コラーゲン分解阻害剤
【課題】生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤および該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬の提供。
【解決手段】コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および／または２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、生薬を見出し、該生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤および該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬を得た。
【解決手段】コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および／または２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、生薬を見出し、該生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤および該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬を得た。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オウゴン（黄ゴン）、ケイヒ（桂皮）またはブクリョウ（茯苓）（以下、それぞれオウゴン、ケイヒ、ブクリョウと示す）等の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤に関する。また、該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
オウゴン、ケイヒまたはブクリョウ等の生薬は、草根木皮から得られる天然由来のものであり、健胃、充血性疾患、発熱を伴う出血性疾患、駆風薬等様々な用途に利用されている（例えば、非特許文献１参照）。近年では、薬に限られず、老化防止効果、美肌効果に優れた皮膚化粧料等の原料としても利用されており（例えば、特許文献１、２参照）、これらの生薬を組み合わせた漢方薬は、副作用が比較的少ない安全な薬とされている。
【０００３】
漢方薬は頭部、胸部、腹部等の体のさまざまな部位に利用されており、舌痛症、味覚異常、口内炎、口腔感染症等の口腔内違和感の解消にも利用されているが（例えば、非特許文献２参照）、歯周炎等の歯に関する疾病に有効なものはほとんど知られていない。
オウゴン、ケイヒ、ブクリョウ、キキョウ（桔梗、以下、キキョウと示す）をそれぞれ４．０、ジオウ（地黄、以下、ジオウと示す）を８．０となるように組み合わせた漢方薬のケイシゴモツトウ（桂枝五物湯、以下、ケイシゴモツトウと示す）において、歯牙の疼痛、口舌内炎、歯齦（しぎん）炎、歯槽膿漏等の口臭等に応用できることが示唆されているが（例えば、非特許文献３参照）、どのような機序によって効果を発揮するのか不明であり、これに含まれるそれぞれの生薬についての、歯に関する疾病への効果も不明であった。
【０００４】
歯に関する疾病のひとつである歯周炎は、様々な原因によって起こるものであるが、歯周組織のコラーゲン分解もその原因とされている。
従来の歯周炎治療薬は、抗生物質をはじめとする抗菌薬や、抗炎症薬が主であったが、これらは細菌や炎症性細胞を標的としたものであり、あくまで対症療法として使用するしかなかった。また、抗菌薬や抗炎症薬には耐性菌の出現や胃腸炎等の副作用があるため、一般的には長期使用できないという問題もあった。そこで、歯周組織のコラーゲン分解等の歯周炎の直接的な原因を標的とする、安全に長期使用できる薬剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３１５９３０号公報
【特許文献２】特開平１０−７２３３６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】天然医薬資源学、第４版、株式会社廣川書店発行
【非特許文献２】専門医のための漢方医学テキスト、社団法人 日本東洋医学会発行
【非特許文献３】臨床応用漢方処方解説（増補改訂版）、岩岡印刷株式会社発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、オウゴン、ケイヒまたはブクリョウ等の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤の提供を課題とする。また、該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者らが開発した「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）において、次の１）および／または２）を示す生薬を見出し、本発明を完成するに至った。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量が多い
該生薬はコラーゲン分解阻害剤の有効成分として有用であり、また、歯周組織のコラーゲン分解を原因のひとつとする歯周炎の治療においても有効である。本発明において見出されたこれらの生薬は、副作用の少ない安全性の高いものとして、漢方薬の原料に長年利用されているものであり、歯周炎の治療においても安全に利用できるものと予測される。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（４）のコラーゲン分解阻害剤および歯周炎治療薬に関する。
（１）コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、次の１）および／または２）を示す生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い
（２）生薬が、オウゴン、カンゾウ（甘草、以下、カンゾウと示す）、ケイヒ、サイシン（細辛、以下、サイシンと示す）、センキュウ（川キュウ、以下、センキュウと示す）、ボウフウ（防風、以下、ボウフウと示す）、ブクリョウ、リュウタン（竜胆、以下、リュウタンと示す）、オウレン（黄連、以下、オウレンと示す）、オンジ（遠志、以下、オンジと示す）、キョウカツ（キョウ活、以下、キョウカツと示す）、コウボク（厚朴、以下、コウボクと示す）、ゴシュユ（呉茱萸、以下、ゴシュユと示す）、ショウキョウ（生姜、以下、ショウキョウと示す）、ショウブコン（菖蒲根、以下、ショウブコンと示す）、センコツ（川骨、以下、センコツと示す）またはシンイ（辛夷、以下、シンイと示す）から選ばれるいずれか一種以上である上記（１）に記載のコラーゲン分解阻害剤。
（３）熱水またはメタノールで抽出した生薬を有効成分とする上記（１）または（２）に記載のコラーゲン分解阻害剤。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のコラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤は、コラーゲンの分解を原因のひとつとする歯周炎において、安全かつ有効な、新たな治療薬の提供に利用できる。また、関節リウマチ、変形性関節症、変形性腰椎症、骨粗鬆症、動脈硬化、浸潤・転移癌、クローン病、ヘルニア、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎またはリウマチ性多発筋痛症等のコラーゲンの分解を原因とする、歯周炎以外の疾患にも利用できる可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図２】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図３】線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６）または線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能をコラーゲンゲルの湿重量によって示した図である（実施例１）。
【図４】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図５】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図６】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能をコラーゲンゲルの湿重量によって示した図である（実施例１）。
【図７】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図８】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図９】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能をコラーゲンゲルの湿重量によって示した図である（実施例１）。
【図１０】線維芽細胞（ＧＦ００）におけるケイヒとケイシゴモツトウとのコラーゲン分解阻害能を比較した図である（実施例１）。
【図１１】線維芽細胞（ＧＦ００）におけるケイヒとトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）とのコラーゲン分解阻害能を比較した図である（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「コラーゲン分解阻害剤」とはコラーゲンの分解を阻害する剤のことをいい、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、次の１）および／または２）を示す生薬を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い
「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」とは、本発明者らが開発した「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）のことをいい、具体的には本発明の実施例１に示された方法のことをいう。
ここで、“１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する”とは、生薬を添加したコラーゲンゲルにおいてコラーゲンの溶解または分解が阻害されることにより、生薬等を含まないコラーゲンゲル（コントロール）と比べて、コラーゲンゲルの収縮が少ない状態になることをいう。
例えば、上記の「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）によってスクリーニングを行った際には、ある生薬を添加したコラーゲンゲルが、コラーゲンの溶解または分解が阻害され、コントロールとして用いたコラーゲンゲルよりもコラーゲンゲル自体が大きく観察される（即ち、コラーゲンゲルの収縮が抑制されている）のであれば、その添加した生薬は、本発明の“１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する”生薬であるといえる。
また、“２）コラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量が多い”とは、スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに含まれる、残存しているコラーゲン量が、生薬等を含まないコラーゲンゲル（コントロール）と比べて多いことをいう。これは、残存コラーゲン量を定量する前のコラーゲンゲルの湿重量から予測することができ、例えば、コラーゲンゲルが熱処理によっても可溶化せず、残存コラーゲン量を定量できない場合でも、コラーゲンゲルの湿重量が、生薬等を含まないコラーゲンゲル（コントロール）と比べて多い場合には、“２）コラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量が多い”とすることもできる。
【００１３】
本発明のこのような「生薬」としては、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、センキュウ、ボウフウ、ブクリョウ、リュウタン、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、センコツまたはシンイ等が挙げられる。本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、これらのコラーゲンの分解阻害能を有する生薬を一種以上含むものであれば良く、複数組み合わせて含むものであっても良い。
【００１４】
本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、特に、熱水またはメタノールで抽出したこれらの生薬を有効成分として含んでいることが好ましい。
例えば、熱水で抽出した生薬として、オウゴンの熱水抽出物、ケイヒの熱水抽出物、ブクリョウの熱水抽出物、ボウフウの熱水抽出物、オウレンの熱水抽出物、オンジの熱水抽出物またはセンコツの熱水抽出物等が挙げられる。また、メタノールで抽出した生薬として、オウゴンのメタノール抽出物、カンゾウのメタノール抽出物、ケイヒのメタノール抽出物、サイシンのメタノール抽出物、センキュウのメタノール抽出物、ボウフウのメタノール抽出物、リュウタンのメタノール抽出物、オウレンのメタノール抽出物、オンジのメタノール抽出物、キョウカツのメタノール抽出物、コウボクのメタノール抽出物、ゴシュユのメタノール抽出物、ショウキョウのメタノール抽出物、ショウブコンのメタノール抽出物、センコツのメタノール抽出物またはシンイのメタノール抽出物等が挙げられる。
本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、熱水またはメタノールで抽出したこれらの生薬を一種以上含むものであれば良く、複数組み合わせて含むものであっても良い。
さらに、本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、これらの有効成分に加えて、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。
【００１５】
本発明の「歯周炎治療薬」は、本発明の「コラーゲン分解阻害剤」を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。特に、オウゴン、ケイヒまたはブクリョウ等のコラーゲン分解阻害能を有する生薬、またはこれらを熱水またはメタノールで抽出したものを有効成分とする「コラーゲン分解阻害剤」を有効成分とするものであることが好ましい。
本発明の「歯周炎治療薬」は、本発明の「コラーゲン分解阻害剤」のみを含有するものであってもよく、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。
さらに、本発明の「歯周炎治療薬」は、液状、固形状、半固形状等のどのような形状であっても良く、塗布剤、チューイングガム、歯磨き剤、うがい薬またはシリンジで投与する歯周ポケット内貼薬等として用いることができる。
【００１６】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
＜コラーゲン分解阻害剤＞
「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）に記載の方法に従い、コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングした。
【００１８】
１．被験物質の調製
オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ブクリョウ、ボウフウおよびリュウタン、ウイキョウ（茴香、以下、ウイキョウと示す）、エンゴサク（延胡索、以下、エンゴサクと示す）、オウギ（黄耆、以下、オウギと示す）、オウレン、オンジ、カッコン（葛根、以下、カッコンと示す）、カンキョウ（乾姜、以下、カンキョウと示す）、キョウカツ、ケイガイ（荊芥、以下、ケイガイと示す）、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミン（五味子、以下、ゴミンと示す）、サイコ（柴胡、以下、サイコと示す）、サンシン（山梔子、以下、サンシンと示す）、サンショウ（山椒、以下、サンショウと示す）、サンズコン（山豆根、以下、サンズコンと示す）、サンソウニン（酸棗仁、以下、サンソウニンと示す）、シャクヤク（芍薬、以下、シャクヤクと示す）、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツ（蒼朮、以下、ソウジュツと示す）またはシンイの３３種類の生薬（いずれも株式会社ウチダ和漢薬）を用いた。
【００１９】
１）熱水抽出
各生薬（サンソウニンおよびショウブコンを除く）を熱水で抽出し、熱水抽出物を得た。
即ち、各生薬約１０ｇを精秤し、ガラス製ティーポット型の容器（煎じ器：株式会社ウチダ和漢薬）にいれ、精製水２００ｍＬ（生薬重量の２０倍量）を加えた。電熱器で沸騰させ、水の量が半量になるまで加熱した（およそ沸騰から２０分）。熱時、カスを濾し、得られた熱水抽出液を室温にさましてから、遠心管に移し遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１０分、１５度）を行った。遠心分離後の上清を吸引ろ過し、ろ液を得た。ろ液を凍結乾燥し熱水抽出物とした。
【００２０】
２）メタノール抽出
各生薬（ブクリョウおよびボウフウを除く）をメタノールで抽出し、メタノール抽出物を得た。
即ち、各生薬約１０ｇを精秤し、ナス型フラスコに入れ、１５０ｍＬの７０％メタノールを加え、４０分間還流抽出を行った。熱時ろ過し、残渣に新たに７０％メタノール１５０ｍＬを加え、再度４０分間還流抽出を行った。熱時ろ過し、先に得たろ液と合わせ、エバポレーターを用いて減圧濃縮した。メタノールが消失した後凍結乾燥し、メタノール抽出物とした。
【００２１】
３）比較物
本発明者らの出願（特願２０１０−０２４３３９）においてコラーゲン分解阻害能が確認されているトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）（持田製薬株式会社）をポジティブコントロールとして用いた。また、ケイシゴモツトウ（オウゴン、ケイヒ、ブクリョウ、キキョウ、ジオウの水製エキス）（原沢製薬工業株式会社）を比較物として用いた。
【００２２】
２．コラーゲンゲルの調製
１）細胞の調製
歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片または抜去歯より組織を経て細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉線維芽細胞（ＧＦ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を、コラーゲン分解能を有する細胞として得た。このうち、コラーゲンゲル収縮率が大きく、コラーゲンゲル収縮後の残存コラーゲン量が約５００μｇ以下と少ない、コラーゲン分解能が高いヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）を特に用いた。このヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）を直径３５ｍｍのコラーゲンゲルを用いて培養した場合、培養終了時には直径３ｍｍ以下位までにコラーゲンゲルを収縮することが観察されており、重度歯周炎の患者から得られるヒト歯肉線維芽細胞であった。得られたヒト歯肉線維芽細胞は、それぞれ由来する歯肉片または抜去歯ごとに、ＧＦＡ１１−６またはＧＦ００と示した。
次に、歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片をＤｉｓｐａｓｅ処理した後、結合組織部分から剥離した上皮組織を細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉上皮細胞（ＧＥ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を、コラーゲン分解能を高める細胞として得た。得られたヒト歯肉上皮細胞は、それぞれ由来する歯肉片ごとに、ＧＥＡ１１、ＧＥＡ１４またはＧＥＡ１５と示した。
【００２３】
２）コラーゲンゲルの構築
セルマトリックスｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作成した。このコラーゲン混合溶液に、スクリーニングに用いる被験物質または比較物を加えた。また、被験物質、比較物等を加えないものをコントロールとした。
これらに上記１）で調製したコラーゲン分解能を有する細胞を懸濁した後、６穴プレート内に播種して３０分間硬化（ゲル化）させ、コラーゲン分解能を有する細胞を含むコラーゲンゲルを構築した。
次に、このコラーゲンゲル上に、上記１）で調製したコラーゲン分解能を高める細胞をトリプシンで分散させた後播種し、コラーゲン分解細胞の単層を形成させ、コラーゲン分解能を有する細胞とコラーゲン分解能を高める細胞とを含むコラーゲンゲルを構築した。
【００２４】
３．コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング
上記で構築した被験物質を含むコラーゲンゲルを、２４時間後にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始した（培養１日目）。浮遊培養開始時点に、再度被験物質を加えた。浮遊培養開始後５日目の段階で、コラーゲンゲルの収縮レベル、残存コラーゲン量定量前のコラーゲンゲルの湿重量および残存コラーゲン量を定量することで、被験物質によるコラーゲン分解阻害の有無や程度を調べ、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニングを行った。
【００２５】
コラーゲンゲルに含まれる残存コラーゲン量は、Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ｃａｒｒｉｃｋｆｅｒｇｕｓ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ，ＵＫ）を用い、熱処理して可溶化したコラーゲンゲルを試料として、コラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量を測定することで定量した。コラーゲンゲルは浮遊細胞培養開始後５日目のものを用いた。
【００２６】
４．結果
図１〜３は、熱水またはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ブクリョウ、ボウフウおよびリュウタンをそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６細胞、ＧＦ００細胞）におけるコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。図１、２は残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルを示したものであり、図３はコラーゲンゲルの湿重量を示したものである。
【００２７】
図１に示したように、線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６細胞）を用いたスクリーニングにおいて、オウゴン、ケイヒまたはボウフウの熱水抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。
また、オウゴン、カンゾウ、ケイヒまたはセンキュウのメタノール抽出物も、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。サイシンのメタノール抽出物は、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、ことが十分に示されなかったものの、２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有していることが示唆された。
【００２８】
また、図２に示したように、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）を用いたスクリーニングにおいて、オウゴン、ケイヒまたはブクリョウの熱水抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。
また、オウゴンまたはケイヒのメタノール抽出物も、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。カンゾウ、センキュウ、ボウフウまたはリュウタンのメタノール抽出物を用いたものは、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、ことが十分に示されなかったものの、２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有していることが示唆された。
【００２９】
図４〜６は、熱水で抽出したウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サイコ、サンシン、サンショウ、サンズコン、シャクヤク、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツまたはシンイをそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）におけるコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。図４、５は残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルを示したものであり、図６はコラーゲンゲルの湿重量を示したものである。
図４および５に示したように、オウレン（Ｗ１３）、オンジ（Ｗ１４）またはセンコツ（Ｗ３１）の熱水抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。
【００３０】
図７〜９は、メタノールで抽出したウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サイコ、サンシン、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツまたはシンイをそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）におけるコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。図７、８は残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルを示したものであり、図９はコラーゲンゲルの湿重量を示したものである。
図７および８に示したように、オウレン（Ｍ１３）、オンジ（Ｍ１４）、キョウカツ（Ｍ１７）、コウボク（Ｍ２０）、ゴシュユ（Ｍ２１）、ショウキョウ（Ｍ２９）、ショウブコン（Ｍ３０）またはシンイ（Ｍ３３）のメタノール抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。センコツ（Ｍ３１）のメタノール抽出物は、スクリーニングにおいてコラーゲンゲルが熱処理によっても可溶化しなかったため、残存コラーゲン量を定量できなかったが、コラーゲンゲルの湿重量の測定結果（図９）から推測すると、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有していることが示唆された。
【００３１】
従って、図１〜９より、オウゴン、ケイヒ、ブクリョウ、ボウフウ、オウレン、オンジまたはセンコツの熱水抽出物、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、センキュウ、ボウフウ、リュウタン、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、センコツまたはシンイのメタノール抽出物が、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および／または２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有する生薬であることが確認された。
【００３２】
図１０、１１は、ケイヒのメタノール抽出物を０、１、１０、１００μｇ／ｍＬ、ケイシゴモツトウを０、１０、３０μｇ／ｍＬおよびトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）を０、２５、１００μｇ／ｍＬとなるように、それぞれコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）における各物質のコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。
その結果、ケイヒのメタノール抽出物を１００μｇ／ｍＬとなるように添加したコラーゲンゲルと、トラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）を１００μｇ／ｍＬとなるように添加したコラーゲンゲルでは、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、のが同程度であり、いずれもコラーゲン分解阻害能を有していることが確認された。
ケイシゴモツトウを３０μｇ／ｍＬ、トラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）を４００μｇ／ｍＬとなるように添加したコラーゲンゲルでも、コラーゲンの分解が全くみられなかったが、これは、コラーゲンゲルに含まれ、コラーゲン分解能を有する線維芽細胞自体が、細胞毒性によって死滅したことによるものであった。従って、ケイシゴモツトウおよび高濃度のトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）は細胞毒性が高く、コラーゲン分解阻害剤として有用でないことが確認された。
【００３３】
５．コラーゲン分解阻害剤の製造
上記において確認されたコラーゲンの分解阻害能を有する生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤を製造した。
【実施例２】
【００３４】
＜歯周炎治療薬＞
実施例１において製造されたコラーゲン分解阻害剤を有効成分として、歯周炎治療薬を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のオウゴン、ケイまたはブクリョウ等の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤の提供により、コラーゲンの分解を主な原因とする歯周炎において有効かつ安全な新たな治療薬を提供することができる。
日本には、約５０００万人の歯周病患者と７００万人の重度歯周炎患者がいるとされているが、本発明のコラーゲン分解阻害剤を用いることで、従来の治療法では治療が困難であった難治性（重度）の歯周炎の進行の停止等を目的とする、新たな歯周炎の治療法の開発にも利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オウゴン（黄ゴン）、ケイヒ（桂皮）またはブクリョウ（茯苓）（以下、それぞれオウゴン、ケイヒ、ブクリョウと示す）等の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤に関する。また、該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
オウゴン、ケイヒまたはブクリョウ等の生薬は、草根木皮から得られる天然由来のものであり、健胃、充血性疾患、発熱を伴う出血性疾患、駆風薬等様々な用途に利用されている（例えば、非特許文献１参照）。近年では、薬に限られず、老化防止効果、美肌効果に優れた皮膚化粧料等の原料としても利用されており（例えば、特許文献１、２参照）、これらの生薬を組み合わせた漢方薬は、副作用が比較的少ない安全な薬とされている。
【０００３】
漢方薬は頭部、胸部、腹部等の体のさまざまな部位に利用されており、舌痛症、味覚異常、口内炎、口腔感染症等の口腔内違和感の解消にも利用されているが（例えば、非特許文献２参照）、歯周炎等の歯に関する疾病に有効なものはほとんど知られていない。
オウゴン、ケイヒ、ブクリョウ、キキョウ（桔梗、以下、キキョウと示す）をそれぞれ４．０、ジオウ（地黄、以下、ジオウと示す）を８．０となるように組み合わせた漢方薬のケイシゴモツトウ（桂枝五物湯、以下、ケイシゴモツトウと示す）において、歯牙の疼痛、口舌内炎、歯齦（しぎん）炎、歯槽膿漏等の口臭等に応用できることが示唆されているが（例えば、非特許文献３参照）、どのような機序によって効果を発揮するのか不明であり、これに含まれるそれぞれの生薬についての、歯に関する疾病への効果も不明であった。
【０００４】
歯に関する疾病のひとつである歯周炎は、様々な原因によって起こるものであるが、歯周組織のコラーゲン分解もその原因とされている。
従来の歯周炎治療薬は、抗生物質をはじめとする抗菌薬や、抗炎症薬が主であったが、これらは細菌や炎症性細胞を標的としたものであり、あくまで対症療法として使用するしかなかった。また、抗菌薬や抗炎症薬には耐性菌の出現や胃腸炎等の副作用があるため、一般的には長期使用できないという問題もあった。そこで、歯周組織のコラーゲン分解等の歯周炎の直接的な原因を標的とする、安全に長期使用できる薬剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−３１５９３０号公報
【特許文献２】特開平１０−７２３３６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】天然医薬資源学、第４版、株式会社廣川書店発行
【非特許文献２】専門医のための漢方医学テキスト、社団法人 日本東洋医学会発行
【非特許文献３】臨床応用漢方処方解説（増補改訂版）、岩岡印刷株式会社発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、オウゴン、ケイヒまたはブクリョウ等の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤の提供を課題とする。また、該コラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者らが開発した「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）において、次の１）および／または２）を示す生薬を見出し、本発明を完成するに至った。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量が多い
該生薬はコラーゲン分解阻害剤の有効成分として有用であり、また、歯周組織のコラーゲン分解を原因のひとつとする歯周炎の治療においても有効である。本発明において見出されたこれらの生薬は、副作用の少ない安全性の高いものとして、漢方薬の原料に長年利用されているものであり、歯周炎の治療においても安全に利用できるものと予測される。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（４）のコラーゲン分解阻害剤および歯周炎治療薬に関する。
（１）コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、次の１）および／または２）を示す生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い
（２）生薬が、オウゴン、カンゾウ（甘草、以下、カンゾウと示す）、ケイヒ、サイシン（細辛、以下、サイシンと示す）、センキュウ（川キュウ、以下、センキュウと示す）、ボウフウ（防風、以下、ボウフウと示す）、ブクリョウ、リュウタン（竜胆、以下、リュウタンと示す）、オウレン（黄連、以下、オウレンと示す）、オンジ（遠志、以下、オンジと示す）、キョウカツ（キョウ活、以下、キョウカツと示す）、コウボク（厚朴、以下、コウボクと示す）、ゴシュユ（呉茱萸、以下、ゴシュユと示す）、ショウキョウ（生姜、以下、ショウキョウと示す）、ショウブコン（菖蒲根、以下、ショウブコンと示す）、センコツ（川骨、以下、センコツと示す）またはシンイ（辛夷、以下、シンイと示す）から選ばれるいずれか一種以上である上記（１）に記載のコラーゲン分解阻害剤。
（３）熱水またはメタノールで抽出した生薬を有効成分とする上記（１）または（２）に記載のコラーゲン分解阻害剤。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のコラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤は、コラーゲンの分解を原因のひとつとする歯周炎において、安全かつ有効な、新たな治療薬の提供に利用できる。また、関節リウマチ、変形性関節症、変形性腰椎症、骨粗鬆症、動脈硬化、浸潤・転移癌、クローン病、ヘルニア、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎またはリウマチ性多発筋痛症等のコラーゲンの分解を原因とする、歯周炎以外の疾患にも利用できる可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図２】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図３】線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６）または線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能をコラーゲンゲルの湿重量によって示した図である（実施例１）。
【図４】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図５】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図６】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能をコラーゲンゲルの湿重量によって示した図である（実施例１）。
【図７】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図８】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能を残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルによって示した図である（実施例１）。
【図９】線維芽細胞（ＧＦ００）における各生薬のコラーゲン分解阻害能をコラーゲンゲルの湿重量によって示した図である（実施例１）。
【図１０】線維芽細胞（ＧＦ００）におけるケイヒとケイシゴモツトウとのコラーゲン分解阻害能を比較した図である（実施例１）。
【図１１】線維芽細胞（ＧＦ００）におけるケイヒとトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）とのコラーゲン分解阻害能を比較した図である（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「コラーゲン分解阻害剤」とはコラーゲンの分解を阻害する剤のことをいい、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、次の１）および／または２）を示す生薬を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い
「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」とは、本発明者らが開発した「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）のことをいい、具体的には本発明の実施例１に示された方法のことをいう。
ここで、“１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する”とは、生薬を添加したコラーゲンゲルにおいてコラーゲンの溶解または分解が阻害されることにより、生薬等を含まないコラーゲンゲル（コントロール）と比べて、コラーゲンゲルの収縮が少ない状態になることをいう。
例えば、上記の「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）によってスクリーニングを行った際には、ある生薬を添加したコラーゲンゲルが、コラーゲンの溶解または分解が阻害され、コントロールとして用いたコラーゲンゲルよりもコラーゲンゲル自体が大きく観察される（即ち、コラーゲンゲルの収縮が抑制されている）のであれば、その添加した生薬は、本発明の“１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する”生薬であるといえる。
また、“２）コラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量が多い”とは、スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに含まれる、残存しているコラーゲン量が、生薬等を含まないコラーゲンゲル（コントロール）と比べて多いことをいう。これは、残存コラーゲン量を定量する前のコラーゲンゲルの湿重量から予測することができ、例えば、コラーゲンゲルが熱処理によっても可溶化せず、残存コラーゲン量を定量できない場合でも、コラーゲンゲルの湿重量が、生薬等を含まないコラーゲンゲル（コントロール）と比べて多い場合には、“２）コラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量が多い”とすることもできる。
【００１３】
本発明のこのような「生薬」としては、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、センキュウ、ボウフウ、ブクリョウ、リュウタン、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、センコツまたはシンイ等が挙げられる。本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、これらのコラーゲンの分解阻害能を有する生薬を一種以上含むものであれば良く、複数組み合わせて含むものであっても良い。
【００１４】
本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、特に、熱水またはメタノールで抽出したこれらの生薬を有効成分として含んでいることが好ましい。
例えば、熱水で抽出した生薬として、オウゴンの熱水抽出物、ケイヒの熱水抽出物、ブクリョウの熱水抽出物、ボウフウの熱水抽出物、オウレンの熱水抽出物、オンジの熱水抽出物またはセンコツの熱水抽出物等が挙げられる。また、メタノールで抽出した生薬として、オウゴンのメタノール抽出物、カンゾウのメタノール抽出物、ケイヒのメタノール抽出物、サイシンのメタノール抽出物、センキュウのメタノール抽出物、ボウフウのメタノール抽出物、リュウタンのメタノール抽出物、オウレンのメタノール抽出物、オンジのメタノール抽出物、キョウカツのメタノール抽出物、コウボクのメタノール抽出物、ゴシュユのメタノール抽出物、ショウキョウのメタノール抽出物、ショウブコンのメタノール抽出物、センコツのメタノール抽出物またはシンイのメタノール抽出物等が挙げられる。
本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、熱水またはメタノールで抽出したこれらの生薬を一種以上含むものであれば良く、複数組み合わせて含むものであっても良い。
さらに、本発明の「コラーゲン分解阻害剤」は、これらの有効成分に加えて、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。
【００１５】
本発明の「歯周炎治療薬」は、本発明の「コラーゲン分解阻害剤」を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。特に、オウゴン、ケイヒまたはブクリョウ等のコラーゲン分解阻害能を有する生薬、またはこれらを熱水またはメタノールで抽出したものを有効成分とする「コラーゲン分解阻害剤」を有効成分とするものであることが好ましい。
本発明の「歯周炎治療薬」は、本発明の「コラーゲン分解阻害剤」のみを含有するものであってもよく、薬学的に許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。
さらに、本発明の「歯周炎治療薬」は、液状、固形状、半固形状等のどのような形状であっても良く、塗布剤、チューイングガム、歯磨き剤、うがい薬またはシリンジで投与する歯周ポケット内貼薬等として用いることができる。
【００１６】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
＜コラーゲン分解阻害剤＞
「コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法」（特願２００９−０７２１８５）に記載の方法に従い、コラーゲン分解阻害能を有する物質をスクリーニングした。
【００１８】
１．被験物質の調製
オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ブクリョウ、ボウフウおよびリュウタン、ウイキョウ（茴香、以下、ウイキョウと示す）、エンゴサク（延胡索、以下、エンゴサクと示す）、オウギ（黄耆、以下、オウギと示す）、オウレン、オンジ、カッコン（葛根、以下、カッコンと示す）、カンキョウ（乾姜、以下、カンキョウと示す）、キョウカツ、ケイガイ（荊芥、以下、ケイガイと示す）、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミン（五味子、以下、ゴミンと示す）、サイコ（柴胡、以下、サイコと示す）、サンシン（山梔子、以下、サンシンと示す）、サンショウ（山椒、以下、サンショウと示す）、サンズコン（山豆根、以下、サンズコンと示す）、サンソウニン（酸棗仁、以下、サンソウニンと示す）、シャクヤク（芍薬、以下、シャクヤクと示す）、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツ（蒼朮、以下、ソウジュツと示す）またはシンイの３３種類の生薬（いずれも株式会社ウチダ和漢薬）を用いた。
【００１９】
１）熱水抽出
各生薬（サンソウニンおよびショウブコンを除く）を熱水で抽出し、熱水抽出物を得た。
即ち、各生薬約１０ｇを精秤し、ガラス製ティーポット型の容器（煎じ器：株式会社ウチダ和漢薬）にいれ、精製水２００ｍＬ（生薬重量の２０倍量）を加えた。電熱器で沸騰させ、水の量が半量になるまで加熱した（およそ沸騰から２０分）。熱時、カスを濾し、得られた熱水抽出液を室温にさましてから、遠心管に移し遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１０分、１５度）を行った。遠心分離後の上清を吸引ろ過し、ろ液を得た。ろ液を凍結乾燥し熱水抽出物とした。
【００２０】
２）メタノール抽出
各生薬（ブクリョウおよびボウフウを除く）をメタノールで抽出し、メタノール抽出物を得た。
即ち、各生薬約１０ｇを精秤し、ナス型フラスコに入れ、１５０ｍＬの７０％メタノールを加え、４０分間還流抽出を行った。熱時ろ過し、残渣に新たに７０％メタノール１５０ｍＬを加え、再度４０分間還流抽出を行った。熱時ろ過し、先に得たろ液と合わせ、エバポレーターを用いて減圧濃縮した。メタノールが消失した後凍結乾燥し、メタノール抽出物とした。
【００２１】
３）比較物
本発明者らの出願（特願２０１０−０２４３３９）においてコラーゲン分解阻害能が確認されているトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）（持田製薬株式会社）をポジティブコントロールとして用いた。また、ケイシゴモツトウ（オウゴン、ケイヒ、ブクリョウ、キキョウ、ジオウの水製エキス）（原沢製薬工業株式会社）を比較物として用いた。
【００２２】
２．コラーゲンゲルの調製
１）細胞の調製
歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片または抜去歯より組織を経て細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉線維芽細胞（ＧＦ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を、コラーゲン分解能を有する細胞として得た。このうち、コラーゲンゲル収縮率が大きく、コラーゲンゲル収縮後の残存コラーゲン量が約５００μｇ以下と少ない、コラーゲン分解能が高いヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）を特に用いた。このヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）を直径３５ｍｍのコラーゲンゲルを用いて培養した場合、培養終了時には直径３ｍｍ以下位までにコラーゲンゲルを収縮することが観察されており、重度歯周炎の患者から得られるヒト歯肉線維芽細胞であった。得られたヒト歯肉線維芽細胞は、それぞれ由来する歯肉片または抜去歯ごとに、ＧＦＡ１１−６またはＧＦ００と示した。
次に、歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片をＤｉｓｐａｓｅ処理した後、結合組織部分から剥離した上皮組織を細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉上皮細胞（ＧＥ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を、コラーゲン分解能を高める細胞として得た。得られたヒト歯肉上皮細胞は、それぞれ由来する歯肉片ごとに、ＧＥＡ１１、ＧＥＡ１４またはＧＥＡ１５と示した。
【００２３】
２）コラーゲンゲルの構築
セルマトリックスｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作成した。このコラーゲン混合溶液に、スクリーニングに用いる被験物質または比較物を加えた。また、被験物質、比較物等を加えないものをコントロールとした。
これらに上記１）で調製したコラーゲン分解能を有する細胞を懸濁した後、６穴プレート内に播種して３０分間硬化（ゲル化）させ、コラーゲン分解能を有する細胞を含むコラーゲンゲルを構築した。
次に、このコラーゲンゲル上に、上記１）で調製したコラーゲン分解能を高める細胞をトリプシンで分散させた後播種し、コラーゲン分解細胞の単層を形成させ、コラーゲン分解能を有する細胞とコラーゲン分解能を高める細胞とを含むコラーゲンゲルを構築した。
【００２４】
３．コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング
上記で構築した被験物質を含むコラーゲンゲルを、２４時間後にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始した（培養１日目）。浮遊培養開始時点に、再度被験物質を加えた。浮遊培養開始後５日目の段階で、コラーゲンゲルの収縮レベル、残存コラーゲン量定量前のコラーゲンゲルの湿重量および残存コラーゲン量を定量することで、被験物質によるコラーゲン分解阻害の有無や程度を調べ、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニングを行った。
【００２５】
コラーゲンゲルに含まれる残存コラーゲン量は、Ｓｉｒｃｏｌ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ｃａｒｒｉｃｋｆｅｒｇｕｓ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ，ＵＫ）を用い、熱処理して可溶化したコラーゲンゲルを試料として、コラーゲンゲル中に残存するコラーゲン量を測定することで定量した。コラーゲンゲルは浮遊細胞培養開始後５日目のものを用いた。
【００２６】
４．結果
図１〜３は、熱水またはメタノールで抽出したオウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、ジオウ、センキュウ、ブクリョウ、ボウフウおよびリュウタンをそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６細胞、ＧＦ００細胞）におけるコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。図１、２は残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルを示したものであり、図３はコラーゲンゲルの湿重量を示したものである。
【００２７】
図１に示したように、線維芽細胞（ＧＦＡ１１−６細胞）を用いたスクリーニングにおいて、オウゴン、ケイヒまたはボウフウの熱水抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。
また、オウゴン、カンゾウ、ケイヒまたはセンキュウのメタノール抽出物も、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。サイシンのメタノール抽出物は、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、ことが十分に示されなかったものの、２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有していることが示唆された。
【００２８】
また、図２に示したように、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）を用いたスクリーニングにおいて、オウゴン、ケイヒまたはブクリョウの熱水抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。
また、オウゴンまたはケイヒのメタノール抽出物も、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。カンゾウ、センキュウ、ボウフウまたはリュウタンのメタノール抽出物を用いたものは、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、ことが十分に示されなかったものの、２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有していることが示唆された。
【００２９】
図４〜６は、熱水で抽出したウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サイコ、サンシン、サンショウ、サンズコン、シャクヤク、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツまたはシンイをそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）におけるコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。図４、５は残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルを示したものであり、図６はコラーゲンゲルの湿重量を示したものである。
図４および５に示したように、オウレン（Ｗ１３）、オンジ（Ｗ１４）またはセンコツ（Ｗ３１）の熱水抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。
【００３０】
図７〜９は、メタノールで抽出したウイキョウ、エンゴサク、オウギ、オウレン、オンジ、カッコン、カンキョウ、キョウカツ、ケイガイ、ゲンチアナ末、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サイコ、サンシン、サンショウ、サンズコン、サンソウニン、シャクヤク、ショウキョウ、ショウブコン、センコツ、ソウジュツまたはシンイをそれぞれ１００μｇ／ｍＬとなるようにコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）におけるコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。図７、８は残存コラーゲン量とコラーゲンゲルの収縮レベルを示したものであり、図９はコラーゲンゲルの湿重量を示したものである。
図７および８に示したように、オウレン（Ｍ１３）、オンジ（Ｍ１４）、キョウカツ（Ｍ１７）、コウボク（Ｍ２０）、ゴシュユ（Ｍ２１）、ショウキョウ（Ｍ２９）、ショウブコン（Ｍ３０）またはシンイ（Ｍ３３）のメタノール抽出物は、いずれも１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであった。センコツ（Ｍ３１）のメタノール抽出物は、スクリーニングにおいてコラーゲンゲルが熱処理によっても可溶化しなかったため、残存コラーゲン量を定量できなかったが、コラーゲンゲルの湿重量の測定結果（図９）から推測すると、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有していることが示唆された。
【００３１】
従って、図１〜９より、オウゴン、ケイヒ、ブクリョウ、ボウフウ、オウレン、オンジまたはセンコツの熱水抽出物、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、センキュウ、ボウフウ、リュウタン、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、センコツまたはシンイのメタノール抽出物が、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、および／または２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い、ものであり、コラーゲン分解阻害能を有する生薬であることが確認された。
【００３２】
図１０、１１は、ケイヒのメタノール抽出物を０、１、１０、１００μｇ／ｍＬ、ケイシゴモツトウを０、１０、３０μｇ／ｍＬおよびトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）を０、２５、１００μｇ／ｍＬとなるように、それぞれコラーゲン混合溶液に添加して構築したコラーゲンゲルを用い、線維芽細胞（ＧＦ００細胞）における各物質のコラーゲン分解阻害能を検討した結果を示したものである。
その結果、ケイヒのメタノール抽出物を１００μｇ／ｍＬとなるように添加したコラーゲンゲルと、トラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）を１００μｇ／ｍＬとなるように添加したコラーゲンゲルでは、１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する、のが同程度であり、いずれもコラーゲン分解阻害能を有していることが確認された。
ケイシゴモツトウを３０μｇ／ｍＬ、トラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）を４００μｇ／ｍＬとなるように添加したコラーゲンゲルでも、コラーゲンの分解が全くみられなかったが、これは、コラーゲンゲルに含まれ、コラーゲン分解能を有する線維芽細胞自体が、細胞毒性によって死滅したことによるものであった。従って、ケイシゴモツトウおよび高濃度のトラピジル（Ｔｒａｐｉｄｉｌ）は細胞毒性が高く、コラーゲン分解阻害剤として有用でないことが確認された。
【００３３】
５．コラーゲン分解阻害剤の製造
上記において確認されたコラーゲンの分解阻害能を有する生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤を製造した。
【実施例２】
【００３４】
＜歯周炎治療薬＞
実施例１において製造されたコラーゲン分解阻害剤を有効成分として、歯周炎治療薬を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のオウゴン、ケイまたはブクリョウ等の生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤の提供により、コラーゲンの分解を主な原因とする歯周炎において有効かつ安全な新たな治療薬を提供することができる。
日本には、約５０００万人の歯周病患者と７００万人の重度歯周炎患者がいるとされているが、本発明のコラーゲン分解阻害剤を用いることで、従来の治療法では治療が困難であった難治性（重度）の歯周炎の進行の停止等を目的とする、新たな歯周炎の治療法の開発にも利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、次の１）および／または２）を示す生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い
【請求項２】
生薬が、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、センキュウ、ボウフウ、ブクリョウ、リュウタン、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、センコツまたはシンイから選ばれるいずれか一種以上である請求項１または２に記載のコラーゲン分解阻害剤。
【請求項３】
熱水またはメタノールで抽出した生薬を有効成分とする請求項１または２に記載のコラーゲン分解阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
【請求項１】
コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法において、次の１）および／または２）を示す生薬を有効成分とするコラーゲン分解阻害剤。
１）コラーゲンゲルの収縮を抑制する
２）スクリーニングにおいてコラーゲンゲルに残存するコラーゲン量が多い
【請求項２】
生薬が、オウゴン、カンゾウ、ケイヒ、サイシン、センキュウ、ボウフウ、ブクリョウ、リュウタン、オウレン、オンジ、キョウカツ、コウボク、ゴシュユ、ショウキョウ、ショウブコン、センコツまたはシンイから選ばれるいずれか一種以上である請求項１または２に記載のコラーゲン分解阻害剤。
【請求項３】
熱水またはメタノールで抽出した生薬を有効成分とする請求項１または２に記載のコラーゲン分解阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−２５６１３６（Ｐ２０１１−２５６１３６Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３２２０６（Ｐ２０１０−１３２２０６）
【出願日】平成２２年６月９日（２０１０．６．９）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５９２０１９２１３）学校法人昭和大学 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月９日（２０１０．６．９）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５９２０１９２１３）学校法人昭和大学 (23)
【Ｆターム（参考）】
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