タンパク質の単離および精製
宿主細胞において組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現された組換え融合タンパク質を精製するための方法を開示する。この方法では、融合タンパク質を所定の密度を有するＲＰＢＬＡとして発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する。そのホモジネートにおいて異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域を提供する。そのＲＰＢＬＡ低下領域を比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離し、その結果として前記融合タンパク質を精製する。その後、所望により、比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域を集めることができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、組換えタンパク粒様会合体（recombinant protein bodies-like assemblies、ＲＰＢＬＡ）内に蓄積された組換えタンパク質を精製するための方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、所望の組換えタンパク質が濃縮され、他の細胞成分から分離され、容易に回収され得るような密度の差によって他の宿主細胞細胞小器官からの単離を可能にする組換えタンパク粒様会合体内の組換え融合タンパク質の単離を提供する。
【０００２】
背景技術
タンパク粒（ＰＢ）は、タンパク質の蓄積に特化した細胞内小器官（すなわち、膜で囲まれた直径約１〜３ミクロンの大型小胞）である。それらの細胞内小器官は、種子のような一部の特定植物組織で自然形成され、発芽および苗成長のための主要なアミノ酸源として働く。
【０００３】
貯蔵タンパク質は、同時翻訳段階で、シグナルペプチドを介して小胞体（ＥＲ）内腔に挿入され、ＥＲまたは液胞のいずれかにパッケージングされ(Galili et al., 1993 Trends Cell Biol. 3:437-443)、（ＥＲ）由来のタンパク粒（ＰＢ）と呼ばれる特異的細胞小器官が発生するこれらの細胞内区画内またはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）内でマルチマー単位に会合する(Okita and Rogers, 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-350；Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613；Sanderfoot and Raikel, 1999 Plant Cell 11:629-642)。
【０００４】
双子葉植物の貯蔵タンパク質は、主として、７Ｓグロブリンまたはビシリンタイプのタンパク質、１１Ｓグロブリンまたはレグミンタイプのタンパク質などの可溶性タンパク質であり、ＰＳＶ内に他のタンパク質（すなわち、プロテアーゼ阻害薬、タンパク質分解酵素、レクチンなど）、糖類および塩類と一緒に隔離される。
【０００５】
ＰＳＶに対して、ＰＢ（１〜３ミクロン）は、主として、穀類の疎水性の極めて強い貯蔵タンパク質（トウモロコシのゼインおよびコムギのグリアジンなど）であるプロラミン類を隔離するが、他の補助タンパク質は隔離しない(Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613)。
【０００６】
現今、ＥＲ本体を除く植物種子以外の組織でＰＢは見つかっていない。ＥＲ本体は、サイズが小さく（０．２〜０．４μｍ）、通常は発生しないが損傷および昆虫による咀嚼によってのみシロイヌナズナ(Arabidopsis)葉で形成される(Matsushima et al., 2003 Plant J. 33:493-502)。
【０００７】
植物のＰＢ形成、貯蔵タンパク質の会合およびターゲッティングを研究するために、遺伝子工学アプローチが用いられてきた。組換えタンパク質、主に植物貯蔵タンパク質を発現させ、シロイヌナズナおよびタバコ内にパッケージングさせると、（栄養組織として）ＰＢを含んでいなかった植物組織が、これらの細胞小器官を「デノボ」発生させることが分かった(Bagga et al., 1997 Plant Cell 9:1683-1696およびBagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23、および米国特許第５，９９０，３８４号、同第５，２１５，９１２号、および同第５，５８９，６１６号；ならびにGeli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。
【０００８】
トウモロコシβ−ゼインは、トランスジェニックタバコ植物で発現させた場合、葉細胞で新たに形成されたＥＲ由来ＰＢ内で正確にターゲッティングされた(Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23)。シロイヌナズナ植物で発現させたトウモロコシγ−ゼインおよび末端切断型γ−ゼインｃＤＮＡも葉の新規ＥＲ由来ＰＢ内に蓄積する(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。トウモロコシ胚乳で発現されるリジンリッチγ−ゼイン(Torrent et al. 1997 Plant Mol. Biol. 34(1):139-149)は、トウモロコシＰＢ内に蓄積し、内因性ゼインと共局在する。α−ゼイン遺伝子を発現しているトランスジェニックタバコ植物で、α−ゼインではＰＢを形成することができないことが証明された。しかしながら、α−ゼインとγ−ゼインが同時発現される場合には、そのα−ゼインの安定性が高まり、両タンパク質がＥＲ由来のタンパク粒内に共局在した(Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345)。新規ＰＢの形成についても、１０ｋＤａのメチオニンリッチなδ−ゼインで形質転換したトランスジェニックダイズにおいて記載されている(Bagga et al., 2000 Plant Sci. 150:21-28)。
【０００９】
組換え貯蔵タンパク質は、アフリカツメガエル卵母細胞および酵母のような非植物宿主系のＰＢ様細胞小器官内でも会合する。Rosenberg et al., 1993 Plant Physiol 102:61-69 では、酵母におけるコムギγ−グリアジンの発現について報告された。その遺伝子は正確に発現され、そのタンパク質がＥＲ由来のＰＢに蓄積された。Torrent et al., 1994 Planta 192:512-518では、アフリカツメガエル卵母細胞において、γゼインをコードする転写物を卵母細胞にマイクロインジェクションすると、γゼインもＰＢ様細胞小器官に蓄積することが証明された。α−ゼイン(Hurkman et al., 1981 J. Cell Biol. 87:292-299)およびγ−グリアジン(Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450)に関しては、アフリカツメガエル卵母細胞において同様の結果を示している。
【００１０】
バイオテクノロジー（遺伝子工学）の分野の重要な功績の１つが生物を遺伝子操作して、治療用、栄養補給用または工業用のタンパク質を生産することができることである。細菌、酵母、作物および哺乳類細胞培養物の発酵培養液から組換えタンパク質を生産し、回収する方法が、提供されている。宿主細胞におけるタンパク質の発現については様々なアプローチが記載されている。これらのアプローチの最も重要な目的は、タンパク質の発現レベル、タンパク質の安定性およびタンパク質の回収である(Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20: 1001-1014；Evangelista et al., 1998 Biotechnol. Prog. 14:607-614)。
【００１１】
タンパク質の回収に関連する問題を解決できる１つの戦略が分泌である。しかしながら、分泌では発現レベルが低く、産物が不安定なことがある。もう１つの戦略は、細胞内の最も有利な位置での組換えタンパク質の蓄積である。この戦略は、テトラペプチド（ＨＤＥＬ／ＫＤＥＬ）のＣ末端伸長を巧みに操作することにより組換えタンパク質をＥＲに向けることによって広く用いられてきた(Conrad and Fiedler, 1998 Plant Mol. Biol. 38:101-109)。
【００１２】
組換えタンパク質をＥＲに向けるための代替アプローチは、植物貯蔵タンパク質含む融合タンパク質または異種タンパク質と融合された貯蔵タンパク質ドメインであった（ＷＯ２００４００３２０７）。１つの興味深い融合戦略は、植物油体の構成タンパク質であるオレオシンと融合された組換えタンパク質の生産である。油体の特有の性質から、二相系を用いてタンパク質を容易に回収できるという利益が得られる(van Rooijen and Moloney, 1995 Bio/Technology 13:72-77)。
【００１３】
異種タンパク質の植物細胞での発現には成功している（総説 Horn et al., 2004 Plant Cell Rep. 22:711-720；Twyman et al., 2003, Trends in Biotechnology 21:570-578；Ma et al., 1995, Science 268: 716-719；Richter et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18:1167-1171）が、一部において、組換えタンパク質の発現がＥＲ由来のＰＢまたはＰＳＶ（ＰＳＶ）に向けられてきた。Yang et al., 2003 Planta 216:597-603では、グルテリンおよびグロブリン貯蔵タンパク質の種子特異的プロモーターを用いて、イネ種子においてヒトリゾチームを発現させた。免疫細胞化学的結果により、組換えタンパク質がＥＲ−ＰＢに存在し、内因性イネグロブリンおよびグルテリンとともに蓄積することが分かった。トランスジェニックタバコ植物におけるヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂの発現は、イネのグルテリンプロモーターを用いて実施された。Tackaberry et al., 1999 Vaccine 17:3020-3029。最近、Arcalis et al., 2004 Plant Physiology 136:1-10では、イネ種子においてＣ末端伸長（ＫＤＥＬ）を用いてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を発現させている。組換えＨＡＳは、内因性イネ貯蔵タンパク質とともにＰＳＶに蓄積した。
【００１４】
植物をバイオファクトリーとして使用するための１つの障害は、下流プロセスに関してさらに調査を行う必要があることである。植物からのタンパク質の精製は、植物系の複雑性から難題である。抽出物の植物固体は大型で、密度が高く、比較的高い値を示す（９〜２０重量％）（総説 Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014参照）。現今、組換えタンパク質精製技術では、抽出物の浄化、脂質および色素を除去するための溶媒での処理、およびいくつかのイオン交換クロマトグラフィーカラムおよびゲル濾過クロマトグラフィーカラムによるタンパク質またはペプチドの精製が行われている。現行のプロトコールでは、それぞれの植物宿主系および組換えタンパク質に対して特異的な溶媒または水溶液を使用することに頼っている。当技術分野では、形質転換した宿主から組換えタンパク質を回収するための効率的で一般的な手順が必要である。組換えタンパク質が植物宿主において産生して、それらを単離しなければならないという場合に特にこの必要性がある。宿主およびタンパク質が多様であり、それらの間で物理的−化学的特性が異なることから、組換え産物を濃縮し、回収するために効率的な方法が求められた。以下で開示する本発明は、真菌細胞および哺乳類細胞などの非高等植物生物からの組換え発現タンパク質の回収を容易にし、高めるのための１つの手段を提供する。
【００１５】
発明の概要
本発明は、形質転換した宿主から組換えタンパク質を回収するための効率的で一般的な手順または方法を提供する。本明細書において示す解決法は、密度に基づく技術によって、特に、密度クッションまたは密度勾配遠心分離技術によって、思いがけなく高収率で、他の宿主細胞細胞小器官タンパク質からの組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）の単離を行うことができるという発見に基づく。
【００１６】
さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞においてＲＰＢＬＡとして発現される組換え融合タンパク質を精製するための方法を意図する。意図される方法によれば、融合タンパク質をＲＰＢＬＡとして発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する。それらのＲＰＢＬＡは、所定の密度を有しており、その所定の密度は異なる融合タンパク質間で異なるが、分離する特定の融合タンパク質に関しては分かっている。ＲＰＢＬＡのその所定の密度は、一般に、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高く、一般に約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。そのホモジネートにおいて異なる密度の領域が形成され、比較的高濃度(enhanced concentration)のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度(depleted concentration)のＲＰＢＬＡを含む領域が提供される。そのＲＰＢＬＡ低下領域が比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離され、その結果として前記融合タンパク質を精製する。その後、比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域を集めるか、またはＲＰＢＬＡまたはその中の融合タンパク質の単離の前に１以上の試薬で処理するか、もしくは１以上の手順に供することができる。
【００１７】
好ましい実施において、融合タンパク質は、互いに結合している２つのポリペプチド配列を含み、それらの配列において、１つの配列はタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のものであり、一方、もう１つの配列は薬物分子および酵素などのような目的産物の配列である。好ましいタンパク粒誘導配列は、γ−ゼイン、α−ゼインまたはイネプロラミンなどのプロラミン化合物のものである。
【００１８】
本明細書における宿主細胞は、真核細胞（例えば、高等植物、真菌および酵母のもの）、動物細胞（例えば、哺乳類細胞）ならびに藻類細胞である。それらの細胞は、新鮮バイオマスから直接得られるように新鮮細胞であるか、または乾燥バイオマスから得られるように乾燥細胞である；バイオマス、すなわち、生体または細胞から得られる量（例えば、植物葉のような培養培地または生体など）により分かる。
【００１９】
本発明はいくつかの利益と利点を有する。
【００２０】
１つの利益は、本発明を用いることによって、発現産物の密度の差に基づいて、可溶性細胞材料の残りの部分からの発現タンパク質の比較的単純かつ迅速な精製が可能になるということである。
【００２１】
よって、本発明の利点は、本発明が宿主生物および細胞培養物から内因性化合物（すなわち、非組換え産物）を排除するための方法を提供することである。
【００２２】
本発明のもう１つの利益は、本発明が新鮮または乾燥バイオマス（宿主生物）から組換えペプチドまたはタンパク質を精製する信頼できる再現性のある方法を提供することである。
【００２３】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、一般に、形質転換した生物または細胞培養物から目的の組換えタンパク質およびペプチドを単離および精製するための下流プロセスに関する。さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞において組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現され、蓄積する組換え融合タンパク質を精製するための方法を意図する。このＲＰＢＬＡは、細胞内に高密度蓄積物を形成する貯蔵タンパク質ドメインにより誘導される組換え融合タンパク質会合体である。これらの高密度蓄積物はサイトゾル、エンドメンブレン系細胞小器官(endomenbrane system organelles)、ミトコンドリア、プラスチドに蓄積するかまたは分泌される。意図される方法によれば、融合タンパク質をＲＰＢＬＡとして発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する。そのホモジネートは使用するために浄化することが好ましい。そのホモジネートにおいて異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域を提供する。そのＲＰＢＬＡ低下領域を比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離し、その結果として前記融合タンパク質を精製する。その後、比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域を集めるか、またはＲＰＢＬＡもしくはその中の融合タンパク質の単離の前に１以上の試薬で処理するか、もしくは１以上の手順に供することができる。
【００２４】
好ましい実施において、融合タンパク質は、互いに結合している２つのポリペプチド配列を含み、それらの配列において、１つの配列はタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のものであり、一方、もう１つの配列は薬物分子および酵素などのような目的ポリペプチド産物の配列である。好ましいＰＢＩＳは、γ−ゼイン、α−ゼインまたはイネプロラミンなどのプロラミン化合物のものである。
【００２５】
本方法の一態様は、所望の融合タンパク質を組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現させ、蓄積する宿主生物または細胞培養物の水性ホモジネートまたは他の適当な抽出物（本明細書ではまとめてホモジネートと呼ぶ）を提供することを含む。そのホモジネートは、一般に、使用する前に濾過などにより予備浄化（浄化）して、細胞残屑を除去する。融合タンパク質含有タンパク粒様構造（ＲＰＢＬＡ）、脂質、可溶性タンパク質、細胞小器官、糖類、色素およびアルカロイド類を含むホモジネートを直接段階密度勾配にかけ、遠心分離などによりその成分の密度に基づいてそのホモジネートを分離する。遠心分離の間にそのホモジネートにおいて異なる密度の領域が形成され、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域を提供する。所望の融合タンパク質を含有するＲＰＢＬＡは、特定の密度相間で集めることができる。この手順は、約８０％を上回る純度の発現組換え融合タンパク質の約９０％を上回る回収を可能にした。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、好ましくは浄化したホモジネートから、一段階密度クッションによりＲＰＢＬＡを単離するための方法を意図する。この場合、好ましくは浄化したホモジネートを、内因性汚染化合物がその密度クッションを渡らないように特定の密度クッション上に載せ、遠心力で分離し、高密度のＲＰＢＬＡがそのクッションを渡り、それらを集めることができる。そのホモジネートにおいて、先に述べた異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（クッションより下の領域）と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（クッションより上の領域）を提供する。上述のように、組換えタンパク粒様会合体の密度は、クッションのものより高い。
【００２７】
もう１つの実施形態では、好ましくは浄化したホモジネートは、直接、スクロースまたは他の追加される、密度を与える溶質の不在下で遠心力で分離される。この場合も、遠心分離により、そのホモジネートにおいて異なる密度の領域が形成され、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（ペレット）と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（上清）が提供される。その後、ＲＰＢＬＡを分離して、ＲＰＢＬＡを精製し、その結果として融合タンパク質を提供することができる。
【００２８】
本発明は、形質転換宿主細胞で形成された細胞小器官であるＲＰＢＬＡ内で発現された組換えペプチドまたはタンパク質を回収するための方法を提供する。この場合、宿主細胞は、真核細胞（例えば、高等植物、酵母および真菌のもの）、動物細胞（例えば、哺乳類培養細胞、トランスジェニック動物、動物卵などの細胞）ならびに藻類細胞である。それらの細胞は、植物葉または動物などの培養培地または生体から直接得られるように新鮮細胞であるか、または乾燥細胞である。
【００２９】
組換えタンパク粒様会合体は、異なる融合タンパク質によって違った所定の密度を有するが、分離する特定の融合タンパク質に関しては分かっている。ＲＰＢＬＡのその所定の密度は、一般に、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高く、一般に約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。新規ＲＰＢＬＡの高密度は、組換え融合タンパク質の、マルチマーとして会合し、蓄積する一般能力によるものである。
【００３０】
意図されるＲＰＢＬＡは、真核生物において発現させ、一般に、上述のようにそれらの密度により特徴付けられる。高等植物および動物細胞で発現させた場合、ＲＰＢＬＡは、一般に、膜で囲まれた直径約１ミクロン（μ）の球形である。
【００３１】
融合タンパク質は、それらの密度により分離され、それらの密度はトランスフェクトした細胞に存在する他のいずれのタンパク質のものよりも高い傾向がある。密度によるその分離は、一般に、世界を通じて生化学研究室でよく見られるような遠心機を使用することにより行われる。例示的な市販の遠心機は、Beckman社製Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ（商標）モデルＪ−２５であり、以下ではこの遠心機をワンクッション試験および直接遠心分離に使用する。勾配研究では、Beckman社製Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＸＬ−１００Ｋ超遠心機（ローターＳＷ４１Ｔｉ）を使用した。遠心分離は、多くの場合、追加される、塩化セシウムのような塩またはスクロースのような糖などの密度差を与える溶質の存在下で行われる。ホモジネートと密度差を与える溶質は合わさり、ホモジネート−溶質混合物が生じる。
【００３２】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ペプチド結合により目的の産物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）（標的）に連結されたタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）を含んでなるか、または好ましくは、そのようなＰＢＩＳでできている。ＰＢＩＳは、タンパク質の侵入および／またはＲＰＢＬＡの蓄積を媒介するタンパク質またはアミノ酸配列である。ＰＢＩＳの例示的な、限定されない例としては、例えば、プロラミン類または修飾プロラミン類またはプロラミンドメインのように、貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質が挙げられる。プロラミン類については、Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370) :947- 958に概説されている。
【００３３】
トウモロコシ貯蔵タンパク質であるγ−ゼイン（このＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は以下に示す）は、４種類のトウモロコシプロラミンの１つであり、トウモロコシ胚乳における総タンパク質の１０〜１５％である。他の穀類プロラミンとしてのα−およびγ−ゼインは、粗面ＥＲの細胞質側の膜結合ポリソームで生合成され、内腔内に集められた後、ＥＲ由来のＰＢ内に隔離される(Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613；Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234；Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403)。
【００３４】
γ−ゼインは、４つの特徴的などメイン、ｉ）１９アミノ酸のペプチドシグナル、ii）ヘキサペプチド ＰＰＰＶＨＬの８個の単位を含む繰り返しドメイン（配列番号１）（５３ ａａ）、iii）プロリン残基が他のアミノ酸に代わったＰｒｏＸドメイン（２９ ａａ）およびｉｖ）疎水性システインリッチＣ末端ドメイン（１１１ ａａ）、で構成されている。
【００３５】
γ−ゼインがＥＲ由来のタンパク粒（ＰＢ）に会合する能力は、種子に限定されない。実際に、γ−ゼイン遺伝子がトランスジェニックシロイヌナズナ植物で構成的に発現されると、貯蔵タンパク質は葉の葉肉細胞のＥＲ由来の組換えＰＢ内に蓄積した(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。ＥＲ由来のＰＢへのγ−ゼインの蓄積に関与するシグナル（プロラミン類にはＫＤＥＬシグナルはない）を探した際に、タンデムリピートドメインを含むプロリンリッチＮ末端ドメインがＥＲ保持に必要であり、Ｃ末端ドメインがＰＢ形成に関与することが示された。しかしながら、これらのドメインがＰＢ会合を促進する機構はまだ分かっていない。タンパク粒と呼ぶのが適切なのは種子においてのみであり、他の植物器官および非高等植物で生成される類似構造物は、一般に、組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）と呼ばれる。
【００３６】
例示的な、他の有用なプロラミンタイプの配列をそれらのＧｅｎＢａｎｋＩＤとともに以下の表に示す。
【表１】
さらに有用な配列は、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおりに、配列番号２（ＲＸ３タンパク質配列）、配列番号３（α−ゼインタンパク質配列）、配列番号４（イネプロラミンタンパク質配列）などのクエリーを用いて、all non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF（環境サンプルを除く）データベース内のＢＬＡＳＴ検索を行うことによって得られる。
【００３７】
例示的な修飾プロラミンは、（ａ）シグナルペプチド配列、（ｂ）タンパク質γ−ゼインの繰り返しドメイン ヘキサペプチド ＰＰＰＶＨＬ（配列番号１）の１以上のコピーからなる配列（全ドメインには８個のヘキサペプチド単位が含まれる）；および（ｃ）γ−ゼインのＰｒｏＸドメインの全部または一部からなる配列、を含む。例示的な特異的修飾プロラミンとしては、以下でＲ３、ＲＸ３およびＰ４と表示されるポリペプチド（これらのＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列も以下に示す）が挙げられる。
【００３８】
特に好ましいプロラミンとしては、ＷＯ２００４００３２０７に開示されているようなγ−ゼインおよびその構成部分、イネｒＰ１３タンパク質ならびに２２ｋＤａのトウモロコシα−ゼインＮ末端断片が挙げられる。γ−ゼイン（２７ｋＤ）、イネおよびα−ゼインタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は、配列番号５（ＤＮＡ配列）および配列番号６（タンパク質配列）；配列番号７（ＲＸ３ ＤＮＡ配列）および配列番号８（タンパク質配列）；配列番号９（Ｒ３ ＤＮＡ配列）および配列番号１０（タンパク質配列）；配列番号１１（Ｐ４ ＤＮＡ配列）および配列番号１２（タンパク質配列）；配列番号１３（Ｘ１０ ＤＮＡ配列）および配列番号１４（タンパク質配列）において示す。
【００３９】
ｒＰ１３−（タンパク質配列 配列番号１５およびＤＮＡ配列 配列番号１６） クローンと相同の１３ｋＤのイネプロラミン−（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０１６５０４） Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol . Biochem. 60(2):335-337；Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116；Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153；Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52(8):2242-2246；Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol . Biochem. 63(11):1851-1858
２２ａＺｔ（タンパク質配列 配列番号１７およびＤＮＡ配列 配列番号１８）２２ｋＤのトウモロコシα−ゼインＮ末端断片−（ＧｅｎＢａｎｋ Ｖ０１４７５） Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672；Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317；Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22；Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833。
【００４０】
目的のタンパク質の例としては、治療用途、栄養補給用途、生物防除用途または工業的用途を有するいずれものタンパク質、例えば、モノクローナル抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどのようなｍＡｂ）およびそのフラグメント、ワクチン用の抗原（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ；Ｂ型肝炎プレ表面、表面およびコア抗原、胃腸炎 コロナウイルスなど）、ホルモン類（カルシトニン、成長ホルモンなど）、プロテアーゼ阻害薬、抗生物質、コラーゲン、ヒトラクトフェリン、サイトカイン類、工業用酵素（ヒドロラーゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼなど）などが挙げられる。例示的な目的タンパク質の例示的なＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列を示す（タンパク質配列 配列番号１９およびＤＮＡ配列 配列番号２０）
サケカルシトニンＧｅｎｂａｎｋ ＢＡＣ５７４１７
ｈＥＧＦ−（タンパク質配列 配列番号２１およびＤＮＡ配列 配列番号２２）Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＦ８５７９０に基づくシグナルペプチドを含まない構築物
ｈＧＨ−Ｐ０１２４１に基づくシグナルペプチドを含まない構築物（タンパク質配列 配列番号２３ならびに植物の好ましいコドンを用いたＤＮＡ配列 配列番号２４および天然コドンを用いたＤＮＡ配列 配列番号２５）。
【００４１】
もう１つの実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＰＢＩＳの配列および目的産物の配列の他に、スペーサーアミノ酸配列をさらに含んでなる。そのスペーサーアミノ酸配列は、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、そのスペーサーアミノ酸配列はＰＢＩＳと目的産物の間に置かれる。例示的なアミノ酸配列は、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ−−Ｃエンドプロテアーゼ、第Ｘａ因子などのようなプロテアーゼにより切断可能である。あるいは、例えば、メチオニン残基で切断する臭化シアンのような化学試薬により特異的に切断可能なアミノ酸配列がコードされる。
【００４２】
さらなる実施形態では、形質転換目的に使用される核酸配列は、同時譲渡されるＷＯ２００４００３２０７によって開示されるとおりであり、それはＰＢＩＳと目的のポリペプチドの間に切断可能なアミノ酸残基配列を含む。さらに、もう１つの実施形態では、その核酸配列は、ＷＯ２００４００３２０７によって開示されるとおりであるが、切断可能なアミノ酸配列をコードする核酸配列は存在しない。
【００４３】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞系（動物、動物細胞培養物、植物、植物細胞培養物、真菌類または藻類など）を、（ii）目的産物をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列、にインフレームで作動可能に連結された（ｉ）ＰＢＩＳをコードする第１の核酸、を含んでなる核酸配列（すなわち、両方のポリペプチドがそれらの適切なリーディングフレームから発現されるように、ＰＢＩＳをコードする核酸配列は目的のポリペプチドをコードする配列と化学結合されている）で形質転換することを含む方法によって調製される。発現によって、生じた融合タンパク質は、形質転換した宿主系に高密度組換えタンパク粒様会合体として蓄積する。一実施形態では、第１の核酸配列（ｉ）の３’末端は第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結（結合）されている。もう１つの実施形態では、第１の核酸配列（ｉ）の５’末端は第２の核酸配列（ii）の３’末端に連結（結合）されている。もう１つの実施形態では、ＰＢＩＳは貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質、その断片または修飾断片を含んでなる。
【００４４】
もう１つの特定の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞系（動物、動物細胞培養物、植物、植物細胞培養物、真菌類または藻類など）を、既述の核酸配列（ｉ）および（ii）の他に、スペーサーアミノ酸配列をコードするインフレーム核酸配列（iii）を含んでなる核酸配列で形質転換することを含む方法によって調製される。そのスペーサーアミノ酸配列は、先に述べたように、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。１つの特定の実施形態では、核酸配列（iii）は、前記核酸配列（ｉ）と（ii）の間に位置しており、例えば、第３の核酸配列（iii）の３’末端は第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結されている。もう１つの実施形態では、第３の核酸配列（iii）の５’末端は第２の核酸配列（ii）の３’末端に連結されている。
【００４５】
本明細書において、用語 植物宿主細胞とは、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む植物、具体的に言えば、穀類（例えば、トウモロコシ、イネ、オートムギなど）、マメ科植物（例えば、ダイズなど）、アブラナ科植物（例えば、Arabidopsis thaliana、ナタネなど）およびナス科植物（例えば、ジャガイモ、トマト、タバコなど）を含む。
【００４６】
植物宿主系は植物細胞も包含する。植物細胞としては、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子が挙げられる。植物宿主細胞系は、様々な成熟段階にある可能性があり、液体培養または固体培養において、あるいはポット、温室または圃場において土壌または好適な培地で生育させることができる。植物宿主細胞系での発現は、一過性または永久的である。植物宿主細胞系は、上述のような植物、種子、自家受粉または雑種後代、有性生殖または無性生殖によって生じた胎芽、およびこれらのいずれもの子孫（挿し穂または種子など）の任意のクローンも意味する。
【００４７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いた植物細胞の形質転換は、一般に、双子葉植物で行うことが最もよい。単子葉植物は、通常、プロトプラストの、いわゆる直接遺伝子導入により形質転換することが最も簡単である。直接遺伝子導入は、通常、エレクトロポレーション(electroportation)により、ポリエチレングリコール媒介導入または必要とされるＤＮＡを運ぶマイクロプロジェクタイルによる細胞衝撃により行われる。これらのトランスフェクション法については、当技術分野で周知であり、本明細書においてこれ以上記述する必要はない。また、少なくとも(at lest)イネおよびトウモロコシは、アグロバクテリウムにより形質転換できることも知られている。植物組織から所望のタンパク質を得るための技術と同様に、トランスフェクト細胞およびプロトプラストからの全植物体の再生方法についても周知である。米国特許第５，６１８，９８８号および同第５，６７９，８８０号ならびにその中の引例も参照。
【００４８】
意図される方法は、組換え融合タンパク質の回収と可溶化も含む場合がある。従って、例えば、段階密度勾配または一段階密度クッションから集めたＲＰＢＬＡを、還元剤を含む緩衝溶液に懸濁し、遠心分離する。そのペレットを廃棄し、上清から組換えタンパク質を回収して、所望により、古典的なクロマトグラフ法などによりさらに精製する。
【００４９】
さらに詳述しなくとも、当業者ならば、これまでの説明と次の詳細な実施例から本発明を最大限に利用することができると思われる。よって、次の好ましい具体的な実施形態は、単に例示に過ぎず、開示内容の残りの部分を制限するものと決して解釈してはならない。
【００５０】
試験手順
実施例１：植物の形質転換のためのプラスミドの構築
Ｔ２０およびヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）のコード配列は、合成によって得、植物における発現用にそのコドン使用を最適化するために修飾した。
【００５１】
Ｔ２０の３６アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列の一本鎖は、化学的オリゴヌクレオチド合成により得、その配列の５’末端に、第Ｘａ因子特異的切断部位および酵素制限部位に対応する配列を付加した。この合成構築物（配列番号２６）は、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００５２】
さらなるクローニングのために、ＰＣＲにより、制限部位を含む特異的なＴ２０プライマーを用いて、その二本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００５３】
プライマー：
Ｖ２０順方向（配列番号２７）
Ｖ２０逆方向（配列番号２８）
活性ｈＥＧＦの５３アミノ酸をコードする合成遺伝子は、プライマーオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により、２０個の重複塩基を含むおよそ６０個の塩基からなる４オリゴヌクレオチドを用いて得た。合成ｈＥＧＦ ｃＤＮＡには、第Ｘａ因子特異的切断部位に対応する５’リンカー配列を含めた。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００５４】
ＥＧＦ１（配列番号２９）
ＥＧＦ２（配列番号３０）
ＥＧＦ３（配列番号３１）
ＥＧＦ４（配列番号３２）
活性ｈＧＨの１９１アミノ酸をコードする合成遺伝子は、プライマーオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により、２０個の重複塩基を含む約６０個の塩基からなる１５オリゴヌクレオチドを用いて得た。合成ｈＧＨ ｃＤＮＡには、エンテロキナーゼ特異的切断部位に対応する５’リンカー配列を含めた。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００５５】
ｈＧＨ１（配列番号３３）
ｈＧＨ２（配列番号３４）
ｈＧＨ３（配列番号３５）
ｈＧＨ４（配列番号３６）
ｈＧＨ５（配列番号３７）
ｈＧＨ６（配列番号３８）
ｈＧＨ７（配列番号３９）
ｈＧＨ８（配列番号４０）
ｈＧＨ９（配列番号４１）
ｈＧＨ１０（配列番号４２）
ｈＧＨ１１（配列番号４３）
ｈＧＨ１２（配列番号４４）
ｈＧＨ１３（配列番号４５）
ｈＧＨ１４（配列番号４６）
ｈＧＨ１５（配列番号４７）
アガロースゲル(Amersham)から合成Ｔ２０ ｃＤＮＡおよび合成ｈＥＧＦ ｃＤＮＡを精製し、ｐＧＥＭベクター(Promega)にクローニングした。ＢｓｐＨＩおよびＮｃｏＩの付着末端を有するＲＸ３ ｃＤＮＡ断片（γ−ゼインＮ末端ドメインをコードする）を、（特許出願ＷＯ２００４００３２０７に記載のとおり）予めＮｃｏＩで消化しておいたベクターｐＣＫＧＦＰＳ６５Ｃに挿入した(Reichel et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5888-5893)。Ｔ２０およびＥＧＦをコードする配列をＲＸ３配列とインフレームで融合し、その構築物ＲＸ３−Ｔ２０およびＲＸ３−ＥＧＦを、Ｔ２０合成遺伝子およびＥＧＦ合成遺伝子についてのＧＦＰコード配列を置換することにより調製した。
【００５６】
得られた構築物をｐＣＲＸ３Ｔ２０およびｐＣＲＸ３ＥＧＦと名づけ、それらの構築物は、強力な３５Ｓプロモーターとしてタンパク質の転写を指示する核酸配列（配列番号１）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のような翻訳エンハンサー、Ｔ２０コード配列およびＥＧＦコード配列ならびにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３’ポリアデニル化配列を含んでいた。最終的に、ＨｉｎｄIII／ＨｉｎｄIII発現カセットをバイナリーベクターｐＢｉｎ１９に挿入することにより、効率的な植物形質転換ベクターｐ１９ＲＸ３Ｔ２０およびｐ１９ＲＸ３ＥＧＦを得た(Bevan、1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721)。
【００５７】
ｈＧＨをコードするｃＤＮＡをＲＸ３ Ｎ末端γ−ゼインコード配列（特許ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、強力なＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよび３’ｏｃｓターミネーターを含むｐＵＣ１８由来プラスミドに挿入した。対応する融合タンパク質ＲＸ３−ｈＧＨ配列を含むｐＵＣ１８由来プラスミド（ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨと名づけた）の発現カセットをｐＢｉｎ１９バイナリーベクターに導入した(Bevan, 1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721)。
【００５８】
２２ｋＤのαゼイン（２２ａＺ）をコードするｃＤＮＡと１３ｋＤのイネプロラミン（ｒＰ１３）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ、トウモロコシＷ６４Ａおよびセニアライス(Senia rice)栽培品種のｃＤＮＡライブラリーからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。そのＰＣＲ反応に使用したオリゴヌクレオチドは以下であった：
２２ａＺ−５’（配列番号４８）
２２ａＺ−３’（配列番号４９）
イネ１３Ｐｒｏｌ−５’（配列番号５０）
イネ１３Ｐｒｏｌ−３’（配列番号５１）
対応するＰＣＲ断片をｐＣＲIIベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定し、強力なＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＴＥＶ配列および３’ｏｃｓターミネーターを含むｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。ｐＣＲII−ｒＰ１３をＳａｌＩおよびＮｃｏＩにより消化し、同じ酵素により消化しておいたｐＵＣ１８ＲＸ３Ｃｔプラスミド、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨプラスミドおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦプラスミドにクローニングして、それぞれ：ｐＵＣ１８ｒＰ１３Ｃｔ、ｐＵＣ１８ｒＰ１３ｈＧＨおよびｐＵＣ１８ｒＰ１３ＥＧＦを得た。ｐＣＲII−２２ａＺをＳａｌＩ／ＮｃｏＩにより消化し、同じ酵素により消化しておいたｐＵＣ１８ＲＸ３ＣｔプラスミドおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦプラスミドにクローニングして、それぞれ、ｐＵＣ１８２２ａＺｔＣｔおよびｐＵＣ１８２２ａＺｔＥＧＦを得た。また、ｐＣＲII−２２ａＺは、ＳａｌＩ／ＲｃａＩにより消化し、ＳａｌＩ／ＮｃｏＩにより消化しておいたｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨプラスミドにクローニングして、クローンｐＵＣ１８２２ａＺｈＧＨを得た。
【００５９】
最後に、これら総てのｐＵＣ１８由来のベクターをＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩによりｐＣａｍｂｉａ ５３００にクローニングした。
【００６０】
実施例２：動物および酵母細胞の形質転換のためのプラスミドの構築
動物細胞
成熟カルシトニン配列（Ｃｔ、ＷＯ２００４００３２０７）およびＥＧＦ配列に対応する合成遺伝子、ならびにｈＧＨをコードするｃＤＮＡを、ＲＸ３ Ｎ末端γ−ゼインコード配列（特許ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、それらをベクターｐＵＣ１８に導入した。ｐＵＣ１８由来プラスミドｐＵＣ１８ＲＸ３Ｃｔ、ｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（対応する融合タンパク質 ＲＸ３−Ｃｔ配列、ＲＸ３−ＥＧＦ配列およびＲＸ３−ｈＧＨ配列を含む）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を、Ｘｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩで制限したベクターｐｃＤＮＡ３．１−(Invitrogen)に導入した。得られた構築物をｐ３．１ＲＸ３ＣＴ、ｐ３．１ＲＸ３ＥＧＦおよびｐ３．１ＲＸ３ｈＧＨと名づけ、それらの構築物では融合タンパク質配列はＣＭＶプロモーターとターミネーターｐＡ ＢＧＨ下に存在した。
【００６１】
酵母細胞
上記のｐＵＣ１８由来プラスミドのＳａｌＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ制限断片（対応する融合タンパク質 ＲＸ３−ＥＧＦ配列およびＲＸ３−ｈＧＨ配列を含む）を、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）−Ｂａｍ ＨＩで制限したベクター ｐＹＸ２４３(R&D Systems)に導入した。得られた構築物をそれぞれ、ｃ１１７およびｃ１１８と名づけ、それらの構築物では融合タンパク質配列は誘導ＧＡＬプロモーター下に存在した。
【００６２】
実施例３：宿主の形質転換
酵母
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株ｌｅｕ２）は、ＬｉＡｃ法(Ito et al. 1983, J. Bacteriol. 153:163-168)によりプラスミド構築物 ｃ１１７およびｃ１１８で形質転換し、Ｌｅｕ−プレート上で形質転換体を選択した。発現解析は、それらの形質転換体をガラクトース含有培地で増殖させることにより行った。
【００６３】
植物材料
タバコ(Nicotiana tabacum品種 Wisconsin)植物は、in vitro生育箱内で２４〜２６℃にて明期１６時間で生育させた。成体植物は、温室内で１８〜２８℃間にて、湿度を５５〜６５％間に維持し、平均明期１６時間で生育させた。
【００６４】
アグロインフィルトレーション(agroinfiltration) (Vaquero et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96(20):11128-11133；Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108)方法に用いる苗は、上記のin vitro条件において種子から４〜６週間生育させた。
【００６５】
タバコの安定な形質転換
バイナリーベクターをＡ．ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株に導入した。タバコ(Nicotiana tobaccum, W38)葉のディスクを、Draper and Hamil 1988（Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual (Eds. Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R.), Blackwell Scientific Publications）に記載されているとおりに形質転換した。再生した植物を２００ｍｇ／Ｌカナマイシン含有培地で選抜し、温室に移した。導入遺伝子産物レベルが最も高いトランスジェニックタバコ植物を栽培して、Ｔ１およびＴ２世代を得た。
【００６６】
組換えタンパク質レベルは、免疫ブロット法により検出した。タバコ葉からの総タンパク質抽出物をブラッドフォードアッセイにより定量し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ミニトランスブロット電気泳動転写セル(Bio Rad)を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をγ−ゼイン抗血清（希釈１／７０００）とともにインキュベートし(Ludevid et al. 1985, Plant Science 41:41-48)、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（希釈１／１００００、Amersham Pharmacia）とともにインキュベートした。免疫反応バンドは、高感度化学発光法（ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム、Amersham Pharmacia）により検出した。
【００６７】
タバコアグロインフィルトレーション
アグロインフィルトレーション方法に用いる苗は、種子からin vitro生育箱内で２４〜２６℃にて明期１６時間で４〜６週間生育させた。
【００６８】
所望の構築物を含むＡ．ツメファシエンス株ＬＢ４４０４を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／ｌ、酵母抽出物 ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）で、振盪装置（２５０ｒｐｍ）を用いて２８℃にて一晩（約１８時間）生育させた。その後、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）をさらに添加したＬＢ３０ｍｌにアグロバクテリウムを接種した。一晩２８℃で培養した後（約１８時間）、アグロバクテリウム細胞を３０００×ｇにて１０分間遠心分離することにより集め、ＭＥＳ(Sigma Chemical) ４．９ｇ／ｌおよびスクロース３０ｇ／ｌを含有するｐＨ５．８の液体ＭＳ培地１０ｍｌに再懸濁した。アグロインフィルトレーションのために、細菌培養物を最終ＯＤ６００ ０．１に調整した。さらに、細胞培養物にアセトシリンゴンを終濃度０．２ｍＭまで添加し、２８℃にて９０分間インキュベートした。
【００６９】
アグロインフィルトレーションでは、苗をその懸濁液で完全に覆い、真空を５〜６秒間適用した（１００ＫＰａ）。懸濁液を除去し、苗を生育箱内で明期１６時間の下で２４〜２６℃にて４日間維持した。苗材料を回収し、総タンパク質の抽出を、抗γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。
【００７０】
動物細胞の形質転換
構築物 ｐ３．１ＲＸ３．ＥＧＦおよびｐ３．１ＲＸ３．ｈＧＨを、リポフェクタミンに基づくトランスフェクション法(Invitrogen)により２９３Ｔ、Ｃｏｓ１またはＣＨＯ哺乳類培養細胞に導入した。高活性シアン蛍光修飾ＧＦＰ(an enhanced cyan fluorescent modified GFP)の遺伝子配列を含むプラスミド ｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトした細胞を対照として使用した。
【００７１】
実施例４：タバコ葉からのタンパク質の抽出
新鮮植物材料
植物材料（湿潤または乾燥タバコ葉または苗）を液体窒素中で摩砕し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８、２００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびプロテアーゼ阻害薬［１０μＭアプロチニン、１μＭペプスタチン、１００μＭロイペプチン、１００μＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および１００μＭ Ｅ６４(Sigma Chemical)］を含有する抽出バッファーＴでホモジナイズした。そのホモジネートを４℃にて１００００×ｇで３０分間遠心分離して、不溶性材料を除去した。総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ(BioRad)を用いて定量した。
【００７２】
タバコ葉の乾燥およびタンパク質の抽出
成体トランスジェニックタバコ葉および野生型タバコ葉を濾紙中で３７℃の部屋内で２週間乾燥させた。２週間後、葉を細かく切断し、室温にて５ヶ月間保存した。乾燥材料の総可溶性タンパク質を、新鮮材料について記載したように抽出し、ウエスタンブロット法により解析した。
【００７３】
実施例５：ＲＰＢＬＡの調製
ホモジナイゼーション
新鮮および乾燥トランスジェニックタバコ葉およびアグロインフィルトレートした(agroinfiltrated)タバコ苗（一過性形質転換）を、乳鉢と乳棒で０℃にて、１０％スクロースおよびプロテアーゼ阻害薬（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン、Ｅ−６４）を添加したＴｒｉｓ １００ｍＭ ｐＨ８、ＫＣｌ ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ６ｍＭ、ＥＤＴＡ１０ｍＭを含有するＰＢＰ抽出バッファー中で摩砕した。そのホモジネートを、小型ローター（７．５ｍｍ径）を取り付けたポリトロン（ＩＫＡ Ｔ２５ベーシック、２４，０００ｒｐｍ）を用いてさらに氷中で約１０回、３〜４秒間摩砕した。未破壊組織および細胞を除去するために、固体材料を４層のミラクロス（２２〜２４μｍ）(Calbiochem)で濾過することにより除去した。
【００７４】
実施例６：動物細胞からのタンパク質
トランスフェクト細胞を培養プレートからかき取って回収し、それらをホモジナイゼーションＢ培地（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．９％ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害薬）に懸濁した。その懸濁液を、およそ３０回、２３ゲージ針が取り付けられた５ｍｌシリンジに入れ、それを排出した。位相差顕微鏡により細胞破壊をモニタリングした。そのホモジネートを段階スクロース勾配上に載せ、タバコ葉ホモジネートについて記載したように遠心分離した。
【００７５】
一過性にトランスフェクトした細胞における融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼインに対して作製されたγ−ゼイン抗体を用いて、ウエスタンブロット法により解析した。トランスフェクションの４８時間後、総可溶性細胞タンパク質をバッファーＡ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２％２−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害薬）で抽出した。細胞インキュベーション培地のアリコートを沈殿させ、−２０℃にて保存した。等量のトランスフェクト細胞および培地から抽出したタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、免疫検出のためにニトロセルロースシートに移した。
【００７６】
実施例７：不連続勾配による分離
ホモジネートを４℃にて５０×ｇで５分間遠心分離して、浄化済抽出物を得た。不連続スクロース勾配のために、この浄化済ホモジネート（上清）をバッファーＰＢＰ中の２０％−３０％−４２％−５６％（ｗ／ｗ）または４２％−４９％−５６％−６５％（ｗ／ｗ）スクロース２．５ｍｌからなる段階勾配上に層にし、それを水平ローター（ＳＷ４１Ｔｉ）により８０，０００×ｇで４℃にて１２０分間ブレーキなしで遠心分離した（Beckman社製Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＸＬ−１００Ｋ超遠心機）。
【００７７】
その上清画分、界面画分およびペレット画分を集めた。上清画分、界面画分およびペレット画分の等価アリコートを１５％ＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび融合発現タンパク質に対する特異的抗体を用いることによる免疫ブロット法により解析した。タンパク質ＲＸ３−ＥＧＦ、ＲＸ３−Ｔ２０、ＲＸ３−ＣｔおよびＲＸ３−ＩＮＦをγ−ゼイン抗体を用いてウエスタンブロットにより検出した。電気泳動ゲルは、Morrissey et al., 1981 Anal. Biochem. 117:307-310に従って銀染色により解析して、ＰＢ内の組換えタンパク質と汚染タンパク質の濃縮を評価した。
【００７８】
実施例８：一段階クッションによる分離
上記のように調製したホモジネートを、４２％（ｗ／ｗ）スクロースクッション８ｍｌ（１．１８ｇ／ｃｍ３）上で２４，０００ｇで４℃にて１２０分間遠心分離した。上清画分、界面画分およびペレット画分を回収した。ＲＰＢＬＡはクッションの下部に沈殿した。タンパク質解析では、これらの画分の等価アリコートを１５％ＴＣＡで沈殿させ、サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色により解析した。ＰＢ画分に存在する組換えタンパク質を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により検出した。
【００７９】
実施例９：単離ＲＰＢＬＡからの組換えタンパク質の回収
段階スクロース勾配の４２％〜５６％（ｗ／ｗ）界面から単離したまたは４２％（ｗ／ｗ）スクロースの密度クッションにより単離したＲＰＢＬＡを、ＰＢＰバッファーで洗浄し、１６０００×ｇで５分間の短時間の遠心分離より回収した。ＲＰＢＬＡ内に蓄積した組換えタンパク質を、ホウ酸ナトリウム１２．５ｍＭ ｐＨ８、０．１％ＳＤＳおよび２％２−メルカプトエタノールを含有するＳＢバッファー１容量で可溶化した。その溶液を３７℃にて一晩（約１８時間）インキュベートした。一アリコートを室温にて１６０００×ｇで１０分遠心分離し、その上清およびペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより解析して、タンパク質の完全可溶化を評価した。
【００８０】
実施例１０：トランスフェクト酵母細胞からのタンパク質
組換え融合タンパク質を発現しているＳ．セレビシエをペレット化した。解析するために、各インキュベーション培地のアリコートを沈殿させ、−２０℃にて保存した。細胞ペレットも冷凍し、解凍後、ガラスビーズと培地Ｙ（５０ｍＭ ＨＣｌ−Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害薬）を用いる標準的な方法により細胞を破壊した。細胞および培地のいずれもを等量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび組換え発現タンパク質に対する特異的抗体を用いることによる免疫ブロット法により解析した。
【００８１】
形質転換酵母細胞から細胞小器官を単離するために適用される破壊方法は、Zinser et al., 1995 Yeast, 11:493-536に記載されているスフェロプラストの穏やかな溶解に基づくものであった。形質転換酵母培養細胞（ＤＯ６００ およそ０．５）３０ｍＬをペレット化し、１Ｍソルビトールで洗浄し、１００単位／ｍｌのザイモラーゼを含有するスフェロプラスト化バッファー（１Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．５、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノール）１ｍＬに懸濁した。３０℃にて２０〜３０分間、時々ゆっくりと攪拌しながらスフェロプラスト形成を進めた。１０００ｇで６分間遠心沈殿させた後、そのスフェロプラストを、２−メルカプトエタノールを含まないスフェロプラスト化バッファーで洗浄し、氷冷溶解バッファー（０．３Ｍソルビトール、１０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害薬）０．５ｍＬに再懸濁した。氷上で時々ゆっくりと攪拌しながら２０分経過した後、溶解物を終濃度１．０Ｍソルビトールに調整した。その溶解物を段階スクロース勾配上に載せ、タバコ葉ホモジネートについて記載したように遠心分離した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法により解析した。
【００８２】
結果
実施例Ａ：密度勾配によるトランスジェニック植物栄養組織からのＲＰＢＬＡの単離（精製）
ＲＸ３−ＥＧＦ γ−ゼイン由来融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０ γ−ゼイン由来融合タンパク質をコードする遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンスを介してタバコ植物に導入した。形質転換した植物を免疫ブロット法により解析して、組換えタンパク質の発現がより高い植物を決定した。図２Ａは、ＲＸ３ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３Ｔ２０タンパク質の両方のパターンを示している。注目すべきは、両方の組換えタンパク質が総てのトランスジェニック系に正確に蓄積しているように見えることである。主要な下方のバンドはモノマー形態の融合タンパク質に相当し、上方のバンドはそのダイマーに相当する。融合タンパク質は、通常マルチマーとして蓄積し、免疫ブロット法により検出されるモノマーおよびオリゴマーの量は、ジスルフィド結合の減少レベルに依存したものである。
【００８３】
タバコ葉抽出物を密度段階勾配上に載せ、異なる画分における組換えタンパク質の蓄積を免疫ブロット法により解析した（図２Ｂ）。その結果を示した図２Ｂでは、ＲＸ３−ＥＧＦが高密度のＲＰＢＬＡに対応する画分に現れたことが分かる。これらの細胞小器官の大部分は１．２６３２より高い密度を示し（Ｆ５６、レーン６）、それらのうちのかなりの部分は１．３１６３ｇ／ｃｍ３より高い密度を示している（Ｆ６５、レーン７）。ＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質は界面４９％〜５６％スクロースに存在し（レーン１２）、それによりＲＸ３−Ｔ２０を含むＲＰＢＬＡの密度が１．２２４１ｇ／ｃｍ３より高く、それらのうちのかなりの部分は１．２６３２より密度が高いことが分かり、かなりの割合で密度が１．２６３２より高かった（レーン１３）。
【００８４】
タバコ葉において形成されたこれらの新規ＲＰＢＬＡは、天然トウモロコシタンパク粒の範囲の密度を示す(Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234；Lending et al., 1989 Plant Cell 1:1011-1023)か、またはさらに高い密度である。ＲＸ３−Ｔ２０ ＰＢは、ＲＸ３−ＥＧＦ ＰＢよりも幾分（わずかに）密度が低く、これは目的のタンパク質のいくつかの特有の性質に起因すると考えられるということにも注目すべきである。よって、組換え融合タンパク質が蓄積しているＲＰＢＬＡは、通常存在する可溶性細胞部分と比べて高い密度を有しているが、ＲＸ３ドメインと融合されたタンパク質の特徴によってそのような密度の変化が起こり得る。
【００８５】
高密度のＲＰＢＬＡ画分およびペレットにおいて両方の組換えタンパク質が９０％を上回る割合で回収されると概算された（図２Ｂ参照）。このように、ＲＰＢＬＡの密度による単離は、融合タンパク質を精製（濃縮）するのに有用な系であると思われる。
【００８６】
ＲＰＢＬＡの単離により組換えタンパク質ＲＸ３−ＥＧＦの精製を評価するために、異なる密度画分を銀染色により解析した（図２Ｃ）。染色したゲルより分かるように、タバコ内因性タンパク質の９０％を上回る割合のものが勾配の可溶性画分（Ｓ）および界面画分（Ｆ４２２およびＦ４９）に位置しており、それらの画分ではＲＸ３−ＥＧＦタンパク質が存在しなかったかまたはほとんど検出されなかった（図２Ｂ参照）。このようなことから、勾配の１または２画分（Ｆ５６およびＦ６５）を選択することにより、可溶性タンパク質とより密度の低い細胞小器官に存在するタンパク質の大半を廃棄することができた。
【００８７】
ＲＰＢＬＡ画分（Ｆ５６およびＦ６５）での融合タンパク質の精製の程度に関して、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質はＰＢＬＳ含有画分で検出されたタンパク質のおよそ８０％であると概算された。この結果は、ＲＰＢＬＡ単離手順を用いて、たった一段階の精製で融合タンパク質の重要な濃縮が行えることを示している。
【００８８】
実施例Ｂ：乾燥植物組織から単離したＲＰＢＬＡにおける組換えタンパク質の回収
分子農業において重要な点は、植物バイオマスを保存するための簡単な手段が存在するということである。これに関連して、乾燥させることにより、貯蔵量を減らし、産物を保存するための便宜な方法を提供することができる。それにもかかわらず、乾燥が目的のタンパク質の分解を促進することもよくある。工業的用途では、組換えタンパク質を含むＲＰＢＬＡを単離するために乾燥植物を使用することは大変興味深いことであろう。
【００８９】
上記のようにＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質を蓄積する形質転換タバコ葉を、同様に上記されているように乾燥させた。乾式貯蔵の５ヶ月後、組換えタンパク質の安定性を解析した。等量の湿潤（新鮮）葉組織（Ｗ、レーン１）および乾燥葉組織（Ｄ、レーン２）からのタンパク質抽出物を免疫ブロット法により解析した（図２Ｄ）。図より分かるように、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質は乾燥形質転換植物において安定しており、湿潤植物および乾燥植物において回収された量は同様であった（レーンＷおよびレーンＤを比較）。
【００９０】
段階密度勾配における乾燥葉のホモジネートの融合タンパク質（ＲＸ３ＥＧＦおよびＲＸ３Ｔ２０）の分布を免疫ブロット法により解析した（図２Ｄ、レーン３〜７）。興味深いことに、両方の融合タンパク質は、主として１．１８６８ｇ／ｃｍ３より高い密度を示す高密度構造（Ｆ４２画分）および１．２６３２ｇ／ｃｍ３より高い密度を示す高密度構造（Ｆ５６画分）において回収された。
【００９１】
このように、組換えタンパク質は、乾燥組織からＲＰＢＬＡを単離することにより精製することができ、このことはトランスジェニック植物の採取ならびに組換えタンパク質の抽出および精製は時間とは無関係である可能性があることを示している。これらの結果と一致して、イネ種子においてもγ−ゼイン融合タンパク質がＲＰＢＬＡに蓄積した。
【００９２】
実施例Ｃ：一過性に形質転換したタバコ苗からのＲＰＢＬＡの単離による組換えタンパク質の回収
一過性発現系は、短期間で組換えタンパク質の蓄積挙動を検証するための便宜なツールになり得る。例えば、組換えタンパク質ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−Ｔ２０は、アグロインフィルトレーションにより一過性に形質転換したタバコ苗においても発現され、蓄積した。形質転換苗からのタンパク質抽出物は、免疫ブロット法による解析（図３Ａ）で、安定的に形質転換した植物で観察される特徴的な複雑な電気泳動パターンを示し（図３Ａ、レーン４および図２Ａ、レーン４を比較）、融合タンパク質がこの形質転換方法を用いても正確に会合することが分かる。
【００９３】
分子量が高い方の融合タンパク質、ＲＸ３−ｈＧＨの発現も一過性に形質転換したタバコにおいて解析した（図３Ａ、レーン４）。密度勾配での細胞内分画後、ＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の両方が１．１８６８ｇ／ｃｍ３（Ｆ４２）および１．２６３２ｇ／ｃｍ３（Ｆ５６）より高い密度を示すＲＰＢＬＡ画分に対応する高密度画分において回収された（図３Ｂ、レーン４、レーン５およびレーン９、レーン１０）。このように、一過性発現は、所望の組換えタンパク質を含むＰＢの個々の密度特性を短期間で検証するのに用いることができる。
【００９４】
実施例Ｄ：低速および中速遠心分離による組換えタンパク質の回収
組換えタンパク質を高密度組換えタンパク粒様会合体を介して精製するのに用いる手順を簡易化するために、２つのさらなる代替法を実施した：ｉ）浄化ホモジネートを単一高密度スクロースクッションを用いて遠心分離し（図４Ａ、Ｂ）、ii）浄化ホモジネートを低速遠心分離（すなわち、１０００〜２５００×ｇ、１０分間）で簡単に遠心分離した。前述の結果に一致して、１．１８６８ｇ／ｃｍ３スクロースクッションを用いた遠心分離後に得られたペレットでは、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０タンパク質の両方が（９０％を上回る）高収率で回収された（図４Ａ、レーン４およびレーン６）。さらに、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質の精製は、対応するペレットで汚染タバコ内因性タンパク質がほとんど検出されなかった図４Ｂの銀染色ゲルより分かるように、極めて高率であった（レーン４）。
【００９５】
段階密度勾配と比べた際のこの方法の重要な利点は、組換えタンパク質工業生産のその拡張容易性にある。クッション密度、同様にその粘性および浸透圧などの他の特性は、いずれの場合にも、組換えタンパク質の回収および精製を最適化するために調整することができることにも注目すべきである。
【００９６】
さらに、低速遠心分離（ＬＳＣ）は、融合タンパク質を含むタンパク粒様構造を濃縮し、精製するためにも試みた（図４Ｃ、ＬＳＣ）。その結果は、１０００×ｇ、１０分間経過後に、実質的に総てのＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質がペレットより回収されることを示した（図４Ｃレーン２）。しかし、このペレットに含まれるタンパク質の染色から、その融合タンパク質は、１．１８６８ｇ／ｃｍ３スクロースクッションを用いた遠心分離後に得られたものほど高度に精製されていないことが分かった（図４Ｃ、レーン３およびレーン７を比較）。
【００９７】
その後、低速遠心分離によって得られた最初のペレットを５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有バッファーを用いることにより洗浄した。洗浄後、そのサンプルを１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。興味深いことに、洗浄し、遠心分離した後にはＰ１ペレットに存在する汚染タンパク質の大半が排除され、新たなペレット（Ｐ２、図４Ｃ、レーン９）に高度に濃縮されたＲＸ３−ＥＧＦタンパク質が含まれていた。レーン９のタンパク質は量だけでなくパターンも、スクロースクッションを用いた遠心分離後に得られたペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有バッファーで洗浄した後に得られたもの（図４Ｃ、レーン５）と同様であることが分かる。低速遠心分離による代替法は、融合タンパク質を含む構造の密度の高さに基づいており、スケールアップするために、遠心分離条件を標的に応じて先に最適化することができる。
【００９８】
実施例Ｅ：トランスフェクト動物細胞からのＲＰＢＬＡの単離による組換えタンパク質の回収
貯蔵タンパク質由来の融合タンパク質がトランスフェクト動物細胞においても高密度組換えＰＢ様会合体の形成を誘導するかどうかを確認するために研究に着手した。ホモジナイズしたトランスフェクト哺乳類細胞の細胞小器官の細胞内分布を、段階密度勾配を用いることにより解析した。３つの異なる細胞培養タイプ、２９３Ｔ（ヒト由来）、Ｃｏｓ１（サル由来）およびＣＨＯ（ハムスター由来）を、３つの異なる融合タンパク質、ＲＸ３−Ｃｔ、ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−ｈＧＨをコードするｃＤＮＡを用いることによりトランスフェクトした。ｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトしたＣｏｓ１細胞を対照として使用した。勾配画分を上記のように集め、免疫ブロット法により解析した（図５Ａ）。
【００９９】
トランスフェクト細胞で発現した組換えＲＸ３由来のタンパク質を、γ−ゼイン抗血清を用いることにより検出した。集めた異なる画分における対照ＥＣＧＰの検出は、ウサギで惹起した抗ＧＦＰ抗血清を用いることにより行った。
【０１００】
予想どおりに、可溶性ＥＣＧＰタンパク質は上清画分において回収された（Ｓ、図５Ａ、レーン２）が、界面画分およびペレット画分ではこのタンパク質の痕跡は検出されず、特定の細胞画分が沈降している。これに対して、ＲＸ３ＣＴ、ＲＸ３ＥＧＦおよびＲＸ３ｈＧＨは、主に高密度画分Ｆ３０、Ｆ４２およびＦ５６に存在し（図５Ａ）、γ−ゼイン由来融合タンパク質がこれらの高密度画分（密度 １．１２７０〜１．２６３２ｇ／ｃｍ３）から回収できることが示された。これらの結果は、免疫細胞化学により得られたことと一致し、融合タンパク質はＥＲ内および直径約１〜約１．４ミクロンの組換えタンパク粒様会合体内に位置していた。
【０１０１】
ＲＸ３−Ｃｔトランスフェクト細胞およびＲＸ３−ｈＧＨトランスフェクト細胞の勾配の溶解画分において多量の組換えタンパク質が回収された。これは恐らく、ＥＲ内に含まれるまだ会合していない融合タンパク質を可溶化させるホモジナイゼーション中の過剰の細胞破壊によるものであった。
【０１０２】
低速遠心分離（ＬＳＣ、図５Ｂ）は、ＲＸ３−ＥＧＦを発現しているＣＨＯ細胞のホモジネートを用いることによっても試みた。図５Ｂより分かるように、融合タンパク質の大半が２５００×ｇでのペレットにおいて回収され（レーン２）、融合タンパク質が密度に基づく方法によって回収できる動物細胞の高密度タンパク粒様構造に蓄積することを確認した。
【０１０３】
実施例Ｆ：密度勾配による形質転換酵母からの組換えタンパク質の回収
形質転換酵母における融合タンパク質を含む高密度構造の形成についても段階密度勾配により解析した。ＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、標準的な手順を用いて酵母形質転換ベクターを介してサッカロミセス・セレビシエに導入した。細胞小器官を単離するために適用される破壊方法は、方法において記載したとおり、スフェロプラストの穏やかな溶解に基づくものであった。溶解物を段階スクロース勾配上に載せ、哺乳類細胞またはタバコ葉ホモジネートについて記載したように遠心分離した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法により解析した。
【０１０４】
分画結果は図６に示している。その図からは、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨタンパク質の両方の大部分が勾配の界面Ｆ３０に位置していたことが分かる（図６、レーン４）。この画分は、１．１２７０〜１．１８６８ｇ／ｃｍ３間の密度を有する細胞内構造を含んでいる。上清画分およびＦ２０画分では融合タンパク質がほとんど検出されず、酵母細胞において融合タンパク質が会合することが分かる。酵母細胞はサイズが小型になるため（最大３ミクロン）、植物および動物細胞で観察されるＲＰＢＬＡよりも密度の低い小型のＲＰＢＬＡしか形成しないと考えられる。いずれにせよ、それらは遠心分離により他のほとんどの細胞タンパク質から単離し、精製することができる。
【０１０５】
実施例Ｇ：密度勾配による異なる貯蔵タンパク質ドメインからの融合タンパク質の回収
γ−ゼイン由来の融合タンパク質のそれらの密度特性を介した精製は、他の貯蔵タンパク質由来の融合タンパク質まで拡張可能である。ここで、本発明者らは、１３ｋＤのイネプロラミン（ｒＰ１３）由来の融合タンパク質および２２ｋＤのα−ゼイン（２２ａＺｔ）由来の融合タンパク質が段階スクロース勾配においてＲＰＢＬＡに対応する高密度画分にどのように蓄積するかを示す（図７）。１３ｋＤのイネプロラミン（ｒＰ１３）および２２ｋＤのα−ゼイン［全長型（２２ａＺ）またはＮ末端ドメイン（２２ａＺｔ）］の選択は、それらの間でもＲＸ３ドメインに関しても相同性がないことに基づいたものであった。思いがけなく、どちらの貯蔵タンパク質からも高密度のＲＰＢＬＡが生成され、そのＲＰＢＬＡは段階密度勾配に供した場合にはより密度の高い界面で回収された（図７Ａ）。
【０１０６】
カルシトニン配列を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター下でｒＰ１３配列および２２ａＺｔ配列とインフレームで融合し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入した。タバコ苗を一過性に形質転換し、葉ホモジネートを段階密度勾配に供した。集めた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウサギで惹起した抗カルシトニン抗血清を用いた免疫ブロット法により解析した。
【０１０７】
図７Ａより分かるように（レーン４〜５、およびレーン９〜１０）、ｒＰ１３Ｃｔ融合タンパク質および２２ａＺｔＣｔ融合タンパク質の両方の多くはＦ４２画分およびＦ５６画分に位置し、融合タンパク質の精製のために単離することができる１．１８６８ｇ／ｃｍ３より高い密度を有する組換えＰＢ様会合体が存在することを示した。その結果は、融合タンパク質を含む組換えＰＢ様会合体の密度が融合物に含まれる貯蔵タンパク質の機能によって変動し得ることも示している。
【０１０８】
イネプロラミン（ｒＰ１３−ｈＧＨ）および全長α ゼイン（２２ａＺ−ｈＧＨ）と融合されたｈＧＨを用いてアグロインフィルトレーション研究を行った。この場合も、ＲＰＢＬＡの大部分はＦ４２画分およびＦ５６画分で観察された（７Ａ、レーン４〜５およびレーン９〜１０）が、興味深いことに、今回は一部の会合していない融合タンパク質も上清および低密度の界面で検出された（レーン１〜２およびレーン６〜７）。この結果は、ｒＰ１３および２２ａＺに対するｈＧＨの部分可溶化の影響により説明できる。
【０１０９】
融合タンパク質 ｒＰ１３−ＥＧＦおよび２２ａＺ−ＥＧＦを発現するトランスジェニックタバコ植物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換により作製した。ＥＧＦに対する抗体を用いた免疫ブロット法によって確認される最良の発現体(expressers)と、細胞系統を、同じ構築物でアグロインフィルトレートしたタバコ苗との比較解析に使用した。図７より分かるように（Ａ、レーン４およびレーン９；Ｂ レーン３）、総ての場合において、ＲＰＢＬＡは特異な界面（Ｆ１２）で回収され、ＲＰＢＬＡが極めて密度が高く、同質であることが示唆された。
【０１１０】
これら総ての結果を総合すれば、プロラミン類は、他のタンパク質と融合させた場合であっても、高密度のＲＰＢＬＡを誘導することができることは明らかである。主として、それらの間にほとんど相同性が見られない場合にはそれは思いがけない結果である。さらに、プロラミン類がタンパク粒を安定させるように相互に作用すること、および例えば、α−ゼインの場合のように、それらの一部のものが栄養組織でのみ発現される場合に安定しないことを示すいくつかのデータがある(Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345)。
【０１１１】
実施例Ｈ：単離ＰＢＬＳからの組換えタンパク質の抽出
高密度の組換えＰＢ様会合体を単離することが、トランスジェニック生物から組換えタンパク質を高収率かつ高精製レベルで回収するための有利な方法であることを証明してきた。ここでは、これらの組換えタンパク質を貯蔵細胞小器官から抽出することができることを示す。組換えＰＢＬＡは、いくつかの用途（すなわち、経口ワクチン製剤）に直接使用することができるが、他のいくつかの場合では、精製した組換えタンパク質を処理することが必要になることがある。
【０１１２】
還元剤を含有するバッファー（ホウ酸ナトリウム１２．５ｍＭ ｐＨ８、０．１％ＳＤＳおよび２％２−メルカプトエタノールを含有するＳＢバッファー；処理）中での３７℃にて一晩（約１８時間）のＰＢ画分のインキュベーション後に、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０タンパク質を可溶化した。図８（ＲＸ３−ＥＧＦについてはレーン１〜４、ＲＸ３−Ｔ２０についてはレーン６〜７）より分かるように、抽出された融合タンパク質両方がそれらの可溶形（Ｓ）で回収された。後に、それらの用途に応じて、抽出されたタンパク質はさらなる精製に供するか、または部分的に精製した抽出物として使用することができる。
【０１１３】
本明細書において引用する特許および論文はそれぞれ、引用することにより一部とされる。冠詞「ａ」または「ａｎ」の使用は、１以上を含むよう意図されている。
【０１１４】
上述の説明および実施例は、例示を目的としており、制限するものと解釈してはならない。本発明の精神および範囲内でさらに他の変形が可能であり、当業者ならば容易に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】タバコ植物の一過性（アグロインフィルトレーション）で安定な形質転換において使用したバイナリーベクターの模式図であり、それらのバイナリーベクターを図の上部に示している。図の中央には、酵母形質転換に使用した２種類のベクターを示している。下部には、哺乳類細胞培養物の一過性トランスフェクションに使用したベクターを示している。ＲＸ３、２７ｋＤのγ−ゼインＮ末端ドメイン、２２ａＺ、２２ｋＤのα−ゼイン、２２ａＺｔ、２２ｋＤのα−ゼインＮ末端ドメイン、ｒＰ１３、１３ｋＤのイネプロラミンおよびＣＳ、切断部位。
【図２】４部構成で図を示す、図２Ａ〜図２Ｄ。図２Ａは、トランスジェニックタバコ植物の葉におけるＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の蓄積を示す図である。野生型（ｗｔ）タバコ葉およびトランスジェニックタバコ葉（レーン２およびレーン４）から可溶性タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで解析し、ニトロセルロース膜に移した後、γ−ゼイン抗血清を用いて免疫ブロット解析を行った。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。図２Ｂは、密度勾配画分におけるＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の免疫ブロット解析を示す図である。形質転換したタバコの湿潤（新鮮）葉の浄化ホモジネートを段階スクロース勾配（４２％−４９％−５６％−６５％ｗ／ｗ）上に載せた。ホモジネート画分、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各レーンは全画分の等量に対応する。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ４２、界面 ４２〜４９％ｗ／ｗ；Ｆ４９、界面 ４９〜５６％ｗ／ｗ；Ｆ５６、界面 ５６〜６５％ｗ／ｗ；Ｆ６５、６５％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。図２Ｃは、密度勾配画分における、形質転換タバコ葉においてｐ１９ＲＸ３ＥＧＦによって発現させたＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色解析を示す図である。バッファーＰＢＰによるタバコ湿潤（新鮮）葉の浄化ホモジネートを段階スクロース（４２％−４９％−５６％−６５％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。ホモジネート画分、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の蓄積を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、銀染色により発色させた。各レーンは全画分の等量に対応する。矢印でＲＸ３−ＥＧＦタンパク質を示している。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ４２、界面 ４２〜４９％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４９、界面 ４９〜５６％ｗ／ｗ；Ｆ５６、界面 ５６〜６５％ｗ／ｗ；Ｆ６５、６５％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。図２Ｄは、湿潤および乾燥タバコ葉におけるＲＸ３−Ｔ２０およびＲＸ３−ＥＧＦの蓄積についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットの結果を示す図である。タバコ葉を３７°で１週間乾燥させ、無湿度容器で５ヶ月間保存した。湿潤（Ｗ）および乾燥（Ｄ）形質転換タバコ葉の等量から抽出した可溶性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびγ−ゼイン抗血清を用いた免疫ブロット法により解析した（レーン１およびレーン２）。乾燥サンプルにおける高密度構造内へのＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−Ｔ２０の蓄積を乾燥葉ホモジネートのスクロース勾配（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）による分画によって解析した。上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各画分を等量用いた。Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。
【図３】２部構成で図を示す、図３Ａおよび図３Ｂ。図３Ａは、アグロインフィルトレートしたタバコ苗におけるＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−Ｔ２０の蓄積を示す図である。総可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびγ−ゼイン抗血清を用いた免疫ブロット法により解析した。Ｗｔ＝野生型対照タバコ苗；左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）、ダイマー（Ｄ）およびトリマー（Ｔ）を示している。図３Ｂは、アグロインフィルトレートしたタバコ苗の細胞内分画を示す図である。浄化苗ホモジネートを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。上清画分、界面間画分およびペレット画分におけるＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各レーンには各画分を等量用いた。Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。
【図４】図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃとして３部構成で図を示す。図４Ａは、スクロースクッションを用いて遠心分離した後のＲＸ３−Ｔ２０タンパク質濃度およびＲＸ３−ＥＧＦタンパク質濃度を示す図である。トランスジェニックタバコ葉の浄化ホモジネートをスクロースクッション（４２％ｗ／ｗ）上に載せた。遠心分離後、上清およびペレットにおけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各レーンはそれらの画分の等量に対応する。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｐ、ペレットクッション。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。図４Ｂは、スクロースクッションを用いて遠心分離した後のＲＸ３−ＥＧＦタンパク質の精製を示す図である。トランスジェニックタバコ葉の浄化ホモジネートをスクロースクッション（４２％ｗ／ｗ）上に載せた。遠心分離後、ホモジネート画分、上清画分およびペレット画分のタンパク質パターンを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により解析した。各レーンはそれらの画分の等量に対応する。矢印で、ＲＸ３−ＥＧＦモノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｐ、ペレットクッション。左側に分子量を示している。図４Ｃは、低速遠心分離（ＬＳＣ）後のＲＸ３−ＥＧＦタンパク質濃度と精製を示す図である。ＲＸ３−ＥＧＦを発現しているタバコ葉の浄化ホモジネートを１０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレット（Ｐ１、レーン２）および上清（Ｓ、レーン１）をゲル電気泳動およびγ−ゼイン抗体を用いた免疫ブロット法により解析した。低速遠心分離（ＬＳＣ）によるペレットＰ１を５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝培地で洗浄し、２回目の遠心分離後、ＬＳＣによるＰ１ペレット（レーン７）、洗浄後の上清（Ｗ、レーン８）、最後のペレットＰ２（レーン９）の等量を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により解析した。これらのサンプルを、１回のスクロースクッション遠心分離後に得られたペレットＰ１（レーン３）の等価サンプル（レーン３〜５）と比較し、ＬＳＣペレットと同じ洗浄手順に供した。矢印で、ＲＸ３−ＥＧＦモノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂとして２部構成で図を示す。図５Ａは、トランスフェクト哺乳類細胞に蓄積したＲＸ３−Ｃｔ組換え融合タンパク質、ＲＸ３−ＥＧＦ組換え融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ組換え融合タンパク質の細胞内分布を示す図である。トランスフェクト細胞のホモジネートを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。遠心分離後、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−Ｃｔ融合タンパク質、ＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。ＧＦＰのシアン蛍光変異体であるＥＣＧＰを発現するプラスミド ｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトした細胞を対照として使用し、抗ＧＦＰ抗血清を用いることによりＥＣＧＰを免疫検出した。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。図５Ｂは、低速遠心分離後の、ＣＨＯにより発現されたＲＸ３−ＥＧＦタンパク質濃度を示す図である。ＲＸ３−ＥＧＦを発現しているＣＨＯ細胞のホモジネートを２５００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレット（Ｐ、レーン２）および上清（Ｓ、レーン１）をゲル電気泳動およびγ−ゼイン抗体を用いる免疫ブロット法により解析した。左側に分子量を示している。
【図６】形質転換酵母細胞に蓄積したＲＸ３−ＥＧＦ組換え融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ組換え融合タンパク質の細胞内分布を示す図である。形質転換酵母の溶解されたスフェロプラストを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。遠心分離後、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。Ｈ、溶解スフェロプラストホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。
【図７】図７Ａは、アグロインフィルトレートしたタバコ苗に蓄積した組換え融合タンパク質の細胞内分布を示す図である。浄化苗ホモジネートを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。上清勾配画分、界面勾配画分およびペレット勾配画分におけるｒＰ１３−Ｃｔ融合タンパク質、ｒＰ１３−ＥＧＦ融合タンパク質およびｒＰ１３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、抗カルシトニン抗体、抗ＥＧＦ抗体および抗ｈＧＨ抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。２種類のα−ゼイン遺伝子を用いて等価研究を実施した。カルシトニン（Ｃｔ）およびＥＧＦをαゼインＮ末端ドメイン（２２ａＺｔ）と融合し、ｈＧＨを完全αゼイン遺伝子（２２ａＺ）と融合した。各レーンには各画分を等量用いた。Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。図７Ｂは、トランスジェニックタバコ系の浄化葉ホモジネートを用いて段階スクロース（１０％−４２％−５６％−６２％ｗ／ｗ）勾配上に載せた結果を示す図である。抗ＥＧＦ抗体を用いた免疫ブロットは、各画分の等量についてのｒＰ１３−ＥＧＦおよび２２ａＺｔ−ＥＧＦ分布を示している。Ｓ、上清；Ｆ１０、界面 １０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、界面 ５６％〜６２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ６２、６２％スクロース下でのペレット。
【図８】ＲＰＢＬＡからのＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の回収を示す図である。密度クッションまたは段階勾配から得られたＲＰＢＬＡ画分を還元剤の存在下で再懸濁した。可溶化タンパク質（Ｓ）および非可溶化タンパク質（Ｐ）を、γ−ゼイン抗血清を用いて免疫ブロット法により解析した。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）、ダイマー（Ｄ）およびトリマー（Ｔ）を示している。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、組換えタンパク粒様会合体（recombinant protein bodies-like assemblies、ＲＰＢＬＡ）内に蓄積された組換えタンパク質を精製するための方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、所望の組換えタンパク質が濃縮され、他の細胞成分から分離され、容易に回収され得るような密度の差によって他の宿主細胞細胞小器官からの単離を可能にする組換えタンパク粒様会合体内の組換え融合タンパク質の単離を提供する。
【０００２】
背景技術
タンパク粒（ＰＢ）は、タンパク質の蓄積に特化した細胞内小器官（すなわち、膜で囲まれた直径約１〜３ミクロンの大型小胞）である。それらの細胞内小器官は、種子のような一部の特定植物組織で自然形成され、発芽および苗成長のための主要なアミノ酸源として働く。
【０００３】
貯蔵タンパク質は、同時翻訳段階で、シグナルペプチドを介して小胞体（ＥＲ）内腔に挿入され、ＥＲまたは液胞のいずれかにパッケージングされ(Galili et al., 1993 Trends Cell Biol. 3:437-443)、（ＥＲ）由来のタンパク粒（ＰＢ）と呼ばれる特異的細胞小器官が発生するこれらの細胞内区画内またはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）内でマルチマー単位に会合する(Okita and Rogers, 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-350；Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613；Sanderfoot and Raikel, 1999 Plant Cell 11:629-642)。
【０００４】
双子葉植物の貯蔵タンパク質は、主として、７Ｓグロブリンまたはビシリンタイプのタンパク質、１１Ｓグロブリンまたはレグミンタイプのタンパク質などの可溶性タンパク質であり、ＰＳＶ内に他のタンパク質（すなわち、プロテアーゼ阻害薬、タンパク質分解酵素、レクチンなど）、糖類および塩類と一緒に隔離される。
【０００５】
ＰＳＶに対して、ＰＢ（１〜３ミクロン）は、主として、穀類の疎水性の極めて強い貯蔵タンパク質（トウモロコシのゼインおよびコムギのグリアジンなど）であるプロラミン類を隔離するが、他の補助タンパク質は隔離しない(Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613)。
【０００６】
現今、ＥＲ本体を除く植物種子以外の組織でＰＢは見つかっていない。ＥＲ本体は、サイズが小さく（０．２〜０．４μｍ）、通常は発生しないが損傷および昆虫による咀嚼によってのみシロイヌナズナ(Arabidopsis)葉で形成される(Matsushima et al., 2003 Plant J. 33:493-502)。
【０００７】
植物のＰＢ形成、貯蔵タンパク質の会合およびターゲッティングを研究するために、遺伝子工学アプローチが用いられてきた。組換えタンパク質、主に植物貯蔵タンパク質を発現させ、シロイヌナズナおよびタバコ内にパッケージングさせると、（栄養組織として）ＰＢを含んでいなかった植物組織が、これらの細胞小器官を「デノボ」発生させることが分かった(Bagga et al., 1997 Plant Cell 9:1683-1696およびBagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23、および米国特許第５，９９０，３８４号、同第５，２１５，９１２号、および同第５，５８９，６１６号；ならびにGeli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。
【０００８】
トウモロコシβ−ゼインは、トランスジェニックタバコ植物で発現させた場合、葉細胞で新たに形成されたＥＲ由来ＰＢ内で正確にターゲッティングされた(Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23)。シロイヌナズナ植物で発現させたトウモロコシγ−ゼインおよび末端切断型γ−ゼインｃＤＮＡも葉の新規ＥＲ由来ＰＢ内に蓄積する(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。トウモロコシ胚乳で発現されるリジンリッチγ−ゼイン(Torrent et al. 1997 Plant Mol. Biol. 34(1):139-149)は、トウモロコシＰＢ内に蓄積し、内因性ゼインと共局在する。α−ゼイン遺伝子を発現しているトランスジェニックタバコ植物で、α−ゼインではＰＢを形成することができないことが証明された。しかしながら、α−ゼインとγ−ゼインが同時発現される場合には、そのα−ゼインの安定性が高まり、両タンパク質がＥＲ由来のタンパク粒内に共局在した(Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345)。新規ＰＢの形成についても、１０ｋＤａのメチオニンリッチなδ−ゼインで形質転換したトランスジェニックダイズにおいて記載されている(Bagga et al., 2000 Plant Sci. 150:21-28)。
【０００９】
組換え貯蔵タンパク質は、アフリカツメガエル卵母細胞および酵母のような非植物宿主系のＰＢ様細胞小器官内でも会合する。Rosenberg et al., 1993 Plant Physiol 102:61-69 では、酵母におけるコムギγ−グリアジンの発現について報告された。その遺伝子は正確に発現され、そのタンパク質がＥＲ由来のＰＢに蓄積された。Torrent et al., 1994 Planta 192:512-518では、アフリカツメガエル卵母細胞において、γゼインをコードする転写物を卵母細胞にマイクロインジェクションすると、γゼインもＰＢ様細胞小器官に蓄積することが証明された。α−ゼイン(Hurkman et al., 1981 J. Cell Biol. 87:292-299)およびγ−グリアジン(Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450)に関しては、アフリカツメガエル卵母細胞において同様の結果を示している。
【００１０】
バイオテクノロジー（遺伝子工学）の分野の重要な功績の１つが生物を遺伝子操作して、治療用、栄養補給用または工業用のタンパク質を生産することができることである。細菌、酵母、作物および哺乳類細胞培養物の発酵培養液から組換えタンパク質を生産し、回収する方法が、提供されている。宿主細胞におけるタンパク質の発現については様々なアプローチが記載されている。これらのアプローチの最も重要な目的は、タンパク質の発現レベル、タンパク質の安定性およびタンパク質の回収である(Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20: 1001-1014；Evangelista et al., 1998 Biotechnol. Prog. 14:607-614)。
【００１１】
タンパク質の回収に関連する問題を解決できる１つの戦略が分泌である。しかしながら、分泌では発現レベルが低く、産物が不安定なことがある。もう１つの戦略は、細胞内の最も有利な位置での組換えタンパク質の蓄積である。この戦略は、テトラペプチド（ＨＤＥＬ／ＫＤＥＬ）のＣ末端伸長を巧みに操作することにより組換えタンパク質をＥＲに向けることによって広く用いられてきた(Conrad and Fiedler, 1998 Plant Mol. Biol. 38:101-109)。
【００１２】
組換えタンパク質をＥＲに向けるための代替アプローチは、植物貯蔵タンパク質含む融合タンパク質または異種タンパク質と融合された貯蔵タンパク質ドメインであった（ＷＯ２００４００３２０７）。１つの興味深い融合戦略は、植物油体の構成タンパク質であるオレオシンと融合された組換えタンパク質の生産である。油体の特有の性質から、二相系を用いてタンパク質を容易に回収できるという利益が得られる(van Rooijen and Moloney, 1995 Bio/Technology 13:72-77)。
【００１３】
異種タンパク質の植物細胞での発現には成功している（総説 Horn et al., 2004 Plant Cell Rep. 22:711-720；Twyman et al., 2003, Trends in Biotechnology 21:570-578；Ma et al., 1995, Science 268: 716-719；Richter et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18:1167-1171）が、一部において、組換えタンパク質の発現がＥＲ由来のＰＢまたはＰＳＶ（ＰＳＶ）に向けられてきた。Yang et al., 2003 Planta 216:597-603では、グルテリンおよびグロブリン貯蔵タンパク質の種子特異的プロモーターを用いて、イネ種子においてヒトリゾチームを発現させた。免疫細胞化学的結果により、組換えタンパク質がＥＲ−ＰＢに存在し、内因性イネグロブリンおよびグルテリンとともに蓄積することが分かった。トランスジェニックタバコ植物におけるヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂの発現は、イネのグルテリンプロモーターを用いて実施された。Tackaberry et al., 1999 Vaccine 17:3020-3029。最近、Arcalis et al., 2004 Plant Physiology 136:1-10では、イネ種子においてＣ末端伸長（ＫＤＥＬ）を用いてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を発現させている。組換えＨＡＳは、内因性イネ貯蔵タンパク質とともにＰＳＶに蓄積した。
【００１４】
植物をバイオファクトリーとして使用するための１つの障害は、下流プロセスに関してさらに調査を行う必要があることである。植物からのタンパク質の精製は、植物系の複雑性から難題である。抽出物の植物固体は大型で、密度が高く、比較的高い値を示す（９〜２０重量％）（総説 Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014参照）。現今、組換えタンパク質精製技術では、抽出物の浄化、脂質および色素を除去するための溶媒での処理、およびいくつかのイオン交換クロマトグラフィーカラムおよびゲル濾過クロマトグラフィーカラムによるタンパク質またはペプチドの精製が行われている。現行のプロトコールでは、それぞれの植物宿主系および組換えタンパク質に対して特異的な溶媒または水溶液を使用することに頼っている。当技術分野では、形質転換した宿主から組換えタンパク質を回収するための効率的で一般的な手順が必要である。組換えタンパク質が植物宿主において産生して、それらを単離しなければならないという場合に特にこの必要性がある。宿主およびタンパク質が多様であり、それらの間で物理的−化学的特性が異なることから、組換え産物を濃縮し、回収するために効率的な方法が求められた。以下で開示する本発明は、真菌細胞および哺乳類細胞などの非高等植物生物からの組換え発現タンパク質の回収を容易にし、高めるのための１つの手段を提供する。
【００１５】
発明の概要
本発明は、形質転換した宿主から組換えタンパク質を回収するための効率的で一般的な手順または方法を提供する。本明細書において示す解決法は、密度に基づく技術によって、特に、密度クッションまたは密度勾配遠心分離技術によって、思いがけなく高収率で、他の宿主細胞細胞小器官タンパク質からの組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）の単離を行うことができるという発見に基づく。
【００１６】
さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞においてＲＰＢＬＡとして発現される組換え融合タンパク質を精製するための方法を意図する。意図される方法によれば、融合タンパク質をＲＰＢＬＡとして発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する。それらのＲＰＢＬＡは、所定の密度を有しており、その所定の密度は異なる融合タンパク質間で異なるが、分離する特定の融合タンパク質に関しては分かっている。ＲＰＢＬＡのその所定の密度は、一般に、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高く、一般に約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。そのホモジネートにおいて異なる密度の領域が形成され、比較的高濃度(enhanced concentration)のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度(depleted concentration)のＲＰＢＬＡを含む領域が提供される。そのＲＰＢＬＡ低下領域が比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離され、その結果として前記融合タンパク質を精製する。その後、比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域を集めるか、またはＲＰＢＬＡまたはその中の融合タンパク質の単離の前に１以上の試薬で処理するか、もしくは１以上の手順に供することができる。
【００１７】
好ましい実施において、融合タンパク質は、互いに結合している２つのポリペプチド配列を含み、それらの配列において、１つの配列はタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のものであり、一方、もう１つの配列は薬物分子および酵素などのような目的産物の配列である。好ましいタンパク粒誘導配列は、γ−ゼイン、α−ゼインまたはイネプロラミンなどのプロラミン化合物のものである。
【００１８】
本明細書における宿主細胞は、真核細胞（例えば、高等植物、真菌および酵母のもの）、動物細胞（例えば、哺乳類細胞）ならびに藻類細胞である。それらの細胞は、新鮮バイオマスから直接得られるように新鮮細胞であるか、または乾燥バイオマスから得られるように乾燥細胞である；バイオマス、すなわち、生体または細胞から得られる量（例えば、植物葉のような培養培地または生体など）により分かる。
【００１９】
本発明はいくつかの利益と利点を有する。
【００２０】
１つの利益は、本発明を用いることによって、発現産物の密度の差に基づいて、可溶性細胞材料の残りの部分からの発現タンパク質の比較的単純かつ迅速な精製が可能になるということである。
【００２１】
よって、本発明の利点は、本発明が宿主生物および細胞培養物から内因性化合物（すなわち、非組換え産物）を排除するための方法を提供することである。
【００２２】
本発明のもう１つの利益は、本発明が新鮮または乾燥バイオマス（宿主生物）から組換えペプチドまたはタンパク質を精製する信頼できる再現性のある方法を提供することである。
【００２３】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、一般に、形質転換した生物または細胞培養物から目的の組換えタンパク質およびペプチドを単離および精製するための下流プロセスに関する。さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞において組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現され、蓄積する組換え融合タンパク質を精製するための方法を意図する。このＲＰＢＬＡは、細胞内に高密度蓄積物を形成する貯蔵タンパク質ドメインにより誘導される組換え融合タンパク質会合体である。これらの高密度蓄積物はサイトゾル、エンドメンブレン系細胞小器官(endomenbrane system organelles)、ミトコンドリア、プラスチドに蓄積するかまたは分泌される。意図される方法によれば、融合タンパク質をＲＰＢＬＡとして発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する。そのホモジネートは使用するために浄化することが好ましい。そのホモジネートにおいて異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域を提供する。そのＲＰＢＬＡ低下領域を比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離し、その結果として前記融合タンパク質を精製する。その後、比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域を集めるか、またはＲＰＢＬＡもしくはその中の融合タンパク質の単離の前に１以上の試薬で処理するか、もしくは１以上の手順に供することができる。
【００２４】
好ましい実施において、融合タンパク質は、互いに結合している２つのポリペプチド配列を含み、それらの配列において、１つの配列はタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のものであり、一方、もう１つの配列は薬物分子および酵素などのような目的ポリペプチド産物の配列である。好ましいＰＢＩＳは、γ−ゼイン、α−ゼインまたはイネプロラミンなどのプロラミン化合物のものである。
【００２５】
本方法の一態様は、所望の融合タンパク質を組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現させ、蓄積する宿主生物または細胞培養物の水性ホモジネートまたは他の適当な抽出物（本明細書ではまとめてホモジネートと呼ぶ）を提供することを含む。そのホモジネートは、一般に、使用する前に濾過などにより予備浄化（浄化）して、細胞残屑を除去する。融合タンパク質含有タンパク粒様構造（ＲＰＢＬＡ）、脂質、可溶性タンパク質、細胞小器官、糖類、色素およびアルカロイド類を含むホモジネートを直接段階密度勾配にかけ、遠心分離などによりその成分の密度に基づいてそのホモジネートを分離する。遠心分離の間にそのホモジネートにおいて異なる密度の領域が形成され、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域を提供する。所望の融合タンパク質を含有するＲＰＢＬＡは、特定の密度相間で集めることができる。この手順は、約８０％を上回る純度の発現組換え融合タンパク質の約９０％を上回る回収を可能にした。
【００２６】
本発明のもう１つの態様は、好ましくは浄化したホモジネートから、一段階密度クッションによりＲＰＢＬＡを単離するための方法を意図する。この場合、好ましくは浄化したホモジネートを、内因性汚染化合物がその密度クッションを渡らないように特定の密度クッション上に載せ、遠心力で分離し、高密度のＲＰＢＬＡがそのクッションを渡り、それらを集めることができる。そのホモジネートにおいて、先に述べた異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（クッションより下の領域）と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（クッションより上の領域）を提供する。上述のように、組換えタンパク粒様会合体の密度は、クッションのものより高い。
【００２７】
もう１つの実施形態では、好ましくは浄化したホモジネートは、直接、スクロースまたは他の追加される、密度を与える溶質の不在下で遠心力で分離される。この場合も、遠心分離により、そのホモジネートにおいて異なる密度の領域が形成され、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（ペレット）と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域（上清）が提供される。その後、ＲＰＢＬＡを分離して、ＲＰＢＬＡを精製し、その結果として融合タンパク質を提供することができる。
【００２８】
本発明は、形質転換宿主細胞で形成された細胞小器官であるＲＰＢＬＡ内で発現された組換えペプチドまたはタンパク質を回収するための方法を提供する。この場合、宿主細胞は、真核細胞（例えば、高等植物、酵母および真菌のもの）、動物細胞（例えば、哺乳類培養細胞、トランスジェニック動物、動物卵などの細胞）ならびに藻類細胞である。それらの細胞は、植物葉または動物などの培養培地または生体から直接得られるように新鮮細胞であるか、または乾燥細胞である。
【００２９】
組換えタンパク粒様会合体は、異なる融合タンパク質によって違った所定の密度を有するが、分離する特定の融合タンパク質に関しては分かっている。ＲＰＢＬＡのその所定の密度は、一般に、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高く、一般に約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。新規ＲＰＢＬＡの高密度は、組換え融合タンパク質の、マルチマーとして会合し、蓄積する一般能力によるものである。
【００３０】
意図されるＲＰＢＬＡは、真核生物において発現させ、一般に、上述のようにそれらの密度により特徴付けられる。高等植物および動物細胞で発現させた場合、ＲＰＢＬＡは、一般に、膜で囲まれた直径約１ミクロン（μ）の球形である。
【００３１】
融合タンパク質は、それらの密度により分離され、それらの密度はトランスフェクトした細胞に存在する他のいずれのタンパク質のものよりも高い傾向がある。密度によるその分離は、一般に、世界を通じて生化学研究室でよく見られるような遠心機を使用することにより行われる。例示的な市販の遠心機は、Beckman社製Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ（商標）モデルＪ−２５であり、以下ではこの遠心機をワンクッション試験および直接遠心分離に使用する。勾配研究では、Beckman社製Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＸＬ−１００Ｋ超遠心機（ローターＳＷ４１Ｔｉ）を使用した。遠心分離は、多くの場合、追加される、塩化セシウムのような塩またはスクロースのような糖などの密度差を与える溶質の存在下で行われる。ホモジネートと密度差を与える溶質は合わさり、ホモジネート−溶質混合物が生じる。
【００３２】
特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ペプチド結合により目的の産物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）（標的）に連結されたタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）を含んでなるか、または好ましくは、そのようなＰＢＩＳでできている。ＰＢＩＳは、タンパク質の侵入および／またはＲＰＢＬＡの蓄積を媒介するタンパク質またはアミノ酸配列である。ＰＢＩＳの例示的な、限定されない例としては、例えば、プロラミン類または修飾プロラミン類またはプロラミンドメインのように、貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質が挙げられる。プロラミン類については、Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370) :947- 958に概説されている。
【００３３】
トウモロコシ貯蔵タンパク質であるγ−ゼイン（このＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は以下に示す）は、４種類のトウモロコシプロラミンの１つであり、トウモロコシ胚乳における総タンパク質の１０〜１５％である。他の穀類プロラミンとしてのα−およびγ−ゼインは、粗面ＥＲの細胞質側の膜結合ポリソームで生合成され、内腔内に集められた後、ＥＲ由来のＰＢ内に隔離される(Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613；Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234；Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403)。
【００３４】
γ−ゼインは、４つの特徴的などメイン、ｉ）１９アミノ酸のペプチドシグナル、ii）ヘキサペプチド ＰＰＰＶＨＬの８個の単位を含む繰り返しドメイン（配列番号１）（５３ ａａ）、iii）プロリン残基が他のアミノ酸に代わったＰｒｏＸドメイン（２９ ａａ）およびｉｖ）疎水性システインリッチＣ末端ドメイン（１１１ ａａ）、で構成されている。
【００３５】
γ−ゼインがＥＲ由来のタンパク粒（ＰＢ）に会合する能力は、種子に限定されない。実際に、γ−ゼイン遺伝子がトランスジェニックシロイヌナズナ植物で構成的に発現されると、貯蔵タンパク質は葉の葉肉細胞のＥＲ由来の組換えＰＢ内に蓄積した(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。ＥＲ由来のＰＢへのγ−ゼインの蓄積に関与するシグナル（プロラミン類にはＫＤＥＬシグナルはない）を探した際に、タンデムリピートドメインを含むプロリンリッチＮ末端ドメインがＥＲ保持に必要であり、Ｃ末端ドメインがＰＢ形成に関与することが示された。しかしながら、これらのドメインがＰＢ会合を促進する機構はまだ分かっていない。タンパク粒と呼ぶのが適切なのは種子においてのみであり、他の植物器官および非高等植物で生成される類似構造物は、一般に、組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）と呼ばれる。
【００３６】
例示的な、他の有用なプロラミンタイプの配列をそれらのＧｅｎＢａｎｋＩＤとともに以下の表に示す。
【表１】
さらに有用な配列は、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおりに、配列番号２（ＲＸ３タンパク質配列）、配列番号３（α−ゼインタンパク質配列）、配列番号４（イネプロラミンタンパク質配列）などのクエリーを用いて、all non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF（環境サンプルを除く）データベース内のＢＬＡＳＴ検索を行うことによって得られる。
【００３７】
例示的な修飾プロラミンは、（ａ）シグナルペプチド配列、（ｂ）タンパク質γ−ゼインの繰り返しドメイン ヘキサペプチド ＰＰＰＶＨＬ（配列番号１）の１以上のコピーからなる配列（全ドメインには８個のヘキサペプチド単位が含まれる）；および（ｃ）γ−ゼインのＰｒｏＸドメインの全部または一部からなる配列、を含む。例示的な特異的修飾プロラミンとしては、以下でＲ３、ＲＸ３およびＰ４と表示されるポリペプチド（これらのＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列も以下に示す）が挙げられる。
【００３８】
特に好ましいプロラミンとしては、ＷＯ２００４００３２０７に開示されているようなγ−ゼインおよびその構成部分、イネｒＰ１３タンパク質ならびに２２ｋＤａのトウモロコシα−ゼインＮ末端断片が挙げられる。γ−ゼイン（２７ｋＤ）、イネおよびα−ゼインタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は、配列番号５（ＤＮＡ配列）および配列番号６（タンパク質配列）；配列番号７（ＲＸ３ ＤＮＡ配列）および配列番号８（タンパク質配列）；配列番号９（Ｒ３ ＤＮＡ配列）および配列番号１０（タンパク質配列）；配列番号１１（Ｐ４ ＤＮＡ配列）および配列番号１２（タンパク質配列）；配列番号１３（Ｘ１０ ＤＮＡ配列）および配列番号１４（タンパク質配列）において示す。
【００３９】
ｒＰ１３−（タンパク質配列 配列番号１５およびＤＮＡ配列 配列番号１６） クローンと相同の１３ｋＤのイネプロラミン−（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０１６５０４） Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol . Biochem. 60(2):335-337；Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116；Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153；Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52(8):2242-2246；Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol . Biochem. 63(11):1851-1858
２２ａＺｔ（タンパク質配列 配列番号１７およびＤＮＡ配列 配列番号１８）２２ｋＤのトウモロコシα−ゼインＮ末端断片−（ＧｅｎＢａｎｋ Ｖ０１４７５） Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672；Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317；Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22；Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833。
【００４０】
目的のタンパク質の例としては、治療用途、栄養補給用途、生物防除用途または工業的用途を有するいずれものタンパク質、例えば、モノクローナル抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどのようなｍＡｂ）およびそのフラグメント、ワクチン用の抗原（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ；Ｂ型肝炎プレ表面、表面およびコア抗原、胃腸炎 コロナウイルスなど）、ホルモン類（カルシトニン、成長ホルモンなど）、プロテアーゼ阻害薬、抗生物質、コラーゲン、ヒトラクトフェリン、サイトカイン類、工業用酵素（ヒドロラーゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼなど）などが挙げられる。例示的な目的タンパク質の例示的なＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列を示す（タンパク質配列 配列番号１９およびＤＮＡ配列 配列番号２０）
サケカルシトニンＧｅｎｂａｎｋ ＢＡＣ５７４１７
ｈＥＧＦ−（タンパク質配列 配列番号２１およびＤＮＡ配列 配列番号２２）Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＦ８５７９０に基づくシグナルペプチドを含まない構築物
ｈＧＨ−Ｐ０１２４１に基づくシグナルペプチドを含まない構築物（タンパク質配列 配列番号２３ならびに植物の好ましいコドンを用いたＤＮＡ配列 配列番号２４および天然コドンを用いたＤＮＡ配列 配列番号２５）。
【００４１】
もう１つの実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＰＢＩＳの配列および目的産物の配列の他に、スペーサーアミノ酸配列をさらに含んでなる。そのスペーサーアミノ酸配列は、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、そのスペーサーアミノ酸配列はＰＢＩＳと目的産物の間に置かれる。例示的なアミノ酸配列は、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ−−Ｃエンドプロテアーゼ、第Ｘａ因子などのようなプロテアーゼにより切断可能である。あるいは、例えば、メチオニン残基で切断する臭化シアンのような化学試薬により特異的に切断可能なアミノ酸配列がコードされる。
【００４２】
さらなる実施形態では、形質転換目的に使用される核酸配列は、同時譲渡されるＷＯ２００４００３２０７によって開示されるとおりであり、それはＰＢＩＳと目的のポリペプチドの間に切断可能なアミノ酸残基配列を含む。さらに、もう１つの実施形態では、その核酸配列は、ＷＯ２００４００３２０７によって開示されるとおりであるが、切断可能なアミノ酸配列をコードする核酸配列は存在しない。
【００４３】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞系（動物、動物細胞培養物、植物、植物細胞培養物、真菌類または藻類など）を、（ii）目的産物をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列、にインフレームで作動可能に連結された（ｉ）ＰＢＩＳをコードする第１の核酸、を含んでなる核酸配列（すなわち、両方のポリペプチドがそれらの適切なリーディングフレームから発現されるように、ＰＢＩＳをコードする核酸配列は目的のポリペプチドをコードする配列と化学結合されている）で形質転換することを含む方法によって調製される。発現によって、生じた融合タンパク質は、形質転換した宿主系に高密度組換えタンパク粒様会合体として蓄積する。一実施形態では、第１の核酸配列（ｉ）の３’末端は第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結（結合）されている。もう１つの実施形態では、第１の核酸配列（ｉ）の５’末端は第２の核酸配列（ii）の３’末端に連結（結合）されている。もう１つの実施形態では、ＰＢＩＳは貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質、その断片または修飾断片を含んでなる。
【００４４】
もう１つの特定の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞系（動物、動物細胞培養物、植物、植物細胞培養物、真菌類または藻類など）を、既述の核酸配列（ｉ）および（ii）の他に、スペーサーアミノ酸配列をコードするインフレーム核酸配列（iii）を含んでなる核酸配列で形質転換することを含む方法によって調製される。そのスペーサーアミノ酸配列は、先に述べたように、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。１つの特定の実施形態では、核酸配列（iii）は、前記核酸配列（ｉ）と（ii）の間に位置しており、例えば、第３の核酸配列（iii）の３’末端は第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結されている。もう１つの実施形態では、第３の核酸配列（iii）の５’末端は第２の核酸配列（ii）の３’末端に連結されている。
【００４５】
本明細書において、用語 植物宿主細胞とは、単子葉植物および双子葉植物の両方を含む植物、具体的に言えば、穀類（例えば、トウモロコシ、イネ、オートムギなど）、マメ科植物（例えば、ダイズなど）、アブラナ科植物（例えば、Arabidopsis thaliana、ナタネなど）およびナス科植物（例えば、ジャガイモ、トマト、タバコなど）を含む。
【００４６】
植物宿主系は植物細胞も包含する。植物細胞としては、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子が挙げられる。植物宿主細胞系は、様々な成熟段階にある可能性があり、液体培養または固体培養において、あるいはポット、温室または圃場において土壌または好適な培地で生育させることができる。植物宿主細胞系での発現は、一過性または永久的である。植物宿主細胞系は、上述のような植物、種子、自家受粉または雑種後代、有性生殖または無性生殖によって生じた胎芽、およびこれらのいずれもの子孫（挿し穂または種子など）の任意のクローンも意味する。
【００４７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いた植物細胞の形質転換は、一般に、双子葉植物で行うことが最もよい。単子葉植物は、通常、プロトプラストの、いわゆる直接遺伝子導入により形質転換することが最も簡単である。直接遺伝子導入は、通常、エレクトロポレーション(electroportation)により、ポリエチレングリコール媒介導入または必要とされるＤＮＡを運ぶマイクロプロジェクタイルによる細胞衝撃により行われる。これらのトランスフェクション法については、当技術分野で周知であり、本明細書においてこれ以上記述する必要はない。また、少なくとも(at lest)イネおよびトウモロコシは、アグロバクテリウムにより形質転換できることも知られている。植物組織から所望のタンパク質を得るための技術と同様に、トランスフェクト細胞およびプロトプラストからの全植物体の再生方法についても周知である。米国特許第５，６１８，９８８号および同第５，６７９，８８０号ならびにその中の引例も参照。
【００４８】
意図される方法は、組換え融合タンパク質の回収と可溶化も含む場合がある。従って、例えば、段階密度勾配または一段階密度クッションから集めたＲＰＢＬＡを、還元剤を含む緩衝溶液に懸濁し、遠心分離する。そのペレットを廃棄し、上清から組換えタンパク質を回収して、所望により、古典的なクロマトグラフ法などによりさらに精製する。
【００４９】
さらに詳述しなくとも、当業者ならば、これまでの説明と次の詳細な実施例から本発明を最大限に利用することができると思われる。よって、次の好ましい具体的な実施形態は、単に例示に過ぎず、開示内容の残りの部分を制限するものと決して解釈してはならない。
【００５０】
試験手順
実施例１：植物の形質転換のためのプラスミドの構築
Ｔ２０およびヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）のコード配列は、合成によって得、植物における発現用にそのコドン使用を最適化するために修飾した。
【００５１】
Ｔ２０の３６アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列の一本鎖は、化学的オリゴヌクレオチド合成により得、その配列の５’末端に、第Ｘａ因子特異的切断部位および酵素制限部位に対応する配列を付加した。この合成構築物（配列番号２６）は、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００５２】
さらなるクローニングのために、ＰＣＲにより、制限部位を含む特異的なＴ２０プライマーを用いて、その二本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００５３】
プライマー：
Ｖ２０順方向（配列番号２７）
Ｖ２０逆方向（配列番号２８）
活性ｈＥＧＦの５３アミノ酸をコードする合成遺伝子は、プライマーオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により、２０個の重複塩基を含むおよそ６０個の塩基からなる４オリゴヌクレオチドを用いて得た。合成ｈＥＧＦ ｃＤＮＡには、第Ｘａ因子特異的切断部位に対応する５’リンカー配列を含めた。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００５４】
ＥＧＦ１（配列番号２９）
ＥＧＦ２（配列番号３０）
ＥＧＦ３（配列番号３１）
ＥＧＦ４（配列番号３２）
活性ｈＧＨの１９１アミノ酸をコードする合成遺伝子は、プライマーオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により、２０個の重複塩基を含む約６０個の塩基からなる１５オリゴヌクレオチドを用いて得た。合成ｈＧＨ ｃＤＮＡには、エンテロキナーゼ特異的切断部位に対応する５’リンカー配列を含めた。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００５５】
ｈＧＨ１（配列番号３３）
ｈＧＨ２（配列番号３４）
ｈＧＨ３（配列番号３５）
ｈＧＨ４（配列番号３６）
ｈＧＨ５（配列番号３７）
ｈＧＨ６（配列番号３８）
ｈＧＨ７（配列番号３９）
ｈＧＨ８（配列番号４０）
ｈＧＨ９（配列番号４１）
ｈＧＨ１０（配列番号４２）
ｈＧＨ１１（配列番号４３）
ｈＧＨ１２（配列番号４４）
ｈＧＨ１３（配列番号４５）
ｈＧＨ１４（配列番号４６）
ｈＧＨ１５（配列番号４７）
アガロースゲル(Amersham)から合成Ｔ２０ ｃＤＮＡおよび合成ｈＥＧＦ ｃＤＮＡを精製し、ｐＧＥＭベクター(Promega)にクローニングした。ＢｓｐＨＩおよびＮｃｏＩの付着末端を有するＲＸ３ ｃＤＮＡ断片（γ−ゼインＮ末端ドメインをコードする）を、（特許出願ＷＯ２００４００３２０７に記載のとおり）予めＮｃｏＩで消化しておいたベクターｐＣＫＧＦＰＳ６５Ｃに挿入した(Reichel et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5888-5893)。Ｔ２０およびＥＧＦをコードする配列をＲＸ３配列とインフレームで融合し、その構築物ＲＸ３−Ｔ２０およびＲＸ３−ＥＧＦを、Ｔ２０合成遺伝子およびＥＧＦ合成遺伝子についてのＧＦＰコード配列を置換することにより調製した。
【００５６】
得られた構築物をｐＣＲＸ３Ｔ２０およびｐＣＲＸ３ＥＧＦと名づけ、それらの構築物は、強力な３５Ｓプロモーターとしてタンパク質の転写を指示する核酸配列（配列番号１）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のような翻訳エンハンサー、Ｔ２０コード配列およびＥＧＦコード配列ならびにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３’ポリアデニル化配列を含んでいた。最終的に、ＨｉｎｄIII／ＨｉｎｄIII発現カセットをバイナリーベクターｐＢｉｎ１９に挿入することにより、効率的な植物形質転換ベクターｐ１９ＲＸ３Ｔ２０およびｐ１９ＲＸ３ＥＧＦを得た(Bevan、1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721)。
【００５７】
ｈＧＨをコードするｃＤＮＡをＲＸ３ Ｎ末端γ−ゼインコード配列（特許ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、強力なＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよび３’ｏｃｓターミネーターを含むｐＵＣ１８由来プラスミドに挿入した。対応する融合タンパク質ＲＸ３−ｈＧＨ配列を含むｐＵＣ１８由来プラスミド（ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨと名づけた）の発現カセットをｐＢｉｎ１９バイナリーベクターに導入した(Bevan, 1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721)。
【００５８】
２２ｋＤのαゼイン（２２ａＺ）をコードするｃＤＮＡと１３ｋＤのイネプロラミン（ｒＰ１３）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ、トウモロコシＷ６４Ａおよびセニアライス(Senia rice)栽培品種のｃＤＮＡライブラリーからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。そのＰＣＲ反応に使用したオリゴヌクレオチドは以下であった：
２２ａＺ−５’（配列番号４８）
２２ａＺ−３’（配列番号４９）
イネ１３Ｐｒｏｌ−５’（配列番号５０）
イネ１３Ｐｒｏｌ−３’（配列番号５１）
対応するＰＣＲ断片をｐＣＲIIベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定し、強力なＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ＴＥＶ配列および３’ｏｃｓターミネーターを含むｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。ｐＣＲII−ｒＰ１３をＳａｌＩおよびＮｃｏＩにより消化し、同じ酵素により消化しておいたｐＵＣ１８ＲＸ３Ｃｔプラスミド、ｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨプラスミドおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦプラスミドにクローニングして、それぞれ：ｐＵＣ１８ｒＰ１３Ｃｔ、ｐＵＣ１８ｒＰ１３ｈＧＨおよびｐＵＣ１８ｒＰ１３ＥＧＦを得た。ｐＣＲII−２２ａＺをＳａｌＩ／ＮｃｏＩにより消化し、同じ酵素により消化しておいたｐＵＣ１８ＲＸ３ＣｔプラスミドおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦプラスミドにクローニングして、それぞれ、ｐＵＣ１８２２ａＺｔＣｔおよびｐＵＣ１８２２ａＺｔＥＧＦを得た。また、ｐＣＲII−２２ａＺは、ＳａｌＩ／ＲｃａＩにより消化し、ＳａｌＩ／ＮｃｏＩにより消化しておいたｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨプラスミドにクローニングして、クローンｐＵＣ１８２２ａＺｈＧＨを得た。
【００５９】
最後に、これら総てのｐＵＣ１８由来のベクターをＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩによりｐＣａｍｂｉａ ５３００にクローニングした。
【００６０】
実施例２：動物および酵母細胞の形質転換のためのプラスミドの構築
動物細胞
成熟カルシトニン配列（Ｃｔ、ＷＯ２００４００３２０７）およびＥＧＦ配列に対応する合成遺伝子、ならびにｈＧＨをコードするｃＤＮＡを、ＲＸ３ Ｎ末端γ−ゼインコード配列（特許ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、それらをベクターｐＵＣ１８に導入した。ｐＵＣ１８由来プラスミドｐＵＣ１８ＲＸ３Ｃｔ、ｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（対応する融合タンパク質 ＲＸ３−Ｃｔ配列、ＲＸ３−ＥＧＦ配列およびＲＸ３−ｈＧＨ配列を含む）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を、Ｘｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩで制限したベクターｐｃＤＮＡ３．１−(Invitrogen)に導入した。得られた構築物をｐ３．１ＲＸ３ＣＴ、ｐ３．１ＲＸ３ＥＧＦおよびｐ３．１ＲＸ３ｈＧＨと名づけ、それらの構築物では融合タンパク質配列はＣＭＶプロモーターとターミネーターｐＡ ＢＧＨ下に存在した。
【００６１】
酵母細胞
上記のｐＵＣ１８由来プラスミドのＳａｌＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ制限断片（対応する融合タンパク質 ＲＸ３−ＥＧＦ配列およびＲＸ３−ｈＧＨ配列を含む）を、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）−Ｂａｍ ＨＩで制限したベクター ｐＹＸ２４３(R&D Systems)に導入した。得られた構築物をそれぞれ、ｃ１１７およびｃ１１８と名づけ、それらの構築物では融合タンパク質配列は誘導ＧＡＬプロモーター下に存在した。
【００６２】
実施例３：宿主の形質転換
酵母
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株ｌｅｕ２）は、ＬｉＡｃ法(Ito et al. 1983, J. Bacteriol. 153:163-168)によりプラスミド構築物 ｃ１１７およびｃ１１８で形質転換し、Ｌｅｕ−プレート上で形質転換体を選択した。発現解析は、それらの形質転換体をガラクトース含有培地で増殖させることにより行った。
【００６３】
植物材料
タバコ(Nicotiana tabacum品種 Wisconsin)植物は、in vitro生育箱内で２４〜２６℃にて明期１６時間で生育させた。成体植物は、温室内で１８〜２８℃間にて、湿度を５５〜６５％間に維持し、平均明期１６時間で生育させた。
【００６４】
アグロインフィルトレーション(agroinfiltration) (Vaquero et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96(20):11128-11133；Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108)方法に用いる苗は、上記のin vitro条件において種子から４〜６週間生育させた。
【００６５】
タバコの安定な形質転換
バイナリーベクターをＡ．ツメファシエンスのＬＢＡ４４０４株に導入した。タバコ(Nicotiana tobaccum, W38)葉のディスクを、Draper and Hamil 1988（Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual (Eds. Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R.), Blackwell Scientific Publications）に記載されているとおりに形質転換した。再生した植物を２００ｍｇ／Ｌカナマイシン含有培地で選抜し、温室に移した。導入遺伝子産物レベルが最も高いトランスジェニックタバコ植物を栽培して、Ｔ１およびＴ２世代を得た。
【００６６】
組換えタンパク質レベルは、免疫ブロット法により検出した。タバコ葉からの総タンパク質抽出物をブラッドフォードアッセイにより定量し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ミニトランスブロット電気泳動転写セル(Bio Rad)を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をγ−ゼイン抗血清（希釈１／７０００）とともにインキュベートし(Ludevid et al. 1985, Plant Science 41:41-48)、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（希釈１／１００００、Amersham Pharmacia）とともにインキュベートした。免疫反応バンドは、高感度化学発光法（ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム、Amersham Pharmacia）により検出した。
【００６７】
タバコアグロインフィルトレーション
アグロインフィルトレーション方法に用いる苗は、種子からin vitro生育箱内で２４〜２６℃にて明期１６時間で４〜６週間生育させた。
【００６８】
所望の構築物を含むＡ．ツメファシエンス株ＬＢ４４０４を、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）を添加したＬＢ培地（トリプトン １０ｇ／ｌ、酵母抽出物 ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）で、振盪装置（２５０ｒｐｍ）を用いて２８℃にて一晩（約１８時間）生育させた。その後、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（１００ｍｇ／ｌ）をさらに添加したＬＢ３０ｍｌにアグロバクテリウムを接種した。一晩２８℃で培養した後（約１８時間）、アグロバクテリウム細胞を３０００×ｇにて１０分間遠心分離することにより集め、ＭＥＳ(Sigma Chemical) ４．９ｇ／ｌおよびスクロース３０ｇ／ｌを含有するｐＨ５．８の液体ＭＳ培地１０ｍｌに再懸濁した。アグロインフィルトレーションのために、細菌培養物を最終ＯＤ６００ ０．１に調整した。さらに、細胞培養物にアセトシリンゴンを終濃度０．２ｍＭまで添加し、２８℃にて９０分間インキュベートした。
【００６９】
アグロインフィルトレーションでは、苗をその懸濁液で完全に覆い、真空を５〜６秒間適用した（１００ＫＰａ）。懸濁液を除去し、苗を生育箱内で明期１６時間の下で２４〜２６℃にて４日間維持した。苗材料を回収し、総タンパク質の抽出を、抗γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。
【００７０】
動物細胞の形質転換
構築物 ｐ３．１ＲＸ３．ＥＧＦおよびｐ３．１ＲＸ３．ｈＧＨを、リポフェクタミンに基づくトランスフェクション法(Invitrogen)により２９３Ｔ、Ｃｏｓ１またはＣＨＯ哺乳類培養細胞に導入した。高活性シアン蛍光修飾ＧＦＰ(an enhanced cyan fluorescent modified GFP)の遺伝子配列を含むプラスミド ｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトした細胞を対照として使用した。
【００７１】
実施例４：タバコ葉からのタンパク質の抽出
新鮮植物材料
植物材料（湿潤または乾燥タバコ葉または苗）を液体窒素中で摩砕し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８、２００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびプロテアーゼ阻害薬［１０μＭアプロチニン、１μＭペプスタチン、１００μＭロイペプチン、１００μＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および１００μＭ Ｅ６４(Sigma Chemical)］を含有する抽出バッファーＴでホモジナイズした。そのホモジネートを４℃にて１００００×ｇで３０分間遠心分離して、不溶性材料を除去した。総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を、ブラッドフォードタンパク質アッセイ(BioRad)を用いて定量した。
【００７２】
タバコ葉の乾燥およびタンパク質の抽出
成体トランスジェニックタバコ葉および野生型タバコ葉を濾紙中で３７℃の部屋内で２週間乾燥させた。２週間後、葉を細かく切断し、室温にて５ヶ月間保存した。乾燥材料の総可溶性タンパク質を、新鮮材料について記載したように抽出し、ウエスタンブロット法により解析した。
【００７３】
実施例５：ＲＰＢＬＡの調製
ホモジナイゼーション
新鮮および乾燥トランスジェニックタバコ葉およびアグロインフィルトレートした(agroinfiltrated)タバコ苗（一過性形質転換）を、乳鉢と乳棒で０℃にて、１０％スクロースおよびプロテアーゼ阻害薬（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン、Ｅ−６４）を添加したＴｒｉｓ １００ｍＭ ｐＨ８、ＫＣｌ ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ６ｍＭ、ＥＤＴＡ１０ｍＭを含有するＰＢＰ抽出バッファー中で摩砕した。そのホモジネートを、小型ローター（７．５ｍｍ径）を取り付けたポリトロン（ＩＫＡ Ｔ２５ベーシック、２４，０００ｒｐｍ）を用いてさらに氷中で約１０回、３〜４秒間摩砕した。未破壊組織および細胞を除去するために、固体材料を４層のミラクロス（２２〜２４μｍ）(Calbiochem)で濾過することにより除去した。
【００７４】
実施例６：動物細胞からのタンパク質
トランスフェクト細胞を培養プレートからかき取って回収し、それらをホモジナイゼーションＢ培地（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．９％ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害薬）に懸濁した。その懸濁液を、およそ３０回、２３ゲージ針が取り付けられた５ｍｌシリンジに入れ、それを排出した。位相差顕微鏡により細胞破壊をモニタリングした。そのホモジネートを段階スクロース勾配上に載せ、タバコ葉ホモジネートについて記載したように遠心分離した。
【００７５】
一過性にトランスフェクトした細胞における融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼインに対して作製されたγ−ゼイン抗体を用いて、ウエスタンブロット法により解析した。トランスフェクションの４８時間後、総可溶性細胞タンパク質をバッファーＡ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２％２−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害薬）で抽出した。細胞インキュベーション培地のアリコートを沈殿させ、−２０℃にて保存した。等量のトランスフェクト細胞および培地から抽出したタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、免疫検出のためにニトロセルロースシートに移した。
【００７６】
実施例７：不連続勾配による分離
ホモジネートを４℃にて５０×ｇで５分間遠心分離して、浄化済抽出物を得た。不連続スクロース勾配のために、この浄化済ホモジネート（上清）をバッファーＰＢＰ中の２０％−３０％−４２％−５６％（ｗ／ｗ）または４２％−４９％−５６％−６５％（ｗ／ｗ）スクロース２．５ｍｌからなる段階勾配上に層にし、それを水平ローター（ＳＷ４１Ｔｉ）により８０，０００×ｇで４℃にて１２０分間ブレーキなしで遠心分離した（Beckman社製Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＸＬ−１００Ｋ超遠心機）。
【００７７】
その上清画分、界面画分およびペレット画分を集めた。上清画分、界面画分およびペレット画分の等価アリコートを１５％ＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび融合発現タンパク質に対する特異的抗体を用いることによる免疫ブロット法により解析した。タンパク質ＲＸ３−ＥＧＦ、ＲＸ３−Ｔ２０、ＲＸ３−ＣｔおよびＲＸ３−ＩＮＦをγ−ゼイン抗体を用いてウエスタンブロットにより検出した。電気泳動ゲルは、Morrissey et al., 1981 Anal. Biochem. 117:307-310に従って銀染色により解析して、ＰＢ内の組換えタンパク質と汚染タンパク質の濃縮を評価した。
【００７８】
実施例８：一段階クッションによる分離
上記のように調製したホモジネートを、４２％（ｗ／ｗ）スクロースクッション８ｍｌ（１．１８ｇ／ｃｍ３）上で２４，０００ｇで４℃にて１２０分間遠心分離した。上清画分、界面画分およびペレット画分を回収した。ＲＰＢＬＡはクッションの下部に沈殿した。タンパク質解析では、これらの画分の等価アリコートを１５％ＴＣＡで沈殿させ、サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色により解析した。ＰＢ画分に存在する組換えタンパク質を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により検出した。
【００７９】
実施例９：単離ＲＰＢＬＡからの組換えタンパク質の回収
段階スクロース勾配の４２％〜５６％（ｗ／ｗ）界面から単離したまたは４２％（ｗ／ｗ）スクロースの密度クッションにより単離したＲＰＢＬＡを、ＰＢＰバッファーで洗浄し、１６０００×ｇで５分間の短時間の遠心分離より回収した。ＲＰＢＬＡ内に蓄積した組換えタンパク質を、ホウ酸ナトリウム１２．５ｍＭ ｐＨ８、０．１％ＳＤＳおよび２％２−メルカプトエタノールを含有するＳＢバッファー１容量で可溶化した。その溶液を３７℃にて一晩（約１８時間）インキュベートした。一アリコートを室温にて１６０００×ｇで１０分遠心分離し、その上清およびペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより解析して、タンパク質の完全可溶化を評価した。
【００８０】
実施例１０：トランスフェクト酵母細胞からのタンパク質
組換え融合タンパク質を発現しているＳ．セレビシエをペレット化した。解析するために、各インキュベーション培地のアリコートを沈殿させ、−２０℃にて保存した。細胞ペレットも冷凍し、解凍後、ガラスビーズと培地Ｙ（５０ｍＭ ＨＣｌ−Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害薬）を用いる標準的な方法により細胞を破壊した。細胞および培地のいずれもを等量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび組換え発現タンパク質に対する特異的抗体を用いることによる免疫ブロット法により解析した。
【００８１】
形質転換酵母細胞から細胞小器官を単離するために適用される破壊方法は、Zinser et al., 1995 Yeast, 11:493-536に記載されているスフェロプラストの穏やかな溶解に基づくものであった。形質転換酵母培養細胞（ＤＯ６００ およそ０．５）３０ｍＬをペレット化し、１Ｍソルビトールで洗浄し、１００単位／ｍｌのザイモラーゼを含有するスフェロプラスト化バッファー（１Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．５、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノール）１ｍＬに懸濁した。３０℃にて２０〜３０分間、時々ゆっくりと攪拌しながらスフェロプラスト形成を進めた。１０００ｇで６分間遠心沈殿させた後、そのスフェロプラストを、２−メルカプトエタノールを含まないスフェロプラスト化バッファーで洗浄し、氷冷溶解バッファー（０．３Ｍソルビトール、１０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害薬）０．５ｍＬに再懸濁した。氷上で時々ゆっくりと攪拌しながら２０分経過した後、溶解物を終濃度１．０Ｍソルビトールに調整した。その溶解物を段階スクロース勾配上に載せ、タバコ葉ホモジネートについて記載したように遠心分離した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法により解析した。
【００８２】
結果
実施例Ａ：密度勾配によるトランスジェニック植物栄養組織からのＲＰＢＬＡの単離（精製）
ＲＸ３−ＥＧＦ γ−ゼイン由来融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０ γ−ゼイン由来融合タンパク質をコードする遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンスを介してタバコ植物に導入した。形質転換した植物を免疫ブロット法により解析して、組換えタンパク質の発現がより高い植物を決定した。図２Ａは、ＲＸ３ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３Ｔ２０タンパク質の両方のパターンを示している。注目すべきは、両方の組換えタンパク質が総てのトランスジェニック系に正確に蓄積しているように見えることである。主要な下方のバンドはモノマー形態の融合タンパク質に相当し、上方のバンドはそのダイマーに相当する。融合タンパク質は、通常マルチマーとして蓄積し、免疫ブロット法により検出されるモノマーおよびオリゴマーの量は、ジスルフィド結合の減少レベルに依存したものである。
【００８３】
タバコ葉抽出物を密度段階勾配上に載せ、異なる画分における組換えタンパク質の蓄積を免疫ブロット法により解析した（図２Ｂ）。その結果を示した図２Ｂでは、ＲＸ３−ＥＧＦが高密度のＲＰＢＬＡに対応する画分に現れたことが分かる。これらの細胞小器官の大部分は１．２６３２より高い密度を示し（Ｆ５６、レーン６）、それらのうちのかなりの部分は１．３１６３ｇ／ｃｍ３より高い密度を示している（Ｆ６５、レーン７）。ＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質は界面４９％〜５６％スクロースに存在し（レーン１２）、それによりＲＸ３−Ｔ２０を含むＲＰＢＬＡの密度が１．２２４１ｇ／ｃｍ３より高く、それらのうちのかなりの部分は１．２６３２より密度が高いことが分かり、かなりの割合で密度が１．２６３２より高かった（レーン１３）。
【００８４】
タバコ葉において形成されたこれらの新規ＲＰＢＬＡは、天然トウモロコシタンパク粒の範囲の密度を示す(Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234；Lending et al., 1989 Plant Cell 1:1011-1023)か、またはさらに高い密度である。ＲＸ３−Ｔ２０ ＰＢは、ＲＸ３−ＥＧＦ ＰＢよりも幾分（わずかに）密度が低く、これは目的のタンパク質のいくつかの特有の性質に起因すると考えられるということにも注目すべきである。よって、組換え融合タンパク質が蓄積しているＲＰＢＬＡは、通常存在する可溶性細胞部分と比べて高い密度を有しているが、ＲＸ３ドメインと融合されたタンパク質の特徴によってそのような密度の変化が起こり得る。
【００８５】
高密度のＲＰＢＬＡ画分およびペレットにおいて両方の組換えタンパク質が９０％を上回る割合で回収されると概算された（図２Ｂ参照）。このように、ＲＰＢＬＡの密度による単離は、融合タンパク質を精製（濃縮）するのに有用な系であると思われる。
【００８６】
ＲＰＢＬＡの単離により組換えタンパク質ＲＸ３−ＥＧＦの精製を評価するために、異なる密度画分を銀染色により解析した（図２Ｃ）。染色したゲルより分かるように、タバコ内因性タンパク質の９０％を上回る割合のものが勾配の可溶性画分（Ｓ）および界面画分（Ｆ４２２およびＦ４９）に位置しており、それらの画分ではＲＸ３−ＥＧＦタンパク質が存在しなかったかまたはほとんど検出されなかった（図２Ｂ参照）。このようなことから、勾配の１または２画分（Ｆ５６およびＦ６５）を選択することにより、可溶性タンパク質とより密度の低い細胞小器官に存在するタンパク質の大半を廃棄することができた。
【００８７】
ＲＰＢＬＡ画分（Ｆ５６およびＦ６５）での融合タンパク質の精製の程度に関して、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質はＰＢＬＳ含有画分で検出されたタンパク質のおよそ８０％であると概算された。この結果は、ＲＰＢＬＡ単離手順を用いて、たった一段階の精製で融合タンパク質の重要な濃縮が行えることを示している。
【００８８】
実施例Ｂ：乾燥植物組織から単離したＲＰＢＬＡにおける組換えタンパク質の回収
分子農業において重要な点は、植物バイオマスを保存するための簡単な手段が存在するということである。これに関連して、乾燥させることにより、貯蔵量を減らし、産物を保存するための便宜な方法を提供することができる。それにもかかわらず、乾燥が目的のタンパク質の分解を促進することもよくある。工業的用途では、組換えタンパク質を含むＲＰＢＬＡを単離するために乾燥植物を使用することは大変興味深いことであろう。
【００８９】
上記のようにＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質を蓄積する形質転換タバコ葉を、同様に上記されているように乾燥させた。乾式貯蔵の５ヶ月後、組換えタンパク質の安定性を解析した。等量の湿潤（新鮮）葉組織（Ｗ、レーン１）および乾燥葉組織（Ｄ、レーン２）からのタンパク質抽出物を免疫ブロット法により解析した（図２Ｄ）。図より分かるように、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質は乾燥形質転換植物において安定しており、湿潤植物および乾燥植物において回収された量は同様であった（レーンＷおよびレーンＤを比較）。
【００９０】
段階密度勾配における乾燥葉のホモジネートの融合タンパク質（ＲＸ３ＥＧＦおよびＲＸ３Ｔ２０）の分布を免疫ブロット法により解析した（図２Ｄ、レーン３〜７）。興味深いことに、両方の融合タンパク質は、主として１．１８６８ｇ／ｃｍ３より高い密度を示す高密度構造（Ｆ４２画分）および１．２６３２ｇ／ｃｍ３より高い密度を示す高密度構造（Ｆ５６画分）において回収された。
【００９１】
このように、組換えタンパク質は、乾燥組織からＲＰＢＬＡを単離することにより精製することができ、このことはトランスジェニック植物の採取ならびに組換えタンパク質の抽出および精製は時間とは無関係である可能性があることを示している。これらの結果と一致して、イネ種子においてもγ−ゼイン融合タンパク質がＲＰＢＬＡに蓄積した。
【００９２】
実施例Ｃ：一過性に形質転換したタバコ苗からのＲＰＢＬＡの単離による組換えタンパク質の回収
一過性発現系は、短期間で組換えタンパク質の蓄積挙動を検証するための便宜なツールになり得る。例えば、組換えタンパク質ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−Ｔ２０は、アグロインフィルトレーションにより一過性に形質転換したタバコ苗においても発現され、蓄積した。形質転換苗からのタンパク質抽出物は、免疫ブロット法による解析（図３Ａ）で、安定的に形質転換した植物で観察される特徴的な複雑な電気泳動パターンを示し（図３Ａ、レーン４および図２Ａ、レーン４を比較）、融合タンパク質がこの形質転換方法を用いても正確に会合することが分かる。
【００９３】
分子量が高い方の融合タンパク質、ＲＸ３−ｈＧＨの発現も一過性に形質転換したタバコにおいて解析した（図３Ａ、レーン４）。密度勾配での細胞内分画後、ＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の両方が１．１８６８ｇ／ｃｍ３（Ｆ４２）および１．２６３２ｇ／ｃｍ３（Ｆ５６）より高い密度を示すＲＰＢＬＡ画分に対応する高密度画分において回収された（図３Ｂ、レーン４、レーン５およびレーン９、レーン１０）。このように、一過性発現は、所望の組換えタンパク質を含むＰＢの個々の密度特性を短期間で検証するのに用いることができる。
【００９４】
実施例Ｄ：低速および中速遠心分離による組換えタンパク質の回収
組換えタンパク質を高密度組換えタンパク粒様会合体を介して精製するのに用いる手順を簡易化するために、２つのさらなる代替法を実施した：ｉ）浄化ホモジネートを単一高密度スクロースクッションを用いて遠心分離し（図４Ａ、Ｂ）、ii）浄化ホモジネートを低速遠心分離（すなわち、１０００〜２５００×ｇ、１０分間）で簡単に遠心分離した。前述の結果に一致して、１．１８６８ｇ／ｃｍ３スクロースクッションを用いた遠心分離後に得られたペレットでは、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０タンパク質の両方が（９０％を上回る）高収率で回収された（図４Ａ、レーン４およびレーン６）。さらに、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質の精製は、対応するペレットで汚染タバコ内因性タンパク質がほとんど検出されなかった図４Ｂの銀染色ゲルより分かるように、極めて高率であった（レーン４）。
【００９５】
段階密度勾配と比べた際のこの方法の重要な利点は、組換えタンパク質工業生産のその拡張容易性にある。クッション密度、同様にその粘性および浸透圧などの他の特性は、いずれの場合にも、組換えタンパク質の回収および精製を最適化するために調整することができることにも注目すべきである。
【００９６】
さらに、低速遠心分離（ＬＳＣ）は、融合タンパク質を含むタンパク粒様構造を濃縮し、精製するためにも試みた（図４Ｃ、ＬＳＣ）。その結果は、１０００×ｇ、１０分間経過後に、実質的に総てのＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質がペレットより回収されることを示した（図４Ｃレーン２）。しかし、このペレットに含まれるタンパク質の染色から、その融合タンパク質は、１．１８６８ｇ／ｃｍ３スクロースクッションを用いた遠心分離後に得られたものほど高度に精製されていないことが分かった（図４Ｃ、レーン３およびレーン７を比較）。
【００９７】
その後、低速遠心分離によって得られた最初のペレットを５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有バッファーを用いることにより洗浄した。洗浄後、そのサンプルを１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。興味深いことに、洗浄し、遠心分離した後にはＰ１ペレットに存在する汚染タンパク質の大半が排除され、新たなペレット（Ｐ２、図４Ｃ、レーン９）に高度に濃縮されたＲＸ３−ＥＧＦタンパク質が含まれていた。レーン９のタンパク質は量だけでなくパターンも、スクロースクッションを用いた遠心分離後に得られたペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有バッファーで洗浄した後に得られたもの（図４Ｃ、レーン５）と同様であることが分かる。低速遠心分離による代替法は、融合タンパク質を含む構造の密度の高さに基づいており、スケールアップするために、遠心分離条件を標的に応じて先に最適化することができる。
【００９８】
実施例Ｅ：トランスフェクト動物細胞からのＲＰＢＬＡの単離による組換えタンパク質の回収
貯蔵タンパク質由来の融合タンパク質がトランスフェクト動物細胞においても高密度組換えＰＢ様会合体の形成を誘導するかどうかを確認するために研究に着手した。ホモジナイズしたトランスフェクト哺乳類細胞の細胞小器官の細胞内分布を、段階密度勾配を用いることにより解析した。３つの異なる細胞培養タイプ、２９３Ｔ（ヒト由来）、Ｃｏｓ１（サル由来）およびＣＨＯ（ハムスター由来）を、３つの異なる融合タンパク質、ＲＸ３−Ｃｔ、ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−ｈＧＨをコードするｃＤＮＡを用いることによりトランスフェクトした。ｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトしたＣｏｓ１細胞を対照として使用した。勾配画分を上記のように集め、免疫ブロット法により解析した（図５Ａ）。
【００９９】
トランスフェクト細胞で発現した組換えＲＸ３由来のタンパク質を、γ−ゼイン抗血清を用いることにより検出した。集めた異なる画分における対照ＥＣＧＰの検出は、ウサギで惹起した抗ＧＦＰ抗血清を用いることにより行った。
【０１００】
予想どおりに、可溶性ＥＣＧＰタンパク質は上清画分において回収された（Ｓ、図５Ａ、レーン２）が、界面画分およびペレット画分ではこのタンパク質の痕跡は検出されず、特定の細胞画分が沈降している。これに対して、ＲＸ３ＣＴ、ＲＸ３ＥＧＦおよびＲＸ３ｈＧＨは、主に高密度画分Ｆ３０、Ｆ４２およびＦ５６に存在し（図５Ａ）、γ−ゼイン由来融合タンパク質がこれらの高密度画分（密度 １．１２７０〜１．２６３２ｇ／ｃｍ３）から回収できることが示された。これらの結果は、免疫細胞化学により得られたことと一致し、融合タンパク質はＥＲ内および直径約１〜約１．４ミクロンの組換えタンパク粒様会合体内に位置していた。
【０１０１】
ＲＸ３−Ｃｔトランスフェクト細胞およびＲＸ３−ｈＧＨトランスフェクト細胞の勾配の溶解画分において多量の組換えタンパク質が回収された。これは恐らく、ＥＲ内に含まれるまだ会合していない融合タンパク質を可溶化させるホモジナイゼーション中の過剰の細胞破壊によるものであった。
【０１０２】
低速遠心分離（ＬＳＣ、図５Ｂ）は、ＲＸ３−ＥＧＦを発現しているＣＨＯ細胞のホモジネートを用いることによっても試みた。図５Ｂより分かるように、融合タンパク質の大半が２５００×ｇでのペレットにおいて回収され（レーン２）、融合タンパク質が密度に基づく方法によって回収できる動物細胞の高密度タンパク粒様構造に蓄積することを確認した。
【０１０３】
実施例Ｆ：密度勾配による形質転換酵母からの組換えタンパク質の回収
形質転換酵母における融合タンパク質を含む高密度構造の形成についても段階密度勾配により解析した。ＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、標準的な手順を用いて酵母形質転換ベクターを介してサッカロミセス・セレビシエに導入した。細胞小器官を単離するために適用される破壊方法は、方法において記載したとおり、スフェロプラストの穏やかな溶解に基づくものであった。溶解物を段階スクロース勾配上に載せ、哺乳類細胞またはタバコ葉ホモジネートについて記載したように遠心分離した。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法により解析した。
【０１０４】
分画結果は図６に示している。その図からは、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨタンパク質の両方の大部分が勾配の界面Ｆ３０に位置していたことが分かる（図６、レーン４）。この画分は、１．１２７０〜１．１８６８ｇ／ｃｍ３間の密度を有する細胞内構造を含んでいる。上清画分およびＦ２０画分では融合タンパク質がほとんど検出されず、酵母細胞において融合タンパク質が会合することが分かる。酵母細胞はサイズが小型になるため（最大３ミクロン）、植物および動物細胞で観察されるＲＰＢＬＡよりも密度の低い小型のＲＰＢＬＡしか形成しないと考えられる。いずれにせよ、それらは遠心分離により他のほとんどの細胞タンパク質から単離し、精製することができる。
【０１０５】
実施例Ｇ：密度勾配による異なる貯蔵タンパク質ドメインからの融合タンパク質の回収
γ−ゼイン由来の融合タンパク質のそれらの密度特性を介した精製は、他の貯蔵タンパク質由来の融合タンパク質まで拡張可能である。ここで、本発明者らは、１３ｋＤのイネプロラミン（ｒＰ１３）由来の融合タンパク質および２２ｋＤのα−ゼイン（２２ａＺｔ）由来の融合タンパク質が段階スクロース勾配においてＲＰＢＬＡに対応する高密度画分にどのように蓄積するかを示す（図７）。１３ｋＤのイネプロラミン（ｒＰ１３）および２２ｋＤのα−ゼイン［全長型（２２ａＺ）またはＮ末端ドメイン（２２ａＺｔ）］の選択は、それらの間でもＲＸ３ドメインに関しても相同性がないことに基づいたものであった。思いがけなく、どちらの貯蔵タンパク質からも高密度のＲＰＢＬＡが生成され、そのＲＰＢＬＡは段階密度勾配に供した場合にはより密度の高い界面で回収された（図７Ａ）。
【０１０６】
カルシトニン配列を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター下でｒＰ１３配列および２２ａＺｔ配列とインフレームで融合し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入した。タバコ苗を一過性に形質転換し、葉ホモジネートを段階密度勾配に供した。集めた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウサギで惹起した抗カルシトニン抗血清を用いた免疫ブロット法により解析した。
【０１０７】
図７Ａより分かるように（レーン４〜５、およびレーン９〜１０）、ｒＰ１３Ｃｔ融合タンパク質および２２ａＺｔＣｔ融合タンパク質の両方の多くはＦ４２画分およびＦ５６画分に位置し、融合タンパク質の精製のために単離することができる１．１８６８ｇ／ｃｍ３より高い密度を有する組換えＰＢ様会合体が存在することを示した。その結果は、融合タンパク質を含む組換えＰＢ様会合体の密度が融合物に含まれる貯蔵タンパク質の機能によって変動し得ることも示している。
【０１０８】
イネプロラミン（ｒＰ１３−ｈＧＨ）および全長α ゼイン（２２ａＺ−ｈＧＨ）と融合されたｈＧＨを用いてアグロインフィルトレーション研究を行った。この場合も、ＲＰＢＬＡの大部分はＦ４２画分およびＦ５６画分で観察された（７Ａ、レーン４〜５およびレーン９〜１０）が、興味深いことに、今回は一部の会合していない融合タンパク質も上清および低密度の界面で検出された（レーン１〜２およびレーン６〜７）。この結果は、ｒＰ１３および２２ａＺに対するｈＧＨの部分可溶化の影響により説明できる。
【０１０９】
融合タンパク質 ｒＰ１３−ＥＧＦおよび２２ａＺ−ＥＧＦを発現するトランスジェニックタバコ植物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換により作製した。ＥＧＦに対する抗体を用いた免疫ブロット法によって確認される最良の発現体(expressers)と、細胞系統を、同じ構築物でアグロインフィルトレートしたタバコ苗との比較解析に使用した。図７より分かるように（Ａ、レーン４およびレーン９；Ｂ レーン３）、総ての場合において、ＲＰＢＬＡは特異な界面（Ｆ１２）で回収され、ＲＰＢＬＡが極めて密度が高く、同質であることが示唆された。
【０１１０】
これら総ての結果を総合すれば、プロラミン類は、他のタンパク質と融合させた場合であっても、高密度のＲＰＢＬＡを誘導することができることは明らかである。主として、それらの間にほとんど相同性が見られない場合にはそれは思いがけない結果である。さらに、プロラミン類がタンパク粒を安定させるように相互に作用すること、および例えば、α−ゼインの場合のように、それらの一部のものが栄養組織でのみ発現される場合に安定しないことを示すいくつかのデータがある(Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345)。
【０１１１】
実施例Ｈ：単離ＰＢＬＳからの組換えタンパク質の抽出
高密度の組換えＰＢ様会合体を単離することが、トランスジェニック生物から組換えタンパク質を高収率かつ高精製レベルで回収するための有利な方法であることを証明してきた。ここでは、これらの組換えタンパク質を貯蔵細胞小器官から抽出することができることを示す。組換えＰＢＬＡは、いくつかの用途（すなわち、経口ワクチン製剤）に直接使用することができるが、他のいくつかの場合では、精製した組換えタンパク質を処理することが必要になることがある。
【０１１２】
還元剤を含有するバッファー（ホウ酸ナトリウム１２．５ｍＭ ｐＨ８、０．１％ＳＤＳおよび２％２−メルカプトエタノールを含有するＳＢバッファー；処理）中での３７℃にて一晩（約１８時間）のＰＢ画分のインキュベーション後に、ＲＸ３−ＥＧＦタンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０タンパク質を可溶化した。図８（ＲＸ３−ＥＧＦについてはレーン１〜４、ＲＸ３−Ｔ２０についてはレーン６〜７）より分かるように、抽出された融合タンパク質両方がそれらの可溶形（Ｓ）で回収された。後に、それらの用途に応じて、抽出されたタンパク質はさらなる精製に供するか、または部分的に精製した抽出物として使用することができる。
【０１１３】
本明細書において引用する特許および論文はそれぞれ、引用することにより一部とされる。冠詞「ａ」または「ａｎ」の使用は、１以上を含むよう意図されている。
【０１１４】
上述の説明および実施例は、例示を目的としており、制限するものと解釈してはならない。本発明の精神および範囲内でさらに他の変形が可能であり、当業者ならば容易に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】タバコ植物の一過性（アグロインフィルトレーション）で安定な形質転換において使用したバイナリーベクターの模式図であり、それらのバイナリーベクターを図の上部に示している。図の中央には、酵母形質転換に使用した２種類のベクターを示している。下部には、哺乳類細胞培養物の一過性トランスフェクションに使用したベクターを示している。ＲＸ３、２７ｋＤのγ−ゼインＮ末端ドメイン、２２ａＺ、２２ｋＤのα−ゼイン、２２ａＺｔ、２２ｋＤのα−ゼインＮ末端ドメイン、ｒＰ１３、１３ｋＤのイネプロラミンおよびＣＳ、切断部位。
【図２】４部構成で図を示す、図２Ａ〜図２Ｄ。図２Ａは、トランスジェニックタバコ植物の葉におけるＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の蓄積を示す図である。野生型（ｗｔ）タバコ葉およびトランスジェニックタバコ葉（レーン２およびレーン４）から可溶性タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで解析し、ニトロセルロース膜に移した後、γ−ゼイン抗血清を用いて免疫ブロット解析を行った。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。図２Ｂは、密度勾配画分におけるＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の免疫ブロット解析を示す図である。形質転換したタバコの湿潤（新鮮）葉の浄化ホモジネートを段階スクロース勾配（４２％−４９％−５６％−６５％ｗ／ｗ）上に載せた。ホモジネート画分、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各レーンは全画分の等量に対応する。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ４２、界面 ４２〜４９％ｗ／ｗ；Ｆ４９、界面 ４９〜５６％ｗ／ｗ；Ｆ５６、界面 ５６〜６５％ｗ／ｗ；Ｆ６５、６５％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。図２Ｃは、密度勾配画分における、形質転換タバコ葉においてｐ１９ＲＸ３ＥＧＦによって発現させたＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色解析を示す図である。バッファーＰＢＰによるタバコ湿潤（新鮮）葉の浄化ホモジネートを段階スクロース（４２％−４９％−５６％−６５％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。ホモジネート画分、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の蓄積を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、銀染色により発色させた。各レーンは全画分の等量に対応する。矢印でＲＸ３−ＥＧＦタンパク質を示している。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ４２、界面 ４２〜４９％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４９、界面 ４９〜５６％ｗ／ｗ；Ｆ５６、界面 ５６〜６５％ｗ／ｗ；Ｆ６５、６５％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。図２Ｄは、湿潤および乾燥タバコ葉におけるＲＸ３−Ｔ２０およびＲＸ３−ＥＧＦの蓄積についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットの結果を示す図である。タバコ葉を３７°で１週間乾燥させ、無湿度容器で５ヶ月間保存した。湿潤（Ｗ）および乾燥（Ｄ）形質転換タバコ葉の等量から抽出した可溶性タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルおよびγ−ゼイン抗血清を用いた免疫ブロット法により解析した（レーン１およびレーン２）。乾燥サンプルにおける高密度構造内へのＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−Ｔ２０の蓄積を乾燥葉ホモジネートのスクロース勾配（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）による分画によって解析した。上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各画分を等量用いた。Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。
【図３】２部構成で図を示す、図３Ａおよび図３Ｂ。図３Ａは、アグロインフィルトレートしたタバコ苗におけるＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−Ｔ２０の蓄積を示す図である。総可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびγ−ゼイン抗血清を用いた免疫ブロット法により解析した。Ｗｔ＝野生型対照タバコ苗；左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）、ダイマー（Ｄ）およびトリマー（Ｔ）を示している。図３Ｂは、アグロインフィルトレートしたタバコ苗の細胞内分画を示す図である。浄化苗ホモジネートを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。上清画分、界面間画分およびペレット画分におけるＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各レーンには各画分を等量用いた。Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。
【図４】図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃとして３部構成で図を示す。図４Ａは、スクロースクッションを用いて遠心分離した後のＲＸ３−Ｔ２０タンパク質濃度およびＲＸ３−ＥＧＦタンパク質濃度を示す図である。トランスジェニックタバコ葉の浄化ホモジネートをスクロースクッション（４２％ｗ／ｗ）上に載せた。遠心分離後、上清およびペレットにおけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。各レーンはそれらの画分の等量に対応する。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｐ、ペレットクッション。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。図４Ｂは、スクロースクッションを用いて遠心分離した後のＲＸ３−ＥＧＦタンパク質の精製を示す図である。トランスジェニックタバコ葉の浄化ホモジネートをスクロースクッション（４２％ｗ／ｗ）上に載せた。遠心分離後、ホモジネート画分、上清画分およびペレット画分のタンパク質パターンを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により解析した。各レーンはそれらの画分の等量に対応する。矢印で、ＲＸ３−ＥＧＦモノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｐ、ペレットクッション。左側に分子量を示している。図４Ｃは、低速遠心分離（ＬＳＣ）後のＲＸ３−ＥＧＦタンパク質濃度と精製を示す図である。ＲＸ３−ＥＧＦを発現しているタバコ葉の浄化ホモジネートを１０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレット（Ｐ１、レーン２）および上清（Ｓ、レーン１）をゲル電気泳動およびγ−ゼイン抗体を用いた免疫ブロット法により解析した。低速遠心分離（ＬＳＣ）によるペレットＰ１を５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有緩衝培地で洗浄し、２回目の遠心分離後、ＬＳＣによるＰ１ペレット（レーン７）、洗浄後の上清（Ｗ、レーン８）、最後のペレットＰ２（レーン９）の等量を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により解析した。これらのサンプルを、１回のスクロースクッション遠心分離後に得られたペレットＰ１（レーン３）の等価サンプル（レーン３〜５）と比較し、ＬＳＣペレットと同じ洗浄手順に供した。矢印で、ＲＸ３−ＥＧＦモノマー（Ｍ）およびダイマー（Ｄ）を示している。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂとして２部構成で図を示す。図５Ａは、トランスフェクト哺乳類細胞に蓄積したＲＸ３−Ｃｔ組換え融合タンパク質、ＲＸ３−ＥＧＦ組換え融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ組換え融合タンパク質の細胞内分布を示す図である。トランスフェクト細胞のホモジネートを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。遠心分離後、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−Ｃｔ融合タンパク質、ＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。ＧＦＰのシアン蛍光変異体であるＥＣＧＰを発現するプラスミド ｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトした細胞を対照として使用し、抗ＧＦＰ抗血清を用いることによりＥＣＧＰを免疫検出した。Ｈ、ホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。図５Ｂは、低速遠心分離後の、ＣＨＯにより発現されたＲＸ３−ＥＧＦタンパク質濃度を示す図である。ＲＸ３−ＥＧＦを発現しているＣＨＯ細胞のホモジネートを２５００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレット（Ｐ、レーン２）および上清（Ｓ、レーン１）をゲル電気泳動およびγ−ゼイン抗体を用いる免疫ブロット法により解析した。左側に分子量を示している。
【図６】形質転換酵母細胞に蓄積したＲＸ３−ＥＧＦ組換え融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ組換え融合タンパク質の細胞内分布を示す図である。形質転換酵母の溶解されたスフェロプラストを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。遠心分離後、上清画分、界面画分およびペレット画分におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼイン抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。Ｈ、溶解スフェロプラストホモジネート；Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。左側に分子量を示している。
【図７】図７Ａは、アグロインフィルトレートしたタバコ苗に蓄積した組換え融合タンパク質の細胞内分布を示す図である。浄化苗ホモジネートを段階スクロース（２０％−３０％−４２％−５６％ｗ／ｗ）勾配上に載せた。上清勾配画分、界面勾配画分およびペレット勾配画分におけるｒＰ１３−Ｃｔ融合タンパク質、ｒＰ１３−ＥＧＦ融合タンパク質およびｒＰ１３−ｈＧＨ融合タンパク質の蓄積を、抗カルシトニン抗体、抗ＥＧＦ抗体および抗ｈＧＨ抗体を用いて免疫ブロット法により解析した。２種類のα−ゼイン遺伝子を用いて等価研究を実施した。カルシトニン（Ｃｔ）およびＥＧＦをαゼインＮ末端ドメイン（２２ａＺｔ）と融合し、ｈＧＨを完全αゼイン遺伝子（２２ａＺ）と融合した。各レーンには各画分を等量用いた。Ｓ、上清；Ｆ２０、界面 ２０％〜３０％ｗ／ｗスクロース；Ｆ３０、界面 ３０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、５６％スクロース下でのペレット。図７Ｂは、トランスジェニックタバコ系の浄化葉ホモジネートを用いて段階スクロース（１０％−４２％−５６％−６２％ｗ／ｗ）勾配上に載せた結果を示す図である。抗ＥＧＦ抗体を用いた免疫ブロットは、各画分の等量についてのｒＰ１３−ＥＧＦおよび２２ａＺｔ−ＥＧＦ分布を示している。Ｓ、上清；Ｆ１０、界面 １０％〜４２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ４２、界面 ４２％〜５６％ｗ／ｗスクロース；Ｆ５６、界面 ５６％〜６２％ｗ／ｗスクロース；Ｆ６２、６２％スクロース下でのペレット。
【図８】ＲＰＢＬＡからのＲＸ３−Ｔ２０融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の回収を示す図である。密度クッションまたは段階勾配から得られたＲＰＢＬＡ画分を還元剤の存在下で再懸濁した。可溶化タンパク質（Ｓ）および非可溶化タンパク質（Ｐ）を、γ−ゼイン抗血清を用いて免疫ブロット法により解析した。左側に分子量を示している。矢印で、ＲＸ３由来融合物モノマー（Ｍ）、ダイマー（Ｄ）およびトリマー（Ｔ）を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞において組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現された組換え融合タンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）融合タンパク質を、所定の密度を有する組換えタンパク粒様会合体として発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する工程、
（ｂ）そのホモジネートにおいて異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域とを提供する工程、および
（ｃ）そのＲＰＢＬＡ低下領域を比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離し、その結果として前記融合タンパク質を精製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ＲＰＢＬＡの所定の密度が、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合タンパク質が、互いに連結している２つの配列を含み、１つの配列がタンパク粒誘導配列であり、もう１つの配列が目的産物の配列である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
ホモジネートにおける異なる密度の領域が、密度差を与える溶質の存在下でそのホモジネートを遠心分離することにより提供される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
異なる密度の領域が、密度勾配によって提供される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
異なる密度の領域が、前記ＲＰＢＬＡよりも低密度の密度クッションによって提供される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
異なる密度の領域が、ホモジネートの低速遠心分離後に得られる上清とペレットによって提供される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞が、高等植物細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が、真菌細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１０】
真菌宿主細胞が、酵母細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が、藻類細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、動物細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１３】
動物宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
融合タンパク質が、タンパク粒誘導配列と目的産物の配列との間にリンカー配列をさらに含む、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク粒誘導配列が、プロラミンまたは修飾プロラミンを含んでなる、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、またはイネプロラミンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＰＢＬＡの密度が、約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
ホモジネートが、新鮮バイオマスから調製される、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
ホモジネートが、乾燥バイオマスから調製される、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＰＢＬＡを回収する工程をさらに含む、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項１】
宿主細胞において組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として発現された組換え融合タンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）融合タンパク質を、所定の密度を有する組換えタンパク粒様会合体として発現させる形質転換宿主細胞の水性ホモジネートを提供する工程、
（ｂ）そのホモジネートにおいて異なる密度の領域を形成して、比較的高濃度のＲＰＢＬＡを含む領域と比較的低濃度のＲＰＢＬＡを含む領域とを提供する工程、および
（ｃ）そのＲＰＢＬＡ低下領域を比較的高濃度のＲＰＢＬＡの領域から分離し、その結果として前記融合タンパク質を精製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
ＲＰＢＬＡの所定の密度が、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合タンパク質が、互いに連結している２つの配列を含み、１つの配列がタンパク粒誘導配列であり、もう１つの配列が目的産物の配列である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
ホモジネートにおける異なる密度の領域が、密度差を与える溶質の存在下でそのホモジネートを遠心分離することにより提供される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
異なる密度の領域が、密度勾配によって提供される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
異なる密度の領域が、前記ＲＰＢＬＡよりも低密度の密度クッションによって提供される、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
異なる密度の領域が、ホモジネートの低速遠心分離後に得られる上清とペレットによって提供される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞が、高等植物細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が、真菌細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１０】
真菌宿主細胞が、酵母細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞が、藻類細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が、動物細胞である、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項１３】
動物宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
融合タンパク質が、タンパク粒誘導配列と目的産物の配列との間にリンカー配列をさらに含む、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク粒誘導配列が、プロラミンまたは修飾プロラミンを含んでなる、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、またはイネプロラミンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＰＢＬＡの密度が、約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
ホモジネートが、新鮮バイオマスから調製される、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
ホモジネートが、乾燥バイオマスから調製される、請求項１〜１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＰＢＬＡを回収する工程をさらに含む、請求項１〜１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５２１７６７（Ｐ２００８−５２１７６７Ａ）
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４１８７８（Ｐ２００７−５４１８７８）
【出願日】平成１７年１１月２９日（２００５．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２８７８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５６４８４
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０５００３２１８）エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＥＲＡ ＢＩＯＴＥＣＨ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２９日（２００５．１１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２８７８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５６４８４
【国際公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【出願人】（５０５００３２１８）エラ、ビオテック、ソシエダッド、アノニマ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＥＲＡ ＢＩＯＴＥＣＨ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]