スフィンゴシンキナーゼ２を利用した細胞増殖抑制剤、その核移行シグナルを持つ融合タンパク質の作製方法、及び薬剤候補物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニングキット
スフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）の機能解析を行い、その解析を通じて医学上および産業上有用な方法・物質を提供する。本発明者は、スフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）の機能解析を進めた結果、ＳＰＨＫ２が細胞内において主として核内に存在し、そのアミノ末端側に核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つこと、ＳＰＨＫ２を発現させると細胞のＤＮＡ合成が抑制されること、また、ＳＰＨＫ２がそのＤＮＡ合成抑制作用を発揮するためには、核内に存在することが必要であること等を見出した。よって、ＳＰＨＫ２は、細胞増殖抑制剤として利用でき、またそのＮＬＳ配列は新たな融合タンパク質の作製などに応用でき、医学上および産業上有用なものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、スフィンゴシンキナーゼ２を利用した細胞増殖抑制剤、及びその核移行シグナルを持つ融合タンパク質の作製方法、並びに薬剤候補物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
本出願は、米国仮特許出願（Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．）６０／４８４，３４８（出願日：２００３年 ７月 １日、発明の名称：Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２ ｉｓ ａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と関連するとともに、該米国仮特許出願の利益を主張する。
生理活性物質スフィンゴシン１リン酸（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ １−ｐｏｓｐｈａｔｅ；ＳＰＰ）は、リピッドアクティベーター又はリピッドメディエーターとして、細胞内外で作用し、細胞の種々の機能を調節する。少なくともこれまでに、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制、細胞分化、細胞運動、細胞骨格の再編成等の多岐にわたる生理機能に関与することが報告されている。
上記スフィンゴシン１リン酸は、ＥＤＧ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ）レセプターファミリー（「ＳＰＰ受容体」とも呼ばれる）のリガンドであることが最近明らかになり、スフィンゴシン１リン酸は細胞外リガンドとして作用することが示された。スフィンゴシン１リン酸の受容体としては、現在までに少なくとも５つの受容体（即ち、ＥＤＧ−１／ＳＰＰ１，ＥＤＧ−５／ＳＰＰ２，ＥＤＧ−３／ＳＰＰ３，ＥＤＧ−６／ＳＰＰ４，ＥＤＧ−８／ＳＰＰ５）が同定されている。
またスフィンゴシン１リン酸は、細胞内セカンドメッセンジャーとしての役割を有しており、細胞内貯蔵領域からのカルシウム放出、アポトーシスの抑制などに重要な役割を持つことが知られている。
一方、スフィンゴシンキナーゼ（以下「ＳＰＨＫ」ともいう）は、スフィンゴシンをリン酸化し、上記スフィンゴシン１リン酸を産生する酵素であり、細胞内のスフィンゴシン１リン酸の量を調節する。哺乳類由来のＳＰＨＫとしては、スフィンゴシンキナーゼ１およびスフィンゴシンキナーゼ２（以下それぞれ「ＳＰＨＫ１」「ＳＰＨＫ２」ともいう）の２つのアイソフォームが知られている（例えば、Ｋｏｈａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３，２３７２２−２３７２８、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５，１９５１３−１９５２０参照）。このうち、ＳＰＨＫ２のアミノ酸配列およびその塩基配列については、下記のデータベース（Ｉ）（ＩＩ）に記載されている。
（Ｉ）ＤＤＢＪ：アクセッション番号ＡＦ２４５４４７（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））
（ＩＩ）ＤＤＢＪ：アクセッション番号ＡＦ２４５４４８（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））
上記ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２とでは、その生物化学的特性に相違がみられる。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＳＰＨＫ１の活性は、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００によって強く活性化されるが、塩によって抑制される。これに対して、ＳＰＨＫ２の活性は逆の反応を示す。また、ＳＰＨＫ１をＨＥＫ２９３細胞に発現させると、その酵素活性は飛躍的に高まるが、ＳＰＨＫ２を発現させた場合はそれほど上昇しない。
上記ＳＰＨＫ１については、機能解析の結果、過剰発現させると、▲１▼細胞のＧ１期からＳ期への移行を促進し、細胞増殖を誘導する、▲２▼細胞のアポトーシス応答を抑制する、ことが知られている。また、ＳＰＨＫ１を過剰発現させると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腫瘍を形成させることも報告されている。さらに、ＳＰＨＫ１結合分子として、ＴＲＡＦ２，ＲＰＫ１１８，ＡＫＡＰ関連タンパクといった複数の分子が既に同定されている。
これに対して、ＳＰＨＫ２の機能については殆どわかっていないのが現状である。ＳＰＨＫ２の基質であるスフィンゴシン１リン酸は、前述のように、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制等の多岐にわたる生理機能に関与し、ひいては、これらの生理機能に関わる種々の病気（例えば、動脈硬化や本態性高血圧等）にも深く関与していると考えられる。したがって、そのリン酸化酵素ＳＰＨＫ２の機能を解明することは、このような病気の病態解析やその診断方法・治療方法の開発などにもつながり、医学上および産業上重要な貢献をもたらすものと期待される。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ＳＰＨＫ２の機能解析を行い、その解析を通じて医学上および産業上有用な方法・物質を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記の課題に鑑み、ＳＰＨＫ２の詳細な機能解析を進めた結果、ＳＰＨＫ２が細胞内において主として核内に存在し、そのアミノ末端側に核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つこと、ＳＰＨＫ２を発現させると細胞のＤＮＡ合成が抑制されること、また、ＳＰＨＫ２がそのＤＮＡ合成抑制作用を発揮するためには、核内に存在することが必要であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｊ）の発明を含むものである。
Ａ） 哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２タンパク質、またはそのタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
Ｂ） 上記Ａ）の細胞増殖抑制剤であって、ヒト又はマウス由来のスフィンゴシンキナーゼ２を用いた細胞増殖抑制剤。
Ｃ） 哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２のアミノ末端側に存在する核移行シグナルをコードするオリゴヌクレオチド。
Ｄ） 上記Ｃ）記載のオリゴヌクレオチドを用いて、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルと他のタンパク質とを融合させた融合タンパク質を作製する方法。
Ｅ） 上記Ｄ）記載の方法によって作製された融合タンパク質。
Ｆ） 上記Ｅ）記載の融合タンパク質であって、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルとスフィンゴシンキナーゼ１とを融合させた融合タンパク質。
Ｇ） 上記Ｆ）記載の融合タンパク質、またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
Ｈ） スフィンゴシンキナーゼ２の細胞増殖抑制作用を調節する物質のスクリーニング方法。
Ｉ） 上記Ｈ）記載のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を使用することを特徴とするスクリーニング方法。
Ｊ） 上記Ｈ）またはＩ）記載のスクリーニング方法により得られた物質を含む薬剤。
Ｋ） 上記Ｈ）記載のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキット。
Ｌ） 上記Ｋ）記載のスクリーニングキットには、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれることを特徴とするスクリーニングキット。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＰＨＫ２およびＳＰＨＫ１の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図２（ａ）は、ｍＳＰＨＫ１、ｍＳＰＨＫ２、ｍＳＰＨＫ２ΔＭ、ｍＳＰＨＫ２ΔＮの構造を模式的に示す図であり、図２（ｂ）は、上記ｍＳＰＨＫ２、ｍＳＰＨＫ２ΔＭ、ｍＳＰＨＫ２ΔＮの細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図３（ａ）は、ＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列と他のタンパク質のＮＬＳ配列とを比較して示す図であり、図３（ｂ）は、ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ、ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図４（ａ）は、ＳＰＨＫ２の発現が細胞内でのＤＮＡ合成を抑制するかどうかを調べた結果を示すグラフであり、図４（ｂ）は、Ｄｏｘ濃度に応じてＳＰＨＫ２の発現が誘導されることを確認したイムノブロット解析の結果を示す図である。
図５は、ＳＰＨＫ２、ＳＰＨＫ１、またはそれらの改変体を細胞内発現させ、細胞内でのＤＮＡ合成がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
図６（ａ）は、Ｄｏｘ存在下またはＤｏｘ非存在下で培養した各細胞における、ＳＰＨＫ２の細胞内発現の有無を調べた結果を示す図であり、図６（ｂ）は、ＳＰＨＫ２の発現がアポトーシスを誘導するかどうかを調べた結果を示す図である。
図７（ａ）および図７（ｂ）は、ＳＰＨＫ２の発現が細胞周期にどのような影響を与えるかを調べた結果を示す図である。
図８は、ＳＰＨＫ２、ＳＰＨＫ１、または変異体の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図９は、細胞の種類および細胞密度によってＳＰＨＫ２の局在化がどのように変化するかを調べた結果を示す表である。
図１０（ａ）は、細胞内在性のＳＰＨＫ２の活性を調べた結果を示す、図であり、図１０（ｂ）は、内在性のＳＰＨＫ２の局在箇所をイムノブロットにて検出した結果を示す図であり、図１０（ｃ）は、細胞内在性のＳＰＨＫ２の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図１１（ａ）は、種々のＳＰＨＫタンパク質の活性を調べた結果を示すグラフであり、図１１（ｂ）は、細胞質画分（Ｃ）と核画分（Ｎ）とにおけるＳＰＰの蓄積を調べた結果を示すグラフである。
図１２は、異なるエピトープ特異的抗体を用いてＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の具体的態様について説明する。
（１）細胞増殖抑制剤
本発明の細胞増殖抑制剤は、前記のとおり、哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）タンパク質、またはそのタンパク質をコードする遺伝子（核酸）を含む細胞増殖抑制剤である。
ここで、「スフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）」とは、主としてヒト又はマウス由来のタンパク質を意味する。ヒト由来のＳＰＨＫ２は、６１８個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列並びに塩基配列は例えばアクセッション番号ＡＦ２４５４４７に記載される。マウス由来のＳＰＨＫ２は、６１７個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列並びに塩基配列は例えばアクセッション番号ＡＦ２４５４４８に記載される。
後述の実施例に示すように、ＳＰＨＫ２を発現させると細胞のＤＮＡ合成が抑制され、ＳＰＨＫ２を導入した細胞の大半は細胞周期においてＧ１／Ｓ期の状態から９時間経過後もＧ１／Ｓ期の状態にとどまった（図４（ａ）、図４（ｂ）、図５、図７（ａ）、図７（ｂ）参照）。したがって、ＳＰＨＫ２タンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子は、細胞増殖抑制剤として利用可能である。
尚、ＳＰＨＫ２タンパク質は、ヒト又はマウス由来のものに限らず、哺乳類由来のものであればよい。また、ヒト又はマウス由来のＳＰＨＫ２であっても、上記アクセッション番号に記載されたアミノ酸配列に限らず、その配列の一部が異なるものであってもよい。即ち、ヒト又はマウス由来のＳＰＨＫ２には、（ａ）上記アクセッション番号に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、のみならず、（ｂ）上記アクセッション番号に記載されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ合成抑制作用を示すタンパク質、も含まれる。
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
また、ＳＰＨＫ２タンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によってＳＰＨＫ２タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。さらに、ＳＰＨＫ２タンパク質は、糖鎖結合やリン酸化等により修飾されたものであってもよい。
本発明の細胞増殖抑制剤は、ＳＰＨＫ２タンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよく、ここにいう「遺伝子」には、上記アクセッション番号に記載される塩基配列中の少なくともオープンリーディングフレーム領域を有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。
また、「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡ・ＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖は、センス鎖となるコード鎖であっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。さらに、「遺伝子」は、タンパク質をコードするコード配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
本発明の細胞増殖抑制剤は、上述したＳＰＨＫ２タンパク質、または当該タンパク質をコードするＳＰＨＫ２遺伝子を含むものであればよく、その他に、適当な溶液（緩衝液を含む）、酵素、ベクター、または、脂質・蛋白・低分子化合物などといった他の化学物質を含むものであってもよい。
本発明の細胞増殖抑制剤は、各種の細胞培養技術、皮膚組織等の組織作製や器官・臓器の作製に代表される再生医療、モデル動物を用いた実験系などに利用できる。そのほか、治療薬（特に細胞増殖性疾病の治療薬）などへの応用も可能である。
（２）ＳＰＨＫ２の核移行シグナルを持つ融合タンパク質作製方法
本発明者は、後述の実施例に示すように、ＳＰＨＫ２が細胞内において主として核内に存在し、そのアミノ末端側に核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つこと、そのＮＬＳ配列とＳＰＨＫ１タンパク質とを融合させて発現させることで、本来核に移行しないＳＰＨＫ１タンパク質を核に移行させ得ること、さらに、核に移行したその融合タンパク質は、野生型のＳＰＨＫ１には本来ないＤＮＡ合成抑制作用を示したこと、を明らかにした。
したがって、ＳＰＨＫ２の核移行シグナル（ＮＬＳ）と他のタンパク質とを融合させることで、本来核に移行しないタンパク質を核に移行させることができ、また、本来核に移行しないタンパク質を核に移行させることで、そのタンパク質の野生型には本来ない機能・作用を発揮させることが可能である。
ＳＰＨＫ２の核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つ本発明の融合タンパク質の作製方法は特に限定されるものではないが、以下では、後述の実施例において使用した作製方法について簡単に説明する。
実験では、マウス由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列とマウス由来のＳＰＨＫ１タンパク質とを融合させた融合タンパク質を作製した。マウス由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列は、本発明者により、アミノ末端側に存在する８７〜９５番目のアミノ酸配列「ＲＧＲＲＧＧＲＲＲ（配列番号１）」と同定された。また、他のＮＬＳ配列との比較から、特に８９〜９４番目のアミノ酸配列「ＲＲＧＧＲＲ」が機能上重要と判断された。
融合タンパク質の作製には、上記ＮＬＳ配列をコードするオリゴヌクレオチド（下記センスプライマー）を使用した。まず、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーからＳＰＨＫ１遺伝子をクローニングした。次に、このＳＰＨＫ１遺伝子が挿入されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った。その際、センスプライマーに上記ＮＬＳ配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用し、具体的には、マウス由来のＳＰＨＫ２の８７〜９８番目のアミノ酸配列をコードする下記塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
上記オリゴヌクレオチドのうち、１０〜４５番目の配列が、ＳＰＨＫ２の８７〜９８番目のアミノ酸配列をコードする領域に相当する。また、４６〜６０番目の配列は、ＳＰＨＫ１の１〜５番目のアミノ酸配列をコードする領域に相当する。
上記ＰＣＲ法により得られた増幅断片をｐＴＢ−７０１ベクターに挿入して発現ベクターを作製した。この発現ベクターを宿主細胞（実施例ではＮＩＨ ３Ｔ３細胞）にトランスフェクションし、融合タンパク質を発現させた。
上記と同様の方法によりヒト由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列を持つ融合タンパク質を作製する場合、そのＮＬＳ配列は、ヒト由来のＳＰＨＫ２の８６〜９４番目のアミノ酸配列「ＲＧＲＲＧＡＲＲＲ（配列番号３）」と考えられ、特に８８〜９３番目のアミノ酸配列「ＲＲＧＡＲＲ」が機能上重要と判断されるので、このＮＬＳ配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用するとよい。
勿論、本発明の融合タンパク質は、上記以外の方法により作製してもよい。また、ＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列とＳＰＨＫ１タンパク質とを融合させた融合タンパク質は、ＳＰＨＫ２タンパク質と同様にＤＮＡ合成抑制作用を示したことから、その融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子は、前記（１）の細胞増殖抑制剤と同様に、細胞増殖抑制剤としての利用が可能である。
（３）薬剤候補物質のスクリーニング方法
上記のようにＳＰＨＫ２タンパク質はＤＮＡ合成抑制作用（換言すれば、細胞増殖抑制作用）を示すことから、ＳＰＨＫ２タンパク質、及びその遺伝子は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）のスクリーニングに有用であり、例えば、ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を調節する物質のスクリーニング方法に利用可能である。ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を調節する物質とは、例えば、ＳＰＨＫ２タンパク質と基質のスフィンゴシンとの結合を阻害し、ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を阻害する物質や、あるいは反対に、ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を高める物質等が挙げられる。このような物質は、細胞増殖が必要な疾患、例えば皮膚や角膜の再生等の再生医療に利用可能であり、そのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ＳＰＨＫ２タンパク質の基質スフィンゴシンとの結合領域を発現させ、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ）において、同結合領域と基質スフィンゴシンとの結合を阻害する分子等を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法が挙げられる。
このように、本発明のスクリーニング方法においては、ＳＰＨＫ２の全長タンパク質以外に、その部分タンパク質を使用するものであってもよい。また、上記全長タンパク質や部分タンパク質の改変体を使用してもよい。上記部分タンパク質としては、▲１▼基質スフィンゴシンとの結合領域、▲２▼触媒領域（キナーゼ活性領域）、または▲３▼ＮＬＳ配列を含む領域、などを使用することが考えられる。また、上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓやＭｙｃ等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞系でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）ＳＰＨＫ２の部分タンパク質（例えば、上記▲１▼〜▲３▼の領域）をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降−免疫ブロット法を用いてＳＰＨＫ２タンパク質と基質スフィンゴシンとの結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。また、本発明のスクリーニング方法には、例えば、上記タンパク質をコードする遺伝子を用いてもよい。
また、本発明のスクリーニング方法は、▲１▼ＳＰＨＫ２タンパク質の核内移行を阻害する物質を検索する方法、あるいは、▲２▼ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞質と核内との間の行き来を制御する物質を検索する方法、などであってもよい。ＳＰＨＫ２タンパク質は、主として核内に存在するが、細胞質にもわずかながら存在が観察されたことから、細胞質と核内との間を行き来している可能性がある。そうであれば、細胞質と核内との間のＳＰＨＫ２の行き来を制御する物質は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）として有用である。
さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト以外のタンパク質、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
（４）スクリーニングキット
また、本発明には、上記（３）欄で説明したスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットも含まれる。本キットは、上記のスクリーニング方法を実施することができるキットであればよく、その具体的な構成は特に限定されるものではない。例えば、上記スクリーニングキットには、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれていればよい。
本キットによれば、簡便且つ確実に上記（３）欄のスクリーニング方法を実施することができ、スフィンゴシンキナーゼ２の細胞増殖抑制作用を調節する物質を探索することができる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【実施例】
以下、本発明の基礎をなす、ＳＰＨＫ２について行った機能解析の結果について図面を参照しながら説明する。
〔実施例１：ＳＰＨＫ２は、主として核内に局在する〕
ＳＰＨＫ２の細胞内局在を検討するため、マウス由来のＳＰＨＫ２を緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合させた融合タンパク質（ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ）を、発現ベクターを用いてＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、２日後に共焦点顕微鏡にて観察した。その結果を図１のパネルＡに示す。図中のバーは、１０μｍの長さを示す（以下同様）。同図に示すように、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、主として核内に存在し、細胞質には殆ど存在しなかった。
ＳＰＨＫ２の核内局在は、ＨｅＬａ細胞に一過性に発現させた場合にも同様に観察された（図１のパネルＢ参照）。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に発現させた場合も同様にＳＰＨＫ２の核内局在が観察された（データ示さず）。
ＧＦＰとの融合によりＳＰＨＫ２が核内に局在した可能性も考えられたため、次に、ＳＰＨＫ２のアイソザイムであるＳＰＨＫ１とＧＦＰとの融合タンパク質を発現させ、その細胞内分布をＳＰＨＫ２と比較した。その結果を図１のパネルＣに示す。同図に示すように、ＳＰＨＫ１−ＧＦＰ融合タンパク質は、主として細胞質に存在し、核内には存在しなかった。
さらに、ＧＦＰの代わりにＨＡタグを付加したＳＰＨＫ２タンパク質（ＨＡ−ＳＰＨＫ２）を発現させ、抗ＨＡ抗体によりその局在を検討した。その結果を図１のパネルＤに示す。ＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質は、図中「Ｓ」に示されるように主として核内に分布し、細胞質における発現はわずかであった。あわせて、ヌクレオポリン（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）の染色も行ったが、図中「Ｎ」に示されるようにその染色パターンは、核の外縁を明確に示すものであった。以上の結果から、ＳＰＨＫ２が主として核内に存在することが示された。
〔実施例２：ＳＰＨＫ２の核移行シグナルは、アミノ末端側の領域に存在する〕
マウス由来のＳＰＨＫ２（ｍＳＰＨＫ２）は、マウス由来のＳＰＨＫ１（ｍＳＰＨＫ１）よりもアミノ酸残基の数が２３６個多い（図２（ａ）の模式図参照）。同図に示すように、ＳＰＨＫ２は、ＳＰＨＫ１にはない２つの長い配列領域（１つはアミノ末端側、他は中央付近）を含んでいる。
ＳＰＨＫ２とＳＰＨＫ１とで細胞内局在が異なるのは、ＳＰＨＫ２のみに存在するこれら２つの長い配列領域のいずれかによるものと考えられた。そこで、２つの欠失変異体を作製した。１つはｍＳＰＨＫ２ΔＭであり、中央付近を欠失させたもの、他はｍＳＰＨＫ２ΔＮであり、アミノ末端側を欠失させたものである。
ｍＳＰＨＫ２ΔＭ−ＧＦＰ融合タンパク質をＣＯＳ７細胞に一過性に発現させると、この融合タンパク質は主に核内に局在した（図２（ｂ）参照）。この結果は、ＳＰＨＫ２の中央付近は同タンパクの核内局在に影響を与えないことを示している。一方、ｍＳＰＨＫ２ΔＮ−ＧＦＰ融合タンパク質をＣＯＳ７細胞に一過性に発現させると、同図に示すようにこの融合タンパク質は核に移行できなかった。以上の結果は、核移行シグナル（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）が、ＳＰＨＫ２のアミノ末端側の領域に存在することを示すものである。
〔実施例３：ＳＰＨＫ２における核移行シグナル（ＮＬＳ）配列の同定〕
ＳＰＨＫ２のアミノ酸配列におけるＮＬＳ配列の存在は以前報告がなかったが、今回の解析により、マウス由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列を同定した。同ＮＬＳ配列は、アルギニン（Ｒ）の豊富な「ＲＧＲＲＧＧＲＲＲ」という配列であり、図３（ａ）に示されるように、▲１▼ヒト免疫不全ウイルス−１（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−１）のＴａｔタンパクおよびＲｅｖタンパク、▲２▼ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＲｅｘタンパク、▲３▼非典型のプロテインキナーゼＣλ（ＰＫＣλ）、に存在する各ＮＬＳ配列に類似する。同図には、これらＮＬＳ配列の共通配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＮＬＳ）もあわせて示される。図中、各数字はアミノ酸残基の位置を示している。ＳＰＨＫ２の場合、最初と最後のアルギニンがそれぞれ、全長アミノ酸配列中の８７番目と９５番目に位置することを示す。また、太字はＮＬＳの機能上重要なアルギニンとリジンを示し、各配列はこれらアミノ酸残基に基づいて整列されている。
ＳＰＨＫ２の持つ上記ＮＬＳ配列が本当にＮＬＳとしての機能を有するかどうか調べるため、変異体ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ−ＧＦＰを作製した。この変異体は、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質の９３番目と９４番目のアルギニン（図３（ａ）においてアステリスクが付されたアルギニン）をいずれもグルタミン酸（Ｅ）に改変したものである。この変異体ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ−ＧＦＰをＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、発現ベクターを導入して２日後、細胞を固定し共焦点顕微鏡にて観察すると、図３（ｂ）に示すように、この変異タンパク質は核に移行できなかった。
さらに、ＳＰＨＫ２の上記ＮＬＳ配列を本来細胞質に存在するＳＰＨＫ１と融合させた融合タンパク質を発現させ、その核内移行の有無を検討した。即ち、融合タンパク質ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１−ＧＦＰをＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、発現ベクターを導入して２日後、細胞を固定し共焦点顕微鏡にて観察すると、図３（ｂ）に示すようにこの融合タンパク質は主に核内に集積した。以上の結果は、上記ＮＬＳ配列がＳＰＨＫ２の核内移行に必要かつ十分であることを示すものである。
〔実施例４：ＳＰＨＫ２は、細胞内のＤＮＡ合成を抑制する〕
上記のようにＳＰＨＫ２は核内に局在することから、ＳＰＨＫ２は核内での作用に関与している可能性が考えられた。そこで、ＳＰＨＫ２を安定発現するＨｅＬａ細胞への〔３Ｈ〕チミジンの取り込みを測定することによって細胞内でのＤＮＡ合成の変化を調べた。
実験では、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ：Ｄｏｘ）が、ＳＰＨＫ２を導入したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞に対してＳＰＨＫ２の発現を誘導することを利用し、同細胞を様々なＤｏｘ濃度（０〜１μｇ／ｍｌ）で処理した後、〔３Ｈ〕チミジンの取り込みを指標にして各濃度条件下における細胞内のＤＮＡ合成の変化を調べた。その結果を図４（ａ）のグラフに示す。各値は、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。
同図に示すように、０．１μｇ／ｍｌのＤｏｘ濃度でＳＰＨＫ２の発現が誘導された細胞では、Ｄｏｘ非含有（０μｇ／ｍｌ）条件下で外因性のＳＰＨＫ２を発現しない細胞と比較して、〔３Ｈ〕チミジンの取り込みが約５０％抑制された。ＤｏｘによりＳＰＨＫ２の発現が誘導されることは、イムノブロット解析によって確認された。即ち、ＨＡ−ＳＰＨＫ２を導入したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞を様々なＤｏｘ濃度条件下におき、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて抗ＨＡ抗体を用いたイムノブロット解析に供した。その結果を図４（ｂ）に示す。また、ＳＰＨＫ２遺伝子を持たない発現ベクターを導入した細胞では、Ｄｏｘ濃度がいずれの場合も、〔３Ｈ〕チミジンの取り込みに殆ど影響を与えなかった（データ示さず）。以上の結果は、ＳＰＨＫ２が細胞内のＤＮＡ合成を抑制したことを示すものである。
〔実施例５：ＳＰＨＫ２の核内局在は、そのＤＮＡ合成抑制活性に不可欠である〕
ＳＰＨＫ２によるＤＮＡ合成抑制の仕組みは、ＢｒｄＵ（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）の取り込みを測定することによっても検討された。
実験では、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、▲１▼コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）であるＨＡ−ＧＦＰ，▲２▼ＨＡ−ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ，▲３▼ＨＡ−ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ−ＧＦＰ，▲４▼ＨＡ−ＳＰＨＫ１−ＧＦＰ，▲５▼ＮＬＳ−ＨＡ−ＳＰＨＫ１−ＧＦＰの何れかをコードする発現ベクターを導入し、導入してから２日後、各ベクターを導入した培養細胞に対してＢｒｄＵを３時間添加した。その後、各細胞について、二重免疫蛍光により、全細胞とＢｒｄＵの取り込みを視覚化し、全細胞のうちＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合を決定した。その結果を図５のグラフに示す。各値は、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。
同図に示すように、ＳＰＨＫ２をＮＩＨ ３Ｔ３細胞に発現させると、ＢｒｄＵの取り込みは、コントロールベクターを導入した細胞に比べて著しく抑制された。この結果は、ＳＰＨＫ２が細胞内のＤＮＡ合成を抑制したことを示すものである。対照的に、ＳＰＨＫ１を発現する細胞では、ＢｒｄＵの取り込みが約４０％増加した。
また、前述のＮＬＳ配列を改変し、核内移行できなかった変異体ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅを細胞に発現させた場合は、同図に示すように、ＳＰＨＫ２のＤＮＡ合成抑制活性が失われた。さらに、ＳＰＨＫ２由来のＮＬＳ配列と融合させ、ＳＰＨＫ１に核移行能を持たせた変異体ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１を発現させると、同図に示すように、ＤＮＡ合成が抑制された。
以上の結果は、ＳＰＨＫ２の核内局在が、そのＤＮＡ合成抑制作用に不可欠であることを示すものである。
〔実施例６：ＳＰＨＫ２の発現は、アポトーシスを誘導しない〕
ＳＰＨＫ２を導入したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞をＤｏｘにより誘導すると、図６（ａ）に示すように、ＳＰＨＫ２は主に細胞核内に発現した（Ｄｏｘ（−）とＤｏｘ（＋）との比較。Ｄｏｘ（＋）は細胞を３日間０．１μｇ／ｍｌのＤｏｘ条件下で処理したものであり、Ｄｏｘ（−）は細胞を３日間Ｄｏｘ非含有条件下で処理したもの）。
次に、ＳＰＨＫ２の発現によって細胞にアポトーシスが誘導されるかどうかを調べるため、上記０．１μｇ／ｍｌのＤｏｘ条件下で処理したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞、および上記Ｄｏｘ非含有条件下で処理したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞から抽出したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、そのＤＮＡパターンを調べた。その結果、図６（ｂ）に示すように、上記Ｄｏｘ条件下でＳＰＨＫ２を発現誘導した細胞（図中レーン１）と、上記Ｄｏｘ非含有条件下で発現誘導しなかった細胞（図中レーン２）とでは、ほぼ同じＤＮＡパターンが得られた。
一方、アポトーシスを誘導することが知られているＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）およびｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅで処理したＨｅＬａ細胞（図中レーン３）では、同図に示すように、典型的なアポトーシスのラダ−パターンを示した。以上の結果は、ＳＰＨＫ２は、細胞内のＤＮＡ合成を抑制するが、アポトーシスは誘導しないことを示すものである。
〔実施例７：ＳＰＨＫ２の発現は、細胞周期をＧ１／Ｓ期にとどまらせる〕
次に、ＳＰＨＫ２の細胞周期に与える影響を調べた。実験では、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ発現ベクター（ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、またはＳＰＨＫ２を有さないベクター（Ｍｏｃｋ ｔｒｅａｔｅｄ）を発現させ、フローサイトメトリー法による解析を行った。図７（ａ）は、フローサイトメトリーの結果を示しており、縦軸は前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ）であり、細胞の大きさを示す。横軸はＧＦＰ蛍光強度である。ＧＦＰ蛍光強度が強い細胞（Ｒ２：即ち、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰを発現）、およびＧＦＰ蛍光強度が弱い細胞（Ｒ１：即ち、ＳＰＨＫ２を発現せず）の双方について、二重チミジンブロックによってＳ期の始まりに同調させた。その後、チミジンブロックを取り除き、所定時間（０ｈ，３ｈ，９ｈ）経過ごとにＲ１およびＲ２両細胞のＤＮＡ量（ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ）を、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を用いたフローサイトメトリー法によって解析した。その結果を図７（ｂ）に示す。
同図の各ヒストグラムには、測定結果であるＧ１期，Ｓ期，Ｇ２／Ｍ期のそれぞれの割合（％）が合わせて示される。同図に示すように、二重チミジンブロックによってＲ１およびＲ２両細胞をＳ期の始まりに同調させた結果として、ブロック除去後０時間（０ｈ）では、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）および非発現細胞（Ｒ１）のほぼ１００％がＧ２／Ｍ期に移行しなかった。
ブロック除去後３時間（３ｈ）では、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）と非発現細胞（Ｒ１）との間に違いがみられた。非発現細胞（Ｒ１）では３時間後、大多数の細胞はＳ期に移行した。また、ブロック除去後９時間（９ｈ）経過すると、非発現細胞（Ｒ１）では、Ｓ期のままのものとＧ２／Ｍ期に移行するものとに分かれた。
対照的に、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）では３時間後、各時期の割合にあまり変化がみられず、その多くはＧ１期にとどまり、典型的なＧ１／Ｓ期での停止を示した。また、ブロック除去後９時間（９ｈ）経過すると、非発現細胞（Ｒ１）では、約４０％がＧ２／Ｍ期に移行したのに対して、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）では、Ｇ２／Ｍ期のものはわずか７％であった。
以上の結果は、ＳＰＨＫ２を発現させると、細胞周期をＧ１期またはＳ期に長くとどまらせ、ＤＮＡ合成を抑制することを示すものである。
【実施例８】
続いて、ＳＰＨＫ２の細胞内局在をより詳細に解析すべく、実施例１で示した結果に加えて、さらにＳＰＨＫ２およびその変異体の局在化を調べた。具体的には、ＳＰＨＫ２、ＳＰＨＫ１、およびこれらの変異体をＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＮＩＨ ３Ｔ３細胞にて一過性に発現させ、その細胞内局在を調べた。なお、図８のパネルＡ、Ｂはそれぞれ図１のパネルＡ、Ｂと一致し、図８のパネルＪ、Ｋはそれぞれ図２（ｂ）の図と一致し、図８のパネルＬ、Ｍはそれぞれ図３（ｂ）の図と一致するため、ここではその説明を省略する。
マウス由来のＳＰＨＫ２を緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合させた融合タンパク質（ｍＳＰＨＫ２−ＧＦＰ）を、発現ベクターを用いてＮＩＨ ３Ｔ３細胞に一過性に発現させ、２日後に共焦点顕微鏡にて観察した。その結果を図８のパネルＣに示す。図中のバーは、１０μｍの長さを示す（以下同様）。同図に示すように、ｍＳＰＨＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、主として核内に存在し、細胞質には殆ど存在しなかった。
また、ＧＦＰとの融合の有無、或いは種の違いにより細胞内局在に相違があるか否かを調べた。具体的には、まず、ヒト由来のＳＰＨＫ２（ｈＳＰＨＫ２）をＨｅＬａ細胞にて一過性に発現させ、ｈＳＰＨＫ２およびｍＳＰＨＫ２の共通ペプチド配列に対する特異的抗体を用い、共焦点顕微鏡にて細胞内局在を観察した。その結果をパネルＤに示す。
同図に示すように、ｍＳＰＨＫ２と同様に、ｈＳＰＨＫ２も、主として核に局在化することがわかった。また、ＨｅＬａ細胞を核特異的染色剤４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）にて染色したところ（図８のパネルＥ）、ＤＡＰＩとｈＳＰＨＫ２とは共に核局在化することが確認された（図８のパネルＦ）。
次に、ＳＰＨＫのアイソザイムであるＳＰＨＫ１（マウス由来）をＧＦＰと融合させた融合タンパク質ｍＳＰＨＫ１−ＧＦＰを作製し、このｍＳＰＨＫ１−ＧＦＰの細胞内局在を調べ、ＳＰＨＫ２のそれと比較した。図８のパネルＨに示すように、ＣＯＳ７細胞では、ｍＳＰＨＫ１−ＧＦＰは主に細胞質に局在化し、核にはほとんど局在化しなかった。これは従前の報告と同様の結果である（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｌ．，Ｎａｖａ，Ｖ．，Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ，Ｏ．，Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７，５４５−５５８）。
【実施例９】
次に、ＳＰＨＫ２の核または細胞質への分配に、細胞の種類や細胞の密集度（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が影響するか否かを検討した。具体的には、ｈＳＰＨＫ２を高密度（ｈｉｇｈ：３×１０４／ｍｍ２）または低密度（ｌｏｗ：６×１０３／ｍｍ２）状態の種々の細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）にて一過性に発現させた。２日後に形質転換細胞を固定化し、抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡にて観察した。
ｈＳＰＨＫ２の染色の結果に応じて、ｈＳＰＨＫ２を発現した細胞を、ｈＳＰＨＫ２が主に核に局在化したグループ（Ｎ＞Ｃ）、ｈＳＰＨＫ２が核と細胞質とにほぼ同等に局在化したグループ（Ｎ＝Ｃ）、ｈＳＰＨＫ２が主に細胞質に局在化したグループ（Ｎ＜Ｃ）、の３つのグループに分けた。その結果を図９に示す。
図９の表に示すように、ＨｅＬａ細胞にて一過性に発現させたｈＳＰＨＫ２は、全ての条件で主に核に局在化することがわかった。ＣＯＳ７細胞にて発現させたｈＳＰＨＫ２は、細胞密度に応じて、劇的に細胞内局在化が変化することがわかった。すなわち、高密度条件では主に核に局在化する一方（６１．４％）、低密度条件ではわずか１０．３％しか核に局在化しない。また対照的に、ＨＥＫ２９３細胞で発現させたｈＳＰＨＫ２は、細胞密度にかかわらず主に細胞質に局在化することがわかった。
【実施例１０】
続いて、外因的に発現させた組換えＳＰＨＫ２と同様に、細胞内在性のＳＰＨＫ２も核に局在化するか否か調べた。この問題に取り組むために、抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いて、ＨｅＬａ細胞の核抽出物から細胞内在性のＳＰＨＫ２を免疫沈降し、その活性を解析した。具体的には以下のように行った。
まず、免疫源ペプチド１５μｇ／ｍｌの存在下／非存在下にて、抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いて、精製した核抽出画分の細胞内在性のＳＰＨＫ２を免疫沈降した。免沈した沈殿物を洗浄し、ＳＰＨＫ２活性を測定した。なお、細胞内在性のＳＰＨＫ２は１．４ｐｍｏｌ ＳＰＰ／ｍｉｎ／ｔｕｂｅであった。その結果を図１０（ａ）に示す。
同図に示すように、免疫源ペプチド存在下で調製した免沈物にはＳＰＰに相当するバンドは見出されない一方、免疫源ペプチド非存在下で調製した免沈物には明確なＳＰＰに相当するバンドが検出された。これは、抗ＳＰＨＫ２抗体に特異的に結合した、精製核抽出画分はＳＰＨＫ２活性を有することを示している。
次に、免疫源ペプチド非存在下で調製した免沈物の分取をさらに抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いた免疫ブロットにより解析した。具体的には、免疫源ペプチドなしで免疫沈降した免沈物、アフィニティ精製したＨＡ−ＳＰＨＫ１、およびＨＡ−ＳＰＨＫ２を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した後、抗ｈＳＰＨＫ２抗体または抗ＳＰＨＫ１抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）にて免疫ブロットした。その結果を図１０（ｂ）に示す。
同図に示すように、核画分の免沈物は約７０ｋＤａのあたりに明確なバンドが検出された。これは、アフィニティ精製された組換えＨＡ−ｈＳＰＨＫ２の位置に相当するものである。この約７０ｋＤａのバンドは、転写後修飾されたタンパク質の存在を表すものとしてしばしば二重バンドとして検出されるものである。また、抗ｈＳＰＨＫ２抗体は、ＨＡ−ＳＰＨＫ１とはクロスリアクトしなかった。免沈物を抗ＳＰＨＫ１抗体で免疫ブロットしたところ、正式なＨＡ−ＳＰＨＫ１またはＨＡ−ＳＰＨＫ２のあたりには免疫反応性のバンドを生じなかった。
これらの結果から、抗ｈＳＰＨＫ２抗体は、細胞内在性のＳＰＨＫ２を特異的に認識するが、ＳＰＨＫ１は認識せず、また精製された核画分は細胞内在性のＳＰＨＫ２を含むことが強く示唆された。この結果を免疫細胞化学的解析によりさらに確認した。
具体的には、抗ｈＳＰＨＫ２抗体でＨｅＬａ細胞を固定化・染色した後、共焦点顕微鏡にて観察した。また、核は、２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩにて染色した。その結果を図１０（ｃ）に示す。なお、図中のｂａｒは１０μｍを示す。その結果、同図に示すように、細胞内在性のＳＰＨＫ２は、主に核に局在化し、細胞質には僅かに存在することがわかった。これらの結果は、図１、図８、図９に示す過剰発現させた組換えＳＰＨＫ２の結果と同様であった。
【実施例１１】
続いて、ＳＰＨＫおよび種々の変異体のタンパク質発現および酵素活性について調べた。具体的には、ＣＯＳ７細胞に一過性にｈＳＰＨＫ２、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、ＮＬＳ−ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、またはプラスミドベクターｐＣＭＶ５をトランスフェクトし、形質転換した。２日後に、形質転換細胞の破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＨＡ抗体または抗ＳＰＨＫ２抗体にてイムノブロットした。その結果を図１１（ａ）のインセットに示す。また、細胞破砕物の分取を用いて酵素活性を測定した。その結果を図１１（ａ）にグラフとして示す。
同図に示すように、ベクターのみを形質転換したＣＯＳ７細胞はＳＰＨＫ活性が低かった。その一方、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、ＮＬＳ−ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、またはｈＳＰＨＫ２を形質転換した細胞では、ベクターのみ形質転換した場合に比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＳＰＨＫ活性がそれぞれ６３倍、５３倍、５２倍上昇した。
さらに、精製した完全な核画分を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核へのＳＰＰの蓄積を調べた。具体的には、ＨｅＬａ細胞に一過性にｈＳＰＨＫ２、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、ＮＬＳ−ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、またはプラスミドベクターｐＣＭＶ５を形質転換した。２日後に形質転換細胞を破砕し、分画した。細胞質画分（Ｃ）および核画分（Ｎ）について、ＳＰＰの蓄積またはＬＤＨ活性を測定した。その結果を図１１（ｂ）に示す。
同図に示すように、ｈＳＰＨＫ２を発現させた細胞では、ＳＰＰは主に核画分に蓄積したが（７５％）、この結果は図９の表に示す形態学的測定と同様の結果であった。一方、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１を発現させた細胞では、以前の報告（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｌ．，Ｎａｖａ，Ｖ．，Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ，Ｏ．，Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７，５４５−５５８）と同様に、ＳＰＰは主に細胞質画分に蓄積した。また、ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１を発現させた場合は、はっきりとＳＰＰの蓄積が細胞質画分から核画分へと移っていることがわかる。なお、典型的な細胞質マーカータンパク質であるＬＤＨは核画分ではほとんど検出されていない。また、典型的な核膜マーカーであるｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎは核画分にて検出されている（データ不図示）。
【実施例１２】
次に、異なるエピトープ特異的抗体を用いて、ＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞内分布を調べた。具体的には、Ｎ末にＨＡタグを付けたＳＰＨＫ２遺伝子（ＨＡ−ＳＰＨＫ２）をＣＯＳ７細胞に導入し、１日後に抗ＨＡ抗体あるいは抗ＳＰＨＫ２抗体を用いて免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果を図１２に示す。
同図のパネルＡ〜Ｃに示すように、抗ＨＡ抗体で染色すると、ＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質は主に細胞質に顆粒状に或いは細胞膜直下に分布し、核はほとんど染色されないが、抗ＳＰＨＫ２抗体で染色すると、核に最も高密度に分布し、細胞質にも抗ＨＡ抗体で染色したときと同じような分布像が認められた。
このことから核に移行したＨＡ−ＳＰＨＫ２はＮ末のＨＡタグを含む部分が切断され、抗ＨＡ抗体に対する抗原性が消失したことが強く示唆された。因みに、抗ＳＰＨＫ２抗体の認識部位はＳＰＨＫ２の中央部に存在するため、抗原性が保たれていると推測される。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ２を利用した細胞増殖抑制剤、及びその核移行シグナルを持つ融合タンパク質の作製方法、並びに薬剤候補物質のスクリーニング方法等に関するものであり、前述したとおり、各種の細胞培養技術、皮膚組織等の組織作製や器官・臓器の作製に代表される再生医療、モデル動物を用いた実験系などへの利用、さらに、細胞増殖性疾患等の疾患の診断薬や治療薬などに利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【配列表】
【図１】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、スフィンゴシンキナーゼ２を利用した細胞増殖抑制剤、及びその核移行シグナルを持つ融合タンパク質の作製方法、並びに薬剤候補物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
本出願は、米国仮特許出願（Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．）６０／４８４，３４８（出願日：２００３年 ７月 １日、発明の名称：Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２ ｉｓ ａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と関連するとともに、該米国仮特許出願の利益を主張する。
生理活性物質スフィンゴシン１リン酸（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ １−ｐｏｓｐｈａｔｅ；ＳＰＰ）は、リピッドアクティベーター又はリピッドメディエーターとして、細胞内外で作用し、細胞の種々の機能を調節する。少なくともこれまでに、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制、細胞分化、細胞運動、細胞骨格の再編成等の多岐にわたる生理機能に関与することが報告されている。
上記スフィンゴシン１リン酸は、ＥＤＧ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ）レセプターファミリー（「ＳＰＰ受容体」とも呼ばれる）のリガンドであることが最近明らかになり、スフィンゴシン１リン酸は細胞外リガンドとして作用することが示された。スフィンゴシン１リン酸の受容体としては、現在までに少なくとも５つの受容体（即ち、ＥＤＧ−１／ＳＰＰ１，ＥＤＧ−５／ＳＰＰ２，ＥＤＧ−３／ＳＰＰ３，ＥＤＧ−６／ＳＰＰ４，ＥＤＧ−８／ＳＰＰ５）が同定されている。
またスフィンゴシン１リン酸は、細胞内セカンドメッセンジャーとしての役割を有しており、細胞内貯蔵領域からのカルシウム放出、アポトーシスの抑制などに重要な役割を持つことが知られている。
一方、スフィンゴシンキナーゼ（以下「ＳＰＨＫ」ともいう）は、スフィンゴシンをリン酸化し、上記スフィンゴシン１リン酸を産生する酵素であり、細胞内のスフィンゴシン１リン酸の量を調節する。哺乳類由来のＳＰＨＫとしては、スフィンゴシンキナーゼ１およびスフィンゴシンキナーゼ２（以下それぞれ「ＳＰＨＫ１」「ＳＰＨＫ２」ともいう）の２つのアイソフォームが知られている（例えば、Ｋｏｈａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３，２３７２２−２３７２８、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５，１９５１３−１９５２０参照）。このうち、ＳＰＨＫ２のアミノ酸配列およびその塩基配列については、下記のデータベース（Ｉ）（ＩＩ）に記載されている。
（Ｉ）ＤＤＢＪ：アクセッション番号ＡＦ２４５４４７（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））
（ＩＩ）ＤＤＢＪ：アクセッション番号ＡＦ２４５４４８（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））
上記ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２とでは、その生物化学的特性に相違がみられる。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＳＰＨＫ１の活性は、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００によって強く活性化されるが、塩によって抑制される。これに対して、ＳＰＨＫ２の活性は逆の反応を示す。また、ＳＰＨＫ１をＨＥＫ２９３細胞に発現させると、その酵素活性は飛躍的に高まるが、ＳＰＨＫ２を発現させた場合はそれほど上昇しない。
上記ＳＰＨＫ１については、機能解析の結果、過剰発現させると、▲１▼細胞のＧ１期からＳ期への移行を促進し、細胞増殖を誘導する、▲２▼細胞のアポトーシス応答を抑制する、ことが知られている。また、ＳＰＨＫ１を過剰発現させると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腫瘍を形成させることも報告されている。さらに、ＳＰＨＫ１結合分子として、ＴＲＡＦ２，ＲＰＫ１１８，ＡＫＡＰ関連タンパクといった複数の分子が既に同定されている。
これに対して、ＳＰＨＫ２の機能については殆どわかっていないのが現状である。ＳＰＨＫ２の基質であるスフィンゴシン１リン酸は、前述のように、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制等の多岐にわたる生理機能に関与し、ひいては、これらの生理機能に関わる種々の病気（例えば、動脈硬化や本態性高血圧等）にも深く関与していると考えられる。したがって、そのリン酸化酵素ＳＰＨＫ２の機能を解明することは、このような病気の病態解析やその診断方法・治療方法の開発などにもつながり、医学上および産業上重要な貢献をもたらすものと期待される。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ＳＰＨＫ２の機能解析を行い、その解析を通じて医学上および産業上有用な方法・物質を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記の課題に鑑み、ＳＰＨＫ２の詳細な機能解析を進めた結果、ＳＰＨＫ２が細胞内において主として核内に存在し、そのアミノ末端側に核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つこと、ＳＰＨＫ２を発現させると細胞のＤＮＡ合成が抑制されること、また、ＳＰＨＫ２がそのＤＮＡ合成抑制作用を発揮するためには、核内に存在することが必要であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｊ）の発明を含むものである。
Ａ） 哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２タンパク質、またはそのタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
Ｂ） 上記Ａ）の細胞増殖抑制剤であって、ヒト又はマウス由来のスフィンゴシンキナーゼ２を用いた細胞増殖抑制剤。
Ｃ） 哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２のアミノ末端側に存在する核移行シグナルをコードするオリゴヌクレオチド。
Ｄ） 上記Ｃ）記載のオリゴヌクレオチドを用いて、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルと他のタンパク質とを融合させた融合タンパク質を作製する方法。
Ｅ） 上記Ｄ）記載の方法によって作製された融合タンパク質。
Ｆ） 上記Ｅ）記載の融合タンパク質であって、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルとスフィンゴシンキナーゼ１とを融合させた融合タンパク質。
Ｇ） 上記Ｆ）記載の融合タンパク質、またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
Ｈ） スフィンゴシンキナーゼ２の細胞増殖抑制作用を調節する物質のスクリーニング方法。
Ｉ） 上記Ｈ）記載のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を使用することを特徴とするスクリーニング方法。
Ｊ） 上記Ｈ）またはＩ）記載のスクリーニング方法により得られた物質を含む薬剤。
Ｋ） 上記Ｈ）記載のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキット。
Ｌ） 上記Ｋ）記載のスクリーニングキットには、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれることを特徴とするスクリーニングキット。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＰＨＫ２およびＳＰＨＫ１の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図２（ａ）は、ｍＳＰＨＫ１、ｍＳＰＨＫ２、ｍＳＰＨＫ２ΔＭ、ｍＳＰＨＫ２ΔＮの構造を模式的に示す図であり、図２（ｂ）は、上記ｍＳＰＨＫ２、ｍＳＰＨＫ２ΔＭ、ｍＳＰＨＫ２ΔＮの細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図３（ａ）は、ＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列と他のタンパク質のＮＬＳ配列とを比較して示す図であり、図３（ｂ）は、ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ、ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図４（ａ）は、ＳＰＨＫ２の発現が細胞内でのＤＮＡ合成を抑制するかどうかを調べた結果を示すグラフであり、図４（ｂ）は、Ｄｏｘ濃度に応じてＳＰＨＫ２の発現が誘導されることを確認したイムノブロット解析の結果を示す図である。
図５は、ＳＰＨＫ２、ＳＰＨＫ１、またはそれらの改変体を細胞内発現させ、細胞内でのＤＮＡ合成がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
図６（ａ）は、Ｄｏｘ存在下またはＤｏｘ非存在下で培養した各細胞における、ＳＰＨＫ２の細胞内発現の有無を調べた結果を示す図であり、図６（ｂ）は、ＳＰＨＫ２の発現がアポトーシスを誘導するかどうかを調べた結果を示す図である。
図７（ａ）および図７（ｂ）は、ＳＰＨＫ２の発現が細胞周期にどのような影響を与えるかを調べた結果を示す図である。
図８は、ＳＰＨＫ２、ＳＰＨＫ１、または変異体の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図９は、細胞の種類および細胞密度によってＳＰＨＫ２の局在化がどのように変化するかを調べた結果を示す表である。
図１０（ａ）は、細胞内在性のＳＰＨＫ２の活性を調べた結果を示す、図であり、図１０（ｂ）は、内在性のＳＰＨＫ２の局在箇所をイムノブロットにて検出した結果を示す図であり、図１０（ｃ）は、細胞内在性のＳＰＨＫ２の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
図１１（ａ）は、種々のＳＰＨＫタンパク質の活性を調べた結果を示すグラフであり、図１１（ｂ）は、細胞質画分（Ｃ）と核画分（Ｎ）とにおけるＳＰＰの蓄積を調べた結果を示すグラフである。
図１２は、異なるエピトープ特異的抗体を用いてＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞内分布を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の具体的態様について説明する。
（１）細胞増殖抑制剤
本発明の細胞増殖抑制剤は、前記のとおり、哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）タンパク質、またはそのタンパク質をコードする遺伝子（核酸）を含む細胞増殖抑制剤である。
ここで、「スフィンゴシンキナーゼ２（ＳＰＨＫ２）」とは、主としてヒト又はマウス由来のタンパク質を意味する。ヒト由来のＳＰＨＫ２は、６１８個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列並びに塩基配列は例えばアクセッション番号ＡＦ２４５４４７に記載される。マウス由来のＳＰＨＫ２は、６１７個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列並びに塩基配列は例えばアクセッション番号ＡＦ２４５４４８に記載される。
後述の実施例に示すように、ＳＰＨＫ２を発現させると細胞のＤＮＡ合成が抑制され、ＳＰＨＫ２を導入した細胞の大半は細胞周期においてＧ１／Ｓ期の状態から９時間経過後もＧ１／Ｓ期の状態にとどまった（図４（ａ）、図４（ｂ）、図５、図７（ａ）、図７（ｂ）参照）。したがって、ＳＰＨＫ２タンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子は、細胞増殖抑制剤として利用可能である。
尚、ＳＰＨＫ２タンパク質は、ヒト又はマウス由来のものに限らず、哺乳類由来のものであればよい。また、ヒト又はマウス由来のＳＰＨＫ２であっても、上記アクセッション番号に記載されたアミノ酸配列に限らず、その配列の一部が異なるものであってもよい。即ち、ヒト又はマウス由来のＳＰＨＫ２には、（ａ）上記アクセッション番号に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、のみならず、（ｂ）上記アクセッション番号に記載されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ合成抑制作用を示すタンパク質、も含まれる。
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
また、ＳＰＨＫ２タンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によってＳＰＨＫ２タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。さらに、ＳＰＨＫ２タンパク質は、糖鎖結合やリン酸化等により修飾されたものであってもよい。
本発明の細胞増殖抑制剤は、ＳＰＨＫ２タンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよく、ここにいう「遺伝子」には、上記アクセッション番号に記載される塩基配列中の少なくともオープンリーディングフレーム領域を有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。
また、「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡ・ＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖は、センス鎖となるコード鎖であっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。さらに、「遺伝子」は、タンパク質をコードするコード配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
本発明の細胞増殖抑制剤は、上述したＳＰＨＫ２タンパク質、または当該タンパク質をコードするＳＰＨＫ２遺伝子を含むものであればよく、その他に、適当な溶液（緩衝液を含む）、酵素、ベクター、または、脂質・蛋白・低分子化合物などといった他の化学物質を含むものであってもよい。
本発明の細胞増殖抑制剤は、各種の細胞培養技術、皮膚組織等の組織作製や器官・臓器の作製に代表される再生医療、モデル動物を用いた実験系などに利用できる。そのほか、治療薬（特に細胞増殖性疾病の治療薬）などへの応用も可能である。
（２）ＳＰＨＫ２の核移行シグナルを持つ融合タンパク質作製方法
本発明者は、後述の実施例に示すように、ＳＰＨＫ２が細胞内において主として核内に存在し、そのアミノ末端側に核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つこと、そのＮＬＳ配列とＳＰＨＫ１タンパク質とを融合させて発現させることで、本来核に移行しないＳＰＨＫ１タンパク質を核に移行させ得ること、さらに、核に移行したその融合タンパク質は、野生型のＳＰＨＫ１には本来ないＤＮＡ合成抑制作用を示したこと、を明らかにした。
したがって、ＳＰＨＫ２の核移行シグナル（ＮＬＳ）と他のタンパク質とを融合させることで、本来核に移行しないタンパク質を核に移行させることができ、また、本来核に移行しないタンパク質を核に移行させることで、そのタンパク質の野生型には本来ない機能・作用を発揮させることが可能である。
ＳＰＨＫ２の核移行シグナル（ＮＬＳ）を持つ本発明の融合タンパク質の作製方法は特に限定されるものではないが、以下では、後述の実施例において使用した作製方法について簡単に説明する。
実験では、マウス由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列とマウス由来のＳＰＨＫ１タンパク質とを融合させた融合タンパク質を作製した。マウス由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列は、本発明者により、アミノ末端側に存在する８７〜９５番目のアミノ酸配列「ＲＧＲＲＧＧＲＲＲ（配列番号１）」と同定された。また、他のＮＬＳ配列との比較から、特に８９〜９４番目のアミノ酸配列「ＲＲＧＧＲＲ」が機能上重要と判断された。
融合タンパク質の作製には、上記ＮＬＳ配列をコードするオリゴヌクレオチド（下記センスプライマー）を使用した。まず、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーからＳＰＨＫ１遺伝子をクローニングした。次に、このＳＰＨＫ１遺伝子が挿入されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った。その際、センスプライマーに上記ＮＬＳ配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用し、具体的には、マウス由来のＳＰＨＫ２の８７〜９８番目のアミノ酸配列をコードする下記塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
上記オリゴヌクレオチドのうち、１０〜４５番目の配列が、ＳＰＨＫ２の８７〜９８番目のアミノ酸配列をコードする領域に相当する。また、４６〜６０番目の配列は、ＳＰＨＫ１の１〜５番目のアミノ酸配列をコードする領域に相当する。
上記ＰＣＲ法により得られた増幅断片をｐＴＢ−７０１ベクターに挿入して発現ベクターを作製した。この発現ベクターを宿主細胞（実施例ではＮＩＨ ３Ｔ３細胞）にトランスフェクションし、融合タンパク質を発現させた。
上記と同様の方法によりヒト由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列を持つ融合タンパク質を作製する場合、そのＮＬＳ配列は、ヒト由来のＳＰＨＫ２の８６〜９４番目のアミノ酸配列「ＲＧＲＲＧＡＲＲＲ（配列番号３）」と考えられ、特に８８〜９３番目のアミノ酸配列「ＲＲＧＡＲＲ」が機能上重要と判断されるので、このＮＬＳ配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用するとよい。
勿論、本発明の融合タンパク質は、上記以外の方法により作製してもよい。また、ＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列とＳＰＨＫ１タンパク質とを融合させた融合タンパク質は、ＳＰＨＫ２タンパク質と同様にＤＮＡ合成抑制作用を示したことから、その融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードする遺伝子は、前記（１）の細胞増殖抑制剤と同様に、細胞増殖抑制剤としての利用が可能である。
（３）薬剤候補物質のスクリーニング方法
上記のようにＳＰＨＫ２タンパク質はＤＮＡ合成抑制作用（換言すれば、細胞増殖抑制作用）を示すことから、ＳＰＨＫ２タンパク質、及びその遺伝子は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）のスクリーニングに有用であり、例えば、ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を調節する物質のスクリーニング方法に利用可能である。ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を調節する物質とは、例えば、ＳＰＨＫ２タンパク質と基質のスフィンゴシンとの結合を阻害し、ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を阻害する物質や、あるいは反対に、ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞増殖抑制作用を高める物質等が挙げられる。このような物質は、細胞増殖が必要な疾患、例えば皮膚や角膜の再生等の再生医療に利用可能であり、そのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ＳＰＨＫ２タンパク質の基質スフィンゴシンとの結合領域を発現させ、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ）において、同結合領域と基質スフィンゴシンとの結合を阻害する分子等を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法が挙げられる。
このように、本発明のスクリーニング方法においては、ＳＰＨＫ２の全長タンパク質以外に、その部分タンパク質を使用するものであってもよい。また、上記全長タンパク質や部分タンパク質の改変体を使用してもよい。上記部分タンパク質としては、▲１▼基質スフィンゴシンとの結合領域、▲２▼触媒領域（キナーゼ活性領域）、または▲３▼ＮＬＳ配列を含む領域、などを使用することが考えられる。また、上記「（タンパク質の）改変体」とは、当該タンパク質の１個または数個（好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された改変体をいい、当該タンパク質がＨｉｓやＭｙｃ等のタグによって標識される場合や、当該タンパク質を蛍光タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させる場合、当該タンパク質にリン酸化や糖鎖結合等により修飾を施す場合などをも含む意味で用いている。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞系でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）ＳＰＨＫ２の部分タンパク質（例えば、上記▲１▼〜▲３▼の領域）をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降−免疫ブロット法を用いてＳＰＨＫ２タンパク質と基質スフィンゴシンとの結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。また、本発明のスクリーニング方法には、例えば、上記タンパク質をコードする遺伝子を用いてもよい。
また、本発明のスクリーニング方法は、▲１▼ＳＰＨＫ２タンパク質の核内移行を阻害する物質を検索する方法、あるいは、▲２▼ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞質と核内との間の行き来を制御する物質を検索する方法、などであってもよい。ＳＰＨＫ２タンパク質は、主として核内に存在するが、細胞質にもわずかながら存在が観察されたことから、細胞質と核内との間を行き来している可能性がある。そうであれば、細胞質と核内との間のＳＰＨＫ２の行き来を制御する物質は、薬剤の候補分子（創薬ターゲット）として有用である。
さらに、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト以外のタンパク質、例えば、マウスホモログやラットホモログ、その他の生物の各ホモログを用いてスクリーニングを行ってもよい。
（４）スクリーニングキット
また、本発明には、上記（３）欄で説明したスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットも含まれる。本キットは、上記のスクリーニング方法を実施することができるキットであればよく、その具体的な構成は特に限定されるものではない。例えば、上記スクリーニングキットには、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれていればよい。
本キットによれば、簡便且つ確実に上記（３）欄のスクリーニング方法を実施することができ、スフィンゴシンキナーゼ２の細胞増殖抑制作用を調節する物質を探索することができる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【実施例】
以下、本発明の基礎をなす、ＳＰＨＫ２について行った機能解析の結果について図面を参照しながら説明する。
〔実施例１：ＳＰＨＫ２は、主として核内に局在する〕
ＳＰＨＫ２の細胞内局在を検討するため、マウス由来のＳＰＨＫ２を緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合させた融合タンパク質（ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ）を、発現ベクターを用いてＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、２日後に共焦点顕微鏡にて観察した。その結果を図１のパネルＡに示す。図中のバーは、１０μｍの長さを示す（以下同様）。同図に示すように、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、主として核内に存在し、細胞質には殆ど存在しなかった。
ＳＰＨＫ２の核内局在は、ＨｅＬａ細胞に一過性に発現させた場合にも同様に観察された（図１のパネルＢ参照）。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に発現させた場合も同様にＳＰＨＫ２の核内局在が観察された（データ示さず）。
ＧＦＰとの融合によりＳＰＨＫ２が核内に局在した可能性も考えられたため、次に、ＳＰＨＫ２のアイソザイムであるＳＰＨＫ１とＧＦＰとの融合タンパク質を発現させ、その細胞内分布をＳＰＨＫ２と比較した。その結果を図１のパネルＣに示す。同図に示すように、ＳＰＨＫ１−ＧＦＰ融合タンパク質は、主として細胞質に存在し、核内には存在しなかった。
さらに、ＧＦＰの代わりにＨＡタグを付加したＳＰＨＫ２タンパク質（ＨＡ−ＳＰＨＫ２）を発現させ、抗ＨＡ抗体によりその局在を検討した。その結果を図１のパネルＤに示す。ＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質は、図中「Ｓ」に示されるように主として核内に分布し、細胞質における発現はわずかであった。あわせて、ヌクレオポリン（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）の染色も行ったが、図中「Ｎ」に示されるようにその染色パターンは、核の外縁を明確に示すものであった。以上の結果から、ＳＰＨＫ２が主として核内に存在することが示された。
〔実施例２：ＳＰＨＫ２の核移行シグナルは、アミノ末端側の領域に存在する〕
マウス由来のＳＰＨＫ２（ｍＳＰＨＫ２）は、マウス由来のＳＰＨＫ１（ｍＳＰＨＫ１）よりもアミノ酸残基の数が２３６個多い（図２（ａ）の模式図参照）。同図に示すように、ＳＰＨＫ２は、ＳＰＨＫ１にはない２つの長い配列領域（１つはアミノ末端側、他は中央付近）を含んでいる。
ＳＰＨＫ２とＳＰＨＫ１とで細胞内局在が異なるのは、ＳＰＨＫ２のみに存在するこれら２つの長い配列領域のいずれかによるものと考えられた。そこで、２つの欠失変異体を作製した。１つはｍＳＰＨＫ２ΔＭであり、中央付近を欠失させたもの、他はｍＳＰＨＫ２ΔＮであり、アミノ末端側を欠失させたものである。
ｍＳＰＨＫ２ΔＭ−ＧＦＰ融合タンパク質をＣＯＳ７細胞に一過性に発現させると、この融合タンパク質は主に核内に局在した（図２（ｂ）参照）。この結果は、ＳＰＨＫ２の中央付近は同タンパクの核内局在に影響を与えないことを示している。一方、ｍＳＰＨＫ２ΔＮ−ＧＦＰ融合タンパク質をＣＯＳ７細胞に一過性に発現させると、同図に示すようにこの融合タンパク質は核に移行できなかった。以上の結果は、核移行シグナル（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）が、ＳＰＨＫ２のアミノ末端側の領域に存在することを示すものである。
〔実施例３：ＳＰＨＫ２における核移行シグナル（ＮＬＳ）配列の同定〕
ＳＰＨＫ２のアミノ酸配列におけるＮＬＳ配列の存在は以前報告がなかったが、今回の解析により、マウス由来のＳＰＨＫ２のＮＬＳ配列を同定した。同ＮＬＳ配列は、アルギニン（Ｒ）の豊富な「ＲＧＲＲＧＧＲＲＲ」という配列であり、図３（ａ）に示されるように、▲１▼ヒト免疫不全ウイルス−１（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−１）のＴａｔタンパクおよびＲｅｖタンパク、▲２▼ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＲｅｘタンパク、▲３▼非典型のプロテインキナーゼＣλ（ＰＫＣλ）、に存在する各ＮＬＳ配列に類似する。同図には、これらＮＬＳ配列の共通配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＮＬＳ）もあわせて示される。図中、各数字はアミノ酸残基の位置を示している。ＳＰＨＫ２の場合、最初と最後のアルギニンがそれぞれ、全長アミノ酸配列中の８７番目と９５番目に位置することを示す。また、太字はＮＬＳの機能上重要なアルギニンとリジンを示し、各配列はこれらアミノ酸残基に基づいて整列されている。
ＳＰＨＫ２の持つ上記ＮＬＳ配列が本当にＮＬＳとしての機能を有するかどうか調べるため、変異体ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ−ＧＦＰを作製した。この変異体は、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質の９３番目と９４番目のアルギニン（図３（ａ）においてアステリスクが付されたアルギニン）をいずれもグルタミン酸（Ｅ）に改変したものである。この変異体ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ−ＧＦＰをＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、発現ベクターを導入して２日後、細胞を固定し共焦点顕微鏡にて観察すると、図３（ｂ）に示すように、この変異タンパク質は核に移行できなかった。
さらに、ＳＰＨＫ２の上記ＮＬＳ配列を本来細胞質に存在するＳＰＨＫ１と融合させた融合タンパク質を発現させ、その核内移行の有無を検討した。即ち、融合タンパク質ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１−ＧＦＰをＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、発現ベクターを導入して２日後、細胞を固定し共焦点顕微鏡にて観察すると、図３（ｂ）に示すようにこの融合タンパク質は主に核内に集積した。以上の結果は、上記ＮＬＳ配列がＳＰＨＫ２の核内移行に必要かつ十分であることを示すものである。
〔実施例４：ＳＰＨＫ２は、細胞内のＤＮＡ合成を抑制する〕
上記のようにＳＰＨＫ２は核内に局在することから、ＳＰＨＫ２は核内での作用に関与している可能性が考えられた。そこで、ＳＰＨＫ２を安定発現するＨｅＬａ細胞への〔３Ｈ〕チミジンの取り込みを測定することによって細胞内でのＤＮＡ合成の変化を調べた。
実験では、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ：Ｄｏｘ）が、ＳＰＨＫ２を導入したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞に対してＳＰＨＫ２の発現を誘導することを利用し、同細胞を様々なＤｏｘ濃度（０〜１μｇ／ｍｌ）で処理した後、〔３Ｈ〕チミジンの取り込みを指標にして各濃度条件下における細胞内のＤＮＡ合成の変化を調べた。その結果を図４（ａ）のグラフに示す。各値は、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。
同図に示すように、０．１μｇ／ｍｌのＤｏｘ濃度でＳＰＨＫ２の発現が誘導された細胞では、Ｄｏｘ非含有（０μｇ／ｍｌ）条件下で外因性のＳＰＨＫ２を発現しない細胞と比較して、〔３Ｈ〕チミジンの取り込みが約５０％抑制された。ＤｏｘによりＳＰＨＫ２の発現が誘導されることは、イムノブロット解析によって確認された。即ち、ＨＡ−ＳＰＨＫ２を導入したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞を様々なＤｏｘ濃度条件下におき、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて抗ＨＡ抗体を用いたイムノブロット解析に供した。その結果を図４（ｂ）に示す。また、ＳＰＨＫ２遺伝子を持たない発現ベクターを導入した細胞では、Ｄｏｘ濃度がいずれの場合も、〔３Ｈ〕チミジンの取り込みに殆ど影響を与えなかった（データ示さず）。以上の結果は、ＳＰＨＫ２が細胞内のＤＮＡ合成を抑制したことを示すものである。
〔実施例５：ＳＰＨＫ２の核内局在は、そのＤＮＡ合成抑制活性に不可欠である〕
ＳＰＨＫ２によるＤＮＡ合成抑制の仕組みは、ＢｒｄＵ（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）の取り込みを測定することによっても検討された。
実験では、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、▲１▼コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）であるＨＡ−ＧＦＰ，▲２▼ＨＡ−ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ，▲３▼ＨＡ−ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅ−ＧＦＰ，▲４▼ＨＡ−ＳＰＨＫ１−ＧＦＰ，▲５▼ＮＬＳ−ＨＡ−ＳＰＨＫ１−ＧＦＰの何れかをコードする発現ベクターを導入し、導入してから２日後、各ベクターを導入した培養細胞に対してＢｒｄＵを３時間添加した。その後、各細胞について、二重免疫蛍光により、全細胞とＢｒｄＵの取り込みを視覚化し、全細胞のうちＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合を決定した。その結果を図５のグラフに示す。各値は、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。
同図に示すように、ＳＰＨＫ２をＮＩＨ ３Ｔ３細胞に発現させると、ＢｒｄＵの取り込みは、コントロールベクターを導入した細胞に比べて著しく抑制された。この結果は、ＳＰＨＫ２が細胞内のＤＮＡ合成を抑制したことを示すものである。対照的に、ＳＰＨＫ１を発現する細胞では、ＢｒｄＵの取り込みが約４０％増加した。
また、前述のＮＬＳ配列を改変し、核内移行できなかった変異体ＳＰＨＫ２Ｒ９３Ｅ／Ｒ９４Ｅを細胞に発現させた場合は、同図に示すように、ＳＰＨＫ２のＤＮＡ合成抑制活性が失われた。さらに、ＳＰＨＫ２由来のＮＬＳ配列と融合させ、ＳＰＨＫ１に核移行能を持たせた変異体ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１を発現させると、同図に示すように、ＤＮＡ合成が抑制された。
以上の結果は、ＳＰＨＫ２の核内局在が、そのＤＮＡ合成抑制作用に不可欠であることを示すものである。
〔実施例６：ＳＰＨＫ２の発現は、アポトーシスを誘導しない〕
ＳＰＨＫ２を導入したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞をＤｏｘにより誘導すると、図６（ａ）に示すように、ＳＰＨＫ２は主に細胞核内に発現した（Ｄｏｘ（−）とＤｏｘ（＋）との比較。Ｄｏｘ（＋）は細胞を３日間０．１μｇ／ｍｌのＤｏｘ条件下で処理したものであり、Ｄｏｘ（−）は細胞を３日間Ｄｏｘ非含有条件下で処理したもの）。
次に、ＳＰＨＫ２の発現によって細胞にアポトーシスが誘導されるかどうかを調べるため、上記０．１μｇ／ｍｌのＤｏｘ条件下で処理したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞、および上記Ｄｏｘ非含有条件下で処理したＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞から抽出したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、そのＤＮＡパターンを調べた。その結果、図６（ｂ）に示すように、上記Ｄｏｘ条件下でＳＰＨＫ２を発現誘導した細胞（図中レーン１）と、上記Ｄｏｘ非含有条件下で発現誘導しなかった細胞（図中レーン２）とでは、ほぼ同じＤＮＡパターンが得られた。
一方、アポトーシスを誘導することが知られているＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）およびｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅで処理したＨｅＬａ細胞（図中レーン３）では、同図に示すように、典型的なアポトーシスのラダ−パターンを示した。以上の結果は、ＳＰＨＫ２は、細胞内のＤＮＡ合成を抑制するが、アポトーシスは誘導しないことを示すものである。
〔実施例７：ＳＰＨＫ２の発現は、細胞周期をＧ１／Ｓ期にとどまらせる〕
次に、ＳＰＨＫ２の細胞周期に与える影響を調べた。実験では、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ発現ベクター（ＳＰＨＫ２−ＧＦＰ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、またはＳＰＨＫ２を有さないベクター（Ｍｏｃｋ ｔｒｅａｔｅｄ）を発現させ、フローサイトメトリー法による解析を行った。図７（ａ）は、フローサイトメトリーの結果を示しており、縦軸は前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ）であり、細胞の大きさを示す。横軸はＧＦＰ蛍光強度である。ＧＦＰ蛍光強度が強い細胞（Ｒ２：即ち、ＳＰＨＫ２−ＧＦＰを発現）、およびＧＦＰ蛍光強度が弱い細胞（Ｒ１：即ち、ＳＰＨＫ２を発現せず）の双方について、二重チミジンブロックによってＳ期の始まりに同調させた。その後、チミジンブロックを取り除き、所定時間（０ｈ，３ｈ，９ｈ）経過ごとにＲ１およびＲ２両細胞のＤＮＡ量（ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ）を、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を用いたフローサイトメトリー法によって解析した。その結果を図７（ｂ）に示す。
同図の各ヒストグラムには、測定結果であるＧ１期，Ｓ期，Ｇ２／Ｍ期のそれぞれの割合（％）が合わせて示される。同図に示すように、二重チミジンブロックによってＲ１およびＲ２両細胞をＳ期の始まりに同調させた結果として、ブロック除去後０時間（０ｈ）では、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）および非発現細胞（Ｒ１）のほぼ１００％がＧ２／Ｍ期に移行しなかった。
ブロック除去後３時間（３ｈ）では、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）と非発現細胞（Ｒ１）との間に違いがみられた。非発現細胞（Ｒ１）では３時間後、大多数の細胞はＳ期に移行した。また、ブロック除去後９時間（９ｈ）経過すると、非発現細胞（Ｒ１）では、Ｓ期のままのものとＧ２／Ｍ期に移行するものとに分かれた。
対照的に、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）では３時間後、各時期の割合にあまり変化がみられず、その多くはＧ１期にとどまり、典型的なＧ１／Ｓ期での停止を示した。また、ブロック除去後９時間（９ｈ）経過すると、非発現細胞（Ｒ１）では、約４０％がＧ２／Ｍ期に移行したのに対して、ＳＰＨＫ２発現細胞（Ｒ２）では、Ｇ２／Ｍ期のものはわずか７％であった。
以上の結果は、ＳＰＨＫ２を発現させると、細胞周期をＧ１期またはＳ期に長くとどまらせ、ＤＮＡ合成を抑制することを示すものである。
【実施例８】
続いて、ＳＰＨＫ２の細胞内局在をより詳細に解析すべく、実施例１で示した結果に加えて、さらにＳＰＨＫ２およびその変異体の局在化を調べた。具体的には、ＳＰＨＫ２、ＳＰＨＫ１、およびこれらの変異体をＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＮＩＨ ３Ｔ３細胞にて一過性に発現させ、その細胞内局在を調べた。なお、図８のパネルＡ、Ｂはそれぞれ図１のパネルＡ、Ｂと一致し、図８のパネルＪ、Ｋはそれぞれ図２（ｂ）の図と一致し、図８のパネルＬ、Ｍはそれぞれ図３（ｂ）の図と一致するため、ここではその説明を省略する。
マウス由来のＳＰＨＫ２を緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と融合させた融合タンパク質（ｍＳＰＨＫ２−ＧＦＰ）を、発現ベクターを用いてＮＩＨ ３Ｔ３細胞に一過性に発現させ、２日後に共焦点顕微鏡にて観察した。その結果を図８のパネルＣに示す。図中のバーは、１０μｍの長さを示す（以下同様）。同図に示すように、ｍＳＰＨＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、主として核内に存在し、細胞質には殆ど存在しなかった。
また、ＧＦＰとの融合の有無、或いは種の違いにより細胞内局在に相違があるか否かを調べた。具体的には、まず、ヒト由来のＳＰＨＫ２（ｈＳＰＨＫ２）をＨｅＬａ細胞にて一過性に発現させ、ｈＳＰＨＫ２およびｍＳＰＨＫ２の共通ペプチド配列に対する特異的抗体を用い、共焦点顕微鏡にて細胞内局在を観察した。その結果をパネルＤに示す。
同図に示すように、ｍＳＰＨＫ２と同様に、ｈＳＰＨＫ２も、主として核に局在化することがわかった。また、ＨｅＬａ細胞を核特異的染色剤４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）にて染色したところ（図８のパネルＥ）、ＤＡＰＩとｈＳＰＨＫ２とは共に核局在化することが確認された（図８のパネルＦ）。
次に、ＳＰＨＫのアイソザイムであるＳＰＨＫ１（マウス由来）をＧＦＰと融合させた融合タンパク質ｍＳＰＨＫ１−ＧＦＰを作製し、このｍＳＰＨＫ１−ＧＦＰの細胞内局在を調べ、ＳＰＨＫ２のそれと比較した。図８のパネルＨに示すように、ＣＯＳ７細胞では、ｍＳＰＨＫ１−ＧＦＰは主に細胞質に局在化し、核にはほとんど局在化しなかった。これは従前の報告と同様の結果である（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｌ．，Ｎａｖａ，Ｖ．，Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ，Ｏ．，Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７，５４５−５５８）。
【実施例９】
次に、ＳＰＨＫ２の核または細胞質への分配に、細胞の種類や細胞の密集度（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が影響するか否かを検討した。具体的には、ｈＳＰＨＫ２を高密度（ｈｉｇｈ：３×１０４／ｍｍ２）または低密度（ｌｏｗ：６×１０３／ｍｍ２）状態の種々の細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）にて一過性に発現させた。２日後に形質転換細胞を固定化し、抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡にて観察した。
ｈＳＰＨＫ２の染色の結果に応じて、ｈＳＰＨＫ２を発現した細胞を、ｈＳＰＨＫ２が主に核に局在化したグループ（Ｎ＞Ｃ）、ｈＳＰＨＫ２が核と細胞質とにほぼ同等に局在化したグループ（Ｎ＝Ｃ）、ｈＳＰＨＫ２が主に細胞質に局在化したグループ（Ｎ＜Ｃ）、の３つのグループに分けた。その結果を図９に示す。
図９の表に示すように、ＨｅＬａ細胞にて一過性に発現させたｈＳＰＨＫ２は、全ての条件で主に核に局在化することがわかった。ＣＯＳ７細胞にて発現させたｈＳＰＨＫ２は、細胞密度に応じて、劇的に細胞内局在化が変化することがわかった。すなわち、高密度条件では主に核に局在化する一方（６１．４％）、低密度条件ではわずか１０．３％しか核に局在化しない。また対照的に、ＨＥＫ２９３細胞で発現させたｈＳＰＨＫ２は、細胞密度にかかわらず主に細胞質に局在化することがわかった。
【実施例１０】
続いて、外因的に発現させた組換えＳＰＨＫ２と同様に、細胞内在性のＳＰＨＫ２も核に局在化するか否か調べた。この問題に取り組むために、抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いて、ＨｅＬａ細胞の核抽出物から細胞内在性のＳＰＨＫ２を免疫沈降し、その活性を解析した。具体的には以下のように行った。
まず、免疫源ペプチド１５μｇ／ｍｌの存在下／非存在下にて、抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いて、精製した核抽出画分の細胞内在性のＳＰＨＫ２を免疫沈降した。免沈した沈殿物を洗浄し、ＳＰＨＫ２活性を測定した。なお、細胞内在性のＳＰＨＫ２は１．４ｐｍｏｌ ＳＰＰ／ｍｉｎ／ｔｕｂｅであった。その結果を図１０（ａ）に示す。
同図に示すように、免疫源ペプチド存在下で調製した免沈物にはＳＰＰに相当するバンドは見出されない一方、免疫源ペプチド非存在下で調製した免沈物には明確なＳＰＰに相当するバンドが検出された。これは、抗ＳＰＨＫ２抗体に特異的に結合した、精製核抽出画分はＳＰＨＫ２活性を有することを示している。
次に、免疫源ペプチド非存在下で調製した免沈物の分取をさらに抗ｈＳＰＨＫ２抗体を用いた免疫ブロットにより解析した。具体的には、免疫源ペプチドなしで免疫沈降した免沈物、アフィニティ精製したＨＡ−ＳＰＨＫ１、およびＨＡ−ＳＰＨＫ２を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した後、抗ｈＳＰＨＫ２抗体または抗ＳＰＨＫ１抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）にて免疫ブロットした。その結果を図１０（ｂ）に示す。
同図に示すように、核画分の免沈物は約７０ｋＤａのあたりに明確なバンドが検出された。これは、アフィニティ精製された組換えＨＡ−ｈＳＰＨＫ２の位置に相当するものである。この約７０ｋＤａのバンドは、転写後修飾されたタンパク質の存在を表すものとしてしばしば二重バンドとして検出されるものである。また、抗ｈＳＰＨＫ２抗体は、ＨＡ−ＳＰＨＫ１とはクロスリアクトしなかった。免沈物を抗ＳＰＨＫ１抗体で免疫ブロットしたところ、正式なＨＡ−ＳＰＨＫ１またはＨＡ−ＳＰＨＫ２のあたりには免疫反応性のバンドを生じなかった。
これらの結果から、抗ｈＳＰＨＫ２抗体は、細胞内在性のＳＰＨＫ２を特異的に認識するが、ＳＰＨＫ１は認識せず、また精製された核画分は細胞内在性のＳＰＨＫ２を含むことが強く示唆された。この結果を免疫細胞化学的解析によりさらに確認した。
具体的には、抗ｈＳＰＨＫ２抗体でＨｅＬａ細胞を固定化・染色した後、共焦点顕微鏡にて観察した。また、核は、２μｇ／ｍｌのＤＡＰＩにて染色した。その結果を図１０（ｃ）に示す。なお、図中のｂａｒは１０μｍを示す。その結果、同図に示すように、細胞内在性のＳＰＨＫ２は、主に核に局在化し、細胞質には僅かに存在することがわかった。これらの結果は、図１、図８、図９に示す過剰発現させた組換えＳＰＨＫ２の結果と同様であった。
【実施例１１】
続いて、ＳＰＨＫおよび種々の変異体のタンパク質発現および酵素活性について調べた。具体的には、ＣＯＳ７細胞に一過性にｈＳＰＨＫ２、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、ＮＬＳ−ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、またはプラスミドベクターｐＣＭＶ５をトランスフェクトし、形質転換した。２日後に、形質転換細胞の破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＨＡ抗体または抗ＳＰＨＫ２抗体にてイムノブロットした。その結果を図１１（ａ）のインセットに示す。また、細胞破砕物の分取を用いて酵素活性を測定した。その結果を図１１（ａ）にグラフとして示す。
同図に示すように、ベクターのみを形質転換したＣＯＳ７細胞はＳＰＨＫ活性が低かった。その一方、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、ＮＬＳ−ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、またはｈＳＰＨＫ２を形質転換した細胞では、ベクターのみ形質転換した場合に比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＳＰＨＫ活性がそれぞれ６３倍、５３倍、５２倍上昇した。
さらに、精製した完全な核画分を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核へのＳＰＰの蓄積を調べた。具体的には、ＨｅＬａ細胞に一過性にｈＳＰＨＫ２、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、ＮＬＳ−ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１、またはプラスミドベクターｐＣＭＶ５を形質転換した。２日後に形質転換細胞を破砕し、分画した。細胞質画分（Ｃ）および核画分（Ｎ）について、ＳＰＰの蓄積またはＬＤＨ活性を測定した。その結果を図１１（ｂ）に示す。
同図に示すように、ｈＳＰＨＫ２を発現させた細胞では、ＳＰＰは主に核画分に蓄積したが（７５％）、この結果は図９の表に示す形態学的測定と同様の結果であった。一方、ＨＡ−ｍＳＰＨＫ１を発現させた細胞では、以前の報告（Ｏｌｉｖｅｒａ，Ａ．，Ｋｏｈａｍａ，Ｔ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｌ．，Ｎａｖａ，Ｖ．，Ｃｕｖｉｌｌｉｅｒ，Ｏ．，Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７，５４５−５５８）と同様に、ＳＰＰは主に細胞質画分に蓄積した。また、ＮＬＳ−ＳＰＨＫ１を発現させた場合は、はっきりとＳＰＰの蓄積が細胞質画分から核画分へと移っていることがわかる。なお、典型的な細胞質マーカータンパク質であるＬＤＨは核画分ではほとんど検出されていない。また、典型的な核膜マーカーであるｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎは核画分にて検出されている（データ不図示）。
【実施例１２】
次に、異なるエピトープ特異的抗体を用いて、ＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質の細胞内分布を調べた。具体的には、Ｎ末にＨＡタグを付けたＳＰＨＫ２遺伝子（ＨＡ−ＳＰＨＫ２）をＣＯＳ７細胞に導入し、１日後に抗ＨＡ抗体あるいは抗ＳＰＨＫ２抗体を用いて免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果を図１２に示す。
同図のパネルＡ〜Ｃに示すように、抗ＨＡ抗体で染色すると、ＨＡ−ＳＰＨＫ２タンパク質は主に細胞質に顆粒状に或いは細胞膜直下に分布し、核はほとんど染色されないが、抗ＳＰＨＫ２抗体で染色すると、核に最も高密度に分布し、細胞質にも抗ＨＡ抗体で染色したときと同じような分布像が認められた。
このことから核に移行したＨＡ−ＳＰＨＫ２はＮ末のＨＡタグを含む部分が切断され、抗ＨＡ抗体に対する抗原性が消失したことが強く示唆された。因みに、抗ＳＰＨＫ２抗体の認識部位はＳＰＨＫ２の中央部に存在するため、抗原性が保たれていると推測される。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ２を利用した細胞増殖抑制剤、及びその核移行シグナルを持つ融合タンパク質の作製方法、並びに薬剤候補物質のスクリーニング方法等に関するものであり、前述したとおり、各種の細胞培養技術、皮膚組織等の組織作製や器官・臓器の作製に代表される再生医療、モデル動物を用いた実験系などへの利用、さらに、細胞増殖性疾患等の疾患の診断薬や治療薬などに利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【配列表】
【図１】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２タンパク質、またはそのタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ヒト又はマウス由来のスフィンゴシンキナーゼ２を用いることを特徴とする請求の範囲１記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２のアミノ末端側に存在する核移行シグナルをコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求の範囲３記載のオリゴヌクレオチドを用いて、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルと他のタンパク質とを融合させた融合タンパク質を作製する方法。
【請求項５】
請求の範囲４記載の方法によって作製された融合タンパク質。
【請求項６】
請求の範囲５記載の融合タンパク質であって、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルとスフィンゴシンキナーゼ１とを融合させた融合タンパク質。
【請求項７】
請求の範囲６記載の融合タンパク質、またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
スフィンゴシンキナーゼ２の細胞増殖抑制作用を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求の範囲８記載のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を使用することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求の範囲８または９記載のスクリーニング方法により得られた物質を含む薬剤。
【請求項１１】
請求の範囲８記載のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキット。
【請求項１２】
上記スクリーニングキットには、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれることを特徴とする請求の範囲１１記載のスクリーニングキット。
【請求項１】
哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２タンパク質、またはそのタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
ヒト又はマウス由来のスフィンゴシンキナーゼ２を用いることを特徴とする請求の範囲１記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
哺乳類由来のスフィンゴシンキナーゼ２のアミノ末端側に存在する核移行シグナルをコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求の範囲３記載のオリゴヌクレオチドを用いて、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルと他のタンパク質とを融合させた融合タンパク質を作製する方法。
【請求項５】
請求の範囲４記載の方法によって作製された融合タンパク質。
【請求項６】
請求の範囲５記載の融合タンパク質であって、スフィンゴシンキナーゼ２の核移行シグナルとスフィンゴシンキナーゼ１とを融合させた融合タンパク質。
【請求項７】
請求の範囲６記載の融合タンパク質、またはその融合タンパク質をコードする遺伝子を含む細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
スフィンゴシンキナーゼ２の細胞増殖抑制作用を調節する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求の範囲８記載のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子を使用することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求の範囲８または９記載のスクリーニング方法により得られた物質を含む薬剤。
【請求項１１】
請求の範囲８記載のスクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキット。
【請求項１２】
上記スクリーニングキットには、スフィンゴシンキナーゼ２の全長または部分タンパク質、あるいは当該タンパク質の改変体、もしくはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が含まれることを特徴とする請求の範囲１１記載のスクリーニングキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１１０７
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６７１６（Ｐ２００５−５０６７１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６８４８
【国際出願日】平成１５年１２月２５日（２００３．１２．２５）
【出願人】（８００００００５７）財団法人新産業創造研究機構 (99)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６８４８
【国際出願日】平成１５年１２月２５日（２００３．１２．２５）
【出願人】（８００００００５７）財団法人新産業創造研究機構 (99)
【Ｆターム（参考）】
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