サイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物および使用方法
本発明は、一種の免疫細胞を活性化する方法を提供する。これは、以下の、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドを含む免疫原組成物および免疫細胞を混合して混合培養物を形成するステップと、該混合培養物を適当な培地で培養するステップとを含み、これにより、活性化した免疫細胞が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一種の抗ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）のワクチンに関し、特に抗ヘルペスウイルスの免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）の産生に使用される免疫原組成物に関する。本発明は、さらに前記免疫原組成物の用途、および免疫細胞の活性化に応用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスはヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに属する。現在までに、８種のウイルスに関して、ヒトにおける疾病の原因となることが知られている。この種のウイルスはヒトヘルペスウイルス（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ、ＨＨＶ）と総称され、その中には以下が含まれる。（１）ヒトヘルペスウイルス−１（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＨＶ−１）であり、単純ヘルペスウイルス−１（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＳＶ−１）とも言われる。（２）ヒトヘルペスウイルス−２（ＨＨＶ−２）であり、単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）とも言われる。（３）ヒトヘルペスウイルス−３（ＨＨＶ−３）、すなわち水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）であり、水痘および帯状疱疹を引き起こすことがあり、水痘ウイルスとも呼ばれる。（４）ヒトヘルペスウイルス−４（ＨＨＶ−４）、すなわちエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ、ＥＢＶ）で、一種のリンパ球ウイルスである。バーキットリンパ腫および上咽頭癌を引き起こすことがある。（５）ヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）、すなわちサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）である。（６）ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）、すなわちロゼオロウイルスであり、小児バラ疹および突発性発疹を含む第六病を引き起こすことがある。（７）ヒトヘルペスウイルス−７（ＨＨＶ−７）であり、ＨＨＶ−６と近似し、症状はだいたい同じである。（８）ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）であり、ラジノウイルス属で、ｋＳＨＶと略される。カポジ肉腫から発見された。
【０００３】
移植を受けた患者のヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ、ＨＶ）に対する感染管理は、既存技術では、主に抗ウイルス薬を使用し、先制的治療（ｐｒｅｅｍｐｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または予防治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を行う。サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）を例とすると、前者は、培養実験により陽性が示されるか、または検査によってウイルスが自発的複製をしていることが示されると、無症状であっても先制的治療を行う。後者は、血清に対して陽性である患者は、感染の証拠がなくても予防治療を行う。既存技術において、ＣＭＶ複製の制御に使用される数種の抗ウイルス薬には、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、フォスカネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）およびシドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）（Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００４年、４：７２５〜３８）が含まれる。移植を受けた患者に対して、これらの試薬を用いて、治療としてヘルペスウイルス感染の制御を行い、現在すでに顕著な進歩を遂げている。
【０００４】
しかしながら、これらの薬理学的戦略（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）には制限がある。例えば、薬物毒性、薬剤耐性の発生、低経口バイオアベイラビリティ（ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）および低効力などの問題である。抗ウイルス薬を利用して治療しても、死亡率は依然として高く、特に、可能な限り早期に治療を始めていない場合に高い（Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、上述と同じ、Ｉｓｏｎ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ．、２００５年、２６：６９１〜７０５、Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．、２００３年、１７：２５９〜６４）。そのほか、患者がこれらの試薬を長期間使用すると、抗ウイルス薬に対する薬剤耐性が徐々に発生することがある（Ｉｓｏｎ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．、上述と同じ、Ｂｉｒｏｎ ＫＫ．、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、２００６年、７１：１５４〜６３）。
【０００５】
既存の、ヘルペスウイルス感染症に対する免疫療法は、生ウイルスを基にしたヘルペスウイルス抗原の供給源（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスに感染した細胞（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、ヘルペスウイルス遺伝子発現ベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）、または合成されたヘルペスウイルスタンパク質もしくはペプチドを使用し、ヘルペスウイルス特異的免疫応答を活性化する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）を刺激する。ウイルスまたはウイルス感染した細胞を抗原の供給源とすると、ウイルス汚染および感染を引き起こすという潜在的な危険性があり、全長のヘルペスウイルス遺伝子またはタンパク質を抗原の供給源とすると、免疫抑制作用（ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）または免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を誘発する潜在的危険がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００４年、４：７２５〜３８
【非特許文献２】Ｉｓｏｎ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ．、２００５年、２６：６９１〜７０５
【非特許文献３】Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．、２００３年、１７：２５９〜６４
【非特許文献４】Ｂｉｒｏｎ ＫＫ．、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、２００６年、７１：１５４〜６３
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：５２２〜５２７、２０００年
【非特許文献６】Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、 １３（１４）：１５９１〜６０７、２００６年
【非特許文献７】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８（５）：３５１〜６０、２００８年
【非特許文献８】Ｈａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．、２００８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６：２６９〜２７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、既存技術が前述したウイルス汚染による感染、および免疫寛容などを含む問題を有することに基づき、一種のヘルペスウイルス疾患に対する免疫療法を提供することにある。これは、前述したような、生ウイルス、ヘルペスウイルス感染細胞、または全長のヘルペスウイルスタンパク質を使用することにより生じる種々の問題が起こることはない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の目的を達成するため、第１の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチド断片の少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチド断片と、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドを含む。
【０００９】
第２の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチドプールのうちの少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールと、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドプールを含む。
【００１０】
第３の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物を提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチド断片を含む。
【００１１】
第４の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物を提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチドプールを含む。
【００１２】
本発明の好ましい実施例において、前記免疫原組成物のうちのＣＭＶ ｐｐ６５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ＩＥ−１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ＶＧＬＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ＶＰＡＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ｐ１００はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と実質的に同じ配列を有する。
【００１３】
好ましくは、前述した免疫原組成物は、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールを含む。
【００１４】
第５の局面において、本発明は、前述した第１から第４の局面のいずれか１つの免疫原組成物が、生体外でヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発する用途を提供する。
【００１５】
第６の局面において、本発明は、前述した第１から第４の局面のいずれか１つの免疫原組成物が、ヘルペスウイルス感染症を治療する医薬品の製造に使用される用途を提供する。
【００１６】
第７の局面において、本発明は、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫細胞を活性化する方法を提供する。これは次に挙げる、免疫細胞および前述の第１から第４の局面のいずれか１つの免疫原組成物を混合し、細胞混合培養物を形成するステップと、この細胞混合培養物を適当な培地で培養し、活性化した免疫細胞が得られるステップとを含む。
【００１７】
第８の局面において、本発明は、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）の産生を誘発する方法を提供する。これは次に挙げる、一種の前述した第１から第４の局面のいずれか１つの方法によって得られる活性化された免疫細胞、および一種のリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を提供するステップと、この活性化された免疫細胞およびリンパ球を、適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップとを含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、免疫原組成物が抗ＣＭＶ免疫応答（ａｎｔｉ−ＣＭＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を効果的に活性化することができ、さらにこれらのペプチドプールは生ウイルス、ＣＭＶ感染した細胞を使用しないため、不必要な感染の問題および免疫抑制作用、免疫寛容などの潜在的な危険性がないことを実証した。そのほか、本発明による方法は、免疫細胞を効果的に活性化し、またリンパ球をさらに活性化することにも使用され、抗ＣＭＶウイルス活性を有する免疫エフェクター細胞を産生する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の方法の簡単なフローチャートである。
【図２】図２は、ＣＭＶポリペプチド由来のペプチドプールの概要図である。このポリペプチドはｐｐ６５を例としている。
【図３】図３は、樹状細胞によって活性化されるリンパ球の調製プロセスである。
【図４】図４は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール、およびその組合せによってＰＢＭＣの細胞が刺激され、増殖作用が生じる効果を示す。そのうち、ＡはＣＦＳＥ染色分析の結果であり、Ｂは細胞内サイトカイン染色分析の結果である。
【図５】図５は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール、およびその組合せによってＰＢＭＣの細胞が刺激され、免疫応答が生じる効果を示す。そのうち、Ａ、Ｂは、それぞれ異なるドナーからのＰＢＭＣの試験結果である。
【図６】図６は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール、およびその組合せの、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋グループの細胞の増殖作用に対する影響を示す。
【図７】図７のＡおよびＢは、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せによって、異なる供給源のＰＢＭＣが刺激され、ＰＢＭＣにおいて分泌されるサイトカインの状況を示したものである。
【図８】図８は、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを有する混合プールにより処理を行った樹状細胞（ＤＣｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ ｏｆ ５ ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）が、非接着性末梢血単核細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ＰＢＭＣ）を刺激し、そのうちのＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞（ＩＥ）の細胞内サイトカイン染色の結果を示す。
【図９】図９は、図８の結果を棒グラフで示したものである。図９のＡは、各グループのＩＬ−２の発現状態を示し、図９のＢは、各グループのＣＤ１０７ａの発現状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、出願人は、一種の抗ヘルペスウイルスの免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を産生する免疫原組成物および方法を研究開発した。図１を組み合わせて参照されたい。本発明の方法は、主に以下の各局面を包含する。まず、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドを含む異なる免疫原組成物（１０）により免疫細胞（２０）が刺激される。そのうち免疫原組成物（１０）は、例えばＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰ、およびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来ペプチドプール（１１）（１２）（１３）（１４）（１５）が含まれ、活性化した免疫細胞（２１）が得られる。これは、例えばＴリンパ球などのリンパ球（３０）を活性化する能力を有する。次に、活性化した免疫細胞（２１）およびリンパ球（３０）を一緒に培養すると、免疫エフェクター細胞（３１）が得られる。続いて、得られた免疫エフェクター細胞（３１）を、さらに個体（４０）の体内へ移植することができ、ヘルペスウイルスの関連疾患を予防および治療する目的を達成する。
【００２１】
出願人は、２、３、４または５種類のＣＭＶペプチドプールを組み合わせた混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）が、単一または２つのＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールと比較すると、抗ＣＭＶ免疫応答（ａｎｔｉ−ＣＭＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をさらに効果的に活性化することができ、特に、ＣＭＶ特異的なＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球が活性化されて、高いエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を生じることができることを実証した。本発明のＣＭＶ免疫原組成物および免疫治療方法が、ヘルペスウイルス関連疾患の予防及び治療に使用することができることを示した。
【００２２】
したがって、本発明は、１つの局面において、一種のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチド断片の少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰ、およびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチド断片と、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドを含む。
【００２３】
本発明は、別の局面において、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）をさらに提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチドプールのうちの少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールと、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドプールを含む。
【００２４】
本発明は、別の局面において、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物も提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチド断片を含む。
【００２５】
本発明は、別の局面において、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物も提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチドプールを含む。
【００２６】
ＣＭＶ ｐｐ６５は、一種のＣＭＶ構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、ＨＣＭＶのリン酸化マトリックスタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）を指す。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ｐｐ６５は、６５ｋＤａ低マトリックスリンタンパク質（ｌｏｗｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）、すなわちテグメントタンパク質ＵＬ８３（Ｔｅｇｕｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＵＬ８３）である。（２）生物種（Ｏｒｇａｎｉｓｍ）：ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）であり、ヒトヘルペスウイルス−５（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−５、ＨＨＶ−５）に属する。（３）配列長：５６１アミノ酸である。（４）機能：ＨＣＭＶウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）のマトリックスの１部分を形成する。好ましい具体的実例は、番号がＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０６７２５の配列、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＮＰ＿０４００１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のような配列を有する。
【００２７】
ＣＭＶ ＩＥ−１は、一種のＣＭＶの主要前初期タンパク質−１（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）であり、一種の転写調節タンパク質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ＩＥ−１は、すなわちＵＬ１２３である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：４９１アミノ酸である。（４）機能：前初期転写調節因子に属し、ＥＩ−２のＥ１．７プロモーター遺伝子（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に対する活性化を増強する。好ましい具体的実例は、番号がＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：のＰ１３２０２配列、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０４００６０、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のような配列を有する。
【００２８】
ＣＭＶ ＶＧＬＢは、一種のＣＭＶのウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であり、次に挙げる特性を有する。（１）名称：糖タンパク質Ｂは、糖タンパク質ＧＰ５５とも呼ばれ、すなわちＵＬ５５である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：９０７アミノ酸である。（４）機能：１型膜タンパク質（Ｔｙｐｅ １ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）に属し、ＣＤ２０９／ＤＣ−ＳＩＧＮのウイルス配位子である。これらの作用は、ウイルス粒子を樹状細胞に取り込ませ、主に許容細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）にする。好ましい具体的実例は、番号がＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＹＰ＿０８１５１４の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のような配列を有する。
【００２９】
ＣＭＶ ＶＰＡＰは、一種のＣＭＶのポリメラーゼプロセシビティ因子（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）、つまりＨＣＭＶポリメラーゼタンパク質のサブユニットである。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ＤＮＡポリメラーゼプロセシビティ因子であり、ポリメラーゼアクセサリータンパク質（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）とも呼ばれ、すなわちＵＬ４４である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：４３３アミノ酸である。（４）機能：ＤＮＡポリメラーゼのアクセサリーサブユニット（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ）の働きは、重合反応のプロセシビティを高めることである。好ましい具体的実例は、番号がＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＡＡＯ７３４５２の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のような配列を有する。
【００３０】
ＣＭＶ ｐ１００は、一種のＣＭＶのテグメントタンパク質であり、大きさが１５０ＫＤａのＨＣＭＶマトリックスリンタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）を指す。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ｐｐ１５０であり、塩基性リンタンパク質（Ｂａｓｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＰＰ）とも呼ばれ、すなわちＵＬ３２である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：１０４６アミノ酸である。（４）機能：ＣＭＶの大きい構造リンタンパク質である。好ましい具体的実例は、番号がＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＡＧ３１６４４の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のような配列を有する。
【００３１】
本発明の好ましい実施例において、前述したＣＭＶ ｐｐ６５、ＩＥ−１、ＶＧＬＢ、ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチドは、それぞれ前述した対応する配列と、実質的に同じ配列を有する。
【００３２】
本発明によると、「に由来のペプチド断片」という語は、前記タンパク質配列のすべて、もしくは一部分の配列を有するペプチドまたはペプチド断片を指す。
【００３３】
本発明によると、「実質的に同じ」という語は、異なる種において、アミノ酸配列の変異が、それが構成するタンパク質の活性に必ずしも影響を及ぼすわけではないため、アミノ酸配列が一定程度の相同性を有していれば、そのタンパク質の活性に影響がないことを意味する。上述の一定程度の相同性とは、好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
【００３４】
本発明の好ましい実施例において、前述の免疫原組成物は、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールを含む。ここで使用する「ペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｏｏｌ）」という語は、一種の遺伝子産物全体の配列に及ぶ（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、部分的にアミノ酸の重複を有する、複数のペプチドから構成される組合せを指す。
【００３５】
本発明の好ましい実施例において、各ポリペプチド由来のペプチドプールにおける、各ペプチドの長さは、１２から１８個のアミノ酸である。
【００３６】
本発明の好ましい実施例において、各ペプチドプールにおける、隣接する２つのペプチドの配列は、１０から１５個の連続したアミノ酸残基の重複を有する。
【００３７】
例を挙げると、前述したポリペプチド由来のペプチドプールが、「ペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）」である場合、これは、一種の遺伝子産物全体の配列に及ぶ（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、部分的にアミノ酸の重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）を有する、１５量体ペプチドで構成されるペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｏｏｌ）を意味する。同じ理由で、その他の大きさのペプチドを有するペプチドプールも、同じである。
【００３８】
本発明の好ましい具体例において、各ポリペプチド由来のペンタデカペプチドプールにおける、２つの隣接するペンタデカペプチドは、１１個の連続したアミノ酸残基の重複を有する。例えば、図２に示すように、ＣＭＶのｐｐ６５遺伝子の遺伝子産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載した配列を有し、５６１個のアミノ酸を含む。ＣＭＶのｐｐ６５ポリペプチド由来のペンタデカペプチドプール（１１）は、多くのペプチドを含むことができ、そのうち１５量体ペプチド（１１１）は１から１５の位置の１５個のアミノ酸が連続する配列を有する。その隣接した別の１５量体ペプチド（１１２）は、５から１５の位置の連続する１１個のアミノ酸が重複し、それに続く１６から１９の位置の４個の連続するアミノ酸残基配列を有する。さらに隣接した１５量体ペプチド（１１３）は、９から１９の位置の連続する１１個のアミノ酸が重複し、それに続く２０から２３の位置の４個の連続するアミノ酸残基配列を有する。これから類推すると、最後に残る、４個の連続するアミノ酸残基が不足するとき、重複部分のアミノ酸配列を伸長し、各ペンタデカペプチドを満足させることを、１５量体（１５−ｍｅｒ）の条件とする。
【００３９】
本発明によると、前記原則は、前述したＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールにも適用される。
【００４０】
本発明によると、前述したペプチドプールを、本技術分野で周知の方法によって合成することができる。本発明の好ましい具体例において、前述のペプチドプールは人工的に合成されたペプチドで構成される。
【００４１】
本発明によると、前述したペプチドプールにおける隣接したペプチドとは、設定した最長の重複である連続するアミノ酸配列を有する２つのペプチドを意味する。前述の１５量体ペプチドのペプチドプールを例とすると、このペプチドプールが１１個の連続したアミノ酸配列の重複を有すると設定する場合、この隣接した２つのペプチドは、それぞれＣ末端に近い１１個の連続したアミノ酸配列、およびＮ末端に近い１１個の連続したアミノ酸が同じである。
【００４２】
本発明によると、前述の免疫原組成物は、さらに生理的に受容できる支持剤または賦形剤を含む。
【００４３】
本発明によると、前述の免疫原組成物は、さらに免疫促進剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）を含む。
【００４４】
ここで使用される「免疫促進剤（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）」という語は、外来抗原に対する抗体または細胞調節を含む免疫応答を、実質的に増進または増強することができる任意の物質を意味する。一種の好ましい免疫促進剤は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含む。アジュバントは、抗原を保護し、高代謝しないように設計された物質を含む。例えば、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）または鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）および免疫応答刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、例えば界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）に属する共重合体（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）であり、リピドＡ（ｌｉｐｉｄ Ａ）などを含む。そのほか、さらに百日咳菌由来のタンパク質（Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と、由来するタンパク質である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、免疫調節剤とみなすことができる、例えばα−ｇａｌａｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（α−ＧａｌＣｅｒ）およびその誘導体などの糖脂質、ならびにＣｐＧ由来のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を含む。
【００４５】
特定のアジュバントは、市販の試薬でよく、例えば不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、ローウェイ、ニュージャージ州）、ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）、例えば水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｇｅｌ）またはリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などのアルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ）、カルシウム、鉄または亜鉛の塩類、アシル化チロシンの不溶性浮遊物（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｙｌａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、アシル化糖類（ａｃｙｌａｔｅｄ ｓｕｇａｒｓ）、陽イオンまたは陰イオン由来の多糖（ｃａｔｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｏｒ ａｎｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ）、生分解性ミクロスフェア（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）と、キラヤサポナリアＡ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ａ、Ｑｕｉｌ Ａ）、ならびに、その他の例えばＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン２、−７、−１２などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などであり、その他の類似する成長ホルモンもアジュバントとして使用できる。
【００４６】
本発明は、別の局面において、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫細胞を活性化する方法を提供する。これは、免疫細胞および前述した免疫原組成物を混合し、細胞混合培養物を形成することと、この細胞混合培養物を適当な培地で培養し、活性化した免疫細胞が得られることとを含む。
【００４７】
本発明によると、前述した免疫細胞は、一種の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）である。好ましくは、前述した免疫細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）を含む。好ましい樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）は、末梢血単核細胞、骨髄細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）由来である。
【００４８】
当業者には周知のように、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、哺乳動物の一種の白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）に存在する。主に血液、環境中にさらされる組織およびその他の組織、例えば皮膚、鼻腔、肺、胃および小腸の上皮組織などに存在する。これらの働きは、環境刺激により生じる先天的および後天的免疫応答を調節する。そのうちの１つの最も重要な機能は、抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）した後、免疫システムのその他の白血球に提示（ｐｒｅｓｅｎｔ）することであり、したがって、一種の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）である（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：５２２〜５２７、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、 １３（１４）：１５９１〜６０７、２００６年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８（５）：３５１〜６０、２００８年）。本発明の好ましい実施例において、該樹状細胞は、ヒトの樹状細胞である。
【００４９】
本発明によると、前述の適当な培地は、サイトカインまたは成長ホルモンを含む。該サイトカインは、次に挙げるＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびその組合せで構成される群から選択される。
【００５０】
本発明は、別の局面において、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の産生を誘発する方法を提供する。これは次に挙げる、一種の前述した方法で得られる活性化した免疫細胞および一種のリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を提供するステップと、この活性化した免疫細胞およびリンパ球を、適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップとを含む。
【００５１】
好ましい該リンパ球は、一種の自己または異種リンパ球（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）である。さらに好ましい該リンパ球は、一種の自己リンパ球（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）である。
【００５２】
本発明によると、該リンパ球は、非接着性の末梢血単核細胞に由来する。本発明の好ましい実施例において、該リンパ球はＴリンパ球またはＢリンパ球である。さらに好ましくは、Ｔリンパ球は自己Ｔリンパ球である。
【００５３】
ここで使用される「自己の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」という語は、当業者には周知のように、同一個体に由来することを示す。例を挙げると、示された自己免疫細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）が、提供された樹状細胞と同一個体（ｓｅｌｆｓａｍｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）に由来する免疫細胞であることを示す。これにより、不必要な免疫応答、例えば異種免疫応答（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）などの発生が誘発されるのを防止する。
【００５４】
本発明による免疫原組成物は、一種のヘルペスウイルスファミリーに属するサイトメガロウイルスに由来する。本発明の方法により得られる活性化した免疫細胞も、ヘルペスウイルス特異性を有するリンパ球を活性化することができ、さらにはヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）に対する免疫応答を誘発することに応用される。
【００５５】
示したヘルペスウイルスは、これに限定されないが、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス−１（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス−２（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−２、ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ）、エプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ、ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス−６（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−６、ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス−７（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−７、ＨＨＶ−７）、およびヒトヘルペスウイルス−８（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−８、ＨＨＶ−８）でよい。
【００５６】
本発明は、さらに以下の実施例によって説明を行う。しかし、明らかであることは、これらの実施例は説明のために用いたに過ぎず、本発明を実施する上での制限であるとみなされるべきではない。
【実施例】
【００５７】
実験材料および方法
１．ペプチドおよび抗原
以下の実施例で使用した１５量体ペプチドプール（１５−ｍｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｏｏｌｓ）は、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）から購入した。これは、次に挙げる、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（５６１個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは１３８種のペプチドを含む）、ＨＣＭＶＡ ＩＥ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）（４９１個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは１２０種のペプチドを含む）、ＨＣＭＶＡ ＶＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（４３３個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは１０６種のペプチドを含む）、ＨＣＭＶＡ ｐ１００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（１０４８個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは２５９種のペプチドを含む）、およびＨＣＭＶＴ ＶＧＬＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（９０７個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは２２４種のペプチドを含む）の全長に及び（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、１１個のアミノ酸が部分的に重複する配列を有するペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む。その他の抗原およびペプチドは、異なる方法で合成することができる。そのうち、ＷＴ−１（Ｗｉｌｍ’ｓ ｔｕｍｏｒ １）（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ：Ｐ１９５４４、この配列をＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：６に示す）由来のペプチドプール（ＷＴ３３、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、およびＣ型肝炎ウイルスのコアウイルス（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＢＶ４６２３４（１−１９１／／ｐｒｏｄｕｃｔ＝“ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ”、この配列をＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：７に示す）由来のペプチドプールは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃａｎ １５／１１の方式で、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツに発注した。これらは、非特異的ペプチドプールとして使用した。
【００５８】
２．末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）の分離
血漿を分離した血液（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｂｌｏｏｄ）および全血は、健康なドナーから採取した。末梢血単核細胞は、前に述べたようにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ニュージャージ州、米国）を使用し、密度勾配遠心分離により調製した（Ｈａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．、２００８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６：２６９〜２７９）。ヒト末梢血単核細胞の生存率は、トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）により測定し、細胞生存率が８０％より大きいグループの細胞だけを以下の実施例に使用した。
【００５９】
３．樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）の調製
末梢血単核細胞を、１×１０７細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で６ウェルプレートに播き、末梢血単核細胞をＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、カリフォルニア州、米国）で２時間培養し、接着を行った。続いて、未接着の細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を慎重に取り除いて冷凍し、後の共培養実験に使用するＴリンパ球（Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の供給源とした。接着した細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州、米国）および２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州、米国）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地で培養した。樹状細胞を産生するため、細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で２４時間培養し、さらにＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｇｅｎｔａｕｒ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、米国）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、米国）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＰＧＥ２（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、米国）で２４時間培養し、成熟反応（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を行った。樹状細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、フローサイトメトリー法で分析した。
【００６０】
４．樹状細胞を活性化することによる、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）での抗原特異的リンパ球の増幅
図３を合わせて参照されたい。前記方法は、おおよそ図中に示されるプロセスで行った。樹状細胞によって活性化されたリンパ球は、先に記載した方法に基づき調製される（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、上述と同じ）。簡単に述べると、成熟した樹状細胞を、ペプチド（５μｇ／ｍＬ）またはその他の抗原で３時間負荷（ｌｏａｄｅｄ）し、放射線照射を行った（２，５００ｒａｄｓ）。樹状細胞および相同な非接着性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１：２０の比率で、２％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で共培養し、３日目に、ＩＬ−２（Ｇｅｎｔａｕｒ、アーヘン、ドイツ）、ＩＬ−７（Ｇｅｎｔａｕｒ）およびＩＬ−１５（Ｇｅｎｔａｕｒ）を添加した。続いて、１日おきに、これらのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を含む新鮮な培地を添加した。共培養物中のＴリンパ球の機能分析は、細胞内サイトカイン染色（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって行った。
【００６１】
５．カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステルを基礎とした細胞増殖分析法、ＣＦＳＥを基礎とした細胞増殖分析法（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＣＦＳＥ−ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）
簡単に述べると、１×１０６ＰＢＭＣｓを、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を利用して標識し、続いて抗原を利用して培養を刺激した。３日目に、ＩＬ−２（Ｇｅｎｔａｕｒ、アーヘン、ドイツ）およびＩＬ−１５（Ｇｅｎｔａｕｒ）を添加した。次に、１日おきにこれらのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を含む新鮮な培地を添加し、７日目まで続けた。細胞のＣＤ４およびＣＤ８について染色し、フローサイトメトリー法で分析した。
【００６２】
６．ＣＤ１０７ａおよび細胞内サイトカイン染色（ＣＤ１０７ａ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
細胞染色の分析は、Ｈａｎらの文献のように行った（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、上述と同じ）。簡単に述べると、３×１０５の増幅したＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞（ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＭＶ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）は、抗原負荷した相同な樹状細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＤＣｓ）もしくは単核細胞を使用して、抗ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣを有するか、または有さないＡＩＭ−Ｖ培地で刺激を行った。刺激反応を１時間行った後、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した。５時間後、細胞のＣＤ４およびＣＤ８について染色、固定（ｆｉｘｅｄ）、透過（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ）し、さらにＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−２に対する抗体（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）を利用し、ＦＩＸ／ＰＥＲＭおよびＰＥＲＭ／Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）を使用して、染色を行った。
【００６３】
７．酵素結合イムノスポットアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳｐｏｔ ａｓｓａｙ）
分離したばかりのＰＢＭＣを、１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で、１０μｇ／ｍｌ ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ（１−Ｄ１Ｋ、ＭａｂＴｅｃｈ）でコート（ｃｏａｔｅｄ）した９６ウェルプレートに播き、なおかつ５％不活化ヒトＡＢ血清（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍ）（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、米国）を使用し、ブロック（ｂｌｏｃｋ）を行った。異なるペプチドプールの組合せを利用し、２重の方式で細胞の刺激反応を行った。３７℃、５％ＣＯ２下で１８から２０時間培養を行った後、細胞を単離し、１μｇ／ｍｌのビオチン標識した抗ＩＦＮ−γ（ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ）（７−Ｂ６−１、ＭａｂＴｅｃｈ）を添加した。ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡＬＰ）（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加することにより、呈色反応（ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の［スポット（ｓｐｏｔｓ）］が形成され、続いて基質のＢＣＩＰ／ＮＢＴ−ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。スポットの数は、ＥＬＩＳＰＯＴ読取装置（ＥＬＩＳＰＯＴ ｒｅａｄｅｒ）（ＡｕｔｏＩｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）で算出した。１０６ＰＢＭＣごとに含まれるスポット形成細胞（ｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＳＦＣ）が示される。
【００６４】
実施例１ 異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたはその組合せによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が刺激される効果の分析−−−ＣＦＳＥ染色法を利用
本実施例の目的は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せを利用して、末梢血単核細胞を刺激し、さらにＣＦＳＥ染色を利用して、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せの、末梢血単核細胞の細胞増殖活性に対する影響を分析し、それによって異なる組合せで免疫応答を刺激して生じる効果について理解することにある。
【００６５】
ＣＦＳＥ標識した抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、それぞれ「実験材料および方法」に記載した方法に基づき、以下に記載するグループに分け、異なるペプチドプールの組合せによって末梢血単核細胞を刺激し、７日間培養を行った。
【００６６】
（１）ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、サンプル「１」で示す。
（２）ＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「２」で示す。
（３）ＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「３」で示す。
（４）ｐ１００のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「４」で示す。
（５）ＶＰＡＰのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「５」で示す。
（６）ｐｐ６５およびＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「６」で示す。
（７）ｐｐ６５およびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「７」で示す。
（８）ＶＧＬＢおよびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「８」で示す。
（９）ｐｐ６５、ＶＧＬＢおよびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「９」で示す。
（１０）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１およびｐ１００のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「１０」で示す。
（１１）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１、ｐ１００およびＶＰＡＰのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「１１」で示す。
【００６７】
そのほか、以下のグループをコントロール群とした。
【００６８】
（１２）ＣＦＳＥ標識した末梢血単核細胞を単独で培養し、未刺激のコントロール群（ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。サンプル「１２」で示し、実験のバックグラウンド値とした。
（１３）ＣＦＳＥ標識した末梢血単核細胞、およびＣ型肝炎ウイルスのコアウイルス（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）由来のペプチドプールを負荷した樹状細胞を共培養し、ネガティブコントロール群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。サンプル「１３」で示す。
【００６９】
上述で刺激されたＰＢＭＣは、続いて「実験材料および方法」に示す方法の通り、抗原特異的細胞増殖（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および分析を行った。さらに「細胞内サイトカイン染色」分析を行い、得られた実験データから先にＰＢＭＣの数値を差し引き、図を作成した。
【００７０】
結果は、図４に示す通りである。図４Ａは、異なるペプチドプールの組合せによる刺激下での、細胞増殖の状態を示す。図４Ｂは、異なるペプチドプールの組合せで増殖した細胞を示し、これは、ＩＦＮ−γの能力を表す。
【００７１】
上述の結果から以下のことがわかる。（１）５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを単独で使用するとき、そのすべてにおいて反応がある。（２）ｐｐ６５、ＶＧＬＢおよびｐ１００のような単一ポリペプチド由来のペプチドプールもまた、免疫応答を誘発することができる。（３）２種類以上のペプチドプールの組合せは、単一のペプチドプールで得られる結果より比較的良好である。（４）この５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールにおいて、ｐｐ６５およびＶＧＬＢの２種類のペプチドプールの免疫応答は比較的強く、組み合わせると免疫応答は付加効果を有する。ペプチドプールの組合せは数が多いほど、付加効果は良好である。
【００７２】
実施例２ 異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたはその組合せによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が刺激される効果の分析−−−ＥＬＩＳｐｏｔ分析法を利用
本実施例の目的は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せを利用して、末梢血単核細胞を刺激し、さらにＥＬＩＳｐｏｔを利用して、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せの、ＰＢＭＣの細胞機能に対する影響を分析することにある。
【００７３】
異なるドナーから分離されたばかりの末梢血単核細胞は、それぞれ「実験材料および方法」に記載の方法により得られた。以下に記載するグループにおいて、異なるペプチドの組合せによってＰＢＭＣを刺激し、培養して２０時間刺激した。また「実験材料および方法」に記載のＥＬＩＳｐｏｔ分析法を利用して、ＩＦＮ−γの分析を行った。
【００７４】
（１）ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、サンプル「１」で示す。
（２）ＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「２」で示す。
（３）ＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「３」で示す。
（４）ｐｐ６５およびＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「４」で示す。
（５）ｐｐ６５およびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「５」で示す。
（６）ｐｐ６５、ＶＧＬＢおよびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「６」で示す。
（７）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１およびｐ１００のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「７」で示す。
（８）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１、ｐ１００およびＶＰＡＰのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「８」で示す。
【００７５】
結果は図５に示す通りである。ｐｐ６５＋ＶＧＬＢ［棒４（ｂａｒ４）を参照］またはｐｐ６５＋ＩＥ−１［棒５（ｂａｒ５）を参照］は、ＰＢＭＣを刺激してＩＦＮ−γを産生する効果について、ｐｐ６５［棒１（ｂａｒ１）を参照］より比較的顕著である。また、そのうちｐｐ６５＋ＶＧＬＢ（棒４を参照）の刺激効果は、ｐｐ６５＋ＩＥ−１（棒５を参照）より優れている。複数種のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールの組合せのグループの効果（棒６、７、８を参照）は、２種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含むグループ（棒４、５を参照）、またはｐｐ６５単独のグループ（棒１を参照）より、わずかに優れている。
【００７６】
実施例３ ＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたは組合せによって、ＰＢＭＣ各グループの細胞が刺激される増殖作用の分析
本実施例の目的は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せを利用してＰＢＭＣを刺激し、さらに異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せの、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋グループの細胞に対する増殖作用の影響を分析することにある。
【００７７】
ＣＦＳＥ標識したＰＢＭＣは、それぞれ（１）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、「ｐｐ６５」で示し、（２）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５およびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１の２つのペンタデカペプチドを含む混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）であり、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ペプチドプールおよびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１ペプチドプールを含み、「ｐｐ６５／ＩＥ−１」で示し、（３）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５、ＨＣＭＶＡ ＩＥ−１、ＨＣＭＶＡ ＶＰＡＰ、ＨＣＭＶＡ ｐ１００、ＨＣＭＶＴ ＶＧＬＢの５つのペンタデカペプチドプールを含む混合プールであり、「５ｐｅｐｍｉｘ」で示し、（４）非特異的ペンタデカペプチドプールであり、「ＷＴ−１」で示し、（５）抗ＣＤ３抗体であり、ポジティブコントロール群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ａｎｔｉ−ＣＤ３」で示す、などを刺激物として、７日間培養を行った。また「実験材料および方法」に記載した方法のように、抗原特異的細胞増殖（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の分析を、特に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋グループの細胞の増殖作用について行った。またＣＦＳＥ標識したＰＢＭＣの単独培養を未刺激のコントロール群（ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ＰＢＭＣ」と示す。
【００７８】
結果は図６に示す通りである。各グループのＣＦＳＥ希釈の細胞（ＣＦＳＥ−ｄｉｌｕｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）（つまり増殖細胞）の割合は、図６に明示する通りである。単一のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５）、または２種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５／ＩＥ−１）と比較して、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（５ｐｅｐｍｉｘ）は、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋またはＣＤ８＋グループの細胞に関わらず、すべて最高の増殖作用を誘発した。これは、この５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む組合せが、最も強い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有することを示す。
【００７９】
実施例４ 各種のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたは組合せによって刺激される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の機能性分析
本実施例は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せによって、異なる供給源からのＰＢＭＣの細胞を刺激し、さらにＰＢＭＣのサイトカイン分泌の状態を分析して、免疫機能を判定することにより、各種組合せの免疫原性を確定した。
【００８０】
ドナー２人からのＰＢＭＣは、それぞれ（１）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、「ｐｐ６５」で示し、（２）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５およびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１の２つのペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）であり、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ペプチドプールおよびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１ペプチドプールを含み、「ｐｐ６５／ＩＥ−１」で示し、（３）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５、ＨＣＭＶＡ ＩＥ−１、ＨＣＭＶＡ ＶＰＡＰ、ＨＣＭＶＡ ｐ１００、ＨＣＭＶＴ ＶＧＬＢの５つのペンタデカペプチドプールを含む混合プールであり、「５ｐｅｐｍｉｘ」で示し、（４）非特異的ペンタデカペプチドプールであり、「ＷＴ−１」で示し、（５）抗ＣＤ３抗体であり、ポジティブコントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ａｎｔｉ−ＣＤ３」で示す、などを刺激物として７日間培養を行った。さらに「実験材料および方法」に記載の方法のように、細胞内サイトカイン染色分析（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＣＣＳ）を行い、各グループの細胞のＩＬ−２およびＩＦＮ−γの発現に対して分析を行った。ＰＢＭＣ単独培養を未刺激のコントロール群（ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ＰＢＭＣ ｏｎｌｙ」と示す。
【００８１】
図７ＡおよびＢは、それぞれ異なる供給源のＰＢＭＣに関する、前述の試験で得られた結果を示す。そのうち各棒グラフは、図中に明示されるように、それぞれＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを発現するＰＢＭＣを具体的に表す。結果を、単一のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５）、または２種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５／ＩＥ−１）と比較して述べると、該５種類のＣＭＶ抗原のペプチドプールを含む混合プール（５ｐｅｐｍｉｘ）は、ＰＢＭＣを刺激し、細胞に対してＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを発現する能力が最も優れている。これは、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む組合せが、最も強い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有することを示す。
【００８２】
実施例５ 樹状細胞がＰＢＭＣを刺激することによる、ＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞の産生
本実施例は、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プールを利用して処理した樹状細胞（ＤＣｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ ｏｆ ５ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）が、非接着性末梢血単核細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ＰＢＭＣ）を刺激し、ＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞が産生される効果について理解する。
【００８３】
５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）を使用して処理した樹状細胞、および非接着性末梢血単核細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ＰＢＭＣ）（Ｔリンパ球の供給源とする）を、「実験材料および方法」に記載の方法を利用して調製し、共培養を行った（図３を参照）。共培養を１５日間行い、ＤＣにより活性化されたリンパ球（ＤＣ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を、それぞれ単一のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール（ｐｐ６５、ＩＥ−１、ＶＧＬＢ、ＶＰＡＰ、ｐ１００）またはこの５種類のペプチドプールの組合せを含む樹状細胞によって、５時間再刺激（ｒｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）した。それと同時に、ホルボールミリスチン酸アセタートにイオノマイシンを加えて（ＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＤＣにより活性化されたリンパ球を刺激し、ポジティブコントロール群とし、非特異的抗原（ＷＴ−１）で処理した相同な樹状細胞をコントロール群とした。再刺激されたリンパ球は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）と、脱顆粒作用の細胞標識ＣＤ１０７ａに対する染色により、抗原特異的免疫エフェクター細胞の機能について、評価を行った。
【００８４】
図８は、前記細胞内サイトカイン染色の結果である。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αなどのサイトカインと、ＣＤ１０７ａの発現は、図８に明示する通りである。図９ＡおよびＢは、図８の結果に基づき作成した棒グラフである。それぞれＩＬ−２および／またはＴＮＦ−αを発現した細胞の全体に占める割合と、ＩＦＮ−γおよび／またはＣＤ１０７ａを発現した細胞の全体に占める割合を示す。結果は、５種類のペプチドプールの組合せ（５ｐｅｐｍｉｘ）の刺激によって産生された活性化免疫細胞は、いずれか１つの単一のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールに対して、特異的応答（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が生じ、そのうち、ｐｐ６５およびＶＧＬＢの免疫応答が最も強いことを示した。５種類のペプチドプールの組合せで処理した樹状細胞で再刺激したグループは、免疫エフェクター細胞中で、最も高いサイトカイン産生をもたらすことができる。
【００８５】
前記実施例の結果は、複数のＣＭＶタンパク質由来（最高で５種類まで）のペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）を混合した組合せが、短時間の暴露でＣＤ４＋およびＣＤ８＋の２つのＴリンパ球を同時に、効果的に活性化することができることを示した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴリンパ球の抗原特異的増殖反応と、エフェクターサイトカイン（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の産生が顕著に向上した。これは、ＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールの組合せが、抗ＣＭＶ免疫力を形成する、一種の効果的なワクチンまたは免疫療法とすることができることを示す。図６および図７に示すように、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールの組合せは、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の細胞の増殖反応とサイトカイン合成を誘発することができる。単独および２種類を混合したＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールも免疫応答を刺激するが、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールの組合せは、最も強い抗原特異的免疫応答を生じることができる。免疫エフェクター細胞の機能は、数種類の免疫活性化サイトカインおよび脱顆粒作用の標識ＣＤ１０７ａに対する多色フローサイトメトリーにより、分析評価を行った。図８および図９に示すように、単一または２種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールと比較すると、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを混合した組合せ（５ｐｅｐｍｉｘ）は、エフェクターサイトカイン（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の産生、およびＣＤ１０７ａの脱顆粒化作用（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を誘発する上で、最も効果的であった。これは、５種類のＣＭＶペプチドプールを混合した組合せが、一種の最も効果的なＣＭＶワクチンまたは免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）であることをさらに実証した。
【００８６】
以上の記述は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明に対し、いかなる形式での制限も行わない。いかなる当業者も、本発明で提起した技術的特徴から逸脱しない範囲内において、本発明で開示された技術内容を利用し、部分的な変更または修飾を行った同等の実施例、さらに本発明から逸脱しない技術的特徴の内容は、すべて本発明の技術的特徴の範囲内に属するべきである。
【符号の説明】
【００８７】
１０ 免疫原組成物
１１ ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプール
１２ ＣＭＶ ＩＥ−１ペプチドプール
１３ ＣＭＶ ＶＧＬＢペプチドプール
１４ ＣＭＶ ＶＰＡＰペプチドプール
１５ ＣＭＶ ｐ１００ペプチドプール
１１１ １５量体ペプチド
１１２ １５量体ペプチド
１１３ １５量体ペプチド
２０ 免疫細胞
２１ 活性化された免疫細胞
３０ リンパ球
３１ 免疫エフェクター細胞
４０ 個体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一種の抗ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）のワクチンに関し、特に抗ヘルペスウイルスの免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）の産生に使用される免疫原組成物に関する。本発明は、さらに前記免疫原組成物の用途、および免疫細胞の活性化に応用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスはヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに属する。現在までに、８種のウイルスに関して、ヒトにおける疾病の原因となることが知られている。この種のウイルスはヒトヘルペスウイルス（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ、ＨＨＶ）と総称され、その中には以下が含まれる。（１）ヒトヘルペスウイルス−１（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＨＶ−１）であり、単純ヘルペスウイルス−１（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＳＶ−１）とも言われる。（２）ヒトヘルペスウイルス−２（ＨＨＶ−２）であり、単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）とも言われる。（３）ヒトヘルペスウイルス−３（ＨＨＶ−３）、すなわち水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ、ＶＺＶ）であり、水痘および帯状疱疹を引き起こすことがあり、水痘ウイルスとも呼ばれる。（４）ヒトヘルペスウイルス−４（ＨＨＶ−４）、すなわちエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ、ＥＢＶ）で、一種のリンパ球ウイルスである。バーキットリンパ腫および上咽頭癌を引き起こすことがある。（５）ヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）、すなわちサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）である。（６）ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）、すなわちロゼオロウイルスであり、小児バラ疹および突発性発疹を含む第六病を引き起こすことがある。（７）ヒトヘルペスウイルス−７（ＨＨＶ−７）であり、ＨＨＶ−６と近似し、症状はだいたい同じである。（８）ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）であり、ラジノウイルス属で、ｋＳＨＶと略される。カポジ肉腫から発見された。
【０００３】
移植を受けた患者のヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ、ＨＶ）に対する感染管理は、既存技術では、主に抗ウイルス薬を使用し、先制的治療（ｐｒｅｅｍｐｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または予防治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を行う。サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）を例とすると、前者は、培養実験により陽性が示されるか、または検査によってウイルスが自発的複製をしていることが示されると、無症状であっても先制的治療を行う。後者は、血清に対して陽性である患者は、感染の証拠がなくても予防治療を行う。既存技術において、ＣＭＶ複製の制御に使用される数種の抗ウイルス薬には、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、フォスカネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）およびシドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）（Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００４年、４：７２５〜３８）が含まれる。移植を受けた患者に対して、これらの試薬を用いて、治療としてヘルペスウイルス感染の制御を行い、現在すでに顕著な進歩を遂げている。
【０００４】
しかしながら、これらの薬理学的戦略（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）には制限がある。例えば、薬物毒性、薬剤耐性の発生、低経口バイオアベイラビリティ（ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）および低効力などの問題である。抗ウイルス薬を利用して治療しても、死亡率は依然として高く、特に、可能な限り早期に治療を始めていない場合に高い（Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、上述と同じ、Ｉｓｏｎ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ．、２００５年、２６：６９１〜７０５、Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．、２００３年、１７：２５９〜６４）。そのほか、患者がこれらの試薬を長期間使用すると、抗ウイルス薬に対する薬剤耐性が徐々に発生することがある（Ｉｓｏｎ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．、上述と同じ、Ｂｉｒｏｎ ＫＫ．、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、２００６年、７１：１５４〜６３）。
【０００５】
既存の、ヘルペスウイルス感染症に対する免疫療法は、生ウイルスを基にしたヘルペスウイルス抗原の供給源（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルスに感染した細胞（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、ヘルペスウイルス遺伝子発現ベクター（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）、または合成されたヘルペスウイルスタンパク質もしくはペプチドを使用し、ヘルペスウイルス特異的免疫応答を活性化する抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）を刺激する。ウイルスまたはウイルス感染した細胞を抗原の供給源とすると、ウイルス汚染および感染を引き起こすという潜在的な危険性があり、全長のヘルペスウイルス遺伝子またはタンパク質を抗原の供給源とすると、免疫抑制作用（ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）または免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を誘発する潜在的危険がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００４年、４：７２５〜３８
【非特許文献２】Ｉｓｏｎ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ．、２００５年、２６：６９１〜７０５
【非特許文献３】Ｇａｎｄｈｉ ＭＫ、ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．、２００３年、１７：２５９〜６４
【非特許文献４】Ｂｉｒｏｎ ＫＫ．、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、２００６年、７１：１５４〜６３
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：５２２〜５２７、２０００年
【非特許文献６】Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、 １３（１４）：１５９１〜６０７、２００６年
【非特許文献７】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８（５）：３５１〜６０、２００８年
【非特許文献８】Ｈａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．、２００８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６：２６９〜２７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、既存技術が前述したウイルス汚染による感染、および免疫寛容などを含む問題を有することに基づき、一種のヘルペスウイルス疾患に対する免疫療法を提供することにある。これは、前述したような、生ウイルス、ヘルペスウイルス感染細胞、または全長のヘルペスウイルスタンパク質を使用することにより生じる種々の問題が起こることはない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の目的を達成するため、第１の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチド断片の少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチド断片と、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドを含む。
【０００９】
第２の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチドプールのうちの少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールと、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドプールを含む。
【００１０】
第３の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物を提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチド断片を含む。
【００１１】
第４の局面において、本発明は、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物を提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチドプールを含む。
【００１２】
本発明の好ましい実施例において、前記免疫原組成物のうちのＣＭＶ ｐｐ６５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ＩＥ−１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ＶＧＬＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ＶＰＡＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と実質的に同じ配列を有する。ＣＭＶ ｐ１００はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と実質的に同じ配列を有する。
【００１３】
好ましくは、前述した免疫原組成物は、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールを含む。
【００１４】
第５の局面において、本発明は、前述した第１から第４の局面のいずれか１つの免疫原組成物が、生体外でヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発する用途を提供する。
【００１５】
第６の局面において、本発明は、前述した第１から第４の局面のいずれか１つの免疫原組成物が、ヘルペスウイルス感染症を治療する医薬品の製造に使用される用途を提供する。
【００１６】
第７の局面において、本発明は、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫細胞を活性化する方法を提供する。これは次に挙げる、免疫細胞および前述の第１から第４の局面のいずれか１つの免疫原組成物を混合し、細胞混合培養物を形成するステップと、この細胞混合培養物を適当な培地で培養し、活性化した免疫細胞が得られるステップとを含む。
【００１７】
第８の局面において、本発明は、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）の産生を誘発する方法を提供する。これは次に挙げる、一種の前述した第１から第４の局面のいずれか１つの方法によって得られる活性化された免疫細胞、および一種のリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を提供するステップと、この活性化された免疫細胞およびリンパ球を、適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップとを含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、免疫原組成物が抗ＣＭＶ免疫応答（ａｎｔｉ−ＣＭＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を効果的に活性化することができ、さらにこれらのペプチドプールは生ウイルス、ＣＭＶ感染した細胞を使用しないため、不必要な感染の問題および免疫抑制作用、免疫寛容などの潜在的な危険性がないことを実証した。そのほか、本発明による方法は、免疫細胞を効果的に活性化し、またリンパ球をさらに活性化することにも使用され、抗ＣＭＶウイルス活性を有する免疫エフェクター細胞を産生する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の方法の簡単なフローチャートである。
【図２】図２は、ＣＭＶポリペプチド由来のペプチドプールの概要図である。このポリペプチドはｐｐ６５を例としている。
【図３】図３は、樹状細胞によって活性化されるリンパ球の調製プロセスである。
【図４】図４は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール、およびその組合せによってＰＢＭＣの細胞が刺激され、増殖作用が生じる効果を示す。そのうち、ＡはＣＦＳＥ染色分析の結果であり、Ｂは細胞内サイトカイン染色分析の結果である。
【図５】図５は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール、およびその組合せによってＰＢＭＣの細胞が刺激され、免疫応答が生じる効果を示す。そのうち、Ａ、Ｂは、それぞれ異なるドナーからのＰＢＭＣの試験結果である。
【図６】図６は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール、およびその組合せの、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋グループの細胞の増殖作用に対する影響を示す。
【図７】図７のＡおよびＢは、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せによって、異なる供給源のＰＢＭＣが刺激され、ＰＢＭＣにおいて分泌されるサイトカインの状況を示したものである。
【図８】図８は、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを有する混合プールにより処理を行った樹状細胞（ＤＣｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ ｏｆ ５ ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）が、非接着性末梢血単核細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ＰＢＭＣ）を刺激し、そのうちのＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞（ＩＥ）の細胞内サイトカイン染色の結果を示す。
【図９】図９は、図８の結果を棒グラフで示したものである。図９のＡは、各グループのＩＬ−２の発現状態を示し、図９のＢは、各グループのＣＤ１０７ａの発現状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、出願人は、一種の抗ヘルペスウイルスの免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を産生する免疫原組成物および方法を研究開発した。図１を組み合わせて参照されたい。本発明の方法は、主に以下の各局面を包含する。まず、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドを含む異なる免疫原組成物（１０）により免疫細胞（２０）が刺激される。そのうち免疫原組成物（１０）は、例えばＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰ、およびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来ペプチドプール（１１）（１２）（１３）（１４）（１５）が含まれ、活性化した免疫細胞（２１）が得られる。これは、例えばＴリンパ球などのリンパ球（３０）を活性化する能力を有する。次に、活性化した免疫細胞（２１）およびリンパ球（３０）を一緒に培養すると、免疫エフェクター細胞（３１）が得られる。続いて、得られた免疫エフェクター細胞（３１）を、さらに個体（４０）の体内へ移植することができ、ヘルペスウイルスの関連疾患を予防および治療する目的を達成する。
【００２１】
出願人は、２、３、４または５種類のＣＭＶペプチドプールを組み合わせた混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）が、単一または２つのＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールと比較すると、抗ＣＭＶ免疫応答（ａｎｔｉ−ＣＭＶ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をさらに効果的に活性化することができ、特に、ＣＭＶ特異的なＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球が活性化されて、高いエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を生じることができることを実証した。本発明のＣＭＶ免疫原組成物および免疫治療方法が、ヘルペスウイルス関連疾患の予防及び治療に使用することができることを示した。
【００２２】
したがって、本発明は、１つの局面において、一種のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチド断片の少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰ、およびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチド断片と、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドを含む。
【００２３】
本発明は、別の局面において、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）をさらに提供する。これは、（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチドプールのうちの少なくとも１つ、ならびに（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールと、前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドプールを含む。
【００２４】
本発明は、別の局面において、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物も提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチド断片を含む。
【００２５】
本発明は、別の局面において、一種のサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物も提供する。これは、ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチドプールを含む。
【００２６】
ＣＭＶ ｐｐ６５は、一種のＣＭＶ構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、ＨＣＭＶのリン酸化マトリックスタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）を指す。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ｐｐ６５は、６５ｋＤａ低マトリックスリンタンパク質（ｌｏｗｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）、すなわちテグメントタンパク質ＵＬ８３（Ｔｅｇｕｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＵＬ８３）である。（２）生物種（Ｏｒｇａｎｉｓｍ）：ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）であり、ヒトヘルペスウイルス−５（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−５、ＨＨＶ−５）に属する。（３）配列長：５６１アミノ酸である。（４）機能：ＨＣＭＶウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）のマトリックスの１部分を形成する。好ましい具体的実例は、番号がＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０６７２５の配列、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＮＰ＿０４００１８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のような配列を有する。
【００２７】
ＣＭＶ ＩＥ−１は、一種のＣＭＶの主要前初期タンパク質−１（ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）であり、一種の転写調節タンパク質（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ＩＥ−１は、すなわちＵＬ１２３である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：４９１アミノ酸である。（４）機能：前初期転写調節因子に属し、ＥＩ−２のＥ１．７プロモーター遺伝子（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に対する活性化を増強する。好ましい具体的実例は、番号がＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：のＰ１３２０２配列、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０４００６０、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のような配列を有する。
【００２８】
ＣＭＶ ＶＧＬＢは、一種のＣＭＶのウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であり、次に挙げる特性を有する。（１）名称：糖タンパク質Ｂは、糖タンパク質ＧＰ５５とも呼ばれ、すなわちＵＬ５５である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：９０７アミノ酸である。（４）機能：１型膜タンパク質（Ｔｙｐｅ １ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）に属し、ＣＤ２０９／ＤＣ−ＳＩＧＮのウイルス配位子である。これらの作用は、ウイルス粒子を樹状細胞に取り込ませ、主に許容細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）にする。好ましい具体的実例は、番号がＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＹＰ＿０８１５１４の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のような配列を有する。
【００２９】
ＣＭＶ ＶＰＡＰは、一種のＣＭＶのポリメラーゼプロセシビティ因子（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）、つまりＨＣＭＶポリメラーゼタンパク質のサブユニットである。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ＤＮＡポリメラーゼプロセシビティ因子であり、ポリメラーゼアクセサリータンパク質（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）とも呼ばれ、すなわちＵＬ４４である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：４３３アミノ酸である。（４）機能：ＤＮＡポリメラーゼのアクセサリーサブユニット（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ）の働きは、重合反応のプロセシビティを高めることである。好ましい具体的実例は、番号がＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＡＡＯ７３４５２の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のような配列を有する。
【００３０】
ＣＭＶ ｐ１００は、一種のＣＭＶのテグメントタンパク質であり、大きさが１５０ＫＤａのＨＣＭＶマトリックスリンタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）を指す。これは、次に挙げる特性を有する。（１）名称：ｐｐ１５０であり、塩基性リンタンパク質（Ｂａｓｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＰＰ）とも呼ばれ、すなわちＵＬ３２である。（２）生物種：ヒトサイトメガロウイルスであり、ＨＨＶ−５に属する。（３）配列長：１０４６アミノ酸である。（４）機能：ＣＭＶの大きい構造リンタンパク質である。好ましい具体的実例は、番号がＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＡＧ３１６４４の配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のような配列を有する。
【００３１】
本発明の好ましい実施例において、前述したＣＭＶ ｐｐ６５、ＩＥ−１、ＶＧＬＢ、ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチドは、それぞれ前述した対応する配列と、実質的に同じ配列を有する。
【００３２】
本発明によると、「に由来のペプチド断片」という語は、前記タンパク質配列のすべて、もしくは一部分の配列を有するペプチドまたはペプチド断片を指す。
【００３３】
本発明によると、「実質的に同じ」という語は、異なる種において、アミノ酸配列の変異が、それが構成するタンパク質の活性に必ずしも影響を及ぼすわけではないため、アミノ酸配列が一定程度の相同性を有していれば、そのタンパク質の活性に影響がないことを意味する。上述の一定程度の相同性とは、好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
【００３４】
本発明の好ましい実施例において、前述の免疫原組成物は、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールを含む。ここで使用する「ペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｏｏｌ）」という語は、一種の遺伝子産物全体の配列に及ぶ（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、部分的にアミノ酸の重複を有する、複数のペプチドから構成される組合せを指す。
【００３５】
本発明の好ましい実施例において、各ポリペプチド由来のペプチドプールにおける、各ペプチドの長さは、１２から１８個のアミノ酸である。
【００３６】
本発明の好ましい実施例において、各ペプチドプールにおける、隣接する２つのペプチドの配列は、１０から１５個の連続したアミノ酸残基の重複を有する。
【００３７】
例を挙げると、前述したポリペプチド由来のペプチドプールが、「ペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）」である場合、これは、一種の遺伝子産物全体の配列に及ぶ（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、部分的にアミノ酸の重複（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）を有する、１５量体ペプチドで構成されるペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｏｏｌ）を意味する。同じ理由で、その他の大きさのペプチドを有するペプチドプールも、同じである。
【００３８】
本発明の好ましい具体例において、各ポリペプチド由来のペンタデカペプチドプールにおける、２つの隣接するペンタデカペプチドは、１１個の連続したアミノ酸残基の重複を有する。例えば、図２に示すように、ＣＭＶのｐｐ６５遺伝子の遺伝子産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載した配列を有し、５６１個のアミノ酸を含む。ＣＭＶのｐｐ６５ポリペプチド由来のペンタデカペプチドプール（１１）は、多くのペプチドを含むことができ、そのうち１５量体ペプチド（１１１）は１から１５の位置の１５個のアミノ酸が連続する配列を有する。その隣接した別の１５量体ペプチド（１１２）は、５から１５の位置の連続する１１個のアミノ酸が重複し、それに続く１６から１９の位置の４個の連続するアミノ酸残基配列を有する。さらに隣接した１５量体ペプチド（１１３）は、９から１９の位置の連続する１１個のアミノ酸が重複し、それに続く２０から２３の位置の４個の連続するアミノ酸残基配列を有する。これから類推すると、最後に残る、４個の連続するアミノ酸残基が不足するとき、重複部分のアミノ酸配列を伸長し、各ペンタデカペプチドを満足させることを、１５量体（１５−ｍｅｒ）の条件とする。
【００３９】
本発明によると、前記原則は、前述したＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールにも適用される。
【００４０】
本発明によると、前述したペプチドプールを、本技術分野で周知の方法によって合成することができる。本発明の好ましい具体例において、前述のペプチドプールは人工的に合成されたペプチドで構成される。
【００４１】
本発明によると、前述したペプチドプールにおける隣接したペプチドとは、設定した最長の重複である連続するアミノ酸配列を有する２つのペプチドを意味する。前述の１５量体ペプチドのペプチドプールを例とすると、このペプチドプールが１１個の連続したアミノ酸配列の重複を有すると設定する場合、この隣接した２つのペプチドは、それぞれＣ末端に近い１１個の連続したアミノ酸配列、およびＮ末端に近い１１個の連続したアミノ酸が同じである。
【００４２】
本発明によると、前述の免疫原組成物は、さらに生理的に受容できる支持剤または賦形剤を含む。
【００４３】
本発明によると、前述の免疫原組成物は、さらに免疫促進剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）を含む。
【００４４】
ここで使用される「免疫促進剤（ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）」という語は、外来抗原に対する抗体または細胞調節を含む免疫応答を、実質的に増進または増強することができる任意の物質を意味する。一種の好ましい免疫促進剤は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含む。アジュバントは、抗原を保護し、高代謝しないように設計された物質を含む。例えば、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）または鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）および免疫応答刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、例えば界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）に属する共重合体（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）であり、リピドＡ（ｌｉｐｉｄ Ａ）などを含む。そのほか、さらに百日咳菌由来のタンパク質（Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と、由来するタンパク質である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、免疫調節剤とみなすことができる、例えばα−ｇａｌａｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（α−ＧａｌＣｅｒ）およびその誘導体などの糖脂質、ならびにＣｐＧ由来のポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を含む。
【００４５】
特定のアジュバントは、市販の試薬でよく、例えば不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、ローウェイ、ニュージャージ州）、ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）、例えば水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｇｅｌ）またはリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などのアルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔｓ）、カルシウム、鉄または亜鉛の塩類、アシル化チロシンの不溶性浮遊物（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｙｌａｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、アシル化糖類（ａｃｙｌａｔｅｄ ｓｕｇａｒｓ）、陽イオンまたは陰イオン由来の多糖（ｃａｔｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｏｒ ａｎｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ）、生分解性ミクロスフェア（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）と、キラヤサポナリアＡ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ａ、Ｑｕｉｌ Ａ）、ならびに、その他の例えばＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン２、−７、−１２などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などであり、その他の類似する成長ホルモンもアジュバントとして使用できる。
【００４６】
本発明は、別の局面において、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫細胞を活性化する方法を提供する。これは、免疫細胞および前述した免疫原組成物を混合し、細胞混合培養物を形成することと、この細胞混合培養物を適当な培地で培養し、活性化した免疫細胞が得られることとを含む。
【００４７】
本発明によると、前述した免疫細胞は、一種の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）である。好ましくは、前述した免疫細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）を含む。好ましい樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）は、末梢血単核細胞、骨髄細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ）、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）由来である。
【００４８】
当業者には周知のように、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、哺乳動物の一種の白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）に存在する。主に血液、環境中にさらされる組織およびその他の組織、例えば皮膚、鼻腔、肺、胃および小腸の上皮組織などに存在する。これらの働きは、環境刺激により生じる先天的および後天的免疫応答を調節する。そのうちの１つの最も重要な機能は、抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）した後、免疫システムのその他の白血球に提示（ｐｒｅｓｅｎｔ）することであり、したがって、一種の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）である（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：５２２〜５２７、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、 １３（１４）：１５９１〜６０７、２００６年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８（５）：３５１〜６０、２００８年）。本発明の好ましい実施例において、該樹状細胞は、ヒトの樹状細胞である。
【００４９】
本発明によると、前述の適当な培地は、サイトカインまたは成長ホルモンを含む。該サイトカインは、次に挙げるＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびその組合せで構成される群から選択される。
【００５０】
本発明は、別の局面において、一種の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の産生を誘発する方法を提供する。これは次に挙げる、一種の前述した方法で得られる活性化した免疫細胞および一種のリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を提供するステップと、この活性化した免疫細胞およびリンパ球を、適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップとを含む。
【００５１】
好ましい該リンパ球は、一種の自己または異種リンパ球（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）である。さらに好ましい該リンパ球は、一種の自己リンパ球（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）である。
【００５２】
本発明によると、該リンパ球は、非接着性の末梢血単核細胞に由来する。本発明の好ましい実施例において、該リンパ球はＴリンパ球またはＢリンパ球である。さらに好ましくは、Ｔリンパ球は自己Ｔリンパ球である。
【００５３】
ここで使用される「自己の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」という語は、当業者には周知のように、同一個体に由来することを示す。例を挙げると、示された自己免疫細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ）が、提供された樹状細胞と同一個体（ｓｅｌｆｓａｍｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）に由来する免疫細胞であることを示す。これにより、不必要な免疫応答、例えば異種免疫応答（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）などの発生が誘発されるのを防止する。
【００５４】
本発明による免疫原組成物は、一種のヘルペスウイルスファミリーに属するサイトメガロウイルスに由来する。本発明の方法により得られる活性化した免疫細胞も、ヘルペスウイルス特異性を有するリンパ球を活性化することができ、さらにはヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）に対する免疫応答を誘発することに応用される。
【００５５】
示したヘルペスウイルスは、これに限定されないが、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス−１（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１、ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス−２（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−２、ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ）、エプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ、ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス−６（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−６、ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス−７（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−７、ＨＨＶ−７）、およびヒトヘルペスウイルス−８（Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−８、ＨＨＶ−８）でよい。
【００５６】
本発明は、さらに以下の実施例によって説明を行う。しかし、明らかであることは、これらの実施例は説明のために用いたに過ぎず、本発明を実施する上での制限であるとみなされるべきではない。
【実施例】
【００５７】
実験材料および方法
１．ペプチドおよび抗原
以下の実施例で使用した１５量体ペプチドプール（１５−ｍｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｏｏｌｓ）は、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）から購入した。これは、次に挙げる、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（５６１個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは１３８種のペプチドを含む）、ＨＣＭＶＡ ＩＥ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）（４９１個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは１２０種のペプチドを含む）、ＨＣＭＶＡ ＶＰＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（４３３個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは１０６種のペプチドを含む）、ＨＣＭＶＡ ｐ１００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（１０４８個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは２５９種のペプチドを含む）、およびＨＣＭＶＴ ＶＧＬＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（９０７個のアミノ酸、これに由来するペプチドプールは２２４種のペプチドを含む）の全長に及び（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、１１個のアミノ酸が部分的に重複する配列を有するペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む。その他の抗原およびペプチドは、異なる方法で合成することができる。そのうち、ＷＴ−１（Ｗｉｌｍ’ｓ ｔｕｍｏｒ １）（Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ：Ｐ１９５４４、この配列をＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：６に示す）由来のペプチドプール（ＷＴ３３、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）、およびＣ型肝炎ウイルスのコアウイルス（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＢＶ４６２３４（１−１９１／／ｐｒｏｄｕｃｔ＝“ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ”、この配列をＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：７に示す）由来のペプチドプールは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃａｎ １５／１１の方式で、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツに発注した。これらは、非特異的ペプチドプールとして使用した。
【００５８】
２．末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）の分離
血漿を分離した血液（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｂｌｏｏｄ）および全血は、健康なドナーから採取した。末梢血単核細胞は、前に述べたようにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ニュージャージ州、米国）を使用し、密度勾配遠心分離により調製した（Ｈａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．、２００８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６：２６９〜２７９）。ヒト末梢血単核細胞の生存率は、トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）により測定し、細胞生存率が８０％より大きいグループの細胞だけを以下の実施例に使用した。
【００５９】
３．樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）の調製
末梢血単核細胞を、１×１０７細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で６ウェルプレートに播き、末梢血単核細胞をＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、カリフォルニア州、米国）で２時間培養し、接着を行った。続いて、未接着の細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を慎重に取り除いて冷凍し、後の共培養実験に使用するＴリンパ球（Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の供給源とした。接着した細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州、米国）および２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州、米国）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地で培養した。樹状細胞を産生するため、細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で２４時間培養し、さらにＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｇｅｎｔａｕｒ）、ＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、米国）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、米国）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＰＧＥ２（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、米国）で２４時間培養し、成熟反応（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を行った。樹状細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、フローサイトメトリー法で分析した。
【００６０】
４．樹状細胞を活性化することによる、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）での抗原特異的リンパ球の増幅
図３を合わせて参照されたい。前記方法は、おおよそ図中に示されるプロセスで行った。樹状細胞によって活性化されたリンパ球は、先に記載した方法に基づき調製される（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、上述と同じ）。簡単に述べると、成熟した樹状細胞を、ペプチド（５μｇ／ｍＬ）またはその他の抗原で３時間負荷（ｌｏａｄｅｄ）し、放射線照射を行った（２，５００ｒａｄｓ）。樹状細胞および相同な非接着性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１：２０の比率で、２％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地で共培養し、３日目に、ＩＬ−２（Ｇｅｎｔａｕｒ、アーヘン、ドイツ）、ＩＬ−７（Ｇｅｎｔａｕｒ）およびＩＬ−１５（Ｇｅｎｔａｕｒ）を添加した。続いて、１日おきに、これらのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を含む新鮮な培地を添加した。共培養物中のＴリンパ球の機能分析は、細胞内サイトカイン染色（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって行った。
【００６１】
５．カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステルを基礎とした細胞増殖分析法、ＣＦＳＥを基礎とした細胞増殖分析法（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ−ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＣＦＳＥ−ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）
簡単に述べると、１×１０６ＰＢＭＣｓを、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を利用して標識し、続いて抗原を利用して培養を刺激した。３日目に、ＩＬ−２（Ｇｅｎｔａｕｒ、アーヘン、ドイツ）およびＩＬ−１５（Ｇｅｎｔａｕｒ）を添加した。次に、１日おきにこれらのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を含む新鮮な培地を添加し、７日目まで続けた。細胞のＣＤ４およびＣＤ８について染色し、フローサイトメトリー法で分析した。
【００６２】
６．ＣＤ１０７ａおよび細胞内サイトカイン染色（ＣＤ１０７ａ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
細胞染色の分析は、Ｈａｎらの文献のように行った（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、上述と同じ）。簡単に述べると、３×１０５の増幅したＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞（ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＭＶ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）は、抗原負荷した相同な樹状細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ＤＣｓ）もしくは単核細胞を使用して、抗ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣを有するか、または有さないＡＩＭ−Ｖ培地で刺激を行った。刺激反応を１時間行った後、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した。５時間後、細胞のＣＤ４およびＣＤ８について染色、固定（ｆｉｘｅｄ）、透過（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ）し、さらにＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−２に対する抗体（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）を利用し、ＦＩＸ／ＰＥＲＭおよびＰＥＲＭ／Ｗａｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）を使用して、染色を行った。
【００６３】
７．酵素結合イムノスポットアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳｐｏｔ ａｓｓａｙ）
分離したばかりのＰＢＭＣを、１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で、１０μｇ／ｍｌ ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ（１−Ｄ１Ｋ、ＭａｂＴｅｃｈ）でコート（ｃｏａｔｅｄ）した９６ウェルプレートに播き、なおかつ５％不活化ヒトＡＢ血清（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍ）（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、米国）を使用し、ブロック（ｂｌｏｃｋ）を行った。異なるペプチドプールの組合せを利用し、２重の方式で細胞の刺激反応を行った。３７℃、５％ＣＯ２下で１８から２０時間培養を行った後、細胞を単離し、１μｇ／ｍｌのビオチン標識した抗ＩＦＮ−γ（ｂｉｏｔｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ）（７−Ｂ６−１、ＭａｂＴｅｃｈ）を添加した。ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡＬＰ）（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加することにより、呈色反応（ｃｏｌｏｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の［スポット（ｓｐｏｔｓ）］が形成され、続いて基質のＢＣＩＰ／ＮＢＴ−ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加した。スポットの数は、ＥＬＩＳＰＯＴ読取装置（ＥＬＩＳＰＯＴ ｒｅａｄｅｒ）（ＡｕｔｏＩｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）で算出した。１０６ＰＢＭＣごとに含まれるスポット形成細胞（ｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＳＦＣ）が示される。
【００６４】
実施例１ 異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたはその組合せによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が刺激される効果の分析−−−ＣＦＳＥ染色法を利用
本実施例の目的は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せを利用して、末梢血単核細胞を刺激し、さらにＣＦＳＥ染色を利用して、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せの、末梢血単核細胞の細胞増殖活性に対する影響を分析し、それによって異なる組合せで免疫応答を刺激して生じる効果について理解することにある。
【００６５】
ＣＦＳＥ標識した抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、それぞれ「実験材料および方法」に記載した方法に基づき、以下に記載するグループに分け、異なるペプチドプールの組合せによって末梢血単核細胞を刺激し、７日間培養を行った。
【００６６】
（１）ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、サンプル「１」で示す。
（２）ＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「２」で示す。
（３）ＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「３」で示す。
（４）ｐ１００のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「４」で示す。
（５）ＶＰＡＰのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「５」で示す。
（６）ｐｐ６５およびＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「６」で示す。
（７）ｐｐ６５およびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「７」で示す。
（８）ＶＧＬＢおよびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「８」で示す。
（９）ｐｐ６５、ＶＧＬＢおよびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「９」で示す。
（１０）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１およびｐ１００のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「１０」で示す。
（１１）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１、ｐ１００およびＶＰＡＰのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「１１」で示す。
【００６７】
そのほか、以下のグループをコントロール群とした。
【００６８】
（１２）ＣＦＳＥ標識した末梢血単核細胞を単独で培養し、未刺激のコントロール群（ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。サンプル「１２」で示し、実験のバックグラウンド値とした。
（１３）ＣＦＳＥ標識した末梢血単核細胞、およびＣ型肝炎ウイルスのコアウイルス（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）由来のペプチドプールを負荷した樹状細胞を共培養し、ネガティブコントロール群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。サンプル「１３」で示す。
【００６９】
上述で刺激されたＰＢＭＣは、続いて「実験材料および方法」に示す方法の通り、抗原特異的細胞増殖（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および分析を行った。さらに「細胞内サイトカイン染色」分析を行い、得られた実験データから先にＰＢＭＣの数値を差し引き、図を作成した。
【００７０】
結果は、図４に示す通りである。図４Ａは、異なるペプチドプールの組合せによる刺激下での、細胞増殖の状態を示す。図４Ｂは、異なるペプチドプールの組合せで増殖した細胞を示し、これは、ＩＦＮ−γの能力を表す。
【００７１】
上述の結果から以下のことがわかる。（１）５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを単独で使用するとき、そのすべてにおいて反応がある。（２）ｐｐ６５、ＶＧＬＢおよびｐ１００のような単一ポリペプチド由来のペプチドプールもまた、免疫応答を誘発することができる。（３）２種類以上のペプチドプールの組合せは、単一のペプチドプールで得られる結果より比較的良好である。（４）この５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールにおいて、ｐｐ６５およびＶＧＬＢの２種類のペプチドプールの免疫応答は比較的強く、組み合わせると免疫応答は付加効果を有する。ペプチドプールの組合せは数が多いほど、付加効果は良好である。
【００７２】
実施例２ 異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたはその組合せによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が刺激される効果の分析−−−ＥＬＩＳｐｏｔ分析法を利用
本実施例の目的は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せを利用して、末梢血単核細胞を刺激し、さらにＥＬＩＳｐｏｔを利用して、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せの、ＰＢＭＣの細胞機能に対する影響を分析することにある。
【００７３】
異なるドナーから分離されたばかりの末梢血単核細胞は、それぞれ「実験材料および方法」に記載の方法により得られた。以下に記載するグループにおいて、異なるペプチドの組合せによってＰＢＭＣを刺激し、培養して２０時間刺激した。また「実験材料および方法」に記載のＥＬＩＳｐｏｔ分析法を利用して、ＩＦＮ−γの分析を行った。
【００７４】
（１）ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、サンプル「１」で示す。
（２）ＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「２」で示す。
（３）ＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「３」で示す。
（４）ｐｐ６５およびＶＧＬＢのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「４」で示す。
（５）ｐｐ６５およびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「５」で示す。
（６）ｐｐ６５、ＶＧＬＢおよびＩＥ−１のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「６」で示す。
（７）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１およびｐ１００のペンタデカペプチドプールであり、サンプル「７」で示す。
（８）ｐｐ６５、ＶＧＬＢ、ＩＥ−１、ｐ１００およびＶＰＡＰのペンタデカペプチドプールであり、サンプル「８」で示す。
【００７５】
結果は図５に示す通りである。ｐｐ６５＋ＶＧＬＢ［棒４（ｂａｒ４）を参照］またはｐｐ６５＋ＩＥ−１［棒５（ｂａｒ５）を参照］は、ＰＢＭＣを刺激してＩＦＮ−γを産生する効果について、ｐｐ６５［棒１（ｂａｒ１）を参照］より比較的顕著である。また、そのうちｐｐ６５＋ＶＧＬＢ（棒４を参照）の刺激効果は、ｐｐ６５＋ＩＥ−１（棒５を参照）より優れている。複数種のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールの組合せのグループの効果（棒６、７、８を参照）は、２種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含むグループ（棒４、５を参照）、またはｐｐ６５単独のグループ（棒１を参照）より、わずかに優れている。
【００７６】
実施例３ ＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたは組合せによって、ＰＢＭＣ各グループの細胞が刺激される増殖作用の分析
本実施例の目的は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せを利用してＰＢＭＣを刺激し、さらに異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せの、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋グループの細胞に対する増殖作用の影響を分析することにある。
【００７７】
ＣＦＳＥ標識したＰＢＭＣは、それぞれ（１）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、「ｐｐ６５」で示し、（２）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５およびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１の２つのペンタデカペプチドを含む混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）であり、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ペプチドプールおよびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１ペプチドプールを含み、「ｐｐ６５／ＩＥ−１」で示し、（３）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５、ＨＣＭＶＡ ＩＥ−１、ＨＣＭＶＡ ＶＰＡＰ、ＨＣＭＶＡ ｐ１００、ＨＣＭＶＴ ＶＧＬＢの５つのペンタデカペプチドプールを含む混合プールであり、「５ｐｅｐｍｉｘ」で示し、（４）非特異的ペンタデカペプチドプールであり、「ＷＴ−１」で示し、（５）抗ＣＤ３抗体であり、ポジティブコントロール群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ａｎｔｉ−ＣＤ３」で示す、などを刺激物として、７日間培養を行った。また「実験材料および方法」に記載した方法のように、抗原特異的細胞増殖（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の分析を、特に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋グループの細胞の増殖作用について行った。またＣＦＳＥ標識したＰＢＭＣの単独培養を未刺激のコントロール群（ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ＰＢＭＣ」と示す。
【００７８】
結果は図６に示す通りである。各グループのＣＦＳＥ希釈の細胞（ＣＦＳＥ−ｄｉｌｕｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）（つまり増殖細胞）の割合は、図６に明示する通りである。単一のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５）、または２種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５／ＩＥ−１）と比較して、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（５ｐｅｐｍｉｘ）は、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋またはＣＤ８＋グループの細胞に関わらず、すべて最高の増殖作用を誘発した。これは、この５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む組合せが、最も強い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有することを示す。
【００７９】
実施例４ 各種のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールまたは組合せによって刺激される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の機能性分析
本実施例は、異なるＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールおよびその組合せによって、異なる供給源からのＰＢＭＣの細胞を刺激し、さらにＰＢＭＣのサイトカイン分泌の状態を分析して、免疫機能を判定することにより、各種組合せの免疫原性を確定した。
【００８０】
ドナー２人からのＰＢＭＣは、それぞれ（１）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５のペンタデカペプチドプール（ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）であり、「ｐｐ６５」で示し、（２）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５およびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１の２つのペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）であり、ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ペプチドプールおよびＨＣＭＶＡ ＩＥ−１ペプチドプールを含み、「ｐｐ６５／ＩＥ−１」で示し、（３）ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５、ＨＣＭＶＡ ＩＥ−１、ＨＣＭＶＡ ＶＰＡＰ、ＨＣＭＶＡ ｐ１００、ＨＣＭＶＴ ＶＧＬＢの５つのペンタデカペプチドプールを含む混合プールであり、「５ｐｅｐｍｉｘ」で示し、（４）非特異的ペンタデカペプチドプールであり、「ＷＴ−１」で示し、（５）抗ＣＤ３抗体であり、ポジティブコントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ａｎｔｉ−ＣＤ３」で示す、などを刺激物として７日間培養を行った。さらに「実験材料および方法」に記載の方法のように、細胞内サイトカイン染色分析（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＣＣＳ）を行い、各グループの細胞のＩＬ−２およびＩＦＮ−γの発現に対して分析を行った。ＰＢＭＣ単独培養を未刺激のコントロール群（ｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、「ＰＢＭＣ ｏｎｌｙ」と示す。
【００８１】
図７ＡおよびＢは、それぞれ異なる供給源のＰＢＭＣに関する、前述の試験で得られた結果を示す。そのうち各棒グラフは、図中に明示されるように、それぞれＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを発現するＰＢＭＣを具体的に表す。結果を、単一のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５）、または２種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む混合プール（ｐｐ６５／ＩＥ−１）と比較して述べると、該５種類のＣＭＶ抗原のペプチドプールを含む混合プール（５ｐｅｐｍｉｘ）は、ＰＢＭＣを刺激し、細胞に対してＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γを発現する能力が最も優れている。これは、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプールを含む組合せが、最も強い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有することを示す。
【００８２】
実施例５ 樹状細胞がＰＢＭＣを刺激することによる、ＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞の産生
本実施例は、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プールを利用して処理した樹状細胞（ＤＣｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ ｏｆ ５ＣＭＶ ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）が、非接着性末梢血単核細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ＰＢＭＣ）を刺激し、ＣＭＶ特異的免疫エフェクター細胞が産生される効果について理解する。
【００８３】
５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを含む混合プール（ｍｉｘｅｄ ｐｏｏｌ）を使用して処理した樹状細胞、および非接着性末梢血単核細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ＰＢＭＣ）（Ｔリンパ球の供給源とする）を、「実験材料および方法」に記載の方法を利用して調製し、共培養を行った（図３を参照）。共培養を１５日間行い、ＤＣにより活性化されたリンパ球（ＤＣ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を、それぞれ単一のＣＭＶタンパク質由来のペプチドプール（ｐｐ６５、ＩＥ−１、ＶＧＬＢ、ＶＰＡＰ、ｐ１００）またはこの５種類のペプチドプールの組合せを含む樹状細胞によって、５時間再刺激（ｒｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）した。それと同時に、ホルボールミリスチン酸アセタートにイオノマイシンを加えて（ＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、ＤＣにより活性化されたリンパ球を刺激し、ポジティブコントロール群とし、非特異的抗原（ＷＴ−１）で処理した相同な樹状細胞をコントロール群とした。再刺激されたリンパ球は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）と、脱顆粒作用の細胞標識ＣＤ１０７ａに対する染色により、抗原特異的免疫エフェクター細胞の機能について、評価を行った。
【００８４】
図８は、前記細胞内サイトカイン染色の結果である。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αなどのサイトカインと、ＣＤ１０７ａの発現は、図８に明示する通りである。図９ＡおよびＢは、図８の結果に基づき作成した棒グラフである。それぞれＩＬ−２および／またはＴＮＦ−αを発現した細胞の全体に占める割合と、ＩＦＮ−γおよび／またはＣＤ１０７ａを発現した細胞の全体に占める割合を示す。結果は、５種類のペプチドプールの組合せ（５ｐｅｐｍｉｘ）の刺激によって産生された活性化免疫細胞は、いずれか１つの単一のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールに対して、特異的応答（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が生じ、そのうち、ｐｐ６５およびＶＧＬＢの免疫応答が最も強いことを示した。５種類のペプチドプールの組合せで処理した樹状細胞で再刺激したグループは、免疫エフェクター細胞中で、最も高いサイトカイン産生をもたらすことができる。
【００８５】
前記実施例の結果は、複数のＣＭＶタンパク質由来（最高で５種類まで）のペンタデカペプチドプール（ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ）を混合した組合せが、短時間の暴露でＣＤ４＋およびＣＤ８＋の２つのＴリンパ球を同時に、効果的に活性化することができることを示した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴリンパ球の抗原特異的増殖反応と、エフェクターサイトカイン（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の産生が顕著に向上した。これは、ＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールの組合せが、抗ＣＭＶ免疫力を形成する、一種の効果的なワクチンまたは免疫療法とすることができることを示す。図６および図７に示すように、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールの組合せは、ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の細胞の増殖反応とサイトカイン合成を誘発することができる。単独および２種類を混合したＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールも免疫応答を刺激するが、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールの組合せは、最も強い抗原特異的免疫応答を生じることができる。免疫エフェクター細胞の機能は、数種類の免疫活性化サイトカインおよび脱顆粒作用の標識ＣＤ１０７ａに対する多色フローサイトメトリーにより、分析評価を行った。図８および図９に示すように、単一または２種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールと比較すると、５種類のＣＭＶタンパク質由来のペンタデカペプチドプールを混合した組合せ（５ｐｅｐｍｉｘ）は、エフェクターサイトカイン（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の産生、およびＣＤ１０７ａの脱顆粒化作用（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を誘発する上で、最も効果的であった。これは、５種類のＣＭＶペプチドプールを混合した組合せが、一種の最も効果的なＣＭＶワクチンまたは免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）であることをさらに実証した。
【００８６】
以上の記述は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明に対し、いかなる形式での制限も行わない。いかなる当業者も、本発明で提起した技術的特徴から逸脱しない範囲内において、本発明で開示された技術内容を利用し、部分的な変更または修飾を行った同等の実施例、さらに本発明から逸脱しない技術的特徴の内容は、すべて本発明の技術的特徴の範囲内に属するべきである。
【符号の説明】
【００８７】
１０ 免疫原組成物
１１ ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドプール
１２ ＣＭＶ ＩＥ−１ペプチドプール
１３ ＣＭＶ ＶＧＬＢペプチドプール
１４ ＣＭＶ ＶＰＡＰペプチドプール
１５ ＣＭＶ ｐ１００ペプチドプール
１１１ １５量体ペプチド
１１２ １５量体ペプチド
１１３ １５量体ペプチド
２０ 免疫細胞
２１ 活性化された免疫細胞
３０ リンパ球
３１ 免疫エフェクター細胞
４０ 個体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種の免疫細胞を活性化する方法であって、以下の
免疫細胞、およびサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物を混合し、細胞混合培養物を形成するステップと、
該細胞混合培養物を適当な培地で培養し、活性化した免疫細胞が得られるステップと、
を含み、そのうち該免疫原組成物が、
（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチド断片の少なくとも１つ、ならびに
（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチド断片と前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチド、
を含み、あるいは、
（ｃ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチドプールのうちの少なくとも１つ、ならびに
（ｄ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールと前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドプール、
を含み、あるいは、
（ｅ）ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチド断片、
を含む、方法。
【請求項２】
該ＣＭＶ ｐｐ６５がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ＩＥ−１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ＶＧＬＢがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ＶＰＡＰがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ｐ１００がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と実質的に同じ配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫原組成物が、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫原組成物における、各ポリペプチド由来のペプチドプールの各ペプチドの長さが、１２から１８個のアミノ酸である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
免疫原組成物における、各ペプチドプールの２つの隣接するペプチドの配列が、１０から１５個の連続したアミノ酸残基の重複を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫原組成物における、各ポリペプチド由来のペプチドプールが、ペンタデカペプチドプールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫原組成物における、各ポリペプチド由来のペンタデカペプチドプールの、２つの隣接するペンタデカペプチドの配列が、１１個の連続したアミノ酸残基の重複を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫原組成物が、さらに免疫促進剤を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該免疫細胞が、末梢血単核細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞または幹細胞由来の樹状細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該適当な培地がサイトカインを含み、該サイトカインが次に挙げるＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびその組合せで構成される群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
一種の免疫エフェクター細胞の産生を誘発する方法であって、以下の、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法で得られる、一種の活性化された免疫細胞および一種のリンパ球を提供するステップと、
該活性化された免疫細胞およびリンパ球を適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップと、
を含む、方法。
【請求項１２】
該リンパ球が、非接着性の末梢血単核細胞由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該リンパ球が、Ｔリンパ球またはＢリンパ球である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
一種の免疫エフェクター細胞の産生を誘発する方法であって、以下の、
請求項４に記載の方法で得られる、一種の活性化された免疫細胞および一種のリンパ球を提供するステップと、
該活性化された免疫細胞およびリンパ球を適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップと、
を含む、方法。
【請求項１５】
該リンパ球が、非接着性の末梢血単核細胞由来である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該リンパ球が、Ｔリンパ球またはＢリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
一種の免疫細胞を活性化する方法であって、以下の
免疫細胞、およびサイトメガロウイルス由来のペプチドを含む免疫原組成物を混合し、細胞混合培養物を形成するステップと、
該細胞混合培養物を適当な培地で培養し、活性化した免疫細胞が得られるステップと、
を含み、そのうち該免疫原組成物が、
（ａ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチド断片の少なくとも１つ、ならびに
（ｂ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチド断片と前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチド、
を含み、あるいは、
（ｃ）ＣＭＶ ｐｐ６５およびＣＭＶ ＩＥ−１ポリペプチド由来のペプチドプールのうちの少なくとも１つ、ならびに
（ｄ）次に挙げるＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールと前述の任意の組合せで構成される群から選択されるペプチドプール、
を含み、あるいは、
（ｅ）ＣＭＶ ＶＧＬＢポリペプチド由来のペプチド断片、
を含む、方法。
【請求項２】
該ＣＭＶ ｐｐ６５がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ＩＥ−１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ＶＧＬＢがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ＶＰＡＰがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と実質的に同じ配列を有し、該ＣＭＶ ｐ１００がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と実質的に同じ配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫原組成物が、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＶＧＬＢ、ＣＭＶ ＶＰＡＰおよびＣＭＶ ｐ１００ポリペプチド由来のペプチドプールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫原組成物における、各ポリペプチド由来のペプチドプールの各ペプチドの長さが、１２から１８個のアミノ酸である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
免疫原組成物における、各ペプチドプールの２つの隣接するペプチドの配列が、１０から１５個の連続したアミノ酸残基の重複を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫原組成物における、各ポリペプチド由来のペプチドプールが、ペンタデカペプチドプールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫原組成物における、各ポリペプチド由来のペンタデカペプチドプールの、２つの隣接するペンタデカペプチドの配列が、１１個の連続したアミノ酸残基の重複を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫原組成物が、さらに免疫促進剤を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該免疫細胞が、末梢血単核細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞または幹細胞由来の樹状細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該適当な培地がサイトカインを含み、該サイトカインが次に挙げるＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびその組合せで構成される群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
一種の免疫エフェクター細胞の産生を誘発する方法であって、以下の、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法で得られる、一種の活性化された免疫細胞および一種のリンパ球を提供するステップと、
該活性化された免疫細胞およびリンパ球を適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップと、
を含む、方法。
【請求項１２】
該リンパ球が、非接着性の末梢血単核細胞由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該リンパ球が、Ｔリンパ球またはＢリンパ球である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
一種の免疫エフェクター細胞の産生を誘発する方法であって、以下の、
請求項４に記載の方法で得られる、一種の活性化された免疫細胞および一種のリンパ球を提供するステップと、
該活性化された免疫細胞およびリンパ球を適当な培地で共培養し、免疫エフェクター細胞が得られるステップと、
を含む、方法。
【請求項１５】
該リンパ球が、非接着性の末梢血単核細胞由来である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該リンパ球が、Ｔリンパ球またはＢリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図８】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図２】
【図８】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【公表番号】特表２０１２−５３０５００（Ｐ２０１２−５３０５００Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６４６８（Ｐ２０１２−５１６４６８）
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０００７１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４８５４１
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５１１３０４３７２）ヴェクトライト バイオメディカ インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５１１３０４３９４）ベイジン シーティーエル バイオメディカ インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０００７１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４８５４１
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５１１３０４３７２）ヴェクトライト バイオメディカ インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５１１３０４３９４）ベイジン シーティーエル バイオメディカ インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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