スギ花粉由来の新規タンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用
【課題】 スギ花粉症の診断や治療に有用な新規タンパク質を提供する。
【解決手段】 本発明に係るタンパク質（ＣＰＡ１２１）は、２７８アミノ酸残基からなるタンパク質であり、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ（ＸＴＨ）と高い相同性を有するものである。
【解決手段】 本発明に係るタンパク質（ＣＰＡ１２１）は、２７８アミノ酸残基からなるタンパク質であり、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ（ＸＴＨ）と高い相同性を有するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スギ花粉由来の新規タンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用に関するものであり、特に、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼのアミノ酸配列との相同性を有し、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥと高い反応頻度を示すタンパク質、およびそのタンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉症は、スギ林から早春に飛散するスギ花粉を吸収することによって起こるアレルギー疾患であり、鼻炎や皮膚炎、喘息発作などの即時型のアレルギー反応を誘発するものである。近年、スギ花粉症の患者数は急増し、深刻な社会問題となっている。
【０００３】
スギ花粉症は、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発するアレルゲン（以下「スギ花粉アレルゲン」と称す）を免疫系が認識することが引き金となって発症することが知られており、これまでに、いくつかのスギ花粉アレルゲンが同定されている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、ペクテート・リアーゼ活性を有するタンパク質であるＣｒｙ ｊ１が開示されており、非特許文献２には、ペクチンを加水分解するポリメチルガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質であるＣｒｙ ｊ２が開示されている。また、特許文献１には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって測定した分子量が５７０００〜６７０００ダルトンであり、等電点が７．０〜９．０の範囲にあるアレルゲンが開示されている。さらに、本発明者らは、イソフラボンレダクターゼ様のアレルゲンであるＣＪＰ−６の同定（非特許文献３）および上記Ｃｒｙ ｊ１およびＣｒｙ ｊ２の異性体の同定に成功している（非特許文献４）。
【特許文献１】特開２００１−１５１７９７号公報（平成１３（２００１）年６月５日公開）
【非特許文献１】Yasueda, H. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 71, 77-86 (1983).
【非特許文献２】Sakagucji, H. et al., Allergy, 45, 309-312 (1990)
【非特許文献３】Kawamoto S. et al., Clin. Exp. Allergy, 32, 1064-1070(2002)
【非特許文献４】Fujimura, T. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 133, 125-135 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のように、現在のところ同定されたスギ花粉アレルゲンの種類は非常に少ないため、アレルギー反応を実際の生体反応に即した形で知るための情報としては未だ不十分であるという問題がある。したがって、さらに多くのスギ花粉アレルゲンを同定し、その特性を知ることが必要である。
【０００６】
また、上述のこれまで同定されたアレルゲン以外のスギ花粉アレルゲンによってアレルギー反応が誘発される場合も多いため、スギ花粉症患者一人ひとりに適した診断や治療を行うためには、より多くのスギ花粉アレルゲンを同定し、スギ花粉アレルゲンに関するデータを蓄積する必要がある。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、スギ花粉症の診断や治療に有用な新規タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ（以下「ＸＴＨ」と称する）と相同性を有する新規タンパク質を見出すとともに、当該タンパク質がスギ花粉症患者の血清ＩｇＥと高い反応頻度を示すことを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ活性を有し、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴としている。
【００１０】
また、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明に係るタンパク質は、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有することが好ましい。
【００１２】
また、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるタンパク質であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴としている。
【００１３】
上記ＸＴＨは、植物が細胞壁の構築・構造変化を起こすための必須酵素であるが、これまでにアレルゲンとして作用するという報告はなされていない。しかしながら、後述する実施例に示すように、上記ＸＴＨのアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質はスギ花粉症患者血清のＩｇＥと高い反応頻度を有する。上記タンパク質は、それぞれ、ＸＴＨ活性を有するタンパク質、ＸＴＨの活性部位（活性中心）と相同なアミノ酸配列を含むタンパク質、ＸＴＨのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するタンパク質であり、ＸＴＨのアミノ酸配列との相同性は高く、かつ、アレルゲン活性を有している。したがって、新規アレルゲンとして利用でき、アレルギー診断用薬剤や治療用薬剤等に応用することができる。
【００１４】
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードすることを特徴としている。また、本発明に係る遺伝子は、下記の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
のいずれかであることが好ましい。
【００１５】
上記遺伝子は、上記アレルゲン活性を有する新規タンパク質をコードする。したがって、形質転換等の手法により宿主に上記タンパク質を生産させることができる。
【００１６】
また、本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質と結合することを特徴としている。上記抗体は、上記タンパク質と特異的に抗原抗体反応を行うことができる。したがって、上記タンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞を同定することができる。
【００１７】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係る遺伝子を含むことを特徴としている。上記ベクターによれば、上記遺伝子を生物または細胞に導入することができる。したがって、上記タンパク質を生物または細胞において発現させることができる。また、無細胞タンパク質合成系を用いて上記タンパク質を合成することもできる。
【００１８】
さらに、本発明に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターを用いることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が導入されていることを特徴としている。さらに、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係る形質転換体を用いることを特徴としている。上記形質転換体には、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれているので、上記形質転換体を有性生殖または無性生殖、もしくは培養等することにより、本発明に係るタンパク質を生産することができる。したがって、本発明に係るタンパク質を容易に大量調製することができる。
【００２０】
また、本発明に係るペプチドは、本発明に係るタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来Ｔ細胞を増殖させる活性を有することを特徴としている。上記ペプチドは、本発明に係るタンパク質の一部分、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープを含んでいるので、アレルゲンとして作用することができる。したがって、アレルギー診断用薬剤や、スギ花粉症患者に対する減感作療法の治療用薬剤等に利用することができる。
【００２１】
また、本発明に係る検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されていることを特徴としている。上記構成によれば、上記塩基配列またはその相補配列をプローブとして、当該プローブとハイブリダイズするヌクレオチドを検出することができる。したがって、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出等を行うことができる。
【００２２】
また、本発明に係る検出器具は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。さらに、本発明に係る検出器具は、本発明に係る抗体が基板上に固定化されていることを特徴としている。上記構成によれば、アレルゲン活性を有するタンパク質等が基板上に固定化されているので、上記タンパク質等と相互作用する物質を検出することができる。したがって、タンパク質群の相互作用を分子レベルで明らかにすることができる。
【００２３】
また、本発明に係るアレルギー診断用薬剤は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含むことを特徴としている。上記タンパク質およびペプチドは、スギ花粉症のアレルゲン活性を有しているので、これらを認識する患者血清中のＩｇＥ抗体と結合しうる。したがって、上記タンパク質および／または上記ペプチドを含む薬剤を被験者に投与することにより、スギ花粉に対するアレルギーの有無を診断することができる。
【００２４】
また、本発明に係る治療用薬剤は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含むことを特徴としている。上記タンパク質および上記ペプチドは、スギ花粉症のアレルゲン活性を有している。したがって、上記タンパク質および／または上記ペプチドを含む薬剤は、スギ花粉症に対する減感作療法等における治療用薬剤として用いることができる。
【００２５】
さらに、本発明に係る治療用薬剤は、本発明に係る抗体を含むことを特徴としている。上記抗体は、スギ花粉アレルゲンと特異的に結合することができる。したがって、上記抗体を含む薬剤は、受動免疫によるスギ花粉症の治療用薬剤等として用いることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係るタンパク質は、以上のように、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、ＸＴＨのアミノ酸配列と相同性を有し、かつ、アレルゲン活性を有するものである。それゆえ、スギ花粉症患者血清のＩｇＥと高頻度で反応することができるので、アレルギー診断薬や、減感作療法用の治療用薬剤等として好適に利用することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の位置実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。以下、本発明に係るタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、およびこれらの利用について詳述する。
【００２８】
（１）本発明に係るタンパク質
一実施形態において、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、ＸＴＨ活性を有し、かつ、アレルゲン活性を有することが好ましい。上記ＸＴＨは糖転移酵素の一つであり、セルロースに架橋しているキシログルカンを切断し、他のキシログルカンに繋ぎ換えることにより、細胞壁の再編や構築に関与していると考えられている。また、ＸＴＨは、花粉においては、花粉柱が伸長する際に活性化して細胞壁の糖鎖構造を変化させる酵素として知られている。
【００２９】
上記「ＸＴＨ活性を有する」とは、本発明に係るタンパク質が、ＸＴＨと同様の酵素活性を示すことができればよいとの意である。後述するＣＰＡ１２１の組み換えタンパク質は界面活性剤により変性しているため、リフォールディングして活性を取り戻す必要があるが、一定分子量範囲のキシログルカンに対して酵素を作用させた場合、糖転移が起こり、分子量分布が変化するため、リフォールディング後のＸＴＨ活性をゲル濾過クロマトグラフィーなどで分析することでＸＴＨ活性を確認することができる。なお、天然物のＸＴＨ活性についても同様に確認することができる。
【００３０】
また、本明細書中において、上記「アレルゲン活性」とは、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、アトピー性の人に即時型アレルギー反応を引き起こす活性のみならず、単に血清中のＩｇＥと結合する活性をも含むものとする。
【００３１】
他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有することが好ましい。
【００３２】
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＸＴＨ特有の活性部位（活性中心）であり、ＸＴＨが基質を取り込んでその反応を触媒する場所のアミノ酸配列である。上記配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。すなわち、本発明に係るタンパク質には、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質も含まれる。
【００３３】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであることが好ましく、上記ＸＴＨ活性を維持することができるものであればよい。
【００３４】
このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３５】
他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、Ｎ型糖鎖結合部位を含んでいてもよい。Ｎ型糖鎖とは、糖タンパク質の糖鎖のうち、タンパク質のアスパラギン残基に結合している糖鎖のことであり、Ｎ−アセチルグルコサミン２個とマンノース３個の基本構造からなる。
【００３６】
また、他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、上記ＸＴＨのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有することが好ましい。ここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合のことであり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。上記相同性は、６０％以上であることが好ましいが、後述する実施例に示すように、ＸＴＨと相同性の高いタンパク質はスギ花粉症患者血清のＩｇＥと高い反応頻度を有していることから、相同性は高いほど好ましいと考えられ、６５％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましい。また、特に、ＸＴＨの活性部位（活性中心）のアミノ酸配列に対する相同性が高いことがより好ましい。
【００３７】
また、他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるタンパク質であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有することが好ましい。
【００３８】
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質（以下「ＣＰＡ１２１」と称する）のアミノ酸配列は、上記ＸＴＨのアミノ酸配列と相同性を有している。具体的には、後述する実施例に示すように、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシス由来のＸＴＨと、それぞれ７０％、６８％、６６％という高い相同性を有している。
【００３９】
また、上記ＣＰＡ１２１は、後述する実施例に示すように、スギ花粉症患者の血清に含まれるＩｇＥ抗体によって認識され、当該スギ花粉症患者のアレルギー反応を誘発するアレルゲンである。これまで上記ＸＴＨがアレルゲンとして報告された例はないが、上記ＣＰＡ１２１は上述のようにアレルゲンであるとともに、ＸＴＨのアミノ酸配列と高い相同性を有するため、ＸＴＨとして初めて見出されたアレルゲンである可能性がある。
【００４０】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」は、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであることが好ましい。このような変異タンパク質は、上述したように、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４１】
なお、以上説示した本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合タンパク質であってもよい。したがって、本発明に係るタンパク質は、既に説明した構造以外に、他の構造を含む複合タンパク質であっても良い。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００４２】
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明に係るタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明に係るタンパク質を取得する方法は、特に限定されるものではない。例えば、後述する本発明に係る遺伝子（本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内で発現させて取得してもよいし、細胞、組織などから単離精製してもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明に係るタンパク質は、他のタンパク質とつながった融合タンパク質であってもよい。さらに本発明に係るタンパク質は、無細胞系によって合成されたものであってもよいし、化学合成されたものであってもよい。あるいは、本発明に係るタンパク質は、Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２など、他のアレルゲンタンパク質と融合させて使用してもよい。
【００４４】
上記タンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、上記ＸＴＨに特有な活性部位（活性中心）と相同なアミノ酸配列を含んでおり、かつ、アレルゲン活性を有しているため、新規アレルゲンとして、アレルギー診断用薬剤や治療用薬剤等に利用することができる。
【００４５】
本発明に係るタンパク質を取得する方法（生産方法）は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。すなわち、スギ花粉から本発明に係るタンパク質を抽出・精製してもよい。また、精製方法も特に限定されるものではない。例えば、細胞抽出液を従来公知のカラム等を用いて精製すればよい。
【００４６】
本発明に係るタンパク質は、その一部分、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープ（以下「Ｔ細胞エピトープ」と称する）を含む部分のみを利用するようにしてもよい。すなわち、本発明に係るタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有するペプチドも、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４７】
上記「スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性」とは、スギ花粉症患者由来の末梢血単核細胞群（Ｔ細胞が多く含まれる）を、上記ペプチドの存在下で培養したときに、該末梢血単核細胞群のＤＮＡ合成速度を、上記ペプチドの非存在下で培養した末梢血単核細胞群の２倍を越える速度、より好ましくは５倍以上の速度にする活性のことを意味する。
【００４８】
なお上記Ｔ細胞は、体内に取り込まれたアレルゲンを認識し、ＩｇＥ抗体の産生を促す細胞である。したがって、Ｔ細胞がアレルゲンを認識する能力が低下すれば、当該アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生量は低下し、それに伴い当該アレルゲンによって誘発されるアレルギー反応は沈静化する。そこで減感作療法では、微量のアレルゲンを当該アレルゲンに対してアレルギー反応を誘発する患者に投与することにより、当該アレルゲンに対するＴ細胞の感受性を低下させる。したがって、上記ペプチドは、スギ花粉症患者に対する減感作療法において利用することができる。
【００４９】
上記ペプチドの同定は、適宜公知の方法を用いて行うことが可能である。例えば以下のようにして同定することができる。
【００５０】
まず本発明に係るオーバーラップペプチドを合成する。ここで「オーバーラップペプチド」とは、本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１；配列番号２）のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端からＣ末端に至る全アミノ酸残基をカバーするペプチドのことである。かかるオーバーラップペプチドは、市販されているペプチド自動合成装置により容易に合成することができる。これらのオーバーラップペプチドの中から、少なくとも一つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを同定すればよい。
【００５１】
またＴ細胞エピトープを同定するためには、スギ花粉症患者の末梢血リンパ球から、本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１）を特異的に認識し増殖応答するＴ細胞ラインを樹立する必要がある。一般に、患者毎に反応するＴ細胞エピトープが異なるため、患者毎にＴ細胞ラインを樹立することが望ましい。
【００５２】
Ｔ細胞ラインの樹立するためには、通常患者の末梢血リンパ球を本発明に係るタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１）の存在下、７日間程度培養して抗原刺激によりＴ細胞を活性化し、さらに、活性化Ｔ細胞を、抗原と抗原提示細胞と共に７日間培養することを数回繰り返して抗原刺激することにより、抗原特異的Ｔ細胞ラインを作製することができる。
【００５３】
しかしながら、Ｔ細胞が増殖因子のIL−2の存在下でよく増殖している場合は、抗原刺激は最初だけにすることが好ましい。Ｔ細胞ラインを数度抗原刺激すると、増殖率の高いＴ細胞が選択的に取れ、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを同定する場合において、エピトープによっては十分な増殖応答を示さない場合が生じるからである。
【００５４】
なお、抗原刺激に使用する本発明に係るタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１）としては、スギ花粉から取得した天然型のものが最も望ましいが、組換えタンパク質、あるいはオーバーラップペプチドの混合物も好適に使用できる。上記本発明に係るタンパク質は、大腸菌で発現させ精製したものが利用できる。
【００５５】
また、上記で使用する抗原提示細胞としては、Ｔ細胞ラインと同一人の末梢血リンパ球を、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射して増殖能力を失わせたものが望ましい。しかし、採血回数が多くなるため、Epstein−Barr virus（EBV）を自己のＢリンパ球に感染させトランスフォーメーションを起こさせたものは、in vitroで増殖し続けリンパ芽球様細胞株（Ｂ細胞株）となるため、このＢ細胞株を抗原提示細胞として用いてもよい。Ｂ細胞株の樹立方法は既に確立されている［組織培養の技術第二版、187-191 頁、日本組織学会編（1988.8.10）］。
【００５６】
それぞれの患者固有のＴ細胞ラインが認識する、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは以下のようにして同定される。ここで「認識する」という意味は、Ｔ細胞レセプターが抗原エピトープ（MHC 分子を含めて）と特異的に結合し、その結果、Ｔ細胞が活性化されることを意味し、活性化の状態は、リンホカインの産生や、ＤＮＡの合成を [ 3Ｈ] チミジンの取込み量を指標として測定することにより観察される。すなわち、Ｔ細胞ラインとマイトマイシンＣ処理した同一人のＢ細胞株とを、９６穴平底プレートに播種し、オーバーラップペプチドと共に混合培養し、 [ 3Ｈ] チミジンの取込み量（cpm ）を液体シンチレーションカウンターで測定する。その際、 [ 3Ｈ] チミジンの取込みは、個々の培養系で異なるため、例えば、個々のペプチドに対するＴ細胞ラインの[ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm）を、抗原を添加していないコントロールの [ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm ）で除した数（stimulation index: SI ）が２以上のものを上記ペプチドと同定する。
【００５７】
（２）本発明に係る遺伝子
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードする。本発明に係る遺伝子には、さらに、上記遺伝子の変異体が含まれる。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００５８】
このような変異体としては、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００５９】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子または当該遺伝子にハイブリダイズする遺伝子を含む、単離した遺伝子を提供する。
【００６０】
本発明に係る遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡも包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係る遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６１】
一実施形態において、本発明に係る遺伝子は、
（ａ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
のいずれかであることが好ましい。上記（ａ）に係る遺伝子は、上記ＣＰＡ１２１をコードする遺伝子である。
【００６２】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６３】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００６４】
本発明に係る遺伝子を取得する方法としては、公知の技術により本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明における遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係る遺伝子の塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００６５】
あるいは、本発明に係る遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明における遺伝子のｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００６６】
（３）抗体
本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質と特異的に結合することができる。上記抗体とは免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００６７】
上記抗体は、本発明に係るタンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞の同定などに利用することができる。例えば、本発明に係るタンパク質を含む花粉が大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜にどの程度存在しているのかを調べるために利用することができる。
【００６８】
上記抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）等の方法を用いて作製することができる。
【００６９】
また、上記抗体には、上記タンパク質に特異的に結合しうる完全な抗体分子のみならず、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントも含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ないため（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））、好ましく用いることができる。
【００７０】
（４）本発明に係るタンパク質および／または遺伝子の利用
（４−１）ベクター
本発明に係るベクターは、上記本発明に係る遺伝子を含むものであれば特に限定されるものではない。例えば、上記本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００７１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係る遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００７２】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および大腸菌および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００７３】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係る遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【００７４】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【００７５】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００７６】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７７】
（４−２）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が導入されているものであり、上記「形質転換体」とは、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
【００７８】
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。
【００７９】
本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換体は、当該タンパク質を含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００８０】
宿主への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。また、遺伝子を直接細胞または組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。
【００８１】
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行えばよい。
【００８２】
ＰＣＲ増幅産物については、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００８３】
上記形質転換体を作製し、有性生殖あるいは無性生殖、または培養等することにより、上記形質転換体内で本発明に係るタンパク質を生産することができるため、上記タンパク質を容易に大量調製することが可能となる。
【００８４】
（４−３）タンパク質の生産方法
上記本発明にかかるベクターおよび形質転換体を用いることによって本発明にかかるタンパク質の生産を行うことができる。
【００８５】
一実施形態において、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（上記本発明にかかるベクター）を用いることを特徴とする。
【００８６】
本実施形態の一つの局面において、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００８７】
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係る遺伝子を組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記タンパク質（ポリペプチド）を精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的遺伝子（ポリヌクレオチド）を導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００８８】
このように宿主に外来遺伝子（ポリヌクレオチド）を導入する場合、発現ベクターは、外来遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたタンパク質（ポリペプチド）を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質（ポリペプチド）の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質（ポリペプチド）を精製することが可能である。
【００８９】
本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を含む細胞または組織の抽出液から当該タンパク質（ポリペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。タンパク質（ポリペプチド）を精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００９０】
別の実施形態において、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を天然に発現する細胞または組織から当該タンパク質（ポリペプチド）を精製することを特徴とする。本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上述した抗体を用いて本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上述したタンパク質（ポリペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【００９１】
さらに他の実施形態において、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を化学合成するものであってもよい。化学合成の方法は特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を化学合成することができる。
【００９２】
本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を生産する方法によって取得されるタンパク質（ポリペプチド）は、天然に存在する変異タンパク質（ポリペプチド）であっても、人為的に作製された変異タンパク質（ポリペプチド）であってもよい。
【００９３】
変異タンパク質（ポリペプチド）を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質（ポリペプチド）を作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質（ポリペプチド）作製法を用いることによって、変異タンパク質（ポリペプチド）を作製することができる。変異タンパク質（ポリペプチド）の作製には市販のキットを利用してもよい。
【００９４】
（４−４）検出器具
本発明に係る検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されたもの、本発明に係るタンパク質および／またはペプチドが基板上に固定化されたもの、または、本発明に係る抗体が基板上に固定化されたものであり、種々の条件下において、本発明に係るタンパク質、ペプチド、遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用することができる。
【００９５】
一実施形態において、本発明に係る検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されていることを特徴としている。このような検出器具としては、例えば、ＤＮＡチップを挙げることができる。上記「ＤＮＡチップ」とは、合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した合成型ＤＮＡチップを意味するが、これに限定されず、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡを基板上に固定化した貼付け型ＤＮＡマイクロアレイも包含する。
【００９６】
基板上に固定するプローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する公知の方法（例えば、ＳＡＧＥ法（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）等が挙げられるがこれらに限定されない）によって決定することができる。
【００９７】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、当該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【００９８】
本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出に用いることができ、発現しているｍＲＮＡの種類、発現レベルの把握・発現解析等を行うことができる。
【００９９】
他の実施形態において、本発明に係る検出器具は、本発明に係るタンパク質および／またはペプチドまたは抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、いわゆるプロテインチップである。
【０１００】
上記の方法以外のタンパク質および／またはペプチド、または抗体を基板上に固定化する方法としては、例えば、ニトロセルロース膜やＰＤＶＦ膜にタンパク質や抗体をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法、または、タンパク質や抗体の変性を軽減するために、スライドガラス上にポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパク質や抗体をスポットする方法が挙げられる。
【０１０１】
さらに、タンパク質や抗体を基板表面に吸着させるだけでなく、強固に結合させるため、アルデヒド修飾ガラスを利用した方法（Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０（２０００））を用いることもできる。また、基板上でのタンパク質の配向を揃えて固定化する方法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法（Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１（２００１））を用いることができる。
【０１０２】
上記検出器具は、例えば種々の生物またはその組織もしくは細胞からの抽出液を標的サンプルとする検出に用いることができ、上記タンパク質等と相互作用する物質を検出することができる。したがって、タンパク質群の相互作用を分子レベルで明らかにすることができる。
【０１０３】
なお、上記「基板」は、目的物（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質）を担持することのできる物質をいい、「支持体」と交換可能に使用される。好ましい基板（支持体）としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、目的物をこれらの基板に固定化する方法は、特に限定されるものではない。例えば、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：５１９−５２０（１９９２）に記載の方法を用いることができる。
【０１０４】
本発明に係る検出器具に用いる基板の材質としては、目的物を安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【０１０５】
（４−５）薬剤
一実施形態において、本発明に係るアレルギー診断用薬剤は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含むことを特徴としている。
【０１０６】
本発明に係るタンパク質は、これまでにスギ花粉症の主要アレルゲンとして知られているＣｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２とは異なる構造を有する新規のスギ花粉アレルゲンである。アレルゲンを認識するＩｇＥ抗体は、アレルゲンであるタンパク質の特定の領域（エピトープ）を認識することから、本発明に係るタンパク質は、Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２とは異なるエピトープを有していると考えられる。換言すれば、本発明に係るタンパク質を認識する抗体と、Ｃｒｙ ｊ１またはＣｒｙ ｊ２を認識する抗体とは異なると考えられる。
【０１０７】
また、本発明に係るペプチドは、上述のように、本発明に係るタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有するペプチドである。
【０１０８】
したがって、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含む薬剤を用いることにより、上記タンパク質および／またはペプチドを認識する抗体を有するスギ花粉症患者を検出することができ、上記薬剤をアレルギー診断用薬剤として利用することができる。
【０１０９】
また、スギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合には、当該スギ花粉症患者が保有している抗体により認識されるアレルゲンを当該患者に投与する必要がある。例えば、Ｃｒｙ ｊ１に対する抗体を保有している患者には、Ｃｒｙ ｊ１を投与する必要がある。
【０１１０】
これまで、スギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合には、主にＣｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２が当該患者に投与されていた。しかし、上述の理由から、本発明に係るタンパク質に対する抗体を保有するスギ花粉症患者に対しては、上記Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２を用いた治療方法は効果を奏さないと考えられる。
【０１１１】
すなわち、本発明に係るタンパク質および／またはペプチドを認識する抗体を有するスギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合は、上記Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２ではなく、上記本発明に係るタンパク質および／またはペプチドを抗原として用いる必要がある。したがって、上記タンパク質および／またはペプチドを含む薬剤を用いることにより、的確な減感作療法を行うことが可能となる。
【０１１２】
また、本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質を認識することができるので、上記抗体を含む抗体を含む治療用薬剤は、免疫されていない個体に注射して免疫能を賦与する受動免疫に用いることができる。
【０１１３】
本発明に係る治療用薬剤は通常、本発明にかかるタンパク質または抗体を０．０１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５〜５０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．５〜５．０％（ｗ／ｗ）含んでなる。また、減感作療法の治療用薬剤としては、本発明にかかるタンパク質を０．０１〜０．０２％（ｗ／ｗ）含んでなることが好ましい。
【０１１４】
本発明にかかる治療用薬剤は、当該タンパク質または抗体単独の形態はもとより、それ以外に生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、プルランなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤、さらには必要に応じてステロイドホルモンやクロモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン剤、抗タキキニン剤を含む１種または２種以上の他の薬剤と組み合わせた組成物としての形態を包含する。
【０１１５】
さらに、本発明の薬学的組成物は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、本発明にかかるタンパク質および／またはペプチド、または抗体を、例えば、１日当たりの用量またはその整数倍（４倍まで）またはその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤形にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、口腔剤、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【０１１６】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１７】
以下、本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【実施例】
【０１１８】
［実施例１：アレルゲンの分画］
（１）スギ花粉粗抗原の調製
日本スギ花粉（広島県豊田郡豊町にて採取）８０ｇに抽出バッファー（２０ｍＭ ＰＢＳ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．６）を３．２リットル加えた後、４℃で一晩攪拌した。その後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３０分）によって得た上清に対して、終濃度８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩攪拌した。次に、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３０分）によって沈殿を採取し、超純水を用いて一晩透析する工程を５回行った。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分）することで得られた上清を凍結乾燥し、スギ花粉粗抗原を得た。
【０１１９】
（２）スギ花粉粗抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離
まず、上記スギ花粉粗抗原を平衡化し、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に供した。上記スギ花粉粗抗原はカラム容量の５倍量の２０ｍＭ酢酸バッファー（以降「Ａバッファー」と称する。ｐＨ５）による透析で平衡化し、カラムに平衡化したスギ花粉粗抗原の溶液を流して塩基性タンパクを吸着させた。次に、カラムの３倍量のＡバッファーで未吸着の成分を洗い流した後、Ａバッファーに対して１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸バッファー、（以降「Ｂバッファー」と称する。ｐＨ５）の割合が徐々に上がるようにグラジエントをかけて流し、塩基性の弱いタンパク質から順に溶出させた。なお、グラジエントは流量１リットルの時点で両バッファーの比率が５０％ずつになるよう設定した。最後に、Ｂバッファー１００％で残りのタンパク質を全て溶出した。
【０１２０】
上記陽イオン交換クロマトグラフィーによって６つのフラクションが得られた。当該６つのフラクションは超純水に対する透析により脱塩し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分離した。分離ゲルはポリアクリルアミド濃度１２．５％のゲルを用い、電気泳動後、染色液（エタノール：酢酸：水＝９：２：９＋０．２５％ＣＢＢ Ｒ−２５０）でタンパク質を染色した。その後、脱色液（エタノール：酢酸：水＝５：２：１３）で余分な染色液を除去した。
【０１２１】
図１は、上記６つのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示すものである。「ＬＭＷ」は分子量マーカーである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された各タンパク質は、４０人のスギ花粉症患者から得た血清とのウエスタンブロッティングに供した。
【０１２２】
ウェスタンブロッティングにより電気泳動したタンパク質は、ＰＶＤＦメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写し、メンブレンをブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ、＋３％スキムミルク、１％ＢＳＡ）に浸して室温で３〜５時間浸透した後、ブロッキングバッファーで１０倍希釈した血清（患者および健常者のもの）に浸して４℃で一晩浸透した。
【０１２３】
次に、ＰＢＳＴで１０分×３回振盪洗浄し（以降、洗浄は全てＰＢＳＴを用いて行った）、ブロッキングバッファーで２００００倍希釈したＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＥ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）に浸して室温で２時間浸透した。そして、１０分×３回振盪洗浄後、ブロッキングバッファーで２００００倍希釈したＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＺＹＭＥＤ社）に浸して室温で１時間浸透した。最後に、１０分×５回振盪洗浄後、ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で発光させ、Ｘ線フィルムに感光させた。
【０１２４】
その結果、データは示さないが、図１のレーン５に丸囲みしたバンド（分子量約３０ｋＤａ）のタンパク質が、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥと７０％の反応頻度を示した。
【０１２５】
［実施例２：スギ花粉アレルゲンＣＰＡ１２１の分離、解析］
（１）二次元電気泳動
上記分子量約３０ｋＤａのタンパク質の分解能を向上させるため、まず、スギ花粉粗抗原の二次元電気泳動を行った。
【０１２６】
スギ花粉粗抗原２００ｍｇに４ｍｌのＰＢＳ＋ジチオトレイトール６０ｍｇを加えて懸濁し、ＰＢＳで６０％に調製したトリクロロ酢酸２ｍｌを加えた後、氷上で９０分間静置した。その後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１５分）を行い、沈殿を回収した。この沈殿に冷アセトン１０ｍｌを加えて懸濁し、洗浄した。さらに、遠心分離（３５００ｒｐｍ、２０分）を行った後、スピードバックで沈殿を乾燥させた。その沈殿にＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ３−１０、１％ＤＴＴ、０．８％Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）１ｍｌを加えて懸濁し、超音波破砕によって完全に溶解させた。その後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ、２０分）を行い、その上清を二次元電気泳動用のサンプルに用いた。
【０１２７】
ｐＩレンジ３〜１０のドライストリップをＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで一晩膨潤させた後、スギ花粉粗抗原のサンプルをストリップにアプライして一次元目（等電点）の電気泳動を行った。アクリルアミド濃度９〜１８％のグラジエントゲルを作製し、その上に等電点電気泳動後のゲルをセットした。ゲルの上から低融点アガロースを重層し固化させた後、８０Ｖで一晩、二次元目（分子量）の電気泳動を行った。二次元目の電気泳動が終了した後、ゲルを銀染色することによってタンパク質を検出した。
【０１２８】
図２は、スギ花粉粗抗原の二次元電気泳動結果を示すものである。上述の図１のレーン５に丸囲みしたバンド（分子量約３０ｋＤａ）のタンパク質は、図２において丸で囲んだ部分に相当する。
【０１２９】
（２）Ｎ末端アミノ酸配列の分析およびＸＴＨとの相同性確認
図２において丸で囲んだ部分のうち、矢印で示した中央のスポット（Ｎｏ．１２１）について、プロテインシークエンサーによりＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、２０残基のアミノ酸配列（配列番号４）が明らかとなった。
【０１３０】
上記２０残基のアミノ酸配列について相同性検索を行ったところ、ＸＴＨのアミノ酸配列と６０％の相同性を有していた。なお、上記相同性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いたＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ検索によって確認した。
【０１３１】
［実施例３：ＣＰＡ１２１のｃＤＮＡ塩基配列の決定および一次構造の決定］
上述のように、図２において説明したスポット（Ｎｏ．１２１）のＮ末端アミノ酸配列は、ＸＴＨのアミノ酸配列と６０％の相同性を有していた。現在までにＸＴＨがアレルゲンとして報告された例はないが、このような相同性の高さから、上記Ｎｏ．１２１はＸＴＨとして初めて見出されたアレルゲンである可能性が考えられる。そこで、本発明者は上記Ｎｏ．１２１に係るタンパク質をＣＰＡ１２１と命名し、ＣＰＡ１２１がスギ花粉のアレルゲンである可能性を検証することとし、まずＣＰＡ１２１のｃＤＮＡ塩基配列および一次構造を決定した。
【０１３２】
（１）スギ花粉からの全ＲＮＡの抽出
日本スギの花粉３ｇを液体窒素中で粉砕し、１０倍量（Ｗ／Ｖ）の２×ＣＴＡＢ（centyltrimethylammomium bromide）溶液中に、粉砕されたスギ花粉を懸濁した後、６５℃で１０分間インキュベートした。そして、上記懸濁液と等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を上記懸濁液に加えて攪拌し、室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した。分離された液層のうち、水層（上層）を回収し、当該水層と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の３／４倍量のイソプロピルアルコールを当該水層に加えた後に、室温で１０分間静置した。その後、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）し、形成された沈殿をＴＥ（Tris−EDTA）バッファーに溶解することにより全ＲＮＡ粗抽出液を得た。
【０１３３】
上記全ＲＮＡ粗抽出液をさらに精製するために、上記全ＲＮＡ粗抽出液の１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム溶液を上記全ＲＮＡ粗抽出液に加え、２時間氷上でインキュベートした。そして、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）し、形成された沈殿をＴＥバッファーに溶解した。この溶解液に当該ＴＥバッファーと等量のＴＥ飽和フェノール（ｐＨ９．０）を加え攪拌した後に、室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層と等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の冷エタノール（−２０℃）とを当該水層に加え、−８０℃で１０分間静置した。その後、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）し、ＲＮＡの沈殿を得た。そして、当該沈殿を７０％エタノールで洗浄した後に、真空乾燥し、乾燥した沈殿を適量のＴＥバッファーに溶解した。
【０１３４】
（２）ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片の取得
上記（１）において得られた全ＲＮＡを鋳型として、全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。具体的には、３´RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用いて、逆転写反応とＰＣＲ反応とを行い、全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。以下において、この手法の詳細な説明を行う。
【０１３５】
（２−ａ）全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によるｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡ（５μｇ）を含む溶液 ５μｌに、アダプタープライマー １μｌと、ＤＥＰＣ（diethylpyrocarbonate）処理液 ６μｌとを加え、インキュベート（７０℃、１０分間）した後に、氷上に１分間静置した。この反応液に１０×ＰＣＲバッファー ２μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ２ ２μｌ，ｄＮＴＰ ＭＩ×（２．５ ｍＭ each） １μｌ、ＤＴＴ（dithiothreitol）（０．１ Ｍ） ２μｌを加え、４２℃で５分間プレインキュベートした。この反応液にSUPERSCRIPT II（Life Technonogies, Inc.社製）を１μｌ加えて、４２℃で５０分間インキュベートした。その後、７０℃で１５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。この反応液を氷上で静置した後に、RNase Hを１μｌ加えてインキュベート（３７℃、２０分間）することによりＲＮＡを消化した。
【０１３６】
（２−ｂ）ＰＣＲ反応によるＣＰＡ１２１遺伝子のｃＤＮＡの増幅
次に、上記（ａ）の処理によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。この反応において次に示す２種類のプライマーを用いた。
プライマー１：Forward 5’ ACHGAYTTYGAYATHACNTTYGG 3’（配列番号９）
プライマー２：Reverse 5’ RCAIGCITSDGCIYTRAARTTNC 3’（配列番号１０）
ＰＣＲ反応は、９４℃２分間の後、９４℃１分間→５３℃１分間→６８℃１分間の工程を３０回行い、その後試料を４℃に保持した。
【０１３７】
（３）全長ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの取得および塩基配列の決定
上記（２）において得られたＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に組み込み、ベクター特異的なプライマーを用いて、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【０１３８】
さらに、５´末端および３´末端を含めたＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの全塩基配列を決定するために、上記ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片の塩基配列を基に、次に示す新たなプライマー３、４を作製した。
プライマー３：Forward 5’ GACGGTGCAGTGAAGATCGATTG 3’（配列番号１１）
プライマー４：Reverse AUAP
上記プライマー３、４を用いて、３´RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）を行った。すなわち、９４℃２分間の後、９４℃１分間→６０℃１分間→６８℃１分間の工程を３０回行い、その後試料を４℃に保持した。
【０１３９】
さらに、次に示す新たなプライマー５〜８を作製した。
プライマー５：Forward(first) AAP
プライマー６：Reverse（first） 5’ CCATGAATTCACAGAGCAATCAG 3’（配列番号１２）
プライマー７：Forward (second) AUAP
プライマー８：Reverse (second) 5’ AGTGAGCTGCAAGCGTTGGC 3’（配列番号１３）
上記プライマー５〜８を用いて、５´RACEを行った。すなわち、９４℃２分間の後、９４℃１分間→５５℃１分間→６８℃１分間の工程を３０回行い、その後試料を４℃に保持した。条件はプライマー５および６を用いる第一段階ＰＣＲ、プライマー７および８を用いる第二段階ＰＣＲともに同じである。
【０１４０】
プライマー３、４を用いた３’ＲＡＣＥ法により、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの３’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。一方、プライマー５〜８を用いた５’ＲＡＣＥ法により、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの５’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。これにより、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの全塩基配列を決定するに至った。
【０１４１】
なお、上記のように、配列番号９、１０においては「ユニバーサルコード」表示できる塩基についてはこれを用いた。「ユニバーサルコード」は以下の通り定義されている。また、上記プライマー２の配列中「Ｉ」はイノシンを表し、配列表においてはイノシンは「ｎ」で表している。また、上記「AUAP」、「AAP」は、それぞれ、Abridged Universal Amplification Primer、Abridged Anchor Primerというキット内の特定配列を持ったプライマーの名称である。
ｍ：ＡまたはＣ
ｒ：ＧまたはＡ
ｗ：ＡまたはＴ
ｓ：ＧまたはＣ
ｙ：ＴまたはＣ
ｋ：ＧまたはＴ
ｖ：ＡまたはＧまたはＣ
ｈ：ＡまたはＣまたはＴ
ｄ：ＡまたはＧまたはＴ
ｂ：ＧまたはＣまたはＴ
ｎ：（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）または（不明または他の塩基）
図３は、ＣＰＡ１２１の全塩基配列と、当該配列から予想されるアミノ酸配列を示すものである。決定された配列は、１１５５塩基からなり（配列番号５）、８３４塩基からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域（配列番号３）を有していた。図３に示すように、上記ＯＲＦ領域は、２７８のアミノ酸（配列番号２）をコードすると予想される。上記配列番号２に係るアミノ酸配列から算出した理論分子量は、約３１５００であり、その配列中には、図３に下線を引いて示したＸＴＨに特有な活性部位（活性中心）のアミノ酸配列（ＤＥＩＤＦＥＦＬＧ；配列番号１）および、その直後に下線を引いて示したＮ型糖鎖結合部位（ＮＬＳ）が存在していた。
【０１４２】
なお、上記配列番号４に記載のアミノ酸配列は、図３および配列番号５に示すアミノ酸配列の２３位から４２位までに相当するが、両者のアミノ酸配列には相違する部分も存在している。これはＸＴＨには多くのアイソフォームが存在し、アイソフォームによって少しずつアミノ酸配列が異なることによると考えられる。例えばアラビドプシスのＸＴＨでは少なくとも２０以上のアイソフォームが報告されている。
【０１４３】
［実施例４：ＣＰＡ１２１とＸＴＨとのアミノ酸配列の相同性検索］
ＣＰＡ１２１とＸＴＨとのアミノ酸配列の相同性を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いたＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ検索により探索した。図４は、上記配列番号２に係るＣＰＡ１２１のアミノ酸配列と、リンゴ（Ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、図中Ｍ．ｄｏｍと略記；配列番号６）、アスパラガス（Ａ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、図中Ａ．ｏｆｆと略記；配列番号７）、アラビドプシス（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，図中Ａ．ｔｈａと略記；配列番号８）由来のＸＴＨのアミノ酸配列との相同性を示すものである。
【０１４４】
図４において、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシスのアミノ酸配列中、ＣＰＡ１２１のアミノ酸配列と相同性を有する部分は白抜き文字で表している。ＣＰＡ１２１のアミノ酸配列は、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシス由来ＸＴＨのアミノ酸配列と、それぞれ７０％、６８％、６６％という高い相同性を示した。
【０１４５】
［実施例５：組み換えＣＰＡ１２１の発現］
ＣＰＡ１２１を大量に得るために、ＣＰＡ１２１とＧＳＴ（glutathione S−transferase）との融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１）を大腸菌の発現系にて発現させた。図５は、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１を発現誘導させた大腸菌から抽出したタンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示している。
【０１４６】
ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１の発現誘導は、以下のように行った。まず、ＣＰＡ１２１遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）（配列番号３）をｐＧＥＸ４Ｔ-１ベクターに組み込み、当該ベクターをタンパク質発現用大腸菌株であるＢＬ２１に導入した。上記ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターには、ＩＰＴＧ（isopropyl-thio-beta-D-galactopyranoside）によって転写活性が高まるプロモーターが組み込まれており、ＩＰＴＧを大腸菌の培地に添加することによりタンパク質発現を誘導できる。そこで、ＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導した後に、大腸菌を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０１４７】
図５中のレーン１はＩＰＴＧによる発現誘導前の大腸菌から抽出したタンパク質の電気泳動結果を示すものであり、レーン２はＩＰＴＧによる発現誘導後の大腸菌から抽出したタンパク質の電気泳動結果を示すものである。レーン２に現れた分子量約５７ｋＤａのバンドがＧＳＴ−ＣＰＡ１２１であり、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１は抗ＧＳＴ抗体と反応することを確認した。なお、上記確認はＧＳＴ−ＣＰＡ１２１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロッティングすることにより行った。１次抗体にはＡｎｔｉ−ＧＳＴ抗体を、２次抗体にＡｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＧ−ＨＲＰを用いた。
【０１４８】
次に、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１が可溶性か不溶性かを確認するために、ＩＰＴＧ添加後の大腸菌をＰＢＳ中にて超音波破砕した後に遠心分離することにより、当該大腸菌のタンパク質を可溶性画分と不溶性画分とに分離した。当該可溶性画分および不溶性画分を電気泳動したところ、図５のレーン３、４に示すように、上記ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１の大部分は、不溶性画分に存在していた。
【０１４９】
そこで、上記不溶性画分に含まれるＣＰＡ１２１をＧＳＴ−ＣＰＡ１２１から分離するために、上記不溶性画分を０．３％サルコシルに溶解し、トロンビンによって消化した。図５中のレーン５は、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１のトロンビン消化物の電気泳動結果を示すものである。上記ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１は、ＧＳＴと推測されるタンパク質と、組み替えＣＰＡ１２１（以下では、ｒＣＰＡ１２１と称す）と推測されるタンパク質とに分離した。ここで、上記トロンビンは、ＧＳＴと当該ＧＳＴに融合されたタンパク質との境界に存在する特定のアミノ酸配列を認識し、消化する酵素である。
【０１５０】
上記ｒＣＰＡ１２１と推測されるタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列をペプチドシークエンスにより決定したところ、当該Ｎ末端のアミノ酸配列とＣＰＡ１２１のアミノ酸配列とが一致した。この結果から、上記ｒＣＰＡ１２１と推測されるタンパク質は、実際にｒＣＰＡ１２１であることが確認された。
【０１５１】
［実施例６：ｒＣＰＡ１２１のアレルゲン活性の測定］
上記実施例５において得られたｒＣＰＡ１２１がアレルゲン活性を有しているかどうかを明らかにするために、ｒＣＰＡ１２１を含む画分と、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥとの反応を、ウエスタンブロッティングによって解析した。また、スギ花粉症の主要アレルゲンであるＣｒｊ１（組換え体ではないネイティブＣｒｊ１）と上記血清ＩｇＥとの反応についても解析した。
【０１５２】
上記ｒＣＰＡ１２１を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後に、分離されたタンパク質をブロッティングキット（ＡＴＴＯ社製）を用いてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に転写した。ネイティブＣｒｊ１についても同様にＰＶＤＦ膜への転写を行った。次に、当該ＰＶＤＦ膜をブロッキング液（３％ 脱脂粉乳、１％ BSA、０．５％ Tween20を含むPBS）中で３〜５時間振とうした後に、１０倍希釈したスギ花粉症患者の血清または健常者の血清と４℃で一晩反応させた（１次抗体反応）。
【０１５３】
次に、１次抗体反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ（０．５％ Tween20を含むＰＢＳ）により洗浄した後に、ビオチン標識されたヒトＩｇＥ抗体（２００００倍希釈）（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）と２時間反応させた（２次抗体反応）。
【０１５４】
その後、２次抗体反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識されたストレプトアビジン（２００００倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.社製）と１時間反応させた。そして、ECL−Plus Western blotting detection reagent（Amersham Bioscience社製）を用いてＸ線フィルム上でＨＲＰの活性を検出した。
【０１５５】
図６は、ウエスタンブロッティングの結果を示すものである。被験者はスギ花粉症患者１７人であり、図６において、Ｐ１〜Ｐ１７で表されている。図６に示したプラスマイナスの記号は、プラスがｒＣＰＡ１２１に対して陽性であることを示し、プラス記号の数が多いほど強い陽性であることを示す。マイナスはｒＣＰＡ１２１に対して陰性であることを示す。Ｈ１およびＨ２は健常者血清により染色を行った対照区の結果を表し、Ｎは血清を添加しない対照区の結果を表している。
【０１５６】
図６に示すように、スギ花粉症患者１７検体の血清ＩｇＥを用いて染色を行ったところ、１７検体中１２検体がrＣＰＡ１２１と反応性を示し、７１％という高い頻度で反応したことが確認された。この結果から、スギ花粉症患者は高い確率でrＣＰＡ１２１に対するＩｇＥ抗体を有していることが示唆され、ＣＰＡ１２１がスギ花粉アレルゲンとして作用することが示唆された。また、ネイティブＣｒｊ１とは上記１７検体中１４検体（８２％）が高い頻度で反応性を示したが、Ｐ１、Ｐ２の血清ＩｇＥのように、ｒＣＰＡ１２１とは反応するが、Ｃｒｊ１とは反応しない患者も見られた。なお、上記対照区では、いずれも反応は見られなかった。
【０１５７】
以上の結果から、ＣＰＡ１２１は、ＸＴＨと相同性を有するとともに、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発するアレルゲンであることが強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
以上のように、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥと高頻度に反応することができるため、スギ花粉アレルゲンとして用いることが可能となる。そのため、新規アレルゲンとして、アレルギー診断用薬剤や治療用薬剤等に利用することができ、製薬産業等に広く応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】スギ花粉粗抗原を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画したフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示すものである。
【図２】スギ花粉粗抗原の二次元電気泳動結果を示すものである。
【図３】ＣＰＡ１２１の全塩基配列と、当該配列から予想されるアミノ酸配列を示すものである。
【図４】配列番号２に係るＣＰＡ１２１のアミノ酸配列と、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシス由来のＸＴＨのアミノ酸配列との相同性を示すものである。
【図５】ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１を発現誘導させた大腸菌から抽出したタンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示すものである。
【図６】ｒＣＰＡ１２１を含む画分と、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥとの反応を、ウエスタンブロッティングによって解析した結果を示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スギ花粉由来の新規タンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用に関するものであり、特に、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼのアミノ酸配列との相同性を有し、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥと高い反応頻度を示すタンパク質、およびそのタンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉症は、スギ林から早春に飛散するスギ花粉を吸収することによって起こるアレルギー疾患であり、鼻炎や皮膚炎、喘息発作などの即時型のアレルギー反応を誘発するものである。近年、スギ花粉症の患者数は急増し、深刻な社会問題となっている。
【０００３】
スギ花粉症は、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発するアレルゲン（以下「スギ花粉アレルゲン」と称す）を免疫系が認識することが引き金となって発症することが知られており、これまでに、いくつかのスギ花粉アレルゲンが同定されている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、ペクテート・リアーゼ活性を有するタンパク質であるＣｒｙ ｊ１が開示されており、非特許文献２には、ペクチンを加水分解するポリメチルガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質であるＣｒｙ ｊ２が開示されている。また、特許文献１には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって測定した分子量が５７０００〜６７０００ダルトンであり、等電点が７．０〜９．０の範囲にあるアレルゲンが開示されている。さらに、本発明者らは、イソフラボンレダクターゼ様のアレルゲンであるＣＪＰ−６の同定（非特許文献３）および上記Ｃｒｙ ｊ１およびＣｒｙ ｊ２の異性体の同定に成功している（非特許文献４）。
【特許文献１】特開２００１−１５１７９７号公報（平成１３（２００１）年６月５日公開）
【非特許文献１】Yasueda, H. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 71, 77-86 (1983).
【非特許文献２】Sakagucji, H. et al., Allergy, 45, 309-312 (1990)
【非特許文献３】Kawamoto S. et al., Clin. Exp. Allergy, 32, 1064-1070(2002)
【非特許文献４】Fujimura, T. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 133, 125-135 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のように、現在のところ同定されたスギ花粉アレルゲンの種類は非常に少ないため、アレルギー反応を実際の生体反応に即した形で知るための情報としては未だ不十分であるという問題がある。したがって、さらに多くのスギ花粉アレルゲンを同定し、その特性を知ることが必要である。
【０００６】
また、上述のこれまで同定されたアレルゲン以外のスギ花粉アレルゲンによってアレルギー反応が誘発される場合も多いため、スギ花粉症患者一人ひとりに適した診断や治療を行うためには、より多くのスギ花粉アレルゲンを同定し、スギ花粉アレルゲンに関するデータを蓄積する必要がある。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、スギ花粉症の診断や治療に有用な新規タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ（以下「ＸＴＨ」と称する）と相同性を有する新規タンパク質を見出すとともに、当該タンパク質がスギ花粉症患者の血清ＩｇＥと高い反応頻度を示すことを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ活性を有し、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴としている。
【００１０】
また、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明に係るタンパク質は、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有することが好ましい。
【００１２】
また、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるタンパク質であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴としている。
【００１３】
上記ＸＴＨは、植物が細胞壁の構築・構造変化を起こすための必須酵素であるが、これまでにアレルゲンとして作用するという報告はなされていない。しかしながら、後述する実施例に示すように、上記ＸＴＨのアミノ酸配列と相同性の高いタンパク質はスギ花粉症患者血清のＩｇＥと高い反応頻度を有する。上記タンパク質は、それぞれ、ＸＴＨ活性を有するタンパク質、ＸＴＨの活性部位（活性中心）と相同なアミノ酸配列を含むタンパク質、ＸＴＨのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するタンパク質であり、ＸＴＨのアミノ酸配列との相同性は高く、かつ、アレルゲン活性を有している。したがって、新規アレルゲンとして利用でき、アレルギー診断用薬剤や治療用薬剤等に応用することができる。
【００１４】
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードすることを特徴としている。また、本発明に係る遺伝子は、下記の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
のいずれかであることが好ましい。
【００１５】
上記遺伝子は、上記アレルゲン活性を有する新規タンパク質をコードする。したがって、形質転換等の手法により宿主に上記タンパク質を生産させることができる。
【００１６】
また、本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質と結合することを特徴としている。上記抗体は、上記タンパク質と特異的に抗原抗体反応を行うことができる。したがって、上記タンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞を同定することができる。
【００１７】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係る遺伝子を含むことを特徴としている。上記ベクターによれば、上記遺伝子を生物または細胞に導入することができる。したがって、上記タンパク質を生物または細胞において発現させることができる。また、無細胞タンパク質合成系を用いて上記タンパク質を合成することもできる。
【００１８】
さらに、本発明に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターを用いることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が導入されていることを特徴としている。さらに、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係る形質転換体を用いることを特徴としている。上記形質転換体には、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれているので、上記形質転換体を有性生殖または無性生殖、もしくは培養等することにより、本発明に係るタンパク質を生産することができる。したがって、本発明に係るタンパク質を容易に大量調製することができる。
【００２０】
また、本発明に係るペプチドは、本発明に係るタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来Ｔ細胞を増殖させる活性を有することを特徴としている。上記ペプチドは、本発明に係るタンパク質の一部分、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープを含んでいるので、アレルゲンとして作用することができる。したがって、アレルギー診断用薬剤や、スギ花粉症患者に対する減感作療法の治療用薬剤等に利用することができる。
【００２１】
また、本発明に係る検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されていることを特徴としている。上記構成によれば、上記塩基配列またはその相補配列をプローブとして、当該プローブとハイブリダイズするヌクレオチドを検出することができる。したがって、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出等を行うことができる。
【００２２】
また、本発明に係る検出器具は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。さらに、本発明に係る検出器具は、本発明に係る抗体が基板上に固定化されていることを特徴としている。上記構成によれば、アレルゲン活性を有するタンパク質等が基板上に固定化されているので、上記タンパク質等と相互作用する物質を検出することができる。したがって、タンパク質群の相互作用を分子レベルで明らかにすることができる。
【００２３】
また、本発明に係るアレルギー診断用薬剤は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含むことを特徴としている。上記タンパク質およびペプチドは、スギ花粉症のアレルゲン活性を有しているので、これらを認識する患者血清中のＩｇＥ抗体と結合しうる。したがって、上記タンパク質および／または上記ペプチドを含む薬剤を被験者に投与することにより、スギ花粉に対するアレルギーの有無を診断することができる。
【００２４】
また、本発明に係る治療用薬剤は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含むことを特徴としている。上記タンパク質および上記ペプチドは、スギ花粉症のアレルゲン活性を有している。したがって、上記タンパク質および／または上記ペプチドを含む薬剤は、スギ花粉症に対する減感作療法等における治療用薬剤として用いることができる。
【００２５】
さらに、本発明に係る治療用薬剤は、本発明に係る抗体を含むことを特徴としている。上記抗体は、スギ花粉アレルゲンと特異的に結合することができる。したがって、上記抗体を含む薬剤は、受動免疫によるスギ花粉症の治療用薬剤等として用いることができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係るタンパク質は、以上のように、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、ＸＴＨのアミノ酸配列と相同性を有し、かつ、アレルゲン活性を有するものである。それゆえ、スギ花粉症患者血清のＩｇＥと高頻度で反応することができるので、アレルギー診断薬や、減感作療法用の治療用薬剤等として好適に利用することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の位置実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。以下、本発明に係るタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、およびこれらの利用について詳述する。
【００２８】
（１）本発明に係るタンパク質
一実施形態において、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、ＸＴＨ活性を有し、かつ、アレルゲン活性を有することが好ましい。上記ＸＴＨは糖転移酵素の一つであり、セルロースに架橋しているキシログルカンを切断し、他のキシログルカンに繋ぎ換えることにより、細胞壁の再編や構築に関与していると考えられている。また、ＸＴＨは、花粉においては、花粉柱が伸長する際に活性化して細胞壁の糖鎖構造を変化させる酵素として知られている。
【００２９】
上記「ＸＴＨ活性を有する」とは、本発明に係るタンパク質が、ＸＴＨと同様の酵素活性を示すことができればよいとの意である。後述するＣＰＡ１２１の組み換えタンパク質は界面活性剤により変性しているため、リフォールディングして活性を取り戻す必要があるが、一定分子量範囲のキシログルカンに対して酵素を作用させた場合、糖転移が起こり、分子量分布が変化するため、リフォールディング後のＸＴＨ活性をゲル濾過クロマトグラフィーなどで分析することでＸＴＨ活性を確認することができる。なお、天然物のＸＴＨ活性についても同様に確認することができる。
【００３０】
また、本明細書中において、上記「アレルゲン活性」とは、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、アトピー性の人に即時型アレルギー反応を引き起こす活性のみならず、単に血清中のＩｇＥと結合する活性をも含むものとする。
【００３１】
他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有することが好ましい。
【００３２】
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＸＴＨ特有の活性部位（活性中心）であり、ＸＴＨが基質を取り込んでその反応を触媒する場所のアミノ酸配列である。上記配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。すなわち、本発明に係るタンパク質には、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質も含まれる。
【００３３】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであることが好ましく、上記ＸＴＨ活性を維持することができるものであればよい。
【００３４】
このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３５】
他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、Ｎ型糖鎖結合部位を含んでいてもよい。Ｎ型糖鎖とは、糖タンパク質の糖鎖のうち、タンパク質のアスパラギン残基に結合している糖鎖のことであり、Ｎ−アセチルグルコサミン２個とマンノース３個の基本構造からなる。
【００３６】
また、他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、上記ＸＴＨのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有することが好ましい。ここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合のことであり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。上記相同性は、６０％以上であることが好ましいが、後述する実施例に示すように、ＸＴＨと相同性の高いタンパク質はスギ花粉症患者血清のＩｇＥと高い反応頻度を有していることから、相同性は高いほど好ましいと考えられ、６５％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましい。また、特に、ＸＴＨの活性部位（活性中心）のアミノ酸配列に対する相同性が高いことがより好ましい。
【００３７】
また、他の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉に含まれるタンパク質であって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有することが好ましい。
【００３８】
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有するタンパク質（以下「ＣＰＡ１２１」と称する）のアミノ酸配列は、上記ＸＴＨのアミノ酸配列と相同性を有している。具体的には、後述する実施例に示すように、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシス由来のＸＴＨと、それぞれ７０％、６８％、６６％という高い相同性を有している。
【００３９】
また、上記ＣＰＡ１２１は、後述する実施例に示すように、スギ花粉症患者の血清に含まれるＩｇＥ抗体によって認識され、当該スギ花粉症患者のアレルギー反応を誘発するアレルゲンである。これまで上記ＸＴＨがアレルゲンとして報告された例はないが、上記ＣＰＡ１２１は上述のようにアレルゲンであるとともに、ＸＴＨのアミノ酸配列と高い相同性を有するため、ＸＴＨとして初めて見出されたアレルゲンである可能性がある。
【００４０】
上記「１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」は、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであることが好ましい。このような変異タンパク質は、上述したように、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４１】
なお、以上説示した本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合タンパク質であってもよい。したがって、本発明に係るタンパク質は、既に説明した構造以外に、他の構造を含む複合タンパク質であっても良い。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００４２】
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明に係るタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明に係るタンパク質を取得する方法は、特に限定されるものではない。例えば、後述する本発明に係る遺伝子（本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内で発現させて取得してもよいし、細胞、組織などから単離精製してもよい。また、上記宿主細胞での発現条件によっては、本発明に係るタンパク質は、他のタンパク質とつながった融合タンパク質であってもよい。さらに本発明に係るタンパク質は、無細胞系によって合成されたものであってもよいし、化学合成されたものであってもよい。あるいは、本発明に係るタンパク質は、Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２など、他のアレルゲンタンパク質と融合させて使用してもよい。
【００４４】
上記タンパク質は、スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、上記ＸＴＨに特有な活性部位（活性中心）と相同なアミノ酸配列を含んでおり、かつ、アレルゲン活性を有しているため、新規アレルゲンとして、アレルギー診断用薬剤や治療用薬剤等に利用することができる。
【００４５】
本発明に係るタンパク質を取得する方法（生産方法）は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。すなわち、スギ花粉から本発明に係るタンパク質を抽出・精製してもよい。また、精製方法も特に限定されるものではない。例えば、細胞抽出液を従来公知のカラム等を用いて精製すればよい。
【００４６】
本発明に係るタンパク質は、その一部分、特にＴ細胞によって特異的に認識されるエピトープ（以下「Ｔ細胞エピトープ」と称する）を含む部分のみを利用するようにしてもよい。すなわち、本発明に係るタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有するペプチドも、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４７】
上記「スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性」とは、スギ花粉症患者由来の末梢血単核細胞群（Ｔ細胞が多く含まれる）を、上記ペプチドの存在下で培養したときに、該末梢血単核細胞群のＤＮＡ合成速度を、上記ペプチドの非存在下で培養した末梢血単核細胞群の２倍を越える速度、より好ましくは５倍以上の速度にする活性のことを意味する。
【００４８】
なお上記Ｔ細胞は、体内に取り込まれたアレルゲンを認識し、ＩｇＥ抗体の産生を促す細胞である。したがって、Ｔ細胞がアレルゲンを認識する能力が低下すれば、当該アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生量は低下し、それに伴い当該アレルゲンによって誘発されるアレルギー反応は沈静化する。そこで減感作療法では、微量のアレルゲンを当該アレルゲンに対してアレルギー反応を誘発する患者に投与することにより、当該アレルゲンに対するＴ細胞の感受性を低下させる。したがって、上記ペプチドは、スギ花粉症患者に対する減感作療法において利用することができる。
【００４９】
上記ペプチドの同定は、適宜公知の方法を用いて行うことが可能である。例えば以下のようにして同定することができる。
【００５０】
まず本発明に係るオーバーラップペプチドを合成する。ここで「オーバーラップペプチド」とは、本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１；配列番号２）のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端からＣ末端に至る全アミノ酸残基をカバーするペプチドのことである。かかるオーバーラップペプチドは、市販されているペプチド自動合成装置により容易に合成することができる。これらのオーバーラップペプチドの中から、少なくとも一つのＴ細胞エピトープを含むペプチドを同定すればよい。
【００５１】
またＴ細胞エピトープを同定するためには、スギ花粉症患者の末梢血リンパ球から、本発明にかかるタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１）を特異的に認識し増殖応答するＴ細胞ラインを樹立する必要がある。一般に、患者毎に反応するＴ細胞エピトープが異なるため、患者毎にＴ細胞ラインを樹立することが望ましい。
【００５２】
Ｔ細胞ラインの樹立するためには、通常患者の末梢血リンパ球を本発明に係るタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１）の存在下、７日間程度培養して抗原刺激によりＴ細胞を活性化し、さらに、活性化Ｔ細胞を、抗原と抗原提示細胞と共に７日間培養することを数回繰り返して抗原刺激することにより、抗原特異的Ｔ細胞ラインを作製することができる。
【００５３】
しかしながら、Ｔ細胞が増殖因子のIL−2の存在下でよく増殖している場合は、抗原刺激は最初だけにすることが好ましい。Ｔ細胞ラインを数度抗原刺激すると、増殖率の高いＴ細胞が選択的に取れ、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを同定する場合において、エピトープによっては十分な増殖応答を示さない場合が生じるからである。
【００５４】
なお、抗原刺激に使用する本発明に係るタンパク質（例えば、ＣＰＡ１２１）としては、スギ花粉から取得した天然型のものが最も望ましいが、組換えタンパク質、あるいはオーバーラップペプチドの混合物も好適に使用できる。上記本発明に係るタンパク質は、大腸菌で発現させ精製したものが利用できる。
【００５５】
また、上記で使用する抗原提示細胞としては、Ｔ細胞ラインと同一人の末梢血リンパ球を、マイトマイシンＣ処理あるいは放射線照射して増殖能力を失わせたものが望ましい。しかし、採血回数が多くなるため、Epstein−Barr virus（EBV）を自己のＢリンパ球に感染させトランスフォーメーションを起こさせたものは、in vitroで増殖し続けリンパ芽球様細胞株（Ｂ細胞株）となるため、このＢ細胞株を抗原提示細胞として用いてもよい。Ｂ細胞株の樹立方法は既に確立されている［組織培養の技術第二版、187-191 頁、日本組織学会編（1988.8.10）］。
【００５６】
それぞれの患者固有のＴ細胞ラインが認識する、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは以下のようにして同定される。ここで「認識する」という意味は、Ｔ細胞レセプターが抗原エピトープ（MHC 分子を含めて）と特異的に結合し、その結果、Ｔ細胞が活性化されることを意味し、活性化の状態は、リンホカインの産生や、ＤＮＡの合成を [ 3Ｈ] チミジンの取込み量を指標として測定することにより観察される。すなわち、Ｔ細胞ラインとマイトマイシンＣ処理した同一人のＢ細胞株とを、９６穴平底プレートに播種し、オーバーラップペプチドと共に混合培養し、 [ 3Ｈ] チミジンの取込み量（cpm ）を液体シンチレーションカウンターで測定する。その際、 [ 3Ｈ] チミジンの取込みは、個々の培養系で異なるため、例えば、個々のペプチドに対するＴ細胞ラインの[ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm）を、抗原を添加していないコントロールの [ 3Ｈ] チミジン取込み量（cpm ）で除した数（stimulation index: SI ）が２以上のものを上記ペプチドと同定する。
【００５７】
（２）本発明に係る遺伝子
本発明に係る遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードする。本発明に係る遺伝子には、さらに、上記遺伝子の変異体が含まれる。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００５８】
このような変異体としては、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００５９】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子または当該遺伝子にハイブリダイズする遺伝子を含む、単離した遺伝子を提供する。
【００６０】
本発明に係る遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡも包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係る遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６１】
一実施形態において、本発明に係る遺伝子は、
（ａ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
のいずれかであることが好ましい。上記（ａ）に係る遺伝子は、上記ＣＰＡ１２１をコードする遺伝子である。
【００６２】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００６３】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【００６４】
本発明に係る遺伝子を取得する方法としては、公知の技術により本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明における遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係る遺伝子の塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００６５】
あるいは、本発明に係る遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明における遺伝子のｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００６６】
（３）抗体
本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質と特異的に結合することができる。上記抗体とは免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００６７】
上記抗体は、本発明に係るタンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞の同定などに利用することができる。例えば、本発明に係るタンパク質を含む花粉が大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜にどの程度存在しているのかを調べるために利用することができる。
【００６８】
上記抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）等の方法を用いて作製することができる。
【００６９】
また、上記抗体には、上記タンパク質に特異的に結合しうる完全な抗体分子のみならず、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体フラグメントも含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ないため（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））、好ましく用いることができる。
【００７０】
（４）本発明に係るタンパク質および／または遺伝子の利用
（４−１）ベクター
本発明に係るベクターは、上記本発明に係る遺伝子を含むものであれば特に限定されるものではない。例えば、上記本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００７１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係る遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００７２】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および大腸菌および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００７３】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係る遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【００７４】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【００７５】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００７６】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７７】
（４−２）形質転換体
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る遺伝子が導入されているものであり、上記「形質転換体」とは、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
【００７８】
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。
【００７９】
本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換体は、当該タンパク質を含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００８０】
宿主への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。また、遺伝子を直接細胞または組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。
【００８１】
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行えばよい。
【００８２】
ＰＣＲ増幅産物については、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００８３】
上記形質転換体を作製し、有性生殖あるいは無性生殖、または培養等することにより、上記形質転換体内で本発明に係るタンパク質を生産することができるため、上記タンパク質を容易に大量調製することが可能となる。
【００８４】
（４−３）タンパク質の生産方法
上記本発明にかかるベクターおよび形質転換体を用いることによって本発明にかかるタンパク質の生産を行うことができる。
【００８５】
一実施形態において、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（上記本発明にかかるベクター）を用いることを特徴とする。
【００８６】
本実施形態の一つの局面において、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００８７】
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るタンパク質の生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係る遺伝子を組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記タンパク質（ポリペプチド）を精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的遺伝子（ポリヌクレオチド）を導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００８８】
このように宿主に外来遺伝子（ポリヌクレオチド）を導入する場合、発現ベクターは、外来遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたタンパク質（ポリペプチド）を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質（ポリペプチド）の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質（ポリペプチド）を精製することが可能である。
【００８９】
本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を含む細胞または組織の抽出液から当該タンパク質（ポリペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。タンパク質（ポリペプチド）を精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００９０】
別の実施形態において、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を天然に発現する細胞または組織から当該タンパク質（ポリペプチド）を精製することを特徴とする。本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上述した抗体を用いて本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るタンパク質（ポリペプチド）の生産方法は、上述したタンパク質（ポリペプチド）を精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【００９１】
さらに他の実施形態において、本発明に係るタンパク質の生産方法は、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を化学合成するものであってもよい。化学合成の方法は特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を化学合成することができる。
【００９２】
本発明に係るタンパク質（ポリペプチド）を生産する方法によって取得されるタンパク質（ポリペプチド）は、天然に存在する変異タンパク質（ポリペプチド）であっても、人為的に作製された変異タンパク質（ポリペプチド）であってもよい。
【００９３】
変異タンパク質（ポリペプチド）を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質（ポリペプチド）を作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質（ポリペプチド）作製法を用いることによって、変異タンパク質（ポリペプチド）を作製することができる。変異タンパク質（ポリペプチド）の作製には市販のキットを利用してもよい。
【００９４】
（４−４）検出器具
本発明に係る検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されたもの、本発明に係るタンパク質および／またはペプチドが基板上に固定化されたもの、または、本発明に係る抗体が基板上に固定化されたものであり、種々の条件下において、本発明に係るタンパク質、ペプチド、遺伝子の発現パターンの検出・測定などに利用することができる。
【００９５】
一実施形態において、本発明に係る検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されていることを特徴としている。このような検出器具としては、例えば、ＤＮＡチップを挙げることができる。上記「ＤＮＡチップ」とは、合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した合成型ＤＮＡチップを意味するが、これに限定されず、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡを基板上に固定化した貼付け型ＤＮＡマイクロアレイも包含する。
【００９６】
基板上に固定するプローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する公知の方法（例えば、ＳＡＧＥ法（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）等が挙げられるがこれらに限定されない）によって決定することができる。
【００９７】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、当該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【００９８】
本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出に用いることができ、発現しているｍＲＮＡの種類、発現レベルの把握・発現解析等を行うことができる。
【００９９】
他の実施形態において、本発明に係る検出器具は、本発明に係るタンパク質および／またはペプチドまたは抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、いわゆるプロテインチップである。
【０１００】
上記の方法以外のタンパク質および／またはペプチド、または抗体を基板上に固定化する方法としては、例えば、ニトロセルロース膜やＰＤＶＦ膜にタンパク質や抗体をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法、または、タンパク質や抗体の変性を軽減するために、スライドガラス上にポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパク質や抗体をスポットする方法が挙げられる。
【０１０１】
さらに、タンパク質や抗体を基板表面に吸着させるだけでなく、強固に結合させるため、アルデヒド修飾ガラスを利用した方法（Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０（２０００））を用いることもできる。また、基板上でのタンパク質の配向を揃えて固定化する方法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法（Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１（２００１））を用いることができる。
【０１０２】
上記検出器具は、例えば種々の生物またはその組織もしくは細胞からの抽出液を標的サンプルとする検出に用いることができ、上記タンパク質等と相互作用する物質を検出することができる。したがって、タンパク質群の相互作用を分子レベルで明らかにすることができる。
【０１０３】
なお、上記「基板」は、目的物（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質）を担持することのできる物質をいい、「支持体」と交換可能に使用される。好ましい基板（支持体）としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、目的物をこれらの基板に固定化する方法は、特に限定されるものではない。例えば、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：５１９−５２０（１９９２）に記載の方法を用いることができる。
【０１０４】
本発明に係る検出器具に用いる基板の材質としては、目的物を安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【０１０５】
（４−５）薬剤
一実施形態において、本発明に係るアレルギー診断用薬剤は、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含むことを特徴としている。
【０１０６】
本発明に係るタンパク質は、これまでにスギ花粉症の主要アレルゲンとして知られているＣｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２とは異なる構造を有する新規のスギ花粉アレルゲンである。アレルゲンを認識するＩｇＥ抗体は、アレルゲンであるタンパク質の特定の領域（エピトープ）を認識することから、本発明に係るタンパク質は、Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２とは異なるエピトープを有していると考えられる。換言すれば、本発明に係るタンパク質を認識する抗体と、Ｃｒｙ ｊ１またはＣｒｙ ｊ２を認識する抗体とは異なると考えられる。
【０１０７】
また、本発明に係るペプチドは、上述のように、本発明に係るタンパク質に含まれるペプチドであって、スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有するペプチドである。
【０１０８】
したがって、本発明に係るタンパク質および／または本発明に係るペプチドを含む薬剤を用いることにより、上記タンパク質および／またはペプチドを認識する抗体を有するスギ花粉症患者を検出することができ、上記薬剤をアレルギー診断用薬剤として利用することができる。
【０１０９】
また、スギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合には、当該スギ花粉症患者が保有している抗体により認識されるアレルゲンを当該患者に投与する必要がある。例えば、Ｃｒｙ ｊ１に対する抗体を保有している患者には、Ｃｒｙ ｊ１を投与する必要がある。
【０１１０】
これまで、スギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合には、主にＣｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２が当該患者に投与されていた。しかし、上述の理由から、本発明に係るタンパク質に対する抗体を保有するスギ花粉症患者に対しては、上記Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２を用いた治療方法は効果を奏さないと考えられる。
【０１１１】
すなわち、本発明に係るタンパク質および／またはペプチドを認識する抗体を有するスギ花粉症患者に対して減感作療法を行う場合は、上記Ｃｒｙ ｊ１やＣｒｙ ｊ２ではなく、上記本発明に係るタンパク質および／またはペプチドを抗原として用いる必要がある。したがって、上記タンパク質および／またはペプチドを含む薬剤を用いることにより、的確な減感作療法を行うことが可能となる。
【０１１２】
また、本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質を認識することができるので、上記抗体を含む抗体を含む治療用薬剤は、免疫されていない個体に注射して免疫能を賦与する受動免疫に用いることができる。
【０１１３】
本発明に係る治療用薬剤は通常、本発明にかかるタンパク質または抗体を０．０１〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．０５〜５０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは０．５〜５．０％（ｗ／ｗ）含んでなる。また、減感作療法の治療用薬剤としては、本発明にかかるタンパク質を０．０１〜０．０２％（ｗ／ｗ）含んでなることが好ましい。
【０１１４】
本発明にかかる治療用薬剤は、当該タンパク質または抗体単独の形態はもとより、それ以外に生理的に許容される、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マンニトール、プルランなどの担体、賦形剤、免疫助成剤、安定剤、さらには必要に応じてステロイドホルモンやクロモグリク酸ナトリウムなどの抗炎症剤や抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン剤、抗タキキニン剤を含む１種または２種以上の他の薬剤と組み合わせた組成物としての形態を包含する。
【０１１５】
さらに、本発明の薬学的組成物は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、本発明にかかるタンパク質および／またはペプチド、または抗体を、例えば、１日当たりの用量またはその整数倍（４倍まで）またはその約数（１／４０まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離した一体の剤形にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、口腔剤、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、注射剤などが挙げられる。
【０１１６】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１７】
以下、本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【実施例】
【０１１８】
［実施例１：アレルゲンの分画］
（１）スギ花粉粗抗原の調製
日本スギ花粉（広島県豊田郡豊町にて採取）８０ｇに抽出バッファー（２０ｍＭ ＰＢＳ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．６）を３．２リットル加えた後、４℃で一晩攪拌した。その後、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３０分）によって得た上清に対して、終濃度８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩攪拌した。次に、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３０分）によって沈殿を採取し、超純水を用いて一晩透析する工程を５回行った。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分）することで得られた上清を凍結乾燥し、スギ花粉粗抗原を得た。
【０１１９】
（２）スギ花粉粗抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離
まず、上記スギ花粉粗抗原を平衡化し、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に供した。上記スギ花粉粗抗原はカラム容量の５倍量の２０ｍＭ酢酸バッファー（以降「Ａバッファー」と称する。ｐＨ５）による透析で平衡化し、カラムに平衡化したスギ花粉粗抗原の溶液を流して塩基性タンパクを吸着させた。次に、カラムの３倍量のＡバッファーで未吸着の成分を洗い流した後、Ａバッファーに対して１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸バッファー、（以降「Ｂバッファー」と称する。ｐＨ５）の割合が徐々に上がるようにグラジエントをかけて流し、塩基性の弱いタンパク質から順に溶出させた。なお、グラジエントは流量１リットルの時点で両バッファーの比率が５０％ずつになるよう設定した。最後に、Ｂバッファー１００％で残りのタンパク質を全て溶出した。
【０１２０】
上記陽イオン交換クロマトグラフィーによって６つのフラクションが得られた。当該６つのフラクションは超純水に対する透析により脱塩し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）により分離した。分離ゲルはポリアクリルアミド濃度１２．５％のゲルを用い、電気泳動後、染色液（エタノール：酢酸：水＝９：２：９＋０．２５％ＣＢＢ Ｒ−２５０）でタンパク質を染色した。その後、脱色液（エタノール：酢酸：水＝５：２：１３）で余分な染色液を除去した。
【０１２１】
図１は、上記６つのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示すものである。「ＬＭＷ」は分子量マーカーである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された各タンパク質は、４０人のスギ花粉症患者から得た血清とのウエスタンブロッティングに供した。
【０１２２】
ウェスタンブロッティングにより電気泳動したタンパク質は、ＰＶＤＦメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写し、メンブレンをブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ、＋３％スキムミルク、１％ＢＳＡ）に浸して室温で３〜５時間浸透した後、ブロッキングバッファーで１０倍希釈した血清（患者および健常者のもの）に浸して４℃で一晩浸透した。
【０１２３】
次に、ＰＢＳＴで１０分×３回振盪洗浄し（以降、洗浄は全てＰＢＳＴを用いて行った）、ブロッキングバッファーで２００００倍希釈したＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＥ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）に浸して室温で２時間浸透した。そして、１０分×３回振盪洗浄後、ブロッキングバッファーで２００００倍希釈したＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＺＹＭＥＤ社）に浸して室温で１時間浸透した。最後に、１０分×５回振盪洗浄後、ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で発光させ、Ｘ線フィルムに感光させた。
【０１２４】
その結果、データは示さないが、図１のレーン５に丸囲みしたバンド（分子量約３０ｋＤａ）のタンパク質が、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥと７０％の反応頻度を示した。
【０１２５】
［実施例２：スギ花粉アレルゲンＣＰＡ１２１の分離、解析］
（１）二次元電気泳動
上記分子量約３０ｋＤａのタンパク質の分解能を向上させるため、まず、スギ花粉粗抗原の二次元電気泳動を行った。
【０１２６】
スギ花粉粗抗原２００ｍｇに４ｍｌのＰＢＳ＋ジチオトレイトール６０ｍｇを加えて懸濁し、ＰＢＳで６０％に調製したトリクロロ酢酸２ｍｌを加えた後、氷上で９０分間静置した。その後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１５分）を行い、沈殿を回収した。この沈殿に冷アセトン１０ｍｌを加えて懸濁し、洗浄した。さらに、遠心分離（３５００ｒｐｍ、２０分）を行った後、スピードバックで沈殿を乾燥させた。その沈殿にＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（８Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ３−１０、１％ＤＴＴ、０．８％Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）１ｍｌを加えて懸濁し、超音波破砕によって完全に溶解させた。その後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ、２０分）を行い、その上清を二次元電気泳動用のサンプルに用いた。
【０１２７】
ｐＩレンジ３〜１０のドライストリップをＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで一晩膨潤させた後、スギ花粉粗抗原のサンプルをストリップにアプライして一次元目（等電点）の電気泳動を行った。アクリルアミド濃度９〜１８％のグラジエントゲルを作製し、その上に等電点電気泳動後のゲルをセットした。ゲルの上から低融点アガロースを重層し固化させた後、８０Ｖで一晩、二次元目（分子量）の電気泳動を行った。二次元目の電気泳動が終了した後、ゲルを銀染色することによってタンパク質を検出した。
【０１２８】
図２は、スギ花粉粗抗原の二次元電気泳動結果を示すものである。上述の図１のレーン５に丸囲みしたバンド（分子量約３０ｋＤａ）のタンパク質は、図２において丸で囲んだ部分に相当する。
【０１２９】
（２）Ｎ末端アミノ酸配列の分析およびＸＴＨとの相同性確認
図２において丸で囲んだ部分のうち、矢印で示した中央のスポット（Ｎｏ．１２１）について、プロテインシークエンサーによりＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、２０残基のアミノ酸配列（配列番号４）が明らかとなった。
【０１３０】
上記２０残基のアミノ酸配列について相同性検索を行ったところ、ＸＴＨのアミノ酸配列と６０％の相同性を有していた。なお、上記相同性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いたＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ検索によって確認した。
【０１３１】
［実施例３：ＣＰＡ１２１のｃＤＮＡ塩基配列の決定および一次構造の決定］
上述のように、図２において説明したスポット（Ｎｏ．１２１）のＮ末端アミノ酸配列は、ＸＴＨのアミノ酸配列と６０％の相同性を有していた。現在までにＸＴＨがアレルゲンとして報告された例はないが、このような相同性の高さから、上記Ｎｏ．１２１はＸＴＨとして初めて見出されたアレルゲンである可能性が考えられる。そこで、本発明者は上記Ｎｏ．１２１に係るタンパク質をＣＰＡ１２１と命名し、ＣＰＡ１２１がスギ花粉のアレルゲンである可能性を検証することとし、まずＣＰＡ１２１のｃＤＮＡ塩基配列および一次構造を決定した。
【０１３２】
（１）スギ花粉からの全ＲＮＡの抽出
日本スギの花粉３ｇを液体窒素中で粉砕し、１０倍量（Ｗ／Ｖ）の２×ＣＴＡＢ（centyltrimethylammomium bromide）溶液中に、粉砕されたスギ花粉を懸濁した後、６５℃で１０分間インキュベートした。そして、上記懸濁液と等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を上記懸濁液に加えて攪拌し、室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した。分離された液層のうち、水層（上層）を回収し、当該水層と等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（２４：１）を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の３／４倍量のイソプロピルアルコールを当該水層に加えた後に、室温で１０分間静置した。その後、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）し、形成された沈殿をＴＥ（Tris−EDTA）バッファーに溶解することにより全ＲＮＡ粗抽出液を得た。
【０１３３】
上記全ＲＮＡ粗抽出液をさらに精製するために、上記全ＲＮＡ粗抽出液の１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム溶液を上記全ＲＮＡ粗抽出液に加え、２時間氷上でインキュベートした。そして、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）し、形成された沈殿をＴＥバッファーに溶解した。この溶解液に当該ＴＥバッファーと等量のＴＥ飽和フェノール（ｐＨ９．０）を加え攪拌した後に、室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層と等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を当該水層に加えて攪拌し、再度室温で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）した。分離された液層のうち、水層を回収し、当該水層の１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の冷エタノール（−２０℃）とを当該水層に加え、−８０℃で１０分間静置した。その後、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ，１０分）し、ＲＮＡの沈殿を得た。そして、当該沈殿を７０％エタノールで洗浄した後に、真空乾燥し、乾燥した沈殿を適量のＴＥバッファーに溶解した。
【０１３４】
（２）ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片の取得
上記（１）において得られた全ＲＮＡを鋳型として、全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。具体的には、３´RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用いて、逆転写反応とＰＣＲ反応とを行い、全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。以下において、この手法の詳細な説明を行う。
【０１３５】
（２−ａ）全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によるｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡ（５μｇ）を含む溶液 ５μｌに、アダプタープライマー １μｌと、ＤＥＰＣ（diethylpyrocarbonate）処理液 ６μｌとを加え、インキュベート（７０℃、１０分間）した後に、氷上に１分間静置した。この反応液に１０×ＰＣＲバッファー ２μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ２ ２μｌ，ｄＮＴＰ ＭＩ×（２．５ ｍＭ each） １μｌ、ＤＴＴ（dithiothreitol）（０．１ Ｍ） ２μｌを加え、４２℃で５分間プレインキュベートした。この反応液にSUPERSCRIPT II（Life Technonogies, Inc.社製）を１μｌ加えて、４２℃で５０分間インキュベートした。その後、７０℃で１５分間インキュベートすることにより反応を停止させた。この反応液を氷上で静置した後に、RNase Hを１μｌ加えてインキュベート（３７℃、２０分間）することによりＲＮＡを消化した。
【０１３６】
（２−ｂ）ＰＣＲ反応によるＣＰＡ１２１遺伝子のｃＤＮＡの増幅
次に、上記（ａ）の処理によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。この反応において次に示す２種類のプライマーを用いた。
プライマー１：Forward 5’ ACHGAYTTYGAYATHACNTTYGG 3’（配列番号９）
プライマー２：Reverse 5’ RCAIGCITSDGCIYTRAARTTNC 3’（配列番号１０）
ＰＣＲ反応は、９４℃２分間の後、９４℃１分間→５３℃１分間→６８℃１分間の工程を３０回行い、その後試料を４℃に保持した。
【０１３７】
（３）全長ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの取得および塩基配列の決定
上記（２）において得られたＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に組み込み、ベクター特異的なプライマーを用いて、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【０１３８】
さらに、５´末端および３´末端を含めたＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの全塩基配列を決定するために、上記ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡ断片の塩基配列を基に、次に示す新たなプライマー３、４を作製した。
プライマー３：Forward 5’ GACGGTGCAGTGAAGATCGATTG 3’（配列番号１１）
プライマー４：Reverse AUAP
上記プライマー３、４を用いて、３´RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）を行った。すなわち、９４℃２分間の後、９４℃１分間→６０℃１分間→６８℃１分間の工程を３０回行い、その後試料を４℃に保持した。
【０１３９】
さらに、次に示す新たなプライマー５〜８を作製した。
プライマー５：Forward(first) AAP
プライマー６：Reverse（first） 5’ CCATGAATTCACAGAGCAATCAG 3’（配列番号１２）
プライマー７：Forward (second) AUAP
プライマー８：Reverse (second) 5’ AGTGAGCTGCAAGCGTTGGC 3’（配列番号１３）
上記プライマー５〜８を用いて、５´RACEを行った。すなわち、９４℃２分間の後、９４℃１分間→５５℃１分間→６８℃１分間の工程を３０回行い、その後試料を４℃に保持した。条件はプライマー５および６を用いる第一段階ＰＣＲ、プライマー７および８を用いる第二段階ＰＣＲともに同じである。
【０１４０】
プライマー３、４を用いた３’ＲＡＣＥ法により、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの３’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。一方、プライマー５〜８を用いた５’ＲＡＣＥ法により、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの５’末端側の断片を取得し、この断片の塩基配列を決定した。これにより、ＣＰＡ１２１ｃＤＮＡの全塩基配列を決定するに至った。
【０１４１】
なお、上記のように、配列番号９、１０においては「ユニバーサルコード」表示できる塩基についてはこれを用いた。「ユニバーサルコード」は以下の通り定義されている。また、上記プライマー２の配列中「Ｉ」はイノシンを表し、配列表においてはイノシンは「ｎ」で表している。また、上記「AUAP」、「AAP」は、それぞれ、Abridged Universal Amplification Primer、Abridged Anchor Primerというキット内の特定配列を持ったプライマーの名称である。
ｍ：ＡまたはＣ
ｒ：ＧまたはＡ
ｗ：ＡまたはＴ
ｓ：ＧまたはＣ
ｙ：ＴまたはＣ
ｋ：ＧまたはＴ
ｖ：ＡまたはＧまたはＣ
ｈ：ＡまたはＣまたはＴ
ｄ：ＡまたはＧまたはＴ
ｂ：ＧまたはＣまたはＴ
ｎ：（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）または（不明または他の塩基）
図３は、ＣＰＡ１２１の全塩基配列と、当該配列から予想されるアミノ酸配列を示すものである。決定された配列は、１１５５塩基からなり（配列番号５）、８３４塩基からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域（配列番号３）を有していた。図３に示すように、上記ＯＲＦ領域は、２７８のアミノ酸（配列番号２）をコードすると予想される。上記配列番号２に係るアミノ酸配列から算出した理論分子量は、約３１５００であり、その配列中には、図３に下線を引いて示したＸＴＨに特有な活性部位（活性中心）のアミノ酸配列（ＤＥＩＤＦＥＦＬＧ；配列番号１）および、その直後に下線を引いて示したＮ型糖鎖結合部位（ＮＬＳ）が存在していた。
【０１４２】
なお、上記配列番号４に記載のアミノ酸配列は、図３および配列番号５に示すアミノ酸配列の２３位から４２位までに相当するが、両者のアミノ酸配列には相違する部分も存在している。これはＸＴＨには多くのアイソフォームが存在し、アイソフォームによって少しずつアミノ酸配列が異なることによると考えられる。例えばアラビドプシスのＸＴＨでは少なくとも２０以上のアイソフォームが報告されている。
【０１４３】
［実施例４：ＣＰＡ１２１とＸＴＨとのアミノ酸配列の相同性検索］
ＣＰＡ１２１とＸＴＨとのアミノ酸配列の相同性を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いたＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ検索により探索した。図４は、上記配列番号２に係るＣＰＡ１２１のアミノ酸配列と、リンゴ（Ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、図中Ｍ．ｄｏｍと略記；配列番号６）、アスパラガス（Ａ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、図中Ａ．ｏｆｆと略記；配列番号７）、アラビドプシス（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，図中Ａ．ｔｈａと略記；配列番号８）由来のＸＴＨのアミノ酸配列との相同性を示すものである。
【０１４４】
図４において、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシスのアミノ酸配列中、ＣＰＡ１２１のアミノ酸配列と相同性を有する部分は白抜き文字で表している。ＣＰＡ１２１のアミノ酸配列は、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシス由来ＸＴＨのアミノ酸配列と、それぞれ７０％、６８％、６６％という高い相同性を示した。
【０１４５】
［実施例５：組み換えＣＰＡ１２１の発現］
ＣＰＡ１２１を大量に得るために、ＣＰＡ１２１とＧＳＴ（glutathione S−transferase）との融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１）を大腸菌の発現系にて発現させた。図５は、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１を発現誘導させた大腸菌から抽出したタンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示している。
【０１４６】
ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１の発現誘導は、以下のように行った。まず、ＣＰＡ１２１遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）（配列番号３）をｐＧＥＸ４Ｔ-１ベクターに組み込み、当該ベクターをタンパク質発現用大腸菌株であるＢＬ２１に導入した。上記ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターには、ＩＰＴＧ（isopropyl-thio-beta-D-galactopyranoside）によって転写活性が高まるプロモーターが組み込まれており、ＩＰＴＧを大腸菌の培地に添加することによりタンパク質発現を誘導できる。そこで、ＩＰＴＧによりタンパク質発現を誘導した後に、大腸菌を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０１４７】
図５中のレーン１はＩＰＴＧによる発現誘導前の大腸菌から抽出したタンパク質の電気泳動結果を示すものであり、レーン２はＩＰＴＧによる発現誘導後の大腸菌から抽出したタンパク質の電気泳動結果を示すものである。レーン２に現れた分子量約５７ｋＤａのバンドがＧＳＴ−ＣＰＡ１２１であり、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１は抗ＧＳＴ抗体と反応することを確認した。なお、上記確認はＧＳＴ−ＣＰＡ１２１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロッティングすることにより行った。１次抗体にはＡｎｔｉ−ＧＳＴ抗体を、２次抗体にＡｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＧ−ＨＲＰを用いた。
【０１４８】
次に、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１が可溶性か不溶性かを確認するために、ＩＰＴＧ添加後の大腸菌をＰＢＳ中にて超音波破砕した後に遠心分離することにより、当該大腸菌のタンパク質を可溶性画分と不溶性画分とに分離した。当該可溶性画分および不溶性画分を電気泳動したところ、図５のレーン３、４に示すように、上記ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１の大部分は、不溶性画分に存在していた。
【０１４９】
そこで、上記不溶性画分に含まれるＣＰＡ１２１をＧＳＴ−ＣＰＡ１２１から分離するために、上記不溶性画分を０．３％サルコシルに溶解し、トロンビンによって消化した。図５中のレーン５は、ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１のトロンビン消化物の電気泳動結果を示すものである。上記ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１は、ＧＳＴと推測されるタンパク質と、組み替えＣＰＡ１２１（以下では、ｒＣＰＡ１２１と称す）と推測されるタンパク質とに分離した。ここで、上記トロンビンは、ＧＳＴと当該ＧＳＴに融合されたタンパク質との境界に存在する特定のアミノ酸配列を認識し、消化する酵素である。
【０１５０】
上記ｒＣＰＡ１２１と推測されるタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列をペプチドシークエンスにより決定したところ、当該Ｎ末端のアミノ酸配列とＣＰＡ１２１のアミノ酸配列とが一致した。この結果から、上記ｒＣＰＡ１２１と推測されるタンパク質は、実際にｒＣＰＡ１２１であることが確認された。
【０１５１】
［実施例６：ｒＣＰＡ１２１のアレルゲン活性の測定］
上記実施例５において得られたｒＣＰＡ１２１がアレルゲン活性を有しているかどうかを明らかにするために、ｒＣＰＡ１２１を含む画分と、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥとの反応を、ウエスタンブロッティングによって解析した。また、スギ花粉症の主要アレルゲンであるＣｒｊ１（組換え体ではないネイティブＣｒｊ１）と上記血清ＩｇＥとの反応についても解析した。
【０１５２】
上記ｒＣＰＡ１２１を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後に、分離されたタンパク質をブロッティングキット（ＡＴＴＯ社製）を用いてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に転写した。ネイティブＣｒｊ１についても同様にＰＶＤＦ膜への転写を行った。次に、当該ＰＶＤＦ膜をブロッキング液（３％ 脱脂粉乳、１％ BSA、０．５％ Tween20を含むPBS）中で３〜５時間振とうした後に、１０倍希釈したスギ花粉症患者の血清または健常者の血清と４℃で一晩反応させた（１次抗体反応）。
【０１５３】
次に、１次抗体反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ（０．５％ Tween20を含むＰＢＳ）により洗浄した後に、ビオチン標識されたヒトＩｇＥ抗体（２００００倍希釈）（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）と２時間反応させた（２次抗体反応）。
【０１５４】
その後、２次抗体反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識されたストレプトアビジン（２００００倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.社製）と１時間反応させた。そして、ECL−Plus Western blotting detection reagent（Amersham Bioscience社製）を用いてＸ線フィルム上でＨＲＰの活性を検出した。
【０１５５】
図６は、ウエスタンブロッティングの結果を示すものである。被験者はスギ花粉症患者１７人であり、図６において、Ｐ１〜Ｐ１７で表されている。図６に示したプラスマイナスの記号は、プラスがｒＣＰＡ１２１に対して陽性であることを示し、プラス記号の数が多いほど強い陽性であることを示す。マイナスはｒＣＰＡ１２１に対して陰性であることを示す。Ｈ１およびＨ２は健常者血清により染色を行った対照区の結果を表し、Ｎは血清を添加しない対照区の結果を表している。
【０１５６】
図６に示すように、スギ花粉症患者１７検体の血清ＩｇＥを用いて染色を行ったところ、１７検体中１２検体がrＣＰＡ１２１と反応性を示し、７１％という高い頻度で反応したことが確認された。この結果から、スギ花粉症患者は高い確率でrＣＰＡ１２１に対するＩｇＥ抗体を有していることが示唆され、ＣＰＡ１２１がスギ花粉アレルゲンとして作用することが示唆された。また、ネイティブＣｒｊ１とは上記１７検体中１４検体（８２％）が高い頻度で反応性を示したが、Ｐ１、Ｐ２の血清ＩｇＥのように、ｒＣＰＡ１２１とは反応するが、Ｃｒｊ１とは反応しない患者も見られた。なお、上記対照区では、いずれも反応は見られなかった。
【０１５７】
以上の結果から、ＣＰＡ１２１は、ＸＴＨと相同性を有するとともに、スギ花粉症のアレルギー反応を誘発するアレルゲンであることが強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
以上のように、本発明に係るタンパク質は、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥと高頻度に反応することができるため、スギ花粉アレルゲンとして用いることが可能となる。そのため、新規アレルゲンとして、アレルギー診断用薬剤や治療用薬剤等に利用することができ、製薬産業等に広く応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】スギ花粉粗抗原を陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画したフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示すものである。
【図２】スギ花粉粗抗原の二次元電気泳動結果を示すものである。
【図３】ＣＰＡ１２１の全塩基配列と、当該配列から予想されるアミノ酸配列を示すものである。
【図４】配列番号２に係るＣＰＡ１２１のアミノ酸配列と、リンゴ、アスパラガス、アラビドプシス由来のＸＴＨのアミノ酸配列との相同性を示すものである。
【図５】ＧＳＴ−ＣＰＡ１２１を発現誘導させた大腸菌から抽出したタンパク質を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示すものである。
【図６】ｒＣＰＡ１２１を含む画分と、スギ花粉症患者の血清ＩｇＥとの反応を、ウエスタンブロッティングによって解析した結果を示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ活性を有し、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴とする請求項２または３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項６】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質と結合することを特徴とする抗体。
【請求項８】
請求項５または６に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
請求項５または６に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質に含まれるペプチドであって、
スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
請求項５または６に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質および／または請求項１２に記載のペプチドが基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項１５】
請求項７に記載の抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質および／または請求項１２に記載のペプチドを含むことを特徴とするアレルギー診断用薬剤。
【請求項１７】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質および／または請求項１２に記載のペプチドを含むことを特徴とする治療用薬剤。
【請求項１８】
請求項７に記載の抗体を含むことを特徴とする治療用薬剤。
【請求項１】
スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ活性を有し、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
スギ花粉に含まれるアレルゲンであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アレルゲン活性を有することを特徴とする請求項２または３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項６】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質と結合することを特徴とする抗体。
【請求項８】
請求項５または６に記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
請求項５または６に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質に含まれるペプチドであって、
スギ花粉症患者由来のＴ細胞を増殖させる活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
請求項５または６に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列が基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質および／または請求項１２に記載のペプチドが基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項１５】
請求項７に記載の抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質および／または請求項１２に記載のペプチドを含むことを特徴とするアレルギー診断用薬剤。
【請求項１７】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質および／または請求項１２に記載のペプチドを含むことを特徴とする治療用薬剤。
【請求項１８】
請求項７に記載の抗体を含むことを特徴とする治療用薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２１７８３０（Ｐ２００６−２１７８３０Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２３６５（Ｐ２００５−３２３６５）
【出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年９月３０日 日本アレルギー学会事務所発行の「アレルギー 第５３巻 第８・９号」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年９月３０日 日本アレルギー学会事務所発行の「アレルギー 第５３巻 第８・９号」に発表
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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