ダイコンソウの有機抽出物およびその利用
【課題】損傷骨格筋の線維性組織の形成を抑制しながら、重度の損傷骨格筋線維の完全な治癒を引き起こすことが可能な薬剤を提供する
【解決手段】外傷性骨格筋において急速な血管形成（２４時間未満）、筋線維形成、および線維性組織形成阻害に対して強力な刺激効果を示す、漢方薬のダイコンソウ（Ｇｅｕｍ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ Ｖａｒ．）の有機抽出物を同定した。該抽出物はウサギおよびラットの動物モデルにおいて骨格筋の完全な治癒につながる、損傷した骨格筋での血管形成および筋線維形成に対して強力な二重効果を示した。本発明の抽出物は、骨格筋外傷、熱傷、皮膚創傷および手術時の傷口を含む軟組織の治療、および骨折や骨欠損の治療に効果的な治療薬に発展させることができる。
【解決手段】外傷性骨格筋において急速な血管形成（２４時間未満）、筋線維形成、および線維性組織形成阻害に対して強力な刺激効果を示す、漢方薬のダイコンソウ（Ｇｅｕｍ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ Ｖａｒ．）の有機抽出物を同定した。該抽出物はウサギおよびラットの動物モデルにおいて骨格筋の完全な治癒につながる、損傷した骨格筋での血管形成および筋線維形成に対して強力な二重効果を示した。本発明の抽出物は、骨格筋外傷、熱傷、皮膚創傷および手術時の傷口を含む軟組織の治療、および骨折や骨欠損の治療に効果的な治療薬に発展させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は漢方薬に関するものである。特に、本発明はダイコンソウ（Ｇｅｕｍ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ Ｖａｒｉａｎｔ）の有機抽出物（以下「ＥＧＪＶ」）、および、損傷した骨格筋と皮膚を含む軟組織とにおいて、血管新生、骨格筋再生および線維性組織形成阻害を刺激するための有機抽出物の利用に関するものである。また本発明はＥＧＪＶの有機抽出物を製造する方法、および、骨格筋損傷あるいは皮膚損傷の治療、手術時の傷口の治癒の促進、あるいは皮膚治療や形成外科における瘢痕形成の軽減のための方法にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ダイコンソウは、Ｇ. ボリシイ、Ｇ. キロエンセ、Ｇ. コッシキネウム、Ｇ. マクロフィルム、Ｇ. モンタヌム、Ｇ. レプタンス、Ｇ. リバレ、Ｇ. トリフロルム、Ｇ. ウルバヌム、およびダイコンソウ（Ｇ. ジャポニクム）などの６５種の根茎草本および亜低木の属であり、単純葉または羽状複葉、および標準的な花を有する。ダイコンソウは多年生草でバラ科の顕花植物である。ダイコンソウの植物全体の水抽出物は漢方では利尿薬として用いられてきた（Ｐｅｒｒｙ、Ｌ．Ｍ．、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｅａｓｔ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａ、ＭＩＴ出版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ、ｐｐ．２４２、１９８０年）。
【０００３】
重度の損傷後の骨格筋の治癒は遅くかつ不十分である。損傷した骨格筋の再生能力の限界、および外傷部位における急速な線維性瘢痕組織の形成は大きな臨床治療の問題である。重度の外傷性骨格筋の共通運命は線維症となる。現在まで、重度の損傷後の完全な骨格筋の治癒を促進することができる効果的な治療上の処置は見つかっていない。
【０００４】
上述のように、重度の損傷後の筋肉治癒は遅く、そして不完全であり、その結果として線維性組織に置換されてしまう（Ｇｒｏｕｎｄｓ、Ｍ．Ｄ．Ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２、５３５−５４３（１９９９年）；Ｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．１５、９−１４（１９８７年））。現在のところ、重度の筋肉損傷後に顕著な骨格筋の再生を促進するのに用いることができる効果的な治療法はない。我々の以前の研究（Ｌｉ、Ｍ．ら、Ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ‐ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１、２８９−２９２（２０００年）；Ｌｉ、Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８４、２６３−２６８（２０００年））にあるように、動物モデルにおいて、筋線維の再生と同様に培養サテライト細胞の増殖および分化をも増進しうる筋線維形成因子を同定した。しかしながら、これらの筋線維形成因子は筋肉治癒を高めることはできたが、重度の筋肉損傷後の完全な治癒は生じなかった。
【０００５】
線維性組織は、比較的に虚血性の環境で生育が可能であるが、しかし、通常組織の細胞は生育が困難である。骨格筋が損傷した際、血管系もしばしば損傷を受け、そのため損傷部位周辺の血液の供給が不十分になる。通常、線維性組織はより早く生育し、損傷した筋線維が占めていたスペースを占めるため、新しい筋線維の置換のためのスペースをブロックすることになる。以前の研究によると、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、あるいはＰＤＧＦのようないくつかの成長因子は血管新生を増進しうるが、しかし、これらの成長因子に仲介されるこの血管新生にはおよそ２〜９週間を要する可能性がある。重度の骨格筋損傷の完全な治癒をもたらす、特に数時間のうちに新血管形成を引き起こすことが可能な製品は世界市場で入手することができない。現在まで、重度の損傷骨格筋に完全な治癒をもたらすことが可能な記録された薬品あるいは要素は、市場あるいは研究においてさえも存在しない。
【０００６】
（発明の概要）本発明の主な目的は、損傷骨格筋の線維性組織の形成を抑制しながら、重度の損傷骨格筋線維の完全な治癒を引き起こすことが可能な薬剤を提供することである。本目的を達するために、本発明者は入念な調査を遂行した。その結果、自然源からの有機抽出物（ダイコンソウの全体）が迅速な血管新生および筋線維形成に二重の効果を示すことを発見した。これらの二重効果は骨格筋損傷の治療、皮膚治癒、手術の傷口の治癒、熱傷および潰瘍のような他の軟組織の治療、および骨折治癒や骨欠損修復のような硬組織の治療に用いることが可能である。
【０００７】
本発明の目的の一つはＥＧＪＶを提供することである。「ＥＧＪＶ」はゲミン（ｇｅｍｉｎ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むタンニン、および、２−ヒドロキシオレアノール酸（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｏｌｅａｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、２−ヒドロキシウルソル酸（２−Ｈｕｄｒｏｘｙｌｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、２，１９−ジヒドロキシ−ウルソル酸（２，１９−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸（２−ａｌｐｈａ、１９−ａｌｐｈａ−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ Ａｃｉｄ）、ウルソル酸（Ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、エピモリック酸（Ｅｐｉｍｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、マスリニック酸（Ｍａｓｌｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、エウスカフィク酸（Ｅｕｓｃａｐｈｉｃ Ａｃｉｄ）、トルメンティク酸（Ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ Ａｃｉｄ）、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシド（２８−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｏｆ ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ Ａｃｉｄ）などを含むトリテルペンを主に含有する。
【０００８】
本発明の他の目的は、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療のための薬剤の製造において「ＥＧＪＶ」の利用を提供することである。このＥＧＪＶは製薬的に可能な添加剤と組み合わせて、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療のための様々な種類の薬剤に調剤することが可能である。
【０００９】
本発明の他の目的は、骨格筋損傷あるいは皮膚損傷を患う哺乳動物への有効量の「ＥＧＪＶ」の投与を含む、骨格筋損傷あるいは皮膚損傷の治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、Ｃ１〜Ｃ４アルコールを用いた植物ダイコンソウの抽出物を抽出するステップを含む、「ＥＧＪＶ」の製造方法を提供することである。
（発明の詳細な説明）本発明は以下の４つの態様を呈する：
第一の態様はＥＧＪＶ製造の方法に関する。
【００１１】
１．ダイコンソウからの有機抽出物を製造するための方法を提供する。本方法はａ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群より選択されたアルコールによる植物ダイコンソウの抽出物を抽出するステップを含む。ステップａ）は室温にて３〜６回、好ましくは５回、繰り返される。ステップａ）を行う前に、ダイコンソウ植物を粉末にしておくことが好ましい。Ｃ１〜Ｃ４アルコールはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびテルブタノールを含む。より好ましいアルコールはメタノールおよびエタノールである。そして最も好ましいのはメタノールである。アルコールで抽出されるダイコンソウに対してのアルコールの総量についての明確な制限はない。しかしながら経済的な観点から言えば、使用されるアルコールの総量は抽出されるダイコンソウの総量の１〜１０倍重量であることが好ましい。
【００１２】
２．上記項目１で記載されたような方法は、さらに、ｂ）ステップａ）から得られた抽出物を乾燥して乾燥粉末にするステップと、ｃ）Ｃ６アルカン、酢酸エチルおよびＣ１〜Ｃ４アルコールから成る群より選択されたアルコールを用いて、ステップｂ）より得られた粉末から連続的に抽出するステップとを含むことができる。Ｃ６アルカンは、例えばシクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、およびネオへキサン等を含む６炭素原子のサイクリックおよび非サイクリックなアルカンを含む。Ｃ１〜Ｃ４アルコールはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびテルブタノールを含む。ステップｃ）においてより好ましいアルコールは、ｎ−プロパノールおよびｎ−ブタノールである。さらに、最も好ましいのはｎ−ブタノールである。前の乾燥するステップで得られた乾燥粉末に対するＣ６アルカン、酢酸エチルおよびアルコールの総量に関して厳密な制限はない。しかしながら、経済的観点から言えば、用いられる有機溶媒の総量はさらに抽出される粉末量に対し、１〜１０倍重量であることが好ましい。
【００１３】
３．ＥＧＪＶをより適用しやすくするために、上記項目２で記載された方法は、ｄ）ステップｃ）で得られた抽出物を乾燥粉末へと乾燥するステップを有さらに含んでいる。乾燥ステップｄ）を行う前に、前のステップｃ）で得られた抽出物をその中のどんな不溶性粉末も除去するためにろ過することが好ましい。乾燥ステップｄ）は例えば、５０℃の室温より高い温度で減圧下において達成できる。
【００１４】
４．ＥＧＪＶをより精製するために、上記項目３で記載されたような方法は好ましくはさらにｅ）ステップｄ）で得られた粉末のクロマトグラフ・カラムに充填し、そしてｆ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されるアルコールを水溶液におけてその濃度を上げることでカラムを溶出するステップを含む。ステップｅ）においてクロマトグラフ・カラムに制約はない。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘあるいは逆行性フェーズカラムを用いることができる。ステップｆ）において用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびテルブタノールから成る群より選択されるいずれかであり、メタノールが最も好ましい。
【００１５】
本発明の二つ目の態様は、上記項目１〜４に記載のいずれかの方法で得られるダイコンソウの有機抽出物に関する。ＮＭＲ分析により、本発明のＥＧＪＶはゲミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むタンニン、および、２−ヒドロキシオレアノール酸、２−ヒドロキシウルソル酸、２，１９−ジヒドロキシ−ウルソル酸、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸、ウルソル酸、エピモリック酸、マスリニック酸、エウスカフィク酸、トルメンティク酸、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシドなどを含むトリテルペンを主に含有する。
【００１６】
本発明の第三の態様は、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療のための薬剤の製造におけるダイコンソウの有機抽出物の利用に関する。ＥＧＪＶは血管新生および筋線維形成を増進するための薬剤に用いることが可能である。ＥＧＪＶに加えて、薬剤にはＥＧＪＶと混合可能な他の薬剤も含むことができる。前記他の薬剤には抗生物質、ビタミン、サイトカイン、および骨誘導タンパク質等が含まれるが、それに限ったものではない。製薬的に可能な添加物とともにＥＧＪＶは粉末、溶液、懸濁液、クリーム、あるいはペーストなどを含む様々な形態に調剤が可能であるがそれに限ったものではない。これら様々な形態の薬剤を製造するための添加物および方法は当分野の技術者に周知である。
【００１７】
本発明の第四の態様は、骨格筋損傷、皮膚損傷、手術時の傷口あるいは骨折を患う哺乳動物への、ダイコンソウからの有機抽出物の有効量の投与を含む、骨格筋損傷、皮膚損傷あるいは骨折の治療の方法に関する。「有効量」という言葉は、細胞培養システムあるいは動物モデルシステムにおいて血管新生及び筋線維形成を効果的に増進することが可能な量のことである。この「有効量」は治療をうける動物の種、投与されるＥＧＪＶの濃度、および筋肉あるいは皮膚の重傷度を含むいくつかの要素によって決まる。この「有効量」を決定する方法は当分野の技術者に周知である。ここで用いられる「投与」という言葉は薬剤を届けるためのいずれの標準的な手段も意味する。投与の手段は当分野で周知であり、静脈注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮内投与、あるいは経皮投与等を含むが、これに限ったものではない。「動物」という言葉は好ましくはラット、ハツカネズミ、ネコ、イヌ、ウマおよびヒツジ等を含む哺乳動物をさす。より好ましくは、この言葉は人間をさす。
【００１８】
（例）以下の例を参照して本発明を下記でより詳細に説明する。しかしながら、本発明の範囲はこれらの例に限られるものではない。
【００１９】
（例１）「ＥＧＪＶ」の製造
ダイコンソウは中国の貴州省から採取した。乾燥植物（１キログラム）を粉末にし、室温で２〜３時間かけメタノール（８リットル）でろ過し、これを５回繰り返した。そして抽出物を減圧下で乾燥させ、約５０グラムの残留物を産出する。乾燥粉末（５０グラム）を１２０ミリリットルの水に懸濁し、続けてヘキサン（５ｘ２５０ミリリットル）、エタノール（５ｘ２５０ミリリットル）およびｎ−ブタノール（５ｘ２５０ミリリットル）で分離する。ｎ−ブタノール溶解画分をろ過し、減圧下（５０℃）で濃縮し粉末状の残留物を産出した。粉末状残留物を１０％メタノールで平衡を保ったＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０のカラムに充填し、水中のメタノールの濃度上昇により溶出した。ＮＭＲ分析により、ゲミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦのようなタンニン、及び、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸、ウルソル酸、エピモリック酸、マスリニック酸、エウスカフィク酸、トルメンティク酸、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシドなどを含むトリテルペンを主に含有する、１２の画分が溶出された。これらの１２のメタノール溶出画分を混合し、例２および３においてＥＧＪＶとして用いた。
【００２０】
漢方薬である血管新生および筋線維形成薬剤のスクリーニングの過程で、本発明の発明者はｎ−ブタノール可溶性画分も後のメタノール溶出画分と同様に、重度の損傷骨格筋での新しい血管および筋肉の再生の初期成長（２４時間以内）の刺激において強力な二重効果を示すことを発見した。特に記載がない限り、以下で用いられる「ＥＧＪＶ」という言葉はメタノール溶出画分をさす。
【００２１】
（例２）ウサギ筋肉損傷モデルにおける活性画分の二重効果の評価
ここで、本発明者は「ＥＧＪＶ」の効果を分析した。実験結果では、コントロールにおける線維性瘢痕組織と比較すると、ＥＧＪＶは重度の損傷骨格筋の治癒過程において、損傷箇所での再生筋線維の存在を伴う顕著な効果があることを驚くほど示した。ＥＧＪＶは損傷筋肉の治癒過程の初期における筋線維形成および血管新生の両方の刺激、および骨格筋治癒および皮膚損創傷の治癒の両方における線維性瘢痕形成の阻害に対して、非常に有益な効果があると思われる。
【００２２】
ＥＧＪＶは重度の筋肉損傷ウサギ動物モデル（メス、Ｎ＝１２、平均体重：２．５キログラム）に用いた。ウサギは前脛骨筋に手術用ハサミでの切断による損傷から生じる筋肉損傷を受けた。６匹のウサギには筋損傷の直後に前脛骨筋の表皮下に５％ＤＭＳＯに溶解したＥＧＪＶを１ミリリットル注射した。他の６匹のウサギにはコントロールとして同じ容量の５％ＤＭＳＯを注射した。注射は一度だけ行った。各グループの２匹のウサギを損傷の２日後に犠牲にした。前脛骨筋を取り出し、パラフィン切片およびＨＥ（つまりヘマトキシリンおよびエオジン）染色用に加工した。各グループの別の２匹のウサギを損傷の１週間後に犠牲にし、残りの各グループの２匹は損傷の２週間後に犠牲にした。異なる時点で犠牲にしたウサギは全て、以下の同じ方法で処理した。
【００２３】
図１Ｅに見られるように、５％ＤＭＳＯを一回注射した前脛骨筋の切断損傷の１日後では、損傷箇所の領域は炎症細胞の浸潤はほとんど見られないまま依然として乾燥しておらず、新しく形成された血管および再生筋管も見られない。一方で、１日目のＥＧＪＶ処理群では、創傷箇所は多数の炎症細胞で満たされており、新しく再生した薄い筋管をわずかに伴った新しく形成された血管が創傷箇所にいくらか見られた（図１Ｂ）。筋肉損傷の２日後には創傷箇所で多くの新しく形成された血管が見られ、新しい再生筋管もまた形成されていた（図１Ｃ）。対照的に、ＤＭＳＯのコントロール群では創傷箇所は未だ乾燥せず、炎症細胞の浸潤もほとんど見られなかった（図１Ｅ）。このコントロール群では新しく形成された血管も新しい再生筋管も見られなかった（図１Ｅ）。１８日目のＥＧＪＶ処理群では、創傷の隙間に新しく再生し比較的に成熟した多数の筋管（中心核を備えた通常の筋線維よりもわずかに小さい）が観察された（図１Ｄ）。一方、コントロールでは創傷の隙間は線維性組織で満たされていた（図１Ｆ）。
【００２４】
（例３）
ラットの筋肉損傷モデルにおける活性画分の二重効果の評価
ラットの骨格筋損傷モデルでＥＧＪＶをさらに調べた。実験結果は重度の損傷筋肉の創傷箇所においてＥＧＪＶが血管再生（２４時間以内の）およびサテライト細胞の増殖を顕著に刺激しうることを示した。ＥＧＪＶで処理された動物の損傷箇所は、コントロールの動物においては筋線維形成が主な特徴であるのとは著しく対照的に、損傷の２週間以内に新しい再生筋線維で完全に置き換えられた。
【００２５】
実験のラット（ＳＤラット、メス、Ｎ＝４０、平均体重：１５０グラム）は前脛骨筋に手術用ハサミでの切断による損傷から生じる筋肉損傷を受けた。２０匹のラットは前脛骨筋の皮下に５％ＤＭＳＯに溶かしたＥＧＪＶを筋損傷の直後に０．１ミリリットル注射した。他の２０匹のラットにはコントロールとして同量の５％ＤＭＳＯを注射した。注射は一度だけ行った。各グループから４匹のラットを損傷のそれぞれ１、２および３日後に犠牲にした。前脛骨筋を取り出し、パラフィン切片およびＨＥ染色用に加工した。各グループからの別の４匹のラットを損傷の７日後に犠牲にし、残りの各グループの４匹のラットは損傷の１４日後に犠牲にした。異なる時点で犠牲にしたラットは全て、以下の同じ方法で処理した。
【００２６】
損傷の１日後に調べた際、コントロールのラットの前脛骨筋における創傷箇所は、多数の炎症細胞で満たされており、２日目にはさらに多くの炎症細胞が浸潤していた（図２ａ）。また、新しく形成された血管も非常にわずかに観察された。対照的に、ＥＧＪＶ処理したラットにおける損傷箇所では、１日目には多数の新しく形成された血管（図２ｂ）が、そして２日目には新しく再生した長くて薄い筋管を伴ったより多くの血管（筋管の中央に核を伴う）（図２ｃ）がはっきりと認められた。ＥＧＪＶ処理した群の３日目においては、創傷箇所で、多数のより新しい再生筋管の一団が損傷した筋線維に置き換わっているのが観察された（図２ｄ）。
【００２７】
７日目には、コントロールの動物の創傷箇所は炎症細胞および置換した線維性組織で満たされていた（図３ａ）。極めて対照的に、ＥＧＪＶ処理した動物の創傷箇所では新しく発達した高度に整列した筋管が多数見られた（図３ｂ〜３ｃ）。新しい再生筋管に沿って、増殖したサタライト細胞もまた検出された（図３ｄ）。線維性組織形成の顕著な徴候も見られなかった。
【００２８】
１４日目には、コントロール動物の創傷箇所は線維性組織形成によって治癒した。筋肉損傷の隙間は図４ａに示すように収縮していた。しかしながら、ＥＧＪＶ処理したラットでは、線維性組織形成の徴候はなく、高度に整列した新しい再生筋線維が創傷箇所を埋めていた（図４ｂおよび４ｃ）。実験動物の筋肉になされた切断の輪郭は依然として既存の筋線維および新しく再生した筋線維の間で異なって筋線維を染色することにより認められた。これはおそらくは二つの異なる時期の筋線維の間のタンパク質の内容の違いによるものである。
【００２９】
まとめると、我々の実験結果は、骨格筋の創傷箇所でＥＧＪＶの一回局注により引き起こされた活発な新血管形成が見られ、損傷の２４時間以内に注射箇所周辺に血液細胞で満たされた多数の新しい毛細血管の芽が形成された。筋肉損傷の２日後の創傷箇所では、多数の新しく形成された血管に加えて、散乱した新しい再生筋線維（長くて薄い）もまた多く観察された。対照的にコントロールにおいては多数の炎症細胞が浸潤していた。７日目では損傷した筋肉の隙間を埋めながら新しい再生筋線維が伸張し、隣接する損傷しなかった筋線維の長軸に沿って正しく方向付けられていた。コントロールにおいては、創傷箇所では浸潤した炎症細胞を除いて、線維性組織が形成されていた。１４日目にはＥＧＪＶ処理した筋肉では新しい再生筋肉により損傷筋肉の創傷が完全に置換されており、このときコントロールでは創傷は線維性組織形成により治癒しており、創傷の隙間が狭まっていた。
【００３０】
（実験結果の説明）
実験結果は、重度に損傷した筋肉の治癒過程の間に、本発明のＥＧＪＶが早期の血管新生（２４時間未満）、筋線維形成、および線維性組織形成阻害へのその多様な影響により骨格筋の治癒過程に介入することを示している。ＥＧＪＶから生じた早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害の多様な影響は互いに協調し、重度に損傷した骨格筋の完全な治癒をもたらす。早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害の間の協調は、新しい筋線維成長のためのより理想的な周辺環境を構築する。線維性組織は比較的に虚血性の状態で成長することが可能である。例えば、もし必要な養分が供給されないならば、十分な筋線維形成は不可能であろう。もし血液の供給が不十分であるならば、線維性組織は成長が可能であるが、通常の組織細胞は不可能であろう。筋線維形成は十分な血液の供給があり線維性組織の閉塞がないという状態においてのみ適切に起こる。我々のＥＧＪＶは２４時間あるいはそれ未満における新しい血管の早い成長を刺激することが可能であり、その結果、適切な細胞の成長および増殖に適した状況を構築する。促進された早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害の協調が重度に損傷した筋肉の完全な治癒につながったということが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害におけるＥＧＪＶの独特の特長は、骨格筋損傷、軟組織の外傷、手術時の傷口、熱傷、潰瘍、骨折および骨欠損の治療に非常に有益である。またＥＧＪＶは他の治療薬と組み合わせて、特に血液の供給が少ないあるいはほとんどの血管が損傷した場所における、骨折および欠損の治療のためのＥＧＪＶと骨誘導タンパク質との組み合わせのような、さらに良い薬を作ることも可能である。それゆえに、ＥＧＪＶは骨格筋損傷、皮膚損傷、手術時の傷口の治癒および骨折の治癒の治療のための治療薬の第一世代へと発展する大きな将来性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
これら、およびその他の本発明の特長は、図を考慮した以下の詳細な記述より当分野の技術者に周知のこととなるだろう。
【図１】図１は、１、２、３、７および１８日間、５％ＤＭＳＯに溶解した本発明のＥＧＪＶあるいは５％ＤＭＳＯコントロールで処理後のウサギの筋線維損傷した前脛骨筋の様子を示している。図１Ａは創傷箇所が多数の炎症細胞（Ｉｎｆ）で満たされていたことを示している。記号「Ｎ」は通常の筋線維の様子を示している。図１ＢはＥＧＪＶでの処理後に、１日目の創傷箇所で新しく再生した薄い筋管をわずかに伴ったいくつかの新しい血管が見られたことを示している。新しい血管は黒矢印で示され、新しい再生筋管は緑矢印で示されている。図１Ｃで示されるように筋線維損傷の２日後には多数の新しく形成された血管が創傷箇所で観察され（緑矢印で示した）、いくらかの新しい再生筋管が形成された（黒矢印で示した）。対照的に図１Ｅ（ＤＭＳＯコントロール群）で見られるように創傷箇所は依然として乾燥せず、炎症細胞の浸潤はほとんどみられなかった。また新しく形成された血管あるいは新しい再生筋管も観察されなかった。
【００３３】
１８日目には、中心核を備え、比較的に成熟した新しい再生筋管（サイズはＮで示される通常の筋線維よりは少し小さい）が黒矢印で示されるように創傷の隙間で多数観察された（図１Ｄ）。対照的に、コントロールの創傷の隙間は図１ＦにおいてＦｉｂで示されるような線維性組織で満たされていた。
【図２】図２は１、２および３日間の本発明のＥＧＪＶ処理後の筋線維損傷した前脛骨筋の様子を示した写真である。図２ａは５％ＤＭＳＯコントロールの２日目において創傷箇所が多数の炎症細胞（Ｉｎｆ）で満たされていることを示している。記号「Ｎ」は通常の筋線維の様子を示している。対照的に、図２ｂ〜２ｄはＥＧＪＶ処理群の結果を示しており、新しく形成された血管が筋線維損傷１日後の創傷箇所（黒矢印で示した）で多数観察された（図２ｂ参照）。筋線維損傷後２日目においては黒矢印で示された新しく形成された多数の血管に加えて、新しく再生し伸張した薄い筋管（緑矢印で示した）も新しく形成された血管に沿って観察された（図２ｃ参照）。そして、筋線維損傷の３日後には緑矢印で囲まれるようにさらに多くの新しい再生筋管の一団が観察された（図２ｄ参照）。
【図３】図３は７日間のＥＧＪＶ処理後の、ラットにおける筋線維損傷した前脛骨筋の組織学的な様子を示した写真である。図３ａはコントロールでの創傷箇所が炎症細胞（「Ｉｎｆ」で示した）および線維性組織（「Ｆｂ」で示した）で満たされていたことを示している。対照的に、図３ｂおよび３ｃからのＥＧＪＶ処理群では、よく整列し伸長した新しい再生筋管（赤矢印で示した）が観察され、それらが創傷箇所の隙間を埋めていた。図３ｄは図３ｃにおける青い長方形の領域の拡大である。図３ｄにおいて赤矢印は新しい再生筋管を示し、緑矢印は新しい再生筋管の中心核を示し、青矢印は活性なサテライト細胞を示唆している。それらのいくつかのサテライト細胞は筋管に融合すると思われる。
【図４】図４は１４日間のＥＧＪＶ処理後の筋線維損傷した前脛骨筋の組織学的な様子を示した写真である。図４ａはコントロールにおける創傷箇所が線維性組織形成（「Ｆｂ」で示した）により治癒し、損傷の隙間が縮まった（青矢印）ことを示している。対照的に、図４ｂおよび４ｃより、ＥＧＪＶ処理群においてはよく整列し伸張した新しい再生筋線維が創傷の隙間を完全に埋めているのが観察された。記号「Ｒｍ」は新しい再生筋線維を示し、「Ｅｍ」は既存の筋線維を示している。切れ目の輪郭は緑矢印で示されるように依然として認識できる。図３ｂおよび３ｃにおいて、おそらく２つの異なる時期の細胞群ではタンパク質の内容が異なるために、新しい再生筋線維（２週間未満）は既存の筋線維と比較すると異なって染色される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は漢方薬に関するものである。特に、本発明はダイコンソウ（Ｇｅｕｍ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ Ｖａｒｉａｎｔ）の有機抽出物（以下「ＥＧＪＶ」）、および、損傷した骨格筋と皮膚を含む軟組織とにおいて、血管新生、骨格筋再生および線維性組織形成阻害を刺激するための有機抽出物の利用に関するものである。また本発明はＥＧＪＶの有機抽出物を製造する方法、および、骨格筋損傷あるいは皮膚損傷の治療、手術時の傷口の治癒の促進、あるいは皮膚治療や形成外科における瘢痕形成の軽減のための方法にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ダイコンソウは、Ｇ. ボリシイ、Ｇ. キロエンセ、Ｇ. コッシキネウム、Ｇ. マクロフィルム、Ｇ. モンタヌム、Ｇ. レプタンス、Ｇ. リバレ、Ｇ. トリフロルム、Ｇ. ウルバヌム、およびダイコンソウ（Ｇ. ジャポニクム）などの６５種の根茎草本および亜低木の属であり、単純葉または羽状複葉、および標準的な花を有する。ダイコンソウは多年生草でバラ科の顕花植物である。ダイコンソウの植物全体の水抽出物は漢方では利尿薬として用いられてきた（Ｐｅｒｒｙ、Ｌ．Ｍ．、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｅａｓｔ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａ、ＭＩＴ出版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ、ｐｐ．２４２、１９８０年）。
【０００３】
重度の損傷後の骨格筋の治癒は遅くかつ不十分である。損傷した骨格筋の再生能力の限界、および外傷部位における急速な線維性瘢痕組織の形成は大きな臨床治療の問題である。重度の外傷性骨格筋の共通運命は線維症となる。現在まで、重度の損傷後の完全な骨格筋の治癒を促進することができる効果的な治療上の処置は見つかっていない。
【０００４】
上述のように、重度の損傷後の筋肉治癒は遅く、そして不完全であり、その結果として線維性組織に置換されてしまう（Ｇｒｏｕｎｄｓ、Ｍ．Ｄ．Ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２、５３５−５４３（１９９９年）；Ｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．１５、９−１４（１９８７年））。現在のところ、重度の筋肉損傷後に顕著な骨格筋の再生を促進するのに用いることができる効果的な治療法はない。我々の以前の研究（Ｌｉ、Ｍ．ら、Ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ‐ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１、２８９−２９２（２０００年）；Ｌｉ、Ｍ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８４、２６３−２６８（２０００年））にあるように、動物モデルにおいて、筋線維の再生と同様に培養サテライト細胞の増殖および分化をも増進しうる筋線維形成因子を同定した。しかしながら、これらの筋線維形成因子は筋肉治癒を高めることはできたが、重度の筋肉損傷後の完全な治癒は生じなかった。
【０００５】
線維性組織は、比較的に虚血性の環境で生育が可能であるが、しかし、通常組織の細胞は生育が困難である。骨格筋が損傷した際、血管系もしばしば損傷を受け、そのため損傷部位周辺の血液の供給が不十分になる。通常、線維性組織はより早く生育し、損傷した筋線維が占めていたスペースを占めるため、新しい筋線維の置換のためのスペースをブロックすることになる。以前の研究によると、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、あるいはＰＤＧＦのようないくつかの成長因子は血管新生を増進しうるが、しかし、これらの成長因子に仲介されるこの血管新生にはおよそ２〜９週間を要する可能性がある。重度の骨格筋損傷の完全な治癒をもたらす、特に数時間のうちに新血管形成を引き起こすことが可能な製品は世界市場で入手することができない。現在まで、重度の損傷骨格筋に完全な治癒をもたらすことが可能な記録された薬品あるいは要素は、市場あるいは研究においてさえも存在しない。
【０００６】
（発明の概要）本発明の主な目的は、損傷骨格筋の線維性組織の形成を抑制しながら、重度の損傷骨格筋線維の完全な治癒を引き起こすことが可能な薬剤を提供することである。本目的を達するために、本発明者は入念な調査を遂行した。その結果、自然源からの有機抽出物（ダイコンソウの全体）が迅速な血管新生および筋線維形成に二重の効果を示すことを発見した。これらの二重効果は骨格筋損傷の治療、皮膚治癒、手術の傷口の治癒、熱傷および潰瘍のような他の軟組織の治療、および骨折治癒や骨欠損修復のような硬組織の治療に用いることが可能である。
【０００７】
本発明の目的の一つはＥＧＪＶを提供することである。「ＥＧＪＶ」はゲミン（ｇｅｍｉｎ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むタンニン、および、２−ヒドロキシオレアノール酸（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｏｌｅａｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、２−ヒドロキシウルソル酸（２−Ｈｕｄｒｏｘｙｌｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、２，１９−ジヒドロキシ−ウルソル酸（２，１９−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸（２−ａｌｐｈａ、１９−ａｌｐｈａ−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−１２−ｕｒｓｅｎ−２８−ｏｉｃ Ａｃｉｄ）、ウルソル酸（Ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、エピモリック酸（Ｅｐｉｍｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）、マスリニック酸（Ｍａｓｌｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、エウスカフィク酸（Ｅｕｓｃａｐｈｉｃ Ａｃｉｄ）、トルメンティク酸（Ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ Ａｃｉｄ）、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシド（２８−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｏｆ ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ Ａｃｉｄ）などを含むトリテルペンを主に含有する。
【０００８】
本発明の他の目的は、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療のための薬剤の製造において「ＥＧＪＶ」の利用を提供することである。このＥＧＪＶは製薬的に可能な添加剤と組み合わせて、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療のための様々な種類の薬剤に調剤することが可能である。
【０００９】
本発明の他の目的は、骨格筋損傷あるいは皮膚損傷を患う哺乳動物への有効量の「ＥＧＪＶ」の投与を含む、骨格筋損傷あるいは皮膚損傷の治療方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、Ｃ１〜Ｃ４アルコールを用いた植物ダイコンソウの抽出物を抽出するステップを含む、「ＥＧＪＶ」の製造方法を提供することである。
（発明の詳細な説明）本発明は以下の４つの態様を呈する：
第一の態様はＥＧＪＶ製造の方法に関する。
【００１１】
１．ダイコンソウからの有機抽出物を製造するための方法を提供する。本方法はａ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群より選択されたアルコールによる植物ダイコンソウの抽出物を抽出するステップを含む。ステップａ）は室温にて３〜６回、好ましくは５回、繰り返される。ステップａ）を行う前に、ダイコンソウ植物を粉末にしておくことが好ましい。Ｃ１〜Ｃ４アルコールはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびテルブタノールを含む。より好ましいアルコールはメタノールおよびエタノールである。そして最も好ましいのはメタノールである。アルコールで抽出されるダイコンソウに対してのアルコールの総量についての明確な制限はない。しかしながら経済的な観点から言えば、使用されるアルコールの総量は抽出されるダイコンソウの総量の１〜１０倍重量であることが好ましい。
【００１２】
２．上記項目１で記載されたような方法は、さらに、ｂ）ステップａ）から得られた抽出物を乾燥して乾燥粉末にするステップと、ｃ）Ｃ６アルカン、酢酸エチルおよびＣ１〜Ｃ４アルコールから成る群より選択されたアルコールを用いて、ステップｂ）より得られた粉末から連続的に抽出するステップとを含むことができる。Ｃ６アルカンは、例えばシクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、およびネオへキサン等を含む６炭素原子のサイクリックおよび非サイクリックなアルカンを含む。Ｃ１〜Ｃ４アルコールはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびテルブタノールを含む。ステップｃ）においてより好ましいアルコールは、ｎ−プロパノールおよびｎ−ブタノールである。さらに、最も好ましいのはｎ−ブタノールである。前の乾燥するステップで得られた乾燥粉末に対するＣ６アルカン、酢酸エチルおよびアルコールの総量に関して厳密な制限はない。しかしながら、経済的観点から言えば、用いられる有機溶媒の総量はさらに抽出される粉末量に対し、１〜１０倍重量であることが好ましい。
【００１３】
３．ＥＧＪＶをより適用しやすくするために、上記項目２で記載された方法は、ｄ）ステップｃ）で得られた抽出物を乾燥粉末へと乾燥するステップを有さらに含んでいる。乾燥ステップｄ）を行う前に、前のステップｃ）で得られた抽出物をその中のどんな不溶性粉末も除去するためにろ過することが好ましい。乾燥ステップｄ）は例えば、５０℃の室温より高い温度で減圧下において達成できる。
【００１４】
４．ＥＧＪＶをより精製するために、上記項目３で記載されたような方法は好ましくはさらにｅ）ステップｄ）で得られた粉末のクロマトグラフ・カラムに充填し、そしてｆ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されるアルコールを水溶液におけてその濃度を上げることでカラムを溶出するステップを含む。ステップｅ）においてクロマトグラフ・カラムに制約はない。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘあるいは逆行性フェーズカラムを用いることができる。ステップｆ）において用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびテルブタノールから成る群より選択されるいずれかであり、メタノールが最も好ましい。
【００１５】
本発明の二つ目の態様は、上記項目１〜４に記載のいずれかの方法で得られるダイコンソウの有機抽出物に関する。ＮＭＲ分析により、本発明のＥＧＪＶはゲミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むタンニン、および、２−ヒドロキシオレアノール酸、２−ヒドロキシウルソル酸、２，１９−ジヒドロキシ−ウルソル酸、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸、ウルソル酸、エピモリック酸、マスリニック酸、エウスカフィク酸、トルメンティク酸、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシドなどを含むトリテルペンを主に含有する。
【００１６】
本発明の第三の態様は、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療のための薬剤の製造におけるダイコンソウの有機抽出物の利用に関する。ＥＧＪＶは血管新生および筋線維形成を増進するための薬剤に用いることが可能である。ＥＧＪＶに加えて、薬剤にはＥＧＪＶと混合可能な他の薬剤も含むことができる。前記他の薬剤には抗生物質、ビタミン、サイトカイン、および骨誘導タンパク質等が含まれるが、それに限ったものではない。製薬的に可能な添加物とともにＥＧＪＶは粉末、溶液、懸濁液、クリーム、あるいはペーストなどを含む様々な形態に調剤が可能であるがそれに限ったものではない。これら様々な形態の薬剤を製造するための添加物および方法は当分野の技術者に周知である。
【００１７】
本発明の第四の態様は、骨格筋損傷、皮膚損傷、手術時の傷口あるいは骨折を患う哺乳動物への、ダイコンソウからの有機抽出物の有効量の投与を含む、骨格筋損傷、皮膚損傷あるいは骨折の治療の方法に関する。「有効量」という言葉は、細胞培養システムあるいは動物モデルシステムにおいて血管新生及び筋線維形成を効果的に増進することが可能な量のことである。この「有効量」は治療をうける動物の種、投与されるＥＧＪＶの濃度、および筋肉あるいは皮膚の重傷度を含むいくつかの要素によって決まる。この「有効量」を決定する方法は当分野の技術者に周知である。ここで用いられる「投与」という言葉は薬剤を届けるためのいずれの標準的な手段も意味する。投与の手段は当分野で周知であり、静脈注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮内投与、あるいは経皮投与等を含むが、これに限ったものではない。「動物」という言葉は好ましくはラット、ハツカネズミ、ネコ、イヌ、ウマおよびヒツジ等を含む哺乳動物をさす。より好ましくは、この言葉は人間をさす。
【００１８】
（例）以下の例を参照して本発明を下記でより詳細に説明する。しかしながら、本発明の範囲はこれらの例に限られるものではない。
【００１９】
（例１）「ＥＧＪＶ」の製造
ダイコンソウは中国の貴州省から採取した。乾燥植物（１キログラム）を粉末にし、室温で２〜３時間かけメタノール（８リットル）でろ過し、これを５回繰り返した。そして抽出物を減圧下で乾燥させ、約５０グラムの残留物を産出する。乾燥粉末（５０グラム）を１２０ミリリットルの水に懸濁し、続けてヘキサン（５ｘ２５０ミリリットル）、エタノール（５ｘ２５０ミリリットル）およびｎ−ブタノール（５ｘ２５０ミリリットル）で分離する。ｎ−ブタノール溶解画分をろ過し、減圧下（５０℃）で濃縮し粉末状の残留物を産出した。粉末状残留物を１０％メタノールで平衡を保ったＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０のカラムに充填し、水中のメタノールの濃度上昇により溶出した。ＮＭＲ分析により、ゲミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦのようなタンニン、及び、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸、ウルソル酸、エピモリック酸、マスリニック酸、エウスカフィク酸、トルメンティク酸、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシドなどを含むトリテルペンを主に含有する、１２の画分が溶出された。これらの１２のメタノール溶出画分を混合し、例２および３においてＥＧＪＶとして用いた。
【００２０】
漢方薬である血管新生および筋線維形成薬剤のスクリーニングの過程で、本発明の発明者はｎ−ブタノール可溶性画分も後のメタノール溶出画分と同様に、重度の損傷骨格筋での新しい血管および筋肉の再生の初期成長（２４時間以内）の刺激において強力な二重効果を示すことを発見した。特に記載がない限り、以下で用いられる「ＥＧＪＶ」という言葉はメタノール溶出画分をさす。
【００２１】
（例２）ウサギ筋肉損傷モデルにおける活性画分の二重効果の評価
ここで、本発明者は「ＥＧＪＶ」の効果を分析した。実験結果では、コントロールにおける線維性瘢痕組織と比較すると、ＥＧＪＶは重度の損傷骨格筋の治癒過程において、損傷箇所での再生筋線維の存在を伴う顕著な効果があることを驚くほど示した。ＥＧＪＶは損傷筋肉の治癒過程の初期における筋線維形成および血管新生の両方の刺激、および骨格筋治癒および皮膚損創傷の治癒の両方における線維性瘢痕形成の阻害に対して、非常に有益な効果があると思われる。
【００２２】
ＥＧＪＶは重度の筋肉損傷ウサギ動物モデル（メス、Ｎ＝１２、平均体重：２．５キログラム）に用いた。ウサギは前脛骨筋に手術用ハサミでの切断による損傷から生じる筋肉損傷を受けた。６匹のウサギには筋損傷の直後に前脛骨筋の表皮下に５％ＤＭＳＯに溶解したＥＧＪＶを１ミリリットル注射した。他の６匹のウサギにはコントロールとして同じ容量の５％ＤＭＳＯを注射した。注射は一度だけ行った。各グループの２匹のウサギを損傷の２日後に犠牲にした。前脛骨筋を取り出し、パラフィン切片およびＨＥ（つまりヘマトキシリンおよびエオジン）染色用に加工した。各グループの別の２匹のウサギを損傷の１週間後に犠牲にし、残りの各グループの２匹は損傷の２週間後に犠牲にした。異なる時点で犠牲にしたウサギは全て、以下の同じ方法で処理した。
【００２３】
図１Ｅに見られるように、５％ＤＭＳＯを一回注射した前脛骨筋の切断損傷の１日後では、損傷箇所の領域は炎症細胞の浸潤はほとんど見られないまま依然として乾燥しておらず、新しく形成された血管および再生筋管も見られない。一方で、１日目のＥＧＪＶ処理群では、創傷箇所は多数の炎症細胞で満たされており、新しく再生した薄い筋管をわずかに伴った新しく形成された血管が創傷箇所にいくらか見られた（図１Ｂ）。筋肉損傷の２日後には創傷箇所で多くの新しく形成された血管が見られ、新しい再生筋管もまた形成されていた（図１Ｃ）。対照的に、ＤＭＳＯのコントロール群では創傷箇所は未だ乾燥せず、炎症細胞の浸潤もほとんど見られなかった（図１Ｅ）。このコントロール群では新しく形成された血管も新しい再生筋管も見られなかった（図１Ｅ）。１８日目のＥＧＪＶ処理群では、創傷の隙間に新しく再生し比較的に成熟した多数の筋管（中心核を備えた通常の筋線維よりもわずかに小さい）が観察された（図１Ｄ）。一方、コントロールでは創傷の隙間は線維性組織で満たされていた（図１Ｆ）。
【００２４】
（例３）
ラットの筋肉損傷モデルにおける活性画分の二重効果の評価
ラットの骨格筋損傷モデルでＥＧＪＶをさらに調べた。実験結果は重度の損傷筋肉の創傷箇所においてＥＧＪＶが血管再生（２４時間以内の）およびサテライト細胞の増殖を顕著に刺激しうることを示した。ＥＧＪＶで処理された動物の損傷箇所は、コントロールの動物においては筋線維形成が主な特徴であるのとは著しく対照的に、損傷の２週間以内に新しい再生筋線維で完全に置き換えられた。
【００２５】
実験のラット（ＳＤラット、メス、Ｎ＝４０、平均体重：１５０グラム）は前脛骨筋に手術用ハサミでの切断による損傷から生じる筋肉損傷を受けた。２０匹のラットは前脛骨筋の皮下に５％ＤＭＳＯに溶かしたＥＧＪＶを筋損傷の直後に０．１ミリリットル注射した。他の２０匹のラットにはコントロールとして同量の５％ＤＭＳＯを注射した。注射は一度だけ行った。各グループから４匹のラットを損傷のそれぞれ１、２および３日後に犠牲にした。前脛骨筋を取り出し、パラフィン切片およびＨＥ染色用に加工した。各グループからの別の４匹のラットを損傷の７日後に犠牲にし、残りの各グループの４匹のラットは損傷の１４日後に犠牲にした。異なる時点で犠牲にしたラットは全て、以下の同じ方法で処理した。
【００２６】
損傷の１日後に調べた際、コントロールのラットの前脛骨筋における創傷箇所は、多数の炎症細胞で満たされており、２日目にはさらに多くの炎症細胞が浸潤していた（図２ａ）。また、新しく形成された血管も非常にわずかに観察された。対照的に、ＥＧＪＶ処理したラットにおける損傷箇所では、１日目には多数の新しく形成された血管（図２ｂ）が、そして２日目には新しく再生した長くて薄い筋管を伴ったより多くの血管（筋管の中央に核を伴う）（図２ｃ）がはっきりと認められた。ＥＧＪＶ処理した群の３日目においては、創傷箇所で、多数のより新しい再生筋管の一団が損傷した筋線維に置き換わっているのが観察された（図２ｄ）。
【００２７】
７日目には、コントロールの動物の創傷箇所は炎症細胞および置換した線維性組織で満たされていた（図３ａ）。極めて対照的に、ＥＧＪＶ処理した動物の創傷箇所では新しく発達した高度に整列した筋管が多数見られた（図３ｂ〜３ｃ）。新しい再生筋管に沿って、増殖したサタライト細胞もまた検出された（図３ｄ）。線維性組織形成の顕著な徴候も見られなかった。
【００２８】
１４日目には、コントロール動物の創傷箇所は線維性組織形成によって治癒した。筋肉損傷の隙間は図４ａに示すように収縮していた。しかしながら、ＥＧＪＶ処理したラットでは、線維性組織形成の徴候はなく、高度に整列した新しい再生筋線維が創傷箇所を埋めていた（図４ｂおよび４ｃ）。実験動物の筋肉になされた切断の輪郭は依然として既存の筋線維および新しく再生した筋線維の間で異なって筋線維を染色することにより認められた。これはおそらくは二つの異なる時期の筋線維の間のタンパク質の内容の違いによるものである。
【００２９】
まとめると、我々の実験結果は、骨格筋の創傷箇所でＥＧＪＶの一回局注により引き起こされた活発な新血管形成が見られ、損傷の２４時間以内に注射箇所周辺に血液細胞で満たされた多数の新しい毛細血管の芽が形成された。筋肉損傷の２日後の創傷箇所では、多数の新しく形成された血管に加えて、散乱した新しい再生筋線維（長くて薄い）もまた多く観察された。対照的にコントロールにおいては多数の炎症細胞が浸潤していた。７日目では損傷した筋肉の隙間を埋めながら新しい再生筋線維が伸張し、隣接する損傷しなかった筋線維の長軸に沿って正しく方向付けられていた。コントロールにおいては、創傷箇所では浸潤した炎症細胞を除いて、線維性組織が形成されていた。１４日目にはＥＧＪＶ処理した筋肉では新しい再生筋肉により損傷筋肉の創傷が完全に置換されており、このときコントロールでは創傷は線維性組織形成により治癒しており、創傷の隙間が狭まっていた。
【００３０】
（実験結果の説明）
実験結果は、重度に損傷した筋肉の治癒過程の間に、本発明のＥＧＪＶが早期の血管新生（２４時間未満）、筋線維形成、および線維性組織形成阻害へのその多様な影響により骨格筋の治癒過程に介入することを示している。ＥＧＪＶから生じた早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害の多様な影響は互いに協調し、重度に損傷した骨格筋の完全な治癒をもたらす。早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害の間の協調は、新しい筋線維成長のためのより理想的な周辺環境を構築する。線維性組織は比較的に虚血性の状態で成長することが可能である。例えば、もし必要な養分が供給されないならば、十分な筋線維形成は不可能であろう。もし血液の供給が不十分であるならば、線維性組織は成長が可能であるが、通常の組織細胞は不可能であろう。筋線維形成は十分な血液の供給があり線維性組織の閉塞がないという状態においてのみ適切に起こる。我々のＥＧＪＶは２４時間あるいはそれ未満における新しい血管の早い成長を刺激することが可能であり、その結果、適切な細胞の成長および増殖に適した状況を構築する。促進された早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害の協調が重度に損傷した筋肉の完全な治癒につながったということが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
早期の血管新生、筋線維形成、および線維性組織形成阻害におけるＥＧＪＶの独特の特長は、骨格筋損傷、軟組織の外傷、手術時の傷口、熱傷、潰瘍、骨折および骨欠損の治療に非常に有益である。またＥＧＪＶは他の治療薬と組み合わせて、特に血液の供給が少ないあるいはほとんどの血管が損傷した場所における、骨折および欠損の治療のためのＥＧＪＶと骨誘導タンパク質との組み合わせのような、さらに良い薬を作ることも可能である。それゆえに、ＥＧＪＶは骨格筋損傷、皮膚損傷、手術時の傷口の治癒および骨折の治癒の治療のための治療薬の第一世代へと発展する大きな将来性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
これら、およびその他の本発明の特長は、図を考慮した以下の詳細な記述より当分野の技術者に周知のこととなるだろう。
【図１】図１は、１、２、３、７および１８日間、５％ＤＭＳＯに溶解した本発明のＥＧＪＶあるいは５％ＤＭＳＯコントロールで処理後のウサギの筋線維損傷した前脛骨筋の様子を示している。図１Ａは創傷箇所が多数の炎症細胞（Ｉｎｆ）で満たされていたことを示している。記号「Ｎ」は通常の筋線維の様子を示している。図１ＢはＥＧＪＶでの処理後に、１日目の創傷箇所で新しく再生した薄い筋管をわずかに伴ったいくつかの新しい血管が見られたことを示している。新しい血管は黒矢印で示され、新しい再生筋管は緑矢印で示されている。図１Ｃで示されるように筋線維損傷の２日後には多数の新しく形成された血管が創傷箇所で観察され（緑矢印で示した）、いくらかの新しい再生筋管が形成された（黒矢印で示した）。対照的に図１Ｅ（ＤＭＳＯコントロール群）で見られるように創傷箇所は依然として乾燥せず、炎症細胞の浸潤はほとんどみられなかった。また新しく形成された血管あるいは新しい再生筋管も観察されなかった。
【００３３】
１８日目には、中心核を備え、比較的に成熟した新しい再生筋管（サイズはＮで示される通常の筋線維よりは少し小さい）が黒矢印で示されるように創傷の隙間で多数観察された（図１Ｄ）。対照的に、コントロールの創傷の隙間は図１ＦにおいてＦｉｂで示されるような線維性組織で満たされていた。
【図２】図２は１、２および３日間の本発明のＥＧＪＶ処理後の筋線維損傷した前脛骨筋の様子を示した写真である。図２ａは５％ＤＭＳＯコントロールの２日目において創傷箇所が多数の炎症細胞（Ｉｎｆ）で満たされていることを示している。記号「Ｎ」は通常の筋線維の様子を示している。対照的に、図２ｂ〜２ｄはＥＧＪＶ処理群の結果を示しており、新しく形成された血管が筋線維損傷１日後の創傷箇所（黒矢印で示した）で多数観察された（図２ｂ参照）。筋線維損傷後２日目においては黒矢印で示された新しく形成された多数の血管に加えて、新しく再生し伸張した薄い筋管（緑矢印で示した）も新しく形成された血管に沿って観察された（図２ｃ参照）。そして、筋線維損傷の３日後には緑矢印で囲まれるようにさらに多くの新しい再生筋管の一団が観察された（図２ｄ参照）。
【図３】図３は７日間のＥＧＪＶ処理後の、ラットにおける筋線維損傷した前脛骨筋の組織学的な様子を示した写真である。図３ａはコントロールでの創傷箇所が炎症細胞（「Ｉｎｆ」で示した）および線維性組織（「Ｆｂ」で示した）で満たされていたことを示している。対照的に、図３ｂおよび３ｃからのＥＧＪＶ処理群では、よく整列し伸長した新しい再生筋管（赤矢印で示した）が観察され、それらが創傷箇所の隙間を埋めていた。図３ｄは図３ｃにおける青い長方形の領域の拡大である。図３ｄにおいて赤矢印は新しい再生筋管を示し、緑矢印は新しい再生筋管の中心核を示し、青矢印は活性なサテライト細胞を示唆している。それらのいくつかのサテライト細胞は筋管に融合すると思われる。
【図４】図４は１４日間のＥＧＪＶ処理後の筋線維損傷した前脛骨筋の組織学的な様子を示した写真である。図４ａはコントロールにおける創傷箇所が線維性組織形成（「Ｆｂ」で示した）により治癒し、損傷の隙間が縮まった（青矢印）ことを示している。対照的に、図４ｂおよび４ｃより、ＥＧＪＶ処理群においてはよく整列し伸張した新しい再生筋線維が創傷の隙間を完全に埋めているのが観察された。記号「Ｒｍ」は新しい再生筋線維を示し、「Ｅｍ」は既存の筋線維を示している。切れ目の輪郭は緑矢印で示されるように依然として認識できる。図３ｂおよび３ｃにおいて、おそらく２つの異なる時期の細胞群ではタンパク質の内容が異なるために、新しい再生筋線維（２週間未満）は既存の筋線維と比較すると異なって染色される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されたアルコールによる植物ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ Ｖａｒ．）の抽出物を抽出するステップを含むダイコンソウの有機抽出物を製造する方法。
【請求項２】
ｂ）ステップａ）より得た抽出物の乾燥粉末へ乾燥し、そして、
ｃ）Ｃ６アルカン、酢酸エチルおよびＣ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されたアルコールによるステップｂ）より入手した粉末を連続的に抽出する、
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｄ）ステップｃ）より得た抽出物の乾燥粉末へ乾燥する、
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｅ）ステップｄ）より得た粉末をクロマトグラフ・カラムに充填し、そして、
ｆ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されるアルコールの水溶液におけるその濃度を上げることによってカラムを溶出する、
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）が２〜３時間室温で実施され、そして５回繰り返されることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
有機溶媒がメタノールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｃ６アルカンはｎ−ヘキサンであり、かつステップｃ）で用いられるアルコールはｎ−ブタノールであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフ・カラムは１０％重量のメタノールで平衡を保たれたＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０のカラムであり、かつステップｅ）で用いられるアルコールはメタノールであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）あるいはｄ）が減圧下で実施されることを特徴とする請求項２〜８いずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
得られた抽出物が、ゲミン（Ｇｅｍｉｎ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むタンニン、および２−ヒドロキシオレアノール酸、２−ヒドロキシウルソル酸、２，１９−ジヒドロキシ−ウルソル酸、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸、ウルソル酸、エピモリック酸、マスリニック酸、エウスカフィク酸、トルメンティク酸、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシドを含むトリテルペンを主に含有することを特徴とする請求項１〜９いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか一項に記載の方法により得られるダイコンソウの有機抽出物。
【請求項１２】
骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折を治療するための薬剤の製造における請求項１〜１０いずれか一項に記載の方法に従って得られるダイコンソウの有機抽出物の利用。
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれか一項に記載の方法により得られる有効量のダイコンソウの有機抽出物を、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折を被った動物へ投与することを含むことを特徴とする、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療の方法。
【請求項１４】
動物とは哺乳動物であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物とは人間であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１】
ａ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されたアルコールによる植物ダイコンソウ（Ｇｅｕｍ Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ Ｔｈｕｎｂ Ｖａｒ．）の抽出物を抽出するステップを含むダイコンソウの有機抽出物を製造する方法。
【請求項２】
ｂ）ステップａ）より得た抽出物の乾燥粉末へ乾燥し、そして、
ｃ）Ｃ６アルカン、酢酸エチルおよびＣ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されたアルコールによるステップｂ）より入手した粉末を連続的に抽出する、
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｄ）ステップｃ）より得た抽出物の乾燥粉末へ乾燥する、
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｅ）ステップｄ）より得た粉末をクロマトグラフ・カラムに充填し、そして、
ｆ）Ｃ１〜Ｃ４アルコールから成る群から選択されるアルコールの水溶液におけるその濃度を上げることによってカラムを溶出する、
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）が２〜３時間室温で実施され、そして５回繰り返されることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
有機溶媒がメタノールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｃ６アルカンはｎ−ヘキサンであり、かつステップｃ）で用いられるアルコールはｎ−ブタノールであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフ・カラムは１０％重量のメタノールで平衡を保たれたＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０のカラムであり、かつステップｅ）で用いられるアルコールはメタノールであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）あるいはｄ）が減圧下で実施されることを特徴とする請求項２〜８いずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
得られた抽出物が、ゲミン（Ｇｅｍｉｎ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むタンニン、および２−ヒドロキシオレアノール酸、２−ヒドロキシウルソル酸、２，１９−ジヒドロキシ−ウルソル酸、２−アルファ、１９−アルファ−ジヒドロキシ−３−オキソ−１２−ウルセン−２８−オイク酸、ウルソル酸、エピモリック酸、マスリニック酸、エウスカフィク酸、トルメンティク酸、トルメンティク酸の２８−ベータ−Ｄ−グルコシドを含むトリテルペンを主に含有することを特徴とする請求項１〜９いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか一項に記載の方法により得られるダイコンソウの有機抽出物。
【請求項１２】
骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折を治療するための薬剤の製造における請求項１〜１０いずれか一項に記載の方法に従って得られるダイコンソウの有機抽出物の利用。
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれか一項に記載の方法により得られる有効量のダイコンソウの有機抽出物を、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折を被った動物へ投与することを含むことを特徴とする、骨格筋損傷、皮膚損傷、あるいは骨折の治療の方法。
【請求項１４】
動物とは哺乳動物であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物とは人間であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５１０６３７（Ｐ２００６−５１０６３７Ａ）
【公表日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５７７３９（Ｐ２００４−５５７７３９）
【出願日】平成１４年１２月１０日（２００２．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００２／０００８７８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５２３８１
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【出願人】（５０５２１４３３１）ザ・チャイニーズ・ユニバーシティー・オブ・ホンコン (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＯＮＧ ＫＯＮＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１２月１０日（２００２．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００２／０００８７８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５２３８１
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【出願人】（５０５２１４３３１）ザ・チャイニーズ・ユニバーシティー・オブ・ホンコン (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＮＥＳＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＯＮＧ ＫＯＮＧ
【Ｆターム（参考）】
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