タンパク質の複雑な混合物を単純化するためのＲＲＮＫペプチドの選択的単離に基づくタンパク質の同定及び相対的定量の方法
【課題】現在のマススペクトロメーター及びクロマトグラフィーシステムでは特別のプロテオームのタンパク質分解により発生するペプチドの複雑な混合物を直接分析することはできなかった。
【解決手段】本発明はクロマトグラフィーステップの非保持フラクション中に、アミノ基の修飾体を持たず、アルギニン残基のＣ−末端におけるトリプシン切断により生じ、その配列中にリシン残基を持たない（ＲＲｎＫペプチド）ペプチドを単離することによりタンパク分解ペプチドの複雑な混合物の分析を可能にした。
【解決手段】本発明はクロマトグラフィーステップの非保持フラクション中に、アミノ基の修飾体を持たず、アルギニン残基のＣ−末端におけるトリプシン切断により生じ、その配列中にリシン残基を持たない（ＲＲｎＫペプチド）ペプチドを単離することによりタンパク分解ペプチドの複雑な混合物の分析を可能にした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野、特にプロテオミクスの分野に関係する。プロテオミクスは、生物の全遺伝子群（ゲノム）のタンパク質の全てとして定義されるプロテオームを試験の対象とする分析手段及び方法の全群を含む学問分野である。
【背景技術】
【０００２】
生物のプロテオームは非常にダイナミックであり、そしてゲノムから由来するタンパク質を予測することは可能であるが、所与の瞬間に発現するタンパク質及びそのそれぞれの相対的量（定量的プロテオミクス）を予測することは不可能である。プロテオミクスは今日、二つの分析手段：二次元電気泳動（２ＤＥ）及びマススペクトロメトリー（ＭＳ）の調和の取れた組合せのお陰で実現している。２ＤＥはタンパク質の複雑な混合物の分離のためには最も強力な手段であり、それらの相対的定量も可能にする。一方マススペクトロメトリーは、非常に高い感度（ｆモル）を有しており、分析したペプチドの構造の解明及び翻訳後修飾の検出を可能にする。
【０００３】
２ＤＥは、プロテオミクス試験において大量スケールにそれを使用することを阻害するいくつかの欠点を持っている（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｎ ｉｍｐｏｓｓｉｂｌｅ ａｍｏｕｒ． Ｓａｎｔｏｎｉ Ｖ．， Ｍｏｌｌｏｙ Ｍ．， Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ Ｔ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２１，１０５４−１０７０，２０００； Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ−ｐｉｔｆａｌｌ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ． Ｈａｙｎｅｓ Ｐ．Ａ．， Ｙａｃｈｔｓ ＩＩＩ Ｊ．Ｒ． Ｙｅａｓｔ． １７，８１−８７，２０００）：
−疎水性タンパク質の分析の困難さ。例えば、常にワクチン開発の魅力的な候補である膜タンパク質は二次元ゲルにおいて低く呈示されることは良く知られている。
−極端な等電点のタンパク質は効率よく集めることができない。
−高品質で再現性のある二次元ゲルの精巧さには非常な苦心と熟練が必要である。
−マススペクトロメーターと直接結合できないので、合理的時間内の高処理分析をかなり制限する。
−別々に発現したタンパク質を検出するための自動的方法におけるゲルの画像解析は専門家の介入を不要にするほどには有効でないので、時間を要する。
【０００４】
このような理由のために、完全なタンパク質でプロテオームの定量的試験を行う代わりにペプチドで行う傾向が生じた。マススペクトロメトリーによって決定されるペプチド（３〜５個のアミノ酸）の短い配列は、配列データベースにおいて元のタンパク質の信頼性のある同定を行うのに充分であるために、これが可能である（Ｅｒｒｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ． Ｍａｎｎ Ｍ， Ｗｉｌｍ Ｍ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６， ４３９０−４３９９， １９９４）。
【０００５】
一方、疎水性タンパク質のタンパク分解消化は、取り扱い易い非疎水性ペプチドを一部発生させることさえできる。この理由により、大多数のタンパク質を同定することにより高処理定量的プロテオミクスの試験を行い、二次元電気泳動を使用しない戦略が生じることも促進された。
【０００６】
この方向の先駆的仕事は１９９９年にＬｉｎｋと共同研究者により成され（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７，６７６−６８２，１９９９）、彼らはマススペクトロメトリーに直結した二次元クロマトグラフィーシステムを開発した（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。
【０００７】
これらの著者はミクロキャピラリーカチオン交換カラム、続いて逆相カラムを充填した。ペプチドは酸性のｐＨにおいて注入され、全てカチオン交換樹脂に吸着され、その後移動相の塩濃度を増加することにより、これらのペプチドのフラクションが逆相カラム上に溶出される。アセトニトリルの連続グラジエントにより逆相カラムに残留したペプチドは溶出され、それらはマススペクトロメトリーにより分析され、配列データベースにおいてその同定が行われる。カチオン交換カラムに吸着されたペプチドが全て完全に溶出するまで、この操作は数回繰り返される。科学文献においてこの方法はＭｕｄＰｉＴ（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）として知られており、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの総タンパク質の加水分解物から出発して１４８４個のタンパク質を同定することができた（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，２４２−２４７，２００１）。
【０００８】
現在のマススペクトロメーター及びクロマトグラフィーシステムの効率では特別のプロテオームのタンパク質分解により発生するペプチドの複雑な混合物を直接分析することはできないので、現在の知識はこの分画は大多数のタンパク質の同定には必須であることを示している。マススペクトロメーターにクロマトグラフィーシステムをオンラインで結んだときに、この方法は疑いもなく高処理タンパク質同定を促進したが、しかし試験している混合物中に存在するタンパク質の相対的定量測定は未だ解決されていなかった。この問題を解決する最初のステップは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞が窒素−１４（１４Ｎ）を含有する培地中で、そして他の細胞が窒素−１５（１５Ｎ）を含有する培地中で増殖したときに、Ｗａｓｈｂｕｒｎ ＭＰ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｄａｔｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｖｉａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７４：１６５０−１６５６，２００２）によって行われた。この方法を実施した際に、一つの条件に由来するタンパク質は全て１５Ｎで標識され、そして他の条件に由来するタンパク質は１４Ｎで標識された。彼らは両条件下で得られたタンパク質を混合した；全タンパク質の特異的タンパク分解が行われ、次いでマススペクトロメトリーによるペプチド配列分析によりタンパク質の同定が行われた。タンパク質の相対量の測定は１５Ｎ／１４Ｎで標識されたペプチドの強度比により行われた。
【０００９】
しかし、この同位元素標識の方法は常に実施することができるものではなく、同位元素を加えた培地の高いコストのために、イースト及び細菌のような単純な生物においてのみ現在のところ実行可能である。他方、このタイプの標識は試験する生物学的システムにおいて常に実現可能というものではなく、また標識されたペプチドと非標識ペプチドの間に生じるマスシフトはペプチド配列中に存在する窒素原子の数によるので、１５Ｎによる標識は同定操作に一定の複雑さをもたらすことを指摘する必要がある。この最後の困難を乗り越えるために、特別な標識アミノ酸を添加した培地において試験中の生物を増殖するときに他の著者は一部のアミノ酸への同位元素標識の導入を制限した。この方法はＳＩＬＡＣ（ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｂｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）と命名され、二つの比較される条件において標識及び非標識ロイシン又はリシンを添加した培地を使用して１２Ｃ／１３Ｃ及び１Ｈ／２Ｈによる標識を使用したかなりの数の出版物がある（Ｓ．Ｅ．Ｏｎｇ， Ｂ．Ｂｌａｇｏｅｖ， Ｉ．Ｋｒａｔｃｈｍａｒｏｖａ， Ｄ．Ｂ．Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｈ．Ｓｔｅｅｎ， Ａ．Ｐａｎｄｅｙ， Ｍ．Ｍａｎｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００２，１，３７６−３８６；Ｂｅｒｇｅｒ ＳＪ， Ｌｅｅ ＳＷ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＧＡ， Ｌｉｊｉａｎａ ＰＴ， Ｔｏｌｉｃ Ｎ， Ｓｈｅｎ Ｅ， Ｚｈａｏ Ｒ， Ｓｍｉｔｈ ＲＤ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄａｔｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ−ＭＳ／ＭＳ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，７４，４９９４−５０００；及びＰｒｅｃｉｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｙｓｉｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍａｓｓ Ｔａｇｇｉｎｇ， Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００３，１４，１−７）。重いペプチドに対して軽いペプチドのマスシフトは、ペプチド配列が標識アミノ酸を含む場合にのみ生じる；したがって標識アミノ酸を持たないペプチドは定量に使用できない。ＳＩＬＡＣの使用は、その高コストのためにプロテオミクスの実験の全てに普遍的な方法として使用することはできず、培地を使用して試験する生物学的課題にのみ適用される。
【００１０】
タンパク質の複雑な混合物のタンパク質分解によって発生するペプチドの全てのＣ−末端カルボキシル基に取り込むことができるので、プロテオミクスの実験において定量を行うための１８Ｏによる標識はより普遍的方法である。一つのタンパク質混合物は通常の水で調整された緩衝液の存在下に消化され、一方別の混合物は１８Ｏで標識された水（Ｈ２１８Ｏ）の存在下に消化される。Ｈ２１８Ｏで調製された緩衝液中で得られたペプチドはそのＣ−末端に１および２原子の１８Ｏを取り込むことができ、他方、他のペプチドは自然の同位元素分布を示す。標識及び非標識分子種の相対的定量を行うために、マススペクトル中で１６Ｏ／１８Ｏで標識された分子種の同位元素分布に相当する面積を計算する必要があり、ペプチドが同定された後に、それらを含むタンパク質の比率を推定する。このタイプの標識には二つの限界があり、一つは、標識及び非標識ペプチドの同位体分布の間に充分な分離が生ぜず、もう一つは、１８Ｏの付加が各ペプチドに対して１及び２原子の１８Ｏの均一な付加ではない。適当なソフトウエアが複雑に重複した同位体の分布を正しく解釈できなければ、これらの二つの問題は軽い種及び重い種の相対的定量に重大な意味を持つ可能性がある。
【００１１】
同位体分布の重複を避けるために、そしてペプチドのＣ−末端の１８Ｏの取り込みを均一化するために、Ｙａｏ及び共同研究者（Ｙａｏ Ｘ， Ａｆｏｎｓｏ Ｃ ａｎｄ Ｆｅｎｓｅｌａｕ Ｃ． Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ １８Ｏ ｌａｂｅｌｉｎｇ： ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ １６Ｏ−ｔｏ−１８Ｏ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３，２，１４７−５２）は、トリプシンの存在下にタンパク分解ペプチドの長時間インキュベーションにより消化操作後のタンパク分解ペプチドを １８Ｏで完全に標識することを提案した。
【００１２】
この方法により、トリプシン分解ペプチドのＣ−末端に２原子の１８Ｏの完全取り込みが保証されそして標識及び非標識ペプチドの同位元素分布の間に４ Ｄａの分離が達成される。しかし、塩基性アミノ酸リシン及びアルギニンのＣ−末端におけるペプチド結合のトリプシン切断の親和性に比較してこの方法の親和性は非常に劣っているので、１８Ｏ−原子の取り込みに抵抗するペプチドがある。これが起こった場合には、大きな誤差が定量に持ち込まれる可能性がある。他方で、１８Ｏによる１６Ｏの完全な交換を保証するトリプシン分解ペプチドの長いインキュベーション時間は配列の非特異的切断の出現を促進する可能性があり、それはタンパク質データベースにおける同定の結果に影響する。
【００１３】
しかし、１８Ｏによる標識は、特殊な様式においては配列データベースにおける信頼できる方法としてＮ−グリコペプチドを同定するために（Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｊ， Ｔａｋａｏ Ｔ， Ｈｏｒｉ Ｈ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ， Ｐａｄｒｏｎ Ｇ， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ． Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｇｌｉｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＮＧａｓｅ−Ｆ ｉｎ １８Ｏ−ｌａｂｅｌｅｄ Ｗａｔｅｒ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９２，２０５，１５１−１５８）、そして偽陽性を識別するために（Ｋｕｓｔｅｒ， Ｂ ａｎｄ Ｍａｎｎ Ｍ． １８Ｏ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９９，７１，１４３１−１４４０）プロテオミクスにおいて使用されてきた。糖タンパク質又はグリコペプチドは１８Ｏ標識水で調製された緩衝液の存在下にＰＮＧアーゼ−Ｆで脱グリコシル化され、そしてＮ−グリコシル化アスパラギン残基（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は高度に特異的様式でその側鎖に１８Ｏ原子を取り込んだアスパラギン酸残基に変換される。定量的プロテオミクスにおいて、一つの条件では通常の水で調製した緩衝液において、そして別の条件では１８Ｏ標識水の存在下において糖タンパク質を脱グリコシル化するために、これと同じ方法を使用することができる。
【００１４】
分析された検体の同比率を混合したのち、各タンパク質の相対的量が１６Ｏ／１８Ｏの比として同様に推定された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｊ， Ｔａｋａｏ Ｔ， Ｈｏｒｉ Ｈ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ， Ｐａｄｒｏｎ Ｇ， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ． Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＮＧａｓｅ−Ｆ ｉｎ １８Ｏ−ｌａｂｅｌｅｄ Ｗａｔｅｒ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９２，２０５，１５１−１５８）。
【００１５】
定量的プロテオミクスを行うためにタンパク分解ペプチドの全てに標識を導入する別の方法がＺａｐｐａｃｏｓｔａ及びＡｎｎａｎにより導入された（Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ Ｆ， ａｎｄ Ａｎｎａｎ ＲＳ． Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ−ｄｒｉｖｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００４，７６，６６１８−６６２７）。最初のステップにおいて、リシン残基は全てＯ−メチルイソ尿素との反応によりホモアルギニンに変換され、次いで比較される条件の一つにおいて得られたタンパク質分解ペプチドの全てのアミノ末端基の全ては重い同位体（特に重水素）に富む保護試薬で誘導体にされ、一方他の条件で得られたペプチドは非標識試薬で修飾される。両検体は混合され、重いペプチドと軽いペプチドの同位体分布の強度比を測定して相対的定量を行う。
【００１６】
標識及び非標識種の同位体分布の重複を避けるために、ペプチドの誘導体化は重水素化無水プロピオン酸（ｄ５）及び通常の無水プロピオン酸で行われる。しかし、３個を超える重水素原子の導入は、逆相クロマトグラフィーにおけるその保持時間はＺｈａｎｇ及び共同研究者により示されているように異なるので、軽−及び重−分子種の相対的定量において誤差を誘発する可能性がある（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｓｉｏｍａ ＣＳ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００１，７３，５１４２−５１４９）。定量の誤差は、一つの分子種の配列中に重水素原子の数が増加する同じ測定において増加する可能性があり（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｓｉｏｍａ ＣＳ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＡ， Ｘｉｏｎｇ Ｌ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｔｏｐｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００２； ７４，３６６２−３６６９）そして誘導体化が１３Ｃ以外で標識した同じ保護試薬で行われた場合に、これらの誤差は最少になることが認められた（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ， Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００２，１，１３９−１４７）。
【００１７】
圧倒的な数の発生したペプチドは、現在のクロマトグラフィーシステム及び最新のマススペクトロメーターの分解能を上回るので、複雑なタンパク質の混合物のタンパク質分解の分析は大きな課題である。
【００１８】
この課題に取り組み、そして二次元電気泳動を使用する必要のない定量的プロテオミクスを行うことができるようにするための現在の趨勢は、共通の性質を有するペプチドのサブセットの選択的単離をすることができ、そしてその試験がそれが由来したタンパク質の代理性に影響しない方法を開発することによるペプチド混合物の単純化であった。つまり、最初の混合物中に存在する膨大な数のタンパク質を分析するのは不可能である。ペプチドの選択的単離と適当な同位体標識技術を結合することにより、同定のみならず比較された最初の混合物中に存在するタンパク質の相対的定量も可能になる。
【００１９】
システイン含有ペプチドの選択的単離。
この方法は、システイン含有ペプチドの選択的単離に基づく良く知られたＩＣＡＴ法（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ）を提案しているときに、Ｇｉｇｙ及び共同研究者により始められた（Ｑａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ． Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．， Ｒｉｓｔ，Ｂ．， Ｇｅｒｂｅｒ， Ｓ．Ａ．， Ｔｕｒｅｃｅｋ， Ｆ．， Ｇｅｌｂ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ， Ｒ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９，１７，９９４−９９９）。この方法はアフィニティークロマトグラフィー（ストレプトアビジン−ビオチン）と軽及び重変異体にＩＣＡＴ試薬で標識することを組み合わせている。この試薬は三つの機能的要素よりなる：
１−システイン残基のチオール基と特異的に反応する基。
２−親和要素（ビオチン）を持ち、ＩＣＡＴ試薬と反応するペプチドを選択的に単離することを可能にする基。
３−上記の要素を分離する腕。重い変異体においてその構造（重ＩＣＡＴ）中に８原子の重水素を有し、そして軽い変異体は８原子の水素を有す（軽ＩＣＡＴ）。
【００２０】
両条件に由来するタンパク質はＤＴＴの存在下に別々に還元された後、一つの条件で発生した遊離システインは重ＩＣＡＴと反応し、別の条件で発生したものは軽ＩＣＡＴと反応する。両タンパク質混合物は等量で合併され、そしてタンパク分解消化が行われる。発生したペプチドはストレプトアビジンアフィニティーカラムにより精製され、結果としてＩＣＡＴで修飾されたシステイン含有ペプチドは選択的に単離される。
【００２１】
相対的定量を行うために、軽及び重−ＩＣＡＴで標識されたペプチドに相当するシグナルの相対的強度が測定される。これらの試薬で標識されたペプチドの質量は、配列中に含まれるシステイン残基の数により、８単位の倍数の質量差がある。
【００２２】
この方法にはいくつかの欠点がある：
−ＩＣＡＴ試薬の大きさはかなりあるので、ペプチドのイオン化効率及びマススペクトルの解釈に影響する。
−重ＩＣＡＴで修飾されたペプチド中に８原子の重水素の存在により、保持時間が軽ＩＣＡＴで修飾されたペプチドに対してかなり異なる可能性があるので、定量に大きな誤差を生じる可能性があり（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｓｉｏｍａ ＣＳ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ． Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００１，７３，５１４２−５１４９）そして強度比は定量すべきペプチドの軽及び重種の溶出の間同じではない。
−ＩＣＡＴについて記述されている定量方法は、同位体分布の重複を避けるためにシグナルを充分に分離していないほかの方法の同位体標識には適用できない。
−ＭｕｄＰｉｔ（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１９，２４２−２４７）の場合のように、さらにペプチド混合物を分画することが好ましい場合には、ペプチドの選択的単離に使用されるものとは異なるクロマトグラフィーを使用する必要があり、検体の処理中にかなりのロスを生じる。
−選択的単離のステップの間に高親和性クロマトグラフィーを使用する場合は、一部の特別なペプチドについてロスはかなりのものになる可能性がある。
−システインを含まないタンパク質はこの方法によって分析することができない。
【００２３】
メチオニン含有ペプチドの選択的単離。
最近、メチオニン含有ペプチドを選択的に単離することを可能にするＣＯＦＲＡＤＩＣと命名された方法が文献に記述された（Ｇｅｖａｅｒｔ Ｋ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊ， Ｇｏｅｔｈａｌｓ Ｍ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＲ， Ｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ Ｂ， Ｄｅｍｏｌ Ｈ， Ｍａｒｔｅｎｓ Ｌ， Ｐｕｙｐｅ Ｍ， Ｓｔａｅｓ Ａ， Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｇｅｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｓ ｔｈａｎ ８００ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００２ ，１１，８９６−９０３）。この方法は数ステップからなる：全てのタンパク質を還元し、Ｓ−アルキル化の後、それらを消化し、得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分画し、著者が初回と命名する操作においてかなりの数のフラクションに集める。これらのフラクションのそれぞれを別々に３分間過酸化水素（３％ｖ／ｖ）の溶液と反応させ、第２回の操作において同じ条件の同じクロマトグラフィーシステムにおいて再度分析する。酸化された後にそれらは疎水性の低い分子種になりその保持時間が減少するので、その保持時間が変化しないメチオニンを含まず、廃棄される残りのペプチドとは異なるので、メチオニンを含むペプチドは選択的に単離される。この方法はＩＣＡＴにより得られるのと同程度にペプチドの複雑な混合物を単純化することができ、またホスホペプチド、タンパク質のＮ−末端ペプチド、ジスルフィド架橋により連結したペプチドの選択的単離にも適用することができると著者は概説した（Ｍａｒｔｅｎｓ Ｌ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｐ， Ｄａｍｍｅ ＪＶ， Ｓｔａｅｓ Ａ， Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｈｅｓｑｕｉｅｒｅ Ｂ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＲ， Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ， Ｇｅｖａｅｒｔ Ｋ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｍａｐｐｅｄ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｅｎｔｒｉｃ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； Ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｆｉｌｅ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００５，５（１２）：３１９３−２０４．）。
【００２４】
酸化条件は、システイン及びトリプトファンのような不安定な残基の酸化を避けるために最適化したと著者らは述べているが、これが生じた場合には、この方法の選択性に影響し、達成されるペプチド混合物の単純化の程度は、著者らが主張するようにＩＣＡＴ法の程度とは類似しないであろう。
【００２５】
他方、メチオニン含有ペプチドを全て選択的に単離することを達成するためにこの方法を自動化することができるが、多数のクロマトグラフィー操作を行う必要があり、この方法の全体収量が逆に影響を受ける可能性がある。
【００２６】
Ｎ−末端ペプチドの選択的単離。
ＣＯＦＲＡＤＩＣの変法は、全てのタンパク質のＮ−末端ペプチドを選択的に単離するためにも提案されている（Ｇｅｖａｅｒｔ Ｋ， Ｇｏｅｔｈａｌｓ Ｍ， Ｍａｒｔｅｎｓ Ｌ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊ， Ｓｔａｅｓ ＴＯ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＲ， Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｒｔｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３；２１，５６６−５６９）。この方法の最初のステップは、比較される複雑な混合物中に存在するタンパク質の一級アミノ基を全て保護することであり、次いで修飾タンパク質の特別なタンパク質分解が行われ、そして逆相クロマトグラフィーによりペプチド混合物はかなりの数のフラクションに分離される。
【００２７】
タンパク質分解により発生した内部のペプチドのそれぞれに一つずつ存在する新しいアミノ基は、さらに高度に疎水性の保護基と反応して、そして再度前記と同じ条件下で同じクロマトグラフィーシステムにおいて分離される。内部ペプチドの全ての保持時間は第二の保護試薬の付加によりかなり増加するが、この方法により最初のステップにおいて保護された全てのＮ−末端ペプチドは、元のフラクションと同じ保持時間で集められた場合に、選択的に単離される。この方法は不利である可能性がある：信頼性のある定量を行うためには、アミノ基の保護からなる最初のステップは定量的な様式で行われなければならないが、タンパク質が複雑な混合物で存在する場合にはこれは少し困難である可能性がある。
【００２８】
またこの最初のステップにおいて、アミノ基の保護はたんぱく質の溶解性をかなり減少させる可能性があり、これがこの方法の定量性に影響することがある沈殿を生じる可能性がある。最後に、タンパク質につき一つのペプチドが単離されるということは、行過ぎた単純化であり、複雑な混合物中に存在するタンパク質の同定及び定量において悪い影響を与える可能性がある。タンパク質につき３〜４ペプチドに減らされた群を単離することにより余裕を生じる方法は、定量結果の確認が可能となるので、二次元電気泳動を使用しないプロテオミクス試験にとって理想的である可能性がある。
【００２９】
Ｎ−糖タンパク質の選択的単離。
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに報告されている膜タンパク質の約９１％は糖タンパク質であると報じられている。プロテオミクス試験のためにレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用することによる糖タンパク質の選択単離に基づく方法が提案されている（Ｇｅｎｇ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｂｉｎａ Ｍ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｓ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ． ２００１，７５２，２９３−３０６； Ｋａｊｉ Ｈ， Ｓａｉｔｏ Ｈ， Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｙ， Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ， Ｔａｏｋａ Ｍ， Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ Ｊ， Ｋａｓａｉ Ｋ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ， Ｉｓｏｂｅ Ｔ． Ｌｅｃｔｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ， ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３，２１，６６７−６７２）。クロマトグラフィーカラムに固定した特別なレクチン又は一組のレクチンを使用することは（Ｊｉ Ｊ， Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ａ， Ｇｅｎｇ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ａｍｉｎｉ Ａ， Ｂｉｎａ Ｍ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ． Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ． ２０００，７４５，１９７−２１０， Ｇｅｎｇ Ｍ， Ｊｉ Ｊ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ， Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｅｓ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ２０００，８７０（１−２），２９５−３１３）、それらが存在する全ての糖の型を認識できずまた有効な選択的単離を保証できないので、限界がある。この限界を克服するために、Ｚｈａｎｇ及び共同研究者は（Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｌｉ ＸＪ， Ｍａｒｔｉｎ ＤＢ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３，２１，６２７−６２９）、ヒドラジンにより誘導体にすることにより固相支持体に糖タンパク質を固定し、後にＰＮＧアーゼ−Ｆの作用によりそれを放出することを提案した。この最後のステップをＨ２１８Ｏの存在下及び非存在下において実施するので、二つの生物学的条件の下に発現されるタンパク質の相対的定量が可能になる。この方法は、ワクチン候補と考えられる膜タンパク質のような生物学的に関心がある検体又は受容体又は存在する中では最も複雑なタンパク質である血清に適用できるが、しかしその適用は糖タンパク質が多い検体にのみ限られている。
【００３０】
ヒスチジン残基を持つペプチドの選択的単離。
ヒトプロテオーム中にヒスチジンが多いことはシステインと類似している。ヒスチジンはヒトプロテオームのタンパク質の８３％に、またこのアミノ酸を含有するトリプシン分解ペプチド１５％に存在する（Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ， Ｒｉｇｇｓ Ｌ， Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｘｉｏｎｇ Ｌ， Ｌｉｕ Ｐ， Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｅ， Ｓｅｅｌｅｙ Ｅ， Ｓｉｏｍａ Ｃ， ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＡ． Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００２，３７，１３３−１４５）。このために、ペプチドの複雑な混合物のかなりの単純化を達成するために、ヒスチジンを含むペプチドの選択的単離はプロテオミクス試験にとって魅力的である。クロマトグラフィー支持体に固定化された金属イオンと配位複合体を形成することによりヒスチジンを含むペプチドを選択的に捕捉するためにアフィニティークロマトグラフィーが使用された。種々のマトリックス及び固定化金属を評価する研究がいくつかある（Ｒｅｎ Ｄ， Ｐｅｎｎｅｒ ＮＡ， Ｓｌｅｎｔｚ ＢＥ， Ｉｎｅｒｏｗｉｃｚ ＨＤ， Ｒｙｂａｌｋｏ Ｍ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｃｕ（ＩＩ）． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ． ２００４，１０３１，８７−９２）が、その結果は、選択的単離のために以前記述されたほかの方法に比較してその特異性がまだ劣ることを示した（Ｒｅｎ Ｄ， Ｐｅｎｎｅｒ ＮＡ， Ｓｌｅｎｔｚ ＢＥ， Ｍｉｒｚａｅｉ Ｈ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ． Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００３，２，３２１−３２９； Ｒｅｎ Ｄ， Ｐｅｎｎｅｒ ＮＡ， Ｓｌｅｎｔｚ ＢＥ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００４，３，３７−４５）。事実、特異性を増加させるために、過去のタンパク質の修飾方法を含めて変法の探索が行われている。
【００３１】
Ｃ−末端にアルギニンを持つペプチドの単離。
最近、Ｆｏｅｔｔｉｎｇｅｒ及び共同研究者（Ｆｏｅｔｔｉｎｇｅｒ Ａ．， Ｌｅｉｔｎｅｒ Ａ．， Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｗ． Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｃａｐｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｂｏｒｏｎａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ． ２００５，１０７９，１８７−１９６）はボロン酸アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用することによりアルギニンを含有するペプチドを固相において捕捉する方法を提案した。この研究において、著者らは、マススペクトロメトリーにより分析される前にこれらのペプチドを効率よく放出することができると述べている。この方法は、アルギニンのグアニジノ基のアルカリ性条件下（ｐＨ＞８）において２，３−ブタンヂオンによる選択的共有結合修飾及び固定化フェニルボロン酸を持つ固体支持体中に修飾ペプチドを保持することに基づいている。アルギニンを含まないペプチドは保持されないフラクション中に廃棄され、アルギニンを含むペプチドは、前記反応の可逆性のために、酸性ｐＨにおいて固相支持体から溶出することができる。この方法はある場合にプロテオミクス試験における適用性を損なうので、ある強調すべき欠点を持っている。一方で、アフィニティー選択において、このクロマトグラフィーはリシン残基を持つペプチドの非特異的結合を示す可能性があり、その程度は変動する（１０〜９０％）。他方、アルギニンは配列分析された全てのゲノムの中に多く存在するアミノ酸であるので、達成される単純化の程度（約５０％）は不充分であり、したがってボロン酸アフィニティークロマトグラフィーの後であっても検体は非常に複雑であることに変わりはない。
【００３２】
Ｎ−末端にセリン及びトレオニンを持つペプチドの選択的単離。
２００３年にＣｈｅｌｉｕｓ及びＳｈａｌｅｒ（Ｃｈｅｌｉｕｓ Ｄ， Ｓｈａｌｅｒ ＴＡ． Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ： Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００３，１４，２０５−２１１）は、Ｎ−末端にセリン及びトレオニンを持つペプチドを選択的に単離する方法を記述した。この方法は、数ステップ（１）ペプチドのＮ−末端に存在するセリン及びトレオニンの水酸基の過ヨウ素酸塩での酸化的処理によるカルボニル基への変換；（２）ヒドラゾンを形成するための新しく形成されたカルボニル基の置換ヒドラジドによる反応及び（３）アフィニティークロマトグラフィーを使用することによる標識ペプチドの選択的単離からなる。この研究において、著者らは、後の選択的単離において固定化したストレプトアビジンを持つビーズを使用するために、Ｎ−末端にセリン及びトレオニンを持つペプチドをビオチンで標識することを提案している。この方法はいくつかの欠点を持つ：（ａ）過ヨウ素酸による酸化のステップは全てのメチオニン残基の酸化のようなペプチドの化学的修飾を誘発する、（ｂ）酸性のｐＨにおける処理によるアフィニティーカラムからのペプチドの溶出ステップは修飾ペプチドのリンカーの分解を誘発する。この研究において、Ｃｈｅｌｉｕｓ Ｄ， Ｓｈａｌｅｒ ＴＡ．（Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ： Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００３，１４，２０５−２１１）は、タンパク質の複雑な混合物を分析するためのこの方法の応用例を示さなかった。
【００３３】
陽イオン交換クロマトグラフィーによるペプチドの選択的単離。
陽イオン交換クロマトグラフィーもまたＢｅｔａｎｃｏｕｒｔと共同研究者（ＳＣＡＰＥ：Ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｐｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｌ， Ｇｉｌ Ｊ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅ−Ｃｏｓｓｉｏ Ｊ， Ｇａｒｃｉａ Ｌ， Ｐａｊｏｎ Ｒ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ， Ａｌｖａｒｅｚ Ｆ， Ｃｅｎｓｕｓ Ｇ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５，４，４９１−４９６）によって、プロテオミクス試験においてその配列中にヒスチジンもアルギニンも含まないペプチド（ｎＨｎＲペプチド）を選択的に単離する場合に使用された。この方法は、アミノ酸の可逆的保護と中性ペプチド（電荷０）から陽性荷電ペプチド（電荷１＋，２＋，３＋，４＋など）を有効にそして簡単に分離することができるクロマトグラフィーシステムの組合せに基づいている。この方法は分析されるペプチド混合物のＩＣＡＴ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ． Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｆ．，Ｇｅｌｂ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ． Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７，９９４−９９９，１９９９）で達成される程度のかなりの単純化を達成する。
【００３４】
アミノ基の保護反応の後、このクロマトグラフィーシステムは、その殆んどがアルギニン及びヒスチジンである荷電ペプチドを保持し、一方非保持フラクションはその配列にヒスチジンもアルギニンも含まない中性ペプチド（ｎＨｎＲペプチド）である。このｎＨｎＲペプチドはマススペクトロメーターで分析される前に、それらが有する保護基が加水分解処理により除去され、遊離アミノ基を再生し、マススペクトロメトリー分析においてイオン化及びフラグメンテーションが容易となるので、データベース中において同定される。
【００３５】
この方法は陽イオン交換クロマトグラフィーの非保持フラクション中にｎＨｎＲペプチドを分離するので、非常に多数のタンパク質を同定するためには、さらに分画するために別のクロマトグラフィーステップが必要である。これらの追加のクロマトグラフィーステップは操作中に損失を生じ、この方法の結果に影響する可能性がある。他方、ペプチドのアミノ基の脱保護の処理は分解を生じ、一部の特別なペプチドの回収にかなり影響する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
これらのペプチドの選択的単離の方法については記述したような限界があるので、複雑な混合物を示すタンパク質の同定及び発現レベルの測定のために、そのマススペクトロメトリー分析を行う以前に分析すべき複雑な混合物の単純化による小グループのべプチドの選択的及び特異的な単離方法は引き続き強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明に提案されているペプチドの選択的単離の方法は、有効にして簡単な方法でクロマトグラフィーステップの非保持フラクション中に（１）アミノ基の修飾体を持たない、（２）アルギニン残基のＣ−末端におけるトリプシン切断により生じ、そして（３）その配列中にリシン残基を持たない（ＲＲｎＫペプチド）ペプチドを単離することによりタンパク分解ペプチドの複雑な混合物の単純化を達成する。
【００３８】
この方法は、複雑な混合物を構成するタンパク質の同定に使用することができ、そして比較する条件の下に相対的量の測定に使用することができる。この目的のために、人工的に或いは自然資源から得られたタンパク質の混合物は図１に示されそして以下に説明されるステップによって処理される：
【００３９】
（１）例えば、ヨウ化酢酸アミド、ヨウ化酢酸、アクリルアミド、４−ビニルピリジンなど、この目的に使用される試薬のいずれかによるシステイン残基の還元及びＳ−アルキル化。この最初のステップは、いくつかの理由のために非常に重要である：（ａ）それは分析される混合物中に存在するタンパク質のペプチド結合の次の酵素的加水分解のステップの大きな有効性を保証する；（ｂ）それはシステイン残基を有する別のタンパク質のペプチドの交差結合を回避する；（ｃ）それはデータベース中のタンパク質の同定を容易にする。
【００４０】
（２）タンパク質の加水分解。これは、高度に特異的にリシン残基のＣ−末端においてペプチド結合を加水分解するリシル−エンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）を使用するタンパク分解的消化により達成される。
【００４１】
（３）保護反応は、ステップ２のタンパク分解処理により発生したペプチド中に存在するリシンのα−アミノ末端基及びε−アミノ基の化学的共有結合修飾にある。この方法において、生成した修飾ペプチドがクロマトグラフィーカラム中に又は化学的に活性化された固相支持体に選択的に保持されることが保証されるならば、多様な修飾アミノ基を使用することができる。保護試薬には次のものがある：無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水テトラヒドロフタル酸、クロロギ酸 ９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、２−メチルスホニルエチル スクシンイミジル カルボナート、尿素及びアミノ基を保護する試薬、例えば（ａ）ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニル及び４−メトキシベンジルオキシカルボニルを含む芳香族ウレタン型保護基；（ｂ）ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル及びメチルスルホニルエトキシカルボニルを含む脂肪族ウレタン型保護基；（ｃ）アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル及びイソボルニルオキシカルボニルを含むシクロアルキルウレタン型保護基；（ｄ）アシル保護基又はスルホニル保護基。好ましくは、保護基は、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニル及び１−カンファースルホニルを含み；（ｅ）ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、α−メチルニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、６−ニトロベラトリル、４−メトキシフェナシル及び３’，５’−ジメチトキシベンゾイン及びビオチン及びその化学的誘導体の活性エステルを含む光感受性保護基。さらに、修飾ペプチドに多価陰性電化を提供するほかの保護基、例えばＳＯ３−基も使用することができる。一般的に、アミノ基の保護のためにペプチド合成に使用される試薬又は既に説明した性質を充たすアミノ基と反応することができるほかの試薬は使用することができる。
【００４２】
アミノ基の修飾を行うのに必要なこの種の試薬及びプロトコールは文献中で容易に見出すことができる（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， ｐａｇ．４９４−６５４， Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）及びＰｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｎ．， ｐａｇ．７４−１０３， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８））、そしてその使用法は本発明の中に含まれる。
【００４３】
（４）過剰の保護試薬の分解及びチロシン残基のＯ−アシル化の除去。このステップは、（１）ＬＥＰペプチドのアミノ基の保護試薬の過剰を分解し、この方法により次のトリプシンの再消化により発生する新しいアミノ基との反応を避けるために、そして（２）提案する方法の収率に影響するチロシン残基におけるＯ−アシル化を除くため、の二つの目的を持って行われる。ほぼｐＨ １１に達するまでアンモニア又はエチルアミンのようなアミンを加え、それを１時間３７℃でインキュベーションすることにより前記の目的が保証される。特に、過剰の試薬の分解は、エタノール又はメタノールのような１級アルコール又は遊離アミノ酸の混合物を反応緩衝液に加えることによっても達成することができる。
【００４４】
（５）１級アミノ基を保護されたＬＥＰペプチドのトリプシンによる再消化。保護されたＬＥＰペプチドは、アルギニンを含むＬＥＰペプチド中のアルギニンのＣ−末端のペプチド結合のみを加水分解する高度に選択的な酵素であるトリプシンにより再消化される。
【００４５】
（６）ＲＲｎＫペプチドの選択的単離。使用したクロマトグラフィーカラムは、非保持フラクション中にその遊離アミノ基を持つＲＲｎＫペプチドの選択的単離を可能にし、他方、カラム中に第３のステップの間に導入された保護１級アミノ基を有するペプチドが共有又は非共有結合により保持される。ＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために、アミノ基に結合した保護基がこのクロマトグラフィーステップにおいて非常に高い親和性を持って認識されるならば、いずれのアフィニティークロマトグラフィーでも使用することができる。これを達成するために使用できるのは：
（ａ）ハイブリドーマ技術により得られたモノクロナール又はポリクロナール抗体；抗体フラグメント；１本鎖抗体；天然資源から単離された抗体又はファージディスプレーライブラリーから選択された抗体を固定化したクロマトグラフィーカラム。ペプチドに導入された保護基に高度に選択的に結合する化学的又はファージライブラリーから選抜されたタンパク質又はそのフラグメント、又はペプチドを固定化したクロマトグラフィーカラム。
（ｂ）この保護基が固定化したタンパク質の天然のリガンド、接合団又は単純に固定化タンパク質に高度に特異的に結合する有機性又は無機性の化合物であり得る。例えば、ＬＥＰペプチドのアミノ基は、ストレプトアビジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ又はレクチンのそれぞれを固定化したカラムにより特に保持されるビオチン又はグルタチオン又は一部のオリゴ糖基で誘導体にすることができる。他のタンパク質及びそれぞれのリガンドも使用することができ、そしてＷａｎｇ及び共同研究者により要約されている（Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｆａｎｇ，Ｘ；Ｌｕ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．“Ｔｈｅ ＰＤＢｂｉｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ： Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ Ｋｎｏｗｎ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２００４；４７（１２）；２９７７−２９８０及びＷａｎｇ，Ｒ．；Ｆａｎｇ，Ｘ．；Ｌｕ，Ｙ．；Ｙａｎｇ，Ｃ．−Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．“Ｔｈｅ ＰＤＢ ｂｉｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ： Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００５；４８（１２）；４１１１−４１１９）。
（ｃ）固定化した金属キレートを持つクロマトグラフィーカラム及びヒスチジンの尾を持つアミノ基の位置で保護されたＬＥＰペプチドの選択的保持をすることができるクロマトグラフィーカラム。
【００４６】
酸性のｐＨにおけるカチオン交換クロマトグラフィーと例えばスルホン酸基（ＳＯ３−）などであり得るいくつかの陰性電荷を持つ多価官能基を持つ試薬によるペプチドの１級アミノ基の誘導体化の組合せを使用した場合に、ＲＲｎＫペプチドは保持フラクション中に選択的に単離することができる。ＲＲｎＫペプチドは全て酸性のｐＨにおいてＮ−末端アミノ基及びもう一つはＣ−末端アルギニンに位置する２個の陽性電荷を有するが、逆に、この試薬により誘導体化されたペプチドは酸性のｐＨにおいて多価陰性電荷を持ち、それはカチオン交換カラムには保持されないであろう。この変法は、ＲＲｎＫペプチドがカチオン交換クロマトグラフィーカラムに保持された場合に、マススペクトロメトリーによる分析の前にさらに分画することができるので、同定されるタンパク質の数を増加させる利点がある。前記と同じ原理に基づいて、アニオン交換クロマトグラフィーは少なくとも陰性電荷を有する修飾基を持つペプチドの全てを保持するために使用することもでき、そしてＲＲｎＫペプチドは非保持フラクションに選択的に単離されるであろう。
【００４７】
また、ＲＲｎＫペプチドはアミノ保護基とクロマトグラフィーのビーズの中に存在する反応基との間の化学反応により選択することができる。
【００４８】
（ｄ）例えば、ステップ３において使用された保護基が１級炭素の位置にハロゲン原子（基本的に臭素又はヨー素）を有している場合、又はそれらがチオエーテル又はマレイン酸イミジル基又はその構造中にチオール基を持つクロマトグラフィーのマトリックス又は磁気ビーズ中に存在するスルフヒドリル基の付加が可能であるその他の不飽和結合を有する場合。この目的のために、システイン残基と結合するチオセファロース（−ＳＨ）又はペプチド合成法用に設計されたいずれかの樹脂からＢｏｃ／Ｂｚｌにより調製されたチオール化された樹脂（例えば、必要な修飾を施したポリスチレンポリマーに基づくアミノメチル化樹脂、ＰＥＧ−アミノ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン）を使用することができる。また、クロマトグラフィーカラムとして、なかでも４−メトキシトリチルチオール化樹脂、２−クロロトリチルチオール化樹脂、Ｎ−（２−メルカプトエチル）アミン樹脂のようなチオール基で活性化された樹脂を使用することができる。
【００４９】
ＲＲｎＫペプチドは脱塩ステップの後にカチオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに分画することができ、そしてより大きな数のタンパク質の同定のために逆相を使用することができる（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，２４２−２４７，２００１）、或いは上記目的を達成するために逆相クロマトグラフィーによる二重分画をすることもできる。
【００５０】
この方法を定量的プロテオミクスに適用するには、２つの比較条件のうちの１つにおいて発生するペプチドはその構造中に数個の重い同位元素（１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ及び／又は２Ｈ）を有し、一方別の条件において発生したペプチドは前記の天然に多い同位元素（１２Ｃ，１４Ｎ，１６Ｏ及び／又は１Ｈ）を有している。
【００５１】
２つの比較条件のうちの１つにおいて発生するペプチドの構造中への重い同位元素の取り込みは、２つの異なる方法により行うことができる：
【００５２】
（ａ）細胞によって導入された同位元素標識。細胞増殖に必須な一定の栄養素の２つの同位元素種を含む培地で培養された組織又は細胞から得られたタンパク質の抽出に応用される。使用される栄養素の中では、窒素源（１４Ｎ／１５Ｎ）を構成する標識化合物が標識される；必須アミノ酸はある位置が水素（１Ｈ／２Ｈ）、窒素（１４Ｎ／１５Ｎ）、炭素（１２Ｃ／１３Ｃ）、酸素（１６Ｏ／１８Ｏ）などで標識される。この方法の特殊性のために、ＲＲｎＫペプチドは全てそのＣ−末端に少なくとも１個のアルギニン残基有しているので、このアミノ酸への重い同位元素の導入は選択的に単離されたペプチド全てが標識されていることを保証する。例えば、比較する条件の１つにおいて、培地は同位元素標識したアルギニン（１３Ｃ６−，１５Ｎ２−又は１５Ｎ４−アルギニン）の濃度を高くして行うことができ、別の条件では標識は行わない。次いで、両者の全タンパク質の抽出物を混合した後、それらを同時に加水分解し、ＲＲｎＫペプチドの選択的単離が達成されるまで、ステップ１〜６の記述にしたがってこの方法が行われる。
【００５３】
（ｂ）タンパク質分解の間に導入される同位元素標識。この方法のステップ２に記述したように、比較されるタンパク質の検体は別々に水溶液中で加水分解される。水溶液の一つは予め１８Ｏ（Ｈ２１８Ｏ）を加えて調製され、他方の水は天然の同位体濃度を有している。この方法により、最初の条件から得られるタンパク分解ペプチドは全て、そのＣ−末端のカルボン酸に１又は２原子の１８Ｏを取り込んで、標識される。その後、タンパク分解酵素の阻害物質の混合物又は使用したタンパク分解酵素の特異的阻害物質を添加することにより使用したタンパク分解作用の阻害を行い、両条件において消化されたタンパク質の等量を混合する。特にステップ５においてトリプシンによるＬＥＰペプチドの再消化の間にＲＲｎＫペプチドの標識が生じることは注意する必要があり、そのため消化溶液を調整するために使用されるＨ２１８Ｏの同位体純度の汚染を避けるために、このステップの前に試薬の添加を行ってはならない。同位体標識のこの方法を使用する場合には、酸性条件において１８Ｏ−標識ペプチドの長時間の処理は勧められない。その理由は、ペプチドのＣ−末端カルボキシル基へ酵素的に導入した標識の部分的又は完全な消失を生じ、定量に大きな誤差を生じる可能性があるからである。
【００５４】
相対的定量は、標識及び非標識ＲＲｎＫペプチドの混合物の同位体分布を計算するための適当なソフトウエアを使用してマススペクトルにより行われる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｔｏｐｉｃａ， Ａ Ｗｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４，３２，Ｗ６７４−Ｗ６７８ ａｎｄ ／ｏｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｓ Ｍｉｘｅｓ ｂｙ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｐｅａｋ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００４，１８，２４６５−２４７２）。このソフトウエアは標識及び非標識ＲＲｎＫペプチドの理論的同位体分布を算出し、そして理論的同位体分布から得られた面積が実験的に観察された同位体の面積に最も良く一致するような比率でそれらが組み合わされる。軽い及び重い同位元素（１２Ｃ／１３Ｃ，１４Ｎ／１５Ｎ，１６Ｏ／１８Ｏ及び／又は１Ｈ／２Ｈ）で標識されたペプチドに対応する面積のそれぞれの間に存在する比は、正規化した後に、比較する混合物中のペプチドを含むタンパク質の相対的比率に相当する。
【００５５】
定量を行うために、（ｔｏ）分析されるペプチド又はその配列の原子組成、（ｂ）実験に使用された同位体標識のタイプ及び（ｃ）関心のＲＲｎＫペプチドの実験的同位体分布を含むマススペクトルの領域を知る必要がある。この情報は全て非常に限定的であり、実験上のノイズを非常に正確に計算することができ、定量に関係のないほかの信号の重複を分析から除くことができる。これらの情報は全てソフトウエアを使用する定量方法を非常に強固にし、そして使用した同位体標識の方法とは関係ないものにする。
【００５６】
この提案した方法はペプチド及びタンパク質の分析に最も頻繁に使用されているイオン化方法を使用することができる：エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）。関心のペプチドはマススペクトロメーター中において選択され、それらは衝撃チャンバーを通過し、そこで衝撃として知られる操作を使用して解離を誘発し、充分な構造的情報を含むフラグメントが得られ、そして分析されるペプチドの部分的又は完全なアミノ酸配列の推定が可能になる。この情報を含むマススペクトルは、ＭＳ／ＭＳスペクトルとして知られている。それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルは、それを発生したペプチド配列に対して非常に典型的であり、それはフラグメントイオンの指紋と考えることができ、そして適当なソフトウエアの支援により配列データベースの中でそのペプチドの信頼性のある同定を行うのに充分である。事実、これは配列データベース中のタンパク質の同定を行う最も良く知られているサーチエンジンが使用している原理である：ＭＡＳＣＯＴソフトウエア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ， ＵＫ）（Ｐｅｒｋｉｎｓ， ＤＮ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． １９９９，２０，３５５１−３５６７）；及びＳＥＱＵＥＳＴソフトウエア（Ｔｒａｄｅｍａｒｋ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ． ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍａｃｋ， Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｏｕ Ｍｉｘ ｂｙ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ Ｌｏｗ−Ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ Ｌｅｖｅｌ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６９，７６７−７７６；Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄａｔｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９４，５，９７６−９８９； Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３８，８９７（Ｊｕｌ．２３，１９９６） Ｙａｔｅｓ，ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．）。
【００５７】
これらのソフトウエア（ＭＡＳＣＯＴ及びＳＥＱＵＥＳＴ）は、実験的に得られたＭＳ／ＭＳスペクトルをタンパク質配列データバース中に一定の分子マスを持ちそして使用したタンパク質分解酵素の特異的切断により生じた全ペプチドの理論的ＭＳ／ＭＳと比較する。理論的フラグメントのマス値と実験で得られた値の間で全く一致することを示すＭＳ／ＭＳスペクトルは分析するペプチドの値に相当するはずであり、したがってそれを含むタンパク質が推定され、配列データベースにおいて同定が行われる。
【００５８】
以下の参考文献は、タンパク質の同定、特に分析されたプロテオームにおいてマススペクトロメトリーの技術の一部の応用に関係している：Ｉｄｅｋｅｒ Ｔ， Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ， Ｒａｎｉｓｈ ＪＴＯ， Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ Ｒ， Ｂｕｈｌｅｒ Ｊ， Ｅｎｇ ＪＫ， Ｂｕｎｇａｒｎｅｒ Ｒ， Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ， Ｈｏｏｄ Ｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｏ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，９２９−３４； Ｇｙｇｉ ＳＰ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０００，４，４８９−４９４．； Ｇｙｇｉ ＳＰ，Ｒｉｓｔ Ｂ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｑｕａｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００；１，３９６−４０１； Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ， Ｂｒｕｃｅ ＪＥ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＧＡ， Ｒｉｓｔ Ｂ， Ｐａｓｓａｔｏｌｉｃ Ｌ， Ｆｉｅｈｎ ＯＲ， Ｓｍｉｔｈ ＲＤ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍａｓｓ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；７２，１１１２−８．及びＧｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ， Ｗａｔｔｓ ＪＤ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｃｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２０００；１４，３４４−３４８； Ｚｈｏｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１，１９，３７５−３７８．
【００５９】
提案した方法の高度な選択性を考慮すると、より速い同定を保証するために、偽陽性の同定を避けるために、そしてＭＡＳＣＯＴ及びＳＥＱＵＥＳＴソフトウエアを使用してより信頼性のある同定をするために、同定はＲＲｎＫペプチドのみを有するデータベースに限定することができる。
【００６０】
実施例
実施例１．ＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために提案された方法を適用した場合の、種々の生物のプロテオーム中のペプチドの複雑な混合物の単純化のインシリコ評価。
今日、ＤＮＡ分子の配列分析により達成された高い効率は、いくつかの生物の完全なゲノム配列を知ることを可能にした。これは逆にこれらのゲノムからいかなるタンパク質が誘導されるか、そして試験されているプロテオームに対して行われる特定のタンパク質分解処理によりいかなるペプチドが発生するかを予測することを可能にする。
【００６１】
ＲＲｎＫペプチドを選択的に単離した場合に可能である単純化の程度を見積もるために、所与の生物のプロテオームについて計算するＰＣに使用するためにＳＥＬＥＳＴＡＣＴと命名されたソフトウエアがＣで書かれた：
１−Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅに報告されているタンパク質の全数。
２−特定のタンパク質分解処理により発生するペプチド／タンパク質の全数。
３−この特定のタンパク質分解処理により発生するＲＲｎＫペプチド／タンパク質の数。
４−プロテオームの範囲内で、本発明において提案されている方法により同定に成功することができるＲＲｎＫペプチドを持つタンパク質のパーセンテージ（個別のプロテオームについて報告されているタンパク質の全数に関して）。
【００６２】
比較の目的で、このプログラムは、個別のプロテオーム中のシステイン残基を有するタンパク質分解ペプチドに関するパラメーターの算出にも使用され、したがってそれらは、先駆的方法でありそしてペプチドの選択的単離により頻繁に使用されそしてプロテオーム試験へ適用されているＩＣＡＴ法により確実に選択的に単離することができるであろう。
【００６３】
表１．図１に提案した方法を適用した場合の、種々の生物のプロテオーム中に含まれるＲＲｎＫペプチドのＳＥＬＥＳＴＡＣＴソフトウエアを使用したインシリコ分析。良く知られているＩＣＡＴ法を適用した場合の単純化の結果も示されている。
【表１】
ａ）Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅに報告されているタンパク質の全数に対応。
ｂ）種々の分析されたプロテオームのトリプシンによる特異的タンパク質分解により発生したトリプシン分解ペプチドの全数をコード化されたタンパク質の全数で割った。整数で示されている。
ｃ）図１に提案した方法を使用した場合に分析されたタンパク質当たりのＲＲｎＫペプチドの全数及びＩＣＡＴ法により得られた全数。整数で示されている。
ｄ）分析されたプロテオームの範囲は、この表のタイトルに記述したクロマトグラフィーの方法を使用して単離することができるＲＲｎＫペプチドを有するタンパク質の全数のパーセンテージを示す。この数字は、提案する方法（左）及びＩＣＡＴ法（右）である。
【００６４】
表１において、病原体、細菌、イースト、植物及び哺乳動物を含むいくつかのプロテオームについて得られた結果が示されている。理解できるように、平均５個のＲＲｎＫペプチド／タンパク質が選択的に単離され、これはＩＣＡＴ法により得られた値に類似するので、混合物は、平均１８個の典型的ペプチド／タンパク質からこれらのタンパク質にとって最適の値までかなり単純化されているであろう。提案された方法により試験することができる生物のプロテオームのパーセンテージとして示されるプロテオームの範囲（８６．４％）は、ＩＣＡＴにより達成される値（８７％）とも非常に類似している。しかし、個別のプロテオームが分析された場合に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓプロテオームの場合に著しい差が認められる。本発明による方法において、この生物のプロテオームの９４．６％の分析が可能であるが、他方、ＩＣＡＴが使用された場合には８０未満が分析できるに過ぎない。この微生物をプロテオミクスの道具を使用して試験する場合には、選択される方法は本発明のＲＲｎＫペプチドによる選択的単離でなければならない。ＳＥＬＥＳＴＡＣＴソフトウエアの使用は、本発明の方法を適用した時に、個別のプロテオームにおいて予想される結果を推定する場合に非常に有用であり、したがってプロテオミクス用のペプチドの選択的単離のほかの方法と比較することを可能にする。
【００６５】
これは、本発明の原理、クロマトグラフィーシステムを使用してＲＲｎＫペプチドを選択的に単離することは、ペプチドの複雑な混合物の理想的単純化をすることができ、同時に試験されるプロテオームの広範囲を含むことを保障するので、非常に有用であり、そして異なる進化の程度の生物のプロテオミクスの試験に首尾よく使用することができる。
【００６６】
後はだだ、実施例２に示すために、アミノ基の保護と修飾ペプチドを有効な方法で保持することができ、一方マススペクトロメーター中で分析するために非保持フラクションにＲＲｎＫペプチドを準備するクロマトグラフィーシステムの組合せが残されている。
【００６７】
実施例２．組換えストレプトキナーゼのＲＲｎＫペプチドの選択的単離。方法の選択性及び特異性の評価。
図１に提案した方法を組換えストレプトキナーゼ（ｒＳＫ，明細書の最後の配列１を参照）に適用した。このタンパク質はトリプシン消化により非常に多数のトリプシン分解ペプチドを生じるが（使用した酵素による完全な切断を考慮すると４２ペプチド）、ＲＲｎＫペプチドは５個のみであり（表２参照）、提案した方法の特異性及び選択性を非常に評価し易いので、このタンパク質をモデルとして選んだ。
【００６８】
表２．組換えストレプトキナーゼ（ｒＳＫ）のＲＲｎＫペプチドのアミノ酸配列及び理論的質量
【表２】
ａ）太字で示したアミノ酸はアルギニン残基におけるトリプシンの切断部位に相当する。矢印はトリプシンによる切断部位を示す。
【００６９】
続けて行うべきステップは以下の通り：
（１）タンパク質を、塩酸グアニジン２ ｍｏｌ／Ｌを含む５００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解し、１：２００の酵素：基質比でリシル−エンドペプチダーゼを加え、消化を３７℃で１６時間行った。
（２）タンパク分解ペプチドの混合物を０〜５℃の温度でインキュベートし、１級アミノ基（アルファ及びイプシロン）に対してモル比１０：１で修飾試薬（ビオチンアミドペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を加えた。混合物を短時間攪拌し、氷浴中で再度インキュベートした。この操作をさらに２回５分間の間隔を置いて行った。
（３）修飾されたＬＥＰペプチドを塩基性ｐＨでインキュベート（２〜３％トリエチルアミンで１時間３７℃）することにより、残った修飾試薬及びチロシン残基のＯ−アシル化を除いた。
（４）塩酸グアニジンの濃度が１ ｍｏｌ／Ｌになるまで消化緩衝液を希釈し、１：１００の酵素：基質比でトリプシンを加え、４時間３７℃で消化を行った。
（５）予めＨ２Ｏ／ＴＦＡ ０．０５％の溶液で平衡したＲＰ−Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ，２０ｘ２．１ ｍｍ）を使用する逆相クロマトグラフィーにより過剰の修飾試薬を除去し、移動相のアセトニトリル／ＴＦＡ（０．０５％ｖ／ｖ）含量を１から８０％まで１０分間で増加する急速グラジエントを使用してペプチドを単一フラクションとして集める。
（６）アフィニティーマトリックス（セファロースにストレプトアビジンを固定）を充填したクロマトグラフィーカラムを流量５００ ｃｍ／ｈで１２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）で平衡した。ペプチド混合物を同じ平衡溶液に溶解し、アフィニティーカラムに負荷した。２２６ ｎｍにおける吸光度を記録し、マススペクトロメトリーによる後の分析のために非保持フラクションを集めた。
（７）ＺｉｐＴｉｐ（Ｃ１８）を使用してＲＲｎＫペプチドを含有する非保持フラクションを脱塩し、マススペクトロメーターで分析した。
【００７０】
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（図２Ａ）は、ｒＳＫのＬＥＰの消化により生じたペプチドに対応するかなりの数のシグナルを示している。これらのシグナルのｒＳＫの配列に対する割当て、並びにそれぞれのペプチドの質量の実験値及び理論値を表３に示す。
【００７１】
表３．図２Ａで観察されたシグナルに対するｒＳＫのＬＥＰペプチドの割当ての要約。
【表３】
ａ）太字及びイタリックで強調されたアミノ酸はｒＳＫの５個のＲＲｎＫペプチドの配列に相当する。各ペプチドのＮ−及びＣ−末端の数字はそれぞれｒＳＫの配列中の位置に相当する。
ｂ）ｒＳＫのＬＥＰペプチドの実験で得られた質量。
ｃ）ｒＳＫのＬＥＰペプチドの理論上の質量。
【００７２】
表３のＬＥＰペプチド１３，１５及び２０は、表２に示されたｒＳＫ配列の５個のＲＲｎＫペプチドの配列を含んでいることに注意。
【００７３】
大部分のＬＥＰペプチドは、その構造の中に含まれる１級アミノ基（リシンの末端アミノ基及びイプシロンアミノ基）に加えられた保護基の数に相当する量でその分子質量が増加した。完全な切断により生じたＬＥＰペプチドの大部分は２個の保護基を付加しているはずである（２ｘ２２６ Ｄａ＝５５２ Ｄａ）、一つはＮ−末端のアミノ基に、そしてもう一つはＣ−末端に存在するリシン残基に。しかし、これらのペプチドの一部は予想よりも多い保護基を付加していた。例えば、図２Ｂにおいて、表３のビオチン化ペプチド１６及び２０に相当する質量３８０９．７５及び４４３９．０７のシグナルは、予想よりも１又は２個多い保護基を付加したことを、明らかに見て取ることができる（図２、網掛け菱形に加えられた数を参照）。
【００７４】
この修飾ペプチドに対応するＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの詳細な分析により、これらの付加はチロシン残基の側鎖に存在することが示された。これらの結果は、Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ ａｎｄ Ａｎｎａｎ（Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ Ｆ，ａｎｄ Ａｎｎａｎ ＲＳ． Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ−ｄｅｒｉｖｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２００４，７６，６６１８−６６２７）がトリプシン分解ペプチドの末端アミノ基を全て定量的に別の試薬で保護しようと試みたときに得られた結果と一致する。後に、チロシン残基におけるこの好ましくない修飾はこの実施例に記述されたステップ３に述べられている塩基による処理（図２Ｃ）により除かれた（Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ Ｆ． ａｎｄ Ａｎｎａｎ ＲＳ． Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ−ｄｒｉｖｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００４，７６，６６１８−６６２７）。図２Ｂの黒菱形の付いたシグナルは塩基処理の後には図２Ｃには存在しないので、塩基処理はこの副反応の影響を元に戻すのに有効であることを示していることに注目。図２Ｃに白丸で示されているシグナルは、その配列中にＲＲｎＫペプチドを有するビオチン化ＬＥＰペプチドに相当する。ＲＲｎＫペプチドを発生させるために、ビオチン化ＬＥＰペプチドはトリプシンで消化される。生成した混合物は図２Ｄに示されている。図２Ｄにおいて黒丸で標識されたシグナルはｒＳＫのＲＲｎＫペプチドに相当する。
【００７５】
ＲＲｎＫペプチドの選択的単離を達成するために、反応混合物は、ストレプトアビジンを固定化したセファロースカラムを通し、非保持フラクションをマススペクトロメトリーにより分析した。その結果を図２Ｅに示す。質量１４２３．７０，１５１８．７１及び１７３６．８４の３つのシグナルは、ＲＲｎＫペプチド、ＮＬＤＦＲＤＬＹＤＰＲ， ＤＳＳＩＶＴＨＤＮＤＩＦＲ 及び ＹＴＥＥＥＲＥＶＹＳＹＬＲにそれぞれ割付けられた。これら３個のＲＲｎＫペプチドの中で、１つだけが表２に含まれている（ペプチド１参照）。図２Ｅにおいて選択的に単離された質量１４２３．７０及び１７３６．８４のその他の２個のＲＲｎＫペプチドは、トリプシンの不完全な切断により生じ、そしてそれらは表２に示された残りの４個のＲＲｎＫペプチドを含んでいる。このトリプシンの不完全な切断は、アルギニン残基に隣接して酸性の残基（Ａｓｐ）の存在により生じる可能性がある。
【００７６】
図２Ｅのアスタリスクを付けた質量１３４３．６６のシグナルは、非ＲＲｎＫペプチドの非特異的単離によるものではなく、マススペクトロメトリー測定の際にイオン化部分において発生した質量１７３６．８０のＲＲｎＫペプチド３９０ＹＴＥＥＥＲＥＶＹＳＹＬＲ４０２のフラグメント（シリーズｙ”１１）に割り当てられた。
【００７７】
これらの結果は、図２ＤのＥＳＩ−ＭＳスペクトルに示されたペプチドの複雑な混合物をかなり単純化し、モデルタンパク質ｒＳＫについて理論的に予測される（表２に示された）５個のＲＲｎＫペプチドを、特異性なく、選択的に単離できるので、プロテオームの実験に首尾よく使用できることを示している。他方で、この方法の高い選択性及び特異性により、偽陽性の同定を避けるために、この目的のために工夫されたソフトウエアによるデータベースの調査をＲＲｎＫペプチドのみに限定することができる。
【００７８】
ＩＣＡＴ法が持っている一つの欠点、二次元電気泳動を使用しないペプチドの選択的単離のためにプロテオミクスに使用されている方法の欠点は、システイン含有ペプチドの全てに導入される試薬の高い分子質量であり、このためにその後のマススペクトロメトリー分析においてイオン化の効率及びフラグメンテーションに影響を及ぼす可能性がある。
【００７９】
これに対して、ＲＲｎＫペプチドはその構造の中に、この方法のステップの間に導入されるいずれのタイプの化学的修飾も有しておらず、衝撃誘発解離実験の際に気相におけるイオン化及びフラグメンテーションに影響しない。この利点は、気相におけるペプチドの有効なフラグメンテーションを得て、配列データベースにおけるより信頼性の高い同定を保証するために高く評価されている。
【００８０】
実施例３．化学的に活性な固体支持体を使用するＲＲｎＫペプチドの選択的単離。
ＲＲｎＫペプチドは、ＬＥＰペプチドにアミノ基の保護反応により導入された修飾基と反応する化学的に活性な基で官能化された固相支持体を使用して単離することができる。この方法により、既に記述したように修飾ペプチドと固相支持体の間に共有結合が形成される。一方、ＲＲｎＫペプチドはその構造中に化学的修飾を受けないので、それらは固相支持体と反応せず、非保持フラクション中に選択的に単離され、マススペクトロメトリーにより分析される。
【００８１】
この実施例において、遊離チオール基を含有する固相支持体（ＭＢＨＡメチルベンズヒドリルアミン樹脂）及び図３に示すようにチオール基と定量的に反応する２つの異なる化学試薬（ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によるＬＥＰペプチドの化学的修飾を使用することによるＲＲｎＫペプチドの選択的単離が示される。
【００８２】
固体支持体の調製は以下の方法で行われる：
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ／ＨＯＢｔ／ ＤＩＣ（１／１／１）の混合物の４倍過剰をジメチルホルムアミドに溶解して、予め活性化したＭＢＨＡ樹脂（１〜１．２ ｍｍｏｌ／ｇの置換基を持つ）に加えた。Ｋａｉｓｅｒアッセイが陰性になるまで反応を続けた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をジメチルホルムアミド中２０％ピペリジン混合物と２０分間処理して、末端アミノ基を保護するＦｍｏｃ基を除去する。続いて、ＤＭＦで数回洗う。Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）樹脂を数回メタノールで、最後にエーテルで洗う。それを真空中に２４時間保ち、そしてＣｙｓのチオール基を保護するＴｒｔ基を除くために、ＴＦＡ／ＥＤＴ／水／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）の混合物と２時間反応する。最後に樹脂を濾取し、エーテルで充分に洗う。
【００８３】
ｒＳＫタンパク質のＲＲｎＫペプチドを単離するために続くステップは、ステップ（２）においてアミノ基の保護を２つの異なる試薬、ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで別々に行ったことが異なる以外は、本発明の実施例３において記述したステップ（１）から（４）と同じであった。これに続くステップを以下に記述する：
【００８４】
（５）ｒＳＫを溶解したのと同じ溶液で予め平衡した固相支持体に、加えた試薬の量に対するチオール基のモル比を５０：１に維持して反応混合物を加えた。反応混合物を室温、暗所に置き、４時間ゆっくりと攪拌し、それぞれ、ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用した。
【００８５】
（６）修飾ペプチドを結合したマトリックスを１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により除き、同じ反応緩衝液で２回洗った。
【００８６】
（７）ｒＳＫのＲＲｎＫペプチドを含有する上清からＺｉｐＴｉｐｓを使用して脱塩し、マススペクトロメトリーで分析した。
【００８７】
上に記述した方法のステップを終えて得られた結果は、互いに非常に近似しており、２種類の試薬を使用して得られたＥＳＩ−ＭＳスペクトルで見てとることができる：ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図４Ａ）及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図４Ｂ）。両者の場合に（図４Ａ及びＢ）、シグナルｍ／ｚ９２９．５９，１４２３．７８，１５１８．９１及び１７３７．０３は得られたＥＳＩ−ＭＳスペクトルの中で最も強く、これらの質量の値はｒＳＫタンパク質のＲＲｎＫペプチドの予想される値に良く一致することを理解することができる（実施例２、図２Ｅ及び表２を参照）。
【００８８】
上記のシグナルの他には、認められる強度の他のシグナルは検出されていないので、非保持フラクション中に非ＲＲｎＫペプチドの非特異的単離はないことを示している。これらの結果は、固相支持体とＬＥＰペプチドの１級アミノ基に導入された保護基の間の化学反応を使用することは、プロテオミクス試験のＲＲｎＫペプチドの選択的単離に有用であることを示している。これらのマトリックスの使用は、その表面に高い濃度の活性化官能基を有する場合には、少量のマトリクスを使用することができ、これによって修飾ペプチドの定量的結合のみならず、ＬＥＰペプチドの定量的保護を達成するために加えた過剰の試薬の結合も保証する利点がある。特にこれは、選択的単離の前の脱塩ステップ（実施例２のステップ５を参照）を省略することによりＲＲｎＫアミノ基の選択的単離の方法を単純化する。
【００８９】
この実施例は、１級アミノ基のＬＥＰペプチドの保護ステップの際に導入された修飾試薬と固相マトリックス官能基の間の定量的化学反応を、ＲＲｎＫペプチドの高度に選択的で特異的な単離のために使用することができるというコンセプトも示している。
【００９０】
他方、この実施例において、修飾ペプチドを結合した固相支持体は簡単な遠心分離操作により除去されたが、固相支持体として１級アミノ基の修飾基と共有結合を形成することにより修飾ペプチドを捕捉するために適当に活性化された磁気ビーズが使用されている場合には磁場によりこれを行うことができる。
【００９１】
実施例４．ＲＲｎＫペプチドの選択的単離のためにカチオン交換クロマトグラフィーの使用。
実施例２及び３において、アフィニティークロマトグラフィーと活性化固相支持体及びＬＥＰペプチドのアミノ基に導入された保護基の間の化学反応をそれぞれ使用することにより、ＲＲｎＫペプチドは非保持フラクション中に単離される。この実施例において、ペプチドに陰性電荷を導入する試薬でアミノ基を誘導体化することを組み合わせたカチオン交換クロマトグラフィーもこの目的に使用することができることを示す。
【００９２】
このアイデアは、ＲＲｎＫペプチドは末端アミノ基には修飾がなく、そのＣ−末端にアルギニンを有しているので、酸性ｐＨで溶解された場合には少なくとも２個の陽性電荷を持ち、その配列中にヒスチジン残基を有する場合には陽性電荷の数は増加するという原理に基づいている。すなわち、ＲＲｎＫペプチドは多価陽性電荷を持つペプチドである。
【００９３】
他方、２回の消化ＬＥＰ／トリプシンにより発生した残りのペプチドは、１級アミノ基、そのＮ−末端アミノ基又はリシン残基の側鎖のアミノ基のいずれもが保護されている場合に、プロトン付加の場所がなくなるために陽性電荷を持つ可能性が除かれる。さらに、アミノ基の保護基が陰性電荷を持っている場合には、ペプチドの正味の陰性電荷はかなり増える。
【００９４】
強い酸に由来するので酸性ｐＨにおいても２個の陰性電荷を追加賦与する試薬によりそのアミノ基を誘導体化した後のＲＲｎＫペプチド及びｒＳＫの修飾ペプチドが持つはずの電荷を以下の表に示す。例えば、この特徴を充たす修飾試薬は、ペプチドにスルホン酸（ＳＯ３−）を導入することができる。
【００９５】
表４．３，５−ジスルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシクスクシンイミドエステルでアミノ基を誘導体化した後に、提案した方法により得られたタンパク分解ペプチドの陽性及び陰性電荷の相対値の分析。
【表４】
ａ）網掛けの行はｒＳＫのＲＲｎＫペプチドである。
ｂ）太字で強調したアミノ酸は塩基性アミノ酸、ヒスチジン及びアルギニンを示す。スルホン酸基で修飾したリシン残基はイタリックで強調されている。示したペプチドはＬＥＰ及びトリプシンの完全分解により発生した。
ｃ）トリプシンによる分解により発生した末端アミノ基を有するペプチド。
ｄ）修飾ペプチドの配列中に存在するスルホン酸基により導入された陰性電荷の数。
ｅ）塩基性アミノ酸アルギニン及びヒスチジン及びトリプシンによる切断により発生したペプチドのアミノ末端により提供される陽性電荷。
ｆ）それぞれのペプチドの陰性及び陽性電荷の合計。
【００９６】
酸性ｐＨにおけるペプチドの正味電荷は、（遊離の末端アミノ基を有するペプチドにおけるアルギニン及びヒスチジン及び末端アミノ基により分配される（Ｒ＋Ｈ＋Ｎｔ））陽性電荷及びＬＥＰペプチドの１級アミノ基に加えられた修飾試薬中に存在する２個のスルホン酸基により提供される陰性電荷の合計として考えられた。
【００９７】
ｒＳＫの５個のＲＲｎＫペプチドは多価陽性電荷（ｚ＝２＋から３＋）を持っており、他方、その他のペプチドは中性又は陰性電荷を持つ可能性があることをこの結果は示している。これは、カチオン交換クロマトグラフィーによるこれらのペプチドの混合物の分離は可能であることを示している。
【００９８】
各修飾アミノ酸に２個の陰性電荷を導入するために、３，５−ジスルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが次のプロトコールを使用して合成される：
１モルの３，５−ジスルホ安息香酸をＴＨＦに溶解し、１モルのジイソプロピル カルボジイミド及び１．５モルのＮＨＳと２０時間反応させる。沈殿を濾取し、上清をロータリーエバポレーターで濃縮する。得られた沈殿を酢酸エチルで結晶化する。
【００９９】
カチオン交換クロマトグラフィーを使用してＲＲｎＫペプチドを単離するために、実施例２に記述したのと同じステップ（１）〜（５）が続くが、違いは、ＬＥＰペプチドの１級アミノ基を保護するためにステップ２において、同じ反応緩衝液に溶解した３，５−ジスルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを反応混合物（ＨＥＰＥＳ ５００ ｍＭ，ｐＨ ８．０）に加えたことである。
【０１００】
次のステップを以下に記述する：
（６）カチオン交換クロマトグラフィーカラム（１０ｘ５ ｍｍ）にＭｅｒｃｋ社のＥＭＤ−６５０（Ｓ）ＳＯ３−マトリックスを充填し、ＴＦＡ（０．０５％ｖ／ｖ）の溶液で平衡した。オクチルグルコシド０．５％（ｗ／ｖ）を含有する平衡緩衝液に溶解したペプチドを５００ ｃｍ／ｈの流量でカラムに適用した。２２６ ｎｍで吸光度を記録した。非保持フラクションを捨て；カラムを充分に洗って使用した洗剤の残りを除去した。保持されたペプチドを２モル／ＬのＮａＣｌを含有する同じ平衡緩衝液を使用して溶出した。保持フラクションをマススペクトロメトリーによる分析のために集めた。
【０１０１】
（８）ＲＲｎＫペプチドを含む非保持フラクションをＺｉｐＴｉｐ（Ｃ１８）で脱塩し、マススペクトロメーターで分析した。
【０１０２】
ここに記述されたクロマトグラフィーシステムは、タンパク質のＣ−末端（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｏ ｍｕｔａｔｅｄ（Ｃｙｓ１２５−Ａｌａ） ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２． Ｍｏｙａ Ｇ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ， Ｈｕｅｒｔａ Ｖ， Ｇａｒｃｉａ Ｙ， Ｍｕｌｂｅｒｒｙ Ｖ， Ｐｅｒｅｚ Ｄ， Ｈｅａｔｈ Ｆ， Ｍ． Ｃｌａｗｓ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ． ２００２，９７１（１−２），１２９−４２）及びタンパク質の保護されたＮ−末端（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｇｅｓｔｓ． Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｌ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ， Ｔａｋａｏ Ｔ， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ２００１，５７（５），３４５−５３）を含むペプチドの選択的単離のために工夫された方法において中性のペプチドから陽性荷電ペプチドを分離するために首尾よく使用することができ、そしてそれより最近その使用はプロテオーム試験のためのペプチドの選択的単離に拡張された（ＳＣＡＰＥ：Ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｐｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｌ， Ｇｉｌ Ｊ， Ｂｅｓａｄｅ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅ−Ｃｏｓｓｉｏ Ｊ， Ｇａｒｃｉａ Ｌ， Ｐａｊｏｎ Ｒ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ， Ａｌｖａｒｅｚ Ｆ， Ｐａｄｒｏｎ Ｇ． Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００５，４，４９１−４９６）。
【０１０３】
表４に示された結果を分析すると、ｒＳＫの５個のＲＲｎＫペプチド（ペプチド１８，２９，３０，３７及び３８）は、そのアミノ基が２個のスルホン酸基を導入する試薬で修飾された後に酸性ｐＨにおいて正味の陽性電荷を持つ唯一のペプチドであることが明らかに理解することができる。逆に、その他のペプチドは、この修飾を受けているので、その正味の電荷は陰性又は中性であるために、中性のペプチドから陽性に荷電したペプチドを分離するために設計されたこのクロマトグラフィーシステムもまた保持フラクション中のＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために首尾よく使用することができる。
【０１０４】
このことは、保持フラクションのＥＳＩ−ＭＳスペクトルが得られ、そして予想されるｒＳＫのＲＲｎＫペプチドだけがすべて検出されたときに示された（図５）。質量１４２３．７５及び１７３６．８８のシグナルはこの実施例の表４には含まれていないが、これらはペプチド３２１Ｎ−Ｒ３３１及び３９０Ｄ−Ｒ４０２に対応し、またそれらはアルギニン残基の位置での特異的切断により生じたのでＲＲｎＫに分類され、そしてそれらは配列の中にリシン残基を持っていないことを指摘するのは重要なことである。これらのペプチドはトリプシンの不完全な切断により生じ、表４に示されたＲＲｎＫペプチド（２９及び３０）及び（３７及び３８）の配列を含んでいる。
【０１０５】
同様に、修飾ペプチドは陰性電荷を持ちそして容易に保持することができるので、アニオン交換クロマトグラフィーをＲＲｎＫペプチドの選択的単離に使用することができるであろう。逆に、ＲＲｎＫペプチドは構造の中にスルホン酸基を持たないペプチドであり、それらは非保持フラクションに単離されるであろう。この場合に、ＲＲｎＫペプチドは非保持フラクションに単離されるであろう。
【０１０６】
修飾ペプチドはより多くの陰性電荷を持つが、提案した方法の選択性及び特異性は高いので、カチオン交換クロマトグラフィーを使用することにより修飾ペプチドとＲＲｎＫペプチドの分離を容易に達成することができる。
【０１０７】
ＬＥＰペプチドのアミノ基が保護された後に、それらがより疎水性の分子種に変換され、ある場合にはその溶解性が損なわれることがあるが、荷電した基で修飾した場合は前の実施例に使用した試薬よりも水性媒体における溶解性の増加が保証されるはずである。このことは、本発明の方法に提案されたアミノ基の保護に伴う損失の減少に役立つはずである。
【０１０８】
ＲＲｎＫペプチドの選択的単離に使用されたのと同じクロマトグラフィーカラムは、関心のペプチドの追加の分画に使用することができる。これはこの方法を単純化するのみならず、ＭｕｄＰｉｔ実験（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，２４２−２４７，２００１）において行われたのと同様な方法で交代塩グラジエント及び逆相による多数のタンパク質の同定を行うこともできる。
【０１０９】
この実施例で得られた結果は、陰性電荷を導入するペプチドのアミノ基の適当な誘導体と組合せたカチオン交換クロマトグラフィーは、プロテオーム実験におけるＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために首尾よく使用できることを示している。
【０１１０】
実施例５．１８Ｏによる同位体標識を使用するＲＲｎＫペプチドの選択単離による２つの人工的混合物（Ａ及びＢ）中のタンパク質成分の同定及び相対的定量。
それぞれタンパク質ｒＳＫ、組換えヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）、リゾチームＣ、オボアルブミン、Ｐ６４Ｋ及びＢＳＡからなる２つの人工的混合物Ａ及びＢが調製された。Ａ／Ｂのモル比は、それぞれのタンパク質について異なった：ｒＳＫ １：１、リゾチーム ２：１、オボアルブミン ３：１、Ｐ６４Ｋ １：３、そしてＢＳＡ １：５。これらのタンパク質の配列は本明細書の配列表（１〜６）に示されている。
【０１１１】
５ ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質Ａ及びＢの混合物を別々に、２ ｍｏｌ／Ｌの塩酸グアニジン及び１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２００ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した。システイン残基の濃度に対して５０倍モル過剰のＤＴＴを加え、反応混合物を窒素雰囲気中３７℃で４時間インキュベートした。溶液を室温に冷却し、前に加えたＤＴＴの量に対して２倍過剰のアクリルアミド溶液を加え、暗所に１時間置いた。両混合物を、１：１００の酵素：基質比を使用してＬＥＰタンパク分解酵素で８時間３７℃において消化した。反応混合物を０〜５℃の温度に冷却し、発生したペプチドの１級アミノ基の濃度に対して８：１の比率を使用して保護試薬（ビオチンアミドペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を２０分の間隔で３回加える。次いで、５％の濃度でトリエチルアミンを加え、反応を３７℃で１時間インキュベートする。生成する混合物を透析し、別々に通常の水（混合物Ａ）及びＩＳＯＴＥＣにより提供された９９％同位体純度の１８Ｏ−標識水（Ｈ２１８Ｏ）（混合物Ｂ）を使用して再構成する。両者を１：２０の比率のトリプシンを使用して３７℃で消化する。４時間後、タンパク分解を停止し、発生した標識ペプチドと非標識ペプチドを混合した後に酵素により触媒される同位体交換を避けるために、トリプシンの量に対して２：１の濃度でアプロチニン溶液を両混合物に加えた。ペプチドの両混合物は混合され、そして加えられた過剰の保護試薬を除くためにアセトニトリルの急速グラジエントを使用して逆相クロマトグラフィーにより脱塩する。ペプチドの混合物を濃縮し、ストレプトアビジンを固定化したセファロースからなるアフィニティーマトリックスに使用したのと同じ平衡溶媒に溶解した。検体に２ ｃｍ／ｈの流量を適用し、非保持フラクションを脱塩し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１１２】
混合物Ｂのタンパク分解の間に、１８Ｏで標識されたペプチドはそのＣ−末端に１及び２原子の１８Ｏを付加することができるので、両条件の下に得られたペプチドの相対的量を計算するためのこの比はペプチドに対応する同位体分布の面積比により与えられるので、１原子（１８Ｏ１）及び２原子（１８Ｏ２）の１８−酸素を取り込んだペプチドの分布の面積で１６Ｏ２の面積を割った、次の式：
（面積１６Ｏ２）／（面積１８Ｏ１＋面積１８Ｏ２）
に従って得られることを記憶に留めておくことが必要である。
【０１１３】
分析する混合物中のペプチドの相対的定量は、本発明の方法の詳細な説明の中で説明されているように、ＩＳＯＴＯＰＩＣＡソフトウエアを使用して行われる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｔｏｐｉｃａ， Ａ Ｗｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４，３２，Ｗ６７４−Ｗ６７８ ａｎｄ／ｏｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｐｅａｋ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００４；１８；２４６５−２４７２）。
【０１１４】
調製された混合物中に存在する６個のタンパク質のＲＲｎＫペプチドは単離され、そして１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験において配列分析され、ＭＡＳＣＯＴソフトウエアにより行われた同定の結果並びに定量の結果は表３に示される。
【０１１５】
特に、定量を行うために、これらのペプチドの同位体分布の拡大された領域が選ばれ、分析されるペプチドの全体の式及び１８Ｏによる標識と共にＩＳＯＴＯＰＩＣＡソフトウエアに導入された。
【０１１６】
表３．１８Ｏ／１６Ｏで標識された２つの人工的混合物中に存在する５個のタンパク質のＲＲｎＫペプチドの選択的単離及びその選択的定量の要約。
【表５】
ａ）ＭＡＳＣＯＴソフトウエアにより自動的に同定されたＲＲｎＫペプチドの配列。
ｂ）比較された人工的混合物Ａ及びＢの中のタンパク質の理論的比。
ｃ）２つの比較された人工的混合物中に存在するタンパク質の相対的量を測定したときに得られた実験値。太字は相対的定量値の平均及びカッコ内は標準偏差の値。
【０１１７】
６個のタンパク質について、相対的定量に対応する実験値の平均は理論値に良く一致し、得られた標準偏差は非常に小さかった（５％未満）。
【０１１８】
これらの結果は、この方法は定量的プロテオミクスに使用することができ、非常に良い精度で混合物中に存在するタンパク質の相対的量を測定できることを示している。同定されたタンパク質の一つのタンパク質について得られた実験的同位体分布に対応する面積の調整は図３に示す。
【０１１９】
全ての場合に、理論的分布の理論的輪郭（赤線）及び実験で得られたスペクトル（黒い影をつけたスペクトル）の間で非常に良好な調整が得られたことが認められる。それぞれのタンパク質に属すペプチドの相対的定量について得られた結果は、理論値に非常に近似しており、定量的プロテオーム試験におけるこの方法の有用性を示している。
【０１２０】
ＲＲｎＫペプチドの選択的単離方法は１８Ｏ−標識と完全に調和しており、ペプチドのＣ−末端に導入される標識に影響しない単離方法でそのステップが構成されているのでいずれの生物学的システムの定量的プロテオミック試験にも適用することができる。１６Ｏ／１８Ｏ標識法は、比較するタンパク質混合物のタンパク分解の間に発生するペプチドの全てに普遍的に導入することができる。
【０１２１】
それぞれのタンパク質の相対的定量に関する実験値と理論値の一致は、使用した同位体標識（１８Ｏ）が標識ペプチドと非標識ペプチドの同位体分布の分離を保証しない場合でも、ＩＳＯＴＯＰＩＣＡソフトウエアが信頼性のある結果を提供することをわれわれに確証する。
【０１２２】
選択的単離のこの方法において、ＲＲｎＫペプチドは全てＣ−末端にアルギニンを有しているので、アルギニン残基に１３Ｃ６で特異的に標識を導入するＳＩＬＡＣとして知られている方法（Ｇｒｕｈｌｅｒ Ａ， Ｓｃｈｕｌｚｅ ＷＸ，Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ Ｒ， Ｍａｎｎ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ． Ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００５，４（１１），１６９７−７０９）が相対的量の測定に使用できると予想することができる。一部の方法において、培養条件により導入されるいずれかの他のタイプの標識（１Ｈ／２Ｈ又は１４Ｎ／１５Ｎ）をアルギニン残基に使用することができる。
【０１２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びデータベース検索。
測定はＭｉｃｒｏｍａｓｓ社（マンチェスター、英国）のハイブリッドマススペクトロメーター（４重極及び飛行時間、ＱＴｏｆ−２）において行われる。マススペクトロメーターは２００ｘ１ ｍｍ（Ｖｙｄａｃ， ＵＳＥＳ）のカラムを通してオンラインでＨＰＬＣ（ＡＫＴＡ Ｂａｓｉｃ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓｗｅｄｅｎ）に連結された。ペプチドは、緩衝液Ｂ（アセトニトリル中ギ酸０．２％）の５から４５％への直線的グラジエント（１２０分）で溶出した。
【０１２４】
マススペクトロメーターは、コーン及びキャピラリー電圧、それぞれ３５及び３０００ボルトで運転された。ＭＳ／ＭＳスペクトルの取得のために、７カウント／セグの強度を越えた後、１価、２価、３価荷電の前駆イオンを自動的に選択した。測定モードは、全イオン流（ＴＩＣ）が２カウント／セグに減少した場合又はＭＳ／ＭＳスペクトルを４秒間で取る場合にはＭＳ／ＭＳからＭＳに変更した。取得及びデータ処理はＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア（バージョン３．５、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，英国）により行い、一方、ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づくタンパク質の同定はインターネットのＭＡＳＣＯＴソフトウエア無料バージョンにより行った。探査パラメーターの中に、システイン修飾並びに酸化及び脱アミド化の可能性を含めた。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】定量的プロテオミクスに応用するために本発明に記述された方法を使用してＲＲｎＫペプチドの選択的単離を示す図。黒い菱形により、ＬＥＰペプチドの１級アミノ基に加えられたビオチン基が示されている。
【図２】ＲＲｎＫペプチドの選択的単離がモデルタンパク質：組換えストレプトキナーゼ（ｒＳＫ）で示されている。（Ａ）ＬＥＰペプチドの混合物のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。ビオチン化反応により数個の保護基を加えた２つのＬＥＰペプチドは黒矢印で示されている。（Ｂ）その１級アミノ基の完全なビオチン化の後のペプチド混合物のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。１級アミノ基及びチロシン残基にそれぞれ加えられたビオチン残基は白と黒の菱形で示されている。（Ｃ）チロシン残基のＯ−アシル化の除去及び過剰の保護基の分解の後のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。潜在的ＲＲｎＫペプチドを含む保護されたＬＥＰペプチドは白丸で示されている。（Ｄ）保護されたＬＥＰペプチドのトリプシン消化のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。ｒＳＫのＲＲｎＫペプチドは黒丸で示されている。（Ｅ）本発明の目的の方法を適用した後のＲＲｎＫペプチドの選択的単離。
【図３】固相支持体中のチオール基とＬＥＰペプチドの１級アミノ基に導入された保護基（マレインイミドプロピオニル及びヨー化アセチル）の間の化学反応。網の入った円は遊離チオール基で活性化された支持固相を示す。
【図４】固相支持体としてチオール基で活性化されたＭＢＨＡ樹脂及び２つの保護基：マレインイミジル及びヨウ化アセチルを使用したｒＳＫのＲＲｎＫペプチドの選択単離に対応する（Ａ）及び（Ｂ）に示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図５】本発明中で提案されている方法及びカチオン交換クロマトグラフィー及び保護基として３，５−ジスルホ−安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの組合せを使用するｒＳＫのＲＲｎＫペプチドの単離に対応するＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図６−１】黒色で示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、アミノ基をビオチンで保護した後、セファロースにストレプトアビジンを固定化したアフィニティークロマトグラフィー及び２つの人工的混合物におけるタンパク質の相対的定量を行うために１８Ｏの標識を使用し、実施例１に示した選択的単離方法を適用した後得られたペプチド、３２７ＬＤＶＶＥＭＭＤＧＬＭＱＧＡＤＲ３２２（Ｐ６４Ｋ），１４３ＥＬＩＮＳＷＶＥＳＱＴＮＧＩＩＲ１５８（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ），６２ＷＷＣＮＤＧＲ６８（ｌｙｓｏｚｙｍｅ），５４ＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲ７６（ＥＰＯ），及び３３７ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ３４７（ＢＳＡ）の実験的同位体分布に対応する。それぞれのスペクトルにおいて、２原子の１６Ｏ２（青色）、及びＣ−末端に１原子（紫色）及び２原子の１８Ｏ（黄色）を持つペプチドに相当する同位体分布が示される。それぞれの場合に示された比率において既に述べた３種の混合物（１６Ｏ２，１８Ｏ１及び１８Ｏ２）の理論的同位体の分布は赤色で示されている。
【図６−２】黒色で示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、アミノ基をビオチンで保護した後、セファロースにストレプトアビジンを固定化したアフィニティークロマトグラフィー及び２つの人工的混合物におけるタンパク質の相対的定量を行うために１８Ｏの標識を使用し、実施例１に示した選択的単離方法を適用した後得られたペプチド、３２７ＬＤＶＶＥＭＭＤＧＬＭＱＧＡＤＲ３２２（Ｐ６４Ｋ），１４３ＥＬＩＮＳＷＶＥＳＱＴＮＧＩＩＲ１５８（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ），６２ＷＷＣＮＤＧＲ６８（ｌｙｓｏｚｙｍｅ），５４ＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲ７６（ＥＰＯ），及び３３７ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ３４７（ＢＳＡ）の実験的同位体分布に対応する。それぞれのスペクトルにおいて、２原子の１６Ｏ２（青色）、及びＣ−末端に１原子（紫色）及び２原子の１８Ｏ（黄色）を持つペプチドに相当する同位体分布が示される。それぞれの場合に示された比率において既に述べた３種の混合物（１６Ｏ２，１８Ｏ１及び１８Ｏ２）の理論的同位体の分布は赤色で示されている。
【図６−３】黒色で示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、アミノ基をビオチンで保護した後、セファロースにストレプトアビジンを固定化したアフィニティークロマトグラフィー及び２つの人工的混合物におけるタンパク質の相対的定量を行うために１８Ｏの標識を使用し、実施例１に示した選択的単離方法を適用した後得られたペプチド、３２７ＬＤＶＶＥＭＭＤＧＬＭＱＧＡＤＲ３２２（Ｐ６４Ｋ），１４３ＥＬＩＮＳＷＶＥＳＱＴＮＧＩＩＲ１５８（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ），６２ＷＷＣＮＤＧＲ６８（ｌｙｓｏｚｙｍｅ），５４ＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲ７６（ＥＰＯ），及び３３７ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ３４７（ＢＳＡ）の実験的同位体分布に対応する。それぞれのスペクトルにおいて、２原子の１６Ｏ２（青色）、及びＣ−末端に１原子（紫色）及び２原子の１８Ｏ（黄色）を持つペプチドに相当する同位体分布が示される。それぞれの場合に示された比率において既に述べた３種の混合物（１６Ｏ２，１８Ｏ１及び１８Ｏ２）の理論的同位体の分布は赤色で示されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野、特にプロテオミクスの分野に関係する。プロテオミクスは、生物の全遺伝子群（ゲノム）のタンパク質の全てとして定義されるプロテオームを試験の対象とする分析手段及び方法の全群を含む学問分野である。
【背景技術】
【０００２】
生物のプロテオームは非常にダイナミックであり、そしてゲノムから由来するタンパク質を予測することは可能であるが、所与の瞬間に発現するタンパク質及びそのそれぞれの相対的量（定量的プロテオミクス）を予測することは不可能である。プロテオミクスは今日、二つの分析手段：二次元電気泳動（２ＤＥ）及びマススペクトロメトリー（ＭＳ）の調和の取れた組合せのお陰で実現している。２ＤＥはタンパク質の複雑な混合物の分離のためには最も強力な手段であり、それらの相対的定量も可能にする。一方マススペクトロメトリーは、非常に高い感度（ｆモル）を有しており、分析したペプチドの構造の解明及び翻訳後修飾の検出を可能にする。
【０００３】
２ＤＥは、プロテオミクス試験において大量スケールにそれを使用することを阻害するいくつかの欠点を持っている（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｎ ｉｍｐｏｓｓｉｂｌｅ ａｍｏｕｒ． Ｓａｎｔｏｎｉ Ｖ．， Ｍｏｌｌｏｙ Ｍ．， Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ Ｔ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２１，１０５４−１０７０，２０００； Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ−ｐｉｔｆａｌｌ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ． Ｈａｙｎｅｓ Ｐ．Ａ．， Ｙａｃｈｔｓ ＩＩＩ Ｊ．Ｒ． Ｙｅａｓｔ． １７，８１−８７，２０００）：
−疎水性タンパク質の分析の困難さ。例えば、常にワクチン開発の魅力的な候補である膜タンパク質は二次元ゲルにおいて低く呈示されることは良く知られている。
−極端な等電点のタンパク質は効率よく集めることができない。
−高品質で再現性のある二次元ゲルの精巧さには非常な苦心と熟練が必要である。
−マススペクトロメーターと直接結合できないので、合理的時間内の高処理分析をかなり制限する。
−別々に発現したタンパク質を検出するための自動的方法におけるゲルの画像解析は専門家の介入を不要にするほどには有効でないので、時間を要する。
【０００４】
このような理由のために、完全なタンパク質でプロテオームの定量的試験を行う代わりにペプチドで行う傾向が生じた。マススペクトロメトリーによって決定されるペプチド（３〜５個のアミノ酸）の短い配列は、配列データベースにおいて元のタンパク質の信頼性のある同定を行うのに充分であるために、これが可能である（Ｅｒｒｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ． Ｍａｎｎ Ｍ， Ｗｉｌｍ Ｍ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６， ４３９０−４３９９， １９９４）。
【０００５】
一方、疎水性タンパク質のタンパク分解消化は、取り扱い易い非疎水性ペプチドを一部発生させることさえできる。この理由により、大多数のタンパク質を同定することにより高処理定量的プロテオミクスの試験を行い、二次元電気泳動を使用しない戦略が生じることも促進された。
【０００６】
この方向の先駆的仕事は１９９９年にＬｉｎｋと共同研究者により成され（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７，６７６−６８２，１９９９）、彼らはマススペクトロメトリーに直結した二次元クロマトグラフィーシステムを開発した（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。
【０００７】
これらの著者はミクロキャピラリーカチオン交換カラム、続いて逆相カラムを充填した。ペプチドは酸性のｐＨにおいて注入され、全てカチオン交換樹脂に吸着され、その後移動相の塩濃度を増加することにより、これらのペプチドのフラクションが逆相カラム上に溶出される。アセトニトリルの連続グラジエントにより逆相カラムに残留したペプチドは溶出され、それらはマススペクトロメトリーにより分析され、配列データベースにおいてその同定が行われる。カチオン交換カラムに吸着されたペプチドが全て完全に溶出するまで、この操作は数回繰り返される。科学文献においてこの方法はＭｕｄＰｉＴ（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）として知られており、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの総タンパク質の加水分解物から出発して１４８４個のタンパク質を同定することができた（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，２４２−２４７，２００１）。
【０００８】
現在のマススペクトロメーター及びクロマトグラフィーシステムの効率では特別のプロテオームのタンパク質分解により発生するペプチドの複雑な混合物を直接分析することはできないので、現在の知識はこの分画は大多数のタンパク質の同定には必須であることを示している。マススペクトロメーターにクロマトグラフィーシステムをオンラインで結んだときに、この方法は疑いもなく高処理タンパク質同定を促進したが、しかし試験している混合物中に存在するタンパク質の相対的定量測定は未だ解決されていなかった。この問題を解決する最初のステップは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞が窒素−１４（１４Ｎ）を含有する培地中で、そして他の細胞が窒素−１５（１５Ｎ）を含有する培地中で増殖したときに、Ｗａｓｈｂｕｒｎ ＭＰ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｄａｔｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｖｉａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７４：１６５０−１６５６，２００２）によって行われた。この方法を実施した際に、一つの条件に由来するタンパク質は全て１５Ｎで標識され、そして他の条件に由来するタンパク質は１４Ｎで標識された。彼らは両条件下で得られたタンパク質を混合した；全タンパク質の特異的タンパク分解が行われ、次いでマススペクトロメトリーによるペプチド配列分析によりタンパク質の同定が行われた。タンパク質の相対量の測定は１５Ｎ／１４Ｎで標識されたペプチドの強度比により行われた。
【０００９】
しかし、この同位元素標識の方法は常に実施することができるものではなく、同位元素を加えた培地の高いコストのために、イースト及び細菌のような単純な生物においてのみ現在のところ実行可能である。他方、このタイプの標識は試験する生物学的システムにおいて常に実現可能というものではなく、また標識されたペプチドと非標識ペプチドの間に生じるマスシフトはペプチド配列中に存在する窒素原子の数によるので、１５Ｎによる標識は同定操作に一定の複雑さをもたらすことを指摘する必要がある。この最後の困難を乗り越えるために、特別な標識アミノ酸を添加した培地において試験中の生物を増殖するときに他の著者は一部のアミノ酸への同位元素標識の導入を制限した。この方法はＳＩＬＡＣ（ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｂｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）と命名され、二つの比較される条件において標識及び非標識ロイシン又はリシンを添加した培地を使用して１２Ｃ／１３Ｃ及び１Ｈ／２Ｈによる標識を使用したかなりの数の出版物がある（Ｓ．Ｅ．Ｏｎｇ， Ｂ．Ｂｌａｇｏｅｖ， Ｉ．Ｋｒａｔｃｈｍａｒｏｖａ， Ｄ．Ｂ．Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｈ．Ｓｔｅｅｎ， Ａ．Ｐａｎｄｅｙ， Ｍ．Ｍａｎｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００２，１，３７６−３８６；Ｂｅｒｇｅｒ ＳＪ， Ｌｅｅ ＳＷ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＧＡ， Ｌｉｊｉａｎａ ＰＴ， Ｔｏｌｉｃ Ｎ， Ｓｈｅｎ Ｅ， Ｚｈａｏ Ｒ， Ｓｍｉｔｈ ＲＤ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄａｔｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ−ＭＳ／ＭＳ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００２，７４，４９９４−５０００；及びＰｒｅｃｉｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｙｓｉｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍａｓｓ Ｔａｇｇｉｎｇ， Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００３，１４，１−７）。重いペプチドに対して軽いペプチドのマスシフトは、ペプチド配列が標識アミノ酸を含む場合にのみ生じる；したがって標識アミノ酸を持たないペプチドは定量に使用できない。ＳＩＬＡＣの使用は、その高コストのためにプロテオミクスの実験の全てに普遍的な方法として使用することはできず、培地を使用して試験する生物学的課題にのみ適用される。
【００１０】
タンパク質の複雑な混合物のタンパク質分解によって発生するペプチドの全てのＣ−末端カルボキシル基に取り込むことができるので、プロテオミクスの実験において定量を行うための１８Ｏによる標識はより普遍的方法である。一つのタンパク質混合物は通常の水で調整された緩衝液の存在下に消化され、一方別の混合物は１８Ｏで標識された水（Ｈ２１８Ｏ）の存在下に消化される。Ｈ２１８Ｏで調製された緩衝液中で得られたペプチドはそのＣ−末端に１および２原子の１８Ｏを取り込むことができ、他方、他のペプチドは自然の同位元素分布を示す。標識及び非標識分子種の相対的定量を行うために、マススペクトル中で１６Ｏ／１８Ｏで標識された分子種の同位元素分布に相当する面積を計算する必要があり、ペプチドが同定された後に、それらを含むタンパク質の比率を推定する。このタイプの標識には二つの限界があり、一つは、標識及び非標識ペプチドの同位体分布の間に充分な分離が生ぜず、もう一つは、１８Ｏの付加が各ペプチドに対して１及び２原子の１８Ｏの均一な付加ではない。適当なソフトウエアが複雑に重複した同位体の分布を正しく解釈できなければ、これらの二つの問題は軽い種及び重い種の相対的定量に重大な意味を持つ可能性がある。
【００１１】
同位体分布の重複を避けるために、そしてペプチドのＣ−末端の１８Ｏの取り込みを均一化するために、Ｙａｏ及び共同研究者（Ｙａｏ Ｘ， Ａｆｏｎｓｏ Ｃ ａｎｄ Ｆｅｎｓｅｌａｕ Ｃ． Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ １８Ｏ ｌａｂｅｌｉｎｇ： ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ １６Ｏ−ｔｏ−１８Ｏ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３，２，１４７−５２）は、トリプシンの存在下にタンパク分解ペプチドの長時間インキュベーションにより消化操作後のタンパク分解ペプチドを １８Ｏで完全に標識することを提案した。
【００１２】
この方法により、トリプシン分解ペプチドのＣ−末端に２原子の１８Ｏの完全取り込みが保証されそして標識及び非標識ペプチドの同位元素分布の間に４ Ｄａの分離が達成される。しかし、塩基性アミノ酸リシン及びアルギニンのＣ−末端におけるペプチド結合のトリプシン切断の親和性に比較してこの方法の親和性は非常に劣っているので、１８Ｏ−原子の取り込みに抵抗するペプチドがある。これが起こった場合には、大きな誤差が定量に持ち込まれる可能性がある。他方で、１８Ｏによる１６Ｏの完全な交換を保証するトリプシン分解ペプチドの長いインキュベーション時間は配列の非特異的切断の出現を促進する可能性があり、それはタンパク質データベースにおける同定の結果に影響する。
【００１３】
しかし、１８Ｏによる標識は、特殊な様式においては配列データベースにおける信頼できる方法としてＮ−グリコペプチドを同定するために（Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｊ， Ｔａｋａｏ Ｔ， Ｈｏｒｉ Ｈ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ， Ｐａｄｒｏｎ Ｇ， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ． Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｇｌｉｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＮＧａｓｅ−Ｆ ｉｎ １８Ｏ−ｌａｂｅｌｅｄ Ｗａｔｅｒ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９２，２０５，１５１−１５８）、そして偽陽性を識別するために（Ｋｕｓｔｅｒ， Ｂ ａｎｄ Ｍａｎｎ Ｍ． １８Ｏ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｌ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９９，７１，１４３１−１４４０）プロテオミクスにおいて使用されてきた。糖タンパク質又はグリコペプチドは１８Ｏ標識水で調製された緩衝液の存在下にＰＮＧアーゼ−Ｆで脱グリコシル化され、そしてＮ−グリコシル化アスパラギン残基（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は高度に特異的様式でその側鎖に１８Ｏ原子を取り込んだアスパラギン酸残基に変換される。定量的プロテオミクスにおいて、一つの条件では通常の水で調製した緩衝液において、そして別の条件では１８Ｏ標識水の存在下において糖タンパク質を脱グリコシル化するために、これと同じ方法を使用することができる。
【００１４】
分析された検体の同比率を混合したのち、各タンパク質の相対的量が１６Ｏ／１８Ｏの比として同様に推定された（Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｊ， Ｔａｋａｏ Ｔ， Ｈｏｒｉ Ｈ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ， Ｐａｄｒｏｎ Ｇ， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ． Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＮＧａｓｅ−Ｆ ｉｎ １８Ｏ−ｌａｂｅｌｅｄ Ｗａｔｅｒ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９２，２０５，１５１−１５８）。
【００１５】
定量的プロテオミクスを行うためにタンパク分解ペプチドの全てに標識を導入する別の方法がＺａｐｐａｃｏｓｔａ及びＡｎｎａｎにより導入された（Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ Ｆ， ａｎｄ Ａｎｎａｎ ＲＳ． Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ−ｄｒｉｖｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００４，７６，６６１８−６６２７）。最初のステップにおいて、リシン残基は全てＯ−メチルイソ尿素との反応によりホモアルギニンに変換され、次いで比較される条件の一つにおいて得られたタンパク質分解ペプチドの全てのアミノ末端基の全ては重い同位体（特に重水素）に富む保護試薬で誘導体にされ、一方他の条件で得られたペプチドは非標識試薬で修飾される。両検体は混合され、重いペプチドと軽いペプチドの同位体分布の強度比を測定して相対的定量を行う。
【００１６】
標識及び非標識種の同位体分布の重複を避けるために、ペプチドの誘導体化は重水素化無水プロピオン酸（ｄ５）及び通常の無水プロピオン酸で行われる。しかし、３個を超える重水素原子の導入は、逆相クロマトグラフィーにおけるその保持時間はＺｈａｎｇ及び共同研究者により示されているように異なるので、軽−及び重−分子種の相対的定量において誤差を誘発する可能性がある（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｓｉｏｍａ ＣＳ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００１，７３，５１４２−５１４９）。定量の誤差は、一つの分子種の配列中に重水素原子の数が増加する同じ測定において増加する可能性があり（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｓｉｏｍａ ＣＳ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＡ， Ｘｉｏｎｇ Ｌ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｔｏｐｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００２； ７４，３６６２−３６６９）そして誘導体化が１３Ｃ以外で標識した同じ保護試薬で行われた場合に、これらの誤差は最少になることが認められた（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ， Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｃｏｄｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００２，１，１３９−１４７）。
【００１７】
圧倒的な数の発生したペプチドは、現在のクロマトグラフィーシステム及び最新のマススペクトロメーターの分解能を上回るので、複雑なタンパク質の混合物のタンパク質分解の分析は大きな課題である。
【００１８】
この課題に取り組み、そして二次元電気泳動を使用する必要のない定量的プロテオミクスを行うことができるようにするための現在の趨勢は、共通の性質を有するペプチドのサブセットの選択的単離をすることができ、そしてその試験がそれが由来したタンパク質の代理性に影響しない方法を開発することによるペプチド混合物の単純化であった。つまり、最初の混合物中に存在する膨大な数のタンパク質を分析するのは不可能である。ペプチドの選択的単離と適当な同位体標識技術を結合することにより、同定のみならず比較された最初の混合物中に存在するタンパク質の相対的定量も可能になる。
【００１９】
システイン含有ペプチドの選択的単離。
この方法は、システイン含有ペプチドの選択的単離に基づく良く知られたＩＣＡＴ法（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ）を提案しているときに、Ｇｉｇｙ及び共同研究者により始められた（Ｑａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ． Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．， Ｒｉｓｔ，Ｂ．， Ｇｅｒｂｅｒ， Ｓ．Ａ．， Ｔｕｒｅｃｅｋ， Ｆ．， Ｇｅｌｂ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ， Ｒ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９，１７，９９４−９９９）。この方法はアフィニティークロマトグラフィー（ストレプトアビジン−ビオチン）と軽及び重変異体にＩＣＡＴ試薬で標識することを組み合わせている。この試薬は三つの機能的要素よりなる：
１−システイン残基のチオール基と特異的に反応する基。
２−親和要素（ビオチン）を持ち、ＩＣＡＴ試薬と反応するペプチドを選択的に単離することを可能にする基。
３−上記の要素を分離する腕。重い変異体においてその構造（重ＩＣＡＴ）中に８原子の重水素を有し、そして軽い変異体は８原子の水素を有す（軽ＩＣＡＴ）。
【００２０】
両条件に由来するタンパク質はＤＴＴの存在下に別々に還元された後、一つの条件で発生した遊離システインは重ＩＣＡＴと反応し、別の条件で発生したものは軽ＩＣＡＴと反応する。両タンパク質混合物は等量で合併され、そしてタンパク分解消化が行われる。発生したペプチドはストレプトアビジンアフィニティーカラムにより精製され、結果としてＩＣＡＴで修飾されたシステイン含有ペプチドは選択的に単離される。
【００２１】
相対的定量を行うために、軽及び重−ＩＣＡＴで標識されたペプチドに相当するシグナルの相対的強度が測定される。これらの試薬で標識されたペプチドの質量は、配列中に含まれるシステイン残基の数により、８単位の倍数の質量差がある。
【００２２】
この方法にはいくつかの欠点がある：
−ＩＣＡＴ試薬の大きさはかなりあるので、ペプチドのイオン化効率及びマススペクトルの解釈に影響する。
−重ＩＣＡＴで修飾されたペプチド中に８原子の重水素の存在により、保持時間が軽ＩＣＡＴで修飾されたペプチドに対してかなり異なる可能性があるので、定量に大きな誤差を生じる可能性があり（Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｓｉｏｍａ ＣＳ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ． Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００１，７３，５１４２−５１４９）そして強度比は定量すべきペプチドの軽及び重種の溶出の間同じではない。
−ＩＣＡＴについて記述されている定量方法は、同位体分布の重複を避けるためにシグナルを充分に分離していないほかの方法の同位体標識には適用できない。
−ＭｕｄＰｉｔ（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，１９，２４２−２４７）の場合のように、さらにペプチド混合物を分画することが好ましい場合には、ペプチドの選択的単離に使用されるものとは異なるクロマトグラフィーを使用する必要があり、検体の処理中にかなりのロスを生じる。
−選択的単離のステップの間に高親和性クロマトグラフィーを使用する場合は、一部の特別なペプチドについてロスはかなりのものになる可能性がある。
−システインを含まないタンパク質はこの方法によって分析することができない。
【００２３】
メチオニン含有ペプチドの選択的単離。
最近、メチオニン含有ペプチドを選択的に単離することを可能にするＣＯＦＲＡＤＩＣと命名された方法が文献に記述された（Ｇｅｖａｅｒｔ Ｋ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊ， Ｇｏｅｔｈａｌｓ Ｍ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＲ， Ｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ Ｂ， Ｄｅｍｏｌ Ｈ， Ｍａｒｔｅｎｓ Ｌ， Ｐｕｙｐｅ Ｍ， Ｓｔａｅｓ Ａ， Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｇｅｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｓ ｔｈａｎ ８００ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００２ ，１１，８９６−９０３）。この方法は数ステップからなる：全てのタンパク質を還元し、Ｓ−アルキル化の後、それらを消化し、得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分画し、著者が初回と命名する操作においてかなりの数のフラクションに集める。これらのフラクションのそれぞれを別々に３分間過酸化水素（３％ｖ／ｖ）の溶液と反応させ、第２回の操作において同じ条件の同じクロマトグラフィーシステムにおいて再度分析する。酸化された後にそれらは疎水性の低い分子種になりその保持時間が減少するので、その保持時間が変化しないメチオニンを含まず、廃棄される残りのペプチドとは異なるので、メチオニンを含むペプチドは選択的に単離される。この方法はＩＣＡＴにより得られるのと同程度にペプチドの複雑な混合物を単純化することができ、またホスホペプチド、タンパク質のＮ−末端ペプチド、ジスルフィド架橋により連結したペプチドの選択的単離にも適用することができると著者は概説した（Ｍａｒｔｅｎｓ Ｌ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｐ， Ｄａｍｍｅ ＪＶ， Ｓｔａｅｓ Ａ， Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｈｅｓｑｕｉｅｒｅ Ｂ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＲ， Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ， Ｇｅｖａｅｒｔ Ｋ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｍａｐｐｅｄ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｅｎｔｒｉｃ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； Ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｆｉｌｅ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００５，５（１２）：３１９３−２０４．）。
【００２４】
酸化条件は、システイン及びトリプトファンのような不安定な残基の酸化を避けるために最適化したと著者らは述べているが、これが生じた場合には、この方法の選択性に影響し、達成されるペプチド混合物の単純化の程度は、著者らが主張するようにＩＣＡＴ法の程度とは類似しないであろう。
【００２５】
他方、メチオニン含有ペプチドを全て選択的に単離することを達成するためにこの方法を自動化することができるが、多数のクロマトグラフィー操作を行う必要があり、この方法の全体収量が逆に影響を受ける可能性がある。
【００２６】
Ｎ−末端ペプチドの選択的単離。
ＣＯＦＲＡＤＩＣの変法は、全てのタンパク質のＮ−末端ペプチドを選択的に単離するためにも提案されている（Ｇｅｖａｅｒｔ Ｋ， Ｇｏｅｔｈａｌｓ Ｍ， Ｍａｒｔｅｎｓ Ｌ， Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊ， Ｓｔａｅｓ ＴＯ， Ｔｈｏｍａｓ ＧＲ， Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｒｔｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３；２１，５６６−５６９）。この方法の最初のステップは、比較される複雑な混合物中に存在するタンパク質の一級アミノ基を全て保護することであり、次いで修飾タンパク質の特別なタンパク質分解が行われ、そして逆相クロマトグラフィーによりペプチド混合物はかなりの数のフラクションに分離される。
【００２７】
タンパク質分解により発生した内部のペプチドのそれぞれに一つずつ存在する新しいアミノ基は、さらに高度に疎水性の保護基と反応して、そして再度前記と同じ条件下で同じクロマトグラフィーシステムにおいて分離される。内部ペプチドの全ての保持時間は第二の保護試薬の付加によりかなり増加するが、この方法により最初のステップにおいて保護された全てのＮ−末端ペプチドは、元のフラクションと同じ保持時間で集められた場合に、選択的に単離される。この方法は不利である可能性がある：信頼性のある定量を行うためには、アミノ基の保護からなる最初のステップは定量的な様式で行われなければならないが、タンパク質が複雑な混合物で存在する場合にはこれは少し困難である可能性がある。
【００２８】
またこの最初のステップにおいて、アミノ基の保護はたんぱく質の溶解性をかなり減少させる可能性があり、これがこの方法の定量性に影響することがある沈殿を生じる可能性がある。最後に、タンパク質につき一つのペプチドが単離されるということは、行過ぎた単純化であり、複雑な混合物中に存在するタンパク質の同定及び定量において悪い影響を与える可能性がある。タンパク質につき３〜４ペプチドに減らされた群を単離することにより余裕を生じる方法は、定量結果の確認が可能となるので、二次元電気泳動を使用しないプロテオミクス試験にとって理想的である可能性がある。
【００２９】
Ｎ−糖タンパク質の選択的単離。
Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに報告されている膜タンパク質の約９１％は糖タンパク質であると報じられている。プロテオミクス試験のためにレクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用することによる糖タンパク質の選択単離に基づく方法が提案されている（Ｇｅｎｇ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｂｉｎａ Ｍ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｓ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ． ２００１，７５２，２９３−３０６； Ｋａｊｉ Ｈ， Ｓａｉｔｏ Ｈ， Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｙ， Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ， Ｔａｏｋａ Ｍ， Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ Ｊ， Ｋａｓａｉ Ｋ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ， Ｉｓｏｂｅ Ｔ． Ｌｅｃｔｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ， ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３，２１，６６７−６７２）。クロマトグラフィーカラムに固定した特別なレクチン又は一組のレクチンを使用することは（Ｊｉ Ｊ， Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ａ， Ｇｅｎｇ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ａｍｉｎｉ Ａ， Ｂｉｎａ Ｍ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ． Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ． ２０００，７４５，１９７−２１０， Ｇｅｎｇ Ｍ， Ｊｉ Ｊ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ， Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｅｓ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ２０００，８７０（１−２），２９５−３１３）、それらが存在する全ての糖の型を認識できずまた有効な選択的単離を保証できないので、限界がある。この限界を克服するために、Ｚｈａｎｇ及び共同研究者は（Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｌｉ ＸＪ， Ｍａｒｔｉｎ ＤＢ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３，２１，６２７−６２９）、ヒドラジンにより誘導体にすることにより固相支持体に糖タンパク質を固定し、後にＰＮＧアーゼ−Ｆの作用によりそれを放出することを提案した。この最後のステップをＨ２１８Ｏの存在下及び非存在下において実施するので、二つの生物学的条件の下に発現されるタンパク質の相対的定量が可能になる。この方法は、ワクチン候補と考えられる膜タンパク質のような生物学的に関心がある検体又は受容体又は存在する中では最も複雑なタンパク質である血清に適用できるが、しかしその適用は糖タンパク質が多い検体にのみ限られている。
【００３０】
ヒスチジン残基を持つペプチドの選択的単離。
ヒトプロテオーム中にヒスチジンが多いことはシステインと類似している。ヒスチジンはヒトプロテオームのタンパク質の８３％に、またこのアミノ酸を含有するトリプシン分解ペプチド１５％に存在する（Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ， Ｒｉｇｇｓ Ｌ， Ｚｈａｎｇ Ｒ， Ｘｉｏｎｇ Ｌ， Ｌｉｕ Ｐ， Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｅ， Ｓｅｅｌｅｙ Ｅ， Ｓｉｏｍａ Ｃ， ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＡ． Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００２，３７，１３３−１４５）。このために、ペプチドの複雑な混合物のかなりの単純化を達成するために、ヒスチジンを含むペプチドの選択的単離はプロテオミクス試験にとって魅力的である。クロマトグラフィー支持体に固定化された金属イオンと配位複合体を形成することによりヒスチジンを含むペプチドを選択的に捕捉するためにアフィニティークロマトグラフィーが使用された。種々のマトリックス及び固定化金属を評価する研究がいくつかある（Ｒｅｎ Ｄ， Ｐｅｎｎｅｒ ＮＡ， Ｓｌｅｎｔｚ ＢＥ， Ｉｎｅｒｏｗｉｃｚ ＨＤ， Ｒｙｂａｌｋｏ Ｍ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｃｕ（ＩＩ）． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ． ２００４，１０３１，８７−９２）が、その結果は、選択的単離のために以前記述されたほかの方法に比較してその特異性がまだ劣ることを示した（Ｒｅｎ Ｄ， Ｐｅｎｎｅｒ ＮＡ， Ｓｌｅｎｔｚ ＢＥ， Ｍｉｒｚａｅｉ Ｈ， Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ． Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００３，２，３２１−３２９； Ｒｅｎ Ｄ， Ｐｅｎｎｅｒ ＮＡ， Ｓｌｅｎｔｚ ＢＥ， Ｒｅｇｎｉｅｒ ＦＥ． Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００４，３，３７−４５）。事実、特異性を増加させるために、過去のタンパク質の修飾方法を含めて変法の探索が行われている。
【００３１】
Ｃ−末端にアルギニンを持つペプチドの単離。
最近、Ｆｏｅｔｔｉｎｇｅｒ及び共同研究者（Ｆｏｅｔｔｉｎｇｅｒ Ａ．， Ｌｅｉｔｎｅｒ Ａ．， Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｗ． Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｃａｐｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｂｏｒｏｎａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ． ２００５，１０７９，１８７−１９６）はボロン酸アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用することによりアルギニンを含有するペプチドを固相において捕捉する方法を提案した。この研究において、著者らは、マススペクトロメトリーにより分析される前にこれらのペプチドを効率よく放出することができると述べている。この方法は、アルギニンのグアニジノ基のアルカリ性条件下（ｐＨ＞８）において２，３−ブタンヂオンによる選択的共有結合修飾及び固定化フェニルボロン酸を持つ固体支持体中に修飾ペプチドを保持することに基づいている。アルギニンを含まないペプチドは保持されないフラクション中に廃棄され、アルギニンを含むペプチドは、前記反応の可逆性のために、酸性ｐＨにおいて固相支持体から溶出することができる。この方法はある場合にプロテオミクス試験における適用性を損なうので、ある強調すべき欠点を持っている。一方で、アフィニティー選択において、このクロマトグラフィーはリシン残基を持つペプチドの非特異的結合を示す可能性があり、その程度は変動する（１０〜９０％）。他方、アルギニンは配列分析された全てのゲノムの中に多く存在するアミノ酸であるので、達成される単純化の程度（約５０％）は不充分であり、したがってボロン酸アフィニティークロマトグラフィーの後であっても検体は非常に複雑であることに変わりはない。
【００３２】
Ｎ−末端にセリン及びトレオニンを持つペプチドの選択的単離。
２００３年にＣｈｅｌｉｕｓ及びＳｈａｌｅｒ（Ｃｈｅｌｉｕｓ Ｄ， Ｓｈａｌｅｒ ＴＡ． Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ： Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００３，１４，２０５−２１１）は、Ｎ−末端にセリン及びトレオニンを持つペプチドを選択的に単離する方法を記述した。この方法は、数ステップ（１）ペプチドのＮ−末端に存在するセリン及びトレオニンの水酸基の過ヨウ素酸塩での酸化的処理によるカルボニル基への変換；（２）ヒドラゾンを形成するための新しく形成されたカルボニル基の置換ヒドラジドによる反応及び（３）アフィニティークロマトグラフィーを使用することによる標識ペプチドの選択的単離からなる。この研究において、著者らは、後の選択的単離において固定化したストレプトアビジンを持つビーズを使用するために、Ｎ−末端にセリン及びトレオニンを持つペプチドをビオチンで標識することを提案している。この方法はいくつかの欠点を持つ：（ａ）過ヨウ素酸による酸化のステップは全てのメチオニン残基の酸化のようなペプチドの化学的修飾を誘発する、（ｂ）酸性のｐＨにおける処理によるアフィニティーカラムからのペプチドの溶出ステップは修飾ペプチドのリンカーの分解を誘発する。この研究において、Ｃｈｅｌｉｕｓ Ｄ， Ｓｈａｌｅｒ ＴＡ．（Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｒｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ： Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００３，１４，２０５−２１１）は、タンパク質の複雑な混合物を分析するためのこの方法の応用例を示さなかった。
【００３３】
陽イオン交換クロマトグラフィーによるペプチドの選択的単離。
陽イオン交換クロマトグラフィーもまたＢｅｔａｎｃｏｕｒｔと共同研究者（ＳＣＡＰＥ：Ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｐｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｌ， Ｇｉｌ Ｊ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅ−Ｃｏｓｓｉｏ Ｊ， Ｇａｒｃｉａ Ｌ， Ｐａｊｏｎ Ｒ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ， Ａｌｖａｒｅｚ Ｆ， Ｃｅｎｓｕｓ Ｇ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５，４，４９１−４９６）によって、プロテオミクス試験においてその配列中にヒスチジンもアルギニンも含まないペプチド（ｎＨｎＲペプチド）を選択的に単離する場合に使用された。この方法は、アミノ酸の可逆的保護と中性ペプチド（電荷０）から陽性荷電ペプチド（電荷１＋，２＋，３＋，４＋など）を有効にそして簡単に分離することができるクロマトグラフィーシステムの組合せに基づいている。この方法は分析されるペプチド混合物のＩＣＡＴ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ． Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｆ．，Ｇｅｌｂ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ． Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７，９９４−９９９，１９９９）で達成される程度のかなりの単純化を達成する。
【００３４】
アミノ基の保護反応の後、このクロマトグラフィーシステムは、その殆んどがアルギニン及びヒスチジンである荷電ペプチドを保持し、一方非保持フラクションはその配列にヒスチジンもアルギニンも含まない中性ペプチド（ｎＨｎＲペプチド）である。このｎＨｎＲペプチドはマススペクトロメーターで分析される前に、それらが有する保護基が加水分解処理により除去され、遊離アミノ基を再生し、マススペクトロメトリー分析においてイオン化及びフラグメンテーションが容易となるので、データベース中において同定される。
【００３５】
この方法は陽イオン交換クロマトグラフィーの非保持フラクション中にｎＨｎＲペプチドを分離するので、非常に多数のタンパク質を同定するためには、さらに分画するために別のクロマトグラフィーステップが必要である。これらの追加のクロマトグラフィーステップは操作中に損失を生じ、この方法の結果に影響する可能性がある。他方、ペプチドのアミノ基の脱保護の処理は分解を生じ、一部の特別なペプチドの回収にかなり影響する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
これらのペプチドの選択的単離の方法については記述したような限界があるので、複雑な混合物を示すタンパク質の同定及び発現レベルの測定のために、そのマススペクトロメトリー分析を行う以前に分析すべき複雑な混合物の単純化による小グループのべプチドの選択的及び特異的な単離方法は引き続き強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明に提案されているペプチドの選択的単離の方法は、有効にして簡単な方法でクロマトグラフィーステップの非保持フラクション中に（１）アミノ基の修飾体を持たない、（２）アルギニン残基のＣ−末端におけるトリプシン切断により生じ、そして（３）その配列中にリシン残基を持たない（ＲＲｎＫペプチド）ペプチドを単離することによりタンパク分解ペプチドの複雑な混合物の単純化を達成する。
【００３８】
この方法は、複雑な混合物を構成するタンパク質の同定に使用することができ、そして比較する条件の下に相対的量の測定に使用することができる。この目的のために、人工的に或いは自然資源から得られたタンパク質の混合物は図１に示されそして以下に説明されるステップによって処理される：
【００３９】
（１）例えば、ヨウ化酢酸アミド、ヨウ化酢酸、アクリルアミド、４−ビニルピリジンなど、この目的に使用される試薬のいずれかによるシステイン残基の還元及びＳ−アルキル化。この最初のステップは、いくつかの理由のために非常に重要である：（ａ）それは分析される混合物中に存在するタンパク質のペプチド結合の次の酵素的加水分解のステップの大きな有効性を保証する；（ｂ）それはシステイン残基を有する別のタンパク質のペプチドの交差結合を回避する；（ｃ）それはデータベース中のタンパク質の同定を容易にする。
【００４０】
（２）タンパク質の加水分解。これは、高度に特異的にリシン残基のＣ−末端においてペプチド結合を加水分解するリシル−エンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）を使用するタンパク分解的消化により達成される。
【００４１】
（３）保護反応は、ステップ２のタンパク分解処理により発生したペプチド中に存在するリシンのα−アミノ末端基及びε−アミノ基の化学的共有結合修飾にある。この方法において、生成した修飾ペプチドがクロマトグラフィーカラム中に又は化学的に活性化された固相支持体に選択的に保持されることが保証されるならば、多様な修飾アミノ基を使用することができる。保護試薬には次のものがある：無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水テトラヒドロフタル酸、クロロギ酸 ９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、２−メチルスホニルエチル スクシンイミジル カルボナート、尿素及びアミノ基を保護する試薬、例えば（ａ）ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニル及び４−メトキシベンジルオキシカルボニルを含む芳香族ウレタン型保護基；（ｂ）ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル及びメチルスルホニルエトキシカルボニルを含む脂肪族ウレタン型保護基；（ｃ）アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル及びイソボルニルオキシカルボニルを含むシクロアルキルウレタン型保護基；（ｄ）アシル保護基又はスルホニル保護基。好ましくは、保護基は、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニル及び１−カンファースルホニルを含み；（ｅ）ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、α−メチルニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、６−ニトロベラトリル、４−メトキシフェナシル及び３’，５’−ジメチトキシベンゾイン及びビオチン及びその化学的誘導体の活性エステルを含む光感受性保護基。さらに、修飾ペプチドに多価陰性電化を提供するほかの保護基、例えばＳＯ３−基も使用することができる。一般的に、アミノ基の保護のためにペプチド合成に使用される試薬又は既に説明した性質を充たすアミノ基と反応することができるほかの試薬は使用することができる。
【００４２】
アミノ基の修飾を行うのに必要なこの種の試薬及びプロトコールは文献中で容易に見出すことができる（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， ｐａｇ．４９４−６５４， Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）及びＰｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｎ．， ｐａｇ．７４−１０３， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８））、そしてその使用法は本発明の中に含まれる。
【００４３】
（４）過剰の保護試薬の分解及びチロシン残基のＯ−アシル化の除去。このステップは、（１）ＬＥＰペプチドのアミノ基の保護試薬の過剰を分解し、この方法により次のトリプシンの再消化により発生する新しいアミノ基との反応を避けるために、そして（２）提案する方法の収率に影響するチロシン残基におけるＯ−アシル化を除くため、の二つの目的を持って行われる。ほぼｐＨ １１に達するまでアンモニア又はエチルアミンのようなアミンを加え、それを１時間３７℃でインキュベーションすることにより前記の目的が保証される。特に、過剰の試薬の分解は、エタノール又はメタノールのような１級アルコール又は遊離アミノ酸の混合物を反応緩衝液に加えることによっても達成することができる。
【００４４】
（５）１級アミノ基を保護されたＬＥＰペプチドのトリプシンによる再消化。保護されたＬＥＰペプチドは、アルギニンを含むＬＥＰペプチド中のアルギニンのＣ−末端のペプチド結合のみを加水分解する高度に選択的な酵素であるトリプシンにより再消化される。
【００４５】
（６）ＲＲｎＫペプチドの選択的単離。使用したクロマトグラフィーカラムは、非保持フラクション中にその遊離アミノ基を持つＲＲｎＫペプチドの選択的単離を可能にし、他方、カラム中に第３のステップの間に導入された保護１級アミノ基を有するペプチドが共有又は非共有結合により保持される。ＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために、アミノ基に結合した保護基がこのクロマトグラフィーステップにおいて非常に高い親和性を持って認識されるならば、いずれのアフィニティークロマトグラフィーでも使用することができる。これを達成するために使用できるのは：
（ａ）ハイブリドーマ技術により得られたモノクロナール又はポリクロナール抗体；抗体フラグメント；１本鎖抗体；天然資源から単離された抗体又はファージディスプレーライブラリーから選択された抗体を固定化したクロマトグラフィーカラム。ペプチドに導入された保護基に高度に選択的に結合する化学的又はファージライブラリーから選抜されたタンパク質又はそのフラグメント、又はペプチドを固定化したクロマトグラフィーカラム。
（ｂ）この保護基が固定化したタンパク質の天然のリガンド、接合団又は単純に固定化タンパク質に高度に特異的に結合する有機性又は無機性の化合物であり得る。例えば、ＬＥＰペプチドのアミノ基は、ストレプトアビジン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ又はレクチンのそれぞれを固定化したカラムにより特に保持されるビオチン又はグルタチオン又は一部のオリゴ糖基で誘導体にすることができる。他のタンパク質及びそれぞれのリガンドも使用することができ、そしてＷａｎｇ及び共同研究者により要約されている（Ｗａｎｇ，Ｒ．；Ｆａｎｇ，Ｘ；Ｌｕ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．“Ｔｈｅ ＰＤＢｂｉｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ： Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ Ｋｎｏｗｎ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２００４；４７（１２）；２９７７−２９８０及びＷａｎｇ，Ｒ．；Ｆａｎｇ，Ｘ．；Ｌｕ，Ｙ．；Ｙａｎｇ，Ｃ．−Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．“Ｔｈｅ ＰＤＢ ｂｉｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ： Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００５；４８（１２）；４１１１−４１１９）。
（ｃ）固定化した金属キレートを持つクロマトグラフィーカラム及びヒスチジンの尾を持つアミノ基の位置で保護されたＬＥＰペプチドの選択的保持をすることができるクロマトグラフィーカラム。
【００４６】
酸性のｐＨにおけるカチオン交換クロマトグラフィーと例えばスルホン酸基（ＳＯ３−）などであり得るいくつかの陰性電荷を持つ多価官能基を持つ試薬によるペプチドの１級アミノ基の誘導体化の組合せを使用した場合に、ＲＲｎＫペプチドは保持フラクション中に選択的に単離することができる。ＲＲｎＫペプチドは全て酸性のｐＨにおいてＮ−末端アミノ基及びもう一つはＣ−末端アルギニンに位置する２個の陽性電荷を有するが、逆に、この試薬により誘導体化されたペプチドは酸性のｐＨにおいて多価陰性電荷を持ち、それはカチオン交換カラムには保持されないであろう。この変法は、ＲＲｎＫペプチドがカチオン交換クロマトグラフィーカラムに保持された場合に、マススペクトロメトリーによる分析の前にさらに分画することができるので、同定されるタンパク質の数を増加させる利点がある。前記と同じ原理に基づいて、アニオン交換クロマトグラフィーは少なくとも陰性電荷を有する修飾基を持つペプチドの全てを保持するために使用することもでき、そしてＲＲｎＫペプチドは非保持フラクションに選択的に単離されるであろう。
【００４７】
また、ＲＲｎＫペプチドはアミノ保護基とクロマトグラフィーのビーズの中に存在する反応基との間の化学反応により選択することができる。
【００４８】
（ｄ）例えば、ステップ３において使用された保護基が１級炭素の位置にハロゲン原子（基本的に臭素又はヨー素）を有している場合、又はそれらがチオエーテル又はマレイン酸イミジル基又はその構造中にチオール基を持つクロマトグラフィーのマトリックス又は磁気ビーズ中に存在するスルフヒドリル基の付加が可能であるその他の不飽和結合を有する場合。この目的のために、システイン残基と結合するチオセファロース（−ＳＨ）又はペプチド合成法用に設計されたいずれかの樹脂からＢｏｃ／Ｂｚｌにより調製されたチオール化された樹脂（例えば、必要な修飾を施したポリスチレンポリマーに基づくアミノメチル化樹脂、ＰＥＧ−アミノ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン）を使用することができる。また、クロマトグラフィーカラムとして、なかでも４−メトキシトリチルチオール化樹脂、２−クロロトリチルチオール化樹脂、Ｎ−（２−メルカプトエチル）アミン樹脂のようなチオール基で活性化された樹脂を使用することができる。
【００４９】
ＲＲｎＫペプチドは脱塩ステップの後にカチオン交換クロマトグラフィーを使用してさらに分画することができ、そしてより大きな数のタンパク質の同定のために逆相を使用することができる（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，２４２−２４７，２００１）、或いは上記目的を達成するために逆相クロマトグラフィーによる二重分画をすることもできる。
【００５０】
この方法を定量的プロテオミクスに適用するには、２つの比較条件のうちの１つにおいて発生するペプチドはその構造中に数個の重い同位元素（１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ及び／又は２Ｈ）を有し、一方別の条件において発生したペプチドは前記の天然に多い同位元素（１２Ｃ，１４Ｎ，１６Ｏ及び／又は１Ｈ）を有している。
【００５１】
２つの比較条件のうちの１つにおいて発生するペプチドの構造中への重い同位元素の取り込みは、２つの異なる方法により行うことができる：
【００５２】
（ａ）細胞によって導入された同位元素標識。細胞増殖に必須な一定の栄養素の２つの同位元素種を含む培地で培養された組織又は細胞から得られたタンパク質の抽出に応用される。使用される栄養素の中では、窒素源（１４Ｎ／１５Ｎ）を構成する標識化合物が標識される；必須アミノ酸はある位置が水素（１Ｈ／２Ｈ）、窒素（１４Ｎ／１５Ｎ）、炭素（１２Ｃ／１３Ｃ）、酸素（１６Ｏ／１８Ｏ）などで標識される。この方法の特殊性のために、ＲＲｎＫペプチドは全てそのＣ−末端に少なくとも１個のアルギニン残基有しているので、このアミノ酸への重い同位元素の導入は選択的に単離されたペプチド全てが標識されていることを保証する。例えば、比較する条件の１つにおいて、培地は同位元素標識したアルギニン（１３Ｃ６−，１５Ｎ２−又は１５Ｎ４−アルギニン）の濃度を高くして行うことができ、別の条件では標識は行わない。次いで、両者の全タンパク質の抽出物を混合した後、それらを同時に加水分解し、ＲＲｎＫペプチドの選択的単離が達成されるまで、ステップ１〜６の記述にしたがってこの方法が行われる。
【００５３】
（ｂ）タンパク質分解の間に導入される同位元素標識。この方法のステップ２に記述したように、比較されるタンパク質の検体は別々に水溶液中で加水分解される。水溶液の一つは予め１８Ｏ（Ｈ２１８Ｏ）を加えて調製され、他方の水は天然の同位体濃度を有している。この方法により、最初の条件から得られるタンパク分解ペプチドは全て、そのＣ−末端のカルボン酸に１又は２原子の１８Ｏを取り込んで、標識される。その後、タンパク分解酵素の阻害物質の混合物又は使用したタンパク分解酵素の特異的阻害物質を添加することにより使用したタンパク分解作用の阻害を行い、両条件において消化されたタンパク質の等量を混合する。特にステップ５においてトリプシンによるＬＥＰペプチドの再消化の間にＲＲｎＫペプチドの標識が生じることは注意する必要があり、そのため消化溶液を調整するために使用されるＨ２１８Ｏの同位体純度の汚染を避けるために、このステップの前に試薬の添加を行ってはならない。同位体標識のこの方法を使用する場合には、酸性条件において１８Ｏ−標識ペプチドの長時間の処理は勧められない。その理由は、ペプチドのＣ−末端カルボキシル基へ酵素的に導入した標識の部分的又は完全な消失を生じ、定量に大きな誤差を生じる可能性があるからである。
【００５４】
相対的定量は、標識及び非標識ＲＲｎＫペプチドの混合物の同位体分布を計算するための適当なソフトウエアを使用してマススペクトルにより行われる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｔｏｐｉｃａ， Ａ Ｗｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４，３２，Ｗ６７４−Ｗ６７８ ａｎｄ ／ｏｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｓ Ｍｉｘｅｓ ｂｙ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｐｅａｋ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００４，１８，２４６５−２４７２）。このソフトウエアは標識及び非標識ＲＲｎＫペプチドの理論的同位体分布を算出し、そして理論的同位体分布から得られた面積が実験的に観察された同位体の面積に最も良く一致するような比率でそれらが組み合わされる。軽い及び重い同位元素（１２Ｃ／１３Ｃ，１４Ｎ／１５Ｎ，１６Ｏ／１８Ｏ及び／又は１Ｈ／２Ｈ）で標識されたペプチドに対応する面積のそれぞれの間に存在する比は、正規化した後に、比較する混合物中のペプチドを含むタンパク質の相対的比率に相当する。
【００５５】
定量を行うために、（ｔｏ）分析されるペプチド又はその配列の原子組成、（ｂ）実験に使用された同位体標識のタイプ及び（ｃ）関心のＲＲｎＫペプチドの実験的同位体分布を含むマススペクトルの領域を知る必要がある。この情報は全て非常に限定的であり、実験上のノイズを非常に正確に計算することができ、定量に関係のないほかの信号の重複を分析から除くことができる。これらの情報は全てソフトウエアを使用する定量方法を非常に強固にし、そして使用した同位体標識の方法とは関係ないものにする。
【００５６】
この提案した方法はペプチド及びタンパク質の分析に最も頻繁に使用されているイオン化方法を使用することができる：エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）。関心のペプチドはマススペクトロメーター中において選択され、それらは衝撃チャンバーを通過し、そこで衝撃として知られる操作を使用して解離を誘発し、充分な構造的情報を含むフラグメントが得られ、そして分析されるペプチドの部分的又は完全なアミノ酸配列の推定が可能になる。この情報を含むマススペクトルは、ＭＳ／ＭＳスペクトルとして知られている。それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルは、それを発生したペプチド配列に対して非常に典型的であり、それはフラグメントイオンの指紋と考えることができ、そして適当なソフトウエアの支援により配列データベースの中でそのペプチドの信頼性のある同定を行うのに充分である。事実、これは配列データベース中のタンパク質の同定を行う最も良く知られているサーチエンジンが使用している原理である：ＭＡＳＣＯＴソフトウエア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ， ＵＫ）（Ｐｅｒｋｉｎｓ， ＤＮ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． １９９９，２０，３５５１−３５６７）；及びＳＥＱＵＥＳＴソフトウエア（Ｔｒａｄｅｍａｒｋ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ． ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍａｃｋ， Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｏｕ Ｍｉｘ ｂｙ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ａｎｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ Ｌｏｗ−Ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ Ｌｅｖｅｌ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６９，７６７−７７６；Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ． Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄａｔｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９４，５，９７６−９８９； Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３８，８９７（Ｊｕｌ．２３，１９９６） Ｙａｔｅｓ，ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．）。
【００５７】
これらのソフトウエア（ＭＡＳＣＯＴ及びＳＥＱＵＥＳＴ）は、実験的に得られたＭＳ／ＭＳスペクトルをタンパク質配列データバース中に一定の分子マスを持ちそして使用したタンパク質分解酵素の特異的切断により生じた全ペプチドの理論的ＭＳ／ＭＳと比較する。理論的フラグメントのマス値と実験で得られた値の間で全く一致することを示すＭＳ／ＭＳスペクトルは分析するペプチドの値に相当するはずであり、したがってそれを含むタンパク質が推定され、配列データベースにおいて同定が行われる。
【００５８】
以下の参考文献は、タンパク質の同定、特に分析されたプロテオームにおいてマススペクトロメトリーの技術の一部の応用に関係している：Ｉｄｅｋｅｒ Ｔ， Ｔｈｏｒｓｓｏｎ Ｖ， Ｒａｎｉｓｈ ＪＴＯ， Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ Ｒ， Ｂｕｈｌｅｒ Ｊ， Ｅｎｇ ＪＫ， Ｂｕｎｇａｒｎｅｒ Ｒ， Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ， Ｈｏｏｄ Ｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｏ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，９２９−３４； Ｇｙｇｉ ＳＰ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０００，４，４８９−４９４．； Ｇｙｇｉ ＳＰ，Ｒｉｓｔ Ｂ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｑｕａｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００；１，３９６−４０１； Ｇｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ， Ｂｒｕｃｅ ＪＥ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＧＡ， Ｒｉｓｔ Ｂ， Ｐａｓｓａｔｏｌｉｃ Ｌ， Ｆｉｅｈｎ ＯＲ， Ｓｍｉｔｈ ＲＤ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍａｓｓ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ． Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；７２，１１１２−８．及びＧｏｏｄｌｅｔｔ ＤＲ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ， Ｗａｔｔｓ ＪＤ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｃｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２０００；１４，３４４−３４８； Ｚｈｏｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１，１９，３７５−３７８．
【００５９】
提案した方法の高度な選択性を考慮すると、より速い同定を保証するために、偽陽性の同定を避けるために、そしてＭＡＳＣＯＴ及びＳＥＱＵＥＳＴソフトウエアを使用してより信頼性のある同定をするために、同定はＲＲｎＫペプチドのみを有するデータベースに限定することができる。
【００６０】
実施例
実施例１．ＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために提案された方法を適用した場合の、種々の生物のプロテオーム中のペプチドの複雑な混合物の単純化のインシリコ評価。
今日、ＤＮＡ分子の配列分析により達成された高い効率は、いくつかの生物の完全なゲノム配列を知ることを可能にした。これは逆にこれらのゲノムからいかなるタンパク質が誘導されるか、そして試験されているプロテオームに対して行われる特定のタンパク質分解処理によりいかなるペプチドが発生するかを予測することを可能にする。
【００６１】
ＲＲｎＫペプチドを選択的に単離した場合に可能である単純化の程度を見積もるために、所与の生物のプロテオームについて計算するＰＣに使用するためにＳＥＬＥＳＴＡＣＴと命名されたソフトウエアがＣで書かれた：
１−Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅに報告されているタンパク質の全数。
２−特定のタンパク質分解処理により発生するペプチド／タンパク質の全数。
３−この特定のタンパク質分解処理により発生するＲＲｎＫペプチド／タンパク質の数。
４−プロテオームの範囲内で、本発明において提案されている方法により同定に成功することができるＲＲｎＫペプチドを持つタンパク質のパーセンテージ（個別のプロテオームについて報告されているタンパク質の全数に関して）。
【００６２】
比較の目的で、このプログラムは、個別のプロテオーム中のシステイン残基を有するタンパク質分解ペプチドに関するパラメーターの算出にも使用され、したがってそれらは、先駆的方法でありそしてペプチドの選択的単離により頻繁に使用されそしてプロテオーム試験へ適用されているＩＣＡＴ法により確実に選択的に単離することができるであろう。
【００６３】
表１．図１に提案した方法を適用した場合の、種々の生物のプロテオーム中に含まれるＲＲｎＫペプチドのＳＥＬＥＳＴＡＣＴソフトウエアを使用したインシリコ分析。良く知られているＩＣＡＴ法を適用した場合の単純化の結果も示されている。
【表１】
ａ）Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅに報告されているタンパク質の全数に対応。
ｂ）種々の分析されたプロテオームのトリプシンによる特異的タンパク質分解により発生したトリプシン分解ペプチドの全数をコード化されたタンパク質の全数で割った。整数で示されている。
ｃ）図１に提案した方法を使用した場合に分析されたタンパク質当たりのＲＲｎＫペプチドの全数及びＩＣＡＴ法により得られた全数。整数で示されている。
ｄ）分析されたプロテオームの範囲は、この表のタイトルに記述したクロマトグラフィーの方法を使用して単離することができるＲＲｎＫペプチドを有するタンパク質の全数のパーセンテージを示す。この数字は、提案する方法（左）及びＩＣＡＴ法（右）である。
【００６４】
表１において、病原体、細菌、イースト、植物及び哺乳動物を含むいくつかのプロテオームについて得られた結果が示されている。理解できるように、平均５個のＲＲｎＫペプチド／タンパク質が選択的に単離され、これはＩＣＡＴ法により得られた値に類似するので、混合物は、平均１８個の典型的ペプチド／タンパク質からこれらのタンパク質にとって最適の値までかなり単純化されているであろう。提案された方法により試験することができる生物のプロテオームのパーセンテージとして示されるプロテオームの範囲（８６．４％）は、ＩＣＡＴにより達成される値（８７％）とも非常に類似している。しかし、個別のプロテオームが分析された場合に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓプロテオームの場合に著しい差が認められる。本発明による方法において、この生物のプロテオームの９４．６％の分析が可能であるが、他方、ＩＣＡＴが使用された場合には８０未満が分析できるに過ぎない。この微生物をプロテオミクスの道具を使用して試験する場合には、選択される方法は本発明のＲＲｎＫペプチドによる選択的単離でなければならない。ＳＥＬＥＳＴＡＣＴソフトウエアの使用は、本発明の方法を適用した時に、個別のプロテオームにおいて予想される結果を推定する場合に非常に有用であり、したがってプロテオミクス用のペプチドの選択的単離のほかの方法と比較することを可能にする。
【００６５】
これは、本発明の原理、クロマトグラフィーシステムを使用してＲＲｎＫペプチドを選択的に単離することは、ペプチドの複雑な混合物の理想的単純化をすることができ、同時に試験されるプロテオームの広範囲を含むことを保障するので、非常に有用であり、そして異なる進化の程度の生物のプロテオミクスの試験に首尾よく使用することができる。
【００６６】
後はだだ、実施例２に示すために、アミノ基の保護と修飾ペプチドを有効な方法で保持することができ、一方マススペクトロメーター中で分析するために非保持フラクションにＲＲｎＫペプチドを準備するクロマトグラフィーシステムの組合せが残されている。
【００６７】
実施例２．組換えストレプトキナーゼのＲＲｎＫペプチドの選択的単離。方法の選択性及び特異性の評価。
図１に提案した方法を組換えストレプトキナーゼ（ｒＳＫ，明細書の最後の配列１を参照）に適用した。このタンパク質はトリプシン消化により非常に多数のトリプシン分解ペプチドを生じるが（使用した酵素による完全な切断を考慮すると４２ペプチド）、ＲＲｎＫペプチドは５個のみであり（表２参照）、提案した方法の特異性及び選択性を非常に評価し易いので、このタンパク質をモデルとして選んだ。
【００６８】
表２．組換えストレプトキナーゼ（ｒＳＫ）のＲＲｎＫペプチドのアミノ酸配列及び理論的質量
【表２】
ａ）太字で示したアミノ酸はアルギニン残基におけるトリプシンの切断部位に相当する。矢印はトリプシンによる切断部位を示す。
【００６９】
続けて行うべきステップは以下の通り：
（１）タンパク質を、塩酸グアニジン２ ｍｏｌ／Ｌを含む５００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解し、１：２００の酵素：基質比でリシル−エンドペプチダーゼを加え、消化を３７℃で１６時間行った。
（２）タンパク分解ペプチドの混合物を０〜５℃の温度でインキュベートし、１級アミノ基（アルファ及びイプシロン）に対してモル比１０：１で修飾試薬（ビオチンアミドペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を加えた。混合物を短時間攪拌し、氷浴中で再度インキュベートした。この操作をさらに２回５分間の間隔を置いて行った。
（３）修飾されたＬＥＰペプチドを塩基性ｐＨでインキュベート（２〜３％トリエチルアミンで１時間３７℃）することにより、残った修飾試薬及びチロシン残基のＯ−アシル化を除いた。
（４）塩酸グアニジンの濃度が１ ｍｏｌ／Ｌになるまで消化緩衝液を希釈し、１：１００の酵素：基質比でトリプシンを加え、４時間３７℃で消化を行った。
（５）予めＨ２Ｏ／ＴＦＡ ０．０５％の溶液で平衡したＲＰ−Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ，２０ｘ２．１ ｍｍ）を使用する逆相クロマトグラフィーにより過剰の修飾試薬を除去し、移動相のアセトニトリル／ＴＦＡ（０．０５％ｖ／ｖ）含量を１から８０％まで１０分間で増加する急速グラジエントを使用してペプチドを単一フラクションとして集める。
（６）アフィニティーマトリックス（セファロースにストレプトアビジンを固定）を充填したクロマトグラフィーカラムを流量５００ ｃｍ／ｈで１２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）で平衡した。ペプチド混合物を同じ平衡溶液に溶解し、アフィニティーカラムに負荷した。２２６ ｎｍにおける吸光度を記録し、マススペクトロメトリーによる後の分析のために非保持フラクションを集めた。
（７）ＺｉｐＴｉｐ（Ｃ１８）を使用してＲＲｎＫペプチドを含有する非保持フラクションを脱塩し、マススペクトロメーターで分析した。
【００７０】
ＥＳＩ−ＭＳスペクトル（図２Ａ）は、ｒＳＫのＬＥＰの消化により生じたペプチドに対応するかなりの数のシグナルを示している。これらのシグナルのｒＳＫの配列に対する割当て、並びにそれぞれのペプチドの質量の実験値及び理論値を表３に示す。
【００７１】
表３．図２Ａで観察されたシグナルに対するｒＳＫのＬＥＰペプチドの割当ての要約。
【表３】
ａ）太字及びイタリックで強調されたアミノ酸はｒＳＫの５個のＲＲｎＫペプチドの配列に相当する。各ペプチドのＮ−及びＣ−末端の数字はそれぞれｒＳＫの配列中の位置に相当する。
ｂ）ｒＳＫのＬＥＰペプチドの実験で得られた質量。
ｃ）ｒＳＫのＬＥＰペプチドの理論上の質量。
【００７２】
表３のＬＥＰペプチド１３，１５及び２０は、表２に示されたｒＳＫ配列の５個のＲＲｎＫペプチドの配列を含んでいることに注意。
【００７３】
大部分のＬＥＰペプチドは、その構造の中に含まれる１級アミノ基（リシンの末端アミノ基及びイプシロンアミノ基）に加えられた保護基の数に相当する量でその分子質量が増加した。完全な切断により生じたＬＥＰペプチドの大部分は２個の保護基を付加しているはずである（２ｘ２２６ Ｄａ＝５５２ Ｄａ）、一つはＮ−末端のアミノ基に、そしてもう一つはＣ−末端に存在するリシン残基に。しかし、これらのペプチドの一部は予想よりも多い保護基を付加していた。例えば、図２Ｂにおいて、表３のビオチン化ペプチド１６及び２０に相当する質量３８０９．７５及び４４３９．０７のシグナルは、予想よりも１又は２個多い保護基を付加したことを、明らかに見て取ることができる（図２、網掛け菱形に加えられた数を参照）。
【００７４】
この修飾ペプチドに対応するＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの詳細な分析により、これらの付加はチロシン残基の側鎖に存在することが示された。これらの結果は、Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ ａｎｄ Ａｎｎａｎ（Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ Ｆ，ａｎｄ Ａｎｎａｎ ＲＳ． Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ−ｄｅｒｉｖｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２００４，７６，６６１８−６６２７）がトリプシン分解ペプチドの末端アミノ基を全て定量的に別の試薬で保護しようと試みたときに得られた結果と一致する。後に、チロシン残基におけるこの好ましくない修飾はこの実施例に記述されたステップ３に述べられている塩基による処理（図２Ｃ）により除かれた（Ｚａｐｐａｃｏｓｔａ Ｆ． ａｎｄ Ａｎｎａｎ ＲＳ． Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ−ｄｒｉｖｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００４，７６，６６１８−６６２７）。図２Ｂの黒菱形の付いたシグナルは塩基処理の後には図２Ｃには存在しないので、塩基処理はこの副反応の影響を元に戻すのに有効であることを示していることに注目。図２Ｃに白丸で示されているシグナルは、その配列中にＲＲｎＫペプチドを有するビオチン化ＬＥＰペプチドに相当する。ＲＲｎＫペプチドを発生させるために、ビオチン化ＬＥＰペプチドはトリプシンで消化される。生成した混合物は図２Ｄに示されている。図２Ｄにおいて黒丸で標識されたシグナルはｒＳＫのＲＲｎＫペプチドに相当する。
【００７５】
ＲＲｎＫペプチドの選択的単離を達成するために、反応混合物は、ストレプトアビジンを固定化したセファロースカラムを通し、非保持フラクションをマススペクトロメトリーにより分析した。その結果を図２Ｅに示す。質量１４２３．７０，１５１８．７１及び１７３６．８４の３つのシグナルは、ＲＲｎＫペプチド、ＮＬＤＦＲＤＬＹＤＰＲ， ＤＳＳＩＶＴＨＤＮＤＩＦＲ 及び ＹＴＥＥＥＲＥＶＹＳＹＬＲにそれぞれ割付けられた。これら３個のＲＲｎＫペプチドの中で、１つだけが表２に含まれている（ペプチド１参照）。図２Ｅにおいて選択的に単離された質量１４２３．７０及び１７３６．８４のその他の２個のＲＲｎＫペプチドは、トリプシンの不完全な切断により生じ、そしてそれらは表２に示された残りの４個のＲＲｎＫペプチドを含んでいる。このトリプシンの不完全な切断は、アルギニン残基に隣接して酸性の残基（Ａｓｐ）の存在により生じる可能性がある。
【００７６】
図２Ｅのアスタリスクを付けた質量１３４３．６６のシグナルは、非ＲＲｎＫペプチドの非特異的単離によるものではなく、マススペクトロメトリー測定の際にイオン化部分において発生した質量１７３６．８０のＲＲｎＫペプチド３９０ＹＴＥＥＥＲＥＶＹＳＹＬＲ４０２のフラグメント（シリーズｙ”１１）に割り当てられた。
【００７７】
これらの結果は、図２ＤのＥＳＩ−ＭＳスペクトルに示されたペプチドの複雑な混合物をかなり単純化し、モデルタンパク質ｒＳＫについて理論的に予測される（表２に示された）５個のＲＲｎＫペプチドを、特異性なく、選択的に単離できるので、プロテオームの実験に首尾よく使用できることを示している。他方で、この方法の高い選択性及び特異性により、偽陽性の同定を避けるために、この目的のために工夫されたソフトウエアによるデータベースの調査をＲＲｎＫペプチドのみに限定することができる。
【００７８】
ＩＣＡＴ法が持っている一つの欠点、二次元電気泳動を使用しないペプチドの選択的単離のためにプロテオミクスに使用されている方法の欠点は、システイン含有ペプチドの全てに導入される試薬の高い分子質量であり、このためにその後のマススペクトロメトリー分析においてイオン化の効率及びフラグメンテーションに影響を及ぼす可能性がある。
【００７９】
これに対して、ＲＲｎＫペプチドはその構造の中に、この方法のステップの間に導入されるいずれのタイプの化学的修飾も有しておらず、衝撃誘発解離実験の際に気相におけるイオン化及びフラグメンテーションに影響しない。この利点は、気相におけるペプチドの有効なフラグメンテーションを得て、配列データベースにおけるより信頼性の高い同定を保証するために高く評価されている。
【００８０】
実施例３．化学的に活性な固体支持体を使用するＲＲｎＫペプチドの選択的単離。
ＲＲｎＫペプチドは、ＬＥＰペプチドにアミノ基の保護反応により導入された修飾基と反応する化学的に活性な基で官能化された固相支持体を使用して単離することができる。この方法により、既に記述したように修飾ペプチドと固相支持体の間に共有結合が形成される。一方、ＲＲｎＫペプチドはその構造中に化学的修飾を受けないので、それらは固相支持体と反応せず、非保持フラクション中に選択的に単離され、マススペクトロメトリーにより分析される。
【００８１】
この実施例において、遊離チオール基を含有する固相支持体（ＭＢＨＡメチルベンズヒドリルアミン樹脂）及び図３に示すようにチオール基と定量的に反応する２つの異なる化学試薬（ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）によるＬＥＰペプチドの化学的修飾を使用することによるＲＲｎＫペプチドの選択的単離が示される。
【００８２】
固体支持体の調製は以下の方法で行われる：
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ／ＨＯＢｔ／ ＤＩＣ（１／１／１）の混合物の４倍過剰をジメチルホルムアミドに溶解して、予め活性化したＭＢＨＡ樹脂（１〜１．２ ｍｍｏｌ／ｇの置換基を持つ）に加えた。Ｋａｉｓｅｒアッセイが陰性になるまで反応を続けた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をジメチルホルムアミド中２０％ピペリジン混合物と２０分間処理して、末端アミノ基を保護するＦｍｏｃ基を除去する。続いて、ＤＭＦで数回洗う。Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）樹脂を数回メタノールで、最後にエーテルで洗う。それを真空中に２４時間保ち、そしてＣｙｓのチオール基を保護するＴｒｔ基を除くために、ＴＦＡ／ＥＤＴ／水／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）の混合物と２時間反応する。最後に樹脂を濾取し、エーテルで充分に洗う。
【００８３】
ｒＳＫタンパク質のＲＲｎＫペプチドを単離するために続くステップは、ステップ（２）においてアミノ基の保護を２つの異なる試薬、ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで別々に行ったことが異なる以外は、本発明の実施例３において記述したステップ（１）から（４）と同じであった。これに続くステップを以下に記述する：
【００８４】
（５）ｒＳＫを溶解したのと同じ溶液で予め平衡した固相支持体に、加えた試薬の量に対するチオール基のモル比を５０：１に維持して反応混合物を加えた。反応混合物を室温、暗所に置き、４時間ゆっくりと攪拌し、それぞれ、ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用した。
【００８５】
（６）修飾ペプチドを結合したマトリックスを１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により除き、同じ反応緩衝液で２回洗った。
【００８６】
（７）ｒＳＫのＲＲｎＫペプチドを含有する上清からＺｉｐＴｉｐｓを使用して脱塩し、マススペクトロメトリーで分析した。
【００８７】
上に記述した方法のステップを終えて得られた結果は、互いに非常に近似しており、２種類の試薬を使用して得られたＥＳＩ−ＭＳスペクトルで見てとることができる：ヨウ化酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図４Ａ）及びマレインイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図４Ｂ）。両者の場合に（図４Ａ及びＢ）、シグナルｍ／ｚ９２９．５９，１４２３．７８，１５１８．９１及び１７３７．０３は得られたＥＳＩ−ＭＳスペクトルの中で最も強く、これらの質量の値はｒＳＫタンパク質のＲＲｎＫペプチドの予想される値に良く一致することを理解することができる（実施例２、図２Ｅ及び表２を参照）。
【００８８】
上記のシグナルの他には、認められる強度の他のシグナルは検出されていないので、非保持フラクション中に非ＲＲｎＫペプチドの非特異的単離はないことを示している。これらの結果は、固相支持体とＬＥＰペプチドの１級アミノ基に導入された保護基の間の化学反応を使用することは、プロテオミクス試験のＲＲｎＫペプチドの選択的単離に有用であることを示している。これらのマトリックスの使用は、その表面に高い濃度の活性化官能基を有する場合には、少量のマトリクスを使用することができ、これによって修飾ペプチドの定量的結合のみならず、ＬＥＰペプチドの定量的保護を達成するために加えた過剰の試薬の結合も保証する利点がある。特にこれは、選択的単離の前の脱塩ステップ（実施例２のステップ５を参照）を省略することによりＲＲｎＫアミノ基の選択的単離の方法を単純化する。
【００８９】
この実施例は、１級アミノ基のＬＥＰペプチドの保護ステップの際に導入された修飾試薬と固相マトリックス官能基の間の定量的化学反応を、ＲＲｎＫペプチドの高度に選択的で特異的な単離のために使用することができるというコンセプトも示している。
【００９０】
他方、この実施例において、修飾ペプチドを結合した固相支持体は簡単な遠心分離操作により除去されたが、固相支持体として１級アミノ基の修飾基と共有結合を形成することにより修飾ペプチドを捕捉するために適当に活性化された磁気ビーズが使用されている場合には磁場によりこれを行うことができる。
【００９１】
実施例４．ＲＲｎＫペプチドの選択的単離のためにカチオン交換クロマトグラフィーの使用。
実施例２及び３において、アフィニティークロマトグラフィーと活性化固相支持体及びＬＥＰペプチドのアミノ基に導入された保護基の間の化学反応をそれぞれ使用することにより、ＲＲｎＫペプチドは非保持フラクション中に単離される。この実施例において、ペプチドに陰性電荷を導入する試薬でアミノ基を誘導体化することを組み合わせたカチオン交換クロマトグラフィーもこの目的に使用することができることを示す。
【００９２】
このアイデアは、ＲＲｎＫペプチドは末端アミノ基には修飾がなく、そのＣ−末端にアルギニンを有しているので、酸性ｐＨで溶解された場合には少なくとも２個の陽性電荷を持ち、その配列中にヒスチジン残基を有する場合には陽性電荷の数は増加するという原理に基づいている。すなわち、ＲＲｎＫペプチドは多価陽性電荷を持つペプチドである。
【００９３】
他方、２回の消化ＬＥＰ／トリプシンにより発生した残りのペプチドは、１級アミノ基、そのＮ−末端アミノ基又はリシン残基の側鎖のアミノ基のいずれもが保護されている場合に、プロトン付加の場所がなくなるために陽性電荷を持つ可能性が除かれる。さらに、アミノ基の保護基が陰性電荷を持っている場合には、ペプチドの正味の陰性電荷はかなり増える。
【００９４】
強い酸に由来するので酸性ｐＨにおいても２個の陰性電荷を追加賦与する試薬によりそのアミノ基を誘導体化した後のＲＲｎＫペプチド及びｒＳＫの修飾ペプチドが持つはずの電荷を以下の表に示す。例えば、この特徴を充たす修飾試薬は、ペプチドにスルホン酸（ＳＯ３−）を導入することができる。
【００９５】
表４．３，５−ジスルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシクスクシンイミドエステルでアミノ基を誘導体化した後に、提案した方法により得られたタンパク分解ペプチドの陽性及び陰性電荷の相対値の分析。
【表４】
ａ）網掛けの行はｒＳＫのＲＲｎＫペプチドである。
ｂ）太字で強調したアミノ酸は塩基性アミノ酸、ヒスチジン及びアルギニンを示す。スルホン酸基で修飾したリシン残基はイタリックで強調されている。示したペプチドはＬＥＰ及びトリプシンの完全分解により発生した。
ｃ）トリプシンによる分解により発生した末端アミノ基を有するペプチド。
ｄ）修飾ペプチドの配列中に存在するスルホン酸基により導入された陰性電荷の数。
ｅ）塩基性アミノ酸アルギニン及びヒスチジン及びトリプシンによる切断により発生したペプチドのアミノ末端により提供される陽性電荷。
ｆ）それぞれのペプチドの陰性及び陽性電荷の合計。
【００９６】
酸性ｐＨにおけるペプチドの正味電荷は、（遊離の末端アミノ基を有するペプチドにおけるアルギニン及びヒスチジン及び末端アミノ基により分配される（Ｒ＋Ｈ＋Ｎｔ））陽性電荷及びＬＥＰペプチドの１級アミノ基に加えられた修飾試薬中に存在する２個のスルホン酸基により提供される陰性電荷の合計として考えられた。
【００９７】
ｒＳＫの５個のＲＲｎＫペプチドは多価陽性電荷（ｚ＝２＋から３＋）を持っており、他方、その他のペプチドは中性又は陰性電荷を持つ可能性があることをこの結果は示している。これは、カチオン交換クロマトグラフィーによるこれらのペプチドの混合物の分離は可能であることを示している。
【００９８】
各修飾アミノ酸に２個の陰性電荷を導入するために、３，５−ジスルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが次のプロトコールを使用して合成される：
１モルの３，５−ジスルホ安息香酸をＴＨＦに溶解し、１モルのジイソプロピル カルボジイミド及び１．５モルのＮＨＳと２０時間反応させる。沈殿を濾取し、上清をロータリーエバポレーターで濃縮する。得られた沈殿を酢酸エチルで結晶化する。
【００９９】
カチオン交換クロマトグラフィーを使用してＲＲｎＫペプチドを単離するために、実施例２に記述したのと同じステップ（１）〜（５）が続くが、違いは、ＬＥＰペプチドの１級アミノ基を保護するためにステップ２において、同じ反応緩衝液に溶解した３，５−ジスルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを反応混合物（ＨＥＰＥＳ ５００ ｍＭ，ｐＨ ８．０）に加えたことである。
【０１００】
次のステップを以下に記述する：
（６）カチオン交換クロマトグラフィーカラム（１０ｘ５ ｍｍ）にＭｅｒｃｋ社のＥＭＤ−６５０（Ｓ）ＳＯ３−マトリックスを充填し、ＴＦＡ（０．０５％ｖ／ｖ）の溶液で平衡した。オクチルグルコシド０．５％（ｗ／ｖ）を含有する平衡緩衝液に溶解したペプチドを５００ ｃｍ／ｈの流量でカラムに適用した。２２６ ｎｍで吸光度を記録した。非保持フラクションを捨て；カラムを充分に洗って使用した洗剤の残りを除去した。保持されたペプチドを２モル／ＬのＮａＣｌを含有する同じ平衡緩衝液を使用して溶出した。保持フラクションをマススペクトロメトリーによる分析のために集めた。
【０１０１】
（８）ＲＲｎＫペプチドを含む非保持フラクションをＺｉｐＴｉｐ（Ｃ１８）で脱塩し、マススペクトロメーターで分析した。
【０１０２】
ここに記述されたクロマトグラフィーシステムは、タンパク質のＣ−末端（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｏ ｍｕｔａｔｅｄ（Ｃｙｓ１２５−Ａｌａ） ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２． Ｍｏｙａ Ｇ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ， Ｈｕｅｒｔａ Ｖ， Ｇａｒｃｉａ Ｙ， Ｍｕｌｂｅｒｒｙ Ｖ， Ｐｅｒｅｚ Ｄ， Ｈｅａｔｈ Ｆ， Ｍ． Ｃｌａｗｓ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ． ２００２，９７１（１−２），１２９−４２）及びタンパク質の保護されたＮ−末端（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｏｃｋｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｇｅｓｔｓ． Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｌ， Ｂｅｓａｄａ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ， Ｔａｋａｏ Ｔ， Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ Ｙ， Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ２００１，５７（５），３４５−５３）を含むペプチドの選択的単離のために工夫された方法において中性のペプチドから陽性荷電ペプチドを分離するために首尾よく使用することができ、そしてそれより最近その使用はプロテオーム試験のためのペプチドの選択的単離に拡張された（ＳＣＡＰＥ：Ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｐｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｌ， Ｇｉｌ Ｊ， Ｂｅｓａｄｅ Ｖ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＪ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅ−Ｃｏｓｓｉｏ Ｊ， Ｇａｒｃｉａ Ｌ， Ｐａｊｏｎ Ｒ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ， Ａｌｖａｒｅｚ Ｆ， Ｐａｄｒｏｎ Ｇ． Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００５，４，４９１−４９６）。
【０１０３】
表４に示された結果を分析すると、ｒＳＫの５個のＲＲｎＫペプチド（ペプチド１８，２９，３０，３７及び３８）は、そのアミノ基が２個のスルホン酸基を導入する試薬で修飾された後に酸性ｐＨにおいて正味の陽性電荷を持つ唯一のペプチドであることが明らかに理解することができる。逆に、その他のペプチドは、この修飾を受けているので、その正味の電荷は陰性又は中性であるために、中性のペプチドから陽性に荷電したペプチドを分離するために設計されたこのクロマトグラフィーシステムもまた保持フラクション中のＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために首尾よく使用することができる。
【０１０４】
このことは、保持フラクションのＥＳＩ−ＭＳスペクトルが得られ、そして予想されるｒＳＫのＲＲｎＫペプチドだけがすべて検出されたときに示された（図５）。質量１４２３．７５及び１７３６．８８のシグナルはこの実施例の表４には含まれていないが、これらはペプチド３２１Ｎ−Ｒ３３１及び３９０Ｄ−Ｒ４０２に対応し、またそれらはアルギニン残基の位置での特異的切断により生じたのでＲＲｎＫに分類され、そしてそれらは配列の中にリシン残基を持っていないことを指摘するのは重要なことである。これらのペプチドはトリプシンの不完全な切断により生じ、表４に示されたＲＲｎＫペプチド（２９及び３０）及び（３７及び３８）の配列を含んでいる。
【０１０５】
同様に、修飾ペプチドは陰性電荷を持ちそして容易に保持することができるので、アニオン交換クロマトグラフィーをＲＲｎＫペプチドの選択的単離に使用することができるであろう。逆に、ＲＲｎＫペプチドは構造の中にスルホン酸基を持たないペプチドであり、それらは非保持フラクションに単離されるであろう。この場合に、ＲＲｎＫペプチドは非保持フラクションに単離されるであろう。
【０１０６】
修飾ペプチドはより多くの陰性電荷を持つが、提案した方法の選択性及び特異性は高いので、カチオン交換クロマトグラフィーを使用することにより修飾ペプチドとＲＲｎＫペプチドの分離を容易に達成することができる。
【０１０７】
ＬＥＰペプチドのアミノ基が保護された後に、それらがより疎水性の分子種に変換され、ある場合にはその溶解性が損なわれることがあるが、荷電した基で修飾した場合は前の実施例に使用した試薬よりも水性媒体における溶解性の増加が保証されるはずである。このことは、本発明の方法に提案されたアミノ基の保護に伴う損失の減少に役立つはずである。
【０１０８】
ＲＲｎＫペプチドの選択的単離に使用されたのと同じクロマトグラフィーカラムは、関心のペプチドの追加の分画に使用することができる。これはこの方法を単純化するのみならず、ＭｕｄＰｉｔ実験（Ｗａｓｈｂｕｒｎ Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｂｙ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，２４２−２４７，２００１）において行われたのと同様な方法で交代塩グラジエント及び逆相による多数のタンパク質の同定を行うこともできる。
【０１０９】
この実施例で得られた結果は、陰性電荷を導入するペプチドのアミノ基の適当な誘導体と組合せたカチオン交換クロマトグラフィーは、プロテオーム実験におけるＲＲｎＫペプチドの選択的単離のために首尾よく使用できることを示している。
【０１１０】
実施例５．１８Ｏによる同位体標識を使用するＲＲｎＫペプチドの選択単離による２つの人工的混合物（Ａ及びＢ）中のタンパク質成分の同定及び相対的定量。
それぞれタンパク質ｒＳＫ、組換えヒトエリトロポエチン（ＥＰＯ）、リゾチームＣ、オボアルブミン、Ｐ６４Ｋ及びＢＳＡからなる２つの人工的混合物Ａ及びＢが調製された。Ａ／Ｂのモル比は、それぞれのタンパク質について異なった：ｒＳＫ １：１、リゾチーム ２：１、オボアルブミン ３：１、Ｐ６４Ｋ １：３、そしてＢＳＡ １：５。これらのタンパク質の配列は本明細書の配列表（１〜６）に示されている。
【０１１１】
５ ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質Ａ及びＢの混合物を別々に、２ ｍｏｌ／Ｌの塩酸グアニジン及び１０ ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２００ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した。システイン残基の濃度に対して５０倍モル過剰のＤＴＴを加え、反応混合物を窒素雰囲気中３７℃で４時間インキュベートした。溶液を室温に冷却し、前に加えたＤＴＴの量に対して２倍過剰のアクリルアミド溶液を加え、暗所に１時間置いた。両混合物を、１：１００の酵素：基質比を使用してＬＥＰタンパク分解酵素で８時間３７℃において消化した。反応混合物を０〜５℃の温度に冷却し、発生したペプチドの１級アミノ基の濃度に対して８：１の比率を使用して保護試薬（ビオチンアミドペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を２０分の間隔で３回加える。次いで、５％の濃度でトリエチルアミンを加え、反応を３７℃で１時間インキュベートする。生成する混合物を透析し、別々に通常の水（混合物Ａ）及びＩＳＯＴＥＣにより提供された９９％同位体純度の１８Ｏ−標識水（Ｈ２１８Ｏ）（混合物Ｂ）を使用して再構成する。両者を１：２０の比率のトリプシンを使用して３７℃で消化する。４時間後、タンパク分解を停止し、発生した標識ペプチドと非標識ペプチドを混合した後に酵素により触媒される同位体交換を避けるために、トリプシンの量に対して２：１の濃度でアプロチニン溶液を両混合物に加えた。ペプチドの両混合物は混合され、そして加えられた過剰の保護試薬を除くためにアセトニトリルの急速グラジエントを使用して逆相クロマトグラフィーにより脱塩する。ペプチドの混合物を濃縮し、ストレプトアビジンを固定化したセファロースからなるアフィニティーマトリックスに使用したのと同じ平衡溶媒に溶解した。検体に２ ｃｍ／ｈの流量を適用し、非保持フラクションを脱塩し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１１２】
混合物Ｂのタンパク分解の間に、１８Ｏで標識されたペプチドはそのＣ−末端に１及び２原子の１８Ｏを付加することができるので、両条件の下に得られたペプチドの相対的量を計算するためのこの比はペプチドに対応する同位体分布の面積比により与えられるので、１原子（１８Ｏ１）及び２原子（１８Ｏ２）の１８−酸素を取り込んだペプチドの分布の面積で１６Ｏ２の面積を割った、次の式：
（面積１６Ｏ２）／（面積１８Ｏ１＋面積１８Ｏ２）
に従って得られることを記憶に留めておくことが必要である。
【０１１３】
分析する混合物中のペプチドの相対的定量は、本発明の方法の詳細な説明の中で説明されているように、ＩＳＯＴＯＰＩＣＡソフトウエアを使用して行われる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｔｏｐｉｃａ， Ａ Ｗｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４，３２，Ｗ６７４−Ｗ６７８ ａｎｄ／ｏｒ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｏｆ Ｃｏｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｐｅａｋ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２００４；１８；２４６５−２４７２）。
【０１１４】
調製された混合物中に存在する６個のタンパク質のＲＲｎＫペプチドは単離され、そして１回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験において配列分析され、ＭＡＳＣＯＴソフトウエアにより行われた同定の結果並びに定量の結果は表３に示される。
【０１１５】
特に、定量を行うために、これらのペプチドの同位体分布の拡大された領域が選ばれ、分析されるペプチドの全体の式及び１８Ｏによる標識と共にＩＳＯＴＯＰＩＣＡソフトウエアに導入された。
【０１１６】
表３．１８Ｏ／１６Ｏで標識された２つの人工的混合物中に存在する５個のタンパク質のＲＲｎＫペプチドの選択的単離及びその選択的定量の要約。
【表５】
ａ）ＭＡＳＣＯＴソフトウエアにより自動的に同定されたＲＲｎＫペプチドの配列。
ｂ）比較された人工的混合物Ａ及びＢの中のタンパク質の理論的比。
ｃ）２つの比較された人工的混合物中に存在するタンパク質の相対的量を測定したときに得られた実験値。太字は相対的定量値の平均及びカッコ内は標準偏差の値。
【０１１７】
６個のタンパク質について、相対的定量に対応する実験値の平均は理論値に良く一致し、得られた標準偏差は非常に小さかった（５％未満）。
【０１１８】
これらの結果は、この方法は定量的プロテオミクスに使用することができ、非常に良い精度で混合物中に存在するタンパク質の相対的量を測定できることを示している。同定されたタンパク質の一つのタンパク質について得られた実験的同位体分布に対応する面積の調整は図３に示す。
【０１１９】
全ての場合に、理論的分布の理論的輪郭（赤線）及び実験で得られたスペクトル（黒い影をつけたスペクトル）の間で非常に良好な調整が得られたことが認められる。それぞれのタンパク質に属すペプチドの相対的定量について得られた結果は、理論値に非常に近似しており、定量的プロテオーム試験におけるこの方法の有用性を示している。
【０１２０】
ＲＲｎＫペプチドの選択的単離方法は１８Ｏ−標識と完全に調和しており、ペプチドのＣ−末端に導入される標識に影響しない単離方法でそのステップが構成されているのでいずれの生物学的システムの定量的プロテオミック試験にも適用することができる。１６Ｏ／１８Ｏ標識法は、比較するタンパク質混合物のタンパク分解の間に発生するペプチドの全てに普遍的に導入することができる。
【０１２１】
それぞれのタンパク質の相対的定量に関する実験値と理論値の一致は、使用した同位体標識（１８Ｏ）が標識ペプチドと非標識ペプチドの同位体分布の分離を保証しない場合でも、ＩＳＯＴＯＰＩＣＡソフトウエアが信頼性のある結果を提供することをわれわれに確証する。
【０１２２】
選択的単離のこの方法において、ＲＲｎＫペプチドは全てＣ−末端にアルギニンを有しているので、アルギニン残基に１３Ｃ６で特異的に標識を導入するＳＩＬＡＣとして知られている方法（Ｇｒｕｈｌｅｒ Ａ， Ｓｃｈｕｌｚｅ ＷＸ，Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ Ｒ， Ｍａｎｎ Ｍ， Ｊｅｎｓｅｎ ＯＮ． Ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２００５，４（１１），１６９７−７０９）が相対的量の測定に使用できると予想することができる。一部の方法において、培養条件により導入されるいずれかの他のタイプの標識（１Ｈ／２Ｈ又は１４Ｎ／１５Ｎ）をアルギニン残基に使用することができる。
【０１２３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びデータベース検索。
測定はＭｉｃｒｏｍａｓｓ社（マンチェスター、英国）のハイブリッドマススペクトロメーター（４重極及び飛行時間、ＱＴｏｆ−２）において行われる。マススペクトロメーターは２００ｘ１ ｍｍ（Ｖｙｄａｃ， ＵＳＥＳ）のカラムを通してオンラインでＨＰＬＣ（ＡＫＴＡ Ｂａｓｉｃ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓｗｅｄｅｎ）に連結された。ペプチドは、緩衝液Ｂ（アセトニトリル中ギ酸０．２％）の５から４５％への直線的グラジエント（１２０分）で溶出した。
【０１２４】
マススペクトロメーターは、コーン及びキャピラリー電圧、それぞれ３５及び３０００ボルトで運転された。ＭＳ／ＭＳスペクトルの取得のために、７カウント／セグの強度を越えた後、１価、２価、３価荷電の前駆イオンを自動的に選択した。測定モードは、全イオン流（ＴＩＣ）が２カウント／セグに減少した場合又はＭＳ／ＭＳスペクトルを４秒間で取る場合にはＭＳ／ＭＳからＭＳに変更した。取得及びデータ処理はＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア（バージョン３．５、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，英国）により行い、一方、ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づくタンパク質の同定はインターネットのＭＡＳＣＯＴソフトウエア無料バージョンにより行った。探査パラメーターの中に、システイン修飾並びに酸化及び脱アミド化の可能性を含めた。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】定量的プロテオミクスに応用するために本発明に記述された方法を使用してＲＲｎＫペプチドの選択的単離を示す図。黒い菱形により、ＬＥＰペプチドの１級アミノ基に加えられたビオチン基が示されている。
【図２】ＲＲｎＫペプチドの選択的単離がモデルタンパク質：組換えストレプトキナーゼ（ｒＳＫ）で示されている。（Ａ）ＬＥＰペプチドの混合物のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。ビオチン化反応により数個の保護基を加えた２つのＬＥＰペプチドは黒矢印で示されている。（Ｂ）その１級アミノ基の完全なビオチン化の後のペプチド混合物のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。１級アミノ基及びチロシン残基にそれぞれ加えられたビオチン残基は白と黒の菱形で示されている。（Ｃ）チロシン残基のＯ−アシル化の除去及び過剰の保護基の分解の後のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。潜在的ＲＲｎＫペプチドを含む保護されたＬＥＰペプチドは白丸で示されている。（Ｄ）保護されたＬＥＰペプチドのトリプシン消化のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。ｒＳＫのＲＲｎＫペプチドは黒丸で示されている。（Ｅ）本発明の目的の方法を適用した後のＲＲｎＫペプチドの選択的単離。
【図３】固相支持体中のチオール基とＬＥＰペプチドの１級アミノ基に導入された保護基（マレインイミドプロピオニル及びヨー化アセチル）の間の化学反応。網の入った円は遊離チオール基で活性化された支持固相を示す。
【図４】固相支持体としてチオール基で活性化されたＭＢＨＡ樹脂及び２つの保護基：マレインイミジル及びヨウ化アセチルを使用したｒＳＫのＲＲｎＫペプチドの選択単離に対応する（Ａ）及び（Ｂ）に示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図５】本発明中で提案されている方法及びカチオン交換クロマトグラフィー及び保護基として３，５−ジスルホ−安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの組合せを使用するｒＳＫのＲＲｎＫペプチドの単離に対応するＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図６−１】黒色で示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、アミノ基をビオチンで保護した後、セファロースにストレプトアビジンを固定化したアフィニティークロマトグラフィー及び２つの人工的混合物におけるタンパク質の相対的定量を行うために１８Ｏの標識を使用し、実施例１に示した選択的単離方法を適用した後得られたペプチド、３２７ＬＤＶＶＥＭＭＤＧＬＭＱＧＡＤＲ３２２（Ｐ６４Ｋ），１４３ＥＬＩＮＳＷＶＥＳＱＴＮＧＩＩＲ１５８（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ），６２ＷＷＣＮＤＧＲ６８（ｌｙｓｏｚｙｍｅ），５４ＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲ７６（ＥＰＯ），及び３３７ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ３４７（ＢＳＡ）の実験的同位体分布に対応する。それぞれのスペクトルにおいて、２原子の１６Ｏ２（青色）、及びＣ−末端に１原子（紫色）及び２原子の１８Ｏ（黄色）を持つペプチドに相当する同位体分布が示される。それぞれの場合に示された比率において既に述べた３種の混合物（１６Ｏ２，１８Ｏ１及び１８Ｏ２）の理論的同位体の分布は赤色で示されている。
【図６−２】黒色で示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、アミノ基をビオチンで保護した後、セファロースにストレプトアビジンを固定化したアフィニティークロマトグラフィー及び２つの人工的混合物におけるタンパク質の相対的定量を行うために１８Ｏの標識を使用し、実施例１に示した選択的単離方法を適用した後得られたペプチド、３２７ＬＤＶＶＥＭＭＤＧＬＭＱＧＡＤＲ３２２（Ｐ６４Ｋ），１４３ＥＬＩＮＳＷＶＥＳＱＴＮＧＩＩＲ１５８（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ），６２ＷＷＣＮＤＧＲ６８（ｌｙｓｏｚｙｍｅ），５４ＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲ７６（ＥＰＯ），及び３３７ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ３４７（ＢＳＡ）の実験的同位体分布に対応する。それぞれのスペクトルにおいて、２原子の１６Ｏ２（青色）、及びＣ−末端に１原子（紫色）及び２原子の１８Ｏ（黄色）を持つペプチドに相当する同位体分布が示される。それぞれの場合に示された比率において既に述べた３種の混合物（１６Ｏ２，１８Ｏ１及び１８Ｏ２）の理論的同位体の分布は赤色で示されている。
【図６−３】黒色で示されたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、アミノ基をビオチンで保護した後、セファロースにストレプトアビジンを固定化したアフィニティークロマトグラフィー及び２つの人工的混合物におけるタンパク質の相対的定量を行うために１８Ｏの標識を使用し、実施例１に示した選択的単離方法を適用した後得られたペプチド、３２７ＬＤＶＶＥＭＭＤＧＬＭＱＧＡＤＲ３２２（Ｐ６４Ｋ），１４３ＥＬＩＮＳＷＶＥＳＱＴＮＧＩＩＲ１５８（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ），６２ＷＷＣＮＤＧＲ６８（ｌｙｓｏｚｙｍｅ），５４ＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲ７６（ＥＰＯ），及び３３７ＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲ３４７（ＢＳＡ）の実験的同位体分布に対応する。それぞれのスペクトルにおいて、２原子の１６Ｏ２（青色）、及びＣ−末端に１原子（紫色）及び２原子の１８Ｏ（黄色）を持つペプチドに相当する同位体分布が示される。それぞれの場合に示された比率において既に述べた３種の混合物（１６Ｏ２，１８Ｏ１及び１８Ｏ２）の理論的同位体の分布は赤色で示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン残基（ＲＲ）のＣ−末端での切断により生じそしてその配列中にリシン残基を含まない（ｎＫ）ペプチド（ＲＲｎＫとここでは命名する）の選択的単離によって特徴付けられ、タンパク質の相対的濃度の測定が比較する検体中の異なる同位体で標識された各ＲＲｎＫペプチドの理論的スペクトルに対応する面積の比により行われ、以下のステップ：
ａ）分析される複雑な混合物中に存在するタンパク質のシステイン残基の非中性化及びＳ−アルキル化、及び酵素リシルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）を使用するリシン残基のＣ−末端におけるそのペプチド結合の特異的加水分解、
ｂ）ステップ（ａ）で得られたペプチドの１級アミノ基（アルファ及びイプシロン）の、非共有結合相互作用（静電的、親和性、疎水性など）又は共有結合の形成によりステップ（ｅ)においてクロマトグラフィーカラム中又は活性化した固相支持体中に保持され得る可逆的又は不可逆的な化学的修飾、
ｃ）加えられた過剰の保護試薬の分解及びチロシン残基のＯ−アシル化の除去のためのアルカリ処理、
ｄ）ステップ（ｂ）において得られたＬＥＰ保護ペプチドのトリプシンによる消化、
ｅ）ステップ（ａ）に先立つＳＩＬＡＣとして知られる方法を使用する培養条件によるタンパク質の検体の異なる同位体による標識、又はステップ（ａ）及び／又は（ｄ）におけるペプチドの標識、
ｆ）相互作用、共有結合又は高い親和性を持つ非共有結合のいずれかによりクロマトグラフィーカラム又は活性化固相支持体の中にステップ（ｂ）において導入された保護基を持つペプチドを保持し、場合によって非保持フラクション中に又は保持フラクション中にＲＲｎＫペプチドを得る、
ｇ）液体クロマトグラフィーに連結したマススペクトロメトリーによるステップ（ｅ）において選択的に単離したＲＲｎＫペプチドを含むタンパク質の同定、
ｈ）ステップ（ｆ）において同定されたＲＲｎＫペプチドのマススペクトルの面積の実験値と理論値の比によるステップ（ｇ）の混合物中の１又は数個のタンパク質の相対的定量、
よりなる細胞抽出又は生物学的液に由来する複雑な混合物中の１つ又は数個のタンパク質の同定及び相対的定量のための方法。
【請求項２】
アミノ基の修飾試薬：例えば、無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水テトラヒドロフタル酸、クロロギ酸 ９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、２−メチルスルホニルエチル スクシンイミジルカルボナート、尿素及びアミノ基を保護する試薬：例えば、（ａ）ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニル及び４−メトキシベンジルオキシカルボニルを含む芳香族ウレタン型保護基；（ｂ）ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル及びメチルスルホニルエトキシカルボニルを含む脂肪族ウレタン型保護基；（ｃ）アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル及びイソボルニルオキシカルボニルを含むシクロアルキルウレタン型保護基；（ｄ）アシル保護基又はスルホニル保護基、好ましい保護基はベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニル及び１−カンファースルホニルを含む；（ｅ）ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチル−１（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、アルファメチル−２−ニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、６−ニトロベラトリル、４−メトキシフェナシル及び３’，５’−ジメトキシベンゾインのカルバメート誘導体を含む光感受性保護基及びビオチンの活性化誘導体及びその化学的誘導体、さらに例えばＳＯ３−基のような修飾ペプチドに多価陰性電荷を提供する他の保護基、一般的にアミノ基を保護するためにペプチド合成に使用される試薬又は前に説明した性質を充たすアミノ基と反応できるほかの試薬、
を使用するステップ（ａ）におけるタンパク分解処理において発生したペプチドに含まれるリシンのステップ（ｂ）における末端α−アミノ基及びε−アミノ基の共有結合修飾によって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ファージディスプレーライブラリー又は１本鎖抗体、合成により得られたモノクロナール抗体又は抗体フラグメント又は天然資源から単離されたか又は合成ペプチドライブラリーから単離されたか又はファージディスプレーペプチドライブラリーにより得られたペプチド、ＬＥＰペプチドのアミノ基に導入された天然又は人工的リガンドに結合する高い親和性を持つ他のタンパク質を固定化したアフィニティーマトリックス、及び一般的にペプチドのアミノ基に導入された保護基と共有結合又は非共有結合で結合することができる反応基を含有する活性マトリックスのいずれかをステップ（ａ）において使用することによって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＲｎＫペプチドを保持フラクション中に選択的に単離するためにアミノ基に陰性電荷を導入する誘導体と組み合わせたカチオン交換クロマトグラフィーの使用によって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｅ）において発生したペプチドの実験的に得られたマススペクトルに最も良く合うＲＲｎＫペプチドの標識及び非標識分子種の理論的スペクトルに対応する面積の比を計算することにより検体中の１個又は数個のタンパク質の相対的濃度を測定することによって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項１】
アルギニン残基（ＲＲ）のＣ−末端での切断により生じそしてその配列中にリシン残基を含まない（ｎＫ）ペプチド（ＲＲｎＫとここでは命名する）の選択的単離によって特徴付けられ、タンパク質の相対的濃度の測定が比較する検体中の異なる同位体で標識された各ＲＲｎＫペプチドの理論的スペクトルに対応する面積の比により行われ、以下のステップ：
ａ）分析される複雑な混合物中に存在するタンパク質のシステイン残基の非中性化及びＳ−アルキル化、及び酵素リシルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）を使用するリシン残基のＣ−末端におけるそのペプチド結合の特異的加水分解、
ｂ）ステップ（ａ）で得られたペプチドの１級アミノ基（アルファ及びイプシロン）の、非共有結合相互作用（静電的、親和性、疎水性など）又は共有結合の形成によりステップ（ｅ)においてクロマトグラフィーカラム中又は活性化した固相支持体中に保持され得る可逆的又は不可逆的な化学的修飾、
ｃ）加えられた過剰の保護試薬の分解及びチロシン残基のＯ−アシル化の除去のためのアルカリ処理、
ｄ）ステップ（ｂ）において得られたＬＥＰ保護ペプチドのトリプシンによる消化、
ｅ）ステップ（ａ）に先立つＳＩＬＡＣとして知られる方法を使用する培養条件によるタンパク質の検体の異なる同位体による標識、又はステップ（ａ）及び／又は（ｄ）におけるペプチドの標識、
ｆ）相互作用、共有結合又は高い親和性を持つ非共有結合のいずれかによりクロマトグラフィーカラム又は活性化固相支持体の中にステップ（ｂ）において導入された保護基を持つペプチドを保持し、場合によって非保持フラクション中に又は保持フラクション中にＲＲｎＫペプチドを得る、
ｇ）液体クロマトグラフィーに連結したマススペクトロメトリーによるステップ（ｅ）において選択的に単離したＲＲｎＫペプチドを含むタンパク質の同定、
ｈ）ステップ（ｆ）において同定されたＲＲｎＫペプチドのマススペクトルの面積の実験値と理論値の比によるステップ（ｇ）の混合物中の１又は数個のタンパク質の相対的定量、
よりなる細胞抽出又は生物学的液に由来する複雑な混合物中の１つ又は数個のタンパク質の同定及び相対的定量のための方法。
【請求項２】
アミノ基の修飾試薬：例えば、無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水テトラヒドロフタル酸、クロロギ酸 ９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、２−メチルスルホニルエチル スクシンイミジルカルボナート、尿素及びアミノ基を保護する試薬：例えば、（ａ）ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニル及び４−メトキシベンジルオキシカルボニルを含む芳香族ウレタン型保護基；（ｂ）ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル及びメチルスルホニルエトキシカルボニルを含む脂肪族ウレタン型保護基；（ｃ）アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル及びイソボルニルオキシカルボニルを含むシクロアルキルウレタン型保護基；（ｄ）アシル保護基又はスルホニル保護基、好ましい保護基はベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニル及び１−カンファースルホニルを含む；（ｅ）ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチル−１（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、アルファメチル−２−ニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、６−ニトロベラトリル、４−メトキシフェナシル及び３’，５’−ジメトキシベンゾインのカルバメート誘導体を含む光感受性保護基及びビオチンの活性化誘導体及びその化学的誘導体、さらに例えばＳＯ３−基のような修飾ペプチドに多価陰性電荷を提供する他の保護基、一般的にアミノ基を保護するためにペプチド合成に使用される試薬又は前に説明した性質を充たすアミノ基と反応できるほかの試薬、
を使用するステップ（ａ）におけるタンパク分解処理において発生したペプチドに含まれるリシンのステップ（ｂ）における末端α−アミノ基及びε−アミノ基の共有結合修飾によって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ファージディスプレーライブラリー又は１本鎖抗体、合成により得られたモノクロナール抗体又は抗体フラグメント又は天然資源から単離されたか又は合成ペプチドライブラリーから単離されたか又はファージディスプレーペプチドライブラリーにより得られたペプチド、ＬＥＰペプチドのアミノ基に導入された天然又は人工的リガンドに結合する高い親和性を持つ他のタンパク質を固定化したアフィニティーマトリックス、及び一般的にペプチドのアミノ基に導入された保護基と共有結合又は非共有結合で結合することができる反応基を含有する活性マトリックスのいずれかをステップ（ａ）において使用することによって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＲｎＫペプチドを保持フラクション中に選択的に単離するためにアミノ基に陰性電荷を導入する誘導体と組み合わせたカチオン交換クロマトグラフィーの使用によって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｅ）において発生したペプチドの実験的に得られたマススペクトルに最も良く合うＲＲｎＫペプチドの標識及び非標識分子種の理論的スペクトルに対応する面積の比を計算することにより検体中の１個又は数個のタンパク質の相対的濃度を測定することによって特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【公開番号】特開２００７−１３９７８７（Ｐ２００７−１３９７８７Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００６−３１５４０３（Ｐ２００６−３１５４０３）
【出願日】平成１８年１１月２２日（２００６．１１．２２）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１５４０３（Ｐ２００６−３１５４０３）
【出願日】平成１８年１１月２２日（２００６．１１．２２）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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