コロナウイルス、核酸、蛋白質、ならびにワクチンの生成方法、薬剤および診断
新規コロナウイルス、ＨｃｏＶ−ＮＬ６３は、ヒトを含む指向性とともにここで開示される。手段および方法が、（以前に）ウイルスに感染した対象を診断するために提供される。また、特にワクチン、薬剤、核酸および特異的結合要素が提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はウイルス学および医薬の分野に関連する。さらに、特に本発明は新規コロナウイルスの同定と、種々の試料中のウイルスを分類し、疾患を診断する手段および方法、感染した対象またはその危険のある対象の治療のためのワクチンおよび薬剤を開発する手段および方法等の、ウイルスに関連する手段および方法とに関連する。
【０００２】
コロナウイルスはコロナウイルス科の中の属であるが、大きなエンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡは大きさが２７〜３２ｋｂであり、キャップされ、ポリアデニル化されている。コロナウイルスの３種の血清学的に別個の群が同定された。各群内で、ウイルスは宿主域およびゲノム配列によって同定される。コロナウイルスは、マウス、ラット、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシおよびヒトにおいて同定された（３９，４０）。大部分のコロナウイルスは１種の宿主のみを感染させ、胃腸炎を含む重度の疾患および気道疾患を引き起こす。ヒトにおいて、３種のコロナウイルスが詳細に研究されている。ＨＣｏＶ−２２９ＥおよびＨＣｏＶ−ＯＣ４３は６０代半ばで同定されており、一般的な感冒を引き起こすことが知られている（１３−１７，１９，４１，４２）。一般的な感冒の他に、ＨＣｏＶ−２２９Ｅウイルスはより悪い状態の気道疾患を罹患している幼児から単離されているので、ＨＣｏＶ−２２９Ｅは幼児においてさらに重度の疾患を引き起こし得ることが示唆されている（２８）。第３の最近同定されたコロナウイルス、すなわちＳＡＲＳ−ＣｏＶは、生命に関わる肺炎を引き起こす可能性を有しており（４３）、これまで同定された最も病原性を有するヒトコロナウイルスである。ＳＡＲＳ−ＣｏＶはコロナウイルスの第４の群の第１の要素である、または該ウイルスは群２のコロナウイルスの異常型であることが示唆されている（２７，４４）。
【０００３】
コロナウイルスのゲノムは４種の構造タンパク質、すなわち、スパイク蛋白質と、膜蛋白質と、エンベロープ蛋白質と、ヌクレオカプシド蛋白質とをコードする。数種の非構造蛋白質が複製および転写に関与しており、ゲノム（１Ａおよび１Ｂ）の５’末端で、２つの長いオーバーラップするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。これらの２つのＯＲＦはリボソームフレームシフトを経て結合される。ＯＲＦ１Ａおよび１Ｂにコードされるポリペプチドは、ウイルスコードプロテアーゼによって、翻訳後処理される。さらに、さらなる非構造蛋白質がＳおよびＥ遺伝子間、またはＭおよびＮ遺伝子間もしくはＮ遺伝子の下流でコードされる。これらの「補助非構造蛋白質遺伝子」の中には、ウイルス複製に必須ではないと分かっているものもある（４５，４６）。１Ａおよび１Ｂのコロナウイルス遺伝子産物は、ゲノムＲＮＡから翻訳されるが、残りのウイルス蛋白質はサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ ｍＲＮＡ）から翻訳され、それぞれ、ゲノムの５’部分由来の５’末端を有している。ｓｇ ｍＲＮＡは、ほとんどがマイナス鎖合成に間に起こる可能性のある不連続的翻訳処理を経て得られる（４７）。不連続的翻訳は、シス作用エレメント間の塩基対、すなわち転写関連配列（ＴＲＳ）を必要とし、一方はゲノムの５’部分に位置する配列（始端部ＴＲＳ）であり、他方はＯＲＦの上流に位置する配列（本体ＴＲＳ）である（４８）。
【０００４】
ここに示す新規コロナウイルスは気管支梢炎に罹患している小児から単離された。本発明者らはウイルスを有する、気道疾患に罹患している７名以上のヒトを見つけたので、このウイルスによる感染は他に類のない事例ではない。さらに、本発明者らはここで完全なゲノム配列を示し、新規コロナウイルスのゲノム構造に関する臨床情報を提供する。
【０００５】
今日、一連の原因不明のヒトの疾患が存在する。これらの多くに関して、ウイルス起源であることが示唆されており、新規ウイルスの継続的な調査の重要性を強調している２２，２３，２４。新規ウイルスの調査の際に、重大な問題に遭遇する。第１にウイルスの中には体外で複製しない、少なくとも、ウイルス診断において一般的に使用される細胞中で複製しないものもある。第２に、体外で複製し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こすそれらのウイルスに関して、その後に行うウイルス同定法がうまくいかないことがある。既知のウイルスに対してもたらされる抗体は培養ウイルスを認識しないこともあり、ウイルス特異的ＰＣＲ法は新規ウイルスゲノムを増幅しないこともある。本発明者らはｃＤＮＡ増幅制限断片長多型性技術（ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ）に基づくウイルス発見のための方法を開発した。この技術を用いて、ＲＮＡまたはＤＮＡは再生可能に増幅される。標的遺伝子の配列の予備的知識は必要ない１。一般的にｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ法が使用され、異なる遺伝子発現を観察する。しかしながら、本発明者らはこの方法を修正し、患者のリンパ漿／血清試料から直接でも、ＣＰＥ陽性ウイルス培養物から間接的にでもウイルス配列を増幅可能にした（図１）。修正されたウイルス発見ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ（ＶＩＤＩＳＣＡ）法において、増幅の前のｍＲＮＡ単離工程は、ウイルス核酸に対して選択的に豊富にする処理によって置き換えられる。遠心分離段階は精製に関連し、残余の細胞およびミトコンドリアを除去する。さらに、ＤＮＡｓｅ処理が使用され、分解した細胞由来の妨害染色体ＤＮＡおよび妨害ミトコンドリアＤＮＡを除去する一方、ウイルス核酸がウイルス粒子内で保護される。最終的に、頻繁に切断する制限酵素を選択することによって、該方法は微調整され、大部分のウイルスが増幅される。
【０００６】
２００３年１月、７ヶ月の小児が鼻感冒、結膜炎および熱を伴って来院した。胸部Ｘ線は気管支梢炎の典型的特徴を示し、発病の５日後に鼻咽頭吸引物の試料が収集された（試料ｎｒ：ＮＬ６３）。この試料についての、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３と、ライノウイルスと、エンテロウイルスと、ＨＣｏＶ−２２９Ｅと、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３とに対するあらゆる診断試験は陰性であった。ウイルスの培養物において、ＲＳＶと、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３とを検出するための免疫蛍光分析は依然として陰性であった。酸不安定性およびクロロホルム感受性試験は、ウイルスがエンベロープを有している可能性が大きく、ピコルナウイルス群の要素ではないことを示した。実際に、これは新規コロナウイルスであった。本発明において、本発明者らは新規ヒトコロナウイルスの詳細な説明を示す。コロナウイルスは、およそ２７〜３１ｋｂの、非常に長く分節していない単一鎖の（＋）センスＲＮＡによって特徴付けられる。これはどの既知のＲＮＡウイルスの中でも最も長いゲノムである。該ゲノムは、５’メチル化キャップおよび３’ポリ−Ａを有しており、ｍＲＮＡとしてそのまま機能する。これまで、３種のヒトコロナウイルスのみが特徴付けられており、したがって第４のヒトコロナウイルスの特徴を分類することによって、ヒトコロナウイルス間の差違に関する興味深い情報が提供される。新規ウイルスは群１のコロナウイルスの要素であり、ＨＣｏＶ−２２９Ｅに最も関連しているが、その差違は顕著である。類似点は、ヌクレオチドレベルで８５％より大きくなく、ＨＣｏＶ−２２９Ｅの４Ａおよび４Ｂ遺伝子の位置で唯１つのＯＲＦがＨＣｏＶ−ＮＬ６３（ＯＲＦ３）に存在し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のＳ遺伝子の５’領域は５３７個のヌクレオチドのフレーム挿入点において他とは異なるものを含んでいる。レセプタの結合が蛋白質のＮ末端部分に対して位置付けられているので挿入点にコードされる１７９個のアミノ酸はレセプタ結合に関与している可能性が大きい。スパイク蛋白質のＮ末端におけるこの特異的な部分は、細胞培養物中のウイルスの広範な宿主域を明らかにすることもある。ＨＣｏＶ−２２９Ｅが狭い宿主域を有する細胞培養物中で扱い難い場合、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３はサル腎臓細胞において効果的に複製される。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の他に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶも、サル腎臓細胞（ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するＶｅｒｏ−Ｅ６細胞およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（２１））で複製可能である。しかしながら、予測スパイク遺伝子を比較することによって、両ウイルスによって共有され体外のウイルスの一般的な宿主域を明確にする蛋白質領域は同定されない。また、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のＳ遺伝子における挿入点はＳＡＲＳのＳ遺伝子において存在しなかった。または、他のウイルス蛋白質がウイルスの細胞指向性に関与することもある。しかしながら、本発明者らは、ＨＣｏＶ−２２９ＥよりもＳＡＲＳ−ＣｏＶ対して、蛋白質レベルで、より類似しているＨＣｏＶ−ＮＬ６３のいずれの遺伝子も同定していない。
【０００７】
ＨＣｏＶ−２２９ＥとＨＣｏＶ−ＮＬ６３との間の、すなわちＳ遺伝子における挿入点と改変非構造補助蛋白質遺伝子との間の２つの重要な差違は、ブタコロナウイルスＰＲＣｏＶとＴＧＥＶとの間で注目される差違に匹敵するものである。これらの２種のブタウイルスは抗原的および遺伝学的に関連しているが、これらの病原性は非常に異なる。ＴＧＥＶは新生ブタにおいて、高い死亡率で重症の下痢を引き起こす。ＰＲＣｏＶは腸組織においてほとんど複製せず、呼吸組織に特異的指向性を有するのに対して、それは小さい腸において腸細胞を複製し、破壊する。ＴＧＥＶとＰＲＣｏＶとの間のＳ，３Ａおよび３Ｂ遺伝子におけるゲノムの差違は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３とＨＣｏＶ−２２９Ｅとの間の差違に匹敵する。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のようにＴＥＧＶは６７２〜６８１ｎｔにわたるＳ遺伝子の５’部分のフレーム挿入点において他とは異なる（５３）。さらに、ＴＧＥＶにおいて正常な補助蛋白質遺伝子３Ａおよび３Ｂは、ＰＲＣｏＶにおいて突然変異または不活性であることが多い。ヒトコロナウイルスに対するこれらのデータから推定して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３はＨＣｏＶ−２２９Ｅと比較してより病原性のヒトウイルスである可能性があることが推測される。しかしながら、これを支持する疫学データはない。本発明者らのデータに基づくと、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅはおそらく、同じ病原性を共有しているようである。一般的な感冒ウイルスＨＣｏＶ−２２９Ｅは幼児においてさらに重症疾患を引き起こす可能性があり（２８）、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が幼児および免疫障害患者においてのみ呼吸器疾患を引き起こしていることを示唆する本発明者らのデータに匹敵する。
【０００８】
今日まで、ウイルス性病原体はヒトにおける呼吸器疾患の症例の大部分において同定されておらず（平均して２０％５９）、本発明者らのデータはこれらの症例の一部においてＨＣｏＶ−ＮＬ６３が関与していることを示唆している。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が呼吸器疾患に罹患している患者において検出される頻度は、２００３年１月の時点で５％以下であった。ウイルスは２００３年の春または夏に収集されたいずれの試料においても検出されず、主に冬期に蔓延する傾向にあるヒトコロナウイルスの疫学と一致する（１５）。本発明者らの診断ＰＣＲのためのプライマは１Ｂ遺伝子に位置し、ゲノムＲＮＡは鋳型として用いられる。ヌクレオカプシド遺伝子または３’ＵＴＲにおいてアニーリングするプライマを用いることによって、ＰＣＲにおいて、より多くの鋳型が与えられる。なぜなら、ゲノムＲＮＡの他に、感染細胞中のあらゆるｓｇ ｍＲＮＡも、増幅のための鋳型であるからである。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対して陽性であると判った人の人数は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３を有している人の正確な人数を過小評価している可能性もある。
【０００９】
新規に発見されたコロナウイルス（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３と表される）は特徴付けられ、配列決定された。典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の配列は図１９に与えられ、その一部が表３に与えられる。したがって、１つの特徴において、本発明は単離および／または組換え核酸を提供し、図１９および／または表３に示される配列、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。ウイルスＨＣｏＶ−ＮＬ６３は、典型によって特徴付けられる。しかしながら、多くの自然変異体が、たとえば図１６に示されるように、ＯＲＦ１ａ領域における多型に対して存在する。このような自然変異体の存在は、たとえば、ゲノムを複製するポリメラーゼによる誤りの導入を経た頻繁な突然変異を受けるＲＮＡウイルスにとって通常のことである。したがって、僅かに相違する核酸配列を有するＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスもまた本発明によって提供される。このようなウイルスは典型核酸配列を有する核酸の誘導体であるとみなされる。変異体は必ずしも自然変異体でなくてもよい。当然組換え手段を経た変異体を生成することも可能である。たとえば、ウイルスの大部分が、特定のアミノ酸に対するトリプレット遺伝子コードにおける余分量を使用するヌクレオチド置換によって変更され得る。したがって、コードされた蛋白質のアミノ酸配列は変更されない。しかしながら、アミノ酸の変更でさえ、一般的に、ウイルスの複製およびコード能力に影響を与えることなく導入可能である。たとえば、保守的アミノ酸置換は許容されることが多い。典型ウイルスにおける変更は、ウイルスの複製能力を変更することなく、核酸配列の７０％まで可能である。したがって、一実施形態において、本発明は、単離および／または組換え核酸を提供し、典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の核酸に対して少なくとも７０％相同である。しかしながら、大部分の生存可能な変異体は、典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に従う核酸に少なくとも９５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９９パーセント相同である。ＵＴＲ領域における異種コロナウイルス間の相同性は通常高く、この理由により、本出願における相同性はＵＴＲ領域外の領域、好ましくは蛋白質コード領域において測定される。したがって、本発明はＨＣｏＶ−ＮＬ６３の誘導体を提供し、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される少なくとも１つの蛋白質コード領域において（核酸レベルで）少なくとも９５％の相同性および好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。ウイルスの核酸またはその一部の核酸は複製され、プローブとして使用され、試料中のウイルスを検出する。したがって、本発明はさらに単離および／または組換え核酸を提供し、典型ウイルスの核酸の１００個の連続したヌクレオチドの伸張部または前記１００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９９％相同である領域を含む（ＵＴＲ領域外で核酸レベルで測定される場合）。１００の連続したヌクレオチドの伸張部は、本発明のウイルスの機能的部分とみなされる。さらに、バクテリアベクタが提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３またはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸を含む。さらに、前記バクテリアベクタを含むバクテリアが提供される。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の配列またはその一部が使用され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に特異的であり、したがってＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸を特異的に複製可能なプライマを生成する。同様に厳しい条件下でＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸に特異的にハイブリッド形成するプローブが生成される。したがって、本発明はさらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブを提供する。好ましくは、前記プライマまたはプローブは厳しい条件下で前記核酸にハイブリッド形成可能である。特に好ましい実施形態において、前記プライマおよび／またはプローブは表３，表７，表１０または図１６〜図１８に示される配列を含む。
【００１０】
典型ウイルスの核酸は種々の蛋白質およびポリ蛋白質をコードする。これらの蛋白質はたとえばウイルスを生成するまたは（ポリ）蛋白質をコードする核酸で形質転換される細胞中で発現される。したがって、本発明はさらに単離および／または組換え蛋白様分子を提供し、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示されるような配列、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。蛋白質の多くの種々の変異体は、必ずしも量においてではなく質において同じ機能を有し、上述のように、天然に存在し、人工的に生成されることが可能であり、したがって、本発明はさらに上述の蛋白様分子に少なくとも７０％相同である単離および／または組換え蛋白様分子を提供する。このような相同の蛋白質は典型によってコードされる蛋白質の誘導体とみなされる。好ましくは、誘導体蛋白質は、典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３によってコードされる蛋白質と少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。典型ウイルスによってコードされる蛋白様分子の断片および一部が生成され、したがって、このような部分もまた、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、単離および／または組換え蛋白様分子が提供され、典型ウイルスによってコードされる蛋白様分子の少なくとも３０個の連続したアミノ酸の伸張部を含む。典型ウイルスによってコードされる蛋白質は遺伝子コードの余分量を使用して種々の異なる核酸配列によってコードされる。したがって、本発明はさらに図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白質をコードする核酸を提供する。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスは複製され、体外で細胞株を培養するのに用いる。ウイルスはこのような培養物から収集されることが可能であり、種々の異なる用途に用いられ、対象における免疫応答の発生を含むがこれに限定されない。したがって、本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸配列またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。さらに、単離または組換えウイルスが提供され、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。ＨＣｏＶ−ＮＬ６に感染した対象は多くの種々の臨床症状および／または無症状を示す。したがって、さらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を誘導可能な、単離または組換えウイルスまたはその、機能的部分、誘導体または類似体が提供される。
【００１１】
ウイルスは、ウイルスの物質を特異的に結合できる特異的結合相手を生成するために使用される物質を含む。結合相手は免疫担当対象へのウイルスの注入によって生成され得る。免疫付与の結果として、対象から得られた血清は、一般的にウイルスまたはその、免疫原性部分、誘導体および／もしくは類似体に特異的な多くの種々の抗体を含むであろう。特異的結合相手は、当然、多くの種々の異なる技術を経て生成され得る。たとえば、ファージ提示技術によって生成され得る。特異的結合相手を生成する方法はこれに限定されない。結合は一般的にウイルスの蛋白様部分に特異的である。しかしながら、当然、結合はまた、ウイルス中に含まれる蛋白質のウイルス特異的翻訳後修飾に特異的でもある。したがって、本発明はさらに好ましくは典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の核酸によってコードされるものに対して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの蛋白様分子を特異的に結合可能な単離結合分子を提供する。好ましくは、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。結合分子は、好ましくは図１９または表３の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の核酸配列を特異的に結合可能である。結合分子は好ましくは蛋白様分子である。しかしながら、他の結合分子もまた、本発明の範囲内である。たとえば、必ずしも量においてではなく質において蛋白質と同じ結合性質を有する蛋白質類または類似体を生成可能である。さらに、本発明に従う結合分子を生成する方法が提供され、該方法は、
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の典型核酸によってコードされる、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、あるいは単離および／または組換え蛋白様分子を結合可能な分子を生成し、
前記ウイルスおよび／または前記蛋白様分子に特異的な蛋白様結合分子を選択することを含む。
【００１２】
他のヒトコロナウイルスとＨＣｏＶ−ＮＬ６３との全体的な相同性はあまり高くない。したがって、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに特異的に結合可能な多くの種々の結合分子が生成され得る。このような結合分子が使用され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを検出する。したがって本発明はさらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを特異的に結合可能な結合分子と免疫反応する単離または組換えウイルスを提供する。同様に、本発明は図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される、単離および／または組換え蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用を提供し、試料中の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを特異的に結合可能な結合分子または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を検出する。逆に、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが使用され、試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出する。感受性標的細胞に対するＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの結合は特異的受容体を経て起こる。この受容体は本発明の結合分子として使用され得る。好ましくは、結合分子は抗体またはその機能的同等物を含む。検出方法が使用され、対象中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を診断する。したがって、試料中の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法が提供され、該方法は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３特異的プライマおよび／またはプローブを用いて前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸をハイブリッド形成するおよび／または増幅することと、ハイブリッド形成したおよび／または増幅した生成物を検出することとを含む。さらにキット、好ましくは診断キットが提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明に従う結合分子、および／または、本発明に従うＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的プライマ／プローブを含む。特に好ましい実施形態において、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸、あるいは図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子を特異的に結合可能な分子、あるいはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスおよび／または典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の、核酸または機能的部分、誘導体もしくは類似体に特異的にハイブリッド形成可能なプライマまたはプローブの使用が提供され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルスを検出および／または同定する。好ましくは、前記核酸は表３に示される配列を含む。
【００１３】
本発明はさらにワクチンを提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。さらにワクチンが提供され、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子、または、このような蛋白様分子の機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。本発明の蛋白様分子は、それ自身ワクチンとして、または蛋白質の一部として、またはその、誘導体もしくは類似体として提供されてもよい。適切な類似体とはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス蛋白様分子またはその、機能的部分もしくは誘導体をコードする核酸である。核酸は本発明においても提供されるＤＮＡワクチン方法において使用されてもよい。ＤＮＡワクチンのための担体として、ウイルスレプリコン中に発現可能なＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス核酸を組み込むことが適切であることが多く、標的細胞においてＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス核酸の複製を可能にし、これによりもたらされる免疫応答を促進する。このようなＤＮＡワクチン方法に適している蛋白質をコードするＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスは、図２２に示されるＳ蛋白質またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。好ましくは、Ｓ蛋白質の一部はＨＣｏＶ−２２９Ｅウイルスと比較すると、フレーム挿入点において５３７の免疫原性部分を含む。好ましくは、前記部分は実質的に前記５３７挿入点を含む。５３７挿入点とは、図１９の配列２０４７２〜２１００９に対応する配列のことである。
【００１４】
他の適切な候補はＭおよびまたはＮ蛋白質，またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。一般的にワクチンは適切なアジュバントを含む。ワクチンにおける使用の他に、記載されるウイルスおよび／または蛋白様分子もまた使用され、対象中でＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的免疫応答を発生および／または促進する。免疫応答は細胞性でも体液性でもあり得る。したがってさらに、単離Ｔ−細胞が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに特異的であるＴ細胞受容体、または典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３によってコードされる蛋白様分子を含む。さらに、単離Ｂ細胞が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに特異的な抗体、またはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスによってコードされる蛋白様分子を生成する。細胞株は複製された受容体または抗体を含む発現カセットを与えられるとすぐに、抗体またはＴ−細胞受容体が複製される。したがって、本発明はさらにこのような受容体または抗体を生成する細胞を提供する。このような細胞は、好ましくはＣＨＯ細胞等の、記載される蛋白質の大規模な生成に適している細胞である。
【００１５】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに対する受動免疫を対象に与えることももまた可能である。このために、対象は本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３特異的結合分子を与えられる。このような免疫性が使用され、対象中にＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスでの（さらなる）感染のための障壁を与え、したがってさらにワクチンが提供され、本発明に従うＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子を含む。好ましい実施形態において、受動免疫は、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを特異的に結合可能なヒトまたはヒト化抗体によって与えられる。障壁は完全でなくてもよい。結合分子の存在は少なくとも、対象における他の標的細胞へのウイルスの拡散を減少させる。受動免疫は予防として対象に投与されてもよく、ウイルスに曝された場合、少なくとも、対象におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの拡散を減少させる。または、受動免疫はウイルスに既に感染した対象に与えられてもよい。後者の場合、本発明の１以上のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子は薬剤として使用され、少なくとも、対象におけるウイルスの拡散を減少させ、したがって少なくとも部分的にウイルス感染に有効である。したがって本発明はさらに薬剤を提供し、本発明に従うＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子を含む。さらに、本発明のウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、あるいは本発明の蛋白様分子、あるいは本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子の使用を提供し、コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製する。さらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス関連疾患に罹患しているまたは罹患する危険のあるヒトを治療するための方法が提供され、本発明に従うワクチンまたは薬剤を前記ヒトに投与することを含む。さらに別の実施形態において、ヒトがＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているか否かを判断する方法が提供され、前記ヒトから試料を得ることと、前記試料中の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む。
【００１６】
さらに別の実施形態において、単離細胞または組換え体もしくは細胞株が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。好ましくは、前記細胞は霊長類細胞であり、好ましくはサル細胞である。好ましい実施形態において、前記細胞は本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを複製する細胞である。特定の実施形態において、細胞は腎細胞である。該細胞が使用され、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを生成する、または病原性が低下するようにＨＣｏＶ−ＮＬ６３を弱毒化する。ウイルスの弱毒化は、記載される好ましい細胞株でのウイルスの継代培養の際に自然に起こる。弱毒化ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスはワクチンとして使用される。
【００１７】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスはエンドプロテアーゼをコードする。典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス中のプロテアーゼに対する配列は図（２１）に示されている。プロテアーゼはＨＣｏＶ−ＮＬ６３にコードされるポリ蛋白質の処理に関して重要である。プロテアーゼの作用はここでさらに記載されるウイルスプロテアーゼ阻害剤によって少なくとも部分的に阻害される。したがって、本発明はさらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス複製を少なくとも部分的に阻害するための化合物を提供する。好ましい化合物は、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（５５）（たとえば、リバビリン（５４）およびミコフェノール酸）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ阻害剤（たとえば、６−アザウリジンおよびピラゾフリン）、３ＣＬプロテアーゼ阻害剤（５６）（たとえば、ＶＮＳＴＬＱ−ＡＧ７０８８エステル、下記参照）、キャップ−メチル化阻害剤（５８）（カルボン酸アデノシン類似体、たとえば、Ｎｅｏｐｌａｎｏｃｉｎ Ａおよび３−ｄｅａｚａｎｅｏｐｌａｎｃｉｎ Ａ）、亜酸化窒素シンターゼ誘導化合物（たとえば、グリシルリジン）およびインターフェロン（５７）の阻害剤である。これらのプロテアーゼ阻害剤が特に好ましい。配列ＶＮＳＴＬＱは、３Ｃｌｐｒｏ阻害剤ＶＮＳＴＬＱ−ＡＧ７０８８（５６）において使用されるＳＡＲＳ−３ＣＬｐｒｏのＮ末端蛋白質分解処理部位である。この化合物において、ヘキサペプチドＶＮＳＴＬＱは、ＳＡＲＳ ３ＣＬｐｒｏ活性を阻害するビニル性エチルエステル（ＡＧ７０８８、下記構造式１を参照）のＣ末端に結合する。
【００１８】
【化１】
【００１９】
ヘキサペプチドＶＮＳＴＬＱはＨＣｏＶ−ＮＬ６３におけるＹＮＳＴＬＱに対応する。したがって、ＹＮＳＴＬＱ−ＡＧ７０８８はＨＣｏＶ−ＮＬ６３ ３ＣＬｐｒｏ相同分子種を阻害する。したがって、好ましい実施形態において、プロテアーゼ阻害剤はアミノ酸配列ＶＮＳＴＬＱ、さらに好ましくはＹＮＳＴＬＱを含む。必ずしも量においてではなく質において同じ活性を含むこのようなプロテアーゼ阻害剤の類似体もまた本発明によって提供される。このような類似体は好ましい配列を有するペプチドを含む化合物を含み、ペプチドは修飾を含む。他の類似体は好ましいアミノ酸配列に似た蛋白様活性を有する化合物を含む。Ｓ−アデノシルメチオニン依存リボース２’−オルトメチルトランスフェラーゼは、ウイルスＲＮＡの５’末端におけるキャップ構造（ＧｐｐｐＮｍ）のメチル化に関与する。反応に対してメチル基のこの転位を阻害する抗ウイルス化合物（カルボン酸アデノシン類似体、たとえばＮｅｏｐｌａｎｏｃｉｎ Ａおよび３−ｄｅａｚａｎｅｏｐｌａｎｃｉｎ Ａ）は、ウイルス蛋白質の発現を抑制する。
【００２０】
本発明はさらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸によってコードされる蛋白様分子を提供し、前記蛋白様分子は３ＣＬプロテアーゼまたはその機能的同等物である。機能的同等物は、１またはそれ以上の保守的アミノ酸置換を有する蛋白質分解活性部分および／または誘導体を含む。化合物が抗コロナウイルス活性、好ましくはコロナウイルスの抗蛋白質分解活性を有するか否かを判断するための方法は当技術分野で多く知られている。したがって、本発明はさらに、化合物が抗コロナウイルス複製活性を含むか否かを判断する方法を提供し、前記方法はＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはＨＣｏＶ−ＮＬ６３の複製に関与するＨＣｏＶ−ＮＬ６３蛋白質、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を使用するという点で特徴付けられる。好ましくは、本発明は化合物がウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害可能か否かを判断する方法を提供し、前記プロテアーゼがＨＣｏＶ−ＮＬ６３の３ＣＬプロテアーゼまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体であるという点で特徴付けられる。３ＣＬ阻害性に関して試験される好ましい化合物は３Ｃｌｐｒｏ切断部位のＮ末端に位置するヘキサペプチドである。３Ｃｌ蛋白質分解活性を少なくとも部分的に阻害するのに有効な化合物が、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に罹患しているまたは罹患する危険のあるヒトの治療のための薬剤の調製に使用される。
【００２１】
１以上の好ましい抗コロナウイルス複製化合物が、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に罹患しているまたは罹患する危険のある対象を治療するための薬剤として使用される。したがって本発明はさらに、コロナウイルス感染に罹患しているヒトまたは罹患する危険のあるヒトの治療のための薬剤を提供し、前記コロナウイルスはＨＣｏＶ−ＮＬ６３典型ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸配列を含む。
【００２２】
本発明において、複数の種々の組換えウイルスが、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス核酸を骨格として使用して生成される。このような複製能力のあるまたは複製欠陥の組換えウイルスは、たとえば、遺伝子運搬担体として使用されることが可能である。他方、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの一部は細胞に遺伝物質を運搬するための他の手段に基づく遺伝子運搬担体において使用される。したがって、本発明はさらに、遺伝子運搬担体を提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス、好ましくは典型ウイルスの核酸の少なくとも一部を含む。好ましくはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の蛋白質をコードする核酸を含む。本発明はまた、キメラコロナウイルスを示し、少なくとも２つのコロナウイルスに由来する核酸を含み、前記部分の少なくとも１つはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに由来する。前記ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス由来部分は好ましくは蛋白質コード領域の少なくとも５０個のヌクレオチドを含む。さらに好ましくは前記ＨＣｏＶ−ＮＬ６３由来部分は図１９に示される配列またはその機能的誘導体の少なくとも５００、さらに好ましくは１０００個のヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本発明はキメラコロナウイルスを提供し、図１９に示される配列の少なくとも１０００個のヌクレオチドおよび別のコロナウイルスの少なくとも１０００個のヌクレオチドを含み、前記後者の１０００個のヌクレオチドは図１９に示される配列と５％以上配列が相違する配列を含む。多くのＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス断片の配列は表３に示されている。広域のゲノムＲＮＡにおける断片の位置は図５に示されている。したがって、本発明は１つの特徴において、単離または組換えウイルスを提供し、表３に示される核酸配列または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。同定典型断片を用いて、さらにゲノムの配列を決定することが可能である。ゲノム上を歩行するプライマによってこれをなす１つの方法。プライマは配列が既知である領域に向けられており、このプライマが使用され、未知の隣接領域の配列を決定する。次のプライマが新たに同定された配列に対して生成され、さらなる領域が配列決定される。この手順はウイルスの全配列が解明されるまで繰り返される。ウイルスの出典として、オランダ、アムステルダム、アムステルダム大学、学術医学センター、ヒトレトロウイルス学科のＣ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｅｋ博士に問い合わせてもよい。
【００２３】
決定された核酸配列の整列によって、検出された配列に使用されるリーディングフレームが明らかになった。したがって本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、（表３）に示されるアミノ酸配列または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。特定のアミノ酸配列は使用されたコドンに依存する種々の核酸から生成され得る。したがって、本発明はさらに（表３）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。さらに単離または組換えウイルスが提供され、（表３）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。
【００２４】
多くの他の種類のウイルスのように、コロナウイルスは、対象の個体群を経たウイルスの拡散の際におよび／または生体外で培養している間に、複数の自然および選択された突然変異体を得る。さらに人工的な変異体は、認識された対応物を天然に有しておらず、ウイルス性および／または疾患を引き起こすウイルスの性質を変更することなく、典型ウイルスの配列またはその誘導体に導入され得る。新規に発見された亜型の典型を特徴付けたことによって、同じ亜型に属するこのウイルス群に手掛かりが与えられる。したがって、本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、表３に示される配列に対しておよそ８０％相同である、または表３に示されるアミノ酸配列に対して８０％相同である核酸配列を含む。好ましくは、相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２５】
それぞれの典型断片はウイルス配列のデータベースと比較され、特に高い相同性を有する対象データが表５および表６に述べられている。比較される断片は現在既知のいずれのコロナウイルスとも広範囲の相同性を有していない。したがって本発明は単離および／または組換えウイルスを提供し、表３に示される１６３−２のアミノ酸配列に対して８９％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２６】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−４のアミノ酸配列に対して６０％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２７】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−９の核酸配列に対して８５％以上相同である核酸配列を含む。好ましくは、前記相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２８】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１０のアミノ酸配列に対して９４％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２９】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１１のアミノ酸配列に対して５０％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３０】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１４のアミノ酸配列に対して８７％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３１】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１５のアミノ酸配列に対して８３％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３２】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１８のアミノ酸配列に対して７８％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３３】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される核酸配列に対して５０％以上相同である核酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３４】
本発明はまた、単離および／または組換えＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの機能的部分、誘導体および／または類似体を提供する。ウイルスの一部は膜組織含有部分、ヌクレオカプシド含有部分、蛋白様断片および／または核酸含有部分であってもよい。該部分の機能性は、該部分に対して選ばれる用途によって異なる。たとえば、該ウイルスの一部は免疫化の目的のために使用されてもよい。この実施形態において、機能性は、必ずしも量においてではなく質において完全なウイルスと同様の免疫原性を含む。ウイルスの別の使用はウイルスの感染性である。たとえば、生体外（または生体内）での培養に関して、この実施形態において、機能性は必ずしも量においてではなく質において同様の感染性を含む。ウイルスに対して多くの種々の使用が存在するため、多くの他の機能性が定義されてもよく、限定されない実施例はキメラウイルスの生成（すなわち、１以上の他の（コロナ）ウイルス）を用いて）、およびワクチン化および／または遺伝子治療目的のウイルスベクタの生成である。このようなウイルスおよび／またはベクタもまた、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の機能的部分を含み、したがってまた、本発明に含まれる。本発明のウイルスの機能的誘導体は、前記化合物の性質が必ずしも量においてではなく質において本質的に同じであるように変更されたウイルスとして定義される。誘導体は、たとえば（好ましくは“ウォッブル”に基づく）ヌクレオチド置換を経て、（保守的）アミノ酸置換、それに続く修飾を経て、等の多くの方法で提供され得る。
【００３５】
ウイルスの類似化合物もまた当技術分野の方法を使用して生成され得る。たとえば、キメラウイルスまたはキメラ蛋白質を有するＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが生成される。たとえばＨＣｏＶ−ＮＬ６３は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３表面蛋白質の少なくとも一部および非ＨＣｏＶ−ＮＬ６３免疫原性部分を含む細胞表面関連融合蛋白質を生成することによって、さらに免疫原性になり得る。このようなキメラ蛋白質を含むＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが使用され、たとえばワクチン化目的のために、宿主において向上した免疫応答を誘導する。
【００３６】
ここで使用されるように、「本発明のウイルス」という用語はまた、前記ウイルスの機能的部分、誘導体および／または類似体を含むことを意味している。
【００３７】
コロナウイルスの３種のグループはヒトおよび家畜の種々の疾患と関連し、胃腸炎および上下気道疾患を含む。ヒトコロナウイルスＨＣｏＶ−２２９ＥおよびＨＣｏＶ−ＯＣ４３は軽い疾患（一般的な感冒）に関連するが、さらに重症の疾患が子供１６において、非常に低い罹患率ではあるが観察される。複数のコロナウイルスは動物において重症の疾患を引き起こし、ＳＡＲＳ−ＣｏＶがヒトにおいて重症の疾患を引き起こすコロナウイルスの第１例である。しかしながら、ヒトにおける呼吸器疾患の症例の実質的部分は診断が下されていないことは強調されるべきである。たとえば、気管支梢炎を伴って入院しているカナダの子供における呼吸器ウイルスの最近の調査では、約２０％の患者においてウイルス性病原体が明らかにされていない１７。本発明者らが、気管支梢炎を伴った子供において新規コロナウイルスを同定したという事実は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が病原性呼吸器系ウイルスであることを示している。
【００３８】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が、感染した子供に気管支梢炎を引き起こし得る病原性呼吸器系ウイルスであることを考慮すると、なぜＨＣｏＶ−ＮＬ６３が以前に細胞培養によって認められなかったのかという興味深い疑問が残る。本発明者らは、該ウイルスが、ルーチン診断設定において使用されることが多い細胞である、サル腎細胞（ｔＭＫまたはＬＬＣ−ＭＫ２細胞）において培養され得ることを発見し、したがって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに似たＨＣｏＶ−ＮＬ６３が、病原体保有動物からヒトの個体群に新規に導入された、またはこれは最近宿主細胞域を拡大したヒトウイルスであるということが推測される。明らかにＨＣｏＶ−ＮＬ６３感染の有病率を調査することは重要であり、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３診断ＲＴ−ＰＣＲを用いて、気道疾患を伴う患者からの試料をスクリーニングすることは、この問題の解明に役立つであろう。
【００３９】
コロナウイルスは狭い宿主域の細胞培養において一般的に扱い難いため、新規ヒトコロナウイルスはｔＭＫ細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞から得られたということは注目すべきことである。しかしながら、ＳＡＲＳ−ＣｏＶもＨＣｏＶ−ＮＬ６３もサル腎細胞（ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するベロ−Ｅ６細胞およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞）中で効率的に複製するようである。最近記載されたＳＡＲＳ−ＣｏＶのゲノムは複数の他にない特徴を有しており、おそらく生物学的に重要ないくつかの特有のオープンリーディングフレームを含んでいる１５，１８。したがって本発明者らはＨＣｏＶ−ＮＬ６３の完全なゲノム配列を分析し、これらのウイルスの拡大した宿主細胞域および向上した病原性を決定し得る、ＳＡＲＳ−ＣｏＶとの類似性および差違をスクリーニングするであろう。
【００４０】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３は感染した対象における特定の表現型に関連する。表現型は気管支梢炎、鼻感冒、結膜炎および熱を包含し得る、および表現型はさらに他の呼吸器系の問題および下痢を包含することもある。したがって、一実施形態において、本発明はさらに（上述の１以上の相同性を有する）本発明の単離およびまたは組換えウイルスを提供し、前記ウイルスまたは、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体は、さらに、対象中にＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患または症状を引き起こす能力を含む。別の実施形態において、本発明は単離および／または組換えウイルスを提供し、さらに、第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザル３７）において、および／またはサル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２（ＥＣＣＡＣ８５０６２８０４，ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７）への継代の際に、ＣＰＥを引き起こす性質を含む。好ましい実施形態において、前記ウイルスはベロ−細胞においてＣＰＥを生成しない（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８６）３４。
【００４１】
本発明はさらに表３に示される核酸、および表３に示されるアミノ酸配列、またはこのような核酸および／またはアミノ酸配列の、機能的部分および／もしくは同等物を提供する。前記核酸の機能的同等物は必ずしも量においてではなく質において、前記核酸（またはその一部）と同じハイブリッド形成性を含む。本発明のアミノ酸配列の機能的同等物は必ずしも量においてではなく質において、前記アミノ酸配列（またはその一部）と同じ免疫原性を含む。本発明の核酸の一部は少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。アミノ酸配列の一部は互いにペプチド結合している少なくとも５個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも８、さらに好ましくは少なくとも１２、さらに好ましくは少なくとも１６個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、前記ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸は少なくとも半連続しており、さらに好ましくは、前記ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸は連続している。本発明の核酸および／またはアミノ酸配列またはその部分の同等物は、本発明の核酸および／またはアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性、本発明の核酸および／またはアミノ酸配列およびその一部に対して、好ましくは少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。本発明はさらにプライマおよび／またはプローブを提供し、本発明に従うウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能であり、好ましくはプライマおよび／またはプローブは表３に示される核酸配列に特異的にハイブリッド形成可能である。さらに好ましくは、プライマおよび／またはプローブは、厳しい条件下で前記核酸にハイブリッド形成可能である。特に好ましい実施形態において、プライマおよび／またプローブが提供され、表７に示される配列を含む。
【００４２】
当該技術分野において、特異的結合要素が、同定された核酸、脂質および／またはアミノ酸配列に対して生成され得る多くの方法が知られている。このような特異的結合要素はいかなる性質であってもよいが、一般的に核酸および／または蛋白様性質である。したがって、本発明はさらに、本発明に従う、ウイルス、核酸および／またはアミノ酸、またはその機能的部分、誘導体もしくは類似体を特異的に結合可能な単離分子を提供する。前記単離分子はまた、特異的結合要素と呼ばれる。好ましくは前記特異的結合要素は、表３に示される核酸配列の少なくとも一部、および／または表３に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部を特異的に結合可能である。好ましい実施形態において、前記結合要素は、蛋白様分子である。好ましくは、抗体またはその、機能的部分、誘導体および／または類似体である。特異的結合要素は好ましくは、無関係の対照と比較して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対する有意なよりよい結合性質を含む。しかしながら、たとえば抗体に関して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３において特異的に認識されるエピトープはまた、限られた数の他の分子にも存在することが可能である。したがって、結合要素の結合は特異的なこともあるが、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に存在する分子以外の分子を認識することもある。この交叉反応は特異的結合と分けられるべきであり、抗体の一般的性質である。交叉反応は通常、特定の目的の適切な特異的結合要素の選択を妨げない。たとえば、肝細胞中の蛋白質もまた認識する特異的結合要素は、肝細胞の存在下でさえ多くの用途において使用され、細胞中の位置等の追加情報が、識別するために使用されることが多い。
【００４３】
本発明の抗体の１つの供給源は、本発明のウイルスをスクリーニングした感染対象の血液である。さらに、一種が前記対象から得られるＢ細胞を特徴付けることもある。適切のＢ細胞が培養され、抗体が収集されてもよい。または、抗体は当該Ｂ細胞から配列決定され、人工的に生成されてもよい。本発明の別の抗体供給源は実験動物の免疫付与または人工ライブラリを使用してウイルスの精製フラクションをスクリーニングすることによって生成され得る。抗体の機能的部分は、必ずしも量においてではなく、質において、実質的に前記抗体と同じ性質を有している。前記機能的部分は好ましくはＨＣｏＶ−ＮＬ６３の抗原を特異的に結合可能である。しかしながら、前記機能的部分は前記全抗体と比較して、異なる程度にこのような抗原を結合することもある。抗体の機能的部分または誘導体はＦＡＢ断片または単一鎖抗体を含む。抗体の類似体は、たとえばキメラ抗体を含む。ここで使用されるように、「抗体」という文言はまた、前記抗体の機能的部分、誘導体および／または類似体を含むということである。
【００４４】
本発明の抗体が得られると、その結合能等の所望の性質が改良され得る。これは、たとえばＡｌａ走査および／または置換ネットマッピング法（replacement net mapping
method）によってなされ得る。これらの方法を用いて、当初のアミノ酸配列に基づいて多くの種々の蛋白様分子が生成されるが、各分子は少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａｌａ走査）、または他の任意のアミノ酸残基（
replacement net mapping）のいずれによっても置換され得る。各変異体は続いて前記所望の性質についてスクリーニングされる。生成されたデータが使用され、改良蛋白様分子が設計される。
【００４５】
特異的結合要素が生成される多くの種々の方法がある。好ましい実施形態において、本発明は、特異的蛋白様結合要素を生成するための方法を提供し、本発明に従うウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体に結合可能な蛋白様分子を生成し、前記ウイルスに特異的な蛋白様分子を選択することを含む。必要であれば、該方法は前記ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体に結合可能な蛋白様分子の収集物を生成し、前記ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を特異的に結合可能な１以上の結合要素を前記収集物から選択する。
【００４６】
任意の特異的結合要素は、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスについて特有である。したがって、このような結合要素と特異的に反応するウイルスはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスであり、このように本発明によって提供される。したがって、本発明は、本発明の特異的結合要素、好ましくは蛋白様結合要素と免疫反応する単離および／または組換えウイルスを提供する。本発明はさらに単離ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを含む物質の組成、および／または実質的にＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対応するウイルスを提供する。「実質的にＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対応する」ウイルスという文言は、上述のようにＨＣｏＶ−ＮＬ６３鎖に同一であるか、または前記ＨＣｏＶ−ＮＬ６３鎖と比較して１以上の変異を含むＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスのことを言及している。これらの変異は、自然変異または人工変異を含んでもよい。前記変異は当然、必ずしも全ての特異的結合要素ではないが、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の特異的結合要素を用いる検出を可能にするはずである。前記変異は抗体相互作用、増幅および／またはハイブリッド形成等の一般的検出方法を使用して、変異体を検出することを可能にする。
【００４７】
特異的結合要素が、たとえば診断目的に重要な分子であることを考慮すると、本発明はさらに本発明のウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用を提供し、試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出する。さらに、本発明によって定義される、ウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸および／またはアミノ酸配列の使用が提供され、試料中の前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を特異的に結合可能な分子を検出する。好ましくは、前記核酸および／またはアミノ酸配列は、表３に示される配列またはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。好ましくは、前記部分は、少なくとも３０個のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸長であり、前記部分は好ましくは、９５％以上、好ましくは９９％以上の配列同一性を含む。好ましい特徴において、前記特異的結合要素は前記ウイルスの特異的配位子および／または抗体を含む。
【００４８】
さらに、本発明に従うプライマおよび／またはプローブ、本発明の特異的結合要素、ならびに／あるいは、本発明に従う、ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸が提供され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルスまたはその一部を検出および／または同定する。好ましくは、前記核酸は表３に示される配列を含む。
【００４９】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが使用され、対象中において免疫応答を発生させる。これは、たとえばワクチン接種戦略において有用である。したがって、本発明はさらにワクチンまたは薬剤として使用するためのＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を提供する。該薬剤が使用されるのは、一般的に、対象が既にウイルスに感染しており、免疫原が使用されウイルスに対する免疫応答を増化する場合である。本発明はさらに、ワクチンまたは薬剤としての使用のための、本発明の特異的結合要素を提供する。当該使用は、特異的結合要素が蛋白様分子、好ましくは抗体またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。このような抗体は受動免疫を提供するが、それに付着するプロテアーゼ等の活性要素を有してもよい。該薬剤の使用は、さらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに感染した対象が特異的結合要素で治療される場合であってもよい。
【００５０】
ワクチンは種々の方法で生成されてもよい。１つの方法は、たとえば記載されるサル細胞株でＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを培養し、培養物から得られた不活性ウイルスを使用することである。または、弱毒化ウイルスは、不活性または生ワクチンのいずれとしても使用され得る。コロナウイルスワクチンの生成のための方法が適応され、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３のためのワクチンを生成する。したがって、本発明はさらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用を提供し、コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製する。さらに本発明は本発明の特異的結合要素の使用を提供し、コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンまたは薬剤を調製する。さらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明の特異的結合要素、本発明の核酸あるいは本発明のプライマおよび／またはプローブが提供され、コロナウイルス属関連疾患を診断する。好ましくは、前記コロナウイルス属関連疾患はＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルス関連疾患を含む。
【００５１】
さらに、ワクチンが提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／または、本発明の特異的結合要素を含む。さらに、薬剤が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／または、本発明の特異的結合要素を含む。好ましくは、前記ワクチンまたは薬剤が使用され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を少なくとも部分的に予防するおよび／または治療する。
【００５２】
本発明の重要な使用は診断ツールを生成し、対象がＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に罹患しているか否かまたは対象がＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に曝されているか否かを判断することである。多くの種々の診断上の利用が予想される。それらは一般的に、対象中に存在するまたは存在したウイルスの分類を可能にする要素を同定することを含む。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のための１種の診断ツールは、種々の細胞株におけるウイルスの特異的拡散特性を使用する。それは記載される好ましいサル細胞株において複製するが、ベロ細胞においては複製されない。当該性質が使用され、他の既知のコロナウイルスからＨＣｏＶ−ＮＬ６３を識別する。したがって、１つの特徴において、本発明は診断キットを提供し、少なくとも１種の好ましいサル細胞株、好ましくは第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザルまたはサル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２）を含む。
【００５３】
多くの最新の診断キットは、（ウイルスまたはウイルス感染細胞を検出するための）特異的結合要素、および／または、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／または、（診断される対象の血液成分中の抗体を検出するための）本発明のアミノ酸またはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。多くの他の一般的に知られる診断キットは試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的核酸の同定を利用している。このようなアッセイが実施される種々の方法があり、１つは試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法であり、本発明に従うプライマおよび／またはプローブを用いて前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸をハイブリッド形成および／または増幅することと、ハイブリッド形成および／または増幅された生成物を検出することとを含む。したがって、本発明はまた、診断キットを提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明に従う特異的結合要素、および／または、本発明に従うプライマ／プローブを提供する。
【００５４】
さらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているまたは罹患する危険のあるヒトを治療するための方法が提供され、本発明に従うワクチンまたは薬剤を前記ヒトに投与することを含む。さらに、ヒトがＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているか否かを判断するための方法が提供され、前記ヒトからの試料を得ることと、本発明の方法および／または診断キットを用いて前記試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む。
【００５５】
さらに、本発明に従うウイルスまたは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体と、本発明に従う核酸とをコードする単離または組換え核酸が提供され、少なくとも、表３に示される配列の機能的部分を含む。さらに本発明に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列および本発明に従うアミノ酸配列が提供され、少なくとも、表３に示される配列の機能的部分を含む。さらに本発明に従う方法によって得られる、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３を特異的に結合可能な蛋白様分子、および、ワクチンにおけるこのような蛋白様分子の使用またはＨＣｏＶ−ＮＬ６３検出のための診断方法が提供される。
【００５６】
実施例
実施例１
ウイルス発見のためのｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ
本発明者らはｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ技術を修正し、血漿／血清試料から、またはＣＰＥ陽性培養上清からウイルス配列を増幅できるようにした（図１）。調整された方法においては、増幅前のｍＲＮＡ単離段階は、ウイルス核酸を精製する処理に置き換えられる。残余の細胞およびミトコンドリアを除去するための遠心分離段階は、精製に重要である。さらに分解細胞由来の妨害染色体ＤＮＡおよび妨害ミトコンドリアＤＮＡを取り除くには、ＤＮＡｓｅ処理単独で充分であり、最終的に頻繁に切断する制限酵素を選択することによって、該方法は充分調整され、大部分のウイルスが増幅される。このいわゆるウイルス発見ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ（ＶＩＤＩＳＣＡ）を用いて、本発明者らは肝炎Ｂウイルスに感染しているヒトおよび急性パルボＢ１９に感染しているヒトのＥＤＴＡ−血漿由来のウイルス核酸を増幅できた（結果は示されていない）。該技術もまた、陽性培養上清中のＨＩＶ−１を検出可能であり、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス両方を同定する能力を示す（結果は示されていない）。
【００５７】
残余の細胞を除去するために、１１０μｌのウイルス培養上清をエッペンドルフ微小遠心（１３５００ｒｐｍ）において最大速度で１０分間沈降させた。１００μｌが未使用の試験管に移され、１５μｌのＤＮＡｓｅバッファおよび２０ユニットのＤＮＡｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、３７℃で４５分間ＤＮＡｓｅ処理された。ＤＮＡｓｅ処理が含まれ、分解細胞由来の染色体ＤＮＡを除去する。この９００μｌのＬ６溶解バッファおよび４０μｌのシリカ懸濁液が加えられ、Ｂｏｏｍ４に記載のように核酸が抽出された。ウイルス核酸は４０μｌのＨ２Ｏに溶出された。２０μｌの溶出液を用いて、逆転写が行われ、１０ｍＭ トリスＨＣｌｐＨ８．３と、５０ｍＭ ＫＣｌと、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と、４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２と、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰとを含むバッファ中、２．５μｇのランダム６量体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２００Ｕ ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。試料は３７℃で９０分間培養された。続いて、第２鎖ＤＮＡ合成が行われ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓそれぞれと、１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２と、トリス−ＨＣｌｐＨ７．５中、２６ Ｕ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＩＩ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、７．５Ｕ ＲＮＡｓｅ Ｈ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。３７℃９０分間の培養の後、フェノール／クロロホルム抽出が行われ、エタノール沈殿が続いた。ペレットが３０μｌのＨ２Ｏに溶解された。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは、基本的に、いくつかの修正を加えたＢａｃｈｅｍ１に記載のように行われた。ｄｓＤＮＡは製造業者のプロトコルに従って、ＨｉｎＰ ＩおよびＭｓｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて分解された。分解の後、ＭｓｅＩアダプタおよびＨｉｎＰ Ｉアダプタ（以下参照）が５Ｕリガーゼ酵素（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびリガーゼバッファと共に加えられ、続いて３７℃で２時間のさらなる培養が行われた。ＭｓｅＩアダプタおよびＨｉｎＰ Ｉアダプタは、ＭＳＥおよびＨｉｎＰ１アダプタ（表１）に対する先端鎖オリゴとＭＳＥアダプタおよびＨｉｎＰ１アダプタに対する下端鎖オリゴとを混合することによって、前もって調製され、６５℃で培養され、続いてリガースバッファの１：４０希釈物の存在下で室温まで冷却した。
【００５８】
第１ＰＣＲは、投入量として、１０μｌのライゲーション混合物と、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と、１００ｎｇのＨｉｎＰＩ標準プライマと、１００ｎｇのＭｓｅＩ標準プライマとで行われた。ＰＣＲ反応は５分９５℃、２０周期の１分９５℃−１分５５℃−２分７２℃、１０分７２℃のデータに従って行われた。投入量として５μｌの第１ＰＣＲ生成物が、１００ｎｇのＨｉｎＰＩ−Ｎプライマと、１００ｎｇ ＭｓｅＩ−Ｎ（１ヌクレオチドで拡張された標準プライマの配列）と、２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼとを含む第２「選択的」増幅段階において使用された。選択的ＰＣＲが、「タッチダウンＰＣＲ」のデータに従って増幅された。すなわち１０周期の６０秒９４℃−３０秒６５℃−１分７２℃で増幅され、アニーリング温度は各サイクルで６５℃から１℃に下げられ、続いて、２３周期の３０秒９４℃−３０秒５６℃−１分７２℃で増幅された。最後に、試料は１０分７２℃で培養された。ＰＣＲ生成物は、４％Ｍｅｔａｐｈｏｒ（登録商標）ゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）で評価された。ゲルのバンドがかなり薄ければ、ＰＣＲ生成物は、６０μｌのＰＣＲ生成物を使用して、真空乾燥によって濃縮された。製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉａｇｅｎゲル精製キットを使用して、関心のあるＰＣＲ断片はゲルから切断され、ＤＮＡがゲルから溶離された。ＰＣＲ生成物はｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、化学的に適格なＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを使用して複製された。コロニーにおけるＰＣＲが行われ、このＰＣＲ生成物が投入され、Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネータ ケミストリ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、挿入部分が配列決定された。逆転写段階は除かれ、ＨｉｎＰＩ分解およびアダプタ ライゲーションのみが行われ、第１ＰＣＲは２０周期の代わりに３５周期で行われ、それらの第１ＰＣＲ断片はアガロースゲル電気泳動上で視覚化された。
【００５９】
ＤＮＡ配列決定および分析
プラスミドを含むコロナウイルス−ＰＣＲ生成物はＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて配列決定され、−２１ Ｍ１３ＲＰおよびＴ７プライマを使用した。反応混合物を配列決定する電気泳動はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７自動シークエンサーを用いて行われ、製造業者のプロトコルに従った。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（バージョン １．０１）およびＡｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（バージョン ２．１）ソフトウェアパッケージ（ＡＢＩ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）が使用され、全ての配列決定データを分析した。配列は、ＮＣＢＩウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastのＢＬＡＳＴツールを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおける全ての配列と比較された。系統発生解析のために、配列がＣｌｕｓｔａｌＸソフトウェアパッケージを使用して、以下の設定で整列された３４。Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：１０．００，Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ０．２０，Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｗｉｔｃｈ ３０％，ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ０．５９。系統発生解析はＭＥＧＡプログラムの近隣結合法を使用して実施された（９）。ヌクレオチド距離マトリックスは、Ｋｉｍｕｒａの２パラメータ推定値またはｐ距離推定値のいずれか一方によって生成された（５）。ブートストラップ再サンプリング（５００複製）が使用され、個々の枝上におおよその信用限界を置いた。
【００６０】
完全なＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノムのヌクレオチド配列の決定
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノムの既に配列決定されている領域に位置する、特異的プライマの組み合わせと、特許ＰＡＬＭ法（ＷＯ０１５１６６１）を使用して、本発明者らは当該新規コロナウイルスに対する完全長ゲノム配列を複製および決定する過程にある。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノムの分析部分に位置する５’−オリゴヌクレオチドと、３’標識化ランダムプライマ（ＪＺＨ２Ｒ）との組み合わせを使用して、さらなる断片が前記プロトコルと同様のネストＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用して増幅された。
【００６１】
ＳＺ１６３の単離
２００３年１月、鼻感冒、結膜炎および熱を伴った７ヶ月の子供が来院した。胸部Ｘ線は気管支梢炎の典型的特徴を示し、発病から４日後に、鼻咽頭吸引物が収集された（試料ｎｒ：ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）。アデノウイルスと、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と、インフルエンザＡおよびＢと、パラインフルエンザ１，２および３と、ライノウイルスと、ＨＣｏＶ−２２９Ｅと、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３とに対する、当該試料についての通常使用されるあらゆる試験は陰性であった。続いて、臨床試料がヒト線維芽肺（ＨＦＬ）細胞と、第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザル）と、Ｒ−ヒーラ細胞とを含む種々の細胞に接種された。ＣＰＥはｔＭＫ細胞でのみ検出され、接種後８日に最初に観察された。ＣＰＥは、ウイルス感染した細胞における屈折の出現と共に拡散し、７日後に細胞分離された。さらに顕著なＣＰＥがＬＬＣ−ＭＫ２細胞への継代の際に観察された。さらに、全体的な細胞円形化、適度な細胞増大が観察された。ヒト内皮肺細胞、ＨＦＬ、横紋筋肉腫細胞およびベロ細胞におけるさらなる継代培養は、ＣＰＥに対して依然として陰性であった。培養物中のインフルエンザＡおよびＢ、ＲＳＶ、アデノウイルスまたはパラインフルエンザウイルス型１，２もしくは３を検出するための免疫蛍光アッセイは依然として陰性であった。
【００６２】
続いて、感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養上清がＶＩＤＩＳＣＡによって分析された。対照として、本発明者らは非感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の上清を使用した。第２ＰＣＲ増幅段階後、複数のＤＮＡ断片が試験試料中に存在したが、該対照中には存在しなかった。これらの断片は複製され、配列決定された。ＧｅｎｂａｎｋにおけるＢｌａｓｔ検索は１６断片中８断片が、最も高い相同性を有するコロナウイルス科のヒトコロナウイルス２２９Ｅに対して配列類似性を有していることが明らかとなった（表４および５）。
【００６３】
レプリカーゼ１Ｂ領域の２７０ｎｔ断片の系統発生解析は、本発明者らがコロナウイルス群１の別個の新規要素を同定したことを示した。ＶＩＤＩＳＣＡ技術を用いて、１６３−２，１６３−４，１６３−９，１６３−１０，１６３−１１，１６３−１４，１６３−１５および１６３−１８という名の８ＨＣＯＶ−１６３−特異的断片が単離され、複製され、配列決定され、Ｇｅｎｂａｎｋからの関連配列を用いて整列された。使用された配列のＧｅｎｂａｎｋ登録番号は、ＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス）：ＡＦ２０１９２９、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ：ＡＦ３０４４６０、ＰＥＤＶ（ブタ伝染性下痢症ウイルス）：ＡＦ３５３５１１、ＴＧＥＶ（伝染性胃腸炎ウイルス）：ＡＪ２７１９６５、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ：ＡＹ２７８５５４、ＩＢＶ（鳥類伝染性気管支炎ウイルス）：ＮＣ＿００１４５１、ＢＣｏＶ（ウシコロナウイルス）：ＮＣ＿００３０４５、ＦＣｏＶ（ネココロナウイルス）：Ｙ１３９２１およびＸ８０７７９、ＣＣｏＶ（イヌコロナウイルス）：ＡＢ１０５３７３およびＡ２２７３２、ＰＲＣｏＶ（ブタ呼吸器コロナウイルス）：Ｍ９４０９７、ＦＩＰＶ（ネコ伝染性腹膜炎ウイルス）：Ｄ３２０４４である。ＨＣｏＶ−２２９Ｅ（ＡＦ３０４４６０）と比較されるＨＣｏＶ−ＮＬ６３断片の位置：レプリカーゼ１ＡＢ遺伝子：１５１５５−１５３６１，１６０４９−１６１８２，１６１９０−１６３１５，１８４４４−１８５５０，スパイク遺伝子：２２１２４−２２２６６、ヌクレオカプシド遺伝子：２５６６７−２５８８２および２５８８７−２５９５７、３’ＵＴＲ：２７０５２−２７１２３。枝の長さは配列ごとの置換の数を示している。最も密接に関連した種の配列から同一性スコアが計算される（表５および表６）。
【００６４】
また、推定アミノ酸配列が関連コロナ（様）ウイルスのオープンリーディングフレームにおける対応する領域に対して整列された（表６）。
【００６５】
ヒトコロナウイルスはヒトにおける一般的な感冒の１０〜３０％を占めており７、呼吸器疾患を伴う子供においてコロナウイルスが見つかることは珍しいことではない。しかしながら、ウイルスＨＣｏＶ−ＮＬ６３がＬＬＣ−ＭＫ細胞から得られるということは印象的である。ヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＯＣ−４３は、サル腎細胞において複製できないことが知られている。興味深いことに、ＳＡＲＳの原因である新たに同定されたヒトコロナウイルスもまた、サル腎細胞において複製可能である３０。
【００６６】
細胞培養物におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３の増殖
鼻咽頭吸引物は発症の４日後に収集された。試料は、アデノウイルスと、ＲＳＶと、インフルエンザＡと、インフルエンザＢと、パラインフルエンザ型１，２および３の存在するかについて、ウイルス性呼吸器キット（Ｂａｒｔｅｌｓ：Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｐｌｃ，Ｗｉｃｋｌｏｗ Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて試験された。さらに、ライノウイルスと、メタ−肺炎ウイルス属と、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅとに対するＰＣＲ診断が行われた２，１０。続いて、元の鼻咽頭吸引物が、ＨＦＬ細胞、ｔＭＫ細胞およびＲＨａＬａ細胞を含む種々の細胞培養物に接種された。試験管はローラドラム中で３４℃に保たれ、３〜４日毎に観察された。維持培地は３〜４日毎に補給された。２種の異なる培地が実施された。ウシ胎児血清を含まないＯｐｔｉｍｅｍ１（Ｇｉｂｃｏ）がｔＭＫ細胞に対して使用され、３％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ Ｈａｎｋｓ’／Ｅａｒｌｅ’ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）が残りの細胞型に使用された。ウイルス培養物において、インフルエンザウイルスＡおよびＢと、ＲＳＶと、アデノウイルス（Ｉｍａｇｅｎ，ＤＡＫＯ）とに対する蛍光標識マウス抗体のプールを用いて直接染色が行われた。間接染色はマウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてパラインフルエンザウイルス型１，２または３に対して行われ、続いて標識ウサギ抗マウス抗体（Ｉｍａｇｅｎ，ＤＡＫＯ）を用いて染色が行われた。
【００６７】
鼻咽頭標本におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３の検出方法
診断ＲＴ−ＰＣＲに対して、核酸がＢｏｏｍ法４によって、５０μｌウイルス上清または５０μｌ懸濁鼻咽頭標本から抽出された。１０ｎｇの逆転写プライマｒｅｐＳＺ−ＲＴ（表７）が使用されたことを除いて、逆転写は上述のように行われた。ＲＴ混合物全体が、１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−１および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−３を含む第１ＰＣＲ混合物に加えられた。ＰＣＲ反応は５分９５℃、２０周期の１分９５℃−１分５５℃−２分７２℃、１０分７２℃のデータに従って行われた。ネストＰＣＲは１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−２および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−４を含む５μｌの第１ＰＣＲを使用して開始された。第１ＰＣＲと同じデータの２５周期ＰＣＲが行われた。１０μｌの第１および１０μｌのネストＰＣＲがアガロースゲル電気泳動によって分析された（図２）。断片の複製および配列決定は、基本的に上述のように行われた。
【００６８】
ポリクローナル抗体を培養する方法
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３表面蛋白（たとえば、Ｓ−糖蛋白質またはＨＥ−糖蛋白質）内の適切な領域が選択され、適切なオリゴヌクレオチドおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅された。相当する、精製されたウイルス抗原は、適切な宿主（たとえば、前記Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ３８）における発現によって得られる。メスＮＺＷウサギ（およそ４ｋｇ）は０．５〜５．０ｍｇのウイルス蛋白質抗原調製品を与えられる。抗原は０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で懸濁され、等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）において乳化された。フロイントアジュバントは、既知のアジュバントシステムであり、該システムは少量の抗原が使用され、抗原の免疫原性が（おそらくであるが）未知であるこれらの実験における使用に適している。刊行されている使用のためのガイドラインに従い、該ガイドラインは、各部において注入を０．１ｍｌまでに制限し、最初の免疫化投与量に関してＣＦＡのみを使用する。この抗原調製（全量１ｍｌ）は、ウサギの首の後部の弛緩性皮膚に皮下注射される。この注射投与法は免疫学的に有効であり、片側面または両側面注射に関連する局部炎症の可能性を最小限にする（このような側面炎症は動物の移動性を低下させ得る）。３週間の安静状態の後、１ｍｌの血液が試験出血のために耳動脈から取り出される。所望の抗体の力価が小さすぎると判断されると、抗体が増やされる。適切な抗体レベルのウサギは皮下的に、ＣＦＡに含まれる１．０ｍｇの抗原を用いて促進される。促進された動物は２週間後に出血させられる、すなわち、１５ｍｌの血液が、赤外線灯を用いて血管を広げて、耳動脈から採取される。ウサギは市販の拘束手段の内に置かれ、全部で７回以下のキシラジンを用いて鎮静され、ウサギは、キシラジン／ケタミンを使用して麻酔に続いて心臓の穿刺によって放血させられた。
【００６９】
ワクチン生成のための方法
サブユニットワクチン生成のために、ＨＥ，ＭおよびＮ蛋白質とおそらく組み合わされるＳ−糖蛋白質は適切な真核性宿主（たとえば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＬＬＣ−ＭＫ２細胞）において発現され、選択的に２つの小さな親和性タグ（たとえば、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐＩＩタグ）を使用して精製される。適切な精製の後、得られたウイルス蛋白質はサブユニットワクチンとして使用され得る。
【００７０】
あるいは、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが適切な細胞株において上述のように増殖され、続いてＷｕ１１に記載のように処理され得る。簡潔に、ウイルスは２０％ポリエチレングリコール６０００を用いて培地から沈殿させられ、不連続な４０〜６５％スクロース変化率を経て、４時間８００００×ｇ、続いて、直線的な５〜４０％ＣｓＣｌ変化率、１２００００×ｇで４時間、超遠心分離によって精製される。得られたウイルス調製物は、Ｂｌｏｎｄｅｌ３に記載のように６５℃で３０分間加熱することによって不活性化され得る。
【００７１】
光学バイオセンサにおける、固定化した配位子に結合する、Ｓ糖蛋白質または任意のＨＣＯＶ−ＮＬ６３ウイルス蛋白質の解析
結合反応は２０℃で、わずかな修正をした、ＩＡｓｙｓ ２チャネル共鳴ミラーバイオセンサにおいて実行された（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｓａｘｏｎ Ｈｉｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。平面ビオチン表面は、６００ａｒｃ ｓシグナルが、１ｎｇ結合蛋白質／ｍｍ２に対応し、製造業者の教授に従い、ストレプトアビジンを用いて誘導化された。対照は、ウイルス蛋白質はストレプトアビジン誘導ビオチン表面に結合しないということを示した（結果は示されていない）。ビオチン化抗体は平面ストレプトアビジン誘導表面に固定化され、その後ＰＢＳで洗浄された。バイオセンサキュベットの表面上の、固定化した配位子および結合したＳ−糖蛋白質の分布が共鳴走査によって調べられ、常にこれらの分子はセンサ表面上に均一に分布し、したがってミクロの状態で集合しないことが示された。結合アッセイが２０±０．１℃で３０μｌのＰＢＳの最終体積において実施された。ライゲート（ｌｉｇａｔｅ）がキュベットに対して、１μｌ〜５μｌのＰＢＳ中に既知の濃度で追加され、１４〜７０ｎＭのＳ−糖蛋白質の最終濃度を与えた。解離段階後、残余の結合したライゲートを除去し、固定した配位子を再生するために、キュベットは５０μｌの２Ｍ ＮａＣｌ−１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２で３回、５０μｌの２０ｍＭ ＨＣｌで３回洗浄した。データは、種々の量の固定した抗体（０．２，０．６および１．２ｎｇ／ｍｍ２）を用いて実行された実験からプールされた。ｋｏｎの計算のために、低濃度のライゲート（Ｓ−糖蛋白質）が使用されたが、ｋｏｆｆの測定のために、より高濃度のライゲートが使用され（１μＭ）、再結合の影響を避けた。結合パラメータｋｏｎおよびｋｏｆｆは結合反応の会合および解離段階からそれぞれ計算され、手段を提供する非線形曲線適合ＦａｓｔＦｉｔソフトウェア（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒ）を使用した。解離定数（ｋｄ）は会合および解離速度定数と平衡付近で観測される結合の程度とから計算された。
【００７２】
実施例２
方法
ウイルス単離
子供は、アムステルダムに住んでいたが、３日以来のコリザおよび結膜炎の症状を伴って病院に収容された。入院時、彼女は息切れしており、飲むことを拒絶した。患者の体温は３９℃、呼吸数は９６％の酸素飽和状態で５０回呼吸／分であり、脈拍は１７７打／分であった。聴診の際、左右の持続性イクスピリウム（ｅｘｐｉｒｉｕｍ）および終末呼気性喘鳴が見られた。胸部Ｘ線検査は気管支梢炎の典型的特徴を示した。子供は１日目にサルブタモールおよびイプラトロピウムを用い、続いて５日間、サルブタモールを用いて治療された。子供は外来で毎日みられ、症状は徐々に軽減した。鼻咽頭吸引物は発症５日後に収集された。試料は、ＲＳＶと、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３の存在についてウイルス呼吸器キット（Ｂａｒｔｅｌｓ：Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｐｌｃ，Ｗｉｃｋｌｏｗ Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して試験された。さらに、ライノウイルスと、エンテロウイルスと、メタ−肺炎ウイルス属と、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅに対するＰＣＲ試験が行われた（２，１０）。元の鼻咽頭吸引物は種々の細胞に接種された。培養物はローラドラム中３４℃に保たれ、３〜４日毎に観察された。維持培地は３〜４日毎に補給された。２種の異なる培地が実施された。ウシ胎児血清を含まないＯｐｒｉｍｅｍ１（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）がｔＭＫ細胞に対して使用され、３％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ Ｈａｎｋｓ’／Ｅａｒｌｅ’ｓ培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が残余の細胞型に対して使用された。吸引物試料に感染した細胞培養物は培養の１週間後に呼吸器ウイルスの存在に関して染色された。直接染色がＲＳＶと、インフルエンザＡおよびＢウイルス（Ｉｍａｇｅｎ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）とに対する蛍光標識マウス抗体のプールを用いて行われた。間接染色が、マウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてアデノウイルスとパラインフルエンザウイルス型１，２または３とに対して行われ、ＦＩＴＣ−標識ウサギ抗マウス抗体（Ｉｍａｇｅｎ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて次の染色が行われた。
【００７３】
ＶＩＤＩＳＣＡ法
残余の細胞およびミトコンドリアを除去するために、１１０μｌのウイルス培養物の上清が、エッペンドルフ微小遠心（１３５００ｒｐｍ）において、最大速度で１０分間沈降させられた。染色体ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡを溶解細胞から除去するために、１００μｌが未使用の試験管に移され、３７℃で４５分間ＤＮＡｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて処理された。核酸はＢｏｏｍに記載のように抽出された（４）。逆転写反応がランダム６量体プライマ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行われ、一方、第２鎖ＤＮＡ合成がＳｅｑｕｅｎａｓｅＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて実施された。フェノール／クロロホルム抽出の後にエタノール精製が行われた。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰが基本的に、いくつかの修正をしたＢａｃｈｅｍ（１）に記載のように行われた。ｄｓＤＮＡはＨｉｎＰＩおよびＭｓｅＩ制限酵素を用いて分解された（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。続いてＭｓｅＩ−およびＨｉｎＰＩ−アンカ（下記）が、５Ｕリガーゼ酵素（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共に提供されたリガーゼ中に３７℃で２時間、加えられた。ＭｓｅＩ−およびＨｉｎＰＩ−アンカが先端鎖オリゴ（ＭｓｅＩアンカに対する５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ−３’およびＨｉｎＰＩアンカに対する５’−ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣ−３’）を下端鎖オリゴ（ＭｓｅＩアンカに対する５’−ＴＡＧＧＴＡＣＧＣＡＴＧＣ−３’およびＨｉｎＰＩアンカに対する５’−ＣＧＧＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ−３’）と共に、リガーゼバッファ１：４０希釈物中で混合することによって調製される。２０周期のＰＣＲは、１０μｌのライゲーション混合物と、１００ｎｇＨｉｎＰＩ標準プライマ（５’−ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣ−３’）と、１００ｎｇのＭｓｅＩ標準プライマ（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＡＡ−３’）とを用いて行われた。５μｌのこのＰＣＲ生成物は、１００ｎｇ ＨｉｎＰＩ−Ｎプライマおよび１００ｎｇ ＭｓｅＩ−Ｎ（「Ｎ」は標準プライマが１つのヌクレオチドＧ，Ａ，ＴまたはＣで拡張されることを示している）を用いた第２「選択的」増幅段階における投入物として使用された。増幅の選択的巡回は、「タッチダウンＰＣＲ」すなわち１０周期の［６０秒９４℃−３０秒６５℃−１分７２℃］で行われ、アニーリング温度は各周期１℃低下され、続いて２３周期の［３０秒９４℃−３０秒５６℃−１分７２℃］および１周期の１０分７２℃が行われた。ＰＣＲ生成物は４％Ｍｅｔａｐｈｏｒ（登録商標）アガロースゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上で分析され、関心のある断片がＢｉｇＤｙｅターミネータ試薬を用いて複製および配列決定された。電気泳動およびデータ収集がＡＢＩ３７７機器上で行われた。
【００７４】
ｃＤＮＡライブラリ構築および全ゲノム配列決定
ｃＤＮＡライブラリは、わずかな修正をしたＭａｒｒａ１７に記載のように生成された。逆転写反応の間、ランダム６量体プライマのみが使用され、オリゴｄＴ−プライマは使用されず、増幅されたｃＤＮＡはＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡ複製ベクタ中に複製された。コロニーが採取され、ＢＨＩ培地中に懸濁された。Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液は、増幅のためのＴ７およびＭ１３ＲＰを使用して、ＰＣＲ増幅において投入物として使用された。続いて、ＰＣＲ生成物がＰＣＲ−増幅において使用されたものと同じプライマとＢｉｇＤｙｅターミネータ試薬とを用いて配列決定された。電気泳動およびデータ収集はＡＢＩ３７７機器上で行われた。配列は、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ソフトウェア バージョン ２．０を用いて集められた。
【００７５】
診断ＲＴ−ＰＣＲ
４９２人から、総数６００の呼吸器試料が２００２年８月から２００２年１２までの間に収集された。物質の種類は、口腔／鼻咽頭吸引物から咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄物、唾液に至った。試料は上下気道疾患に罹患しているヒトの定期的ウイルス診断スクリーニングのために収集された。１００μｌの試料がＢｏｏｍ抽出において使用された（４）。逆転写が、１０ｎｇを使用したＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）または逆転写プライマ（ｒｅｐＳＺ−ＲＴ：５’−ＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣ−３’）を用いて行われた。ＲＴ混合物全体が、１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−１（５’−ＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧ−３’）および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−３（５’−ＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＡＴＣＣＴＡ−３’）を含む第１ＰＣＲ混合物に加えられた。ＰＣＲ反応は、５分９５℃、２０周期の１分９５℃−１分５５℃−２分７２℃、１０分７２℃のデータに従って行われた。ネストされたＰＣＲは１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−２（５’−ＴＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＴ−３’）および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−４（５’−ＴＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴ−３’）と共に、５μｌの第１ＰＣＲを使用して開始された。第１ＰＣＲと同じデータの２５周期のＰＣＲが行われた。１０μｌのＰＣＲ生成物がアガロースゲル電気泳動によって分析された。あらゆる陽性試料が配列決定され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３の存在を確認した。
【００７６】
配列分析
配列はＮＣＢＩウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastのＢＬＡＳＴツールを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中のあらゆる配列と比較された。系統発生解析のために、配列は以下の設定でＣｌｕｓｔａｌＸソフトウェアパッケージを使用して整列された。Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：１０．００，Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ０．２０，Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｗｉｔｃｈ ３０％，ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ０．５（９）。系統発生解析は、１遺伝子内のあらゆる断片の情報を使用するＭＥＧＡプログラム（５）の近隣結合法を使用して実行された。ヌクレオチド距離マトリックスはＫｉｍｕｒａの２パラメータ推定値またはｐ距離推定値のいずれか一方によって生成された（６）。ブートストラップ再サンプリング（５００複製）が使用され、個々の枝上におおよその信用限界を置いた。
【００７７】
結果
急性呼吸器疾患を伴う子供からのウイルスの単離
２００３年１月、鼻感冒、結膜炎および熱を伴う７ヶ月の子供が来院した。胸部Ｘ線は気管支梢炎の典型的特徴を示し、発病から５日後に、鼻咽頭吸引物試料が収集された（試料 ＮＬ６３）。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３と、ライノウイルスと、エンテロウイルスと、ＨＣｏＶ−２２９Ｅと、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３とに対する診断試験は、依然として陰性であった。続いて、臨床試料はヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＦＬ）と、第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザル）と、ヒーラ細胞とに接種された。ＣＰＥはｔＭＫ細胞でのみ検出され、接種後８日に最初に観察された。ＣＰＥはウイルス感染した細胞における屈折の出現と共に拡散し、７日後に細胞分離された。さらに顕著なＣＰＥがサル腎細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２への継代の際に、全体的な細胞円形化および適度な細胞増大とともに観察された（図１）。ＨＦＬ、横紋筋肉腫細胞およびベロ細胞におけるさらなる継代培養は、ＣＰＥに対して依然として陰性であった。培養物中のＲＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルスまたはパラインフルエンザウイルス型１，２および３を検出するための免疫蛍光アッセイは依然として陰性であった。酸不安定性およびクロロホルム感受性試験は、ウイルスはおそらくエンベロープを有しておりピコルナウイルス群２４の要素ではないということを示した。
【００７８】
ＶＩＤＩＳＣＡ法によるウイルス発見
分子生物学ツールによる未知の病原体の同定は、標的配列が未知であり、ゲノム特異的ＰＣＲ−プライマを設計することができないという問題に直面する。この問題を克服するために、本発明者らは、ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ技術４に基づくＶＩＤＩＳＣＡ法を開発した。ＶＩＤＩＳＣＡの利点は、制限酵素部位の存在は充分増幅を保証するので、配列の予備的知識が要求されないということである。投入試料は、血漿／血清または培養上清のいずれであってもよい。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは単離ｍＲＮＡを用いて開始するのに対して、ＶＩＤＩＳＣＡ技術はウイルス核酸に関して選択的に濃縮する処理で始まり、遠心分離段階を含み、残余の細胞およびミトコンドリアを除去する。さらに、ＤＮＡｓｅ処理が使用され、分解した細胞由来の妨害染色体ＤＮＡおよび妨害ミトコンドリアＤＮＡを除去し、一方、ウイルス核酸はウイルス粒子内で保護される。最終的に、頻繁に切断する制限酵素を選択することによって、該方法は微調整され、大部分のウイルスが増幅される。ＶＩＤＩＳＣＡを使用して、本発明者らは肝炎Ｂウイルスに感染しているヒトおよび急性パルボウイルスＢ１９に感染しているヒトのＥＤＴＡ血漿由来のウイルス核酸を増幅することができた。該技術はまた細胞培養物中のＨＩＶ−１を検出することが可能であり、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス両方を同定する能力を示す。
【００７９】
ＣＰＥ−陽性培養物ＮＬ６３の上清がＶＩＤＩＳＣＡによって分析された。本発明者らは対照として非感染細胞の上清を使用した。第２ＰＣＲ増幅段階の後、特有で顕著なＤＮＡ断片が対照中でなく試験試料中に存在した。これらの断片は複製され、配列決定された。１６断片中１２はコロナウイルス科の要素に対して配列類似性を示したが、有意な配列相違はあらゆる断片において明白であった。これらの結果は本発明者らが新規コロナウイルス（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）を同定したということを示している。
【００８０】
患者試料におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３の検出
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が子供の鼻咽頭吸引物に由来するということを示すために、本発明者らはＨＣｏＶ−ＮＬ６３を特異的に検出する診断ＲＴ−ＰＣＲを設計した。この試験は１ｂ遺伝子内の特有の配列に基づいており、臨床試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３の存在を確認した。このＰＣＲ生成物の配列は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における生体外での継代の際に同定されたウイルスの配列と同一であった（結果は示されていない）。
【００８１】
培養されたコロナウイルスは該子供由来であることが確認されたが、該問題は、依然として、これは他に類のない臨床事例であるのか、またはＨＣｏＶ−ＮＬ６３はヒトにおいて広まっているのかというところにとどまっている。この問題に対処するために、本発明者らは、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の存在に関して２００２年１２月から２００３年８月までの間の、入院患者および外来診療室を訪れた人の呼吸器試料を調べた。本発明者らはＨＣｏＶ−ＮＬ６３を有するさらなる７人を確認した。ＰＣＲ生成物の配列分析は、種々の試料においてわずかな特徴的な（および複製可能な）点変異の存在を示し、ＮＬ６３の種々の部分群が相互に広がっていることを示唆した。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３陽性の少なくとも５人は気道疾患に罹患しており、２人の臨床データは得られなかった。初発症例を含んでおり、５人の患者が１歳以下の子供であり、３人の患者が大人である。２人の大人は免疫抑制されているようであり、それは、彼らのうちの１人が骨髄移植者であり、もう１人がＣＤ４細胞の総数が非常に少ないＡＩＤＳに罹患しているＨＩＶ陽性患者であるからである。第３の大人の臨床データは得られなかった。１人の患者のみがＲＳＶ（ｎｒ７２）に重感染しており、ＨＩＶ感染患者（ｎｒ４６６）はニューモシスティス・カリニを有していた。他の呼吸器病因は他のＨＣｏＶ−ＮＬ６３陽性患者において見つからず、呼吸器症状はＨＣｏＶ−ＮＬ６３によって引き起こされることを示唆している。あらゆるＨＣｏＶ−ＮＬ６３陽性試料が昨冬季に収集され、２００３年１月においては７％の検出頻度であった。２００３年の春および夏に収集された３０６の試料はいずれも該ウイルスを含んでいなかった（Ｐ＜０．０１，２−ｔａｉｌｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）。
【００８２】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３完全ゲノム分析
コロナウイルスのゲノムは特徴的なゲノム組織を有している。５’ｈａｌｆはラージ１ａおよび１ｂ遺伝子を含んでおり、非構造ポリ蛋白質をコードしており、４つの構造蛋白質、すなわちスパイク（Ｓ）、膜組織（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）およびヌクレオカプシド（Ｎ）をコードする遺伝子を含む。さらなる非構造蛋白質が１ｂおよびＳ遺伝子間、ＳおよびＥ遺伝子間、ＭおよびＮ遺伝子間またはＮ遺伝子下流のいずれかでコードされる。
【００８３】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノム組織がこれらの特徴を共有しているか否かを判断するために、本発明者らは提供物質として、精製したウイルスのストックを用いてｃＤＮＡライブラリを構築した。総数４７５ゲノム断片が、ヌクレオチドごとに７配列という平均範囲で分析された。特異的ＰＣＲが設計され、質の低い配列データの、隙間を埋め、領域を配列決定した。５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）および３’ＲＡＣＥ実験と組み合わせて、完全ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノム配列が解明された。
【００８４】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のゲノムはポリＡ末端を有する２７，５５３個のヌクレオチドのＲＮＡである。それは３４％のＧ−Ｃ含有量を有し、３７％〜４２％２５にわたるコロナウイルス科のうちで最も低いＧ−Ｃ含有量を有している。ＺＣｕｒｖｅソフトウェアが使用され、ＯＲＦ２６を同定し、ゲノム配置は既知のコロナウイルスとの類似性を使用して描かれる（図６）。１ａおよび１ｂ遺伝子は、ウイルス複製に必須である、ＲＮＡポリメラーゼおよびプロテアーゼをコードする。潜在的偽結節構造は１２４３９位に存在し、−１フレームシフト信号を提供し、１ｂポリ蛋白質を翻訳する。Ｓ，Ｅ，ＭおよびＮ蛋白質をコードすると予測される遺伝子がゲノムの３’部分に見られる。２８６個および２８７個のヌクレオチドの短い非翻訳領域（ＵＴＲ）はそれぞれ５’および３’末端に存在する。血球凝集素エステラーゼ遺伝子は、群２および群３コロナウイルス中に存在するものであるが、存在していなかった。ＳおよびＥ遺伝子間のＯＲＦ３はおそらくただ１つの補助非構造蛋白質をコードする。
【００８５】
１ａおよび１ａｂポリ蛋白質はゲノムＲＮＡから翻訳されるが、残りのウイルス蛋白質はサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ ｍＲＮＡ）から翻訳され、それぞれ、ゲノムの５’部分（５’リーダー配列）由来の共通の５’末端および３’共通末端部を有する。ｓｇ ｍＲＮＡはマイナス鎖合成の間、不連続的転写によって作成された２７。不連続的転写はシス作用転写調節配列（ＴＲＳ）間の塩基対を必要とし、一方はゲノムの５’部分（リーダーＴＲＳ）の近くに位置し、他方は各ＯＲＦ上流（ＴＲＳ本体）に位置する２８。本発明者らが配列決定のために使用したｃＤＮＡバンクは、Ｎ蛋白質のｓｇ ｍＲＮＡの複製を含んでおり、あらゆるｓｇ ｍＲＮＡに対して融合されるリーダー配列を正確に解読する機会を提供する。７２個のヌクレオチドのリーダーは５’ＵＴＲで同定された。リーダーＴＲＳ（５’−ＵＣＵＣＡＡＣＵＡＡＡＣ−３’）はＮ遺伝子のＴＲＳ本体上流と１１／１２個のヌクレオチド類似性を示した。推定ＴＲＳもまたＳ，ＯＲＦ３，ＥおよびＭ遺伝子の上流で同定された。
【００８６】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の配列は他のコロナウイルスの完全ゲノムと共に整列された。ヌクレオチド同一性比率が各遺伝子に対して決定された。Ｍ遺伝子を除く全ての遺伝子に対して、ＨＣｏＶ−２２９Ｅとの同一性比率が最も高かった。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が群１コロナウイルスの新たな要素であることを確認するために、病原分析が１Ａ，１Ｂ，Ｓ，ＭおよびＮ遺伝子のヌクレオチド配列を使用して行われた。分析された各遺伝子に対して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３は群１コロナウイルスと共に集団化された。部分群ＨＣｏＶ−ＮＬ６３／ＨＣｏＶ−２２９Ｅのブートストラップ値は１ａ，１ｂおよびＳ遺伝子に対して１００であった。しかしながら、ＭおよびＮ遺伝子に対して、この、部分クラスタのブートストラップ値は（それぞれ７８および４１に）減少し、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ，ＨＣｏＶ−ＮＬ６３およびＰＥＤＶを含む部分クラスタが明らかになる。病原分析がＯＲＦ３およびＥ遺伝子に対して行われなかったが、これは、それぞれ、当該領域が種々のコロナウイルス群間で非常に変化していたから、または当該領域が分析するには小さすぎたからである。Ｓｉｍｐｌｏｔソフトウェア バージョン２．０２９によるブートスキャン分析は組換えの徴候を検出しなかった（結果は示されていない）。
【００８７】
ＳおよびＥ遺伝子間のただ１つの非構造蛋白質遺伝子の存在は注目に値する。それはＰＥＤＶおよびＯＣ４３を除いて、ほとんど全てのコロナウイルスがこの領域において２以上のＯＲＦを有するからである３０，３１。恐らくＨＣｏＶ−２２９Ｅと比較して、Ｓ遺伝子の５’部分における５３７個のヌクレオチドの大きな挿入部分は最も注目に値する。Ｂｌａｓｔ検索は、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されている任意のコロナウイルス配列または任意の他の配列に対する、スパイク蛋白質のこのさらなる１７９個のアミノ酸領域の類似性を検出しなかった。
【００８８】
【表１】
【００８９】
【表２】
【００９０】
【表３】
【００９１】
【表４】
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
【表８】
【００９６】
【表９】
【００９７】
【表１０】
【００９８】
【表１１】
【００９９】
【表１２】
【０１００】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは、配列の予備知識がなくとも核酸の増幅を可能にする。ＣＰＥ−陽性および非感染細胞由来の培養上清はｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ法で扱われた。非感染対照試料に存在しない、ＣＰＥ−陽性培養物由来の増幅生成物は複製され、配列決定された。
【図２】ＨＣｏＶ−ＮＬ１６３に感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞。パネルＡおよびＢは非染色細胞であり、一方パネルＣおよびＤはヘマトキシリンエオシンで染色されている。ＨＣｏＶ−ＮＬ１６３の典型的ＣＰＥはパネルＡおよびＣに示されている。対照非感染ＬＬＣ−ＭＫ細胞はパネルＢおよびＤに示されている。
【図３】Ｍｅｔａｐｈｏｒ（登録商標）アガロースゲル電気泳動によって視覚化されたＶＤ−ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ ＰＣＲ生成物。選択的増幅段階の間に使用される、１６プライマ対結合のうちの１（ＨｉｎＰ Ｉ−ＧおよびＭｓｅ Ｉ−Ａ）のＰＣＲ生成物。レーン１および２：ウイルス培養物ＮＬ１６３の複製ＰＣＲ生成物；レーン５および６：ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の対照上清およびレーン７および８：陰性ＰＣＲ対照。レーンＭ：２５ｂｐ分子量マーカー（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）。矢印はゲルから切除され、配列決定された新規コロナウイルス断片を示す。
【図４】ＨＣｏＶ−ＮＬ１６３配列の系統発生解析。Ｇ１，Ｇ２およびＧ３は群１、群２および群３コロナウイルスクラスタを示す。使用された配列のＧｅｎｂａｎｋ受託番号は以下のとおりである。ＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス）：ＡＦ２０１９２９、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ：ＡＦ３０４４６０、ＰＥＤＶ（ブタ伝染性下痢症ウイルス）：ＡＦ３５３５１１、ＴＧＥＶ（伝染性胃腸炎ウイルス）：ＡＪ２７１９６５、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ：ＡＹ２７８５５４、ＩＢＶ（鳥類伝染性気管支炎）：ＮＣ＿００１４５１、ＢＣｏＶ（ウシコロナウイルス）：ＮＣ＿００３０４５、ＦＣｏＶ（ネココロナウイルス）：Ｙ１３９２１およびＸ８０７９９、ＣＣｏＶ（イヌコロナウイルス）：ＡＢ１０５３７３およびＡ２２７３２、ＰＲＣｏＶ（ブタ呼吸器コロナウイルス）：Ｍ９４０９７およびＦＩＰＶ（ネコ感染性腹膜炎ウイルス）：Ｄ３２０４４。ＨＣｏＶ−２２９Ｅ（ＡＦ３０４４６０）と比較したＨＣｏＶ−１６３断片の位置。レプリカーゼ１ＡＢ遺伝子：１５１５５−１５３６１、１６０４９−１６１８２、１６１９０−１６３１５および１８４４４−１８５５０、スパイク遺伝子：２２１２４−２２２６６、ヌクレオカプシド遺伝子：２５６６７−２５８８２および２５８８７−２５９５７、３’ＵＴＲ：２７０５２−２７１２３。枝長は配列ごとの置換数を示す。
【図５】コロナウイルスの配置図および表３に記載の１６３断片の位置。
【図６】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３’の制限地図。ｓｓＲＮＡゲノムの完全２７５５３ｎｔ ｃＤＮＡ誘導体。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が番号が付された黒矢印として表されており、これらのＯＲＦ内の同定された（ＰＦＡＭ）領域が灰色の箱として示されている。
【図７】ＨＣｏＶ ＮＬ６３および他のヒトコロナウイルスのＳｉｍｐｌｏｔ分析。ＨＣｏＶ ＮＬ６３のＳＡＲＳ、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅに対する比較における差は、スパイク蛋白質コードＯＲＦにおける特有の５３７ｉｎ−ｆｒａｍｅ挿入によって引き起こされる（この記載の別の場所を参照）。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ分析は、Lole, K. S. , R. C. Bollinger, R. S. Paranjape, D. Gadkari, S. S.Kulkarni, N. G. Novak,R. Ingersoll, H. W. Sheppard, and S. C. Ray. 1999. Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination. J. Virol. 73: 152-160に記載されている。
【図８】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３スパイクおよびマトリックス蛋白質のための発現構築。ＨｉｓおよびＳｔｒｅｐＩＩ標識スパイク融合蛋白質の発現はバクテリア成長培地へのＩＰＴＧの添加によって誘導され得る。ａｔｔＢ１／Ｂ２介在再結合を介して、Ｓ遺伝子挿入部分は他の市販の発現ベクタへ転写され、他の宿主における蛋白質の生成を促進する。ｐＧＰ７Ｓに関して同一の複製手順を経て、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ Ｍ−遺伝子に対するＧａｔｅｗａｙ適合発現ベクタが構築され得る。プラスミドはＮおよびＣ−末端親和性標識マトリックス融合蛋白質のＩＰＴＧ誘導生成を指示し、完全長融合蛋白質の選択的復元を可能にする。
【図９】再結合部位 ＮＬ６３−２２９Ｅ。ＮＬ６３由来配列は下線付の黒色太字であり、２２９Ｅ由来配列は灰色太字である。
【図１０】制限地図 ｃＤＮＡ複製ＮＬ６３／２２９Ｅハイブリッド。ＮＬ６３由来部分は灰色の箱として示され、２２９Ｅ由来領域は線として示されている。２つのゲノム間の接合部は、連続する、２つの黒矢印で印をつけている、１ｂ’とハイブリッド１ｂＯＲＦを示す‘ＯＲＦ−１ｂとによって示されている。 第２キメラゲノムは相互組換えによって、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のヌクレオチド１９６５３をＨＣｏＶ−ＯＣ４３のヌクレオチド２０６８２に融合し、ハイブリッドＯＲＦ１ｂを再び生成し、ハイブリッド１ａｂレプリカーゼ ポリ蛋白質を生成した。組換えが保存配列ＡＡＴＴＡＴＧＧ内で起こった。
【図１１】組換え部位 ＮＬ６３／ＯＣ４３ハイブリッド。先と同様にＮＬ６３由来領域は下線付きの黒色太字であり、ＯＣ４３由来配列は灰色太字である。得られたｃＤＮＡ制限地図は図１２に示される。
【図１２】制限地図 組換えＮＬ６３／ＯＣ４３ゲノム。ＮＬ６３由来部分は灰色のボックスで示されており、組換え部位は黒矢印１ｂ’および‘１ｂの間に示されている。
【図１３】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３ならびに２つのハイブリッドＮＬ６３／２２９ＥおよびＮＬ６３／ＯＣ４３由来のＯＲＦ１ｂの類似性プロット推定蛋白質配置構造。
【図１４】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３誘導体を発現する緑色蛍光蛋白質。機能的同等物ＮＬ６３／４ＧＥＰは、ヒトコドン最適化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に、Ｅ蛋白質（ＯＲＦ４）のｉｎ−ｆｒａｍｅ Ｃ末端融合を有している。感染細胞は４−ＥＧＦＰ融合蛋白質の励起後、蛍光を発しているようであった。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が使用され、ウイルス感染およびポリシストロニックサブゲノムメッセンジャの翻訳の過程を解明した。
【図１５】機能的誘導体ＮＬ６３Ｄ２０５２０２１０１１の制限地図。ＮＬ６３の欠失誘導体はスパイク蛋白質のＮ末端における大部分の挿入部分を欠いている。ヌクレオチド２０５２０−２１０１１を欠失することによって、特有の領域が除去され、一方、予測分泌シグナル配列は保持される（Nielsen, H. , J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. Von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10: 1-6）。
【図１６】さらなる患者試料由来のＨＣｏＶ−ＮＬ６３における配列変異。６人の患者試料由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物の両鎖の直接配列決定は、ＯＲＦ１ａ領域における多型性の存在を明らかにした。
【図１７】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３特異的および一般的ヒトコロナウイルス検出プローブ。コロナウイルスポリメラーゼは複数のサブゲノムＲＮＡを生成する。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３およびＳＡＲＳの配列決定ライブラリにおいてｃＤＮＡクローンをコードするＳ，Ｅ，ＭおよびＮの頻度（Snijder, E. J. , P. J. Bredenbeek, J. C. Dobbe, V. Thiel, J. Ziebuhr, L. L. Poon, Y. Guan, M. Rozanov, W. J. Spaan, and A. E. Gorbalenya. 2003，Unique and conserved features of genome and proteome of SARS-coronavirus, an early split-off from the coronavirus group 2 lineage. J. Mol. Biol. 331: 991-1004）。ノーザンブロットデータは感染細胞中のこれらのサブゲノムＲＮＡの高い存在度を示す。したがってこれらの遺伝子は診断試験に対する魅力的な標的である。ゲノムおよびサブゲノムＲＮＡは同一の３’末端を有するので、Ｎ遺伝子を含むプローブはそれら全てに対してハイブリッド形成するであろう。あらゆるヒトコロナウイルスの完全長配列の整列を経て、ＯＲＦ１ｂ中の保存領域が同定され、ネストされたＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いてそれらの検出を行った。
【図１８】一般的コロナウイルス検出プライマ。
【図１９】ヌクレオチド配列 ＨｃｏＶ＿ＮＬ６３。
【図２０】ＨＣｏＶ＿ＮＬ６３のＯＲＦ１ａ、レプリカーゼ酵素複合体。
【０１０２】
【図２１】ＨＣｏＶ＿ＮＬ６３のＯＲＦ１ａｂレプリカーゼ ポリ蛋白質。
【図２２】スパイク蛋白質（ＯＲＦ３）は（下記の連続配列の第１行目に示される）１６ＡＡのＮ末端分泌シグナル配列を含む（Nielsen, H. , J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. Von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10: 1-6）。
【図２３】ＯＲＦ−４コロナウイルス＿ＮＳ４、コロナウイルス非構造蛋白質４。この科は複数の非構造蛋白質４（ＮＳ４）配列または小さな膜蛋白質からなる。ＯＲＦ−５。この科は膜貫通型糖蛋白質である種々のマトリックス蛋白質からなる。Ｍ蛋白質またはＥ１糖蛋白質はウイルス集合に関わる。Ｅ１ウイルス膜蛋白質は、ウイルスエンベロープの形成のために要求され、ゴルジ複合体を介して輸送される。マトリックス蛋白質は、（連続配列の第１部分に示されている）Ｎ末端分泌シグナル配列を含むと予測される（Nielsen, H. , J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. Von Heijne. 1997.Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10: 1-6.）。ＯＲＦ−６ Ｐｆａｍ ００９３７、コロナウイルス ヌクレオカプシド蛋白質。ゲノムＲＮＡと複合体を形成する構造蛋白質。
【０１０３】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はウイルス学および医薬の分野に関連する。さらに、特に本発明は新規コロナウイルスの同定と、種々の試料中のウイルスを分類し、疾患を診断する手段および方法、感染した対象またはその危険のある対象の治療のためのワクチンおよび薬剤を開発する手段および方法等の、ウイルスに関連する手段および方法とに関連する。
【０００２】
コロナウイルスはコロナウイルス科の中の属であるが、大きなエンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムＲＮＡは大きさが２７〜３２ｋｂであり、キャップされ、ポリアデニル化されている。コロナウイルスの３種の血清学的に別個の群が同定された。各群内で、ウイルスは宿主域およびゲノム配列によって同定される。コロナウイルスは、マウス、ラット、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシおよびヒトにおいて同定された（３９，４０）。大部分のコロナウイルスは１種の宿主のみを感染させ、胃腸炎を含む重度の疾患および気道疾患を引き起こす。ヒトにおいて、３種のコロナウイルスが詳細に研究されている。ＨＣｏＶ−２２９ＥおよびＨＣｏＶ−ＯＣ４３は６０代半ばで同定されており、一般的な感冒を引き起こすことが知られている（１３−１７，１９，４１，４２）。一般的な感冒の他に、ＨＣｏＶ−２２９Ｅウイルスはより悪い状態の気道疾患を罹患している幼児から単離されているので、ＨＣｏＶ−２２９Ｅは幼児においてさらに重度の疾患を引き起こし得ることが示唆されている（２８）。第３の最近同定されたコロナウイルス、すなわちＳＡＲＳ−ＣｏＶは、生命に関わる肺炎を引き起こす可能性を有しており（４３）、これまで同定された最も病原性を有するヒトコロナウイルスである。ＳＡＲＳ−ＣｏＶはコロナウイルスの第４の群の第１の要素である、または該ウイルスは群２のコロナウイルスの異常型であることが示唆されている（２７，４４）。
【０００３】
コロナウイルスのゲノムは４種の構造タンパク質、すなわち、スパイク蛋白質と、膜蛋白質と、エンベロープ蛋白質と、ヌクレオカプシド蛋白質とをコードする。数種の非構造蛋白質が複製および転写に関与しており、ゲノム（１Ａおよび１Ｂ）の５’末端で、２つの長いオーバーラップするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。これらの２つのＯＲＦはリボソームフレームシフトを経て結合される。ＯＲＦ１Ａおよび１Ｂにコードされるポリペプチドは、ウイルスコードプロテアーゼによって、翻訳後処理される。さらに、さらなる非構造蛋白質がＳおよびＥ遺伝子間、またはＭおよびＮ遺伝子間もしくはＮ遺伝子の下流でコードされる。これらの「補助非構造蛋白質遺伝子」の中には、ウイルス複製に必須ではないと分かっているものもある（４５，４６）。１Ａおよび１Ｂのコロナウイルス遺伝子産物は、ゲノムＲＮＡから翻訳されるが、残りのウイルス蛋白質はサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ ｍＲＮＡ）から翻訳され、それぞれ、ゲノムの５’部分由来の５’末端を有している。ｓｇ ｍＲＮＡは、ほとんどがマイナス鎖合成に間に起こる可能性のある不連続的翻訳処理を経て得られる（４７）。不連続的翻訳は、シス作用エレメント間の塩基対、すなわち転写関連配列（ＴＲＳ）を必要とし、一方はゲノムの５’部分に位置する配列（始端部ＴＲＳ）であり、他方はＯＲＦの上流に位置する配列（本体ＴＲＳ）である（４８）。
【０００４】
ここに示す新規コロナウイルスは気管支梢炎に罹患している小児から単離された。本発明者らはウイルスを有する、気道疾患に罹患している７名以上のヒトを見つけたので、このウイルスによる感染は他に類のない事例ではない。さらに、本発明者らはここで完全なゲノム配列を示し、新規コロナウイルスのゲノム構造に関する臨床情報を提供する。
【０００５】
今日、一連の原因不明のヒトの疾患が存在する。これらの多くに関して、ウイルス起源であることが示唆されており、新規ウイルスの継続的な調査の重要性を強調している２２，２３，２４。新規ウイルスの調査の際に、重大な問題に遭遇する。第１にウイルスの中には体外で複製しない、少なくとも、ウイルス診断において一般的に使用される細胞中で複製しないものもある。第２に、体外で複製し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こすそれらのウイルスに関して、その後に行うウイルス同定法がうまくいかないことがある。既知のウイルスに対してもたらされる抗体は培養ウイルスを認識しないこともあり、ウイルス特異的ＰＣＲ法は新規ウイルスゲノムを増幅しないこともある。本発明者らはｃＤＮＡ増幅制限断片長多型性技術（ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ）に基づくウイルス発見のための方法を開発した。この技術を用いて、ＲＮＡまたはＤＮＡは再生可能に増幅される。標的遺伝子の配列の予備的知識は必要ない１。一般的にｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ法が使用され、異なる遺伝子発現を観察する。しかしながら、本発明者らはこの方法を修正し、患者のリンパ漿／血清試料から直接でも、ＣＰＥ陽性ウイルス培養物から間接的にでもウイルス配列を増幅可能にした（図１）。修正されたウイルス発見ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ（ＶＩＤＩＳＣＡ）法において、増幅の前のｍＲＮＡ単離工程は、ウイルス核酸に対して選択的に豊富にする処理によって置き換えられる。遠心分離段階は精製に関連し、残余の細胞およびミトコンドリアを除去する。さらに、ＤＮＡｓｅ処理が使用され、分解した細胞由来の妨害染色体ＤＮＡおよび妨害ミトコンドリアＤＮＡを除去する一方、ウイルス核酸がウイルス粒子内で保護される。最終的に、頻繁に切断する制限酵素を選択することによって、該方法は微調整され、大部分のウイルスが増幅される。
【０００６】
２００３年１月、７ヶ月の小児が鼻感冒、結膜炎および熱を伴って来院した。胸部Ｘ線は気管支梢炎の典型的特徴を示し、発病の５日後に鼻咽頭吸引物の試料が収集された（試料ｎｒ：ＮＬ６３）。この試料についての、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３と、ライノウイルスと、エンテロウイルスと、ＨＣｏＶ−２２９Ｅと、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３とに対するあらゆる診断試験は陰性であった。ウイルスの培養物において、ＲＳＶと、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３とを検出するための免疫蛍光分析は依然として陰性であった。酸不安定性およびクロロホルム感受性試験は、ウイルスがエンベロープを有している可能性が大きく、ピコルナウイルス群の要素ではないことを示した。実際に、これは新規コロナウイルスであった。本発明において、本発明者らは新規ヒトコロナウイルスの詳細な説明を示す。コロナウイルスは、およそ２７〜３１ｋｂの、非常に長く分節していない単一鎖の（＋）センスＲＮＡによって特徴付けられる。これはどの既知のＲＮＡウイルスの中でも最も長いゲノムである。該ゲノムは、５’メチル化キャップおよび３’ポリ−Ａを有しており、ｍＲＮＡとしてそのまま機能する。これまで、３種のヒトコロナウイルスのみが特徴付けられており、したがって第４のヒトコロナウイルスの特徴を分類することによって、ヒトコロナウイルス間の差違に関する興味深い情報が提供される。新規ウイルスは群１のコロナウイルスの要素であり、ＨＣｏＶ−２２９Ｅに最も関連しているが、その差違は顕著である。類似点は、ヌクレオチドレベルで８５％より大きくなく、ＨＣｏＶ−２２９Ｅの４Ａおよび４Ｂ遺伝子の位置で唯１つのＯＲＦがＨＣｏＶ−ＮＬ６３（ＯＲＦ３）に存在し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のＳ遺伝子の５’領域は５３７個のヌクレオチドのフレーム挿入点において他とは異なるものを含んでいる。レセプタの結合が蛋白質のＮ末端部分に対して位置付けられているので挿入点にコードされる１７９個のアミノ酸はレセプタ結合に関与している可能性が大きい。スパイク蛋白質のＮ末端におけるこの特異的な部分は、細胞培養物中のウイルスの広範な宿主域を明らかにすることもある。ＨＣｏＶ−２２９Ｅが狭い宿主域を有する細胞培養物中で扱い難い場合、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３はサル腎臓細胞において効果的に複製される。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の他に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶも、サル腎臓細胞（ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するＶｅｒｏ−Ｅ６細胞およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（２１））で複製可能である。しかしながら、予測スパイク遺伝子を比較することによって、両ウイルスによって共有され体外のウイルスの一般的な宿主域を明確にする蛋白質領域は同定されない。また、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のＳ遺伝子における挿入点はＳＡＲＳのＳ遺伝子において存在しなかった。または、他のウイルス蛋白質がウイルスの細胞指向性に関与することもある。しかしながら、本発明者らは、ＨＣｏＶ−２２９ＥよりもＳＡＲＳ−ＣｏＶ対して、蛋白質レベルで、より類似しているＨＣｏＶ−ＮＬ６３のいずれの遺伝子も同定していない。
【０００７】
ＨＣｏＶ−２２９ＥとＨＣｏＶ−ＮＬ６３との間の、すなわちＳ遺伝子における挿入点と改変非構造補助蛋白質遺伝子との間の２つの重要な差違は、ブタコロナウイルスＰＲＣｏＶとＴＧＥＶとの間で注目される差違に匹敵するものである。これらの２種のブタウイルスは抗原的および遺伝学的に関連しているが、これらの病原性は非常に異なる。ＴＧＥＶは新生ブタにおいて、高い死亡率で重症の下痢を引き起こす。ＰＲＣｏＶは腸組織においてほとんど複製せず、呼吸組織に特異的指向性を有するのに対して、それは小さい腸において腸細胞を複製し、破壊する。ＴＧＥＶとＰＲＣｏＶとの間のＳ，３Ａおよび３Ｂ遺伝子におけるゲノムの差違は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３とＨＣｏＶ−２２９Ｅとの間の差違に匹敵する。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のようにＴＥＧＶは６７２〜６８１ｎｔにわたるＳ遺伝子の５’部分のフレーム挿入点において他とは異なる（５３）。さらに、ＴＧＥＶにおいて正常な補助蛋白質遺伝子３Ａおよび３Ｂは、ＰＲＣｏＶにおいて突然変異または不活性であることが多い。ヒトコロナウイルスに対するこれらのデータから推定して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３はＨＣｏＶ−２２９Ｅと比較してより病原性のヒトウイルスである可能性があることが推測される。しかしながら、これを支持する疫学データはない。本発明者らのデータに基づくと、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅはおそらく、同じ病原性を共有しているようである。一般的な感冒ウイルスＨＣｏＶ−２２９Ｅは幼児においてさらに重症疾患を引き起こす可能性があり（２８）、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が幼児および免疫障害患者においてのみ呼吸器疾患を引き起こしていることを示唆する本発明者らのデータに匹敵する。
【０００８】
今日まで、ウイルス性病原体はヒトにおける呼吸器疾患の症例の大部分において同定されておらず（平均して２０％５９）、本発明者らのデータはこれらの症例の一部においてＨＣｏＶ−ＮＬ６３が関与していることを示唆している。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が呼吸器疾患に罹患している患者において検出される頻度は、２００３年１月の時点で５％以下であった。ウイルスは２００３年の春または夏に収集されたいずれの試料においても検出されず、主に冬期に蔓延する傾向にあるヒトコロナウイルスの疫学と一致する（１５）。本発明者らの診断ＰＣＲのためのプライマは１Ｂ遺伝子に位置し、ゲノムＲＮＡは鋳型として用いられる。ヌクレオカプシド遺伝子または３’ＵＴＲにおいてアニーリングするプライマを用いることによって、ＰＣＲにおいて、より多くの鋳型が与えられる。なぜなら、ゲノムＲＮＡの他に、感染細胞中のあらゆるｓｇ ｍＲＮＡも、増幅のための鋳型であるからである。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対して陽性であると判った人の人数は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３を有している人の正確な人数を過小評価している可能性もある。
【０００９】
新規に発見されたコロナウイルス（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３と表される）は特徴付けられ、配列決定された。典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の配列は図１９に与えられ、その一部が表３に与えられる。したがって、１つの特徴において、本発明は単離および／または組換え核酸を提供し、図１９および／または表３に示される配列、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。ウイルスＨＣｏＶ−ＮＬ６３は、典型によって特徴付けられる。しかしながら、多くの自然変異体が、たとえば図１６に示されるように、ＯＲＦ１ａ領域における多型に対して存在する。このような自然変異体の存在は、たとえば、ゲノムを複製するポリメラーゼによる誤りの導入を経た頻繁な突然変異を受けるＲＮＡウイルスにとって通常のことである。したがって、僅かに相違する核酸配列を有するＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスもまた本発明によって提供される。このようなウイルスは典型核酸配列を有する核酸の誘導体であるとみなされる。変異体は必ずしも自然変異体でなくてもよい。当然組換え手段を経た変異体を生成することも可能である。たとえば、ウイルスの大部分が、特定のアミノ酸に対するトリプレット遺伝子コードにおける余分量を使用するヌクレオチド置換によって変更され得る。したがって、コードされた蛋白質のアミノ酸配列は変更されない。しかしながら、アミノ酸の変更でさえ、一般的に、ウイルスの複製およびコード能力に影響を与えることなく導入可能である。たとえば、保守的アミノ酸置換は許容されることが多い。典型ウイルスにおける変更は、ウイルスの複製能力を変更することなく、核酸配列の７０％まで可能である。したがって、一実施形態において、本発明は、単離および／または組換え核酸を提供し、典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の核酸に対して少なくとも７０％相同である。しかしながら、大部分の生存可能な変異体は、典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に従う核酸に少なくとも９５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９９パーセント相同である。ＵＴＲ領域における異種コロナウイルス間の相同性は通常高く、この理由により、本出願における相同性はＵＴＲ領域外の領域、好ましくは蛋白質コード領域において測定される。したがって、本発明はＨＣｏＶ−ＮＬ６３の誘導体を提供し、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される少なくとも１つの蛋白質コード領域において（核酸レベルで）少なくとも９５％の相同性および好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。ウイルスの核酸またはその一部の核酸は複製され、プローブとして使用され、試料中のウイルスを検出する。したがって、本発明はさらに単離および／または組換え核酸を提供し、典型ウイルスの核酸の１００個の連続したヌクレオチドの伸張部または前記１００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９９％相同である領域を含む（ＵＴＲ領域外で核酸レベルで測定される場合）。１００の連続したヌクレオチドの伸張部は、本発明のウイルスの機能的部分とみなされる。さらに、バクテリアベクタが提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３またはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸を含む。さらに、前記バクテリアベクタを含むバクテリアが提供される。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の配列またはその一部が使用され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に特異的であり、したがってＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸を特異的に複製可能なプライマを生成する。同様に厳しい条件下でＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸に特異的にハイブリッド形成するプローブが生成される。したがって、本発明はさらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブを提供する。好ましくは、前記プライマまたはプローブは厳しい条件下で前記核酸にハイブリッド形成可能である。特に好ましい実施形態において、前記プライマおよび／またはプローブは表３，表７，表１０または図１６〜図１８に示される配列を含む。
【００１０】
典型ウイルスの核酸は種々の蛋白質およびポリ蛋白質をコードする。これらの蛋白質はたとえばウイルスを生成するまたは（ポリ）蛋白質をコードする核酸で形質転換される細胞中で発現される。したがって、本発明はさらに単離および／または組換え蛋白様分子を提供し、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示されるような配列、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。蛋白質の多くの種々の変異体は、必ずしも量においてではなく質において同じ機能を有し、上述のように、天然に存在し、人工的に生成されることが可能であり、したがって、本発明はさらに上述の蛋白様分子に少なくとも７０％相同である単離および／または組換え蛋白様分子を提供する。このような相同の蛋白質は典型によってコードされる蛋白質の誘導体とみなされる。好ましくは、誘導体蛋白質は、典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３によってコードされる蛋白質と少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。典型ウイルスによってコードされる蛋白様分子の断片および一部が生成され、したがって、このような部分もまた、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、単離および／または組換え蛋白様分子が提供され、典型ウイルスによってコードされる蛋白様分子の少なくとも３０個の連続したアミノ酸の伸張部を含む。典型ウイルスによってコードされる蛋白質は遺伝子コードの余分量を使用して種々の異なる核酸配列によってコードされる。したがって、本発明はさらに図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白質をコードする核酸を提供する。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスは複製され、体外で細胞株を培養するのに用いる。ウイルスはこのような培養物から収集されることが可能であり、種々の異なる用途に用いられ、対象における免疫応答の発生を含むがこれに限定されない。したがって、本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸配列またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。さらに、単離または組換えウイルスが提供され、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。ＨＣｏＶ−ＮＬ６に感染した対象は多くの種々の臨床症状および／または無症状を示す。したがって、さらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を誘導可能な、単離または組換えウイルスまたはその、機能的部分、誘導体または類似体が提供される。
【００１１】
ウイルスは、ウイルスの物質を特異的に結合できる特異的結合相手を生成するために使用される物質を含む。結合相手は免疫担当対象へのウイルスの注入によって生成され得る。免疫付与の結果として、対象から得られた血清は、一般的にウイルスまたはその、免疫原性部分、誘導体および／もしくは類似体に特異的な多くの種々の抗体を含むであろう。特異的結合相手は、当然、多くの種々の異なる技術を経て生成され得る。たとえば、ファージ提示技術によって生成され得る。特異的結合相手を生成する方法はこれに限定されない。結合は一般的にウイルスの蛋白様部分に特異的である。しかしながら、当然、結合はまた、ウイルス中に含まれる蛋白質のウイルス特異的翻訳後修飾に特異的でもある。したがって、本発明はさらに好ましくは典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の核酸によってコードされるものに対して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの蛋白様分子を特異的に結合可能な単離結合分子を提供する。好ましくは、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。結合分子は、好ましくは図１９または表３の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の核酸配列を特異的に結合可能である。結合分子は好ましくは蛋白様分子である。しかしながら、他の結合分子もまた、本発明の範囲内である。たとえば、必ずしも量においてではなく質において蛋白質と同じ結合性質を有する蛋白質類または類似体を生成可能である。さらに、本発明に従う結合分子を生成する方法が提供され、該方法は、
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の典型核酸によってコードされる、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、あるいは単離および／または組換え蛋白様分子を結合可能な分子を生成し、
前記ウイルスおよび／または前記蛋白様分子に特異的な蛋白様結合分子を選択することを含む。
【００１２】
他のヒトコロナウイルスとＨＣｏＶ−ＮＬ６３との全体的な相同性はあまり高くない。したがって、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに特異的に結合可能な多くの種々の結合分子が生成され得る。このような結合分子が使用され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを検出する。したがって本発明はさらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを特異的に結合可能な結合分子と免疫反応する単離または組換えウイルスを提供する。同様に、本発明は図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される、単離および／または組換え蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用を提供し、試料中の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを特異的に結合可能な結合分子または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を検出する。逆に、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが使用され、試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出する。感受性標的細胞に対するＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの結合は特異的受容体を経て起こる。この受容体は本発明の結合分子として使用され得る。好ましくは、結合分子は抗体またはその機能的同等物を含む。検出方法が使用され、対象中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を診断する。したがって、試料中の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法が提供され、該方法は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３特異的プライマおよび／またはプローブを用いて前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸をハイブリッド形成するおよび／または増幅することと、ハイブリッド形成したおよび／または増幅した生成物を検出することとを含む。さらにキット、好ましくは診断キットが提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明に従う結合分子、および／または、本発明に従うＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的プライマ／プローブを含む。特に好ましい実施形態において、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸、あるいは図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子を特異的に結合可能な分子、あるいはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスおよび／または典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の、核酸または機能的部分、誘導体もしくは類似体に特異的にハイブリッド形成可能なプライマまたはプローブの使用が提供され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルスを検出および／または同定する。好ましくは、前記核酸は表３に示される配列を含む。
【００１３】
本発明はさらにワクチンを提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。さらにワクチンが提供され、図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される蛋白様分子、または、このような蛋白様分子の機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。本発明の蛋白様分子は、それ自身ワクチンとして、または蛋白質の一部として、またはその、誘導体もしくは類似体として提供されてもよい。適切な類似体とはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス蛋白様分子またはその、機能的部分もしくは誘導体をコードする核酸である。核酸は本発明においても提供されるＤＮＡワクチン方法において使用されてもよい。ＤＮＡワクチンのための担体として、ウイルスレプリコン中に発現可能なＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス核酸を組み込むことが適切であることが多く、標的細胞においてＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス核酸の複製を可能にし、これによりもたらされる免疫応答を促進する。このようなＤＮＡワクチン方法に適している蛋白質をコードするＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスは、図２２に示されるＳ蛋白質またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。好ましくは、Ｓ蛋白質の一部はＨＣｏＶ−２２９Ｅウイルスと比較すると、フレーム挿入点において５３７の免疫原性部分を含む。好ましくは、前記部分は実質的に前記５３７挿入点を含む。５３７挿入点とは、図１９の配列２０４７２〜２１００９に対応する配列のことである。
【００１４】
他の適切な候補はＭおよびまたはＮ蛋白質，またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体である。一般的にワクチンは適切なアジュバントを含む。ワクチンにおける使用の他に、記載されるウイルスおよび／または蛋白様分子もまた使用され、対象中でＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的免疫応答を発生および／または促進する。免疫応答は細胞性でも体液性でもあり得る。したがってさらに、単離Ｔ−細胞が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに特異的であるＴ細胞受容体、または典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３によってコードされる蛋白様分子を含む。さらに、単離Ｂ細胞が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに特異的な抗体、またはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスによってコードされる蛋白様分子を生成する。細胞株は複製された受容体または抗体を含む発現カセットを与えられるとすぐに、抗体またはＴ−細胞受容体が複製される。したがって、本発明はさらにこのような受容体または抗体を生成する細胞を提供する。このような細胞は、好ましくはＣＨＯ細胞等の、記載される蛋白質の大規模な生成に適している細胞である。
【００１５】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに対する受動免疫を対象に与えることももまた可能である。このために、対象は本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３特異的結合分子を与えられる。このような免疫性が使用され、対象中にＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスでの（さらなる）感染のための障壁を与え、したがってさらにワクチンが提供され、本発明に従うＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子を含む。好ましい実施形態において、受動免疫は、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを特異的に結合可能なヒトまたはヒト化抗体によって与えられる。障壁は完全でなくてもよい。結合分子の存在は少なくとも、対象における他の標的細胞へのウイルスの拡散を減少させる。受動免疫は予防として対象に投与されてもよく、ウイルスに曝された場合、少なくとも、対象におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの拡散を減少させる。または、受動免疫はウイルスに既に感染した対象に与えられてもよい。後者の場合、本発明の１以上のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子は薬剤として使用され、少なくとも、対象におけるウイルスの拡散を減少させ、したがって少なくとも部分的にウイルス感染に有効である。したがって本発明はさらに薬剤を提供し、本発明に従うＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子を含む。さらに、本発明のウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、あるいは本発明の蛋白様分子、あるいは本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的結合分子の使用を提供し、コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製する。さらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス関連疾患に罹患しているまたは罹患する危険のあるヒトを治療するための方法が提供され、本発明に従うワクチンまたは薬剤を前記ヒトに投与することを含む。さらに別の実施形態において、ヒトがＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているか否かを判断する方法が提供され、前記ヒトから試料を得ることと、前記試料中の、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む。
【００１６】
さらに別の実施形態において、単離細胞または組換え体もしくは細胞株が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。好ましくは、前記細胞は霊長類細胞であり、好ましくはサル細胞である。好ましい実施形態において、前記細胞は本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを複製する細胞である。特定の実施形態において、細胞は腎細胞である。該細胞が使用され、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを生成する、または病原性が低下するようにＨＣｏＶ−ＮＬ６３を弱毒化する。ウイルスの弱毒化は、記載される好ましい細胞株でのウイルスの継代培養の際に自然に起こる。弱毒化ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスはワクチンとして使用される。
【００１７】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスはエンドプロテアーゼをコードする。典型ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス中のプロテアーゼに対する配列は図（２１）に示されている。プロテアーゼはＨＣｏＶ−ＮＬ６３にコードされるポリ蛋白質の処理に関して重要である。プロテアーゼの作用はここでさらに記載されるウイルスプロテアーゼ阻害剤によって少なくとも部分的に阻害される。したがって、本発明はさらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス複製を少なくとも部分的に阻害するための化合物を提供する。好ましい化合物は、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（５５）（たとえば、リバビリン（５４）およびミコフェノール酸）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ阻害剤（たとえば、６−アザウリジンおよびピラゾフリン）、３ＣＬプロテアーゼ阻害剤（５６）（たとえば、ＶＮＳＴＬＱ−ＡＧ７０８８エステル、下記参照）、キャップ−メチル化阻害剤（５８）（カルボン酸アデノシン類似体、たとえば、Ｎｅｏｐｌａｎｏｃｉｎ Ａおよび３−ｄｅａｚａｎｅｏｐｌａｎｃｉｎ Ａ）、亜酸化窒素シンターゼ誘導化合物（たとえば、グリシルリジン）およびインターフェロン（５７）の阻害剤である。これらのプロテアーゼ阻害剤が特に好ましい。配列ＶＮＳＴＬＱは、３Ｃｌｐｒｏ阻害剤ＶＮＳＴＬＱ−ＡＧ７０８８（５６）において使用されるＳＡＲＳ−３ＣＬｐｒｏのＮ末端蛋白質分解処理部位である。この化合物において、ヘキサペプチドＶＮＳＴＬＱは、ＳＡＲＳ ３ＣＬｐｒｏ活性を阻害するビニル性エチルエステル（ＡＧ７０８８、下記構造式１を参照）のＣ末端に結合する。
【００１８】
【化１】
【００１９】
ヘキサペプチドＶＮＳＴＬＱはＨＣｏＶ−ＮＬ６３におけるＹＮＳＴＬＱに対応する。したがって、ＹＮＳＴＬＱ−ＡＧ７０８８はＨＣｏＶ−ＮＬ６３ ３ＣＬｐｒｏ相同分子種を阻害する。したがって、好ましい実施形態において、プロテアーゼ阻害剤はアミノ酸配列ＶＮＳＴＬＱ、さらに好ましくはＹＮＳＴＬＱを含む。必ずしも量においてではなく質において同じ活性を含むこのようなプロテアーゼ阻害剤の類似体もまた本発明によって提供される。このような類似体は好ましい配列を有するペプチドを含む化合物を含み、ペプチドは修飾を含む。他の類似体は好ましいアミノ酸配列に似た蛋白様活性を有する化合物を含む。Ｓ−アデノシルメチオニン依存リボース２’−オルトメチルトランスフェラーゼは、ウイルスＲＮＡの５’末端におけるキャップ構造（ＧｐｐｐＮｍ）のメチル化に関与する。反応に対してメチル基のこの転位を阻害する抗ウイルス化合物（カルボン酸アデノシン類似体、たとえばＮｅｏｐｌａｎｏｃｉｎ Ａおよび３−ｄｅａｚａｎｅｏｐｌａｎｃｉｎ Ａ）は、ウイルス蛋白質の発現を抑制する。
【００２０】
本発明はさらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３核酸によってコードされる蛋白様分子を提供し、前記蛋白様分子は３ＣＬプロテアーゼまたはその機能的同等物である。機能的同等物は、１またはそれ以上の保守的アミノ酸置換を有する蛋白質分解活性部分および／または誘導体を含む。化合物が抗コロナウイルス活性、好ましくはコロナウイルスの抗蛋白質分解活性を有するか否かを判断するための方法は当技術分野で多く知られている。したがって、本発明はさらに、化合物が抗コロナウイルス複製活性を含むか否かを判断する方法を提供し、前記方法はＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはＨＣｏＶ−ＮＬ６３の複製に関与するＨＣｏＶ−ＮＬ６３蛋白質、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を使用するという点で特徴付けられる。好ましくは、本発明は化合物がウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害可能か否かを判断する方法を提供し、前記プロテアーゼがＨＣｏＶ−ＮＬ６３の３ＣＬプロテアーゼまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体であるという点で特徴付けられる。３ＣＬ阻害性に関して試験される好ましい化合物は３Ｃｌｐｒｏ切断部位のＮ末端に位置するヘキサペプチドである。３Ｃｌ蛋白質分解活性を少なくとも部分的に阻害するのに有効な化合物が、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に罹患しているまたは罹患する危険のあるヒトの治療のための薬剤の調製に使用される。
【００２１】
１以上の好ましい抗コロナウイルス複製化合物が、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に罹患しているまたは罹患する危険のある対象を治療するための薬剤として使用される。したがって本発明はさらに、コロナウイルス感染に罹患しているヒトまたは罹患する危険のあるヒトの治療のための薬剤を提供し、前記コロナウイルスはＨＣｏＶ−ＮＬ６３典型ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の核酸配列を含む。
【００２２】
本発明において、複数の種々の組換えウイルスが、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス核酸を骨格として使用して生成される。このような複製能力のあるまたは複製欠陥の組換えウイルスは、たとえば、遺伝子運搬担体として使用されることが可能である。他方、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの一部は細胞に遺伝物質を運搬するための他の手段に基づく遺伝子運搬担体において使用される。したがって、本発明はさらに、遺伝子運搬担体を提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス、好ましくは典型ウイルスの核酸の少なくとも一部を含む。好ましくはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の蛋白質をコードする核酸を含む。本発明はまた、キメラコロナウイルスを示し、少なくとも２つのコロナウイルスに由来する核酸を含み、前記部分の少なくとも１つはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに由来する。前記ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス由来部分は好ましくは蛋白質コード領域の少なくとも５０個のヌクレオチドを含む。さらに好ましくは前記ＨＣｏＶ−ＮＬ６３由来部分は図１９に示される配列またはその機能的誘導体の少なくとも５００、さらに好ましくは１０００個のヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本発明はキメラコロナウイルスを提供し、図１９に示される配列の少なくとも１０００個のヌクレオチドおよび別のコロナウイルスの少なくとも１０００個のヌクレオチドを含み、前記後者の１０００個のヌクレオチドは図１９に示される配列と５％以上配列が相違する配列を含む。多くのＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス断片の配列は表３に示されている。広域のゲノムＲＮＡにおける断片の位置は図５に示されている。したがって、本発明は１つの特徴において、単離または組換えウイルスを提供し、表３に示される核酸配列または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。同定典型断片を用いて、さらにゲノムの配列を決定することが可能である。ゲノム上を歩行するプライマによってこれをなす１つの方法。プライマは配列が既知である領域に向けられており、このプライマが使用され、未知の隣接領域の配列を決定する。次のプライマが新たに同定された配列に対して生成され、さらなる領域が配列決定される。この手順はウイルスの全配列が解明されるまで繰り返される。ウイルスの出典として、オランダ、アムステルダム、アムステルダム大学、学術医学センター、ヒトレトロウイルス学科のＣ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｅｋ博士に問い合わせてもよい。
【００２３】
決定された核酸配列の整列によって、検出された配列に使用されるリーディングフレームが明らかになった。したがって本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、（表３）に示されるアミノ酸配列または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。特定のアミノ酸配列は使用されたコドンに依存する種々の核酸から生成され得る。したがって、本発明はさらに（表３）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。さらに単離または組換えウイルスが提供され、（表３）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列または前記ウイルスの、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。
【００２４】
多くの他の種類のウイルスのように、コロナウイルスは、対象の個体群を経たウイルスの拡散の際におよび／または生体外で培養している間に、複数の自然および選択された突然変異体を得る。さらに人工的な変異体は、認識された対応物を天然に有しておらず、ウイルス性および／または疾患を引き起こすウイルスの性質を変更することなく、典型ウイルスの配列またはその誘導体に導入され得る。新規に発見された亜型の典型を特徴付けたことによって、同じ亜型に属するこのウイルス群に手掛かりが与えられる。したがって、本発明はさらに単離または組換えウイルスを提供し、表３に示される配列に対しておよそ８０％相同である、または表３に示されるアミノ酸配列に対して８０％相同である核酸配列を含む。好ましくは、相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２５】
それぞれの典型断片はウイルス配列のデータベースと比較され、特に高い相同性を有する対象データが表５および表６に述べられている。比較される断片は現在既知のいずれのコロナウイルスとも広範囲の相同性を有していない。したがって本発明は単離および／または組換えウイルスを提供し、表３に示される１６３−２のアミノ酸配列に対して８９％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２６】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−４のアミノ酸配列に対して６０％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２７】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−９の核酸配列に対して８５％以上相同である核酸配列を含む。好ましくは、前記相同性は少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２８】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１０のアミノ酸配列に対して９４％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２９】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１１のアミノ酸配列に対して５０％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３０】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１４のアミノ酸配列に対して８７％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３１】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１５のアミノ酸配列に対して８３％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３２】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される１６３−１８のアミノ酸配列に対して７８％以上相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３３】
さらに、単離または組換えウイルスが提供され、表３に示される核酸配列に対して５０％以上相同である核酸配列を含む。好ましくは前記相同性は、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％およびさらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００３４】
本発明はまた、単離および／または組換えＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスの機能的部分、誘導体および／または類似体を提供する。ウイルスの一部は膜組織含有部分、ヌクレオカプシド含有部分、蛋白様断片および／または核酸含有部分であってもよい。該部分の機能性は、該部分に対して選ばれる用途によって異なる。たとえば、該ウイルスの一部は免疫化の目的のために使用されてもよい。この実施形態において、機能性は、必ずしも量においてではなく質において完全なウイルスと同様の免疫原性を含む。ウイルスの別の使用はウイルスの感染性である。たとえば、生体外（または生体内）での培養に関して、この実施形態において、機能性は必ずしも量においてではなく質において同様の感染性を含む。ウイルスに対して多くの種々の使用が存在するため、多くの他の機能性が定義されてもよく、限定されない実施例はキメラウイルスの生成（すなわち、１以上の他の（コロナ）ウイルス）を用いて）、およびワクチン化および／または遺伝子治療目的のウイルスベクタの生成である。このようなウイルスおよび／またはベクタもまた、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の機能的部分を含み、したがってまた、本発明に含まれる。本発明のウイルスの機能的誘導体は、前記化合物の性質が必ずしも量においてではなく質において本質的に同じであるように変更されたウイルスとして定義される。誘導体は、たとえば（好ましくは“ウォッブル”に基づく）ヌクレオチド置換を経て、（保守的）アミノ酸置換、それに続く修飾を経て、等の多くの方法で提供され得る。
【００３５】
ウイルスの類似化合物もまた当技術分野の方法を使用して生成され得る。たとえば、キメラウイルスまたはキメラ蛋白質を有するＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが生成される。たとえばＨＣｏＶ−ＮＬ６３は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３表面蛋白質の少なくとも一部および非ＨＣｏＶ−ＮＬ６３免疫原性部分を含む細胞表面関連融合蛋白質を生成することによって、さらに免疫原性になり得る。このようなキメラ蛋白質を含むＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが使用され、たとえばワクチン化目的のために、宿主において向上した免疫応答を誘導する。
【００３６】
ここで使用されるように、「本発明のウイルス」という用語はまた、前記ウイルスの機能的部分、誘導体および／または類似体を含むことを意味している。
【００３７】
コロナウイルスの３種のグループはヒトおよび家畜の種々の疾患と関連し、胃腸炎および上下気道疾患を含む。ヒトコロナウイルスＨＣｏＶ−２２９ＥおよびＨＣｏＶ−ＯＣ４３は軽い疾患（一般的な感冒）に関連するが、さらに重症の疾患が子供１６において、非常に低い罹患率ではあるが観察される。複数のコロナウイルスは動物において重症の疾患を引き起こし、ＳＡＲＳ−ＣｏＶがヒトにおいて重症の疾患を引き起こすコロナウイルスの第１例である。しかしながら、ヒトにおける呼吸器疾患の症例の実質的部分は診断が下されていないことは強調されるべきである。たとえば、気管支梢炎を伴って入院しているカナダの子供における呼吸器ウイルスの最近の調査では、約２０％の患者においてウイルス性病原体が明らかにされていない１７。本発明者らが、気管支梢炎を伴った子供において新規コロナウイルスを同定したという事実は、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が病原性呼吸器系ウイルスであることを示している。
【００３８】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が、感染した子供に気管支梢炎を引き起こし得る病原性呼吸器系ウイルスであることを考慮すると、なぜＨＣｏＶ−ＮＬ６３が以前に細胞培養によって認められなかったのかという興味深い疑問が残る。本発明者らは、該ウイルスが、ルーチン診断設定において使用されることが多い細胞である、サル腎細胞（ｔＭＫまたはＬＬＣ−ＭＫ２細胞）において培養され得ることを発見し、したがって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに似たＨＣｏＶ−ＮＬ６３が、病原体保有動物からヒトの個体群に新規に導入された、またはこれは最近宿主細胞域を拡大したヒトウイルスであるということが推測される。明らかにＨＣｏＶ−ＮＬ６３感染の有病率を調査することは重要であり、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３診断ＲＴ−ＰＣＲを用いて、気道疾患を伴う患者からの試料をスクリーニングすることは、この問題の解明に役立つであろう。
【００３９】
コロナウイルスは狭い宿主域の細胞培養において一般的に扱い難いため、新規ヒトコロナウイルスはｔＭＫ細胞およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞から得られたということは注目すべきことである。しかしながら、ＳＡＲＳ−ＣｏＶもＨＣｏＶ−ＮＬ６３もサル腎細胞（ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するベロ−Ｅ６細胞およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞）中で効率的に複製するようである。最近記載されたＳＡＲＳ−ＣｏＶのゲノムは複数の他にない特徴を有しており、おそらく生物学的に重要ないくつかの特有のオープンリーディングフレームを含んでいる１５，１８。したがって本発明者らはＨＣｏＶ−ＮＬ６３の完全なゲノム配列を分析し、これらのウイルスの拡大した宿主細胞域および向上した病原性を決定し得る、ＳＡＲＳ−ＣｏＶとの類似性および差違をスクリーニングするであろう。
【００４０】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３は感染した対象における特定の表現型に関連する。表現型は気管支梢炎、鼻感冒、結膜炎および熱を包含し得る、および表現型はさらに他の呼吸器系の問題および下痢を包含することもある。したがって、一実施形態において、本発明はさらに（上述の１以上の相同性を有する）本発明の単離およびまたは組換えウイルスを提供し、前記ウイルスまたは、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体は、さらに、対象中にＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患または症状を引き起こす能力を含む。別の実施形態において、本発明は単離および／または組換えウイルスを提供し、さらに、第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザル３７）において、および／またはサル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２（ＥＣＣＡＣ８５０６２８０４，ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７）への継代の際に、ＣＰＥを引き起こす性質を含む。好ましい実施形態において、前記ウイルスはベロ−細胞においてＣＰＥを生成しない（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８６）３４。
【００４１】
本発明はさらに表３に示される核酸、および表３に示されるアミノ酸配列、またはこのような核酸および／またはアミノ酸配列の、機能的部分および／もしくは同等物を提供する。前記核酸の機能的同等物は必ずしも量においてではなく質において、前記核酸（またはその一部）と同じハイブリッド形成性を含む。本発明のアミノ酸配列の機能的同等物は必ずしも量においてではなく質において、前記アミノ酸配列（またはその一部）と同じ免疫原性を含む。本発明の核酸の一部は少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。アミノ酸配列の一部は互いにペプチド結合している少なくとも５個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも８、さらに好ましくは少なくとも１２、さらに好ましくは少なくとも１６個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、前記ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸は少なくとも半連続しており、さらに好ましくは、前記ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸は連続している。本発明の核酸および／またはアミノ酸配列またはその部分の同等物は、本発明の核酸および／またはアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性、本発明の核酸および／またはアミノ酸配列およびその一部に対して、好ましくは少なくとも９０％の相同性、さらに好ましくは９５％およびさらに好ましくは少なくとも９９％の相同性を含む。本発明はさらにプライマおよび／またはプローブを提供し、本発明に従うウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能であり、好ましくはプライマおよび／またはプローブは表３に示される核酸配列に特異的にハイブリッド形成可能である。さらに好ましくは、プライマおよび／またはプローブは、厳しい条件下で前記核酸にハイブリッド形成可能である。特に好ましい実施形態において、プライマおよび／またプローブが提供され、表７に示される配列を含む。
【００４２】
当該技術分野において、特異的結合要素が、同定された核酸、脂質および／またはアミノ酸配列に対して生成され得る多くの方法が知られている。このような特異的結合要素はいかなる性質であってもよいが、一般的に核酸および／または蛋白様性質である。したがって、本発明はさらに、本発明に従う、ウイルス、核酸および／またはアミノ酸、またはその機能的部分、誘導体もしくは類似体を特異的に結合可能な単離分子を提供する。前記単離分子はまた、特異的結合要素と呼ばれる。好ましくは前記特異的結合要素は、表３に示される核酸配列の少なくとも一部、および／または表３に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部を特異的に結合可能である。好ましい実施形態において、前記結合要素は、蛋白様分子である。好ましくは、抗体またはその、機能的部分、誘導体および／または類似体である。特異的結合要素は好ましくは、無関係の対照と比較して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対する有意なよりよい結合性質を含む。しかしながら、たとえば抗体に関して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３において特異的に認識されるエピトープはまた、限られた数の他の分子にも存在することが可能である。したがって、結合要素の結合は特異的なこともあるが、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３に存在する分子以外の分子を認識することもある。この交叉反応は特異的結合と分けられるべきであり、抗体の一般的性質である。交叉反応は通常、特定の目的の適切な特異的結合要素の選択を妨げない。たとえば、肝細胞中の蛋白質もまた認識する特異的結合要素は、肝細胞の存在下でさえ多くの用途において使用され、細胞中の位置等の追加情報が、識別するために使用されることが多い。
【００４３】
本発明の抗体の１つの供給源は、本発明のウイルスをスクリーニングした感染対象の血液である。さらに、一種が前記対象から得られるＢ細胞を特徴付けることもある。適切のＢ細胞が培養され、抗体が収集されてもよい。または、抗体は当該Ｂ細胞から配列決定され、人工的に生成されてもよい。本発明の別の抗体供給源は実験動物の免疫付与または人工ライブラリを使用してウイルスの精製フラクションをスクリーニングすることによって生成され得る。抗体の機能的部分は、必ずしも量においてではなく、質において、実質的に前記抗体と同じ性質を有している。前記機能的部分は好ましくはＨＣｏＶ−ＮＬ６３の抗原を特異的に結合可能である。しかしながら、前記機能的部分は前記全抗体と比較して、異なる程度にこのような抗原を結合することもある。抗体の機能的部分または誘導体はＦＡＢ断片または単一鎖抗体を含む。抗体の類似体は、たとえばキメラ抗体を含む。ここで使用されるように、「抗体」という文言はまた、前記抗体の機能的部分、誘導体および／または類似体を含むということである。
【００４４】
本発明の抗体が得られると、その結合能等の所望の性質が改良され得る。これは、たとえばＡｌａ走査および／または置換ネットマッピング法（replacement net mapping
method）によってなされ得る。これらの方法を用いて、当初のアミノ酸配列に基づいて多くの種々の蛋白様分子が生成されるが、各分子は少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａｌａ走査）、または他の任意のアミノ酸残基（
replacement net mapping）のいずれによっても置換され得る。各変異体は続いて前記所望の性質についてスクリーニングされる。生成されたデータが使用され、改良蛋白様分子が設計される。
【００４５】
特異的結合要素が生成される多くの種々の方法がある。好ましい実施形態において、本発明は、特異的蛋白様結合要素を生成するための方法を提供し、本発明に従うウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体に結合可能な蛋白様分子を生成し、前記ウイルスに特異的な蛋白様分子を選択することを含む。必要であれば、該方法は前記ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体に結合可能な蛋白様分子の収集物を生成し、前記ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を特異的に結合可能な１以上の結合要素を前記収集物から選択する。
【００４６】
任意の特異的結合要素は、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスについて特有である。したがって、このような結合要素と特異的に反応するウイルスはＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスであり、このように本発明によって提供される。したがって、本発明は、本発明の特異的結合要素、好ましくは蛋白様結合要素と免疫反応する単離および／または組換えウイルスを提供する。本発明はさらに単離ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを含む物質の組成、および／または実質的にＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対応するウイルスを提供する。「実質的にＨＣｏＶ−ＮＬ６３に対応する」ウイルスという文言は、上述のようにＨＣｏＶ−ＮＬ６３鎖に同一であるか、または前記ＨＣｏＶ−ＮＬ６３鎖と比較して１以上の変異を含むＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスのことを言及している。これらの変異は、自然変異または人工変異を含んでもよい。前記変異は当然、必ずしも全ての特異的結合要素ではないが、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の特異的結合要素を用いる検出を可能にするはずである。前記変異は抗体相互作用、増幅および／またはハイブリッド形成等の一般的検出方法を使用して、変異体を検出することを可能にする。
【００４７】
特異的結合要素が、たとえば診断目的に重要な分子であることを考慮すると、本発明はさらに本発明のウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用を提供し、試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出する。さらに、本発明によって定義される、ウイルスまたは、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸および／またはアミノ酸配列の使用が提供され、試料中の前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を特異的に結合可能な分子を検出する。好ましくは、前記核酸および／またはアミノ酸配列は、表３に示される配列またはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。好ましくは、前記部分は、少なくとも３０個のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸長であり、前記部分は好ましくは、９５％以上、好ましくは９９％以上の配列同一性を含む。好ましい特徴において、前記特異的結合要素は前記ウイルスの特異的配位子および／または抗体を含む。
【００４８】
さらに、本発明に従うプライマおよび／またはプローブ、本発明の特異的結合要素、ならびに／あるいは、本発明に従う、ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸が提供され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルスまたはその一部を検出および／または同定する。好ましくは、前記核酸は表３に示される配列を含む。
【００４９】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが使用され、対象中において免疫応答を発生させる。これは、たとえばワクチン接種戦略において有用である。したがって、本発明はさらにワクチンまたは薬剤として使用するためのＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を提供する。該薬剤が使用されるのは、一般的に、対象が既にウイルスに感染しており、免疫原が使用されウイルスに対する免疫応答を増化する場合である。本発明はさらに、ワクチンまたは薬剤としての使用のための、本発明の特異的結合要素を提供する。当該使用は、特異的結合要素が蛋白様分子、好ましくは抗体またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。このような抗体は受動免疫を提供するが、それに付着するプロテアーゼ等の活性要素を有してもよい。該薬剤の使用は、さらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスに感染した対象が特異的結合要素で治療される場合であってもよい。
【００５０】
ワクチンは種々の方法で生成されてもよい。１つの方法は、たとえば記載されるサル細胞株でＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスを培養し、培養物から得られた不活性ウイルスを使用することである。または、弱毒化ウイルスは、不活性または生ワクチンのいずれとしても使用され得る。コロナウイルスワクチンの生成のための方法が適応され、本発明のＨＣｏＶ−ＮＬ６３のためのワクチンを生成する。したがって、本発明はさらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用を提供し、コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製する。さらに本発明は本発明の特異的結合要素の使用を提供し、コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンまたは薬剤を調製する。さらに、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明の特異的結合要素、本発明の核酸あるいは本発明のプライマおよび／またはプローブが提供され、コロナウイルス属関連疾患を診断する。好ましくは、前記コロナウイルス属関連疾患はＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルス関連疾患を含む。
【００５１】
さらに、ワクチンが提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／または、本発明の特異的結合要素を含む。さらに、薬剤が提供され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／または、本発明の特異的結合要素を含む。好ましくは、前記ワクチンまたは薬剤が使用され、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を少なくとも部分的に予防するおよび／または治療する。
【００５２】
本発明の重要な使用は診断ツールを生成し、対象がＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に罹患しているか否かまたは対象がＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス感染に曝されているか否かを判断することである。多くの種々の診断上の利用が予想される。それらは一般的に、対象中に存在するまたは存在したウイルスの分類を可能にする要素を同定することを含む。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のための１種の診断ツールは、種々の細胞株におけるウイルスの特異的拡散特性を使用する。それは記載される好ましいサル細胞株において複製するが、ベロ細胞においては複製されない。当該性質が使用され、他の既知のコロナウイルスからＨＣｏＶ−ＮＬ６３を識別する。したがって、１つの特徴において、本発明は診断キットを提供し、少なくとも１種の好ましいサル細胞株、好ましくは第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザルまたはサル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２）を含む。
【００５３】
多くの最新の診断キットは、（ウイルスまたはウイルス感染細胞を検出するための）特異的結合要素、および／または、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、および／または、（診断される対象の血液成分中の抗体を検出するための）本発明のアミノ酸またはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。多くの他の一般的に知られる診断キットは試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルス特異的核酸の同定を利用している。このようなアッセイが実施される種々の方法があり、１つは試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法であり、本発明に従うプライマおよび／またはプローブを用いて前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸をハイブリッド形成および／または増幅することと、ハイブリッド形成および／または増幅された生成物を検出することとを含む。したがって、本発明はまた、診断キットを提供し、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体、本発明に従う特異的結合要素、および／または、本発明に従うプライマ／プローブを提供する。
【００５４】
さらにＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているまたは罹患する危険のあるヒトを治療するための方法が提供され、本発明に従うワクチンまたは薬剤を前記ヒトに投与することを含む。さらに、ヒトがＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているか否かを判断するための方法が提供され、前記ヒトからの試料を得ることと、本発明の方法および／または診断キットを用いて前記試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することとを含む。
【００５５】
さらに、本発明に従うウイルスまたは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体と、本発明に従う核酸とをコードする単離または組換え核酸が提供され、少なくとも、表３に示される配列の機能的部分を含む。さらに本発明に従う核酸によってコードされるアミノ酸配列および本発明に従うアミノ酸配列が提供され、少なくとも、表３に示される配列の機能的部分を含む。さらに本発明に従う方法によって得られる、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３を特異的に結合可能な蛋白様分子、および、ワクチンにおけるこのような蛋白様分子の使用またはＨＣｏＶ−ＮＬ６３検出のための診断方法が提供される。
【００５６】
実施例
実施例１
ウイルス発見のためのｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ
本発明者らはｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ技術を修正し、血漿／血清試料から、またはＣＰＥ陽性培養上清からウイルス配列を増幅できるようにした（図１）。調整された方法においては、増幅前のｍＲＮＡ単離段階は、ウイルス核酸を精製する処理に置き換えられる。残余の細胞およびミトコンドリアを除去するための遠心分離段階は、精製に重要である。さらに分解細胞由来の妨害染色体ＤＮＡおよび妨害ミトコンドリアＤＮＡを取り除くには、ＤＮＡｓｅ処理単独で充分であり、最終的に頻繁に切断する制限酵素を選択することによって、該方法は充分調整され、大部分のウイルスが増幅される。このいわゆるウイルス発見ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ（ＶＩＤＩＳＣＡ）を用いて、本発明者らは肝炎Ｂウイルスに感染しているヒトおよび急性パルボＢ１９に感染しているヒトのＥＤＴＡ−血漿由来のウイルス核酸を増幅できた（結果は示されていない）。該技術もまた、陽性培養上清中のＨＩＶ−１を検出可能であり、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス両方を同定する能力を示す（結果は示されていない）。
【００５７】
残余の細胞を除去するために、１１０μｌのウイルス培養上清をエッペンドルフ微小遠心（１３５００ｒｐｍ）において最大速度で１０分間沈降させた。１００μｌが未使用の試験管に移され、１５μｌのＤＮＡｓｅバッファおよび２０ユニットのＤＮＡｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、３７℃で４５分間ＤＮＡｓｅ処理された。ＤＮＡｓｅ処理が含まれ、分解細胞由来の染色体ＤＮＡを除去する。この９００μｌのＬ６溶解バッファおよび４０μｌのシリカ懸濁液が加えられ、Ｂｏｏｍ４に記載のように核酸が抽出された。ウイルス核酸は４０μｌのＨ２Ｏに溶出された。２０μｌの溶出液を用いて、逆転写が行われ、１０ｍＭ トリスＨＣｌｐＨ８．３と、５０ｍＭ ＫＣｌと、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と、４．８ｍＭ ＭｇＣｌ２と、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰとを含むバッファ中、２．５μｇのランダム６量体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２００Ｕ ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。試料は３７℃で９０分間培養された。続いて、第２鎖ＤＮＡ合成が行われ、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰｓそれぞれと、１７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２と、トリス−ＨＣｌｐＨ７．５中、２６ Ｕ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＩＩ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、７．５Ｕ ＲＮＡｓｅ Ｈ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。３７℃９０分間の培養の後、フェノール／クロロホルム抽出が行われ、エタノール沈殿が続いた。ペレットが３０μｌのＨ２Ｏに溶解された。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは、基本的に、いくつかの修正を加えたＢａｃｈｅｍ１に記載のように行われた。ｄｓＤＮＡは製造業者のプロトコルに従って、ＨｉｎＰ ＩおよびＭｓｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて分解された。分解の後、ＭｓｅＩアダプタおよびＨｉｎＰ Ｉアダプタ（以下参照）が５Ｕリガーゼ酵素（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびリガーゼバッファと共に加えられ、続いて３７℃で２時間のさらなる培養が行われた。ＭｓｅＩアダプタおよびＨｉｎＰ Ｉアダプタは、ＭＳＥおよびＨｉｎＰ１アダプタ（表１）に対する先端鎖オリゴとＭＳＥアダプタおよびＨｉｎＰ１アダプタに対する下端鎖オリゴとを混合することによって、前もって調製され、６５℃で培養され、続いてリガースバッファの１：４０希釈物の存在下で室温まで冷却した。
【００５８】
第１ＰＣＲは、投入量として、１０μｌのライゲーション混合物と、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と、１００ｎｇのＨｉｎＰＩ標準プライマと、１００ｎｇのＭｓｅＩ標準プライマとで行われた。ＰＣＲ反応は５分９５℃、２０周期の１分９５℃−１分５５℃−２分７２℃、１０分７２℃のデータに従って行われた。投入量として５μｌの第１ＰＣＲ生成物が、１００ｎｇのＨｉｎＰＩ−Ｎプライマと、１００ｎｇ ＭｓｅＩ−Ｎ（１ヌクレオチドで拡張された標準プライマの配列）と、２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼとを含む第２「選択的」増幅段階において使用された。選択的ＰＣＲが、「タッチダウンＰＣＲ」のデータに従って増幅された。すなわち１０周期の６０秒９４℃−３０秒６５℃−１分７２℃で増幅され、アニーリング温度は各サイクルで６５℃から１℃に下げられ、続いて、２３周期の３０秒９４℃−３０秒５６℃−１分７２℃で増幅された。最後に、試料は１０分７２℃で培養された。ＰＣＲ生成物は、４％Ｍｅｔａｐｈｏｒ（登録商標）ゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）で評価された。ゲルのバンドがかなり薄ければ、ＰＣＲ生成物は、６０μｌのＰＣＲ生成物を使用して、真空乾燥によって濃縮された。製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉａｇｅｎゲル精製キットを使用して、関心のあるＰＣＲ断片はゲルから切断され、ＤＮＡがゲルから溶離された。ＰＣＲ生成物はｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、化学的に適格なＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを使用して複製された。コロニーにおけるＰＣＲが行われ、このＰＣＲ生成物が投入され、Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネータ ケミストリ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、挿入部分が配列決定された。逆転写段階は除かれ、ＨｉｎＰＩ分解およびアダプタ ライゲーションのみが行われ、第１ＰＣＲは２０周期の代わりに３５周期で行われ、それらの第１ＰＣＲ断片はアガロースゲル電気泳動上で視覚化された。
【００５９】
ＤＮＡ配列決定および分析
プラスミドを含むコロナウイルス−ＰＣＲ生成物はＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて配列決定され、−２１ Ｍ１３ＲＰおよびＴ７プライマを使用した。反応混合物を配列決定する電気泳動はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７自動シークエンサーを用いて行われ、製造業者のプロトコルに従った。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（バージョン １．０１）およびＡｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（バージョン ２．１）ソフトウェアパッケージ（ＡＢＩ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）が使用され、全ての配列決定データを分析した。配列は、ＮＣＢＩウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastのＢＬＡＳＴツールを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおける全ての配列と比較された。系統発生解析のために、配列がＣｌｕｓｔａｌＸソフトウェアパッケージを使用して、以下の設定で整列された３４。Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：１０．００，Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ０．２０，Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｗｉｔｃｈ ３０％，ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ０．５９。系統発生解析はＭＥＧＡプログラムの近隣結合法を使用して実施された（９）。ヌクレオチド距離マトリックスは、Ｋｉｍｕｒａの２パラメータ推定値またはｐ距離推定値のいずれか一方によって生成された（５）。ブートストラップ再サンプリング（５００複製）が使用され、個々の枝上におおよその信用限界を置いた。
【００６０】
完全なＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノムのヌクレオチド配列の決定
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノムの既に配列決定されている領域に位置する、特異的プライマの組み合わせと、特許ＰＡＬＭ法（ＷＯ０１５１６６１）を使用して、本発明者らは当該新規コロナウイルスに対する完全長ゲノム配列を複製および決定する過程にある。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノムの分析部分に位置する５’−オリゴヌクレオチドと、３’標識化ランダムプライマ（ＪＺＨ２Ｒ）との組み合わせを使用して、さらなる断片が前記プロトコルと同様のネストＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用して増幅された。
【００６１】
ＳＺ１６３の単離
２００３年１月、鼻感冒、結膜炎および熱を伴った７ヶ月の子供が来院した。胸部Ｘ線は気管支梢炎の典型的特徴を示し、発病から４日後に、鼻咽頭吸引物が収集された（試料ｎｒ：ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）。アデノウイルスと、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と、インフルエンザＡおよびＢと、パラインフルエンザ１，２および３と、ライノウイルスと、ＨＣｏＶ−２２９Ｅと、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３とに対する、当該試料についての通常使用されるあらゆる試験は陰性であった。続いて、臨床試料がヒト線維芽肺（ＨＦＬ）細胞と、第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザル）と、Ｒ−ヒーラ細胞とを含む種々の細胞に接種された。ＣＰＥはｔＭＫ細胞でのみ検出され、接種後８日に最初に観察された。ＣＰＥは、ウイルス感染した細胞における屈折の出現と共に拡散し、７日後に細胞分離された。さらに顕著なＣＰＥがＬＬＣ−ＭＫ２細胞への継代の際に観察された。さらに、全体的な細胞円形化、適度な細胞増大が観察された。ヒト内皮肺細胞、ＨＦＬ、横紋筋肉腫細胞およびベロ細胞におけるさらなる継代培養は、ＣＰＥに対して依然として陰性であった。培養物中のインフルエンザＡおよびＢ、ＲＳＶ、アデノウイルスまたはパラインフルエンザウイルス型１，２もしくは３を検出するための免疫蛍光アッセイは依然として陰性であった。
【００６２】
続いて、感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養上清がＶＩＤＩＳＣＡによって分析された。対照として、本発明者らは非感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の上清を使用した。第２ＰＣＲ増幅段階後、複数のＤＮＡ断片が試験試料中に存在したが、該対照中には存在しなかった。これらの断片は複製され、配列決定された。ＧｅｎｂａｎｋにおけるＢｌａｓｔ検索は１６断片中８断片が、最も高い相同性を有するコロナウイルス科のヒトコロナウイルス２２９Ｅに対して配列類似性を有していることが明らかとなった（表４および５）。
【００６３】
レプリカーゼ１Ｂ領域の２７０ｎｔ断片の系統発生解析は、本発明者らがコロナウイルス群１の別個の新規要素を同定したことを示した。ＶＩＤＩＳＣＡ技術を用いて、１６３−２，１６３−４，１６３−９，１６３−１０，１６３−１１，１６３−１４，１６３−１５および１６３−１８という名の８ＨＣＯＶ−１６３−特異的断片が単離され、複製され、配列決定され、Ｇｅｎｂａｎｋからの関連配列を用いて整列された。使用された配列のＧｅｎｂａｎｋ登録番号は、ＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス）：ＡＦ２０１９２９、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ：ＡＦ３０４４６０、ＰＥＤＶ（ブタ伝染性下痢症ウイルス）：ＡＦ３５３５１１、ＴＧＥＶ（伝染性胃腸炎ウイルス）：ＡＪ２７１９６５、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ：ＡＹ２７８５５４、ＩＢＶ（鳥類伝染性気管支炎ウイルス）：ＮＣ＿００１４５１、ＢＣｏＶ（ウシコロナウイルス）：ＮＣ＿００３０４５、ＦＣｏＶ（ネココロナウイルス）：Ｙ１３９２１およびＸ８０７７９、ＣＣｏＶ（イヌコロナウイルス）：ＡＢ１０５３７３およびＡ２２７３２、ＰＲＣｏＶ（ブタ呼吸器コロナウイルス）：Ｍ９４０９７、ＦＩＰＶ（ネコ伝染性腹膜炎ウイルス）：Ｄ３２０４４である。ＨＣｏＶ−２２９Ｅ（ＡＦ３０４４６０）と比較されるＨＣｏＶ−ＮＬ６３断片の位置：レプリカーゼ１ＡＢ遺伝子：１５１５５−１５３６１，１６０４９−１６１８２，１６１９０−１６３１５，１８４４４−１８５５０，スパイク遺伝子：２２１２４−２２２６６、ヌクレオカプシド遺伝子：２５６６７−２５８８２および２５８８７−２５９５７、３’ＵＴＲ：２７０５２−２７１２３。枝の長さは配列ごとの置換の数を示している。最も密接に関連した種の配列から同一性スコアが計算される（表５および表６）。
【００６４】
また、推定アミノ酸配列が関連コロナ（様）ウイルスのオープンリーディングフレームにおける対応する領域に対して整列された（表６）。
【００６５】
ヒトコロナウイルスはヒトにおける一般的な感冒の１０〜３０％を占めており７、呼吸器疾患を伴う子供においてコロナウイルスが見つかることは珍しいことではない。しかしながら、ウイルスＨＣｏＶ−ＮＬ６３がＬＬＣ−ＭＫ細胞から得られるということは印象的である。ヒトコロナウイルス２２９ＥおよびＯＣ−４３は、サル腎細胞において複製できないことが知られている。興味深いことに、ＳＡＲＳの原因である新たに同定されたヒトコロナウイルスもまた、サル腎細胞において複製可能である３０。
【００６６】
細胞培養物におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３の増殖
鼻咽頭吸引物は発症の４日後に収集された。試料は、アデノウイルスと、ＲＳＶと、インフルエンザＡと、インフルエンザＢと、パラインフルエンザ型１，２および３の存在するかについて、ウイルス性呼吸器キット（Ｂａｒｔｅｌｓ：Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｐｌｃ，Ｗｉｃｋｌｏｗ Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて試験された。さらに、ライノウイルスと、メタ−肺炎ウイルス属と、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅとに対するＰＣＲ診断が行われた２，１０。続いて、元の鼻咽頭吸引物が、ＨＦＬ細胞、ｔＭＫ細胞およびＲＨａＬａ細胞を含む種々の細胞培養物に接種された。試験管はローラドラム中で３４℃に保たれ、３〜４日毎に観察された。維持培地は３〜４日毎に補給された。２種の異なる培地が実施された。ウシ胎児血清を含まないＯｐｔｉｍｅｍ１（Ｇｉｂｃｏ）がｔＭＫ細胞に対して使用され、３％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ Ｈａｎｋｓ’／Ｅａｒｌｅ’ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）が残りの細胞型に使用された。ウイルス培養物において、インフルエンザウイルスＡおよびＢと、ＲＳＶと、アデノウイルス（Ｉｍａｇｅｎ，ＤＡＫＯ）とに対する蛍光標識マウス抗体のプールを用いて直接染色が行われた。間接染色はマウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてパラインフルエンザウイルス型１，２または３に対して行われ、続いて標識ウサギ抗マウス抗体（Ｉｍａｇｅｎ，ＤＡＫＯ）を用いて染色が行われた。
【００６７】
鼻咽頭標本におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３の検出方法
診断ＲＴ−ＰＣＲに対して、核酸がＢｏｏｍ法４によって、５０μｌウイルス上清または５０μｌ懸濁鼻咽頭標本から抽出された。１０ｎｇの逆転写プライマｒｅｐＳＺ−ＲＴ（表７）が使用されたことを除いて、逆転写は上述のように行われた。ＲＴ混合物全体が、１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−１および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−３を含む第１ＰＣＲ混合物に加えられた。ＰＣＲ反応は５分９５℃、２０周期の１分９５℃−１分５５℃−２分７２℃、１０分７２℃のデータに従って行われた。ネストＰＣＲは１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−２および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−４を含む５μｌの第１ＰＣＲを使用して開始された。第１ＰＣＲと同じデータの２５周期ＰＣＲが行われた。１０μｌの第１および１０μｌのネストＰＣＲがアガロースゲル電気泳動によって分析された（図２）。断片の複製および配列決定は、基本的に上述のように行われた。
【００６８】
ポリクローナル抗体を培養する方法
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３表面蛋白（たとえば、Ｓ−糖蛋白質またはＨＥ−糖蛋白質）内の適切な領域が選択され、適切なオリゴヌクレオチドおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅された。相当する、精製されたウイルス抗原は、適切な宿主（たとえば、前記Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ３８）における発現によって得られる。メスＮＺＷウサギ（およそ４ｋｇ）は０．５〜５．０ｍｇのウイルス蛋白質抗原調製品を与えられる。抗原は０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で懸濁され、等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）において乳化された。フロイントアジュバントは、既知のアジュバントシステムであり、該システムは少量の抗原が使用され、抗原の免疫原性が（おそらくであるが）未知であるこれらの実験における使用に適している。刊行されている使用のためのガイドラインに従い、該ガイドラインは、各部において注入を０．１ｍｌまでに制限し、最初の免疫化投与量に関してＣＦＡのみを使用する。この抗原調製（全量１ｍｌ）は、ウサギの首の後部の弛緩性皮膚に皮下注射される。この注射投与法は免疫学的に有効であり、片側面または両側面注射に関連する局部炎症の可能性を最小限にする（このような側面炎症は動物の移動性を低下させ得る）。３週間の安静状態の後、１ｍｌの血液が試験出血のために耳動脈から取り出される。所望の抗体の力価が小さすぎると判断されると、抗体が増やされる。適切な抗体レベルのウサギは皮下的に、ＣＦＡに含まれる１．０ｍｇの抗原を用いて促進される。促進された動物は２週間後に出血させられる、すなわち、１５ｍｌの血液が、赤外線灯を用いて血管を広げて、耳動脈から採取される。ウサギは市販の拘束手段の内に置かれ、全部で７回以下のキシラジンを用いて鎮静され、ウサギは、キシラジン／ケタミンを使用して麻酔に続いて心臓の穿刺によって放血させられた。
【００６９】
ワクチン生成のための方法
サブユニットワクチン生成のために、ＨＥ，ＭおよびＮ蛋白質とおそらく組み合わされるＳ−糖蛋白質は適切な真核性宿主（たとえば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＬＬＣ−ＭＫ２細胞）において発現され、選択的に２つの小さな親和性タグ（たとえば、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐＩＩタグ）を使用して精製される。適切な精製の後、得られたウイルス蛋白質はサブユニットワクチンとして使用され得る。
【００７０】
あるいは、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスが適切な細胞株において上述のように増殖され、続いてＷｕ１１に記載のように処理され得る。簡潔に、ウイルスは２０％ポリエチレングリコール６０００を用いて培地から沈殿させられ、不連続な４０〜６５％スクロース変化率を経て、４時間８００００×ｇ、続いて、直線的な５〜４０％ＣｓＣｌ変化率、１２００００×ｇで４時間、超遠心分離によって精製される。得られたウイルス調製物は、Ｂｌｏｎｄｅｌ３に記載のように６５℃で３０分間加熱することによって不活性化され得る。
【００７１】
光学バイオセンサにおける、固定化した配位子に結合する、Ｓ糖蛋白質または任意のＨＣＯＶ−ＮＬ６３ウイルス蛋白質の解析
結合反応は２０℃で、わずかな修正をした、ＩＡｓｙｓ ２チャネル共鳴ミラーバイオセンサにおいて実行された（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｓａｘｏｎ Ｈｉｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。平面ビオチン表面は、６００ａｒｃ ｓシグナルが、１ｎｇ結合蛋白質／ｍｍ２に対応し、製造業者の教授に従い、ストレプトアビジンを用いて誘導化された。対照は、ウイルス蛋白質はストレプトアビジン誘導ビオチン表面に結合しないということを示した（結果は示されていない）。ビオチン化抗体は平面ストレプトアビジン誘導表面に固定化され、その後ＰＢＳで洗浄された。バイオセンサキュベットの表面上の、固定化した配位子および結合したＳ−糖蛋白質の分布が共鳴走査によって調べられ、常にこれらの分子はセンサ表面上に均一に分布し、したがってミクロの状態で集合しないことが示された。結合アッセイが２０±０．１℃で３０μｌのＰＢＳの最終体積において実施された。ライゲート（ｌｉｇａｔｅ）がキュベットに対して、１μｌ〜５μｌのＰＢＳ中に既知の濃度で追加され、１４〜７０ｎＭのＳ−糖蛋白質の最終濃度を与えた。解離段階後、残余の結合したライゲートを除去し、固定した配位子を再生するために、キュベットは５０μｌの２Ｍ ＮａＣｌ−１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２で３回、５０μｌの２０ｍＭ ＨＣｌで３回洗浄した。データは、種々の量の固定した抗体（０．２，０．６および１．２ｎｇ／ｍｍ２）を用いて実行された実験からプールされた。ｋｏｎの計算のために、低濃度のライゲート（Ｓ−糖蛋白質）が使用されたが、ｋｏｆｆの測定のために、より高濃度のライゲートが使用され（１μＭ）、再結合の影響を避けた。結合パラメータｋｏｎおよびｋｏｆｆは結合反応の会合および解離段階からそれぞれ計算され、手段を提供する非線形曲線適合ＦａｓｔＦｉｔソフトウェア（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒ）を使用した。解離定数（ｋｄ）は会合および解離速度定数と平衡付近で観測される結合の程度とから計算された。
【００７２】
実施例２
方法
ウイルス単離
子供は、アムステルダムに住んでいたが、３日以来のコリザおよび結膜炎の症状を伴って病院に収容された。入院時、彼女は息切れしており、飲むことを拒絶した。患者の体温は３９℃、呼吸数は９６％の酸素飽和状態で５０回呼吸／分であり、脈拍は１７７打／分であった。聴診の際、左右の持続性イクスピリウム（ｅｘｐｉｒｉｕｍ）および終末呼気性喘鳴が見られた。胸部Ｘ線検査は気管支梢炎の典型的特徴を示した。子供は１日目にサルブタモールおよびイプラトロピウムを用い、続いて５日間、サルブタモールを用いて治療された。子供は外来で毎日みられ、症状は徐々に軽減した。鼻咽頭吸引物は発症５日後に収集された。試料は、ＲＳＶと、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３の存在についてウイルス呼吸器キット（Ｂａｒｔｅｌｓ：Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｐｌｃ，Ｗｉｃｋｌｏｗ Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して試験された。さらに、ライノウイルスと、エンテロウイルスと、メタ−肺炎ウイルス属と、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅに対するＰＣＲ試験が行われた（２，１０）。元の鼻咽頭吸引物は種々の細胞に接種された。培養物はローラドラム中３４℃に保たれ、３〜４日毎に観察された。維持培地は３〜４日毎に補給された。２種の異なる培地が実施された。ウシ胎児血清を含まないＯｐｒｉｍｅｍ１（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）がｔＭＫ細胞に対して使用され、３％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ Ｈａｎｋｓ’／Ｅａｒｌｅ’ｓ培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が残余の細胞型に対して使用された。吸引物試料に感染した細胞培養物は培養の１週間後に呼吸器ウイルスの存在に関して染色された。直接染色がＲＳＶと、インフルエンザＡおよびＢウイルス（Ｉｍａｇｅｎ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）とに対する蛍光標識マウス抗体のプールを用いて行われた。間接染色が、マウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてアデノウイルスとパラインフルエンザウイルス型１，２または３とに対して行われ、ＦＩＴＣ−標識ウサギ抗マウス抗体（Ｉｍａｇｅｎ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて次の染色が行われた。
【００７３】
ＶＩＤＩＳＣＡ法
残余の細胞およびミトコンドリアを除去するために、１１０μｌのウイルス培養物の上清が、エッペンドルフ微小遠心（１３５００ｒｐｍ）において、最大速度で１０分間沈降させられた。染色体ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡを溶解細胞から除去するために、１００μｌが未使用の試験管に移され、３７℃で４５分間ＤＮＡｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて処理された。核酸はＢｏｏｍに記載のように抽出された（４）。逆転写反応がランダム６量体プライマ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）およびＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行われ、一方、第２鎖ＤＮＡ合成がＳｅｑｕｅｎａｓｅＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｏｓｅｎｄａａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて実施された。フェノール／クロロホルム抽出の後にエタノール精製が行われた。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰが基本的に、いくつかの修正をしたＢａｃｈｅｍ（１）に記載のように行われた。ｄｓＤＮＡはＨｉｎＰＩおよびＭｓｅＩ制限酵素を用いて分解された（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。続いてＭｓｅＩ−およびＨｉｎＰＩ−アンカ（下記）が、５Ｕリガーゼ酵素（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共に提供されたリガーゼ中に３７℃で２時間、加えられた。ＭｓｅＩ−およびＨｉｎＰＩ−アンカが先端鎖オリゴ（ＭｓｅＩアンカに対する５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ−３’およびＨｉｎＰＩアンカに対する５’−ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣ−３’）を下端鎖オリゴ（ＭｓｅＩアンカに対する５’−ＴＡＧＧＴＡＣＧＣＡＴＧＣ−３’およびＨｉｎＰＩアンカに対する５’−ＣＧＧＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ−３’）と共に、リガーゼバッファ１：４０希釈物中で混合することによって調製される。２０周期のＰＣＲは、１０μｌのライゲーション混合物と、１００ｎｇＨｉｎＰＩ標準プライマ（５’−ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣ−３’）と、１００ｎｇのＭｓｅＩ標準プライマ（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＴＡＡ−３’）とを用いて行われた。５μｌのこのＰＣＲ生成物は、１００ｎｇ ＨｉｎＰＩ−Ｎプライマおよび１００ｎｇ ＭｓｅＩ−Ｎ（「Ｎ」は標準プライマが１つのヌクレオチドＧ，Ａ，ＴまたはＣで拡張されることを示している）を用いた第２「選択的」増幅段階における投入物として使用された。増幅の選択的巡回は、「タッチダウンＰＣＲ」すなわち１０周期の［６０秒９４℃−３０秒６５℃−１分７２℃］で行われ、アニーリング温度は各周期１℃低下され、続いて２３周期の［３０秒９４℃−３０秒５６℃−１分７２℃］および１周期の１０分７２℃が行われた。ＰＣＲ生成物は４％Ｍｅｔａｐｈｏｒ（登録商標）アガロースゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）上で分析され、関心のある断片がＢｉｇＤｙｅターミネータ試薬を用いて複製および配列決定された。電気泳動およびデータ収集がＡＢＩ３７７機器上で行われた。
【００７４】
ｃＤＮＡライブラリ構築および全ゲノム配列決定
ｃＤＮＡライブラリは、わずかな修正をしたＭａｒｒａ１７に記載のように生成された。逆転写反応の間、ランダム６量体プライマのみが使用され、オリゴｄＴ−プライマは使用されず、増幅されたｃＤＮＡはＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡ複製ベクタ中に複製された。コロニーが採取され、ＢＨＩ培地中に懸濁された。Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液は、増幅のためのＴ７およびＭ１３ＲＰを使用して、ＰＣＲ増幅において投入物として使用された。続いて、ＰＣＲ生成物がＰＣＲ−増幅において使用されたものと同じプライマとＢｉｇＤｙｅターミネータ試薬とを用いて配列決定された。電気泳動およびデータ収集はＡＢＩ３７７機器上で行われた。配列は、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ソフトウェア バージョン ２．０を用いて集められた。
【００７５】
診断ＲＴ−ＰＣＲ
４９２人から、総数６００の呼吸器試料が２００２年８月から２００２年１２までの間に収集された。物質の種類は、口腔／鼻咽頭吸引物から咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄物、唾液に至った。試料は上下気道疾患に罹患しているヒトの定期的ウイルス診断スクリーニングのために収集された。１００μｌの試料がＢｏｏｍ抽出において使用された（４）。逆転写が、１０ｎｇを使用したＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）または逆転写プライマ（ｒｅｐＳＺ−ＲＴ：５’−ＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣ−３’）を用いて行われた。ＲＴ混合物全体が、１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−１（５’−ＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧ−３’）および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−３（５’−ＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＡＡＴＣＣＴＡ−３’）を含む第１ＰＣＲ混合物に加えられた。ＰＣＲ反応は、５分９５℃、２０周期の１分９５℃−１分５５℃−２分７２℃、１０分７２℃のデータに従って行われた。ネストされたＰＣＲは１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−２（５’−ＴＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＴ−３’）および１００ｎｇのプライマｒｅｐＳＺ−４（５’−ＴＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴ−３’）と共に、５μｌの第１ＰＣＲを使用して開始された。第１ＰＣＲと同じデータの２５周期のＰＣＲが行われた。１０μｌのＰＣＲ生成物がアガロースゲル電気泳動によって分析された。あらゆる陽性試料が配列決定され、試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３の存在を確認した。
【００７６】
配列分析
配列はＮＣＢＩウェブページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastのＢＬＡＳＴツールを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中のあらゆる配列と比較された。系統発生解析のために、配列は以下の設定でＣｌｕｓｔａｌＸソフトウェアパッケージを使用して整列された。Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：１０．００，Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ０．２０，Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｗｉｔｃｈ ３０％，ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔ ０．５（９）。系統発生解析は、１遺伝子内のあらゆる断片の情報を使用するＭＥＧＡプログラム（５）の近隣結合法を使用して実行された。ヌクレオチド距離マトリックスはＫｉｍｕｒａの２パラメータ推定値またはｐ距離推定値のいずれか一方によって生成された（６）。ブートストラップ再サンプリング（５００複製）が使用され、個々の枝上におおよその信用限界を置いた。
【００７７】
結果
急性呼吸器疾患を伴う子供からのウイルスの単離
２００３年１月、鼻感冒、結膜炎および熱を伴う７ヶ月の子供が来院した。胸部Ｘ線は気管支梢炎の典型的特徴を示し、発病から５日後に、鼻咽頭吸引物試料が収集された（試料 ＮＬ６３）。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と、アデノウイルスと、インフルエンザＡおよびＢウイルスと、パラインフルエンザウイルス型１，２および３と、ライノウイルスと、エンテロウイルスと、ＨＣｏＶ−２２９Ｅと、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３とに対する診断試験は、依然として陰性であった。続いて、臨床試料はヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＦＬ）と、第３のサル腎細胞（ｔＭＫ；カニクイザル）と、ヒーラ細胞とに接種された。ＣＰＥはｔＭＫ細胞でのみ検出され、接種後８日に最初に観察された。ＣＰＥはウイルス感染した細胞における屈折の出現と共に拡散し、７日後に細胞分離された。さらに顕著なＣＰＥがサル腎細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２への継代の際に、全体的な細胞円形化および適度な細胞増大とともに観察された（図１）。ＨＦＬ、横紋筋肉腫細胞およびベロ細胞におけるさらなる継代培養は、ＣＰＥに対して依然として陰性であった。培養物中のＲＳＶ、アデノウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルスまたはパラインフルエンザウイルス型１，２および３を検出するための免疫蛍光アッセイは依然として陰性であった。酸不安定性およびクロロホルム感受性試験は、ウイルスはおそらくエンベロープを有しておりピコルナウイルス群２４の要素ではないということを示した。
【００７８】
ＶＩＤＩＳＣＡ法によるウイルス発見
分子生物学ツールによる未知の病原体の同定は、標的配列が未知であり、ゲノム特異的ＰＣＲ−プライマを設計することができないという問題に直面する。この問題を克服するために、本発明者らは、ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ技術４に基づくＶＩＤＩＳＣＡ法を開発した。ＶＩＤＩＳＣＡの利点は、制限酵素部位の存在は充分増幅を保証するので、配列の予備的知識が要求されないということである。投入試料は、血漿／血清または培養上清のいずれであってもよい。ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは単離ｍＲＮＡを用いて開始するのに対して、ＶＩＤＩＳＣＡ技術はウイルス核酸に関して選択的に濃縮する処理で始まり、遠心分離段階を含み、残余の細胞およびミトコンドリアを除去する。さらに、ＤＮＡｓｅ処理が使用され、分解した細胞由来の妨害染色体ＤＮＡおよび妨害ミトコンドリアＤＮＡを除去し、一方、ウイルス核酸はウイルス粒子内で保護される。最終的に、頻繁に切断する制限酵素を選択することによって、該方法は微調整され、大部分のウイルスが増幅される。ＶＩＤＩＳＣＡを使用して、本発明者らは肝炎Ｂウイルスに感染しているヒトおよび急性パルボウイルスＢ１９に感染しているヒトのＥＤＴＡ血漿由来のウイルス核酸を増幅することができた。該技術はまた細胞培養物中のＨＩＶ−１を検出することが可能であり、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス両方を同定する能力を示す。
【００７９】
ＣＰＥ−陽性培養物ＮＬ６３の上清がＶＩＤＩＳＣＡによって分析された。本発明者らは対照として非感染細胞の上清を使用した。第２ＰＣＲ増幅段階の後、特有で顕著なＤＮＡ断片が対照中でなく試験試料中に存在した。これらの断片は複製され、配列決定された。１６断片中１２はコロナウイルス科の要素に対して配列類似性を示したが、有意な配列相違はあらゆる断片において明白であった。これらの結果は本発明者らが新規コロナウイルス（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）を同定したということを示している。
【００８０】
患者試料におけるＨＣｏＶ−ＮＬ６３の検出
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が子供の鼻咽頭吸引物に由来するということを示すために、本発明者らはＨＣｏＶ−ＮＬ６３を特異的に検出する診断ＲＴ−ＰＣＲを設計した。この試験は１ｂ遺伝子内の特有の配列に基づいており、臨床試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３の存在を確認した。このＰＣＲ生成物の配列は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における生体外での継代の際に同定されたウイルスの配列と同一であった（結果は示されていない）。
【００８１】
培養されたコロナウイルスは該子供由来であることが確認されたが、該問題は、依然として、これは他に類のない臨床事例であるのか、またはＨＣｏＶ−ＮＬ６３はヒトにおいて広まっているのかというところにとどまっている。この問題に対処するために、本発明者らは、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の存在に関して２００２年１２月から２００３年８月までの間の、入院患者および外来診療室を訪れた人の呼吸器試料を調べた。本発明者らはＨＣｏＶ−ＮＬ６３を有するさらなる７人を確認した。ＰＣＲ生成物の配列分析は、種々の試料においてわずかな特徴的な（および複製可能な）点変異の存在を示し、ＮＬ６３の種々の部分群が相互に広がっていることを示唆した。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３陽性の少なくとも５人は気道疾患に罹患しており、２人の臨床データは得られなかった。初発症例を含んでおり、５人の患者が１歳以下の子供であり、３人の患者が大人である。２人の大人は免疫抑制されているようであり、それは、彼らのうちの１人が骨髄移植者であり、もう１人がＣＤ４細胞の総数が非常に少ないＡＩＤＳに罹患しているＨＩＶ陽性患者であるからである。第３の大人の臨床データは得られなかった。１人の患者のみがＲＳＶ（ｎｒ７２）に重感染しており、ＨＩＶ感染患者（ｎｒ４６６）はニューモシスティス・カリニを有していた。他の呼吸器病因は他のＨＣｏＶ−ＮＬ６３陽性患者において見つからず、呼吸器症状はＨＣｏＶ−ＮＬ６３によって引き起こされることを示唆している。あらゆるＨＣｏＶ−ＮＬ６３陽性試料が昨冬季に収集され、２００３年１月においては７％の検出頻度であった。２００３年の春および夏に収集された３０６の試料はいずれも該ウイルスを含んでいなかった（Ｐ＜０．０１，２−ｔａｉｌｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）。
【００８２】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３完全ゲノム分析
コロナウイルスのゲノムは特徴的なゲノム組織を有している。５’ｈａｌｆはラージ１ａおよび１ｂ遺伝子を含んでおり、非構造ポリ蛋白質をコードしており、４つの構造蛋白質、すなわちスパイク（Ｓ）、膜組織（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）およびヌクレオカプシド（Ｎ）をコードする遺伝子を含む。さらなる非構造蛋白質が１ｂおよびＳ遺伝子間、ＳおよびＥ遺伝子間、ＭおよびＮ遺伝子間またはＮ遺伝子下流のいずれかでコードされる。
【００８３】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノム組織がこれらの特徴を共有しているか否かを判断するために、本発明者らは提供物質として、精製したウイルスのストックを用いてｃＤＮＡライブラリを構築した。総数４７５ゲノム断片が、ヌクレオチドごとに７配列という平均範囲で分析された。特異的ＰＣＲが設計され、質の低い配列データの、隙間を埋め、領域を配列決定した。５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）および３’ＲＡＣＥ実験と組み合わせて、完全ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ゲノム配列が解明された。
【００８４】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のゲノムはポリＡ末端を有する２７，５５３個のヌクレオチドのＲＮＡである。それは３４％のＧ−Ｃ含有量を有し、３７％〜４２％２５にわたるコロナウイルス科のうちで最も低いＧ−Ｃ含有量を有している。ＺＣｕｒｖｅソフトウェアが使用され、ＯＲＦ２６を同定し、ゲノム配置は既知のコロナウイルスとの類似性を使用して描かれる（図６）。１ａおよび１ｂ遺伝子は、ウイルス複製に必須である、ＲＮＡポリメラーゼおよびプロテアーゼをコードする。潜在的偽結節構造は１２４３９位に存在し、−１フレームシフト信号を提供し、１ｂポリ蛋白質を翻訳する。Ｓ，Ｅ，ＭおよびＮ蛋白質をコードすると予測される遺伝子がゲノムの３’部分に見られる。２８６個および２８７個のヌクレオチドの短い非翻訳領域（ＵＴＲ）はそれぞれ５’および３’末端に存在する。血球凝集素エステラーゼ遺伝子は、群２および群３コロナウイルス中に存在するものであるが、存在していなかった。ＳおよびＥ遺伝子間のＯＲＦ３はおそらくただ１つの補助非構造蛋白質をコードする。
【００８５】
１ａおよび１ａｂポリ蛋白質はゲノムＲＮＡから翻訳されるが、残りのウイルス蛋白質はサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ ｍＲＮＡ）から翻訳され、それぞれ、ゲノムの５’部分（５’リーダー配列）由来の共通の５’末端および３’共通末端部を有する。ｓｇ ｍＲＮＡはマイナス鎖合成の間、不連続的転写によって作成された２７。不連続的転写はシス作用転写調節配列（ＴＲＳ）間の塩基対を必要とし、一方はゲノムの５’部分（リーダーＴＲＳ）の近くに位置し、他方は各ＯＲＦ上流（ＴＲＳ本体）に位置する２８。本発明者らが配列決定のために使用したｃＤＮＡバンクは、Ｎ蛋白質のｓｇ ｍＲＮＡの複製を含んでおり、あらゆるｓｇ ｍＲＮＡに対して融合されるリーダー配列を正確に解読する機会を提供する。７２個のヌクレオチドのリーダーは５’ＵＴＲで同定された。リーダーＴＲＳ（５’−ＵＣＵＣＡＡＣＵＡＡＡＣ−３’）はＮ遺伝子のＴＲＳ本体上流と１１／１２個のヌクレオチド類似性を示した。推定ＴＲＳもまたＳ，ＯＲＦ３，ＥおよびＭ遺伝子の上流で同定された。
【００８６】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３の配列は他のコロナウイルスの完全ゲノムと共に整列された。ヌクレオチド同一性比率が各遺伝子に対して決定された。Ｍ遺伝子を除く全ての遺伝子に対して、ＨＣｏＶ−２２９Ｅとの同一性比率が最も高かった。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が群１コロナウイルスの新たな要素であることを確認するために、病原分析が１Ａ，１Ｂ，Ｓ，ＭおよびＮ遺伝子のヌクレオチド配列を使用して行われた。分析された各遺伝子に対して、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３は群１コロナウイルスと共に集団化された。部分群ＨＣｏＶ−ＮＬ６３／ＨＣｏＶ−２２９Ｅのブートストラップ値は１ａ，１ｂおよびＳ遺伝子に対して１００であった。しかしながら、ＭおよびＮ遺伝子に対して、この、部分クラスタのブートストラップ値は（それぞれ７８および４１に）減少し、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ，ＨＣｏＶ−ＮＬ６３およびＰＥＤＶを含む部分クラスタが明らかになる。病原分析がＯＲＦ３およびＥ遺伝子に対して行われなかったが、これは、それぞれ、当該領域が種々のコロナウイルス群間で非常に変化していたから、または当該領域が分析するには小さすぎたからである。Ｓｉｍｐｌｏｔソフトウェア バージョン２．０２９によるブートスキャン分析は組換えの徴候を検出しなかった（結果は示されていない）。
【００８７】
ＳおよびＥ遺伝子間のただ１つの非構造蛋白質遺伝子の存在は注目に値する。それはＰＥＤＶおよびＯＣ４３を除いて、ほとんど全てのコロナウイルスがこの領域において２以上のＯＲＦを有するからである３０，３１。恐らくＨＣｏＶ−２２９Ｅと比較して、Ｓ遺伝子の５’部分における５３７個のヌクレオチドの大きな挿入部分は最も注目に値する。Ｂｌａｓｔ検索は、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されている任意のコロナウイルス配列または任意の他の配列に対する、スパイク蛋白質のこのさらなる１７９個のアミノ酸領域の類似性を検出しなかった。
【００８８】
【表１】
【００８９】
【表２】
【００９０】
【表３】
【００９１】
【表４】
【００９２】
【表５】
【００９３】
【表６】
【００９４】
【表７】
【００９５】
【表８】
【００９６】
【表９】
【００９７】
【表１０】
【００９８】
【表１１】
【００９９】
【表１２】
【０１００】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰは、配列の予備知識がなくとも核酸の増幅を可能にする。ＣＰＥ−陽性および非感染細胞由来の培養上清はｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ法で扱われた。非感染対照試料に存在しない、ＣＰＥ−陽性培養物由来の増幅生成物は複製され、配列決定された。
【図２】ＨＣｏＶ−ＮＬ１６３に感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞。パネルＡおよびＢは非染色細胞であり、一方パネルＣおよびＤはヘマトキシリンエオシンで染色されている。ＨＣｏＶ−ＮＬ１６３の典型的ＣＰＥはパネルＡおよびＣに示されている。対照非感染ＬＬＣ−ＭＫ細胞はパネルＢおよびＤに示されている。
【図３】Ｍｅｔａｐｈｏｒ（登録商標）アガロースゲル電気泳動によって視覚化されたＶＤ−ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ ＰＣＲ生成物。選択的増幅段階の間に使用される、１６プライマ対結合のうちの１（ＨｉｎＰ Ｉ−ＧおよびＭｓｅ Ｉ−Ａ）のＰＣＲ生成物。レーン１および２：ウイルス培養物ＮＬ１６３の複製ＰＣＲ生成物；レーン５および６：ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の対照上清およびレーン７および８：陰性ＰＣＲ対照。レーンＭ：２５ｂｐ分子量マーカー（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）。矢印はゲルから切除され、配列決定された新規コロナウイルス断片を示す。
【図４】ＨＣｏＶ−ＮＬ１６３配列の系統発生解析。Ｇ１，Ｇ２およびＧ３は群１、群２および群３コロナウイルスクラスタを示す。使用された配列のＧｅｎｂａｎｋ受託番号は以下のとおりである。ＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス）：ＡＦ２０１９２９、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ：ＡＦ３０４４６０、ＰＥＤＶ（ブタ伝染性下痢症ウイルス）：ＡＦ３５３５１１、ＴＧＥＶ（伝染性胃腸炎ウイルス）：ＡＪ２７１９６５、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ：ＡＹ２７８５５４、ＩＢＶ（鳥類伝染性気管支炎）：ＮＣ＿００１４５１、ＢＣｏＶ（ウシコロナウイルス）：ＮＣ＿００３０４５、ＦＣｏＶ（ネココロナウイルス）：Ｙ１３９２１およびＸ８０７９９、ＣＣｏＶ（イヌコロナウイルス）：ＡＢ１０５３７３およびＡ２２７３２、ＰＲＣｏＶ（ブタ呼吸器コロナウイルス）：Ｍ９４０９７およびＦＩＰＶ（ネコ感染性腹膜炎ウイルス）：Ｄ３２０４４。ＨＣｏＶ−２２９Ｅ（ＡＦ３０４４６０）と比較したＨＣｏＶ−１６３断片の位置。レプリカーゼ１ＡＢ遺伝子：１５１５５−１５３６１、１６０４９−１６１８２、１６１９０−１６３１５および１８４４４−１８５５０、スパイク遺伝子：２２１２４−２２２６６、ヌクレオカプシド遺伝子：２５６６７−２５８８２および２５８８７−２５９５７、３’ＵＴＲ：２７０５２−２７１２３。枝長は配列ごとの置換数を示す。
【図５】コロナウイルスの配置図および表３に記載の１６３断片の位置。
【図６】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３’の制限地図。ｓｓＲＮＡゲノムの完全２７５５３ｎｔ ｃＤＮＡ誘導体。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が番号が付された黒矢印として表されており、これらのＯＲＦ内の同定された（ＰＦＡＭ）領域が灰色の箱として示されている。
【図７】ＨＣｏＶ ＮＬ６３および他のヒトコロナウイルスのＳｉｍｐｌｏｔ分析。ＨＣｏＶ ＮＬ６３のＳＡＲＳ、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅに対する比較における差は、スパイク蛋白質コードＯＲＦにおける特有の５３７ｉｎ−ｆｒａｍｅ挿入によって引き起こされる（この記載の別の場所を参照）。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ分析は、Lole, K. S. , R. C. Bollinger, R. S. Paranjape, D. Gadkari, S. S.Kulkarni, N. G. Novak,R. Ingersoll, H. W. Sheppard, and S. C. Ray. 1999. Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination. J. Virol. 73: 152-160に記載されている。
【図８】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３スパイクおよびマトリックス蛋白質のための発現構築。ＨｉｓおよびＳｔｒｅｐＩＩ標識スパイク融合蛋白質の発現はバクテリア成長培地へのＩＰＴＧの添加によって誘導され得る。ａｔｔＢ１／Ｂ２介在再結合を介して、Ｓ遺伝子挿入部分は他の市販の発現ベクタへ転写され、他の宿主における蛋白質の生成を促進する。ｐＧＰ７Ｓに関して同一の複製手順を経て、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３ Ｍ−遺伝子に対するＧａｔｅｗａｙ適合発現ベクタが構築され得る。プラスミドはＮおよびＣ−末端親和性標識マトリックス融合蛋白質のＩＰＴＧ誘導生成を指示し、完全長融合蛋白質の選択的復元を可能にする。
【図９】再結合部位 ＮＬ６３−２２９Ｅ。ＮＬ６３由来配列は下線付の黒色太字であり、２２９Ｅ由来配列は灰色太字である。
【図１０】制限地図 ｃＤＮＡ複製ＮＬ６３／２２９Ｅハイブリッド。ＮＬ６３由来部分は灰色の箱として示され、２２９Ｅ由来領域は線として示されている。２つのゲノム間の接合部は、連続する、２つの黒矢印で印をつけている、１ｂ’とハイブリッド１ｂＯＲＦを示す‘ＯＲＦ−１ｂとによって示されている。 第２キメラゲノムは相互組換えによって、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３のヌクレオチド１９６５３をＨＣｏＶ−ＯＣ４３のヌクレオチド２０６８２に融合し、ハイブリッドＯＲＦ１ｂを再び生成し、ハイブリッド１ａｂレプリカーゼ ポリ蛋白質を生成した。組換えが保存配列ＡＡＴＴＡＴＧＧ内で起こった。
【図１１】組換え部位 ＮＬ６３／ＯＣ４３ハイブリッド。先と同様にＮＬ６３由来領域は下線付きの黒色太字であり、ＯＣ４３由来配列は灰色太字である。得られたｃＤＮＡ制限地図は図１２に示される。
【図１２】制限地図 組換えＮＬ６３／ＯＣ４３ゲノム。ＮＬ６３由来部分は灰色のボックスで示されており、組換え部位は黒矢印１ｂ’および‘１ｂの間に示されている。
【図１３】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ＨＣｏＶ−２２９Ｅ、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３ならびに２つのハイブリッドＮＬ６３／２２９ＥおよびＮＬ６３／ＯＣ４３由来のＯＲＦ１ｂの類似性プロット推定蛋白質配置構造。
【図１４】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３誘導体を発現する緑色蛍光蛋白質。機能的同等物ＮＬ６３／４ＧＥＰは、ヒトコドン最適化緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に、Ｅ蛋白質（ＯＲＦ４）のｉｎ−ｆｒａｍｅ Ｃ末端融合を有している。感染細胞は４−ＥＧＦＰ融合蛋白質の励起後、蛍光を発しているようであった。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３が使用され、ウイルス感染およびポリシストロニックサブゲノムメッセンジャの翻訳の過程を解明した。
【図１５】機能的誘導体ＮＬ６３Ｄ２０５２０２１０１１の制限地図。ＮＬ６３の欠失誘導体はスパイク蛋白質のＮ末端における大部分の挿入部分を欠いている。ヌクレオチド２０５２０−２１０１１を欠失することによって、特有の領域が除去され、一方、予測分泌シグナル配列は保持される（Nielsen, H. , J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. Von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10: 1-6）。
【図１６】さらなる患者試料由来のＨＣｏＶ−ＮＬ６３における配列変異。６人の患者試料由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物の両鎖の直接配列決定は、ＯＲＦ１ａ領域における多型性の存在を明らかにした。
【図１７】ＨＣｏＶ−ＮＬ６３特異的および一般的ヒトコロナウイルス検出プローブ。コロナウイルスポリメラーゼは複数のサブゲノムＲＮＡを生成する。ＨＣｏＶ−ＮＬ６３およびＳＡＲＳの配列決定ライブラリにおいてｃＤＮＡクローンをコードするＳ，Ｅ，ＭおよびＮの頻度（Snijder, E. J. , P. J. Bredenbeek, J. C. Dobbe, V. Thiel, J. Ziebuhr, L. L. Poon, Y. Guan, M. Rozanov, W. J. Spaan, and A. E. Gorbalenya. 2003，Unique and conserved features of genome and proteome of SARS-coronavirus, an early split-off from the coronavirus group 2 lineage. J. Mol. Biol. 331: 991-1004）。ノーザンブロットデータは感染細胞中のこれらのサブゲノムＲＮＡの高い存在度を示す。したがってこれらの遺伝子は診断試験に対する魅力的な標的である。ゲノムおよびサブゲノムＲＮＡは同一の３’末端を有するので、Ｎ遺伝子を含むプローブはそれら全てに対してハイブリッド形成するであろう。あらゆるヒトコロナウイルスの完全長配列の整列を経て、ＯＲＦ１ｂ中の保存領域が同定され、ネストされたＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いてそれらの検出を行った。
【図１８】一般的コロナウイルス検出プライマ。
【図１９】ヌクレオチド配列 ＨｃｏＶ＿ＮＬ６３。
【図２０】ＨＣｏＶ＿ＮＬ６３のＯＲＦ１ａ、レプリカーゼ酵素複合体。
【０１０２】
【図２１】ＨＣｏＶ＿ＮＬ６３のＯＲＦ１ａｂレプリカーゼ ポリ蛋白質。
【図２２】スパイク蛋白質（ＯＲＦ３）は（下記の連続配列の第１行目に示される）１６ＡＡのＮ末端分泌シグナル配列を含む（Nielsen, H. , J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. Von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10: 1-6）。
【図２３】ＯＲＦ−４コロナウイルス＿ＮＳ４、コロナウイルス非構造蛋白質４。この科は複数の非構造蛋白質４（ＮＳ４）配列または小さな膜蛋白質からなる。ＯＲＦ−５。この科は膜貫通型糖蛋白質である種々のマトリックス蛋白質からなる。Ｍ蛋白質またはＥ１糖蛋白質はウイルス集合に関わる。Ｅ１ウイルス膜蛋白質は、ウイルスエンベロープの形成のために要求され、ゴルジ複合体を介して輸送される。マトリックス蛋白質は、（連続配列の第１部分に示されている）Ｎ末端分泌シグナル配列を含むと予測される（Nielsen, H. , J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. Von Heijne. 1997.Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10: 1-6.）。ＯＲＦ−６ Ｐｆａｍ ００９３７、コロナウイルス ヌクレオカプシド蛋白質。ゲノムＲＮＡと複合体を形成する構造蛋白質。
【０１０３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１９および／または表３に示される配列を含む単離および／または組換え核酸、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項２】
請求項１記載の核酸に対して少なくとも７０％相同である単離および／または組換え核酸。
【請求項３】
請求項１記載の核酸に対して少なくとも９５％相同である単離および／または組換え核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の１００個の連続ヌクレオチドの伸張部を含む単離および／または組換え核酸。
【請求項５】
図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される配列を含む単離および／または組換え蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項６】
請求項５記載の蛋白様分子に対して少なくとも７０％相同である単離および／または組換え蛋白様分子。
【請求項７】
請求項５記載の蛋白様分子に対して少なくとも９５％相同である単離および／または組換え蛋白様分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の蛋白様分子の少なくとも３０個の連続アミノ酸の伸張部を含む単離および／または組換え蛋白様分子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸配列を含む単離または組換えウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子を含む単離または組換えウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項１２】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を誘導可能な請求項１０または請求項１１記載の、単離または組換えウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体。
【請求項１３】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクタ。
【請求項１４】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１５】
請求項８または９に記載のプライマおよび／またはプローブであって、厳しい条件下で前記核酸にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載のプライマおよび／またはプローブであって、表３，表７，表１０および図１６〜図１８に示される配列を含むプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１７】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子に特異的に結合可能な単離結合分子、および／または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離または組換えウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸配列を特異的に結合可能な単離結合分子。
【請求項１９】
表３に示される核酸配列の少なくとも一部を特異的に結合可能な単離結合分子。
【請求項２０】
蛋白様分子である請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離結合分子。
【請求項２１】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を結合可能な分子、あるいは請求項５〜８のいずれか１項に記載の単離および／または組換え蛋白様分子を生成し、
前記ウイルスおよびまたは前記蛋白様分子に対して特異的である蛋白様結合分子を選択することを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を生成する方法。
【請求項２２】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の分子と免疫反応する単離または組換えウイルス。
【請求項２３】
試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルス、または機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用。
【請求項２４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルスを特異的に結合可能な結合分子を検出するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の単離および／または組換え蛋白様分子、または試料中の前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用。
【請求項２５】
請求項２４記載の使用であって、前記結合分子は前記ウイルスに対する特異的配位子および／または抗体を含むことを特徴とする使用。
【請求項２６】
試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルスを検出および／または同定するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のプライマおよび／またはプローブ、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、および／または請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の、核酸または機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用。
【請求項２７】
請求項２６記載の使用であって、表３に示される配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項２８】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を含むワクチン。
【請求項２９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子を含むワクチン。
【請求項３０】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を含むワクチン。
【請求項３１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を含む薬剤。
【請求項３２】
コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用。
【請求項３３】
コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子の使用。
【請求項３４】
コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製するための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子の使用。
【請求項３５】
試料中のコロナウイルスを検出する方法であって、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の、プライマおよび／またはプローブが使用されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
コロナウイルスに対して結合分子を検出する方法であって、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルス、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子が使用されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
コロナウイルス属関連疾患の診断のための、請求項３５または請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の使用であって、前記コロナウイルス属関連疾患はＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルス関連疾患を含むことを特徴とする使用。
【請求項３９】
試料中の請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法であって、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマおよび／またはプローブを用いて、前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を、ハイブリッド形成および／または増幅し、ハイブリッド形成したおよび／または増幅した生成物を検出することを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、および／または請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマ／プローブを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項４１】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているまたは罹患している危険のあるヒトを治療する方法であって、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の、ワクチンまたは薬剤を前記ヒトに投与することを特徴とする方法。
【請求項４２】
ヒトがＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているか否かを判断する方法であって、前記ヒトから試料を得ることと、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離および／または組換えウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む細胞。
【請求項４４】
前記細胞は霊長類細胞であることを特徴とする請求項４３記載の細胞。
【請求項４５】
前記細胞は腎細胞であることを特徴とする請求項４３または４４記載の細胞。
【請求項４６】
前記細胞はサル細胞であることを特徴とする請求項４４または請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
３ＣＬプロテアーゼをコードすることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子。
【請求項４８】
化合物がウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害可能であるか否かを判断するための方法であって、前記プロテアーゼは請求項４７記載のプロテアーゼまたは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体であることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７記載のウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害可能な化合物。
【請求項５０】
前記化合物はアミノ酸配列ＹＮＳＴＬＱまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことを特徴とする請求項４９記載の化合物。
【請求項５１】
コロナウイルス感染に罹患しているヒトまたは罹患する危険のあるヒトを治療する薬剤であって、前記コロナウイルスは請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸配列を含み、前記薬剤はアミノ酸配列ＹＮＳＴＬＱまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項５２】
コロナウイルス感染に罹患しているまたは罹患している危険のあるヒトの治療のための薬剤の調製のための、推定３Ｃｌｐｒｏ切断部位のＮ末端に位置する任意のヘキサペプチドの使用であって、前記コロナウイルスは請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項５３】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の配列を含む遺伝子運搬担体。
【請求項５４】
前記ベクタは請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸に基づくことを特徴とする請求項５３記載の遺伝子運搬担体。
【請求項５５】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項５６】
図１９に示される核酸において、１２４３３〜１２４３９位にある配列を含むリボソーム不安定部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｓｌｉｐｐｅｒｙ ｓｉｔｅ）を含むポリシストロニックメッセンジャＲＮＡ。
【請求項５７】
少なくとも、図２２に示される配列を有するスパイク蛋白質の免疫原性部分を含むことを特徴とする請求項２９記載のワクチン。
【請求項５８】
前記部分は図１９の２０４７２〜２１００９の配列、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことを特徴とする請求項５７記載のワクチン。
【請求項５９】
図１９に示される配列の少なくとも１０００個のヌクレオチドと別のコロナウイルスの少なくとも１０００個のヌクレオチドとを含むキメラコロナウイルスであって、前記後者の１０００個のヌクレオチドは図１９に示される配列と５％以上の配列相違がある配列を含むことを特徴とするキメラコロナウイルス。
【請求項１】
図１９および／または表３に示される配列を含む単離および／または組換え核酸、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項２】
請求項１記載の核酸に対して少なくとも７０％相同である単離および／または組換え核酸。
【請求項３】
請求項１記載の核酸に対して少なくとも９５％相同である単離および／または組換え核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の１００個の連続ヌクレオチドの伸張部を含む単離および／または組換え核酸。
【請求項５】
図２０，図２１，図２２，図２３または表３に示される配列を含む単離および／または組換え蛋白様分子、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項６】
請求項５記載の蛋白様分子に対して少なくとも７０％相同である単離および／または組換え蛋白様分子。
【請求項７】
請求項５記載の蛋白様分子に対して少なくとも９５％相同である単離および／または組換え蛋白様分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の蛋白様分子の少なくとも３０個の連続アミノ酸の伸張部を含む単離および／または組換え蛋白様分子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸配列を含む単離または組換えウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子を含む単離または組換えウイルス、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体。
【請求項１２】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患を誘導可能な請求項１０または請求項１１記載の、単離または組換えウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体。
【請求項１３】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸を含むベクタ。
【請求項１４】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸に特異的にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１５】
請求項８または９に記載のプライマおよび／またはプローブであって、厳しい条件下で前記核酸にハイブリッド形成可能なプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載のプライマおよび／またはプローブであって、表３，表７，表１０および図１６〜図１８に示される配列を含むプライマおよび／またはプローブ。
【請求項１７】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子に特異的に結合可能な単離結合分子、および／または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離または組換えウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の核酸配列を特異的に結合可能な単離結合分子。
【請求項１９】
表３に示される核酸配列の少なくとも一部を特異的に結合可能な単離結合分子。
【請求項２０】
蛋白様分子である請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離結合分子。
【請求項２１】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を結合可能な分子、あるいは請求項５〜８のいずれか１項に記載の単離および／または組換え蛋白様分子を生成し、
前記ウイルスおよびまたは前記蛋白様分子に対して特異的である蛋白様結合分子を選択することを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を生成する方法。
【請求項２２】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の分子と免疫反応する単離または組換えウイルス。
【請求項２３】
試料中の前記ウイルスを特異的に結合可能な分子を検出するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルス、または機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用。
【請求項２４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルスを特異的に結合可能な結合分子を検出するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の単離および／または組換え蛋白様分子、または試料中の前記ウイルスの、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の使用。
【請求項２５】
請求項２４記載の使用であって、前記結合分子は前記ウイルスに対する特異的配位子および／または抗体を含むことを特徴とする使用。
【請求項２６】
試料中のＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルスを検出および／または同定するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のプライマおよび／またはプローブ、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、および／または請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の、核酸または機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用。
【請求項２７】
請求項２６記載の使用であって、表３に示される配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項２８】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を含むワクチン。
【請求項２９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子を含むワクチン。
【請求項３０】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を含むワクチン。
【請求項３１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子を含む薬剤。
【請求項３２】
コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体の使用。
【請求項３３】
コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子の使用。
【請求項３４】
コロナウイルス属関連疾患に対するワクチンを調製するための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子の使用。
【請求項３５】
試料中のコロナウイルスを検出する方法であって、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、または請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の、プライマおよび／またはプローブが使用されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
コロナウイルスに対して結合分子を検出する方法であって、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルス、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子が使用されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
コロナウイルス属関連疾患の診断のための、請求項３５または請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の使用であって、前記コロナウイルス属関連疾患はＨＣｏＶ−ＮＬ６３コロナウイルス関連疾患を含むことを特徴とする使用。
【請求項３９】
試料中の請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出する方法であって、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマおよび／またはプローブを用いて、前記ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体を、ハイブリッド形成および／または増幅し、ハイブリッド形成したおよび／または増幅した生成物を検出することを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の、ウイルスまたは機能的部分、誘導体もしくは類似体、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の結合分子、および／または請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の、プライマ／プローブを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項４１】
ＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているまたは罹患している危険のあるヒトを治療する方法であって、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の、ワクチンまたは薬剤を前記ヒトに投与することを特徴とする方法。
【請求項４２】
ヒトがＨＣｏＶ−ＮＬ６３関連疾患に罹患しているか否かを判断する方法であって、前記ヒトから試料を得ることと、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＨＣｏＶ−ＮＬ６３ウイルスまたはその、機能的部分、誘導体もしくは類似体を検出することを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離および／または組換えウイルスまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む細胞。
【請求項４４】
前記細胞は霊長類細胞であることを特徴とする請求項４３記載の細胞。
【請求項４５】
前記細胞は腎細胞であることを特徴とする請求項４３または４４記載の細胞。
【請求項４６】
前記細胞はサル細胞であることを特徴とする請求項４４または請求項４５に記載の細胞。
【請求項４７】
３ＣＬプロテアーゼをコードすることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載の蛋白様分子。
【請求項４８】
化合物がウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害可能であるか否かを判断するための方法であって、前記プロテアーゼは請求項４７記載のプロテアーゼまたは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体であることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４７記載のウイルスプロテアーゼを少なくとも部分的に阻害可能な化合物。
【請求項５０】
前記化合物はアミノ酸配列ＹＮＳＴＬＱまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことを特徴とする請求項４９記載の化合物。
【請求項５１】
コロナウイルス感染に罹患しているヒトまたは罹患する危険のあるヒトを治療する薬剤であって、前記コロナウイルスは請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸配列を含み、前記薬剤はアミノ酸配列ＹＮＳＴＬＱまたはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項５２】
コロナウイルス感染に罹患しているまたは罹患している危険のあるヒトの治療のための薬剤の調製のための、推定３Ｃｌｐｒｏ切断部位のＮ末端に位置する任意のヘキサペプチドの使用であって、前記コロナウイルスは請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の配列を含むことを特徴とする使用。
【請求項５３】
請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の配列を含む遺伝子運搬担体。
【請求項５４】
前記ベクタは請求項１〜４または９のいずれか１項に記載の核酸に基づくことを特徴とする請求項５３記載の遺伝子運搬担体。
【請求項５５】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項５６】
図１９に示される核酸において、１２４３３〜１２４３９位にある配列を含むリボソーム不安定部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｓｌｉｐｐｅｒｙ ｓｉｔｅ）を含むポリシストロニックメッセンジャＲＮＡ。
【請求項５７】
少なくとも、図２２に示される配列を有するスパイク蛋白質の免疫原性部分を含むことを特徴とする請求項２９記載のワクチン。
【請求項５８】
前記部分は図１９の２０４７２〜２１００９の配列、またはその、機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことを特徴とする請求項５７記載のワクチン。
【請求項５９】
図１９に示される配列の少なくとも１０００個のヌクレオチドと別のコロナウイルスの少なくとも１０００個のヌクレオチドとを含むキメラコロナウイルスであって、前記後者の１０００個のヌクレオチドは図１９に示される配列と５％以上の配列相違がある配列を含むことを特徴とするキメラコロナウイルス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図１９−６】
【図１９−７】
【図１９−８】
【図１９−９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２１−３】
【図２１−４】
【図２１−５】
【図２１−６】
【図２１−７】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図１９−６】
【図１９−７】
【図１９−８】
【図１９−９】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２１−３】
【図２１−４】
【図２１−５】
【図２１−６】
【図２１−７】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００７−５０２６１２（Ｐ２００７−５０２６１２Ａ）
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３８００（Ｐ２００６−５２３８００）
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７１３３
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０５４３００１２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＳＴＥＲＤＡＭ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＶＩＲＡＬ ＧＥＮＯＭＩＣＳ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｍｅｉｂｅｒｇｄｒｅｅｆ ５９ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７１３３
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０５４３００１２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＳＴＥＲＤＡＭ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＶＩＲＡＬ ＧＥＮＯＭＩＣＳ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｍｅｉｂｅｒｇｄｒｅｅｆ ５９ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
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