異は、青色-、シアン色-および黄緑色発光種をもたらしている。
しかしながら、GFPの多大な有用性にもかかわらず、GFPと同様なまたは異なる特性を有する他の蛍光たんぱく質も当該技術において有用であろう。とりわけ、新規な蛍光たんぱく質の利益としては、より大きな励起による新たなスペクトルおよびより良好な適合性に基づく蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の実現性がある。1999年において、GFPホモログ類が非生体発光性花虫類(Anthozoa)種からクローニングされた(Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973)。この発見により、これらのたんぱく質は生体発光機構の必要成分ではないことが実証された。花虫類由来GFP様たんぱく質は、シアン色、緑色、黄色、赤色蛍光たんぱく質および紫青色非蛍光色素たんぱく質(CP)を含む大きなスペクトル多様性を示していた(Matz et al., Bioessays (2002), 24(10): 953-959)。その後、GFPホモログ類のcDNAが、ヒトモシクラゲ(Aequorea macrodactyla) (GenBank受託番号AF435427〜AF435433)およびオワンクラゲ(Aequorea Coerulescens) (Gurskaya et al., Biochem J. (2003), 373(pt2): 403-408)のような数種のヒドロイドクラゲ(Hydroid medusae)からクローニングされた。これまでの、GFP研究40年の歴史は、２種類の刺胞類(Cnidaria)群：ヒドロ虫類および花虫類内のみのGFP様たんぱく質類を明らかにしているに過ぎない。
【０００５】
蛍光たんぱく質の分子生物学における手段としての有用性は、既知の蛍光たんぱく質に比較して異なる且つ改良された性質を有する他の蛍光たんぱく質についての研究を促している。即ち、本発明の目的は、限られた数の既知の蛍光たんぱく質においては現在のところ利用し得ない特性を示す新規な蛍光たんぱく質並びに既知のGFPの不利益を被らないこれら新規な蛍光たんぱく質をコード化するDNA類を提供することである。
【０００６】
発明の要約
本発明は、新規な蛍光たんぱく質をコード化する核酸分子、その変異体および誘導体を提供する。該核酸は、その非天然環境において分離され、合成され或いは存在し得る。
ある実施態様においては、本発明の核酸は、カイアシ(copepod)類 (節足動物(Arthropoda)門、甲殻類(Crustacea)亜門、アゴアシ(Maxillopoda)綱、コペポーダ(Copepoda)亜綱)またはその変異体もしくは誘導体から分離される。
ある実施態様においては、本発明の核酸は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28からなる群から選ばれたアミノ酸配列を有するたんぱく質をコード化する。ある実施態様においては、該核酸は、上記たんぱく質のホモログ、変異体、誘導体、擬態物またはフラグメントをコード化する。
ある実施態様においては、本発明の核酸は、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27からなる群から選ばれた、またはこれらと相同性の、実質的に同じ、または同一であるヌクレオチド配列を有する。遺伝子コードの縮退のため本発明の上記核酸配列と異なるまたは本発明の上記核酸配列にハイブリッド化している核酸配列も、本発明の範囲に属する。
【０００７】
もう１つの実施態様においては、本発明は、上記本発明の核酸によってコード化されたたんぱく質、または該たんぱく質に実質的に同じもしくはその相同物、誘導体もしくは変異体に関し、或いは本発明の上記たんぱく質を含む融合たんぱく質に関する。
また、本発明の核酸のフラグメントおよび本発明の核酸に緊縮条件下でハイブリッド化している核酸も提供する。
さらに他の実施態様においては、本発明の核酸を含むベクターを提供する。さらに、本発明は、本発明の核酸を含む発現カセットおよび所望の宿主細胞において上記核酸を発現するのに必要な調節要素を提供する。
さらにもう１つの実施態様においては、適切な宿主細胞においてたんぱく質を発現させ、その宿主細胞から該たんぱく質を分離することを含む、本発明の蛍光たんぱく質の産生方法を提供する。該方法は、(a) 適切な発現調節要素に作動可能に結合させた蛍光たんぱく質をコード化する本発明の核酸分子を調製し、(b) 該核酸分子から蛍光たんぱく質を発現させ、そして、(c)他のたんぱく質を実質的に含まない蛍光たんぱく質を分離することを含む。
さらに、本発明のたんぱく質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体も提供する。
【０００８】
さらに、本発明の核酸、ベクターまたは発現カセットを含む宿主細胞、安定な細胞系、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物も提供する。
さらにもう１つの実施態様においては、上記本発明の核酸にハイブリッド化し得るヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプローブも提供する。
また、本発明の蛍光たんぱく質および該たんぱく質をコード化する核酸を使用する方法も提供する。
好ましい実施態様においては、生物学的分子の標識化方法を提供し、該方法は、当該生物学的分子を本発明のたんぱく質にカップリングさせることを含む。
もう１つの好ましい実施態様においては、細胞の標識化方法も提供し、該方法は、本発明のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む。
もう１つの好ましい実施態様においては、細胞オルガネラの標識化方法も提供し、該方法は、適切な非細胞性局在化シグナルに融合させた本発明のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む。
さらにもう１つの好ましい実施態様においては、生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法を提供し、該方法は、本発明のたんぱく質からの蛍光シグナルを検出することを含む。
さらにもう１つの好ましい実施態様においては、生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法を提供し、該方法は、本発明の核酸分子を細胞中に発現させることを含む。
さらに、本発明の核酸、該核酸を導入したベクターもしくは発現カセット、または本発明のたんぱく質を含むキットも提供する。
【０００９】
上記で要約したように、本発明は、蛍光たんぱく質並びにその変形体、変異体および誘導体をコード化する核酸分子、並びにこれらの核酸によってコード化されたたんぱく質およびペプチドに関する。上記興味ある核酸分子およびたんぱく質は、カイアシ類種から分離する。興味あるたんぱく質としては、緑色蛍光たんぱく質であるppluGFP1 (SEQ ID NO：2)、ppluGFP2 (即ち、CopGFP、SEQ ID NO：4)、laesGFP (SEQ ID NO：6)、pmeaGFP1 (SEQ ID NO：8)、pmeaGFP2 (SEQ ID NO：10)、pdae1GFP (SEQ ID NO：16)、pmedGFP1 (SEQ ID NO：12)およびpmedGFP2 (SEQ ID NO：14)がある。また、上述の特定のたんぱく質と実質的に同様なたんぱく質、またはその誘導体、ホモログもしくは変異体も興味がある。また、上記核酸のフラグメントおよび上記核酸によってコード化されたペプチド、並びに本発明のたんぱく質およびペプチドに対して特異的な抗体も提供する。さらに、上述の核酸分子を含む宿主細胞、安定な細胞系およびトランスジェニック生物体も提供する。上記本発明のたんぱく質および核酸の組成物は、種々の異なる用途および方法、とりわけたんぱく質標識化用途における使用を見出している。最後に、そのような方法および用途において使用するキットも提供する。
【００１０】
核酸分子
本発明は、カイアシ類由来の蛍光たんぱく質、これらたんぱく質の誘導体、変異体およびホモログ、並びにこれらのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。本発明において使用する核酸分子は、ゲノムDNA分子もしくはcDNA分子のようなDNA分子、またはmRNA分子のようなRAM分子である。とりわけ、上記核酸分子は、本発明のカイアシ類蛍光たんぱく質またはそのフラグメントをコード化し、適切な条件下において、本発明に従う蛍光たんぱく質またはたんぱく質フラグメント(ペプチド)として発現し得るオープンリーディングフレームを有するcDNA分子である。また、本発明は、本発明のたんぱく質またはたんぱく質フラグメントをコード化する核酸と相同性であり、実質的に同様であり、同一であり、それら核酸から誘導されたまたはそれら核酸の擬態物である核酸にも及ぶ。本発明の核酸は、その天然環境以外の環境において存在する；例えば、これらの核酸は、分離され、濃縮量で存在し、或いは生体外またはその天然産環境以外の細胞もしくは生物体中に存在するまたは発現させる。
興味ある特定の核酸分子は、節足動物門から、好ましくは甲殻類亜門から、より好ましくはアゴアシ綱から、より好ましくはコペポーダ亜綱から、より好ましくはカラヌス(Calanoida)目、さらにより好ましくはポンテラ(Pontellidae)科からの生物体から分離される。
興味ある特定の核酸分子としては、下記のカイアシ類緑色蛍光たんぱく質類(およびそれらのホモログ/誘導体/変異体類)をコード化する核酸分子がある：ppluGFP1、ポンテリナ プルマタ(Pontellina plumata)由来のppluGFP2たんぱく質、ラビドセラ エスチバ(Labidocera aestiva)由来のlaesGFP、ポンテラ メアジ ホイーラー(Pontella meadi Wheeler)由来のpmeaGFP1およびpmeaGFP2、ポンテラ メジテラニア(Pontella mediterranea)由来のpmedGFP1およびpmedGFP2、および未同定ポンテラ種由来のpdae1GFPがある。これら興味ある特定のタイプの核酸分子の各々については、下記の実験の部においてより詳細に説明する。下記の実験の部においてより詳細に説明するCopCFP、CopGFP-NA1〜3のようなこれらたんぱく質のホモログ/誘導体/変異体類も、とりわけ興味のあるものである。これらのたんぱく質における推定野生タイプcDNAコード配列は、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15に示されている。
【００１１】
また、上述の核酸分子のホモログ類も興味がある。相同性核酸源は、任意の植物または動物種であり得、核酸擬態物を含むその配列は、全体的にまたは部分的に合成し得る。ある実施態様においては、本発明の核酸は、少なくとも約40％、好ましくは約50％、55％、60％、65％、70％またはそれ以上(75％、80％、85％、90％および95％またはそれ以上のような)のヌクレオチドまたはアミノ酸レベルにおいて、相応するホモログ類と同一の配列を有する。参照配列は、普通少なくとも約30個のヌクレオチド長、より普通には少なくとも約60個のヌクレオチド長であり得、比較する完全配列まで及び得る。配列類似性は、参照配列に基づいて算出する。配列解析のためのアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990)に記載されているBLASTのように、当該技術において公知である(例えば、デフォルト設定、即ち、パラメーター W=4およびT=17を使用して)。
ホモログ類は、多くの方法のいずれかの方法によって同定する。本発明のcDNAフラグメントを、ターゲット生物体からのcDNAライブラリーに対するハイブリッド化プローブとして、低緊縮条件を使用することによって使用し得る。上記プローブは、大きいフラグメントまたは1以上の短い縮退プライマーであり得る。配列類似性を有する核酸は、低緊縮条件下での、例えば、50℃および6×SSC (0.9M 塩化ナトリウム/0.9M クエン酸ナトリウム)でのハイブリッド化およびその後の1×SSC (150mM 塩化ナトリウム/15mM クエン酸ナトリウム)で55℃の洗浄によって検出する。配列同一性は、高緊縮条件下での、例えば、50℃以上および0.1×SSC (15mM 塩化ナトリウム/1.5mM クエン酸ナトリウム)でのハイブリッド化により判定し得る。与えられた配列と実質的同一の領域を有する核酸、例えば、対立遺伝子変異体、当該核酸の遺伝子的改変種等は、高緊縮ハイブリッド化条件下において与えられた配列に結合する。プローブ類、とりわけDNA配列の標識化プローブを使用することにより、相同性のまたは関連する遺伝子を分離することができる。
【００１２】
また、上述の核酸に、緊縮条件下、好ましくは高緊縮条件下でハイブリッド化する核酸(即ち、前述の核酸の補体)も提供する。緊縮条件の例は、50℃以上および0.1×SSC (15mM 塩化ナトリウム/1.5mM クエン酸ナトリウム)でのハイブリッド化である。高緊縮ハイブリッド化条件のもう１つの例は、50％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸デストラン(destran)および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAの溶液中42℃での１夜インキュベーション、およびその後の0.1×SSC中約65℃での洗浄である。他の高緊縮ハイブリッド化条件は、当該技術において公知であり、これらも本発明の核酸を同定するのに使用し得る。
また、本発明のたんぱく質の変形体、変異体または誘導体をコード化する核酸も提供する。変異体または誘導体は、上述の核酸から選ばれたテンプレート核酸上に、該テンプレート配列中で1個以上のヌクレオチドを修飾し、欠落させまたは付加させ或いはこれらを組合せて、該テンプレート核酸の変形体を生成させることによって、生成させ得る。修飾、付加または欠落は、変異性PCR、シュフリング(shuffling)、オリゴヌクレオチド特異性変異誘発、集合PCR、雌雄PCR変異誘発、生体内変異誘発、カセット変異誘発、反復アンサンブル変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)、指数アンサンブル変異誘発、部位特異性変異誘発、ランダム変異誘発、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和変異誘発(GSSM)、合成ライゲーション再構築(SLR)またはこれらの組合せのような当該技術において公知の任意の方法よって導入し得る(例えば、Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22；Barany, Gene (1985) 37: 111-123；および、Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108)を参照されたい)。また、修飾、付加または欠落は、組換え、反復配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異誘発、ウラシル含有テンプレート変異誘発、ギャップド二本鎖変異誘発、ポイントミスマッチ修復変異誘発、修復欠損宿主株変異誘発、化学変異誘発、放射能変異誘発、欠落変異誘発、制限-選択変異誘発、制限-精製変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル変異誘発、キメラ核酸多重体形成およびこれらの組合せを含む方法によっても導入し得る。幾つかの実施態様においては、変異体または誘導核酸によってコード化された蛍光たんぱく質は、野生タイプの蛍光たんぱく質と同じ蛍光または生化学特性を有している。他の実施態様においては、変異体または誘導核酸は、下記で変異体CopCFP、CopGFP-NA1〜３についてより詳細に説明しているように、改変された特性を有する蛍光たんぱく質をコード化している。
【００１３】
さらに、本発明のたんぱく質をコード化する核酸の縮退変異体も提供する。核酸の縮退変異体は、核酸のコドンの同じアミノ酸をコード化している他のコドンによる置換を含む。とりわけ、核酸の縮退変異体は、宿主細胞中でのその発現を増大させるように生成させる。この実施態様においては、宿主細胞の遺伝子内の好ましくないまたはあまり好ましくない核酸のコドンを、宿主細胞の遺伝子内のコード配列中に過発現しているコドンにより置換し、この置換コドンが同じアミノ酸をコード化する。本発明の核酸のヒト化形は、といわけ興味を有する。本明細書において使用するとき、用語“ヒト化”とは、哺乳動物(ヒト)細胞中でのたんぱく質の発現に対してコドンを最適化するように核酸配列になされた変更を称する(Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593)。また、たんぱく質類のヒト化を記載している米国特許第5,795,737号も参照されたい、該米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。興味ある縮退変異体の例は、下記の実験の部においてもっと詳細に説明する。
本明細書において使用するときの用語“cDNA”とは、天然成熟mRNA種中に見出される配列要素の配列を占める核酸を含むものとし、配列要素はエクソン並びに5'および3'非コード領域である。通常、mRNA種は隣接エクソンを有し、介入イントロンは、存在する場合、核RNA開裂により除去され、上記たんぱく質をコード化する連続オープンリーディングフレームを生成する。
興味あるゲノム配列は、天然染色体中に通常存在するイントロンの全てを含む、列挙した配列に定義されているような開始コドンと停止コドンとの間に存在する核酸を含み得る。興味あるゲノム配列は、成熟mRNA中に見出される5'および3'非翻訳領域、並びに転写領域の5'および3'末端のいずれかでの約1kb(それ以上であり得る)のフランキングゲノムDNAのようなプロモーター、エンハンサー等のような特定の転写および翻訳調節配列をさらに含み得る。
【００１４】
本発明の核酸分子は、本発明のたんぱく質の全てまたは１部をコード化し得る。二本鎖または一本鎖フラグメントは、オリゴヌクレオチドを、通常の方法に従い、制限酵素消化、PCR増幅等により化学合成することによって、上記DNA配列から得ることができる。殆どの部分において、DNAフラグメントは、長さにおいて少なくとも約15個のヌクレオチド、通常は長さにおいて少なくとも約18個のヌクレオチドまたは長さにおいて約25個のヌクレオチドであろうし、長さにおいて少なくとも約50個のヌクレオチドであり得る。幾つかの実施態様においては、上記本発明のヌクレオチド酸分子は、長さにおいて約100個、約200個、約300個、約400個、約500個、約600個、約700個のヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。本発明の核酸は、本発明のたんぱく質のフラグメントまたは全長たんぱく質をコード化し得る；例えば、本発明の核酸は、約25個のアミノ酸、約50個、約75個、約100個、約125個、約150個、約200個のアミノ酸のポリペプチドから全長たんぱく質までをコード化し得る。
本発明の核酸は、実質的に精製形で分離し得ることができる。実質的に精製形とは、当該核酸が少なくとも約50％純粋、通常は少なくとも約90％純粋であり、典型的に“組換え体”であること、即ち、その天然宿主生物体中の天然産生染色体上に通常結合していない1個以上のヌクレオチドによってフランキングされていることを意味する。
例えば、SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27の配列を有する本発明の核酸、相応するcDNA、全長遺伝子および構築物は、当業者にとって公知の多くの種々のプロトコールにより合成的に生成させ得る。適切な核酸構築物は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されているような標準の組換えDNA技術を使用し、例えば、United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Researchに記載されている調節下に精製し得る。
【００１５】
また、下記でより詳細に説明する本発明のたんぱく質またはそのフラグメントを含む融合たんぱく質をコード化する核酸も提供する。
また、本発明の核酸を含むベクターおよび他の核酸構築物も提供する。適切なベクターとしては、ウイルスおよび非ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ等、好ましくはベクターがあり、適切な宿主中での本発明の核酸配列のクローニング、増幅、発現、伝達等において使用する。適切なベクターの選択については当業者が精通していることであり、多くのそのようなベクターは、商業的に入手可能である。構築物を製造するためには、部分長または全長核酸を、ベクター中に、典型的にはベクター内の開裂制限酵素部位へのDNAリガーゼ結合によって挿入する。また、所望のヌクレオチド配列を、生体内相同性組換えにより、典型的にはベクターに対し相同性の領域を所望ヌクレオチド配列の側面上に結合させることによっても挿入させ得る。相同性の領域は、オリゴヌクレオチドのライゲーションにより、或いは、例えば、相同性の領域と所望のヌクレオチド配列部分の双方を含むプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により付加させる。
本発明の色原体もしくは蛍光たんぱく質またはその融合たんぱく質の製造において或いは本発明の核酸分子の複製においてとりわけ使用する発現カセットまたは発現系も提供する。発現カセットは、染色体外要素として存在し得、或いは細胞のゲノム中に、上記発現カセットの細胞中への導入の結果として、組込み得る。発現においては、本発明の核酸によってコード化された遺伝子産生物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両性類または哺乳動物系のような任意の好都合な発現系中で発現させる。発現ベクターにおいては、本発明の核酸を、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、レプレッサーおよびインジューサーを含み得る調節配列に作動可能に結合させる。所望産生物を発現し得る発現カセットまたは系の製造方法は、当業者にとって公知である。
本発明のたんぱく質を安定的に発現する細胞系は、当該技術において公知の方法によって選択し得る(例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ヒグロマイシンのような選択性マーカーと一緒の同時移入は、ゲノム中に組み込んだ遺伝子を含有する移入細胞の同定および分離を可能にする)。
【００１６】
上記の所望発現系は、原核生物または真核生物宿主において使用し得る。大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、サッカロミセス セレヴィシエ(S. cerevisiae)、バキュロウイルスベクターと組合せた昆虫細胞、または脊柱動物のような高級生物体の細胞、例えば、COS 7細胞、HEK 293、CHO、アフリカツメガエル卵母細胞等のような宿主細胞を上記たんぱく質の産生において使用し得る。
上述の宿主細胞のいずれかまたは他の適切な宿主細胞もしくは生物体を使用して本発明の核酸を複製および/または発現させた場合、得られる複製核酸、発現たんぱく質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物体の産生物として、本発明の範囲に属する。産生物は、当該技術において公知の適切な手段によって回収し得る。
また、本発明のゲノム配列のプロモーター配列も興味があり、例えば、その5'フランキング領域の配列を、本発明のたんぱく質遺伝子を発現させる細胞/組織中での発現の調節を行うエンハンサー結合部位のようなプロモーター要素において使用し得る。
また、PCR用のプライマー、ハイブリッド化スクリーニングプローブ等として有用である本発明の核酸の小さいDNAフラグメントも興味がある。より大きめのDNAフラグメントは、前述したようなコード化ポリペプチドの産生において有用である。しかしながら、幾何学的PCRのような幾何学的増幅反応における使用においては、対の小さいDNAフラグメント、即ち、プライマーを使用するであろう。プライマー配列の正確な組成は本発明において重要ではないが、殆どの用途において、プライマーは、、当該技術において知られているように、緊縮条件下で本発明の配列にハイブリッド化するであろう。少なくとも約50個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100個のヌクレオチドの増幅産生物を生成させ、完全配列の核酸にまで及び得る対のプライマーを選択するのが好ましい。プライマー配列選択のためのアルゴリズムは、一般に既知であり、市販のソフトウェアパッケージにおいて入手し得る。増幅プライマーは、DNAの相補ストランドにハイブリッド化し、互いに対して開始するであろう。
【００１７】
また、本発明の核酸分子は、生物学的試験標本における遺伝子の発現を同定するのにも使用し得る。ゲノムDNAまたはRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在について細胞を精査する方法は、当該技術において良好に確立されている。要するに、DNAまたはmRNAを細胞サンプルから分離する。mRNAは、逆転写酵素を使用して相補DNAストランドを形成させるRT-PCRにより、さらにその後の本発明のDNA配列に対して特異性のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅により、増幅させ得る。また、mRNAサンプルをゲル電気泳動により分離し、適切な支持体、例えば、ニトロセルロース、ナイロン等に移し、その後、プローブとしての本発明のDNAのフラグメントによって精査する。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、現場ハイブリッド化、および固形チップ上に配列させたDNAプローブへのハイブリッド化のような他の方法も使用し得る。本発明の配列にハイブリッド化するmRNAの検出は、サンプル中での遺伝子発現を指標し得る。
フランキングプロモーター領域およびコード領域を含む本発明の核酸は、当該技術において公知の種々の方法で変異させて、プロモーター強度の目標とする変化を発生させ、或いはコード化されたたんぱく質の配列またはコード化されたたんぱく質の蛍光特性を含むコード化されたたんぱく質の性質を変えることはできる。
【００１８】
たんぱく質
また、本発明によれば、全長たんぱく質を包含するカイアシ類蛍光たんぱく質、その誘導体および変異体、並びにその１部またはフラグメントも提供される。また、下記でより詳細に説明するような、天然産生たんぱく質の変形体(そのような変形体は、天然産たんぱく質と相同性であるかまたは実質的に類似している)、および天然産生たんぱく質の変異体も提供される。
多くの実施態様においては、本発明のたんぱく質は、約300nm〜700nm、通常約350nm〜550nm、より通常は約450nm〜550nm、多くの場合約470nm〜520nm、例えば、470〜500nmの吸光度最高値を有し、一方、本発明たんぱく質の発光スペクトルは、典型的には約400nm〜700nm、通常約450nm〜650nm、より通常は約480nm〜600nmの範囲であるが、多くの実施態様においては、この発光スペクトルは、約480〜550nm、例えば、490〜520nmまたは490〜510nmの範囲である。本発明のたんぱく質は、約25,000〜150,000、通常約45,000〜120,000、例えば、50,000〜100,000の範囲である最高吸光係数を一般に有する。本発明のたんぱく質は、典型的に約150〜300個のアミノ酸、通常約200〜300個のアミノ酸残基の長さ範囲であり、約15〜35kDa、通常約17.5〜32.5kDa範囲の分子量を一般に有する。
ある実施態様においては、本発明のたんぱく質は光輝性であり、光輝性とは、当該色素および蛍光たんぱく質を一般的な方法(例えば、目視スクリーニング、分光測定、分光蛍光分析、蛍光顕微鏡測定、FACS装置による等)によって検出し得ることを意味する。特定の蛍光たんぱく質の蛍光輝度は、最高吸光係数を乗じたその量子収率によって決定する。色素たんぱく質の輝度は、その最高吸光係数によって表し得る。
【００１９】
ある実施態様においては、本発明のたんぱく質は、宿主細胞内での発現後に急速に産生停止する。急速に産生停止(rapidly folding)とは、当該たんぱく質がその発色または蛍光性をもたらすその三次構造を短時間で達成することを意味する。これらの実施態様においては、上記たんぱく質は、一般に約3日を越えない、通常は約2日を越えない、より通常は約1日を越えない時間内で産生停止する。
興味ある特定のたんぱく質は、節足動物門から、好ましくは甲殻類亜門から、より好ましくはアゴアシ綱から、より好ましくはコペポーダ亜綱から、より好ましくはカラヌス目から、さらにより好ましくはポンテラ科からのフルオロたんぱく質(並びにそのホモログ、変異体および誘導体)である。
興味ある特定のたんぱく質としては、下記のカイアシ類緑色蛍光たんぱく質(およびそのホモログ/誘導体/変異体)がある：ppluGFP1、ポンテリナ プルマタ由来のppluGFP2たんぱく質、ラビドセラ エスチバ由来のlaesGFP、ポンテラ メアジ ホイーラー由来のpmeaGFP1およびpmeaGFP2、ポンテラ メジテラニア由来のpmedGFP1およびpmedGFP2、および未同定ポンテラ種由来のpdae1GFPがある。これら興味ある特定のたんぱく質の各々については、下記の実験の部においてより詳細に説明する。これらのたんぱく質における野生タイプのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16に示されている。下記の実験の部においてより詳細に説明するCopCFP、CopGFP-NA1、CopGFP-NA2、CopGFP-NA3のようなこれらたんぱく質のホモログ/誘導体/変異体類も、とりわけ興味のあるものである。
【００２０】
ホモログ類、即ち、本発明の前記で提示した特定のアミノ酸配列、即ち、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28から配列において変化するたんぱく質類も提供する。ホモログとは、D.G. Higgins and P.M. Sharp, “Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer,” CABIOS, 5 pp. 151-3 (1989)に記載されているようなMegAlign, DNAstar clustalアルゴリズムを使用して測定したときに(パラメーター ktuple 1、ギャップペナルティー 3、ウィンドウ 5およびセーブ対角線 5を使用して)、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28のアミノ酸配列に対し少なくとも約50％、通常少なくとも約55％、より通常は少なくとも約60％のアミノ酸配列同一性を有するたんぱく質を意味する。多くの実施態様において、興味あるホモログ類は、とりわけ上記たんぱく質の官能性領域を提供するアミノ酸配列に対してはるかに高い、例えば、70％、75％、80％、85％、90％(例えば、92％、93％、94％)またはそれ以上の、例えば、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％の配列同一性を有する。
また、野生タイプのたんぱく質と実質的に同一であるたんぱく質も提供し、実質的同一とは、当該たんぱく質が少なくとも約60％、通常少なくとも約65％、より通常は少なくとも70％の野生タイプたんぱく質の配列に対するアミノ酸配列同一性を有することを意味し、ある場合には、その同一性は、はるかに高く、例えば、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上であり得る。
また、上述の天然産生性たんぱく質の誘導体または変異体であるたんぱく質も提供する。変異体および誘導体類は、野生タイプ(例えば、天然産生)たんぱく質の生物学的特性を保持し得、或いは野生タイプたんぱく質と異なる生物学的特性を有し得る。本発明のたんぱく質の“生物学的特性”なる用語は、限定するものではないが、吸光度最高値、発光最高値、最高吸光係数、輝度 (例えば、野生タイプたんぱく質、またはオワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱく質(GFP)のような他の参照たんぱく質と比較して)等のようなスペクトル特性；生体内および/または生体外安定性(例えば、半減期)のような生化学特性；成熟速度、凝集性向およびオリゴマー化性向；並びに他のそのような特性を称する。変異には、1個のアミノ酸交換、１個以上のアミノ酸の欠落または挿入、N-末端切り取りまたは延長、C-末端切り取りまたは延長等がある。
【００２１】
変異体および誘導体は、上記の“核酸分子”の章で詳細に説明したような標準の分子生物学的方法を使用して生成させ得る。数種の変異体を本明細書において説明する。実施例に提示した手引きを考慮し、標準方法を使用するならば、当業者であれば、広範囲のさらなる変異体を生成させ、生物学的(例えば、生化学、スペクトル等の)特性が改変されたかどうかを試験することは容易になし得る。例えば、蛍光強度は、種々の励起波長において分光測定計を使用して測定し得る。
また、誘導体は、RNAエディテイング、化学修飾、翻訳後および転写後修飾等を含む標準方法を使用しても生成させ得る。例えば、誘導体は、修正リン酸化、グリコシル化、アセチル化、脂質化のような方法によりまたは種々のタイプの成熟開裂等により生成させ得る。
天然産生たんぱく質である本発明のたんぱく質は、非天然産生環境において存在し、例えば、それらたんぱく質の天然産生環境から分離する。例えば、精製たんぱく質が提供され、“精製”とは、当該たんぱく質が興味ある非色原性または蛍光たんぱく質を実質的に含まない混合物中に存在することを意味し、“実質的に含まない”とは、混合物含有分の90％未満、通常60％未満、より通常は50％未満が非色原性または蛍光たんぱく質またはその変異体であることを意味する。また、本発明のたんぱく質は、分離形でも存在し得、分離形とは、当該たんぱく質が他のたんぱく質およびそのオリゴ糖、核酸およびフラグメント等のような他の天然産生生物学的分子を実質的に含まないことを意味し、この場合の用語“実質的に含まない”とは、分離たんぱく質を含有する組成物の70％未満、通常60％未満、より通常は50％未満がある種の他の天然産生生物学的分子であることを意味する。ある実施態様においては、上記たんぱく質は実質的に精製形で存在し、“実質的に精製形”とは、少なくとも95％、通常少なくとも97％、より通常は少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００２２】
また、天然産生たんぱく質並びに上述したたんぱく質の変異体および誘導体のフラグメントも提供する。生物学的に活性なフラグメントおよび/または官能性ドメインに相当するフラグメント等は、とりわけ興味のあるものである。興味あるフラグメントは、典型的には長さにおいて少なくとも約30個のアミノ酸、通常長さにおいて少なくとも約50個のアミノ酸、好ましくは長さにおいて少なくとも約75個または100個のアミノ酸であり、長さにおいて300個のアミノ酸ほどの長いまたはそれ以上であり得るが、通常は長さにおいて約250個のアミノ酸を越えないポリペプチドであり、該フラグメントは、長さにおいて、本発明のたんぱく質の少なくとも約25個のアミノ酸、通常は少なくとも約45個のアミノ酸、多くの実施態様においては少なくとも50個のアミノ酸と同一であるアミノ酸ストレッチを有するであろう。幾つかの実施態様においては、本発明のポリペプチドは、長さにおいて、約25個のアミノ酸、約50個、約75個、約100個、約125個、約150個、約200個または約250個のアミノ酸から上記たんぱく質の全長までである。幾つかの実施態様においては、たんぱく質フラグメントは、野生タイプのたんぱく質の特異的性質の全てまたは実質的に全てを保持している。
本発明のたんぱく質およびポリペプチドは、天然産生源から取得し得、或いは合成的に生成させ得る。例えば、野生タイプのたんぱく質は、上記たんぱく質を発現する生物学的源、例えば、前記した特定の種のようなカイアシ種に由来し得る。また、本発明のたんぱく質は、合成手段により、例えば、興味あるたんぱく質をコード化する組換え核酸コード配列を、適切な宿主中で、前述するようにして発現させることによっても誘導し得る。任意の好都合なたんぱく質精製手法を使用し得、適切なたんぱく質精製方法論は、Guide to Protein Purification, (Deuthser ed., Academic Press, 1990)に記載されている。例えば、溶解物を起原源から調製し、HPLC、除外クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等を使用して精製する。
【００２３】
また、例えば、分解配列、非細胞性局在化配列(例えば、核局在化シグナル、ペルオキシマル(peroximal)ターゲッティングシグナル、ゴルジ装置ターゲッティング配列、ミトコンドリアターゲッティング配列等)、シグナルペプチド、または興味ある任意のたんぱく質もしくはポリペプチドに融合させた本発明のたんぱく質またはそのフラグメントを含む融合たんぱく質も提供する。融合たんぱく質は、例えば、本発明の蛍光たんぱく質のポリペプチドと該蛍光たんぱく質のN-末端および/またはC-末端で枠内融合させた第２のポリペプチド(“融合パートナー”)とを含み得る。融合パートナーとしては、限定するものではないが、融合パートナーに対し特異的な抗体を結合し得るポリペプチド類(例えば、エピトープタグ類)、抗体またはその結合性フラグメント、触媒機能を与えるかまたは細胞応答を誘発させるポリペプチド類、リガンドもしくはレセプター類またはこれらの擬態物等がある。そのような融合たんぱく質においては、融合パートナーは、一般に、融合たんぱく質のフルオロ/色素たんぱく質部分と天然には結合してなく、典型的に、本発明のカイアシ類蛍光たんぱく質またはその誘導体/フラグメントではない；即ち、融合パートナーは、カイアシ種中で見出せない。
また、本発明の蛍光または色素たんぱく質に特異的に結合する抗体も提供する。適切な抗体は、当該技術において公知の方法を使用して産生させ得る。例えば、ポリクローナル抗体は、(Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載されているようにして得ることができ、モノクローナル抗体は、 (Goding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3rd edition, (1996) Academic Press) に記載されているようにして得ることができる。また、ヒト化抗体のようなキメラ抗体、並びに一本鎖抗体および抗体フラグメント、例えば、Fv、F(ab')2およびFabも興味がある。
【００２４】
形質転換体
本発明の核酸は、トランスジェニック生物体または細胞系内での部位特異性遺伝子修飾のような形質転換体を生成させるのに使用し得る。本発明のトランスジェニック細胞は、トランス遺伝子として存在する本発明に従う１種以上の核酸を含む。本発明の目的においては、原核(例えば、大腸菌、ストレプトミセス sp.、枯草菌、アシドフィルス菌(Lactobacillus acidophilus)等)または真核宿主細胞のような任意の適切な宿主細胞を使用し得る。本発明のトランスジェニック生物体は、細菌、シアノバクテリア、真菌、植物および動物のような原核または真核生物体であり得、生物体の１種以上の細胞が当該技術において周知の遺伝子組換え法によるようなヒトの介入によって導入された本発明の異質核酸を含有する。
本発明の分離された核酸は、当該技術において公知の方法、例えば、感染、移入、形質転換またはトランス接合によって宿主中に導入し得る。上記核酸分子(即ち、DNA)をそのような生物体に移送する方法は、広く知られており、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)のような文献に提示されている。
１つの実施態様においては、トランスジェニック生物体は、原核生物体であり得る。原核宿主の形質転換に関する方法は、当該技術において十分に立証されている(例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press；および Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Incを参照されたい)。
もう１つの実施態様においては、トランスジェニック生物体は、真菌、例えば、酵母であり得る。酵母は、異質遺伝子発現におけるビヒクルとして広汎に使用されている(例えば、Goodey et al Yeast biotechnology, D R Berry et al, eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp 401-429；および King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp 107-133を参照されたい)。維持のために宿主ゲノムによる組換えを必要とする組込みベクターおよび自己複製プラスミドベクターのような数タイプの酵母ベクターが入手可能である。
【００２５】
もう１つの宿主生物体は動物である。トランスジェニック動物は、当該技術において周知であり、Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press；Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory；Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2nd Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association；Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000)のような文献に提示されている遺伝子導入方法によって得ることができる。例えば、トランスジェニック動物は、相同性組換えにより得ることができ、内生座が改変される。また、核酸構築物は、ゲノム中にランダムに組込む。安定な組込み用ベクターとしては、プラスミド類、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス類、YAC類等がある。
核酸は、細胞プレカーサー中への導入により、マイクロインジェクションによるような意図的な遺伝子操作により、或いは組換えウイルスまたは組換えウイルスベクター等による感染により、直接または間接的に細胞中に導入し得る。遺伝子操作なる用語は、古典的な交雑育種または生体外受精を含まないが、むしろ組換え核酸分子の導入に関する。この核酸分子は染色体内に組込んでもよく、或いは染色体外複製性DNAであってもよい。
相同性組換え用のDNA構築物は、本発明の核酸の少なくとも１部を含み、その遺伝子は、所望の遺伝子修飾(１以上)を有し且つターゲット座に対する相同性の領域を含む。ランダム組込み用のDNA構築物は、組換えを介在するための相同性の領域を含む必要はない。好都合なことに、正および負選択のためのマーカーを含ませ得る。相同性組換えによるターゲット遺伝子修飾を有する細胞の産生方法は、当該技術において公知である。哺乳動物細胞の種々の移入方法については、Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537を参照されたい。
【００２６】
胚幹(ES)細胞においては、ES細胞系を使用し得、或いは胚細胞を、マウス、ラット、モルモット等のような宿主から新鮮に得ることができる。そのような細胞は、適切な線維芽細胞供給体層上で増殖させるかまたは白血病抑制因子(LIF)の存在下に増殖させる。形質転換ESまたは胚細胞は、当該技術において記載されている適切な方法を使用して、トランスジェニック動物の生成に使用し得る。
トランスジェニック動物は、非ヒト動物(例えば、マウス、ラット)、鳥類または両性類等のような非ヒト動物であり得、機能性試験、薬物スクリーニング等において使用できる。トランスジェニック動物使用の代表的な例としては、下記に説明する例がある。
また、トランスジェニック植物も生成させ得る。トランスジェニック植物細胞および植物を調製する方法は、米国特許第5,767,367号；第5,750,870号；第5,739,409号；第5,689,049号；第5,689,045号；第5,674,731号；第5,656,466号；第5,633,155号；第5,629,470号；第5,595,896号；第5,576,198号；第5,538,879号；第5,484,956号に記載されており、これら米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。トランスジェニック植物を生成させる方法は、Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp. 275-295において、さらに Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) 719 pにおいても見受けられる。
例えば、体細胞を含む胚形成性外植片は、トランスジェニック宿主の調製において使用し得る。細胞または組織の収穫後、興味ある外来DNAを該植物細胞中に導入する；そのような導入においては、種々の異なる方法が利用可能である。分離されたプロトプラストにより、このプロトプラストの裸DNAと一緒のインキュベーションのようなDNA介在遺伝子伝達プロトコールによる導入(そのようなプラスミドは、多価カチオン(例えば、PEGまたはPLO)の存在下での興味ある外来コード配列を含む)；或いは、興味ある外来配列を含む裸DNAの存在下での上記プロトプラストのエレクトロポレーションの機会が生ずる。その後、外来DNAを成功裏に取込んだプロトプラストを選択し、カルス中に増殖させ、最終的には、適切な量と比率のオーキシン類およびサイトカイニン類のような刺激因子との接触により、トランスジェニック植物中に増殖させる。
当業者において利用し得る“遺伝子銃”法またはアグロバクテリウム介在形質転換のような他の適切な植物産生方法も使用し得る。
【００２７】
使用方法
本発明の蛍光たんぱく質(並びに前述した本発明の他の成分)は、種々の異なる用途での使用を見出している。例えば、本発明の蛍光たんぱく質は、生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの標識化、分析または検出方法において使用し得る。これらのタイプのたんぱく質の各々についての代表的な使用を以下に説明するが、以下で説明する使用は、単なる例示であって、如何なる形でも、本発明のたんぱく質の使用を説明した使用に限定することを意味しない。
生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの標識化方法に関する好ましい実施態様においては、本発明のたんぱく質は、細胞および分子の生物学的アッセイにおける生体内ラベル(またはレポーター分子)としての使用を見出している。興味あるアッセイとしては、限定するものではないが、遺伝子発現、たんぱく質局在化および同時局在化、たんぱく質-たんぱく質相互作用、たんぱく質-核酸相互作用、核酸-核酸相互作用、細胞および細胞オルガネラの局在化および相互作用等についてのアッセイがある。本発明の蛍光たんぱく質は、生存および固定細胞中での生体分子ラベルまたは細胞オルガネララベルとして、細胞またはオルガネラ融合中のマーカーとして、細胞またはオルガネラの完全性マーカーとして、移入マーカーとして(例えば、少なくとも１種の本発明の蛍光たんぱく質をコード化する発現ベクターを含有する移入細胞選択のためのラベルとして)、近生理学的濃度で作動するリアルタイムプローブとして等の用途を見出している。
【００２８】
さらにまた、本発明のたんぱく質は、生物学的分子の分析方法においても使用し得る。例えば、本発明のたんぱく質は、生物学的物質中での興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現の同定および/または測定においての使用を見出している。この方法は、i) 細胞中に、本発明に従う蛍光たんぱく質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子(該核酸分子は、上記興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現を調節する発現制御配列と作動可能に結合されて、その制御下にある)を導入し；ii) 上記核酸を適切な条件下で発現させ；そして、iii)上記興味あるたんぱく質発現を測定する手段として上記蛍光たんぱく質の蛍光発光量を検出することを含む。
とりわけ、本発明のたんぱく質は、生物学的物質中での興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現および/または局在化の同定および/または測定においての使用を見出している。この方法は、i) 細胞中に、本発明に従う蛍光たんぱく質をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子(該核酸分子は、興味あるたんぱく質またはポリペプチドをコード化する配列と融合させており、上記興味あるたんぱく質またはポリペプチドの発現を調節する発現制御配列と作動可能に結合されて、その制御下にある)を導入し；ii) 上記細胞を、上記興味あるたんぱく質の発現に適する条件下で培養し；そして、iii)上記興味あるたんぱく質の発現/局在化を測定する手段として上記蛍光たんぱく質の蛍光発光量を検出することを含む。
【００２９】
興味ある用途としては、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法における本発明のたんぱく質の使用がある。これらの方法においては、本発明のたんぱく質は、第２の蛍光たんぱく質または染料、例えば、Matz et al., Nature Biotechnology 17:969-973 (1999)に記載されているような蛍光たんぱく質；例えば、米国特許第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号に記載されているようなオワンクラゲ由来の緑色蛍光たんぱく質の赤色移行変異体(これらの米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる)；クマリンおよびその誘導体、7-アミノ-4-メチルクマリンおよびアミノクマリンのような他の蛍光染料；ボディピー(bodipy)染料；カスケードブルー；フルオレセインイソチオシアネートおよびオレゴングリーンのようなフルオレセインおよびその誘導体；テキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン類およびエリトロシン類のようなローダミン染料；Cy3およびCy5のようなシアニン染料；クワンタム(quantum)染料のようなレンタニンド(lenthaninde)イオンの大環状キレート類；並びに米国特許第5,843,746号；第5,700,673号；第5,674,713号；第5,618,722号；第5,418,155号；第5,330,906号；第5,229,285号；第5,221,623号；第5,182,202号に記載されているもののような、ルシフェラーゼ類のような化学発光染料(これらの米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる)と一緒に、供与体および/または受容体として作動する。
本発明の蛍光たんぱく質を使用するFRETアッセイを使用し得る特定の例としては、限定するものではないが、ペプチドまたはたんぱく質が本発明の蛍光たんぱく質を含むFRET蛍光混合物と共有結合し、該結合ペプチドまたはたんぱく質が、例えば、カスパーゼ介在開裂におけるプロテアーゼ特異性基質、PKA調節ドメイン(cAMPセンサー)のような、FRETを増大または低下させるシグナルを受けるときに立体配座変化を受けるペプチド、リン酸化部位(例えば、リン酸化部位は当該ペプチド中に存在し、又は当該ペプチドは他のたんぱく質のリン酸化/脱リン酸化ドメインに対して結合特異性を有する)であり、或いは上記ペプチドがCa2+結合ドメインを有する場合のような、多くの種々の事象のバイオセンサーとして、哺乳動物2-ハイブリッド系、転写因子二量体化、膜たんぱく質多量体化、多たんぱく質複合体形成におけるようなたんぱく質-たんぱく質相互作用の検出がある。さらに、本発明のたんぱく質が使用を見出している蛍光共鳴エネルギー移動即ちFRET用途としては、限定するものではないが、米国特許第6,008,373号；第5,998,146号；第5,981,200号；第5,945,526号；第5,945,283号；第5,911,952号；第5,869,255号；第5,866,336号；第5,863,727号；5,728,528号；第5,707,804号；第5,688,648号、第5,439,797号に記載されている用途がある；これらの米国特許は、参考として本明細書に合体させる。
【００３０】
本発明の蛍光たんぱく質は、細胞中での１種以上の興味あるたんぱく質の発現および/または転座の調節に対する試験物質の効果の検出方法における使用を見出している。または、本発明の蛍光たんぱく質は、興味あるたんぱく質の発現および発現制御配列の試験物質に応答しての同時活性の検出方法における使用も見出している。上記蛍光たんぱく質は、細胞中での２種以上の発現制御配列の試験物質に応答しての活性を比較する方法における使用も見出している。そのような方法は、プロセスにおける効果を測定すべき試験物質の存在下または不存在下において実施し得る。
また、本発明の蛍光たんぱく質は、蛍光指示基を発現する細胞アレーの顕微鏡画像形成および電子分析による自動化スクリーニングに関連する用途における使用も見出している。スクリーニングは薬物発見においてまた機能性ゲノムの分野において使用し得、本発明のたんぱく質は、例えば、内皮細胞による多細胞細管の形成(血管形成)、Fluoroblok Insertシステム(Becton Dickinson社)による細胞移動、創傷治癒または神経突起伸張における多細胞再組織化および移動の変化を検出する細胞全体のマーカーとして使用する。スクリーニングは、本発明のたんぱく質を、刺激時のキナーゼおよび転写因子転座のような、例えばシグナル形質導入における細胞活性についての指示薬として細胞内位置の変化を検出するペプチド(ターゲッティング配列のような)またはたんぱく質に融合させたマーカーとして使用する場合も、使用し得る。例としては、たんぱく質キナーゼC、たんぱく質キナーセA、転写因子NFkBおよびNFAT；サイクリンA，サイクリンB1およびサイクリンEのような細胞環状たんぱく質；開裂基質のその後の移動を伴うプロテアーゼ開裂；小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、核心、核小体、原形質膜、ヒストン類、エンドソーム、リソソームまたは微細管のような細胞内構造体用のマーカーを含むリン脂質がある。
【００３１】
また、本発明のたんぱく質は、局在化マーカーによる他の蛍光融合たんぱく質の同時局在化を検出する高容量スクリーニングにおいて、細胞内蛍光たんぱく質/ペプチドの移動の指示薬としてまたは単独のマーカーとしても使用し得る。本発明の蛍光たんぱく質が使用を見出している細胞アレーの自動化スクリーニングに関連する用途の例には、米国特許第5,989,835号；並びにWO 0017624号；WO 00/26408号；WO 00/17643号；およびWO 00/03246号がある；これら特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。
本発明の蛍光たんぱく質は、高処理量スクリーニングアッセイにおける使用も見出している。本発明の蛍光たんぱく質は、24時間よりも長い半減期を有する安定なたんぱく質である。また、薬物発見における転写レポーターとして使用し得る、短縮した半減期を有する本発明たんぱく質の不安定化形も提供される。例えば、本発明に従うたんぱく質は、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、マウスサイクリンB1破壊ボックスまたはユビキチン等由来のPEST配列のような、短めの半減期を有するたんぱく質から誘導された推定たんぱく質分解性シグナル配列と融合させ得る。不安定化たんぱく質およびこれを生成させるのに使用し得るベクターの説明については、例えば、米国特許第6,130,313号を参照されたい；該米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。シグナル形質導入経路におけるプロモーターは、例えば、AP1、NFAT、NFkB、Smad、STAT、p53、E2F、Rb、myc、CRE、ER、GRおよびTRE等のような薬物スクリーニングにおいて、本発明の蛍光たんぱく質の不安定化形を使用して検出し得る。
本発明のたんぱく質は、本発明のたんぱく質をPKCガンマCa結合ドメイン、PKCガンマDAG結合ドメイン、SH2ドメインまたはSH3ドメイン等のような特定のドメインに融合させることによって、第２のメッセンジャー検出体として使用し得る。
種々の異なる用途において同様に使用し得る本発明たんぱく質の分泌形は、分泌性リーディング配列を本発明のたんぱく質に融合させることによって調製し得る。
また、本発明のたんぱく質は、蛍光活性化細胞分別(FACS)用途における使用も見出している。そのような用途においては、本発明の蛍光たんぱく質を細胞集団をマークするラベルとして使用し、その後、得られた標識化細胞集団を、蛍光活性化細胞分別装置により、当該技術において公知のようにして分別する。FACS法は、米国特許第5,968,738号および第5,804,387号に記載されており、これらの米国特許の開示は参考として本明細書に合体させる。
【００３２】
また、本発明のたんぱく質は、トランスジェニック動物における生体内ラベルとしての使用も見出している。例えば、本発明のたんぱく質の発現は、組織特異性プロモーターによって誘導し得、そのような方法は、他の用途の中で、トランスジェニック発現の有効性を試験するような、遺伝子治療の研究における使用を見出している。そのような用途を例示するトランスジェニック動物における蛍光たんぱく質の代表的な用途は、WO 00/02997号において見出され、その開示は参考として本明細書に合体させる。
本発明のたんぱく質の更なる用途としては、細胞または動物中への注入後のマーカーとしておよび定量測定における較正において；細胞生存性モニタリング用の酸素バイオセンサー装置におけるマーカーまたはレポーターとして；動物類、ペット類、おもちゃ類、食品等のマーカーまたはラベルとしての使用がある。
また、本発明の蛍光たんぱく質は、プロテアーゼ開裂アッセイにおける使用も見出している。例えば、開裂不活化蛍光アッセイは本発明のたんぱく質を使用して展開し得、本発明のたんぱく質を、該たんぱく質の蛍光特性を破壊するすることなくプロテアーゼ特異性開裂配列を含むように操作する。活性化プロテアーゼによる蛍光たんぱく質の開裂時には、蛍光は、官能性発色団の破壊により鋭敏に減少するであろう。また、開裂活性化蛍光は、本発明のたんぱく質を使用するして展開し得、該たんぱく質を、発色団の近くまたはその内部で更なるスペーサー配列を含有するように操作する。この変異体は、官能性発色団の１部がスペーサーによって分割されるので、その蛍光活性を有意に低下させる。スペーサーは、２つの同一プロテアーゼ特異性開裂部位によって枠組みされる。活性化プロテアーゼによる開裂時に、スペーサーを切断し、蛍光たんぱく質の２つの残留“サブユニット”を再構築して官能性蛍光たんぱく質を生成し得るであろう。上記の用途の双方は、カスパーゼ等のような種々のタイプの異なるプロテアーゼについてのアッセイにおいて展開し得るであろう。
【００３３】
また、本発明のたんぱく質は、生物学的膜中のリン脂質組成を測定するアッセイにおいても使用し得る。例えば、特定のリン脂質に結合して生物学的膜中のリン脂質分布像の局在化/可視化を可能にし、また特定のリン脂質基盤(raft)中の膜たんぱく質の同時局在化も可能にする本発明たんぱく質の融合たんぱく質(または本発明たんぱく質の任意の他の種の共有または非共有修飾体)は、本発明のたんぱく質によって達成され得る。
また、本発明の蛍光たんぱく質は、Ca2+イオン指示薬；pH指示薬；リン酸化指示薬；またはマグネシウム、ナトリウム、カリウム、クロライドおよびハライドのような他のイオンの指示薬のような、原核および真核細胞におけるバイオセンサーとしての使用を見出している。また、蛍光たんぱく質のバイオセンサーとしての使用方法としては、米国特許第5,972,638号；第5,824,485号および第5,650,135号(並びに本明細書において引用した文献)に記載されている方法がある；これら米国特許の開示は、参考として本明細書に合体させる。
前述した本発明の抗体も、本発明のたんぱく質の他の蛍光たんぱく質からの区別化のような多くの用途おける使用を見出している。
【００３４】
キット
また、本発明によれば、上述の用途の１つ以上を実施するのに使用するキットも提供される。好ましい実施態様においては、キットは、生物学的分子の標識化において使用し得る。キットは、本発明のそのままのたんぱく質、または本発明のたんぱく質をコード化する核酸を、好ましくは本発明のたんぱく質の発現のための要素、例えば、本発明のたんぱく質をコード化する核酸を含むベクターのような構築物と一緒に含む。また、本発明は、そのようなキット成分を製造する手段にも及ぶ。該手段としては、カイアシ類由来のcDNAおよび本発明の核酸を、例えば、PCRにより産生させるためのオリゴヌクレオチドプライマー対があり得、或いは、該手段としては、連結させたときに本発明の蛍光たんぱく質をコード化する核酸を産生し得る多くの核酸フラグメント等があり得る。キット成分は、典型的には適切な容器内の、緩衝液ような適切な保存媒質中に典型的に存在する。キット中には、提供されるたんぱく質に対し特異性の抗体も存在し得る。ある実施態様においては、キットは、各々が本発明のたんぱく質をコード化する複数の異なるベクターを含み、各ベクターは、異なる環境においておよび/または異なる条件下での発現、例えば、ベクターが哺乳動物細胞での発現のための強力プロモーターを含むかまたはプロモーターの通例挿入のための複数のクローニング部位を有する無プロモーターベクターである場合の構成的発現および調整発現など用に設計されている。
上記の各成分以外に、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための使用説明書をさらに含む。これらの使用説明書は、種々の形で本発明のキット中に存在し得、その形状の1つ以上がキット中に存在し得る。
【００３５】
以下の実施例は、例示のために提示し、限定のためではない。
実施例
実施例１
カイアシ種由来の蛍光たんぱく質cDNAのクローニング
明緑色蛍光を有する数種の小(約0.5〜1mm長)コペポーダ試験標本(節足動物門；甲殻類亜門；アゴアシ綱；コペポーダ亜綱；カラヌス目；ポンテラ科)を、プランクトンサンプルから選択した。
これらカイアシ類由来の蛍光たんぱく質について研究するために、大腸菌中の発現cDNAライブラリーのスクリーニングに基づく戦略を使用した。全RNAは、単一生物体から、NucleoSpin RNA IIキット(Clontech社)により分離した。増幅cDNAサンプルは、SMART cDNA増幅キット(Clontech社)を使用して調製し、PCR-Scriptベクター(Stratagene社)中にクローニングした。約5×104の組換えクローンを、蛍光立体顕微鏡を使用して目視スクリーニングした。結果として、数種の密接に関連した(63％よりも高い同一性、表１参照)新規なGFP様たんぱく質を同定した：ポンテリナ プルマタ由来のppluGFP1 (SEQ ID NO：1および2)およびppluGFP2 (SEQ ID NO：3および4)；ラビドセラ エスチバ由来のlaesGFP (SEQ ID NO：5および6)；ポンテラ メアジ ホイーラー由来のpmeaGFP1 (SEQ ID NO：7および8)およびpmeaGFP2 (SEQ ID NO：9および10)；ポンテラ メジテラニア由来のpmedGFP1 (SEQ ID NO：11および12)およびpmedGFP2 (SEQ ID NO：13および14)；および未同定カイアシ種由来のpdae1GFP (SEQ ID NO：15および16)。各カイアシ類GFPは、DsRedおよびオワンクラゲGFPそれぞれと約25％と18％のアミノ酸同一性を有していた(図１)。
【００３６】
表１：各カイアシ類GFP間のアミノ酸同一性レベル
【００３７】
実施例２
カイアシ類蛍光たんぱく質の特性決定
カイアシ類蛍光たんぱく質の配列をコードする核酸を、実施例１で説明したようにして取得し、pQE30発現ベクター(Qiagen社)中にクローニングして、組換えたんぱく質がそのN-末端で6個ヒスチジンのタグを含有するようにした。大腸菌中での発現後、たんぱく質を金属アフィニティー樹脂TALON (Clontech社)によって精製し、特性決定した。
全てのたんぱく質が、緑色蛍光を示し、それぞれ、482〜495および502〜507nmにおいて、類似するが同一ではない励起-発光スペクトルピークを有していた(図２〜８)。野生タイプオワンクラゲGFPとは対照的に、各新規なたんぱく質は、１つのみの吸光-励起ピークを有しており、これは、おそらく脱プロトン化発色団状態に相応している。
ppluGFP2をさらに詳細に精査した。精製ppluGFP2は、70,000 M-1cm-1のモル吸光係数と0.60の蛍光量子収率を有していた。モル吸光係数測定においては、成熟発色団濃度を評価した。たんぱく質を等容量の2M NaOHでアルカリ変性した。これらの条件下で、GFP様発色団は446 nmで吸光し、そのモル吸光係数は44,000 M-1cm-1である(Ward, W.W., Bioluminescence and Chemiluminescence (1981), Academic Press, 235-242)。未変性およびアルカリ変性ppluGFP2の吸収スペクトルを測定した。未変性状態のたんぱく質のモル吸光係数は、変性たんぱく質の吸収に基づき評価した。量子収率測定においては、ppluGFP2の蛍光を量子収率0.60を有する同等の吸収性のEGFP (Patterson, G., et al., J. Cell. Sci. (2001) 114:837-838)と比較した。
ゲル濾過試験の結果は、ppluGFP2は、ppluGFP2がEGFPと同じ移動性を示したことから、単量体たんぱく質であることを示唆していた。精製たんぱく質サンプル(約1 mg/ml)をSephadex-100カラム(0.7×60cm)上に負荷させ、50 mMリン酸緩衝液(pH7)と100 mM NaClとの溶液で溶出させた。EGFP、HcRed1およびDsRed2 (Clontech社)を、それぞれ、モノマー、ダイマーおよびテトラマー標準として使用した。
【００３８】
実施例３
ppluGFP2変異体および誘導体の調製
野生タイプppluGFP2核酸コード配列を実施例１に記載したようにして得た。哺乳動物細胞中での発現を増強するために、哺乳動物最適化コドン(SEQ ID NO：17および18)を使用して、ppluGFP2の“ヒト化”形を合成した。サッカロミセス セレヴィシエ中での発現を増強するために、ppluGFP2の酵母最適化形を、S. セレヴィシエ最適化コドン(SEQ ID NO：19および20)を使用して合成した。
ppluGFP2の“ヒト化”形を部位特異性変異誘発に供してたんぱく質のシアン光発光形を得た。置換基Y58Wを有するたんぱく質をコード化する変異体核酸を、更なるランダム変異誘発において使用し、たんぱく質の成熟速度および蛍光輝度を改善した。Diversity PCR Random Mutagenesisキット(CLONTECH社)を、1000 bp当り5〜6の変異に対して最適の条件下において使用した。変異体たんぱく質を発現している大腸菌コロニーを、蛍光立体顕微鏡 SZX-12 (Olympus社)により、目視スクリーニングした。最明色クローンCopCFPをさらに特性決定した。総体的に、この変異体は、3個の置換基：Y58W、H143R、I119Tを担持していた(SEQ ID NO：21および22)。このたんぱく質における励起-発光スペクトルは、それぞれ、417および477nmでのピークを有していた(図９)。
ppluGFP2は生体外溶液中および長時間細胞培養において単独で発現させたときの双方で凝集を形成する性向を示したので、抑制された凝集能力を有する延長形のたんぱく質を生成させた。ppluGFP2のヒト化形を非凝集性変異体産生用のテンプレートとして使用した。第１形(CopGFP-NA1、SEQ ID NO：23および24)は、K5E置換基(ナンバーリングは野生タイプに基づく)と、ppluGFP2バレルの外側界面上の正電荷をシールドして他のppluGFP2たんぱく質分子との電荷相互作用を阻止しているたんぱく質N-末端での延長負荷電アミノ酸尾部とを含有している。第２形(CopGFP-NA2、SEQ ID NO：25および26)は、C-末端で更なる尾部を含有している。第３形のCopGFP-NA3は、CopGFP-NA1およびCopGFP-NA2形に存在する全ての変化を含む(SEQ ID NO：27および28)。全ての形が生体内および生体外試験において凝集能力の低下を示している。
【００３９】
実施例４
ポリクローナル抗体調製
実施例１で説明したようにして調製したppluGFP2の核酸のコード領域をpQE30発現ベクター(Qiagen社)中にクローニングして、組換えたんぱく質がそのN-末端で6個ヒスチジンのタグを含有するようにした。大腸菌中での発現後、たんぱく質を金属アフィニティー樹脂TALON (Clontech社)によって変性条件下で精製した。ウサギを、完全フロイントアジュバント中に乳化させた組換えポリペプチドにより、免疫化し、月毎の間隔で4回ブースターした。各ブースターの10日または11日後に、動物を採血した。ポリクローナル抗血清を組換えたんぱく質上でELISAおよびウェスタンイムノブロッティングにより試験した。
【００４０】
実施例５
ppluGFP2を使用しての哺乳動物細胞標識化
真核細胞の蛍光標識化においては、実施例３において説明したようにして調製したppluGFP2のヒト化形をpEGFP-C1ベクター(CLONTECH社)中にAgeIとBglII制限部位との間でクローニングした(EGFPコード領域の代りに)。以下の細胞系を使用した：293Tヒト腎臓上皮細胞、3T3マウス胚線維芽細胞、L929ネズミ皮下線維芽細胞、Veroアフリカミドリザル腎臓上皮細胞およびCOS1アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞。各細胞を、LipofectAMINE試薬(Invitrogen社)を使用して移入し、移入後20時間で試験した。CCDカメラ(DP-50、Olympus社)を備えたOlympus CK40蛍光顕微鏡を使用して細胞画像を形成した。各種細胞系中でのppluGFP2の発現は、明緑色シグナルをもたらした。蛍光は、移入24時間後で明らかに検出可能であった。細胞毒性は、観察されなかった。
【００４１】
実施例６
ppluGFP2を使用してのたんぱく質標識化およびたんぱく質局在化分析
実施例３において説明したようにして調製したppluGFP2のヒト化形を、ヒト細胞質ベータ-アクチンおよびヒト核小体たんぱく質、フィブリラリン(fibrillarin)に融合させた。ppluGFP2タグ付け融合構築物を発現するプラスミドによる293Tヒト腎臓上皮細胞の移入は、相応する融合パートナーに特徴的なパターンを明白にした明色蛍光をもたらしていた。
【００４２】
実施例７
ppluGFP2を使用しての細胞オルガネラ標識化
実施例３において説明したようにして調製したppluGFP2のヒト化形を以下の非細胞性局在化シグナルに融合させた：ヒトシトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIII由来のミトコンドリアターゲッティング配列(MTS)；ヒトベータ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼのN-末端81個のアミノ酸をコード化する配列(GT; Watzele & Berger (1990) Nucleic Acids. Res. 18:7174)；ペルオキシマルターゲッティングシグナル1 (Gould et al., J. Biol. Chem. (1989) 108:1657-1664；Gould et al., EMBO J. (1990) 9:85-90；Monosov et al. J. Histo. Cytochem. (1996) 44:581-589)；そのC-末端で融合させたシミアン・ウイルス40ラージT-抗原の核局在化シグナル(NLS)の3種の複写体(Kalderon et al. Cell (1984) 39:499-509；Lanford et al. Cell (1986) 46:575-782)。
ppluGFP2タグ付け融合構築物を発現するプラスミドによる293Tヒト腎臓上皮細胞の移入は、宿主細胞の相応するオルガネラへの有効なたんぱく質転座をもたらした。蛍光は、移入24時間後、明らかに検出可能であった。
【００４３】
本明細書において引用した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願について参考として合体させるように特定的に且つ個々に指摘していたように、参考として本明細書に合体させる。いずれの刊行物の引用も本発明の背景と理解を提供するものであり、そのような刊行物のいずれもが従来技術であるという是認と解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】オワンクラゲGFPおよびDsRedを含む新規なカイアシ類蛍光たんぱく質の配列構造を示す。ナンバリングはGFPに基づく。導入ギャップはドットで示す。カイアシ類GFPをppluGFP1と比較している：これらの配列中、ppluGFP1中の相応するアミノ酸と同一の残基は、ダッシュで示している。
【図２】野生タイプのppluGFP１における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する(ppluGFP2は、本質的に同じスペクトルを有する)。
【図３】野生タイプのlaesGFPにおける励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図４】野生タイプのpmeaGFP1における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図５】野生タイプのpmeaGFP2における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図６】野生タイプのpmedGFP1における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図７】野生タイプのpmedGFP2における励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図８】野生タイプのpdae1GFPにおける励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【図９】CopCFPにおける励起(点線)および発光(実線)スペクトルを例示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群から選ばれる、蛍光たんぱく質をコード化する分離された核酸分子：
(a) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列を含むたんぱく質をコード化する核酸；
(b) SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27において示されるヌクレオチド配列を含む核酸；
(c) 緊縮条件下に前記(a)または(b)の核酸とハイブリッド化している核酸；
(d) 前記(a)のアミノ酸配列に対し少なくとも約60％の配列同一性を有するたんぱく質をコード化する核酸；
(e) 前記(b)のヌクレオチド配列に対し少なくとも約55％の配列同一性を有する核酸；
(f) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列中に少なくとも１個のアミノ酸置換、欠落または挿入を有するたんぱく質をコード化する核酸；
(g) 前記(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)の核酸の誘導体または擬態物；
(h) 前記(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の核酸の変異体；
(i) 遺伝子コードの縮退により、前記(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)または(h)の核酸とは異なる核酸；および、
(j) 前記(a)または(b)の核酸のフラグメント。
【請求項２】
前記核酸が、節足動物門からの生物体から分離される、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸が、コペポーダ亜綱からの生物体から分離される、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸が、ポンテラ科から分離される、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
(a) 請求項１記載の核酸分子；および(b) 所望宿主細胞内での前記核酸分子発現のための調節要素を含む発現カセット。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項８】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含む安定な細胞系。
【請求項９】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物。
【請求項１０】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含むトランスジェニック動物。
【請求項１１】
(a) 適切な発現調節要素に作動可能に結合させた請求項１記載の核酸分子を調製し、(b) 該核酸分子から蛍光たんぱく質を発現させ、そして、(c)他のたんぱく質を実質的に含まない蛍光たんぱく質を分離することを含む、蛍光たんぱく質の産生方法。
【請求項１２】
請求項１記載の核酸分子のフラグメントを含み、該フラグメントが長さにおいて少なくとも100個のアミノ酸のペプチドをコード化する、核酸分子。
【請求項１３】
請求項１記載の核酸分子の長さにおいて少なくとも300個の残基のヌクレオチド配列と実質的に同じかまたは同一である配列を有する核酸分子。
【請求項１４】
下記からなる群から選ばれた、分離された蛍光たんぱく質：
(a) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列を含むたんぱく質；
(b) SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコード化されたたんぱく質；
(c) 前記(a)または(b)のアミノ酸配列に対し少なくとも約60％の配列同一性を有するたんぱく質；
(d) 前記(a)、(b)または(c)のたんぱく質の変異体；
(e) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列中に少なくとも１個のアミノ酸置換、欠落または挿入を有するたんぱく質；
(f) 前記(a)、(b)、(c)、(d)または(e)のたんぱく質の誘導体；
(g) 前記(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)のたんぱく質のフラグメント；および、
(h) 前記(a)または(b)の長さにおいて少なくとも100個の残基のアミノ酸配列と実質的に同じかまたは同一である配列を有するたんぱく質。
【請求項１５】
請求項１４記載のたんぱく質を含む融合たんぱく質。
【請求項１６】
請求項１４記載のたんぱく質に特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、請求項６記載の発現カセット、請求項１４記載のたんぱく質、請求項１５記載の融合たんぱく質、またはこれらを産生させる手段を含むキット。
【請求項１８】
SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27からなる群から選ばれたヌクレオチド配列にハイブリッド化し得るヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１９】
生物学的分子を請求項１４記載のたんぱく質にカップリングさせることを含む生物学的分子の標識化方法。
【請求項２０】
請求項１４記載のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む細胞の標識化方法。
【請求項２１】
適切な非細胞性局在化シグナルに融合させた請求項１４記載のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む細胞オルガネラの標識化方法。
【請求項２２】
請求項１４または１５記載のたんぱく質から蛍光シグナルを検出することを含む生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法。
【請求項２３】
請求項１記載の核酸分子を細胞中に発現させることを含む生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法。
【請求項２４】
請求項１４または１５記載のたんぱく質から蛍光シグナルを検出することを含む生物学的分子の検出方法。
【請求項１】
下記からなる群から選ばれる、蛍光たんぱく質をコード化する分離された核酸分子：
(a) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列を含むたんぱく質をコード化する核酸；
(b) SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27において示されるヌクレオチド配列を含む核酸；
(c) 緊縮条件下に前記(a)または(b)の核酸とハイブリッド化している核酸；
(d) 前記(a)のアミノ酸配列に対し少なくとも約60％の配列同一性を有するたんぱく質をコード化する核酸；
(e) 前記(b)のヌクレオチド配列に対し少なくとも約55％の配列同一性を有する核酸；
(f) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列中に少なくとも１個のアミノ酸置換、欠落または挿入を有するたんぱく質をコード化する核酸；
(g) 前記(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)の核酸の誘導体または擬態物；
(h) 前記(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の核酸の変異体；
(i) 遺伝子コードの縮退により、前記(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)または(h)の核酸とは異なる核酸；および、
(j) 前記(a)または(b)の核酸のフラグメント。
【請求項２】
前記核酸が、節足動物門からの生物体から分離される、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸が、コペポーダ亜綱からの生物体から分離される、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸が、ポンテラ科から分離される、請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
(a) 請求項１記載の核酸分子；および(b) 所望宿主細胞内での前記核酸分子発現のための調節要素を含む発現カセット。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含む細胞。
【請求項８】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含む安定な細胞系。
【請求項９】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物。
【請求項１０】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、または請求項６記載の発現カセットを含むトランスジェニック動物。
【請求項１１】
(a) 適切な発現調節要素に作動可能に結合させた請求項１記載の核酸分子を調製し、(b) 該核酸分子から蛍光たんぱく質を発現させ、そして、(c)他のたんぱく質を実質的に含まない蛍光たんぱく質を分離することを含む、蛍光たんぱく質の産生方法。
【請求項１２】
請求項１記載の核酸分子のフラグメントを含み、該フラグメントが長さにおいて少なくとも100個のアミノ酸のペプチドをコード化する、核酸分子。
【請求項１３】
請求項１記載の核酸分子の長さにおいて少なくとも300個の残基のヌクレオチド配列と実質的に同じかまたは同一である配列を有する核酸分子。
【請求項１４】
下記からなる群から選ばれた、分離された蛍光たんぱく質：
(a) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列を含むたんぱく質；
(b) SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25または27において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコード化されたたんぱく質；
(c) 前記(a)または(b)のアミノ酸配列に対し少なくとも約60％の配列同一性を有するたんぱく質；
(d) 前記(a)、(b)または(c)のたんぱく質の変異体；
(e) SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26または28において示されるアミノ酸配列中に少なくとも１個のアミノ酸置換、欠落または挿入を有するたんぱく質；
(f) 前記(a)、(b)、(c)、(d)または(e)のたんぱく質の誘導体；
(g) 前記(a)、(b)、(c)、(d)、(e)または(f)のたんぱく質のフラグメント；および、
(h) 前記(a)または(b)の長さにおいて少なくとも100個の残基のアミノ酸配列と実質的に同じかまたは同一である配列を有するたんぱく質。
【請求項１５】
請求項１４記載のたんぱく質を含む融合たんぱく質。
【請求項１６】
請求項１４記載のたんぱく質に特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
請求項１記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、請求項６記載の発現カセット、請求項１４記載のたんぱく質、請求項１５記載の融合たんぱく質、またはこれらを産生させる手段を含むキット。
【請求項１８】
SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27からなる群から選ばれたヌクレオチド配列にハイブリッド化し得るヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１９】
生物学的分子を請求項１４記載のたんぱく質にカップリングさせることを含む生物学的分子の標識化方法。
【請求項２０】
請求項１４記載のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む細胞の標識化方法。
【請求項２１】
適切な非細胞性局在化シグナルに融合させた請求項１４記載のたんぱく質を細胞中に産生させることを含む細胞オルガネラの標識化方法。
【請求項２２】
請求項１４または１５記載のたんぱく質から蛍光シグナルを検出することを含む生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法。
【請求項２３】
請求項１記載の核酸分子を細胞中に発現させることを含む生物学的分子、細胞または細胞オルガネラの分析方法。
【請求項２４】
請求項１４または１５記載のたんぱく質から蛍光シグナルを検出することを含む生物学的分子の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５１２０９３（Ｐ２００６−５１２０９３Ａ）
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０９９５１（Ｐ２００５−５０９９５１）
【出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２００３／０００５２５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９７３
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０５１７４３４５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２００３／０００５２５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９７３
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０５１７４３４５）
【Ｆターム（参考）】
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