テトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子
新規テトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子および該遺伝子がコードする蛋白質を見出し、該蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法を提供し、大腸癌の判定方法、防止方法および治療方法を提供する。配列表の配列番号１の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含むＤＮＡ；該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド；該ＤＮＡがコードする蛋白質；該ＤＮＡを含有する組換えベクター；該組換えベクターを含有する形質転換体；該蛋白質に対する抗体；該蛋白質の製造方法：該蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法；該ＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする大腸癌の判定方法；大腸癌の判定キット；大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、テトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子、該遺伝子に係るＤＮＡ、該ＤＮＡがコードする蛋白質に関する。また、該ＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡに関する。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有する組換えベクター、該ベクターを含有する形質転換体、該形質転換体を用いた該蛋白質の製造方法、該蛋白質に対する抗体に関する。また、該蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法に関する。また、該蛋白質の阻害剤を含んでなる癌の防止剤および／または治療剤に関する。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡおよび／または該抗体を含有する大腸癌の判定キットに関する。
【背景技術】
テトラヒドロ葉酸合成酵素（以後、Ｃ１−ＴＨＦＳという）は、様々な代謝反応に必要なＣ１基を供与するテトラヒドロ葉酸誘導体を合成する酵素である（非特許文献１、以後、テトラヒドロ葉酸をＴＦとテトラヒドロ葉酸誘導体をＴＦ誘導体という）。具体的にはＴＦ誘導体は、プリン、チミジル酸、ヒスチジンおよびパントテン酸等の生合成反応にＣ１基を供与する。すなわちＴＦおよびＴＦ誘導体は、核酸代謝およびアミノ酸代謝等に深く関与している。そのためＴＦおよびＴＦ誘導体は、細胞分裂が盛んな組織に多くみられ、細胞増殖および成長に不可欠である。
Ｃ１−ＴＨＦＳは、３種の機能を有するトリ酵素である。具体的には、Ｃ１−ＴＨＦＳは、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素（１０−ｆｏｒｍｙｌ−ＴＨＦ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＥＣ ６．３．４．３）、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（５，１０−ｍｅｔｈｅｎｙｌ−ＴＨＦ ｃｙｃｌｏｈｙｒｏｌａｓｅ、ＥＣ ３．５．４．９）および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（５，１０−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ＴＨＦ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ １．５．１．５）の機能を有する。Ｃ１−ＴＨＦＳは、これらの機能を発揮することにより、様々な代謝反応に必要なＴＦ誘導体の合成を促進する。
Ｃ１−ＴＨＦＳは、ヒト、マウス、酵母等の真核生物、大腸菌等の原核生物など様々な生物種を対象に、その解析が進められている（非特許文献２−５）。酵母については、その細胞質およびミトコンドリアに存在し機能するＣ１−ＴＨＦＳの存在が知られている。また、ヒトについては、その細胞の細胞質に存在し機能するＣ１−ＴＨＦＳが知られている。
しかし、ヒトについてその細胞のミトコンドリアに存在し機能するＣ１−ＴＨＦＳは知られておらず、唯一、非特許文献１９の報告があるのみである。また大腸癌組織において正常大腸組織と比較し発現が亢進するヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子も知られていない。
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
【非特許文献１】 ハム（Ｈｕｍ ＤＷ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８８年、第２６３巻、第３１号、ｐ．１５９４６−１５９５０。
【非特許文献２】 スタベン（Ｓｔａｂｅｎ，Ｃ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８４年、第２６１巻、ｐ．４６２９−４６３７。
【非特許文献３】 シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｋ．Ｗ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８６年、第２６１巻、ｐ．１２２６６−１２２７１。
【非特許文献４】 シグペン（Ｔｈｉｇｐｅｎ、Ａ．Ｅ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９０年、第２６５巻、ｐ．７９０７−７９１３。
【非特許文献５】 デブ（Ｄｅｖ，Ｉ．Ｋ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９７８年、第２５３巻、ｐ．４２４５−４２５３。
【非特許文献６】 ラジら（Ｒａｊ ＳＫら）「バイオケミストリ アンド モレキュラ バイオロジ インターナショナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、第４４巻、第１号、ｐ．８９−９５。
【非特許文献７】 フローマンら（Ｆｒｏｈｍａｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２。
【非特許文献８】 「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７。
【非特許文献９】 「メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５、ｐ．４９９−。
【非特許文献１０】 クラロス（Ｃｌａｒｏｓ ＭＧ）ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９６年、第２４１巻、第３号、ｐ．７７９−７８６。
【非特許文献１１】 キム（Ｋｉｍ ＰＪ）ら、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」 ２００３年、第３６２巻、ｐ．２０５−２０９。
【非特許文献１２】 ギルズ（Ｒ．Ｈ．Ｇｉｌｅｓ）ら、「バイオシミカ イト バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，２００３年、第１６５３巻、ｐ．１−２４。
【非特許文献１３】 ヘイ（Ｈｅ ＴＣ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９８年、第１２８巻、ｐ．１５０９−１５１５。
【非特許文献１４】 レベンス（Ｌｅｖｅｎｓ ＤＬ）、「ジーンズ アンド デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，２００３年、第１７号、ｐ．１０７１−１０７７。
【非特許文献１５】 ガロウ（Ｇａｒｒｏｗ ＴＡ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９３年、第２６８巻、ｐ．１１９１０−１１９１６。
【非特許文献１６】 ニキフォロフ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ＭＡ）ら、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２２巻、ｐ．５７９３−５８００。
【非特許文献１７】 タブチジアン（Ｔａｖｔｉｇｉａｎ ＳＶ）ら、「モレキュラー バイオロジー オブ ザ セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙａｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」、１９９４年、第５巻、ｐ．３７５−３８８。
【非特許文献１８】 ビラー（Ｖｉｌｌａｒ Ｅ）「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８５年、第２６０巻、第４号、ｐ．２２４５−２２５２
【非特許文献１９】 プラサンナン（Ｐｒａｓａｎｎａｎ Ｐ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、第４４号、ｐ．４３１７８−４３１８７。
【非特許文献２０】 杉浦ら、「バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．）２００４年、第３１５巻、第１号、ｐ．２０４−２１１）
【発明の開示】
本発明が解決しようとする課題は、新規Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子に係るＤＮＡおよび該ＤＮＡがコードする蛋白質を見出して提供することである。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡを提供することも課題に含まれる。また、該遺伝子に係るＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを用いて形質転換させてなる形質転換体、該蛋白質に対する抗体、該蛋白質の製造方法および該蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法を提供することも課題に含まれる。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡおよび／または該抗体を含有する大腸癌の判定キットおよびある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法を提供することも課題に含まれる。また、大腸癌の防止剤および／または治療剤を提供することも課題に含まれる。
本発明者らは上記課題のために鋭意努力し、新規Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子を見出し、該遺伝子に係るＤＮＡを用いて新規Ｃ１−ＴＨＦＳを取得することに成功した。そして、該ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、該Ｃ１−ＴＨＦＳが、細胞質からミトコンドリアに移行し、ミトコンドリアにおいて機能することを見出した。また、該Ｃ１−ＴＨＦＳが細胞増殖促進活性を有することを実証した。さらに、該Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子の発現が、大腸癌組織において正常大腸組織と比較し有意に亢進することを実証して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含み、かつ、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素活性、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ活性および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性の３つの活性、および／または、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである、（２）に記載のＤＮＡ。
（４） （１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加された塩基配列を有し、かつ細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（５） （１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（６） 以下の群より選ばれるＤＮＡであって、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つを増幅するためのプライマーおよび／または検出するためのプローブである（５）に記載のＤＮＡ；
（ｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ
および
（ｉｖ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（７） （１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（８） プラスミドＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号。
（９） （７）に記載の組換えベクターまたは（８）に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体。
（１０） 以下の（ａ）から（ｂ）のいずれかの蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
（１１） （４）に記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
（１２） （７）に記載の組換えベクターまたは（８）に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、（１０）または（１１）に記載の蛋白質の製造方法。
（１３） （１０）または（１１）に記載の蛋白質または該蛋白質の断片を抗原とする抗体。
（１４） （１０）または（１１）に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と（１０）または（１１）に記載の蛋白質との相互作用を可能にする条件下で、細胞増殖促進活性の存在、非存在または変化を検出することにより、該化合物が（１０）または（１１）に記載の蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
（１５） （１０）または（１１）に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、（１０）または（１１）に記載の蛋白質、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、（５）または（６）に記載のＤＮＡ、（７）に記載の組換えベクターまたは（８）に記載のプラスミド、（９）に記載の形質転換体および（１３）に記載の抗体のうちすくなくともいずれか１つを用いることを特徴とする同定方法。
（１６） ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、ある組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
（１７） （１６）に記載の判定方法であって、ある組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量が、対照である正常大腸由来組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量の３倍以上である場合に、ある組織が大腸癌由来組織であると判定することを特徴とする判定方法。
（１８） （１７）に記載の判定方法であって、ある組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を以下の工程により測定することを特徴とする判定方法；
（ｉ）ある組織に含まれるＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行う工程、
（ｉｉ）逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程および
（ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの量を測定する工程。
（１９） （５）または（６）に記載のＤＮＡおよび（１３）に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸癌の判定キットであって、（１６）から（１８）のいずれか１項に記載の判定方法に用いることを特徴とする大腸癌の判定キット。
（２０） （１０）または（１１）に記載の蛋白質の阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のｃＤＮＡおよび該遺伝子がコードする蛋白質の一次構造を示す図である。上段にｃＤＮＡ、下段に蛋白質の一次構造を示す。
ＮＤはＮ末端部分ＤＮＡを、ＮＴは、Ｎ末端欠損ＤＮＡを、ＳＰはターゲット配列（シグナルペプチド）を示す。
図２は、ヒトＣ１−ＴＨＦＳ（Ｈｕｍａｎ Ｃ−１ ｔｅｒｔａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）および本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子（ＤＫＦＺＰ）の一次構造を示す。Ｄ／Ｃ ドメインは、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼおよび５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分構造を意味する。Ｓ ドメインは、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分構造を意味する。
図３は、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓの構造を示す図である。図中、ＢａｍＨＩ６８７およびＸｈｏＩ３６３０は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの認識部位を示す。ＣＭＶプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター領域、Ｎｅｏ ｒ／Ｋａｎ ｒは、ネオマイシンおよびカナマイシン耐性遺伝子部位を示す。ｈＣ１Ｓは，本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の挿入部位を示す。
図４は、正常大腸細胞および大腸癌細胞内における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量を示す写真である。上段に本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量、下段に対照であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素遺伝子の発現量を示す。
１は大腸癌細胞ＨＣＴ１１６、２は大腸癌細胞ＳＷ６２０、３は正常大腸細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮを表す。ＤＫＦＺＰは、本発明で提供される遺伝子の発現量を、ＧＡＰＤＨは、グリセリンアルデヒド三リン酸脱水素酵素の発現量を示す。
図５は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の発現を確認したウエスタンブロッティングの結果の写真である。図中、ｌｙｓａｔｅは２９３細胞の溶解溶液のサンプルであること、ＩＰＰは２９３細胞の溶解溶液中で抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降させた後の沈降物のサンプルであることを示す。
−は、遺伝子導入されない動物細胞由来のサンプル、Ｅは、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞由来のサンプル、ＦＬは、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞由来のサンプルを示す。
図６は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子によりコードされる蛋白質が、細胞増殖を促進することを示す写真である。２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ→１０ ｃｍ ｐｌａｔｅレーンは、２４穴のプレートに播種した２９３細胞に本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を導入後１０ｃｍプレートに播き直したサンプルを示す。１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ→１０ ｃｍ ｐｌａｔｅレーンは、１２穴のプレートに播種した２９３細胞に本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を導入後１０ｃｍプレートに播き直したサンプルを示す。
ＤＫＦＺＰは、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞の増殖を、Ｅｍｐｔｙ Ｖｅｃｔｏｒは、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞の増殖を示す。
図７は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞内局在を示す写真である。図中、Ｍは、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を導入した２９３細胞から単離したミトコンドリア画分、Ｃはその細胞質画分を示す。上段は抗ＦＬＡＧによるイムノブロッティングの結果、下段は抗ミトコンドリアＨＳＰ７０抗体による結果を示す。
図８は、既存の抗癌剤標的遺伝子と本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現パターンを比較した図である。左図は本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子、中図はＤＨＦＲ遺伝子、右図はＴＳ遺伝子の発現パターンで、それぞれ左から正常大腸組織、大腸癌および胸腺での発現強度が示されている。各ドットは、各臓器サンプルでの強度を示し、バーはそれらの平均値を示す。
図９は、ミトコンドリア１炭素単位代謝系活性化のカスケード仮説を示す図である。βカテニンの活性化に始まり、段階を経て、ミトコンドリアのＣ１単位代謝の活性化が引き起こされることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する場合を意味する。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行）等に記載されている方法に準じて行った場合を意味する。
本願明細書において、「相同性」とは、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて計算される数値を意味する。
本願明細書において、「組織」とは１以上の細胞を含んでいれば良く、単一の細胞も、「組織」の定義に含まれる。
（遺伝子の取得）
本遺伝子に係るＤＮＡは、自体公知のＤＮＡクローニング方法、ＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献６）およびＲＡＣＥ法（非特許文献７）等を利用して、取得され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合には、まず本遺伝子に係るＤＮＡの発現が確認されている適当な起源から全てのＲＮＡを自体公知のＲＮＡ調整法を利用して抽出する。本遺伝子は、ヒト大腸癌組織において正常大腸組織と比較し、その発現が亢進していることより、該起源としてヒト大腸癌組織が例示される。次に、抽出されたＲＮＡから、自体公知の逆転写酵素反応を利用してｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素反応用のプライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等が例示できる。これらのプライマーは、常法に従って合成により得ることができる。合成されたｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの塩基配列に特有なプライマー（センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの２種類のプライマー）を用いて、自体公知のＰＣＲ法を利用して増幅する。ＰＣＲ用のプライマーは、ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により得ることができる。センスプライマーとしては、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡを例示することができる。アンチセンスプライマーとしては、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡを例示することができる。増幅したｃＤＮＡの単離精製は、常法により行うことができる。例えば、ゲル電気泳動法により実施可能である。増幅後、単離精製されたｃＤＮＡとして、本遺伝子に係るＤＮＡを取得することができる。
取得されたＤＮＡの塩基配列は、公知の方法を利用して決定することができる。例えば、ジデオキシ法（非特許文献８）、マクサム・ギルバート法（非特許文献９）を用いて塩基配列を決定することができる。
（遺伝子の機能）
本遺伝子は、ＯＲＦ２９３４ｂｐ、９７８アミノ酸をコードする新規の遺伝子であることが明らかとなった。このうち、１番目から３１番目のアミノ酸配列がミトコンドリアターゲット配列であり、３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質が成熟蛋白質である。
本遺伝子に係るＤＮＡの５´末端部分の一部（以後、Ｎ末端部分ＤＮＡという）が欠落したＤＮＡ（以後、Ｎ末端欠損ＤＮＡという）の塩基配列は、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録され、公開されている（図１）。Ｎ末端欠損ＤＮＡは、既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子に係るＤＮＡと、塩基配列上において高い相同性を有することが分かっている（図２）。
Ｎ末端欠損ＤＮＡと既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子に係るＤＮＡとのアミノ酸配列上における相同性検索の結果、Ｎ末端欠損ＤＮＡは、既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性に対応する既知ヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子上の部分配列のうち、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分配列に対し７５．７％程度の相同性を有し、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼの酵素活性に対応する部分配列に対し３３．２％程度の相同性を有し、５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分配列に対し３３．２％程度の相同性を有することが、明らかとなった。
また、ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログが既に発見されている。ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログ遺伝子と既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子との塩基配列上における相同性検索の結果、ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログ遺伝子は、既知ヒトＣ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性に対応する部分配列のうち、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼの酵素活性に対応する部分配列および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分配列への相同性と比較し、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分配列への相同性が高いことが分かっている。さらに、ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログ遺伝子がコードする蛋白質は、既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性すべてを有していることも、明らかとなっている。
すなわち、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼの酵素活性に対応する部分構造および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分構造は、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分構造に比べ、ＤＮＡ変異等の原因によるアミノ酸配列の変化に対し、活性が失われにくい部分構造であると考えられている。
これらのことより、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質も、Ｃ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性すべてを有していると考えられる。すなわち本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質は、ヒトＣ１−ＴＨＦＳのアイソザイムであると考えられる。
一方、リボソームにおいて合成された蛋白質の中には、Ｎ末端部分に特有のターゲット配列を有しているものがある。それら蛋白質は、ターゲット配列に応じてゴルジ体、ミトコンドリアなどの細胞小器官へ輸送されることがわかっている。ミトコンドリアへ輸送される全ての蛋白質が有するターゲット配列に、アミノ酸配列上のコンセンサスがあるということではない。しかし、ミトコンドリアへ輸送される全ての蛋白質が有するターゲット配列は、共通して、塩基性アミノ酸の含有率が高く、ターゲット配列全体は疎水的であることがわかっている（非特許文献１０）。そこで、本傾向を指標に、アミノ酸配列が明らかな任意の蛋白質がミトコンドリアへ輸送されるためのターゲット配列を有しているか否かを予測することは、可能である。
Ｎ末端ＤＮＡがコードするポリペプチドがターゲット配列を有するか否かを、そのアミノ酸配列から予測した結果、Ｎ末端ＤＮＡがコードするポリペプチドは、ターゲット配列を有していることが明らかとなった。よって、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質は、リボソームにおいて合成された後、ミトコンドリアへ輸送され、さらにミトコンドリアにおいてターゲット配列に係るペプチドが切断され、その結果、ターゲット配列に係るペプチドが除かれたポリペプチドが成熟蛋白質として機能すると考えられる。下記実施例で示すように、配列２のアミノ酸配列の１番目から３１番目のアミノ酸配列がミトコンドリアターゲット配列であることを確認している。
また、本遺伝子に係るＤＮＡをヒト胎児腎臓由来の細胞株にリポソームを用いて導入した結果、導入しない場合と比較し、細胞増殖が促進された。本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質が、Ｃ１−ＴＨＦＳの３種類の酵素活性を有していると予想されることから、細胞増殖促進の結果は、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質が、核酸合成に関与していると考えられる。
本遺伝子に係るＤＮＡは、Ｎ末端欠損ＤＮＡと比較し、Ｎ末端部分ＤＮＡ、すなわち細胞質からミトコンドリアへの移行のためのターゲット配列に係るＤＮＡを含むＤＮＡを有している。このことは、本遺伝子が、既知の細胞質に存在し機能しているヒトＣ１−ＴＨＦＳをコードする遺伝子とは異なり、ミトコンドリア局在性のヒトＣ１−ＴＨＦＳをコードする遺伝子であることを意味している。また、正常大腸組織と比較し大腸癌組織において、本遺伝子の発現が有意に亢進している。以上のことから、本発明はＣ１−ＴＨＦＳの代謝反応のさらなる解明に寄与するものである。また、本遺伝子は、従来のＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子にはない抗癌剤が標的とする蛋白質をコードする遺伝子として、新たな抗癌剤の開発に寄与することができる。
（ＤＮＡ）
本発明に係るＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含むＤＮＡであり、好ましくは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである。
また、本発明に係るＤＮＡには、配列表の配列番号１の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含み、かつ、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素活性、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ活性および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性の３つの活性、および／または、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも含まれ、好ましくは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである。
さらに、本発明に係るＤＮＡには、上記ＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異などを有し、かつ細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも含まれる。該ＤＮＡは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たＤＮＡであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、エキソヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製法、部位特異的突然変異誘発法などが挙げられる。
「１ないし複数」とは、一般には、１個から２０個、好ましくは、１個から１０個、さらに好ましくは、１個から数個である。数個とは、一般には１個から５個、好ましくは、１個から３個、さらに好ましくは、１個から２個である。
本明細書において、上記ＤＮＡを本遺伝子に係るＤＮＡという。
また、本発明に係るＤＮＡには、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、本遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。該ＤＮＡは、その最小単位として好ましくは５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上のヌクレオチド、さらに好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるＤＮＡである。該ＤＮＡは、本発明に係るＤＮＡに固有な塩基配列領域を有することが好ましい。該ＤＮＡは、該ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、自体公知の化学合成方法（参照：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６０（１）巻、第１１５−１２７頁（１９８７））を利用して製造可能である。該ＤＮＡは、本遺伝子に係るＤＮＡを増幅するためのプライマーまたは本遺伝子に係るＤＮＡの検出用プローブなどに用いられる。
本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、本遺伝子に係るＤＮＡのＮ末端および／またはＣ末端に付加配列を有するＤＮＡが挙げられる。かかるＤＮＡがコードする蛋白質が細胞増殖活性および／または前期３種の酵素活性を有する限りにおいて付加配列は限定されない。
また、本発明に係るＤＮＡには、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、本遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つを増幅するためのプライマーおよび／または検出するためのプローブであるＤＮＡも含まれる。該ＤＮＡは、本遺伝子の取得、本遺伝子の転写物量の測定などに用いられる。例えば、該ＤＮＡは、配列表の配列番号３から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡである。例えば、配列表の配列番号３および４に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、本遺伝子に係るＤＮＡの取得の際、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖を増幅するためのプライマーとして用いられる。例えば、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、本遺伝子に係るＤＮＡの断片および該断片ＤＮＡの相補鎖を増幅するためのプライマーならびに本遺伝子に係るＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖を検出するためのプローブとして用いられる。
本明細書において、上記ＤＮＡのうち本遺伝子に係るＤＮＡを除くＤＮＡを本遺伝子等にハイブリダイズするＤＮＡという。
（蛋白質）
本発明の一つの態様は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質、または、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。さらに、本発明に係る蛋白質には、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するＤＮＡがコードする蛋白質であって、細胞増殖促進活性を有する蛋白質も含まれる。
これらの蛋白質は、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。例えば、Ｎ末端やＣ末端に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカー蛋白質を介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化した蛋白質も本発明に含まれる。付加される蛋白質等としては、例えばグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇなどのタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光物質類等が例示できる。これら蛋白質等の付加により、本発明に係る蛋白質の精製、検出を容易にすることが可能となる。
本発明が提供する蛋白質は、該蛋白質をコードするＤＮＡを遺伝子工学的手法により発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または生体生物由来の生物学的試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってよい。
本発明が提供する蛋白質は、該蛋白質の活性を阻害する阻害剤のスクリーニングに有用である。例えば、該蛋白質の活性として、細胞増殖促進活性が挙げられる。
本遺伝子を提供する本発明を完成させることにより、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質を、そのＣ１−ＴＨＦＳ活性を保持したまま、発現させることができる。また、該蛋白質の精製、該蛋白質を標的とした薬剤スクリーニングを可能にすることができる。
一方、本遺伝子に係るＤＮＡは、Ｎ末端欠損ＤＮＡと比較し、Ｎ末端部分ＤＮＡすなわち細胞質からミトコンドリアへの移行のためのターゲット配列に係るＤＮＡおよび構造遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡを有している。よって、仮にＮ末端欠損ＤＮＡを用いて動物細胞等において強制的に該ＤＮＡを発現させた場合、Ｎ末端欠損ＤＮＡは構造遺伝子にかかるＤＮＡを全て含んでいないため、発現させた蛋白質がＣ１−ＴＨＦＳ活性を示さないと考えられる。また、Ｎ末端欠損ＤＮＡはミトコンドリアへの移行のためのターゲット配列に係るＤＮＡを有していないため、発現させた蛋白質が細胞質からミトコンドリアへ移行しそこでＣ１−ＴＨＦＳ活性を呈することも考えにくい。
（組換えベクター）
本発明は一つの態様として、本遺伝子に係るＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。組換えベクターは、本遺伝子に係るＤＮＡ等を適当なベクターＤＮＡに挿入することによって得ることができる。
ベクターＤＮＡは、導入する細胞の種類等により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落したものでもよい。例えば、プラスミド、バクテリアファージおよびウイルス由来のベクターが例示できる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドおよび酵母由来のプラスミドが例示される。バクテリアファージＤＮＡとしては、λファージなどが例示される。ウイルス由来のベクターＤＮＡとしては、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０およびバキュロウイルスなどが例示される。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来のベクターＤＮＡなどが例示される。あるいは、これらを組合わせて作成されるベクターＤＮＡ（コスミドなど）が例示される。組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、選択マーカー等を構成要素とし、これらを自体公知の方法に基づき組合わせて作製される。選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが例示できる。
ベクターＤＮＡに目的の遺伝子を組み込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理して目的の遺伝子を特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的の遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望のベクターが得られる。
後述の実施例に示すｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓ（図３）では、ベクターＤＮＡとして、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製）を用いた。ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓは、平成１５年６月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号として寄託されている。プラスミドＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号も本発明に含まれる。
（形質転換体）
本発明は一つの態様において、本発明に係る組換えベクターを、宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係る蛋白質を提供することが可能である。該形質転換体には、本発明に係るＤＮＡ以外の所望の遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。宿主に導入するベクターＤＮＡは、１種のベクターであってもよいし、２種以上のベクターＤＮＡでもあってもよい。
宿主としては、原核生物および真核生物のいずれをも用いることができる。原核生物としては、大腸菌、枯草菌等が例示できる。真核生物としては酵母、昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞などの動物細胞が例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。より好ましくは、ヒト細胞を用いる。
形質転換は、自体公知の方法を利用して行うことができる。好ましくは、遺伝子の安定性を考慮し、宿主の染色体へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自立複製系を利用する。本発明が提供するＤＮＡの導入は、それ自体公知の方法を利用して行われる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトポレーション法、リポフェクション法が例示できるが、これらの方法に限定されない。導入効率および簡便性の観点から、好ましくはリポフェクション法が挙げられる。なお、後述の実施例では、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓを２９３細胞へリポフェクション法により導入し、形質転換させた結果得られた形質転換体を用いて、本発明に係る蛋白質を発現させた。２９３細胞は、アデノウイルス５型の癌遺伝子Ｅ１でトランスフォームされたヒト胎児腎細胞を意味する。
（蛋白質の製造方法）
本発明は一つの態様において、本発明に係る形質転換体を培養する工程を含む本発明に係る蛋白質の製造方法を提供する。本発明に係る蛋白質の発現は、無細胞蛋白質発現系を用いて行うことができる。その他、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術を用いて、本発明に係る蛋白質を発現させることができる。例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで培養で得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより、本発明に係る蛋白質を製造することができる。本発明に係る形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法を利用して行うことができる。培養は、形質転換体により発現される該蛋白質の細胞増殖促進活性を指標にして実施することができる。また、該蛋白質が有する前記３種類の酵素活性を指標に実施することもできる。これらの酵素活性は、自体公知の方法（非特許文献１８）を用いて測定可能である。あるいは、宿主中または宿主外に産生された該蛋白質量を指標にしてもよい。発現させた蛋白質は、自体公知の精製方法を利用して、精製回収することができる。例えば、分子篩、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の組み合わせにより、精製回収することができる。その他、硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収することができる。好ましくは、本発明に係る蛋白質に対する抗体を作製し、本発明に係る蛋白質の該抗体への特異的な吸着性を利用し、精製回収することができる。
（抗体）
本発明は一つの態様において、本発明に係る蛋白質に対する抗体を提供する。抗体は、本発明に係る蛋白質またはその断片を抗原として用いて作製する。抗原は、該蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。該蛋白質に特異的な抗体を作製するためには、該蛋白質および／またはその断片に固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本発明に係る蛋白質またはその断片に係るアミノ酸配列と同一または相同である必要がなく、該蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上不連続であっても、露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に本発明が提供する蛋白質および／またはその断片を特異的に結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応を利用して決定できる。
抗体は、自体公知の抗体作製方法を利用して、産生される。抗体を産生するためには、本発明が提供する蛋白質またはその断片を、アジュバンドの存在または非存在下で、単独または担体に結合して動物に投与し、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行う。担体は、自身が宿主に対して有害作用を起こさず抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法を利用して取得する。好ましい抗体回収法としては、免疫アフィニティクロマトグラフィー法が例示できる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記免疫手段を施された動物から抗体産生細胞（例えば脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、本発明が提供する蛋白質でおよび／またはその断片を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明が提供する蛋白質の精製用抗体、標識マーカー等として用いることができる。また、該ポリクローナル抗体または該モノクローナル抗体は、直接本発明が提供する蛋白質と結合し、その活性を制御することができる。よって、本発明に係る蛋白質の活性が関与する疾病の治療または／および防止のために有用である。例えば、ヒト正常大腸組織と比較してヒト大腸癌組織において、本遺伝子に係るＤＮＡはその発現が亢進しているため、該ポリクローナル抗体または該モノクローナル抗体は、大腸癌の治療または／および防止に有用である。さらには該ポリクローナル抗体または該モノクローナル抗体は、該蛋白質の標識マーカーとして大腸癌の診断手段を提供することもできる。
（化合物の同定方法）
本発明は一つの態様において、本発明に係る蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法を提供する。該化合物の同定方法は、本発明に係る蛋白質、本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクターまたは本発明に係るプラスミド、本発明に係る形質転換体および本発明に係る抗体のうちすくなくともいずれか１つを用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本発明に係る同定方法により、該蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別または該抗体を利用した抗体認識物質の選別などが可能である。該同定方法により同定された化合物は、本発明に係る蛋白質の活性が関与する疾病の治療または／および防止のために有用である。ヒト正常大腸組織と比較してヒト大腸癌組織において本遺伝子に係るＤＮＡはその発現が亢進している。よって、該化合物は大腸癌の治療または／および防止などに有用である。
例えば、本発明に係る蛋白質の細胞増殖促進活性を測定する実験系において、該蛋白質と被検化合物の相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質と被検化合物とを共存させて該活性を測定する。ついで、被検化合物の非共存下での測定結果との比較における該活性の存在、非存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現などを検出することにより、該蛋白質の該活性を阻害する化合物を同定可能である。活性の測定は、活性の直接的な検出により行うこともできるし、例えば活性の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施可能である。シグナルとして、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇなどのタグペプチド類等を用いることができる。
披検化合物を共存させた場合の該蛋白質の該活性を、被検化合物を共存させなかった場合の該蛋白質の該活性と比較することにより、該披検化合物が該活性に及ぼす効果を測定することができる。該披検化合物を共存させた場合の該活性が、該披検化合物を共存させなかった場合の該蛋白質の該活性と比較して低減した場合には、該披検化合物には該蛋白質の活性を阻害する作用があると判定できる。
一例として、本発明に係る蛋白質の細胞増殖促進活性を指標にして、該活性に影響を与え得る化合物を選別することができる。該細胞増殖促進活性は、本発明に係る蛋白質が発現する細胞を培養し、培養後に増殖した細胞数を計測することで定量化が可能である。細胞数は、バイオレッド、ニュートラルレッド等を用いて、生細胞を染色することにより計測され得る。また、生細胞による放射標識されたチミジンの取り込みを指標に、細胞数を計測することも可能である。
（大腸癌の判定方法）
また、本発明は一つの態様において、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、ある組織における本遺伝子に係るＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする判定方法を提供する。すなわち、本遺伝子に係るＤＮＡは、大腸癌組織において正常大腸組織と比較し、有意にその発現が亢進している。よって、本遺伝子に係るＤＮＡの発現量を指標に、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定することが可能である。
披検試料としては、本発明で提供される遺伝子および／またはその変異遺伝子の核酸および／または核酸断片を含むものである限り制限されない。例えば大腸組織細胞、大腸組織生検などの生体生物由来の生物学的試料を披検試料として例示できる。該核酸として、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ，該ＤＮＡの相補鎖、本遺伝子に係るＤＮＡの断片、該断片ＤＮＡの相補鎖およびこれらＤＮＡが転写されてなるＲＮＡなどが例示される。披検試料は、試料中に含まれる核酸の検出を容易ならしめる種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングなどの方法を用いて調製され得る。
該核酸の検出および該核酸量の測定は、自体公知の遺伝子検出方法および測定方法を利用して行い得る。該検出方法として、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノザンブロット法などが例示される。該測定方法として、ノザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法および分光分析法などが例示される。例えば、次の工程により本遺伝子に係るＤＮＡの発現量を測定することが可能である。
（ｉ）ある組織に含まれるＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行う工程、（ｉｉ）逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
および（ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの量を測定する工程。
該検出方法においては、本発明に係る遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／または該遺伝子に係るＤＮＡの増幅の実施に、本遺伝子に係るＤＮＡまたは該ＤＮＡの相補鎖の断片であってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するＤＮＡ断片とは、本遺伝子に係るＤＮＡのみに特異的にハイブリダイゼーションできるＤＮＡを意味する。プライマーとしての性質を有するものは、本遺伝子に係るＤＮＡのみを特異的に増幅できるＤＮＡを意味する。プローブまたはプライマーとしては、塩基配列長が一般的に５ないし５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０ないし３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５ないし３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。一般的に、プローブは標識されたものを用いるが、非標識であってもよい。適当な標識としては、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体などが例示できる。プローブを標識する方法は、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法などを例示することができる。例えば、該プローブおよび／またはプライマーとして、本発明に係るポリヌクレオチドが例示される。
また、上記同定方法における発現量は、対照である正常大腸由来組織における本遺伝子に係るＤＮＡの発現量と比較し、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは８倍以上である場合に、ある組織が大腸癌由来組織であると判定することが可能である。後述の実施例において、大腸癌細胞における該ＤＮＡの発現量は正常大腸細胞における該ＤＮＡの発現量のおよそ２．３８倍であった。
（大腸癌の判定キット）
また、本発明は一つの態様において、本遺伝子等にハイブリダイズするＤＮＡおよび本発明に係る抗体のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸癌の判定キットを提供する。例えば、ヒト大腸癌組織においてヒト正常大腸組織と比較して本遺伝子に係るＤＮＡの発現の亢進が見られることから、被検組織における該ＤＮＡの発現産物を、本発明に係る大腸癌の判定キットに含有されるＤＮＡをプローブとして用いることにより検出し、該ＤＮＡの発現量を測定することにより、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定することが可能である。該判定キットには、緩衝液、塩、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、本遺伝子等にハイブリダイズするＤＮＡおよび該抗体の性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。
（大腸癌の防止剤および／または治療剤）
本発明は一つの態様において、本発明に係る蛋白質の阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤を提供する。本発明に係る蛋白質の阻害剤としては、本発明に係る抗体および本発明に係る化合物の同定方法により同定された化合物が例示される。大腸癌細胞において本遺伝子にかかるＤＮＡの発現が正常大腸細胞と比較し亢進しているため、本発明に係る蛋白質の阻害剤は大腸癌の防止および／または治療に有用である。
医薬の製造には、１種または２種以上の医薬用担体を用いることが好ましい。本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％の範囲とするのが適当である。
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤や賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択される。
例えば、水、医薬に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
所望により、通常の製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調整することもできる。
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などのいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセスロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれでも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などが包含される。
緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩）などを例示できる。
等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。
キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調整した後に使用することも可能である。
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、本発明の医薬組成物の有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用有無等）および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。
一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは０．１μｇから１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて、これらの用量の変更を行うことができる．上記投与量は、１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与しても良い．
処方は投与形態に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られたものを用いればよい。また、処方するときには、これらを単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他の抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。
投与形態は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与形態を選択する。例えば、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等に投与することもできる。大腸癌組織に直接投与することもできる。
医薬形状は投与形態に応じて選択することができ、遺伝子治療剤、シクロデキストリン等の包接体、溶液剤、けん濁剤、脂肪乳剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤等の作製も可能である。しかし、本発明の医薬の形態は、これに限定されない。
製剤化にあたっては、その形態に応じて適切な製剤用添加物を用いることができ、常法に従って製剤化することができる。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、目的とする物質を溶媒に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
シクロデキストリン包接化は、例えば目的とする物質を溶媒に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
注射用の溶液剤は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
けん濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
脂肪乳剤化は、例えば目的とする物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に。必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これらを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブトウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
散剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸入剤、経粘膜吸収剤等についても、通常用いられる方法により調製可能である。
【実施例】
以下、実施例により本発明についてさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（正常大腸細胞と比較し、大腸癌細胞において発現が亢進している遺伝子の同定）
正常細胞と比較し、癌細胞において発現が亢進している遺伝子は、バイオエクスプレス（Ｇｅｎｅｌｏｇｉｃ社）のマイクロアレイデータベースを利用して、同定された。マイクロアレイデータベースには、正常大腸組織細胞１１７サンプル、大腸癌細胞７７サンプルの各細胞内の発現プロファイルデータが含まれている。発現プロファイルデータはアフィメトリクスヒト遺伝子オリゴチップＨＧ−Ｕ１３３を用いた各細胞内の発現データベースとして格納されている。正常大腸組織細胞内での発現量よりも大腸癌細胞内での発現量が多い遺伝子のうち、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に遺伝子の全長の塩基配列が登録されていない本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を同定した。１１７サンプルの正常大腸組織細胞内における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現平均量に対する７７サンプルの大腸癌細胞内における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現平均量の比は、約２．３８となった。有意水準は、０．００００００１未満であった。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量の比を他の癌細胞において同様に調査した結果、乳癌の場合には約１．２２（有意水準０．００２４３）、肺癌の場合には約１．５２（有意水準０．００００００１未満）、胃癌の場合には約１．９８（有意水準０．００００３）、膵癌の場合には約１．３７（有意水準０．００１９）の発現量の比を示した。
（遺伝子の取得）
マイクロアレイデータベースのプローブ配列情報に相当する遺伝子として、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）中には、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のＮ末端欠損ＤＮＡの塩基配列が登録されていた。よって、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のＮ末端ＤＮＡの塩基配列は、不明であった。
そこで、本発明で提供されるＤＮＡの全長配列を次のように決定した。まず、本発明で提供されるＤＮＡの全長配列を推定した。最初に、Ｎ末端欠損ＤＮＡの５´末端３０ポリヌクレオチドに係る塩基配列をクエリーとして、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に対し相同性検索を行った。検索の結果、ヒトゲノムＤＮＡ断片（アクセッション番号、ＡＬ０３５０８６）と高い相同性を示した。ヒトゲノムＤＮＡ断片の塩基配列のうち、Ｎ末端欠損ＤＮＡの塩基配列と相同性を有する部分配列を除いて得られる塩基配列（以後、塩基配列Ａという）を対象として、塩基配列Ａに含まれる開始コドンのうち最も５’末端に近く存在する開始コドンを同定し、塩基配列Ａのうち該開始コドン以降の部分配列（以後、推定Ｎ末端塩基配列という）を同定した。推定Ｎ末端塩基配列の配列長は、１８３であり、６１アミノ酸をコードする部分配列であることが推定された。さらに、Ｎ末端欠損ＤＮＡの塩基配列をアミノ酸配列に変換したものをクエリーに、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に対して相同性検索を行った。その結果、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のマウスオルソログと推察される遺伝子に係るＤＮＡと高い相同性を示した。該ＤＮＡの５‘末端部分配列（配列長１８３）をアミノ酸配列に変換したものと、推定Ｎ末端塩基配列をアミノ酸配列に変換したものとで相同性検索を行ったところ、良好な相同性（５６．１％）を示した。よって、推定Ｎ末端塩基配列は、Ｎ末端部分ＤＮＡの塩基配列であることが推定された。
さらに、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のｃＤＮＡクローニングを行った。センスプライマーとして配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを、アンチセンスセンスプライマーとして配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用した。鋳型は、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用いた。ＰＣＲ増幅反応は、９４℃２分間、９４℃３０秒、６８℃４分を４０サイクル行い、続いて６８℃３分間処理を行った。得られた増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯＶｅｃｔｏｒ（東洋紡社）へライゲーションした。得られた組換えベクター（以後、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒという）に含まれる本遺伝子に係るＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ Ｔｏｗｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行った。その結果、本遺伝子にかかるＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列であることが判明した。
（正常大腸細胞および大腸癌細胞内における発現量比較）
正常大腸細胞における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の転写産物量が、大腸癌細胞における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の転写産物量よりも少ないことを、以下の手順で確認した。まず、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６及びＳＷ６２０を大日本製薬より購入し、両細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、岩城硝子社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。一方、正常大腸上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、該細胞をＡＣＬ−４無血清培地で培養した。これらの細胞から、アイソゲン（日本ジーン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡから、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ社）Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて３０℃１０分、４２℃３０分、９９℃５分、５℃５分の条件の下、逆転写反応を行った。次に逆転写反応で得られたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅反応を行った。反応は、得られたｃＤＮＡの１／１０が溶解している溶液に、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーを加えて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて行った。反応条件は、９４℃１．５分、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル、最後に７２℃３分処理とした。反応液を１％アガロースゲルに供与し、電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド染色により、ＰＣＲ増幅産物を検出した。
対照として、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素の発現を、同様の方法で、検出した。その結果、対照のグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素の発現量については、正常大腸細胞および大腸癌細胞間で有意な差異は認められなかった。しかし、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量については、大腸癌細胞内における発現量が正常大腸細胞内における発現量よりも多いことが明らかとなった（図４）。
（蛋白質の取得）
本遺伝子に係るＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを導入した動物細胞を培養することにより、本遺伝子がコードする蛋白質を発現させ、その分子量を、ウエスタンブロット法を用いて測定した。発現ベクターとして、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ＶｅｃｔｏｒをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し得られたＤＮＡフラグメントと、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒとを混合し、本遺伝子に係るＤＮＡ（以後、ｈＣ１Ｓという）を組み込んだ発現ベクター（以後、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒという）を得た。動物細胞には、２９３細胞を用いた。まず、１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２９３細胞をサブコンフルエント状態に至るまで、培養した。培養後、培地をオプティＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に交換した。交換後、４μｇの本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、リポフェクション法により、２９３細胞に導入した。対照として本遺伝子が組み込まれていないｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、リポフェクション法により、２９３細胞に導入した。
導入時から５時間経過後、遺伝子導入された細胞の培養液に２０％ ＦＣＳ含有オプティＭＥＭＩ培地を、培養液の最終血清濃度が１０％になるように、加えた。更に翌日、遺伝子導入された細胞の培地を１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。遺伝子導入時から４８時間経過後、細胞を溶解するための溶液（１％ トリトンＸ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡフリー、ロッシュ社）を加え、遺伝子導入された細胞を溶解した。氷冷下３０分間放置した後、溶液（以後、溶解後溶液という）を回収、遠心処理（１５０００回転、１５分間）した。遠心処理後、上清にＢＳＡ処理ＩｇＧアガロースゲル（シグマ）を加え、一晩４℃で放置した。翌日、上清に抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲル（シグマ社）を加え、３．５時間４℃で抗原抗体反応させた後、洗浄液（０．１％ トリトンＸ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回、リン酸緩衝液で１回洗浄した。抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲルと結合した蛋白質は、１０％ ２−メルカプトエタノール含有サンプル緩衝液で回収した。回収溶液ならびに溶解後溶液を、４−２０％ＳＤＳゲルに供与し、電気泳動を行った。泳動後、泳動産物をニトロセルロースフィルター（Ｓｃｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｈｃｕｅｌｌ社）へ転写した。転写後、ＢＳＡブロッキングを行い、抗ＦＬＡＧＭ２抗体（シグマ社）および過酸化水素脱水素酵素で標識された抗マウスＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と泳動産物を反応させ、４−クロロ−１−ナフトールで発色させた。免疫沈降させずに溶解後溶液を直接用いた場合には、本発明で提供される蛋白質を検出することができなかった。しかし、抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲルで免疫沈降させた場合には、本発明で提供される蛋白質を、検出できた。検出の結果、本発明で提供される蛋白質の分子量は、約１１０ｋＤａであることが明らかとなった（図５）。
（本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞増殖促進活性）
２４および１２穴のプレート上に、１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて２９３細胞を播種し、サブコンフルエント状態になるまで培養を行った。培養後、０．４μｇ（２４穴）あるいは０．７μｇ（１２穴）の本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、２９３細胞へ導入した。対照として本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子が組み込まれていないｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、２９３細胞へ導入した。翌日、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中、１０ｃｍプレートに巻きなおし、Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように、追加した。１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含んだ培地を３ないし４日ごとに交換し、１０−１４日間培養することによりコロニーを形成させた。形成したコロニーを０．２％クリスタルバイオレットで染色した。その結果、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を細胞に導入し、強制発現させると、細胞増殖促進させることがわかった。この結果は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質が、細胞増殖促進活性を有することを示すものである（図６）。
（本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞内局在性）
本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞内での局在を以下の手順で決定した。１０ｃｍプレートでサブコンフルエント状態の２９３細胞に前述の方法で、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えベクター、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４、を導入した。４８時間後、細胞を０．５ｍｌのミトコンドリア単離緩衝液（ＭＩＢ；２００ｍＭマンニトール、７０ｍＭスクロース、３５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ リン酸カリウム、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡフリー、ｐＨ７．３）中に回収した。細胞をホモジナイザーで破砕懸濁した後、６００ｇ ４°Ｃで２回迷心沈殿を行った。上清をさらに１５０００ｒｐｍ ４°Ｃで２０分間遠心した。上清（細胞質分画）、沈殿（ミトコンドリア分画）おのおの、最初の懸濁液の１／５相当量を抗ＦＬＡＧ抗体を用いた前述のウエスタンブロット、あるいは抗ミトコンドリアＨＳＰ７０抗体（１／５００希釈、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ）を用いたウエスタンブロットに供した。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質と思われるバンドはミトコンドリア分画にだけ検出され、本遺伝子の配列分析から予測されたミトコンドリア局在性を示した（図７上段）。また、抗ミトコンドリアＨＳＰ７０もミトコンドリア分画にのみ検出され、分画実験操作の妥当性は証明された（図７下段）。
（本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質のシグナルペプチド切断部位）
前述の方法で、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質を２９３細胞で発現し、抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲルにより精製し、４−２０％ＳＤＳゲル電気泳動で分離した。その後、ゲル内の蛋白質をＰＶＤＦ膜（ファルマシア）に転写し、クマジーＲ２５０液で染色した。１１０Ｋｄａ付近のバンドで示され、かつ本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質と考えられる蛋白質のＮ末を東レリサーチセンターで決定した。結果はＳＳＧＧＧであり、予想通り、ミトコンドリアターゲット配列と考えられた位置（配列表２の３１番目Ａｌａと３２番目Ｓｅｒの間）で切断されていた。
（発現パターンに基づく、ＤＨＦＲ、ＴＳなど既存の抗癌剤標的に対し、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の標的としての優位性）
既存の抗癌剤標的であるジヒドロ化葉酸還元化酵素（ＤＨＦＲ：メトトレキセートの標的）、チミジル酸合成酵素（ＴＳ：５−フルオロウリジンの標的）と本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子間で、ヒト臓器における発現パターンをバイオエクスプレスのマイクロアレイデータベースを用いて比較した（図８）。正常大腸組織と比べ、大腸癌における発現強度はＤＨＦＲ遺伝子で１．１倍、ＴＳ遺伝子で１．５倍の上昇であった。一方、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子は前述の通り２．３８倍発現が亢進していた。さらに、増殖細胞を多く抱える正常組織、胸腺に注目すると、ここでのＤＨＦＲ遺伝子の発現は、正常大腸組織に対し２．５倍という値であった。同様に、ＴＳ遺伝子の胸腺での発現は５．５倍の値であった。胸腺でこれらの遺伝子の発現が高いために、これら遺伝子を標的とする抗癌剤、メトトレキセートや５−フルオロウリジンの副作用が発現しやすくなっていると考えられる。ところが、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現は、胸腺でも正常大腸組織での１．４倍という値であった。このように、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子は癌組織で発現が亢進している上に、通常増殖に関与する遺伝子（例えばＤＨＦＲやＴＳ遺伝子）の発現が上昇する、胸腺のような組織においても、顕著な高発現がみられない。従って、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子は、ここで比較した他の２種の抗癌剤標的よりも、副作用の少ない抗がん剤の提供などの点において有利な抗癌剤標的とみなせる。
（大腸癌の発癌過程における、Ｗｎｔ経路を通したミトコンドリアでのＣ１代謝の活性化と本発明の遺伝子の有用性）
大腸癌の場合、ポリープ状の前がん状態からβカテニンによる遺伝子発現撹乱により癌状態へ移行することで発癌すると考えられている（非特許文献１１）。Ｗｎｔ遺伝子シグナル経路の活性化を引き起こす変異、換言すればＡＰＣ遺伝子を不活性化する、あるいはβカテニンを活性化するような変異は、βカテニンの核内蓄積をもたらし、ひいてはβカテニンと転写因子Ｔｃｆ／ＬＥＦの複合体を形成させる。約９０％の大腸癌でＷｎｔ遺伝子シグナル経路の活性化を引き起こす変異がみられることが知られている（非特許文献１２）。このβカテニン経路の標的遺伝子のひとつとしてｃ−ｍｙｃ癌遺伝子が存在する（非特許文献１３）。ｍｙｃは細胞増殖、分化、アポトーシスに関わる重要な転写因子であるが（非特許文献１４）、詳細なメカニズムは未だ詳らかではない。最近、ミトコンドリアセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｍｔＳＨＭＴ）がｍｙｃの標的遺伝子であることが明らかとなってきたが（非特許文献１５、１６）、この遺伝子産物はセリンとテトラヒドロ葉酸からグリシンと５，１０メチレンテトラ葉酸を合成する反応およびその逆反応を触媒し、Ｃ１−ＴＨＦＳとともに１炭素単位代謝に関わっている。また、他の研究において、マウスでｃ−ｍｙｃが転写を引き起こす遺伝子としてＵ０６６６５というクローンが同定されてきたが（非特許文献１７）、この遺伝子は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のマウスオルソログの一部であることが発明者の分析により明らかとなった。こういった事実を総合的に考えてみると、ミトコンドリアという同じ細胞内部位で、しかも一つの代謝経路中で協力している遺伝子群が、協調的な遺伝子の制御下にあると考えるのはたいへん理にかなったことといえる。そこで、発明者は、Ｗｎｔシグナル経路が活性化することでミトコンドリアの炭素単位代謝が活性化される現象が大腸癌の発癌過程で重要な役目を担っていると考えている（図９）。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子はこの過程の根幹をなす遺伝子といえ、それゆえ、抗癌剤標的となりうる（非特許文献２０）。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００３年９月３０日出願の日本特許出願（特願２００３−３４１２４５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明は、癌細胞において正常細胞と比較し発現が亢進している新規Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子を提供するものである。本遺伝子に係るＤＮＡは、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードする。本特性を利用した新規医薬組成物、診断手段の提供は、大腸癌の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１： （１）：（２９３４）本蛋白質全長をコードする領域
配列番号１： （１）：（１８３） Ｎ末端部分ＤＮＡ
配列番号１： （１８４）：（２９３４） Ｎ末端欠損ＤＮＡ
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、テトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子、該遺伝子に係るＤＮＡ、該ＤＮＡがコードする蛋白質に関する。また、該ＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡに関する。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有する組換えベクター、該ベクターを含有する形質転換体、該形質転換体を用いた該蛋白質の製造方法、該蛋白質に対する抗体に関する。また、該蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法に関する。また、該蛋白質の阻害剤を含んでなる癌の防止剤および／または治療剤に関する。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡおよび／または該抗体を含有する大腸癌の判定キットに関する。
【背景技術】
テトラヒドロ葉酸合成酵素（以後、Ｃ１−ＴＨＦＳという）は、様々な代謝反応に必要なＣ１基を供与するテトラヒドロ葉酸誘導体を合成する酵素である（非特許文献１、以後、テトラヒドロ葉酸をＴＦとテトラヒドロ葉酸誘導体をＴＦ誘導体という）。具体的にはＴＦ誘導体は、プリン、チミジル酸、ヒスチジンおよびパントテン酸等の生合成反応にＣ１基を供与する。すなわちＴＦおよびＴＦ誘導体は、核酸代謝およびアミノ酸代謝等に深く関与している。そのためＴＦおよびＴＦ誘導体は、細胞分裂が盛んな組織に多くみられ、細胞増殖および成長に不可欠である。
Ｃ１−ＴＨＦＳは、３種の機能を有するトリ酵素である。具体的には、Ｃ１−ＴＨＦＳは、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素（１０−ｆｏｒｍｙｌ−ＴＨＦ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＥＣ ６．３．４．３）、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（５，１０−ｍｅｔｈｅｎｙｌ−ＴＨＦ ｃｙｃｌｏｈｙｒｏｌａｓｅ、ＥＣ ３．５．４．９）および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（５，１０−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ＴＨＦ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ １．５．１．５）の機能を有する。Ｃ１−ＴＨＦＳは、これらの機能を発揮することにより、様々な代謝反応に必要なＴＦ誘導体の合成を促進する。
Ｃ１−ＴＨＦＳは、ヒト、マウス、酵母等の真核生物、大腸菌等の原核生物など様々な生物種を対象に、その解析が進められている（非特許文献２−５）。酵母については、その細胞質およびミトコンドリアに存在し機能するＣ１−ＴＨＦＳの存在が知られている。また、ヒトについては、その細胞の細胞質に存在し機能するＣ１−ＴＨＦＳが知られている。
しかし、ヒトについてその細胞のミトコンドリアに存在し機能するＣ１−ＴＨＦＳは知られておらず、唯一、非特許文献１９の報告があるのみである。また大腸癌組織において正常大腸組織と比較し発現が亢進するヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子も知られていない。
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
【非特許文献１】 ハム（Ｈｕｍ ＤＷ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８８年、第２６３巻、第３１号、ｐ．１５９４６−１５９５０。
【非特許文献２】 スタベン（Ｓｔａｂｅｎ，Ｃ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８４年、第２６１巻、ｐ．４６２９−４６３７。
【非特許文献３】 シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｋ．Ｗ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８６年、第２６１巻、ｐ．１２２６６−１２２７１。
【非特許文献４】 シグペン（Ｔｈｉｇｐｅｎ、Ａ．Ｅ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９０年、第２６５巻、ｐ．７９０７−７９１３。
【非特許文献５】 デブ（Ｄｅｖ，Ｉ．Ｋ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９７８年、第２５３巻、ｐ．４２４５−４２５３。
【非特許文献６】 ラジら（Ｒａｊ ＳＫら）「バイオケミストリ アンド モレキュラ バイオロジ インターナショナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」、第４４巻、第１号、ｐ．８９−９５。
【非特許文献７】 フローマンら（Ｆｒｏｈｍａｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２。
【非特許文献８】 「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７。
【非特許文献９】 「メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５、ｐ．４９９−。
【非特許文献１０】 クラロス（Ｃｌａｒｏｓ ＭＧ）ら、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９６年、第２４１巻、第３号、ｐ．７７９−７８６。
【非特許文献１１】 キム（Ｋｉｍ ＰＪ）ら、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」 ２００３年、第３６２巻、ｐ．２０５−２０９。
【非特許文献１２】 ギルズ（Ｒ．Ｈ．Ｇｉｌｅｓ）ら、「バイオシミカ イト バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，２００３年、第１６５３巻、ｐ．１−２４。
【非特許文献１３】 ヘイ（Ｈｅ ＴＣ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９８年、第１２８巻、ｐ．１５０９−１５１５。
【非特許文献１４】 レベンス（Ｌｅｖｅｎｓ ＤＬ）、「ジーンズ アンド デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，２００３年、第１７号、ｐ．１０７１−１０７７。
【非特許文献１５】 ガロウ（Ｇａｒｒｏｗ ＴＡ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９３年、第２６８巻、ｐ．１１９１０−１１９１６。
【非特許文献１６】 ニキフォロフ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ＭＡ）ら、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２２巻、ｐ．５７９３−５８００。
【非特許文献１７】 タブチジアン（Ｔａｖｔｉｇｉａｎ ＳＶ）ら、「モレキュラー バイオロジー オブ ザ セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙａｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ）」、１９９４年、第５巻、ｐ．３７５−３８８。
【非特許文献１８】 ビラー（Ｖｉｌｌａｒ Ｅ）「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８５年、第２６０巻、第４号、ｐ．２２４５−２２５２
【非特許文献１９】 プラサンナン（Ｐｒａｓａｎｎａｎ Ｐ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、第４４号、ｐ．４３１７８−４３１８７。
【非特許文献２０】 杉浦ら、「バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．）２００４年、第３１５巻、第１号、ｐ．２０４−２１１）
【発明の開示】
本発明が解決しようとする課題は、新規Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子に係るＤＮＡおよび該ＤＮＡがコードする蛋白質を見出して提供することである。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡを提供することも課題に含まれる。また、該遺伝子に係るＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターを用いて形質転換させてなる形質転換体、該蛋白質に対する抗体、該蛋白質の製造方法および該蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法を提供することも課題に含まれる。さらに、該遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、該遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡおよび／または該抗体を含有する大腸癌の判定キットおよびある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法を提供することも課題に含まれる。また、大腸癌の防止剤および／または治療剤を提供することも課題に含まれる。
本発明者らは上記課題のために鋭意努力し、新規Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子を見出し、該遺伝子に係るＤＮＡを用いて新規Ｃ１−ＴＨＦＳを取得することに成功した。そして、該ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、該Ｃ１−ＴＨＦＳが、細胞質からミトコンドリアに移行し、ミトコンドリアにおいて機能することを見出した。また、該Ｃ１−ＴＨＦＳが細胞増殖促進活性を有することを実証した。さらに、該Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子の発現が、大腸癌組織において正常大腸組織と比較し有意に亢進することを実証して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含み、かつ、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素活性、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ活性および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性の３つの活性、および／または、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである、（２）に記載のＤＮＡ。
（４） （１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加された塩基配列を有し、かつ細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（５） （１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（６） 以下の群より選ばれるＤＮＡであって、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つを増幅するためのプライマーおよび／または検出するためのプローブである（５）に記載のＤＮＡ；
（ｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ
および
（ｉｖ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
（７） （１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（８） プラスミドＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号。
（９） （７）に記載の組換えベクターまたは（８）に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体。
（１０） 以下の（ａ）から（ｂ）のいずれかの蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
（１１） （４）に記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
（１２） （７）に記載の組換えベクターまたは（８）に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、（１０）または（１１）に記載の蛋白質の製造方法。
（１３） （１０）または（１１）に記載の蛋白質または該蛋白質の断片を抗原とする抗体。
（１４） （１０）または（１１）に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と（１０）または（１１）に記載の蛋白質との相互作用を可能にする条件下で、細胞増殖促進活性の存在、非存在または変化を検出することにより、該化合物が（１０）または（１１）に記載の蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
（１５） （１０）または（１１）に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、（１０）または（１１）に記載の蛋白質、（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡ、（５）または（６）に記載のＤＮＡ、（７）に記載の組換えベクターまたは（８）に記載のプラスミド、（９）に記載の形質転換体および（１３）に記載の抗体のうちすくなくともいずれか１つを用いることを特徴とする同定方法。
（１６） ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、ある組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
（１７） （１６）に記載の判定方法であって、ある組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量が、対照である正常大腸由来組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量の３倍以上である場合に、ある組織が大腸癌由来組織であると判定することを特徴とする判定方法。
（１８） （１７）に記載の判定方法であって、ある組織における（１）から（４）のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を以下の工程により測定することを特徴とする判定方法；
（ｉ）ある組織に含まれるＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行う工程、
（ｉｉ）逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程および
（ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの量を測定する工程。
（１９） （５）または（６）に記載のＤＮＡおよび（１３）に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸癌の判定キットであって、（１６）から（１８）のいずれか１項に記載の判定方法に用いることを特徴とする大腸癌の判定キット。
（２０） （１０）または（１１）に記載の蛋白質の阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のｃＤＮＡおよび該遺伝子がコードする蛋白質の一次構造を示す図である。上段にｃＤＮＡ、下段に蛋白質の一次構造を示す。
ＮＤはＮ末端部分ＤＮＡを、ＮＴは、Ｎ末端欠損ＤＮＡを、ＳＰはターゲット配列（シグナルペプチド）を示す。
図２は、ヒトＣ１−ＴＨＦＳ（Ｈｕｍａｎ Ｃ−１ ｔｅｒｔａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）および本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子（ＤＫＦＺＰ）の一次構造を示す。Ｄ／Ｃ ドメインは、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼおよび５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分構造を意味する。Ｓ ドメインは、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分構造を意味する。
図３は、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓの構造を示す図である。図中、ＢａｍＨＩ６８７およびＸｈｏＩ３６３０は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの認識部位を示す。ＣＭＶプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター領域、Ｎｅｏ ｒ／Ｋａｎ ｒは、ネオマイシンおよびカナマイシン耐性遺伝子部位を示す。ｈＣ１Ｓは，本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の挿入部位を示す。
図４は、正常大腸細胞および大腸癌細胞内における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量を示す写真である。上段に本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量、下段に対照であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素遺伝子の発現量を示す。
１は大腸癌細胞ＨＣＴ１１６、２は大腸癌細胞ＳＷ６２０、３は正常大腸細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮを表す。ＤＫＦＺＰは、本発明で提供される遺伝子の発現量を、ＧＡＰＤＨは、グリセリンアルデヒド三リン酸脱水素酵素の発現量を示す。
図５は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の発現を確認したウエスタンブロッティングの結果の写真である。図中、ｌｙｓａｔｅは２９３細胞の溶解溶液のサンプルであること、ＩＰＰは２９３細胞の溶解溶液中で抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降させた後の沈降物のサンプルであることを示す。
−は、遺伝子導入されない動物細胞由来のサンプル、Ｅは、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞由来のサンプル、ＦＬは、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞由来のサンプルを示す。
図６は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子によりコードされる蛋白質が、細胞増殖を促進することを示す写真である。２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ→１０ ｃｍ ｐｌａｔｅレーンは、２４穴のプレートに播種した２９３細胞に本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を導入後１０ｃｍプレートに播き直したサンプルを示す。１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ→１０ ｃｍ ｐｌａｔｅレーンは、１２穴のプレートに播種した２９３細胞に本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を導入後１０ｃｍプレートに播き直したサンプルを示す。
ＤＫＦＺＰは、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞の増殖を、Ｅｍｐｔｙ Ｖｅｃｔｏｒは、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ｖｅｃｔｏｒが導入された動物細胞の増殖を示す。
図７は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞内局在を示す写真である。図中、Ｍは、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を導入した２９３細胞から単離したミトコンドリア画分、Ｃはその細胞質画分を示す。上段は抗ＦＬＡＧによるイムノブロッティングの結果、下段は抗ミトコンドリアＨＳＰ７０抗体による結果を示す。
図８は、既存の抗癌剤標的遺伝子と本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現パターンを比較した図である。左図は本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子、中図はＤＨＦＲ遺伝子、右図はＴＳ遺伝子の発現パターンで、それぞれ左から正常大腸組織、大腸癌および胸腺での発現強度が示されている。各ドットは、各臓器サンプルでの強度を示し、バーはそれらの平均値を示す。
図９は、ミトコンドリア１炭素単位代謝系活性化のカスケード仮説を示す図である。βカテニンの活性化に始まり、段階を経て、ミトコンドリアのＣ１単位代謝の活性化が引き起こされることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する場合を意味する。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行）等に記載されている方法に準じて行った場合を意味する。
本願明細書において、「相同性」とは、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて計算される数値を意味する。
本願明細書において、「組織」とは１以上の細胞を含んでいれば良く、単一の細胞も、「組織」の定義に含まれる。
（遺伝子の取得）
本遺伝子に係るＤＮＡは、自体公知のＤＮＡクローニング方法、ＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献６）およびＲＡＣＥ法（非特許文献７）等を利用して、取得され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合には、まず本遺伝子に係るＤＮＡの発現が確認されている適当な起源から全てのＲＮＡを自体公知のＲＮＡ調整法を利用して抽出する。本遺伝子は、ヒト大腸癌組織において正常大腸組織と比較し、その発現が亢進していることより、該起源としてヒト大腸癌組織が例示される。次に、抽出されたＲＮＡから、自体公知の逆転写酵素反応を利用してｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素反応用のプライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー等が例示できる。これらのプライマーは、常法に従って合成により得ることができる。合成されたｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの塩基配列に特有なプライマー（センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの２種類のプライマー）を用いて、自体公知のＰＣＲ法を利用して増幅する。ＰＣＲ用のプライマーは、ｃＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により得ることができる。センスプライマーとしては、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡを例示することができる。アンチセンスプライマーとしては、配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡを例示することができる。増幅したｃＤＮＡの単離精製は、常法により行うことができる。例えば、ゲル電気泳動法により実施可能である。増幅後、単離精製されたｃＤＮＡとして、本遺伝子に係るＤＮＡを取得することができる。
取得されたＤＮＡの塩基配列は、公知の方法を利用して決定することができる。例えば、ジデオキシ法（非特許文献８）、マクサム・ギルバート法（非特許文献９）を用いて塩基配列を決定することができる。
（遺伝子の機能）
本遺伝子は、ＯＲＦ２９３４ｂｐ、９７８アミノ酸をコードする新規の遺伝子であることが明らかとなった。このうち、１番目から３１番目のアミノ酸配列がミトコンドリアターゲット配列であり、３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質が成熟蛋白質である。
本遺伝子に係るＤＮＡの５´末端部分の一部（以後、Ｎ末端部分ＤＮＡという）が欠落したＤＮＡ（以後、Ｎ末端欠損ＤＮＡという）の塩基配列は、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に登録され、公開されている（図１）。Ｎ末端欠損ＤＮＡは、既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子に係るＤＮＡと、塩基配列上において高い相同性を有することが分かっている（図２）。
Ｎ末端欠損ＤＮＡと既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子に係るＤＮＡとのアミノ酸配列上における相同性検索の結果、Ｎ末端欠損ＤＮＡは、既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性に対応する既知ヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子上の部分配列のうち、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分配列に対し７５．７％程度の相同性を有し、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼの酵素活性に対応する部分配列に対し３３．２％程度の相同性を有し、５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分配列に対し３３．２％程度の相同性を有することが、明らかとなった。
また、ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログが既に発見されている。ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログ遺伝子と既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子との塩基配列上における相同性検索の結果、ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログ遺伝子は、既知ヒトＣ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性に対応する部分配列のうち、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼの酵素活性に対応する部分配列および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分配列への相同性と比較し、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分配列への相同性が高いことが分かっている。さらに、ヒトＣ１−ＴＨＦＳオルソログ遺伝子がコードする蛋白質は、既知のヒトＣ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性すべてを有していることも、明らかとなっている。
すなわち、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼの酵素活性に対応する部分構造および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼの酵素活性に対応する部分構造は、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素の酵素活性に対応する部分構造に比べ、ＤＮＡ変異等の原因によるアミノ酸配列の変化に対し、活性が失われにくい部分構造であると考えられている。
これらのことより、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質も、Ｃ１−ＴＨＦＳが有する３種類の酵素活性すべてを有していると考えられる。すなわち本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質は、ヒトＣ１−ＴＨＦＳのアイソザイムであると考えられる。
一方、リボソームにおいて合成された蛋白質の中には、Ｎ末端部分に特有のターゲット配列を有しているものがある。それら蛋白質は、ターゲット配列に応じてゴルジ体、ミトコンドリアなどの細胞小器官へ輸送されることがわかっている。ミトコンドリアへ輸送される全ての蛋白質が有するターゲット配列に、アミノ酸配列上のコンセンサスがあるということではない。しかし、ミトコンドリアへ輸送される全ての蛋白質が有するターゲット配列は、共通して、塩基性アミノ酸の含有率が高く、ターゲット配列全体は疎水的であることがわかっている（非特許文献１０）。そこで、本傾向を指標に、アミノ酸配列が明らかな任意の蛋白質がミトコンドリアへ輸送されるためのターゲット配列を有しているか否かを予測することは、可能である。
Ｎ末端ＤＮＡがコードするポリペプチドがターゲット配列を有するか否かを、そのアミノ酸配列から予測した結果、Ｎ末端ＤＮＡがコードするポリペプチドは、ターゲット配列を有していることが明らかとなった。よって、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質は、リボソームにおいて合成された後、ミトコンドリアへ輸送され、さらにミトコンドリアにおいてターゲット配列に係るペプチドが切断され、その結果、ターゲット配列に係るペプチドが除かれたポリペプチドが成熟蛋白質として機能すると考えられる。下記実施例で示すように、配列２のアミノ酸配列の１番目から３１番目のアミノ酸配列がミトコンドリアターゲット配列であることを確認している。
また、本遺伝子に係るＤＮＡをヒト胎児腎臓由来の細胞株にリポソームを用いて導入した結果、導入しない場合と比較し、細胞増殖が促進された。本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質が、Ｃ１−ＴＨＦＳの３種類の酵素活性を有していると予想されることから、細胞増殖促進の結果は、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質が、核酸合成に関与していると考えられる。
本遺伝子に係るＤＮＡは、Ｎ末端欠損ＤＮＡと比較し、Ｎ末端部分ＤＮＡ、すなわち細胞質からミトコンドリアへの移行のためのターゲット配列に係るＤＮＡを含むＤＮＡを有している。このことは、本遺伝子が、既知の細胞質に存在し機能しているヒトＣ１−ＴＨＦＳをコードする遺伝子とは異なり、ミトコンドリア局在性のヒトＣ１−ＴＨＦＳをコードする遺伝子であることを意味している。また、正常大腸組織と比較し大腸癌組織において、本遺伝子の発現が有意に亢進している。以上のことから、本発明はＣ１−ＴＨＦＳの代謝反応のさらなる解明に寄与するものである。また、本遺伝子は、従来のＣ１−ＴＨＦＳ遺伝子にはない抗癌剤が標的とする蛋白質をコードする遺伝子として、新たな抗癌剤の開発に寄与することができる。
（ＤＮＡ）
本発明に係るＤＮＡは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含むＤＮＡであり、好ましくは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである。
また、本発明に係るＤＮＡには、配列表の配列番号１の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含み、かつ、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素活性、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ活性および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性の３つの活性、および／または、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも含まれ、好ましくは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである。
さらに、本発明に係るＤＮＡには、上記ＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異などを有し、かつ細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも含まれる。該ＤＮＡは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たＤＮＡであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、エキソヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製法、部位特異的突然変異誘発法などが挙げられる。
「１ないし複数」とは、一般には、１個から２０個、好ましくは、１個から１０個、さらに好ましくは、１個から数個である。数個とは、一般には１個から５個、好ましくは、１個から３個、さらに好ましくは、１個から２個である。
本明細書において、上記ＤＮＡを本遺伝子に係るＤＮＡという。
また、本発明に係るＤＮＡには、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、本遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。該ＤＮＡは、その最小単位として好ましくは５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上のヌクレオチド、さらに好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるＤＮＡである。該ＤＮＡは、本発明に係るＤＮＡに固有な塩基配列領域を有することが好ましい。該ＤＮＡは、該ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、自体公知の化学合成方法（参照：ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６０（１）巻、第１１５−１２７頁（１９８７））を利用して製造可能である。該ＤＮＡは、本遺伝子に係るＤＮＡを増幅するためのプライマーまたは本遺伝子に係るＤＮＡの検出用プローブなどに用いられる。
本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡとしては、本遺伝子に係るＤＮＡのＮ末端および／またはＣ末端に付加配列を有するＤＮＡが挙げられる。かかるＤＮＡがコードする蛋白質が細胞増殖活性および／または前期３種の酵素活性を有する限りにおいて付加配列は限定されない。
また、本発明に係るＤＮＡには、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、本遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つを増幅するためのプライマーおよび／または検出するためのプローブであるＤＮＡも含まれる。該ＤＮＡは、本遺伝子の取得、本遺伝子の転写物量の測定などに用いられる。例えば、該ＤＮＡは、配列表の配列番号３から６のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡである。例えば、配列表の配列番号３および４に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、本遺伝子に係るＤＮＡの取得の際、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖を増幅するためのプライマーとして用いられる。例えば、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、本遺伝子に係るＤＮＡの断片および該断片ＤＮＡの相補鎖を増幅するためのプライマーならびに本遺伝子に係るＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖を検出するためのプローブとして用いられる。
本明細書において、上記ＤＮＡのうち本遺伝子に係るＤＮＡを除くＤＮＡを本遺伝子等にハイブリダイズするＤＮＡという。
（蛋白質）
本発明の一つの態様は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質、または、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。さらに、本発明に係る蛋白質には、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するＤＮＡがコードする蛋白質であって、細胞増殖促進活性を有する蛋白質も含まれる。
これらの蛋白質は、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。例えば、Ｎ末端やＣ末端に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカー蛋白質を介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化した蛋白質も本発明に含まれる。付加される蛋白質等としては、例えばグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇなどのタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光物質類等が例示できる。これら蛋白質等の付加により、本発明に係る蛋白質の精製、検出を容易にすることが可能となる。
本発明が提供する蛋白質は、該蛋白質をコードするＤＮＡを遺伝子工学的手法により発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または生体生物由来の生物学的試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってよい。
本発明が提供する蛋白質は、該蛋白質の活性を阻害する阻害剤のスクリーニングに有用である。例えば、該蛋白質の活性として、細胞増殖促進活性が挙げられる。
本遺伝子を提供する本発明を完成させることにより、本遺伝子に係るＤＮＡがコードする蛋白質を、そのＣ１−ＴＨＦＳ活性を保持したまま、発現させることができる。また、該蛋白質の精製、該蛋白質を標的とした薬剤スクリーニングを可能にすることができる。
一方、本遺伝子に係るＤＮＡは、Ｎ末端欠損ＤＮＡと比較し、Ｎ末端部分ＤＮＡすなわち細胞質からミトコンドリアへの移行のためのターゲット配列に係るＤＮＡおよび構造遺伝子に係るＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡを有している。よって、仮にＮ末端欠損ＤＮＡを用いて動物細胞等において強制的に該ＤＮＡを発現させた場合、Ｎ末端欠損ＤＮＡは構造遺伝子にかかるＤＮＡを全て含んでいないため、発現させた蛋白質がＣ１−ＴＨＦＳ活性を示さないと考えられる。また、Ｎ末端欠損ＤＮＡはミトコンドリアへの移行のためのターゲット配列に係るＤＮＡを有していないため、発現させた蛋白質が細胞質からミトコンドリアへ移行しそこでＣ１−ＴＨＦＳ活性を呈することも考えにくい。
（組換えベクター）
本発明は一つの態様として、本遺伝子に係るＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。組換えベクターは、本遺伝子に係るＤＮＡ等を適当なベクターＤＮＡに挿入することによって得ることができる。
ベクターＤＮＡは、導入する細胞の種類等により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落したものでもよい。例えば、プラスミド、バクテリアファージおよびウイルス由来のベクターが例示できる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドおよび酵母由来のプラスミドが例示される。バクテリアファージＤＮＡとしては、λファージなどが例示される。ウイルス由来のベクターＤＮＡとしては、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０およびバキュロウイルスなどが例示される。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来のベクターＤＮＡなどが例示される。あるいは、これらを組合わせて作成されるベクターＤＮＡ（コスミドなど）が例示される。組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー、選択マーカー等を構成要素とし、これらを自体公知の方法に基づき組合わせて作製される。選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが例示できる。
ベクターＤＮＡに目的の遺伝子を組み込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理して目的の遺伝子を特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的の遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望のベクターが得られる。
後述の実施例に示すｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓ（図３）では、ベクターＤＮＡとして、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製）を用いた。ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓは、平成１５年６月２５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号として寄託されている。プラスミドＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号も本発明に含まれる。
（形質転換体）
本発明は一つの態様において、本発明に係る組換えベクターを、宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係る蛋白質を提供することが可能である。該形質転換体には、本発明に係るＤＮＡ以外の所望の遺伝子を組み込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。宿主に導入するベクターＤＮＡは、１種のベクターであってもよいし、２種以上のベクターＤＮＡでもあってもよい。
宿主としては、原核生物および真核生物のいずれをも用いることができる。原核生物としては、大腸菌、枯草菌等が例示できる。真核生物としては酵母、昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞などの動物細胞が例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。より好ましくは、ヒト細胞を用いる。
形質転換は、自体公知の方法を利用して行うことができる。好ましくは、遺伝子の安定性を考慮し、宿主の染色体へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自立複製系を利用する。本発明が提供するＤＮＡの導入は、それ自体公知の方法を利用して行われる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトポレーション法、リポフェクション法が例示できるが、これらの方法に限定されない。導入効率および簡便性の観点から、好ましくはリポフェクション法が挙げられる。なお、後述の実施例では、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ−ｈＣ１Ｓを２９３細胞へリポフェクション法により導入し、形質転換させた結果得られた形質転換体を用いて、本発明に係る蛋白質を発現させた。２９３細胞は、アデノウイルス５型の癌遺伝子Ｅ１でトランスフォームされたヒト胎児腎細胞を意味する。
（蛋白質の製造方法）
本発明は一つの態様において、本発明に係る形質転換体を培養する工程を含む本発明に係る蛋白質の製造方法を提供する。本発明に係る蛋白質の発現は、無細胞蛋白質発現系を用いて行うことができる。その他、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術を用いて、本発明に係る蛋白質を発現させることができる。例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで培養で得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより、本発明に係る蛋白質を製造することができる。本発明に係る形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法を利用して行うことができる。培養は、形質転換体により発現される該蛋白質の細胞増殖促進活性を指標にして実施することができる。また、該蛋白質が有する前記３種類の酵素活性を指標に実施することもできる。これらの酵素活性は、自体公知の方法（非特許文献１８）を用いて測定可能である。あるいは、宿主中または宿主外に産生された該蛋白質量を指標にしてもよい。発現させた蛋白質は、自体公知の精製方法を利用して、精製回収することができる。例えば、分子篩、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の組み合わせにより、精製回収することができる。その他、硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収することができる。好ましくは、本発明に係る蛋白質に対する抗体を作製し、本発明に係る蛋白質の該抗体への特異的な吸着性を利用し、精製回収することができる。
（抗体）
本発明は一つの態様において、本発明に係る蛋白質に対する抗体を提供する。抗体は、本発明に係る蛋白質またはその断片を抗原として用いて作製する。抗原は、該蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。該蛋白質に特異的な抗体を作製するためには、該蛋白質および／またはその断片に固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本発明に係る蛋白質またはその断片に係るアミノ酸配列と同一または相同である必要がなく、該蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上不連続であっても、露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は、免疫学的に本発明が提供する蛋白質および／またはその断片を特異的に結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応を利用して決定できる。
抗体は、自体公知の抗体作製方法を利用して、産生される。抗体を産生するためには、本発明が提供する蛋白質またはその断片を、アジュバンドの存在または非存在下で、単独または担体に結合して動物に投与し、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行う。担体は、自身が宿主に対して有害作用を起こさず抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法を利用して取得する。好ましい抗体回収法としては、免疫アフィニティクロマトグラフィー法が例示できる。
モノクローナル抗体を生産するためには、上記免疫手段を施された動物から抗体産生細胞（例えば脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、本発明が提供する蛋白質でおよび／またはその断片を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
かくして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明が提供する蛋白質の精製用抗体、標識マーカー等として用いることができる。また、該ポリクローナル抗体または該モノクローナル抗体は、直接本発明が提供する蛋白質と結合し、その活性を制御することができる。よって、本発明に係る蛋白質の活性が関与する疾病の治療または／および防止のために有用である。例えば、ヒト正常大腸組織と比較してヒト大腸癌組織において、本遺伝子に係るＤＮＡはその発現が亢進しているため、該ポリクローナル抗体または該モノクローナル抗体は、大腸癌の治療または／および防止に有用である。さらには該ポリクローナル抗体または該モノクローナル抗体は、該蛋白質の標識マーカーとして大腸癌の診断手段を提供することもできる。
（化合物の同定方法）
本発明は一つの態様において、本発明に係る蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法を提供する。該化合物の同定方法は、本発明に係る蛋白質、本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクターまたは本発明に係るプラスミド、本発明に係る形質転換体および本発明に係る抗体のうちすくなくともいずれか１つを用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本発明に係る同定方法により、該蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別または該抗体を利用した抗体認識物質の選別などが可能である。該同定方法により同定された化合物は、本発明に係る蛋白質の活性が関与する疾病の治療または／および防止のために有用である。ヒト正常大腸組織と比較してヒト大腸癌組織において本遺伝子に係るＤＮＡはその発現が亢進している。よって、該化合物は大腸癌の治療または／および防止などに有用である。
例えば、本発明に係る蛋白質の細胞増殖促進活性を測定する実験系において、該蛋白質と被検化合物の相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質と被検化合物とを共存させて該活性を測定する。ついで、被検化合物の非共存下での測定結果との比較における該活性の存在、非存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現などを検出することにより、該蛋白質の該活性を阻害する化合物を同定可能である。活性の測定は、活性の直接的な検出により行うこともできるし、例えば活性の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施可能である。シグナルとして、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇなどのタグペプチド類等を用いることができる。
披検化合物を共存させた場合の該蛋白質の該活性を、被検化合物を共存させなかった場合の該蛋白質の該活性と比較することにより、該披検化合物が該活性に及ぼす効果を測定することができる。該披検化合物を共存させた場合の該活性が、該披検化合物を共存させなかった場合の該蛋白質の該活性と比較して低減した場合には、該披検化合物には該蛋白質の活性を阻害する作用があると判定できる。
一例として、本発明に係る蛋白質の細胞増殖促進活性を指標にして、該活性に影響を与え得る化合物を選別することができる。該細胞増殖促進活性は、本発明に係る蛋白質が発現する細胞を培養し、培養後に増殖した細胞数を計測することで定量化が可能である。細胞数は、バイオレッド、ニュートラルレッド等を用いて、生細胞を染色することにより計測され得る。また、生細胞による放射標識されたチミジンの取り込みを指標に、細胞数を計測することも可能である。
（大腸癌の判定方法）
また、本発明は一つの態様において、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、ある組織における本遺伝子に係るＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする判定方法を提供する。すなわち、本遺伝子に係るＤＮＡは、大腸癌組織において正常大腸組織と比較し、有意にその発現が亢進している。よって、本遺伝子に係るＤＮＡの発現量を指標に、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定することが可能である。
披検試料としては、本発明で提供される遺伝子および／またはその変異遺伝子の核酸および／または核酸断片を含むものである限り制限されない。例えば大腸組織細胞、大腸組織生検などの生体生物由来の生物学的試料を披検試料として例示できる。該核酸として、本遺伝子に係るＤＮＡを含有するＤＮＡ，該ＤＮＡの相補鎖、本遺伝子に係るＤＮＡの断片、該断片ＤＮＡの相補鎖およびこれらＤＮＡが転写されてなるＲＮＡなどが例示される。披検試料は、試料中に含まれる核酸の検出を容易ならしめる種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングなどの方法を用いて調製され得る。
該核酸の検出および該核酸量の測定は、自体公知の遺伝子検出方法および測定方法を利用して行い得る。該検出方法として、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノザンブロット法などが例示される。該測定方法として、ノザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法および分光分析法などが例示される。例えば、次の工程により本遺伝子に係るＤＮＡの発現量を測定することが可能である。
（ｉ）ある組織に含まれるＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行う工程、（ｉｉ）逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程
および（ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの量を測定する工程。
該検出方法においては、本発明に係る遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／または該遺伝子に係るＤＮＡの増幅の実施に、本遺伝子に係るＤＮＡまたは該ＤＮＡの相補鎖の断片であってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するＤＮＡ断片とは、本遺伝子に係るＤＮＡのみに特異的にハイブリダイゼーションできるＤＮＡを意味する。プライマーとしての性質を有するものは、本遺伝子に係るＤＮＡのみを特異的に増幅できるＤＮＡを意味する。プローブまたはプライマーとしては、塩基配列長が一般的に５ないし５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０ないし３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５ないし３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。一般的に、プローブは標識されたものを用いるが、非標識であってもよい。適当な標識としては、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体などが例示できる。プローブを標識する方法は、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法などを例示することができる。例えば、該プローブおよび／またはプライマーとして、本発明に係るポリヌクレオチドが例示される。
また、上記同定方法における発現量は、対照である正常大腸由来組織における本遺伝子に係るＤＮＡの発現量と比較し、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは８倍以上である場合に、ある組織が大腸癌由来組織であると判定することが可能である。後述の実施例において、大腸癌細胞における該ＤＮＡの発現量は正常大腸細胞における該ＤＮＡの発現量のおよそ２．３８倍であった。
（大腸癌の判定キット）
また、本発明は一つの態様において、本遺伝子等にハイブリダイズするＤＮＡおよび本発明に係る抗体のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸癌の判定キットを提供する。例えば、ヒト大腸癌組織においてヒト正常大腸組織と比較して本遺伝子に係るＤＮＡの発現の亢進が見られることから、被検組織における該ＤＮＡの発現産物を、本発明に係る大腸癌の判定キットに含有されるＤＮＡをプローブとして用いることにより検出し、該ＤＮＡの発現量を測定することにより、ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定することが可能である。該判定キットには、緩衝液、塩、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、本遺伝子等にハイブリダイズするＤＮＡおよび該抗体の性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。
（大腸癌の防止剤および／または治療剤）
本発明は一つの態様において、本発明に係る蛋白質の阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤を提供する。本発明に係る蛋白質の阻害剤としては、本発明に係る抗体および本発明に係る化合物の同定方法により同定された化合物が例示される。大腸癌細胞において本遺伝子にかかるＤＮＡの発現が正常大腸細胞と比較し亢進しているため、本発明に係る蛋白質の阻害剤は大腸癌の防止および／または治療に有用である。
医薬の製造には、１種または２種以上の医薬用担体を用いることが好ましい。本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％の範囲とするのが適当である。
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤や賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択される。
例えば、水、医薬に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
所望により、通常の製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調整することもできる。
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などのいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセスロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれでも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などが包含される。
緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩）などを例示できる。
等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。
キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調整した後に使用することも可能である。
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、本発明の医薬組成物の有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用有無等）および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。
一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは０．１μｇから１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて、これらの用量の変更を行うことができる．上記投与量は、１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与しても良い．
処方は投与形態に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られたものを用いればよい。また、処方するときには、これらを単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他の抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。
投与形態は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与形態を選択する。例えば、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等に投与することもできる。大腸癌組織に直接投与することもできる。
医薬形状は投与形態に応じて選択することができ、遺伝子治療剤、シクロデキストリン等の包接体、溶液剤、けん濁剤、脂肪乳剤、散剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤等の作製も可能である。しかし、本発明の医薬の形態は、これに限定されない。
製剤化にあたっては、その形態に応じて適切な製剤用添加物を用いることができ、常法に従って製剤化することができる。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、目的とする物質を溶媒に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
シクロデキストリン包接化は、例えば目的とする物質を溶媒に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
注射用の溶液剤は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
けん濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
脂肪乳剤化は、例えば目的とする物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に。必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これらを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブトウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
散剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸入剤、経粘膜吸収剤等についても、通常用いられる方法により調製可能である。
【実施例】
以下、実施例により本発明についてさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（正常大腸細胞と比較し、大腸癌細胞において発現が亢進している遺伝子の同定）
正常細胞と比較し、癌細胞において発現が亢進している遺伝子は、バイオエクスプレス（Ｇｅｎｅｌｏｇｉｃ社）のマイクロアレイデータベースを利用して、同定された。マイクロアレイデータベースには、正常大腸組織細胞１１７サンプル、大腸癌細胞７７サンプルの各細胞内の発現プロファイルデータが含まれている。発現プロファイルデータはアフィメトリクスヒト遺伝子オリゴチップＨＧ−Ｕ１３３を用いた各細胞内の発現データベースとして格納されている。正常大腸組織細胞内での発現量よりも大腸癌細胞内での発現量が多い遺伝子のうち、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に遺伝子の全長の塩基配列が登録されていない本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を同定した。１１７サンプルの正常大腸組織細胞内における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現平均量に対する７７サンプルの大腸癌細胞内における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現平均量の比は、約２．３８となった。有意水準は、０．００００００１未満であった。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量の比を他の癌細胞において同様に調査した結果、乳癌の場合には約１．２２（有意水準０．００２４３）、肺癌の場合には約１．５２（有意水準０．００００００１未満）、胃癌の場合には約１．９８（有意水準０．００００３）、膵癌の場合には約１．３７（有意水準０．００１９）の発現量の比を示した。
（遺伝子の取得）
マイクロアレイデータベースのプローブ配列情報に相当する遺伝子として、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）中には、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のＮ末端欠損ＤＮＡの塩基配列が登録されていた。よって、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のＮ末端ＤＮＡの塩基配列は、不明であった。
そこで、本発明で提供されるＤＮＡの全長配列を次のように決定した。まず、本発明で提供されるＤＮＡの全長配列を推定した。最初に、Ｎ末端欠損ＤＮＡの５´末端３０ポリヌクレオチドに係る塩基配列をクエリーとして、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に対し相同性検索を行った。検索の結果、ヒトゲノムＤＮＡ断片（アクセッション番号、ＡＬ０３５０８６）と高い相同性を示した。ヒトゲノムＤＮＡ断片の塩基配列のうち、Ｎ末端欠損ＤＮＡの塩基配列と相同性を有する部分配列を除いて得られる塩基配列（以後、塩基配列Ａという）を対象として、塩基配列Ａに含まれる開始コドンのうち最も５’末端に近く存在する開始コドンを同定し、塩基配列Ａのうち該開始コドン以降の部分配列（以後、推定Ｎ末端塩基配列という）を同定した。推定Ｎ末端塩基配列の配列長は、１８３であり、６１アミノ酸をコードする部分配列であることが推定された。さらに、Ｎ末端欠損ＤＮＡの塩基配列をアミノ酸配列に変換したものをクエリーに、ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に対して相同性検索を行った。その結果、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のマウスオルソログと推察される遺伝子に係るＤＮＡと高い相同性を示した。該ＤＮＡの５‘末端部分配列（配列長１８３）をアミノ酸配列に変換したものと、推定Ｎ末端塩基配列をアミノ酸配列に変換したものとで相同性検索を行ったところ、良好な相同性（５６．１％）を示した。よって、推定Ｎ末端塩基配列は、Ｎ末端部分ＤＮＡの塩基配列であることが推定された。
さらに、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のｃＤＮＡクローニングを行った。センスプライマーとして配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを、アンチセンスセンスプライマーとして配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを使用した。鋳型は、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、ＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用いた。ＰＣＲ増幅反応は、９４℃２分間、９４℃３０秒、６８℃４分を４０サイクル行い、続いて６８℃３分間処理を行った。得られた増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯＶｅｃｔｏｒ（東洋紡社）へライゲーションした。得られた組換えベクター（以後、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒという）に含まれる本遺伝子に係るＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ Ｔｏｗｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて行った。その結果、本遺伝子にかかるＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列であることが判明した。
（正常大腸細胞および大腸癌細胞内における発現量比較）
正常大腸細胞における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の転写産物量が、大腸癌細胞における本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の転写産物量よりも少ないことを、以下の手順で確認した。まず、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６及びＳＷ６２０を大日本製薬より購入し、両細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、岩城硝子社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。一方、正常大腸上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、該細胞をＡＣＬ−４無血清培地で培養した。これらの細胞から、アイソゲン（日本ジーン社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡから、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ社）Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて３０℃１０分、４２℃３０分、９９℃５分、５℃５分の条件の下、逆転写反応を行った。次に逆転写反応で得られたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅反応を行った。反応は、得られたｃＤＮＡの１／１０が溶解している溶液に、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーを加えて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて行った。反応条件は、９４℃１．５分、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル、最後に７２℃３分処理とした。反応液を１％アガロースゲルに供与し、電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド染色により、ＰＣＲ増幅産物を検出した。
対照として、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素の発現を、同様の方法で、検出した。その結果、対照のグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素の発現量については、正常大腸細胞および大腸癌細胞間で有意な差異は認められなかった。しかし、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現量については、大腸癌細胞内における発現量が正常大腸細胞内における発現量よりも多いことが明らかとなった（図４）。
（蛋白質の取得）
本遺伝子に係るＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを導入した動物細胞を培養することにより、本遺伝子がコードする蛋白質を発現させ、その分子量を、ウエスタンブロット法を用いて測定した。発現ベクターとして、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ＶｅｃｔｏｒをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し得られたＤＮＡフラグメントと、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒとを混合し、本遺伝子に係るＤＮＡ（以後、ｈＣ１Ｓという）を組み込んだ発現ベクター（以後、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒという）を得た。動物細胞には、２９３細胞を用いた。まず、１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２９３細胞をサブコンフルエント状態に至るまで、培養した。培養後、培地をオプティＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に交換した。交換後、４μｇの本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、リポフェクション法により、２９３細胞に導入した。対照として本遺伝子が組み込まれていないｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、リポフェクション法により、２９３細胞に導入した。
導入時から５時間経過後、遺伝子導入された細胞の培養液に２０％ ＦＣＳ含有オプティＭＥＭＩ培地を、培養液の最終血清濃度が１０％になるように、加えた。更に翌日、遺伝子導入された細胞の培地を１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。遺伝子導入時から４８時間経過後、細胞を溶解するための溶液（１％ トリトンＸ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡフリー、ロッシュ社）を加え、遺伝子導入された細胞を溶解した。氷冷下３０分間放置した後、溶液（以後、溶解後溶液という）を回収、遠心処理（１５０００回転、１５分間）した。遠心処理後、上清にＢＳＡ処理ＩｇＧアガロースゲル（シグマ）を加え、一晩４℃で放置した。翌日、上清に抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲル（シグマ社）を加え、３．５時間４℃で抗原抗体反応させた後、洗浄液（０．１％ トリトンＸ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回、リン酸緩衝液で１回洗浄した。抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲルと結合した蛋白質は、１０％ ２−メルカプトエタノール含有サンプル緩衝液で回収した。回収溶液ならびに溶解後溶液を、４−２０％ＳＤＳゲルに供与し、電気泳動を行った。泳動後、泳動産物をニトロセルロースフィルター（Ｓｃｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｈｃｕｅｌｌ社）へ転写した。転写後、ＢＳＡブロッキングを行い、抗ＦＬＡＧＭ２抗体（シグマ社）および過酸化水素脱水素酵素で標識された抗マウスＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と泳動産物を反応させ、４−クロロ−１−ナフトールで発色させた。免疫沈降させずに溶解後溶液を直接用いた場合には、本発明で提供される蛋白質を検出することができなかった。しかし、抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲルで免疫沈降させた場合には、本発明で提供される蛋白質を、検出できた。検出の結果、本発明で提供される蛋白質の分子量は、約１１０ｋＤａであることが明らかとなった（図５）。
（本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞増殖促進活性）
２４および１２穴のプレート上に、１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて２９３細胞を播種し、サブコンフルエント状態になるまで培養を行った。培養後、０．４μｇ（２４穴）あるいは０．７μｇ（１２穴）の本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、２９３細胞へ導入した。対照として本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子が組み込まれていないｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ Ｖｅｃｔｏｒを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、２９３細胞へ導入した。翌日、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中、１０ｃｍプレートに巻きなおし、Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように、追加した。１ｍｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含んだ培地を３ないし４日ごとに交換し、１０−１４日間培養することによりコロニーを形成させた。形成したコロニーを０．２％クリスタルバイオレットで染色した。その結果、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子を細胞に導入し、強制発現させると、細胞増殖促進させることがわかった。この結果は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質が、細胞増殖促進活性を有することを示すものである（図６）。
（本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞内局在性）
本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質の細胞内での局在を以下の手順で決定した。１０ｃｍプレートでサブコンフルエント状態の２９３細胞に前述の方法で、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子組換えベクター、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４、を導入した。４８時間後、細胞を０．５ｍｌのミトコンドリア単離緩衝液（ＭＩＢ；２００ｍＭマンニトール、７０ｍＭスクロース、３５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ リン酸カリウム、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡフリー、ｐＨ７．３）中に回収した。細胞をホモジナイザーで破砕懸濁した後、６００ｇ ４°Ｃで２回迷心沈殿を行った。上清をさらに１５０００ｒｐｍ ４°Ｃで２０分間遠心した。上清（細胞質分画）、沈殿（ミトコンドリア分画）おのおの、最初の懸濁液の１／５相当量を抗ＦＬＡＧ抗体を用いた前述のウエスタンブロット、あるいは抗ミトコンドリアＨＳＰ７０抗体（１／５００希釈、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ）を用いたウエスタンブロットに供した。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質と思われるバンドはミトコンドリア分画にだけ検出され、本遺伝子の配列分析から予測されたミトコンドリア局在性を示した（図７上段）。また、抗ミトコンドリアＨＳＰ７０もミトコンドリア分画にのみ検出され、分画実験操作の妥当性は証明された（図７下段）。
（本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質のシグナルペプチド切断部位）
前述の方法で、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質を２９３細胞で発現し、抗ＦＬＡＧＭ２アガロースゲルにより精製し、４−２０％ＳＤＳゲル電気泳動で分離した。その後、ゲル内の蛋白質をＰＶＤＦ膜（ファルマシア）に転写し、クマジーＲ２５０液で染色した。１１０Ｋｄａ付近のバンドで示され、かつ本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子がコードする蛋白質と考えられる蛋白質のＮ末を東レリサーチセンターで決定した。結果はＳＳＧＧＧであり、予想通り、ミトコンドリアターゲット配列と考えられた位置（配列表２の３１番目Ａｌａと３２番目Ｓｅｒの間）で切断されていた。
（発現パターンに基づく、ＤＨＦＲ、ＴＳなど既存の抗癌剤標的に対し、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の標的としての優位性）
既存の抗癌剤標的であるジヒドロ化葉酸還元化酵素（ＤＨＦＲ：メトトレキセートの標的）、チミジル酸合成酵素（ＴＳ：５−フルオロウリジンの標的）と本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子間で、ヒト臓器における発現パターンをバイオエクスプレスのマイクロアレイデータベースを用いて比較した（図８）。正常大腸組織と比べ、大腸癌における発現強度はＤＨＦＲ遺伝子で１．１倍、ＴＳ遺伝子で１．５倍の上昇であった。一方、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子は前述の通り２．３８倍発現が亢進していた。さらに、増殖細胞を多く抱える正常組織、胸腺に注目すると、ここでのＤＨＦＲ遺伝子の発現は、正常大腸組織に対し２．５倍という値であった。同様に、ＴＳ遺伝子の胸腺での発現は５．５倍の値であった。胸腺でこれらの遺伝子の発現が高いために、これら遺伝子を標的とする抗癌剤、メトトレキセートや５−フルオロウリジンの副作用が発現しやすくなっていると考えられる。ところが、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子の発現は、胸腺でも正常大腸組織での１．４倍という値であった。このように、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子は癌組織で発現が亢進している上に、通常増殖に関与する遺伝子（例えばＤＨＦＲやＴＳ遺伝子）の発現が上昇する、胸腺のような組織においても、顕著な高発現がみられない。従って、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子は、ここで比較した他の２種の抗癌剤標的よりも、副作用の少ない抗がん剤の提供などの点において有利な抗癌剤標的とみなせる。
（大腸癌の発癌過程における、Ｗｎｔ経路を通したミトコンドリアでのＣ１代謝の活性化と本発明の遺伝子の有用性）
大腸癌の場合、ポリープ状の前がん状態からβカテニンによる遺伝子発現撹乱により癌状態へ移行することで発癌すると考えられている（非特許文献１１）。Ｗｎｔ遺伝子シグナル経路の活性化を引き起こす変異、換言すればＡＰＣ遺伝子を不活性化する、あるいはβカテニンを活性化するような変異は、βカテニンの核内蓄積をもたらし、ひいてはβカテニンと転写因子Ｔｃｆ／ＬＥＦの複合体を形成させる。約９０％の大腸癌でＷｎｔ遺伝子シグナル経路の活性化を引き起こす変異がみられることが知られている（非特許文献１２）。このβカテニン経路の標的遺伝子のひとつとしてｃ−ｍｙｃ癌遺伝子が存在する（非特許文献１３）。ｍｙｃは細胞増殖、分化、アポトーシスに関わる重要な転写因子であるが（非特許文献１４）、詳細なメカニズムは未だ詳らかではない。最近、ミトコンドリアセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｍｔＳＨＭＴ）がｍｙｃの標的遺伝子であることが明らかとなってきたが（非特許文献１５、１６）、この遺伝子産物はセリンとテトラヒドロ葉酸からグリシンと５，１０メチレンテトラ葉酸を合成する反応およびその逆反応を触媒し、Ｃ１−ＴＨＦＳとともに１炭素単位代謝に関わっている。また、他の研究において、マウスでｃ−ｍｙｃが転写を引き起こす遺伝子としてＵ０６６６５というクローンが同定されてきたが（非特許文献１７）、この遺伝子は、本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子のマウスオルソログの一部であることが発明者の分析により明らかとなった。こういった事実を総合的に考えてみると、ミトコンドリアという同じ細胞内部位で、しかも一つの代謝経路中で協力している遺伝子群が、協調的な遺伝子の制御下にあると考えるのはたいへん理にかなったことといえる。そこで、発明者は、Ｗｎｔシグナル経路が活性化することでミトコンドリアの炭素単位代謝が活性化される現象が大腸癌の発癌過程で重要な役目を担っていると考えている（図９）。本発明で提供されるＤＮＡに係る遺伝子はこの過程の根幹をなす遺伝子といえ、それゆえ、抗癌剤標的となりうる（非特許文献２０）。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００３年９月３０日出願の日本特許出願（特願２００３−３４１２４５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明は、癌細胞において正常細胞と比較し発現が亢進している新規Ｃ１−ＴＨＦＳ遺伝子を提供するものである。本遺伝子に係るＤＮＡは、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードする。本特性を利用した新規医薬組成物、診断手段の提供は、大腸癌の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１： （１）：（２９３４）本蛋白質全長をコードする領域
配列番号１： （１）：（１８３） Ｎ末端部分ＤＮＡ
配列番号１： （１８４）：（２９３４） Ｎ末端欠損ＤＮＡ
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含み、かつ、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素活性、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ活性および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性の３つの活性、および／または、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載のＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加された塩基配列を有し、かつ細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の群より選ばれるＤＮＡであって、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つを増幅するためのプライマーおよび／または検出するためのプローブである請求項５に記載のＤＮＡ；
（ｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ
および
（ｉｖ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項８】
プラスミドＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号。
【請求項９】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｂ）のいずれかの蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
【請求項１１】
請求項４に記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
【請求項１２】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、請求項１０または１１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の蛋白質または該蛋白質の断片を抗原とする抗体。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と請求項１０または１１に記載の蛋白質との相互作用を可能にする条件下で、細胞増殖促進活性の存在、非存在または変化を検出することにより、該化合物が請求項１０または１１に記載の蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、請求項１０または１１に記載の蛋白質、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項５または６に記載のＤＮＡ、請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載のプラスミド、請求項９に記載の形質転換体および請求項１３に記載の抗体のうちすくなくともいずれか１つを用いることを特徴とする同定方法。
【請求項１６】
ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、ある組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の判定方法であって、ある組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量が、対照である正常大腸由来組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量の３倍以上である場合に、ある組織が大腸癌由来組織であると判定することを特徴とする判定方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の判定方法であって、ある組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を以下の工程により測定することを特徴とする判定方法；
（ｉ）ある組織に含まれるＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行う工程、
（ｉｉ）逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程および
（ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの量を測定する工程。
【請求項１９】
請求項５または６に記載のＤＮＡおよび請求項１３に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸癌の判定キットであって、請求項１６から請求項１８のいずれか１項に記載の判定方法に用いることを特徴とする大腸癌の判定キット。
【請求項２０】
請求項１０または１１に記載の蛋白質の阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の９４番目から２９３４番目の塩基配列を含み、かつ、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素活性、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ活性および５、１０−メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性の３つの活性、および／または、細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡである、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載のＤＮＡのＤＮＡ配列において１ないし複数のＤＮＡの欠失、置換、付加された塩基配列を有し、かつ細胞増殖促進活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の群より選ばれるＤＮＡであって、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡの相補鎖、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの部分塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補鎖のうちすくなくともいずれか１つを増幅するためのプライマーおよび／または検出するためのプローブである請求項５に記載のＤＮＡ；
（ｉ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ
および
（ｉｖ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項８】
プラスミドＦＥＲＭ ＢＰ−８４１９号。
【請求項９】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｂ）のいずれかの蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３２番目から９７８番目のアミノ酸配列で表される蛋白質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
【請求項１１】
請求項４に記載のＤＮＡがコードする蛋白質。
【請求項１２】
請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含む、請求項１０または１１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の蛋白質または該蛋白質の断片を抗原とする抗体。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と請求項１０または１１に記載の蛋白質との相互作用を可能にする条件下で、細胞増殖促進活性の存在、非存在または変化を検出することにより、該化合物が請求項１０または１１に記載の蛋白質の細胞増殖促進活性を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
【請求項１５】
請求項１０または１１に記載の蛋白質が有する細胞増殖促進活性を阻害する化合物の同定方法であって、請求項１０または１１に記載の蛋白質、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項５または６に記載のＤＮＡ、請求項７に記載の組換えベクターまたは請求項８に記載のプラスミド、請求項９に記載の形質転換体および請求項１３に記載の抗体のうちすくなくともいずれか１つを用いることを特徴とする同定方法。
【請求項１６】
ある組織が大腸癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、ある組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の判定方法であって、ある組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量が、対照である正常大腸由来組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量の３倍以上である場合に、ある組織が大腸癌由来組織であると判定することを特徴とする判定方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の判定方法であって、ある組織における請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの発現量を以下の工程により測定することを特徴とする判定方法；
（ｉ）ある組織に含まれるＲＮＡを鋳型に、逆転写反応を行う工程、
（ｉｉ）逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列で表されるＤＮＡをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程および
（ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡの量を測定する工程。
【請求項１９】
請求項５または６に記載のＤＮＡおよび請求項１３に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸癌の判定キットであって、請求項１６から請求項１８のいずれか１項に記載の判定方法に用いることを特徴とする大腸癌の判定キット。
【請求項２０】
請求項１０または１１に記載の蛋白質の阻害剤を含んでなる大腸癌の防止剤および／または治療剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０９５３
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４３２８（Ｐ２００５−５１４３２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４８１２
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４８１２
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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