シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来のＰＨＡ合成酵素変異体及びそれを用いたラクテート重合体または共重合体の製造方法
本発明は、ラクチル−ＣｏＡを基質として利用して、ラクテート重合体及び／又は共重合体を合成しうるシュードモナス・スピーシーズ６−１９（Pseudomonas sp.6-19, KCTC 11027BP）由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素（PHA synthase）の変異体に関するものである。また、本発明はこのような合成酵素変異体を利用することを特徴とするラクテート重合体及び／又は共重合体の製造方法に関するものである。本発明に係るシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体は、従来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が基質として使用するのに困難であったラクチル−ＣｏＡを基質として使用して、ラクテート重合体及び／又は共重合体を高効率で製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクチル−ＣｏＡを基質として用いて、ラクテート重合体（ｌａｃｔａｔｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）及び／又はラクテート共重合体（ｌａｃｔａｔｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を合成しうる、シュードモナス・スピーシーズ６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９）由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体に関する。また、本発明は、このようなポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を利用することを特徴とするラクテート重合体及び／又は共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（ＰＬＡ）は、ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）から由来した代表的な生分解性重合体であり、汎用高分子あるいは医療用高分子としての応用性が大きい。現在、ＰＬＡは微生物発酵により生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては低分子量（１，０００〜５，０００ダルトン）のＰＬＡのみが生成される。高分子量（＞１００，０００ダルトン）のＰＬＡを合成するためには、連鎖カップリング剤（chain coupling agent）を利用して、ラクテートの直接重合で得られた低分子量のＰＬＡを重合する方法を利用することができる。しかし、有機溶剤や連鎖カップリング剤の添加によって高分子量のＰＬＡを得る工程が複雑になり、またこれらを除去することが容易ではないという短所がある。現在、商用化されている高分子量ＰＬＡ生産工程は、ラクテートをラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）に転換した後、ラクチド環の開環縮合反応を通してＰＬＡを合成する方法が使われている。
化学合成により、ラクテートを用いてＰＬＡを合成する場合、ＰＬＡ重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）は容易に収得することができる。しかし、様々なモノマー単位（unit）を有するＰＬＡ共重合体の合成は難しく、商業的に効用性が非常に劣るという短所がある。
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は過度の炭素源が存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の栄養分が不足する時、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵化合物としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油に由来した合成高分子に似た物性を有しながら、完全な生分解性を示すため、既存の合成プラスチックに代わる物質として認識されている。
微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡ単量体に転換する酵素と、ＰＨＡ単量体を利用してＰＨＡ重合体を合成するＰＨＡ合成酵素が必須的である。微生物を利用してＰＬＡ及びラクテート共重合体を合成する時も、同様のシステムが必要とされるので、元来のＰＨＡ合成酵素の基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡを提供しうる酵素以外に、さらにラクチル−ＣｏＡを提供しうる酵素が必要とされる。
【０００３】
そこで、本発明者らはラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを使用するシステムを利用して、ＰＬＡ及びラクテート共重合体の合成に成功した（特許文献１）。しかし、２位においてヒドロキシル化（hydroxylation）されたヒドロキシアルカノエートに対するＰＨＡ合成酵素の反応性は非常に低かった。in vitro活性測定を通してＰＨＡ合成酵素のラクチル−ＣｏＡに対する反応性を分析した報告はあったが、上述した問題点のようにラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡ合成酵素の反応性は非常に微弱であると知られていた（非特許文献１、２、３）。従って、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用できないＰＨＡ合成酵素を利用してＰＬＡ及びラクテート共重合体を合成する時には合成効率が非常に低くならざるを得ない。即ち、２位の炭素位置がヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートであるラクテートはＰＨＡ合成酵素の基質特異性に適しないために、効率的にＰＬＡ及びラクテート共重合体を合成するためには、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用できるＰＨＡ合成酵素が非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国特許出願公開第１０−２００６−０１２１５５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001
【非特許文献２】Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994
【非特許文献３】Yuan et al. Arch Biochem Biophys. 394:87, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の主な目的は、ラクチル−ＣｏＡを基質として効率的に利用できるＰＨＡ合成酵素を提供することにある。
本発明の別の目的は、上記ラクチル−ＣｏＡを基質として利用できるＰＨＡ合成酵素及びプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子を含有する植物または細胞を利用して、ＰＬＡ及びラクテート共重合体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列で４８１位のアミノ酸であるグルタミンが変異されたことを特徴とするラクチル−ＣｏＡを基質として利用してラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
【０００８】
好ましくは、本発明は、上記変異体が１３０位のアミノ酸であるグルタミン酸、３２５位のアミノ酸であるセリン及び４７７位のアミノ酸であるセリンよりなる群から選択された一つ以上のアミノ酸がさらに変異されたことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
【０００９】
より好ましくは、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列で、下記変異：
ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；
ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；
ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；
ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；
ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；
ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；
ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；
ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；
ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；
ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；
ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；
ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又は
ｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ
を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするラクチル−ＣｏＡを基質として利用して、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
【００１０】
本発明者らは、シュードモナス・スピーシーズ６−１９（Pseudomonas sp.6-19）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用する場合、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート重合体及び／又は共重合体を高効率で製造できることを確認し、本発明を完成した。
【００１１】
また、本発明は、上記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体をコードする遺伝子を提供する。
さらに、本発明は、上記遺伝子を含有するラクテート重合体または共重合体合成用組換えベクターを提供する。
より好ましくは、本発明は、上記組換えベクターがプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）をさらに含有することを特徴とする組換えベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された細胞または植物を提供する。
さらに、本発明は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を上記組換えベクターで形質転換して得られることを特徴とする細胞または植物を提供する。
さらにまた、本発明は、上記細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテート重合体または共重合体の製造方法を提供する。
より好ましくは、本発明は、上記培養または栽培が、３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）を含有する環境で遂行され、製造された共重合体が３−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体であることを特徴とする製造方法を提供する。
【００１３】
本発明において、上記共重合体は、単量体の種類が２個の二重合体、単量体の種類が３個の三重合体、単量体の種類が４個の四重合体などを含む意味である。
本発明において、上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５，８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６,７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，6−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸からなる群から選択された一つ以上である。
【００１４】
また、本発明は上記細胞または植物を培養または培養することを特徴とするラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を含む組換え発現ベクターを作製する過程を示す図である。
【図２】ｐｈａＣ１Ｐｓ６-１９合成酵素とＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００及びｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を含む組換えベクター（ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢ及びｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢ）で形質転換された大腸菌をＰＨＢが合成される条件で培養した後、ＦＡＣＳ（Florescence Activated Cell Sorting）分析した結果である。
【図３】ＰＨＡ合成酵素とＣＰ−ＰＣＴが同時に発現される恒常的発現ベクターを示す簡単な図である。
【図４】本発明のシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、ＳＣＬ変異体遺伝子と、ＣＰ−ＰＣＴ遺伝子とを含む組換え発現ベクターを作製する過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、ベクターとは、適した宿主内でＤＮＡを発現させることができる、適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを意味する。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、または単純なゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムにかかわりなく複製して機能するか、または場合によっては、ゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在ベクターの最も通例的に使われる形態であるから、本発明でプラスミドとベクターは同じ意味で使われる。しかし、本発明は当業者に既に知られた、または知られることになる、同等の機能を有するベクターの別の形態も含む。
【００１７】
発現調節配列とは、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必須的なＤＮＡ配列を意味する。この調節配列は転写を実施するためのプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列はプロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドで遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（cytomegalovirus）由来プロモーターなどが好ましく使われる。
【００１８】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために非常に多様な発現調節配列の中のどのようなものでもベクターに使われることができる。有用な発現調節配列の例には、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、上記ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α−交配システムのプロモーター及び原核生物または真核生物またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知らされたコンストラクト配列及びこれらの種々の組み合わせが含まれる。
【００１９】
核酸は別の核酸配列と機能的関係に配置される時、“作動可能に連結（operably linked ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が、調節配列に結合される時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であってもよい。例えば、プレ配列（pre-sequence）または分泌リーダー（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され；またはリボソーム結合部位は配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され；またはリボソーム結合部位は翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（enhancer）は接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションにより遂行される。そのような部位が存在しない場合、常法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００２０】
本願発明で使われた用語、“発現ベクター”とは通常異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア(recombinant carrier)として一般的に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは宿主細胞から天然的に見つからないＤＮＡであるヘテロ型ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡに関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００２１】
当業者において公知であるように、宿主細胞で形質転換された遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に、作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（replication origin）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれる。発現宿主が真核細胞の場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００２２】
本発明において、組換えベクターとしてはプラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（酵母人工染色体、Yeast Artificial Chromosome）ベクターを含む様々なベクターを導入することができる。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用するのが好ましい。そのような目的のために用いられる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように、複製が効率的に行われるようにする複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選択できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片を挿入できる制限酵素切断部位を含む構造；を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても常法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーションすることができる。
【００２３】
本発明に係る組換えベクターは、常法によって適切な宿主細胞に形質転換することができる。本発明でより好ましい宿主細胞は、バクテリア、酵母及び黴などが可能であるが、これらに制限されるものではない。本発明で好ましい宿主細胞は原核細胞であり、大腸菌がより好ましい。適した大腸菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社製）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂなどを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（speices）及び属（genera）などもまた使用できる。上述したＥ．ｃｏｌｉの他にも、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属の菌株、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバシリ属（bacilli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）のようなさらに別の腸内細菌及び様々なシュードモナス（Pseudomonas）属の菌株が宿主細胞として利用でき、本発明は上記記載した例に制限されるものではない。
また、原核細胞の形質転換はSambrook et al., supraの1.82セクションに記載されたカルシウムクロリド方法を用いて容易に達成できる。また、選択的にエレクトロポレーション法（Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982)）もこのような細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００２４】
本発明の転換酵素の遺伝子及び合成酵素の遺伝子を含有する植物体を製造するための植物体の形質感染は、アグロバクテリウムやウイルスベクターなどを用いた常法によって達成できる。例えば、本発明に係る遺伝子を含有する組換えベクターでアグロバクテリウム属の微生物を形質転換させた後、上記形質転換されたアグロバクテリウム属の微生物を対象植物の組織などに感染させ、形質感染された植物を得ることができる。より具体的に、（ａ）対象植物の外植片（explant）を前培養（pre-culture）した後、これを上記形質転換されたアグロバクテリウムと共培養して形質感染させる工程；（ｂ）形質感染された外植片をカルス誘導培地で培養してカルスを収得する工程；及び（ｃ）得られたカルスを切断し、これをシュート誘導培地で培養してシュートを形成させる工程；を経て形質感染された植物を製造できる。
本発明で、“外植片（explant）”とは、植物体から切断した組織の切片を意味するもので、子葉（cotyledon）または胚軸（hypocotyl）を含む。本発明の方法に使われる植物の外植片には、子葉または胚軸を使用することができ、植物の種子を消毒して洗浄した後、ＭＳ培地で発芽させて得た子葉を使用することがさらに好ましい。
本発明で利用可能な形質感染対象植物としてはタバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、トウモロコシなどが挙げられるが、これに制限されるものではない。また、形質転換に使われる植物が有性繁殖植物であっても、組織培養などにより無性的に繰返生殖させることができることは当業者にとって自明である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためだけであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
特に、以下実施例では、ＰＨＡ合成酵素変異体を用いてラクテート共重合体を合成するのに、３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）を添加し、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ））を合成することだけが記載されているが、３−ＨＢ以外のヒドロキシアルカノエートを添加し、上記ヒドロキシアルカノエートとラクテートの共重合体を製造することができることは当業者にとって自明なことである。
【００２６】
＜実施例１＞シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング及び発現ベクターの作製
本発明に使われたシュードモナス属（ＫＣＴＣ １１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004）に基づいた配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマーを作製し、ＰＣＲを遂行してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。
配列番号１：5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3
配列番号２：5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子に該当する１．７ｋｂｐサイズの遺伝子断片を確認した。ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素の発現のために単量体供給酵素と合成酵素が共に発現されるオペロン形態の恒常的発現システムを導入した（図１）。
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347）からラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutrophus）Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Stratagene社製）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組換えベクターを製造した。
ｐＲｅＣＡＢベクターはＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモーターにより恒常的に発現され、大腸菌でもよく作動すると知られている（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347）。ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６ ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、上記で得たｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによってｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターを製造した（図１）。
【００２７】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位がそれぞれ両端に一つずつ含まれたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子切片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法でアミノ酸の変換無しに除去しており、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を追加するために、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマーを用いてオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号３：5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3
配列番号４：5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3
配列番号５：5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3
配列番号６：5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3
配列番号７：5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3
配列番号８：5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3
上記作製したｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターのｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子塩基配列はシークエンスによって確認し、その結果を配列番号９に示した。これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
上記遺伝子塩基配列の類似性を分析した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ６１−３（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998)由来ｐｈａＣ１と塩基配列で８４．３％の相同性を有し、アミノ酸配列相同性は８８．９％と上記２合成酵素が非常に類似した酵素であることを確認した。これらの結果から、本発明で得たｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素はＴｙｐｅ ＩＩ ＰＨＡ合成酵素であることを確認した。
上記ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素がＰＨＢを合成するか否かを確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社製）に形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成は観察されなかった。
【００２８】
＜実施例２＞シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素の基質特異性変異体の作製
多様な種類のＰＨＡ合成酵素の中で、Ｔｙｐｅ ＩＩ ＰＨＡ合成酵素は比較的炭素数の長い基質を重合させるＭＣＬ−ＰＨＡ（medium-chain-length PHA）合成酵素として知られている。このＭＣＬ合成酵素はラクテート重合体生産に非常に有用となることが期待されている。本発明で獲得したｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素と非常に相同性の高いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３由来ｐｈａＣ１合成酵素は、Ｔｙｐｅ ＩＩ合成酵素であるが、比較的広い範囲の基質特異性を有することが報告（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998）されており、ＳＣＬ−ＰＨＡ(short-chain-length PHA)生産に適した突然変異体に関する研究結果が報告（Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004）されれている。これらの結果に基づいて、本発明ではＳＣＬ活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３個所を配列アライメント解析を通して探し出し、配列番号１１〜配列番号１４のプライマーを用いたＳＤＭ方法を利用して、下記表１のようなｐｈａＣ１Ｐｓ６-１９合成酵素変異体を作った。
【００２９】
【表１】
【００３０】
配列番号１１：5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3
配列番号１２：5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3
配列番号１３：5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3
配列番号１４：5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3
配列番号１５：5- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3
配列番号１６：5- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3
【００３１】
これらの組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ ａｇａｒ、グルコース２０ｇ/Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ/ｍＬ)で生育させた結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅと、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ＢｌｕｅとのいずれもＰＨＢ生成を確認することができた。即ち、単量体供給酵素であるｐｈａＡＲＥとｐｈａＢＲＥによりグルコースから３ＨＢ−ＣｏＡが生成され、これを基質としてｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００及びｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）がＰＨＢを合成したものである。定量的な分析のために、形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅをグルコース（２０ｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ培地で、３７℃で４日間培養した。培養された組換え大腸菌にスクロースショック（sucrose shock）を与えた後、ナイルレッド染色を行い、これをＦＡＣＳ分析した（図２）。
【００３２】
野生型合成酵素を含むベクターであるｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢベクターで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅはナイルレッドにより染色されない反面、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換された大腸菌とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅは細胞内に蓄積されたＰＨＢがナイルレッドにより染色され、高い蛍光度を示した。また、培養菌体を遠心分離により回収し、８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を行って細胞内の合成されたＰＨＢ含量を測定した結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換させた大腸菌とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換させた大腸菌はＰＨＢ含量が乾燥細胞重量に対してそれぞれ２９．７％（ｗ／ｗ）及び４３．１％（ｗ／ｗ）であり、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢの場合は検出されなかった。
【００３３】
＜実施例３＞シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素とプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が可能な組換え大腸菌の作製及びそれを用いたＰＬＡまたはラクテート共重合体の製造
本実施例では、ＰＬＡ及びラクテート共重合体合成時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）を使用した。図３のようにＰＨＡ合成酵素とＣＰ−ＰＣＴが共に発現されるオペロン形態の恒常的発現システムを構築した。ＣＰ−ＰＣＴの場合、微生物に毒性を示すものと知られているが、一般的に組換えタンパク質発現に広く使われるｔａｃプロモーターやＴ７プロモーターを使用したＩＰＴＧによる発現誘導システムでは誘導剤添加直後に組換え微生物が全て死滅する。このために弱く発現されるが、微生物増殖によって持続的に発現される恒常的発現システムを使用することが適していると判断した。ｃｐ−ｐｃｔはクロストリジウム・プロピオニカムの染色体ＤＮＡを配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを利用してＰＣＲして得られた断片を使用した。この時、元来野生型ＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ ｓｉｔｅをクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法を利用して除去した（図４）。
配列番号１７：5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA
配列番号１８：5-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg
また、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号１９：5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3
配列番号２０：5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3
【００３４】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有したｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、 ラルストニア・ ユートロファス（Ralstonia eutrophus）Ｈ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）を除去した後、上記ＰＣＲクローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを製造した（図４）。
【００３５】
また、別のｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＣＰＰＣＴ組換えベクター及び野生型ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１−ＣＰＰＣＴ組換えベクターもやはり上記のような方法で作製した。ＣＰ−ＰＣＴによる単量体供給で重合体の合成可否を確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＣＰＰＣＴとｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ ２ｇ／Ｌ、ナイルレッド０.５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成を観察することができた。
上記作製されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを利用して様々な条件でフラスコ培養を遂行し、ＰＬＡ及びラクテート共重合体の生産を試みた。その結果を表２に示した。
【００３６】
【表２】
【００３７】
上記２段階培養の場合、培養液をＭＲ培地に置換した後、嫌気的培養を試みてラクテートが細胞内で作られるように試みたものである。多様な条件で組換え大腸菌を培養した結果、ＰＬＡ単独重合体は乾燥細胞重量に対して約１％程度合成されており、３ＨＢを基質として添加し、ラクテート共重合体合成を試みた場合は、約６％程度得ることができた。本実施例で使用した組換え大腸菌の流加培養に使われたＭＲ培地の組成は表３に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
＜実施例４＞組換え大腸菌の流加培養を通じたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の製造
ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターで形質転換された組換え大腸菌を２０ｇ／Ｌのグルコース、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンなどが含まれた３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、撹拌速度２００ｒｐｍで１２時間培養した。この培養液を同一培地１００ｍＬに接種し、同一条件で６時間培養した。これを流加培養の種培養液（seed culture）として使用した。流加培養のための開始培地としてＭＲ培地を使用した。ＭＲ培地２．４Ｌが含有された発酵槽に１００ｍＬの種培養液を接種して流加培養を解した。培養液の温度は３７℃であり、ｐＨは１４％アンモニア水溶液を用いて６．８〜６．９になるように調節し、溶存酸素は空気供給及び撹拌速度調節を介して飽和空気の２０％以上を維持した。この時、空気供給速度は１ｖｖｍであった。初期開始培地に含有されたグルコースが枯渇した時、グルコース２０ｇと３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）５ｇを供給し、同時に撹拌速度を２００ｒｐｍに、そして空気供給速度を０．１ｖｖｍにそれぞれ低減させ、培養条件を好気条件から嫌気条件に転換した。培養期間の間、グルコースは５回供給した。この中の第１回目と第３回目の供給時には、５ｇの３ＨＢを共に供給した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、凍結乾燥した。
合成された重合体の分離精製のために、ソックスレー抽出器でクロロホルムを利用して凍結乾燥細胞から重合体を抽出した。クロロホルムに溶けている重合体抽出液から回転蒸発器を利用して、クロロホルムをほとんど除去し、そこにメタノールを添加して重合体を沈澱させた。沈澱された重合体をフィルタろ過を用いてろ過した後、真空乾燥器で１２時間乾燥し、最終回収した。
【００４０】
さらに、遠心分離によって回収された菌体の一部を８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を遂行して細胞内合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の含量を測定した。３ＨＶ含量が重量比で１２％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）共重合体及びＰＬＡ単独重合体を標準物質として使用した。
分析結果、大腸菌内に合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の含量は、乾燥細胞重量に対して約１０％、共重合体の中のＰＬＡ含量は８８ｍｏｌ％であった。
本実施例を通して最終回収された重合体のガスクロマトグラフィー分析を遂行した結果、回収された重合体はＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体であることを再確認しており、重合体の中のＰＬＡ含量また８８ｍｏｌ％であることを再確認した。
【００４１】
＜実施例５＞組換え大腸菌の流加培養を通じたＰＬＡ単独重合体の製造
実施例４と同様にして、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターで形質転換された組換え大腸菌の種培養を実施し、ＭＲ培地２．４Ｌが含有された発酵槽に１００ｍＬの種培養液を接種して流加培養を開始した。培養液の温度は３７℃、ｐＨは１４％アンモニア水溶液を利用して６．８〜６．９になるように調節し、溶存酸素は空気供給及び撹拌速度調節を通して飽和空気の２０％以上を維持した。この時、空気供給速度は１ｖｖｍであり、初期開始培地に含有されたグルコースが枯渇した時、グルコース２０ｇを供給し、同時に撹拌速度を２００ｒｐｍに、空気供給速度を０．１ｖｖｍにそれぞれ低減し、培養条件を好気条件から嫌気条件に転換させた。培養期間の間、グルコースを５回供給した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、これを凍結乾燥した。重合体は実施例４と同様にして最終回収した。
さらに、遠心分離によって回収された菌体の一部を８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を遂行して細胞内合成されたＰＬＡ含量を測定した。３ＨＶ含量が重量比で１２％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）共重合体、メチル−４ＨＢ及びＰＬＡ単独重合体を標準物質として使用した。
分析結果、３ＨＢ及び４ＨＢは全く検出されていなく、ＰＬＡだけが検出されたことを確認することができた。大腸菌内に合成されたＰＬＡの含量は乾燥細胞重量に対して約１０％であった。本実施例を通して最終回収された重合体のガスクロマトグラフィー分析を遂行した結果、回収された重合体はＰＬＡ含量が９９.１ｍｏｌ％ポリラクテート重合体であった。
【００４２】
＜実施例６＞様々な変異体の作製
上記実施例２と同様にして、下記プライマーを利用して様々なＰＨＡ合成酵素変異体を作製した。作製された変異体を下記表４、５、６及び７に総合して示した。
Ｅ１３０Ｄ
配列番号１５：5’-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3’
配列番号１６：5' -ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3'
Ｓ３２５Ｔ
配列番号１１：5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'
配列番号１２：5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3'
Ｓ４７７Ｒ
配列番号２１：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3'
配列番号２２：5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｈ
配列番号２３：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cat ggg cat atc- 3'
配列番号２４：5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｆ
配列番号２５：5'- gaa ttc gtg ctg tcg agc ttt ggg cat atc- 3'
配列番号２６：5'- gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｙ
配列番号２７：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc tat ggg cat atc- 3'
配列番号２８：5'-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｇ
配列番号２９：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc- 3'
配列番号３０：5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｑ４８１Ｋ
配列番号３１：5'-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号３２：5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c- 3'
Ｑ４８１Ｍ
配列番号３３：5'-ggg cat atc atg agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号３４：5'-gcg ggt tca gga tgc tca tga tat gcc c- 3'
Ｑ４８１Ｒ
配列番号３５：5'-ggg cat atc cgc agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号３６：5'-gcg ggt tca gga tgc tgc gga tat gcc c- 3'
【００４３】
【表４】
【００４４】
【表５】
【００４５】
【表６】
【００４６】
【表７】
【００４７】
＜実施例７＞様々な変異体を用いたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の合成
上記実施例３に記載された方法と同様にして、シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体とプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が可能な組換え大腸菌を作製し、これを利用して実施例４と同様にしてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を作製した。その結果を下記表８、９及び１０に示した。
【００４８】
【表８】
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【００５１】
上記表８、９及び１０に示されるように、本発明に係るＰＨＡ合成酵素変異体はラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート共重合体を高効率で製造することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上で示されるように、本発明に係るシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を使用すれば、従来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が、基質として使用するのに困難であったラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート重合体及び／又は共重合体を高効率で製造することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクチル−ＣｏＡを基質として用いて、ラクテート重合体（ｌａｃｔａｔｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）及び／又はラクテート共重合体（ｌａｃｔａｔｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を合成しうる、シュードモナス・スピーシーズ６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９）由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体に関する。また、本発明は、このようなポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を利用することを特徴とするラクテート重合体及び／又は共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（ＰＬＡ）は、ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）から由来した代表的な生分解性重合体であり、汎用高分子あるいは医療用高分子としての応用性が大きい。現在、ＰＬＡは微生物発酵により生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては低分子量（１，０００〜５，０００ダルトン）のＰＬＡのみが生成される。高分子量（＞１００，０００ダルトン）のＰＬＡを合成するためには、連鎖カップリング剤（chain coupling agent）を利用して、ラクテートの直接重合で得られた低分子量のＰＬＡを重合する方法を利用することができる。しかし、有機溶剤や連鎖カップリング剤の添加によって高分子量のＰＬＡを得る工程が複雑になり、またこれらを除去することが容易ではないという短所がある。現在、商用化されている高分子量ＰＬＡ生産工程は、ラクテートをラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）に転換した後、ラクチド環の開環縮合反応を通してＰＬＡを合成する方法が使われている。
化学合成により、ラクテートを用いてＰＬＡを合成する場合、ＰＬＡ重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）は容易に収得することができる。しかし、様々なモノマー単位（unit）を有するＰＬＡ共重合体の合成は難しく、商業的に効用性が非常に劣るという短所がある。
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は過度の炭素源が存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の栄養分が不足する時、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵化合物としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油に由来した合成高分子に似た物性を有しながら、完全な生分解性を示すため、既存の合成プラスチックに代わる物質として認識されている。
微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡ単量体に転換する酵素と、ＰＨＡ単量体を利用してＰＨＡ重合体を合成するＰＨＡ合成酵素が必須的である。微生物を利用してＰＬＡ及びラクテート共重合体を合成する時も、同様のシステムが必要とされるので、元来のＰＨＡ合成酵素の基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡを提供しうる酵素以外に、さらにラクチル−ＣｏＡを提供しうる酵素が必要とされる。
【０００３】
そこで、本発明者らはラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを使用するシステムを利用して、ＰＬＡ及びラクテート共重合体の合成に成功した（特許文献１）。しかし、２位においてヒドロキシル化（hydroxylation）されたヒドロキシアルカノエートに対するＰＨＡ合成酵素の反応性は非常に低かった。in vitro活性測定を通してＰＨＡ合成酵素のラクチル−ＣｏＡに対する反応性を分析した報告はあったが、上述した問題点のようにラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡ合成酵素の反応性は非常に微弱であると知られていた（非特許文献１、２、３）。従って、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用できないＰＨＡ合成酵素を利用してＰＬＡ及びラクテート共重合体を合成する時には合成効率が非常に低くならざるを得ない。即ち、２位の炭素位置がヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートであるラクテートはＰＨＡ合成酵素の基質特異性に適しないために、効率的にＰＬＡ及びラクテート共重合体を合成するためには、ラクチル−ＣｏＡを効率的に利用できるＰＨＡ合成酵素が非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国特許出願公開第１０−２００６−０１２１５５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001
【非特許文献２】Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994
【非特許文献３】Yuan et al. Arch Biochem Biophys. 394:87, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の主な目的は、ラクチル−ＣｏＡを基質として効率的に利用できるＰＨＡ合成酵素を提供することにある。
本発明の別の目的は、上記ラクチル−ＣｏＡを基質として利用できるＰＨＡ合成酵素及びプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子を含有する植物または細胞を利用して、ＰＬＡ及びラクテート共重合体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列で４８１位のアミノ酸であるグルタミンが変異されたことを特徴とするラクチル−ＣｏＡを基質として利用してラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
【０００８】
好ましくは、本発明は、上記変異体が１３０位のアミノ酸であるグルタミン酸、３２５位のアミノ酸であるセリン及び４７７位のアミノ酸であるセリンよりなる群から選択された一つ以上のアミノ酸がさらに変異されたことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
【０００９】
より好ましくは、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列で、下記変異：
ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；
ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；
ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；
ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；
ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；
ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；
ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；
ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；
ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；
ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；
ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；
ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又は
ｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ
を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするラクチル−ＣｏＡを基質として利用して、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を提供する。
【００１０】
本発明者らは、シュードモナス・スピーシーズ６−１９（Pseudomonas sp.6-19）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用する場合、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート重合体及び／又は共重合体を高効率で製造できることを確認し、本発明を完成した。
【００１１】
また、本発明は、上記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体をコードする遺伝子を提供する。
さらに、本発明は、上記遺伝子を含有するラクテート重合体または共重合体合成用組換えベクターを提供する。
より好ましくは、本発明は、上記組換えベクターがプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）をさらに含有することを特徴とする組換えベクターを提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された細胞または植物を提供する。
さらに、本発明は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を上記組換えベクターで形質転換して得られることを特徴とする細胞または植物を提供する。
さらにまた、本発明は、上記細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテート重合体または共重合体の製造方法を提供する。
より好ましくは、本発明は、上記培養または栽培が、３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）を含有する環境で遂行され、製造された共重合体が３−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体であることを特徴とする製造方法を提供する。
【００１３】
本発明において、上記共重合体は、単量体の種類が２個の二重合体、単量体の種類が３個の三重合体、単量体の種類が４個の四重合体などを含む意味である。
本発明において、上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５，８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６,７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，6−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸からなる群から選択された一つ以上である。
【００１４】
また、本発明は上記細胞または植物を培養または培養することを特徴とするラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子を含む組換え発現ベクターを作製する過程を示す図である。
【図２】ｐｈａＣ１Ｐｓ６-１９合成酵素とＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００及びｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を含む組換えベクター（ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢ及びｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢ）で形質転換された大腸菌をＰＨＢが合成される条件で培養した後、ＦＡＣＳ（Florescence Activated Cell Sorting）分析した結果である。
【図３】ＰＨＡ合成酵素とＣＰ−ＰＣＴが同時に発現される恒常的発現ベクターを示す簡単な図である。
【図４】本発明のシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、ＳＣＬ変異体遺伝子と、ＣＰ−ＰＣＴ遺伝子とを含む組換え発現ベクターを作製する過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、ベクターとは、適した宿主内でＤＮＡを発現させることができる、適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを意味する。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、または単純なゲノム挿入物であってもよい。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムにかかわりなく複製して機能するか、または場合によっては、ゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在ベクターの最も通例的に使われる形態であるから、本発明でプラスミドとベクターは同じ意味で使われる。しかし、本発明は当業者に既に知られた、または知られることになる、同等の機能を有するベクターの別の形態も含む。
【００１７】
発現調節配列とは、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必須的なＤＮＡ配列を意味する。この調節配列は転写を実施するためのプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列はプロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドで遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（cytomegalovirus）由来プロモーターなどが好ましく使われる。
【００１８】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために非常に多様な発現調節配列の中のどのようなものでもベクターに使われることができる。有用な発現調節配列の例には、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他の解糖酵素に対するプロモーター、上記ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α−交配システムのプロモーター及び原核生物または真核生物またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知らされたコンストラクト配列及びこれらの種々の組み合わせが含まれる。
【００１９】
核酸は別の核酸配列と機能的関係に配置される時、“作動可能に連結（operably linked ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が、調節配列に結合される時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であってもよい。例えば、プレ配列（pre-sequence）または分泌リーダー（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され；またはリボソーム結合部位は配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され；またはリボソーム結合部位は翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（enhancer）は接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションにより遂行される。そのような部位が存在しない場合、常法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００２０】
本願発明で使われた用語、“発現ベクター”とは通常異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア(recombinant carrier)として一般的に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは宿主細胞から天然的に見つからないＤＮＡであるヘテロ型ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡに関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００２１】
当業者において公知であるように、宿主細胞で形質転換された遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に、作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（replication origin）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれる。発現宿主が真核細胞の場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００２２】
本発明において、組換えベクターとしてはプラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（酵母人工染色体、Yeast Artificial Chromosome）ベクターを含む様々なベクターを導入することができる。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用するのが好ましい。そのような目的のために用いられる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように、複製が効率的に行われるようにする複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選択できるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片を挿入できる制限酵素切断部位を含む構造；を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても常法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーションすることができる。
【００２３】
本発明に係る組換えベクターは、常法によって適切な宿主細胞に形質転換することができる。本発明でより好ましい宿主細胞は、バクテリア、酵母及び黴などが可能であるが、これらに制限されるものではない。本発明で好ましい宿主細胞は原核細胞であり、大腸菌がより好ましい。適した大腸菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社製）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂなどを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（speices）及び属（genera）などもまた使用できる。上述したＥ．ｃｏｌｉの他にも、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属の菌株、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバシリ属（bacilli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）のようなさらに別の腸内細菌及び様々なシュードモナス（Pseudomonas）属の菌株が宿主細胞として利用でき、本発明は上記記載した例に制限されるものではない。
また、原核細胞の形質転換はSambrook et al., supraの1.82セクションに記載されたカルシウムクロリド方法を用いて容易に達成できる。また、選択的にエレクトロポレーション法（Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982)）もこのような細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００２４】
本発明の転換酵素の遺伝子及び合成酵素の遺伝子を含有する植物体を製造するための植物体の形質感染は、アグロバクテリウムやウイルスベクターなどを用いた常法によって達成できる。例えば、本発明に係る遺伝子を含有する組換えベクターでアグロバクテリウム属の微生物を形質転換させた後、上記形質転換されたアグロバクテリウム属の微生物を対象植物の組織などに感染させ、形質感染された植物を得ることができる。より具体的に、（ａ）対象植物の外植片（explant）を前培養（pre-culture）した後、これを上記形質転換されたアグロバクテリウムと共培養して形質感染させる工程；（ｂ）形質感染された外植片をカルス誘導培地で培養してカルスを収得する工程；及び（ｃ）得られたカルスを切断し、これをシュート誘導培地で培養してシュートを形成させる工程；を経て形質感染された植物を製造できる。
本発明で、“外植片（explant）”とは、植物体から切断した組織の切片を意味するもので、子葉（cotyledon）または胚軸（hypocotyl）を含む。本発明の方法に使われる植物の外植片には、子葉または胚軸を使用することができ、植物の種子を消毒して洗浄した後、ＭＳ培地で発芽させて得た子葉を使用することがさらに好ましい。
本発明で利用可能な形質感染対象植物としてはタバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、トウモロコシなどが挙げられるが、これに制限されるものではない。また、形質転換に使われる植物が有性繁殖植物であっても、組織培養などにより無性的に繰返生殖させることができることは当業者にとって自明である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためだけであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
特に、以下実施例では、ＰＨＡ合成酵素変異体を用いてラクテート共重合体を合成するのに、３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）を添加し、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ））を合成することだけが記載されているが、３−ＨＢ以外のヒドロキシアルカノエートを添加し、上記ヒドロキシアルカノエートとラクテートの共重合体を製造することができることは当業者にとって自明なことである。
【００２６】
＜実施例１＞シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング及び発現ベクターの作製
本発明に使われたシュードモナス属（ＫＣＴＣ １１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004）に基づいた配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマーを作製し、ＰＣＲを遂行してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。
配列番号１：5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3
配列番号２：5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子に該当する１．７ｋｂｐサイズの遺伝子断片を確認した。ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素の発現のために単量体供給酵素と合成酵素が共に発現されるオペロン形態の恒常的発現システムを導入した（図１）。
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347）からラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutrophus）Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Stratagene社製）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組換えベクターを製造した。
ｐＲｅＣＡＢベクターはＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモーターにより恒常的に発現され、大腸菌でもよく作動すると知られている（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347）。ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６ ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、上記で得たｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによってｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターを製造した（図１）。
【００２７】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位がそれぞれ両端に一つずつ含まれたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子切片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法でアミノ酸の変換無しに除去しており、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を追加するために、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマーを用いてオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号３：5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3
配列番号４：5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3
配列番号５：5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3
配列番号６：5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3
配列番号７：5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3
配列番号８：5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3
上記作製したｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターのｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子塩基配列はシークエンスによって確認し、その結果を配列番号９に示した。これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に示した。
上記遺伝子塩基配列の類似性を分析した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ６１−３（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998)由来ｐｈａＣ１と塩基配列で８４．３％の相同性を有し、アミノ酸配列相同性は８８．９％と上記２合成酵素が非常に類似した酵素であることを確認した。これらの結果から、本発明で得たｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素はＴｙｐｅ ＩＩ ＰＨＡ合成酵素であることを確認した。
上記ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素がＰＨＢを合成するか否かを確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社製）に形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成は観察されなかった。
【００２８】
＜実施例２＞シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素の基質特異性変異体の作製
多様な種類のＰＨＡ合成酵素の中で、Ｔｙｐｅ ＩＩ ＰＨＡ合成酵素は比較的炭素数の長い基質を重合させるＭＣＬ−ＰＨＡ（medium-chain-length PHA）合成酵素として知られている。このＭＣＬ合成酵素はラクテート重合体生産に非常に有用となることが期待されている。本発明で獲得したｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素と非常に相同性の高いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３由来ｐｈａＣ１合成酵素は、Ｔｙｐｅ ＩＩ合成酵素であるが、比較的広い範囲の基質特異性を有することが報告（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998）されており、ＳＣＬ−ＰＨＡ(short-chain-length PHA)生産に適した突然変異体に関する研究結果が報告（Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004）されれている。これらの結果に基づいて、本発明ではＳＣＬ活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３個所を配列アライメント解析を通して探し出し、配列番号１１〜配列番号１４のプライマーを用いたＳＤＭ方法を利用して、下記表１のようなｐｈａＣ１Ｐｓ６-１９合成酵素変異体を作った。
【００２９】
【表１】
【００３０】
配列番号１１：5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3
配列番号１２：5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3
配列番号１３：5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3
配列番号１４：5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3
配列番号１５：5- atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3
配列番号１６：5- ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3
【００３１】
これらの組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ ａｇａｒ、グルコース２０ｇ/Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ/ｍＬ)で生育させた結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅと、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ＢｌｕｅとのいずれもＰＨＢ生成を確認することができた。即ち、単量体供給酵素であるｐｈａＡＲＥとｐｈａＢＲＥによりグルコースから３ＨＢ−ＣｏＡが生成され、これを基質としてｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００及びｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）がＰＨＢを合成したものである。定量的な分析のために、形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅをグルコース（２０ｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ培地で、３７℃で４日間培養した。培養された組換え大腸菌にスクロースショック（sucrose shock）を与えた後、ナイルレッド染色を行い、これをＦＡＣＳ分析した（図２）。
【００３２】
野生型合成酵素を含むベクターであるｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢベクターで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅはナイルレッドにより染色されない反面、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換された大腸菌とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅは細胞内に蓄積されたＰＨＢがナイルレッドにより染色され、高い蛍光度を示した。また、培養菌体を遠心分離により回収し、８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を行って細胞内の合成されたＰＨＢ含量を測定した結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換させた大腸菌とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換させた大腸菌はＰＨＢ含量が乾燥細胞重量に対してそれぞれ２９．７％（ｗ／ｗ）及び４３．１％（ｗ／ｗ）であり、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢの場合は検出されなかった。
【００３３】
＜実施例３＞シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素とプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が可能な組換え大腸菌の作製及びそれを用いたＰＬＡまたはラクテート共重合体の製造
本実施例では、ＰＬＡ及びラクテート共重合体合成時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）を使用した。図３のようにＰＨＡ合成酵素とＣＰ−ＰＣＴが共に発現されるオペロン形態の恒常的発現システムを構築した。ＣＰ−ＰＣＴの場合、微生物に毒性を示すものと知られているが、一般的に組換えタンパク質発現に広く使われるｔａｃプロモーターやＴ７プロモーターを使用したＩＰＴＧによる発現誘導システムでは誘導剤添加直後に組換え微生物が全て死滅する。このために弱く発現されるが、微生物増殖によって持続的に発現される恒常的発現システムを使用することが適していると判断した。ｃｐ−ｐｃｔはクロストリジウム・プロピオニカムの染色体ＤＮＡを配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを利用してＰＣＲして得られた断片を使用した。この時、元来野生型ＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ ｓｉｔｅをクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法を利用して除去した（図４）。
配列番号１７：5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA
配列番号１８：5-gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg
また、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号１９：5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3
配列番号２０：5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3
【００３４】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有したｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、 ラルストニア・ ユートロファス（Ralstonia eutrophus）Ｈ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）を除去した後、上記ＰＣＲクローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを製造した（図４）。
【００３５】
また、別のｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＣＰＰＣＴ組換えベクター及び野生型ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１−ＣＰＰＣＴ組換えベクターもやはり上記のような方法で作製した。ＣＰ−ＰＣＴによる単量体供給で重合体の合成可否を確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＣＰＰＣＴとｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ ２ｇ／Ｌ、ナイルレッド０.５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成を観察することができた。
上記作製されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを利用して様々な条件でフラスコ培養を遂行し、ＰＬＡ及びラクテート共重合体の生産を試みた。その結果を表２に示した。
【００３６】
【表２】
【００３７】
上記２段階培養の場合、培養液をＭＲ培地に置換した後、嫌気的培養を試みてラクテートが細胞内で作られるように試みたものである。多様な条件で組換え大腸菌を培養した結果、ＰＬＡ単独重合体は乾燥細胞重量に対して約１％程度合成されており、３ＨＢを基質として添加し、ラクテート共重合体合成を試みた場合は、約６％程度得ることができた。本実施例で使用した組換え大腸菌の流加培養に使われたＭＲ培地の組成は表３に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
＜実施例４＞組換え大腸菌の流加培養を通じたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の製造
ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターで形質転換された組換え大腸菌を２０ｇ／Ｌのグルコース、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンなどが含まれた３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、撹拌速度２００ｒｐｍで１２時間培養した。この培養液を同一培地１００ｍＬに接種し、同一条件で６時間培養した。これを流加培養の種培養液（seed culture）として使用した。流加培養のための開始培地としてＭＲ培地を使用した。ＭＲ培地２．４Ｌが含有された発酵槽に１００ｍＬの種培養液を接種して流加培養を解した。培養液の温度は３７℃であり、ｐＨは１４％アンモニア水溶液を用いて６．８〜６．９になるように調節し、溶存酸素は空気供給及び撹拌速度調節を介して飽和空気の２０％以上を維持した。この時、空気供給速度は１ｖｖｍであった。初期開始培地に含有されたグルコースが枯渇した時、グルコース２０ｇと３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）５ｇを供給し、同時に撹拌速度を２００ｒｐｍに、そして空気供給速度を０．１ｖｖｍにそれぞれ低減させ、培養条件を好気条件から嫌気条件に転換した。培養期間の間、グルコースは５回供給した。この中の第１回目と第３回目の供給時には、５ｇの３ＨＢを共に供給した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、凍結乾燥した。
合成された重合体の分離精製のために、ソックスレー抽出器でクロロホルムを利用して凍結乾燥細胞から重合体を抽出した。クロロホルムに溶けている重合体抽出液から回転蒸発器を利用して、クロロホルムをほとんど除去し、そこにメタノールを添加して重合体を沈澱させた。沈澱された重合体をフィルタろ過を用いてろ過した後、真空乾燥器で１２時間乾燥し、最終回収した。
【００４０】
さらに、遠心分離によって回収された菌体の一部を８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を遂行して細胞内合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の含量を測定した。３ＨＶ含量が重量比で１２％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）共重合体及びＰＬＡ単独重合体を標準物質として使用した。
分析結果、大腸菌内に合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の含量は、乾燥細胞重量に対して約１０％、共重合体の中のＰＬＡ含量は８８ｍｏｌ％であった。
本実施例を通して最終回収された重合体のガスクロマトグラフィー分析を遂行した結果、回収された重合体はＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体であることを再確認しており、重合体の中のＰＬＡ含量また８８ｍｏｌ％であることを再確認した。
【００４１】
＜実施例５＞組換え大腸菌の流加培養を通じたＰＬＡ単独重合体の製造
実施例４と同様にして、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターで形質転換された組換え大腸菌の種培養を実施し、ＭＲ培地２．４Ｌが含有された発酵槽に１００ｍＬの種培養液を接種して流加培養を開始した。培養液の温度は３７℃、ｐＨは１４％アンモニア水溶液を利用して６．８〜６．９になるように調節し、溶存酸素は空気供給及び撹拌速度調節を通して飽和空気の２０％以上を維持した。この時、空気供給速度は１ｖｖｍであり、初期開始培地に含有されたグルコースが枯渇した時、グルコース２０ｇを供給し、同時に撹拌速度を２００ｒｐｍに、空気供給速度を０．１ｖｖｍにそれぞれ低減し、培養条件を好気条件から嫌気条件に転換させた。培養期間の間、グルコースを５回供給した。培養終了後、遠心分離により細胞を回収し、これを凍結乾燥した。重合体は実施例４と同様にして最終回収した。
さらに、遠心分離によって回収された菌体の一部を８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を遂行して細胞内合成されたＰＬＡ含量を測定した。３ＨＶ含量が重量比で１２％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）共重合体、メチル−４ＨＢ及びＰＬＡ単独重合体を標準物質として使用した。
分析結果、３ＨＢ及び４ＨＢは全く検出されていなく、ＰＬＡだけが検出されたことを確認することができた。大腸菌内に合成されたＰＬＡの含量は乾燥細胞重量に対して約１０％であった。本実施例を通して最終回収された重合体のガスクロマトグラフィー分析を遂行した結果、回収された重合体はＰＬＡ含量が９９.１ｍｏｌ％ポリラクテート重合体であった。
【００４２】
＜実施例６＞様々な変異体の作製
上記実施例２と同様にして、下記プライマーを利用して様々なＰＨＡ合成酵素変異体を作製した。作製された変異体を下記表４、５、６及び７に総合して示した。
Ｅ１３０Ｄ
配列番号１５：5’-atc aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3’
配列番号１６：5' -ggt cgg cgc cat cgc atc ggt cat gag gtt gat- 3'
Ｓ３２５Ｔ
配列番号１１：5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'
配列番号１２：5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG- 3'
Ｓ４７７Ｒ
配列番号２１：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cgc ggg cat atc- 3'
配列番号２２：5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｈ
配列番号２３：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc cat ggg cat atc- 3'
配列番号２４：5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｆ
配列番号２５：5'- gaa ttc gtg ctg tcg agc ttt ggg cat atc- 3'
配列番号２６：5'- gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｙ
配列番号２７：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc tat ggg cat atc- 3'
配列番号２８：5'-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｓ４７７Ｇ
配列番号２９：5'-gaa ttc gtg ctg tcg agc ggc ggg cat atc- 3'
配列番号３０：5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3'
Ｑ４８１Ｋ
配列番号３１：5'-ggg cat atc aaa agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号３２：5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c- 3'
Ｑ４８１Ｍ
配列番号３３：5'-ggg cat atc atg agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号３４：5'-gcg ggt tca gga tgc tca tga tat gcc c- 3'
Ｑ４８１Ｒ
配列番号３５：5'-ggg cat atc cgc agc atc ctg aac ccg c- 3'
配列番号３６：5'-gcg ggt tca gga tgc tgc gga tat gcc c- 3'
【００４３】
【表４】
【００４４】
【表５】
【００４５】
【表６】
【００４６】
【表７】
【００４７】
＜実施例７＞様々な変異体を用いたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の合成
上記実施例３に記載された方法と同様にして、シュードモナス・スピーシーズ６−１９由来ＰＨＡ合成酵素変異体とプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が可能な組換え大腸菌を作製し、これを利用して実施例４と同様にしてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を作製した。その結果を下記表８、９及び１０に示した。
【００４８】
【表８】
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【００５１】
上記表８、９及び１０に示されるように、本発明に係るＰＨＡ合成酵素変異体はラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート共重合体を高効率で製造することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上で示されるように、本発明に係るシュードモナス・スピーシーズ６−１９由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体を使用すれば、従来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が、基質として使用するのに困難であったラクチル−ＣｏＡを基質として使用してラクテート重合体及び／又は共重合体を高効率で製造することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０のアミノ酸配列で４８１位のアミノ酸であるグルタミンが変異されたことを特徴とするラクチル−ＣｏＡを基質として利用して、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
【請求項２】
前記変異体は、１３０位のアミノ酸であるグルタミン酸、３２５位のアミノ酸であるセリン及び４７７位のアミノ酸であるセリンよりなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が、さらに変異されたことを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
【請求項３】
前記変異体は配列番号１０のアミノ酸配列で、
ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；
ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；
ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；
ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；
ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；
ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；
ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；
ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；
ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；
ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；
Ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；
ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又は
ｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
が変異されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組換えベクター。
【請求項６】
前記組換えベクターは、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）をさらに含有することを特徴とする請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された細胞または植物。
【請求項８】
プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を請求項６に記載の組換えベクターで形質転換して得られることを特徴とする細胞または植物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１０】
前記培養または栽培はヒドロキシアルカノエートを含有する環境で遂行され、共重合体はヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含有することを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５,８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１】
配列番号１０のアミノ酸配列で４８１位のアミノ酸であるグルタミンが変異されたことを特徴とするラクチル−ＣｏＡを基質として利用して、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成しうるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
【請求項２】
前記変異体は、１３０位のアミノ酸であるグルタミン酸、３２５位のアミノ酸であるセリン及び４７７位のアミノ酸であるセリンよりなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が、さらに変異されたことを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
【請求項３】
前記変異体は配列番号１０のアミノ酸配列で、
ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；
ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；
ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；
ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；
ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；
ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；
ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；
ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；
ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；
ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；
Ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；
ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又は
ｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
が変異されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組換えベクター。
【請求項６】
前記組換えベクターは、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）をさらに含有することを特徴とする請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターで形質転換された細胞または植物。
【請求項８】
プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を請求項６に記載の組換えベクターで形質転換して得られることを特徴とする細胞または植物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１０】
前記培養または栽培はヒドロキシアルカノエートを含有する環境で遂行され、共重合体はヒドロキシアルカノエート単量体単位及びラクテート単量体単位を含有することを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５,８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸からなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５１０７７５（Ｐ２０１０−５１０７７５Ａ）
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３８３２８（Ｐ２００９−５３８３２８）
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００５８５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６２９９９
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５００２３９８２３）エルジー・ケム・リミテッド (1,221)
【出願人】（５００１９２４７０）コリア・アドヴァンスド・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００５８５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６２９９９
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５００２３９８２３）エルジー・ケム・リミテッド (1,221)
【出願人】（５００１９２４７０）コリア・アドヴァンスド・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (12)
【Ｆターム（参考）】
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