タンパク質キナーゼ阻害剤
本発明は、細胞増殖性疾患の治療に有用な、式（Ｉ）の化合物：
またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。
またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度に相同なサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）ＣＤＫ４およびＣＤＫ６と、サイクリンＤとの組み合わせは、細胞周期のＧ１（増殖）およびＳ（ＤＮＡ複製）期の間で制限点Ｒを通る遷移の重要な調節因子である。ＣＤＫ４／６は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）のリン酸化反応を介してそれらの効果を発揮する。一度リン酸化されると、ｐＲｂは、Ｓ期への移行を促進する遺伝子の転写に対するその阻害効果を失う。
【０００３】
一方、内因性タンパク質調整因子ｐ１６ＩＮＫ４または小分子阻害剤によるＣＤＫ４／６キナーゼ活性の特異的阻害は、低リン酸化ｐＲｂと、Ｇ１制限点における細胞の停止を導く。Ｇ１制限点の制御における主要な機構として、これらキナーゼにより制御される経路は、広範囲のヒト腫瘍において変更されるので、これら腫瘍におけるＣＤＫ４／ＣＤＫ６の阻害は、細胞分裂を防止することによる治療的利点を有する。
【０００４】
Ｐｉｍ−１は、細胞周期の進行、転写／シグナル変換経路およびアポトーシスを含む種々の生物学的機能を制御し、また、その発現は、血液学的腫瘍、前立腺腫瘍、および、経口腫瘍を含むいくつかの癌と関連している、セリン／トレオニンキナーゼである（非特許文献１）。
【０００５】
キナーゼ阻害剤は、当該技術分野において公知である。特許文献１は、一連の置換２−ピリミジンアミンを開示し、また、それらをキナーゼ阻害剤、特に、キナーゼｐ５６ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０およびタンパク質キナーゼＣとして記載している。特許文献１は、Ｃｄｋの阻害については開示していない。
【０００６】
特許文献２において開示されている、一連の２−（ピリジン−２−イルアミノ）−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オンは、ＣＤＫ４／６阻害活性を有するものとして記載されている。これらの化合物は、例えば癌および再狭窄のような細胞増殖性疾患の治療に有用であると記載されている。しかし、これらの化合物は、水溶液に溶けにくく、他の（非Ｃｄｋ）キナーゼ標的において目立った阻害活性を示さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９８／１１０９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０６２２３６号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．およびＴ．Ｍｏｒｏｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００５．３７（４）：ｐ．７２６−３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌等の細胞増殖性疾患の治療に用いられ得るＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性が依然としてある。本発明は、ＣＤＫ４／６阻害剤を提供する。本発明の特定の化合物は、当該技術分野に公知の特定の化合物よりも有効なＣＤＫ４／６阻害剤である。
【００１０】
加えて、他のＣｄｋと比較してＣＤＫ４／６に対して選択的であるので、薬理学的に関連する濃度にて存在する場合において特定のＧ１停止をもたらし得る、ＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明は、薬理学的に関連する濃度にて存在する場合において特定のＧ１停止をもたらし得るＣＤＫ４／６阻害剤を提供する。
【００１１】
また、改善された水溶液中の溶解性を有するＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、当該技術分野の特定の化合物と比較して改善された水溶液中の溶解性を有する。
【００１２】
さらに、改善された脳組織への分布を有するので、脳（例えば、原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍）内で生じる疾患を処置するために使用され得る、ＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、改善された脳組織への分布を有する。
【００１３】
また、良好な薬物速度論的特性（例えば、経口利用可能性）を有するＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、当該技術分野において公知の特定の化合物と比較した場合に改善された経口利用可能性を有する。
【００１４】
加えて、他の非Ｃｄｋキナーゼ（例えば、Ｐｉｍ−１キナーゼ）における二次的な阻害活性を有するキナーゼ阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、二重ＣＤＫ４／６およびＰｉｍ−１キナーゼ阻害活性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキルまたはシクロプロピル−メチルであり；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたはフッ素であり、Ｒ２またはＲ３のうち少なくとも１つは、フッ素であり；
Ｒ４は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、式中、Ｒ６およびＲ７は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｑは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓまたは直接結合であり；
ＷおよびＹは、ＣまたはＮであり、ここで、ＷまたはＹのうち少なくとも１つは、Ｎであり、ＱがＯまたはＳである場合、ＷはＣである）
またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩、および、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬製剤を提供する。
【００１７】
本発明は、治療における使用のための本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１８】
本発明は、癌の処置における使用のための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。具体的には、これらの癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群より選択される。
【００１９】
この発明は、さらに、有効量の本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を、癌の処置を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される癌を処置する方法を提供する。
【００２０】
加えて、この発明は、癌の治療のための薬剤の製造のための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩の使用を提供する。具体的には、これらの癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される。
【００２１】
さらに、この発明は、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩、および、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、治療に使用するための医薬製剤を提供する。本発明はまた、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩、および、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病を処置するための医薬製剤を提供する。
【００２２】
上述の式において使用された一般的な化学用語は、それらの一般的な意味を有する。例えば、用語「Ｃ３〜Ｃ５アルキル」は、３から５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖である一価の飽和脂肪族鎖を意味し、限定されないが、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含む。
【００２３】
用語「Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル」は、３から５個の炭素原子を含有する飽和炭素環系を意味する。
【００２４】
ここで、ほとんどまたはすべての本発明の化合物が塩を形成可能であることを当業者は理解するだろう。本発明の化合物は、アミンであり、したがって、多数の無機酸および有機酸のいずれかと反応して、製薬的に許容し得る酸付加塩を形成する。このような製薬的に許容し得る酸付加塩、および、それらを調製するための一般的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、以下の文献を参照のこと。Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｌ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ，「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」．Ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｖｏｌ．１３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １９９５，ｐｐ．４５３−４９９；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ ６６，Ｎｏ．１，１９７７年，１月。塩酸塩およびメシラート塩が好ましい。メシラート塩が特に好ましい。
【００２５】
好ましくは、本発明は、Ｒ１が、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロプロピル−メチルである式（Ｉ）の化合物を含む。より好ましくは、Ｒ１はイソプロピルである。
【００２６】
好ましくは、本発明は、Ｒ２が、フッ素であり、Ｒ３が、水素である、式（Ｉ）の化合物を含む。好ましくは、本発明は、Ｒ２が、水素であり、Ｒ３が、フッ素である、式（Ｉ）の化合物を含む。最も好ましくは、Ｒ２およびＲ３の両方は、フッ素である。
【００２７】
好ましくは、本発明は、Ｒ４が、水素である、式（Ｉ）の化合物を含む。代替的に、Ｒ４は、好ましくはメチルである。最も好ましくは、Ｒ４は水素である。
【００２８】
好ましくは、本発明は、Ｒ５が、Ｃ１〜Ｃ３アルキルまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６およびＲ７が、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである、式（Ｉ）の化合物を含む。より好ましくは、Ｒ６およびＲ７は、エチルである。より好ましくは、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。最も好ましくは、Ｒ５は、エチルである。
【００２９】
好ましくは、本発明は、Ｑが、ＣＨ２または直接結合である、式（Ｉ）の化合物を含む。最も好ましくは、ＱはＣＨ２である。
【００３０】
好ましくは、本発明は、Ｙが、Ｎである、式（Ｉ）の化合物を含む。
【００３１】
好ましくは、本発明は、Ｗが、Ｎである、式（Ｉ）の化合物を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明は、ＷおよびＹの両方が、Ｎである、式（Ｉ）の化合物を含む。
【００３３】
本発明の好ましい化合物は、下式の化合物：
【化２】
（式中、
Ｒ１は、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロプロピル−メチルであり；
Ｒ４は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｑは、ＣＨ２、Ｏまたは直接結合であり；
Ｗは、ＣまたはＮであり、ＱがＯの場合、ＷはＣである）
または、その製薬的に許容し得る塩を含む。
【００３４】
特に好ましい化合物は、本願明細書において例示される化合物またはその製薬的に許容し得る塩である。さらに特に好ましい化合物は、化合物［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン、またはその製薬的に許容し得る塩である。［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンは、代替的に、２−ピリミジンアミン、Ｎ−［５−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］−２−ピリジニル］−５−フルオロ−４−［４−フルオロ−２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル］と命名されてもよい。
【００３５】
非常に好ましい化合物は、２１．２９（２θ±０．１°）におけるピーク、ならびに、１１．５４、１０．９１、および１２．１３（２θ±０．１°）を含む群から任意に選択される１つ以上のピーク、を含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα放射線、λ＝１．５４０５６Å）により特徴付けられる、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶である。［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶は、さらに、１１２．７、１２７．３および１２９．４における化学シフトピークν（Ｆ１）［ｐｐｍ］を有する１３Ｃ ＮＭＲスペクトルによりさらに特徴付けられ得る。
【００３６】
本発明の化合物は、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の特定の阻害剤であるので、異常な細胞増殖により特徴付けられる病気または疾患の治療に有用である。具体的には、本発明の化合物は、癌の治療に有用である。
【００３７】
ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は、ｐＲｂのリン酸化反応を介する細胞周期に対するそれらの作用を調節する。本発明の化合物は、ＣＤＫ４／６活性の有効な阻害剤であるので、ｐＲｂリン酸化反応は、あらゆる癌のタイプにおける細胞増殖（したがって、腫瘍成長）を阻害することが期待される。ここで、この細胞は、増殖型であり、機能的インタクトＲｂ１遺伝子（これはｐＲｂをコードする）を含む。したがって、本発明の化合物は、哺乳動物における、ｐＲｂ＋癌、例えば、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病の治療（Ｆｒｙ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００４），３（１１），１４２７）、マントル細胞リンパ腫の治療（Ｍａｒｚｅｃ，Ｍ．ら，Ｂｌｏｏｄ（２００６），１０８（５），１７４４）、卵巣癌の治療（Ｋｉｍ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４），５４，６０５）、膵臓癌の治療（Ｓｃｈｕｔｔｅ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），５７，３１２６）、悪性黒色種および転移性悪性黒色種の治療（Ｍａｅｌａｎｄｓｍｏ，Ｇ．Ｍ．ら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（１９９６），７３，９０９）において有用である。本発明の化合物はまた、哺乳動物における、横紋筋肉種の治療（Ｓａａｂ，Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００６），５（５），１２９９）および多発性骨髄種の治療（Ｂａｕｇｈｎ，Ｌ．Ｂ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６），６６（１５），７６６１）に有用であると期待される。治療される哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
【００３８】
加えて、好ましい本発明の化合物は、改善された脳組織への分布を有する有利な特性を示す。例えば、ラットモデルに投与される場合は、実施例１６の化合物の脳：血漿曝露比（曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血漿濃度および脳濃度（Ｃｍａｘ）を用いて決定される、表６ｃを参照）は、およそ１であり、これは、実施例１６の化合物が脳へ良好に分布していることを示している。一方で、本発明者らにより、国際公開第０３／０６２２３６号からの好ましい化合物、（６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）が、０．１７（ＡＵＣ）および０．１（Ｃｍａｘ）の脳：血漿分布比を示すことが決定されている。これは、この化合物がこのモデルにおいて脳組織内に比較的不十分に分布していることを示している。したがって、好ましい本発明の化合物は、脳に侵入可能であるので、原発性および転移性脳腫瘍（ここで、細胞は、増殖型であり、機能的インタクトＲｂ１遺伝子を含む）の治療において有用である。このようなｐＲｂ＋脳腫瘍の例としては、膠芽腫ならびに髄芽種および星状細胞腫が挙げられる（Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７），２３５，１３９４）。テモゾロマイドは、黒色種、乳癌およびＮＳＣＬＣからの脳転移を含む（Ｓｉｅｎａ，Ｓ．ら，（２００９）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｐ３４３）、膠芽腫および星状細胞腫（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｓ．ら（２０００），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６（７）：２５８５−９７）を含む脳腫瘍の治療に使用される、細胞毒性ＤＮＡアルキル化剤である。テモゾロマイドは、化学修飾／損傷を起こすＤＮＡと相互作用する（Ｍａｒｃｈｅｓｉ，Ｆ．ら，（２００７），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．５６（４）：２７５−８７）。本発明の化合物は、原発性および転移性ｐＲｂ＋脳腫瘍（例えば、膠芽腫および星状細胞腫）の治療のために、テモゾロマイドと組み合わせて使用され得る。ここで、このような転移は、例えば、黒色種、乳癌またはＮＳＣＬＣから生じるものである。
【００３９】
抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類似体であるゲムシタビンＨＣｌは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（β−異性体）であり、２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン一塩酸塩、または、１−（４−アミノ−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−１−イル）−２−デソキシ−２’，２’−ジフルオロリボースとしても知られている。ゲムシタビンＨＣｌは、米国特許第５，４６４，８２６号に記載されている。以下に構造式を示す。
【化３】
【００４０】
ゲムシタビンＨＣｌは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療に有効であり（Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．およびＥｔｔｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．，（１９９９），Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，４，２４１）、膵臓癌の治療に有効であり（Ｐｉｎｏ，Ｓ．Ｍ．ら，（２００４），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，１１９）、卵巣癌の治療に有効であり（Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒ，Ｊ．ら，（２００６），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２４（２９），４６９９）、および転移性乳癌の治療に有効である（Ｃｈａｎ，Ｓ．ら，（２００９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２７（１１），１７５３）。本発明の化合物は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌および転移性乳癌の治療のために、ゲムシタビンＨＣｌと組み合わせて使用され得る。
【００４１】
本発明の化合物は、有効量の本発明の化合物を、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における癌、具体的には、上述した癌を治療する方法において使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌を治療する方法において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌を治療する方法において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、治療有効量の本発明の化合物およびテモゾロマイドの組み合わせを、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における膠芽腫または星状細胞腫を治療する方法において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、治療有効量の本発明の化合物およびゲムシタビンＨＣｌの組み合わせを、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌を治療する方法において使用され得る。
【００４２】
本発明の化合物は、癌、具体的には、上述した癌の治療のために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌の治療のために使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌の治療のために使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、膠芽腫または星状細胞腫の治療において、テモゾロマイドと同時、別個、または、連続的に組み合わせて使用するための、本発明の化合物を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌の治療において、ゲムシタビンＨＣｌと同時、別個、または、連続的に組み合わせて使用するための、本発明の化合物を提供する。
【００４３】
さらに、本発明の化合物は、癌、具体的には、上述した癌の治療のための薬剤の製造において使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌の治療のための薬剤の製造において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌の治療のための薬剤の製造において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、膠芽腫または星状細胞腫の治療のための薬剤の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。ここで、この薬剤はまた、テモゾロマイドを含むか、あるいは、テモゾロマイドと同時か、別個か、または、連続して投与され得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌の治療のための薬剤の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。ここで、この薬剤はまた、ゲムシタビンＨＣｌを含むか、あるいは、ゲムシタビンＨＣｌと同時か、別個か、または、連続して投与され得る。
【００４４】
癌、具体的には、上述した癌を治療するための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤もまた提供される。好ましい実施形態において、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌を治療するための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤もまた提供される。好ましい実施形態において、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌を治療するための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤もまた提供される。別の好ましい実施形態において、本発明は、膠芽腫または星状細胞腫を治療するための、本発明の化合物およびテモゾロマイドとともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌を治療するための、本発明の化合物およびゲムシタビンＨＣｌとともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩およびテモゾロマイドとともに、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬製剤を提供する。
【００４６】
本発明はまた、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩およびゲムシタビンＨＣｌとともに、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬製剤を提供する。
【００４７】
本発明は、さらに、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに、製薬的に許容し得る担体および任意の他の治療成分を含む、医薬製剤を提供する。
【００４８】
さらに、好ましい例示の化合物はまた、Ｐｉｍ−１の阻害剤である。上述したように、Ｐｉｍ−１は、細胞周期の進行、転写／シグナル変換経路およびアポトーシスを含む種々の生物学的機能の制御に関与するセリン／トレオニンキナーゼであり、また、その発現は、いくつかの癌と関連している。具体的には、小分子阻害剤Ｋ００１３５によるＰｉｍ−１の阻害は、ヒトの急性白血病細胞集団の生存およびクローン性増殖を弱めることが示されている（Ｐｏｇａｃｉｃ，Ｖ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００７）．６７（１４）：ｐ．６９１６−２４）。加えて、Ｐｉｍ−１は、バルーン損傷ラットの頚動脈の内膜新生、ならびに、内膜肥厚を示すヒトの胸部大動脈および冠状動脈において発現されることが示されている。さらに、Ｐｉｍ−１機能の特定の阻害は、バルーン損傷後の内膜新生形成およびまた、培養血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖の両方を顕著に抑制した。これは、Ｐｉｍ−１がこのような細胞の増殖において重要な役割を担うことを示唆している。ＶＳＭＣの増殖は、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄）の原因に関わっており、このため、Ｐｉｍ−１の阻害は、ＶＳＭＣの増殖を抑制するので、血管閉塞性疾患の治療に有用であると期待されている（Ｋａｔａｋａｍｉ Ｎら，ＪＢＣ（２００４），２７９（５２），５４７４２−５４７４９）。
【００４９】
したがって、好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩は、有効量の本発明の化合物を、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）を治療する方法において使用され得る。好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩は、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）の治療において使用され得る。さらに、好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩は、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）の治療のための薬剤の製造において使用され得る。また、好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を含む、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）を治療する医薬製剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本願明細書において、「ｈ」は、時間を意味する。「ｍｉｎ」は、分を意味する。「Ｃｄｋ」は、サイクリン依存性キナーゼを意味する。「ｐＲｂ」は、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。「ＭＣＬ」は、マントル細胞リンパ腫を意味する。「ＡＭＬ」は、急性骨髄性白血病を意味する。「ＣＭＬ」は、慢性骨髄性白血病を意味する。「Ｂｏｃ」は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを意味する。「ＥＡ」は、酢酸エチルを意味する。「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを意味する。「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。「ＤＭＡ」は、ジメチルアセトアミドを意味する。「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを意味する。「ＭｔＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを意味する。「ＴＥＡ」は、トリエチルアミンを意味する。「ＦＢＳ」は、ウシ胎仔血清を意味する。「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味する。「ＲＴ」は、室温を意味する。「ｍｐｋ」は、キログラムあたりのミリグラムを意味する。「ｐｏ」は、口から（経口）を意味する。「ｑｄ」は、１日１回の投与を意味する。「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを意味する。「ｑ２ｄ」は、２日ごとの単回投与を意味する。「ｑ２ｄｘ１０」は、２日ごとの単回投与を１０回すること意味する。「ＶＳＭＣ」は、血管平滑筋細胞を意味する。「ＸＲＤ」は、Ｘ線回折を意味する。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物は、以下に示す当業者に公知の技術および手順により調製され得る。より具体的には、式（Ｉ）の化合物は、以下に示すスキーム、方法、および実施例に記載されるように調製され得る。以下のスキームにおける個々の工程は、式（Ｉ）の化合物を提供するために変更され得ることが当業者に理解される。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に取得可能である。すべての置換物は、特に指定されない限り、上記に定義したとおりである。
【００５２】
以下の調製例および実施例における化合物名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ５．０を用いて生成される。
【００５３】
スキーム
式（Ｉ）の化合物の合成を、以下の調製例と、実施例およびスキームの両方において例示する。ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｑ、Ｗ、およびＹは、上記したように定義される。
【００５４】
スキーム１
式（Ｉ）の化合物を、以下のスキーム１に示すようなパラジウム（０）カップリング反応により調製する。
【化４】
【００５５】
スキーム１の上部の反応において、Ｚ＝Ｒ５の場合、ピリミジニル−ベンズイミダゾール塩化物（Ａ）を、パラジウム触媒カップリング反応にてピリジニルアミン（Ｂ）と反応させて、直接式（Ｉ）の化合物を形成する。
【００５６】
スキーム１の下部の反応において、Ｙ−ＺがＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）の場合、ピリミジニルハロゲン化物（Ａ）をまた、ピリジニルアミン（Ｂ）とカップリングさせるが、Ｂｏｃ基を強酸で除去して、遊離アミン（Ｃ）を生成する。最終的に、アミン（Ｃ）を、還元条件下でアルキル化して、式（Ｉ）の化合物を生成する。
【００５７】
スキーム２
ピリミジニル−ベンズイミダゾール（Ａ）の調製例
【化５】
【００５８】
ピリミジニル−ベンズイミダゾール（Ａ）を、市販のピリミジニル二塩化物（Ｄ）およびベンズイミダゾールボロン酸（Ｅ）のパラジウム（ＩＩ）触媒カップリング反応により調製する。
【００５９】
スキーム３
ベンズイミダゾールボロン酸（Ｅ）の調製例
【化６】
【００６０】
ベンズイミダゾールボロン酸（Ｅ）を、ビス（ピナコラト）ジボロン酸を用いて、ベンズイミダゾール（Ｈ）中で臭化物のＰｄ（ＩＩ）触媒ボロニル化を介して調製する。次いで、ベンズイミダゾール（Ｈ）を、カリウムｔ−ブトキシドを用いるアミジン（Ｆ）の環化、または、オルト酢酸トリエチル／酢酸を用いるベンゼンジアミン（Ｇ）の濃縮により調製する。
【００６１】
アミジン（Ｆ）を、塩化ホスホリルの存在下でアミンＲ１−ＮＨ２のモノ−アセトアミド誘導体で４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニルアミンを濃縮することによる、当業者に公知の有機合成により調製する。ベンゼンジアミン（Ｇ）を、アミンＲ１−ＮＨ２による２，４−ジブロモ−ニトロベンゼン中の２箇所の臭素の置換と、その後のニトロ基のアミン基への還元による、当業者に公知の有機合成により、２段階で調製する。
【００６２】
スキーム４
ピリジニルアミン（Ｂ）の調製例（ここで、Ｑは、ＳまたはＯであり、Ｗは、Ｃである）
【化７】
【００６３】
ピリジニルアミン（Ｂ）の合成（ここで、Ｑは、ＳまたはＯであり、Ｗは、Ｃである）を、市販のチオールまたはアルコール（Ｊ）によるピリジン（Ｉ）中の５−ハロゲン化物の置換により達成する。ニトロピリジン（Ｉ）が必要な場合、置換生成物について、さらにニトロ還元工程を行って、（Ｂ）を生成する。化合物（Ｉ）がこれらのスキームを通して汎用的な試薬であるが、いくつかはピリジルアミンやニトロピリジンのように市販のものであることが理解されるべきである。とはいえ、市販の（Ｉ）は、本願明細書および以下に記載した順序について当該技術分野において公知のアミン酸化またはニトロ基還元反応により転換可能である。
【００６４】
スキーム５
ピリジニルアミン（Ｂ）の調製例（ここで、Ｑは、ＣＨ２である）
【化８】
【００６５】
ピリジニルアミン（Ｂ）の合成（ここで、Ｑは、ＣＨ２である）を、以下の２つの方法により達成する。（１）市販のカルバルデヒド（Ｋ）について、遊離アミン（Ｌ）を用いる還元的アミノ化を行い、その後、リチウム１，１，１，３，３，３−ヘキサメチル−ジシラザンまたは液体アンモニアおよび酸化第一銅を用いるＰｄ（０）触媒アミノ化によるピリジン臭化物の置換を行う。（２）市販の１−ピペリジンカルボン酸、４−メチレン−，１，１−ジメチルエチルエステル（Ｍ）について、ヒドロホウ素化を行い、その後、ピリジルアミン（Ｉ）を用いるＰｄ（ＩＩ）カップリングを行う。
【００６６】
スキーム６
ピリジニルアミン（Ｂ）の調製例（ここで、Ｑは、直接結合である）
【化９】
【００６７】
ピリジニルアミン（Ｂ）の合成（ここで、Ｑは、直接結合である）を、以下の２つの方法により達成する。（１）市販の１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸，３，６−ジヒドロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−，１，１−ジメチルエチルエステル（Ｎ）について、ニトロピリジン（Ｉ）を用いるパラジウム（ＩＩ）カップリングを行い、その後、ニトロ基および二重結合の両方の還元を行う。（２）ニトロピリジン（Ｉ）中の臭化物を、遊離アミン（Ｌ）で置換して、その後、ニトロ基の還元を行う。
【００６８】
調製例１
４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルスルファニル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
乾燥トルエン（６．０６ｍＬ）を、２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリン（７６．５２ｍｇ）、ヨウ化銅（Ｉ）（６９．２７ｍｇ）、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４７５．５９ｍｇ）、４−メルカプト−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５８３．５ｍｇ）、マグネシウム（４９．１０ｍｇ）および２−アミノ−５−ヨードピリジン（５５０ｍｇ）の混合物に加える。超音波を用いて混合物中で窒素を泡立て、密閉したチューブ中で２４時間１１０℃にて懸濁液を攪拌する。冷却し、セライトで濾過する。トルエンで洗浄し、真空下で溶媒を除去する。ヘキサン／ＥＡ（１／１）を加え、セライト／シリカゲルパッドで濾過し、ヘキサン／ＥＡ（１／１）および次いでＥＡで２回洗浄する。真空下で溶媒を除去する。ヘキサン／ＥＡ（５０〜７５％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、６３０ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６９】
調製例２
５−フルオロ−２−ニトロ−ピリジン
０℃にて、硫酸（４６ｍＬ）に、開放空気中で２５％の過酸化水素（２６．９８ｍＬ）を加える。５分後、冷えた濃硫酸中の２−アミノ−５−フルオロピリジン（９ｇ）の溶液（４６ｍＬ）を、添加漏斗を用いて滴下して加える。得られた暗色溶液を、浴中で一晩、０℃〜室温にて攪拌する。２００ｍＬの氷水上に注ぎ、ＤＣＭで抽出する。合わせた有機層を５％の亜硫酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。真空下で溶媒を除去し、ＤＣＭで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、７．５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝１４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７０】
対応するアミンを用いて５−フルオロ−２−ニトロ−ピリジンについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００７１】
【表１】
【００７２】
調製例４
１−イソプロピル−４−（２−メチル−６−ニトロ−ピリジン−３−イル）−ピペラジン
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）中の３−ブロモ−２−メチル−６−ニトロ−ピリジン（２．４６ｇ）、１−イソプロピル−ピペラジン（２．７４ｇ）、テトラ−ｎ−ブチルヨウ化アンモニウム（４１８．６９ｍｇ）および炭酸カリウム（１．７２ｇ）を、６５℃で一晩攪拌する。ＥＡおよび水を加え、相を分離させ、硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。メタノールおよび次いでメタノール−ＮＨ３ ２Ｎで溶出する強カチオン交換カートリッジにより精製して、２．５８ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２６５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７３】
対応するブロモ誘導体を用いて、１−イソプロピル−４−（２−メチル−６−ニトロ−ピリジン−３−イル）−ピペラジンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【００７４】
【表２】
【００７５】
調製例７
５−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イル）−６−メチル−ピリジン−２−イルアミン
Ｈ２（バルーン）下で一晩、メタノール（３８ｍＬ）およびＥＡ（３８ｍＬ）中の１−イソプロピル−４−（２−メチル−６−ニトロ−ピリジン−３−イル）−ピペラジン（２．５２ｇ）および１０％のパラジウム炭素（６００ｍｇ）を攪拌する。セライトパッドで濾過し、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／メタノール（０〜１０％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２．２３ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝１４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７６】
対応するニトロ誘導体を用いて、５−（４−イソプロピル−ピペリジン−１−イル）−６−メチル−ピリジン−２−イルアミンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【００７７】
【表３】
【００７８】
調製例１０
４−（６−ニトロ−ピリジン−３−イルオキシ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
０℃にて窒素下で、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４．８４ｇ）を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、３９ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−１−ピペリジン−カルボキシレート（８．７６ｇ）の水溶液に加える。１時間攪拌し、ＤＭＡ（７８ｍＬ）中の５−フルオロ−２−ニトロ−ピリジン（５ｇ）の水溶液を滴下して加える。反応物を室温で一晩攪拌する。水を加え、１時間静置させる。濾過して水で洗浄する。ＤＣＭ／ＥＡ（０〜１５％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、５．６５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７９】
調製例１１
４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルオキシ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
１０％のパラジウム炭素（０．６ｇ）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／メタノール（３０／３０ｍＬ／ｍＬ）の混合物中の４−（６−ニトロ−ピリジン−３−イルオキシ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．６５ｇ）の懸濁液に加える。一晩、２ａｔｍで、Ｐａｒｒ装置において水素化する。セライトパッドで濾過し、ＤＣＭおよびメタノールで洗浄する。ＤＣＭ／メタノール（１０％）／アンモニア（１％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８０】
調製例１２
６−アミノ−２−メチル−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
【化１０】
【００８１】
１，４−ジオキサン（３１．８２ｍＬ）中の４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．４６ｇ）および５−ブロモ−６−メチル−ピリジン−２−イルアミン（１．４９ｇ）の混合物中で、５分間、窒素を泡立て、次いで、三塩基性リン酸カリウムＮ水和物（５．０７ｇ）、酢酸パラジウム（３５．７２ｍｇ）、ジシクロヘキシル−（２’，６’−ジメトキシ−ビフェニル−２−イル）−ホスファン（１３４．６９ｍｇ］）、水（７．９６ｍＬ）を加え、９０℃で３時間、攪拌する。ＤＣＭで希釈し、水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／エタノール５％／ＮＨ３ ０．１％で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、続いて、メタノールおよび次いでメタノール−ＮＨ３２Ｍで溶出する強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）により精製して、２．１２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８２】
調製例１３
６−アミノ−２−メチル−３’，４’，５’，６’−テトラヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
メタノール（２９．３０ｍＬ）中の６−アミノ−２−メチル−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．１２ｇ）および１０％湿潤のパラジウム炭素（３３０ｍｇ）の混合物を、Ｈ２（４５ｐｓｉ）下で、４８時間攪拌する。セライトパッドで濾過し、真空下で溶媒を取り除き、２．０７ｇの標題合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８３】
調製例１４
６−ニトロ−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
水（６３．３９ｍＬ）中の４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１９．６ｇ）、５−ブロモ−２−ニトロピリジン（１２．８７ｇ）、２Ｍの炭酸ナトリウムと、１，４−ジオキサン（３１６．９４ｍＬ）中のビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．４５ｇ）との混合物中で、５分間、窒素を泡立て、８０℃で５時間攪拌する。ＤＣＭで希釈し、水で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／ＥＡ（０〜４０％）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、８．７２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８４】
調製例１５
６−アミノ−３’，４’，５’，６’−テトラヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
６−ニトロ−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．８９ｇ）をエタノール（１２３．８０ｍＬ）に溶解する。パラジウム炭素で水素化して（Ｈ−Ｃｕｂｅ機器、７０ｂａｒ、５０℃、１ｍＬ／ｍｉｎ）、１．７２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２７８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８５】
調製例１６
４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルメチル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
窒素下で、５分間、４−メチレン−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．１０ｇ）を攪拌し、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（７７．４９ｍＬ）の０．５Ｍ ＴＨＦ溶液を加える。窒素下で一時間、７５℃で攪拌する。冷却し、２−アミノ−５−ブロモピリジン（３．８ｇ）、炭酸カリウム（３．８７ｇ）および１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（５３８．１０ｍｇ）ならびにＤＭＦ（４７．８３ｍＬ）および水（４．７８ｍＬ）の脱気した混合物を加える。６０℃で４時間、次いで、室温で一週間にわたって攪拌する。水およびＥＡを加える。ＥＡを用いて水層を分離し、抽出する。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／メタノール（１％）／アンモニア（０．１％）〜ＤＣＭ／メタノール（３％）／アンモニア（０．３％）で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。ＥＡで残留物を粉砕し、１．８５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８６】
対応するブロモ誘導体を用いて、４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルメチル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００８７】
【表４】
【００８８】
調製例１８
１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン
純粋な１−エチルピペラジン（２２１．４４ｍＬ）を、６−ブロモ−ピリジン−３−カルバルデヒド（３００ｇ）およびＤＣＭ（５０００ｍＬ）の混合物に加える。次いで、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（３７２．０９ｇ）を分けて加え、室温で１２時間、攪拌する。ＤＣＭ（１０００ｍＬ）および２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１５００ｍＬ）を加える。層を分離し、ＤＣＭ（６００ｍＬ）で水層を２回抽出する。有機層を合わせ、真空下で溶媒を取り除き、ＥＡを加えて蒸発させ、４５１．３ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８９】
対応するアミンを用いて、１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジンについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００９０】
【表５】
【００９１】
調製例２０
５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン
リチウム１，１，１，３，３，３−ヘキサメチル−ジシラザン（１０５５ｍＬ）をゆっくりと、１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン（２５０ｇ）、ジシクロヘキシルホスフィノ）ビフェニル（１８．５０ｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（２４．１７ｇ）およびＴＨＦ（２５０ｍＬ）の脱気した混合物に、５０℃で加える。この混合物を一晩６５℃で加熱する。３７℃まで冷却し、水（５００ｍＬ）を加える。真空下で溶媒の半分を取り除き、ＤＣＭ（２．５Ｌ）を加える。セライトパッドで濾過し、溶媒の部分を取り除く。メタノール（３００ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭｔＢＥ、６００ｍＬ）を混合物に加え、氷浴中で冷却する。次いで、エチルエーテル（８００ｍＬ）中の２Ｍの塩酸および塩酸（１００ｍＬ）の３２％水溶液中を加える。有機層を取り除き、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（２５００ｍＬ）を加える。ＤＣＭを用いて３回、水相を抽出し、真空下で溶媒を取り除く。完全に溶解するまで５０℃で９０ｍＬのトルエンに溶解し、次いで、８０ｍＬのＭｔＢＥを加える。室温で一晩攪拌する。完全に沈殿させるためにさらにＭｔＢＥ（１００ｍＬ）を加える。固形物を濾過して乾燥させ、１０８．２４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９２】
対応する２−ブロモ−ピリジン誘導体を用いて、５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミンについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００９３】
【表６】
【００９４】
調製例２２
２，４−ジブロモ−１−ニトロ−ベンゼン
発煙硝酸（１０１．４０ｍＬ）を、濃硫酸（３２２．７９ｍＬ）および水（６２．３９ｍＬ）中の１，３−ジブロモベンゼン（１０２．５１ｍＬ）の溶液に、０℃にて、滴下して加える。室温まで温め、１２時間攪拌する。その反応物を氷水（１５００ｍＬ）に注ぐ。得られた黄色の固形物を真空下で濾過し、乾燥させ、１７８．４６ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９５】
調製例２３
（５−ブロモ−２−ニトロ−フェニル）−シクロペンチル−アミン
シクロペンタンアミン（３２ｍＬ）を、１−ブタノール（１６０ｍＬ）中の２，４−ジブロモ−１−ニトロ−ベンゼン（２０ｇ）の水溶液に加える。この混合物を１００℃で一晩加熱する。真空下で溶媒を取り除き、水を加え、ＥＡで抽出する。続いて有機層を、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液および次いで水で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除き、２２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９６】
調製例２４
４−ブロモ−Ｎ２−シクロペンチル−ベンゼン−１，２−ジアミン
亜ジチオン酸ナトリウム（１０７．４７ｇ）を、５−ブロモ−２−ニトロ−フェニル）−シクロペンチル−アミン（２２ｇ）、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）、水（１５０ｍＬ）および水酸化アンモニウム（３０ｍＬ）の溶液に加える。その混合物を室温で一晩攪拌する。ＥＡで２回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除き、１４．８０ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２５６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９７】
調製例２５
６−ブロモ−１−シクロペンチル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
４−ブロモ−Ｎ２−シクロペンチル−ベンゼン−１，２−ジアミン（１０．６ｇ）、トリエチルオルトアセテート（９．５ｍｌ）および酢酸（６．３ｍＬ）の混合物を１００℃で２．５時間加熱する。ＤＣＭで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液に注ぐ。硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／エタノール−１０％ＮＨ３（０〜３％）で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１０．６７ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９８】
調製例２６
Ｎ−イソプロピル−アセトアミド
ＴＥＡ（２３．５８ｍＬ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の２−プロパンアミン（１０ｇ）の水溶液に０℃で加える。次いで、無水酢酸（１６．１５ｍＬ）を慎重に滴下して加える。室温で一晩攪拌する。真空下で溶媒を取り除き、エチルエーテル（エーテル）で希釈し、固形物を濾過する。真空下で溶媒を取り除く。エーテルで油を希釈し、炭酸カリウムを加え、室温で一晩攪拌する。固形物を濾過し、真空下で溶媒を取り除き、１５．６２ｇの標題化合物を得る。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）４．０６（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｄ，６Ｈ）。
【００９９】
対応するアミンを用いて、Ｎ−イソプロピル−アセトアミドについて実質的に記載されているように以下のアミドを調製する。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
調製例３０
Ｎ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミド
ＴＥＡ（１０．０５ｍＬ）を、トルエン（１５０ｍＬ）中の４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニルアミン（１０．０ｇ）、Ｎ−イソプロピルアセトアミド（９．７３ｇ）、塩化ホスホリル（６．７０ｍＬ）の混合物に加える。その混合物を、３時間、還流まで加熱する。その混合物を冷却し、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭに粗製物を溶解し、数回、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で洗浄し、微量の酸を全て取り除く。硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除き、１４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０２】
対応するアセトアミドを用いて、Ｎ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミドについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
調製例３４
６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８１１．４３ｍｇ）を、Ｎ−メチルホルムアミド（２０ｍＬ）中のＮ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミド（２ｇ）の水溶液に加える。混合物を１００℃で２時間加熱する。室温まで冷却し、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムの飽和水溶液（ブライン、３００ｍＬ）で３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ヘキサンを加え、数分間、超音波で振動する。固形物を濾過し、ヘキサンの添加／２回の濾過を繰返し、１．８６ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０５】
対応するアセトアミドを用いて、６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾールについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
調製例３８
４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（３０．０ｇ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（４２．１５ｇ）、トリシクロヘキシルホスフィン（５．４３ｇ）、酢酸カリウム（３２．５８ｇ）、およびＤＭＳＯ（２００ｍＬ）の混合物中で窒素を泡立てる。酢酸パラジウム（２．８ｇ）を加え、９０℃で１時間、予熱した油浴中で加熱する。ＥＡ（２００ｍＬ）で希釈し、セライトパッドで濾過する。その混合物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ヘキサンで粉砕し、固形物を濾過し、２７ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３１９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０８】
対応する６−ブロモ−ベンゾイミダゾール誘導体を用いて、４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾールについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
調製例４３
６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
水（１０３．７ｍＬ）および１，２−ジメトキシエタン（１２０ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−５−フルオロ−ピリミジン（１２．７ｇ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．９ｇ）、２Ｍの炭酸ナトリウムの混合物中で窒素を泡立てる。８０℃で予熱した油浴中で加熱し、１，２−ジメトキシエタン（２００ｍＬ）中の４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（２２ｇ）の溶液を滴下して加える。その混合物を、８４℃で１時間、攪拌する。室温まで冷却し、ＥＡ（８００ｍＬ）を加え、ブライン（１００ｍＬ）で２回洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。アセトニトリルで粉砕し、１４．４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３２３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１１】
対応するジクロロ−ピリミジンおよびボロン酸誘導体を用いて、６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾールについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
対応するアミンおよびクロロ−ピリミジン誘導体を用いて、以下で、［５−（４−エチル−ピペリジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１１４】
【表１２−１】
【表１２−２】
【０１１５】
調製例５８
［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペラジン−１−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミン
【化１１】
【０１１６】
ＤＣＭ（１０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）中の４−｛６−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−ピリジン−３−イルメチル｝−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１５０ｍｇ）の混合物に、ジオキサン（１９４μＬ）中の４Ｍの塩化水素を加える。１０分間攪拌し、真空下で溶媒を取り除く。メタノール、次いでメタノール−ＮＨ３ ２Ｍで溶出する強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）によって精製し、その後、ＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３ ２Ｍ（３％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１２０ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝４７９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１７】
［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペラジン−１−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１１８】
【表１３−１】
【表１３−２】
【０１１９】
実施例１
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン
【化１２】
【０１２０】
１，４−ジオキサン（１９７．０６ｍＬ）中の６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（１５．９ｇ）、５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン（１０．８５ｇ）、炭酸セシウム（３２．１０ｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（１．８２ｇ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（２．３５ｇ）の混合物中で窒素を泡立てる。その混合物を、１１０℃で、２時間、予熱した油浴中で加熱する。室温で冷却し、ＤＣＭで希釈し、セライトパッドで濾過する。真空下で溶媒を取り除き、ＤＣＭ／メタノール（２％）、次いでＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３２Ｍ２％で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、２２．１１ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２１】
対応するアミンおよびクロロ−ピリミジン誘導体を用いて、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１２２】
【表１４】
【０１２３】
実施例４
［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−［５−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン
【化１３】
【０１２４】
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２９９．９ｍｇ）を、［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペラジン−１−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミン（１３０ｍｇ）、アセトン（３１．６μＬ）、１，２−ジクロロエタン（９ｍＬ）および酢酸（１６．３μＬ）の混合物に加える。６０℃で一時間加熱する。真空下で溶媒を取り除く。メタノール、次いでメタノール−ＮＨ３２Ｍで溶出する、強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）によって精製し、続いて、ＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３２Ｍ（３％）で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１１５ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２５】
対応するアミンを用いて、［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−［５−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
実施例９
［４−（３−シクロプロピル−７−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イル］−［５−（１−エチル−ピペリジン−４−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン
【化１４】
【０１２８】
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（７２０ｍｇ）を、［４−（３−シクロプロピル−７−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペリジン−４−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミン（１１０ｍｇ）、１，２ジクロロエタン（１．１４ｍＬ）および酢酸（２７０９μＬ）の混合物に加える。６０℃で１時間加熱する。真空下で溶媒を取り除く。メタノール、次いでメタノール−ＮＨ３２Ｍで溶出する、強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）によって精製し、続いて、ＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３２Ｍ（３％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、８０ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２９】
対応するアミンを用いて、［４−（３−シクロプロピル−７−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イル］−［５−（１−エチル−ピペリジン−４−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１３０】
【表１６−１】
【表１６−２】
【０１３１】
実施例１６
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンメタンスルホネート
メタンスルホン酸（６３．５９ｍＬ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびメタノール（１００ｍＬ）の混合物中の［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン（１７．３ｇ）の溶液に加える。１時間、その溶液を攪拌し、真空下で溶媒を取り除く。ＭｔＢＥで粉砕し、その固形物を濾過し、２０．４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１３２】
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンメタンスルホネートについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１３３】
【表１７−１】
【表１７−２】
【０１３４】
実施例３１
［５−（４−エチル−ピペリジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンＩ型結晶
１０２．１ｍｇのアモルファス［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンを２ｍＬのアセトンと混合する。沈殿した固形物を真空濾過により分離し、淡黄色のケーキを生成し、３０分間、濾過装置上の適切な位置で乾燥させ、７２．１ｍｇの固形物を得る。その固形物を１００℃の真空オーブンに３時間置く。
【０１３５】
Ｉ型の代表的なＸＲＤピークを表１に示す。
【０１３６】
実施例３２
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶
２０８ｍｇのアモルファス［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンを４ｍＬのアセトンと混合する。その懸濁液を、１０００ｒｐｍで攪拌しながら、６０℃で２時間、スラリーにし、次いで、真空濾過により固形物を分離し、淡黄色のケーキを生成する。３０分間、濾過装置上の適切な位置で乾燥させ、１１２ｍｇの固形物を得る（５４％収率）。８０℃の真空オーブンに３時間置く。ＩＩＩ型の代表的なＸＲＤピークを表２に示す。このピーク位置は外部標準を用いて確かめた。
【０１３７】
Ｘ線粉末回折
結晶のＸＲＤパターンを、５０ｋＶおよび４０ｍＡで作動する、ＣｕＫα源（λ＝１．５４０５６Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ Ａｄｖａｎｃｅ Ｘ線粉末回折計で得る。各試料を、２θにおいて０．０２°のステップサイズおよび１ステップあたり９．０秒の走査速度で、ならびに１ｍｍの発散および受光スリットならびに０．１ｍｍの検出器スリットで、２θにおいて４〜４０°の間で走査する。乾燥粉末を、くぼんでいるトップローディング試料ホルダーに詰め、平滑面をスライドガラスを用いて得る。結晶型回折パターンを周囲温度および相対湿度で収集する。III型結晶についてのバックグランドをピーク選択の前に除去するが、Ｉ型については、バックグランドは除去しない。
【０１３８】
任意の所定の結晶型に関して、回折ピークの相対強度が、結晶型および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して変化し得ることは結晶学の分野において周知である。好ましい配向の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特性ピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＃１８，１８４３−１８４４ページ，１９９５を参照のこと。さらに、任意の所定の結晶型に関して、角度ピーク位置はわずかに変化し得ることもまた、結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度または湿度、試料の置換、または内部標準の存在もしくは非存在の変化に起因して変化し得る。この場合において、２θにおいて±０．１のピーク位置の変化は、示された結晶型の明確な同定を妨げずに、それらの電位変化を考慮に入れる。
【０１３９】
結晶型の確認は、（°２θの単位において）特徴的なピーク、典型的により突出したピークのいくらかの固有の組み合わせに基づいてなされ得る。従って、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンＩ型結晶の調製された試料は、以下の表１に記載される回折ピーク（２θ値）を有し、特に１３．０９、１６．３１および１８．８２からなる群より選択されるピークのうちの１つ以上と合わせて４．５１においてピークを有するので、ＣｕＫα放射線を用いてＸＲＤパターンによって特徴付けられ；０．１°の回折角を許容する。
【０１４０】
表１：［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンＩ型結晶のＸ線粉末回折ピーク
【０１４１】
【表１８】
【０１４２】
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶の調製された試料は、以下の表２に記載される回折ピーク（２θ値）を有し、特に１１．５４、１０．９１および１２．１３におけるピークのうちの１つ以上と合わせて２１．２９においてピークを有するので、ＣｕＫα放射線を用いてＸＲＤパターンによって特徴付けられ；０．１°の回折角を許容する。
【０１４３】
表２：［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶のＸ線粉末回折ピーク
【０１４４】
【表１９】
【０１４５】
固体状態１３Ｃ ＮＭＲ
交差偏波／マジック角スピニング（ＣＰ／ＭＡＳ）ＮＭＲ（固体状態ＮＭＲまたはＳＳＮＭＲ）スペクトルは、それぞれ４００．１３１ＭＨｚの１Ｈ周波数および１００．６２３ＭＨｚの１３Ｃ周波数において作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００の広口径ＮＭＲスペクトロメータで、Ｂｒｕｋｅｒ ４ｍｍ二重共振プローブを用いて得られる。ＭＡＳレートは、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＳ−ＩＩコントローラを用いて５または１０ｋＨｚに設定し、スピニング速度は設定ポイントの２Ｈｚ内に維持する。１００ｋＨｚのプロトンニューテーション周波数におけるＳＰＩＮＡＬ６４デカップリングを、異核デカップリングのために使用する。スピニングサイドバンドを、５パルスの全サイドバンド抑制法（ｔｏｔａｌ ｓｉｄｅｂａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＴＯＳＳ）シーケンスにより除去する。プロトンから炭素まで磁化を移動させるためのＣＰ接触時間を４ｍｓに設定し、９３．５から４６．９ｋＨｚまでの線形出力ランプを、ＣＰ効率を高めるために１Ｈチャネルで使用する。獲得時間を３４ｍｓに設定し、スペクトルを、５ｓのリサイクル遅延で３０ｋＨｚの分光幅にわたって獲得する。試料温度を、試料のスピニングによって生じる摩擦熱を最小化するために２９７±１Ｋに調節する。１３Ｃ化学シフトは、アダマンチン（δ＝２９．５ｐｐｍ）の高磁場共鳴によってニート（液体）のテトラメチルシランのプロトンデカップリングされた１３Ｃピークに対する外部参照（±０．０５ｐｐｍ）である。［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶についての化学シフトのピークリストは以下の通りである：
１３Ｃ−ＮＭＲ：ν（Ｆ１）（ｐｐｍ）１１．７，１２．９，２０．５，４８．６，５２．５，５９．４，１０８．９，１１０．０，１１２．７，１２７．３，１２９．４，１３５．５，１３６．４，１４８．８，１５０．１，１５２．２，１５４．５，１５６．３。
【０１４６】
実施例３３
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶−経路Ｂ
【化１５】
ａ．１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン
６−ブロモ−ピリジン−３−カルバルデヒド（８．３ｋｇ）およびＤＣＭ（１８６ｋｇ）の混合物に純粋な１−エチルピペラジン（５．６ｋｇ）を加える。次いで、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１０．９ｋｇ）を少しずつ加え、２０〜３０℃で１２時間攪拌する。ＤＣＭ（３６ｋｇ）および２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（４６ｋｇ）の混合物中で反応をクエンチする。層を分離し、水層をＤＣＭ（２４×２ｋｇ）で２回抽出する。有機層を合わせ、ブライン（５０×２ｋｇ）で洗浄し、真空下で溶媒を除去して、１１．５ｋｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４７】
ｂ．５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン
Ｔ≦４０℃にて、１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン（１４．２ｋｇ）、酸化第一銅（２００ｇ）、およびＭｅＯＨ（５７ｋｇ）の脱気した混合物に液体アンモニア（５０．０ｋｇ）を加える。その混合物を６５〜７５℃にて一晩加熱する。２０〜３０℃まで冷却し、セライト（登録商標）パッドで濾別する。濾液を濃縮し、ＤＣＭ（１１３ｋｇ）を加え、ｐＨを２Ｎの水酸化ナトリウム（２３ｋｇ）で１２〜１４に調整し、相を分離し、有機相をＤＣＭ（５８×２ｋｇ）で洗浄し、有機層を合わせる。セライト（登録商標）で混合物を濾過し、濃縮する。残留物をトルエン（９．７ｋｇ）に溶解し、ＭｔＢＥ（８．３ｋｇ）の添加により結晶化させて、６．０ｋｇの標題化合物を得る。トルエン再結晶によりさらに精製を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４８】
ｃ．Ｎ−イソプロピル−アセトアミド
２０℃未満にて、炭酸カリウム（２８ｋｇ）を、酢酸エチル（１０８ｋｇ）中の２−プロパンアミン（１２ｋｇ）の溶液に加える。混合物を５〜０℃に冷却し、約２〜３ｋｇ／ｈにて塩化アセチル（１６．７ｋｇ）を加える。ガスクロマトグラフィーにより完了するまで攪拌する。反応を水（０．８ｋｇ）でクエンチし、反応混合物を濾過し、濃縮して、１３．４ｋｇの標題化合物を得る。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）４．０６（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｄ，６Ｈ）。
【０１４９】
ｄ．Ｎ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミジン
２０℃未満にて、塩化ホスホリル（１６．０ｋｇ）を、トルエン（１１５ｋｇ）中の４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニルアミン（１４．５ｋｇ）、Ｎ−イソプロピルアセトアミド（８．５ｋｇ）、ＴＥＡ（１０．６ｋｇ）の混合物に加える。ＨＰＬＣにより完了するまで１０〜２０℃にて攪拌する。真空下で溶媒を除去し、ＭｔＢＥ（６４ｋｇ）を加える。１０％炭酸ナトリウム水溶液（２５０ｋｇ）で混合物のｐＨを調整する。混合物を濾過し、ＭｔＢＥ（１１×２ｋｇ）でケーキをリンスする。相を分離し、ＭｔＢＥ（２２×２ｋｇ）で水層を洗浄する。有機層を合わせ、濃縮し、濾過し、シクロヘキサン（０．６ｋｇ）で洗浄し、乾燥させて、１７．２ｋｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５０】
ｅ．６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
Ｔ＜３０℃に温度を維持しながら、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６．９ｋｇ）を、Ｎ−メチルホルムアミド（７６ｋｇ）中のＮ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミド（１６．２ｋｇ）の溶液に少しずつ加える。ＨＰＬＣにより完了するまで７０〜７５℃にて混合物を加熱する。２０〜３０℃に冷却し、水（２２７ｋｇ）に加えることによってクエンチし、次いでＭｔＢＥ（３７×４ｋｇ）で抽出する。合わせた有機相をブライン（４９×２ｋｇ）で洗浄し、２５〜３０Ｌに濃縮し、ｎ−ヘキサン（６４ｋｇ）を加え、スラリーを濾過して、１１ｋｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５１】
ＤＣＭに粗化合物を溶解することによりさらに精製を得て、シリカゲルおよびセライト（登録商標）パッドで濾過し、その後、ＭｔＢｅ／ヘキサン混合物から分離する。
【０１５２】
ｆ．４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（６００ｇ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（８４３ｇ）、トリシクロヘキシルホスフィン（１０６ｇ）、酢酸カリウム（６５２ｇ）、およびＤＭＳＯ（３．６Ｌ）の混合物中で窒素を泡立てる。酢酸パラジウム（４９ｇ）を加え、ＨＰＬＣにより完了するまで１００℃で加熱する。反応混合物を冷却し、水（１８Ｌ）で希釈し、次いで濾過し、固体を分離する。１，２−ジメトキシエタン（４５０ｍＬ）に粗物質を溶解し、セライト（登録商標）で濾過する。その濾液をパートｇで直接使用する。
【０１５３】
ｇ．６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
水（１．７Ｌ）中の２，４−ジクロロ−５−フルオロ−ピリミジン（５１７ｇ）、炭酸ナトリウム（５８６ｇ）と、１，２−ジメトキシエタン（３．４Ｌ）との混合物中で窒素を泡立てる。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．９ｇ）を加え、８０±３℃で反応物を加熱し、パートｆからの１，２−ジメトキシエタン中の４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾールの溶液（５．１Ｌ）を滴下して加える。ＨＰＬＣにより完了するまで８０±３℃で混合物を攪拌する。室温まで冷却し、冷水（２．１Ｌ、５℃）で希釈する。１時間攪拌し、次いで濾過により粗固体を分離する。ＩＰＡで粉砕することにより固体のさらなる精製を達成して、４７２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３２３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５４】
ｈ．［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶
【化１６】
ｔ−アミルアルコール（２．３Ｌ）中の６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（４６５ｇ）、５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン（３２１ｇ）、炭酸カリウム（４０３ｇ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１７ｇ）の混合物中で窒素を泡立てる。ＨＰＬＣにより完了するまで、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（１３．２ｇ）および混合物を１００±５℃で加熱する。室温まで冷却し、ＤＣＭ（１．２Ｌ）で希釈し、セライト（登録商標）パッドで濾過する。濾液を４ＭのＨＣｌ（２．３Ｌ×２）で抽出する。水層を合わせ、炭（３２ｇ）で攪拌する。セライト（登録商標）で濾過し、ＤＣＭ（１．７Ｌ）を加え、ＮａＯＨ（２８％水溶液、１．５Ｌ）でｐＨを調整する。有機層を回収し、ＤＣＭ（１．７Ｌ）で水層を洗浄する。有機層を合わせ、ブライン（１Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。固体により支持されたＳｉ−チオール処理を使用して、残存パラジウムを除去し、溶媒をアセトンに交換する。スラリーを濾過し、乾燥させて、６０５ｇの粗生成物をＩ型として得る。６０５ｇのＩ型と４．３Ｌの乾燥アセトンとを混合する。少なくとも１８時間、５６〜５７℃（還流）で、次いで４時間、周囲温度で懸濁物をスラリーにする。真空濾過により固体を分離し、淡黄色のケーキを生成する。５７０ｇの一定重量が得られるまで、３５℃で真空オーブン中にて固体を乾燥させる。物質を、ＸＲＰＤにより、標題化合物のＩＩＩ型であることを確認する。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５５】
以下のアッセイの結果により、本願明細書に例示される化合物が、特異的ＣＤＫ４／６阻害剤として、および抗癌剤として有用であるという証拠が実証される。本願明細書中で使用される場合、「ＩＣ５０」とは、薬剤で起こり得る５０％の最大阻害反応を生じるその薬剤の濃度を意味し、「ＥＣ５０」とは、薬剤で起こり得る５０％の最大反応を生じるその薬剤の濃度を意味する。
【０１５６】
ＣＤＫ４阻害アッセイ
本発明に含まれる化合物がＣＤＫ４キナーゼに対する親和性を示すことを実証するために、ＣＤＫ４アッセイを実施する。機能的アッセイにより、本発明の化合物がＣＤＫ４キナーゼ活性を阻害する能力を示すという支持が提供される。以下のアッセイに使用される全てのリガンド、放射性標識、溶媒、および試薬は、商業的供給源から容易に利用可能であるか、または当業者により容易に合成され得る。
【０１５７】
２０％ＤＭＳＯ中の１０μＬの試験化合物、２０μＬのアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）およびＣ末端網膜芽細胞腫フラグメント（ＣＴＲＦ）（Ｕｐｓｔａｔｅ カタログ番号１２−４３９）溶液、および１０μＬの酵素溶液を９６ウェルプレート中で混合する。ＡＴＰおよびＣＲＴＦ溶液を、６８ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ） ｐＨ７．４、６．７２ｍＭのＭｇＣｌ２、６．７２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および０．０１３％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００のキナーゼバッファーに希釈した４０μＭのＡＴＰ、０．１６μＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰおよび１μＭのＣＴＲＦの混合物から調製する。酵素溶液を、上記のキナーゼバッファーに希釈した８ｎｇのＣＤＫ４酵素（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ カタログ番号０１４２−０３７３−１）から調製する。試験化合物を、２０％のＤＭＳＯ中で１：３に連続希釈して、２０μＭの開始濃度で１０点曲線を作成する。試験化合物を加えずに２０％のＤＭＳＯバッファーのみをコントロールとして使用し、５００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して、酵素活性の非存在下でバックグランド３３Ｐのレベルを決定する。試薬を混合し、２０℃にて９０分間インキュベートする。反応を、８０μＬの１０％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を加えることによって停止し、ガラス繊維フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＦＣ Ｎ０Ｂ ５０）上に物質が沈殿する。ウェルを、０．５％のＨ３ＰＯ４で４回洗浄し、組み込んだ放射線を、マイクロプレートシンチレーションカウンタ（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ，Ｗａｌｌａｃ）で決定する。
【０１５８】
高コントロールと低コントロールの中央値の間の差を１００％活性として得る。４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用して、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ，Ａｌａｍｅｄａ ＣＡ）を用いてＩＣ５０値を生成する。例示した化合物の全てのメシル酸塩は、上記のアッセイにおいて１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例２５の化合物は上記のアッセイにおいて３ｎＭのＩＣ５０を有する。これにより、例示した化合物のメシレート塩がＣＤＫ４の有効な阻害剤であることが実証される。
【０１５９】
ＣＤＫ６阻害アッセイ
２０％のＤＭＳＯ、２０μＬのＡＴＰおよびＣＴＲＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ カタログ番号１２−４３９）溶液、および１０μＬの酵素溶液中の１０μＬの試験化合物を９６ウェルプレート中で混合する。ＡＴＰおよびＣＲＴＦ溶液を調製して、６８ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、６．７２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．６４ｍＭのＤＴＴ、および０．００４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００のキナーゼバッファーに希釈した１００μＭのＡＴＰ、０．５μのＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰおよび０．８μＭのＣＴＲＦの最終濃度を得る。酵素溶液を、ＣＤＫ４阻害アッセイにおいて上記のキナーゼバッファーに希釈した１．７ｎｇ／μＬのＣＤＫ６酵素（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ カタログ番号７５３３）の最終濃度に調製する。試験化合物を２０％のＤＭＳＯ中で１：３に連続希釈して、２０μＭの開始濃度にて１０点曲線を作成する。試験化合物を加えずに２０％のＤＭＳＯバッファーのみをコントロールとして使用し、５００ｍＭのＥＤＴＡを使用して、酵素活性の非存在下でバックグランド３３Ｐのレベルを決定する。試薬を混合し、２０℃にて９０分間インキュベートする。８０μＬの１０％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４の添加により反応を停止し、ガラス繊維フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＦＣ Ｎ０Ｂ ５０）上に物質が沈殿する。ウェルを０．５％のＨ３ＰＯ４で４回洗浄し、組み込んだ放射線をマイクロプレートシンチレーションカウンタ（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ，Ｗａｌｌａｃ）で決定する。
【０１６０】
ＣＤＫ４と同様の方法でデータを分析する。好ましい例示した化合物は、上記のアッセイにおいて３０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例１９の化合物は、上記のアッセイにおいて５ｎＭのＩＣ５０を有する。これにより、好ましい例示した化合物がＣＤＫ６の有効な阻害剤であることが実証される。
【０１６１】
ＰＩＭ１キナーゼの阻害についてのアッセイ
Ｐｉｍ−１（ヒト、０．４６ｎＭの最終濃度）を、８ｍＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭの適切な基質ペプチド（Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｓ．ら（２００９）Ｂｌｏｏｄ，ＤＯＩ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０３−２１２８５２に記載されているＰｉｍ−１キナーゼ阻害アッセイプロトコルを参照のこと）、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要な場合濃縮）とインキュベートする。反応をＭｇＡＴＰミックスの添加により開始し、次いで室温で４０分間インキュベートする。反応を、３％のリン酸溶液の添加により停止する。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上で停止し、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、メタノールで１回、洗浄し、その後、乾燥させ、シンチレーション計数する。化合物阻害試験のために、１００％のＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストックとして与えられる化合物を、１００％のＤＭＳＯ中で１：１０に希釈して、曲線の最上部の濃度の５０倍ストックを得る。次いで、５０倍ストックを１００％のＤＭＳＯ中で１：３に連続希釈して、１０点濃度−反応曲線を作成し、反応混合物中で１：５０（２％の最終ＤＭＳＯ濃度中に２０μＭ〜０．００１μＭ最終）に希釈して、化合物活性を測定する。ベースラインを、０分時に酸で停止させたコントロールウェル中で規定している間、コントロールウェルはＤＭＳＯのみを含有する。次いで各プレート上のコントロールから測定した阻害パーセントおよび１０点化合物濃度データを、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を用いて４パラメーターロジスティック式にフィットした。
【０１６２】
好ましい例示した化合物は０．０１μＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例２５の化合物は、上記のアッセイにおいて０．００３μＭのＩＣ５０を有する。これにより、好ましい例示した化合物がＰｉｍ−１キナーゼの有効な阻害剤であることが実証される。
【０１６３】
溶解アッセイ
適切な量の試験化合物を、別個のクロマトグラフバイアル中で秤量した。必要な体積の０．０５Ｍのリン酸バッファー、ｐＨ８．０（５００ｍＬのＨＰＬＣ等級水に６．７ｇのリン酸水素二ナトリウム×７Ｈ２Ｏを溶解し、リン酸８５％でｐＨを８．０に調整する）を試料バイアルに加え、２．０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成する。ＤＭＳＯ中の適切な標準溶液を、必要な体積のＤＭＳＯを標準バイアルに加えることにより調製して、２．０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成する。バイアルをしっかりとキャップし、回転装置に入れる。バイアルを、約５０ｒｐｍの角速度を用いて、周囲温度で少なくとも１６時間３６０°で回転させる。個々のバイアルの外観検査を回転後に行う。各バイアルから２５０μＬを０．７μｍのガラスフィルターで濾過する。試料を濾過し、標準濾液を９６ディープウェルプレートの別のウェルに回収する。連続希釈を、２．０ｍｇ／ｍｌ標準溶液のＤＭＳＯ中での適切な連続希釈により調製（２０００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬおよびブランクのＤＭＳＯ試料）する。
【０１６４】
試料および標準溶液を、ＨＰＬＣ（ＬＣカラム：ＸＴｅｒｒａ ＭＳ、Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ、５０℃にて；移動相：Ａ−水中に０．２％ギ酸；Ｂ−アセトニトリル中に０．２％ギ酸；勾配：３分で５〜１００％Ｂ、０．５分間１００％Ｂで保持；流速：７５０μＬ／分；注入量：１μＬ；２００ｎｍ〜４００ｎｍのダイオードアレイ検出器走査）により分析する。定量化のために抽出し、使用する波長を、試料調製物の最も正確な推定を得るために選択する。試験化合物についてのピーク同定に使用するリテンションタイムを、２００μｇ／ｍＬの標準分取クロマトグラムから得る。
【０１６５】
溶解度値を、４レベル較正曲線を用いて算出する。ゼロフィットによる一次または二次式を用いてクロマトグラフ管理データシステムによって算出される較正基準のピーク面積について最適フィットのラインを使用する。溶解度の結果をｍｇ／ｍＬで報告する。好ましい例示した化合物は、上記のアッセイを用いてｐＨ８のリン酸バッファー中で少なくとも２ｍｇ／ｍｌの溶解度を示す。実施例１６の化合物は、上記のアッセイを用いてｐＨ８のリン酸バッファー中で２．０９９ｍｇ／ｍｌの溶解度を示す。従って、このデータは、本発明の好ましい例示した化合物が水溶液に容易に溶解することを実証する。
【０１６６】
ラット経口バイオアベイラビリティアッセイ
留置大腿動脈カニューレを有する雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３２０ｇの体重の範囲）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ ０１８８７，ＵＳＡから得る。試験化合物を、２２．５ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ３中の１０％のＮ−メチルピロリドン／１８％のＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）の溶液（２ｍＬ／ｋｇ）で静脈内投与する。最終薬物濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬ（遊離塩基当量）である。血液試料を２４時間にわたって留置カニューレを用いて得る。次いで、精製水中の１％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ｖ／ｖポリソルベート８０／０．０５％ｖ／ｖ消泡剤中の懸濁液（５ｍＬ／ｋｇ）中の経口量の試験化合物を動物に投与する。最終薬物濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ（遊離塩基当量）である。さらなる血液試料を２４時間にわたって留置カニューレを介して回収する。血漿試料を遠心分離によって得て、分析前に凍結保存（−２０℃）した。
【０１６７】
アセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中の内部標準化合物（正規化のため）を血漿試料に加え、タンパク質を沈殿させ、試料を分析前に遠心分離する。上清を、注入およびＪａｖｅｌｉｎ Ｂｅｔａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２０×２．１ｍｍカートリッジ、移動相Ａ：水／１Ｍの炭酸アンモニウム、２０００：１０ｖ／ｖ、移動相Ｂ：ＭｅＯＨ／１Ｍの炭酸アンモニウム、２０００：１０ｖ／ｖ）で急速勾配溶離により分析する。溶離した検体を、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００トリプル四重極質量分析計を用いてＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析により検出する。血漿中の化合物の濃度を同一の条件下で調製した標準物から測定する。
【０１６８】
経口バイオアベイラビリティを、経口投与後の血漿濃度時間曲線下の面積を、静脈内投与後（投与した用量についての正規化後）の曲線下の面積で割ることによって得る。結果を、静脈内用量に対する生物学的に利用可能な画分（％Ｆ）として表す。好ましい例示した化合物は、上述のアッセイにおいて２０％より高い％Ｆ値を示す。実施例２２の化合物は、上述のアッセイにおいて４８．５％の％Ｆ値を示す。これは、好ましい例示した化合物が良好な経口バイオアベイラビリティを有することを実証する。
【０１６９】
網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）のリン酸化の阻害およびＤＮＡ含有量アッセイ
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からのＣＯＬＯ ２０５細胞を、９６ウェルＢｅｃｋｍａｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）プレート中で２０００細胞／ウェルにて平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、例えばＧｉｂｃｏカタログ番号１１０００−１４４）および１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１３６０−０７０）を含むＲＰＭＩ １６４０倍地（例えば、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号５２４００−０２５）中でインキュベートする。培地に試験化合物を加え、２０μＭ〜０．００１μＭの範囲にわたって、かつ０．２５％の最終ＤＭＳＯ濃度を含む１０点の１：３希釈物を投与することによって細胞を処理する。化合物に対する２４時間の曝露の後、細胞を、室温にて３０分間、ＰＲＥＦＥＲ（商標）固定剤［Ａｎａｔｅｃｈ ＬＴＤ．，カタログ番号４１４］で固定し、次いで、室温にて１５分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中の０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００に透過する。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、３７℃のインキュベーター中で６０分間、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ（リボヌクレアーゼＡ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ−６５１３）で消化する。固定した細胞を、３０分間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号ＲＰＮ４１２Ｖ）でブロックする。一次抗体、抗ホスホＲＢ精製マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎカタログ番号５５８３８５）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に１：２０００にて細胞に加え、４℃で一晩インキュベートする。３回ＰＢＳでの洗浄後、細胞を、室温にて１時間、Ａｌｅｘａ４８８標識化二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１０１７）とインキュベートする。再度、それらをＰＢＳで３回洗浄し、次いで１５μＭのヨウ化プロピジウム（元の溶液からＰＢＳで１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３５６６）を加えて核を染色する。蛍光プレートを、ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰ ＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤによって製造された、レーザースキャニング蛍光マイクロプレートサイトメトリー（４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー励起および複数の光電子増倍管検出から構成される）］で走査して、Ｒｂタンパク質のリン酸化およびＤＮＡ含有量を測定する。画像解析は、異なる亜集団において細胞を同定するための細胞蛍光シグナルに基づく。アッセイの出力は、各々の同定した亜集団の割合、ホスホＲＢ陽性の％、２Ｎの％および４Ｎの％である。ＩＣ５０およびＥＣ５０値を、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（商標）を用いて各出力について４パラメーターロジスティックへの曲線フィッティングにより決定する。例示した化合物の全てのメシル酸塩は、上記のアッセイにおいて２００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例２５の化合物は、上記のアッセイにおいて約１００ｎＭの活性を有する。これは、例示した化合物のメシル酸塩が、インビトロでの全細胞ベースのアッセイにおいて、（低レベルのｐＲｂのリン酸化によって測定した場合）ＣＤＫ４／６キナーゼ活性の有効な阻害剤であることを実証する。
【０１７０】
さらに、例示した化合物の全てのメシル酸塩は、少なくとも２μＭの濃度で存在する場合でさえ、細胞周期のＧ１基の特異的停止を誘発できる。特異的Ｇ１停止は、２Ｎ遺伝子型を有する９０％より多い細胞によって示される。活性化合物の生理学的に関連する濃度においてさえ、特異的Ｇ１停止により、本発明の化合物がＣＤＫ４／６の特異的阻害剤であり、他のＣｄｋの非特異的阻害が最小化され、他の期の細胞周期停止を生じることが実証される。
【０１７１】
ヒト皮下異種移植片モデル
ヒト結腸直腸癌細胞（ｃｏｌｏ−２０５）、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（ＭＶ４−１１）、ヒト膠芽腫細胞（Ｕ８７ＭＧ）、およびヒト肺癌細胞（ＮＣＩ Ｈ４６０およびｃａｌｕ６）を、培地中で増殖させ（ｃｏｌｏ−２０５およびＮＣＩ Ｈ４６０は、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０倍地中で増殖させ；ＭＶ４−１１は、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＢＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地中で増殖させ；Ｕ８７ＭＧおよびｃａｌｕ６は、Ｅａｒｌｅ塩、Ｌ−グルタミンおよび非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％のＦＢＳを含むイーグルＭＥＭ中で増殖させ、ｃｏｌｏ−２０５、Ｕ８７−ＭＧ、ｃａｌｕ６およびＮＣＩ−Ｈ４６０はトリプシン処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ２５２００−０５６）、ＭＶ４−１１は遠心分離により回収した）、無胸腺ヌードマウスのひ腹に皮下注射（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ中で１：１に混合した５００万細胞／動物）した。試験化合物を、適切なビヒクル（２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ２中の１％ヒドロキシエチルセルロース）中で調製し、腫瘍が確立される場合（移植から１１〜２９日後）、２１日間、（２５、５０または１００ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）にて）毎日強制経口により投与する。腫瘍反応を、治療課程の間、１週間に２回実施する腫瘍体積測定により決定する。
【０１７２】
腫瘍増殖遅延を評価するための統計的方法（ＴＧＤ−個々の内挿法）は以下の通りである：各々の動物について、特定の腫瘍体積に到達する時間（閾値）を、閾値に到達する前の最後の測定と次の測定との間に補間することにより計算する。補間は、ｌｏｇ１０（体積）対時間を用いる線形である。動物が閾値に決して到達しない場合、その横断時間は、「＞Ｔ」（ここでＴはその動物について測定される最後の日である）と報告される。それらの横断時間は、ワイブル分布を用いる右側打ち切り（ｒｉｇｈｔ−ｃｅｎｓｏｒｉｎｇ）で「時間−事象」データとして解析される。平均および標準偏差を、各処置群について決定する。腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）は、処置群とビヒクル対照群との間の平均横断時間の差である。Ｔ検定を、ワイブル解析から平均および標準偏差を用いて実施する。体重を毒性の一般的測定として得る。
【０１７３】
上記のプロトコルに実質的に従って、実施例１６の化合物は、表３に示されるそれらのモデルにおいて抗腫瘍活性を実証し、従って、実施例１６の化合物が、広範囲のＲｂ＋腫瘍に対して有効なインビボ活性を有することを実証する。
【０１７４】
さらに、ＡＭＬ ＭＶ４−１１異種移植片において、腫瘍退縮が、実施例１６の化合物のプロアポトーシスＰｉｍ−１阻害活性の指標である、１００ｍｇ／Ｋｇ（ｍｐｋ）の用量にて観測される。表４を参照のこと。
【０１７５】
表３．異なるヒト異種移植片モデルにおける腫瘍増殖遅延
【０１７６】
【表２０】
【０１７７】
表４．ＭＶ４−１１モデルにおける実施例１６の化合物の抗腫瘍活性
【０１７８】
【表２１】
【０１７９】
同所性脳異種移植片モデル
インビボでの脳腫瘍モデル：体重２２５〜３００ｇのオスのＮＩＨ−ＲＮＵラットを、イソフルランで麻酔し、定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）に置いた。正中切開を行い、１ｍｍの穿頭孔を、正中線から２ｍｍ側方で、冠状縫合の３ｍｍ前方に開けた。１０μＬ（ｑｄ投与について５×１０５細胞およびｑ２ｄ投与について１×１０６細胞）中の５×１０５個のＵ８７ ＭＧヒト膠芽腫瘍細胞（Ｅａｒｌｅ塩、Ｌ−グルタミンおよび非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％のＦＢＳを含むイーグルＭＥＭで増殖させた）の細胞懸濁液を、さらに１分間、逆流を防止するために所定の位置に置かれているシリンジを用いて、定位に取り付けたシリンジポンプ（Ｎａｎｏ−Ｉｎｊｅｃｔｏｒ、モデル＃５３３１０およびＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ａｄａｐｔｅｒ Ｃｌａｍｐ、パート＃５１６８１、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ）を用いて約２分間にわたって２５または５０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって３ｍｍの深さで注射し、シリンジをゆっくりと引き抜く。穴を骨ろうで密封し、手術領域を食塩水で洗浄し、切開を縫合または創傷クリップで閉じた。
【０１８０】
試験化合物を、ビヒクル（精製水中の１％ｗ／ｖのヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ｖ／ｖのポリソルベート８０／０．０５％ｖ／ｖの消泡剤）で製剤化し、２０、４０および８０ｍｐｋ（ｑｄｘ２１）にて２１日間毎日投与し、腫瘍移植後４日で８０ｍｐｋ ｑ２ｄｘ１０を開始する。
【０１８１】
一次結果の変数は生存である。死ぬまで動物を毎日モニターし、動物が瀕死状態の場合、獣医スタッフと相談して、腫瘍移植に対する方針に沿って、安楽死させる。運動障害および生体機能の制御などの潜在的な脳機能障害を最小化させるために、細胞を前頭葉に移植する。ヒトにおける前頭葉は、「無症候性（ｓｉｌｅｎｔ）」と言われており、頭痛、吐き気、嘔吐、および認知障害を含む症状を最も一般的に表す。従って、病的状態は、昏睡状態および体重損失として明らかになる可能性が高い。生存データは、ＪＭＰ ｖ６．０．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いる平均生存分析についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により分析される。
【０１８２】
上記のプロトコルに実質的に従って、実施例１６の化合物は、以下の用量；４０ｍｐｋ ｑｄ、８０ｍｐｋ ｑｄおよび８０ｍｐｋ ｑ２ｄにて平均生存（ビヒクル処置した動物と比較した場合）において統計的に有意な増加を生じたので（表５を参照のこと）、実施例１６の化合物が、血液脳関門を横断し、同所性膠芽腫瘍異種移植片モデルにおいて有効なインビボ阻害活性を有し得ることが実証される。
【０１８３】
表５：実施例１６の化合物の投与から生じる平均生存および生存期間中央値（日数）
【０１８４】
【表２２】
【０１８５】
別の実験において、化合物の血漿および脳への曝露レベルを決定するために、腫瘍を保持していないオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、単回用量の実施例１６の化合物を３０ｍｇ／ｋｇにて経口投与する。血漿および脳の濃度を決定するために４８時間にわたって試料を得る。動物を屠殺し、心穿刺により全血を回収し、遠心分離により血漿を単離する。全脳を回収し、液体窒素中で即座に凍結する。
【０１８６】
脳の試料を、８０％メタノール／２０％Ｈ２Ｏ中で均質化することにより調製する。アセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中の内部標準化合物を、血漿または脳ホモジネートの試料に加えてタンパク質を沈殿させ、試料を分析前に遠心分離する。上清を、注入およびＪａｖｅｌｉｎ Ｂｅｔａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２０×２．１ｍｍカートリッジ、移動相Ａ：水／１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、２０００：１０ｖ／ｖ、移動相Ｂ：ＭｅＯＨ／１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、２０００：１０ｖ／ｖ）で急速勾配溶離により分析する。溶離した検体を、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００トリプル四重極質量分析計を用いてＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析により検出する。血漿または脳中の化合物の濃度を同一の条件下で調製した標準物から決定する。
【０１８７】
血漿および脳の濃度を、この研究において各時点での３匹のラットの群から決定し（表６ａおよび６ｂを参照のこと）、０〜４８時間、血漿濃度／時間曲線または脳濃度／時間曲線下の領域を計算するために使用する。曲線（ＡＵＣ）または最大血漿および脳濃度（Ｃｍａｘ）（表６ｃを参照のこと）下のいずれかの領域を用いて脳における曝露の割合の試験により、化合物が約１の脳／血漿比で脳内に十分に分布することが実証される。最大濃度（Ｔｍａｘ）は４時間で検出される。これらの実験により、実施例１６の化合物がまた、血液脳関門を横断でき、脳内に十分に分布することが実証される。対照的に、本発明は、国際公開第０３／０６２２３６号からの好ましい化合物、（６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）が、同じアッセイにおいて、０．１７（ＡＵＣ）と０．１（Ｃｍａｘ）の脳：血漿の分布比を示すことを実証しており、これは、その化合物がこのモデルにおいて脳組織内に比較的不十分に分布することを示している。
【０１８８】
表６ａ：オスのＳＤラットにおいて決定される実施例１６の化合物の血漿濃度（ｎｇ／ｍＬ）
【０１８９】
【表２３】
【０１９０】
表６ｂ：オスのＳＤラットにおいて決定される実施例１６の化合物の脳濃度（ｎｇ／ｇ）
【０１９１】
【表２４】
【０１９２】
表６ｃ：オスのＳＤラットにおいて決定される血漿および脳における実施例１６の化合物に対する平均曝露
【０１９３】
【表２５】
【０１９４】
テモゾロマイドを用いる併用研究
Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植片を増殖させ、前記のとおり測定する。実施例１６の化合物を製剤化し、前記のとおり投与し、１１〜３１日、１日に１回、経口投与する。テモゾロマイド（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、精製水中の１％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ｖ／ｖポリソルベート８０で製剤化し、１１日と１８日目に腹腔内注射により投与する。テモゾロマイドの単一の薬剤活性と実施例１６の化合物を用いる併用治療との比較を表７に示す。腫瘍増殖を、２元相互作用分析により分析する；ｌｏｇに変換された腫瘍体積を、ＳＡＳ、バージョン９．１（Ｃａｒｙ、ＮＣ）における空間電力相関モデルを使用する反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。２×２因子構造を、２つの治療群の間の治療効果および相互作用効果を評価するために使用した。相互作用効果を、全ての時間点（「全体」試験）および各時間点にわたって試験した。テモゾロマイド単独を受容しているものと比べて併用群で見られる腫瘍増殖の増加した阻害により、テモゾロマイドおよび実施例１６の化合物が、皮下膠芽細胞腫異種移植片モデルの組み合わせにおいて有効なインビボ抗腫瘍活性を実証することが示される。
【０１９５】
表７：実施例１６の化合物とテモゾロマイドとのＵ８７−ＭＧ異種移植片の併用研究
【０１９６】
【表２６】
【０１９７】
Ｕ８７ＭＧ同所性脳異種移植片を増殖させ、前記のとおり生存を測定する。動物群を、テモゾロマイド（ｔｅｍｏｌｏｚｏｍｉｄｅ）（ＴＭＺ）、または実施例１６（毎日または一日おきに投与）とテモゾロマイドとの組み合わせで治療する。表８に示すように、テモゾロマイド単独を受容したものと比べて併用群における平均生存の増加により、テモゾロマイドおよび実施例１６の化合物が、同所性膠芽細胞腫異種移植片モデルの組み合わせにおいて有効なインビボ阻害活性を有することが示される。併用治療について死亡および体重損失がないこと（表９を参照のこと）により、それらが十分に許容され、重複する毒性がないことが示される。
【０１９８】
表８：テモゾロマイドと組み合わせた実施例１６の化合物の投与から生じる平均生存および生存期間中央値（日数）
【０１９９】
【表２７】
【０２００】
表９：テモゾロマイド／実施例１６の化合物の研究からの動物の死亡率および体重
【０２０１】
【表２８】
【０２０２】
ゲムシタビンとの併用研究
Ｃａｌｕ−６（肺）皮下異種移植片を増殖させ、前記のとおり測定する。ゲムシタビンを生理食塩水（精製水中の０．９％塩化ナトリウム）中で製剤化し、腹腔内注射によりｑ３ｄｘ７で投与する。試験化合物はｑｄｘ２１で投与する。ゲムシタビンの単一薬剤活性と、ゲムシタビンと実施例１６の化合物の両方を含む併用治療との比較を表１０に示す。腫瘍増殖を２元相互作用分析により分析する。ゲムシタビンを受容するものと比較して併用群に見られる腫瘍増殖の高い阻害により、この薬物が、皮下肺癌異種移植片モデルの組み合わせにおいて有効なインビボ抗腫瘍活性を実証することが示される。併用治療についての死亡率および体重損失の低い発生率により、それらが十分に許容されることが示され、毒性を重複しないことが示唆される（表１１を参照のこと）。
【０２０３】
表１０：実施例１６の化合物とゲムシタビンとのＣａｌｕ−６異種移植片の併用研究
【０２０４】
【表２９】
【０２０５】
表１１：ゲムシタビン／実施例１６の化合物からの動物の死亡率および体重の研究
【０２０６】
【表３０】
【０２０７】
本発明の化合物の経口投与が好ましい。本発明の化合物の静脈内投与もまた、好ましい。状況に応じて、他の投与経路が使用されてもよく、またはさらに好ましい。例えば、経皮投与が、経口医薬を摂取することを忘れやすいか、または経口医薬を摂取することにいらいらする患者に非常に望ましい場合もある。本発明の化合物はまた、特定の状況において経皮、筋肉内、鼻腔内または直腸内経路により投与されてもよい。投与経路は、薬物の物理特性、患者および介護士の利便性、および他の関連状況により制限され、如何なる方法で変更されてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度に相同なサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）ＣＤＫ４およびＣＤＫ６と、サイクリンＤとの組み合わせは、細胞周期のＧ１（増殖）およびＳ（ＤＮＡ複製）期の間で制限点Ｒを通る遷移の重要な調節因子である。ＣＤＫ４／６は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）のリン酸化反応を介してそれらの効果を発揮する。一度リン酸化されると、ｐＲｂは、Ｓ期への移行を促進する遺伝子の転写に対するその阻害効果を失う。
【０００３】
一方、内因性タンパク質調整因子ｐ１６ＩＮＫ４または小分子阻害剤によるＣＤＫ４／６キナーゼ活性の特異的阻害は、低リン酸化ｐＲｂと、Ｇ１制限点における細胞の停止を導く。Ｇ１制限点の制御における主要な機構として、これらキナーゼにより制御される経路は、広範囲のヒト腫瘍において変更されるので、これら腫瘍におけるＣＤＫ４／ＣＤＫ６の阻害は、細胞分裂を防止することによる治療的利点を有する。
【０００４】
Ｐｉｍ−１は、細胞周期の進行、転写／シグナル変換経路およびアポトーシスを含む種々の生物学的機能を制御し、また、その発現は、血液学的腫瘍、前立腺腫瘍、および、経口腫瘍を含むいくつかの癌と関連している、セリン／トレオニンキナーゼである（非特許文献１）。
【０００５】
キナーゼ阻害剤は、当該技術分野において公知である。特許文献１は、一連の置換２−ピリミジンアミンを開示し、また、それらをキナーゼ阻害剤、特に、キナーゼｐ５６ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０およびタンパク質キナーゼＣとして記載している。特許文献１は、Ｃｄｋの阻害については開示していない。
【０００６】
特許文献２において開示されている、一連の２−（ピリジン−２−イルアミノ）−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オンは、ＣＤＫ４／６阻害活性を有するものとして記載されている。これらの化合物は、例えば癌および再狭窄のような細胞増殖性疾患の治療に有用であると記載されている。しかし、これらの化合物は、水溶液に溶けにくく、他の（非Ｃｄｋ）キナーゼ標的において目立った阻害活性を示さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９８／１１０９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０６２２３６号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．およびＴ．Ｍｏｒｏｙ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００５．３７（４）：ｐ．７２６−３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
癌等の細胞増殖性疾患の治療に用いられ得るＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性が依然としてある。本発明は、ＣＤＫ４／６阻害剤を提供する。本発明の特定の化合物は、当該技術分野に公知の特定の化合物よりも有効なＣＤＫ４／６阻害剤である。
【００１０】
加えて、他のＣｄｋと比較してＣＤＫ４／６に対して選択的であるので、薬理学的に関連する濃度にて存在する場合において特定のＧ１停止をもたらし得る、ＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明は、薬理学的に関連する濃度にて存在する場合において特定のＧ１停止をもたらし得るＣＤＫ４／６阻害剤を提供する。
【００１１】
また、改善された水溶液中の溶解性を有するＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、当該技術分野の特定の化合物と比較して改善された水溶液中の溶解性を有する。
【００１２】
さらに、改善された脳組織への分布を有するので、脳（例えば、原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍）内で生じる疾患を処置するために使用され得る、ＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、改善された脳組織への分布を有する。
【００１３】
また、良好な薬物速度論的特性（例えば、経口利用可能性）を有するＣＤＫ４／６阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、当該技術分野において公知の特定の化合物と比較した場合に改善された経口利用可能性を有する。
【００１４】
加えて、他の非Ｃｄｋキナーゼ（例えば、Ｐｉｍ−１キナーゼ）における二次的な阻害活性を有するキナーゼ阻害剤を提供する必要性がある。本発明の特定の化合物は、二重ＣＤＫ４／６およびＰｉｍ−１キナーゼ阻害活性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキルまたはシクロプロピル−メチルであり；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたはフッ素であり、Ｒ２またはＲ３のうち少なくとも１つは、フッ素であり；
Ｒ４は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、式中、Ｒ６およびＲ７は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｑは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓまたは直接結合であり；
ＷおよびＹは、ＣまたはＮであり、ここで、ＷまたはＹのうち少なくとも１つは、Ｎであり、ＱがＯまたはＳである場合、ＷはＣである）
またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩、および、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬製剤を提供する。
【００１７】
本発明は、治療における使用のための本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。
【００１８】
本発明は、癌の処置における使用のための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を提供する。具体的には、これらの癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群より選択される。
【００１９】
この発明は、さらに、有効量の本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を、癌の処置を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される癌を処置する方法を提供する。
【００２０】
加えて、この発明は、癌の治療のための薬剤の製造のための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩の使用を提供する。具体的には、これらの癌は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される。
【００２１】
さらに、この発明は、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩、および、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、治療に使用するための医薬製剤を提供する。本発明はまた、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩、および、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病を処置するための医薬製剤を提供する。
【００２２】
上述の式において使用された一般的な化学用語は、それらの一般的な意味を有する。例えば、用語「Ｃ３〜Ｃ５アルキル」は、３から５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖である一価の飽和脂肪族鎖を意味し、限定されないが、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含む。
【００２３】
用語「Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル」は、３から５個の炭素原子を含有する飽和炭素環系を意味する。
【００２４】
ここで、ほとんどまたはすべての本発明の化合物が塩を形成可能であることを当業者は理解するだろう。本発明の化合物は、アミンであり、したがって、多数の無機酸および有機酸のいずれかと反応して、製薬的に許容し得る酸付加塩を形成する。このような製薬的に許容し得る酸付加塩、および、それらを調製するための一般的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、以下の文献を参照のこと。Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｌ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ，「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」．Ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｖｏｌ．１３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １９９５，ｐｐ．４５３−４９９；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ ６６，Ｎｏ．１，１９７７年，１月。塩酸塩およびメシラート塩が好ましい。メシラート塩が特に好ましい。
【００２５】
好ましくは、本発明は、Ｒ１が、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロプロピル−メチルである式（Ｉ）の化合物を含む。より好ましくは、Ｒ１はイソプロピルである。
【００２６】
好ましくは、本発明は、Ｒ２が、フッ素であり、Ｒ３が、水素である、式（Ｉ）の化合物を含む。好ましくは、本発明は、Ｒ２が、水素であり、Ｒ３が、フッ素である、式（Ｉ）の化合物を含む。最も好ましくは、Ｒ２およびＲ３の両方は、フッ素である。
【００２７】
好ましくは、本発明は、Ｒ４が、水素である、式（Ｉ）の化合物を含む。代替的に、Ｒ４は、好ましくはメチルである。最も好ましくは、Ｒ４は水素である。
【００２８】
好ましくは、本発明は、Ｒ５が、Ｃ１〜Ｃ３アルキルまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６およびＲ７が、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである、式（Ｉ）の化合物を含む。より好ましくは、Ｒ６およびＲ７は、エチルである。より好ましくは、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。最も好ましくは、Ｒ５は、エチルである。
【００２９】
好ましくは、本発明は、Ｑが、ＣＨ２または直接結合である、式（Ｉ）の化合物を含む。最も好ましくは、ＱはＣＨ２である。
【００３０】
好ましくは、本発明は、Ｙが、Ｎである、式（Ｉ）の化合物を含む。
【００３１】
好ましくは、本発明は、Ｗが、Ｎである、式（Ｉ）の化合物を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明は、ＷおよびＹの両方が、Ｎである、式（Ｉ）の化合物を含む。
【００３３】
本発明の好ましい化合物は、下式の化合物：
【化２】
（式中、
Ｒ１は、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロプロピル−メチルであり；
Ｒ４は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｑは、ＣＨ２、Ｏまたは直接結合であり；
Ｗは、ＣまたはＮであり、ＱがＯの場合、ＷはＣである）
または、その製薬的に許容し得る塩を含む。
【００３４】
特に好ましい化合物は、本願明細書において例示される化合物またはその製薬的に許容し得る塩である。さらに特に好ましい化合物は、化合物［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン、またはその製薬的に許容し得る塩である。［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンは、代替的に、２−ピリミジンアミン、Ｎ−［５−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］−２−ピリジニル］−５−フルオロ−４−［４−フルオロ−２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル］と命名されてもよい。
【００３５】
非常に好ましい化合物は、２１．２９（２θ±０．１°）におけるピーク、ならびに、１１．５４、１０．９１、および１２．１３（２θ±０．１°）を含む群から任意に選択される１つ以上のピーク、を含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα放射線、λ＝１．５４０５６Å）により特徴付けられる、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶である。［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶は、さらに、１１２．７、１２７．３および１２９．４における化学シフトピークν（Ｆ１）［ｐｐｍ］を有する１３Ｃ ＮＭＲスペクトルによりさらに特徴付けられ得る。
【００３６】
本発明の化合物は、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の特定の阻害剤であるので、異常な細胞増殖により特徴付けられる病気または疾患の治療に有用である。具体的には、本発明の化合物は、癌の治療に有用である。
【００３７】
ＣＤＫ４およびＣＤＫ６は、ｐＲｂのリン酸化反応を介する細胞周期に対するそれらの作用を調節する。本発明の化合物は、ＣＤＫ４／６活性の有効な阻害剤であるので、ｐＲｂリン酸化反応は、あらゆる癌のタイプにおける細胞増殖（したがって、腫瘍成長）を阻害することが期待される。ここで、この細胞は、増殖型であり、機能的インタクトＲｂ１遺伝子（これはｐＲｂをコードする）を含む。したがって、本発明の化合物は、哺乳動物における、ｐＲｂ＋癌、例えば、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病の治療（Ｆｒｙ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００４），３（１１），１４２７）、マントル細胞リンパ腫の治療（Ｍａｒｚｅｃ，Ｍ．ら，Ｂｌｏｏｄ（２００６），１０８（５），１７４４）、卵巣癌の治療（Ｋｉｍ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４），５４，６０５）、膵臓癌の治療（Ｓｃｈｕｔｔｅ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），５７，３１２６）、悪性黒色種および転移性悪性黒色種の治療（Ｍａｅｌａｎｄｓｍｏ，Ｇ．Ｍ．ら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（１９９６），７３，９０９）において有用である。本発明の化合物はまた、哺乳動物における、横紋筋肉種の治療（Ｓａａｂ，Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００６），５（５），１２９９）および多発性骨髄種の治療（Ｂａｕｇｈｎ，Ｌ．Ｂ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６），６６（１５），７６６１）に有用であると期待される。治療される哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
【００３８】
加えて、好ましい本発明の化合物は、改善された脳組織への分布を有する有利な特性を示す。例えば、ラットモデルに投与される場合は、実施例１６の化合物の脳：血漿曝露比（曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血漿濃度および脳濃度（Ｃｍａｘ）を用いて決定される、表６ｃを参照）は、およそ１であり、これは、実施例１６の化合物が脳へ良好に分布していることを示している。一方で、本発明者らにより、国際公開第０３／０６２２３６号からの好ましい化合物、（６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）が、０．１７（ＡＵＣ）および０．１（Ｃｍａｘ）の脳：血漿分布比を示すことが決定されている。これは、この化合物がこのモデルにおいて脳組織内に比較的不十分に分布していることを示している。したがって、好ましい本発明の化合物は、脳に侵入可能であるので、原発性および転移性脳腫瘍（ここで、細胞は、増殖型であり、機能的インタクトＲｂ１遺伝子を含む）の治療において有用である。このようなｐＲｂ＋脳腫瘍の例としては、膠芽腫ならびに髄芽種および星状細胞腫が挙げられる（Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｈ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７），２３５，１３９４）。テモゾロマイドは、黒色種、乳癌およびＮＳＣＬＣからの脳転移を含む（Ｓｉｅｎａ，Ｓ．ら，（２００９）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｐ３４３）、膠芽腫および星状細胞腫（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｓ．ら（２０００），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６（７）：２５８５−９７）を含む脳腫瘍の治療に使用される、細胞毒性ＤＮＡアルキル化剤である。テモゾロマイドは、化学修飾／損傷を起こすＤＮＡと相互作用する（Ｍａｒｃｈｅｓｉ，Ｆ．ら，（２００７），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．５６（４）：２７５−８７）。本発明の化合物は、原発性および転移性ｐＲｂ＋脳腫瘍（例えば、膠芽腫および星状細胞腫）の治療のために、テモゾロマイドと組み合わせて使用され得る。ここで、このような転移は、例えば、黒色種、乳癌またはＮＳＣＬＣから生じるものである。
【００３９】
抗腫瘍活性を示すヌクレオシド類似体であるゲムシタビンＨＣｌは、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（β−異性体）であり、２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン一塩酸塩、または、１−（４−アミノ−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−１−イル）−２−デソキシ−２’，２’−ジフルオロリボースとしても知られている。ゲムシタビンＨＣｌは、米国特許第５，４６４，８２６号に記載されている。以下に構造式を示す。
【化３】
【００４０】
ゲムシタビンＨＣｌは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療に有効であり（Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．およびＥｔｔｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．，（１９９９），Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，４，２４１）、膵臓癌の治療に有効であり（Ｐｉｎｏ，Ｓ．Ｍ．ら，（２００４），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６，１１９）、卵巣癌の治療に有効であり（Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒ，Ｊ．ら，（２００６），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２４（２９），４６９９）、および転移性乳癌の治療に有効である（Ｃｈａｎ，Ｓ．ら，（２００９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２７（１１），１７５３）。本発明の化合物は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌および転移性乳癌の治療のために、ゲムシタビンＨＣｌと組み合わせて使用され得る。
【００４１】
本発明の化合物は、有効量の本発明の化合物を、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における癌、具体的には、上述した癌を治療する方法において使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌を治療する方法において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌を治療する方法において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、治療有効量の本発明の化合物およびテモゾロマイドの組み合わせを、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における膠芽腫または星状細胞腫を治療する方法において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、治療有効量の本発明の化合物およびゲムシタビンＨＣｌの組み合わせを、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌を治療する方法において使用され得る。
【００４２】
本発明の化合物は、癌、具体的には、上述した癌の治療のために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌の治療のために使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌の治療のために使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、膠芽腫または星状細胞腫の治療において、テモゾロマイドと同時、別個、または、連続的に組み合わせて使用するための、本発明の化合物を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌の治療において、ゲムシタビンＨＣｌと同時、別個、または、連続的に組み合わせて使用するための、本発明の化合物を提供する。
【００４３】
さらに、本発明の化合物は、癌、具体的には、上述した癌の治療のための薬剤の製造において使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌の治療のための薬剤の製造において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌の治療のための薬剤の製造において使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、膠芽腫または星状細胞腫の治療のための薬剤の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。ここで、この薬剤はまた、テモゾロマイドを含むか、あるいは、テモゾロマイドと同時か、別個か、または、連続して投与され得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌の治療のための薬剤の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。ここで、この薬剤はまた、ゲムシタビンＨＣｌを含むか、あるいは、ゲムシタビンＨＣｌと同時か、別個か、または、連続して投与され得る。
【００４４】
癌、具体的には、上述した癌を治療するための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤もまた提供される。好ましい実施形態において、結腸直腸癌、マントル細胞リンパ腫、乳癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌、特に、ＮＳＣＬＣからなる群より選択される癌を治療するための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤もまた提供される。好ましい実施形態において、結腸直腸癌、膠芽腫、急性骨髄性白血病および肺癌からなる群より選択される癌を治療するための、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤もまた提供される。別の好ましい実施形態において、本発明は、膠芽腫または星状細胞腫を治療するための、本発明の化合物およびテモゾロマイドとともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、卵巣癌または転移性乳癌を治療するための、本発明の化合物およびゲムシタビンＨＣｌとともに製薬的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩およびテモゾロマイドとともに、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬製剤を提供する。
【００４６】
本発明はまた、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩およびゲムシタビンＨＣｌとともに、製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬製剤を提供する。
【００４７】
本発明は、さらに、本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩とともに、製薬的に許容し得る担体および任意の他の治療成分を含む、医薬製剤を提供する。
【００４８】
さらに、好ましい例示の化合物はまた、Ｐｉｍ−１の阻害剤である。上述したように、Ｐｉｍ−１は、細胞周期の進行、転写／シグナル変換経路およびアポトーシスを含む種々の生物学的機能の制御に関与するセリン／トレオニンキナーゼであり、また、その発現は、いくつかの癌と関連している。具体的には、小分子阻害剤Ｋ００１３５によるＰｉｍ−１の阻害は、ヒトの急性白血病細胞集団の生存およびクローン性増殖を弱めることが示されている（Ｐｏｇａｃｉｃ，Ｖ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００７）．６７（１４）：ｐ．６９１６−２４）。加えて、Ｐｉｍ−１は、バルーン損傷ラットの頚動脈の内膜新生、ならびに、内膜肥厚を示すヒトの胸部大動脈および冠状動脈において発現されることが示されている。さらに、Ｐｉｍ−１機能の特定の阻害は、バルーン損傷後の内膜新生形成およびまた、培養血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖の両方を顕著に抑制した。これは、Ｐｉｍ−１がこのような細胞の増殖において重要な役割を担うことを示唆している。ＶＳＭＣの増殖は、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄）の原因に関わっており、このため、Ｐｉｍ−１の阻害は、ＶＳＭＣの増殖を抑制するので、血管閉塞性疾患の治療に有用であると期待されている（Ｋａｔａｋａｍｉ Ｎら，ＪＢＣ（２００４），２７９（５２），５４７４２−５４７４９）。
【００４９】
したがって、好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩は、有効量の本発明の化合物を、癌の治療を必要とする哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）を治療する方法において使用され得る。好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩は、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）の治療において使用され得る。さらに、好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩は、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）の治療のための薬剤の製造において使用され得る。また、好ましい本発明の化合物またはその製薬的に許容し得る塩を含む、血管閉塞性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症または再狭窄）を治療する医薬製剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本願明細書において、「ｈ」は、時間を意味する。「ｍｉｎ」は、分を意味する。「Ｃｄｋ」は、サイクリン依存性キナーゼを意味する。「ｐＲｂ」は、網膜芽細胞腫タンパク質を意味する。「ＭＣＬ」は、マントル細胞リンパ腫を意味する。「ＡＭＬ」は、急性骨髄性白血病を意味する。「ＣＭＬ」は、慢性骨髄性白血病を意味する。「Ｂｏｃ」は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを意味する。「ＥＡ」は、酢酸エチルを意味する。「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを意味する。「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。「ＤＭＡ」は、ジメチルアセトアミドを意味する。「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを意味する。「ＭｔＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを意味する。「ＴＥＡ」は、トリエチルアミンを意味する。「ＦＢＳ」は、ウシ胎仔血清を意味する。「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味する。「ＲＴ」は、室温を意味する。「ｍｐｋ」は、キログラムあたりのミリグラムを意味する。「ｐｏ」は、口から（経口）を意味する。「ｑｄ」は、１日１回の投与を意味する。「ＨＰＬＣ」は、高圧液体クロマトグラフィーを意味する。「ｑ２ｄ」は、２日ごとの単回投与を意味する。「ｑ２ｄｘ１０」は、２日ごとの単回投与を１０回すること意味する。「ＶＳＭＣ」は、血管平滑筋細胞を意味する。「ＸＲＤ」は、Ｘ線回折を意味する。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物は、以下に示す当業者に公知の技術および手順により調製され得る。より具体的には、式（Ｉ）の化合物は、以下に示すスキーム、方法、および実施例に記載されるように調製され得る。以下のスキームにおける個々の工程は、式（Ｉ）の化合物を提供するために変更され得ることが当業者に理解される。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に取得可能である。すべての置換物は、特に指定されない限り、上記に定義したとおりである。
【００５２】
以下の調製例および実施例における化合物名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ５．０を用いて生成される。
【００５３】
スキーム
式（Ｉ）の化合物の合成を、以下の調製例と、実施例およびスキームの両方において例示する。ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｑ、Ｗ、およびＹは、上記したように定義される。
【００５４】
スキーム１
式（Ｉ）の化合物を、以下のスキーム１に示すようなパラジウム（０）カップリング反応により調製する。
【化４】
【００５５】
スキーム１の上部の反応において、Ｚ＝Ｒ５の場合、ピリミジニル−ベンズイミダゾール塩化物（Ａ）を、パラジウム触媒カップリング反応にてピリジニルアミン（Ｂ）と反応させて、直接式（Ｉ）の化合物を形成する。
【００５６】
スキーム１の下部の反応において、Ｙ−ＺがＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）の場合、ピリミジニルハロゲン化物（Ａ）をまた、ピリジニルアミン（Ｂ）とカップリングさせるが、Ｂｏｃ基を強酸で除去して、遊離アミン（Ｃ）を生成する。最終的に、アミン（Ｃ）を、還元条件下でアルキル化して、式（Ｉ）の化合物を生成する。
【００５７】
スキーム２
ピリミジニル−ベンズイミダゾール（Ａ）の調製例
【化５】
【００５８】
ピリミジニル−ベンズイミダゾール（Ａ）を、市販のピリミジニル二塩化物（Ｄ）およびベンズイミダゾールボロン酸（Ｅ）のパラジウム（ＩＩ）触媒カップリング反応により調製する。
【００５９】
スキーム３
ベンズイミダゾールボロン酸（Ｅ）の調製例
【化６】
【００６０】
ベンズイミダゾールボロン酸（Ｅ）を、ビス（ピナコラト）ジボロン酸を用いて、ベンズイミダゾール（Ｈ）中で臭化物のＰｄ（ＩＩ）触媒ボロニル化を介して調製する。次いで、ベンズイミダゾール（Ｈ）を、カリウムｔ−ブトキシドを用いるアミジン（Ｆ）の環化、または、オルト酢酸トリエチル／酢酸を用いるベンゼンジアミン（Ｇ）の濃縮により調製する。
【００６１】
アミジン（Ｆ）を、塩化ホスホリルの存在下でアミンＲ１−ＮＨ２のモノ−アセトアミド誘導体で４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニルアミンを濃縮することによる、当業者に公知の有機合成により調製する。ベンゼンジアミン（Ｇ）を、アミンＲ１−ＮＨ２による２，４−ジブロモ−ニトロベンゼン中の２箇所の臭素の置換と、その後のニトロ基のアミン基への還元による、当業者に公知の有機合成により、２段階で調製する。
【００６２】
スキーム４
ピリジニルアミン（Ｂ）の調製例（ここで、Ｑは、ＳまたはＯであり、Ｗは、Ｃである）
【化７】
【００６３】
ピリジニルアミン（Ｂ）の合成（ここで、Ｑは、ＳまたはＯであり、Ｗは、Ｃである）を、市販のチオールまたはアルコール（Ｊ）によるピリジン（Ｉ）中の５−ハロゲン化物の置換により達成する。ニトロピリジン（Ｉ）が必要な場合、置換生成物について、さらにニトロ還元工程を行って、（Ｂ）を生成する。化合物（Ｉ）がこれらのスキームを通して汎用的な試薬であるが、いくつかはピリジルアミンやニトロピリジンのように市販のものであることが理解されるべきである。とはいえ、市販の（Ｉ）は、本願明細書および以下に記載した順序について当該技術分野において公知のアミン酸化またはニトロ基還元反応により転換可能である。
【００６４】
スキーム５
ピリジニルアミン（Ｂ）の調製例（ここで、Ｑは、ＣＨ２である）
【化８】
【００６５】
ピリジニルアミン（Ｂ）の合成（ここで、Ｑは、ＣＨ２である）を、以下の２つの方法により達成する。（１）市販のカルバルデヒド（Ｋ）について、遊離アミン（Ｌ）を用いる還元的アミノ化を行い、その後、リチウム１，１，１，３，３，３−ヘキサメチル−ジシラザンまたは液体アンモニアおよび酸化第一銅を用いるＰｄ（０）触媒アミノ化によるピリジン臭化物の置換を行う。（２）市販の１−ピペリジンカルボン酸、４−メチレン−，１，１−ジメチルエチルエステル（Ｍ）について、ヒドロホウ素化を行い、その後、ピリジルアミン（Ｉ）を用いるＰｄ（ＩＩ）カップリングを行う。
【００６６】
スキーム６
ピリジニルアミン（Ｂ）の調製例（ここで、Ｑは、直接結合である）
【化９】
【００６７】
ピリジニルアミン（Ｂ）の合成（ここで、Ｑは、直接結合である）を、以下の２つの方法により達成する。（１）市販の１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸，３，６−ジヒドロ−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−，１，１−ジメチルエチルエステル（Ｎ）について、ニトロピリジン（Ｉ）を用いるパラジウム（ＩＩ）カップリングを行い、その後、ニトロ基および二重結合の両方の還元を行う。（２）ニトロピリジン（Ｉ）中の臭化物を、遊離アミン（Ｌ）で置換して、その後、ニトロ基の還元を行う。
【００６８】
調製例１
４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルスルファニル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
乾燥トルエン（６．０６ｍＬ）を、２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリン（７６．５２ｍｇ）、ヨウ化銅（Ｉ）（６９．２７ｍｇ）、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４７５．５９ｍｇ）、４−メルカプト−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５８３．５ｍｇ）、マグネシウム（４９．１０ｍｇ）および２−アミノ−５−ヨードピリジン（５５０ｍｇ）の混合物に加える。超音波を用いて混合物中で窒素を泡立て、密閉したチューブ中で２４時間１１０℃にて懸濁液を攪拌する。冷却し、セライトで濾過する。トルエンで洗浄し、真空下で溶媒を除去する。ヘキサン／ＥＡ（１／１）を加え、セライト／シリカゲルパッドで濾過し、ヘキサン／ＥＡ（１／１）および次いでＥＡで２回洗浄する。真空下で溶媒を除去する。ヘキサン／ＥＡ（５０〜７５％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、６３０ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３１０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６９】
調製例２
５−フルオロ−２−ニトロ−ピリジン
０℃にて、硫酸（４６ｍＬ）に、開放空気中で２５％の過酸化水素（２６．９８ｍＬ）を加える。５分後、冷えた濃硫酸中の２−アミノ−５−フルオロピリジン（９ｇ）の溶液（４６ｍＬ）を、添加漏斗を用いて滴下して加える。得られた暗色溶液を、浴中で一晩、０℃〜室温にて攪拌する。２００ｍＬの氷水上に注ぎ、ＤＣＭで抽出する。合わせた有機層を５％の亜硫酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。真空下で溶媒を除去し、ＤＣＭで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、７．５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝１４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７０】
対応するアミンを用いて５−フルオロ−２−ニトロ−ピリジンについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００７１】
【表１】
【００７２】
調製例４
１−イソプロピル−４−（２−メチル−６−ニトロ−ピリジン−３−イル）−ピペラジン
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２０ｍＬ）中の３−ブロモ−２−メチル−６−ニトロ−ピリジン（２．４６ｇ）、１−イソプロピル−ピペラジン（２．７４ｇ）、テトラ−ｎ−ブチルヨウ化アンモニウム（４１８．６９ｍｇ）および炭酸カリウム（１．７２ｇ）を、６５℃で一晩攪拌する。ＥＡおよび水を加え、相を分離させ、硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。メタノールおよび次いでメタノール−ＮＨ３ ２Ｎで溶出する強カチオン交換カートリッジにより精製して、２．５８ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２６５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７３】
対応するブロモ誘導体を用いて、１−イソプロピル−４−（２−メチル−６−ニトロ−ピリジン−３−イル）−ピペラジンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【００７４】
【表２】
【００７５】
調製例７
５−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イル）−６−メチル−ピリジン−２−イルアミン
Ｈ２（バルーン）下で一晩、メタノール（３８ｍＬ）およびＥＡ（３８ｍＬ）中の１−イソプロピル−４−（２−メチル−６−ニトロ−ピリジン−３−イル）−ピペラジン（２．５２ｇ）および１０％のパラジウム炭素（６００ｍｇ）を攪拌する。セライトパッドで濾過し、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／メタノール（０〜１０％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２．２３ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝１４３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７６】
対応するニトロ誘導体を用いて、５−（４−イソプロピル−ピペリジン−１−イル）−６−メチル−ピリジン−２−イルアミンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【００７７】
【表３】
【００７８】
調製例１０
４−（６−ニトロ−ピリジン−３−イルオキシ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
０℃にて窒素下で、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４．８４ｇ）を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、３９ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−１−ピペリジン−カルボキシレート（８．７６ｇ）の水溶液に加える。１時間攪拌し、ＤＭＡ（７８ｍＬ）中の５−フルオロ−２−ニトロ−ピリジン（５ｇ）の水溶液を滴下して加える。反応物を室温で一晩攪拌する。水を加え、１時間静置させる。濾過して水で洗浄する。ＤＣＭ／ＥＡ（０〜１５％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、５．６５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７９】
調製例１１
４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルオキシ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
１０％のパラジウム炭素（０．６ｇ）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／メタノール（３０／３０ｍＬ／ｍＬ）の混合物中の４−（６−ニトロ−ピリジン−３−イルオキシ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．６５ｇ）の懸濁液に加える。一晩、２ａｔｍで、Ｐａｒｒ装置において水素化する。セライトパッドで濾過し、ＤＣＭおよびメタノールで洗浄する。ＤＣＭ／メタノール（１０％）／アンモニア（１％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８０】
調製例１２
６−アミノ−２−メチル−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
【化１０】
【００８１】
１，４−ジオキサン（３１．８２ｍＬ）中の４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．４６ｇ）および５−ブロモ−６−メチル−ピリジン−２−イルアミン（１．４９ｇ）の混合物中で、５分間、窒素を泡立て、次いで、三塩基性リン酸カリウムＮ水和物（５．０７ｇ）、酢酸パラジウム（３５．７２ｍｇ）、ジシクロヘキシル−（２’，６’−ジメトキシ−ビフェニル−２−イル）−ホスファン（１３４．６９ｍｇ］）、水（７．９６ｍＬ）を加え、９０℃で３時間、攪拌する。ＤＣＭで希釈し、水で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／エタノール５％／ＮＨ３ ０．１％で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、続いて、メタノールおよび次いでメタノール−ＮＨ３２Ｍで溶出する強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）により精製して、２．１２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８２】
調製例１３
６−アミノ−２−メチル−３’，４’，５’，６’−テトラヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
メタノール（２９．３０ｍＬ）中の６−アミノ−２−メチル−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．１２ｇ）および１０％湿潤のパラジウム炭素（３３０ｍｇ）の混合物を、Ｈ２（４５ｐｓｉ）下で、４８時間攪拌する。セライトパッドで濾過し、真空下で溶媒を取り除き、２．０７ｇの標題合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８３】
調製例１４
６−ニトロ−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
水（６３．３９ｍＬ）中の４−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１９．６ｇ）、５−ブロモ−２−ニトロピリジン（１２．８７ｇ）、２Ｍの炭酸ナトリウムと、１，４−ジオキサン（３１６．９４ｍＬ）中のビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．４５ｇ）との混合物中で、５分間、窒素を泡立て、８０℃で５時間攪拌する。ＤＣＭで希釈し、水で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／ＥＡ（０〜４０％）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、８．７２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８４】
調製例１５
６−アミノ−３’，４’，５’，６’−テトラヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
６−ニトロ−３’，６’−ジヒドロ−２’Ｈ−［３，４’］ビピリジニル−１’−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．８９ｇ）をエタノール（１２３．８０ｍＬ）に溶解する。パラジウム炭素で水素化して（Ｈ−Ｃｕｂｅ機器、７０ｂａｒ、５０℃、１ｍＬ／ｍｉｎ）、１．７２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２７８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８５】
調製例１６
４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルメチル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
窒素下で、５分間、４−メチレン−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．１０ｇ）を攪拌し、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（７７．４９ｍＬ）の０．５Ｍ ＴＨＦ溶液を加える。窒素下で一時間、７５℃で攪拌する。冷却し、２−アミノ−５−ブロモピリジン（３．８ｇ）、炭酸カリウム（３．８７ｇ）および１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（５３８．１０ｍｇ）ならびにＤＭＦ（４７．８３ｍＬ）および水（４．７８ｍＬ）の脱気した混合物を加える。６０℃で４時間、次いで、室温で一週間にわたって攪拌する。水およびＥＡを加える。ＥＡを用いて水層を分離し、抽出する。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／メタノール（１％）／アンモニア（０．１％）〜ＤＣＭ／メタノール（３％）／アンモニア（０．３％）で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。ＥＡで残留物を粉砕し、１．８５ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８６】
対応するブロモ誘導体を用いて、４−（６−アミノ−ピリジン−３−イルメチル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００８７】
【表４】
【００８８】
調製例１８
１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン
純粋な１−エチルピペラジン（２２１．４４ｍＬ）を、６−ブロモ−ピリジン−３−カルバルデヒド（３００ｇ）およびＤＣＭ（５０００ｍＬ）の混合物に加える。次いで、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（３７２．０９ｇ）を分けて加え、室温で１２時間、攪拌する。ＤＣＭ（１０００ｍＬ）および２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１５００ｍＬ）を加える。層を分離し、ＤＣＭ（６００ｍＬ）で水層を２回抽出する。有機層を合わせ、真空下で溶媒を取り除き、ＥＡを加えて蒸発させ、４５１．３ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８９】
対応するアミンを用いて、１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジンについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００９０】
【表５】
【００９１】
調製例２０
５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン
リチウム１，１，１，３，３，３−ヘキサメチル−ジシラザン（１０５５ｍＬ）をゆっくりと、１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン（２５０ｇ）、ジシクロヘキシルホスフィノ）ビフェニル（１８．５０ｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（２４．１７ｇ）およびＴＨＦ（２５０ｍＬ）の脱気した混合物に、５０℃で加える。この混合物を一晩６５℃で加熱する。３７℃まで冷却し、水（５００ｍＬ）を加える。真空下で溶媒の半分を取り除き、ＤＣＭ（２．５Ｌ）を加える。セライトパッドで濾過し、溶媒の部分を取り除く。メタノール（３００ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭｔＢＥ、６００ｍＬ）を混合物に加え、氷浴中で冷却する。次いで、エチルエーテル（８００ｍＬ）中の２Ｍの塩酸および塩酸（１００ｍＬ）の３２％水溶液中を加える。有機層を取り除き、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（２５００ｍＬ）を加える。ＤＣＭを用いて３回、水相を抽出し、真空下で溶媒を取り除く。完全に溶解するまで５０℃で９０ｍＬのトルエンに溶解し、次いで、８０ｍＬのＭｔＢＥを加える。室温で一晩攪拌する。完全に沈殿させるためにさらにＭｔＢＥ（１００ｍＬ）を加える。固形物を濾過して乾燥させ、１０８．２４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９２】
対応する２−ブロモ−ピリジン誘導体を用いて、５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミンについて実質的に記載されているように以下の化合物を調製する。
【００９３】
【表６】
【００９４】
調製例２２
２，４−ジブロモ−１−ニトロ−ベンゼン
発煙硝酸（１０１．４０ｍＬ）を、濃硫酸（３２２．７９ｍＬ）および水（６２．３９ｍＬ）中の１，３−ジブロモベンゼン（１０２．５１ｍＬ）の溶液に、０℃にて、滴下して加える。室温まで温め、１２時間攪拌する。その反応物を氷水（１５００ｍＬ）に注ぐ。得られた黄色の固形物を真空下で濾過し、乾燥させ、１７８．４６ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９５】
調製例２３
（５−ブロモ−２−ニトロ−フェニル）−シクロペンチル−アミン
シクロペンタンアミン（３２ｍＬ）を、１−ブタノール（１６０ｍＬ）中の２，４−ジブロモ−１−ニトロ−ベンゼン（２０ｇ）の水溶液に加える。この混合物を１００℃で一晩加熱する。真空下で溶媒を取り除き、水を加え、ＥＡで抽出する。続いて有機層を、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液および次いで水で洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除き、２２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９６】
調製例２４
４−ブロモ−Ｎ２−シクロペンチル−ベンゼン−１，２−ジアミン
亜ジチオン酸ナトリウム（１０７．４７ｇ）を、５−ブロモ−２−ニトロ−フェニル）−シクロペンチル−アミン（２２ｇ）、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）、水（１５０ｍＬ）および水酸化アンモニウム（３０ｍＬ）の溶液に加える。その混合物を室温で一晩攪拌する。ＥＡで２回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除き、１４．８０ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２５６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９７】
調製例２５
６−ブロモ−１−シクロペンチル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
４−ブロモ−Ｎ２−シクロペンチル−ベンゼン−１，２−ジアミン（１０．６ｇ）、トリエチルオルトアセテート（９．５ｍｌ）および酢酸（６．３ｍＬ）の混合物を１００℃で２．５時間加熱する。ＤＣＭで希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液に注ぐ。硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭ／エタノール−１０％ＮＨ３（０〜３％）で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１０．６７ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９８】
調製例２６
Ｎ−イソプロピル−アセトアミド
ＴＥＡ（２３．５８ｍＬ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の２−プロパンアミン（１０ｇ）の水溶液に０℃で加える。次いで、無水酢酸（１６．１５ｍＬ）を慎重に滴下して加える。室温で一晩攪拌する。真空下で溶媒を取り除き、エチルエーテル（エーテル）で希釈し、固形物を濾過する。真空下で溶媒を取り除く。エーテルで油を希釈し、炭酸カリウムを加え、室温で一晩攪拌する。固形物を濾過し、真空下で溶媒を取り除き、１５．６２ｇの標題化合物を得る。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）４．０６（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｄ，６Ｈ）。
【００９９】
対応するアミンを用いて、Ｎ−イソプロピル−アセトアミドについて実質的に記載されているように以下のアミドを調製する。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
調製例３０
Ｎ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミド
ＴＥＡ（１０．０５ｍＬ）を、トルエン（１５０ｍＬ）中の４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニルアミン（１０．０ｇ）、Ｎ−イソプロピルアセトアミド（９．７３ｇ）、塩化ホスホリル（６．７０ｍＬ）の混合物に加える。その混合物を、３時間、還流まで加熱する。その混合物を冷却し、真空下で溶媒を取り除く。ＤＣＭに粗製物を溶解し、数回、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で洗浄し、微量の酸を全て取り除く。硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除き、１４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０２】
対応するアセトアミドを用いて、Ｎ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミドについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
調製例３４
６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８１１．４３ｍｇ）を、Ｎ−メチルホルムアミド（２０ｍＬ）中のＮ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミド（２ｇ）の水溶液に加える。混合物を１００℃で２時間加熱する。室温まで冷却し、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）を加え、塩化ナトリウムの飽和水溶液（ブライン、３００ｍＬ）で３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ヘキサンを加え、数分間、超音波で振動する。固形物を濾過し、ヘキサンの添加／２回の濾過を繰返し、１．８６ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０５】
対応するアセトアミドを用いて、６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾールについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
調製例３８
４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（３０．０ｇ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（４２．１５ｇ）、トリシクロヘキシルホスフィン（５．４３ｇ）、酢酸カリウム（３２．５８ｇ）、およびＤＭＳＯ（２００ｍＬ）の混合物中で窒素を泡立てる。酢酸パラジウム（２．８ｇ）を加え、９０℃で１時間、予熱した油浴中で加熱する。ＥＡ（２００ｍＬ）で希釈し、セライトパッドで濾過する。その混合物をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。ヘキサンで粉砕し、固形物を濾過し、２７ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３１９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０８】
対応する６−ブロモ−ベンゾイミダゾール誘導体を用いて、４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾールについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１０９】
【表１０】
【０１１０】
調製例４３
６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
水（１０３．７ｍＬ）および１，２−ジメトキシエタン（１２０ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−５−フルオロ−ピリミジン（１２．７ｇ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．９ｇ）、２Ｍの炭酸ナトリウムの混合物中で窒素を泡立てる。８０℃で予熱した油浴中で加熱し、１，２−ジメトキシエタン（２００ｍＬ）中の４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（２２ｇ）の溶液を滴下して加える。その混合物を、８４℃で１時間、攪拌する。室温まで冷却し、ＥＡ（８００ｍＬ）を加え、ブライン（１００ｍＬ）で２回洗浄する。硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で溶媒を取り除く。アセトニトリルで粉砕し、１４．４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３２３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１１】
対応するジクロロ−ピリミジンおよびボロン酸誘導体を用いて、６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾールについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
対応するアミンおよびクロロ−ピリミジン誘導体を用いて、以下で、［５−（４−エチル−ピペリジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１１４】
【表１２−１】
【表１２−２】
【０１１５】
調製例５８
［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペラジン−１−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミン
【化１１】
【０１１６】
ＤＣＭ（１０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）中の４−｛６−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−ピリジン−３−イルメチル｝−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１５０ｍｇ）の混合物に、ジオキサン（１９４μＬ）中の４Ｍの塩化水素を加える。１０分間攪拌し、真空下で溶媒を取り除く。メタノール、次いでメタノール−ＮＨ３ ２Ｍで溶出する強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）によって精製し、その後、ＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３ ２Ｍ（３％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１２０ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝４７９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１１７】
［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペラジン−１−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミンについて実質的に記載されているように以下の中間体を調製する。
【０１１８】
【表１３−１】
【表１３−２】
【０１１９】
実施例１
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン
【化１２】
【０１２０】
１，４−ジオキサン（１９７．０６ｍＬ）中の６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（１５．９ｇ）、５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン（１０．８５ｇ）、炭酸セシウム（３２．１０ｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（１．８２ｇ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（２．３５ｇ）の混合物中で窒素を泡立てる。その混合物を、１１０℃で、２時間、予熱した油浴中で加熱する。室温で冷却し、ＤＣＭで希釈し、セライトパッドで濾過する。真空下で溶媒を取り除き、ＤＣＭ／メタノール（２％）、次いでＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３２Ｍ２％で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、２２．１１ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２１】
対応するアミンおよびクロロ−ピリミジン誘導体を用いて、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１２２】
【表１４】
【０１２３】
実施例４
［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−［５−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン
【化１３】
【０１２４】
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（２９９．９ｍｇ）を、［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペラジン−１−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミン（１３０ｍｇ）、アセトン（３１．６μＬ）、１，２−ジクロロエタン（９ｍＬ）および酢酸（１６．３μＬ）の混合物に加える。６０℃で一時間加熱する。真空下で溶媒を取り除く。メタノール、次いでメタノール−ＮＨ３２Ｍで溶出する、強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）によって精製し、続いて、ＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３２Ｍ（３％）で溶出する、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１１５ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２５】
対応するアミンを用いて、［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−［５−（４−イソプロピル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
実施例９
［４−（３−シクロプロピル−７−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イル］−［５−（１−エチル−ピペリジン−４−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン
【化１４】
【０１２８】
ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（７２０ｍｇ）を、［４−（３−シクロプロピル−７−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イル］−（５−ピペリジン−４−イルメチル−ピリジン−２−イル）−アミン（１１０ｍｇ）、１，２ジクロロエタン（１．１４ｍＬ）および酢酸（２７０９μＬ）の混合物に加える。６０℃で１時間加熱する。真空下で溶媒を取り除く。メタノール、次いでメタノール−ＮＨ３２Ｍで溶出する、強カチオン交換カートリッジ（ＳＣＸ）によって精製し、続いて、ＤＣＭ／メタノール−ＮＨ３２Ｍ（３％）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、８０ｍｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１２９】
対応するアミンを用いて、［４−（３−シクロプロピル−７−フルオロ−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−５−フルオロ−ピリミジン−２−イル］−［５−（１−エチル−ピペリジン−４−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミンについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１３０】
【表１６−１】
【表１６−２】
【０１３１】
実施例１６
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンメタンスルホネート
メタンスルホン酸（６３．５９ｍＬ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）およびメタノール（１００ｍＬ）の混合物中の［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミン（１７．３ｇ）の溶液に加える。１時間、その溶液を攪拌し、真空下で溶媒を取り除く。ＭｔＢＥで粉砕し、その固形物を濾過し、２０．４ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１３２】
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンメタンスルホネートについて実質的に記載されているように以下の実施例の化合物を調製する。
【０１３３】
【表１７−１】
【表１７−２】
【０１３４】
実施例３１
［５−（４−エチル−ピペリジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンＩ型結晶
１０２．１ｍｇのアモルファス［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンを２ｍＬのアセトンと混合する。沈殿した固形物を真空濾過により分離し、淡黄色のケーキを生成し、３０分間、濾過装置上の適切な位置で乾燥させ、７２．１ｍｇの固形物を得る。その固形物を１００℃の真空オーブンに３時間置く。
【０１３５】
Ｉ型の代表的なＸＲＤピークを表１に示す。
【０１３６】
実施例３２
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶
２０８ｍｇのアモルファス［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンを４ｍＬのアセトンと混合する。その懸濁液を、１０００ｒｐｍで攪拌しながら、６０℃で２時間、スラリーにし、次いで、真空濾過により固形物を分離し、淡黄色のケーキを生成する。３０分間、濾過装置上の適切な位置で乾燥させ、１１２ｍｇの固形物を得る（５４％収率）。８０℃の真空オーブンに３時間置く。ＩＩＩ型の代表的なＸＲＤピークを表２に示す。このピーク位置は外部標準を用いて確かめた。
【０１３７】
Ｘ線粉末回折
結晶のＸＲＤパターンを、５０ｋＶおよび４０ｍＡで作動する、ＣｕＫα源（λ＝１．５４０５６Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えた、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ Ａｄｖａｎｃｅ Ｘ線粉末回折計で得る。各試料を、２θにおいて０．０２°のステップサイズおよび１ステップあたり９．０秒の走査速度で、ならびに１ｍｍの発散および受光スリットならびに０．１ｍｍの検出器スリットで、２θにおいて４〜４０°の間で走査する。乾燥粉末を、くぼんでいるトップローディング試料ホルダーに詰め、平滑面をスライドガラスを用いて得る。結晶型回折パターンを周囲温度および相対湿度で収集する。III型結晶についてのバックグランドをピーク選択の前に除去するが、Ｉ型については、バックグランドは除去しない。
【０１３８】
任意の所定の結晶型に関して、回折ピークの相対強度が、結晶型および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して変化し得ることは結晶学の分野において周知である。好ましい配向の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特性ピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＃１８，１８４３−１８４４ページ，１９９５を参照のこと。さらに、任意の所定の結晶型に関して、角度ピーク位置はわずかに変化し得ることもまた、結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度または湿度、試料の置換、または内部標準の存在もしくは非存在の変化に起因して変化し得る。この場合において、２θにおいて±０．１のピーク位置の変化は、示された結晶型の明確な同定を妨げずに、それらの電位変化を考慮に入れる。
【０１３９】
結晶型の確認は、（°２θの単位において）特徴的なピーク、典型的により突出したピークのいくらかの固有の組み合わせに基づいてなされ得る。従って、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンＩ型結晶の調製された試料は、以下の表１に記載される回折ピーク（２θ値）を有し、特に１３．０９、１６．３１および１８．８２からなる群より選択されるピークのうちの１つ以上と合わせて４．５１においてピークを有するので、ＣｕＫα放射線を用いてＸＲＤパターンによって特徴付けられ；０．１°の回折角を許容する。
【０１４０】
表１：［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンＩ型結晶のＸ線粉末回折ピーク
【０１４１】
【表１８】
【０１４２】
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶の調製された試料は、以下の表２に記載される回折ピーク（２θ値）を有し、特に１１．５４、１０．９１および１２．１３におけるピークのうちの１つ以上と合わせて２１．２９においてピークを有するので、ＣｕＫα放射線を用いてＸＲＤパターンによって特徴付けられ；０．１°の回折角を許容する。
【０１４３】
表２：［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶のＸ線粉末回折ピーク
【０１４４】
【表１９】
【０１４５】
固体状態１３Ｃ ＮＭＲ
交差偏波／マジック角スピニング（ＣＰ／ＭＡＳ）ＮＭＲ（固体状態ＮＭＲまたはＳＳＮＭＲ）スペクトルは、それぞれ４００．１３１ＭＨｚの１Ｈ周波数および１００．６２３ＭＨｚの１３Ｃ周波数において作動するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００の広口径ＮＭＲスペクトロメータで、Ｂｒｕｋｅｒ ４ｍｍ二重共振プローブを用いて得られる。ＭＡＳレートは、Ｂｒｕｋｅｒ ＭＡＳ−ＩＩコントローラを用いて５または１０ｋＨｚに設定し、スピニング速度は設定ポイントの２Ｈｚ内に維持する。１００ｋＨｚのプロトンニューテーション周波数におけるＳＰＩＮＡＬ６４デカップリングを、異核デカップリングのために使用する。スピニングサイドバンドを、５パルスの全サイドバンド抑制法（ｔｏｔａｌ ｓｉｄｅｂａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＴＯＳＳ）シーケンスにより除去する。プロトンから炭素まで磁化を移動させるためのＣＰ接触時間を４ｍｓに設定し、９３．５から４６．９ｋＨｚまでの線形出力ランプを、ＣＰ効率を高めるために１Ｈチャネルで使用する。獲得時間を３４ｍｓに設定し、スペクトルを、５ｓのリサイクル遅延で３０ｋＨｚの分光幅にわたって獲得する。試料温度を、試料のスピニングによって生じる摩擦熱を最小化するために２９７±１Ｋに調節する。１３Ｃ化学シフトは、アダマンチン（δ＝２９．５ｐｐｍ）の高磁場共鳴によってニート（液体）のテトラメチルシランのプロトンデカップリングされた１３Ｃピークに対する外部参照（±０．０５ｐｐｍ）である。［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶についての化学シフトのピークリストは以下の通りである：
１３Ｃ−ＮＭＲ：ν（Ｆ１）（ｐｐｍ）１１．７，１２．９，２０．５，４８．６，５２．５，５９．４，１０８．９，１１０．０，１１２．７，１２７．３，１２９．４，１３５．５，１３６．４，１４８．８，１５０．１，１５２．２，１５４．５，１５６．３。
【０１４６】
実施例３３
［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶−経路Ｂ
【化１５】
ａ．１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン
６−ブロモ−ピリジン−３−カルバルデヒド（８．３ｋｇ）およびＤＣＭ（１８６ｋｇ）の混合物に純粋な１−エチルピペラジン（５．６ｋｇ）を加える。次いで、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１０．９ｋｇ）を少しずつ加え、２０〜３０℃で１２時間攪拌する。ＤＣＭ（３６ｋｇ）および２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（４６ｋｇ）の混合物中で反応をクエンチする。層を分離し、水層をＤＣＭ（２４×２ｋｇ）で２回抽出する。有機層を合わせ、ブライン（５０×２ｋｇ）で洗浄し、真空下で溶媒を除去して、１１．５ｋｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４７】
ｂ．５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン
Ｔ≦４０℃にて、１−（６−ブロモ−ピリジン−３−イルメチル）−４−エチル−ピペラジン（１４．２ｋｇ）、酸化第一銅（２００ｇ）、およびＭｅＯＨ（５７ｋｇ）の脱気した混合物に液体アンモニア（５０．０ｋｇ）を加える。その混合物を６５〜７５℃にて一晩加熱する。２０〜３０℃まで冷却し、セライト（登録商標）パッドで濾別する。濾液を濃縮し、ＤＣＭ（１１３ｋｇ）を加え、ｐＨを２Ｎの水酸化ナトリウム（２３ｋｇ）で１２〜１４に調整し、相を分離し、有機相をＤＣＭ（５８×２ｋｇ）で洗浄し、有機層を合わせる。セライト（登録商標）で混合物を濾過し、濃縮する。残留物をトルエン（９．７ｋｇ）に溶解し、ＭｔＢＥ（８．３ｋｇ）の添加により結晶化させて、６．０ｋｇの標題化合物を得る。トルエン再結晶によりさらに精製を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１４８】
ｃ．Ｎ−イソプロピル−アセトアミド
２０℃未満にて、炭酸カリウム（２８ｋｇ）を、酢酸エチル（１０８ｋｇ）中の２−プロパンアミン（１２ｋｇ）の溶液に加える。混合物を５〜０℃に冷却し、約２〜３ｋｇ／ｈにて塩化アセチル（１６．７ｋｇ）を加える。ガスクロマトグラフィーにより完了するまで攪拌する。反応を水（０．８ｋｇ）でクエンチし、反応混合物を濾過し、濃縮して、１３．４ｋｇの標題化合物を得る。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）４．０６（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｄ，６Ｈ）。
【０１４９】
ｄ．Ｎ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミジン
２０℃未満にて、塩化ホスホリル（１６．０ｋｇ）を、トルエン（１１５ｋｇ）中の４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニルアミン（１４．５ｋｇ）、Ｎ−イソプロピルアセトアミド（８．５ｋｇ）、ＴＥＡ（１０．６ｋｇ）の混合物に加える。ＨＰＬＣにより完了するまで１０〜２０℃にて攪拌する。真空下で溶媒を除去し、ＭｔＢＥ（６４ｋｇ）を加える。１０％炭酸ナトリウム水溶液（２５０ｋｇ）で混合物のｐＨを調整する。混合物を濾過し、ＭｔＢＥ（１１×２ｋｇ）でケーキをリンスする。相を分離し、ＭｔＢＥ（２２×２ｋｇ）で水層を洗浄する。有機層を合わせ、濃縮し、濾過し、シクロヘキサン（０．６ｋｇ）で洗浄し、乾燥させて、１７．２ｋｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５０】
ｅ．６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
Ｔ＜３０℃に温度を維持しながら、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６．９ｋｇ）を、Ｎ−メチルホルムアミド（７６ｋｇ）中のＮ−（４−ブロモ−２，６−ジフルオロ−フェニル）−Ｎ’−イソプロピル−アセトアミド（１６．２ｋｇ）の溶液に少しずつ加える。ＨＰＬＣにより完了するまで７０〜７５℃にて混合物を加熱する。２０〜３０℃に冷却し、水（２２７ｋｇ）に加えることによってクエンチし、次いでＭｔＢＥ（３７×４ｋｇ）で抽出する。合わせた有機相をブライン（４９×２ｋｇ）で洗浄し、２５〜３０Ｌに濃縮し、ｎ−ヘキサン（６４ｋｇ）を加え、スラリーを濾過して、１１ｋｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝２７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５１】
ＤＣＭに粗化合物を溶解することによりさらに精製を得て、シリカゲルおよびセライト（登録商標）パッドで濾過し、その後、ＭｔＢｅ／ヘキサン混合物から分離する。
【０１５２】
ｆ．４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
６−ブロモ−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（６００ｇ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（８４３ｇ）、トリシクロヘキシルホスフィン（１０６ｇ）、酢酸カリウム（６５２ｇ）、およびＤＭＳＯ（３．６Ｌ）の混合物中で窒素を泡立てる。酢酸パラジウム（４９ｇ）を加え、ＨＰＬＣにより完了するまで１００℃で加熱する。反応混合物を冷却し、水（１８Ｌ）で希釈し、次いで濾過し、固体を分離する。１，２−ジメトキシエタン（４５０ｍＬ）に粗物質を溶解し、セライト（登録商標）で濾過する。その濾液をパートｇで直接使用する。
【０１５３】
ｇ．６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
水（１．７Ｌ）中の２，４−ジクロロ−５−フルオロ−ピリミジン（５１７ｇ）、炭酸ナトリウム（５８６ｇ）と、１，２−ジメトキシエタン（３．４Ｌ）との混合物中で窒素を泡立てる。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（４．９ｇ）を加え、８０±３℃で反応物を加熱し、パートｆからの１，２−ジメトキシエタン中の４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−６−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾールの溶液（５．１Ｌ）を滴下して加える。ＨＰＬＣにより完了するまで８０±３℃で混合物を攪拌する。室温まで冷却し、冷水（２．１Ｌ、５℃）で希釈する。１時間攪拌し、次いで濾過により粗固体を分離する。ＩＰＡで粉砕することにより固体のさらなる精製を達成して、４７２ｇの標題化合物を得る。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝３２３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５４】
ｈ．［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶
【化１６】
ｔ−アミルアルコール（２．３Ｌ）中の６−（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−４−フルオロ−１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール（４６５ｇ）、５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イルアミン（３２１ｇ）、炭酸カリウム（４０３ｇ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１７ｇ）の混合物中で窒素を泡立てる。ＨＰＬＣにより完了するまで、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（１３．２ｇ）および混合物を１００±５℃で加熱する。室温まで冷却し、ＤＣＭ（１．２Ｌ）で希釈し、セライト（登録商標）パッドで濾過する。濾液を４ＭのＨＣｌ（２．３Ｌ×２）で抽出する。水層を合わせ、炭（３２ｇ）で攪拌する。セライト（登録商標）で濾過し、ＤＣＭ（１．７Ｌ）を加え、ＮａＯＨ（２８％水溶液、１．５Ｌ）でｐＨを調整する。有機層を回収し、ＤＣＭ（１．７Ｌ）で水層を洗浄する。有機層を合わせ、ブライン（１Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。固体により支持されたＳｉ−チオール処理を使用して、残存パラジウムを除去し、溶媒をアセトンに交換する。スラリーを濾過し、乾燥させて、６０５ｇの粗生成物をＩ型として得る。６０５ｇのＩ型と４．３Ｌの乾燥アセトンとを混合する。少なくとも１８時間、５６〜５７℃（還流）で、次いで４時間、周囲温度で懸濁物をスラリーにする。真空濾過により固体を分離し、淡黄色のケーキを生成する。５７０ｇの一定重量が得られるまで、３５℃で真空オーブン中にて固体を乾燥させる。物質を、ＸＲＰＤにより、標題化合物のＩＩＩ型であることを確認する。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１５５】
以下のアッセイの結果により、本願明細書に例示される化合物が、特異的ＣＤＫ４／６阻害剤として、および抗癌剤として有用であるという証拠が実証される。本願明細書中で使用される場合、「ＩＣ５０」とは、薬剤で起こり得る５０％の最大阻害反応を生じるその薬剤の濃度を意味し、「ＥＣ５０」とは、薬剤で起こり得る５０％の最大反応を生じるその薬剤の濃度を意味する。
【０１５６】
ＣＤＫ４阻害アッセイ
本発明に含まれる化合物がＣＤＫ４キナーゼに対する親和性を示すことを実証するために、ＣＤＫ４アッセイを実施する。機能的アッセイにより、本発明の化合物がＣＤＫ４キナーゼ活性を阻害する能力を示すという支持が提供される。以下のアッセイに使用される全てのリガンド、放射性標識、溶媒、および試薬は、商業的供給源から容易に利用可能であるか、または当業者により容易に合成され得る。
【０１５７】
２０％ＤＭＳＯ中の１０μＬの試験化合物、２０μＬのアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）およびＣ末端網膜芽細胞腫フラグメント（ＣＴＲＦ）（Ｕｐｓｔａｔｅ カタログ番号１２−４３９）溶液、および１０μＬの酵素溶液を９６ウェルプレート中で混合する。ＡＴＰおよびＣＲＴＦ溶液を、６８ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ） ｐＨ７．４、６．７２ｍＭのＭｇＣｌ２、６．７２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および０．０１３％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００のキナーゼバッファーに希釈した４０μＭのＡＴＰ、０．１６μＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰおよび１μＭのＣＴＲＦの混合物から調製する。酵素溶液を、上記のキナーゼバッファーに希釈した８ｎｇのＣＤＫ４酵素（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ カタログ番号０１４２−０３７３−１）から調製する。試験化合物を、２０％のＤＭＳＯ中で１：３に連続希釈して、２０μＭの開始濃度で１０点曲線を作成する。試験化合物を加えずに２０％のＤＭＳＯバッファーのみをコントロールとして使用し、５００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して、酵素活性の非存在下でバックグランド３３Ｐのレベルを決定する。試薬を混合し、２０℃にて９０分間インキュベートする。反応を、８０μＬの１０％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を加えることによって停止し、ガラス繊維フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＦＣ Ｎ０Ｂ ５０）上に物質が沈殿する。ウェルを、０．５％のＨ３ＰＯ４で４回洗浄し、組み込んだ放射線を、マイクロプレートシンチレーションカウンタ（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ，Ｗａｌｌａｃ）で決定する。
【０１５８】
高コントロールと低コントロールの中央値の間の差を１００％活性として得る。４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用して、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（商標）ソフトウェア（ＩＤＢＳ，Ａｌａｍｅｄａ ＣＡ）を用いてＩＣ５０値を生成する。例示した化合物の全てのメシル酸塩は、上記のアッセイにおいて１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例２５の化合物は上記のアッセイにおいて３ｎＭのＩＣ５０を有する。これにより、例示した化合物のメシレート塩がＣＤＫ４の有効な阻害剤であることが実証される。
【０１５９】
ＣＤＫ６阻害アッセイ
２０％のＤＭＳＯ、２０μＬのＡＴＰおよびＣＴＲＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ カタログ番号１２−４３９）溶液、および１０μＬの酵素溶液中の１０μＬの試験化合物を９６ウェルプレート中で混合する。ＡＴＰおよびＣＲＴＦ溶液を調製して、６８ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、６．７２ｍＭのＭｇＣｌ２、２．６４ｍＭのＤＴＴ、および０．００４％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００のキナーゼバッファーに希釈した１００μＭのＡＴＰ、０．５μのＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰおよび０．８μＭのＣＴＲＦの最終濃度を得る。酵素溶液を、ＣＤＫ４阻害アッセイにおいて上記のキナーゼバッファーに希釈した１．７ｎｇ／μＬのＣＤＫ６酵素（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ カタログ番号７５３３）の最終濃度に調製する。試験化合物を２０％のＤＭＳＯ中で１：３に連続希釈して、２０μＭの開始濃度にて１０点曲線を作成する。試験化合物を加えずに２０％のＤＭＳＯバッファーのみをコントロールとして使用し、５００ｍＭのＥＤＴＡを使用して、酵素活性の非存在下でバックグランド３３Ｐのレベルを決定する。試薬を混合し、２０℃にて９０分間インキュベートする。８０μＬの１０％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４の添加により反応を停止し、ガラス繊維フィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＦＣ Ｎ０Ｂ ５０）上に物質が沈殿する。ウェルを０．５％のＨ３ＰＯ４で４回洗浄し、組み込んだ放射線をマイクロプレートシンチレーションカウンタ（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ，Ｗａｌｌａｃ）で決定する。
【０１６０】
ＣＤＫ４と同様の方法でデータを分析する。好ましい例示した化合物は、上記のアッセイにおいて３０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例１９の化合物は、上記のアッセイにおいて５ｎＭのＩＣ５０を有する。これにより、好ましい例示した化合物がＣＤＫ６の有効な阻害剤であることが実証される。
【０１６１】
ＰＩＭ１キナーゼの阻害についてのアッセイ
Ｐｉｍ−１（ヒト、０．４６ｎＭの最終濃度）を、８ｍＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭの適切な基質ペプチド（Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｓ．ら（２００９）Ｂｌｏｏｄ，ＤＯＩ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０３−２１２８５２に記載されているＰｉｍ−１キナーゼ阻害アッセイプロトコルを参照のこと）、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要な場合濃縮）とインキュベートする。反応をＭｇＡＴＰミックスの添加により開始し、次いで室温で４０分間インキュベートする。反応を、３％のリン酸溶液の添加により停止する。次いで、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット上で停止し、７５ｍＭのリン酸中で５分間３回、メタノールで１回、洗浄し、その後、乾燥させ、シンチレーション計数する。化合物阻害試験のために、１００％のＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストックとして与えられる化合物を、１００％のＤＭＳＯ中で１：１０に希釈して、曲線の最上部の濃度の５０倍ストックを得る。次いで、５０倍ストックを１００％のＤＭＳＯ中で１：３に連続希釈して、１０点濃度−反応曲線を作成し、反応混合物中で１：５０（２％の最終ＤＭＳＯ濃度中に２０μＭ〜０．００１μＭ最終）に希釈して、化合物活性を測定する。ベースラインを、０分時に酸で停止させたコントロールウェル中で規定している間、コントロールウェルはＤＭＳＯのみを含有する。次いで各プレート上のコントロールから測定した阻害パーセントおよび１０点化合物濃度データを、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を用いて４パラメーターロジスティック式にフィットした。
【０１６２】
好ましい例示した化合物は０．０１μＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例２５の化合物は、上記のアッセイにおいて０．００３μＭのＩＣ５０を有する。これにより、好ましい例示した化合物がＰｉｍ−１キナーゼの有効な阻害剤であることが実証される。
【０１６３】
溶解アッセイ
適切な量の試験化合物を、別個のクロマトグラフバイアル中で秤量した。必要な体積の０．０５Ｍのリン酸バッファー、ｐＨ８．０（５００ｍＬのＨＰＬＣ等級水に６．７ｇのリン酸水素二ナトリウム×７Ｈ２Ｏを溶解し、リン酸８５％でｐＨを８．０に調整する）を試料バイアルに加え、２．０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成する。ＤＭＳＯ中の適切な標準溶液を、必要な体積のＤＭＳＯを標準バイアルに加えることにより調製して、２．０ｍｇ／ｍＬの標的濃度を達成する。バイアルをしっかりとキャップし、回転装置に入れる。バイアルを、約５０ｒｐｍの角速度を用いて、周囲温度で少なくとも１６時間３６０°で回転させる。個々のバイアルの外観検査を回転後に行う。各バイアルから２５０μＬを０．７μｍのガラスフィルターで濾過する。試料を濾過し、標準濾液を９６ディープウェルプレートの別のウェルに回収する。連続希釈を、２．０ｍｇ／ｍｌ標準溶液のＤＭＳＯ中での適切な連続希釈により調製（２０００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬおよびブランクのＤＭＳＯ試料）する。
【０１６４】
試料および標準溶液を、ＨＰＬＣ（ＬＣカラム：ＸＴｅｒｒａ ＭＳ、Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ、５０℃にて；移動相：Ａ−水中に０．２％ギ酸；Ｂ−アセトニトリル中に０．２％ギ酸；勾配：３分で５〜１００％Ｂ、０．５分間１００％Ｂで保持；流速：７５０μＬ／分；注入量：１μＬ；２００ｎｍ〜４００ｎｍのダイオードアレイ検出器走査）により分析する。定量化のために抽出し、使用する波長を、試料調製物の最も正確な推定を得るために選択する。試験化合物についてのピーク同定に使用するリテンションタイムを、２００μｇ／ｍＬの標準分取クロマトグラムから得る。
【０１６５】
溶解度値を、４レベル較正曲線を用いて算出する。ゼロフィットによる一次または二次式を用いてクロマトグラフ管理データシステムによって算出される較正基準のピーク面積について最適フィットのラインを使用する。溶解度の結果をｍｇ／ｍＬで報告する。好ましい例示した化合物は、上記のアッセイを用いてｐＨ８のリン酸バッファー中で少なくとも２ｍｇ／ｍｌの溶解度を示す。実施例１６の化合物は、上記のアッセイを用いてｐＨ８のリン酸バッファー中で２．０９９ｍｇ／ｍｌの溶解度を示す。従って、このデータは、本発明の好ましい例示した化合物が水溶液に容易に溶解することを実証する。
【０１６６】
ラット経口バイオアベイラビリティアッセイ
留置大腿動脈カニューレを有する雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３２０ｇの体重の範囲）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ ０１８８７，ＵＳＡから得る。試験化合物を、２２．５ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ３中の１０％のＮ−メチルピロリドン／１８％のＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）の溶液（２ｍＬ／ｋｇ）で静脈内投与する。最終薬物濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬ（遊離塩基当量）である。血液試料を２４時間にわたって留置カニューレを用いて得る。次いで、精製水中の１％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ｖ／ｖポリソルベート８０／０．０５％ｖ／ｖ消泡剤中の懸濁液（５ｍＬ／ｋｇ）中の経口量の試験化合物を動物に投与する。最終薬物濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ（遊離塩基当量）である。さらなる血液試料を２４時間にわたって留置カニューレを介して回収する。血漿試料を遠心分離によって得て、分析前に凍結保存（−２０℃）した。
【０１６７】
アセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中の内部標準化合物（正規化のため）を血漿試料に加え、タンパク質を沈殿させ、試料を分析前に遠心分離する。上清を、注入およびＪａｖｅｌｉｎ Ｂｅｔａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２０×２．１ｍｍカートリッジ、移動相Ａ：水／１Ｍの炭酸アンモニウム、２０００：１０ｖ／ｖ、移動相Ｂ：ＭｅＯＨ／１Ｍの炭酸アンモニウム、２０００：１０ｖ／ｖ）で急速勾配溶離により分析する。溶離した検体を、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００トリプル四重極質量分析計を用いてＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析により検出する。血漿中の化合物の濃度を同一の条件下で調製した標準物から測定する。
【０１６８】
経口バイオアベイラビリティを、経口投与後の血漿濃度時間曲線下の面積を、静脈内投与後（投与した用量についての正規化後）の曲線下の面積で割ることによって得る。結果を、静脈内用量に対する生物学的に利用可能な画分（％Ｆ）として表す。好ましい例示した化合物は、上述のアッセイにおいて２０％より高い％Ｆ値を示す。実施例２２の化合物は、上述のアッセイにおいて４８．５％の％Ｆ値を示す。これは、好ましい例示した化合物が良好な経口バイオアベイラビリティを有することを実証する。
【０１６９】
網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）のリン酸化の阻害およびＤＮＡ含有量アッセイ
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からのＣＯＬＯ ２０５細胞を、９６ウェルＢｅｃｋｍａｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）プレート中で２０００細胞／ウェルにて平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、例えばＧｉｂｃｏカタログ番号１１０００−１４４）および１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１３６０−０７０）を含むＲＰＭＩ １６４０倍地（例えば、ＧＩＢＣＯ、カタログ番号５２４００−０２５）中でインキュベートする。培地に試験化合物を加え、２０μＭ〜０．００１μＭの範囲にわたって、かつ０．２５％の最終ＤＭＳＯ濃度を含む１０点の１：３希釈物を投与することによって細胞を処理する。化合物に対する２４時間の曝露の後、細胞を、室温にて３０分間、ＰＲＥＦＥＲ（商標）固定剤［Ａｎａｔｅｃｈ ＬＴＤ．，カタログ番号４１４］で固定し、次いで、室温にて１５分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中の０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００に透過する。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、３７℃のインキュベーター中で６０分間、５０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅ（リボヌクレアーゼＡ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ−６５１３）で消化する。固定した細胞を、３０分間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号ＲＰＮ４１２Ｖ）でブロックする。一次抗体、抗ホスホＲＢ精製マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎカタログ番号５５８３８５）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に１：２０００にて細胞に加え、４℃で一晩インキュベートする。３回ＰＢＳでの洗浄後、細胞を、室温にて１時間、Ａｌｅｘａ４８８標識化二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１０１７）とインキュベートする。再度、それらをＰＢＳで３回洗浄し、次いで１５μＭのヨウ化プロピジウム（元の溶液からＰＢＳで１：１００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ３５６６）を加えて核を染色する。蛍光プレートを、ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰ ＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤによって製造された、レーザースキャニング蛍光マイクロプレートサイトメトリー（４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー励起および複数の光電子増倍管検出から構成される）］で走査して、Ｒｂタンパク質のリン酸化およびＤＮＡ含有量を測定する。画像解析は、異なる亜集団において細胞を同定するための細胞蛍光シグナルに基づく。アッセイの出力は、各々の同定した亜集団の割合、ホスホＲＢ陽性の％、２Ｎの％および４Ｎの％である。ＩＣ５０およびＥＣ５０値を、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（商標）を用いて各出力について４パラメーターロジスティックへの曲線フィッティングにより決定する。例示した化合物の全てのメシル酸塩は、上記のアッセイにおいて２００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例２５の化合物は、上記のアッセイにおいて約１００ｎＭの活性を有する。これは、例示した化合物のメシル酸塩が、インビトロでの全細胞ベースのアッセイにおいて、（低レベルのｐＲｂのリン酸化によって測定した場合）ＣＤＫ４／６キナーゼ活性の有効な阻害剤であることを実証する。
【０１７０】
さらに、例示した化合物の全てのメシル酸塩は、少なくとも２μＭの濃度で存在する場合でさえ、細胞周期のＧ１基の特異的停止を誘発できる。特異的Ｇ１停止は、２Ｎ遺伝子型を有する９０％より多い細胞によって示される。活性化合物の生理学的に関連する濃度においてさえ、特異的Ｇ１停止により、本発明の化合物がＣＤＫ４／６の特異的阻害剤であり、他のＣｄｋの非特異的阻害が最小化され、他の期の細胞周期停止を生じることが実証される。
【０１７１】
ヒト皮下異種移植片モデル
ヒト結腸直腸癌細胞（ｃｏｌｏ−２０５）、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（ＭＶ４−１１）、ヒト膠芽腫細胞（Ｕ８７ＭＧ）、およびヒト肺癌細胞（ＮＣＩ Ｈ４６０およびｃａｌｕ６）を、培地中で増殖させ（ｃｏｌｏ−２０５およびＮＣＩ Ｈ４６０は、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０倍地中で増殖させ；ＭＶ４−１１は、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＢＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地中で増殖させ；Ｕ８７ＭＧおよびｃａｌｕ６は、Ｅａｒｌｅ塩、Ｌ−グルタミンおよび非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％のＦＢＳを含むイーグルＭＥＭ中で増殖させ、ｃｏｌｏ−２０５、Ｕ８７−ＭＧ、ｃａｌｕ６およびＮＣＩ−Ｈ４６０はトリプシン処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ２５２００−０５６）、ＭＶ４−１１は遠心分離により回収した）、無胸腺ヌードマウスのひ腹に皮下注射（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ中で１：１に混合した５００万細胞／動物）した。試験化合物を、適切なビヒクル（２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ２中の１％ヒドロキシエチルセルロース）中で調製し、腫瘍が確立される場合（移植から１１〜２９日後）、２１日間、（２５、５０または１００ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）にて）毎日強制経口により投与する。腫瘍反応を、治療課程の間、１週間に２回実施する腫瘍体積測定により決定する。
【０１７２】
腫瘍増殖遅延を評価するための統計的方法（ＴＧＤ−個々の内挿法）は以下の通りである：各々の動物について、特定の腫瘍体積に到達する時間（閾値）を、閾値に到達する前の最後の測定と次の測定との間に補間することにより計算する。補間は、ｌｏｇ１０（体積）対時間を用いる線形である。動物が閾値に決して到達しない場合、その横断時間は、「＞Ｔ」（ここでＴはその動物について測定される最後の日である）と報告される。それらの横断時間は、ワイブル分布を用いる右側打ち切り（ｒｉｇｈｔ−ｃｅｎｓｏｒｉｎｇ）で「時間−事象」データとして解析される。平均および標準偏差を、各処置群について決定する。腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）は、処置群とビヒクル対照群との間の平均横断時間の差である。Ｔ検定を、ワイブル解析から平均および標準偏差を用いて実施する。体重を毒性の一般的測定として得る。
【０１７３】
上記のプロトコルに実質的に従って、実施例１６の化合物は、表３に示されるそれらのモデルにおいて抗腫瘍活性を実証し、従って、実施例１６の化合物が、広範囲のＲｂ＋腫瘍に対して有効なインビボ活性を有することを実証する。
【０１７４】
さらに、ＡＭＬ ＭＶ４−１１異種移植片において、腫瘍退縮が、実施例１６の化合物のプロアポトーシスＰｉｍ−１阻害活性の指標である、１００ｍｇ／Ｋｇ（ｍｐｋ）の用量にて観測される。表４を参照のこと。
【０１７５】
表３．異なるヒト異種移植片モデルにおける腫瘍増殖遅延
【０１７６】
【表２０】
【０１７７】
表４．ＭＶ４−１１モデルにおける実施例１６の化合物の抗腫瘍活性
【０１７８】
【表２１】
【０１７９】
同所性脳異種移植片モデル
インビボでの脳腫瘍モデル：体重２２５〜３００ｇのオスのＮＩＨ−ＲＮＵラットを、イソフルランで麻酔し、定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）に置いた。正中切開を行い、１ｍｍの穿頭孔を、正中線から２ｍｍ側方で、冠状縫合の３ｍｍ前方に開けた。１０μＬ（ｑｄ投与について５×１０５細胞およびｑ２ｄ投与について１×１０６細胞）中の５×１０５個のＵ８７ ＭＧヒト膠芽腫瘍細胞（Ｅａｒｌｅ塩、Ｌ−グルタミンおよび非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％のＦＢＳを含むイーグルＭＥＭで増殖させた）の細胞懸濁液を、さらに１分間、逆流を防止するために所定の位置に置かれているシリンジを用いて、定位に取り付けたシリンジポンプ（Ｎａｎｏ−Ｉｎｊｅｃｔｏｒ、モデル＃５３３１０およびＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ａｄａｐｔｅｒ Ｃｌａｍｐ、パート＃５１６８１、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ）を用いて約２分間にわたって２５または５０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって３ｍｍの深さで注射し、シリンジをゆっくりと引き抜く。穴を骨ろうで密封し、手術領域を食塩水で洗浄し、切開を縫合または創傷クリップで閉じた。
【０１８０】
試験化合物を、ビヒクル（精製水中の１％ｗ／ｖのヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ｖ／ｖのポリソルベート８０／０．０５％ｖ／ｖの消泡剤）で製剤化し、２０、４０および８０ｍｐｋ（ｑｄｘ２１）にて２１日間毎日投与し、腫瘍移植後４日で８０ｍｐｋ ｑ２ｄｘ１０を開始する。
【０１８１】
一次結果の変数は生存である。死ぬまで動物を毎日モニターし、動物が瀕死状態の場合、獣医スタッフと相談して、腫瘍移植に対する方針に沿って、安楽死させる。運動障害および生体機能の制御などの潜在的な脳機能障害を最小化させるために、細胞を前頭葉に移植する。ヒトにおける前頭葉は、「無症候性（ｓｉｌｅｎｔ）」と言われており、頭痛、吐き気、嘔吐、および認知障害を含む症状を最も一般的に表す。従って、病的状態は、昏睡状態および体重損失として明らかになる可能性が高い。生存データは、ＪＭＰ ｖ６．０．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いる平均生存分析についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により分析される。
【０１８２】
上記のプロトコルに実質的に従って、実施例１６の化合物は、以下の用量；４０ｍｐｋ ｑｄ、８０ｍｐｋ ｑｄおよび８０ｍｐｋ ｑ２ｄにて平均生存（ビヒクル処置した動物と比較した場合）において統計的に有意な増加を生じたので（表５を参照のこと）、実施例１６の化合物が、血液脳関門を横断し、同所性膠芽腫瘍異種移植片モデルにおいて有効なインビボ阻害活性を有し得ることが実証される。
【０１８３】
表５：実施例１６の化合物の投与から生じる平均生存および生存期間中央値（日数）
【０１８４】
【表２２】
【０１８５】
別の実験において、化合物の血漿および脳への曝露レベルを決定するために、腫瘍を保持していないオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、単回用量の実施例１６の化合物を３０ｍｇ／ｋｇにて経口投与する。血漿および脳の濃度を決定するために４８時間にわたって試料を得る。動物を屠殺し、心穿刺により全血を回収し、遠心分離により血漿を単離する。全脳を回収し、液体窒素中で即座に凍結する。
【０１８６】
脳の試料を、８０％メタノール／２０％Ｈ２Ｏ中で均質化することにより調製する。アセトニトリル／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中の内部標準化合物を、血漿または脳ホモジネートの試料に加えてタンパク質を沈殿させ、試料を分析前に遠心分離する。上清を、注入およびＪａｖｅｌｉｎ Ｂｅｔａｓｉｌ Ｃ１８カラム（２０×２．１ｍｍカートリッジ、移動相Ａ：水／１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、２０００：１０ｖ／ｖ、移動相Ｂ：ＭｅＯＨ／１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、２０００：１０ｖ／ｖ）で急速勾配溶離により分析する。溶離した検体を、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００トリプル四重極質量分析計を用いてＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析により検出する。血漿または脳中の化合物の濃度を同一の条件下で調製した標準物から決定する。
【０１８７】
血漿および脳の濃度を、この研究において各時点での３匹のラットの群から決定し（表６ａおよび６ｂを参照のこと）、０〜４８時間、血漿濃度／時間曲線または脳濃度／時間曲線下の領域を計算するために使用する。曲線（ＡＵＣ）または最大血漿および脳濃度（Ｃｍａｘ）（表６ｃを参照のこと）下のいずれかの領域を用いて脳における曝露の割合の試験により、化合物が約１の脳／血漿比で脳内に十分に分布することが実証される。最大濃度（Ｔｍａｘ）は４時間で検出される。これらの実験により、実施例１６の化合物がまた、血液脳関門を横断でき、脳内に十分に分布することが実証される。対照的に、本発明は、国際公開第０３／０６２２３６号からの好ましい化合物、（６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）が、同じアッセイにおいて、０．１７（ＡＵＣ）と０．１（Ｃｍａｘ）の脳：血漿の分布比を示すことを実証しており、これは、その化合物がこのモデルにおいて脳組織内に比較的不十分に分布することを示している。
【０１８８】
表６ａ：オスのＳＤラットにおいて決定される実施例１６の化合物の血漿濃度（ｎｇ／ｍＬ）
【０１８９】
【表２３】
【０１９０】
表６ｂ：オスのＳＤラットにおいて決定される実施例１６の化合物の脳濃度（ｎｇ／ｇ）
【０１９１】
【表２４】
【０１９２】
表６ｃ：オスのＳＤラットにおいて決定される血漿および脳における実施例１６の化合物に対する平均曝露
【０１９３】
【表２５】
【０１９４】
テモゾロマイドを用いる併用研究
Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植片を増殖させ、前記のとおり測定する。実施例１６の化合物を製剤化し、前記のとおり投与し、１１〜３１日、１日に１回、経口投与する。テモゾロマイド（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、精製水中の１％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ｖ／ｖポリソルベート８０で製剤化し、１１日と１８日目に腹腔内注射により投与する。テモゾロマイドの単一の薬剤活性と実施例１６の化合物を用いる併用治療との比較を表７に示す。腫瘍増殖を、２元相互作用分析により分析する；ｌｏｇに変換された腫瘍体積を、ＳＡＳ、バージョン９．１（Ｃａｒｙ、ＮＣ）における空間電力相関モデルを使用する反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。２×２因子構造を、２つの治療群の間の治療効果および相互作用効果を評価するために使用した。相互作用効果を、全ての時間点（「全体」試験）および各時間点にわたって試験した。テモゾロマイド単独を受容しているものと比べて併用群で見られる腫瘍増殖の増加した阻害により、テモゾロマイドおよび実施例１６の化合物が、皮下膠芽細胞腫異種移植片モデルの組み合わせにおいて有効なインビボ抗腫瘍活性を実証することが示される。
【０１９５】
表７：実施例１６の化合物とテモゾロマイドとのＵ８７−ＭＧ異種移植片の併用研究
【０１９６】
【表２６】
【０１９７】
Ｕ８７ＭＧ同所性脳異種移植片を増殖させ、前記のとおり生存を測定する。動物群を、テモゾロマイド（ｔｅｍｏｌｏｚｏｍｉｄｅ）（ＴＭＺ）、または実施例１６（毎日または一日おきに投与）とテモゾロマイドとの組み合わせで治療する。表８に示すように、テモゾロマイド単独を受容したものと比べて併用群における平均生存の増加により、テモゾロマイドおよび実施例１６の化合物が、同所性膠芽細胞腫異種移植片モデルの組み合わせにおいて有効なインビボ阻害活性を有することが示される。併用治療について死亡および体重損失がないこと（表９を参照のこと）により、それらが十分に許容され、重複する毒性がないことが示される。
【０１９８】
表８：テモゾロマイドと組み合わせた実施例１６の化合物の投与から生じる平均生存および生存期間中央値（日数）
【０１９９】
【表２７】
【０２００】
表９：テモゾロマイド／実施例１６の化合物の研究からの動物の死亡率および体重
【０２０１】
【表２８】
【０２０２】
ゲムシタビンとの併用研究
Ｃａｌｕ−６（肺）皮下異種移植片を増殖させ、前記のとおり測定する。ゲムシタビンを生理食塩水（精製水中の０．９％塩化ナトリウム）中で製剤化し、腹腔内注射によりｑ３ｄｘ７で投与する。試験化合物はｑｄｘ２１で投与する。ゲムシタビンの単一薬剤活性と、ゲムシタビンと実施例１６の化合物の両方を含む併用治療との比較を表１０に示す。腫瘍増殖を２元相互作用分析により分析する。ゲムシタビンを受容するものと比較して併用群に見られる腫瘍増殖の高い阻害により、この薬物が、皮下肺癌異種移植片モデルの組み合わせにおいて有効なインビボ抗腫瘍活性を実証することが示される。併用治療についての死亡率および体重損失の低い発生率により、それらが十分に許容されることが示され、毒性を重複しないことが示唆される（表１１を参照のこと）。
【０２０３】
表１０：実施例１６の化合物とゲムシタビンとのＣａｌｕ−６異種移植片の併用研究
【０２０４】
【表２９】
【０２０５】
表１１：ゲムシタビン／実施例１６の化合物からの動物の死亡率および体重の研究
【０２０６】
【表３０】
【０２０７】
本発明の化合物の経口投与が好ましい。本発明の化合物の静脈内投与もまた、好ましい。状況に応じて、他の投与経路が使用されてもよく、またはさらに好ましい。例えば、経皮投与が、経口医薬を摂取することを忘れやすいか、または経口医薬を摂取することにいらいらする患者に非常に望ましい場合もある。本発明の化合物はまた、特定の状況において経皮、筋肉内、鼻腔内または直腸内経路により投与されてもよい。投与経路は、薬物の物理特性、患者および介護士の利便性、および他の関連状況により制限され、如何なる方法で変更されてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキルまたはシクロプロピル−メチルであり；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたはフッ素であり、Ｒ２またはＲ３のうち少なくとも１つは、フッ素であり；
Ｒ４は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、式中、Ｒ６およびＲ７は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｑは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓまたは直接結合であり；
ＷおよびＹは、ＣまたはＮであり、ここで、ＷまたはＹのうち少なくとも１つは、Ｎであり、ＱがＯまたはＳである場合、ＷはＣである）
またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項２】
Ｒ１は、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロプロピル−メチルである、請求項１に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項３】
Ｒ１は、イソプロピルである、請求項２に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３はそれぞれ、フッ素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項５】
Ｒ４はＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項６】
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項７】
Ｒ５は、−ＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ、エチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項８】
Ｑは、ＣＨ２または直接結合である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項９】
ＱはＣＨ２である、請求項８に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１０】
Ｙは、Ｎである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１１】
Ｗは、Ｎである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１２】
下式：
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１３】
下式：
【化８】
である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１４】
メシラート塩である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
２１．２９（２θ±０．１°）におけるピーク、ならびに、１１．５４、１０．９１、および１２．１３（２θ±０．１°）を含む群から任意に選択される１つ以上のピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα放射線、λ＝１．５４０５６Å）により特徴付けられる、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶。
【請求項１６】
１１２．７、１２７．３および１２９．４における化学シフトピークν（Ｆ１）［ｐｐｍ］を含む１３Ｃ ＮＭＲスペクトルによりさらに特徴付けられる、請求項１５に記載の［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩、および製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項１８】
治療における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１９】
結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される癌の処置における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項２０】
哺乳動物における結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される癌を処置する方法であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩を、そのような処置を必要とする動物に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキルまたはシクロプロピル−メチルであり；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたはフッ素であり、Ｒ２またはＲ３のうち少なくとも１つは、フッ素であり；
Ｒ４は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは−ＮＲ６Ｒ７であり、式中、Ｒ６およびＲ７は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｑは、ＣＨ２、Ｏ、Ｓまたは直接結合であり；
ＷおよびＹは、ＣまたはＮであり、ここで、ＷまたはＹのうち少なくとも１つは、Ｎであり、ＱがＯまたはＳである場合、ＷはＣである）
またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項２】
Ｒ１は、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロプロピル−メチルである、請求項１に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項３】
Ｒ１は、イソプロピルである、請求項２に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３はそれぞれ、フッ素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項５】
Ｒ４はＨである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項６】
Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項７】
Ｒ５は、−ＮＲ６Ｒ７であり、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ、エチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項８】
Ｑは、ＣＨ２または直接結合である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項９】
ＱはＣＨ２である、請求項８に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１０】
Ｙは、Ｎである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１１】
Ｗは、Ｎである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１２】
下式：
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１３】
下式：
【化８】
である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１４】
メシラート塩である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
２１．２９（２θ±０．１°）におけるピーク、ならびに、１１．５４、１０．９１、および１２．１３（２θ±０．１°）を含む群から任意に選択される１つ以上のピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα放射線、λ＝１．５４０５６Å）により特徴付けられる、［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶。
【請求項１６】
１１２．７、１２７．３および１２９．４における化学シフトピークν（Ｆ１）［ｐｐｍ］を含む１３Ｃ ＮＭＲスペクトルによりさらに特徴付けられる、請求項１５に記載の［５−（４−エチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−［５−フルオロ−４−（７−フルオロ−３−イソプロピル−２−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル）−ピリミジン−２−イル］−アミンIII型結晶。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩、および製薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬製剤。
【請求項１８】
治療における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項１９】
結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される癌の処置における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩。
【請求項２０】
哺乳動物における結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される癌を処置する方法であって、有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬的に許容し得る塩を、そのような処置を必要とする動物に投与することを含んでなる、方法。
【公表番号】特表２０１２−５１３３９６（Ｐ２０１２−５１３３９６Ａ）
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２３３５（Ｐ２０１１−５４２３３５）
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８０３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５０７４
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８０３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５０７４
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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