タンパク質
【課題】新規キシラナーゼの生地への使用法を提供する。
【解決手段】（ａ）小麦粉におけるキシラナーゼ阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼを選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼの適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ、及び／又は適量のキシラナーゼを小麦粉に添加する方法。パン製品の製造過程で、適正量のキシラナーゼを使用することにより、生地系（通常、塩、小麦粉、酵母、及び水からなる）がより安定することが知られており、例えばパン嵩が増したふっくらとしたパンを製造することができる。
【解決手段】（ａ）小麦粉におけるキシラナーゼ阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼを選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼの適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ、及び／又は適量のキシラナーゼを小麦粉に添加する方法。パン製品の製造過程で、適正量のキシラナーゼを使用することにより、生地系（通常、塩、小麦粉、酵母、及び水からなる）がより安定することが知られており、例えばパン嵩が増したふっくらとしたパンを製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質に関する。特に本発明は、小麦粉に含まれる内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の単離に関し、また該阻害剤が種々のキシラナーゼに及ぼす効果を特徴化することに関する。本発明はさらに、該阻害剤を用いたスクリーニングにより同定されたキシラナーゼ、及びかかるスクリーニングにより同定された新規のキシラナーゼに関する。
【０００２】
［従来の技術］
キシラナーゼは、ここ数年製パンに使用されてきた。このことに関しては、小麦粉には内胚乳細胞壁由来のアラビノキシランが含まれていることが知られている。小麦粉に含まれるアラビノキシランの量は小麦粉の種類によって異なり、Rouau et al, Journal of Cereal Science, (1994), 19, 259-272, Effect of an Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the Bread-making Quality of Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties、Fincher and Stone, (1986) Advances in Cereal Technology, Vol. VIII (Why Pomeranz, Ed.) AACC, St.Paul, Minnesota, 207-295、及びMeuser and Suckow (1986), Chemistry and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P J Frasier and T Gillard, Eds.) Royal Society of Chemistry, London, 42-61が、文献例として挙げられる。一般的にアラビノキシラン量は、２〜５％（小麦粉乾燥量に基づく（ｗ／ｗ））である。
【０００３】
Fincher and Stone(1986)は、内胚乳細胞壁における多糖類の７０％はアラビノキシランであると報告している。アラビノキシランの特徴は、水への結合力である。アラビノキシランの一部分は不溶性ペントサン（ＷＩＰ）であり、また一部分は水溶性ペントサン（ＷＳＰ）である。ＷＩＰの高分子量（ＨＭＷ）水溶性重合体への分解と、パン嵩との間に相関関係があることが実験結果から明らかにされている。
【０００４】
パン製品の製造過程で、適正量のキシラナーゼを使用することにより、生地系（通常、塩、小麦粉、酵母、及び水からなる）がより安定することが知られており、例えばパン嵩が増したふっくらとしたパンを製造することができる。
この点に関し、パン嵩を増すために良好なキシラナーゼとは、ＷＩＰを可溶化し、ＷＳＰをキシロースオリゴマーまで分解することなく生地液の粘度を増加させるものをいう。ＷＩＰが低分子量（ＬＭＷ）ＷＳＰに分解されると、生地が損なわれ、粘度増加につながると考えられている（Rouau et al and McCleary (1986) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349-354）。
【０００５】
米国特許５３０６６３３号明細書には、Bacillus subtilis株から得たキシラナーゼが開示されている。かかるキシラナーゼは、該キシラナーゼを含むパン及び焼き製品のコンシステンシーを改良し、嵩の増量に寄与すると考えられている。
Bacillus subtilisからはこの他にもキシラナーゼが単離され、配列決定がなされている（Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. and Yaguchi, M. A xylanasse gene from Bacillus subtilis: nucleotide sequence and comparison with B. pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201-206 (1986)を参照のこと）。
細菌性キシラナーゼを使用すると、非常に粘度の高い生地になると考えられてきた。そのため、Bacillus subtilis由来のキシラナーゼ（例えば米国特許５３０６６３３号明細書に開示された）を用いると非常に粘度の高い生地になると考えられていた。
【０００６】
粘度増加の原因となる先行技術における酵素は、粘度が逆に効率的大量生産上の取扱いを困難にさせることがないように、その使用量を注意深く調整する必要がある。しかし使用量を注意深く調整しなければならないということは、生地製造の前にキシラナーゼを直接小麦粉に加えることができないことを意味する。従って、先行技術によるシステムでは、生地製造過程において極めて注意深くキシラナーゼを加えなければならなかった。
【０００７】
真菌性キシラナーゼは、今日に至るまでベーキングに一般的に用いられてきた。例えばJ Maat et al.（Xylans and xylanases, J Visser et al著, 349-360, Xylanases and their application in bakery）は、Aspergillus niger var. awarmori株から産生されるβ−１，４−キシラナーゼについて教示している。J Maat et al.らによると、かかる真菌性キシラナーゼは、明らかにパン嵩増量に効果的であり、他の種類の真菌、又は細菌由来のキシラナーゼを用いるときにみられるような生地取扱い上の不利益（生地の粘度）を生じることなく、パン嵩を増量できると述べている。
【０００８】
W Debyser et al.,（J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 153-156, 1997, Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt: Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat）は、キシラナーゼ阻害剤が小麦粉に含まれている可能性について言及している。W Debyser et al.が論じている該阻害剤は単離されていない。さらにW Debyser et al.は、該阻害剤が内因性であるか又は微生物由来であるかについても言及していない上に、かかる阻害剤に関する化学的データも全く提示していない。
【０００９】
キシラナーゼ阻害剤の小麦粉における存在については近年X Rouau and A Surget, （Journal of Cereal Science, 28 (1998) 63-70, Evidence for the Presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours）も論じている。Debyser et al.,と同様に、Rouau and Surgetも、小麦粉の水溶性画分における、添加ペントサナーゼ活性を抑制する熱不安定性成分の存在を同定したと考察しているが、Debyser et al.,と同様に、阻害剤を単離しておらず、該阻害剤が内因性であるかあるいは細菌由来であるかについての結論を導き得なかった。かかる阻害剤に関する化学的データを提示していない点についてもDebyser et al.,と同様である。
【００１０】
【非特許文献１】Rouau et al, Journal of Cereal Science, (1994), 19, 259-272, Effect of an Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the Bread-making Quality of Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties
【非特許文献２】Fincher and Stone, (1986) Advances in Cereal Technology, Vol. VIII (Why Pomeranz, Ed.) AACC, St.Paul, Minnesota, 207-295
【非特許文献３】Meuser and Suckow (1986), Chemistry and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P J Frasier and T Gillard, Eds.) Royal Society of Chemistry, London, 42-61
【非特許文献４】Rouau et al and McCleary (1986) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349-354
【非特許文献５】Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. and Yaguchi, M. A xylanasse gene from Bacillus subtilis: nucleotide sequence and comparison with B. pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201-206 (1986)
【非特許文献６】J Maat et al.（Xylans and xylanases, J Visser et al著, 349-360, Xylanases and their application in bakery）
【非特許文献７】W Debyser et al., J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 153-156, 1997, Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt: Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat
【非特許文献８】X Rouau and A Surget, Journal of Cereal Science, 28 (1998) 63-70, Evidence for the Presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours
【特許文献１】米国特許５３０６６３３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、当該技術が抱える課題は、取扱い上の不利な性質を有さない生地からの焼き製品の生産方法に関するものであり、より詳細には、低粘度の生地（取扱い及び製造過程において問題となるほど粘度が高くない生地）をいかに提供するかということにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、かかる課題を解決する目的でなされたものであり、本発明の内容は請求項及び以下の記述に示される。簡潔に述べると本発明は、
１．内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤、該阻害剤をコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにそれらの変異体、相同物又は断片
２．β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が、種々のキシラナーゼにもたらす効果を測定するアッセイ方法
３．種々のキシラナーゼが、生地にもたらす効果を測定するアッセイ方法
４．グルカナーゼ（類）が、種々のキシラナーゼ含有生地にもたらす効果を測定するアッセイ方法
５．新規のキシラナーゼ類、該新規キシラナーゼ類をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列、並びにそれらの変異体、相同物又は断片
６．キシラナーゼの新規な使用法
７．種々のキシラナーゼを用いて生産した食品に関するものである。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のヌクレオチド配列には、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る構築物、本発明の配列を含むか若しくは発現し得るベクター、本発明の配列を含むか若しくは発現し得るプラスミド、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る組織、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る器官、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る形質転換宿主、及び本発明の配列を含むか若しくは発現し得る形質転換生物が含まれる。本発明はまた、本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法、例えば、上記配列を転移させる方法を含め、微生物において発現させる方法に関する。
【００１４】
本発明はＷＯ−Ａ−９８／４９２７８の教示とは異なる。なぜならかかるＰＣＴ特許出願においては、開示しているタンパク性阻害剤の配列に関する情報が最小限のものでしかないからである。
本発明の詳細について、以下に適当な見出しをつけて説明する。便宜上本発明に関し、一般的に応用可能な教示については、「一般的定義」及び「一般的教示」としたセクションにおいて述べたが、各セクションにおける教示は必ずしもそのセクションの内容に限定されるものではない。
【００１５】
（一般的定義）
ここで使用する「小麦粉」なる用語は、小麦を細かくひいた粗挽き粉と同義語である。しかし好ましくは、該用語は、小麦自体から得た小麦粉を意味し、他種の穀類から得たものを意味しない。よって、特に限定しないときには、ここで使う「小麦粉」とは、生地等の媒体中に含まれる小麦粉同様、小麦粉自体を意味することが好ましい。
「キシラナーゼ」なる用語は、その通常の意味で使われる。すなわち、小麦に含まれると考えられるアラビノキシランの脱重合をそれ自体で触媒し得る酵素（すなわち、該酵素自体がＷＩＰの可溶化の触媒能を有し、小麦に含まれるＷＳＰの脱重合の触媒能を有する酵素）のことである。
エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性を測定するアッセイに関しては後述する。便宜上かかるアッセイを「キシラナーゼアッセイ」と呼ぶ。
【００１６】
本発明において、「ヌクレオチド配列」なる用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ（すなわち、組換えＤＮＡ技術により調製したＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡ、さらにこれらの組み合わせを含む。
好ましくは「ヌクレオチド配列」なる用語はＤＮＡを意味する。
本発明のヌクレオチド配列は、一本鎖又は二本鎖のどちらでもよい。
本発明のヌクレオチド配列には、合成又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。当該技術分野において、オリゴヌクレオチドに対する修飾方法は、数多く知られている。かかる修飾方法には、分子の３'及び／又は５'側においてアクリジン又はポリリジン鎖を付加するメチルホスホネート(methylphosphonate)及びホスホロチオエート(phosphorothioate)をバックボーンとするものが含まれる。本発明の目的に鑑みて、本発明におけるヌクレオチド配列は当該技術分野のいかなる手法によって修飾してもよいと理解すべきである。本発明のヌクレオチド配列のインビボでの活性増強又は長期生存をはかるために、このような修飾が行われるのである。
【００１７】
本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列について、「変異体」又は「相同物」なる用語は、それら配列の対立変異と同義語である。
特に、ここで使われる「相同性（homology）」とは「同一性（identity）」と同じ意味と解釈してよい。ここにいう本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列における配列の相同性は、１又は２以上の配列を別の配列と比較して、その別の配列が、元の配列と少なくとも７５％一致しているかどうかをみるという、単に「目測（eyeball）」による比較（厳密な比較のこと）を行うことによって決定できる。相対的な配列の相同性（すなわち配列の同一性）は、２又は３以上の配列間における相同性割合（％）を計算する市販のコンピュータープログラムを用いて決定することも可能である。かかるコンピュータープログラムの主な例としてCLUSTALが挙げられる。
【００１８】
相同性は、目視により比較可能である。しかし、容易に入手できる配列比較プログラムによる比較が、より一般的である。かかる市販のコンピュータープログラムにより、２又は３以上の配列間における相同割合が計算できる。
近接した配列間の相同割合を計算することもできる。すなわち、ある配列が別の配列と一直線上に並び、そのある配列における各アミノ酸と、もう一方の配列においてそれぞれ対応しているアミノ酸とを一残基毎に直接比較することもできる。これを「アンギャップ」アラインメント（alignment）と呼ばれ、このようなアンギャップアラインメントは、残基数が比較的少ない場合に行われる（例えば５０個未満の近接したアミノ酸）。
【００１９】
かかる方法は、極めて簡便かつ堅実な方法ではあるが、例えば、本来は互いに同一な配列であっても、挿入又は欠失が１個でも生じれば、以下に続くアミノ酸残基がアラインメントからはみ出すことになり、従ってこの方法をアラインメント全体に行うときには相同割合が大きく低下する可能性があることを考慮する必要がある。そのため殆どの配列比較法は、全体としての相同割合を過度に損なわない程度の挿入及び欠失を考慮した最適アラインメントを作出するようにデザインされている。このことは、局所的相同性を最大化するために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより達成できる。
【００２０】
しかしながら、上述のより複雑な方法では、アラインメントに生じるギャップの各々に「ギャップペナルティー」を割り当てており、そのため同一アミノ酸の数が同じ場合には、できるだけギャップが少ない配列アラインメントの方が（比較する二配列間の高い相関性を反映して）、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られる。ギャップの存在には比較的高コストを課し、該ギャップにおいて次に現れる各残基には少ないペナルティーを課す「アフィンギャップコスト」が一般的に用いられている。これは、最もよく使用されるギャップ評価システムである。ギャップの高ペナルティーにより、少ないギャップで最適なアラインメントを作製できることはいうまでもない。殆どのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーの修飾が可能である。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウエアを使用する際には、デフォールト値を用いることが好ましい。例えば、後述するGCG Wisconsin Bestfit packageを使用するとき、アミノ酸配列に対するデフォールトギャップペナルティーは、ギャップについて−１２で、各伸張部分について−４である。
【００２１】
従って、相同性の最大値（％）を算出するには、ギャップペナルティーを考慮しつつ、先ず最適アラインメントを作出することが必要とされる。かかるアラインメントを実行するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfit package（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を実施できるソフトウエアとしては、この他に、例えば、BLAST package（Ausubel et al., 1999 (Chapter 18)を参照のこと）、FASTA（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）、及びGENEWORKS suite of comparison toolsを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。BLAST及びFASTAでは、オフライン及びオンラインによるサーチが可能である（Ausubel et al., 1999, 7-58〜7-60頁を参照のこと）。しかし、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。
【００２２】
相同性の最終的な割合（％）は、同一性の観点から測定できるが、アラインメントプロセス自体は通常、オールオアナッシング式の二者比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性又は進化論的距離に基づく各ペアの比較評価を行う目盛りのついた類似性評価マトリックスが一般的に用いられる。かようなマトリックスのうち汎用されているものの一例としては、プログラムのBLAST suiteのデフォールトマトリックスであるBLOSUM62マトリックスが挙げられる。GCG Wisconsinプログラムでは、公知のデフォールト値、又は、もし供給されていれば特別仕様のシンボル比較表のどちらかを使用するのが一般的である（詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。GCGパッケージには公知のデフォールト値、その他のソフトウエアにはBLOSUM62等のデフォールトマトリックスを使用することが好ましい。一旦ソフトウエアが最適アラインメントを作出すると、相同割合（％）、好ましくは配列の同一割合（％）の計算が可能になる。ソフトウエアは通常、配列比較の一端としてかかる計算をし、数字で結果が出る。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで入手でき、デフォールトパラメーターを使う簡便なBLASTサーチアルゴリズムによって配列比較を行うことが好ましい。
【００２３】
また本発明には、本発明のヌクレオチド配列の相補配列、その派生物、断片又はその派生物も含まれる。配列が、その断片と相補的であれば、他の生物等における類似のコード配列を同定するプローブとして、該配列を用いることができる。本発明にはまた、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、並びにその派生物、断片又はその派生物も含まれる。本発明のヌクレオチド配列の相補配列、その派生物、断片又はその派生物とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、並びにその派生物、断片又はその派生物も本発明に含まれる。「相補」なる用語は、コード配列のヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列も包含している。
【００２４】
「変異体」なる用語は、ここに示すヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の相補配列も包含している。「変異体」なる用語は、ストリンジェントな条件（６５℃で０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｎａ3クエン酸塩ｐＨ７．０｝）において、ここに示すヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有する配列の相補配列を包含している。
【００２５】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（相補配列を含む）とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列や、本発明のヌクレオチド配列（ここに示す相補配列を含む）とハイブリダイズ可能な配列の相補ヌクレオチド配列に関する。ここで「ハイブリダイゼーション」なる用語は、Dieffenbach CW and GS Dveksler （1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）記載のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術により行う増幅プロセス同様、「核酸の鎖が、塩基ペアリングにより相補鎖と結合するプロセス」（Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）を含む。
【００２６】
本発明の範囲には、中程度ないし最大限のストリンジェンシーにおいて、ここに示すヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有するポリヌクレオチド配列もまた含まれる。Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)が教示しているように、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の溶解温度（Ｔｍ）に基づいており、それにより後述の明確な「ストリンジェンシー」が決まる。
【００２７】
最高にストリンジェントな条件は、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で生じる。Ｔｍ−５℃〜１０℃で高度のストリンジェンシーが生じる。Ｔｍ−１０℃〜２０℃で中間ストリンジェンシーが生じる。Ｔｍ−２０℃〜２５℃で緩やかなストリンジェンシーが生じる。当該技術の専門家であれば理解するところであるが、最高にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、同一ポリヌクレオチド配列を同定、若しくは検出するときに行い、一方、中間（又は緩やかな）ストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションは、類似、若しくは関連ポリヌクレオチド配列を同定、若しくは検出するときに行う。
本発明は、好ましくは、本発明のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下（６５℃で０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含んでいる。
【００２８】
（内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤）
本発明の目的の一つは、小麦粉から得られる内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を提供することであり、本発明者らの研究の結果、かかる阻害剤は分子量約４０ｋＤａ（ＳＤＳ又はＭＳで測定）のジ−ペプチド（di-peptide）であり、そのｐｌは、約８〜約９．５であることを見い出した。本発明において該阻害剤は、単離した形態及び／又は実質的に純粋な形態にあるものをいい、ここで「単離した」とは、該阻害剤が天然の環境下にはないことを意味する。
【００２９】
現在までの配列解析によって、上記阻害剤が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内、少なくとも１又は２以上の配列をもつことが解明されている。このように本発明は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９、並びにそれらの変異体、相同物、又は断片の内、少なくとも１又は２以上の配列をもつエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を包含している。
【００３０】
本発明の阻害剤に関して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果生じたアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内少なくとも１又は２以上の配列を含む阻害剤と、好ましくは少なくとも同程度の活性を有するキシラナーゼ阻害活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られる阻害剤にキシラナーゼ阻害活性が、好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内少なくとも１又は２以上の配列を有する阻害剤と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列の相同性（配列の類似性又は配列の同一性）に関しては、添付の配列リストに示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有することが望ましい。とりわけ、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９８％の相同性を有することが望ましい。阻害剤の想定される変異体としては、現在のところ、配列番号１及び配列番号２として示される少なくとも１以上の配列を有するものを例示することができる。
【００３１】
本発明の阻害剤は、多くの理由から有用である。例えば、内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の化学的な同定が公知である今日においては、研究者らは、例えば小麦に存在する該阻害剤を定量できるのである。便宜上、この方法を「阻害剤含有量測定法（Inhibitor Amount Determination Method）」と呼ぶことにする。かかる阻害剤含有量測定法により研究者らは、小麦に添加するのに適したキシラナーゼを１又は２種以上選択できるようになり、及び／又は小麦に添加する１又は２以上のキシラナーゼ類の適量を選択できるようになった。
【００３２】
すなわち本発明は、（ａ）小麦粉における阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼを選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼの適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ、及び／又は適量のキシラナーゼを小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３３】
また本発明は、（ａ）小麦粉における阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼ阻害剤を選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼ阻害剤の適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ阻害剤、及び／又は適量のキシラナーゼ阻害剤を小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３４】
本発明はまた、（ａ）小麦粉に含まれる阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼ、及び適したキシラナーゼ阻害剤を選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼ阻害剤の適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ及び適正なキシラナーゼ阻害剤、及び／又は適量のキシラナーゼ阻害剤を小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３５】
阻害剤の含有量は、固体状態のＮＭＲ分光分析等の標準的な化学的な手法により測定できる。阻害剤の含有量は、該阻害剤が有害作用をもたらすことが知られているキシラナーゼ酵素を使っても測定できる。かかる方法では、小麦粉を試料とし、かかるキシラナーゼの所定量を添加することも可能である。一定時間後にキシラナーゼ活性を測定し、その活性測定結果と小麦粉の阻害剤含有量との相関関係から含有量を決定できる。よって本発明はまた、小麦粉試料中に含まれる阻害剤の量をキャリブレーションし、及び／又は測定する手段として、キシラナーゼとその阻害剤を組み合わせて使用することも含むものである。
【００３６】
本発明の阻害剤の存在を確認するために、かかる阻害剤に対する抗体を用いて小麦粉試料のスクリーニングを行うことができる。かかる抗体は、小麦粉試料に含まれる阻害剤を単離することにも利用できる。
【００３７】
（種々のキシラナーゼ類に対しβ−１，４−キシラナーゼ阻害剤が及ぼす効果を測定するアッセイ方法）
本発明の阻害剤にはさらに有用な使用法がある。この点に関し、阻害剤によって損なわれるキシラナーゼを同定するアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害剤を用いることができる。例えばある条件下では、阻害剤に対して低耐性（つまり、あまり耐性のない）を有するキシラナーゼをスクリーニングすることが好ましく、ある場合においては、阻害剤に対して、並（中程度）の耐性（つまり、程々に耐性のある）を有するキシラナーゼを同定するためのアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害剤を用いることができ、また他の場合においては、阻害剤に対して高耐性を示すキシラナーゼを同定するためのアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害剤を用いることができる。阻害剤による阻害の程度を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「阻害剤アッセイプロトコール」と呼ぶこととする。
【００３８】
このように本発明は、キシラナーゼ阻害剤に対し、キシラナーゼが示す耐性の程度の測定方法を提供するものであって、かかる方法には、（ａ）目的のキシラナーゼをその阻害剤と接触せしめ、（ｂ）かかる阻害剤が、目的のキシラナーゼ活性を阻害するか否かを測定することが含まれる。便宜上、かかる方法を「阻害剤アッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００３９】
ここで「耐性」なる用語は、阻害剤によって、キシラナーゼ活性が完全には阻害されないことを意味する。換言すれば、阻害剤によって損なわれることのないキシラナーゼ類を同定するアッセイ／スクリーニングに、阻害剤を用いることが可能となるのである。よって、キシラナーゼ阻害剤に対応するキシラナーゼに関し、「耐性の程度」なる用語が意味するところは、キシラナーゼ阻害剤によるキシラナーゼ活性の非阻害の程度と同じ意味である。従って、キシラナーゼ阻害剤に高い耐性を示すキシラナーゼは、かかるキシラナーゼ阻害剤に対し、高度の非阻害を示すキシラナーゼと類似しているのである。
【００４０】
本発明はまた、（ａ）阻害剤アッセイ方法を行い、（ｂ）阻害剤に対し高度（又は中程度、又は低度）の耐性をもつキシラナーゼを１又は２種以上同定し、（ｃ）同定された１種以上のキシラナーゼを一定量調製するステップを含むプロセスを包含するものである。相応であると同定されたキシラナーゼは、食品製造、特に焼き製品製造用の生地に使用することができる。さらに、阻害剤に対しある程度の耐性をもつキシラナーゼ（他種のキシラナーゼに比べ阻害を受けにくいキシラナーゼ）を同定することにより、実用に際し、かかる同定されたキシラナーゼを、培地に少量添加するだけでこと足りるようになる。キシラナーゼの最終使用には、食品、タンパク質、及び澱粉製品、紙製品、及びパルププロセシング等のいずれかの１又は２以上の調製が含まれる。
【００４１】
従って、本発明にはさらに、（ａ）阻害剤アッセイ方法を実施し、（ｂ）阻害剤に対して高度（又は中程度、又は低度）の耐性をもつキシラナーゼを１種以上同定し、さらに（ｃ）同定されたキシラナーゼを１種以上含む生地を調製するステップを含むプロセスが包含される。
本発明に関する実験の過程において、バクテリア由来キシラナーゼの活性が完全には損なわれなかったという意味において、かかるキシラナーゼが阻害剤に対し耐性を示すことを見い出したのは驚くべきことである。
【００４２】
（種々のキシラナーゼが生地に及ぼす効果を測定するアッセイ方法）
阻害剤アッセイ方法によって適していると同定された細菌性キシラナーゼ類が、生地混合物に含まれていると、意外なことにその生地は、真菌性キシラナーゼを含む生地に比べ粘度が低くなることを見い出した。これらの結果は、先行文献の教示からは全く予想されなかったことである。よって本発明はさらに、焼き食品調製に用いるのに適した細菌性キシラナーゼ又はそれらの変異体を同定する方法を提供するものである。かかる方法には、（ａ）目的の細菌性キシラナーゼを、生地混合物に取り入れ、また真菌性キシラナーゼを含む類似の生地混合物に比べて該生地混合物の粘度が低い場合には、かかる細菌性キシラナーゼ又はそれらの変異体が焼き食品調製に用いるのに適していることになるので、（ｂ）該生地混合物の粘度を測定することが含まれる。便宜上、かかる方法を「粘度アッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００４３】
本発明はさらに、（ａ）粘度アッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに適した１種以上のキシラナーゼを同定し、（ｃ）同定された１種以上のキシラナーゼを一定量調製するステップを含むプロセスを提供するものである。生地の粘度を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「粘度プロトコール」と呼ぶこととする。本発明のキシラナーゼを含み、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地を、本発明では必要に応じて「非粘着性生地」と呼ぶこととする。
【００４４】
細菌性キシラナーゼを用いると、真菌性キシラナーゼを含む生地のように粘度のある生地にはならないという好ましい性質を有するとき、かかるキシラナーゼを、焼き製品を調製する生地等の食品の調製に用いることができる。このように本発明は、（ａ）粘度アッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに適した１種以上のキシラナーゼを同定し、さらに（ｃ）同定されたキシラナーゼを１種以上含む生地を調製するステップを含むプロセスを提供するものである。
【００４５】
（キシラナーゼを含む生地の生地特性に対してグルカナーゼ（類）が及ぼす効果を測定するアッセイ方法）
本発明に関する実験の過程において、本発明者らは、グルカナーゼ酵素がある程度存在するときにキシラナーゼ類が有害な影響を受けることも見い出した。よって、キシラナーゼ酵素を調製又は抽出するのに用いる培地等のキシラナーゼ調製物に、有害レベルのグルカナーゼ酵素が含まれないようにすることが大切である。さらに、キシラナーゼを含む食品を調製する際に使用する培地に、有害レベルのグルカナーゼ酵素が含まれないことが大切である。ここにいう「有害レベル」とは、グルカナーゼ酵素の有害な作用によってキシラナーゼの効果が相殺されてしまう程のグルカナーゼ量を意味する。
【００４６】
従って本発明はさらに、キシラナーゼ組成物（キシラナーゼ調製物等）、キシラナーゼを調製する培地、又は焼き食品調製に用いるのに適したキシラナーゼを添加する培地を同定するアッセイ方法を提供するものであり、かかる方法には、（ａ）目的のキシラナーゼを含む組成物、該キシラナーゼを調製する培地、又は該キシラナーゼを添加する培地を提供し、また、組成物又は培地に存在する活性グルカナーゼ酵素（類）が低レベルであれば、かかる組成物又は培地は焼き食品の調製に適していることになるので、（ｂ）かかる組成物又は培地に活性グルカナーゼ酵素（類）の存在を確認することを含む。便宜上、かかる方法を「グルカナーゼアッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００４７】
本発明はさらに、（ａ）グルカナーゼアッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに適した１種以上の組成物又は培地を同定し、また（ｃ）それら１種以上の同定された組成物又は培地を一定量調製するステップを含むプロセスを提供するものである。グルカナーゼ活性を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「グルカナーゼプロトコール」と呼ぶ。
【００４８】
キシラナーゼがもつ有用な効果が、好ましくない量のグルカナーゼ酵素の存在によって完全に損なわれることがないという意味において、かかる組成物又は培地が好ましい性質をもつとき、かかる組成物又は培地を、食品、好ましくは焼き製品製造用の生地の調製に用いることができる。よって本発明はさらに、（ａ）グルカナーゼアッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に適した１種以上の組成物又は培地を同定し、さらに（ｃ）１種以上の同定された組成物又は培地を含む生地を調製するステップを含むプロセスを包含するものである。このように本発明は、キシラナーゼ調製法を包含するものであって、かかるキシラナーゼ調製法は、実質的にグルカナーゼ酵素（類）非存在下にて行われる。
【００４９】
すなわちキシラナーゼ調製法は、存在すると考えられる少なくとも実質的に全てのグルカナーゼ酵素（類）を先ず除去し、ひいてはグルカナーゼ酵素（類）活性を抑制若しくは消失せしめる初期調製を行うことから始められる。これを達成する技術には、グルカナーゼ酵素（類）を認識し結合する抗体を用いることも含まれ、その場合はグルカナーゼ酵素（類）活性が不活化される。グルカナーゼ酵素（類）特異的抗体を支持体に結合することにより、初期調製物のパッセージがその結合抗体を通過し、その結果グルカナーゼ酵素（類）が上記初期調製物から除去され、実質的にグルカナーゼ酵素（類）を含まないキシラナーゼ調製物を得ることができる。別の実施例、さらには追加の実施例においても、グルカナーゼ酵素活性が最低限であるか、若しくは全くない宿主生物から キシラナーゼ調製物を得ることができることが示されている。この点で、宿主生物に存在するグルカナーゼ酵素活性は不活化されるといえる。他にも、グルカナーゼ遺伝子の発現が抑制され、及び／又は消失する例もある。これを達成する技術には、グルカナーゼコード配列のアンチセンス配列を使用することも含まれる。さらなる実施例においては、グルカナーゼ酵素の発現が全くみられないか若しくは極微量発現される宿主生物を使用している。
【００５０】
（Ｋiアッセイ）
キシラナーゼのＫi値測定（ここでは「Ｋiアッセイ」という）が有用な場合もある。適用例（applications）によっては、Ｋi値がときにキシラナーゼ適性の指標足り得ることを見いだした。Ｋi値の知見自体が有用である。
【００５１】
（コンビネーションアッセイ）
本発明はまた、本発明のアッセイ類を適正に組み合わせることを含むものである。本発明は、阻害剤含有量測定方法を含むステップ、阻害剤アッセイ方法を含むステップ、粘度アッセイ方法を含むステップ、グルカナーゼアッセイ方法を含むステップ、及びＫiアッセイを含むステップの内２又は３以上のステップを含む組み合わせを包含している。かかる組み合わせにおいては、ステップの組み合わせはどの順番でもよく、また必ずしも同時に若しくは続けて行う必要はない。
【００５２】
（新規のキシラナーゼ類）
上述したように本発明は、食品、特に焼き製品調製に用いる生地の調製に使用可能なキシラナーゼを同定するのに適したアッセイを提供するものである。そこで本発明者らは、食品、特に焼き製品調製に用いる生地の調製に適した新規のキシラナーゼ３種を同定した。すなわち本発明はさらに、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又はそれらの変異体、相同物、並びに断片として示されるアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸配列を包含している。
【００５３】
本発明のキシラナーゼに関連して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果できたアミノ酸配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかの配列を含むキシラナーゼ活性と、好ましくは少なくとも同程度の活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られるタンパク質にキシラナーゼ活性が、好ましくは配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかの配列と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列相同性（配列類似性又は配列同一性）に関しては、添付の配列リストに示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。さらに、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、さらに少なくとも９８％の相同性があることがより好ましい。
キシラナーゼが、配列番号７若しくは配列番号１１、又はそれらの変異体、相同物若しくはその断片の配列を含むことが好ましい。
【００５４】
本発明はさらに、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものである。本発明のヌクレオチド配列は次のものから選択することが好ましい。
（ａ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はそれらの変異体、相同物、並びに断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかを含むヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその相補配列の内いずれか１つのヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかとのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかの相補配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列、及び
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示したヌクレオチドに対する遺伝コードの結果、変性したヌクレオチド配列。
【００５５】
本発明のヌクレオチド配列に関連して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果できたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかのアミノ酸配列を含む活性と、好ましくは少なくとも同程度のキシラナーゼ活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られる発現タンパク質にキシラナーゼ活性が、好ましくは配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列相同性（配列類似性又は配列同一性）に関しては、添付の配列リストに配列番号８、配列番号１０、配列番号１２として示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の相同性があるものが望ましく、さらに、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性があるものが望ましい。
本発明のヌクレオチド配列が、配列番号８、配列番号１２、又はそれらの変異体、相同物、若しくは断片として示される配列を含むことが好ましい。
【００５６】
（キシラナーゼ類の新規の使用方法）
上述したように本発明はまた、焼き製品の調製に用いる非粘着性生地（本記載中にて定義）を調製する際に使用できるキシラナーゼの同定に適したアッセイを提供するものである。
我々は、食品、特に焼き製品調製に用いる生地、の調製に適した公知及び新規の細菌性キシラナーゼ数種を同定した。
よって本発明は、本発明のアッセイにより同定し得るキシラナーゼを含む非粘着性生地（本記載中にて定義）を包含するものである。かかるキシラナーゼが、配列番号３、５、７、９、１１、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物として示されるアミノ酸配列のいずれかを有することが好ましい。より好ましくは、かかるキシラナーゼが、配列番号５、７、９、１１、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物として示されるアミノ酸配列のいずれかを有することが好ましい。
【００５７】
先行技術によるシステムとは対照的に本発明は、生地を製造する前にキシラナーゼを小麦粉に直接添加し得る方法を提供する。従って、シングルバッチの小麦粉／キシラナーゼ混合物を生地製造器に投入する。さらに、取扱い容易な生地を得るために使う投入装置が生地製造器に必要でなくなる。
【００５８】
（キシラナーゼ類を用いて調製した食品）
本発明は、食品製造に用いるのに適したキシラナーゼの同定手法を提供するものである。動物用飼料も含む食品の代表例としては、日常食品、食肉製品、禽肉製品、魚肉製品、及び焼き製品が挙げられるが、かかる食品が焼き製品であることが好ましい。本発明の技術範囲に含まれる焼き製品の代表例としては、食パン、ロールパン、バーガー用パン、ピザ台等のパン類、プレッツェル、トルティヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー等が挙げられる。
【００５９】
（一般的な教示）
以下に述べる「本発明のヌクレオチド配列」及び「本発明のアミノ酸配列」なる語句は、ここに挙げるヌクレオチド配列のいずれか１つ若しくは２以上、またここに挙げるアミノ酸配列のいずれか１つ若しくは２以上について言及するものである。
【００６０】
（アミノ酸配列／ポリペプチド配列）
「本発明のアミノ酸配列」なる用語は、「本発明のポリペプチド配列」と同義語である。ここでかかるアミノ酸配列は、キシラナーゼ又はキシラナーゼ阻害剤のアミノ酸配列を意味すると考えてよい。
本発明のポリペプチドには、ここに示すアミノ酸配列の断片、及びその変異体も含まれる。断片の長さとして適正なのは、少なくとも５、又は少なくとも１０、１２、１５、さらには２０個のアミノ酸で構成される断片である。
本発明のポリペプチドは、保存的置換を含む、１又は２個以上（例えば少なくとも２、３、５、又は１０個）の置換、欠失、又は挿入を有するように修飾されていてもよい。保存的置換は、保存置換を示す次の表によって作製できる。次の表には、２列目の同じブロックと、３列目の同じ行にあるアミノ酸を相互置換することが好ましい。
【００６１】
【表１】
【００６２】
本発明のポリペプチドは実質的に単離されているものである。かかるポリペプチドは、意図するポリペプチドの目的を損なわないように、担体又は希釈剤と混合してもよく、その場合も依然として実質的に単離されていると考えられる。本発明のポリペプチドはまた実質的に精製されており、そのとき該ポリペプチドは、調製過程におけるポリペプチドを含み、かかる調製過程におけるポリペプチドの９０％以上、例えば９５％、９８％、又は９９％以上は、本発明のポリペプチドである。本発明のポリペプチドは後述するように例えば、その精製を容易とするためヒスチジン残基を付加し、又は細胞からの分泌を促進すべくシグナル配列を付加することにより修飾してもよい。本発明のポリペプチドは、後述するように合成法（例：Geysen et al., 1996記載の方法）、又は組換え法により作出できる。
【００６３】
酵母、真菌、又は植物宿主細胞等の適正な宿主細胞を用いることにより、本発明の組換え発現産物が最適な生物活性を備えるために必要とされる翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、Ｎ−末端切断化（truncation）、ラピデーション（lapidation）、及びチロシン、セリン、又はトレオニンの燐酸化）が可能になる。
【００６４】
truncation lapidation（ヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド配列）
「本発明のヌクレオチド配列」なる用語は、「本発明のポリヌクレオチド配列」なる用語と同義である。本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド酸配列が含まれる。遺伝的コードが縮重することにより、種々のポリヌクレオチド領域が、所定のアミノ酸配列をコードすることがわかる。
【００６５】
ここに詳述するアミノ酸配列に関する知識をもってすれば、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及び／又はゲノムクローン等の部分及び完全長核酸配列の作製が可能である。例えば、ここに挙げるアミノ酸配列をコードする配列を標的とするよう設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。かかるプライマーには通常複数の縮重部分が含まれる。しかし縮重を最小化するために、ここで述べるアミノ酸配列において１コドンにのみ対応してコードされるメチオニン等のアミノ酸を含む領域をコードする配列が選択される。さらにＰＣＲ法を実施するときに鋳型ＤＮＡとして用いる核酸をもつ生物におけるコドンの使われ方を考慮した上で配列を選択する。公知の配列に対する一本鎖配列（非縮重）プライマーを用いて配列クローニングを行うときのストリンジェンシーより緩やかなストリンジェンシー条件下にて、ＰＣＲを行う。
【００６６】
ＰＣＲで得られた本発明のポリペプチド断片をコードする核酸配列を使用して、ハイブリダイゼーションライブラリースクリーニング技術によって、より長い配列を得ることができる。例えばＰＣＲクローンを放射性原子によって標識し、又は他種、好ましくは他種の植物又は菌種のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いる。ハイブリダイゼーション条件は、通常よりストリンジェントな条件下（例えば０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、約５０℃〜約６０℃）の培地条件である。アミノ酸配列の全体又は部分をコードする縮重核酸プローブは、他種、好ましくは他種の植物又は菌種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをプローブするのに用いられる。しかしＰＣＲは本来、一本鎖配列を得てさらにスクリーニングを行うために行うことが好ましい。
【００６７】
上記の技術により得られた本発明のポリヌクレオチド配列は、上述の技術を用いて、さらなる相同配列及び変異体を得るために用いることができる。また、かかるポリヌクレオチド配列は、使用に際し、種々の宿主細胞系において本発明のポリペプチドを発現せしめるために修飾される。例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対するコドン選択性向を最適化するよう修飾される。その他、制限酵素認識部位を導入すべく、またかかるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能若しくは特性を変えるべく、配列を変化させることが考えられる。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー、代替的増幅反応におけるプライマー等のプライマー、放射活性若しくは非放射活性標識を用いる慣用手法による顕現（revealing）標識等により標識されたプローブを作出するのに用いられる。またかかるポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされる。かかるプライマー、プローブ、及び他の断片は、その長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチドであって、これらはまた本発明のポリヌクレオチドなる用語に包含される。
本発明のポリヌクレオチド又はプライマーは、顕現標識を有する。標識として適しているものとしては、32Ｐ又は35Ｓ等の放射性同位元素、酵素標識、並びにビオチン等の他のタンパク質標識が挙げられる。かかる標識により、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーを標識化し、公知の技術により検出を行うことができる。
【００６９】
ＤＮＡポリヌクレオチド等のポリヌクレオチド、及び本発明によるプライマーは、組換え、合成、又は当該技術の専門家が実施可能ないかなる手法によって作出してもよい。標準技術によってクローニングしてもよい。
一般的にはプライマーは、所望の核酸配列を１ヌクレオチド毎に作製していく段階的製法を含む合成法により作出される。かかる作出を自動方式で行う技術は、先行文献に既にみられる。
【００７０】
長いポリヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術等の組換え法により作出されるのが一般的である。かかる方法には、クローニングの対象であるエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害遺伝子の領域において一対のプライマー（約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、かかるプライマーを、真菌、植物、又は原核細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触せしめ、所望の領域の増幅、増幅断片の単離（反応混合物をアガロースゲル上にて精製することによる）、及び増幅ＤＮＡの回収が実施可能な条件下にてＰＣＲ法を行うことが含まれる。適正なクローニングベクターに増幅ＤＮＡをクローニングできるよう、かかるプライマーは、適当な制限酵素認識部位を含むように設計されている。
【００７１】
（調節配列）
本発明のポリヌクレオチドは、選択された宿主細胞等により、コード配列の発現能を有する調節配列とオペラブル（operable）に結合していることが好ましい。例えば本発明は、かかる調節配列にオペラブルに結合した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、すなわち発現ベクターを包含するものである。
「オペラブルに結合」なる用語は、ここに記載する各成分が、その意図どおりに機能し得る関係にあり、互いに並列関係にあることを意味する。コード配列に「オペラブルに結合」した調節配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列が発現されるように連結される。
「調節配列」なる用語には、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現調節シグナルが含まれる。ここにいう「プロモーター」なる用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位等、当該技術分野にて通常使われる意味で使用される。
【００７２】
発現の、また必要とあれば選択した発現宿主からの目的タンパク質の分泌量の増強、及び／又は本発明のポリペプチド発現の誘導制御を行う異種構造の調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダー、及び末端領域等を選択することにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が増強される。本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターにオペラブルに結合していることが好ましい。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子由来のプロモーター以外にも、本発明のポリペプチドを発現させるプロモーターを用いることができる。かかるプロモーターは、所望の発現宿主において本発明のポリペプチドを発現させる上での効率性を考慮して選択される。
【００７３】
実施例において、本発明における所望のポリペプチドを発現させるため、構成プロモーターが選択される。誘導基質含有培地において発現宿主を培養させることが不要になるので、かかる発現構成物は非常に好都合である。
真菌発現宿主に対して用いるのに適した強力な構成及び／又は誘導プロモーターとしては、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンテターゼ、サブユニット９（ＯｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子からのＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターにおける真菌性遺伝子から得られるものが挙げられる。強力な酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ、及びトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。また、強力な細菌性プロモーターとしては、細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターの他に、α−アミラーゼ及びＳＰ０２プロモーターが挙げられる。ハイブリッドプロモーターもまた、発現構成の誘導調節を改良するために用いられる。
【００７４】
プロモーターはさらに、適合した宿主における発現を確実にし、又は増強させるという特徴を備えている。例えばかかる特徴としては、Pribnow Box又はＴＡＴＡbox等の保存領域が考えられる。それ以外にもプロモーターはさらに、本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響（保持、増強、減少等の）を及ぼす配列をもつ場合もある。それらプロモーターの適正例としては、Ｓｈ１イントロン又はＡＤＨイントロンが挙げられる。その他の配列には、温度、化学物質、光、又はストレス誘導エレメント等の誘導エレメントが含まれる。また、転写又は翻訳を増強するのに適したエレメントも存在する。かようなエレメントの例としては、ＴＭＶ５'シグナル配列（Sleat Gene 217 [1987] 217-225; 及びDawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97を参照のこと）が挙げられる。
【００７５】
（分泌）
本発明のポリペプチドは、宿主細胞から、本発明のポリペプチドがより簡便に回収できる培養培地へ分泌されることが望ましい。本発明においては、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択される。ハイブリッドシグナル配列もまた本発明において用いられる。
異種構造分泌リーダー配列の一般的な例としては、真菌アミログリコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えばｇｌａＡ；Aspergillus由来で、１８及び２４アミノ酸の二形態）、ａ−ファクター遺伝子（Saccharomyces及びKluyveromyces等の酵母）、又はα−アミラーゼ遺伝子（Bacillus）由来のものが挙げられる。
【００７６】
（構築物）
「共役物（conjugate）」、「カセット」、及び「ハイブリッド」なる用語と同義である「構築物（construct）」なる用語には、直接又は間接にプロモーターと接合する本発明におけるヌクレオチド配列が含まれる。本発明のプロモーター及びヌクレオチド配列を仲介するＳｈ１−イントロンやＡＤＨイントロン等のイントロン配列などの適正なスペーサーグループを供給することが間接接合の例として挙げられる。
直接又は間接接合を意味する本発明における「融合」なる用語に関しても「構築」と同じことがいえる。それぞれの場合において各用語は、元来野生型遺伝子プロモーター、及び通常会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組合わせにおいて、かかるプロモーター及びヌクレオチド配列がその自然環境下にあるときに、それらの自然組合わせを意味するものではない。
【００７７】
構築物が、その転移先である好ましくはBacillus subtillis等のBacillus属の細菌など、又はジャガイモ、サトウキビ等の植物における遺伝子構築の選択を可能にするマーカーを有していたり、発現させる場合もある。例えばマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（特に植物における）をコードするマーカー、又はＧ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、及びゲンタマイシン等に耐性を示す抗生物質耐性を供するマーカー等、実際に使用できる種々のマーカーが存在する。
本発明の構築物は、少なくともプロモーターにオペラブルに結合した本発明のヌクレオチド配列を含んでいることが好ましい。
【００７８】
（ベクター）
「ベクター」なる用語には、発現ベクター、形質転換ベクター、及びシャトルベクターが含まれる。
「発現ベクター」なる用語は、インビボで、又はインビトロでの発現能を有する構築物を意味する。
「形質転換ベクター」なる用語は、ある物からある物へ、同種の場合もあれば他種間の場合もあるが、転移できる構築物を意味する。構築物がある種から別の種へ、例えば大腸菌プラスミドから細菌、好ましくはBacillus属の細菌へ、転移できるとき、かかる形質転換ベクターを「シャトルベクター」と呼ぶことがある。大腸菌プラスミドから植物に存在するアグロバクテリア菌へと転移できる構築物の場合もある。
【００７９】
本発明のポリペプチドを発現させるため、後述するように本発明のベクターで適当な宿主細胞を形質転換させることができる。よって本発明はさらに、後述するように発現ベクターにより形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現条件下で培養し、また発現したポリペプチドを回収することからなる本発明のポリペプチドを調製するプロセスを提供するものである。
かかるベクターの例としては、複製によるプラスミド、ウイルス、又はファージベクターが挙げられ、また、かかるポリヌクレオチドの発現プロモーター、及びそのプロモーターの調節因子（regulator）も適宜に例として挙げられる。
【００８０】
本発明のベクターには、１又は２以上の選択マーカー遺伝子も含まれる。工業用微生物に対する選択系として最も適しているのは、宿主生物において変異を必要としない選択マーカー集団によって形成されるものである。真菌性選択マーカーの例としては、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸−脱カルボキシル酵素（ｐｖｒＡ）、ファレオマイシン、及びベノミル耐性（ｂｅｎＡ）遺伝子がある。非真菌性選択マーカーの例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする細菌由来Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母でも用いられるが、真菌では用いない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、ネオマイシン耐性遺伝子（Bacillus）、及び大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子がある。
ＲＮＡ作製、並びに宿主細胞のトランスフェクト又は形質転換を行うときなどは、ベクターをインビトロで用いることもできる。
【００８１】
このように本発明のポリヌクレオチドを、クローニング又は発現ベクター等の組換えベクター（通常複製ベクター）に取り込むことも可能である。かかるベクターを、和合性宿主細胞における核酸の複製に用いることができる。そこで実施例において、本発明のポリヌクレオチドを複製ベクターに導入し、かかるベクターを和合性宿主細胞に導入し、そしてベクター複製が可能となる条件下にてかかる宿主細胞を培養することにより、本発明のポリヌクレオチドを作出する方法を提供する。上記ベクターは宿主細胞から回収する。この方法に適した宿主細胞については、発現ベクターとの関連において後述する。
【００８２】
（組織）
ここにいう「組織」なる用語は、組織それ自体、及び器官を意味する。
（宿主細胞）
本発明における「宿主細胞」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる細胞をも包含し、かかる宿主細胞にプロモーターが存在するときには、該プロモーターが本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な宿主細胞を意味するものである。
本発明の実施例においては、本発明のポリヌクレオチドを形質転換した又はトランスフェクトした宿主細胞が提供される。かかるポリヌクレオチドを複製及び発現せしめるために、該ポリヌクレオチドがベクターに取り込まれていることが好ましい。かかるベクターと適合する細胞、例えば原核生物（例として細菌）、真菌、酵母、又は植物細胞を選択する。
【００８３】
グラム陰性の細菌である大腸菌は、異種遺伝子を発現させるときの宿主として広く使用されている。しかし、大量の異種タンパク質は、細胞内に蓄積する傾向がある。大量の大腸菌細胞質内タンパク質から所望のタンパク質をその状態から精製することはときに困難である。大腸菌とは対照的に、培地へのタンパク質分泌能を有することからバチルス属の細菌は、異種宿主として非常に適している。宿主として適した細菌には、ストレプトミセス属及びシュードモナス属の細菌が知られている。
【００８４】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特質から、及び／又は発現タンパク質のさらなるプロセシングが望まれることから、酵母又は真菌等の原核生物宿主が好ましい。酵母細胞の方が容易に操作できるため、真菌細胞より酵母細胞が一般的に好まれる。しかしタンパク質の中には、酵母細胞からはあまり分泌されなかったり、正しくプロセシングされない（例えば酵母の高グリコシル化）ものがある。かかる場合には真菌宿主生物を選択すべきである。
【００８５】
本発明の技術範囲にある発現宿主の好適例としては、Aspergillus種（ヨーロッパ特許Ａ０１８４４３８号及びＡ０２８４６０３号）、及びTrichoderma種等の真菌類、Bacillus種（ヨーロッパ特許Ａ０１３４０４８号及びＡ０２５３４５５号に記載があるものなど）、Streptomyces種、及びPseudomonas種等の細菌類、並びにKluyveromyces種（ヨーロッパ特許Ａ００９６４３０号及びＡ０３０１６７０号に記載があるものなど）、及びSaccharomyces種等の酵母類がある。
典型的な発現宿主は、Aspergillus niger、Aspergillus niger var. tubigenis、Aspergillus niger var. awamori、Aspergillus aculeatis、Aspergillus nidulans、Aspergillus orvzae、Trichoderma reesei、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Kluyveromyces lactis、及びSaccharomyces cerevisiaeから選択できる。
【００８６】
（生物）
本発明の「生物」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる生物をも包含し、かかる生物にプロモーターが存在するときには、該プロモーターが本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な生物を意味するものである。本発明のキシラナーゼの観点から適当な生物としては、好ましくはBacillus属、より好ましくはBacillus subtilis属の細菌が挙げられる。
【００８７】
本発明における「トランスジェニック生物」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる生物をも包含し、そのプロモーターが、かかる生物内に本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な生物を意味するものである。かかるヌクレオチド配列が、該生物のゲノムに取り込まれていることが好ましい。「トランスジェニック生物」なる用語は、本発明の無処理（native）のヌクレオチドコード配列がその自然環境下にあり、やはり自然環境下にある無処理のプロモーターのコントロール下にあるときには、かかるコード配列を含まない。さらに本発明には、本発明の無処理のタンパク質がその自然環境下にあり、やはりその自然環境下にある無処理のヌクレオチドコード配列により発現され、かかるヌクレオチド配列が、その自然環境下にある無処理のプロモーターのコントロール下にあるときには、かかるコード配列を含まない。
【００８８】
従って本発明のトランスジェニック生物は、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のいずれか１つ又はそれらの組合せ、本発明の構築物（その組合せを含む）、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発明の組織、並びにそれらの産物を含む。形質転換した細胞又は組織を用いて、かかる細胞又は組織から所望の成分の必要量を容易に回収し、調製することができるのである。
【００８９】
（宿主細胞／宿主生物の形質転換）
前述したように、宿主生物としては原核又は真核生物を挙げることができ、原核生物宿主の好適例としては、大腸菌及びBacillus subtilisがある。原核生物宿主の形質転換に関する詳しい教示例としては、Sambrook et al（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、及びAusubel et al., Current Protocles in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.等の文献がある。原核生物宿主を用いる際には、形質転換の前にそのヌクレオチド配列を、イントロン除去等により適当に修飾することが必要になる。そして、上述したように宿主生物として適しているのは、Bacillus subtilis等のBacillus属の細菌である。
【００９０】
他の実施例として、トランスジェニック生物として酵母を用いることもできる。酵母は、異種遺伝子発現のビヒクル（vehicle）として広く使われている。Saccharomyces cerevisiaeは、異種遺伝子発現への使用も含め、かなり以前から工業用に使用されている。Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現に関しては、Goodey et al（1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London）、及びKing et al.,（1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow）が報告している。
【００９１】
いくつかの点から、Saccharomyces cerevisiaeは異種遺伝子発現に適している。第１に、Saccharomyces cerevisiaeはヒトに対し非病原性であり、特定のエンドトキシンの産生能をもたない。第２に、Saccharomyces cerevisiaeは、何世紀にもわたり多様な目的のために、商業目的に安全に利用されてきた歴史がある。その結果、広く世間に認知されている。第３に、広く商業目的に使用され、また研究も数多くされてきているため、その大規模な発酵特性とともに、Saccharomyces cerevisiaeの発生学的及び生理学的特質に関する豊富な知識が蓄積されている。
E Hinchcliffe E Kenny（1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.）は、Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌の原理について報告している。
【００９２】
使用できる酵母ベクターは、その保持のために宿主ゲノムとの組換えを必要とし、プラスミドベクターを自律的に複製する組込み（integrative）ベクターを含む数種類ある。
トランスジェニックSaccharomycesを調製するため、酵母での発現を目的として設計した構築物に、本発明のヌクレオチド配列を挿入して発現構築物を調製した。今までに数種類、異種発現に用いる構築物が作製されている。かかる構築物には、本発明のヌクレオチド配列に融合された酵母において活性を示すプロモーターが含まれ、ＧＡＬ１プロモーター等の酵母由来のプロモーターが用いられる。ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列等の酵母由来のシグナル配列が用いられる。酵母において活性を示すターミネーターが発現系を終了させる。
【００９３】
酵母の形質転換を行うための形質転換プロトコールがいくつか見いだされている。例えば本発明のトランスジェニックSaccharomycesは、Hinnen et al（1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929）、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al（1983, J Bacteriology 153, 13-168）の教示によって調製できる。形質転換した酵母細胞は、種々の選択マーカーを使って選択でき、形質転換に用いるマーカーには、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、及びＴＲＰ１等の数多くの栄養要求性マーカー、及びアミノグリコシド抗生物質マーカー（Ｇ４１８等）などのドミナント抗生物質耐性マーカーがある。
【００９４】
宿主生物としては他にも植物を挙げることができる。遺伝子改変植物を構築する際の基本原理は、挿入された遺伝物質が安定的に保持されるような形で、ゲノム情報を植物ゲノムに挿入することであり、ゲノム情報を挿入する技術はいくつかあるが、主な２つの原理は、ゲノム情報の直接導入、及びベクター系を用いたゲノム情報の導入である。かかる一般的な技術は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol ［1991］ 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に記載されている。
【００９５】
さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列又は構築物を運び、また該ヌクレオチド配列又は構築物を、植物等の生物ゲノムに導入し得るベクター系に関する。かかるベクター系は、１つのベクターを含むことができるが、２つのベクターをもつこともできる。ベクターを２つ有する場合、かかるベクター系は通常二元ベクター系と呼ばれる。二元ベクター系については、Gynheung An et al.（1980）、Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19に、より詳細な記載がある。
【００９６】
所定のヌクレオチド配列を用いた植物細胞の形質転換に広く使用されるシステムは、Agrobacterium tumefaciens由来のＴｉプラスミド、又はAgrobacterium rhizogenes An et al.（1986）, Plant Physiol. 81, 301-305、及びButcher D.N. et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.:D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208由来のＲｉプラスミドを使用することを基本にしている。上述した植物又は植物細胞構築物の構築に適したＴｉ及びＲｉプラスミドを数種類構築した。かかるＴｉプラスミドの非限定例としては、ｐGV3850がある。
【００９７】
本発明のヌクレオチド配列又は構築物は、Ｔ−ＤＮＡボーダーを直接取り囲む配列が分裂しないよう、またこれら領域の内少なくとも１領域が修飾Ｔ−ＤＮＡを植物ゲノムに挿入する際に重要となるように、Ｔ−ＤＮＡの末端配列間に存在する、又はＴ−ＤＮＡ配列に隣接するＴｉプラスミドに挿入されることが好ましい。上述した説明から理解されるように、生物が植物の場合には、本発明のベクター系は、植物を感染させるのに必要な配列（vir領域等）、またＴ−ＤＮＡ配列の少なくともボーダー部分を１つ有していることが好ましい。ここにいうボーダー部分は、遺伝子構築物と同一ベクター上に位置するものである。かかるベクター系は、Agrobacterium tumefaciensＴｉプラスミド、若しくはAgrobacterium rhizogenesＲｉプラスミド、又はその派生物であることが好ましい。なぜならこれらのプラスミドは公知であり、トランスジェニック植物の構築に広く使用されており、これらのプラスミド又はその派生物に基づくベクター系は数多く存在しているからである。
【００９８】
トランスジェニック植物を構築するにあたっては、本発明のヌクレオチド配列又は構築物を植物に挿入する前に、ベクターが複製可能かつ操作が容易な微生物内に先ず構築する。有用な微生物としては大腸菌があるが、上述の特質をもつ微生物であれば他の微生物も使用できる。上記に定義したベクター系のベクターを大腸菌において構築した後、必要とあれば該ベクターを、Agrobacterium tumefaciens等の適当なアグロバクテリア株に転移させる。このように、本発明のヌクレオチド配列又は構築物をハーバリングするアグロバクテリア細胞を得るため、本発明のヌクレオチド配列又は構築物をハーバリングするＴｉプラスミドを、Agrobacterium tumefaciens等の適当なアグロバクテリア株に転移させることが好ましい。次に、かかるアグロバクテリア細胞のＤＮＡを、修飾する予定の植物細胞に転移させる。
【００９９】
かかる方法により、本発明のヌクレオチド又は構築物をベクターにおける適当な制限部位（position）に導入し得る。そこに含まれるプラスミドを用いて大腸菌の形質転換を行う。かかる大腸菌細胞を適した栄養培地で培養した後、回収し溶解させる。かかるプラスミドはこのようにして回収される。分析方法としては、配列分析、制限分析、電気泳動、またさらに生化学−分子生物学的方法が通常実施される。操作を行う毎に使用したＤＮＡ配列は制限され、隣接するＤＮＡ配列に結合される。各配列は、同じ又は別のプラスミド内にてクローニングされる。
【０１００】
所望の本発明のヌクレオチド配列を植物へ導入する各種導入方法を行った後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となる。例えば植物細胞のＴｉ−又はＲｉ−プラスミドを用いて形質転換を行うときには、導入遺伝子のフランキング領域としてのＴｉ−及びＲｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界、またはしばしば左右の境界が結合される。植物細胞の形質転換にＴ−ＤＮＡを用いることについては鋭意研究がなされており、ヨーロッパ特許Ａ１２０５１６号、Hoekema（The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Chapter V）、Fraley, et al.（Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46）、及びAn et al.（EMBO J. 1985, 4:277-284）に報告されている。また、植物組織を直接アグロバクテリアに感染させることは、広く行われている簡便な方法であり、Butcher D.N. et al.（1980, Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.:D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208）にその記載がみられる。この方法に関しては、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991] 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に教示されている。かかる方法により、葉、根、茎、又は植物の他の部分等の植物組織における特定部位において植物を感染させることができる。
【０１０１】
植物を、ヌクレオチド配列をもつアグロバクテリウムに直接感染させると、通常感染させる植物は、剃刀による切開、針による穿孔、研磨用具による摩擦などで損傷する。かかる損傷部分にアグロバクテリウムを接種するのである。そして接種された植物又は植物の部分を適当な培養培地で生育させ、成熟植物とするのである。植物細胞が構築されると、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の成長必須因子を含む適当な培養培地で細胞を培養する方法等の公知の組織培養方法によって、かかる細胞は生育し、かつ保持される。細胞又は組織培養物から植物を再生させる公知の方法により、形質転換細胞を、遺伝子修飾植物において再生させることができる。かかる公知の方法としては例えば、抗生物質を使って形質転換した芽を選択し、その選択した芽を適正な栄養分や植物ホルモン等を含む培地で、継代培養する方法がある。植物の形質転換については、ヨーロッパ特許Ａ０４４９３７５号にも教示されている。
【０１０２】
（ポリペプチドの作出）
本発明においては、従来公知の栄養発酵培地における１又は２以上の本発明のポリヌクレオチドを形質転換された微生物発現宿主等の培養により、本発明のポリペプチドの産生が影響される。発現宿主の選択に基づき、及び／又は発現構築物における調節の必要性に基づいて適当な培地を選択する。当該技術の専門家であれば、かような培地を熟知している。必要とあれば培地は、汚染の可能性がある他の微生物よりも形質転換された発現宿主が好む成分をさらに含有させることができる。
【０１０３】
（抗体）
本発明のアミノ酸配列を、かかるアミノ酸配列に対する抗体を標準的な手法により作製するために用いることができる。抗体を作製するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の種々の宿主を、その阻害剤、何らかのタンパク質、変異体、相同物、又はその断片や派生物、並びに免疫原性特質を維持しているオリゴペプチドを投与することにより免疫する。免疫応答を強化するために種々のアジュバントを、宿主種依存で用いる。かかるアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin：スカシガイのヘモシアニン）、及びジニトロフェノール等の界面活性物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvumも使用が考えられる有用なヒトアジュバントである。
【０１０４】
アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体は、培地における連続細胞株による抗体分子の作製方法のいずれによっても調製し得る。かかる方法には、Koehier及びMilstein（1975 Nature 256:495-497）が最初に報告したハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp77-96）が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに適当な抗原特異性及び生物活性を得るためにマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする「キメラ抗体」の作製方法（Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454）も用いることができる。その他にも一本鎖抗体（米国特許Ａ４９４６７７９号）の作製技術を、阻害剤特異的一本鎖抗体の作製に用いることができる。
【０１０５】
Orlandi et al（1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837）、並びにWinter G及びMilstein C（1991; Nature 349: 293-299）が開示しているように、インビボでの産物をリンパ球集団に誘導することにより、又は組換え免疫グロブリンライブラリー若しくは高度に特異的な結合試薬パネルのスクリーニングにより、抗体を作製することもできる。
【０１０６】
プロトコール
プロトコール１；キシラナーゼアッセイ（エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性）
クエン酸（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）緩衝液（ｐＨ５．０）でキシラナーゼ試料を希釈し、最終アッセイにおいてＯＤ（光学密度）が約０．７となるようにした。該試料の希釈液３種類、及び既知活性の内部標準液を、４０℃で５分間サーモスタットで調節した。反応開始５分後に、１個のXylazyme剤（架橋結合され、染色されたキシラン基質）を上記酵素溶液に加えた。反応開始１５分後に、１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して反応を終了させた。該反応混合液を遠心分離にかけ、上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。希釈液及びキシラナーゼ量を考慮しつつ、試料の活性（ＴＸＵ：Total-Xylanase-Units）が標準と相対的に算出された。
【０１０７】
プロトコール２；粘度プロトコール（粘度測定）
生地の粘度を、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（Stable Micro Systems社製）により測定した。本プロトコールは、Chen及びHoseney（1995）が報告したプロトコールに修正を加えたものである。生地は、Farinograph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００ＢＵ（Brabender Units）で作製した。小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合した。そこに水を加え、さらに５分間生地を混ぜる。できあがった生地を密封容器において３０℃で、１０、３０又は４５分間寝かせる。
【０１０８】
約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載する。均一に押し出すように、該生地を４ｍｍ押し出す。その後Stable Micro Systems protocol（生地の粘度を測定するＴＡ−ＸＴ２のアプリケーション研究）に従って５回測定を行った。簡潔に述べると、１ｍｍの生地が押し出される。ＴＡ−ＸＴ２システムに接合したプローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で生地を押圧する。そのプローブを持ち上げ、生地とプローブが粘着する度合を記録する。以下のＴＡ−ＸＴ２の設定を用いた。
科目： 粘着テスト
テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ
距離： １５ｍｍ
力： ４０ｇ
時間： ０．１ｓ
トリガータイプ 自動−５ｇ
データ収集率 ４００ｐｐｓ
このテストで記録した結果はピーク時の力であり、これは押し出した生地からプローブを持ち上げるのに必要な力を意味する。距離は、プローブに付着している距離を意味する。範囲は、得られた曲線の下の部分を意味する。
【０１０９】
生地の粘度は、使用する小麦粉の品質及びレシピに依存している。従って低粘度の生地とは、参考生地と比べて粘度が１００％から２００％（相対的）と幅があり、キシラナーゼを含まない生地、若しくは焼きテストにおいて同程度の嵩増量が得られるように市販の真菌性キシラナーゼ（Pentopan mono BG, Novo Nordisk社製）を添加したときの粘度に対し、その粘度が好ましくは７０％（相対的）未満である生地をいう。
【０１１０】
プロトコール３；阻害剤アッセイプロトコール（阻害剤アッセイ）
単離及び特徴化の過程で阻害剤を検出するには、以下のアッセイを用いる。１００μｌの阻害剤画分、２５０μｌのキシラナーゼ溶液（１２ＴＸＵ／ｍｌを含む）、及び６５０μｌの緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）を混合する。この混合液を４０．０℃で５分間サーモスタットで調節する。反応開始５分後にXylazyme剤１個を加える。反応開始１５分後に１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して、反応を終了させた。かかる反応混合液を遠心分離（３５００ｇ、１０分間、室温）にかけ、上清を５９０ｎｍで測定した。阻害剤は、残留活性としてブランクとの比較において測定した。ブランクも同様にして調製するが、１００μｌの阻害剤は１００μｌの緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）と置き換えた。例えばＸＭ−１は、阻害剤に対し高耐性を示すと考えられる（図２０参照）。ＸＭ−２及びＸＭ−３は、阻害剤に対し中程度の耐性を示すと考えられる（図２０参照）。
【０１１１】
プロトコール４；グルカナーゼプロトコールＩ（エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性 ０．１Ｍ酢酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）でグルカナーゼ試料を希釈し、最終アッセイにおいてＯＤが約０．７となるようにした。該試料の希釈液３種類、及び既知活性の内部標準を、４０℃で５分間サーモスタットで調節した。反応開始５分後に、Xylazyme剤１個を上記酵素溶液に加えた。反応開始１５分後に、１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して反応を終了させた。該反応混合液を遠心分離にかけ、上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。希釈液及びグルカナーゼ量を考慮しつつ、試料の活性（ＢＧＵ：Beta-Glucanase-Units）の標準との相対算出を行った。
【０１１２】
プロトコール５；阻害剤アッセイプロトコールII（阻害剤キネティックスアッセイ）
阻害剤のキネティックスを考察するために水溶性基質（Azo-xylan、Megazyme社製）を用いた。製造者のプロトコールに従い、２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．０）において、基質の２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。このアッセイは、基質、キシラナーゼ、及び阻害剤を４０℃で５分間予熱して行った。
阻害剤の予備的な特徴化を行うために、用いたキシラナーゼを４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈した。Ｋ1測定を行うために、キシラナーゼを約４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈した。
反応開始後０分時に、０．５ｍｌの基質、０．１ｍｌのキシラナーゼ及び０．１ｍｌの阻害剤を４０℃で混合し、反応開始１２５分後に、２ｍｌのエタノール（９５％）を添加して反応を終了させ、続いて１０秒間渦動した。加水分解されずに沈殿した基質を遠心分離（３５００×ｇ、１０分間、室温）にかけて除去した。上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。
【０１１３】
ブランクも同様にして調製した。変更を加えた点は、阻害剤を２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．０）に置き換えたことだけである。
基質濃度を順次減少させてキネティック実験を行うために、２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．０）で希釈して、２％、１％、０．５％、及び０．２５％可溶性アゾキシラン（ｗ／ｖ）の基質濃度をそれぞれ用意した。
上記のキシラナーゼ及び基質濃度を用いてＫ1測定を行った。かかる測定アッセイを行うにあたり、この双方を以下の各濃度、すなわち０、２、５、１０、２５、５０、及び１００μｌ、の阻害剤抽出物と組み合わせた。阻害剤のモル濃度ではなく、μｌ阻害剤を用いることから、Ｋ1は、μｌ阻害剤として表される。
【０１１４】
要約すると本発明は以下のことを提供する。
ａ．小麦粉から内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を単離すること。
ｂ．小麦粉から単離した内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を特徴化すること。
ｃ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤がキシラナーゼ類に及ぼす効果を特徴化すること。
ｄ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類を選択する方法。
ｅ．エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類を選択する方法。
ｆ．真菌性キシラナーゼを含む生地に比べて、好ましい嵩及び適度な粘度を備えた生地を提供するキシラナーゼ。
ｇ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を用いたキシラナーゼ類のスクリーニング方法及び／又は該キシラナーゼ類を変異させる方法、並びに該キシラナーゼ類又はそれらの変異体を生地製造に使用すること。
ｈ．本発明のキシラナーゼ類を用いた食品の調製。
【０１１５】
以下の試料はブダペスト条約に基づき、公認の寄託機関であり、英国ＡＢ２ １ＲＹ、スコットランド、アバディーン、マーチャードライブ、２３Ｓｔ．に所在するThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)に１９９８年１２月に寄託された。
DH5α::pCR2.1#BSキシラナーゼ ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４０９９９
BL21(DE3)::pET24A#XM1 ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４１０００
BL21(DE3)::pET24A#XM3 ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４１００１
DH5α::pCR2.1#BSキシラナーゼには、野生型キシラナーゼが含まれる。
BL21(DE3)::pET24A#XM1には、XM1キシラナーゼが含まれる。
BL21(DE3)::pET24A#XM3には、XM3キシラナーゼが含まれる。
本発明はまた、これらの寄託物に由来し、及び／又はこれらの寄託物から発現される配列、並びにそれらの配列を含む実施例を包含するものである。
次に図面を参照しながら、例を挙げるだけではあるが、本発明を説明する。
図１〜図１０、図１２〜図１６及び図１８〜図３１はグラフであり、図１１はＳＤＳ ＰＡＧＥ実験の結果を示す画像であり、図１７はＩＥＦ実験の結果を示す画像である。
【実施例１】
【０１１６】
実施例１（異なる種類のキシラナーゼを用い、添加量及び寝かせ時間を変えて作製した生地の粘度）
生地に粘度を与える以下のキシラナーゼ能をテストした。（W.Z. and Hoseney, R.C. (1995). Development of an objective method for dough stickiness. Lebensmittel Wiss u.-Technol., 28, 467-473も参照されたい）
（酵素）
「Ｘ１」は、Aspergillus niger由来のエンド−β−１，４−キシラナーゼを精製した試料のことである。このキシラナーゼは、８４００ＴＸＵ（１５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
「Novo」は、Thermomyces由来のNovo Nordisk's Pentopan Mono BGのことである。このキシラナーゼは、３５００００ＴＸＵ（５６０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
「ＢＸ」は、新規の細菌性キシラナーゼを精製した試料のことである。この試料は、２０００ＴＸＵ（２５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
「R▲o▼hm」は、R▲o▼hm GmbH社製の細菌性キシラナーゼであるVeron Specielのことである。この試料は、１０５００ＴＸＵ（２５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
【０１１７】
（キシラナーゼアッセイ）
キシラナーゼアッセイは、プロトコール１に従って行った。
（小麦粉）
この実験においては、デンマーク産小麦粉（バッチ番号９８０２２）及びドイツ産小麦粉（バッチ番号９８０４８）の２種類の小麦粉を使用した。４００ＢＵにおける上記２種類の小麦粉の水分吸収率は、それぞれ５８％及び６０％であった。
（生地の調製）
生地は、プロトコール２に従って調製した。生地を混合した後、密封容器において３０℃で、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた（粘度測定）
粘度は、プロトコール２に従って測定した。
（真菌性キシラナーゼと新規細菌性キシラナーゼの比較）
以下の生地を作り、１０分後及び４５分後における小麦粉９８０４８の生地の粘度を測定した。２種類の真菌性キシラナーゼ、及び１種類の細菌性キシラナーゼの添加量を変えて（表２参照）、生地を作製した（分量は小麦粉１ｋｇに対するもの）。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
表２における生地から、表３及び図１に示す生地の粘度に関する結果が導きだされる。種々のキシラナーゼを、その分量を様々に変えて添加し、生地を製造してブランクと比較した製造した生地は、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。表３には、粘度がｇ×ｓとして表わされ、粘度の測定結果は、５回測定を行った平均値で示されている。上記表３のデータは、図１に示されている。表３及び図１から、真菌性キシラナーゼＸ１及びNovo生成物中に含まれるキシラナーゼが生地の粘度を上昇させていることがわかる。新規細菌性キシラナーゼを加えたときには、Ｘ１及びNovoと同様の粘度にはならず、さらにコントロールと比較しても該新規キシラナーゼの粘度は減少していた。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
（新規細菌性キシラナーゼとR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの比較）
新規細菌性キシラナーゼの機能を、R▲o▼hm製品の細菌性キシラナーゼであるVeron Specialとの比較において考察するために、小麦粉９８０２２を使用して以下の生地を製造した。２種類の細菌性キシラナーゼの添加量を変えて（表４参照）、生地を作製した（分量は小麦粉１ｋｇに対するもの）。表４に示す生地から、表５及び図２に示す生地粘度の結果を得た。表５には、粘度がｇ×ｓとして表わされ、粘度の測定結果は、５回測定を行った平均値で示されている。表５に示すデータを、図２に図示した。この結果から、ＢＸ（新規の細菌性キシラナーゼ）を加えた生地の粘度は、テストした真菌性キシラナーゼの粘度に比べ、非常に低いことが明らかになった。さらに新規の細菌性キシラナーゼを加えると、R▲o▼hm細菌性キシラナーゼとの比較において生地の粘度が減少することもわかった。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
【表５】
【実施例２】
【０１２４】
実施例２（阻害剤の精製、特徴化、及びキシラナーゼに与える効果）
（小麦粉）
種類の異なる３種類の小麦粉（バッチ番号９８００２、９８０２６、及び９８０５８）を使用して以下の実験を行った。小麦粉バッチ番号９８００２及び９８０５８はデンマーク産の小麦粉である。小麦粉バッチ番号９８０２６はドイツ産の小麦粉である。
（阻害剤抽出）
氷温の蒸留水を用いた撹拌により、阻害剤を小麦粉から抽出した。小麦粉１に対し、２の氷温蒸留水を加えた。この混合物に磁気バーを加え、氷浴させて２０分間撹拌した。小麦粉を撹拌した後、スラリーを遠心分離器のバイアルに入れ、遠心分離（１００００ｇ、４℃で１０分間）にかけた。上清にはキシラナーゼ阻害剤が含まれていた。
（阻害剤アッセイ）
プロトコール３に従って阻害剤アッセイを行った。
【０１２５】
（阻害剤の単離）
１００ｇの小麦粉試料（９８０２６）を抽出した後、クロマトグラフィー法によりキシラナーゼ阻害剤の精製を行った。
（ゲル濾過クロマトグラフィー（２回実施））
７５ｍｌの抽出物を、５００ｍｌSupredex G-25F（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに１０ｍｌ／分の割合で投入し、２０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．２５）でキャリブレートした。溶離液を同一フローにおいて、３０ｍｌ画分として回収した。これら全ての画分において阻害活性が認められた。
【０１２６】
（陽イオン交換クロマトグラフィー（２回実施））
ゲル濾過のランから回収された阻害剤のピーク（２４０ｍｌ）を５０ｍｌSP Sepharose（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに５ｍｌ／分の割合で投入した。阻害剤投入後、Ａ緩衝液（２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２５）を用いて、このカラムをベースラインまで洗浄した。同じフローにおいて、１０カラムボリュームを超えるＡ緩衝液からＢ緩衝液（Ｂ：Ａ＋３５０ｍＭのＮａＣｌ）に至るリニアグラディエントによって阻害剤を溶離させた。この溶離液を１０ｍｌ画分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。
【０１２７】
（疎水性相互作用クロマトグラフィー（２回実施））
陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られた阻害剤のピーク（１１０ｍｌ）に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えて１．０Ｍとし、１０ｍｌPhenyl Sepharose HIC（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに２ｍｌ／分の割合で投入した。Ａ（２０ｍＭのＮａＰｉ、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）からＢ（２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．０）緩衝液に至る１２カラムボリュームのリニアグラディエントによって、阻害剤をカラムから溶離させた。かかる溶離液を２．５ｍｌ画分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。（この実験は２回実施した）
【０１２８】
（分取ゲル濾過クロマトグラフィー）
回転式蒸発装置を使って、ＨＩＣランで得られた５ｍｌの阻害剤ピークを２ｍｌに濃縮した。この試料を３３０ｍｌSuperdex 75PG（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに１ｍｌ／分の割合で投入した。５０ｍＭのＮａＯＡｃ及び０．２ＭのＮａＣｌからなる緩衝液系（ｐＨ５．０）を用いた。溶離液は５．５ｍｌ画分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。
【０１２９】
（プロテアーゼ活性分析）
見いだされた阻害剤効果が、阻害剤によるものか、或いはキシラナーゼを加水分解するプロテアーゼによるものかを確認するために以下の実験を実施した。
（インキュベーションテスト）
２ｍｌの精製キシラナーゼである９８０６０１（エンド−β１，４−キシラナーゼを参照のこと）を、０．２５ｍｌの阻害剤抽出物共存下において４０℃で３時間インキュベーションした。コントロールとして、煮沸（５分間）した阻害剤抽出物を同様にインキュベーションした。インキュベーション後、各試料に５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）を加え２．５ｍｌとし、PD-10カラム（スウェーデン、Pharmacia社製）を使ったゲル濾過によって脱塩し、５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）において３．５ｍｌの試料を得た。
【０１３０】
（加水分解分析）
インキュベーションで得られた精製キシラナーゼ２種類の試料を、SOURCE 15 Sカラムを使って分析した。ゲル濾過した試料１ｍｌを上記カラム（Ａ緩衝液（５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）でキャリブレートした）に２ｍｌ／分の割合で投入した。２０カラムボリュームを超えるＡからＢ（Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）のリニアグラディエントによって試料を溶離させ、２ｍｌ画分として回収した。ＯＤ２８０ｎｍでキシラナーゼが検出され、得られた画分（１００μｌ画分＋９００μｌ緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）＋１Xylazyme剤、１０分間、４０℃。１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを加え反応を終了した。青色＝キシラナーゼ活性）の中にキシラナーゼ活性がみられた。
【０１３１】
（阻害剤の特徴化）
（分析用ゲル濾過クロマトグラフィー）
ＨＩＣランで得られた阻害剤ピーク１００μｌ（回転式蒸発装置を用いて２回濃縮）を、２４ｍｌSuperdex 75 10/30（スウェーデン、Pharmacia社製）に０．５ｍｌ／分の割合で投入した。５０ｍＭのＮａＯＡｃ及び０．１ＭのＮａＣｌからなる緩衝液（ｐＨ５．０）をランニング緩衝液として用いた。溶離液は、２ｍｌ画分として回収した。これらの画分全てにおいて阻害剤が認められた。
かかる阻害剤の大きさを測定するため、２４ｍｌSuperdex 75 10/30カラムに、公知のタンパク質を連続して投入した。このランを実行するときの条件は上述のとおりである。使用した標準タンパク質は以下のとおりである。
タンパク質 大きさ（ＫＤａ）
ＢＳＡ ６７オバルブミン ４３キモトリプシン ２５リボ核酸Ａ １３．７上記タンパク質は、２８０ｎｍにて測定した。
【０１３２】
（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）
調製ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分に、ＳＤＳ試料緩衝液（NOVEX社のプロトコールによって調製）を加え３分間煮沸し、８−１６％ＰＡＧＥゲル（NOVEX社製）にかけた。このゲルを、NOVEX社のシルバー染色プロトコールに従って染色した。分子量マーカーとしてPharmacia社のLMWマーカーを使用した。
【０１３３】
（Ｉｓｏエレクトリックフォーカシング（ＩＥＦ））
無処理の阻害剤のｐｌを測定するため、精製阻害剤試料（３３０ｍｌSuperdex 75 PGによる画分３３）を、pH3-10 IEF GEL（NOVEX）にかけた。ゲルに対するランは、製造者のプロトコールに従って実行した。標準として、Pharmacia社（スウェーデン）のBroad Pl kit, 3.5-9.3を用いた。ゲルは、製造者のプロトコールに従って、クマシブリリアントブルーに染色した。
【０１３４】
（クロマトフォーカシングクロマトグラフィー）
調製ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３の試料を、水に対してゲル濾過した。１００μｌの脱塩した試料を、Mono P HR 5/5（Pharmacia社製、スウェーデン）にかけた。２５ｍＭのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．４）により、開始条件を設定した。このカラムをPoly緩衝液９６と水との割合が、１：１０において溶離した。ｐＨは６．０に調整した（フロー：０．５ｍｌ／分、画分サイズ：０．５ｍｌ）。Poly緩衝液９６による溶離後、Poly緩衝液７４と水との割合が１：１０において、該カラムをさらに溶離させた。
プロトコール３により、全画分のｐＨを測定し、キシラナーゼ阻害剤を示した。
【０１３５】
（アミノ酸配列）
調製精製法によって得られた精製阻害剤の試料（３３０ｍｌSuperdex 75 PGによる画分３３から得た）が用いられた。該試料２００μｌを、C4 Reverse Phase column（Applied Biosystems）にかけた。Ａ：水に０．１％ＴＦＡを添加したもの、及びＢ：１００％アセトニトリルに０．１％ＴＦＡを添加したものを緩衝液系として用いた。このランによる阻害剤ピークを、カルボキシメチル化して、Ｃ４カラムにて再度ランを実行した。かかる方法によって、目的とする阻害剤ペプチド２種を得た。これらのペプチドのＮ末端における配列決定を行った。さらに上記ペプチド２種をLys-Cによって消化した。逆相クロマトグラフィーにより、得られたペプチドを回収してアミノ酸配列決定した。アミノ酸配列決定により得られた配列を確認するため、目的試料の小断片をＭＳ（Voyager社製）を用いて分析した。
【０１３６】
（阻害剤キネティックス）
プロトコール５に従って、阻害剤アッセイを行った。この点に関し、阻害剤に対する予備的な特徴化を行うために用いたキシラナーゼは９８０６０１であり、このキシラナーゼを４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈し、小麦粉９８００２から阻害剤を抽出した。Ｋ1測定を行うために用いたキシラナーゼは、９８０６０１、９８０６０３、９８０８０１、９８０９０１、９８０９０３、９８０９０６、及び９８０９０７であり、これらのキシラナーゼを約４０ＴＸＵ／ｍｌに希釈して用いた。Ｋ1測定に用いた阻害剤は、小麦粉９８０５８から抽出した。
【０１３７】
（ｐＨとの関連における阻害剤の測定）
プロトコール３に以下の修正を加えて実験を行った。６５０μｌ、ｐＨ５．０の緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム）を本アッセイで使用するが、これ以外にもｐＨが４、６、及び７である同じ緩衝液系も本アッセイに使用できる。
【０１３８】
（エンド−β−１，４−キシラナーゼ類）
以下のキシラナーゼ調製物を使用した。
９８０６０１（ＢＸ）：大腸菌において発現されるDaniscoの新規細菌性キシラナーゼの精製調製物（１２２５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０６０３（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hmのものと同一）の精製調製物（１０５０ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０８０１（Ｘ１）：Aspergillus niger由来の精製Ｘ１（８４００ＴＸＵ／ｇ）
９８０８０２（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hmのものと同一）の精製調製物（２６５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０１（Novo）：Novo's Pentopan mono BG由来のThermomycesキシラナーゼの精製調製物（２９００ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼであるBacillus sub.の精製変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０６（ＸＭ３）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼであるBacillus sub.の精製変異体（１７７５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０７（ＸＭ２）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼであるBacillus sub.の精製変異体（１００ＴＸＵ／ｍｌ）
９５３５（Ｘ３）：Aspergillus niger由来の精製キシラナーゼＸ３（６４９０ＴＸＵ／ｍｌ）
【０１３９】
（単離及び特徴化のための阻害剤抽出）
小麦粉（９８０２６）１００ｇを抽出した。遠心分離にかけた後、１５０ｍｌの上清を得た。この抽出物における阻害剤の存在を調べたところ（表６）、その結果はポジティブだった。表６には、キシラナーゼ９８０６０１を使用し、小麦粉（９８０２６）阻害剤抽出物の＋／−添加による残存活性の結果が示されている。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
（阻害剤単離）
阻害剤抽出物７５ｍｌを５００ｍｌゲル濾過カラムにかけた（図３）。阻害剤を検出したところ、画分［４〜１１］において阻害剤が認められた。７５ｍｌの阻害剤抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分のキシラナーゼ阻害剤アッセイを行った。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。表７に示されるように、画分［４〜１１］において阻害剤が認められた。かかる阻害剤をそれぞれのランでプールし、プールした量は２回分で２４０ｍｌだった。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
ゲル濾過カラムの両ランにおける阻害剤ピークのプールは、約２４０ｍｌだった。ゲル濾過で得た２４０ｍｌのプールを陽イオン交換器を用いて２回処理した。フロースルーの結果は阻害剤ネガティブだった。図４及び表８から明らかなように、約７５０ｍＭのＮａＣｌにおいて阻害剤はカラムに結合し、溶離した。
ゲル濾過した阻害剤抽出物２４０ｍｌを陽イオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた画分のアッセイを行って、キシラナーゼ阻害剤の存在を確認した。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。画分［４４〜５４］において阻害剤が存在していた。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
陽イオン交換のランで得られた阻害剤のプールは、１ランにつき１１０ｍｌだった。これらプールした２画分に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えて１．０Ｍにし、２回のランでＨＩＣカラムにかけた。フロースルーで阻害剤を検出したところ、ネガティブだった。図５及び表９から明らかなように、全ての阻害剤がカラムに結合し、好ましい分離を得ることができた。ＨＩＣクロマトグラフィーによる画分分析の結果が表９に示されている。
１４７ｍｌの阻害剤抽出物をＨＩＣクロマトグラフィーにかけて得られた画分のキシラナーゼ阻害剤のアッセイを行った。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。画分［１５〜２３］に阻害剤が存在していた。ＨＩＣクロマトグラフィーで得られた画分１７及び１８を２回程度濃縮し、分取ゲル濾過カラムにかけた（図６）。
【０１４６】
【表９】
【０１４７】
かかる予備的濾過カラムにおける画分の分析結果を表１０に示す。表１０には、濃縮阻害剤試料２ｍｌを分取ゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分におけるキシラナーゼ阻害剤の存在を確認するアッセイの結果が示されている。画分［３１〜３３］において阻害剤が存在していた。
【０１４８】
【表１０】
【０１４９】
（プロテアーゼ活性分析）
キシラナーゼ阻害剤に関する上記のアッセイからは、小麦粉抽出物と混合したときのキシラナーゼ活性低下が、キシラナーゼのタンパク質分解性加水分解に依るものではない可能性を除外することはできない。そこで精製キシラナーゼを「阻害剤」抽出物共存下でインキュベートした。図７及び８から明らかなように、加水分解は生じなかったと考えられる。活性阻害剤のクロマトグラムの方が、少しではあるが、バックグラウンドが大きかった（図８）。しかし、このバックグラウンドは阻害剤のみのクロマトグラムに相当している（阻害剤のクロマトグラムは示さず）。バックグラウンドの差は、煮沸した阻害剤試料の沈殿によるものである。
【０１５０】
（阻害剤の特徴化）
（分析用ゲル濾過クロマトグラフィー）
２回目のＨＩＣランの画分１８における２回濃縮した阻害剤試料１００μｌを、２４ｍｌ分析用Superdex 75 10/30（Pharmacia社製、スウェーデン）にかけた（図９）。溶離液を２ｍｌ画分として回収した。これらの画分のキシラナーゼ阻害剤アッセイを行った。濃縮阻害剤試料１００μｌを分析用ゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分におけるキシラナーゼ阻害剤の存在をみるためにアッセイを行った結果が表１１に示されている。画分［６〜７］において阻害剤が認められた。
【０１５１】
【表１１】
【０１５２】
濃縮した（up-concentrated）阻害剤試料をゲル濾過した後、４種類の標準分子量タンパク質を、全く同じ手順でカラムにかけた（クロマトグラフは示さず）。表１２に、上記タンパク質の分子量及び溶離時間をまとめた。標準タンパク質を阻害剤の分子量（ＭＷ）測定のために用い、表１２中の略語及び数式は表下に示した。
【０１５３】
【表１２】
【０１５４】
Ｋａｖの作用としてｌｏｇ（ＭＷ）をプロットする。公式化ができることから、未知分子の分子量を推定できる（図１０）。図１０から導き出された公式、及び阻害剤の保持時間から、阻害剤の分子量の算出が可能になる。
ＭＷ、ｋＤａ＝１０(-2.4485×Kav+1.9602)
＝１０(-2.4485×0.173559+1.9602)
＝１０1.5352
＝３４．２９
【０１５５】
計算した阻害剤の分子量は、本発明者らがRouau及びSurget（1988, Evidence for the presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flour. Journal of Cereal Science. 28:63-70）の報告をもとに予想していたより高く、そのＭＷ（分子量）は約８ＫＤａだった。ゲル濾過により算出されるＭＷは、阻害剤分子数種が集合することから説明し得る。詳細を知るために、分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得た画分３１、３２、及び３３に対して、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルのランを実行した（図１１）。上記ゲルに示されるように、精製した阻害剤試料と共に処理したレーンに３つのバンドが現れた。これらのバンドは分子量が約４０、３０、及び１０ｋＤａであるタンパク質に相当する。
【０１５６】
（ＭＳを用いた分子量測定）
分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得た阻害剤の画分３３を、Presorbシステム及び５容量の２０ｍＭ酢酸により脱塩した。脱塩処理した画分２００μｌを、C4 Reverse Phase column（Applied Biosystems）にかけた。このランにおいてはピークが３つ認められた。これらピークの内の１つ（ピーク３）が明らかに優勢であり、阻害剤であると考えられた（図１２）。このランで認められた他の２つのピークについても配列決定した。得られた配列から、これらは全て同じ小麦粉タンパク質Serpin由来であり、阻害剤（ピーク３）と同一ではなかった。よってピーク３が目的とするキシラナーゼ阻害剤であるとの結論が得られた。ＭＳ(Voyager社製)を用いて、ピーク３の特徴化をさらに行った。シナピン酸をマトリックスとして用いたＭＳ分光分析により、３９５０３Ｄａのタンパク質に相当するシグナルが認められた（図１３）。
【０１５７】
上述したように、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルからは３つのバンドが認められた。１０ｋＤａ近辺、３０ｋＤａ近辺、及び４０ｋＤａ近辺にそれぞれ１つのバンドがみられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明するために、上述の条件と同一条件下で、精製したドミナント画分を回収し、減圧凍結乾燥し、カルボキシメチル化した後、Ｃ４カラムに戻した。カラムに戻したことにより得られた画分（図１４）をＭＳにより分析した。図１５、１６から明らかなように、これらのポリペプチドの分子量（ＭＷ）は、１２１０４及び２８２２２Ｄａだった。かかるキシラナーゼ阻害剤は、元々ジ−ペプチド（ＭＷ３９５０３Ｄａ）であったか、或いは分析過程において変性及び還元（ＭＷがそれぞれ１２１０４及び２８２２２Ｄａである２つのペプチド）されたかのどちらかであると考えられる。
【０１５８】
（ＩＥＦ及びクロマトフォーカシングクロマトグラフィーによるキシラナーゼ阻害剤のｐｌ測定）
ＩＥＦゲルにおいては、アルカリ性領域に３つのバンド（それぞれ約９．３、８．６、及び８．２）が認められ、酸性領域に３つのバンド（それぞれ５．１、５．３、及び５．５）が認められた（図１７）。この結果からだけでは、無処理のキシラナーゼ阻害剤のｐｌを決定するのは無理であると考えられる。この点に関しては、かかる試料にはキシラナーゼ阻害剤及び約４５００ＤａのSerpinの３断片だけが含まれていることが、配列決定から明らかになっている。Serpinのｐｌを理論的に計算した結果は５．５８であり、配列決定により得られた断片により計算したｐｌは５．４６（Swiss Prot programmesを使用した）だった。このことから、上記ゲルにみられた３つの酸性バンドは、逆相クロマトグラフィー（図１２）で認められたSerpinの３つのピークであり、また３つのアルカリ性バンドは、キシラナーゼ阻害剤の異なる３形態（天然のジ−ペプチド形態、及び２つのペプチド）であることが示唆される（配列決定から示唆される）。
【０１５９】
図１８に示すクロマトフォーカシングクロマトグラフィーの結果から明らかなように、キシラナーゼ阻害剤は所定の条件下ではカラムに結合しない。これは天然のキシラナーゼ阻害剤のｐｌは８．５若しくはそれ以上であることを意味する。よって上述の推定、つまりＩＥＦゲル上に３つのアルカリ性バンドがあることから３種類のキシラナーゼ阻害剤の形態が考え得るという推定は正しいと思われる。
天然のキシラナーゼ阻害剤のｐｌは、８．０〜９．５の間であると結論づけられる。かかる幅内に３つのバンドがある。かかる３バンドは恐らく３形態で存在していると考えられるキシラナーゼ阻害剤に相当している（ＩＥＦによる結果を参照されたい）。この点に関して、ＩＥＦを用いるときには、タンパク質は天然のタンパク質のままランを行うが、ジ−ペプチドタンパク質の中にはＩＥＦ法により部分的に損傷を受けるものがあり、その結果１以上のバンドが出現することがある。
【０１６０】
（配列データ）
阻害剤を形成する２つのペプチドは配列決定され、Ｎ末端及び内在配列が決定された。配列決定の結果は、添付の配列表に配列番号１３〜１９として示した。
第１鎖（Ａ鎖）を形成する配列を、配列番号１３及び１４として示した。第２鎖（Ｂ鎖）を形成する配列を配列番号１５〜１９として示した。配列決定したポリペプチドと相同性を有するポリペプチドをデータベース上で検索したが、その結果はネガティブだった。いずれのポリペプチドも、かつて配列決定されたことも記載されたこともなかった。
【０１６１】
（種類の異なるキシラナーゼ類に対する阻害剤の効果）
種々のキシラナーゼの阻害を考察する目的でいくつかの実験を行った。先ず本発明者らは、キシラナーゼ活性の低下は、抽出物におけるタンパク質分解作用によるものであると考えた。そこで「阻害剤」抽出物の分量を様々に変えて、種々のキシラナーゼをインキュベートした（図１９）。かかるキシラナーゼ類は、程度の差はあれ阻害を受けていた。「阻害剤」濃度条件により、阻害活性が上昇することも見いだした。図１９に示す結果から、タンパク質分解作用又は阻害剤によりキシラナーゼ活性が低下することが示された。しかし一定のキシラナーゼ及び一定濃度の阻害剤による経時実験の結果、並びに「プロテアーゼ活性分析」に基づく上述の結果からは、活性低下が時間の経過に伴って生じることを明らかにできなかった。プロテアーゼと阻害剤を識別するために正式なキネティックスを行った（「阻害剤キネティックス」を参照のこと）。
【０１６２】
Bacillus subtillisキシラナーゼ２種を、そのベーキングに及ぼす効果に着目して詳細に研究した。これらのキシラナーゼは機能的に若干違いがみられ、同量を添加して焼いたときに１種類のキシラナーゼを添加した製品の嵩が幾分大きかった。その理由の１つとして、小麦粉において上記キシラナーゼ類の活性が阻害される程度が異なることが挙げられる。このことを確認するために実験を行った。阻害剤の供給源として小麦粉を２種類用い、かかる実験を２回繰り返して行った。表１３には、種類の小麦粉（９８００２及び９８０２６）から抽出した阻害剤により、２種類のキシラナーゼ（９８０６０１及び９８０６０３）が受ける阻害の結果が示されている。阻害は、％阻害及び％残存活性として算出し、ブランクと比較した。かかる実験からこれら２種類のキシラナーゼは、阻害剤によって程度の差はあるが阻害されることがわかる。上記キシラナーゼ２種は、６アミノ酸が異なるだけである。
【０１６３】
【表１３】
【０１６４】
９８０６０１を基礎として３種のキシラナーゼ変異体を作出した（ＸＭ１、ＸＭ２、及びＸＭ３）。これらの変異体を分析して阻害を調べた（図２０）。図２０から明らかなように、上記変異体３種における残存活性は異なるが、これはキシラナーゼ阻害剤により異なる程度の阻害を受けていることを意味している。５種類のキシラナーゼの内４種類（ＢＸ、R▲o▼hm、ＸＭ１、及びＸＭ３）のキシラナーゼが同じ特異的活性（約２５０００ＴＸＵ／ｍｇのタンパク質）を備えている。ＸＭ２は同様の特異的活性を有していると予想される。ＸＭ１とＸＭ２における阻害の差は、約２５０％である（ＸＭ１の残存活性は、ＸＭ２の静止活性の２．５倍と高い）。この差は１個のアミノ酸に起因する。ＸＭ２のアミノ酸１２２は、アルギニンからアスパラギンに変化し、活性部位近辺で陽電荷の減少をもたらす。
【０１６５】
（阻害剤キネティックス）
阻害剤が拮抗阻害剤であるか非拮抗阻害剤であるかを決定することだけを対象として、簡便な予備的キネティックスを行った。一定のキシラナーゼ及び一定の阻害濃度条件下で、基質の量を様々に変化させてインキュベートした（図２１）。図２１からわかるように、阻害剤存在下のキシラナーゼ及び阻害剤非存在下のキシラナーゼ双方のＶmaxは、約１．１９だった。このことからこの阻害が拮抗阻害であることが示唆される。
上述の予備的阻害実験では、検討したキシラナーゼ類の間でＫ1値が異なることを示していたため、キシラナーゼ数種の正式なＫ1値を測定した。図２２のデータが示すように、キシラナーゼ種間におけるＫ1値には有意の差がみられた。簡単な予備的阻害の特徴化により示された結果が、このことから確認された。
【０１６６】
（ｐＨと阻害との関係）
異なるｐＨにおいてキシラナーゼ阻害剤の存在が容易に認められることから、キシラナーゼ阻害にｐＨが何らかの影響を及ぼしていると考えられる。そこでかかる影響を調べるために実験を行った。図２３から明らかなように、キシラナーゼ阻害はｐＨの影響を受ける。図２４には、キシラナーゼに対する最適ｐＨが示されている。これらの２曲線を比較すると、Novoキシラナーゼ（９８０９０１）のｐＨ４での測定を別にすれば、キシラナーゼにとっての最適ｐＨにおいて最大阻害が生じることがわかる。
【０１６７】
本発明のアッセイにより測定した阻害率が、生地と関連性を有しているかを調べるために計算を行った。
阻害剤抽出
小麦粉（グラム）： ６
水（ｍｌ）： １２
小麦粉ｇ／ｍｌ： ０．５
アッセイにおける小麦粉（ｇ）： ０．０５
キシラナーゼ溶液
ＴＸＵ／ｍｌ： １２
アッセイでのＴＸＵ／ｍｌ： ３
阻害剤：キシラナーゼの割合
小麦粉ＴＸＵ／ｋｇ：６００００（阻害剤アッセイ時）
小麦粉ＴＸＵ／ｋｇ：３０００（ベーカリーへの使用時）
上記の計算から、アッセイにおける阻害剤：キシラナーゼの割合は、生地に含まれるときの割合よりも、アッセイにおける割合の方が２０分の１と低い結果になった。これはキシラナーゼが生地に含まれるときに、より顕著に阻害されることを意味している。しかしながら、移動度及び水分活性は生地における方が低く、このことが阻害に影響を及ぼしているとも考えられる。
【０１６８】
小麦粉には、内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が存在している。かかる阻害剤は、水を用いた簡便な抽出法により小麦粉から抽出でき、この阻害剤が水溶性であることを示している。阻害剤はゲル濾過、イオン交換、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー技術により精製される。
分析用ゲル濾過クロマトグラフィー、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、逆相クロマトグラフィー、及びＭＳを用いた精製阻害剤の特徴化により、約４０ｋＤａのポリペプチドが見いだされた。このポリペプチドは、分子量がそれぞれ１２１０４及び２８２２２Ｄａである２つのペプチドを含むジ−ペプチドであることが判明した。上記精製阻害剤（厳密には２つのペプチド）は、Ｎ末端で配列決定され、次に、得られたペプチドの消化及び配列決定を行った。
【０１６９】
阻害剤を用いた予備実験は、キシラナーゼ活性の低下は、タンパク質分解作用に起因することを示している。しかし、インキュベーション（キシラナーゼ＋阻害剤）の分析結果及び阻害剤のキネティックスは、観察されたキシラナーゼ活性の低下は、拮抗阻害によるものであることを示している。
キシラナーゼ数種類を用いた阻害剤実験からは、阻害剤に対する感受性の違いが見受けられる。キシラナーゼの中には、阻害剤によってほぼ１００％阻害されるものも数種類ある（小麦粉においてよりも、低い阻害剤：キシラナーゼの割合）。ｐＨを様々に変化させて阻害剤アッセイを行ったところ、阻害剤はアッセイにおいては、高度にｐＨ依存性であることが判明した。キシラナーゼ変異体を調べたところ、アミノ酸を１個換えることは、阻害を２５０％減少させることを意味した。
【０１７０】
上述の結果を確認するために、キシラナーゼ数種のＫ1値を測定した。その結果から、使用したキシラナーゼの種類によってＫ1値が異なることが判明し、予備結果においてみられたキシラナーゼと阻害剤に対する耐性の違いとの相関関係が確認された。
【実施例３】
【０１７１】
実施例３（ベーキングテスト）
以下のデータは、ＸＭ１変異体を使ったベーキング実験から得たものである。かかる新規のキシラナーゼ変異体が、嵩の点において明らかにＢＸ（Bacillus subtilis野生型）に勝っていることが、このデータから読みとれる。粘度測定結果からは、上記２種のキシラナーゼ間に有意の差は認められなかった。
（酵素）
９８０９０２（ＢＸ）：大腸菌において発現され、精製したBacillus sub.野生型キシラナーゼ（２０００ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現され、精製したBacillus sub.野生型キシラナーゼ変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ）
（小麦粉）
デンマーク産小麦粉、バッチ番号９８０２２
【０１７２】
（ベーキングテスト：ハードクラストロール）
小麦粉２０００ｇ、乾燥酵母４０ｇ、砂糖３２ｇ、塩３２ｇ、GRINDSTEDTMPanodanA2020 ４ｇ、水４００Brabender Units＋４％を、Hobartミキサーを用い、ロースピードで２分間、ハイスピードで９分間のフックで捏和した。生地の温度は２６℃だった。生地を１３５０ｇ計量し、３０℃で１０分間寝かせて、次にFortunaモールドに流し込んだ。３４℃、８５％ＲＨで４５分間プルーフした後、Bagoオーブンで２２０℃で１８分間焼成し、１２秒間蒸らした。
荒熱をとった後、ロールパンを計量し、パンの容積をrape seed deplacement法により測定した。
比容積＝ パンの容積（ｍｌ）／パンの重さ（ｇ）
【０１７３】
（粘度測定）
粘度測定は、プロトコール２に従って行った。
表１４から明らかなように、新規のキシラナーゼ変異体（ＸＭ１）を添加すると、ＢＸを添加したときに比べ、パン嵩が顕著に増した。表１４には、２種類のキシラナーゼ（ＢＸ及びＸＭ１）の分量を様々に変えて添加したときのパン嵩増量分（ｍｌ／ｇ）及び粘度（ｇ×ｓ）が示されている。また、表１４のデータは、図２５、２６、及び２７に示されている。
【０１７４】
【表１４】
【実施例４】
【０１７５】
実施例４（ＸＭ１、R▲o▼hm Veron specialキシラナーゼ、及びR▲o▼hm Veron Specialキシラナーゼの精製物と生地の粘度との関係）
新規キシラナーゼのＸＭ１添加により、R▲o▼hm's Veron Specialキシラナーゼ（さらに該キシラナーゼを精製したもの）を添加したときよりも、生地の粘度が増減するか否かを調べるために生地を調製し、キシラナーゼの作用結果としての粘度を測定した。
（小麦粉）
デンマーク産小麦粉、バッチ番号９８０２２を使用した。
（生地の調製）
生地は、プロトコール２に従って調製した。生地を混合し、粘度測定を行う前に密封容器において、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。
（粘度測定）
粘度測定は、プロトコール２に従って行った。
（酵素）
９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現されるBacillus sub.野生型の精製変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ）
＃２１９９：R▲o▼hm Veron Specialキシラナーゼ（１０５００ＴＸＵ／ｇ）
９８０６０３（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hm'sと同じ）の精製調製物（１０５０ＴＸＵ／ｍｌ）
粘度測定を行うために以下の生地を作製した（表１５）。
【０１７６】
【表１５】
【０１７７】
表１５に示される生地を用いて、表１６の粘度測定結果が得られた。表１６には、精製R▲o▼hmキシラナーゼ、コントロール、ＸＭ１、及びR▲o▼hm's Veron Specialキシラナーゼを使用して調製した生地の粘度測定結果が示されている。上記データは、図２８、２９、及び３０に示されている。
ＸＭ１を使用したときの粘度増加量は、精製R▲o▼hmキシラナーゼを使用したときの粘度増加量より少なかった。未精製のR▲o▼hmキシラナーゼを使用したときの粘度増加量は、それと比べかなり多かった。
【０１７８】
【表１６】
【実施例５】
【０１７９】
実施例５（細菌性エンド−β−１，４−グルカナーゼと生地の粘度との関係）
以下の結果は、細菌性エンド−β−１，４−グルカナーゼが粘度に与える影響を調べるために行った実験から得られたものである。
（酵素）
９８１１０２−１（Xyl）：Veron Special製品のR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの精製調製物に相当する。かかる調製物は精製キシラナーゼであり、エンド−β−１，４−グルカナーゼを全く含まない（３５０ＴＸＵ／ｍｌ）。
９８１１０２−２（Xyl＋Gluc）：Veron Special製品のR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの精製調製物に相当し、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（９００ＴＸＵ／ｍｌ＋１９ＢＧＵ／ｍｌ）を含む。
【０１８０】
（キシラナーゼアッセイ）
プロトコール１に従ってキシラナーゼアッセイを行った。
（グルカナーゼアッセイ）
プロトコール４に従ってグルカナーゼアッセイを行った。
（小麦粉）
デンマーク産小麦粉バッチ番号９８０５８を使用した。４００ＢＵにおける水分吸収率は６０％だった。
（生地の調製）
生地はプロトコール２に従って調製した。生地を混合した後、密封容器にて３０℃でそれぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。
（粘度測定）
粘度測定はプロトコール２に従って行った。表１７に示した生地を作製し、粘度測定を行った。
【０１８１】
【表１７】
【０１８２】
表１７に示した生地により、表１８に示される粘度測定の結果が得られた。表１８には、キシラナーゼを添加した生地、並びにキシラナーゼ及びグルカナーゼを添加した生地の粘度測定の結果が示され、表１８中の生地番号は、表１７の生地番号に対応している。表１８中、Stik#１０は、生地を１０分寝かせた後に粘度測定を行った結果を、Stik#４５は、４５分寝かせた後に粘度測定を行った結果をそれぞれ示す。表１８から明らかなように、生地にエンド−β−１，４−グルカナーゼを添加すると、生地の粘度は増す。表１８に示した結果を図３１に図示した。
【０１８３】
【表１８】
【０１８４】
要約すると本発明は、実施例に示しながら、以下のものを提供するものである。
ａ．小麦粉から内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を単離すること。
ｂ．小麦粉から単離した内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の特徴化を行うこと。
ｃ．種類の異なるキシラナーゼ類に対し内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が及ぼす効果の特徴化。
ｄ．内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類の選択方法。
ｅ．エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類の選択方法。
ｆ．真菌性キシラナーゼ類を含む生地に比べ、好ましい嵩と程良い粘度を備えた生地を提供するキシラナーゼ類。
ｇ．キシラナーゼ類のスクリーニング方法及び／又は内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を用いて該キシラナーゼを変異させる方法、並びに該キシラナーゼ類又は変異体を生地製造に用いる方法。
ｈ．本発明のキシラナーゼ類を用いて調製した食品。
【０１８５】
本明細書において引用した全ての刊行物は、参考として引用した。当該技術の専門家であれば、本発明の範囲及びその精神から逸脱することなく、本発明において説明した方法及びシステムに様々な修正及び変更を加えることが可能であるのは明白である。特に好ましい実施例を用いて本発明の説明を行ったが、ここにクレームした発明は、これらの実施例に限定されるべきではない。実際、ここに述べた本発明の実施形態に対し、生化学及びバイオテクノロジー又はその関連分野の専門家が充分考慮し得る種々の変更は、本発明のクレームの範囲内でなければならない。
【０１８６】
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】キシラナーゼの種類、添加量、及び寝かせた時間と粘度の関係を示す図である。
【図２】キシラナーゼの種類、添加量、及び寝かせた時間と粘度の関係を示す図である。
【図３】７５ｍｌの阻害剤抽出試料をゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：５００ｍｌSuperdex G-25 F、フロー：１０ｍｌ／分、画分サイズ：３０ｍｌ
【図４】ゲル濾過にかけた２４０ｍｌの阻害剤抽出試料を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：５０ｍｌSepharose SP、フロー：５．０ｍｌ／分、画分サイズ１０ｍｌ
【図５】１４７ｍｌのイオン交換阻害剤抽出試料に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加え１．０ＭにしたものをＨＩＣクロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：１０ｍｌPhenyl ＨＩＣ、フロー：２．０ｍｌ／分、画分サイズ：２．５ｍｌ
【図６】２ｍｌの濃縮阻害剤試料を分取ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。阻害剤は１７６ｍｌで溶離した。カラム：３３０ｍｌ Superdex 75 PG （Pharmacia社製)、溶離液：５０ｍＭのＮａＯＡｃ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０。フロー：１ｍｌ／分、画分サイズ：５．５ｍｌ
【図７】純粋キシラナーゼ＋煮沸阻害剤抽出物の陽イオン交換クロマトグラムを示す図である。試料：１ｍｌの脱塩９８０６０１＋煮沸阻害剤抽出物。カラム：１ｍｌ Source S 15、緩衝液系：Ａ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ。フロー：２ｍｌ／分
【図８】阻害剤抽出物共存下での３時間にわたるインキュベーション後の純粋キシラナーゼの陽イオン交換クロマトグラムを示す図である。試料：１ｍｌの脱塩９８０６０１＋阻害剤。カラム：１ｍｌ Source S15、緩衝液系：Ａ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ。フロー：２ｍｌ／分
【図９】１００μｌの濃縮阻害剤試料を分析用ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。阻害剤は１０．８１ｍｌで溶離した。カラム：２４ｍｌ Superdex 75 10/30（Pharmacia社製、スウェーデン）、溶離液：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、フロー：０．５ｍｌ／分、画分サイズ：２．０ｍｌ
【図１０】Superdex 75 10/30でランにかけて標準タンパク質のＫａｖとＬｏｇ（ＭＷ）との関係を調べた結果を示す図である。
【図１１】分取ゲル濾過により得られた画分３１、３２及び３３のＳＤＳ ＰＡＧＥの結果を示す図である。１列目及び３列目は、ＭＷマーカーである（Pharmacia's LMW markers,スウェーデン）。２列目及び４列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μｌを投入した画分３２である。６列目及び８列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μｌを投入した画分３１である。７列目及び９列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μｌを投入した画分３３である。
【図１２】ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３の逆相クロマトグラムを示す図である。クロマトグラムでは４つのピークが明確に示されている。ピーク３はキシラナーゼ阻害剤である。ピーク４、５、及び６の配列決定を行ったところ、小麦タンパク質であるSerpinと高度な相同性を示した。
【図１３】逆相クロマトグラフィーで得られた画分３のＭＳの結果を示す図である。分光分析から、分子量３９５０３Ｄａの分子が一個見いだされた。
【図１４】画分３３を逆相クロマトグラムにかけて得られたカルボキシメチル化された画分３（図１２参照）を逆相クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。かかるクロマトグラムでは、ジ−ペプチドを示唆する２個の明確なピークが明らかになった。
【図１５】カルボキシメチル化逆相クロマトグラフィー（図１４参照）で得られた画分２をＭＳにかけた結果を示す図である。分光分析から分子量１２１０４Ｄａのペプチドが明らかになった。
【図１６】カルボキシメチル化逆相クロマトグラフィー（図１４参照）で得られた画分３をＭＳにかけた結果を示す図である。分光分析から分子量２８２２２Ｄａのペプチドが明らかになった。
【図１７】分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３及び３４をＩＥＦにかけた結果を示す図である。２列目はｐｌ３〜１０標準、３列目はｐｌ２．５〜６．５標準、４列目及び５列目はそれぞれ画分３３及び画分３４、６列目はトリシン阻害剤（ｐｌ４．５５）、７列目はβ−ラクトグロブリン（ｐｌ５．２０）、また８列目及び９列目はそれぞれ画分３３及び３４である。矢印は、認められた画分３３のバンドを示す。
【図１８】キシラナーゼ阻害剤のクロマトフォーカシングクロマトグラフィーから明らかになった、ｐＨ及び相対的ＯＤ（阻害剤アッセイより）と画分との関係を示す図である。図からわかるように画分７においてＯＤが相対的に減少しているが、これは阻害剤活性によるものである。このときのｐＨは９．４である。
【図１９】キシラナーゼ４種類の残存活性％と、阻害剤濃度との関係を示す図である。用いたキシラナーゼ４種は、◆＝Ｘ１、■＝Ｘ３、×＝ＢＸ、▲＝Novoである。
【図２０】小麦粉抽出物共存下でのインキュベーション後における９８０６０１（coli-1）、９８０６０３（Belase）、及び９８０６０１の変異体３種（ＸＭ１、ＸＭ２、及びＸＭ３）の残存活性を示す図である。
【図２１】キシラナーゼ（９８０６０１）＋／−阻害剤のラインウィーバー・バークプロット（二重逆数プロット）を示す図である。基質濃度は％アゾキシランである。Ｖは、アッセイにおける相対的ＯＤ５９０である（１００がＳ＝２％のとき）。
【図２２】種々のキシラナーゼのＫ1値をμｌ阻害剤として示した図である。
【図２３】３種類のキシラナーゼ（９８０６０１＝Bac. Sub. wt、９８０８０１＝Ｘ１、及び９８０９０１＝Thermomyces）の阻害とｐＨとの関係を示す図である。関連のブランクを基質にしてデータを得た。
【図２４】３種類のキシラナーゼ（９８０６０１＝ＢＸ、９８０８０１＝Ｘ１、及び９８０９０１＝Novo）の最適ｐＨ条件を示す図である。
【図２５】比容積＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２６】比容積増加量＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２７】粘度＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２８】１０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後で測定した粘度と種々のキシラナーゼ調製物及びコントロールとの関係を示す図である。９８０６０３は精製したR▲o▼hmキシラナーゼを、ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図２９】１０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後の、粘度の増加と３種類のキシラナーゼ調製物の関係を示す図である。９８０６０３は精製したR▲o▼hmキシラナーゼを、ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図３０】１０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後の、粘度の増加と２種類のキシラナーゼ調製物の関係を示す図である。ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図３１】粘度の増加とエンド−β−１，４−グルカナーゼ添加との関係を示す図である。１：キシラナーゼ無添加のコントロール生地、２：７５００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉、３：７５００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉＋１５８ＢＧＵ／ｋｇ小麦粉、４：１５０００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉、５：１５０００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉＋３１６ＢＧＵ／ｋｇ小麦粉を示している。１０分（Stik#１０）及び４５分（Stick#４５）後に生地の測定を行った。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質に関する。特に本発明は、小麦粉に含まれる内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の単離に関し、また該阻害剤が種々のキシラナーゼに及ぼす効果を特徴化することに関する。本発明はさらに、該阻害剤を用いたスクリーニングにより同定されたキシラナーゼ、及びかかるスクリーニングにより同定された新規のキシラナーゼに関する。
【０００２】
［従来の技術］
キシラナーゼは、ここ数年製パンに使用されてきた。このことに関しては、小麦粉には内胚乳細胞壁由来のアラビノキシランが含まれていることが知られている。小麦粉に含まれるアラビノキシランの量は小麦粉の種類によって異なり、Rouau et al, Journal of Cereal Science, (1994), 19, 259-272, Effect of an Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the Bread-making Quality of Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties、Fincher and Stone, (1986) Advances in Cereal Technology, Vol. VIII (Why Pomeranz, Ed.) AACC, St.Paul, Minnesota, 207-295、及びMeuser and Suckow (1986), Chemistry and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P J Frasier and T Gillard, Eds.) Royal Society of Chemistry, London, 42-61が、文献例として挙げられる。一般的にアラビノキシラン量は、２〜５％（小麦粉乾燥量に基づく（ｗ／ｗ））である。
【０００３】
Fincher and Stone(1986)は、内胚乳細胞壁における多糖類の７０％はアラビノキシランであると報告している。アラビノキシランの特徴は、水への結合力である。アラビノキシランの一部分は不溶性ペントサン（ＷＩＰ）であり、また一部分は水溶性ペントサン（ＷＳＰ）である。ＷＩＰの高分子量（ＨＭＷ）水溶性重合体への分解と、パン嵩との間に相関関係があることが実験結果から明らかにされている。
【０００４】
パン製品の製造過程で、適正量のキシラナーゼを使用することにより、生地系（通常、塩、小麦粉、酵母、及び水からなる）がより安定することが知られており、例えばパン嵩が増したふっくらとしたパンを製造することができる。
この点に関し、パン嵩を増すために良好なキシラナーゼとは、ＷＩＰを可溶化し、ＷＳＰをキシロースオリゴマーまで分解することなく生地液の粘度を増加させるものをいう。ＷＩＰが低分子量（ＬＭＷ）ＷＳＰに分解されると、生地が損なわれ、粘度増加につながると考えられている（Rouau et al and McCleary (1986) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349-354）。
【０００５】
米国特許５３０６６３３号明細書には、Bacillus subtilis株から得たキシラナーゼが開示されている。かかるキシラナーゼは、該キシラナーゼを含むパン及び焼き製品のコンシステンシーを改良し、嵩の増量に寄与すると考えられている。
Bacillus subtilisからはこの他にもキシラナーゼが単離され、配列決定がなされている（Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. and Yaguchi, M. A xylanasse gene from Bacillus subtilis: nucleotide sequence and comparison with B. pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201-206 (1986)を参照のこと）。
細菌性キシラナーゼを使用すると、非常に粘度の高い生地になると考えられてきた。そのため、Bacillus subtilis由来のキシラナーゼ（例えば米国特許５３０６６３３号明細書に開示された）を用いると非常に粘度の高い生地になると考えられていた。
【０００６】
粘度増加の原因となる先行技術における酵素は、粘度が逆に効率的大量生産上の取扱いを困難にさせることがないように、その使用量を注意深く調整する必要がある。しかし使用量を注意深く調整しなければならないということは、生地製造の前にキシラナーゼを直接小麦粉に加えることができないことを意味する。従って、先行技術によるシステムでは、生地製造過程において極めて注意深くキシラナーゼを加えなければならなかった。
【０００７】
真菌性キシラナーゼは、今日に至るまでベーキングに一般的に用いられてきた。例えばJ Maat et al.（Xylans and xylanases, J Visser et al著, 349-360, Xylanases and their application in bakery）は、Aspergillus niger var. awarmori株から産生されるβ−１，４−キシラナーゼについて教示している。J Maat et al.らによると、かかる真菌性キシラナーゼは、明らかにパン嵩増量に効果的であり、他の種類の真菌、又は細菌由来のキシラナーゼを用いるときにみられるような生地取扱い上の不利益（生地の粘度）を生じることなく、パン嵩を増量できると述べている。
【０００８】
W Debyser et al.,（J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 153-156, 1997, Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt: Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat）は、キシラナーゼ阻害剤が小麦粉に含まれている可能性について言及している。W Debyser et al.が論じている該阻害剤は単離されていない。さらにW Debyser et al.は、該阻害剤が内因性であるか又は微生物由来であるかについても言及していない上に、かかる阻害剤に関する化学的データも全く提示していない。
【０００９】
キシラナーゼ阻害剤の小麦粉における存在については近年X Rouau and A Surget, （Journal of Cereal Science, 28 (1998) 63-70, Evidence for the Presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours）も論じている。Debyser et al.,と同様に、Rouau and Surgetも、小麦粉の水溶性画分における、添加ペントサナーゼ活性を抑制する熱不安定性成分の存在を同定したと考察しているが、Debyser et al.,と同様に、阻害剤を単離しておらず、該阻害剤が内因性であるかあるいは細菌由来であるかについての結論を導き得なかった。かかる阻害剤に関する化学的データを提示していない点についてもDebyser et al.,と同様である。
【００１０】
【非特許文献１】Rouau et al, Journal of Cereal Science, (1994), 19, 259-272, Effect of an Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the Bread-making Quality of Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties
【非特許文献２】Fincher and Stone, (1986) Advances in Cereal Technology, Vol. VIII (Why Pomeranz, Ed.) AACC, St.Paul, Minnesota, 207-295
【非特許文献３】Meuser and Suckow (1986), Chemistry and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P J Frasier and T Gillard, Eds.) Royal Society of Chemistry, London, 42-61
【非特許文献４】Rouau et al and McCleary (1986) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349-354
【非特許文献５】Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. and Yaguchi, M. A xylanasse gene from Bacillus subtilis: nucleotide sequence and comparison with B. pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201-206 (1986)
【非特許文献６】J Maat et al.（Xylans and xylanases, J Visser et al著, 349-360, Xylanases and their application in bakery）
【非特許文献７】W Debyser et al., J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 153-156, 1997, Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt: Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat
【非特許文献８】X Rouau and A Surget, Journal of Cereal Science, 28 (1998) 63-70, Evidence for the Presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours
【特許文献１】米国特許５３０６６３３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、当該技術が抱える課題は、取扱い上の不利な性質を有さない生地からの焼き製品の生産方法に関するものであり、より詳細には、低粘度の生地（取扱い及び製造過程において問題となるほど粘度が高くない生地）をいかに提供するかということにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、かかる課題を解決する目的でなされたものであり、本発明の内容は請求項及び以下の記述に示される。簡潔に述べると本発明は、
１．内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤、該阻害剤をコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにそれらの変異体、相同物又は断片
２．β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が、種々のキシラナーゼにもたらす効果を測定するアッセイ方法
３．種々のキシラナーゼが、生地にもたらす効果を測定するアッセイ方法
４．グルカナーゼ（類）が、種々のキシラナーゼ含有生地にもたらす効果を測定するアッセイ方法
５．新規のキシラナーゼ類、該新規キシラナーゼ類をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列、並びにそれらの変異体、相同物又は断片
６．キシラナーゼの新規な使用法
７．種々のキシラナーゼを用いて生産した食品に関するものである。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のヌクレオチド配列には、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る構築物、本発明の配列を含むか若しくは発現し得るベクター、本発明の配列を含むか若しくは発現し得るプラスミド、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る組織、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る器官、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る形質転換宿主、及び本発明の配列を含むか若しくは発現し得る形質転換生物が含まれる。本発明はまた、本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法、例えば、上記配列を転移させる方法を含め、微生物において発現させる方法に関する。
【００１４】
本発明はＷＯ−Ａ−９８／４９２７８の教示とは異なる。なぜならかかるＰＣＴ特許出願においては、開示しているタンパク性阻害剤の配列に関する情報が最小限のものでしかないからである。
本発明の詳細について、以下に適当な見出しをつけて説明する。便宜上本発明に関し、一般的に応用可能な教示については、「一般的定義」及び「一般的教示」としたセクションにおいて述べたが、各セクションにおける教示は必ずしもそのセクションの内容に限定されるものではない。
【００１５】
（一般的定義）
ここで使用する「小麦粉」なる用語は、小麦を細かくひいた粗挽き粉と同義語である。しかし好ましくは、該用語は、小麦自体から得た小麦粉を意味し、他種の穀類から得たものを意味しない。よって、特に限定しないときには、ここで使う「小麦粉」とは、生地等の媒体中に含まれる小麦粉同様、小麦粉自体を意味することが好ましい。
「キシラナーゼ」なる用語は、その通常の意味で使われる。すなわち、小麦に含まれると考えられるアラビノキシランの脱重合をそれ自体で触媒し得る酵素（すなわち、該酵素自体がＷＩＰの可溶化の触媒能を有し、小麦に含まれるＷＳＰの脱重合の触媒能を有する酵素）のことである。
エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性を測定するアッセイに関しては後述する。便宜上かかるアッセイを「キシラナーゼアッセイ」と呼ぶ。
【００１６】
本発明において、「ヌクレオチド配列」なる用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ（すなわち、組換えＤＮＡ技術により調製したＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡ、さらにこれらの組み合わせを含む。
好ましくは「ヌクレオチド配列」なる用語はＤＮＡを意味する。
本発明のヌクレオチド配列は、一本鎖又は二本鎖のどちらでもよい。
本発明のヌクレオチド配列には、合成又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。当該技術分野において、オリゴヌクレオチドに対する修飾方法は、数多く知られている。かかる修飾方法には、分子の３'及び／又は５'側においてアクリジン又はポリリジン鎖を付加するメチルホスホネート(methylphosphonate)及びホスホロチオエート(phosphorothioate)をバックボーンとするものが含まれる。本発明の目的に鑑みて、本発明におけるヌクレオチド配列は当該技術分野のいかなる手法によって修飾してもよいと理解すべきである。本発明のヌクレオチド配列のインビボでの活性増強又は長期生存をはかるために、このような修飾が行われるのである。
【００１７】
本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列について、「変異体」又は「相同物」なる用語は、それら配列の対立変異と同義語である。
特に、ここで使われる「相同性（homology）」とは「同一性（identity）」と同じ意味と解釈してよい。ここにいう本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列における配列の相同性は、１又は２以上の配列を別の配列と比較して、その別の配列が、元の配列と少なくとも７５％一致しているかどうかをみるという、単に「目測（eyeball）」による比較（厳密な比較のこと）を行うことによって決定できる。相対的な配列の相同性（すなわち配列の同一性）は、２又は３以上の配列間における相同性割合（％）を計算する市販のコンピュータープログラムを用いて決定することも可能である。かかるコンピュータープログラムの主な例としてCLUSTALが挙げられる。
【００１８】
相同性は、目視により比較可能である。しかし、容易に入手できる配列比較プログラムによる比較が、より一般的である。かかる市販のコンピュータープログラムにより、２又は３以上の配列間における相同割合が計算できる。
近接した配列間の相同割合を計算することもできる。すなわち、ある配列が別の配列と一直線上に並び、そのある配列における各アミノ酸と、もう一方の配列においてそれぞれ対応しているアミノ酸とを一残基毎に直接比較することもできる。これを「アンギャップ」アラインメント（alignment）と呼ばれ、このようなアンギャップアラインメントは、残基数が比較的少ない場合に行われる（例えば５０個未満の近接したアミノ酸）。
【００１９】
かかる方法は、極めて簡便かつ堅実な方法ではあるが、例えば、本来は互いに同一な配列であっても、挿入又は欠失が１個でも生じれば、以下に続くアミノ酸残基がアラインメントからはみ出すことになり、従ってこの方法をアラインメント全体に行うときには相同割合が大きく低下する可能性があることを考慮する必要がある。そのため殆どの配列比較法は、全体としての相同割合を過度に損なわない程度の挿入及び欠失を考慮した最適アラインメントを作出するようにデザインされている。このことは、局所的相同性を最大化するために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより達成できる。
【００２０】
しかしながら、上述のより複雑な方法では、アラインメントに生じるギャップの各々に「ギャップペナルティー」を割り当てており、そのため同一アミノ酸の数が同じ場合には、できるだけギャップが少ない配列アラインメントの方が（比較する二配列間の高い相関性を反映して）、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られる。ギャップの存在には比較的高コストを課し、該ギャップにおいて次に現れる各残基には少ないペナルティーを課す「アフィンギャップコスト」が一般的に用いられている。これは、最もよく使用されるギャップ評価システムである。ギャップの高ペナルティーにより、少ないギャップで最適なアラインメントを作製できることはいうまでもない。殆どのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーの修飾が可能である。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウエアを使用する際には、デフォールト値を用いることが好ましい。例えば、後述するGCG Wisconsin Bestfit packageを使用するとき、アミノ酸配列に対するデフォールトギャップペナルティーは、ギャップについて−１２で、各伸張部分について−４である。
【００２１】
従って、相同性の最大値（％）を算出するには、ギャップペナルティーを考慮しつつ、先ず最適アラインメントを作出することが必要とされる。かかるアラインメントを実行するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfit package（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を実施できるソフトウエアとしては、この他に、例えば、BLAST package（Ausubel et al., 1999 (Chapter 18)を参照のこと）、FASTA（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）、及びGENEWORKS suite of comparison toolsを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。BLAST及びFASTAでは、オフライン及びオンラインによるサーチが可能である（Ausubel et al., 1999, 7-58〜7-60頁を参照のこと）。しかし、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。
【００２２】
相同性の最終的な割合（％）は、同一性の観点から測定できるが、アラインメントプロセス自体は通常、オールオアナッシング式の二者比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性又は進化論的距離に基づく各ペアの比較評価を行う目盛りのついた類似性評価マトリックスが一般的に用いられる。かようなマトリックスのうち汎用されているものの一例としては、プログラムのBLAST suiteのデフォールトマトリックスであるBLOSUM62マトリックスが挙げられる。GCG Wisconsinプログラムでは、公知のデフォールト値、又は、もし供給されていれば特別仕様のシンボル比較表のどちらかを使用するのが一般的である（詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。GCGパッケージには公知のデフォールト値、その他のソフトウエアにはBLOSUM62等のデフォールトマトリックスを使用することが好ましい。一旦ソフトウエアが最適アラインメントを作出すると、相同割合（％）、好ましくは配列の同一割合（％）の計算が可能になる。ソフトウエアは通常、配列比較の一端としてかかる計算をし、数字で結果が出る。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで入手でき、デフォールトパラメーターを使う簡便なBLASTサーチアルゴリズムによって配列比較を行うことが好ましい。
【００２３】
また本発明には、本発明のヌクレオチド配列の相補配列、その派生物、断片又はその派生物も含まれる。配列が、その断片と相補的であれば、他の生物等における類似のコード配列を同定するプローブとして、該配列を用いることができる。本発明にはまた、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、並びにその派生物、断片又はその派生物も含まれる。本発明のヌクレオチド配列の相補配列、その派生物、断片又はその派生物とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、並びにその派生物、断片又はその派生物も本発明に含まれる。「相補」なる用語は、コード配列のヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列も包含している。
【００２４】
「変異体」なる用語は、ここに示すヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列の相補配列も包含している。「変異体」なる用語は、ストリンジェントな条件（６５℃で０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｎａ3クエン酸塩ｐＨ７．０｝）において、ここに示すヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有する配列の相補配列を包含している。
【００２５】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（相補配列を含む）とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列や、本発明のヌクレオチド配列（ここに示す相補配列を含む）とハイブリダイズ可能な配列の相補ヌクレオチド配列に関する。ここで「ハイブリダイゼーション」なる用語は、Dieffenbach CW and GS Dveksler （1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）記載のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術により行う増幅プロセス同様、「核酸の鎖が、塩基ペアリングにより相補鎖と結合するプロセス」（Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）を含む。
【００２６】
本発明の範囲には、中程度ないし最大限のストリンジェンシーにおいて、ここに示すヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有するポリヌクレオチド配列もまた含まれる。Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)が教示しているように、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の溶解温度（Ｔｍ）に基づいており、それにより後述の明確な「ストリンジェンシー」が決まる。
【００２７】
最高にストリンジェントな条件は、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で生じる。Ｔｍ−５℃〜１０℃で高度のストリンジェンシーが生じる。Ｔｍ−１０℃〜２０℃で中間ストリンジェンシーが生じる。Ｔｍ−２０℃〜２５℃で緩やかなストリンジェンシーが生じる。当該技術の専門家であれば理解するところであるが、最高にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、同一ポリヌクレオチド配列を同定、若しくは検出するときに行い、一方、中間（又は緩やかな）ストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションは、類似、若しくは関連ポリヌクレオチド配列を同定、若しくは検出するときに行う。
本発明は、好ましくは、本発明のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下（６５℃で０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含んでいる。
【００２８】
（内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤）
本発明の目的の一つは、小麦粉から得られる内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を提供することであり、本発明者らの研究の結果、かかる阻害剤は分子量約４０ｋＤａ（ＳＤＳ又はＭＳで測定）のジ−ペプチド（di-peptide）であり、そのｐｌは、約８〜約９．５であることを見い出した。本発明において該阻害剤は、単離した形態及び／又は実質的に純粋な形態にあるものをいい、ここで「単離した」とは、該阻害剤が天然の環境下にはないことを意味する。
【００２９】
現在までの配列解析によって、上記阻害剤が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内、少なくとも１又は２以上の配列をもつことが解明されている。このように本発明は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９、並びにそれらの変異体、相同物、又は断片の内、少なくとも１又は２以上の配列をもつエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を包含している。
【００３０】
本発明の阻害剤に関して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果生じたアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内少なくとも１又は２以上の配列を含む阻害剤と、好ましくは少なくとも同程度の活性を有するキシラナーゼ阻害活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られる阻害剤にキシラナーゼ阻害活性が、好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内少なくとも１又は２以上の配列を有する阻害剤と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列の相同性（配列の類似性又は配列の同一性）に関しては、添付の配列リストに示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有することが望ましい。とりわけ、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、一層好ましくは少なくとも９８％の相同性を有することが望ましい。阻害剤の想定される変異体としては、現在のところ、配列番号１及び配列番号２として示される少なくとも１以上の配列を有するものを例示することができる。
【００３１】
本発明の阻害剤は、多くの理由から有用である。例えば、内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の化学的な同定が公知である今日においては、研究者らは、例えば小麦に存在する該阻害剤を定量できるのである。便宜上、この方法を「阻害剤含有量測定法（Inhibitor Amount Determination Method）」と呼ぶことにする。かかる阻害剤含有量測定法により研究者らは、小麦に添加するのに適したキシラナーゼを１又は２種以上選択できるようになり、及び／又は小麦に添加する１又は２以上のキシラナーゼ類の適量を選択できるようになった。
【００３２】
すなわち本発明は、（ａ）小麦粉における阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼを選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼの適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ、及び／又は適量のキシラナーゼを小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３３】
また本発明は、（ａ）小麦粉における阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼ阻害剤を選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼ阻害剤の適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ阻害剤、及び／又は適量のキシラナーゼ阻害剤を小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３４】
本発明はまた、（ａ）小麦粉に含まれる阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼ、及び適したキシラナーゼ阻害剤を選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼ阻害剤の適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ及び適正なキシラナーゼ阻害剤、及び／又は適量のキシラナーゼ阻害剤を小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３５】
阻害剤の含有量は、固体状態のＮＭＲ分光分析等の標準的な化学的な手法により測定できる。阻害剤の含有量は、該阻害剤が有害作用をもたらすことが知られているキシラナーゼ酵素を使っても測定できる。かかる方法では、小麦粉を試料とし、かかるキシラナーゼの所定量を添加することも可能である。一定時間後にキシラナーゼ活性を測定し、その活性測定結果と小麦粉の阻害剤含有量との相関関係から含有量を決定できる。よって本発明はまた、小麦粉試料中に含まれる阻害剤の量をキャリブレーションし、及び／又は測定する手段として、キシラナーゼとその阻害剤を組み合わせて使用することも含むものである。
【００３６】
本発明の阻害剤の存在を確認するために、かかる阻害剤に対する抗体を用いて小麦粉試料のスクリーニングを行うことができる。かかる抗体は、小麦粉試料に含まれる阻害剤を単離することにも利用できる。
【００３７】
（種々のキシラナーゼ類に対しβ−１，４−キシラナーゼ阻害剤が及ぼす効果を測定するアッセイ方法）
本発明の阻害剤にはさらに有用な使用法がある。この点に関し、阻害剤によって損なわれるキシラナーゼを同定するアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害剤を用いることができる。例えばある条件下では、阻害剤に対して低耐性（つまり、あまり耐性のない）を有するキシラナーゼをスクリーニングすることが好ましく、ある場合においては、阻害剤に対して、並（中程度）の耐性（つまり、程々に耐性のある）を有するキシラナーゼを同定するためのアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害剤を用いることができ、また他の場合においては、阻害剤に対して高耐性を示すキシラナーゼを同定するためのアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害剤を用いることができる。阻害剤による阻害の程度を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「阻害剤アッセイプロトコール」と呼ぶこととする。
【００３８】
このように本発明は、キシラナーゼ阻害剤に対し、キシラナーゼが示す耐性の程度の測定方法を提供するものであって、かかる方法には、（ａ）目的のキシラナーゼをその阻害剤と接触せしめ、（ｂ）かかる阻害剤が、目的のキシラナーゼ活性を阻害するか否かを測定することが含まれる。便宜上、かかる方法を「阻害剤アッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００３９】
ここで「耐性」なる用語は、阻害剤によって、キシラナーゼ活性が完全には阻害されないことを意味する。換言すれば、阻害剤によって損なわれることのないキシラナーゼ類を同定するアッセイ／スクリーニングに、阻害剤を用いることが可能となるのである。よって、キシラナーゼ阻害剤に対応するキシラナーゼに関し、「耐性の程度」なる用語が意味するところは、キシラナーゼ阻害剤によるキシラナーゼ活性の非阻害の程度と同じ意味である。従って、キシラナーゼ阻害剤に高い耐性を示すキシラナーゼは、かかるキシラナーゼ阻害剤に対し、高度の非阻害を示すキシラナーゼと類似しているのである。
【００４０】
本発明はまた、（ａ）阻害剤アッセイ方法を行い、（ｂ）阻害剤に対し高度（又は中程度、又は低度）の耐性をもつキシラナーゼを１又は２種以上同定し、（ｃ）同定された１種以上のキシラナーゼを一定量調製するステップを含むプロセスを包含するものである。相応であると同定されたキシラナーゼは、食品製造、特に焼き製品製造用の生地に使用することができる。さらに、阻害剤に対しある程度の耐性をもつキシラナーゼ（他種のキシラナーゼに比べ阻害を受けにくいキシラナーゼ）を同定することにより、実用に際し、かかる同定されたキシラナーゼを、培地に少量添加するだけでこと足りるようになる。キシラナーゼの最終使用には、食品、タンパク質、及び澱粉製品、紙製品、及びパルププロセシング等のいずれかの１又は２以上の調製が含まれる。
【００４１】
従って、本発明にはさらに、（ａ）阻害剤アッセイ方法を実施し、（ｂ）阻害剤に対して高度（又は中程度、又は低度）の耐性をもつキシラナーゼを１種以上同定し、さらに（ｃ）同定されたキシラナーゼを１種以上含む生地を調製するステップを含むプロセスが包含される。
本発明に関する実験の過程において、バクテリア由来キシラナーゼの活性が完全には損なわれなかったという意味において、かかるキシラナーゼが阻害剤に対し耐性を示すことを見い出したのは驚くべきことである。
【００４２】
（種々のキシラナーゼが生地に及ぼす効果を測定するアッセイ方法）
阻害剤アッセイ方法によって適していると同定された細菌性キシラナーゼ類が、生地混合物に含まれていると、意外なことにその生地は、真菌性キシラナーゼを含む生地に比べ粘度が低くなることを見い出した。これらの結果は、先行文献の教示からは全く予想されなかったことである。よって本発明はさらに、焼き食品調製に用いるのに適した細菌性キシラナーゼ又はそれらの変異体を同定する方法を提供するものである。かかる方法には、（ａ）目的の細菌性キシラナーゼを、生地混合物に取り入れ、また真菌性キシラナーゼを含む類似の生地混合物に比べて該生地混合物の粘度が低い場合には、かかる細菌性キシラナーゼ又はそれらの変異体が焼き食品調製に用いるのに適していることになるので、（ｂ）該生地混合物の粘度を測定することが含まれる。便宜上、かかる方法を「粘度アッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００４３】
本発明はさらに、（ａ）粘度アッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに適した１種以上のキシラナーゼを同定し、（ｃ）同定された１種以上のキシラナーゼを一定量調製するステップを含むプロセスを提供するものである。生地の粘度を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「粘度プロトコール」と呼ぶこととする。本発明のキシラナーゼを含み、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地を、本発明では必要に応じて「非粘着性生地」と呼ぶこととする。
【００４４】
細菌性キシラナーゼを用いると、真菌性キシラナーゼを含む生地のように粘度のある生地にはならないという好ましい性質を有するとき、かかるキシラナーゼを、焼き製品を調製する生地等の食品の調製に用いることができる。このように本発明は、（ａ）粘度アッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに適した１種以上のキシラナーゼを同定し、さらに（ｃ）同定されたキシラナーゼを１種以上含む生地を調製するステップを含むプロセスを提供するものである。
【００４５】
（キシラナーゼを含む生地の生地特性に対してグルカナーゼ（類）が及ぼす効果を測定するアッセイ方法）
本発明に関する実験の過程において、本発明者らは、グルカナーゼ酵素がある程度存在するときにキシラナーゼ類が有害な影響を受けることも見い出した。よって、キシラナーゼ酵素を調製又は抽出するのに用いる培地等のキシラナーゼ調製物に、有害レベルのグルカナーゼ酵素が含まれないようにすることが大切である。さらに、キシラナーゼを含む食品を調製する際に使用する培地に、有害レベルのグルカナーゼ酵素が含まれないことが大切である。ここにいう「有害レベル」とは、グルカナーゼ酵素の有害な作用によってキシラナーゼの効果が相殺されてしまう程のグルカナーゼ量を意味する。
【００４６】
従って本発明はさらに、キシラナーゼ組成物（キシラナーゼ調製物等）、キシラナーゼを調製する培地、又は焼き食品調製に用いるのに適したキシラナーゼを添加する培地を同定するアッセイ方法を提供するものであり、かかる方法には、（ａ）目的のキシラナーゼを含む組成物、該キシラナーゼを調製する培地、又は該キシラナーゼを添加する培地を提供し、また、組成物又は培地に存在する活性グルカナーゼ酵素（類）が低レベルであれば、かかる組成物又は培地は焼き食品の調製に適していることになるので、（ｂ）かかる組成物又は培地に活性グルカナーゼ酵素（類）の存在を確認することを含む。便宜上、かかる方法を「グルカナーゼアッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００４７】
本発明はさらに、（ａ）グルカナーゼアッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに適した１種以上の組成物又は培地を同定し、また（ｃ）それら１種以上の同定された組成物又は培地を一定量調製するステップを含むプロセスを提供するものである。グルカナーゼ活性を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「グルカナーゼプロトコール」と呼ぶ。
【００４８】
キシラナーゼがもつ有用な効果が、好ましくない量のグルカナーゼ酵素の存在によって完全に損なわれることがないという意味において、かかる組成物又は培地が好ましい性質をもつとき、かかる組成物又は培地を、食品、好ましくは焼き製品製造用の生地の調製に用いることができる。よって本発明はさらに、（ａ）グルカナーゼアッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に適した１種以上の組成物又は培地を同定し、さらに（ｃ）１種以上の同定された組成物又は培地を含む生地を調製するステップを含むプロセスを包含するものである。このように本発明は、キシラナーゼ調製法を包含するものであって、かかるキシラナーゼ調製法は、実質的にグルカナーゼ酵素（類）非存在下にて行われる。
【００４９】
すなわちキシラナーゼ調製法は、存在すると考えられる少なくとも実質的に全てのグルカナーゼ酵素（類）を先ず除去し、ひいてはグルカナーゼ酵素（類）活性を抑制若しくは消失せしめる初期調製を行うことから始められる。これを達成する技術には、グルカナーゼ酵素（類）を認識し結合する抗体を用いることも含まれ、その場合はグルカナーゼ酵素（類）活性が不活化される。グルカナーゼ酵素（類）特異的抗体を支持体に結合することにより、初期調製物のパッセージがその結合抗体を通過し、その結果グルカナーゼ酵素（類）が上記初期調製物から除去され、実質的にグルカナーゼ酵素（類）を含まないキシラナーゼ調製物を得ることができる。別の実施例、さらには追加の実施例においても、グルカナーゼ酵素活性が最低限であるか、若しくは全くない宿主生物から キシラナーゼ調製物を得ることができることが示されている。この点で、宿主生物に存在するグルカナーゼ酵素活性は不活化されるといえる。他にも、グルカナーゼ遺伝子の発現が抑制され、及び／又は消失する例もある。これを達成する技術には、グルカナーゼコード配列のアンチセンス配列を使用することも含まれる。さらなる実施例においては、グルカナーゼ酵素の発現が全くみられないか若しくは極微量発現される宿主生物を使用している。
【００５０】
（Ｋiアッセイ）
キシラナーゼのＫi値測定（ここでは「Ｋiアッセイ」という）が有用な場合もある。適用例（applications）によっては、Ｋi値がときにキシラナーゼ適性の指標足り得ることを見いだした。Ｋi値の知見自体が有用である。
【００５１】
（コンビネーションアッセイ）
本発明はまた、本発明のアッセイ類を適正に組み合わせることを含むものである。本発明は、阻害剤含有量測定方法を含むステップ、阻害剤アッセイ方法を含むステップ、粘度アッセイ方法を含むステップ、グルカナーゼアッセイ方法を含むステップ、及びＫiアッセイを含むステップの内２又は３以上のステップを含む組み合わせを包含している。かかる組み合わせにおいては、ステップの組み合わせはどの順番でもよく、また必ずしも同時に若しくは続けて行う必要はない。
【００５２】
（新規のキシラナーゼ類）
上述したように本発明は、食品、特に焼き製品調製に用いる生地の調製に使用可能なキシラナーゼを同定するのに適したアッセイを提供するものである。そこで本発明者らは、食品、特に焼き製品調製に用いる生地の調製に適した新規のキシラナーゼ３種を同定した。すなわち本発明はさらに、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又はそれらの変異体、相同物、並びに断片として示されるアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸配列を包含している。
【００５３】
本発明のキシラナーゼに関連して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果できたアミノ酸配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかの配列を含むキシラナーゼ活性と、好ましくは少なくとも同程度の活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られるタンパク質にキシラナーゼ活性が、好ましくは配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかの配列と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列相同性（配列類似性又は配列同一性）に関しては、添付の配列リストに示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。さらに、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、さらに少なくとも９８％の相同性があることがより好ましい。
キシラナーゼが、配列番号７若しくは配列番号１１、又はそれらの変異体、相同物若しくはその断片の配列を含むことが好ましい。
【００５４】
本発明はさらに、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものである。本発明のヌクレオチド配列は次のものから選択することが好ましい。
（ａ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はそれらの変異体、相同物、並びに断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかを含むヌクレオチド配列
（ｂ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその相補配列の内いずれか１つのヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかとのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかの相補配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列、及び
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示したヌクレオチドに対する遺伝コードの結果、変性したヌクレオチド配列。
【００５５】
本発明のヌクレオチド配列に関連して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果できたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかのアミノ酸配列を含む活性と、好ましくは少なくとも同程度のキシラナーゼ活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られる発現タンパク質にキシラナーゼ活性が、好ましくは配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列相同性（配列類似性又は配列同一性）に関しては、添付の配列リストに配列番号８、配列番号１０、配列番号１２として示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の相同性があるものが望ましく、さらに、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性があるものが望ましい。
本発明のヌクレオチド配列が、配列番号８、配列番号１２、又はそれらの変異体、相同物、若しくは断片として示される配列を含むことが好ましい。
【００５６】
（キシラナーゼ類の新規の使用方法）
上述したように本発明はまた、焼き製品の調製に用いる非粘着性生地（本記載中にて定義）を調製する際に使用できるキシラナーゼの同定に適したアッセイを提供するものである。
我々は、食品、特に焼き製品調製に用いる生地、の調製に適した公知及び新規の細菌性キシラナーゼ数種を同定した。
よって本発明は、本発明のアッセイにより同定し得るキシラナーゼを含む非粘着性生地（本記載中にて定義）を包含するものである。かかるキシラナーゼが、配列番号３、５、７、９、１１、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物として示されるアミノ酸配列のいずれかを有することが好ましい。より好ましくは、かかるキシラナーゼが、配列番号５、７、９、１１、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物として示されるアミノ酸配列のいずれかを有することが好ましい。
【００５７】
先行技術によるシステムとは対照的に本発明は、生地を製造する前にキシラナーゼを小麦粉に直接添加し得る方法を提供する。従って、シングルバッチの小麦粉／キシラナーゼ混合物を生地製造器に投入する。さらに、取扱い容易な生地を得るために使う投入装置が生地製造器に必要でなくなる。
【００５８】
（キシラナーゼ類を用いて調製した食品）
本発明は、食品製造に用いるのに適したキシラナーゼの同定手法を提供するものである。動物用飼料も含む食品の代表例としては、日常食品、食肉製品、禽肉製品、魚肉製品、及び焼き製品が挙げられるが、かかる食品が焼き製品であることが好ましい。本発明の技術範囲に含まれる焼き製品の代表例としては、食パン、ロールパン、バーガー用パン、ピザ台等のパン類、プレッツェル、トルティヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー等が挙げられる。
【００５９】
（一般的な教示）
以下に述べる「本発明のヌクレオチド配列」及び「本発明のアミノ酸配列」なる語句は、ここに挙げるヌクレオチド配列のいずれか１つ若しくは２以上、またここに挙げるアミノ酸配列のいずれか１つ若しくは２以上について言及するものである。
【００６０】
（アミノ酸配列／ポリペプチド配列）
「本発明のアミノ酸配列」なる用語は、「本発明のポリペプチド配列」と同義語である。ここでかかるアミノ酸配列は、キシラナーゼ又はキシラナーゼ阻害剤のアミノ酸配列を意味すると考えてよい。
本発明のポリペプチドには、ここに示すアミノ酸配列の断片、及びその変異体も含まれる。断片の長さとして適正なのは、少なくとも５、又は少なくとも１０、１２、１５、さらには２０個のアミノ酸で構成される断片である。
本発明のポリペプチドは、保存的置換を含む、１又は２個以上（例えば少なくとも２、３、５、又は１０個）の置換、欠失、又は挿入を有するように修飾されていてもよい。保存的置換は、保存置換を示す次の表によって作製できる。次の表には、２列目の同じブロックと、３列目の同じ行にあるアミノ酸を相互置換することが好ましい。
【００６１】
【表１】
【００６２】
本発明のポリペプチドは実質的に単離されているものである。かかるポリペプチドは、意図するポリペプチドの目的を損なわないように、担体又は希釈剤と混合してもよく、その場合も依然として実質的に単離されていると考えられる。本発明のポリペプチドはまた実質的に精製されており、そのとき該ポリペプチドは、調製過程におけるポリペプチドを含み、かかる調製過程におけるポリペプチドの９０％以上、例えば９５％、９８％、又は９９％以上は、本発明のポリペプチドである。本発明のポリペプチドは後述するように例えば、その精製を容易とするためヒスチジン残基を付加し、又は細胞からの分泌を促進すべくシグナル配列を付加することにより修飾してもよい。本発明のポリペプチドは、後述するように合成法（例：Geysen et al., 1996記載の方法）、又は組換え法により作出できる。
【００６３】
酵母、真菌、又は植物宿主細胞等の適正な宿主細胞を用いることにより、本発明の組換え発現産物が最適な生物活性を備えるために必要とされる翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、Ｎ−末端切断化（truncation）、ラピデーション（lapidation）、及びチロシン、セリン、又はトレオニンの燐酸化）が可能になる。
【００６４】
truncation lapidation（ヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド配列）
「本発明のヌクレオチド配列」なる用語は、「本発明のポリヌクレオチド配列」なる用語と同義である。本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド酸配列が含まれる。遺伝的コードが縮重することにより、種々のポリヌクレオチド領域が、所定のアミノ酸配列をコードすることがわかる。
【００６５】
ここに詳述するアミノ酸配列に関する知識をもってすれば、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及び／又はゲノムクローン等の部分及び完全長核酸配列の作製が可能である。例えば、ここに挙げるアミノ酸配列をコードする配列を標的とするよう設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。かかるプライマーには通常複数の縮重部分が含まれる。しかし縮重を最小化するために、ここで述べるアミノ酸配列において１コドンにのみ対応してコードされるメチオニン等のアミノ酸を含む領域をコードする配列が選択される。さらにＰＣＲ法を実施するときに鋳型ＤＮＡとして用いる核酸をもつ生物におけるコドンの使われ方を考慮した上で配列を選択する。公知の配列に対する一本鎖配列（非縮重）プライマーを用いて配列クローニングを行うときのストリンジェンシーより緩やかなストリンジェンシー条件下にて、ＰＣＲを行う。
【００６６】
ＰＣＲで得られた本発明のポリペプチド断片をコードする核酸配列を使用して、ハイブリダイゼーションライブラリースクリーニング技術によって、より長い配列を得ることができる。例えばＰＣＲクローンを放射性原子によって標識し、又は他種、好ましくは他種の植物又は菌種のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いる。ハイブリダイゼーション条件は、通常よりストリンジェントな条件下（例えば０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、約５０℃〜約６０℃）の培地条件である。アミノ酸配列の全体又は部分をコードする縮重核酸プローブは、他種、好ましくは他種の植物又は菌種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをプローブするのに用いられる。しかしＰＣＲは本来、一本鎖配列を得てさらにスクリーニングを行うために行うことが好ましい。
【００６７】
上記の技術により得られた本発明のポリヌクレオチド配列は、上述の技術を用いて、さらなる相同配列及び変異体を得るために用いることができる。また、かかるポリヌクレオチド配列は、使用に際し、種々の宿主細胞系において本発明のポリペプチドを発現せしめるために修飾される。例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対するコドン選択性向を最適化するよう修飾される。その他、制限酵素認識部位を導入すべく、またかかるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能若しくは特性を変えるべく、配列を変化させることが考えられる。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー、代替的増幅反応におけるプライマー等のプライマー、放射活性若しくは非放射活性標識を用いる慣用手法による顕現（revealing）標識等により標識されたプローブを作出するのに用いられる。またかかるポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされる。かかるプライマー、プローブ、及び他の断片は、その長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチドであって、これらはまた本発明のポリヌクレオチドなる用語に包含される。
本発明のポリヌクレオチド又はプライマーは、顕現標識を有する。標識として適しているものとしては、32Ｐ又は35Ｓ等の放射性同位元素、酵素標識、並びにビオチン等の他のタンパク質標識が挙げられる。かかる標識により、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーを標識化し、公知の技術により検出を行うことができる。
【００６９】
ＤＮＡポリヌクレオチド等のポリヌクレオチド、及び本発明によるプライマーは、組換え、合成、又は当該技術の専門家が実施可能ないかなる手法によって作出してもよい。標準技術によってクローニングしてもよい。
一般的にはプライマーは、所望の核酸配列を１ヌクレオチド毎に作製していく段階的製法を含む合成法により作出される。かかる作出を自動方式で行う技術は、先行文献に既にみられる。
【００７０】
長いポリヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術等の組換え法により作出されるのが一般的である。かかる方法には、クローニングの対象であるエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害遺伝子の領域において一対のプライマー（約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、かかるプライマーを、真菌、植物、又は原核細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触せしめ、所望の領域の増幅、増幅断片の単離（反応混合物をアガロースゲル上にて精製することによる）、及び増幅ＤＮＡの回収が実施可能な条件下にてＰＣＲ法を行うことが含まれる。適正なクローニングベクターに増幅ＤＮＡをクローニングできるよう、かかるプライマーは、適当な制限酵素認識部位を含むように設計されている。
【００７１】
（調節配列）
本発明のポリヌクレオチドは、選択された宿主細胞等により、コード配列の発現能を有する調節配列とオペラブル（operable）に結合していることが好ましい。例えば本発明は、かかる調節配列にオペラブルに結合した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、すなわち発現ベクターを包含するものである。
「オペラブルに結合」なる用語は、ここに記載する各成分が、その意図どおりに機能し得る関係にあり、互いに並列関係にあることを意味する。コード配列に「オペラブルに結合」した調節配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列が発現されるように連結される。
「調節配列」なる用語には、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現調節シグナルが含まれる。ここにいう「プロモーター」なる用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位等、当該技術分野にて通常使われる意味で使用される。
【００７２】
発現の、また必要とあれば選択した発現宿主からの目的タンパク質の分泌量の増強、及び／又は本発明のポリペプチド発現の誘導制御を行う異種構造の調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダー、及び末端領域等を選択することにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が増強される。本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターにオペラブルに結合していることが好ましい。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子由来のプロモーター以外にも、本発明のポリペプチドを発現させるプロモーターを用いることができる。かかるプロモーターは、所望の発現宿主において本発明のポリペプチドを発現させる上での効率性を考慮して選択される。
【００７３】
実施例において、本発明における所望のポリペプチドを発現させるため、構成プロモーターが選択される。誘導基質含有培地において発現宿主を培養させることが不要になるので、かかる発現構成物は非常に好都合である。
真菌発現宿主に対して用いるのに適した強力な構成及び／又は誘導プロモーターとしては、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンテターゼ、サブユニット９（ＯｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子からのＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターにおける真菌性遺伝子から得られるものが挙げられる。強力な酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ、及びトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。また、強力な細菌性プロモーターとしては、細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターの他に、α−アミラーゼ及びＳＰ０２プロモーターが挙げられる。ハイブリッドプロモーターもまた、発現構成の誘導調節を改良するために用いられる。
【００７４】
プロモーターはさらに、適合した宿主における発現を確実にし、又は増強させるという特徴を備えている。例えばかかる特徴としては、Pribnow Box又はＴＡＴＡbox等の保存領域が考えられる。それ以外にもプロモーターはさらに、本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響（保持、増強、減少等の）を及ぼす配列をもつ場合もある。それらプロモーターの適正例としては、Ｓｈ１イントロン又はＡＤＨイントロンが挙げられる。その他の配列には、温度、化学物質、光、又はストレス誘導エレメント等の誘導エレメントが含まれる。また、転写又は翻訳を増強するのに適したエレメントも存在する。かようなエレメントの例としては、ＴＭＶ５'シグナル配列（Sleat Gene 217 [1987] 217-225; 及びDawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97を参照のこと）が挙げられる。
【００７５】
（分泌）
本発明のポリペプチドは、宿主細胞から、本発明のポリペプチドがより簡便に回収できる培養培地へ分泌されることが望ましい。本発明においては、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択される。ハイブリッドシグナル配列もまた本発明において用いられる。
異種構造分泌リーダー配列の一般的な例としては、真菌アミログリコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えばｇｌａＡ；Aspergillus由来で、１８及び２４アミノ酸の二形態）、ａ−ファクター遺伝子（Saccharomyces及びKluyveromyces等の酵母）、又はα−アミラーゼ遺伝子（Bacillus）由来のものが挙げられる。
【００７６】
（構築物）
「共役物（conjugate）」、「カセット」、及び「ハイブリッド」なる用語と同義である「構築物（construct）」なる用語には、直接又は間接にプロモーターと接合する本発明におけるヌクレオチド配列が含まれる。本発明のプロモーター及びヌクレオチド配列を仲介するＳｈ１−イントロンやＡＤＨイントロン等のイントロン配列などの適正なスペーサーグループを供給することが間接接合の例として挙げられる。
直接又は間接接合を意味する本発明における「融合」なる用語に関しても「構築」と同じことがいえる。それぞれの場合において各用語は、元来野生型遺伝子プロモーター、及び通常会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組合わせにおいて、かかるプロモーター及びヌクレオチド配列がその自然環境下にあるときに、それらの自然組合わせを意味するものではない。
【００７７】
構築物が、その転移先である好ましくはBacillus subtillis等のBacillus属の細菌など、又はジャガイモ、サトウキビ等の植物における遺伝子構築の選択を可能にするマーカーを有していたり、発現させる場合もある。例えばマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（特に植物における）をコードするマーカー、又はＧ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、及びゲンタマイシン等に耐性を示す抗生物質耐性を供するマーカー等、実際に使用できる種々のマーカーが存在する。
本発明の構築物は、少なくともプロモーターにオペラブルに結合した本発明のヌクレオチド配列を含んでいることが好ましい。
【００７８】
（ベクター）
「ベクター」なる用語には、発現ベクター、形質転換ベクター、及びシャトルベクターが含まれる。
「発現ベクター」なる用語は、インビボで、又はインビトロでの発現能を有する構築物を意味する。
「形質転換ベクター」なる用語は、ある物からある物へ、同種の場合もあれば他種間の場合もあるが、転移できる構築物を意味する。構築物がある種から別の種へ、例えば大腸菌プラスミドから細菌、好ましくはBacillus属の細菌へ、転移できるとき、かかる形質転換ベクターを「シャトルベクター」と呼ぶことがある。大腸菌プラスミドから植物に存在するアグロバクテリア菌へと転移できる構築物の場合もある。
【００７９】
本発明のポリペプチドを発現させるため、後述するように本発明のベクターで適当な宿主細胞を形質転換させることができる。よって本発明はさらに、後述するように発現ベクターにより形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現条件下で培養し、また発現したポリペプチドを回収することからなる本発明のポリペプチドを調製するプロセスを提供するものである。
かかるベクターの例としては、複製によるプラスミド、ウイルス、又はファージベクターが挙げられ、また、かかるポリヌクレオチドの発現プロモーター、及びそのプロモーターの調節因子（regulator）も適宜に例として挙げられる。
【００８０】
本発明のベクターには、１又は２以上の選択マーカー遺伝子も含まれる。工業用微生物に対する選択系として最も適しているのは、宿主生物において変異を必要としない選択マーカー集団によって形成されるものである。真菌性選択マーカーの例としては、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸−脱カルボキシル酵素（ｐｖｒＡ）、ファレオマイシン、及びベノミル耐性（ｂｅｎＡ）遺伝子がある。非真菌性選択マーカーの例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする細菌由来Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母でも用いられるが、真菌では用いない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、ネオマイシン耐性遺伝子（Bacillus）、及び大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子がある。
ＲＮＡ作製、並びに宿主細胞のトランスフェクト又は形質転換を行うときなどは、ベクターをインビトロで用いることもできる。
【００８１】
このように本発明のポリヌクレオチドを、クローニング又は発現ベクター等の組換えベクター（通常複製ベクター）に取り込むことも可能である。かかるベクターを、和合性宿主細胞における核酸の複製に用いることができる。そこで実施例において、本発明のポリヌクレオチドを複製ベクターに導入し、かかるベクターを和合性宿主細胞に導入し、そしてベクター複製が可能となる条件下にてかかる宿主細胞を培養することにより、本発明のポリヌクレオチドを作出する方法を提供する。上記ベクターは宿主細胞から回収する。この方法に適した宿主細胞については、発現ベクターとの関連において後述する。
【００８２】
（組織）
ここにいう「組織」なる用語は、組織それ自体、及び器官を意味する。
（宿主細胞）
本発明における「宿主細胞」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる細胞をも包含し、かかる宿主細胞にプロモーターが存在するときには、該プロモーターが本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な宿主細胞を意味するものである。
本発明の実施例においては、本発明のポリヌクレオチドを形質転換した又はトランスフェクトした宿主細胞が提供される。かかるポリヌクレオチドを複製及び発現せしめるために、該ポリヌクレオチドがベクターに取り込まれていることが好ましい。かかるベクターと適合する細胞、例えば原核生物（例として細菌）、真菌、酵母、又は植物細胞を選択する。
【００８３】
グラム陰性の細菌である大腸菌は、異種遺伝子を発現させるときの宿主として広く使用されている。しかし、大量の異種タンパク質は、細胞内に蓄積する傾向がある。大量の大腸菌細胞質内タンパク質から所望のタンパク質をその状態から精製することはときに困難である。大腸菌とは対照的に、培地へのタンパク質分泌能を有することからバチルス属の細菌は、異種宿主として非常に適している。宿主として適した細菌には、ストレプトミセス属及びシュードモナス属の細菌が知られている。
【００８４】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特質から、及び／又は発現タンパク質のさらなるプロセシングが望まれることから、酵母又は真菌等の原核生物宿主が好ましい。酵母細胞の方が容易に操作できるため、真菌細胞より酵母細胞が一般的に好まれる。しかしタンパク質の中には、酵母細胞からはあまり分泌されなかったり、正しくプロセシングされない（例えば酵母の高グリコシル化）ものがある。かかる場合には真菌宿主生物を選択すべきである。
【００８５】
本発明の技術範囲にある発現宿主の好適例としては、Aspergillus種（ヨーロッパ特許Ａ０１８４４３８号及びＡ０２８４６０３号）、及びTrichoderma種等の真菌類、Bacillus種（ヨーロッパ特許Ａ０１３４０４８号及びＡ０２５３４５５号に記載があるものなど）、Streptomyces種、及びPseudomonas種等の細菌類、並びにKluyveromyces種（ヨーロッパ特許Ａ００９６４３０号及びＡ０３０１６７０号に記載があるものなど）、及びSaccharomyces種等の酵母類がある。
典型的な発現宿主は、Aspergillus niger、Aspergillus niger var. tubigenis、Aspergillus niger var. awamori、Aspergillus aculeatis、Aspergillus nidulans、Aspergillus orvzae、Trichoderma reesei、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Kluyveromyces lactis、及びSaccharomyces cerevisiaeから選択できる。
【００８６】
（生物）
本発明の「生物」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる生物をも包含し、かかる生物にプロモーターが存在するときには、該プロモーターが本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な生物を意味するものである。本発明のキシラナーゼの観点から適当な生物としては、好ましくはBacillus属、より好ましくはBacillus subtilis属の細菌が挙げられる。
【００８７】
本発明における「トランスジェニック生物」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる生物をも包含し、そのプロモーターが、かかる生物内に本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な生物を意味するものである。かかるヌクレオチド配列が、該生物のゲノムに取り込まれていることが好ましい。「トランスジェニック生物」なる用語は、本発明の無処理（native）のヌクレオチドコード配列がその自然環境下にあり、やはり自然環境下にある無処理のプロモーターのコントロール下にあるときには、かかるコード配列を含まない。さらに本発明には、本発明の無処理のタンパク質がその自然環境下にあり、やはりその自然環境下にある無処理のヌクレオチドコード配列により発現され、かかるヌクレオチド配列が、その自然環境下にある無処理のプロモーターのコントロール下にあるときには、かかるコード配列を含まない。
【００８８】
従って本発明のトランスジェニック生物は、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のいずれか１つ又はそれらの組合せ、本発明の構築物（その組合せを含む）、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発明の組織、並びにそれらの産物を含む。形質転換した細胞又は組織を用いて、かかる細胞又は組織から所望の成分の必要量を容易に回収し、調製することができるのである。
【００８９】
（宿主細胞／宿主生物の形質転換）
前述したように、宿主生物としては原核又は真核生物を挙げることができ、原核生物宿主の好適例としては、大腸菌及びBacillus subtilisがある。原核生物宿主の形質転換に関する詳しい教示例としては、Sambrook et al（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、及びAusubel et al., Current Protocles in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.等の文献がある。原核生物宿主を用いる際には、形質転換の前にそのヌクレオチド配列を、イントロン除去等により適当に修飾することが必要になる。そして、上述したように宿主生物として適しているのは、Bacillus subtilis等のBacillus属の細菌である。
【００９０】
他の実施例として、トランスジェニック生物として酵母を用いることもできる。酵母は、異種遺伝子発現のビヒクル（vehicle）として広く使われている。Saccharomyces cerevisiaeは、異種遺伝子発現への使用も含め、かなり以前から工業用に使用されている。Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現に関しては、Goodey et al（1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London）、及びKing et al.,（1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow）が報告している。
【００９１】
いくつかの点から、Saccharomyces cerevisiaeは異種遺伝子発現に適している。第１に、Saccharomyces cerevisiaeはヒトに対し非病原性であり、特定のエンドトキシンの産生能をもたない。第２に、Saccharomyces cerevisiaeは、何世紀にもわたり多様な目的のために、商業目的に安全に利用されてきた歴史がある。その結果、広く世間に認知されている。第３に、広く商業目的に使用され、また研究も数多くされてきているため、その大規模な発酵特性とともに、Saccharomyces cerevisiaeの発生学的及び生理学的特質に関する豊富な知識が蓄積されている。
E Hinchcliffe E Kenny（1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.）は、Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌の原理について報告している。
【００９２】
使用できる酵母ベクターは、その保持のために宿主ゲノムとの組換えを必要とし、プラスミドベクターを自律的に複製する組込み（integrative）ベクターを含む数種類ある。
トランスジェニックSaccharomycesを調製するため、酵母での発現を目的として設計した構築物に、本発明のヌクレオチド配列を挿入して発現構築物を調製した。今までに数種類、異種発現に用いる構築物が作製されている。かかる構築物には、本発明のヌクレオチド配列に融合された酵母において活性を示すプロモーターが含まれ、ＧＡＬ１プロモーター等の酵母由来のプロモーターが用いられる。ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列等の酵母由来のシグナル配列が用いられる。酵母において活性を示すターミネーターが発現系を終了させる。
【００９３】
酵母の形質転換を行うための形質転換プロトコールがいくつか見いだされている。例えば本発明のトランスジェニックSaccharomycesは、Hinnen et al（1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929）、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al（1983, J Bacteriology 153, 13-168）の教示によって調製できる。形質転換した酵母細胞は、種々の選択マーカーを使って選択でき、形質転換に用いるマーカーには、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、及びＴＲＰ１等の数多くの栄養要求性マーカー、及びアミノグリコシド抗生物質マーカー（Ｇ４１８等）などのドミナント抗生物質耐性マーカーがある。
【００９４】
宿主生物としては他にも植物を挙げることができる。遺伝子改変植物を構築する際の基本原理は、挿入された遺伝物質が安定的に保持されるような形で、ゲノム情報を植物ゲノムに挿入することであり、ゲノム情報を挿入する技術はいくつかあるが、主な２つの原理は、ゲノム情報の直接導入、及びベクター系を用いたゲノム情報の導入である。かかる一般的な技術は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol ［1991］ 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に記載されている。
【００９５】
さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列又は構築物を運び、また該ヌクレオチド配列又は構築物を、植物等の生物ゲノムに導入し得るベクター系に関する。かかるベクター系は、１つのベクターを含むことができるが、２つのベクターをもつこともできる。ベクターを２つ有する場合、かかるベクター系は通常二元ベクター系と呼ばれる。二元ベクター系については、Gynheung An et al.（1980）、Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19に、より詳細な記載がある。
【００９６】
所定のヌクレオチド配列を用いた植物細胞の形質転換に広く使用されるシステムは、Agrobacterium tumefaciens由来のＴｉプラスミド、又はAgrobacterium rhizogenes An et al.（1986）, Plant Physiol. 81, 301-305、及びButcher D.N. et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.:D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208由来のＲｉプラスミドを使用することを基本にしている。上述した植物又は植物細胞構築物の構築に適したＴｉ及びＲｉプラスミドを数種類構築した。かかるＴｉプラスミドの非限定例としては、ｐGV3850がある。
【００９７】
本発明のヌクレオチド配列又は構築物は、Ｔ−ＤＮＡボーダーを直接取り囲む配列が分裂しないよう、またこれら領域の内少なくとも１領域が修飾Ｔ−ＤＮＡを植物ゲノムに挿入する際に重要となるように、Ｔ−ＤＮＡの末端配列間に存在する、又はＴ−ＤＮＡ配列に隣接するＴｉプラスミドに挿入されることが好ましい。上述した説明から理解されるように、生物が植物の場合には、本発明のベクター系は、植物を感染させるのに必要な配列（vir領域等）、またＴ−ＤＮＡ配列の少なくともボーダー部分を１つ有していることが好ましい。ここにいうボーダー部分は、遺伝子構築物と同一ベクター上に位置するものである。かかるベクター系は、Agrobacterium tumefaciensＴｉプラスミド、若しくはAgrobacterium rhizogenesＲｉプラスミド、又はその派生物であることが好ましい。なぜならこれらのプラスミドは公知であり、トランスジェニック植物の構築に広く使用されており、これらのプラスミド又はその派生物に基づくベクター系は数多く存在しているからである。
【００９８】
トランスジェニック植物を構築するにあたっては、本発明のヌクレオチド配列又は構築物を植物に挿入する前に、ベクターが複製可能かつ操作が容易な微生物内に先ず構築する。有用な微生物としては大腸菌があるが、上述の特質をもつ微生物であれば他の微生物も使用できる。上記に定義したベクター系のベクターを大腸菌において構築した後、必要とあれば該ベクターを、Agrobacterium tumefaciens等の適当なアグロバクテリア株に転移させる。このように、本発明のヌクレオチド配列又は構築物をハーバリングするアグロバクテリア細胞を得るため、本発明のヌクレオチド配列又は構築物をハーバリングするＴｉプラスミドを、Agrobacterium tumefaciens等の適当なアグロバクテリア株に転移させることが好ましい。次に、かかるアグロバクテリア細胞のＤＮＡを、修飾する予定の植物細胞に転移させる。
【００９９】
かかる方法により、本発明のヌクレオチド又は構築物をベクターにおける適当な制限部位（position）に導入し得る。そこに含まれるプラスミドを用いて大腸菌の形質転換を行う。かかる大腸菌細胞を適した栄養培地で培養した後、回収し溶解させる。かかるプラスミドはこのようにして回収される。分析方法としては、配列分析、制限分析、電気泳動、またさらに生化学−分子生物学的方法が通常実施される。操作を行う毎に使用したＤＮＡ配列は制限され、隣接するＤＮＡ配列に結合される。各配列は、同じ又は別のプラスミド内にてクローニングされる。
【０１００】
所望の本発明のヌクレオチド配列を植物へ導入する各種導入方法を行った後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となる。例えば植物細胞のＴｉ−又はＲｉ−プラスミドを用いて形質転換を行うときには、導入遺伝子のフランキング領域としてのＴｉ−及びＲｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界、またはしばしば左右の境界が結合される。植物細胞の形質転換にＴ−ＤＮＡを用いることについては鋭意研究がなされており、ヨーロッパ特許Ａ１２０５１６号、Hoekema（The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Chapter V）、Fraley, et al.（Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46）、及びAn et al.（EMBO J. 1985, 4:277-284）に報告されている。また、植物組織を直接アグロバクテリアに感染させることは、広く行われている簡便な方法であり、Butcher D.N. et al.（1980, Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.:D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208）にその記載がみられる。この方法に関しては、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991] 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に教示されている。かかる方法により、葉、根、茎、又は植物の他の部分等の植物組織における特定部位において植物を感染させることができる。
【０１０１】
植物を、ヌクレオチド配列をもつアグロバクテリウムに直接感染させると、通常感染させる植物は、剃刀による切開、針による穿孔、研磨用具による摩擦などで損傷する。かかる損傷部分にアグロバクテリウムを接種するのである。そして接種された植物又は植物の部分を適当な培養培地で生育させ、成熟植物とするのである。植物細胞が構築されると、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の成長必須因子を含む適当な培養培地で細胞を培養する方法等の公知の組織培養方法によって、かかる細胞は生育し、かつ保持される。細胞又は組織培養物から植物を再生させる公知の方法により、形質転換細胞を、遺伝子修飾植物において再生させることができる。かかる公知の方法としては例えば、抗生物質を使って形質転換した芽を選択し、その選択した芽を適正な栄養分や植物ホルモン等を含む培地で、継代培養する方法がある。植物の形質転換については、ヨーロッパ特許Ａ０４４９３７５号にも教示されている。
【０１０２】
（ポリペプチドの作出）
本発明においては、従来公知の栄養発酵培地における１又は２以上の本発明のポリヌクレオチドを形質転換された微生物発現宿主等の培養により、本発明のポリペプチドの産生が影響される。発現宿主の選択に基づき、及び／又は発現構築物における調節の必要性に基づいて適当な培地を選択する。当該技術の専門家であれば、かような培地を熟知している。必要とあれば培地は、汚染の可能性がある他の微生物よりも形質転換された発現宿主が好む成分をさらに含有させることができる。
【０１０３】
（抗体）
本発明のアミノ酸配列を、かかるアミノ酸配列に対する抗体を標準的な手法により作製するために用いることができる。抗体を作製するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の種々の宿主を、その阻害剤、何らかのタンパク質、変異体、相同物、又はその断片や派生物、並びに免疫原性特質を維持しているオリゴペプチドを投与することにより免疫する。免疫応答を強化するために種々のアジュバントを、宿主種依存で用いる。かかるアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin：スカシガイのヘモシアニン）、及びジニトロフェノール等の界面活性物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvumも使用が考えられる有用なヒトアジュバントである。
【０１０４】
アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体は、培地における連続細胞株による抗体分子の作製方法のいずれによっても調製し得る。かかる方法には、Koehier及びMilstein（1975 Nature 256:495-497）が最初に報告したハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp77-96）が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに適当な抗原特異性及び生物活性を得るためにマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする「キメラ抗体」の作製方法（Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454）も用いることができる。その他にも一本鎖抗体（米国特許Ａ４９４６７７９号）の作製技術を、阻害剤特異的一本鎖抗体の作製に用いることができる。
【０１０５】
Orlandi et al（1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837）、並びにWinter G及びMilstein C（1991; Nature 349: 293-299）が開示しているように、インビボでの産物をリンパ球集団に誘導することにより、又は組換え免疫グロブリンライブラリー若しくは高度に特異的な結合試薬パネルのスクリーニングにより、抗体を作製することもできる。
【０１０６】
プロトコール
プロトコール１；キシラナーゼアッセイ（エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性）
クエン酸（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）緩衝液（ｐＨ５．０）でキシラナーゼ試料を希釈し、最終アッセイにおいてＯＤ（光学密度）が約０．７となるようにした。該試料の希釈液３種類、及び既知活性の内部標準液を、４０℃で５分間サーモスタットで調節した。反応開始５分後に、１個のXylazyme剤（架橋結合され、染色されたキシラン基質）を上記酵素溶液に加えた。反応開始１５分後に、１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して反応を終了させた。該反応混合液を遠心分離にかけ、上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。希釈液及びキシラナーゼ量を考慮しつつ、試料の活性（ＴＸＵ：Total-Xylanase-Units）が標準と相対的に算出された。
【０１０７】
プロトコール２；粘度プロトコール（粘度測定）
生地の粘度を、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（Stable Micro Systems社製）により測定した。本プロトコールは、Chen及びHoseney（1995）が報告したプロトコールに修正を加えたものである。生地は、Farinograph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００ＢＵ（Brabender Units）で作製した。小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合した。そこに水を加え、さらに５分間生地を混ぜる。できあがった生地を密封容器において３０℃で、１０、３０又は４５分間寝かせる。
【０１０８】
約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載する。均一に押し出すように、該生地を４ｍｍ押し出す。その後Stable Micro Systems protocol（生地の粘度を測定するＴＡ−ＸＴ２のアプリケーション研究）に従って５回測定を行った。簡潔に述べると、１ｍｍの生地が押し出される。ＴＡ−ＸＴ２システムに接合したプローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で生地を押圧する。そのプローブを持ち上げ、生地とプローブが粘着する度合を記録する。以下のＴＡ−ＸＴ２の設定を用いた。
科目： 粘着テスト
テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ
距離： １５ｍｍ
力： ４０ｇ
時間： ０．１ｓ
トリガータイプ 自動−５ｇ
データ収集率 ４００ｐｐｓ
このテストで記録した結果はピーク時の力であり、これは押し出した生地からプローブを持ち上げるのに必要な力を意味する。距離は、プローブに付着している距離を意味する。範囲は、得られた曲線の下の部分を意味する。
【０１０９】
生地の粘度は、使用する小麦粉の品質及びレシピに依存している。従って低粘度の生地とは、参考生地と比べて粘度が１００％から２００％（相対的）と幅があり、キシラナーゼを含まない生地、若しくは焼きテストにおいて同程度の嵩増量が得られるように市販の真菌性キシラナーゼ（Pentopan mono BG, Novo Nordisk社製）を添加したときの粘度に対し、その粘度が好ましくは７０％（相対的）未満である生地をいう。
【０１１０】
プロトコール３；阻害剤アッセイプロトコール（阻害剤アッセイ）
単離及び特徴化の過程で阻害剤を検出するには、以下のアッセイを用いる。１００μｌの阻害剤画分、２５０μｌのキシラナーゼ溶液（１２ＴＸＵ／ｍｌを含む）、及び６５０μｌの緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）を混合する。この混合液を４０．０℃で５分間サーモスタットで調節する。反応開始５分後にXylazyme剤１個を加える。反応開始１５分後に１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して、反応を終了させた。かかる反応混合液を遠心分離（３５００ｇ、１０分間、室温）にかけ、上清を５９０ｎｍで測定した。阻害剤は、残留活性としてブランクとの比較において測定した。ブランクも同様にして調製するが、１００μｌの阻害剤は１００μｌの緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）と置き換えた。例えばＸＭ−１は、阻害剤に対し高耐性を示すと考えられる（図２０参照）。ＸＭ−２及びＸＭ−３は、阻害剤に対し中程度の耐性を示すと考えられる（図２０参照）。
【０１１１】
プロトコール４；グルカナーゼプロトコールＩ（エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性 ０．１Ｍ酢酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）でグルカナーゼ試料を希釈し、最終アッセイにおいてＯＤが約０．７となるようにした。該試料の希釈液３種類、及び既知活性の内部標準を、４０℃で５分間サーモスタットで調節した。反応開始５分後に、Xylazyme剤１個を上記酵素溶液に加えた。反応開始１５分後に、１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して反応を終了させた。該反応混合液を遠心分離にかけ、上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。希釈液及びグルカナーゼ量を考慮しつつ、試料の活性（ＢＧＵ：Beta-Glucanase-Units）の標準との相対算出を行った。
【０１１２】
プロトコール５；阻害剤アッセイプロトコールII（阻害剤キネティックスアッセイ）
阻害剤のキネティックスを考察するために水溶性基質（Azo-xylan、Megazyme社製）を用いた。製造者のプロトコールに従い、２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．０）において、基質の２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。このアッセイは、基質、キシラナーゼ、及び阻害剤を４０℃で５分間予熱して行った。
阻害剤の予備的な特徴化を行うために、用いたキシラナーゼを４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈した。Ｋ1測定を行うために、キシラナーゼを約４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈した。
反応開始後０分時に、０．５ｍｌの基質、０．１ｍｌのキシラナーゼ及び０．１ｍｌの阻害剤を４０℃で混合し、反応開始１２５分後に、２ｍｌのエタノール（９５％）を添加して反応を終了させ、続いて１０秒間渦動した。加水分解されずに沈殿した基質を遠心分離（３５００×ｇ、１０分間、室温）にかけて除去した。上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。
【０１１３】
ブランクも同様にして調製した。変更を加えた点は、阻害剤を２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．０）に置き換えたことだけである。
基質濃度を順次減少させてキネティック実験を行うために、２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．０）で希釈して、２％、１％、０．５％、及び０．２５％可溶性アゾキシラン（ｗ／ｖ）の基質濃度をそれぞれ用意した。
上記のキシラナーゼ及び基質濃度を用いてＫ1測定を行った。かかる測定アッセイを行うにあたり、この双方を以下の各濃度、すなわち０、２、５、１０、２５、５０、及び１００μｌ、の阻害剤抽出物と組み合わせた。阻害剤のモル濃度ではなく、μｌ阻害剤を用いることから、Ｋ1は、μｌ阻害剤として表される。
【０１１４】
要約すると本発明は以下のことを提供する。
ａ．小麦粉から内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を単離すること。
ｂ．小麦粉から単離した内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を特徴化すること。
ｃ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤がキシラナーゼ類に及ぼす効果を特徴化すること。
ｄ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類を選択する方法。
ｅ．エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類を選択する方法。
ｆ．真菌性キシラナーゼを含む生地に比べて、好ましい嵩及び適度な粘度を備えた生地を提供するキシラナーゼ。
ｇ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を用いたキシラナーゼ類のスクリーニング方法及び／又は該キシラナーゼ類を変異させる方法、並びに該キシラナーゼ類又はそれらの変異体を生地製造に使用すること。
ｈ．本発明のキシラナーゼ類を用いた食品の調製。
【０１１５】
以下の試料はブダペスト条約に基づき、公認の寄託機関であり、英国ＡＢ２ １ＲＹ、スコットランド、アバディーン、マーチャードライブ、２３Ｓｔ．に所在するThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)に１９９８年１２月に寄託された。
DH5α::pCR2.1#BSキシラナーゼ ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４０９９９
BL21(DE3)::pET24A#XM1 ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４１０００
BL21(DE3)::pET24A#XM3 ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４１００１
DH5α::pCR2.1#BSキシラナーゼには、野生型キシラナーゼが含まれる。
BL21(DE3)::pET24A#XM1には、XM1キシラナーゼが含まれる。
BL21(DE3)::pET24A#XM3には、XM3キシラナーゼが含まれる。
本発明はまた、これらの寄託物に由来し、及び／又はこれらの寄託物から発現される配列、並びにそれらの配列を含む実施例を包含するものである。
次に図面を参照しながら、例を挙げるだけではあるが、本発明を説明する。
図１〜図１０、図１２〜図１６及び図１８〜図３１はグラフであり、図１１はＳＤＳ ＰＡＧＥ実験の結果を示す画像であり、図１７はＩＥＦ実験の結果を示す画像である。
【実施例１】
【０１１６】
実施例１（異なる種類のキシラナーゼを用い、添加量及び寝かせ時間を変えて作製した生地の粘度）
生地に粘度を与える以下のキシラナーゼ能をテストした。（W.Z. and Hoseney, R.C. (1995). Development of an objective method for dough stickiness. Lebensmittel Wiss u.-Technol., 28, 467-473も参照されたい）
（酵素）
「Ｘ１」は、Aspergillus niger由来のエンド−β−１，４−キシラナーゼを精製した試料のことである。このキシラナーゼは、８４００ＴＸＵ（１５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
「Novo」は、Thermomyces由来のNovo Nordisk's Pentopan Mono BGのことである。このキシラナーゼは、３５００００ＴＸＵ（５６０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
「ＢＸ」は、新規の細菌性キシラナーゼを精製した試料のことである。この試料は、２０００ＴＸＵ（２５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
「R▲o▼hm」は、R▲o▼hm GmbH社製の細菌性キシラナーゼであるVeron Specielのことである。この試料は、１０５００ＴＸＵ（２５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。
【０１１７】
（キシラナーゼアッセイ）
キシラナーゼアッセイは、プロトコール１に従って行った。
（小麦粉）
この実験においては、デンマーク産小麦粉（バッチ番号９８０２２）及びドイツ産小麦粉（バッチ番号９８０４８）の２種類の小麦粉を使用した。４００ＢＵにおける上記２種類の小麦粉の水分吸収率は、それぞれ５８％及び６０％であった。
（生地の調製）
生地は、プロトコール２に従って調製した。生地を混合した後、密封容器において３０℃で、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた（粘度測定）
粘度は、プロトコール２に従って測定した。
（真菌性キシラナーゼと新規細菌性キシラナーゼの比較）
以下の生地を作り、１０分後及び４５分後における小麦粉９８０４８の生地の粘度を測定した。２種類の真菌性キシラナーゼ、及び１種類の細菌性キシラナーゼの添加量を変えて（表２参照）、生地を作製した（分量は小麦粉１ｋｇに対するもの）。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
表２における生地から、表３及び図１に示す生地の粘度に関する結果が導きだされる。種々のキシラナーゼを、その分量を様々に変えて添加し、生地を製造してブランクと比較した製造した生地は、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。表３には、粘度がｇ×ｓとして表わされ、粘度の測定結果は、５回測定を行った平均値で示されている。上記表３のデータは、図１に示されている。表３及び図１から、真菌性キシラナーゼＸ１及びNovo生成物中に含まれるキシラナーゼが生地の粘度を上昇させていることがわかる。新規細菌性キシラナーゼを加えたときには、Ｘ１及びNovoと同様の粘度にはならず、さらにコントロールと比較しても該新規キシラナーゼの粘度は減少していた。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
（新規細菌性キシラナーゼとR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの比較）
新規細菌性キシラナーゼの機能を、R▲o▼hm製品の細菌性キシラナーゼであるVeron Specialとの比較において考察するために、小麦粉９８０２２を使用して以下の生地を製造した。２種類の細菌性キシラナーゼの添加量を変えて（表４参照）、生地を作製した（分量は小麦粉１ｋｇに対するもの）。表４に示す生地から、表５及び図２に示す生地粘度の結果を得た。表５には、粘度がｇ×ｓとして表わされ、粘度の測定結果は、５回測定を行った平均値で示されている。表５に示すデータを、図２に図示した。この結果から、ＢＸ（新規の細菌性キシラナーゼ）を加えた生地の粘度は、テストした真菌性キシラナーゼの粘度に比べ、非常に低いことが明らかになった。さらに新規の細菌性キシラナーゼを加えると、R▲o▼hm細菌性キシラナーゼとの比較において生地の粘度が減少することもわかった。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
【表５】
【実施例２】
【０１２４】
実施例２（阻害剤の精製、特徴化、及びキシラナーゼに与える効果）
（小麦粉）
種類の異なる３種類の小麦粉（バッチ番号９８００２、９８０２６、及び９８０５８）を使用して以下の実験を行った。小麦粉バッチ番号９８００２及び９８０５８はデンマーク産の小麦粉である。小麦粉バッチ番号９８０２６はドイツ産の小麦粉である。
（阻害剤抽出）
氷温の蒸留水を用いた撹拌により、阻害剤を小麦粉から抽出した。小麦粉１に対し、２の氷温蒸留水を加えた。この混合物に磁気バーを加え、氷浴させて２０分間撹拌した。小麦粉を撹拌した後、スラリーを遠心分離器のバイアルに入れ、遠心分離（１００００ｇ、４℃で１０分間）にかけた。上清にはキシラナーゼ阻害剤が含まれていた。
（阻害剤アッセイ）
プロトコール３に従って阻害剤アッセイを行った。
【０１２５】
（阻害剤の単離）
１００ｇの小麦粉試料（９８０２６）を抽出した後、クロマトグラフィー法によりキシラナーゼ阻害剤の精製を行った。
（ゲル濾過クロマトグラフィー（２回実施））
７５ｍｌの抽出物を、５００ｍｌSupredex G-25F（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに１０ｍｌ／分の割合で投入し、２０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．２５）でキャリブレートした。溶離液を同一フローにおいて、３０ｍｌ画分として回収した。これら全ての画分において阻害活性が認められた。
【０１２６】
（陽イオン交換クロマトグラフィー（２回実施））
ゲル濾過のランから回収された阻害剤のピーク（２４０ｍｌ）を５０ｍｌSP Sepharose（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに５ｍｌ／分の割合で投入した。阻害剤投入後、Ａ緩衝液（２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２５）を用いて、このカラムをベースラインまで洗浄した。同じフローにおいて、１０カラムボリュームを超えるＡ緩衝液からＢ緩衝液（Ｂ：Ａ＋３５０ｍＭのＮａＣｌ）に至るリニアグラディエントによって阻害剤を溶離させた。この溶離液を１０ｍｌ画分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。
【０１２７】
（疎水性相互作用クロマトグラフィー（２回実施））
陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られた阻害剤のピーク（１１０ｍｌ）に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えて１．０Ｍとし、１０ｍｌPhenyl Sepharose HIC（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに２ｍｌ／分の割合で投入した。Ａ（２０ｍＭのＮａＰｉ、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）からＢ（２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．０）緩衝液に至る１２カラムボリュームのリニアグラディエントによって、阻害剤をカラムから溶離させた。かかる溶離液を２．５ｍｌ画分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。（この実験は２回実施した）
【０１２８】
（分取ゲル濾過クロマトグラフィー）
回転式蒸発装置を使って、ＨＩＣランで得られた５ｍｌの阻害剤ピークを２ｍｌに濃縮した。この試料を３３０ｍｌSuperdex 75PG（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに１ｍｌ／分の割合で投入した。５０ｍＭのＮａＯＡｃ及び０．２ＭのＮａＣｌからなる緩衝液系（ｐＨ５．０）を用いた。溶離液は５．５ｍｌ画分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。
【０１２９】
（プロテアーゼ活性分析）
見いだされた阻害剤効果が、阻害剤によるものか、或いはキシラナーゼを加水分解するプロテアーゼによるものかを確認するために以下の実験を実施した。
（インキュベーションテスト）
２ｍｌの精製キシラナーゼである９８０６０１（エンド−β１，４−キシラナーゼを参照のこと）を、０．２５ｍｌの阻害剤抽出物共存下において４０℃で３時間インキュベーションした。コントロールとして、煮沸（５分間）した阻害剤抽出物を同様にインキュベーションした。インキュベーション後、各試料に５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）を加え２．５ｍｌとし、PD-10カラム（スウェーデン、Pharmacia社製）を使ったゲル濾過によって脱塩し、５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）において３．５ｍｌの試料を得た。
【０１３０】
（加水分解分析）
インキュベーションで得られた精製キシラナーゼ２種類の試料を、SOURCE 15 Sカラムを使って分析した。ゲル濾過した試料１ｍｌを上記カラム（Ａ緩衝液（５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）でキャリブレートした）に２ｍｌ／分の割合で投入した。２０カラムボリュームを超えるＡからＢ（Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）のリニアグラディエントによって試料を溶離させ、２ｍｌ画分として回収した。ＯＤ２８０ｎｍでキシラナーゼが検出され、得られた画分（１００μｌ画分＋９００μｌ緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）＋１Xylazyme剤、１０分間、４０℃。１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを加え反応を終了した。青色＝キシラナーゼ活性）の中にキシラナーゼ活性がみられた。
【０１３１】
（阻害剤の特徴化）
（分析用ゲル濾過クロマトグラフィー）
ＨＩＣランで得られた阻害剤ピーク１００μｌ（回転式蒸発装置を用いて２回濃縮）を、２４ｍｌSuperdex 75 10/30（スウェーデン、Pharmacia社製）に０．５ｍｌ／分の割合で投入した。５０ｍＭのＮａＯＡｃ及び０．１ＭのＮａＣｌからなる緩衝液（ｐＨ５．０）をランニング緩衝液として用いた。溶離液は、２ｍｌ画分として回収した。これらの画分全てにおいて阻害剤が認められた。
かかる阻害剤の大きさを測定するため、２４ｍｌSuperdex 75 10/30カラムに、公知のタンパク質を連続して投入した。このランを実行するときの条件は上述のとおりである。使用した標準タンパク質は以下のとおりである。
タンパク質 大きさ（ＫＤａ）
ＢＳＡ ６７オバルブミン ４３キモトリプシン ２５リボ核酸Ａ １３．７上記タンパク質は、２８０ｎｍにて測定した。
【０１３２】
（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）
調製ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分に、ＳＤＳ試料緩衝液（NOVEX社のプロトコールによって調製）を加え３分間煮沸し、８−１６％ＰＡＧＥゲル（NOVEX社製）にかけた。このゲルを、NOVEX社のシルバー染色プロトコールに従って染色した。分子量マーカーとしてPharmacia社のLMWマーカーを使用した。
【０１３３】
（Ｉｓｏエレクトリックフォーカシング（ＩＥＦ））
無処理の阻害剤のｐｌを測定するため、精製阻害剤試料（３３０ｍｌSuperdex 75 PGによる画分３３）を、pH3-10 IEF GEL（NOVEX）にかけた。ゲルに対するランは、製造者のプロトコールに従って実行した。標準として、Pharmacia社（スウェーデン）のBroad Pl kit, 3.5-9.3を用いた。ゲルは、製造者のプロトコールに従って、クマシブリリアントブルーに染色した。
【０１３４】
（クロマトフォーカシングクロマトグラフィー）
調製ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３の試料を、水に対してゲル濾過した。１００μｌの脱塩した試料を、Mono P HR 5/5（Pharmacia社製、スウェーデン）にかけた。２５ｍＭのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．４）により、開始条件を設定した。このカラムをPoly緩衝液９６と水との割合が、１：１０において溶離した。ｐＨは６．０に調整した（フロー：０．５ｍｌ／分、画分サイズ：０．５ｍｌ）。Poly緩衝液９６による溶離後、Poly緩衝液７４と水との割合が１：１０において、該カラムをさらに溶離させた。
プロトコール３により、全画分のｐＨを測定し、キシラナーゼ阻害剤を示した。
【０１３５】
（アミノ酸配列）
調製精製法によって得られた精製阻害剤の試料（３３０ｍｌSuperdex 75 PGによる画分３３から得た）が用いられた。該試料２００μｌを、C4 Reverse Phase column（Applied Biosystems）にかけた。Ａ：水に０．１％ＴＦＡを添加したもの、及びＢ：１００％アセトニトリルに０．１％ＴＦＡを添加したものを緩衝液系として用いた。このランによる阻害剤ピークを、カルボキシメチル化して、Ｃ４カラムにて再度ランを実行した。かかる方法によって、目的とする阻害剤ペプチド２種を得た。これらのペプチドのＮ末端における配列決定を行った。さらに上記ペプチド２種をLys-Cによって消化した。逆相クロマトグラフィーにより、得られたペプチドを回収してアミノ酸配列決定した。アミノ酸配列決定により得られた配列を確認するため、目的試料の小断片をＭＳ（Voyager社製）を用いて分析した。
【０１３６】
（阻害剤キネティックス）
プロトコール５に従って、阻害剤アッセイを行った。この点に関し、阻害剤に対する予備的な特徴化を行うために用いたキシラナーゼは９８０６０１であり、このキシラナーゼを４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈し、小麦粉９８００２から阻害剤を抽出した。Ｋ1測定を行うために用いたキシラナーゼは、９８０６０１、９８０６０３、９８０８０１、９８０９０１、９８０９０３、９８０９０６、及び９８０９０７であり、これらのキシラナーゼを約４０ＴＸＵ／ｍｌに希釈して用いた。Ｋ1測定に用いた阻害剤は、小麦粉９８０５８から抽出した。
【０１３７】
（ｐＨとの関連における阻害剤の測定）
プロトコール３に以下の修正を加えて実験を行った。６５０μｌ、ｐＨ５．０の緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム）を本アッセイで使用するが、これ以外にもｐＨが４、６、及び７である同じ緩衝液系も本アッセイに使用できる。
【０１３８】
（エンド−β−１，４−キシラナーゼ類）
以下のキシラナーゼ調製物を使用した。
９８０６０１（ＢＸ）：大腸菌において発現されるDaniscoの新規細菌性キシラナーゼの精製調製物（１２２５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０６０３（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hmのものと同一）の精製調製物（１０５０ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０８０１（Ｘ１）：Aspergillus niger由来の精製Ｘ１（８４００ＴＸＵ／ｇ）
９８０８０２（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hmのものと同一）の精製調製物（２６５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０１（Novo）：Novo's Pentopan mono BG由来のThermomycesキシラナーゼの精製調製物（２９００ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼであるBacillus sub.の精製変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０６（ＸＭ３）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼであるBacillus sub.の精製変異体（１７７５ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０７（ＸＭ２）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼであるBacillus sub.の精製変異体（１００ＴＸＵ／ｍｌ）
９５３５（Ｘ３）：Aspergillus niger由来の精製キシラナーゼＸ３（６４９０ＴＸＵ／ｍｌ）
【０１３９】
（単離及び特徴化のための阻害剤抽出）
小麦粉（９８０２６）１００ｇを抽出した。遠心分離にかけた後、１５０ｍｌの上清を得た。この抽出物における阻害剤の存在を調べたところ（表６）、その結果はポジティブだった。表６には、キシラナーゼ９８０６０１を使用し、小麦粉（９８０２６）阻害剤抽出物の＋／−添加による残存活性の結果が示されている。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
（阻害剤単離）
阻害剤抽出物７５ｍｌを５００ｍｌゲル濾過カラムにかけた（図３）。阻害剤を検出したところ、画分［４〜１１］において阻害剤が認められた。７５ｍｌの阻害剤抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分のキシラナーゼ阻害剤アッセイを行った。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。表７に示されるように、画分［４〜１１］において阻害剤が認められた。かかる阻害剤をそれぞれのランでプールし、プールした量は２回分で２４０ｍｌだった。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
ゲル濾過カラムの両ランにおける阻害剤ピークのプールは、約２４０ｍｌだった。ゲル濾過で得た２４０ｍｌのプールを陽イオン交換器を用いて２回処理した。フロースルーの結果は阻害剤ネガティブだった。図４及び表８から明らかなように、約７５０ｍＭのＮａＣｌにおいて阻害剤はカラムに結合し、溶離した。
ゲル濾過した阻害剤抽出物２４０ｍｌを陽イオン交換クロマトグラフィーにかけて得られた画分のアッセイを行って、キシラナーゼ阻害剤の存在を確認した。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。画分［４４〜５４］において阻害剤が存在していた。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
陽イオン交換のランで得られた阻害剤のプールは、１ランにつき１１０ｍｌだった。これらプールした２画分に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えて１．０Ｍにし、２回のランでＨＩＣカラムにかけた。フロースルーで阻害剤を検出したところ、ネガティブだった。図５及び表９から明らかなように、全ての阻害剤がカラムに結合し、好ましい分離を得ることができた。ＨＩＣクロマトグラフィーによる画分分析の結果が表９に示されている。
１４７ｍｌの阻害剤抽出物をＨＩＣクロマトグラフィーにかけて得られた画分のキシラナーゼ阻害剤のアッセイを行った。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。画分［１５〜２３］に阻害剤が存在していた。ＨＩＣクロマトグラフィーで得られた画分１７及び１８を２回程度濃縮し、分取ゲル濾過カラムにかけた（図６）。
【０１４６】
【表９】
【０１４７】
かかる予備的濾過カラムにおける画分の分析結果を表１０に示す。表１０には、濃縮阻害剤試料２ｍｌを分取ゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分におけるキシラナーゼ阻害剤の存在を確認するアッセイの結果が示されている。画分［３１〜３３］において阻害剤が存在していた。
【０１４８】
【表１０】
【０１４９】
（プロテアーゼ活性分析）
キシラナーゼ阻害剤に関する上記のアッセイからは、小麦粉抽出物と混合したときのキシラナーゼ活性低下が、キシラナーゼのタンパク質分解性加水分解に依るものではない可能性を除外することはできない。そこで精製キシラナーゼを「阻害剤」抽出物共存下でインキュベートした。図７及び８から明らかなように、加水分解は生じなかったと考えられる。活性阻害剤のクロマトグラムの方が、少しではあるが、バックグラウンドが大きかった（図８）。しかし、このバックグラウンドは阻害剤のみのクロマトグラムに相当している（阻害剤のクロマトグラムは示さず）。バックグラウンドの差は、煮沸した阻害剤試料の沈殿によるものである。
【０１５０】
（阻害剤の特徴化）
（分析用ゲル濾過クロマトグラフィー）
２回目のＨＩＣランの画分１８における２回濃縮した阻害剤試料１００μｌを、２４ｍｌ分析用Superdex 75 10/30（Pharmacia社製、スウェーデン）にかけた（図９）。溶離液を２ｍｌ画分として回収した。これらの画分のキシラナーゼ阻害剤アッセイを行った。濃縮阻害剤試料１００μｌを分析用ゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分におけるキシラナーゼ阻害剤の存在をみるためにアッセイを行った結果が表１１に示されている。画分［６〜７］において阻害剤が認められた。
【０１５１】
【表１１】
【０１５２】
濃縮した（up-concentrated）阻害剤試料をゲル濾過した後、４種類の標準分子量タンパク質を、全く同じ手順でカラムにかけた（クロマトグラフは示さず）。表１２に、上記タンパク質の分子量及び溶離時間をまとめた。標準タンパク質を阻害剤の分子量（ＭＷ）測定のために用い、表１２中の略語及び数式は表下に示した。
【０１５３】
【表１２】
【０１５４】
Ｋａｖの作用としてｌｏｇ（ＭＷ）をプロットする。公式化ができることから、未知分子の分子量を推定できる（図１０）。図１０から導き出された公式、及び阻害剤の保持時間から、阻害剤の分子量の算出が可能になる。
ＭＷ、ｋＤａ＝１０(-2.4485×Kav+1.9602)
＝１０(-2.4485×0.173559+1.9602)
＝１０1.5352
＝３４．２９
【０１５５】
計算した阻害剤の分子量は、本発明者らがRouau及びSurget（1988, Evidence for the presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flour. Journal of Cereal Science. 28:63-70）の報告をもとに予想していたより高く、そのＭＷ（分子量）は約８ＫＤａだった。ゲル濾過により算出されるＭＷは、阻害剤分子数種が集合することから説明し得る。詳細を知るために、分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得た画分３１、３２、及び３３に対して、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルのランを実行した（図１１）。上記ゲルに示されるように、精製した阻害剤試料と共に処理したレーンに３つのバンドが現れた。これらのバンドは分子量が約４０、３０、及び１０ｋＤａであるタンパク質に相当する。
【０１５６】
（ＭＳを用いた分子量測定）
分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得た阻害剤の画分３３を、Presorbシステム及び５容量の２０ｍＭ酢酸により脱塩した。脱塩処理した画分２００μｌを、C4 Reverse Phase column（Applied Biosystems）にかけた。このランにおいてはピークが３つ認められた。これらピークの内の１つ（ピーク３）が明らかに優勢であり、阻害剤であると考えられた（図１２）。このランで認められた他の２つのピークについても配列決定した。得られた配列から、これらは全て同じ小麦粉タンパク質Serpin由来であり、阻害剤（ピーク３）と同一ではなかった。よってピーク３が目的とするキシラナーゼ阻害剤であるとの結論が得られた。ＭＳ(Voyager社製)を用いて、ピーク３の特徴化をさらに行った。シナピン酸をマトリックスとして用いたＭＳ分光分析により、３９５０３Ｄａのタンパク質に相当するシグナルが認められた（図１３）。
【０１５７】
上述したように、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルからは３つのバンドが認められた。１０ｋＤａ近辺、３０ｋＤａ近辺、及び４０ｋＤａ近辺にそれぞれ１つのバンドがみられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明するために、上述の条件と同一条件下で、精製したドミナント画分を回収し、減圧凍結乾燥し、カルボキシメチル化した後、Ｃ４カラムに戻した。カラムに戻したことにより得られた画分（図１４）をＭＳにより分析した。図１５、１６から明らかなように、これらのポリペプチドの分子量（ＭＷ）は、１２１０４及び２８２２２Ｄａだった。かかるキシラナーゼ阻害剤は、元々ジ−ペプチド（ＭＷ３９５０３Ｄａ）であったか、或いは分析過程において変性及び還元（ＭＷがそれぞれ１２１０４及び２８２２２Ｄａである２つのペプチド）されたかのどちらかであると考えられる。
【０１５８】
（ＩＥＦ及びクロマトフォーカシングクロマトグラフィーによるキシラナーゼ阻害剤のｐｌ測定）
ＩＥＦゲルにおいては、アルカリ性領域に３つのバンド（それぞれ約９．３、８．６、及び８．２）が認められ、酸性領域に３つのバンド（それぞれ５．１、５．３、及び５．５）が認められた（図１７）。この結果からだけでは、無処理のキシラナーゼ阻害剤のｐｌを決定するのは無理であると考えられる。この点に関しては、かかる試料にはキシラナーゼ阻害剤及び約４５００ＤａのSerpinの３断片だけが含まれていることが、配列決定から明らかになっている。Serpinのｐｌを理論的に計算した結果は５．５８であり、配列決定により得られた断片により計算したｐｌは５．４６（Swiss Prot programmesを使用した）だった。このことから、上記ゲルにみられた３つの酸性バンドは、逆相クロマトグラフィー（図１２）で認められたSerpinの３つのピークであり、また３つのアルカリ性バンドは、キシラナーゼ阻害剤の異なる３形態（天然のジ−ペプチド形態、及び２つのペプチド）であることが示唆される（配列決定から示唆される）。
【０１５９】
図１８に示すクロマトフォーカシングクロマトグラフィーの結果から明らかなように、キシラナーゼ阻害剤は所定の条件下ではカラムに結合しない。これは天然のキシラナーゼ阻害剤のｐｌは８．５若しくはそれ以上であることを意味する。よって上述の推定、つまりＩＥＦゲル上に３つのアルカリ性バンドがあることから３種類のキシラナーゼ阻害剤の形態が考え得るという推定は正しいと思われる。
天然のキシラナーゼ阻害剤のｐｌは、８．０〜９．５の間であると結論づけられる。かかる幅内に３つのバンドがある。かかる３バンドは恐らく３形態で存在していると考えられるキシラナーゼ阻害剤に相当している（ＩＥＦによる結果を参照されたい）。この点に関して、ＩＥＦを用いるときには、タンパク質は天然のタンパク質のままランを行うが、ジ−ペプチドタンパク質の中にはＩＥＦ法により部分的に損傷を受けるものがあり、その結果１以上のバンドが出現することがある。
【０１６０】
（配列データ）
阻害剤を形成する２つのペプチドは配列決定され、Ｎ末端及び内在配列が決定された。配列決定の結果は、添付の配列表に配列番号１３〜１９として示した。
第１鎖（Ａ鎖）を形成する配列を、配列番号１３及び１４として示した。第２鎖（Ｂ鎖）を形成する配列を配列番号１５〜１９として示した。配列決定したポリペプチドと相同性を有するポリペプチドをデータベース上で検索したが、その結果はネガティブだった。いずれのポリペプチドも、かつて配列決定されたことも記載されたこともなかった。
【０１６１】
（種類の異なるキシラナーゼ類に対する阻害剤の効果）
種々のキシラナーゼの阻害を考察する目的でいくつかの実験を行った。先ず本発明者らは、キシラナーゼ活性の低下は、抽出物におけるタンパク質分解作用によるものであると考えた。そこで「阻害剤」抽出物の分量を様々に変えて、種々のキシラナーゼをインキュベートした（図１９）。かかるキシラナーゼ類は、程度の差はあれ阻害を受けていた。「阻害剤」濃度条件により、阻害活性が上昇することも見いだした。図１９に示す結果から、タンパク質分解作用又は阻害剤によりキシラナーゼ活性が低下することが示された。しかし一定のキシラナーゼ及び一定濃度の阻害剤による経時実験の結果、並びに「プロテアーゼ活性分析」に基づく上述の結果からは、活性低下が時間の経過に伴って生じることを明らかにできなかった。プロテアーゼと阻害剤を識別するために正式なキネティックスを行った（「阻害剤キネティックス」を参照のこと）。
【０１６２】
Bacillus subtillisキシラナーゼ２種を、そのベーキングに及ぼす効果に着目して詳細に研究した。これらのキシラナーゼは機能的に若干違いがみられ、同量を添加して焼いたときに１種類のキシラナーゼを添加した製品の嵩が幾分大きかった。その理由の１つとして、小麦粉において上記キシラナーゼ類の活性が阻害される程度が異なることが挙げられる。このことを確認するために実験を行った。阻害剤の供給源として小麦粉を２種類用い、かかる実験を２回繰り返して行った。表１３には、種類の小麦粉（９８００２及び９８０２６）から抽出した阻害剤により、２種類のキシラナーゼ（９８０６０１及び９８０６０３）が受ける阻害の結果が示されている。阻害は、％阻害及び％残存活性として算出し、ブランクと比較した。かかる実験からこれら２種類のキシラナーゼは、阻害剤によって程度の差はあるが阻害されることがわかる。上記キシラナーゼ２種は、６アミノ酸が異なるだけである。
【０１６３】
【表１３】
【０１６４】
９８０６０１を基礎として３種のキシラナーゼ変異体を作出した（ＸＭ１、ＸＭ２、及びＸＭ３）。これらの変異体を分析して阻害を調べた（図２０）。図２０から明らかなように、上記変異体３種における残存活性は異なるが、これはキシラナーゼ阻害剤により異なる程度の阻害を受けていることを意味している。５種類のキシラナーゼの内４種類（ＢＸ、R▲o▼hm、ＸＭ１、及びＸＭ３）のキシラナーゼが同じ特異的活性（約２５０００ＴＸＵ／ｍｇのタンパク質）を備えている。ＸＭ２は同様の特異的活性を有していると予想される。ＸＭ１とＸＭ２における阻害の差は、約２５０％である（ＸＭ１の残存活性は、ＸＭ２の静止活性の２．５倍と高い）。この差は１個のアミノ酸に起因する。ＸＭ２のアミノ酸１２２は、アルギニンからアスパラギンに変化し、活性部位近辺で陽電荷の減少をもたらす。
【０１６５】
（阻害剤キネティックス）
阻害剤が拮抗阻害剤であるか非拮抗阻害剤であるかを決定することだけを対象として、簡便な予備的キネティックスを行った。一定のキシラナーゼ及び一定の阻害濃度条件下で、基質の量を様々に変化させてインキュベートした（図２１）。図２１からわかるように、阻害剤存在下のキシラナーゼ及び阻害剤非存在下のキシラナーゼ双方のＶmaxは、約１．１９だった。このことからこの阻害が拮抗阻害であることが示唆される。
上述の予備的阻害実験では、検討したキシラナーゼ類の間でＫ1値が異なることを示していたため、キシラナーゼ数種の正式なＫ1値を測定した。図２２のデータが示すように、キシラナーゼ種間におけるＫ1値には有意の差がみられた。簡単な予備的阻害の特徴化により示された結果が、このことから確認された。
【０１６６】
（ｐＨと阻害との関係）
異なるｐＨにおいてキシラナーゼ阻害剤の存在が容易に認められることから、キシラナーゼ阻害にｐＨが何らかの影響を及ぼしていると考えられる。そこでかかる影響を調べるために実験を行った。図２３から明らかなように、キシラナーゼ阻害はｐＨの影響を受ける。図２４には、キシラナーゼに対する最適ｐＨが示されている。これらの２曲線を比較すると、Novoキシラナーゼ（９８０９０１）のｐＨ４での測定を別にすれば、キシラナーゼにとっての最適ｐＨにおいて最大阻害が生じることがわかる。
【０１６７】
本発明のアッセイにより測定した阻害率が、生地と関連性を有しているかを調べるために計算を行った。
阻害剤抽出
小麦粉（グラム）： ６
水（ｍｌ）： １２
小麦粉ｇ／ｍｌ： ０．５
アッセイにおける小麦粉（ｇ）： ０．０５
キシラナーゼ溶液
ＴＸＵ／ｍｌ： １２
アッセイでのＴＸＵ／ｍｌ： ３
阻害剤：キシラナーゼの割合
小麦粉ＴＸＵ／ｋｇ：６００００（阻害剤アッセイ時）
小麦粉ＴＸＵ／ｋｇ：３０００（ベーカリーへの使用時）
上記の計算から、アッセイにおける阻害剤：キシラナーゼの割合は、生地に含まれるときの割合よりも、アッセイにおける割合の方が２０分の１と低い結果になった。これはキシラナーゼが生地に含まれるときに、より顕著に阻害されることを意味している。しかしながら、移動度及び水分活性は生地における方が低く、このことが阻害に影響を及ぼしているとも考えられる。
【０１６８】
小麦粉には、内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が存在している。かかる阻害剤は、水を用いた簡便な抽出法により小麦粉から抽出でき、この阻害剤が水溶性であることを示している。阻害剤はゲル濾過、イオン交換、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー技術により精製される。
分析用ゲル濾過クロマトグラフィー、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、逆相クロマトグラフィー、及びＭＳを用いた精製阻害剤の特徴化により、約４０ｋＤａのポリペプチドが見いだされた。このポリペプチドは、分子量がそれぞれ１２１０４及び２８２２２Ｄａである２つのペプチドを含むジ−ペプチドであることが判明した。上記精製阻害剤（厳密には２つのペプチド）は、Ｎ末端で配列決定され、次に、得られたペプチドの消化及び配列決定を行った。
【０１６９】
阻害剤を用いた予備実験は、キシラナーゼ活性の低下は、タンパク質分解作用に起因することを示している。しかし、インキュベーション（キシラナーゼ＋阻害剤）の分析結果及び阻害剤のキネティックスは、観察されたキシラナーゼ活性の低下は、拮抗阻害によるものであることを示している。
キシラナーゼ数種類を用いた阻害剤実験からは、阻害剤に対する感受性の違いが見受けられる。キシラナーゼの中には、阻害剤によってほぼ１００％阻害されるものも数種類ある（小麦粉においてよりも、低い阻害剤：キシラナーゼの割合）。ｐＨを様々に変化させて阻害剤アッセイを行ったところ、阻害剤はアッセイにおいては、高度にｐＨ依存性であることが判明した。キシラナーゼ変異体を調べたところ、アミノ酸を１個換えることは、阻害を２５０％減少させることを意味した。
【０１７０】
上述の結果を確認するために、キシラナーゼ数種のＫ1値を測定した。その結果から、使用したキシラナーゼの種類によってＫ1値が異なることが判明し、予備結果においてみられたキシラナーゼと阻害剤に対する耐性の違いとの相関関係が確認された。
【実施例３】
【０１７１】
実施例３（ベーキングテスト）
以下のデータは、ＸＭ１変異体を使ったベーキング実験から得たものである。かかる新規のキシラナーゼ変異体が、嵩の点において明らかにＢＸ（Bacillus subtilis野生型）に勝っていることが、このデータから読みとれる。粘度測定結果からは、上記２種のキシラナーゼ間に有意の差は認められなかった。
（酵素）
９８０９０２（ＢＸ）：大腸菌において発現され、精製したBacillus sub.野生型キシラナーゼ（２０００ＴＸＵ／ｍｌ）
９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現され、精製したBacillus sub.野生型キシラナーゼ変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ）
（小麦粉）
デンマーク産小麦粉、バッチ番号９８０２２
【０１７２】
（ベーキングテスト：ハードクラストロール）
小麦粉２０００ｇ、乾燥酵母４０ｇ、砂糖３２ｇ、塩３２ｇ、GRINDSTEDTMPanodanA2020 ４ｇ、水４００Brabender Units＋４％を、Hobartミキサーを用い、ロースピードで２分間、ハイスピードで９分間のフックで捏和した。生地の温度は２６℃だった。生地を１３５０ｇ計量し、３０℃で１０分間寝かせて、次にFortunaモールドに流し込んだ。３４℃、８５％ＲＨで４５分間プルーフした後、Bagoオーブンで２２０℃で１８分間焼成し、１２秒間蒸らした。
荒熱をとった後、ロールパンを計量し、パンの容積をrape seed deplacement法により測定した。
比容積＝ パンの容積（ｍｌ）／パンの重さ（ｇ）
【０１７３】
（粘度測定）
粘度測定は、プロトコール２に従って行った。
表１４から明らかなように、新規のキシラナーゼ変異体（ＸＭ１）を添加すると、ＢＸを添加したときに比べ、パン嵩が顕著に増した。表１４には、２種類のキシラナーゼ（ＢＸ及びＸＭ１）の分量を様々に変えて添加したときのパン嵩増量分（ｍｌ／ｇ）及び粘度（ｇ×ｓ）が示されている。また、表１４のデータは、図２５、２６、及び２７に示されている。
【０１７４】
【表１４】
【実施例４】
【０１７５】
実施例４（ＸＭ１、R▲o▼hm Veron specialキシラナーゼ、及びR▲o▼hm Veron Specialキシラナーゼの精製物と生地の粘度との関係）
新規キシラナーゼのＸＭ１添加により、R▲o▼hm's Veron Specialキシラナーゼ（さらに該キシラナーゼを精製したもの）を添加したときよりも、生地の粘度が増減するか否かを調べるために生地を調製し、キシラナーゼの作用結果としての粘度を測定した。
（小麦粉）
デンマーク産小麦粉、バッチ番号９８０２２を使用した。
（生地の調製）
生地は、プロトコール２に従って調製した。生地を混合し、粘度測定を行う前に密封容器において、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。
（粘度測定）
粘度測定は、プロトコール２に従って行った。
（酵素）
９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現されるBacillus sub.野生型の精製変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ）
＃２１９９：R▲o▼hm Veron Specialキシラナーゼ（１０５００ＴＸＵ／ｇ）
９８０６０３（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hm'sと同じ）の精製調製物（１０５０ＴＸＵ／ｍｌ）
粘度測定を行うために以下の生地を作製した（表１５）。
【０１７６】
【表１５】
【０１７７】
表１５に示される生地を用いて、表１６の粘度測定結果が得られた。表１６には、精製R▲o▼hmキシラナーゼ、コントロール、ＸＭ１、及びR▲o▼hm's Veron Specialキシラナーゼを使用して調製した生地の粘度測定結果が示されている。上記データは、図２８、２９、及び３０に示されている。
ＸＭ１を使用したときの粘度増加量は、精製R▲o▼hmキシラナーゼを使用したときの粘度増加量より少なかった。未精製のR▲o▼hmキシラナーゼを使用したときの粘度増加量は、それと比べかなり多かった。
【０１７８】
【表１６】
【実施例５】
【０１７９】
実施例５（細菌性エンド−β−１，４−グルカナーゼと生地の粘度との関係）
以下の結果は、細菌性エンド−β−１，４−グルカナーゼが粘度に与える影響を調べるために行った実験から得られたものである。
（酵素）
９８１１０２−１（Xyl）：Veron Special製品のR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの精製調製物に相当する。かかる調製物は精製キシラナーゼであり、エンド−β−１，４−グルカナーゼを全く含まない（３５０ＴＸＵ／ｍｌ）。
９８１１０２−２（Xyl＋Gluc）：Veron Special製品のR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの精製調製物に相当し、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（９００ＴＸＵ／ｍｌ＋１９ＢＧＵ／ｍｌ）を含む。
【０１８０】
（キシラナーゼアッセイ）
プロトコール１に従ってキシラナーゼアッセイを行った。
（グルカナーゼアッセイ）
プロトコール４に従ってグルカナーゼアッセイを行った。
（小麦粉）
デンマーク産小麦粉バッチ番号９８０５８を使用した。４００ＢＵにおける水分吸収率は６０％だった。
（生地の調製）
生地はプロトコール２に従って調製した。生地を混合した後、密封容器にて３０℃でそれぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。
（粘度測定）
粘度測定はプロトコール２に従って行った。表１７に示した生地を作製し、粘度測定を行った。
【０１８１】
【表１７】
【０１８２】
表１７に示した生地により、表１８に示される粘度測定の結果が得られた。表１８には、キシラナーゼを添加した生地、並びにキシラナーゼ及びグルカナーゼを添加した生地の粘度測定の結果が示され、表１８中の生地番号は、表１７の生地番号に対応している。表１８中、Stik#１０は、生地を１０分寝かせた後に粘度測定を行った結果を、Stik#４５は、４５分寝かせた後に粘度測定を行った結果をそれぞれ示す。表１８から明らかなように、生地にエンド−β−１，４−グルカナーゼを添加すると、生地の粘度は増す。表１８に示した結果を図３１に図示した。
【０１８３】
【表１８】
【０１８４】
要約すると本発明は、実施例に示しながら、以下のものを提供するものである。
ａ．小麦粉から内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を単離すること。
ｂ．小麦粉から単離した内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の特徴化を行うこと。
ｃ．種類の異なるキシラナーゼ類に対し内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が及ぼす効果の特徴化。
ｄ．内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類の選択方法。
ｅ．エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けないキシラナーゼ類の選択方法。
ｆ．真菌性キシラナーゼ類を含む生地に比べ、好ましい嵩と程良い粘度を備えた生地を提供するキシラナーゼ類。
ｇ．キシラナーゼ類のスクリーニング方法及び／又は内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を用いて該キシラナーゼを変異させる方法、並びに該キシラナーゼ類又は変異体を生地製造に用いる方法。
ｈ．本発明のキシラナーゼ類を用いて調製した食品。
【０１８５】
本明細書において引用した全ての刊行物は、参考として引用した。当該技術の専門家であれば、本発明の範囲及びその精神から逸脱することなく、本発明において説明した方法及びシステムに様々な修正及び変更を加えることが可能であるのは明白である。特に好ましい実施例を用いて本発明の説明を行ったが、ここにクレームした発明は、これらの実施例に限定されるべきではない。実際、ここに述べた本発明の実施形態に対し、生化学及びバイオテクノロジー又はその関連分野の専門家が充分考慮し得る種々の変更は、本発明のクレームの範囲内でなければならない。
【０１８６】
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】キシラナーゼの種類、添加量、及び寝かせた時間と粘度の関係を示す図である。
【図２】キシラナーゼの種類、添加量、及び寝かせた時間と粘度の関係を示す図である。
【図３】７５ｍｌの阻害剤抽出試料をゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：５００ｍｌSuperdex G-25 F、フロー：１０ｍｌ／分、画分サイズ：３０ｍｌ
【図４】ゲル濾過にかけた２４０ｍｌの阻害剤抽出試料を陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：５０ｍｌSepharose SP、フロー：５．０ｍｌ／分、画分サイズ１０ｍｌ
【図５】１４７ｍｌのイオン交換阻害剤抽出試料に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加え１．０ＭにしたものをＨＩＣクロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：１０ｍｌPhenyl ＨＩＣ、フロー：２．０ｍｌ／分、画分サイズ：２．５ｍｌ
【図６】２ｍｌの濃縮阻害剤試料を分取ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。阻害剤は１７６ｍｌで溶離した。カラム：３３０ｍｌ Superdex 75 PG （Pharmacia社製)、溶離液：５０ｍＭのＮａＯＡｃ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０。フロー：１ｍｌ／分、画分サイズ：５．５ｍｌ
【図７】純粋キシラナーゼ＋煮沸阻害剤抽出物の陽イオン交換クロマトグラムを示す図である。試料：１ｍｌの脱塩９８０６０１＋煮沸阻害剤抽出物。カラム：１ｍｌ Source S 15、緩衝液系：Ａ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ。フロー：２ｍｌ／分
【図８】阻害剤抽出物共存下での３時間にわたるインキュベーション後の純粋キシラナーゼの陽イオン交換クロマトグラムを示す図である。試料：１ｍｌの脱塩９８０６０１＋阻害剤。カラム：１ｍｌ Source S15、緩衝液系：Ａ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ。フロー：２ｍｌ／分
【図９】１００μｌの濃縮阻害剤試料を分析用ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。阻害剤は１０．８１ｍｌで溶離した。カラム：２４ｍｌ Superdex 75 10/30（Pharmacia社製、スウェーデン）、溶離液：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、フロー：０．５ｍｌ／分、画分サイズ：２．０ｍｌ
【図１０】Superdex 75 10/30でランにかけて標準タンパク質のＫａｖとＬｏｇ（ＭＷ）との関係を調べた結果を示す図である。
【図１１】分取ゲル濾過により得られた画分３１、３２及び３３のＳＤＳ ＰＡＧＥの結果を示す図である。１列目及び３列目は、ＭＷマーカーである（Pharmacia's LMW markers,スウェーデン）。２列目及び４列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μｌを投入した画分３２である。６列目及び８列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μｌを投入した画分３１である。７列目及び９列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μｌを投入した画分３３である。
【図１２】ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３の逆相クロマトグラムを示す図である。クロマトグラムでは４つのピークが明確に示されている。ピーク３はキシラナーゼ阻害剤である。ピーク４、５、及び６の配列決定を行ったところ、小麦タンパク質であるSerpinと高度な相同性を示した。
【図１３】逆相クロマトグラフィーで得られた画分３のＭＳの結果を示す図である。分光分析から、分子量３９５０３Ｄａの分子が一個見いだされた。
【図１４】画分３３を逆相クロマトグラムにかけて得られたカルボキシメチル化された画分３（図１２参照）を逆相クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。かかるクロマトグラムでは、ジ−ペプチドを示唆する２個の明確なピークが明らかになった。
【図１５】カルボキシメチル化逆相クロマトグラフィー（図１４参照）で得られた画分２をＭＳにかけた結果を示す図である。分光分析から分子量１２１０４Ｄａのペプチドが明らかになった。
【図１６】カルボキシメチル化逆相クロマトグラフィー（図１４参照）で得られた画分３をＭＳにかけた結果を示す図である。分光分析から分子量２８２２２Ｄａのペプチドが明らかになった。
【図１７】分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３及び３４をＩＥＦにかけた結果を示す図である。２列目はｐｌ３〜１０標準、３列目はｐｌ２．５〜６．５標準、４列目及び５列目はそれぞれ画分３３及び画分３４、６列目はトリシン阻害剤（ｐｌ４．５５）、７列目はβ−ラクトグロブリン（ｐｌ５．２０）、また８列目及び９列目はそれぞれ画分３３及び３４である。矢印は、認められた画分３３のバンドを示す。
【図１８】キシラナーゼ阻害剤のクロマトフォーカシングクロマトグラフィーから明らかになった、ｐＨ及び相対的ＯＤ（阻害剤アッセイより）と画分との関係を示す図である。図からわかるように画分７においてＯＤが相対的に減少しているが、これは阻害剤活性によるものである。このときのｐＨは９．４である。
【図１９】キシラナーゼ４種類の残存活性％と、阻害剤濃度との関係を示す図である。用いたキシラナーゼ４種は、◆＝Ｘ１、■＝Ｘ３、×＝ＢＸ、▲＝Novoである。
【図２０】小麦粉抽出物共存下でのインキュベーション後における９８０６０１（coli-1）、９８０６０３（Belase）、及び９８０６０１の変異体３種（ＸＭ１、ＸＭ２、及びＸＭ３）の残存活性を示す図である。
【図２１】キシラナーゼ（９８０６０１）＋／−阻害剤のラインウィーバー・バークプロット（二重逆数プロット）を示す図である。基質濃度は％アゾキシランである。Ｖは、アッセイにおける相対的ＯＤ５９０である（１００がＳ＝２％のとき）。
【図２２】種々のキシラナーゼのＫ1値をμｌ阻害剤として示した図である。
【図２３】３種類のキシラナーゼ（９８０６０１＝Bac. Sub. wt、９８０８０１＝Ｘ１、及び９８０９０１＝Thermomyces）の阻害とｐＨとの関係を示す図である。関連のブランクを基質にしてデータを得た。
【図２４】３種類のキシラナーゼ（９８０６０１＝ＢＸ、９８０８０１＝Ｘ１、及び９８０９０１＝Novo）の最適ｐＨ条件を示す図である。
【図２５】比容積＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２６】比容積増加量＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２７】粘度＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２８】１０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後で測定した粘度と種々のキシラナーゼ調製物及びコントロールとの関係を示す図である。９８０６０３は精製したR▲o▼hmキシラナーゼを、ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図２９】１０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後の、粘度の増加と３種類のキシラナーゼ調製物の関係を示す図である。９８０６０３は精製したR▲o▼hmキシラナーゼを、ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図３０】１０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後の、粘度の増加と２種類のキシラナーゼ調製物の関係を示す図である。ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図３１】粘度の増加とエンド−β−１，４−グルカナーゼ添加との関係を示す図である。１：キシラナーゼ無添加のコントロール生地、２：７５００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉、３：７５００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉＋１５８ＢＧＵ／ｋｇ小麦粉、４：１５０００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉、５：１５０００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉＋３１６ＢＧＵ／ｋｇ小麦粉を示している。１０分（Stik#１０）及び４５分（Stick#４５）後に生地の測定を行った。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号５として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号６として示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを発現することにより得られるポリペプチド；
からなるキシラナーゼの、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地を調製するための使用であって、
前記粘度が、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（Stable Micro Systems社製）により生地粘度を測定することを含む粘度測定方法により測定可能であり、生地が、Farinograph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００Brabender Units（ＢＵ）で、小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合し、そこに水を加え、さらに５分間前記生地を混ぜ、できあがった生地を密封容器において３０℃で、有利には１０、３０又は４５分間寝かせ、約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載し、均一に押し出すように前記生地を４ｍｍ押し出し、１ｍｍの生地を押し出し、ＴＡ−ＸＴ２システムに接合したプローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で、押し出した生地を押圧し、前記プローブを持ち上げ、前記生地と前記プローブとが粘着する度合を記録し、以下のＴＡ−ＸＴ２の設定：
科目： 粘着テスト
テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ
距離： １５ｍｍ
力： ４０ｇ
時間： ０．１ｓ
トリガータイプ 自動−５ｇ
データ収集率 ４００ｐｐｓ
を用いて作製されることを特徴とする使用。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号５として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号６として示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを発現することにより得られるポリペプチド；
からなるキシラナーゼを用いて調製された、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地であって、
前記粘度が、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（Stable Micro Systems社製）により生地粘度を測定することを含む粘度測定方法により測定可能であり、生地が、Farinograph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００Brabender Units（ＢＵ）で、小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合し、そこに水を加え、さらに５分間前記生地を混ぜ、できあがった生地を密封容器において３０℃で、有利には１０、３０又は４５分間寝かせ、約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載し、均一に押し出すように前記生地を４ｍｍ押し出し、１ｍｍの生地を押し出し、ＴＡ−ＸＴ２システムに接合したプローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で、押し出した生地を押圧し、前記プローブを持ち上げ、前記生地と前記プローブとが粘着する度合を記録し、以下のＴＡ−ＸＴ２の設定：
科目： 粘着テスト
テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ
距離： １５ｍｍ
力： ４０ｇ
時間： ０．１ｓ
トリガータイプ 自動−５ｇ
データ収集率 ４００ｐｐｓ
であることを特徴とする生地。
【請求項３】
請求項２記載の生地を用いて調製される焼き製品であって、パン、プレッツェル、トルティヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、又はクラッカーであることを特徴とする焼き製品。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号５として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号６として示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを発現することにより得られるポリペプチド；
からなるキシラナーゼの、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地を調製するための使用であって、
前記粘度が、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（Stable Micro Systems社製）により生地粘度を測定することを含む粘度測定方法により測定可能であり、生地が、Farinograph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００Brabender Units（ＢＵ）で、小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合し、そこに水を加え、さらに５分間前記生地を混ぜ、できあがった生地を密封容器において３０℃で、有利には１０、３０又は４５分間寝かせ、約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載し、均一に押し出すように前記生地を４ｍｍ押し出し、１ｍｍの生地を押し出し、ＴＡ−ＸＴ２システムに接合したプローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で、押し出した生地を押圧し、前記プローブを持ち上げ、前記生地と前記プローブとが粘着する度合を記録し、以下のＴＡ−ＸＴ２の設定：
科目： 粘着テスト
テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ
距離： １５ｍｍ
力： ４０ｇ
時間： ０．１ｓ
トリガータイプ 自動−５ｇ
データ収集率 ４００ｐｐｓ
を用いて作製されることを特徴とする使用。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド：
（ａ）配列番号５として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号６として示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを発現することにより得られるポリペプチド；
からなるキシラナーゼを用いて調製された、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地であって、
前記粘度が、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（Stable Micro Systems社製）により生地粘度を測定することを含む粘度測定方法により測定可能であり、生地が、Farinograph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００Brabender Units（ＢＵ）で、小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合し、そこに水を加え、さらに５分間前記生地を混ぜ、できあがった生地を密封容器において３０℃で、有利には１０、３０又は４５分間寝かせ、約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載し、均一に押し出すように前記生地を４ｍｍ押し出し、１ｍｍの生地を押し出し、ＴＡ−ＸＴ２システムに接合したプローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で、押し出した生地を押圧し、前記プローブを持ち上げ、前記生地と前記プローブとが粘着する度合を記録し、以下のＴＡ−ＸＴ２の設定：
科目： 粘着テスト
テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ
テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ
距離： １５ｍｍ
力： ４０ｇ
時間： ０．１ｓ
トリガータイプ 自動−５ｇ
データ収集率 ４００ｐｐｓ
であることを特徴とする生地。
【請求項３】
請求項２記載の生地を用いて調製される焼き製品であって、パン、プレッツェル、トルティヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、又はクラッカーであることを特徴とする焼き製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公開番号】特開２０１１−９２１９９（Ｐ２０１１−９２１９９Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８０５８１（Ｐ２０１０−２８０５８１）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【分割の表示】特願２０００−５９１１８１（Ｐ２０００−５９１１８１）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１７日（１９９９．１２．１７）
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【分割の表示】特願２０００−５９１１８１（Ｐ２０００−５９１１８１）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１７日（１９９９．１２．１７）
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
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