サイトカインレセプター鎖
【課題】ＩＬ−１３に対するアフィニティーを有するレセプターフラグメント、その産生方法、および、その治療的用途の提供。
【解決手段】ＩＬ−１３レセプターおよびそのフラグメントをコードする特定の配列のポリヌクレオチド、ＩＬ−１３レセプタータンパク質、その産生のための方法、ＩＬ−１３とそのレセプターとの結合のインヒビター、ならびにその同定のための方法、このような分子およびＩＬ−１３／ＩＬ−１３Ｒ相互作用のアンタゴニストを使用する医学処置の方法。
【解決手段】ＩＬ−１３レセプターおよびそのフラグメントをコードする特定の配列のポリヌクレオチド、ＩＬ−１３レセプタータンパク質、その産生のための方法、ＩＬ−１３とそのレセプターとの結合のインヒビター、ならびにその同定のための方法、このような分子およびＩＬ−１３／ＩＬ−１３Ｒ相互作用のアンタゴニストを使用する医学処置の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９７年４月３０日に出願された一部継続出願仮番号０８／８４１，７５１であり、これは、１９９６年３月１日に出願された出願仮番号０８／６０９，５７２の分割出願である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＩＬ−１３に対するアフィニティを有する哺乳動物サイトカインレセプタータンパク質（ヒトおよびマウスのレセプタータンパク質に限定されないものを含む）、そのフラグメントおよび組換えポリヌクレオチド、ならびにこのようなタンパク質を発現するために有用な細胞に関する。
【０００３】
（発明の背景）
サイトカインとして公知の種々の調節分子は、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含め、同定されてきた。種々のタンパク質形態のＩＬ−１３、および種々の形態のＩＬ−１３活性をコードするＤＮＡは、ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３５（１９９３）；Ｍｉｎｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２４８（１９９３）；およびＡｖｅｒｓａら、特許文献１に記載される。従って、用語「ＩＬ−１３」は、組換え遺伝的操作技術によって産生されるか；天然にこれらの因子を産生するかまたは他の因子を有して誘導される際に細胞供給源から精製されるか；化学技術によって合成されるか；または前述の組換え体であるか、これらのドキュメントに記載された配列および／または生物学的活性を有するタンパク質を含む。
【０００４】
ＩＬ−１３は、以下を含む、いくつかの生物学的活性の産生において関係してきたサイトカインである：ヒト未熟Ｂ細胞に含まれるＩｇＧ４およびＩｇＥ切り替えの誘導（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１０９４（１９９４）；生殖細胞系ＩｇＥ重鎖（ε）転写の誘導および正常ヒトＢ細胞におけるＣＤ２３発現（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３０（１９９３））；ならびにＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０ｍＡｂの存在下でのＢ細胞増殖の誘導（Ｃｏｃｋｓら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６５７（１９９３））。ＩＬ−１３の多くの活性がＩＬ−４の活性に類似するにもかかわらず、ＩＬ−４とは対照的に、ＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞またはＴ細胞クローンに成長促進効果を有さない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２６６３（１９９３））。
【０００５】
ほとんどのサイトカインのように、ＩＬ−１３は、標的細胞の表面上のＩＬ−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）と相互作用することによって、特定の生物学的活性を示す。ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−４レセプター（「ＩＬ−４」）は、レセプターの活性化に要求される共通の成分を共有する；しかし、ＩＬ−１３は、１３０ｋＤのＩＬ−４Ｒをトランスフェクトした細胞に結合しない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、前出）。従って、ＩＬ−１３Ｒは、少なくとも１つの他のリガンド結合鎖を含み得る。サイトカインレセプターは、共通して２つまたは３つの鎖から構成される。ＩＬ−１３に対する１つのリガンド結合鎖のクローニングは、最近報告された（Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４９７−５０１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９４／０４６８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＩＬ−１３Ｒの任意の他のＩＬ−１３結合鎖の配列を同定しかつクローニングすることが所望され、その結果、ＩＬ−１３タンパク質は、治療剤の産生ならびにレセプターに結合するＩＬ−１３のインヒビターのスクリーニングならびにレセプターシグナリングを含む、種々の理由のために産生され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明に関して、マウスおよびヒトのレセプターから限定されないものを含むインターロイキン−１３レセプターのＩＬ−１３結合鎖をコードするポリヌクレオチドを、開示する。特定の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝コードの縮重の結果として（ａ）または（ｂ）に特定されるヌクレオチド配列の配列から変動するヌクレオチド配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）に特定されるヌクレオチドにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）に特定される配列の種ホモログをコードするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）または（ｂ）に特定されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＩＬ−１３レセプターの生物学的活性を有するタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結され得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは以下を含む：配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド３１９〜ヌクレオチド１２５７のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド１３２４〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１７８〜ヌクレオチド１１２５のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１１８９〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として、（ａ）または（ｂ）にて特定されるヌクレオチド配列の配列から変化する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）にて特定されるヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、ヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）にて特定される配列の種ホモログをコードする、ヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）または（ｂ）にて特定されるヌクレオチド配列の、対立遺伝子改変体、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、ＩＬ−１３Ｒ結合鎖の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目３） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結された、ポリヌクレオチド。
（項目４） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド３１９〜ヌクレオチド１２５７のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目５） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド１３２４〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目６） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号３のヌクレオチド１７８〜ヌクレオチド１１２５のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目７） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号３のヌクレオチド１１８９〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目８） 項目３に記載のポリヌクレオチドで形質転換された、宿主細胞。
（項目９） 前記細胞が哺乳動物細胞である、項目８に記載の宿主細胞。
（項目１０） ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を産生するためのプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）項目８に記載の宿主細胞の培養物を適切な培養培地中で増殖させる工程；および
（ｂ）該培養物から該ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を精製する工程、
を包含する、プロセス。
（項目１１） 単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質であって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列：および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（項目１２） 配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１３） 配列番号２のアミノ酸２２〜３３４の配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１４） 配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１５） 配列番号４のアミノ酸２６〜３４１の配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１６） 項目１１に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１７） 項目１０に記載のプロセスに従って産生された、タンパク質。
（項目１８） 項目１１に記載のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む、組成物。
（項目１９） ＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合のインヒビターを同定する方法であって、以下：
（ａ）項目１１に記載のタンパク質をＩＬ−１３またはそのフラグメントと合わせる工程であって、該組合せが第１の結合混合物を形成する、工程；
（ｂ）該タンパク質と該ＩＬ−１３またはフラグメントとの間の結合の量を該第１の結合混合物において測定する工程；
（ｃ）化合物を該タンパク質および該ＩＬ−１３またはフラグメントと合わせて、第２の結合混合物を形成する工程；
（ｄ）該第２の結合混合物における結合の量を測定する工程；ならびに
（ｅ）該第１の結合混合物中の結合の量を該第２の結合混合物中の結合の量と比較する工程、
を包含し、該第２の結合混合物の結合の量の減少が生じる場合に、該化合物がＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害し得る、方法。
（項目２０） 項目１９に記載の方法によって同定される、インヒビター。
（項目２１） 項目２０に記載のインヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目２２） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法であって、該方法は、項目２１に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２３） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法であって、該方法は、項目１６に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法であって、該方法は、項目１８に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２５） 単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２６） 前記アミノ酸配列が融合タンパク質の一部である、項目１１に記載のタンパク質。
（項目２７） Ｆｃフラグメントを含む、項目２６に記載のタンパク質。
（項目２８） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３に関連する状態を処置する方法であって、該方法は、項目１６に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２９） 前記状態がＩｇＥに媒介される状態である、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 項目２９に記載の方法であって、前記状態が、アトピー、アレルギー性状態、喘息、および免疫複合体病からなる群より選択される、方法。
（項目３１） 項目３０に記載の方法であって、前記状態が、狼瘡、腎炎、甲状腺炎、およびグレーヴズ病からなる群より選択される、方法。
（項目３２） ＩＬ−１３活性を増強する方法であって、該方法は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質を項目１１に記載のタンパク質と合わせる工程、およびこのような組合せをＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの少なくとも１つの鎖を発現する細胞と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、前記接触させる工程が、このような組合せの治療的に有効な量を哺乳動物被験体に投与することによって実施される、方法。
（項目３４） 配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目３５） 配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目３６） 配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質をコードする、項目２５に記載のポリヌクレオチド。
（項目３７） 配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質をコードする、項目２５に記載のポリヌクレオチド。
（項目３８） 前記状態が肺の炎症状態である、項目２８に記載の方法。
（項目３９） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３に関連する状態を処置する方法であって、該方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４０） 前記状態がＩｇＥに媒介される状態である、項目３９に記載の方法。
（項目４１） 項目４０に記載の方法であって、前記状態が、アトピー、アレルギー性状態、喘息、および免疫複合体病からなる群より選択される、方法。
（項目４２） 項目４１に記載の方法であって、前記状態が、狼瘡、腎炎、甲状腺炎、およびグレーヴズ病からなる群より選択される、方法。
（項目４３） 項目３９に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体または該抗体のＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３ｂｃとのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３Ｒα１とのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子からなる群より選択される、方法。
（項目４４） 前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が項目１１に記載のタンパク質である、項目４３に記載の方法。
（項目４５） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３ｂｃタンパク質とのＩＬ−１３の相互作用を阻害する方法であって、該方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４６） 項目４５に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体または該抗体のＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３ｂｃとのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３Ｒα１とのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子からなる群より選択される、方法。
（項目４７） 前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が項目１１に記載のタンパク質である、項目４６に記載の方法。
【０００９】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜アミノ酸３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜アミノ酸３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜アミノ酸３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜アミノ酸３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。他の好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜アミノ酸３３１のアミノ酸配列をコードする。
【００１０】
ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）もまた、提供される。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を生成するための、プロセスを提供する。このプロセスは以下を包含する：
（ａ）適切な培養培地中で本発明の宿主細胞の培養物を増殖する工程；および
（ｂ）この培養物からヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質を精製する工程。
【００１２】
本発明はまた、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント
、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたＩＬ−１３ｂｄタンパク質を提供する。
【００１３】
好ましくは、このタンパク質は、以下を含む：配列番号２のアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸２２〜３３４の配列；配列番号４の配列；または配列番号４のアミノ酸２６〜３４１の配列。他の好ましい実施形態では、特定のアミノ酸配列は、融合タンパク質（ＩＬ−１３ｂｃ由来でない、さらなるアミノ酸配列を有する）の部分である。好ましい融合タンパク質は、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント）を含む。特に好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００１５】
本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。
【００１６】
ＩＬ−１３ｂｃレセプターまたはＩL−１３レセプターに結合するＩＬ−１３のインヒビターを同定する方法もまた提供される。これらの方法は、以下を包含する：
（ａ）ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはそのフラグメントをＩＬ−１３またはそのフラグメントと合わせて、この組合せが第１の結合混合物を形成する、工程；
（ｂ）この第１の結合混合物中のこのタンパク質とＩＬ−１３またはフラグメントとの間の結合の量を測定する工程；
（ｃ）化合物をこのタンパク質およびＩＬ−１３またはフラグメントと合わせて、第２の結合混合物を形成する工程；
（ｄ）この第２の結合混合物中の結合の量を測定する工程；ならびに
（ｅ）この第１の結合混合物中の結合の量と、この第２の結合混合物中の結合の量を比較する工程；
ここで、この化合物は、この第２の結合混合物の結合量の低下が生じる場合、ＩＬ−１３がＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターに結合することを阻害し得る。これらの方法により同定されたＩＬ−１３Ｒのインヒビターおよびそれらを含有する薬学的組成物もまた提供される。
【００１７】
哺乳動物被験体において、ＬＩ−１３がＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターに結合することを阻害する方法がまた、開示されている。この方法は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３ｂｃもしくはＩＬ−１３ＲのインヒビターまたはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含有する治療上有効な量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１８】
ＩＬ−１３活性を増強する方法がまた提供される。この方法は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質と請求項１１のタンパク質とを合わせる工程、およびこのような組合せを少なくとも１つのＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの鎖を発現する細胞と接触させる工程を包含する。好ましくは、この接触工程は、このような組合せの治療上有効な量を哺乳動物被験体に投与することにより実行される。
哺乳動物被験体において、ＩＬ−１３関連の状態を処置するためのさらなる方法が提供される。この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む治療上有効な量の組成物を投与する工程を包含する。他の方法が、哺乳動物被験体においてＩＬ−１３のＩＬ−１３ｂｃタンパク質との相互作用を阻害する他の方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む治療上有効な量の組成物を投与する工程を包含する。好ましくは、このアンタゴニストはＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体またはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体またはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体またはそのＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】この図は、以下の実施例４に記載のように、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃへの曝露後の、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１１および偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の写真である。
【図２】インターロイキン−１３のインビボブロックによるアレルゲン誘導性の気道過敏症の逆転。最初の気管内チャレンジの１０日後、ＯＶＡ免疫マウスおよびＰＢＳ免疫マウスを、再度ＯＶＡまたはＰＢＳのいずれかで気管内チャレンジした。第２の抗原チャレンジの−１日目、０日目、＋１日目および＋３日目に、マウスに、腹腔内注射により、ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃ（４００μｇ）または等量のコントロールヒトＩｇＧを与えた。アレルギーの表現型をＰＢＳまたはＯＶＡチャレンジの４日後に評価した。（Ａ）ピーク気道圧における時間統合上昇（ｔｉｍｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｉｓｅ）により規定した、アセチルコリンチャレンジに対する気道高過敏状態（ＡＨＲ）（気道圧時間係数［ＡＰＴＩ］（ｃｍＨ2Ｏ×秒））。（Ｂ）気管支肺胞滲出液の炎症性細胞構成。細胞の異なるパーセンテージはサイトスピン調製物の光学顕微鏡評価により決定した。データは細胞の絶対数で表している。（Ｃ）ＯＶＡ−特異的血清ＩｇＥ濃度。結果は、１群あたり８〜１０動物の平均＋／−ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５は、それぞれのＰＢＳコントロール群と比較した：＊＊Ｐ＜０．０５は、ＯＶＡ／Ｈｕ−Ｉｇ群と比較した（多重比較のためのフィッシャー最小有意差検定をともなうワンウェイＡＮＯＶＡ）。
【図３】気道上皮における粘液含有細胞のアレルゲン駆動性増加に対するＩＬ−１３遮断の効果。肺切片（実験群あたりＮ＝４、１動物あたり４切片）をホルマリン中で固定し、１０μｍ切片に切断し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン、ならびに過ヨウ素酸シッフで染色した。代表的な切片を示す。バーは１００μｍである。ＰＢＳ／Ｈｕ−Ｉｇ：ＰＢＳで免疫し、そしてチャレンジしたコントロールであって、ごく少数の粘液含有細胞を示す。ＯＶＡ／Ｈｕ−Ｉｇ：アレルゲンに誘導された間質炎症細胞の増加および粘液を含有する杯細胞数の増加。ＯＶＡ／ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃ：アレルゲンに誘導された杯細胞粘液産生に対するＩＬ−１３遮断の劇的な阻害効果。
【図４】気道の反応性亢進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）のＩＬ−１３誘導。未処理のマウスに、点滴注入により組換えＩＬ−１３（５μｇ／マウス、５０μｌ容量）またはＰＢＳを毎日与えた。最後の処理の２４時間後、（Ａ）気道の過剰応答性、（Ｂ）ＢＡＬ好酸球レベル、（Ｃ）血清の総ＩｇＥレベル、および（Ｄ）粘液スコア、を決定した。結果は、１群あたり７〜１０匹の動物の平均±ＳＥＭ（垂直方向のバー）である。*Ｐ＜０．０５（ＰＢＳ群と比較）（スチューデントｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の発明者らは、ＩＬ−１３ＲのＩＬ−１３結合鎖（本明細書中以降、「
ＩＬ−１３ｂｃ」）をコードするポリヌクレオチド（マウスおよびヒトのＩＬ−
１３ｂｃをコードするポリヌクレオチドを含むが、限定されない）を初めて同定
し、そして提供した。
【００２１】
配列番号１は、マウスＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配
列を提供する。配列番号２は、アミノ酸１〜２１の推定シグナル配列を含む、レ
セプター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。成熟マウスＩＬ−１３ｂｃは、配列
番号２のアミノ酸２２〜３８３の配列を有すると考えられる。成熟マウスレセプ
ター鎖は、少なくとも３つの異なるドメインを有する：細胞外ドメイン（配列番
号２のおよそアミノ酸２２〜３３４を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号２のお
よそアミノ酸３３５〜３５６を含む）、および細胞内ドメイン（配列番号２のお
よそアミノ酸３５７〜３８３を含む）。
【００２２】
配列番号３は、ヒトＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
を提供する。配列番号４は、アミノ酸１〜２５の推定シグナル配列を含む、レセ
プター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。成熟ヒトＩＬ−１３ｂｃは、配列番号
４のアミノ酸２６〜３８０の配列を有すると考えられる。成熟ヒトレセプター鎖
は、少なくとも３つの異なるドメインを有する：細胞外ドメイン（配列番号４の
およそアミノ酸２６〜３４１を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号４のおよそア
ミノ酸３４２〜３６２を含む）、および細胞内ドメイン（配列番号４のおよそア
ミノ酸３６３〜３８０を含む）。
【００２３】
ヒトＩＬ−１３ｂｃ配列の最初の８１アミノ酸は、「ｙｇ９９ｆ１０．ｒ１
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡクローン ４１６４８ ５」として同定さ
れ、そしてデータベース登録番号Ｒ５２７９５ ｇｂ＿ｅｓｔ２を割り当てられ
た発現配列タグ（ＥＳＴ）の翻訳配列に同一である。コードされるタンパク質を
サイトカインレセプターとして同定するように当業者を導く相同性または配列モ
チーフは、このＥＳＴ配列には存在しない。このデータベースエントリーに対応
するｃＤＮＡクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから公的
に入手可能である。本願の優先日後に、このようなクローンは、出願人より注文
され、そして配列決定された。このようなクローンの配列は、本明細書中で配列
番号３として、出願人により以前に報告された配列であることが決定された。
【００２４】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態もまた、生成され得る。このような可
溶性形態としては、配列番号２のアミノ酸１〜３３４もしくは２２〜３３４、ま
たは配列番号４のアミノ酸１〜３４１もしくは２６〜３４１を含むタンパク質が
挙げられるが、限定されない。ＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態はさらに、好ましく
は室温にて、水溶液に可溶性であることによって特徴付けられる。細胞内ドメイ
ンまたはその一部分のみを含むＩＬ−１３ｂｃタンパク質もまた、生成され得る
。全長よりは短い任意の形態のＩＬ−１３ｂｃが本発明において包含され、そし
て本明細書中ではひとまとめにして、「ＩＬ−１３ｂｃ」または「ＩＬ−１３ｂ
ｃタンパク質」として、全長形態および成熟形態と共に言及される。全長よりは
短いＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、全長ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド（配列番号１または配列番号３）の対応するフラグメントを発
現させることにより生成され得る。これらの対応するポリヌクレオチドフラグメ
ントもまた、本発明の一部である。上記のように改変されたポリヌクレオチドは
、標準的な分子生物学技術（適切な所望される欠失変異体の構築、部位特異的変
異誘発方法、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ
連鎖反応によって、を含む）により作製され得る。
【００２５】
本発明の目的のために、タンパク質は、それが以下の特徴のうちの１つ以上を
保有する場合に、「ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性」を有する：（
１）ＩＬ−１３またはそのフラグメント（好ましくは、その生物学的に活性なフ
ラグメント）を結合する能力；および／または（２）ＩＬ−１３Ｒの第２の非Ｉ
Ｌ−１３結合鎖と相互作用して、ＩＬ−１３ＲへのＩＬ−１３の結合に特徴的な
シグナルを生成する能力。好ましくは、タンパク質によって保有される生物学的
活性は、ＩＬ−１３またはそのフラグメントを結合する能力であり、より好まし
くは、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭのＫDで結合する能力である。特定のタンパ
ク質またはペプチドがこのような活性を有するか否かを決定する方法としては、
本明細書中に提供される実施例に記載の方法が挙げられるが、限定されない。
【００２６】
ＩＬ−１３ｂｃまたはその活性なフラグメント（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質）
は、免疫グロブリンのようなキャリア分子に融合され得る。例えば、ＩＬ−１３
ｂｃの可溶性形態は、「リンカー」配列を通して免疫グロブリンのＦｃ部分に融
合され得る。ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰとの融合タンパク質のような他の
融合タンパク質もまた使用され得る。
【００２７】
本発明はまた、配列番号１または配列番号３に示されるようなヌクレオチド配
列の対立遺伝子改変体、すなわち、配列番号１または配列番号３の単離されたポ
リヌクレオチドの天然に存在する二者択一（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）形態（こ
れもまた、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、好ましくは、ＩＬ−１３ｂｃの生物学的
活性を有するＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードする）を包含する。配列番号１
または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェン
トな条件下（例えば、６５℃にて０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズする単離さ
れたポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を
コードするが、遺伝暗号の縮重が理由で配列番号１または配列番号３に示される
ヌクレオチド配列とは異なる単離されたポリヌクレオチドもまた、本発明によっ
て包含される。点変異または誘導される改変によって引き起こされる、配列番号
１または配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列におけるバリエーション
もまた、本発明に包含される。
【００２８】
本発明はまた、他の動物種（特に、他の哺乳動物種）由来のマウスＩＬ−１３
ｂｃおよびヒトＩＬ−１３ｂｃのホモログをコードするポリヌクレオチドを提供
する。種ホモログは、本明細書中に開示されるマウス配列もしくはヒト配列から
プローブまたはプライマーを作製し、そして適切な種由来のライブラリー（例え
ば、関連する種のＰＢＭＣ、胸腺、または精巣から構築されるライブラリーなど
）をスクリーニングすることにより、同定および単離され得る。
【００２９】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、発現制御配列（例えば、Ｋａｕｆｍ
ａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、４４８５〜４４９０（１
９９１）に開示される、ｐＭＴ２発現ベクターまたはｐＥＤ発現ベクター）に作
動可能に連結され、組換え的にＩＬ−１３ｂｃタンパク質を産生し得る。多数の
適切な発現制御配列が、当該分野において公知である。組換えタンパク質を発現
する一般的な方法もまた公知であり、そしてＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、５３７〜５６６（１９９０）に例示
される。本明細書中で定義する場合には、「作動可能に連結する」とは、連結し
たポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された宿主
細胞によりＩＬ−１３ｂｃタンパク質が発現される様式で、本発明の単離したポ
リヌクレオチドと発現制御配列との間に共有結合を形成するように、酵素的また
は化学的に連結することを意味する。
【００３０】
多くの型の細胞が、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現のために適切な宿主細胞
として作用し得る。機能的なＩＬ−１３ｂｃタンパク質を発現し得る任意の細胞
型が、使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細
胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表
皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形
質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、霊長類組織のインビトロ培養物由
来の細胞株、霊長類体外移植組織、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ
−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｒａｔ２、Ｂａｆ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ−１、ＰＣ
１２、ＭｌｘまたはＣ２Ｃ１２細胞が挙げられる。
【００３１】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、本発明の単離したポリヌクレオチドを、１
つ以上の昆虫発現ベクター内の適切な制御配列に作動可能に連結し、そして昆虫
発現系を使用することによって、産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発
現系のための材料および方法は、キットの形態で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＭａｘＢａｃ（
登録商標）キット）から市販されており、そしてこのような方法は、Ｓｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（
本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、当該分野において周
知である。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶形態もまた、昆虫細胞内で、上述の
ような適切な単離されたポリヌクレオチドを使用して、産生され得る。
【００３２】
あるいは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、酵母のような下等真核生物、または
細菌のような原核生物において、産生され得る。適切な酵母株としては、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、ま
たは異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が挙げられる。適切な細菌株とし
ては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を
発現し得る任意の細菌株が挙げられる。
【００３３】
細菌における発現の結果として、組換えタンパク質を取り込む封入体が形成し
得る。従って、組換えタンパク質のリフォールディングは、活性な物質またはよ
り活性な物質を産生するために、必要とされ得る。正しくフォールディングされ
た異種タンパク質を細菌封入体から得るためのいくつかの方法が、当該分野にお
いて公知である。これらの方法は、一般に、このタンパク質をこの封入体から可
溶化する工程、次いでカオトロピック試薬を使用してこのタンパク質を完全に変
性させる工程を包含する。システイン残基がこのタンパク質の一次アミノ酸配列
に存在する場合には、ジスルフィド結合の正しい形成を可能にする環境（レドッ
クス系）においてこのリフォールディングを達成することが、しばしば必要であ
る。リフォールディングの一般的な方法は、Ｋｏｈｎｏ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
．１８５：１８７〜１９５（１９９０）に開示される。ＥＰ０４３３２２５およ
び同時係属中の出願ＵＳＳＮ０８／１６３，８７７は、他の適切な方法を記載す
る。
【００３４】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物と
して（例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を
含む体細胞または生殖細胞により特徴付けられる、トランスジェニック雌ウシ、
ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの成分として）、発現され得る。
【００３５】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、形質転換した宿主細胞の培養物を、所
望のタンパク質を発現するために必要な培養条件下で増殖させることにより、調
製され得る。次いで、得られる発現タンパク質は、この培養培地または細胞抽出
物から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶形態は、馴化培
地から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の膜結合形態は、発現
する細胞から全膜画分を調製し、そしてこの膜を非イオン性界面活性剤（例えば
、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で抽出することにより、精製され得る。
【００３６】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、当業者に公知の方法を使用して、精製され得る
。例えば、本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィル
タ（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾
過ユニット）を使用して、濃縮され得る。濃縮工程に続いて、この濃縮物は、ゲ
ル濾過媒体のような精製マトリックスに適用され得る。あるいは、陰イオン交換
樹脂（例えば、ペンダントであるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはポ
リエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有するマトリックスまたは基質）が使用され得
る。これらのマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セ
ルロース、またはタンパク質の精製において通常使用される他の型であり得る。
あるいは、陽イオン交換工程が使用され得る。適切な陽イオン交換体としては、
スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが
挙げられる。スルホプロピル基が好ましい（例えば、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（
登録商標）カラム）。培養物上清からのＩＬ−１３ｂｃタンパク質の精製はまた
、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール（登録商標）もしくは
Ｃｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ ３ＧＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のよう
なアフィニティー樹脂を介するか；またはフェニルエーテル、ブチルエーテル、
もしくはプロピルエーテルのような樹脂を使用する、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーによるか；または免疫アフィニティークロマトグラフィーによる、１つ
以上のカラム工程を包含し得る。最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、ペンダントであるメチル基または他の脂肪
族基を有するシリカゲル）を使用する、１つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程が使用さ
れて、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をさらに精製し得る。ＩＬ−１３またはそのフ
ラグメントを含むか、あるいはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含む、
アフィニティーカラムもまた、公知の方法に従う精製において、使用され得る。
上記の精製工程のいくつかまたは全てはまた、様々な組み合わせでまたは他の公
知の方法と共に使用されて、実質的に精製された単離された組換えタンパク質を
提供し得る。好ましくは、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、実質的に他
の哺乳動物タンパク質を含まないように、精製される。
【００３７】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまた使用して、ＩＬ−１３ｂｃもしくは
ＩＬ−１３Ｒに結合し得るか、またはＩＬ−１３もしくはＩＬ−１３ｂｃに対す
るＩＬ−１３の結合（細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれか）を妨げ
る薬剤をスクリーニングし得、従って、本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、
正常な結合およびサイトカイン作用のインヒビター（「ＩＬ−１３Ｒインヒビタ
ー」）として作用し得る。所望の結合タンパク質（固定化または固定化されてい
ない）を使用する結合アッセイは、当該分野において周知であり、そして本発明
のＩＬ−１３ｂｃタンパク質を使用するこの目的のために使用され得る。精製さ
れた細胞ベースのスクリーニングアッセイまたはタンパク質ベースのスクリーニ
ングアッセイ（無細胞）を使用して、そのような薬剤を同定し得る。例えば、Ｉ
Ｌ−１３ｂｃタンパク質を、キャリア上に精製形態において固定化し得、そして
精製されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する結合を、可能性のある阻害剤の存
在下および非存在下において測定し得る。代替的に、適切な結合アッセイは、本
発明の可溶性形態のＩＬ−１３ｂｃを使用する。インヒビターをスクリーニング
し得る系の別の例を、以下の実施例２に記載する。
【００３８】
そのようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物を、ＩＬ−１
３またはそのフラグメントと、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を合わせることによっ
て形成し、そして第１の結合混合液中の結合量（Ｂ0）を測定する。第２の結合
混合液もまた、ＩＬ−１３またはそのフラグメントと、ＩＬ−１３ｂｃタンパク
質と、およびスクリーニングすべき化合物または薬剤とを合わせることによって
形成し、そして第２の結合混合液中の結合量（Ｂ）を測定する。第１および第２
の結合混合液中の結合量を、例えば、Ｂ／Ｂ0比の計算を行うことによって、比
較する。第１の結合混合液と比較した第２の結合混合液中の結合の減少が観察さ
れる場合、化合物または薬剤が、結合を阻害し得ると考えられる。必要に応じて
、ＩＬ−１３Ｒの第２鎖を、結合混合液の一方または両方に添加し得る。結合混
合液の処方および最適化は、当業者のレベル内であり、そのような結合混合物は
また、結合を促進するか、または最適化するのに必要な緩衝液および塩を含み得
、そしてさらなるコントロールアッセイが、本発明のスクリーニングアッセイ中
に含まれ得る。
【００３９】
従って、任意の程度で（好ましくは、少なくとも約１０％まで、より好ましく
は約５０％を超えて）、ＩＬ−１３またはそのフラグメントに対するＩＬ−１３
ｂｃタンパク質の結合活性を減少することが見出された化合物が、同定され、次
に、他の結合アッセイにおいて、およびインビボアッセイにおいてスクリーニン
グされ得る。これらの手段によって、治療剤として適切であり得る、ＩＬ−１３
ｂｃ結合について阻害活性を有する化合物が、同定され得る。
【００４０】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドもまた、
ＩＬ−１３ｂｃ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１３の発現または存在、あるいは、ＩＬ
−１３ｂｃ、ＩＬ−１３ＲまたはＩＬ−１３を発現する細胞の検出のための診断
剤として使用し得る。このタンパク質またはポリヌクレオチドを、このタイプの
材料を使用する診断アッセイのための標準手段におけるそのような目的のために
、使用し得る。適切な方法は、当該分野において周知である。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「ＩＬ−１３Ｒ」とは、ＩＬ−１３ｂｃ、お
よび／または、「ＩＬ−１３α１」もしくは「ＮＲ４」として公知の第２のＩＬ
−１３レセプター鎖をいう（マウスレセプター鎖、Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６、９３：４９７〜５０１：ヒト
レセプター鎖、Ａｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１：２９
２６５〜７０、およびＧａｕｃｈａｔら、Ｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、
２７：９７１〜８を参照のこと）。
【００４２】
ＩＬ−１３ｂｃは、ＩＬ−１３の公知の生物学的活性のメディエーターとして
作用する。結果として、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質（特に、可溶性ＩＬ−１３ｂ
ｃタンパク質）、ＩＬ−１３Ｒインヒビター（すなわち、ＩＬ−１３とＩＬ−１
３Ｒとの相互作用のアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１３Ｒ（特にＩＬ−１３ｂ
ｃに対する抗体またはＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体を含む）およびそのフラグ
メントに対する抗体）、ＩＬ−１３およびそのフラグメントに対する抗体、可溶
性ＩＬ−１３Ｒα１タンパク質、ならびに低分子およびＩＬ−１３とＩＬ−１３
Ｒとの相互作用（ＩＬ−１３ｂｃとの相互作用および／またはＩＬ−１３Ｒα１
との相互作用を含む）の他のインヒビターが、ＩＬ−１３が関係する種々の医学
的状態、またはＩＬ−１３の活性（または活性の欠損）によって生じる種々の医
学的状態（集合的に、「ＩＬ−１３関連状態」）の処置または調節において有用
であり得る。ＩＬ−１３Ｒに結合するＩＬ−４の変異形態もまた、ＩＬ−１３ア
ンタゴニストとして使用され得る（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８、９５：９５４５〜８；Ａｖｅ
ｒｓａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３、１７８：２２１３〜８；およびＧｒ
ｕｎｅｗａｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０：４００４〜９を参
照のこと）。
【００４３】
ＩＬ−１３関連状態としては、限定することなく、Ｉｇ媒介性状態および疾患
、特にＩｇＥ媒介性状態（限定することなく、アトピー、アレルギー性状態、喘
息、免疫複合体病（例えば、狼瘡、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、甲状
腺炎およびグレーヴズ病）が含まれる）；肺の炎症状態；免疫欠損、特に造血性
前駆胞における欠損、またはそれに関する障害；癌および他の疾患が挙げられる
。そのような病理学的状態は、疾患、放射線または薬物への曝露から生じ得、そ
して例えば、白血球減少症、細菌およびウイルス感染、貧血、Ｂ細胞またはＴ細
胞欠損（例えば、骨髄移植後の免疫細胞欠損または造血細胞欠損）を含む。ＩＬ
−１３は、マクロファージ活性化を阻害するので、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は
また、マクロファージ活性化の増強のために有用であり得る（すなわち、ワクチ
ン接種、微生物もしくは細胞内生物、または寄生虫感染の処置）。
【００４４】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質もまた、インビトロおよびインビボにおいてＩＬ−
１３の効果を増強するために使用され得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質
は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質（好ましくはＩＬ−１３）と合わせられ
得、そして生じる組合せを、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの少なくとも１
つの鎖を発現する細胞と接触させ得る（好ましくは、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ
−１３Ｒの全ての鎖、例えばＩＬ−１３Ｒα１）。好ましくは、接触工程は、そ
のような組合せの治療的有効量を、インビボにおいて哺乳動物被験体に投与する
ことによって、実行される。ＩＬ−１３タンパク質とＩＬ−１３ｂｃタンパク質
との確立される前の会合は、適切なシグナル伝達に必要な完全なＩＬ−１３／Ｉ
Ｌ−１３Ｒ複合体の形成を助ける。例えば、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２７０：１３５１（１９９５）によって記載される方法を参照のこと。
【００４５】
細胞から精製されたか、または組換え的に産生された、ＩＬ−１３ｂｃタンパ
ク質およびＩＬ−１３Ｒインヒビターを、薬学的に受容可能なキャリアと組み合
わせた場合、薬学的組成物として使用し得る。そのような組成物は、ＩＬ−１３
ｂｃまたはインヒビターおよびキャリアに加えて、種々の希釈剤、充填材、塩、
緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および他の当該分野において周知の材料を含み得
る。用語「薬学的に受容可能」とは、活性成分の生物学的活性の効力を妨げない
非毒性材料を意味する。キャリアの特徴は、投与の経路に依存する。
【００４６】
本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血
因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、Ｉ
Ｌ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、お
よびエリトロポイエチンを含み得る。薬学的組成物はまた、抗サイトカイン抗体
を含み得る。薬学的組成物は、血栓崩壊性因子または抗血栓因子（例えば、プラ
スミノゲン活性化因子および第ＶＩＩＩ因子を含み得る。薬学的組成物はさらに
、他の抗炎症剤を含み得る。そのようなさらなる因子および／または薬剤を薬学
的組成物中に含めて、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂ
ｃインヒビターとの相乗的作用を生じ得るか、単離されたＩＬ−１３ｂｃまたは
ＩＬ−１３インヒビターによって生じる副作用を最小化し得る。逆に、単離され
たＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを、特定のサイトカイン、
リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊性因子または抗血栓因子、あるいは抗炎
症剤の処方物中に含ませて、そのサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、
血栓崩壊性因子または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の副作用を最小化し得る。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、リポソームの形態であり得、ここで単離されたＩＬ
−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、他の薬学的に受容
可能なキャリアに加えて、両親媒性剤（例えば、ミセル、不溶性単層、液晶、ま
たは水溶液中の層状の層として凝集形態にて存在する脂質）とともに組み合わさ
れている。リポソーム性処方物のために適切な脂質としては、モノグリセリド、
ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸など
が挙げられるがこれらに限定されない。このようなリポソーム性処方物の調製は
、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号
；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号（
これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に開示されるように、当
業者のレベル内である。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」とは、意義のある患者の利
益（例えば、このような状態の症状の緩和、治癒、または治癒の速度における増
加）を示すに十分である、薬学的組成物または方法の各活性成分の総量を意味す
る。単独に投与される、個々の活性成分に適用される場合、この用語は、その成
分単独をいう。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせてか、連
続的にか、または同時に投与されるか否かにかかわらず、治療効果を生じる活性
成分の組み合わせた量をいう。
【００４９】
本発明の処置方法または使用を実施する際に、治療有効量の単離されたＩＬ−
１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、哺乳動物に投与され
る。単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは
、単独または他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因
子を用いる処置）と組み合わされるかのいずれかで、本発明の方法に従って投与
され得る。１以上のサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子と同時投
与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは
、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子または抗血栓崩壊
因子と同時にか、あるいは連続的にかのいずれかで、投与され得る。連続的に投
与される場合、担当医は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩
壊因子または抗血栓崩壊因子との組み合わせで、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質また
はＩＬ−１３ｂｃインヒビターを投与する適切な順番を決定する。
【００５０】
薬学的組成物において使用されるＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３
ｂｃインヒビターの投与、または本発明の方法の実施は、種々の従来の様式（例
えば、経口摂取、吸入、または皮膚注射、皮下注射、もしくは静脈内注射）にお
いて実行され得る。患者への静脈内注射が、好ましい。
【００５１】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが
、経口で投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃイン
ヒビターは、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、またはエリキシル剤の形態である
。錠剤形態にて投与される場合、本発明の薬学的組成物は、固体キャリア（例え
ば、ゼラチンまたはアジュバント）をさらに含み得る。錠剤、カプセル剤、およ
び散剤は、約５〜９５％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃイン
ヒビター、および好ましくは約２５〜９０％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質または
ＩＬ−１３ｂcインヒビターを含む。液体形態にて投与される場合、液体キャリ
ア（例えば、水、石油、動物または植物起源の油（例えば、ピーナッツ油、鉱油
、ダイズ油、もしくはゴマ油）あるいは合成油）が、添加され得る。薬学的組成
物の液体形態は、生理学的生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカリド溶
液、あるいはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール
、またはポリエチレングリコール）をさらに含み得る。液体形態にて投与される
場合、この薬学的組成物は、約０．５〜９０重量％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質
またはＩＬ−１３ｂｃインヒビター、および好ましくは約１〜５０％のＩＬ−１
３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含む。
【００５２】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが
静脈内注射、皮膚注射または皮下注射によって投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃ
タンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、発熱物質陰性の非経口的に受
容可能な水溶液の形態である。このような非経口的に受容可能なタンパク質溶液
の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに関する約束事を有し、これは当業者の範
囲内である。静脈内注射、皮膚注射、または皮下注射のための好ましい薬学的組
成物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターに加えて
、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム液、リンゲル液、デキストロース液
、デキストロースおよび塩化ナトリウム液、乳酸リンゲル液または当該分野にお
いて公知の他のビヒクル）を含むべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安
定化剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加剤を含み得
る。
【００５３】
本発明の薬学的組成物中のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃイ
ンヒビターの量は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに患者が経験し
た以前の処置の性質に依存する。最終的には、担当医は、各々の個々の患者を処
置する、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの量を決
定する。最初に、担当医は、低用量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１
３ｂｃインヒビターを投与し、そして患者の応答を観察する。より高用量のＩＬ
−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、最適な治療効果が
患者に対して得られるまで投与され得、そしてその時点で、この投薬量は、一般
的にさらに増加されない。本発明の方法を実施するために使用される種々の薬学
的組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１００ｍｇのＩＬ−１３ｂｃタ
ンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含むべきであることが意図される
。
【００５４】
本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の持続時間は、各々の個々の患者
の処置される疾患および状態の重篤度、ならびに潜在的特異体質応答に依存して
変動する。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの各々
の適用の持続時間は、１２〜２４時間の連続する静脈内投与の範囲にあることが
意図される。最終的には、担当医は、本発明の薬学的組成物を使用して、静脈内
治療の適切な持続時間を決定する。
【００５５】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、動物を免疫して、ＩＬ−１３ｂｃ
タンパク質と特異的に反応し、かつＩＬ−１３またはそのフラグメントのそのレ
セプターへの結合を阻害し得る、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
を得るために、使用され得る。このような抗体は、免疫原としてＩＬ−１３ｂｃ
全体を使用してか、またはＩＬ−１３ｂｃのフラグメント（例えば、可溶性成熟
ＩＬ−１３ｂｃ）の使用によって得られ得る。ＩＬ−１３ｂｃのより小さなフラ
グメントもまた、動物を免疫するために使用され得る。ペプチド免疫原は、カル
ボキシ末端にシステイン残基をさらに含み得、そしてハプテン（例えば、キーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合体化される。さらなるペプチド
免疫原は、チロシン残基を硫酸化されたチロシン残基と置換することによって作
製され得る。このようなペプチドを合成するための方法は、例えば、Ｒ．Ｐ．Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５．２１４９〜２１
５９（１９６３）；Ｊ．Ｌ．Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
２１１，１０（１９８７）のように、当該分野において公知である。
【００５６】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質に結合している中和抗体または非中和抗体（好まし
くは、モノクローナル抗体）もまた、特定の腫瘍に対して有用な治療であり、そ
してまた、上記の状態の処置に有用であり得る。これらの中和モノクローナル抗
体は、ＩＬ−１３ｂｃに結合しているＩＬ−１３をブロックすることが可能であ
り得る。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
（ＩＬ−１３ｂｃ ｃＤＮＡの単離）
（マウスＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの胸腺から調
製した。二本鎖のヘミメチル化（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ｃＤＮＡを、
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｃＤＮＡ合成キットを使用して、製造業者の使用説明書
に従って調製した。簡潔には、第１鎖を、オリゴＴ−Ｘｈｏプライマーでプライ
ムし、そして第２鎖の合成の後に、ＥｃｏＲＩアダプターを付加して、そしてｃ
ＤＮＡを、ＸｈｏＩで消化して、そして精製した。このｃＤＮＡを、Ｚａｐ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）λベクターのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位
に連結し、そしてＧｉｇａｐａｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージ
ング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、製造業者の使用説明書に従っ
てパッケージングした。１．５×１０6の得られた組換えファージのライブラリ
ーを、製造業者の使用説明書に従って増幅した。このライブラリーを、配列ＫＳ
ＲＣＴＣＣＡＢＫＣＲＣＴＣＣＡ（配列番号５）（Ｋ＝Ｇ＋Ｔ；Ｓ＝Ｃ＋Ｇ；Ｒ
＝Ａ＋Ｇ；Ｂ＝Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）の縮重１７マーオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、記載されるような標準的なＴＭＡＣハイブリダイゼーション条件を使用して
、スクリーニングした（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編集者、Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５、第６．４．３節）。クローンＡ２５を同定し
た。なぜなら、これは、１７マープローブにハイブリダイズしたが、既知の造血
素レセプターから誘導されるプローブにはハイブリダイズしなかったからである
。このクローンを、製造業者の使用説明書により、ＺａｐＥｘｐｒｅｓｓベクタ
ー由来のプラスミド形態において単離し、そしてこのＤＮＡ配列を決定した。こ
のＤＮＡ配列は、造血素レセプターファミリーのうちの新規なメンバーをコード
した。
【００５８】
配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含むクローンＡ２５を、１９９
６年２月２２日に、登録番号６９９９７で、ｐＡ２５ｐＢＫＣＭＶとしてＡＴＣ
Ｃに寄託した。
【００５９】
（ヒトＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
マウスレセプターのヒトホモログの部分的なフラグメントを、マウス配列から
誘導されるオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによって単離した。ｃＤＮＡ
を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得られたヒト精巣ポリＡ＋ＲＮＡから調製した。２７
４塩基対のＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド：
【００６０】
【化１】
を用いるＰＣＲによって、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を
使用して、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１×Ｔａｑ緩衝液中での３０サイクル
のインキュベーション（９４℃×１分、４２℃で１分、および７２℃で１分）に
より、このｃＤＮＡから増幅した。このフラグメントのＤＮＡ配列を決定し、そ
して２つのオリゴヌクレオチドを、以下の配列：
【００６１】
【化２】
を有するこのフラグメントの内部部分から調製した。これらのオリゴヌクレオチ
ドをプローブとして使用して、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（カタログ番号ＨＬ１１６１）
から購入したヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。フィルター
を、標準的な５×ＳＳＣハイブリダイゼーション条件を使用して、５２℃でハイ
ブリダイズさせ、そして２×ＳＳＣにおいて５２℃にて洗浄した。４００，００
０個のクローンのスクリーニングにおいて、両方のオリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズする２２個のクローンを単離した。ＤＮＡ配列を、これらのｃＤＮＡク
ローンのうちの４つから決定し、そして全ては、同じ新規の造血素レセプターを
コードしていた。全長ヒトレセプター鎖の推定ＤＮＡ配列を、配列番号３として
示す。
【００６２】
ヒトクローンを、１９９６年２月２２日に登録番号６９９９８で、ｐｈＡ２５
♯１１ｐＤＲ２としてＡＴＣＣに寄託した。
【００６３】
（実施例２）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現および活性のアッセイ）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの産生および精製）
マウスＩＬ−１３ｂｃの細胞外ドメインのアミノ酸１〜３３１をコードするＤ
ＮＡを、ＰＣＲによって、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙをコードするスペーサー配列
に融合し、そしてＣＯＳ−１発現ベクターｐＥＤ ＦｃのヒトＩｇＧ１のヒンジ
ＣＨ２ ＣＨ３領域をコードする配列とインフレームに連結した。ＩＬ−１３ｂ
ｃ−Ｉｇを、ＤＥＡＥデキストランでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から
産生し、そしてプロテインＡセファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を介して精製した。
【００６４】
（Ｂ９増殖アッセイ）
ＩＬ−１３またはＩＬ−４に応答するＢ９細胞（Ａａｒｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７．１７：１４１１〜１４１６）の増殖の刺激を、Ｄ
ＮＡへの３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。細胞（５×１０３／ウェル
）を、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ（１μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、種々の
濃度の増殖因子を含む培地を有する９６ウェルプレートに播種した。３日間のイ
ンキュベーションの後に、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加し、そして
細胞を、さらに４時間インキュベートした。放射能の取り込みを、ＬＫＢ １２
０５Ｐｌａｔｅリーダーを使用して決定した。
【００６５】
Ｂ９細胞株は、ＩＬ−１３、ＩＬ−４またはＩＬ−６に応答して増殖した。Ｉ
Ｌ−１３への応答のみが、可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇによって阻害された。こ
のことは、このレセプターがＩＬ−１３を特異的に結合するが、ＩＬ−４または
ＩＬ−６を特異的に結合しないことを示した。表は、ｃｐｍを示す。２つの別々
の実験を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
（実施例３）
（表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）により測定される、ＩＬ−１３
への可溶性ＩＬ−１３ｂｃの直接的な結合）
Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサを使用して、精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇへ
のＩＬ−１３の直接的な特異的結合を測定した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｊｏｈｎ
ｓｓｏｎら、１９９１）。およそ１０，０００〜１７，０００の共鳴単位（ＲＵ
）の精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ、ヒトＩｇＧ１または関連のないレセプタ
ーを、製造業者により推奨されるように、センサチップ上の異なるフローセルに
各々共有結合的に固定した。（ＲＵは、センサチップ表面に結合したタンパク質
の質量を反映する。）精製されたＩＬ−１３を、過剰の精製されたＩＬ−１３ｂ
ｃ−Ｉｇの存在または非存在下で、５μｌ／分で１０分間、フローセルを横切っ
て注入した。結合を、サンプル注入の前および後のＲＵにおける差異として定量
した。４８１．９ＲＵの特異的ＩＬ−１３結合は、固定化したＩＬ−１３ｂｃ−
Ｉｇについてのみ観察された。一方、ＩＬ−１３およびＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの
同時注入は、固定化されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇへの結合を全く生じなかった（
４ＲＵ）。ＩＬ−１３結合は、固定化されたＩｇＧまたはＩＬ−１１Ｒ−Ｉｇの
いずれについても全く観察されなかった（それぞれ、５．４ＲＵおよび３．７Ｒ
Ｕ）。
【００６８】
【表３】
（実施例４）
（ＣＯＳ細胞において発現されたＩＬ−１３の、標識されたＩＬ−１３ＢＣ−
Ｉｇ融合タンパク質への結合）
（ＩＬ−１３ｂｃ−ＦｃによるＩＬ−１３のＣＯＳインサイチュ検出）
ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１についての発現ベクター、または空のベク
ターを、ＤＥＡＥデキストラン方法を介して、二連のプレート中のＣＯＳ−１細
胞へとトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞をリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて２回洗浄し、そしてメタノールにより、４℃で
１０分間培養皿にて固定化した。固定化の後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次
いで結合緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）、１１％（ｗ／
ｖ）アジ化ナトリウム）で１回リンスし、そして１．０μｇ／ｍｌのＩＬ−１３
ｂｃ−Ｆｃまたは関連する抗サイトカイン抗血清を含む結合緩衝液中で、４℃で
２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして結合緩衝液中
に１：５００で希釈したアルカリホスファターゼ標識化ウサギＦ（ａｂ）２’抗
ヒトＩｇＧ（Ｆｃ融合物検出のため）またはウサギＦ（ａｂ）２’抗ラットＩｇ
Ｇ（抗サイトカイン検出のため）中で、振盪しながら、４℃でインキュベートし
た。細胞を再度、ＰＢＳで２回洗浄した。アルカリホスファターゼ活性を、ニト
ロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホス
フェートを使用して可視化した。
【００６９】
特異的結合を、顕微鏡下で可視化した。ＩＬ−１３でトランスフェクトした細
胞のみが、ＩＬ１３ｂｃ−Ｉｇへの特異的結合を示した。（トランスフェクトさ
れた細胞の写真を参照のこと、図）。
【００７０】
（実施例５）
（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の生物学的活性の決定のための他の系）
他の系が、特異的ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が本明細書中に規定されるような
ＩＬ−１３ｂｃの「生物学的活性」を示すか否かを決定するために使用され得る
。以下は、このような系の例である。
【００７１】
（ＩＬ−１３結合についてのアッセイ）
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質がＩＬ−１３またはそのフラグメントに結合する能
力は、このような結合を検出し得る任意の適切なアッセイによって決定され得る
。いくつかの適切な例は、以下である。
【００７２】
ＩＬ−１３の、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の細胞外領域への結合は、レセプタ
ータンパク質上のホスホチロシンの迅速な誘導を特異的に引き起こす。リン酸化
の誘導によって測定されるようなリガンド結合活性についてのアッセイを、以下
に記載する。
【００７３】
あるいは、（例えば、細胞外ドメインの可溶化形態のような）ＩＬ−１３ｂｃ
タンパク質を、産生および使用してＩＬ−１３結合を検出する。例えば、その細
胞外ドメイン（推定膜貫通ドメインの前（好ましくは、直前）で切断された）が
、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）γ１のヒンジＣH２ドメインおよびヒンジＣH３ド
メインをコードするｃＤＮＡにインフレームで連結される、ｃＤＮＡ構築物を調
製する。この構築物を、ＣＯＳ細胞（例えば、ｐＥＤΔＣまたはｐＭＴ２）につ
いての適切な発現ベクター中に生成する。このプラスミドを、ＣＯＳ細胞に一過
的にトランスフェクトする。分泌されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を
、馴化培地中で収集し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーによって精製す
る。
【００７４】
この精製ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を使用して、多くの適用におい
て、ＩＬ−１３結合を実証する。ＩＬ−１３を酵素連結イムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）プレートの表面上にコートし得、次いで、さらなる結合部位を
、標準的なＥＬＩＳＡ緩衝液を使用してウシ血清アルブミンまたはカゼインでブ
ロックし得る。次いで、ＩＬ−１３−ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を、固相ＩＬ−
１３に結合し、そして結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した二次
ヤギ抗ヒトＩｇで検出する。特異的に結合された酵素の活性を、比色基質（例え
ば、テトラメチルベンジジン）および吸光度の読み取りを用いて測定し得る。
【００７５】
ＩＬ−１３はまた、例えば、膜貫通ドメインまたはグルコシルホスファチジル
イノシトール（ＧＰＩ）結合を提供することによって、細胞の表面上に発現させ
得る。膜結合ＩＬ−１３を発現する細胞を、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク
質を使用して同定し得る。可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合体は、これらの細胞
の表面に結合され、そして蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネー
ト）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇおよびフローサイトメトリーを用いて検出す
る。
【００７６】
（相互作用捕捉）
酵母遺伝子選択方法「相互作用捕捉」［Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７
９１−８０３、１９９３］を使用して、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、本明細書
中に定義されるようなＩＬ−１３ｂｃの生物学的活性を有するか否かを決定し得
る。この系において、ＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺの
両方からのレポーター遺伝子の発現は、ベイト（餌）タンパク質（例えば、この
場合において、ヒトＩＬ−１３ｂｃと相互作用する種）とプレイ（捕食）（例え
ば、この場合において、ヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質）との間の相互作用に依
存する。従って、Ｌｅｕ２発現またはＬａｃＺ発現のレベルによって相互作用の
強度を測定し得る。最も単純な方法は、ＬａｃＺコードタンパク質であるβ−ガ
ラクトシダーゼの活性を測定することである。この活性は、Ｘ−ｇａｌを含有す
る培地またはフィルター上の青色度によって判断され得る。β−ガラクトシダー
ゼ活性の定量測定について、標準的なアッセイは、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙ
ｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９０（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｆ．，およびＨ
ｉｅｔｅｒ，Ｐ．による）に見出され得る。
【００７７】
このような方法において、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が（例えば、ＩＬ−１３
ｂｃの細胞内ドメインにインビボで結合する細胞質タンパク質のような）特定の
種と相互作用するか否かを決定することを所望する場合、この種は、相互作用捕
捉における「ベイト」として、「プレイ」として機能する試験されるべきＩＬ−
１３ｂｃタンパク質を用いるか、またはその逆で使用され得る。
【００７８】
（実施例６）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を使用する喘息の処置）
アレルギー性喘息のよく特徴付けられたマウスモデルを使用する。このマウス
モデルにおいて、アレルゲン曝露は、気道応答性亢進（「ＡＨＲ」）、肺好酸球
増加症、抗原特異的血清ＩｇＥレベルの上昇、および気道内皮粘膜含量の増加を
導く（３、１１）。雄性Ａ／Ｊマウスを、可溶性オボアルブミン（ＯＶＡ）で腹
腔内免疫し、そして引き続き気管内でチャレンジし、そのアレルギー性表現型を
、抗原チャレンジ後４日目に評価した（１３）。ＩＬ−１３の遮断を、後の気管
内アレルゲンチャレンジの２４時間前に、可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−ＩｇＧＦｃ融
合タンパク質（ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃ）（ＩＬ−１３に特異的に結合し結合し
そしてそれを中和する）の全身投与によって行った（１４）。アレルゲン免疫マ
ウスのチャレンジは、アセチルコリンに対する気道応答性の有意な増加を生じた
（１５）（図２Ａ）。ＩＬ−１３の遮断は、このような樹立されたアレルゲン誘
導性ＡＨＲの完全な逆転を生じ；従って、ＩＬ−１３は、このモデルにおけるＡ
ＨＲの発現に必要である。アレルギー性喘息の表現型の完全な発生後の、ＩＬ−
１３の消失がＡＨＲを逆転する能力は、ＩＬ−４消失がこのような逆転を達成す
る能力がないことと対照する。アレルゲン誘導性ＡＨＲの逆転におけるＩＬ−４
Ｒαの遮断の効果の根底にある機構は、ＩＬ−１３−媒介性プロセスの阻害であ
り得、これは、Ｓｔａｔ６活性化が、両方のサイトカインについてのＩＬ−４Ｒ
α媒介性シグナル伝達の下流にあるという事実に一致する。ＩＬ−１３は、おそ
らく、アレルゲン誘導性ＡＨＲを担う主要なＣＤ４＋Ｔ細胞誘導性因子である。
【００７９】
ＡＨＲのＩＬ−１３依存性発現の根底をなす候補機構を評価するために、本発
明者らは、公知のアレルギー性エフェクターカスケードを特徴付けた。好酸球は
、喘息および喘息性ＡＨＲにおける主要なエフェクター細胞として関与している
（１６）。しかし、抗原誘発を繰り返す前のＩＬ−１３の阻害は、アレルゲン誘
導性肺好酸球増加症に有意に影響しない（１７）（図２Ｂ）。ＩｇＥ媒介経路の
関連性を評価するために、本発明者らＯＶＡ特異的血清ＩｇＥを測定した（１８
）。ＩｇＥのＯＶＡ特異的レベルを、ＯＶＡ感作マウスおよびＯＶＡチャレンジ
マウスにおいて観察したが、ＰＢＳ免疫マウスおよびＰＢＳチャレンジマウスに
おいては、抗原特異的抗体レベルは検出されなかった（図２Ｃ）。ＩＬ−１３の
隔離は、ＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルを変更せず、その抑制の欠失は、ＩＬ−１３
隔離が、最初の抗原プライミングおよび抗体形成後に生じるという事実に起因す
るであろう。にもかかわらず、これらの結果は、ＡＨＲが、このモデルにおける
ＩｇＥ産生に依存しないことを示し、これは、アレルギー性ＡＨＲがＩｇＥ欠損
およびＢ細胞欠損マウスにおいて通常発生するという報告（１９）と一致する。
【００８０】
ヒト喘息の病理に一致して、マウスモデルにおけるアレルギー性喘息は、気道
上皮の粘膜含量の顕著な増加に関連する（５、１１）。粘膜の過分泌は、急性喘
息性発作で死亡する患者の剖検標本に特に顕著である（２０）。ＩＬ−１３の遮
断は、気道における粘膜含有細胞のアレルギー誘導性の増加を逆転し（図３）、
これは、気道粘膜含量のアレルギー誘導性の増加が、ＩＬ−１３に依存すること
を実証する。ＩＬ−４はまた、ＩＬ−４トランスジェニックマウスが、抗体感作
の非存在下で顕著な杯細胞過形成を示すように、このプロセスに関与する（５）
。しかし、ＩＬ４欠損マウスおよびコントロールマウスの両方に由来のＴｈ２ク
ローンの、マウス気道への移入は、粘膜の過剰産生を誘導する（２１）。このこ
とは、また、ＩＬ−４の免疫調節性の役割が、エフェクター分子としてのその役
割と綿密に区別されることを必要とすることを示唆する。
【００８１】
未処置（免疫していない）マウスの気道への組換えＩＬ−１３（ｒＩＬ−１３
）の毎日の投与が、ＡＨＲを誘導し、これは、ＩＬ−１３活性の増加が、ＡＨＲ
を誘導するに十分であったことを実証する（図４Ａ）（２２）。ＡＨＲは、ｒＩ
Ｌ−１３投与開始後７２時間までに発症する。好酸球の気管支肺胞洗浄液への有
意な流入が、ｒＩＬ−１３投与後早期に観察されたが、肺好酸球は、ＡＨＲの発
現時点で観察されなかった（図４Ｂ）。好酸球流入の時間経過の重要性は不明な
ままであるが、これは、ＩＬ−１３単独が、おそらく、ケモカイン発現を上方調
節するその能力によって、気道の好酸球浸潤を開始するのに十分であることを示
唆する。ｒＩＬ−１３の気道投与はまた、全血清ＩｇＥ合成の時間依存性の増加
を生じ（図４Ｃ）（２４）、これは、ＩＬ−１３がＩｇＥ合成を調節する、以前
に報告された能力に一致する。血清ＩｇＥの増加は、アレルゲンでの任意の免疫
に非依存的であり、これは、ヒト喘息の表現型が、アレルゲン特異的よりもむし
ろ、全量の血清ＩｇＥ濃度により良好に相関するという観察（２６）との共鳴を
見出す。上記ＩＬ−１３阻害研究から予測されるように、ｒＩＬ−１３の投与は
、気道粘膜産生の増加を誘導した（図４Ｄ）（２７）。
【００８２】
参考文献および注記
【００８３】
【表４】
１３． ６週齢雄性Ａ／Ｊマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒｔ，ＭＥ）から入手し、実験期間中、環境制御し
た特定病原体除去動物施設中で、層流フード下で飼育した（Ｎ＝４〜１０マウス
／実験群）。この研究は、動物の実験使用に関する、ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗ
ｅｌｆａｒｅ Ａｃｔおよびｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔ
ｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ（Ｎ．Ｉ．Ｈ．）ガイドライ
ンによって概略される実験室動物研究についての原則に従って、本明細書に報告
した。マウスを、０．２ｍｌＰＢＳ中の１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ；Ｃ
ｒｕｄｅグレードＩＶ、Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＰＢＳ単
独の腹腔内注射によって免疫した。免疫後１４日目に、マウスを、ケタミンおよ
びキシラジン（それぞれ、４５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔
し、そして５０μｌのＯＶＡの１．５％溶液またはコントロールとして等価量Ｐ
ＢＳを気管内でチャレンジした。この最初の抗原チャレンジ後１０日目に、マウ
スを、ＯＶＡまたはＰＢＳのいずれかで再度、気管内でチャレンジした。そのア
レルギー性表現型の特徴付けを、第２の抗原チャレンジ後９６時間で行った。
１４．ヒトＩＬ−１３ｂｃを上記のようにクローン化した。マウスホモログの可
溶性発現のために、ヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２／ＣＨ３領域とインフレームで
融合させた、マウスｓＩＬ−１３ｂｃ細胞外ドメイン（先の実施例で記載される
ような）をコードするＤＮＡを含むｐＥＤ発現ベクターを、ＨＣＯ細胞にトラン
スフェクトした［Ｄ．Ｄ．Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１
，２３１７（１９９８）］。ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃを、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ［Ｊ．Ｆ．Ｕｒｂａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８、２５５
（１９９８）］で精製した。Ｂ９増殖アッセイにおいて３ｎｇ／ｍｌのマウスＩ
Ｌ−１３を中和する能力によって決定されるように、インビトロＩＤ50は、約１
０ｎｇ／ｍｌであった。ヒトＩｇＧ（ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃのコントロールと
して使用した）を、ヒト免疫グロブリンの１０％溶液（これは、静脈内投与のた
めに市販されている（Ｍｉｌｅｓ）（同書））からｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって同様に精製した。マウスに、ｓＩＬ
−１３ｂｃ−Ｆｃ（４００μｇ）または等量のコントロールＨｕ−ＩｇＧを、腹
腔内注射によって、二次抗原チャレンジの−１日目、０日目、＋１日目および＋
３日目に与えた。
１５．アセチルコリンの静脈内投与に対する気道応答性を、最後の気道内チャレ
ンジの３日後に測定した（１１）。マウスを、ペントバルビタールナトリウム（
９０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、インキュベートし、定常の気道の一回換気量（０．
２ｍｌ）で１２０呼吸／分の速度で喚起し、そしてデカメトニウムブロミド（２
５ｍｇ／ｋｇ）で麻痺させた。安定な気道内圧の確立後、アセチルコリンを、静
脈内注射（５０μｇ／ｋｇ）し、そして動的気道内圧を、５分間追跡した。
１６．Ｇ．Ｊ．Ｇｌｅｉｃｈ，Ｊ．Ａｌｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，４
２２（１９９０）。
１７．気管支肺胞洗浄を、上記（１１）のように行った。
１８．腎臓を切除し、そしてプールした血液を、上記（１１）のような抗体分析
のために収集した。血清を遠心分離で分離し、そして分析まで−８０℃で保存し
た。血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サ
ンプルウェルを、ＰＢＳ中の０．０１％ＯＶＡ溶液でコートし、ＰＢＳ中の１０
％ＦＢＳでブロックし、そしてＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄
した。血清サンプルを、ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳで１：１０および１：１００に
希釈した。一晩のインキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そしてビオチン結合体化抗マウスＩｇＥ（Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加した。洗浄後、１０％ＦＢＳ
／ＰＢＳ中の０．００２５ｍｇ／ｍｌアビジンペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）
を添加し、プレートを、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ｄｉｄ［３−メチル−ベ
ンズチアゾンサルフェート］）（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ）で発
色させた。プレートを、４０５ｎｍで３０分間読み取った。報告されたＯＤ値は
、１：１０希釈された血清サンプルの値である。なぜなら、この値は、１０％Ｆ
ＢＳ／ＰＢＳで１：１００希釈した血清サンプルのＯ．Ｄ．値と比較によるアッ
セイの飽和点以下であることがわかったからである。
【００８４】
【表５】
２２．ミツバチメルチンリーダーをコードするＤＮＡ［Ｄ．Ｃ．Ｔｅｓｓｉｅｒ
，Ｄ．Ｙ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｅ．Ｋｈｏｕｒｉ，Ｆ．Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ，Ｔ
．Ｖｅｒｎｅｔ，Ｇｅｎｅ ２．１７７（１９９１）］およびそれに続く６個の
ヒスチジンタグを、エンテロキナーゼ切断部位によって、マウスＩＬ−１３の成
熟領域に対してＧｌｙ２１で融合し、そして哺乳動物発現ベクターｐＨＴｏｐに
構築した。Ｈ６−ＥＫマウスＩＬ−１３タンパク質を、安定にトランスフェクト
されたＣＨＯ細胞から産生し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって決定されるように、９７％より高い純度に精製した。タン
パク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度によって測定し、そしてエンドトキシン混
入は、Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＬＡＬアッセイによって測定
されるように、３０ＥＵ／ｍｇ未満であった。Ｂａ／Ｆ３ ＩＬ−１３Ｒ１増殖
アッセイによって決定されるように、Ｈ６−ＥＫマウスＩＬ−１３のＥＤ50は、
１ｎｇ／ｍｌであった。マウスｒＩＬ−１３（５０μｌの総量中５μｇ）を、ケ
タミンおよびキシラジン（それぞれ、４５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）の混
合物で麻酔した未処置マウスに、気管内滴下によって毎日投与した。
２３．Ｍ．Ｇｏｅｂｅｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ，９１，４５０（１９９７）。
２４．マウスＩｇＥ特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入
手したマウスＩｇＥに対する補体抗体対（Ｒ３５−７２およびＲ３５−９２）を
製造業者の説明に従って用いて、血清中の総ＩｇＥ免疫グロブリンレベルを定量
した。２連のサンプル（ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳにおける１／１０希釈）を、各
動物から試験した。サンプルのＯ．Ｄ．の読み取りを、既知濃度の組換えマウス
ＩｇＥ（５〜２０００ｐｇ／ｍｌ）で作製した標準曲線から得られた値を使用し
て、ｐｇ／ｍｌに変換し、そして最終濃度を、希釈係数によって乗算することに
よって得た。
２５．Ｃ．Ｌ．Ｅｍｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．Ｂｅｌｌ，Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｗ．Ｗｉｓｄ
ｅｎ，Ａ．Ｎ．Ｊ．Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１８８，３９９（
１９９８）。
２６．Ｌ．Ｒ．Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ，Ｄ．Ｇ．Ｍａｒｓｈ、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．
Ａｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００，３５５（１９９３）。
２７．ｒＩＬ−１３の気道上皮の粘膜細胞含量に対する効果を試験するために、
肺を切除し、１０％ホルマリンに固定化した。次いで、これらを、７０％エタノ
ール中で洗浄し、脱水し、グリコールメタクリレート中に包理し、１０μＭ切片
に切断し、スライド上にマウントし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンおよ
び過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆで染色した。４つの切片を、１動物あたりで試験しし
：肺の１切片あたり４つの領域をスコア付けした。切片を、１〜４のスケールで
スコア付けし、１は、粘膜細胞含量がないことを表す。
【００８５】
【表６】
本明細書中に引用される全ての特許および学術文献は、完全に示されるように
参考として援用される。
【００８６】
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９７年４月３０日に出願された一部継続出願仮番号０８／８４１，７５１であり、これは、１９９６年３月１日に出願された出願仮番号０８／６０９，５７２の分割出願である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＩＬ−１３に対するアフィニティを有する哺乳動物サイトカインレセプタータンパク質（ヒトおよびマウスのレセプタータンパク質に限定されないものを含む）、そのフラグメントおよび組換えポリヌクレオチド、ならびにこのようなタンパク質を発現するために有用な細胞に関する。
【０００３】
（発明の背景）
サイトカインとして公知の種々の調節分子は、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含め、同定されてきた。種々のタンパク質形態のＩＬ−１３、および種々の形態のＩＬ−１３活性をコードするＤＮＡは、ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３５（１９９３）；Ｍｉｎｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２４８（１９９３）；およびＡｖｅｒｓａら、特許文献１に記載される。従って、用語「ＩＬ−１３」は、組換え遺伝的操作技術によって産生されるか；天然にこれらの因子を産生するかまたは他の因子を有して誘導される際に細胞供給源から精製されるか；化学技術によって合成されるか；または前述の組換え体であるか、これらのドキュメントに記載された配列および／または生物学的活性を有するタンパク質を含む。
【０００４】
ＩＬ−１３は、以下を含む、いくつかの生物学的活性の産生において関係してきたサイトカインである：ヒト未熟Ｂ細胞に含まれるＩｇＧ４およびＩｇＥ切り替えの誘導（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１０９４（１９９４）；生殖細胞系ＩｇＥ重鎖（ε）転写の誘導および正常ヒトＢ細胞におけるＣＤ２３発現（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７３０（１９９３））；ならびにＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０ｍＡｂの存在下でのＢ細胞増殖の誘導（Ｃｏｃｋｓら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６５７（１９９３））。ＩＬ−１３の多くの活性がＩＬ−４の活性に類似するにもかかわらず、ＩＬ−４とは対照的に、ＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞またはＴ細胞クローンに成長促進効果を有さない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２６６３（１９９３））。
【０００５】
ほとんどのサイトカインのように、ＩＬ−１３は、標的細胞の表面上のＩＬ−１３レセプター（「ＩＬ−１３Ｒ」）と相互作用することによって、特定の生物学的活性を示す。ＩＬ−１３ＲおよびＩＬ−４レセプター（「ＩＬ−４」）は、レセプターの活性化に要求される共通の成分を共有する；しかし、ＩＬ−１３は、１３０ｋＤのＩＬ−４Ｒをトランスフェクトした細胞に結合しない（Ｚｕｒａｗｓｋｉら、前出）。従って、ＩＬ−１３Ｒは、少なくとも１つの他のリガンド結合鎖を含み得る。サイトカインレセプターは、共通して２つまたは３つの鎖から構成される。ＩＬ−１３に対する１つのリガンド結合鎖のクローニングは、最近報告された（Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４９７−５０１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９４／０４６８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＩＬ−１３Ｒの任意の他のＩＬ−１３結合鎖の配列を同定しかつクローニングすることが所望され、その結果、ＩＬ−１３タンパク質は、治療剤の産生ならびにレセプターに結合するＩＬ−１３のインヒビターのスクリーニングならびにレセプターシグナリングを含む、種々の理由のために産生され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明に関して、マウスおよびヒトのレセプターから限定されないものを含むインターロイキン−１３レセプターのＩＬ−１３結合鎖をコードするポリヌクレオチドを、開示する。特定の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝コードの縮重の結果として（ａ）または（ｂ）に特定されるヌクレオチド配列の配列から変動するヌクレオチド配列；
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）に特定されるヌクレオチドにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）に特定される配列の種ホモログをコードするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）または（ｂ）に特定されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＩＬ−１３レセプターの生物学的活性を有するタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結され得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは以下を含む：配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド３１９〜ヌクレオチド１２５７のヌクレオチド配列；配列番号１のヌクレオチド１３２４〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１７８〜ヌクレオチド１１２５のヌクレオチド配列；配列番号３のヌクレオチド１１８９〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド２５６〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド１０３〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として、（ａ）または（ｂ）にて特定されるヌクレオチド配列の配列から変化する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）にて特定されるヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、ヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）または（ｂ）にて特定される配列の種ホモログをコードする、ヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）または（ｂ）にて特定されるヌクレオチド配列の、対立遺伝子改変体、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、ＩＬ−１３Ｒ結合鎖の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目３） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結された、ポリヌクレオチド。
（項目４） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド３１９〜ヌクレオチド１２５７のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目５） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド１３２４〜ヌクレオチド１４０４のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目６） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号３のヌクレオチド１７８〜ヌクレオチド１１２５のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目７） 項目１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号３のヌクレオチド１１８９〜ヌクレオチド１２４２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目８） 項目３に記載のポリヌクレオチドで形質転換された、宿主細胞。
（項目９） 前記細胞が哺乳動物細胞である、項目８に記載の宿主細胞。
（項目１０） ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を産生するためのプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）項目８に記載の宿主細胞の培養物を適切な培養培地中で増殖させる工程；および
（ｂ）該培養物から該ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を精製する工程、
を包含する、プロセス。
（項目１１） 単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質であって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列：および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（項目１２） 配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１３） 配列番号２のアミノ酸２２〜３３４の配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１４） 配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１５） 配列番号４のアミノ酸２６〜３４１の配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目１６） 項目１１に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１７） 項目１０に記載のプロセスに従って産生された、タンパク質。
（項目１８） 項目１１に記載のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む、組成物。
（項目１９） ＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合のインヒビターを同定する方法であって、以下：
（ａ）項目１１に記載のタンパク質をＩＬ−１３またはそのフラグメントと合わせる工程であって、該組合せが第１の結合混合物を形成する、工程；
（ｂ）該タンパク質と該ＩＬ−１３またはフラグメントとの間の結合の量を該第１の結合混合物において測定する工程；
（ｃ）化合物を該タンパク質および該ＩＬ−１３またはフラグメントと合わせて、第２の結合混合物を形成する工程；
（ｄ）該第２の結合混合物における結合の量を測定する工程；ならびに
（ｅ）該第１の結合混合物中の結合の量を該第２の結合混合物中の結合の量と比較する工程、
を包含し、該第２の結合混合物の結合の量の減少が生じる場合に、該化合物がＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害し得る、方法。
（項目２０） 項目１９に記載の方法によって同定される、インヒビター。
（項目２１） 項目２０に記載のインヒビターおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目２２） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法であって、該方法は、項目２１に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２３） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法であって、該方法は、項目１６に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３レセプターへのＩＬ−１３の結合を阻害する方法であって、該方法は、項目１８に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２５） 単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２６） 前記アミノ酸配列が融合タンパク質の一部である、項目１１に記載のタンパク質。
（項目２７） Ｆｃフラグメントを含む、項目２６に記載のタンパク質。
（項目２８） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３に関連する状態を処置する方法であって、該方法は、項目１６に記載の組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目２９） 前記状態がＩｇＥに媒介される状態である、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 項目２９に記載の方法であって、前記状態が、アトピー、アレルギー性状態、喘息、および免疫複合体病からなる群より選択される、方法。
（項目３１） 項目３０に記載の方法であって、前記状態が、狼瘡、腎炎、甲状腺炎、およびグレーヴズ病からなる群より選択される、方法。
（項目３２） ＩＬ−１３活性を増強する方法であって、該方法は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質を項目１１に記載のタンパク質と合わせる工程、およびこのような組合せをＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの少なくとも１つの鎖を発現する細胞と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、前記接触させる工程が、このような組合せの治療的に有効な量を哺乳動物被験体に投与することによって実施される、方法。
（項目３４） 配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目３５） 配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載のタンパク質。
（項目３６） 配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質をコードする、項目２５に記載のポリヌクレオチド。
（項目３７） 配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質をコードする、項目２５に記載のポリヌクレオチド。
（項目３８） 前記状態が肺の炎症状態である、項目２８に記載の方法。
（項目３９） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３に関連する状態を処置する方法であって、該方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４０） 前記状態がＩｇＥに媒介される状態である、項目３９に記載の方法。
（項目４１） 項目４０に記載の方法であって、前記状態が、アトピー、アレルギー性状態、喘息、および免疫複合体病からなる群より選択される、方法。
（項目４２） 項目４１に記載の方法であって、前記状態が、狼瘡、腎炎、甲状腺炎、およびグレーヴズ病からなる群より選択される、方法。
（項目４３） 項目３９に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体または該抗体のＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３ｂｃとのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３Ｒα１とのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子からなる群より選択される、方法。
（項目４４） 前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が項目１１に記載のタンパク質である、項目４３に記載の方法。
（項目４５） 哺乳動物被験体においてＩＬ−１３ｂｃタンパク質とのＩＬ−１３の相互作用を阻害する方法であって、該方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
（項目４６） 項目４５に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、以下：ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体または該抗体のＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体または該抗体のＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３ｂｃとのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３Ｒα１とのＩＬ−１３の相互作用を阻害し得る低分子からなる群より選択される、方法。
（項目４７） 前記ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が項目１１に記載のタンパク質である、項目４６に記載の方法。
【０００９】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜アミノ酸３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜アミノ酸３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜アミノ酸３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜アミノ酸３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｆ）のフラグメント。他の好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜アミノ酸３３１のアミノ酸配列をコードする。
【００１０】
ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）もまた、提供される。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を生成するための、プロセスを提供する。このプロセスは以下を包含する：
（ａ）適切な培養培地中で本発明の宿主細胞の培養物を増殖する工程；および
（ｂ）この培養物からヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質を精製する工程。
【００１２】
本発明はまた、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜３３４のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸３５７〜３８３のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸２６〜３４１のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸３６３〜３８０のアミノ酸配列；および
（ｇ）ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性を有する、（ａ）〜（ｆ）のフラグメント
、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたＩＬ−１３ｂｄタンパク質を提供する。
【００１３】
好ましくは、このタンパク質は、以下を含む：配列番号２のアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸２２〜３３４の配列；配列番号４の配列；または配列番号４のアミノ酸２６〜３４１の配列。他の好ましい実施形態では、特定のアミノ酸配列は、融合タンパク質（ＩＬ−１３ｂｃ由来でない、さらなるアミノ酸配列を有する）の部分である。好ましい融合タンパク質は、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント）を含む。特に好ましい実施形態は、配列番号２のアミノ酸１〜３３１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸２６〜３３１のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００１５】
本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。
【００１６】
ＩＬ−１３ｂｃレセプターまたはＩL−１３レセプターに結合するＩＬ−１３のインヒビターを同定する方法もまた提供される。これらの方法は、以下を包含する：
（ａ）ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはそのフラグメントをＩＬ−１３またはそのフラグメントと合わせて、この組合せが第１の結合混合物を形成する、工程；
（ｂ）この第１の結合混合物中のこのタンパク質とＩＬ−１３またはフラグメントとの間の結合の量を測定する工程；
（ｃ）化合物をこのタンパク質およびＩＬ−１３またはフラグメントと合わせて、第２の結合混合物を形成する工程；
（ｄ）この第２の結合混合物中の結合の量を測定する工程；ならびに
（ｅ）この第１の結合混合物中の結合の量と、この第２の結合混合物中の結合の量を比較する工程；
ここで、この化合物は、この第２の結合混合物の結合量の低下が生じる場合、ＩＬ−１３がＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターに結合することを阻害し得る。これらの方法により同定されたＩＬ−１３Ｒのインヒビターおよびそれらを含有する薬学的組成物もまた提供される。
【００１７】
哺乳動物被験体において、ＬＩ−１３がＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３レセプターに結合することを阻害する方法がまた、開示されている。この方法は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３ｂｃもしくはＩＬ−１３ＲのインヒビターまたはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含有する治療上有効な量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１８】
ＩＬ−１３活性を増強する方法がまた提供される。この方法は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質と請求項１１のタンパク質とを合わせる工程、およびこのような組合せを少なくとも１つのＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの鎖を発現する細胞と接触させる工程を包含する。好ましくは、この接触工程は、このような組合せの治療上有効な量を哺乳動物被験体に投与することにより実行される。
哺乳動物被験体において、ＩＬ−１３関連の状態を処置するためのさらなる方法が提供される。この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む治療上有効な量の組成物を投与する工程を包含する。他の方法が、哺乳動物被験体においてＩＬ−１３のＩＬ−１３ｂｃタンパク質との相互作用を阻害する他の方法を提供する。この方法は、ＩＬ−１３アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む治療上有効な量の組成物を投与する工程を包含する。好ましくは、このアンタゴニストはＩＬ−１３ｂｃタンパク質、ＩＬ−１３Ｒα１の可溶性形態、ＩＬ−１３に対する抗体またはそのＩＬ−１３結合フラグメント、ＩＬ−１３ｂｃに対する抗体またはそのＩＬ−１３ｂｃ結合フラグメント、ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体またはそのＩＬ−１３Ｒα１結合フラグメント、ＩＬ−４のＩＬ−１３Ｒ結合変異体、ＩＬ−１３とＩＬ−１３ｂｃとの相互作用を阻害し得る低分子、およびＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒα１との相互作用を阻害し得る低分子からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】この図は、以下の実施例４に記載のように、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃへの曝露後の、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１１および偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の写真である。
【図２】インターロイキン−１３のインビボブロックによるアレルゲン誘導性の気道過敏症の逆転。最初の気管内チャレンジの１０日後、ＯＶＡ免疫マウスおよびＰＢＳ免疫マウスを、再度ＯＶＡまたはＰＢＳのいずれかで気管内チャレンジした。第２の抗原チャレンジの−１日目、０日目、＋１日目および＋３日目に、マウスに、腹腔内注射により、ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃ（４００μｇ）または等量のコントロールヒトＩｇＧを与えた。アレルギーの表現型をＰＢＳまたはＯＶＡチャレンジの４日後に評価した。（Ａ）ピーク気道圧における時間統合上昇（ｔｉｍｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｉｓｅ）により規定した、アセチルコリンチャレンジに対する気道高過敏状態（ＡＨＲ）（気道圧時間係数［ＡＰＴＩ］（ｃｍＨ2Ｏ×秒））。（Ｂ）気管支肺胞滲出液の炎症性細胞構成。細胞の異なるパーセンテージはサイトスピン調製物の光学顕微鏡評価により決定した。データは細胞の絶対数で表している。（Ｃ）ＯＶＡ−特異的血清ＩｇＥ濃度。結果は、１群あたり８〜１０動物の平均＋／−ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５は、それぞれのＰＢＳコントロール群と比較した：＊＊Ｐ＜０．０５は、ＯＶＡ／Ｈｕ−Ｉｇ群と比較した（多重比較のためのフィッシャー最小有意差検定をともなうワンウェイＡＮＯＶＡ）。
【図３】気道上皮における粘液含有細胞のアレルゲン駆動性増加に対するＩＬ−１３遮断の効果。肺切片（実験群あたりＮ＝４、１動物あたり４切片）をホルマリン中で固定し、１０μｍ切片に切断し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン、ならびに過ヨウ素酸シッフで染色した。代表的な切片を示す。バーは１００μｍである。ＰＢＳ／Ｈｕ−Ｉｇ：ＰＢＳで免疫し、そしてチャレンジしたコントロールであって、ごく少数の粘液含有細胞を示す。ＯＶＡ／Ｈｕ−Ｉｇ：アレルゲンに誘導された間質炎症細胞の増加および粘液を含有する杯細胞数の増加。ＯＶＡ／ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃ：アレルゲンに誘導された杯細胞粘液産生に対するＩＬ−１３遮断の劇的な阻害効果。
【図４】気道の反応性亢進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）のＩＬ−１３誘導。未処理のマウスに、点滴注入により組換えＩＬ−１３（５μｇ／マウス、５０μｌ容量）またはＰＢＳを毎日与えた。最後の処理の２４時間後、（Ａ）気道の過剰応答性、（Ｂ）ＢＡＬ好酸球レベル、（Ｃ）血清の総ＩｇＥレベル、および（Ｄ）粘液スコア、を決定した。結果は、１群あたり７〜１０匹の動物の平均±ＳＥＭ（垂直方向のバー）である。*Ｐ＜０．０５（ＰＢＳ群と比較）（スチューデントｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の発明者らは、ＩＬ−１３ＲのＩＬ−１３結合鎖（本明細書中以降、「
ＩＬ−１３ｂｃ」）をコードするポリヌクレオチド（マウスおよびヒトのＩＬ−
１３ｂｃをコードするポリヌクレオチドを含むが、限定されない）を初めて同定
し、そして提供した。
【００２１】
配列番号１は、マウスＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配
列を提供する。配列番号２は、アミノ酸１〜２１の推定シグナル配列を含む、レ
セプター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。成熟マウスＩＬ−１３ｂｃは、配列
番号２のアミノ酸２２〜３８３の配列を有すると考えられる。成熟マウスレセプ
ター鎖は、少なくとも３つの異なるドメインを有する：細胞外ドメイン（配列番
号２のおよそアミノ酸２２〜３３４を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号２のお
よそアミノ酸３３５〜３５６を含む）、および細胞内ドメイン（配列番号２のお
よそアミノ酸３５７〜３８３を含む）。
【００２２】
配列番号３は、ヒトＩＬ−１３ｂｃをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
を提供する。配列番号４は、アミノ酸１〜２５の推定シグナル配列を含む、レセ
プター鎖の推定アミノ酸配列を提供する。成熟ヒトＩＬ−１３ｂｃは、配列番号
４のアミノ酸２６〜３８０の配列を有すると考えられる。成熟ヒトレセプター鎖
は、少なくとも３つの異なるドメインを有する：細胞外ドメイン（配列番号４の
およそアミノ酸２６〜３４１を含む）、膜貫通ドメイン（配列番号４のおよそア
ミノ酸３４２〜３６２を含む）、および細胞内ドメイン（配列番号４のおよそア
ミノ酸３６３〜３８０を含む）。
【００２３】
ヒトＩＬ−１３ｂｃ配列の最初の８１アミノ酸は、「ｙｇ９９ｆ１０．ｒ１
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃＤＮＡクローン ４１６４８ ５」として同定さ
れ、そしてデータベース登録番号Ｒ５２７９５ ｇｂ＿ｅｓｔ２を割り当てられ
た発現配列タグ（ＥＳＴ）の翻訳配列に同一である。コードされるタンパク質を
サイトカインレセプターとして同定するように当業者を導く相同性または配列モ
チーフは、このＥＳＴ配列には存在しない。このデータベースエントリーに対応
するｃＤＮＡクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから公的
に入手可能である。本願の優先日後に、このようなクローンは、出願人より注文
され、そして配列決定された。このようなクローンの配列は、本明細書中で配列
番号３として、出願人により以前に報告された配列であることが決定された。
【００２４】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶性形態もまた、生成され得る。このような可
溶性形態としては、配列番号２のアミノ酸１〜３３４もしくは２２〜３３４、ま
たは配列番号４のアミノ酸１〜３４１もしくは２６〜３４１を含むタンパク質が
挙げられるが、限定されない。ＩＬ−１３ｂｃの可溶性形態はさらに、好ましく
は室温にて、水溶液に可溶性であることによって特徴付けられる。細胞内ドメイ
ンまたはその一部分のみを含むＩＬ−１３ｂｃタンパク質もまた、生成され得る
。全長よりは短い任意の形態のＩＬ−１３ｂｃが本発明において包含され、そし
て本明細書中ではひとまとめにして、「ＩＬ−１３ｂｃ」または「ＩＬ−１３ｂ
ｃタンパク質」として、全長形態および成熟形態と共に言及される。全長よりは
短いＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、全長ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド（配列番号１または配列番号３）の対応するフラグメントを発
現させることにより生成され得る。これらの対応するポリヌクレオチドフラグメ
ントもまた、本発明の一部である。上記のように改変されたポリヌクレオチドは
、標準的な分子生物学技術（適切な所望される欠失変異体の構築、部位特異的変
異誘発方法、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ
連鎖反応によって、を含む）により作製され得る。
【００２５】
本発明の目的のために、タンパク質は、それが以下の特徴のうちの１つ以上を
保有する場合に、「ＩＬ−１３レセプター結合鎖の生物学的活性」を有する：（
１）ＩＬ−１３またはそのフラグメント（好ましくは、その生物学的に活性なフ
ラグメント）を結合する能力；および／または（２）ＩＬ−１３Ｒの第２の非Ｉ
Ｌ−１３結合鎖と相互作用して、ＩＬ−１３ＲへのＩＬ−１３の結合に特徴的な
シグナルを生成する能力。好ましくは、タンパク質によって保有される生物学的
活性は、ＩＬ−１３またはそのフラグメントを結合する能力であり、より好まし
くは、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭのＫDで結合する能力である。特定のタンパ
ク質またはペプチドがこのような活性を有するか否かを決定する方法としては、
本明細書中に提供される実施例に記載の方法が挙げられるが、限定されない。
【００２６】
ＩＬ−１３ｂｃまたはその活性なフラグメント（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質）
は、免疫グロブリンのようなキャリア分子に融合され得る。例えば、ＩＬ−１３
ｂｃの可溶性形態は、「リンカー」配列を通して免疫グロブリンのＦｃ部分に融
合され得る。ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰとの融合タンパク質のような他の
融合タンパク質もまた使用され得る。
【００２７】
本発明はまた、配列番号１または配列番号３に示されるようなヌクレオチド配
列の対立遺伝子改変体、すなわち、配列番号１または配列番号３の単離されたポ
リヌクレオチドの天然に存在する二者択一（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）形態（こ
れもまた、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質、好ましくは、ＩＬ−１３ｂｃの生物学的
活性を有するＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードする）を包含する。配列番号１
または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェン
トな条件下（例えば、６５℃にて０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズする単離さ
れたポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を
コードするが、遺伝暗号の縮重が理由で配列番号１または配列番号３に示される
ヌクレオチド配列とは異なる単離されたポリヌクレオチドもまた、本発明によっ
て包含される。点変異または誘導される改変によって引き起こされる、配列番号
１または配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列におけるバリエーション
もまた、本発明に包含される。
【００２８】
本発明はまた、他の動物種（特に、他の哺乳動物種）由来のマウスＩＬ−１３
ｂｃおよびヒトＩＬ−１３ｂｃのホモログをコードするポリヌクレオチドを提供
する。種ホモログは、本明細書中に開示されるマウス配列もしくはヒト配列から
プローブまたはプライマーを作製し、そして適切な種由来のライブラリー（例え
ば、関連する種のＰＢＭＣ、胸腺、または精巣から構築されるライブラリーなど
）をスクリーニングすることにより、同定および単離され得る。
【００２９】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、発現制御配列（例えば、Ｋａｕｆｍ
ａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、４４８５〜４４９０（１
９９１）に開示される、ｐＭＴ２発現ベクターまたはｐＥＤ発現ベクター）に作
動可能に連結され、組換え的にＩＬ−１３ｂｃタンパク質を産生し得る。多数の
適切な発現制御配列が、当該分野において公知である。組換えタンパク質を発現
する一般的な方法もまた公知であり、そしてＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、５３７〜５６６（１９９０）に例示
される。本明細書中で定義する場合には、「作動可能に連結する」とは、連結し
たポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された宿主
細胞によりＩＬ−１３ｂｃタンパク質が発現される様式で、本発明の単離したポ
リヌクレオチドと発現制御配列との間に共有結合を形成するように、酵素的また
は化学的に連結することを意味する。
【００３０】
多くの型の細胞が、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現のために適切な宿主細胞
として作用し得る。機能的なＩＬ−１３ｂｃタンパク質を発現し得る任意の細胞
型が、使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細
胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表
皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形
質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、霊長類組織のインビトロ培養物由
来の細胞株、霊長類体外移植組織、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ
−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｒａｔ２、Ｂａｆ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ−１、ＰＣ
１２、ＭｌｘまたはＣ２Ｃ１２細胞が挙げられる。
【００３１】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、本発明の単離したポリヌクレオチドを、１
つ以上の昆虫発現ベクター内の適切な制御配列に作動可能に連結し、そして昆虫
発現系を使用することによって、産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発
現系のための材料および方法は、キットの形態で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＭａｘＢａｃ（
登録商標）キット）から市販されており、そしてこのような方法は、Ｓｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（
本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、当該分野において周
知である。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶形態もまた、昆虫細胞内で、上述の
ような適切な単離されたポリヌクレオチドを使用して、産生され得る。
【００３２】
あるいは、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、酵母のような下等真核生物、または
細菌のような原核生物において、産生され得る。適切な酵母株としては、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、ま
たは異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が挙げられる。適切な細菌株とし
ては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を
発現し得る任意の細菌株が挙げられる。
【００３３】
細菌における発現の結果として、組換えタンパク質を取り込む封入体が形成し
得る。従って、組換えタンパク質のリフォールディングは、活性な物質またはよ
り活性な物質を産生するために、必要とされ得る。正しくフォールディングされ
た異種タンパク質を細菌封入体から得るためのいくつかの方法が、当該分野にお
いて公知である。これらの方法は、一般に、このタンパク質をこの封入体から可
溶化する工程、次いでカオトロピック試薬を使用してこのタンパク質を完全に変
性させる工程を包含する。システイン残基がこのタンパク質の一次アミノ酸配列
に存在する場合には、ジスルフィド結合の正しい形成を可能にする環境（レドッ
クス系）においてこのリフォールディングを達成することが、しばしば必要であ
る。リフォールディングの一般的な方法は、Ｋｏｈｎｏ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
．１８５：１８７〜１９５（１９９０）に開示される。ＥＰ０４３３２２５およ
び同時係属中の出願ＵＳＳＮ０８／１６３，８７７は、他の適切な方法を記載す
る。
【００３４】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物と
して（例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を
含む体細胞または生殖細胞により特徴付けられる、トランスジェニック雌ウシ、
ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの成分として）、発現され得る。
【００３５】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、形質転換した宿主細胞の培養物を、所
望のタンパク質を発現するために必要な培養条件下で増殖させることにより、調
製され得る。次いで、得られる発現タンパク質は、この培養培地または細胞抽出
物から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の可溶形態は、馴化培
地から精製され得る。本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質の膜結合形態は、発現
する細胞から全膜画分を調製し、そしてこの膜を非イオン性界面活性剤（例えば
、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で抽出することにより、精製され得る。
【００３６】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、当業者に公知の方法を使用して、精製され得る
。例えば、本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィル
タ（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾
過ユニット）を使用して、濃縮され得る。濃縮工程に続いて、この濃縮物は、ゲ
ル濾過媒体のような精製マトリックスに適用され得る。あるいは、陰イオン交換
樹脂（例えば、ペンダントであるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基またはポ
リエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有するマトリックスまたは基質）が使用され得
る。これらのマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セ
ルロース、またはタンパク質の精製において通常使用される他の型であり得る。
あるいは、陽イオン交換工程が使用され得る。適切な陽イオン交換体としては、
スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが
挙げられる。スルホプロピル基が好ましい（例えば、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（
登録商標）カラム）。培養物上清からのＩＬ−１３ｂｃタンパク質の精製はまた
、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール（登録商標）もしくは
Ｃｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ ３ＧＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のよう
なアフィニティー樹脂を介するか；またはフェニルエーテル、ブチルエーテル、
もしくはプロピルエーテルのような樹脂を使用する、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィーによるか；または免疫アフィニティークロマトグラフィーによる、１つ
以上のカラム工程を包含し得る。最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、ペンダントであるメチル基または他の脂肪
族基を有するシリカゲル）を使用する、１つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程が使用さ
れて、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質をさらに精製し得る。ＩＬ−１３またはそのフ
ラグメントを含むか、あるいはＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する抗体を含む、
アフィニティーカラムもまた、公知の方法に従う精製において、使用され得る。
上記の精製工程のいくつかまたは全てはまた、様々な組み合わせでまたは他の公
知の方法と共に使用されて、実質的に精製された単離された組換えタンパク質を
提供し得る。好ましくは、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、実質的に他
の哺乳動物タンパク質を含まないように、精製される。
【００３７】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質をまた使用して、ＩＬ−１３ｂｃもしくは
ＩＬ−１３Ｒに結合し得るか、またはＩＬ−１３もしくはＩＬ−１３ｂｃに対す
るＩＬ−１３の結合（細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれか）を妨げ
る薬剤をスクリーニングし得、従って、本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質は、
正常な結合およびサイトカイン作用のインヒビター（「ＩＬ−１３Ｒインヒビタ
ー」）として作用し得る。所望の結合タンパク質（固定化または固定化されてい
ない）を使用する結合アッセイは、当該分野において周知であり、そして本発明
のＩＬ−１３ｂｃタンパク質を使用するこの目的のために使用され得る。精製さ
れた細胞ベースのスクリーニングアッセイまたはタンパク質ベースのスクリーニ
ングアッセイ（無細胞）を使用して、そのような薬剤を同定し得る。例えば、Ｉ
Ｌ−１３ｂｃタンパク質を、キャリア上に精製形態において固定化し得、そして
精製されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質に対する結合を、可能性のある阻害剤の存
在下および非存在下において測定し得る。代替的に、適切な結合アッセイは、本
発明の可溶性形態のＩＬ−１３ｂｃを使用する。インヒビターをスクリーニング
し得る系の別の例を、以下の実施例２に記載する。
【００３８】
そのようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物を、ＩＬ−１
３またはそのフラグメントと、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を合わせることによっ
て形成し、そして第１の結合混合液中の結合量（Ｂ0）を測定する。第２の結合
混合液もまた、ＩＬ−１３またはそのフラグメントと、ＩＬ−１３ｂｃタンパク
質と、およびスクリーニングすべき化合物または薬剤とを合わせることによって
形成し、そして第２の結合混合液中の結合量（Ｂ）を測定する。第１および第２
の結合混合液中の結合量を、例えば、Ｂ／Ｂ0比の計算を行うことによって、比
較する。第１の結合混合液と比較した第２の結合混合液中の結合の減少が観察さ
れる場合、化合物または薬剤が、結合を阻害し得ると考えられる。必要に応じて
、ＩＬ−１３Ｒの第２鎖を、結合混合液の一方または両方に添加し得る。結合混
合液の処方および最適化は、当業者のレベル内であり、そのような結合混合物は
また、結合を促進するか、または最適化するのに必要な緩衝液および塩を含み得
、そしてさらなるコントロールアッセイが、本発明のスクリーニングアッセイ中
に含まれ得る。
【００３９】
従って、任意の程度で（好ましくは、少なくとも約１０％まで、より好ましく
は約５０％を超えて）、ＩＬ−１３またはそのフラグメントに対するＩＬ−１３
ｂｃタンパク質の結合活性を減少することが見出された化合物が、同定され、次
に、他の結合アッセイにおいて、およびインビボアッセイにおいてスクリーニン
グされ得る。これらの手段によって、治療剤として適切であり得る、ＩＬ−１３
ｂｃ結合について阻害活性を有する化合物が、同定され得る。
【００４０】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドもまた、
ＩＬ−１３ｂｃ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１３の発現または存在、あるいは、ＩＬ
−１３ｂｃ、ＩＬ−１３ＲまたはＩＬ−１３を発現する細胞の検出のための診断
剤として使用し得る。このタンパク質またはポリヌクレオチドを、このタイプの
材料を使用する診断アッセイのための標準手段におけるそのような目的のために
、使用し得る。適切な方法は、当該分野において周知である。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「ＩＬ−１３Ｒ」とは、ＩＬ−１３ｂｃ、お
よび／または、「ＩＬ−１３α１」もしくは「ＮＲ４」として公知の第２のＩＬ
−１３レセプター鎖をいう（マウスレセプター鎖、Ｈｉｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９６、９３：４９７〜５０１：ヒト
レセプター鎖、Ａｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１：２９
２６５〜７０、およびＧａｕｃｈａｔら、Ｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、
２７：９７１〜８を参照のこと）。
【００４２】
ＩＬ−１３ｂｃは、ＩＬ−１３の公知の生物学的活性のメディエーターとして
作用する。結果として、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質（特に、可溶性ＩＬ−１３ｂ
ｃタンパク質）、ＩＬ−１３Ｒインヒビター（すなわち、ＩＬ−１３とＩＬ−１
３Ｒとの相互作用のアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１３Ｒ（特にＩＬ−１３ｂ
ｃに対する抗体またはＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体を含む）およびそのフラグ
メントに対する抗体）、ＩＬ−１３およびそのフラグメントに対する抗体、可溶
性ＩＬ−１３Ｒα１タンパク質、ならびに低分子およびＩＬ−１３とＩＬ−１３
Ｒとの相互作用（ＩＬ−１３ｂｃとの相互作用および／またはＩＬ−１３Ｒα１
との相互作用を含む）の他のインヒビターが、ＩＬ−１３が関係する種々の医学
的状態、またはＩＬ−１３の活性（または活性の欠損）によって生じる種々の医
学的状態（集合的に、「ＩＬ−１３関連状態」）の処置または調節において有用
であり得る。ＩＬ−１３Ｒに結合するＩＬ−４の変異形態もまた、ＩＬ−１３ア
ンタゴニストとして使用され得る（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８、９５：９５４５〜８；Ａｖｅ
ｒｓａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３、１７８：２２１３〜８；およびＧｒ
ｕｎｅｗａｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０：４００４〜９を参
照のこと）。
【００４３】
ＩＬ−１３関連状態としては、限定することなく、Ｉｇ媒介性状態および疾患
、特にＩｇＥ媒介性状態（限定することなく、アトピー、アレルギー性状態、喘
息、免疫複合体病（例えば、狼瘡、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、甲状
腺炎およびグレーヴズ病）が含まれる）；肺の炎症状態；免疫欠損、特に造血性
前駆胞における欠損、またはそれに関する障害；癌および他の疾患が挙げられる
。そのような病理学的状態は、疾患、放射線または薬物への曝露から生じ得、そ
して例えば、白血球減少症、細菌およびウイルス感染、貧血、Ｂ細胞またはＴ細
胞欠損（例えば、骨髄移植後の免疫細胞欠損または造血細胞欠損）を含む。ＩＬ
−１３は、マクロファージ活性化を阻害するので、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質は
また、マクロファージ活性化の増強のために有用であり得る（すなわち、ワクチ
ン接種、微生物もしくは細胞内生物、または寄生虫感染の処置）。
【００４４】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質もまた、インビトロおよびインビボにおいてＩＬ−
１３の効果を増強するために使用され得る。例えば、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質
は、ＩＬ−１３活性を有するタンパク質（好ましくはＩＬ−１３）と合わせられ
得、そして生じる組合せを、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ−１３Ｒの少なくとも１
つの鎖を発現する細胞と接触させ得る（好ましくは、ＩＬ−１３ｂｃ以外のＩＬ
−１３Ｒの全ての鎖、例えばＩＬ−１３Ｒα１）。好ましくは、接触工程は、そ
のような組合せの治療的有効量を、インビボにおいて哺乳動物被験体に投与する
ことによって、実行される。ＩＬ−１３タンパク質とＩＬ−１３ｂｃタンパク質
との確立される前の会合は、適切なシグナル伝達に必要な完全なＩＬ−１３／Ｉ
Ｌ−１３Ｒ複合体の形成を助ける。例えば、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２７０：１３５１（１９９５）によって記載される方法を参照のこと。
【００４５】
細胞から精製されたか、または組換え的に産生された、ＩＬ−１３ｂｃタンパ
ク質およびＩＬ−１３Ｒインヒビターを、薬学的に受容可能なキャリアと組み合
わせた場合、薬学的組成物として使用し得る。そのような組成物は、ＩＬ−１３
ｂｃまたはインヒビターおよびキャリアに加えて、種々の希釈剤、充填材、塩、
緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および他の当該分野において周知の材料を含み得
る。用語「薬学的に受容可能」とは、活性成分の生物学的活性の効力を妨げない
非毒性材料を意味する。キャリアの特徴は、投与の経路に依存する。
【００４６】
本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、または他の造血
因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、Ｉ
Ｌ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、お
よびエリトロポイエチンを含み得る。薬学的組成物はまた、抗サイトカイン抗体
を含み得る。薬学的組成物は、血栓崩壊性因子または抗血栓因子（例えば、プラ
スミノゲン活性化因子および第ＶＩＩＩ因子を含み得る。薬学的組成物はさらに
、他の抗炎症剤を含み得る。そのようなさらなる因子および／または薬剤を薬学
的組成物中に含めて、単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂ
ｃインヒビターとの相乗的作用を生じ得るか、単離されたＩＬ−１３ｂｃまたは
ＩＬ−１３インヒビターによって生じる副作用を最小化し得る。逆に、単離され
たＩＬ−１３ｂｃまたはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを、特定のサイトカイン、
リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊性因子または抗血栓因子、あるいは抗炎
症剤の処方物中に含ませて、そのサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、
血栓崩壊性因子または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の副作用を最小化し得る。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、リポソームの形態であり得、ここで単離されたＩＬ
−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、他の薬学的に受容
可能なキャリアに加えて、両親媒性剤（例えば、ミセル、不溶性単層、液晶、ま
たは水溶液中の層状の層として凝集形態にて存在する脂質）とともに組み合わさ
れている。リポソーム性処方物のために適切な脂質としては、モノグリセリド、
ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸など
が挙げられるがこれらに限定されない。このようなリポソーム性処方物の調製は
、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号
；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号（
これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に開示されるように、当
業者のレベル内である。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」とは、意義のある患者の利
益（例えば、このような状態の症状の緩和、治癒、または治癒の速度における増
加）を示すに十分である、薬学的組成物または方法の各活性成分の総量を意味す
る。単独に投与される、個々の活性成分に適用される場合、この用語は、その成
分単独をいう。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせてか、連
続的にか、または同時に投与されるか否かにかかわらず、治療効果を生じる活性
成分の組み合わせた量をいう。
【００４９】
本発明の処置方法または使用を実施する際に、治療有効量の単離されたＩＬ−
１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、哺乳動物に投与され
る。単離されたＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは
、単独または他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因
子を用いる処置）と組み合わされるかのいずれかで、本発明の方法に従って投与
され得る。１以上のサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子と同時投
与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは
、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子または抗血栓崩壊
因子と同時にか、あるいは連続的にかのいずれかで、投与され得る。連続的に投
与される場合、担当医は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩
壊因子または抗血栓崩壊因子との組み合わせで、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質また
はＩＬ−１３ｂｃインヒビターを投与する適切な順番を決定する。
【００５０】
薬学的組成物において使用されるＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３
ｂｃインヒビターの投与、または本発明の方法の実施は、種々の従来の様式（例
えば、経口摂取、吸入、または皮膚注射、皮下注射、もしくは静脈内注射）にお
いて実行され得る。患者への静脈内注射が、好ましい。
【００５１】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが
、経口で投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃイン
ヒビターは、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、またはエリキシル剤の形態である
。錠剤形態にて投与される場合、本発明の薬学的組成物は、固体キャリア（例え
ば、ゼラチンまたはアジュバント）をさらに含み得る。錠剤、カプセル剤、およ
び散剤は、約５〜９５％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃイン
ヒビター、および好ましくは約２５〜９０％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質または
ＩＬ−１３ｂcインヒビターを含む。液体形態にて投与される場合、液体キャリ
ア（例えば、水、石油、動物または植物起源の油（例えば、ピーナッツ油、鉱油
、ダイズ油、もしくはゴマ油）あるいは合成油）が、添加され得る。薬学的組成
物の液体形態は、生理学的生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカリド溶
液、あるいはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール
、またはポリエチレングリコール）をさらに含み得る。液体形態にて投与される
場合、この薬学的組成物は、約０．５〜９０重量％のＩＬ−１３ｂｃタンパク質
またはＩＬ−１３ｂｃインヒビター、および好ましくは約１〜５０％のＩＬ−１
３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含む。
【００５２】
治療有効量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが
静脈内注射、皮膚注射または皮下注射によって投与される場合、ＩＬ−１３ｂｃ
タンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターは、発熱物質陰性の非経口的に受
容可能な水溶液の形態である。このような非経口的に受容可能なタンパク質溶液
の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに関する約束事を有し、これは当業者の範
囲内である。静脈内注射、皮膚注射、または皮下注射のための好ましい薬学的組
成物は、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターに加えて
、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム液、リンゲル液、デキストロース液
、デキストロースおよび塩化ナトリウム液、乳酸リンゲル液または当該分野にお
いて公知の他のビヒクル）を含むべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安
定化剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加剤を含み得
る。
【００５３】
本発明の薬学的組成物中のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃイ
ンヒビターの量は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに患者が経験し
た以前の処置の性質に依存する。最終的には、担当医は、各々の個々の患者を処
置する、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの量を決
定する。最初に、担当医は、低用量のＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１
３ｂｃインヒビターを投与し、そして患者の応答を観察する。より高用量のＩＬ
−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターが、最適な治療効果が
患者に対して得られるまで投与され得、そしてその時点で、この投薬量は、一般
的にさらに増加されない。本発明の方法を実施するために使用される種々の薬学
的組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１００ｍｇのＩＬ−１３ｂｃタ
ンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターを含むべきであることが意図される
。
【００５４】
本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の持続時間は、各々の個々の患者
の処置される疾患および状態の重篤度、ならびに潜在的特異体質応答に依存して
変動する。ＩＬ−１３ｂｃタンパク質またはＩＬ−１３ｂｃインヒビターの各々
の適用の持続時間は、１２〜２４時間の連続する静脈内投与の範囲にあることが
意図される。最終的には、担当医は、本発明の薬学的組成物を使用して、静脈内
治療の適切な持続時間を決定する。
【００５５】
本発明のＩＬ−１３ｂｃタンパク質はまた、動物を免疫して、ＩＬ−１３ｂｃ
タンパク質と特異的に反応し、かつＩＬ−１３またはそのフラグメントのそのレ
セプターへの結合を阻害し得る、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
を得るために、使用され得る。このような抗体は、免疫原としてＩＬ−１３ｂｃ
全体を使用してか、またはＩＬ−１３ｂｃのフラグメント（例えば、可溶性成熟
ＩＬ−１３ｂｃ）の使用によって得られ得る。ＩＬ−１３ｂｃのより小さなフラ
グメントもまた、動物を免疫するために使用され得る。ペプチド免疫原は、カル
ボキシ末端にシステイン残基をさらに含み得、そしてハプテン（例えば、キーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合体化される。さらなるペプチド
免疫原は、チロシン残基を硫酸化されたチロシン残基と置換することによって作
製され得る。このようなペプチドを合成するための方法は、例えば、Ｒ．Ｐ．Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５．２１４９〜２１
５９（１９６３）；Ｊ．Ｌ．Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
２１１，１０（１９８７）のように、当該分野において公知である。
【００５６】
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質に結合している中和抗体または非中和抗体（好まし
くは、モノクローナル抗体）もまた、特定の腫瘍に対して有用な治療であり、そ
してまた、上記の状態の処置に有用であり得る。これらの中和モノクローナル抗
体は、ＩＬ−１３ｂｃに結合しているＩＬ−１３をブロックすることが可能であ
り得る。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
（ＩＬ−１３ｂｃ ｃＤＮＡの単離）
（マウスＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの胸腺から調
製した。二本鎖のヘミメチル化（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ｃＤＮＡを、
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｃＤＮＡ合成キットを使用して、製造業者の使用説明書
に従って調製した。簡潔には、第１鎖を、オリゴＴ−Ｘｈｏプライマーでプライ
ムし、そして第２鎖の合成の後に、ＥｃｏＲＩアダプターを付加して、そしてｃ
ＤＮＡを、ＸｈｏＩで消化して、そして精製した。このｃＤＮＡを、Ｚａｐ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）λベクターのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位
に連結し、そしてＧｉｇａｐａｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージ
ング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、製造業者の使用説明書に従っ
てパッケージングした。１．５×１０6の得られた組換えファージのライブラリ
ーを、製造業者の使用説明書に従って増幅した。このライブラリーを、配列ＫＳ
ＲＣＴＣＣＡＢＫＣＲＣＴＣＣＡ（配列番号５）（Ｋ＝Ｇ＋Ｔ；Ｓ＝Ｃ＋Ｇ；Ｒ
＝Ａ＋Ｇ；Ｂ＝Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）の縮重１７マーオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、記載されるような標準的なＴＭＡＣハイブリダイゼーション条件を使用して
、スクリーニングした（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編集者、Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５、第６．４．３節）。クローンＡ２５を同定し
た。なぜなら、これは、１７マープローブにハイブリダイズしたが、既知の造血
素レセプターから誘導されるプローブにはハイブリダイズしなかったからである
。このクローンを、製造業者の使用説明書により、ＺａｐＥｘｐｒｅｓｓベクタ
ー由来のプラスミド形態において単離し、そしてこのＤＮＡ配列を決定した。こ
のＤＮＡ配列は、造血素レセプターファミリーのうちの新規なメンバーをコード
した。
【００５８】
配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含むクローンＡ２５を、１９９
６年２月２２日に、登録番号６９９９７で、ｐＡ２５ｐＢＫＣＭＶとしてＡＴＣ
Ｃに寄託した。
【００５９】
（ヒトＩＬ−１３レセプター鎖の単離）
マウスレセプターのヒトホモログの部分的なフラグメントを、マウス配列から
誘導されるオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによって単離した。ｃＤＮＡ
を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得られたヒト精巣ポリＡ＋ＲＮＡから調製した。２７
４塩基対のＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド：
【００６０】
【化１】
を用いるＰＣＲによって、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を
使用して、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１×Ｔａｑ緩衝液中での３０サイクル
のインキュベーション（９４℃×１分、４２℃で１分、および７２℃で１分）に
より、このｃＤＮＡから増幅した。このフラグメントのＤＮＡ配列を決定し、そ
して２つのオリゴヌクレオチドを、以下の配列：
【００６１】
【化２】
を有するこのフラグメントの内部部分から調製した。これらのオリゴヌクレオチ
ドをプローブとして使用して、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（カタログ番号ＨＬ１１６１）
から購入したヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。フィルター
を、標準的な５×ＳＳＣハイブリダイゼーション条件を使用して、５２℃でハイ
ブリダイズさせ、そして２×ＳＳＣにおいて５２℃にて洗浄した。４００，００
０個のクローンのスクリーニングにおいて、両方のオリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズする２２個のクローンを単離した。ＤＮＡ配列を、これらのｃＤＮＡク
ローンのうちの４つから決定し、そして全ては、同じ新規の造血素レセプターを
コードしていた。全長ヒトレセプター鎖の推定ＤＮＡ配列を、配列番号３として
示す。
【００６２】
ヒトクローンを、１９９６年２月２２日に登録番号６９９９８で、ｐｈＡ２５
♯１１ｐＤＲ２としてＡＴＣＣに寄託した。
【００６３】
（実施例２）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の発現および活性のアッセイ）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの産生および精製）
マウスＩＬ−１３ｂｃの細胞外ドメインのアミノ酸１〜３３１をコードするＤ
ＮＡを、ＰＣＲによって、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙをコードするスペーサー配列
に融合し、そしてＣＯＳ−１発現ベクターｐＥＤ ＦｃのヒトＩｇＧ１のヒンジ
ＣＨ２ ＣＨ３領域をコードする配列とインフレームに連結した。ＩＬ−１３ｂ
ｃ−Ｉｇを、ＤＥＡＥデキストランでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から
産生し、そしてプロテインＡセファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を介して精製した。
【００６４】
（Ｂ９増殖アッセイ）
ＩＬ−１３またはＩＬ−４に応答するＢ９細胞（Ａａｒｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７．１７：１４１１〜１４１６）の増殖の刺激を、Ｄ
ＮＡへの３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。細胞（５×１０３／ウェル
）を、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ（１μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、種々の
濃度の増殖因子を含む培地を有する９６ウェルプレートに播種した。３日間のイ
ンキュベーションの後に、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加し、そして
細胞を、さらに４時間インキュベートした。放射能の取り込みを、ＬＫＢ １２
０５Ｐｌａｔｅリーダーを使用して決定した。
【００６５】
Ｂ９細胞株は、ＩＬ−１３、ＩＬ−４またはＩＬ−６に応答して増殖した。Ｉ
Ｌ−１３への応答のみが、可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇによって阻害された。こ
のことは、このレセプターがＩＬ−１３を特異的に結合するが、ＩＬ−４または
ＩＬ−６を特異的に結合しないことを示した。表は、ｃｐｍを示す。２つの別々
の実験を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
（実施例３）
（表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ分析）により測定される、ＩＬ−１３
への可溶性ＩＬ−１３ｂｃの直接的な結合）
Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサを使用して、精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇへ
のＩＬ−１３の直接的な特異的結合を測定した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｊｏｈｎ
ｓｓｏｎら、１９９１）。およそ１０，０００〜１７，０００の共鳴単位（ＲＵ
）の精製されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ、ヒトＩｇＧ１または関連のないレセプタ
ーを、製造業者により推奨されるように、センサチップ上の異なるフローセルに
各々共有結合的に固定した。（ＲＵは、センサチップ表面に結合したタンパク質
の質量を反映する。）精製されたＩＬ−１３を、過剰の精製されたＩＬ−１３ｂ
ｃ−Ｉｇの存在または非存在下で、５μｌ／分で１０分間、フローセルを横切っ
て注入した。結合を、サンプル注入の前および後のＲＵにおける差異として定量
した。４８１．９ＲＵの特異的ＩＬ−１３結合は、固定化したＩＬ−１３ｂｃ−
Ｉｇについてのみ観察された。一方、ＩＬ−１３およびＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇの
同時注入は、固定化されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇへの結合を全く生じなかった（
４ＲＵ）。ＩＬ−１３結合は、固定化されたＩｇＧまたはＩＬ−１１Ｒ−Ｉｇの
いずれについても全く観察されなかった（それぞれ、５．４ＲＵおよび３．７Ｒ
Ｕ）。
【００６８】
【表３】
（実施例４）
（ＣＯＳ細胞において発現されたＩＬ−１３の、標識されたＩＬ−１３ＢＣ−
Ｉｇ融合タンパク質への結合）
（ＩＬ−１３ｂｃ−ＦｃによるＩＬ−１３のＣＯＳインサイチュ検出）
ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１１についての発現ベクター、または空のベク
ターを、ＤＥＡＥデキストラン方法を介して、二連のプレート中のＣＯＳ−１細
胞へとトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞をリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて２回洗浄し、そしてメタノールにより、４℃で
１０分間培養皿にて固定化した。固定化の後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次
いで結合緩衝液（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）、１１％（ｗ／
ｖ）アジ化ナトリウム）で１回リンスし、そして１．０μｇ／ｍｌのＩＬ−１３
ｂｃ−Ｆｃまたは関連する抗サイトカイン抗血清を含む結合緩衝液中で、４℃で
２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして結合緩衝液中
に１：５００で希釈したアルカリホスファターゼ標識化ウサギＦ（ａｂ）２’抗
ヒトＩｇＧ（Ｆｃ融合物検出のため）またはウサギＦ（ａｂ）２’抗ラットＩｇ
Ｇ（抗サイトカイン検出のため）中で、振盪しながら、４℃でインキュベートし
た。細胞を再度、ＰＢＳで２回洗浄した。アルカリホスファターゼ活性を、ニト
ロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホス
フェートを使用して可視化した。
【００６９】
特異的結合を、顕微鏡下で可視化した。ＩＬ−１３でトランスフェクトした細
胞のみが、ＩＬ１３ｂｃ−Ｉｇへの特異的結合を示した。（トランスフェクトさ
れた細胞の写真を参照のこと、図）。
【００７０】
（実施例５）
（ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の生物学的活性の決定のための他の系）
他の系が、特異的ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が本明細書中に規定されるような
ＩＬ−１３ｂｃの「生物学的活性」を示すか否かを決定するために使用され得る
。以下は、このような系の例である。
【００７１】
（ＩＬ−１３結合についてのアッセイ）
ＩＬ−１３ｂｃタンパク質がＩＬ−１３またはそのフラグメントに結合する能
力は、このような結合を検出し得る任意の適切なアッセイによって決定され得る
。いくつかの適切な例は、以下である。
【００７２】
ＩＬ−１３の、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質の細胞外領域への結合は、レセプタ
ータンパク質上のホスホチロシンの迅速な誘導を特異的に引き起こす。リン酸化
の誘導によって測定されるようなリガンド結合活性についてのアッセイを、以下
に記載する。
【００７３】
あるいは、（例えば、細胞外ドメインの可溶化形態のような）ＩＬ−１３ｂｃ
タンパク質を、産生および使用してＩＬ−１３結合を検出する。例えば、その細
胞外ドメイン（推定膜貫通ドメインの前（好ましくは、直前）で切断された）が
、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）γ１のヒンジＣH２ドメインおよびヒンジＣH３ド
メインをコードするｃＤＮＡにインフレームで連結される、ｃＤＮＡ構築物を調
製する。この構築物を、ＣＯＳ細胞（例えば、ｐＥＤΔＣまたはｐＭＴ２）につ
いての適切な発現ベクター中に生成する。このプラスミドを、ＣＯＳ細胞に一過
的にトランスフェクトする。分泌されたＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を
、馴化培地中で収集し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーによって精製す
る。
【００７４】
この精製ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を使用して、多くの適用におい
て、ＩＬ−１３結合を実証する。ＩＬ−１３を酵素連結イムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）プレートの表面上にコートし得、次いで、さらなる結合部位を
、標準的なＥＬＩＳＡ緩衝液を使用してウシ血清アルブミンまたはカゼインでブ
ロックし得る。次いで、ＩＬ−１３−ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク質を、固相ＩＬ−
１３に結合し、そして結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した二次
ヤギ抗ヒトＩｇで検出する。特異的に結合された酵素の活性を、比色基質（例え
ば、テトラメチルベンジジン）および吸光度の読み取りを用いて測定し得る。
【００７５】
ＩＬ−１３はまた、例えば、膜貫通ドメインまたはグルコシルホスファチジル
イノシトール（ＧＰＩ）結合を提供することによって、細胞の表面上に発現させ
得る。膜結合ＩＬ−１３を発現する細胞を、ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合タンパク
質を使用して同定し得る。可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−Ｉｇ融合体は、これらの細胞
の表面に結合され、そして蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネー
ト）に結合体化したヤギ抗ヒトＩｇおよびフローサイトメトリーを用いて検出す
る。
【００７６】
（相互作用捕捉）
酵母遺伝子選択方法「相互作用捕捉」［Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７
９１−８０３、１９９３］を使用して、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が、本明細書
中に定義されるようなＩＬ−１３ｂｃの生物学的活性を有するか否かを決定し得
る。この系において、ＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺの
両方からのレポーター遺伝子の発現は、ベイト（餌）タンパク質（例えば、この
場合において、ヒトＩＬ−１３ｂｃと相互作用する種）とプレイ（捕食）（例え
ば、この場合において、ヒトＩＬ−１３ｂｃタンパク質）との間の相互作用に依
存する。従って、Ｌｅｕ２発現またはＬａｃＺ発現のレベルによって相互作用の
強度を測定し得る。最も単純な方法は、ＬａｃＺコードタンパク質であるβ−ガ
ラクトシダーゼの活性を測定することである。この活性は、Ｘ−ｇａｌを含有す
る培地またはフィルター上の青色度によって判断され得る。β−ガラクトシダー
ゼ活性の定量測定について、標準的なアッセイは、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙ
ｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９０（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｆ．，およびＨ
ｉｅｔｅｒ，Ｐ．による）に見出され得る。
【００７７】
このような方法において、ＩＬ−１３ｂｃタンパク質が（例えば、ＩＬ−１３
ｂｃの細胞内ドメインにインビボで結合する細胞質タンパク質のような）特定の
種と相互作用するか否かを決定することを所望する場合、この種は、相互作用捕
捉における「ベイト」として、「プレイ」として機能する試験されるべきＩＬ−
１３ｂｃタンパク質を用いるか、またはその逆で使用され得る。
【００７８】
（実施例６）
（可溶性ＩＬ−１３ｂｃタンパク質を使用する喘息の処置）
アレルギー性喘息のよく特徴付けられたマウスモデルを使用する。このマウス
モデルにおいて、アレルゲン曝露は、気道応答性亢進（「ＡＨＲ」）、肺好酸球
増加症、抗原特異的血清ＩｇＥレベルの上昇、および気道内皮粘膜含量の増加を
導く（３、１１）。雄性Ａ／Ｊマウスを、可溶性オボアルブミン（ＯＶＡ）で腹
腔内免疫し、そして引き続き気管内でチャレンジし、そのアレルギー性表現型を
、抗原チャレンジ後４日目に評価した（１３）。ＩＬ−１３の遮断を、後の気管
内アレルゲンチャレンジの２４時間前に、可溶性ＩＬ−１３ｂｃ−ＩｇＧＦｃ融
合タンパク質（ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃ）（ＩＬ−１３に特異的に結合し結合し
そしてそれを中和する）の全身投与によって行った（１４）。アレルゲン免疫マ
ウスのチャレンジは、アセチルコリンに対する気道応答性の有意な増加を生じた
（１５）（図２Ａ）。ＩＬ−１３の遮断は、このような樹立されたアレルゲン誘
導性ＡＨＲの完全な逆転を生じ；従って、ＩＬ−１３は、このモデルにおけるＡ
ＨＲの発現に必要である。アレルギー性喘息の表現型の完全な発生後の、ＩＬ−
１３の消失がＡＨＲを逆転する能力は、ＩＬ−４消失がこのような逆転を達成す
る能力がないことと対照する。アレルゲン誘導性ＡＨＲの逆転におけるＩＬ−４
Ｒαの遮断の効果の根底にある機構は、ＩＬ−１３−媒介性プロセスの阻害であ
り得、これは、Ｓｔａｔ６活性化が、両方のサイトカインについてのＩＬ−４Ｒ
α媒介性シグナル伝達の下流にあるという事実に一致する。ＩＬ−１３は、おそ
らく、アレルゲン誘導性ＡＨＲを担う主要なＣＤ４＋Ｔ細胞誘導性因子である。
【００７９】
ＡＨＲのＩＬ−１３依存性発現の根底をなす候補機構を評価するために、本発
明者らは、公知のアレルギー性エフェクターカスケードを特徴付けた。好酸球は
、喘息および喘息性ＡＨＲにおける主要なエフェクター細胞として関与している
（１６）。しかし、抗原誘発を繰り返す前のＩＬ−１３の阻害は、アレルゲン誘
導性肺好酸球増加症に有意に影響しない（１７）（図２Ｂ）。ＩｇＥ媒介経路の
関連性を評価するために、本発明者らＯＶＡ特異的血清ＩｇＥを測定した（１８
）。ＩｇＥのＯＶＡ特異的レベルを、ＯＶＡ感作マウスおよびＯＶＡチャレンジ
マウスにおいて観察したが、ＰＢＳ免疫マウスおよびＰＢＳチャレンジマウスに
おいては、抗原特異的抗体レベルは検出されなかった（図２Ｃ）。ＩＬ−１３の
隔離は、ＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルを変更せず、その抑制の欠失は、ＩＬ−１３
隔離が、最初の抗原プライミングおよび抗体形成後に生じるという事実に起因す
るであろう。にもかかわらず、これらの結果は、ＡＨＲが、このモデルにおける
ＩｇＥ産生に依存しないことを示し、これは、アレルギー性ＡＨＲがＩｇＥ欠損
およびＢ細胞欠損マウスにおいて通常発生するという報告（１９）と一致する。
【００８０】
ヒト喘息の病理に一致して、マウスモデルにおけるアレルギー性喘息は、気道
上皮の粘膜含量の顕著な増加に関連する（５、１１）。粘膜の過分泌は、急性喘
息性発作で死亡する患者の剖検標本に特に顕著である（２０）。ＩＬ−１３の遮
断は、気道における粘膜含有細胞のアレルギー誘導性の増加を逆転し（図３）、
これは、気道粘膜含量のアレルギー誘導性の増加が、ＩＬ−１３に依存すること
を実証する。ＩＬ−４はまた、ＩＬ−４トランスジェニックマウスが、抗体感作
の非存在下で顕著な杯細胞過形成を示すように、このプロセスに関与する（５）
。しかし、ＩＬ４欠損マウスおよびコントロールマウスの両方に由来のＴｈ２ク
ローンの、マウス気道への移入は、粘膜の過剰産生を誘導する（２１）。このこ
とは、また、ＩＬ−４の免疫調節性の役割が、エフェクター分子としてのその役
割と綿密に区別されることを必要とすることを示唆する。
【００８１】
未処置（免疫していない）マウスの気道への組換えＩＬ−１３（ｒＩＬ−１３
）の毎日の投与が、ＡＨＲを誘導し、これは、ＩＬ−１３活性の増加が、ＡＨＲ
を誘導するに十分であったことを実証する（図４Ａ）（２２）。ＡＨＲは、ｒＩ
Ｌ−１３投与開始後７２時間までに発症する。好酸球の気管支肺胞洗浄液への有
意な流入が、ｒＩＬ−１３投与後早期に観察されたが、肺好酸球は、ＡＨＲの発
現時点で観察されなかった（図４Ｂ）。好酸球流入の時間経過の重要性は不明な
ままであるが、これは、ＩＬ−１３単独が、おそらく、ケモカイン発現を上方調
節するその能力によって、気道の好酸球浸潤を開始するのに十分であることを示
唆する。ｒＩＬ−１３の気道投与はまた、全血清ＩｇＥ合成の時間依存性の増加
を生じ（図４Ｃ）（２４）、これは、ＩＬ−１３がＩｇＥ合成を調節する、以前
に報告された能力に一致する。血清ＩｇＥの増加は、アレルゲンでの任意の免疫
に非依存的であり、これは、ヒト喘息の表現型が、アレルゲン特異的よりもむし
ろ、全量の血清ＩｇＥ濃度により良好に相関するという観察（２６）との共鳴を
見出す。上記ＩＬ−１３阻害研究から予測されるように、ｒＩＬ−１３の投与は
、気道粘膜産生の増加を誘導した（図４Ｄ）（２７）。
【００８２】
参考文献および注記
【００８３】
【表４】
１３． ６週齢雄性Ａ／Ｊマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒｔ，ＭＥ）から入手し、実験期間中、環境制御し
た特定病原体除去動物施設中で、層流フード下で飼育した（Ｎ＝４〜１０マウス
／実験群）。この研究は、動物の実験使用に関する、ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｗ
ｅｌｆａｒｅ Ａｃｔおよびｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔ
ｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ（Ｎ．Ｉ．Ｈ．）ガイドライ
ンによって概略される実験室動物研究についての原則に従って、本明細書に報告
した。マウスを、０．２ｍｌＰＢＳ中の１０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ；Ｃ
ｒｕｄｅグレードＩＶ、Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＰＢＳ単
独の腹腔内注射によって免疫した。免疫後１４日目に、マウスを、ケタミンおよ
びキシラジン（それぞれ、４５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔
し、そして５０μｌのＯＶＡの１．５％溶液またはコントロールとして等価量Ｐ
ＢＳを気管内でチャレンジした。この最初の抗原チャレンジ後１０日目に、マウ
スを、ＯＶＡまたはＰＢＳのいずれかで再度、気管内でチャレンジした。そのア
レルギー性表現型の特徴付けを、第２の抗原チャレンジ後９６時間で行った。
１４．ヒトＩＬ−１３ｂｃを上記のようにクローン化した。マウスホモログの可
溶性発現のために、ヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２／ＣＨ３領域とインフレームで
融合させた、マウスｓＩＬ−１３ｂｃ細胞外ドメイン（先の実施例で記載される
ような）をコードするＤＮＡを含むｐＥＤ発現ベクターを、ＨＣＯ細胞にトラン
スフェクトした［Ｄ．Ｄ．Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１
，２３１７（１９９８）］。ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃを、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ［Ｊ．Ｆ．Ｕｒｂａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８、２５５
（１９９８）］で精製した。Ｂ９増殖アッセイにおいて３ｎｇ／ｍｌのマウスＩ
Ｌ−１３を中和する能力によって決定されるように、インビトロＩＤ50は、約１
０ｎｇ／ｍｌであった。ヒトＩｇＧ（ｓＩＬ−１３ｂｃ−Ｆｃのコントロールと
して使用した）を、ヒト免疫グロブリンの１０％溶液（これは、静脈内投与のた
めに市販されている（Ｍｉｌｅｓ）（同書））からｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって同様に精製した。マウスに、ｓＩＬ
−１３ｂｃ−Ｆｃ（４００μｇ）または等量のコントロールＨｕ−ＩｇＧを、腹
腔内注射によって、二次抗原チャレンジの−１日目、０日目、＋１日目および＋
３日目に与えた。
１５．アセチルコリンの静脈内投与に対する気道応答性を、最後の気道内チャレ
ンジの３日後に測定した（１１）。マウスを、ペントバルビタールナトリウム（
９０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、インキュベートし、定常の気道の一回換気量（０．
２ｍｌ）で１２０呼吸／分の速度で喚起し、そしてデカメトニウムブロミド（２
５ｍｇ／ｋｇ）で麻痺させた。安定な気道内圧の確立後、アセチルコリンを、静
脈内注射（５０μｇ／ｋｇ）し、そして動的気道内圧を、５分間追跡した。
１６．Ｇ．Ｊ．Ｇｌｅｉｃｈ，Ｊ．Ａｌｌ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，４
２２（１９９０）。
１７．気管支肺胞洗浄を、上記（１１）のように行った。
１８．腎臓を切除し、そしてプールした血液を、上記（１１）のような抗体分析
のために収集した。血清を遠心分離で分離し、そして分析まで−８０℃で保存し
た。血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サ
ンプルウェルを、ＰＢＳ中の０．０１％ＯＶＡ溶液でコートし、ＰＢＳ中の１０
％ＦＢＳでブロックし、そしてＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄
した。血清サンプルを、ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳで１：１０および１：１００に
希釈した。一晩のインキュベーション後、プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そしてビオチン結合体化抗マウスＩｇＥ（Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加した。洗浄後、１０％ＦＢＳ
／ＰＢＳ中の０．００２５ｍｇ／ｍｌアビジンペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）
を添加し、プレートを、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ｄｉｄ［３−メチル−ベ
ンズチアゾンサルフェート］）（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ）で発
色させた。プレートを、４０５ｎｍで３０分間読み取った。報告されたＯＤ値は
、１：１０希釈された血清サンプルの値である。なぜなら、この値は、１０％Ｆ
ＢＳ／ＰＢＳで１：１００希釈した血清サンプルのＯ．Ｄ．値と比較によるアッ
セイの飽和点以下であることがわかったからである。
【００８４】
【表５】
２２．ミツバチメルチンリーダーをコードするＤＮＡ［Ｄ．Ｃ．Ｔｅｓｓｉｅｒ
，Ｄ．Ｙ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｅ．Ｋｈｏｕｒｉ，Ｆ．Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ，Ｔ
．Ｖｅｒｎｅｔ，Ｇｅｎｅ ２．１７７（１９９１）］およびそれに続く６個の
ヒスチジンタグを、エンテロキナーゼ切断部位によって、マウスＩＬ−１３の成
熟領域に対してＧｌｙ２１で融合し、そして哺乳動物発現ベクターｐＨＴｏｐに
構築した。Ｈ６−ＥＫマウスＩＬ−１３タンパク質を、安定にトランスフェクト
されたＣＨＯ細胞から産生し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによって、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって決定されるように、９７％より高い純度に精製した。タン
パク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度によって測定し、そしてエンドトキシン混
入は、Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＬＡＬアッセイによって測定
されるように、３０ＥＵ／ｍｇ未満であった。Ｂａ／Ｆ３ ＩＬ−１３Ｒ１増殖
アッセイによって決定されるように、Ｈ６−ＥＫマウスＩＬ−１３のＥＤ50は、
１ｎｇ／ｍｌであった。マウスｒＩＬ−１３（５０μｌの総量中５μｇ）を、ケ
タミンおよびキシラジン（それぞれ、４５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇ）の混
合物で麻酔した未処置マウスに、気管内滴下によって毎日投与した。
２３．Ｍ．Ｇｏｅｂｅｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ，９１，４５０（１９９７）。
２４．マウスＩｇＥ特異的ＥＬＩＳＡを使用して、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入
手したマウスＩｇＥに対する補体抗体対（Ｒ３５−７２およびＲ３５−９２）を
製造業者の説明に従って用いて、血清中の総ＩｇＥ免疫グロブリンレベルを定量
した。２連のサンプル（ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳにおける１／１０希釈）を、各
動物から試験した。サンプルのＯ．Ｄ．の読み取りを、既知濃度の組換えマウス
ＩｇＥ（５〜２０００ｐｇ／ｍｌ）で作製した標準曲線から得られた値を使用し
て、ｐｇ／ｍｌに変換し、そして最終濃度を、希釈係数によって乗算することに
よって得た。
２５．Ｃ．Ｌ．Ｅｍｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．Ｂｅｌｌ，Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｗ．Ｗｉｓｄ
ｅｎ，Ａ．Ｎ．Ｊ．Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１８８，３９９（
１９９８）。
２６．Ｌ．Ｒ．Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ，Ｄ．Ｇ．Ｍａｒｓｈ、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．
Ａｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００，３５５（１９９３）。
２７．ｒＩＬ−１３の気道上皮の粘膜細胞含量に対する効果を試験するために、
肺を切除し、１０％ホルマリンに固定化した。次いで、これらを、７０％エタノ
ール中で洗浄し、脱水し、グリコールメタクリレート中に包理し、１０μＭ切片
に切断し、スライド上にマウントし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンおよ
び過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆで染色した。４つの切片を、１動物あたりで試験しし
：肺の１切片あたり４つの領域をスコア付けした。切片を、１〜４のスケールで
スコア付けし、１は、粘膜細胞含量がないことを表す。
【００８５】
【表６】
本明細書中に引用される全ての特許および学術文献は、完全に示されるように
参考として援用される。
【００８６】
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２６３８８９（Ｐ２０１０−２６３８８９Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９７４３０（Ｐ２０１０−９７４３０）
【出願日】平成２２年４月２０日（２０１０．４．２０）
【分割の表示】特願２０００−５８８３５２（Ｐ２０００−５８８３５２）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１３日（１９９９．１２．１３）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【出願人】（５０１２３９２０６）ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２０日（２０１０．４．２０）
【分割の表示】特願２０００−５８８３５２（Ｐ２０００−５８８３５２）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１３日（１９９９．１２．１３）
【出願人】（５０１４１８２１４）ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー (35)
【出願人】（５０１２３９２０６）ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー (2)
【Ｆターム（参考）】
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