ダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法、並びにダイオキシン類モニター用遺伝子及び植物形質転換用プラスミドベクター
【課題】 ダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ、スクリーニング方法を提供する。また、ダイオキシン類モニター用遺伝子及びこの遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターを提供する。
【解決手段】 ダイオキシン類暴露によりその発現が変動する複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から調製されたＤＮＡプローブが基板に固定化されているダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイである。また、このようなＤＮＡアレイを用いたダイオキシン類汚染のスクリーニング方法である。更に、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動するダイオキシン類モニター用遺伝子及びこの遺伝子を宿主の植物体に導入するための植物形質転換用プラスミドベクターである。
【解決手段】 ダイオキシン類暴露によりその発現が変動する複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から調製されたＤＮＡプローブが基板に固定化されているダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイである。また、このようなＤＮＡアレイを用いたダイオキシン類汚染のスクリーニング方法である。更に、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動するダイオキシン類モニター用遺伝子及びこの遺伝子を宿主の植物体に導入するための植物形質転換用プラスミドベクターである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、土壌等の土圏や、湖沼、地下水等の水圏や、焼却場周辺の大気等の大気圏がダイオキシン類により汚染されているか否かをスクリーニングするために用いられるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法、並びに、ダイオキシン類により汚染されているか否かをモニターするのに好適なダイオキシン類モニター用遺伝子及びこれを用いて調製された植物形質転換用プラスミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類には、数多くの化学構造を持つ物質があり、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類や多ハロゲン化ジベンゾフラン類を始めとして、その類縁化合物であるコプラナーＰＣＢ（coplanar polychlorobiphenyls；Co-PCBs）類等が知られている。そして、これらのダイオキシン類は、化学構造的に安定な物質であって環境中で分解され難く、また、人体に対して低濃度で強い毒性を有し、広範囲に汚染が広がるのが特徴であり、しかも、一旦このダイオキシン類で環境が汚染されるとその修復が極めて困難である。
【０００３】
このため、環境省においても、ダイオキシン類汚染対策のための幾つかの技術的指針やマニュアル等を公表しており、特に、ダイオキシン類による汚染が存在するか否か、存在するとすればどの様なダイオキシン類がどの程度の濃度で存在するか、等のダイオキシン類による汚染の実態を高い精度で把握することがダイオキシン類の汚染対策を進める上で極めて重要であることから、高濃度ダイオキシン類汚染物分解処理技術マニュアルとは別に、ダイオキシン類による汚染を測定するための測定方法や精度管理について、幾つかの技術的指針やマニュアルを公表している（環境省ホームページの「ダイオキシン類対策」URL: http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html）。
【０００４】
そして、この環境省の技術的指針やマニュアルによれば、例えば平成１２年１月公表の「ダイオキシン類に係る土壌調査測定マニュアル」には、調査地点から試料を採取して分析試料を調製する方法から、分析に用いる試薬、材料、器具等のブランク試験の方法、多くの操作を含むクリーンアップ処理の方法、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）による分析操作の方法等までが細かに説明されており、特にガスクロマトグラフ質量分析計等を用いた大型分析機器によりダイオキシン類の個別の化合物毎の定量分析を精度良く行うことが求められている。
【０００５】
しかしながら、このガスクロマトグラフ質量分析計を用いるＧＣ−ＭＳ法においては、試料中にどの様なダイオキシン類がどの程度の濃度で含まれているかを正確に測定することはできるが、広い調査領域から採取された多数の試料を同時に一括して測定することができず、しかも、測定に際しては、測定対象の試料がダイオキシン類に汚染されているか否かにかかわらず、たとえ汚染されていない試料についても汚染されている試料と同様の測定操作を必要とし、実際にはダイオキシン類汚染の調査に相当の無駄な労力と費用が嵩むという問題がある。
【０００６】
また、このようなＧＣ−ＭＳ法における問題を解決するために、ダイオキシン受容体（AhR）及びダイオキシン受容体核トランスロケーター（Arnt）を恒常的に産生又は導入し、ダイオキシン類、ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを含む複合体の転写制御領域への結合を介して、レポータータンパクを産生するダイオキシン類測定用形質転換体を調製し、このダイオキシン類測定用形質転換体を用いてダイオキシン類の検出、定量分析、及びスクリーニングを行うことも提案されている（特開2004-135,662号公報）。なお、このダイオキシン類測定用形質転換体は、哺乳動物由来の特定の細胞を宿主とするものである。
【非特許文献１】環境省ホームページの「ダイオキシン類対策」URL: HYPERLINK "http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html" http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html
【特許文献１】特開2004-135,662号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、ダイオキシン類の汚染については、最終的には「どの様なダイオキシン類がどの程度の濃度で存在するか」をＧＣ−ＭＳ法により高い精度で把握することが必要であるとしても、もし採取された多数の試料について「ダイオキシン類で汚染されているか否か」を簡便な方法で容易にスクリーニングすることができれば、このスクリーニングでダイオキシン類の汚染が認められた試料についてのみＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行えばよく、このＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を大幅に低減することができるほか、気軽にダイオキシン類汚染の有無を調査することが可能になり、ダイオキシン類の汚染対策に多大な役割を果たすことになる。
【０００８】
また、例えばダイオキシン類に汚染された地域で長期に亘って環境改善対策を進めているような場合等においては、ダイオキシン類による汚染がどの程度まで改善したかを定期的にモニタリングする必要があるが、これまではこのような場合においても、定期的に試料を採取し、この採取した全ての試料についてＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行う必要があり、もし多数の試料について簡便な方法で容易にダイオキシン類の存在の有無をスクリーニングすることができれば、ＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を低減できるだけでなく、環境改善対策の結果を経時的に観察することが容易になる。
【０００９】
ところで、動物については、これまでにダイオキシン類暴露により発現応答する遺伝子の存在が多数報告されている。このことは、これらの遺伝子がダイオキシン類汚染のバイオマーカーになり得る可能性を示唆している。これに対して、植物については、ダイオキシン類暴露による遺伝子発現についてあまり検討されてこなかったが、植物は動物と異なって移動できない等の植物特有の生活様式を有していることから、長い進化の過程で植物固有の遺伝形質を獲得してきており、その中には有害化学物質のストレスを含む様々な劣悪環境ストレスに適応する遺伝形質も数多く含まれていることから、ダイオキシン類暴露に発現応答する遺伝子の存在が期待される。
【００１０】
そこで、本発明者は、一年草であって種子から開花まで１〜１．５ヶ月とその生育が早く、個体が小さくて生育し易いという特長を有し、しかも、染色体数（2n＝10）が少なくてゲノムサイズ（108塩基数）が小さく、既にゲノムの全塩基配列が決定されていて遺伝子解析がやり易いアブラナ科シロイヌナズナ属の植物、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に着目し、このシロイヌナズナの遺伝子がダイオキシン類に対してどのような発現応答をするかについて検討した結果、シロイヌナズナの遺伝子にはダイオキシン類暴露により遺伝子発現が促進されるものと、反対に抑制されるものと、更には発現応答がないものとが存在し、このシロイヌナズナの遺伝子が有するダイオキシン類暴露に対する発現応答の性質を利用してダイオキシン類汚染のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
また、本発明者は、ダイオキシン類暴露に対する発現促進や発現抑制が比較的強いシロイヌナズナの遺伝子の遺伝子発現調節部位と所定のレポーター遺伝子とを結合させて得られた遺伝子（ダイオキシン類モニター用遺伝子）がダイオキシン類に暴露されると、そのレポーター遺伝子の発現が促進あるいは抑制され、ダイオキシン類モニター用として利用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、ダイオキシン類暴露によりその発現が変動（促進又は抑制）する複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から得られたＤＮＡプローブ（cＤＮＡプローブあるいはオリゴヌクレオチドプローブ）を利用して作製され、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを提供することにある。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、ダイオキシン類暴露によりその発現が変動（促進又は抑制）する複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から調製されたＤＮＡプローブを用いて作製されたＤＮＡアレイを利用し、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができるダイオキシン類汚染のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１４】
更に、本発明の他の目的は、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させた遺伝子であり、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）することを利用し、ダイオキシン類の汚染をモニタリングすることができるダイオキシン類モニター用遺伝子、及びこのダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
すなわち、本発明は、ダイオキシン類暴露によりその発現が促進される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現促進遺伝子）及び／又はダイオキシン類暴露によりその発現が抑制される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現抑制遺伝子）から調製されたＤＮＡプローブが基板に固定化されていることを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイである。
【００１６】
また、本発明は、スクリーニング試料を含む培地でシロイヌナズナを所定期間栽培し、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出し、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製し、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイ上のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションさせ、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べ、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かを判定することを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング方法である。
【００１７】
更に、本発明は、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させた遺伝子であって、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）することを特徴とするダイオキシン類モニター用遺伝子であり、また、このようなダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターである。
【００１８】
なお、ダイオキシン類の汚染をスクリーニングし、あるいは、モニターするために本発明で用いられるシロイヌナズナの遺伝子には、ダイオキシン類に暴露されてその発現が促進される遺伝子（発現促進遺伝子）と、ダイオキシン類に暴露されてその発現が抑制される遺伝子（発現抑制遺伝子）と、ダイオキシン類に暴露されてもその発現が促進も抑制もされない遺伝子（発現無応答遺伝子）とが存在するが、本発明においては、ダイオキシン類に暴露されていないシロイヌナズナ由来のmＲＮＡより調製した蛍光標識cＤＮＡをターゲットとした蛍光シグナル強度（ＳN）に対するダイオキシン類に暴露されたシロイヌナズナ由来のmＲＮＡより調製した蛍光標識cＤＮＡをターゲットとした蛍光シグナル強度（ＳE）のシグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）の遺伝子を「発現促進遺伝子」とし、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）の遺伝子を「発現抑制遺伝子」とし、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５＜ＳE／ＳN＜２．０の遺伝子を「発現無応答遺伝子」と定義した。
【００１９】
ここで、上記発現促進遺伝子としては、具体的には、遺伝子発現の促進が顕著な（比較的強い）Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120等や、遺伝子発現の促進が比較的弱いＡt1g03220、Ａt1g62660、Ａt1g74950、Ａt2g19570、Ａt2g38860、Ａt3g11340、Ａt3g26450、Ａt4g15210、Ａt5g01470、Ａt5g13180、Ａt5g13330、Ａt5g21105、Ａt5g47060、Ａt5g58070等が挙げられる。
【００２０】
また、上記発現抑制遺伝子としては、具体的には、遺伝子発現の抑制が顕著な（比較的強い）Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710等や、遺伝子発現の抑制が比較的弱いＡt1g20020、Ａt1g21310、Ａt1g30110、Ａt1g62480、Ａt2g27710、Ａt2g33370、Ａt2g33830、Ａt2g39390、Ａt3g04920、Ａt3g05560、Ａt3g07350、Ａt3g10340、Ａt3g48100、Ａt3g48930、Ａt3g49780、Ａt3g49910、Ａt3g55980、Ａt4g14320、Ａt4g25830、Ａt5g02020、Ａt5g02870、Ａt5g03180、Ａt5g07660、Ａt5g14740、Ａt5g27770、Ａt5g60670等が挙げられる。
【００２１】
更に、上記発現無応答遺伝子としては、上記の発現促進遺伝子及び発現抑制遺伝子以外のシロイヌナズナ由来の遺伝子が挙げられる。
【００２２】
〔ダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ〕
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイは、少なくとも上記発現促進遺伝子から調製されたＤＮＡプローブ及び／又は上記発現抑制遺伝子から調製されたＤＮＡプローブの一部又は全部が基板に固定化されているものであり、そして、この基板には、これら発現促進遺伝子由来のＤＮＡプローブ及び／又は発現抑制遺伝子由来のＤＮＡプローブの一部又は全部に加えて、発現無応答遺伝子から得られたＤＮＡプローブの一部又は全部が固定化されていてもよい。
【００２３】
このスクリーニング用ＤＮＡアレイに用いる発現促進遺伝子のＤＮＡプローブとしては、好ましくは、遺伝子発現の促進が顕著であって（比較的強くて）グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)のアイソザイム遺伝子をコードするＡt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、及びＡt1g78380等や、チトクロームＰ４５０(CYP)のアイソザイム遺伝子をコードするＡt3g03470、Ａt3g26170、Ａt4g13770、及びＡt5g38970等や、パーオキシダーゼ(PO)のアイソザイム遺伝子をコードするＡt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120等や、その他のＡt2g05380、Ａt3g49220、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、及びＡt5g14920等から選ばれた一部又は全部の遺伝子から導かれたＤＮＡプローブであるのがよく、また、発現抑制遺伝子のＤＮＡプローブとしては、好ましくは、遺伝子発現の抑制が顕著な（比較的強い）Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれた一部又は全部の遺伝子から導かれたＤＮＡプローブであるのがよい。
【００２４】
また、スクリーニング用ＤＮＡアレイに用いる基板としては、典型的には透明な薄いスライドガラス状のガラス板であるが、多孔質ナイロン製基盤等の従来公知の基板も用いることができる。また、この基板上にＤＮＡプローブを固定化する方法についても、例えばガラス板状で直接ＤＮＡ合成を行い、数十merのオリゴヌクレオチドをプローブにするオリゴヌクレオチドアレイ法や、cＤＮＡクローン等をスポッターでガラス板に固定するcＤＮＡマイクロアレイ法等により、従来公知の方法を採用することができる。
【００２５】
例えば、オリゴヌクレオチドをプローブに用いるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを作製する場合について、以下に具体的に説明する。
シロイヌナズナのゲノム中にはチトクロームP450(CYP)をコードする遺伝子として約２８０、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)をコードする遺伝子として４８、パーオキシダーゼ(PO)をコードする遺伝子として７３のアイソザイム遺伝子の存在が知られており、その位置も特定されている。そこでThe Arabidopsis Information Resourceのゲノムデータベースを基にして、長さが６０mer前後でＴm（水素結合変性温度）が６８〜７０℃の条件に合うオリゴヌクレオチド配列をそれぞれの遺伝子について検索し、このオリゴヌクレオチドを合成する。
【００２６】
次に、上記チトクロームP450(CYP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)及びパーオキシダーゼ(PO)以外のタンパク質をコードする遺伝子であって、PCB126暴露により遺伝子発現が促進され、又は、抑制される遺伝子についても、その長さが６０mer前後でＴmが６８〜７０℃の条件に合うオリゴヌクレオチド配列を検索し、このオリゴヌクレオチドを合成する。
【００２７】
以上のようにして検索し合成したオリゴヌクレオチドを用い、また、ＤＮＡアレイの蛍光シグナル補正用コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素あるいはオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)の塩基配列から、それぞれオリゴヌクレオチドプローブを合成し、それらをそれぞれスライドガラス上の４箇所に固定化してダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを作製する。
【００２８】
このようにして作製されるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイは、ダイオキシン類汚染のスクリーニング用として用いることができる。ここで、ダイオキシン類とは、ジベンゾ-p-ジオキシン、ジベンゾフラン及びビフェニルが有する２つのベンゼン環において、複数の水素原子が塩素原子や臭素原子等のハロゲン原子で置換された多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類、多ハロゲン化ジベンゾフラン類及びコプラナーＰＣＢ類の総称であり、そのうち、１分子中に４個以上のハロゲン原子が核置換した多ハロゲン化体が特に人体に対して毒性が強いとされている。
【００２９】
具体的には、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾ-p-ジオキシン等の化合物を挙げることができ、また、多ハロゲン化ジベンゾフラン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、2,3,4,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8,9-ヘキサクロロジベンゾフラン、2,3,4,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾフラン等の化合物を挙げることができ、更に、コプラナーＰＣＢ類としては、例えば、3,3',4,4'-テトラクロロビフェノール、3,4,4',5-テトラクロロビフェニール、3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェノール、2,3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2,3,3',4,4'-ペンタクロロビフェニール、2,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2',3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、3,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェノール、2,3,3',4,4',5-ヘキサクロロビフェニール、2,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェニール、2,3,3',4,4',5,5'-ヘプタクロロビフェノール、2,2',3,3',4,4',5-ヘプタクロロビフェノール等の化合物を挙げることができる。
【００３０】
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイは、特にPCB77及びPCB81等のテトラクロロビフェニール(TeCB)、PCB105、PCB114、PCB118、PCB123及びPCB126等のペンタクロロビフェニール(PeCB)、PCB156、PCB157、PCB167及びPCB169等のヘキサクロビフェニール(HxCB)、及びPCB189等のヘプタクロロビフェニール(HpCB)等のコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）のスクリーニング用として好適に用いることができる。
【００３１】
〔ダイオキシン類汚染のスクリーニング方法〕
また、本発明は、このように複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から調製された発現促進遺伝子由来のＤＮＡプローブ及び／又は発現抑制遺伝子由来のＤＮＡプローブが基板に固定化されたＤＮＡアレイを用いてダイオキシン類汚染のスクリーニングを行う方法であり、先ず、スクリーニング試料を含む培地で例えばオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子が導入されたシロイヌナズナを所定期間栽培し、次いで、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出し、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製し、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイ上のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションさせ、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べ、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かを判定するダイオキシン類汚染のスクリーニング方法である。
【００３２】
ここで、スクリーニング試料とは、ダイオキシン類により汚染されているか否かの調査を必要とする種々の調査対象から採取された土壌、焼却灰、地下水、排水、河川水、湖沼水等や、これらのものから溶剤抽出、固相抽出等の手段で調製されたものであり、また、このスクリーニング試料を含む培地とは、シロイヌナズナを栽培できるように調製されたシロイヌナズナ栽培用の液体及び／又は固体であって、その組成の一部又は全部として上記スクリーニング試料が添加されたものであり、場合によってはシロイヌナズナが播種される調査対象の土地等そのものであってもよい。また、上記培地を用いて行うシロイヌナズナの栽培期間は、特に制限されるものではないが、通常７日間から３０日間、好ましくは７日間から１１日間であるのがよい。
【００３３】
また、標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製するために用いられる標識化合物については、例えば、Cy3-dUTPやCy5-dUTP等の蛍光標識化合物を始め、発色標識化合物や、32Ｐ等のラジオアイソトープ標識化合物等を挙げることができ、これらはその１種のみを単独で用いることができるほか、２種以上の化合物を併用することもできる。
【００３４】
そして、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出す方法については、例えば、グアニジンチオシアネートをＲＮＡ分解酵素阻害剤として用い、高濃度塩化リチウム（LiCl）で高分子ＲＮＡを沈殿させる方法で行われ、また、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製する方法については、例えば、蛍光標識化合物としてCy3-dUTP及びCy5-dUTPを用い、マイクロアレイ用蛍光標識cＤＮＡ作成キット（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いて行われる。
【００３５】
また、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイとの間でハイブリダイゼーションさせる方法については、例えば、蛍光標識化されたCy3-cＤＮＡとCy5-cＤＮＡを同量加えたものを蛍光標識ターゲットcＤＮＡとしてcＤＮＡマイクロアレイにアプライし、遮光下４２℃、１６時間の条件でサザンハイブリダイゼーションを行う方法等が挙げられる。
【００３６】
そして、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べる方法については、例えば、サザンハイブリダイゼーション後のマイクロアレイをよく洗浄して未吸着のcＤＮＡを除去した後、マイクロアレイスキャナーを用いて５３２nm及び６３５nmの２つの波長でスキャニングし、各スポットの蛍光シグナル強度を測定して数値化し、また、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かの判定については、例えば、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）である全ての発現促進遺伝子のシグナル強度比を平均化してその数値を求め、また、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）である全ての発現抑制遺伝子のシグナル強度比を平均化してその数値を求め、これらの求められた数値から判定する。
【００３７】
〔ダイオキシン類モニター用の遺伝子とプラスミドベクター〕
更に、本発明は、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させ、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）するダイオキシン類モニター用遺伝子である。
【００３８】
ここで、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位は、好ましくは、遺伝子発現促進が顕著な（比較的強い）遺伝子、Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120や、遺伝子発現抑制が顕著な（比較的強い）遺伝子、Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710の遺伝子発現調節部位であるのがよく、これらの遺伝子の発現調節部位は、ダイオキシン類モニター用遺伝子が組み込まれた宿主の植物体がダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現を顕著に（比較的強く）促進又は抑制し、宿主の植物体がダイオキシン類に暴露されたか否かの判定が容易になる。
【００３９】
また、これらの遺伝子発現調節部位に結合されるレポーター遺伝子としては、その遺伝子の発現変動を遺伝子発現情報として容易に測定できるものであればよく、特に制限されるものではないが、例えば緑色蛍光タンパク質遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００４０】
本発明においては、上記のダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させてダイオキシン類モニター用遺伝子を作製する。
【００４１】
この遺伝子発現調節部位とレポーター遺伝子との結合は、例えば、次のような方法で行うことができる。すなわち、cDNAマイクロアレイ法及びリアルタイムPCR法で見いだされた上記のダイオキシン類暴露により発現変動（促進又は抑制）する遺伝子の中から、ダイオキシン類汚染のモニタリングに適当な遺伝子を特定する。その遺伝子の発現調節部位の塩基配列をシロイヌナズナ遺伝子のデータベース（The Arabidopsis Information Resource）から入手し、その完全長の配列をＰＣＲ法で調製する。バクテリオファージラムダと大腸菌ゲノム間の類似組み換え反応を応用した遺伝子クローニングシステム(Gateway Technology／Invitrogen)を用いて、植物中でのプロモーター発現解析用に開発されたベクター、pBGWFS7中のレポーター遺伝子の上部に完全長発現調節部位をクローニングする。pBGWFS7中にはレポーター遺伝子として、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)と大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼ遺伝子(GUS)が組み込まれている。
【００４２】
ここで、PCB126暴露及びTCDD暴露により発現促進が見られるグルタチオン-S-トランスフェラーゼの1つであるＡt1g17180遺伝子を例にして、以下に、ダイオキシン類モニター用遺伝子を作製し、次いでこのダイオキシン類モニター用遺伝子を用いて植物形質転換用プラスミドベクターを作製する場合を説明する。
【００４３】
先ず、シロイヌナズナ遺伝子のデータベース（The Arabidopsis Information Resource）よりＡt1g17180遺伝子の発現調節部位に当たる完全長の１３６７塩基配列を入手する。次に、Gateway Technology対応のプライマーセットを調製し、このGateway Technologyにより上記の完全長１３６７塩基配列のＰＣＲを行う。
【００４４】
次に、図１に示す相同組換え酵素による反応（BP反応）に従って、上記のＰＣＲされたＡt1g17180遺伝子の発現調節部位の完全長配列を導入ベクター（Invitrogen社）にクローニングする。すなわち、図１において、上段に示すように、特定の相同組換え認識配列（attB）を有する遺伝子発現調節部位を含んだＤＮＡ断片と、同じく認識配列（attP）を含んだ導入ベクターを混合し、ＢＰ反応で下段に示すような遺伝子調節部位を含んだ導入クローンを得る。
【００４５】
また、図２に示す相同組換え酵素による反応（LR反応）に従って、上記ＢＰ反応で得られた特定の相同組換え認識配列（attＬ配列）を有する完全長の遺伝子発現調節部位を含んだ導入クローンと、同じく認識配列（attＲ配列）を含みなおかつ植物細胞内で機能する境界配列に囲まれた領域を持つ発現ベクター（プロモーター発現解析用ベクター：pBGWFS7）とを混合して反応させ、完全長の遺伝子発現調節部位を含んだ発現クローンを作製し、これをシロイヌナズナへの遺伝子導入用プラスミドベクターとして用いる。
【００４６】
以上のようにして得られた植物形質転換用プラスミドベクターを用いてダイオキシン類モニター用遺伝子が組み込まれた形質転換植物体を作成し、この形質転換植物体を育成してその種子を採取し、この採取した種子をダイオキシン類汚染土壌等に播種し栽培し、形質転換植物体におけるモニター用遺伝子の発現を観察することによりダイオキシン類による汚染をモニタリングする。この場合、形質転換植物体の栽培期間中継続してダイオキシン類汚染のモニタリングが可能になり、宿主として用いる植物体を選ぶことにより、数ヶ月の短期から数十年の長期に及ぶモニタリングが可能になる。
【００４７】
この目的で用いられる宿主の植物体については、特に制限されるものではなく、例えば、生育の速いシロイヌナズナ等のアブラナ科植物体を始めとして、街路樹として好適なポプラ等の落葉高木や、湖、沼等に生息するホテイアオイ等の水生植物等、ダイオキシン類汚染の観測地域や観測必要期間等を考慮して選ぶことができる。
【００４８】
このような宿主の植物体に植物形質転換用プラスミドベクターによりダイオキシン類モニター用遺伝子を導入する形質転換法についても、特に制限されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いたアグロインフェクション法、ショットガン法等により行うことができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法によれば、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができ、このスクリーニングでダイオキシン類の汚染が認められた試料についてのみＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行えばよく、ＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を大幅に低減することができるほか、気軽にダイオキシン類汚染の有無を調査することが可能になる。
【００５０】
また、本発明のダイオキシン類モニター用遺伝子及び植物形質転換用プラスミドベクターによれば、このダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入して得られた形質転換植物体を用いてダイオキシン類の汚染を容易にモニタリングすることができ、環境改善対策結果の追跡やダイオキシン類汚染の有無を経時的に観察することが容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明の実施例及び試験例に基づいて、本発明の好適な実施の形態を具体的に説明する。
【００５２】
１．ダイオキシン類暴露で発現が変動する遺伝子の検出
1.1 シロイヌナズナのダイオキシン類（PCB126）暴露
ダイオキシン類としてコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）の１つである3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニル（PCB126）を用い、また、このＰＣＢ１２６の対照化学物質として塩素化されていないビフェニル（BP）と、ＰＣＢ１２６以外のダイオキシン類として2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキサン（TCDD）と、これらＰＣＢ１２６、ビフェニル及びＴＣＤＤの溶剤であるジメチルスルホキシド（DMSO）とを用い、ＤＭＳＯ中にＰＣＢ１２６、ビフェニル、又はＴＣＤＤがそれぞれ５μg/ml濃度で溶解したPCB126標準液、BP標準液、及びTCDD標準液と、ＤＭＳＯのみのDMSO標準液とを調製した。
【００５３】
一方、ＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）寒天培地（MP Biomedicals社製）にシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の種子を播種し、２６℃１６時間明期／８時間暗期の条件で発芽させてから７日間生育させ、次いでＭＳ液体培地（MP Biomedicals社製）に移植して２日間水耕栽培し、合計栽培日数９日目の水耕栽培溶液中にPCB126終濃度、BP終濃度、又はTCDD終濃度が５ng/mlとなるように上記PCB126標準液、BP標準液、又はTCDD標準液を添加し、それぞれ４８時間又は２時間の暴露を行った。また、コントロールとして溶剤のＤＭＳＯのみのDMSO標準液を上記各標準液に代えて同量添加し、同様に４８時間又は２時間の暴露を行った。
【００５４】
1.2 ダイオキシン類（PCB126）暴露による発現変動遺伝子の検出
このようにして栽培し、各標準液（PCB126標準液、BP標準液、TCDD標準液及びDMSO標準液）に４８時間暴露又は２時間暴露をして得られたシロイヌナズナから定法によりmＲＮＡを取り出し、PCB126暴露のシロイヌナズナから得られたmＲＮＡ溶液には青色蛍光標識化合物（アマシャム ファルマシア バイオテク社製商品名：Cy3-dUTP）を添加し、また、コントロールのDMSO暴露、BP暴露、又はTCDD暴露のシロイヌナズナから得られたmＲＮＡ溶液には赤色蛍光標識化合物（アマシャム ファルマシア バイオテク社製商品名：Cy5-dUTP）をそれぞれ添加し、それぞれ逆転写酵素反応を行って対応する各Cy3-cＤＮＡとCy5-cＤＮＡを調製した。
【００５５】
各Cy3-cＤＮＡとCy5-cＤＮＡとを同量づつ混合して得られた混合物を蛍光標識ターゲットcＤＮＡとし、このターゲットcＤＮＡをシロイヌナズナの約９，０００のcＤＮＡが固定化されているcDNAマイクロアレイ（W. M. KECK FOUNDATION社製商品名：AR9.2K）にアプライし、遮光下４２℃、１６時間の条件でサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００５６】
このサザンハイブリダイゼーションの後、シロイヌナズナのcDNAマイクロアレイについて、マイクロアレイスキャナーを用いて５３２nm及び６３５nmの２つの波長でスキャニングを行い、各スポットのシグナル強度を測定してその数値化を行った。
【００５７】
PCB126暴露のシロイヌナズナ由来のmＲＮＡについては、Cy5シグナル強度(DMSOシグナル)ＳNに対するCy3シグナル強度(PCB126シグナル)ＳEのシグナル強度比（ＳE／ＳN）を算出し、このシグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）の遺伝子を発現促進遺伝子とし、また、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）の遺伝子を発現抑制遺伝子とし、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５＜ＳE／ＳN＜２．０の遺伝子を発現無応答遺伝子とした。
【００５８】
また、対照化学物質のビフェニル及びＴＣＤＤに暴露したBP暴露及びTCDD暴露のシロイヌナズナ由来のmＲＮＡについても、それぞれCy5シグナル強度(BPシグナル又はTCDDシグナル)ＳNに対するCy3シグナル強度(PCB126シグナル)ＳEのシグナル強度比（ＳE／ＳN）を算出し、それぞれこのシグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）の遺伝子と、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）の遺伝子とを調べた。
【００５９】
４８時間暴露又は２時間暴露の場合における発現変動遺伝子（発現促進遺伝子及び発現抑制遺伝子）の結果を表１（４８時間暴露）及び表２（２時間暴露）に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
上記表１及び表２に示す結果から明らかなように、PCB126の４８時間暴露により遺伝子発現が促進した発現促進遺伝子が３１個で、遺伝子発現が抑制された発現抑制遺伝子が７１個見いだされた。また、PCB126の２時間暴露により遺伝子発現が促進した発現促進遺伝子が８０個で、遺伝子発現が抑制された発現抑制遺伝子が２８１個見いだされた。
【００６３】
また、PCB126の４８時間暴露で遺伝子発現が促進した発現促進遺伝子のうち、機能既知の遺伝子は下記表３の通りであった。
【表３】
【００６４】
更に、PCB126の４８時間暴露で遺伝子発現が抑制された発現抑制遺伝子のうち、機能既知の遺伝子は下記表４の通りであった。
【表４】
【００６５】
1.3 リアルタイムＰＣＲ法によるダイオキシン類（PCB126）暴露による発現変
動遺伝子の検出
上記1.2のcDNAマイクロアレイ法による遺伝子解析は定性的に一度に多量の遺伝子解析ができるが、発現変動の定量解析には不向きであるので、上記cDNAマイクロアレイ法により見いだされたPCB126暴露により発現変動する幾つかの遺伝子について、更に発現量の正確な定量解析をリアルタイムＰＣＲ法を用いて行った。このリアルタイムＰＣＲ法は、定量目的とする遺伝子のある特定のＤＮＡ領域を挟む２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの指数関数的な増幅過程をリアルタイムに測定する方法である。
【００６６】
このリアルタイムＰＣＲ法において、プライマーの設計は、標的ＤＮＡ配列に安定してアニーリングできるようにＴm値が適切な範囲にあり、プライマー間あるいはプライマー内部に相補的な配列がなくてＰＣＲ反応効率がよく、鋳型ＤＮＡ上にミスプライミングする部位がなくて特異性が高くなるものを選択した。また、このリアルタイムＰＣＲ法による定量検出方法は、ＰＣＲ産物の２本鎖ＤＮＡに入り込んで蛍光発光する試薬であるインターカレーター（EUROGENTEC社製商品名：SYBR Green I）を用い、蛍光強度を測定することにより行った。このリアルタイムＰＣＲ法による場合においても、DMSO暴露の場合における蛍光シグナル強度(DMSOシグナル)ＳNに対するPCB126暴露における蛍光シグナル強度(PCB126シグナル)ＳEの比（ＳE／ＳN）を算出し、この遺伝子発現量の比（ＳE／ＳN）が２．０以上になったものを発現促進遺伝子とし、また、０．５以下になったものを発現抑制遺伝子とし、遺伝子発現量の比（ＳE／ＳN）が０．５＜ＳE／ＳN＜２．０の遺伝子を発現無応答遺伝子とした。
【００６７】
上記のリアルタイムＰＣＲ法による遺伝子の発現変動の検出において、２時間のPCB126暴露では発現が促進するが、４８時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない２種類の遺伝子（チトクロームP450及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）について、その結果を図３に示す。
また、反対に、４８時間のPCB126暴露では発現が促進するが、２時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない遺伝子（パーオキシダーゼ）について、その結果を図４に示す。
【００６８】
上記実施例及び試験例で示したように、ダイオキシン類暴露によりその発現が促進、あるいは、抑制されることが確認された複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子は、それらの遺伝子の塩基配列を基にＤＮＡプローブを調製して容易にダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを作製することができ、また、このようなスクリーニング用ＤＮＡアレイを用いてダイオキシン類汚染のスクリーニングを行うことができ、更に、その遺伝子発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させて調製され、ダイオキシン類暴露の際にそのレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）するダイオキシン類モニター用遺伝子や、このダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に組み込んだ形質転換植物体を作製するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターとすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法によれば、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができ、このスクリーニングでダイオキシン類の汚染が認められた試料についてのみＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行えばよく、ＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を大幅に低減することができるほか、気軽にダイオキシン類汚染の有無を調査することが可能になる。
【００７０】
また、本発明のダイオキシン類モニター用遺伝子及びこの遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターによれば、最終的にダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入して形質転換植物体を作製し、この形質転換植物体をダイオキシン類のモニタリングする必要がある地域で栽培することにより、かかる地域のダイオキシン類汚染を長期に亘って容易に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、プラスミドベクターの作製で用いたＢＰ反応を説明するための説明図である。
【００７２】
【図２】図２は、プラスミドベクターの作製で用いたＬＲ反応を説明するための説明図である。
【００７３】
【図３】図３は、２時間のPCB126暴露で発現が促進し、４８時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない２種類の遺伝子（チトクロームP450及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）の結果を示すグラフ図である。
【００７４】
【図４】図４は、４８時間のPCB126暴露で発現が促進し、２時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない遺伝子（パーオキシダーゼ）の結果を示すグラフ図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、土壌等の土圏や、湖沼、地下水等の水圏や、焼却場周辺の大気等の大気圏がダイオキシン類により汚染されているか否かをスクリーニングするために用いられるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法、並びに、ダイオキシン類により汚染されているか否かをモニターするのに好適なダイオキシン類モニター用遺伝子及びこれを用いて調製された植物形質転換用プラスミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイオキシン類には、数多くの化学構造を持つ物質があり、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類や多ハロゲン化ジベンゾフラン類を始めとして、その類縁化合物であるコプラナーＰＣＢ（coplanar polychlorobiphenyls；Co-PCBs）類等が知られている。そして、これらのダイオキシン類は、化学構造的に安定な物質であって環境中で分解され難く、また、人体に対して低濃度で強い毒性を有し、広範囲に汚染が広がるのが特徴であり、しかも、一旦このダイオキシン類で環境が汚染されるとその修復が極めて困難である。
【０００３】
このため、環境省においても、ダイオキシン類汚染対策のための幾つかの技術的指針やマニュアル等を公表しており、特に、ダイオキシン類による汚染が存在するか否か、存在するとすればどの様なダイオキシン類がどの程度の濃度で存在するか、等のダイオキシン類による汚染の実態を高い精度で把握することがダイオキシン類の汚染対策を進める上で極めて重要であることから、高濃度ダイオキシン類汚染物分解処理技術マニュアルとは別に、ダイオキシン類による汚染を測定するための測定方法や精度管理について、幾つかの技術的指針やマニュアルを公表している（環境省ホームページの「ダイオキシン類対策」URL: http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html）。
【０００４】
そして、この環境省の技術的指針やマニュアルによれば、例えば平成１２年１月公表の「ダイオキシン類に係る土壌調査測定マニュアル」には、調査地点から試料を採取して分析試料を調製する方法から、分析に用いる試薬、材料、器具等のブランク試験の方法、多くの操作を含むクリーンアップ処理の方法、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）による分析操作の方法等までが細かに説明されており、特にガスクロマトグラフ質量分析計等を用いた大型分析機器によりダイオキシン類の個別の化合物毎の定量分析を精度良く行うことが求められている。
【０００５】
しかしながら、このガスクロマトグラフ質量分析計を用いるＧＣ−ＭＳ法においては、試料中にどの様なダイオキシン類がどの程度の濃度で含まれているかを正確に測定することはできるが、広い調査領域から採取された多数の試料を同時に一括して測定することができず、しかも、測定に際しては、測定対象の試料がダイオキシン類に汚染されているか否かにかかわらず、たとえ汚染されていない試料についても汚染されている試料と同様の測定操作を必要とし、実際にはダイオキシン類汚染の調査に相当の無駄な労力と費用が嵩むという問題がある。
【０００６】
また、このようなＧＣ−ＭＳ法における問題を解決するために、ダイオキシン受容体（AhR）及びダイオキシン受容体核トランスロケーター（Arnt）を恒常的に産生又は導入し、ダイオキシン類、ダイオキシン受容体及びダイオキシン受容体核トランスロケーターを含む複合体の転写制御領域への結合を介して、レポータータンパクを産生するダイオキシン類測定用形質転換体を調製し、このダイオキシン類測定用形質転換体を用いてダイオキシン類の検出、定量分析、及びスクリーニングを行うことも提案されている（特開2004-135,662号公報）。なお、このダイオキシン類測定用形質転換体は、哺乳動物由来の特定の細胞を宿主とするものである。
【非特許文献１】環境省ホームページの「ダイオキシン類対策」URL: HYPERLINK "http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html" http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html
【特許文献１】特開2004-135,662号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、ダイオキシン類の汚染については、最終的には「どの様なダイオキシン類がどの程度の濃度で存在するか」をＧＣ−ＭＳ法により高い精度で把握することが必要であるとしても、もし採取された多数の試料について「ダイオキシン類で汚染されているか否か」を簡便な方法で容易にスクリーニングすることができれば、このスクリーニングでダイオキシン類の汚染が認められた試料についてのみＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行えばよく、このＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を大幅に低減することができるほか、気軽にダイオキシン類汚染の有無を調査することが可能になり、ダイオキシン類の汚染対策に多大な役割を果たすことになる。
【０００８】
また、例えばダイオキシン類に汚染された地域で長期に亘って環境改善対策を進めているような場合等においては、ダイオキシン類による汚染がどの程度まで改善したかを定期的にモニタリングする必要があるが、これまではこのような場合においても、定期的に試料を採取し、この採取した全ての試料についてＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行う必要があり、もし多数の試料について簡便な方法で容易にダイオキシン類の存在の有無をスクリーニングすることができれば、ＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を低減できるだけでなく、環境改善対策の結果を経時的に観察することが容易になる。
【０００９】
ところで、動物については、これまでにダイオキシン類暴露により発現応答する遺伝子の存在が多数報告されている。このことは、これらの遺伝子がダイオキシン類汚染のバイオマーカーになり得る可能性を示唆している。これに対して、植物については、ダイオキシン類暴露による遺伝子発現についてあまり検討されてこなかったが、植物は動物と異なって移動できない等の植物特有の生活様式を有していることから、長い進化の過程で植物固有の遺伝形質を獲得してきており、その中には有害化学物質のストレスを含む様々な劣悪環境ストレスに適応する遺伝形質も数多く含まれていることから、ダイオキシン類暴露に発現応答する遺伝子の存在が期待される。
【００１０】
そこで、本発明者は、一年草であって種子から開花まで１〜１．５ヶ月とその生育が早く、個体が小さくて生育し易いという特長を有し、しかも、染色体数（2n＝10）が少なくてゲノムサイズ（108塩基数）が小さく、既にゲノムの全塩基配列が決定されていて遺伝子解析がやり易いアブラナ科シロイヌナズナ属の植物、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に着目し、このシロイヌナズナの遺伝子がダイオキシン類に対してどのような発現応答をするかについて検討した結果、シロイヌナズナの遺伝子にはダイオキシン類暴露により遺伝子発現が促進されるものと、反対に抑制されるものと、更には発現応答がないものとが存在し、このシロイヌナズナの遺伝子が有するダイオキシン類暴露に対する発現応答の性質を利用してダイオキシン類汚染のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
また、本発明者は、ダイオキシン類暴露に対する発現促進や発現抑制が比較的強いシロイヌナズナの遺伝子の遺伝子発現調節部位と所定のレポーター遺伝子とを結合させて得られた遺伝子（ダイオキシン類モニター用遺伝子）がダイオキシン類に暴露されると、そのレポーター遺伝子の発現が促進あるいは抑制され、ダイオキシン類モニター用として利用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、ダイオキシン類暴露によりその発現が変動（促進又は抑制）する複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から得られたＤＮＡプローブ（cＤＮＡプローブあるいはオリゴヌクレオチドプローブ）を利用して作製され、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを提供することにある。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、ダイオキシン類暴露によりその発現が変動（促進又は抑制）する複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から調製されたＤＮＡプローブを用いて作製されたＤＮＡアレイを利用し、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができるダイオキシン類汚染のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１４】
更に、本発明の他の目的は、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させた遺伝子であり、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）することを利用し、ダイオキシン類の汚染をモニタリングすることができるダイオキシン類モニター用遺伝子、及びこのダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
すなわち、本発明は、ダイオキシン類暴露によりその発現が促進される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現促進遺伝子）及び／又はダイオキシン類暴露によりその発現が抑制される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現抑制遺伝子）から調製されたＤＮＡプローブが基板に固定化されていることを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイである。
【００１６】
また、本発明は、スクリーニング試料を含む培地でシロイヌナズナを所定期間栽培し、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出し、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製し、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイ上のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションさせ、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べ、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かを判定することを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング方法である。
【００１７】
更に、本発明は、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させた遺伝子であって、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）することを特徴とするダイオキシン類モニター用遺伝子であり、また、このようなダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターである。
【００１８】
なお、ダイオキシン類の汚染をスクリーニングし、あるいは、モニターするために本発明で用いられるシロイヌナズナの遺伝子には、ダイオキシン類に暴露されてその発現が促進される遺伝子（発現促進遺伝子）と、ダイオキシン類に暴露されてその発現が抑制される遺伝子（発現抑制遺伝子）と、ダイオキシン類に暴露されてもその発現が促進も抑制もされない遺伝子（発現無応答遺伝子）とが存在するが、本発明においては、ダイオキシン類に暴露されていないシロイヌナズナ由来のmＲＮＡより調製した蛍光標識cＤＮＡをターゲットとした蛍光シグナル強度（ＳN）に対するダイオキシン類に暴露されたシロイヌナズナ由来のmＲＮＡより調製した蛍光標識cＤＮＡをターゲットとした蛍光シグナル強度（ＳE）のシグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）の遺伝子を「発現促進遺伝子」とし、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）の遺伝子を「発現抑制遺伝子」とし、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５＜ＳE／ＳN＜２．０の遺伝子を「発現無応答遺伝子」と定義した。
【００１９】
ここで、上記発現促進遺伝子としては、具体的には、遺伝子発現の促進が顕著な（比較的強い）Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120等や、遺伝子発現の促進が比較的弱いＡt1g03220、Ａt1g62660、Ａt1g74950、Ａt2g19570、Ａt2g38860、Ａt3g11340、Ａt3g26450、Ａt4g15210、Ａt5g01470、Ａt5g13180、Ａt5g13330、Ａt5g21105、Ａt5g47060、Ａt5g58070等が挙げられる。
【００２０】
また、上記発現抑制遺伝子としては、具体的には、遺伝子発現の抑制が顕著な（比較的強い）Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710等や、遺伝子発現の抑制が比較的弱いＡt1g20020、Ａt1g21310、Ａt1g30110、Ａt1g62480、Ａt2g27710、Ａt2g33370、Ａt2g33830、Ａt2g39390、Ａt3g04920、Ａt3g05560、Ａt3g07350、Ａt3g10340、Ａt3g48100、Ａt3g48930、Ａt3g49780、Ａt3g49910、Ａt3g55980、Ａt4g14320、Ａt4g25830、Ａt5g02020、Ａt5g02870、Ａt5g03180、Ａt5g07660、Ａt5g14740、Ａt5g27770、Ａt5g60670等が挙げられる。
【００２１】
更に、上記発現無応答遺伝子としては、上記の発現促進遺伝子及び発現抑制遺伝子以外のシロイヌナズナ由来の遺伝子が挙げられる。
【００２２】
〔ダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ〕
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイは、少なくとも上記発現促進遺伝子から調製されたＤＮＡプローブ及び／又は上記発現抑制遺伝子から調製されたＤＮＡプローブの一部又は全部が基板に固定化されているものであり、そして、この基板には、これら発現促進遺伝子由来のＤＮＡプローブ及び／又は発現抑制遺伝子由来のＤＮＡプローブの一部又は全部に加えて、発現無応答遺伝子から得られたＤＮＡプローブの一部又は全部が固定化されていてもよい。
【００２３】
このスクリーニング用ＤＮＡアレイに用いる発現促進遺伝子のＤＮＡプローブとしては、好ましくは、遺伝子発現の促進が顕著であって（比較的強くて）グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)のアイソザイム遺伝子をコードするＡt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、及びＡt1g78380等や、チトクロームＰ４５０(CYP)のアイソザイム遺伝子をコードするＡt3g03470、Ａt3g26170、Ａt4g13770、及びＡt5g38970等や、パーオキシダーゼ(PO)のアイソザイム遺伝子をコードするＡt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120等や、その他のＡt2g05380、Ａt3g49220、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、及びＡt5g14920等から選ばれた一部又は全部の遺伝子から導かれたＤＮＡプローブであるのがよく、また、発現抑制遺伝子のＤＮＡプローブとしては、好ましくは、遺伝子発現の抑制が顕著な（比較的強い）Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれた一部又は全部の遺伝子から導かれたＤＮＡプローブであるのがよい。
【００２４】
また、スクリーニング用ＤＮＡアレイに用いる基板としては、典型的には透明な薄いスライドガラス状のガラス板であるが、多孔質ナイロン製基盤等の従来公知の基板も用いることができる。また、この基板上にＤＮＡプローブを固定化する方法についても、例えばガラス板状で直接ＤＮＡ合成を行い、数十merのオリゴヌクレオチドをプローブにするオリゴヌクレオチドアレイ法や、cＤＮＡクローン等をスポッターでガラス板に固定するcＤＮＡマイクロアレイ法等により、従来公知の方法を採用することができる。
【００２５】
例えば、オリゴヌクレオチドをプローブに用いるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを作製する場合について、以下に具体的に説明する。
シロイヌナズナのゲノム中にはチトクロームP450(CYP)をコードする遺伝子として約２８０、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)をコードする遺伝子として４８、パーオキシダーゼ(PO)をコードする遺伝子として７３のアイソザイム遺伝子の存在が知られており、その位置も特定されている。そこでThe Arabidopsis Information Resourceのゲノムデータベースを基にして、長さが６０mer前後でＴm（水素結合変性温度）が６８〜７０℃の条件に合うオリゴヌクレオチド配列をそれぞれの遺伝子について検索し、このオリゴヌクレオチドを合成する。
【００２６】
次に、上記チトクロームP450(CYP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)及びパーオキシダーゼ(PO)以外のタンパク質をコードする遺伝子であって、PCB126暴露により遺伝子発現が促進され、又は、抑制される遺伝子についても、その長さが６０mer前後でＴmが６８〜７０℃の条件に合うオリゴヌクレオチド配列を検索し、このオリゴヌクレオチドを合成する。
【００２７】
以上のようにして検索し合成したオリゴヌクレオチドを用い、また、ＤＮＡアレイの蛍光シグナル補正用コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素あるいはオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)の塩基配列から、それぞれオリゴヌクレオチドプローブを合成し、それらをそれぞれスライドガラス上の４箇所に固定化してダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを作製する。
【００２８】
このようにして作製されるダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイは、ダイオキシン類汚染のスクリーニング用として用いることができる。ここで、ダイオキシン類とは、ジベンゾ-p-ジオキシン、ジベンゾフラン及びビフェニルが有する２つのベンゼン環において、複数の水素原子が塩素原子や臭素原子等のハロゲン原子で置換された多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類、多ハロゲン化ジベンゾフラン類及びコプラナーＰＣＢ類の総称であり、そのうち、１分子中に４個以上のハロゲン原子が核置換した多ハロゲン化体が特に人体に対して毒性が強いとされている。
【００２９】
具体的には、多ハロゲン化ジベンゾ-p-ジオキシン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾ-p-ジオキシン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾ-p-ジオキシン等の化合物を挙げることができ、また、多ハロゲン化ジベンゾフラン類としては、例えば、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、2,3,4,7,8-ペンタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,7,8,9-ヘキサクロロジベンゾフラン、2,3,4,6,7,8-ヘキサクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8-ヘプタクロロジベンゾフラン、1,2,3,4,6,7,8,9-オクタクロロジベンゾフラン等の化合物を挙げることができ、更に、コプラナーＰＣＢ類としては、例えば、3,3',4,4'-テトラクロロビフェノール、3,4,4',5-テトラクロロビフェニール、3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェノール、2,3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2,3,3',4,4'-ペンタクロロビフェニール、2,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニール、2',3,4,4',5-ペンタクロロビフェニール、3,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェノール、2,3,3',4,4',5-ヘキサクロロビフェニール、2,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェニール、2,3,3',4,4',5,5'-ヘプタクロロビフェノール、2,2',3,3',4,4',5-ヘプタクロロビフェノール等の化合物を挙げることができる。
【００３０】
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイは、特にPCB77及びPCB81等のテトラクロロビフェニール(TeCB)、PCB105、PCB114、PCB118、PCB123及びPCB126等のペンタクロロビフェニール(PeCB)、PCB156、PCB157、PCB167及びPCB169等のヘキサクロビフェニール(HxCB)、及びPCB189等のヘプタクロロビフェニール(HpCB)等のコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）のスクリーニング用として好適に用いることができる。
【００３１】
〔ダイオキシン類汚染のスクリーニング方法〕
また、本発明は、このように複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子から調製された発現促進遺伝子由来のＤＮＡプローブ及び／又は発現抑制遺伝子由来のＤＮＡプローブが基板に固定化されたＤＮＡアレイを用いてダイオキシン類汚染のスクリーニングを行う方法であり、先ず、スクリーニング試料を含む培地で例えばオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子が導入されたシロイヌナズナを所定期間栽培し、次いで、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出し、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製し、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイ上のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションさせ、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べ、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かを判定するダイオキシン類汚染のスクリーニング方法である。
【００３２】
ここで、スクリーニング試料とは、ダイオキシン類により汚染されているか否かの調査を必要とする種々の調査対象から採取された土壌、焼却灰、地下水、排水、河川水、湖沼水等や、これらのものから溶剤抽出、固相抽出等の手段で調製されたものであり、また、このスクリーニング試料を含む培地とは、シロイヌナズナを栽培できるように調製されたシロイヌナズナ栽培用の液体及び／又は固体であって、その組成の一部又は全部として上記スクリーニング試料が添加されたものであり、場合によってはシロイヌナズナが播種される調査対象の土地等そのものであってもよい。また、上記培地を用いて行うシロイヌナズナの栽培期間は、特に制限されるものではないが、通常７日間から３０日間、好ましくは７日間から１１日間であるのがよい。
【００３３】
また、標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製するために用いられる標識化合物については、例えば、Cy3-dUTPやCy5-dUTP等の蛍光標識化合物を始め、発色標識化合物や、32Ｐ等のラジオアイソトープ標識化合物等を挙げることができ、これらはその１種のみを単独で用いることができるほか、２種以上の化合物を併用することもできる。
【００３４】
そして、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出す方法については、例えば、グアニジンチオシアネートをＲＮＡ分解酵素阻害剤として用い、高濃度塩化リチウム（LiCl）で高分子ＲＮＡを沈殿させる方法で行われ、また、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製する方法については、例えば、蛍光標識化合物としてCy3-dUTP及びCy5-dUTPを用い、マイクロアレイ用蛍光標識cＤＮＡ作成キット（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いて行われる。
【００３５】
また、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイとの間でハイブリダイゼーションさせる方法については、例えば、蛍光標識化されたCy3-cＤＮＡとCy5-cＤＮＡを同量加えたものを蛍光標識ターゲットcＤＮＡとしてcＤＮＡマイクロアレイにアプライし、遮光下４２℃、１６時間の条件でサザンハイブリダイゼーションを行う方法等が挙げられる。
【００３６】
そして、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べる方法については、例えば、サザンハイブリダイゼーション後のマイクロアレイをよく洗浄して未吸着のcＤＮＡを除去した後、マイクロアレイスキャナーを用いて５３２nm及び６３５nmの２つの波長でスキャニングし、各スポットの蛍光シグナル強度を測定して数値化し、また、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かの判定については、例えば、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）である全ての発現促進遺伝子のシグナル強度比を平均化してその数値を求め、また、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）である全ての発現抑制遺伝子のシグナル強度比を平均化してその数値を求め、これらの求められた数値から判定する。
【００３７】
〔ダイオキシン類モニター用の遺伝子とプラスミドベクター〕
更に、本発明は、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させ、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）するダイオキシン類モニター用遺伝子である。
【００３８】
ここで、ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位は、好ましくは、遺伝子発現促進が顕著な（比較的強い）遺伝子、Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120や、遺伝子発現抑制が顕著な（比較的強い）遺伝子、Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710の遺伝子発現調節部位であるのがよく、これらの遺伝子の発現調節部位は、ダイオキシン類モニター用遺伝子が組み込まれた宿主の植物体がダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現を顕著に（比較的強く）促進又は抑制し、宿主の植物体がダイオキシン類に暴露されたか否かの判定が容易になる。
【００３９】
また、これらの遺伝子発現調節部位に結合されるレポーター遺伝子としては、その遺伝子の発現変動を遺伝子発現情報として容易に測定できるものであればよく、特に制限されるものではないが、例えば緑色蛍光タンパク質遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等を挙げることができる。
【００４０】
本発明においては、上記のダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させてダイオキシン類モニター用遺伝子を作製する。
【００４１】
この遺伝子発現調節部位とレポーター遺伝子との結合は、例えば、次のような方法で行うことができる。すなわち、cDNAマイクロアレイ法及びリアルタイムPCR法で見いだされた上記のダイオキシン類暴露により発現変動（促進又は抑制）する遺伝子の中から、ダイオキシン類汚染のモニタリングに適当な遺伝子を特定する。その遺伝子の発現調節部位の塩基配列をシロイヌナズナ遺伝子のデータベース（The Arabidopsis Information Resource）から入手し、その完全長の配列をＰＣＲ法で調製する。バクテリオファージラムダと大腸菌ゲノム間の類似組み換え反応を応用した遺伝子クローニングシステム(Gateway Technology／Invitrogen)を用いて、植物中でのプロモーター発現解析用に開発されたベクター、pBGWFS7中のレポーター遺伝子の上部に完全長発現調節部位をクローニングする。pBGWFS7中にはレポーター遺伝子として、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)と大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼ遺伝子(GUS)が組み込まれている。
【００４２】
ここで、PCB126暴露及びTCDD暴露により発現促進が見られるグルタチオン-S-トランスフェラーゼの1つであるＡt1g17180遺伝子を例にして、以下に、ダイオキシン類モニター用遺伝子を作製し、次いでこのダイオキシン類モニター用遺伝子を用いて植物形質転換用プラスミドベクターを作製する場合を説明する。
【００４３】
先ず、シロイヌナズナ遺伝子のデータベース（The Arabidopsis Information Resource）よりＡt1g17180遺伝子の発現調節部位に当たる完全長の１３６７塩基配列を入手する。次に、Gateway Technology対応のプライマーセットを調製し、このGateway Technologyにより上記の完全長１３６７塩基配列のＰＣＲを行う。
【００４４】
次に、図１に示す相同組換え酵素による反応（BP反応）に従って、上記のＰＣＲされたＡt1g17180遺伝子の発現調節部位の完全長配列を導入ベクター（Invitrogen社）にクローニングする。すなわち、図１において、上段に示すように、特定の相同組換え認識配列（attB）を有する遺伝子発現調節部位を含んだＤＮＡ断片と、同じく認識配列（attP）を含んだ導入ベクターを混合し、ＢＰ反応で下段に示すような遺伝子調節部位を含んだ導入クローンを得る。
【００４５】
また、図２に示す相同組換え酵素による反応（LR反応）に従って、上記ＢＰ反応で得られた特定の相同組換え認識配列（attＬ配列）を有する完全長の遺伝子発現調節部位を含んだ導入クローンと、同じく認識配列（attＲ配列）を含みなおかつ植物細胞内で機能する境界配列に囲まれた領域を持つ発現ベクター（プロモーター発現解析用ベクター：pBGWFS7）とを混合して反応させ、完全長の遺伝子発現調節部位を含んだ発現クローンを作製し、これをシロイヌナズナへの遺伝子導入用プラスミドベクターとして用いる。
【００４６】
以上のようにして得られた植物形質転換用プラスミドベクターを用いてダイオキシン類モニター用遺伝子が組み込まれた形質転換植物体を作成し、この形質転換植物体を育成してその種子を採取し、この採取した種子をダイオキシン類汚染土壌等に播種し栽培し、形質転換植物体におけるモニター用遺伝子の発現を観察することによりダイオキシン類による汚染をモニタリングする。この場合、形質転換植物体の栽培期間中継続してダイオキシン類汚染のモニタリングが可能になり、宿主として用いる植物体を選ぶことにより、数ヶ月の短期から数十年の長期に及ぶモニタリングが可能になる。
【００４７】
この目的で用いられる宿主の植物体については、特に制限されるものではなく、例えば、生育の速いシロイヌナズナ等のアブラナ科植物体を始めとして、街路樹として好適なポプラ等の落葉高木や、湖、沼等に生息するホテイアオイ等の水生植物等、ダイオキシン類汚染の観測地域や観測必要期間等を考慮して選ぶことができる。
【００４８】
このような宿主の植物体に植物形質転換用プラスミドベクターによりダイオキシン類モニター用遺伝子を導入する形質転換法についても、特に制限されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いたアグロインフェクション法、ショットガン法等により行うことができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法によれば、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができ、このスクリーニングでダイオキシン類の汚染が認められた試料についてのみＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行えばよく、ＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を大幅に低減することができるほか、気軽にダイオキシン類汚染の有無を調査することが可能になる。
【００５０】
また、本発明のダイオキシン類モニター用遺伝子及び植物形質転換用プラスミドベクターによれば、このダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入して得られた形質転換植物体を用いてダイオキシン類の汚染を容易にモニタリングすることができ、環境改善対策結果の追跡やダイオキシン類汚染の有無を経時的に観察することが容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明の実施例及び試験例に基づいて、本発明の好適な実施の形態を具体的に説明する。
【００５２】
１．ダイオキシン類暴露で発現が変動する遺伝子の検出
1.1 シロイヌナズナのダイオキシン類（PCB126）暴露
ダイオキシン類としてコプラナーＰＣＢ（Co-PCBs）の１つである3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニル（PCB126）を用い、また、このＰＣＢ１２６の対照化学物質として塩素化されていないビフェニル（BP）と、ＰＣＢ１２６以外のダイオキシン類として2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキサン（TCDD）と、これらＰＣＢ１２６、ビフェニル及びＴＣＤＤの溶剤であるジメチルスルホキシド（DMSO）とを用い、ＤＭＳＯ中にＰＣＢ１２６、ビフェニル、又はＴＣＤＤがそれぞれ５μg/ml濃度で溶解したPCB126標準液、BP標準液、及びTCDD標準液と、ＤＭＳＯのみのDMSO標準液とを調製した。
【００５３】
一方、ＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）寒天培地（MP Biomedicals社製）にシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の種子を播種し、２６℃１６時間明期／８時間暗期の条件で発芽させてから７日間生育させ、次いでＭＳ液体培地（MP Biomedicals社製）に移植して２日間水耕栽培し、合計栽培日数９日目の水耕栽培溶液中にPCB126終濃度、BP終濃度、又はTCDD終濃度が５ng/mlとなるように上記PCB126標準液、BP標準液、又はTCDD標準液を添加し、それぞれ４８時間又は２時間の暴露を行った。また、コントロールとして溶剤のＤＭＳＯのみのDMSO標準液を上記各標準液に代えて同量添加し、同様に４８時間又は２時間の暴露を行った。
【００５４】
1.2 ダイオキシン類（PCB126）暴露による発現変動遺伝子の検出
このようにして栽培し、各標準液（PCB126標準液、BP標準液、TCDD標準液及びDMSO標準液）に４８時間暴露又は２時間暴露をして得られたシロイヌナズナから定法によりmＲＮＡを取り出し、PCB126暴露のシロイヌナズナから得られたmＲＮＡ溶液には青色蛍光標識化合物（アマシャム ファルマシア バイオテク社製商品名：Cy3-dUTP）を添加し、また、コントロールのDMSO暴露、BP暴露、又はTCDD暴露のシロイヌナズナから得られたmＲＮＡ溶液には赤色蛍光標識化合物（アマシャム ファルマシア バイオテク社製商品名：Cy5-dUTP）をそれぞれ添加し、それぞれ逆転写酵素反応を行って対応する各Cy3-cＤＮＡとCy5-cＤＮＡを調製した。
【００５５】
各Cy3-cＤＮＡとCy5-cＤＮＡとを同量づつ混合して得られた混合物を蛍光標識ターゲットcＤＮＡとし、このターゲットcＤＮＡをシロイヌナズナの約９，０００のcＤＮＡが固定化されているcDNAマイクロアレイ（W. M. KECK FOUNDATION社製商品名：AR9.2K）にアプライし、遮光下４２℃、１６時間の条件でサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００５６】
このサザンハイブリダイゼーションの後、シロイヌナズナのcDNAマイクロアレイについて、マイクロアレイスキャナーを用いて５３２nm及び６３５nmの２つの波長でスキャニングを行い、各スポットのシグナル強度を測定してその数値化を行った。
【００５７】
PCB126暴露のシロイヌナズナ由来のmＲＮＡについては、Cy5シグナル強度(DMSOシグナル)ＳNに対するCy3シグナル強度(PCB126シグナル)ＳEのシグナル強度比（ＳE／ＳN）を算出し、このシグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）の遺伝子を発現促進遺伝子とし、また、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）の遺伝子を発現抑制遺伝子とし、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５＜ＳE／ＳN＜２．０の遺伝子を発現無応答遺伝子とした。
【００５８】
また、対照化学物質のビフェニル及びＴＣＤＤに暴露したBP暴露及びTCDD暴露のシロイヌナズナ由来のmＲＮＡについても、それぞれCy5シグナル強度(BPシグナル又はTCDDシグナル)ＳNに対するCy3シグナル強度(PCB126シグナル)ＳEのシグナル強度比（ＳE／ＳN）を算出し、それぞれこのシグナル強度比（ＳE／ＳN）が２．０以上（ＳE／ＳN≧２．０）の遺伝子と、シグナル強度比（ＳE／ＳN）が０．５以下（ＳE／ＳN≦０．５）の遺伝子とを調べた。
【００５９】
４８時間暴露又は２時間暴露の場合における発現変動遺伝子（発現促進遺伝子及び発現抑制遺伝子）の結果を表１（４８時間暴露）及び表２（２時間暴露）に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
上記表１及び表２に示す結果から明らかなように、PCB126の４８時間暴露により遺伝子発現が促進した発現促進遺伝子が３１個で、遺伝子発現が抑制された発現抑制遺伝子が７１個見いだされた。また、PCB126の２時間暴露により遺伝子発現が促進した発現促進遺伝子が８０個で、遺伝子発現が抑制された発現抑制遺伝子が２８１個見いだされた。
【００６３】
また、PCB126の４８時間暴露で遺伝子発現が促進した発現促進遺伝子のうち、機能既知の遺伝子は下記表３の通りであった。
【表３】
【００６４】
更に、PCB126の４８時間暴露で遺伝子発現が抑制された発現抑制遺伝子のうち、機能既知の遺伝子は下記表４の通りであった。
【表４】
【００６５】
1.3 リアルタイムＰＣＲ法によるダイオキシン類（PCB126）暴露による発現変
動遺伝子の検出
上記1.2のcDNAマイクロアレイ法による遺伝子解析は定性的に一度に多量の遺伝子解析ができるが、発現変動の定量解析には不向きであるので、上記cDNAマイクロアレイ法により見いだされたPCB126暴露により発現変動する幾つかの遺伝子について、更に発現量の正確な定量解析をリアルタイムＰＣＲ法を用いて行った。このリアルタイムＰＣＲ法は、定量目的とする遺伝子のある特定のＤＮＡ領域を挟む２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの指数関数的な増幅過程をリアルタイムに測定する方法である。
【００６６】
このリアルタイムＰＣＲ法において、プライマーの設計は、標的ＤＮＡ配列に安定してアニーリングできるようにＴm値が適切な範囲にあり、プライマー間あるいはプライマー内部に相補的な配列がなくてＰＣＲ反応効率がよく、鋳型ＤＮＡ上にミスプライミングする部位がなくて特異性が高くなるものを選択した。また、このリアルタイムＰＣＲ法による定量検出方法は、ＰＣＲ産物の２本鎖ＤＮＡに入り込んで蛍光発光する試薬であるインターカレーター（EUROGENTEC社製商品名：SYBR Green I）を用い、蛍光強度を測定することにより行った。このリアルタイムＰＣＲ法による場合においても、DMSO暴露の場合における蛍光シグナル強度(DMSOシグナル)ＳNに対するPCB126暴露における蛍光シグナル強度(PCB126シグナル)ＳEの比（ＳE／ＳN）を算出し、この遺伝子発現量の比（ＳE／ＳN）が２．０以上になったものを発現促進遺伝子とし、また、０．５以下になったものを発現抑制遺伝子とし、遺伝子発現量の比（ＳE／ＳN）が０．５＜ＳE／ＳN＜２．０の遺伝子を発現無応答遺伝子とした。
【００６７】
上記のリアルタイムＰＣＲ法による遺伝子の発現変動の検出において、２時間のPCB126暴露では発現が促進するが、４８時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない２種類の遺伝子（チトクロームP450及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）について、その結果を図３に示す。
また、反対に、４８時間のPCB126暴露では発現が促進するが、２時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない遺伝子（パーオキシダーゼ）について、その結果を図４に示す。
【００６８】
上記実施例及び試験例で示したように、ダイオキシン類暴露によりその発現が促進、あるいは、抑制されることが確認された複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子は、それらの遺伝子の塩基配列を基にＤＮＡプローブを調製して容易にダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイを作製することができ、また、このようなスクリーニング用ＤＮＡアレイを用いてダイオキシン類汚染のスクリーニングを行うことができ、更に、その遺伝子発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させて調製され、ダイオキシン類暴露の際にそのレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）するダイオキシン類モニター用遺伝子や、このダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に組み込んだ形質転換植物体を作製するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターとすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ及びスクリーニング方法によれば、多数の試料について簡便な方法で容易に「ダイオキシン類で汚染されているか否か」のスクリーニングを行うことができ、このスクリーニングでダイオキシン類の汚染が認められた試料についてのみＧＣ−ＭＳ法による定量分析を行えばよく、ＧＣ−ＭＳ法による定量分析の負荷を大幅に低減することができるほか、気軽にダイオキシン類汚染の有無を調査することが可能になる。
【００７０】
また、本発明のダイオキシン類モニター用遺伝子及びこの遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクターによれば、最終的にダイオキシン類モニター用遺伝子を宿主の植物体に導入して形質転換植物体を作製し、この形質転換植物体をダイオキシン類のモニタリングする必要がある地域で栽培することにより、かかる地域のダイオキシン類汚染を長期に亘って容易に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、プラスミドベクターの作製で用いたＢＰ反応を説明するための説明図である。
【００７２】
【図２】図２は、プラスミドベクターの作製で用いたＬＲ反応を説明するための説明図である。
【００７３】
【図３】図３は、２時間のPCB126暴露で発現が促進し、４８時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない２種類の遺伝子（チトクロームP450及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）の結果を示すグラフ図である。
【００７４】
【図４】図４は、４８時間のPCB126暴露で発現が促進し、２時間のPCB126暴露では発現の変動が見られない遺伝子（パーオキシダーゼ）の結果を示すグラフ図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン類暴露によりその発現が促進される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現促進遺伝子）及び／又はダイオキシン類暴露によりその発現が抑制される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現抑制遺伝子）から調製されたＤＮＡプローブが基板に固定化されていることを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ。
【請求項２】
シロイヌナズナ由来の発現促進遺伝子が、Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項１に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ。
【請求項３】
シロイヌナズナ由来の発現抑制遺伝子が、Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項１に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ。
【請求項４】
スクリーニング試料を含む培地でシロイヌナズナを所定期間栽培し、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出し、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製し、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイ上のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションさせ、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べ、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かを判定することを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項５】
ダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイは、その基板に少なくともダイオキシン類暴露によりその発現が促進される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現促進遺伝子）及び／又はダイオキシン類暴露によりその発現が抑制される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現抑制遺伝子）から調製されたＤＮＡプローブが固定化されている請求項４に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項６】
シロイヌナズナ由来の発現促進遺伝子が、Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項５に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項７】
シロイヌナズナ由来の発現抑制遺伝子が、Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項５又は６に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項８】
標識化合物が、蛍光標識化合物、発色標識化合物、及びラジオアイソトープ標識化合物から選ばれた１種又は２種以上の化合物である請求項４〜７のいずれかに記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項９】
ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させた遺伝子であって、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）することを特徴とするダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１０】
遺伝子の発現調節部位が、ダイオキシン類暴露によりその発現が促進されるＡt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子の遺伝子発現調節部位である請求項９に記載のダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１１】
遺伝子発現調節部位が、ダイオキシン類暴露によりその発現が抑制されるＡt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子の遺伝子発現調節部位である請求項９に記載のダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、及び抗生物質耐性遺伝子から選ばれた遺伝子である請求項９〜１１のいずれかに記載のダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかに記載のダイオキシン類モニター用遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクター。
【請求項１】
ダイオキシン類暴露によりその発現が促進される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現促進遺伝子）及び／又はダイオキシン類暴露によりその発現が抑制される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現抑制遺伝子）から調製されたＤＮＡプローブが基板に固定化されていることを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ。
【請求項２】
シロイヌナズナ由来の発現促進遺伝子が、Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項１に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ。
【請求項３】
シロイヌナズナ由来の発現抑制遺伝子が、Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項１に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング用ＤＮＡアレイ。
【請求項４】
スクリーニング試料を含む培地でシロイヌナズナを所定期間栽培し、栽培したシロイヌナズナからmＲＮＡを取り出し、この取り出されたmＲＮＡから標識化合物で標識されたcＤＮＡからなる逆転写ターゲットを調製し、得られた逆転写ターゲットをダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイ上のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションさせ、上記逆転写ターゲットの標識強度を測定してどの遺伝子の発現が促進及び／又は抑制されたかの遺伝子発現情報を調べ、この遺伝子発現情報に基づいて上記スクリーニング試料がダイオキシン類を含むか否かを判定することを特徴とするダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項５】
ダイオキシン類汚染スクリーニング用のＤＮＡアレイは、その基板に少なくともダイオキシン類暴露によりその発現が促進される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現促進遺伝子）及び／又はダイオキシン類暴露によりその発現が抑制される複数のシロイヌナズナ由来の遺伝子（発現抑制遺伝子）から調製されたＤＮＡプローブが固定化されている請求項４に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項６】
シロイヌナズナ由来の発現促進遺伝子が、Ａt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項５に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項７】
シロイヌナズナ由来の発現抑制遺伝子が、Ａt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子である請求項５又は６に記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項８】
標識化合物が、蛍光標識化合物、発色標識化合物、及びラジオアイソトープ標識化合物から選ばれた１種又は２種以上の化合物である請求項４〜７のいずれかに記載のダイオキシン類汚染のスクリーニング方法。
【請求項９】
ダイオキシン類に暴露された際にその発現が変動（促進又は抑制）するシロイヌナズナ由来の遺伝子の発現調節部位とレポーター遺伝子とを結合させた遺伝子であって、ダイオキシン類に暴露された際にレポーター遺伝子の発現が変動（促進又は抑制）することを特徴とするダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１０】
遺伝子の発現調節部位が、ダイオキシン類暴露によりその発現が促進されるＡt1g10370、Ａt1g17180、Ａt1g59700、Ａt1g78340、Ａt1g78360、Ａt1g78380、Ａt2g05380、Ａt3g03470、Ａt3g26170、Ａt3g49220、Ａt4g13770、Ａt4g23680、Ａt4g34710、Ａt4g34870、Ａt5g14920、Ａt5g38970、Ａt5g39580、Ａt5g51890、Ａt5g64100、Ａt5g64110、及びＡt5g64120から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子の遺伝子発現調節部位である請求項９に記載のダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１１】
遺伝子発現調節部位が、ダイオキシン類暴露によりその発現が抑制されるＡt1g30720、Ａt2g34420、Ａt2g34430、Ａt2g40000、Ａt2g45990、Ａt3g07180、Ａt3g26510、Ａt3g59940、及びＡt5g36710から選ばれたいずれか１つ又は２つ以上の遺伝子の遺伝子発現調節部位である請求項９に記載のダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１２】
レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、及び抗生物質耐性遺伝子から選ばれた遺伝子である請求項９〜１１のいずれかに記載のダイオキシン類モニター用遺伝子。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかに記載のダイオキシン類モニター用遺伝子が組み込まれており、当該遺伝子を宿主の植物体に導入するために用いられる植物形質転換用プラスミドベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−４３９５０（Ｐ２００７−４３９５０Ａ）
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３１５５１（Ｐ２００５−２３１５５１）
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（５０２３４１５４６）学校法人麻布獣医学園 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（５０２３４１５４６）学校法人麻布獣医学園 (17)
【Ｆターム（参考）】
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