ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーＬｍｘ１ａ
本発明により、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞から分裂停止後までの全ての分化段階のドーパミン産生ニューロンに発現する遺伝子Ｌｍｘ１ａが同定された。細胞における該Ｌｍｘ１ａの発現は、パーキンソン病を含む神経変性疾患に対する移植治療に適した細胞の選択の指標となると共に、ドーパミン産生ニューロンの分化誘導に関与する薬剤のスクリーニングにおけるマーカーとしても有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン産生ニューロンにおいて特異的に発現している遺伝子Ｌｍｘ１ａに関する。該遺伝子の発現または該遺伝子によりコードされる蛋白質の発現を検出することにより、パーキンソン病（ＰＤ）等の神経変性疾患の移植治療において用いられるドーパミン産生ニューロン及びその前駆細胞を効率的に分離することができる。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミン系は、哺乳動物の脳において重要な運動調節、ホルモン分泌調節、情動調節等に関与する非常に重要な系である。従って、ドーパミン作動性神経伝達における異常は、様々な神経系の障害を引き起こす。例えば、パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐体外路系の神経変性疾患である（ＨＡＲＲＩＳＯＮ’Ｓ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ 第２巻第２３版，Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４）ｐｐ．２２７５−７）。パーキンソン病の治療法としては、産生されるドーパミン量の低下を補うためにＬ−ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を経口投与する方法が主に採られているが、効果の持続性が良くないことが知られている。
【０００３】
失われたドーパミン産生ニューロンを補うために、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む６〜９週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する治療法も試みられている（米国特許第５６９０９２７号；Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４１−８；Ｆｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４９−５５；Ｗｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５５６−６３；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１１１８−２４；Ｄｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｒａｉｎ １１９：４１−５０；Ｌｏｐｅｚ−Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｐ．Ｐｒｏｃ．２９：９７７−８０）。しかし、現在のところ、この方法では細胞の供給面、倫理面（Ｒｏｓｅｎｓｔａｉｎ（１９９５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３：１０６；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．３３：１０３１−７）で問題がある。また、感染汚染の危険性、免疫学的な移植片拒絶（Ｌｏｐｅｚ−Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｐ．Ｐｒｏｃ．２９：９７７−８０；Ｗｉｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｄｉｎ（１９８８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：２８７−３２４）、胎児組織が糖分解よりも脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９９５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３：１０６）等の様々な面で問題が指摘されている。
【０００４】
倫理面や供給不足の問題を解決するために、例えばブタ由来の皮質、線条、及び中脳細胞を用いる方法も提案されている（例えば、特表平１０−５０８４８７号公報；特表平１０−５０８４８８号公報；特表平１０−５０９０３４号公報参照）。この方法においては、拒絶反応を抑制するため、細胞表面上の抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）を改変するという煩雑な操作が必要とされる。移植片拒絶を解消する方法としては、例えば、セルトーリ細胞を同時に移植することにより、局在的に免疫抑制する方法も提案されている（特表平１１−５０９１７０号公報；特表平１１−５０１８１８号公報；Ｓｅｌａｗｒｙ ａｎｄ Ｃａｍｅｒｏｎ（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２：１２３−９）。ＭＨＣがマッチする血縁者、他人の骨髄、骨髄バンク、及び臍帯血バンク等から移植細胞を得ることも可能であるが、患者自身の細胞を用いることができれば、余計な操作や手間なしに拒絶反応の問題も解決することができる。
【０００５】
そこで、中絶胎児由来の細胞に代えて、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞、骨髄間質細胞などの非神経系細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドーパミン産生ニューロンの分化系の移植材料としての利用が有望視されている。実際、ラットパーキンソン病モデルの病変線条へのＥＳ細胞移植により機能的なドーパミン産生ニューロンが形成されたとの報告もある（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：５０−５６）。将来的にはＥＳ細胞若しくは患者本人の持つ神経幹細胞からの再生治療の重要性が増してくるものと思われる。
【０００６】
神経組織の損傷の治療においては脳機能の再構築が必要となり、周囲の細胞と適切なリンクを形成する（ネットワーク形成）ために成熟した細胞ではなくニューロンへとｉｎ ｖｉｖｏにおいて分化し得る細胞を移植する必要がある。ニューロン前駆細胞の移植において上述した供給面以外で問題となるのは、前駆細胞が不均一な細胞集団へと分化する可能性がある点である。例えば、パーキンソン病の治療においては、カテコールアミン含有ニューロンの中でもドーパミン産生ニューロンを選択的に移植することが必要である。これまで、パーキンソン病の治療に用いることが提案されている移植細胞としては、線条体（Ｌｉｎｄｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６：６１５−３１；Ｗｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５５６−６３）、ヒト胎児神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ＮＴ２Ｚ細胞の有糸分裂後ヒトニューロン（特表平９−５０５０５５４号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）、ドーパミン等のカテコールアミンを産生するように外来遺伝子によりトランスフェクトされた細胞、骨髄ストロマ細胞（特表２００２−５０４５０３号公報；特表２００２−５１３５４５号公報）、遺伝子改変されたＥＳ細胞（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：５０−５６）等が挙げられる。しかしながらいずれも、ドーパミン産生ニューロンまたはドーパミン産生ニューロンへと分化する細胞のみを含むものではない。
【０００７】
未分化な細胞集団からドーパミン産生ニューロンを選択的に濃縮・分離する方法としては、ドーパミン産生ニューロンで発現するチロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）等の遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現するレポーター遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、蛍光を発する細胞を分離することにより、ドーパミン産生ニューロンを生きたまま可視化して濃縮・分離、または同定する方法（特開２００２−５１７７５号公報）が提案されている。この方法は、外来遺伝子の導入という煩雑な工程を不可欠とするものであり、さらに、遺伝子治療に用いることを目的とする場合、レポーター遺伝子の存在は毒性、免疫原性の面からも問題である。
【０００８】
Ｌｍｘ１ａは、発生中の脊髄の上衣板（最も背側の領域で分化誘導因子を分泌するオーガナイザー領域。ニューロンはここからは発生しない）、神経堤、菱脳の菱唇、発生中の大脳半球の後部において発現されているＬＩＭ型ホメオボックス遺伝子として同定された（非特許文献１及び２）。ＩＩ型脳回欠損のモデル動物であるｄｒｅｈｅｒ変異体マウスでは、Ｌｍｘ１ａの常染色体劣性変異が生じていることが明らかにされている（非特許文献１）。さらに、Ｌｍｘ１ａの変異によりｑｕｅｕｅ ｃｏｕｒｔｅ（ｑｃ）ラットにおける中枢神経系病変が引き起こされることも知られている（非特許文献３〜５）。Ｌｍｘ１ａ遺伝子は胎仔期ばかりでなく生後も発現し、大脳皮質や小脳の構築に寄与している。
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３：７６４−７６９
【非特許文献２】Ｆａｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８（１−２）：２２５−２２８
【非特許文献３】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｅ ２００１ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌｓ
【非特許文献４】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｅ １５ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
【非特許文献５】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０００）第１７回日本疾患モデル動物学会記録
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現時点でのパーキンソン病（ＰＤ）移植治療における大きな問題の一つは、中絶胎児の中脳腹側領域あるいは分化誘導されるドーパミン産生ニューロン前駆細胞は、いずれも多種の細胞の混合物である点である。神経回路形成における安全性を考えると、目的の細胞種のみを分離してから用いるのが望ましく、また腫瘍形成の危険性を考慮すれば、分裂停止後の神経細胞を分離してから使用することが良いと考えられる。さらに、細胞の移植先の脳内での生存や、正しくネットワーク形成する能力を考えると、より早期の前駆細胞を分離することにより治療効果を増大させ得ると期待される。そこで、本発明者は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子の単離を試みた。その結果、分裂停止直前及び後の神経前駆細胞で一過性に発現する遺伝子の一つとして、Ｌｒｐ４（ＷＯ ２００４／０６５５９９）及び新規遺伝子６５Ｂ１３（ＷＯ ２００４／０３８０１８）の単離に成功している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、Ｅ１２．５マウス中脳腹側領域を背腹方向にさらに２つの領域に切り分けて、ドーパミン産生ニューロンを含む最も腹側の領域に特異的に発現する遺伝子をサブトラクション法（Ｎ−ＲＤＡ；ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ法；ＲＤＡ法（Ｌｉｓｔｓｙｎ ＮＡ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１：３０３−７）を改良（「ＤＮＡ断片の量の均一化方法及びサブストラクション法」（ＷＯ ０２／１０３００７））により同定した。単離した断片の一つとして、Ｌｍｘ１ａをコードするｃＤＮＡ断片が得られた。これまで、Ｌｍｘ１ａは間脳から脊髄にかけての最背側の上衣板（ｒｏｏｆ ｐｌａｔｅ）領域、海馬及び小脳に発現することが報告されている。しかしながら、ドーパミン産生ニューロン特異的に発現していることは知られていなかった。
【００１１】
Ｌｍｘ１ａは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体において発現が維持されていた。このようにＬｍｘ１ａは、公知のマーカーとは異なった発現パターンを示した。特に増殖中の前駆細胞の段階から発現する遺伝子としての特徴を有する。そのため増殖中前駆細胞を含めたドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなる考えられた。また、公知のマーカーとの併用により、増殖中の前駆細胞と分裂停止後の前駆細胞の選別も可能にした。このように、本発明は、公知のマーカーと比較し、最も初期に発現するマーカーであるという点からも、特にドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング時の有効なマーカーとなることが期待された。
【００１２】
本発明は、具体的には次に示す通りである。
＜１＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む方法。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
＜２＞ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、上記＜１＞記載の方法。
＜３＞以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
＜４＞ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、上記＜３＞記載の試薬。
＜５＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む、方法。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
＜６＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜５＞記載の方法。
＜７＞下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
＜８＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜７＞記載の試薬。
＜９＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜１０＞さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方の遺伝子若しくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、上記＜９＞記載の方法。
＜１１＞（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、上記＜９＞記載の方法。
＜１２＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜１３＞ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列である、上記＜９＞乃至上記＜１２＞記載の方法。
＜１４＞上記＜３＞または上記＜４＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜１５＞上記＜３＞または上記＜４＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜１６＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜１７＞さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、上記＜１６＞記載の方法。
＜１８＞（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、上記＜１６＞記載の方法。
＜１９＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜２０＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜１６＞乃至上記＜１９＞記載の方法。
＜２１＞上記＜７＞または上記＜８＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜２２＞上記＜７＞または上記＜８＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜２３＞ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、以下の（ｂ−１）〜（ｂ−６）に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物を検出する工程
（ｂ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
＜２４＞ポリヌクレオチドが少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列である、上記＜２３＞記載の方法。
＜２５＞ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、下記（ｂ−１）から（ｂ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子翻訳産物を検出する工程、
（ｂ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の翻訳産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
＜２６＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜２５＞記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ドーパミン産生ニューロンマーカー遺伝子チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のマウスＥ１２．５中脳腹側での発現を示す写真である。左側は、矢状断の写真である。右側は、左側の写真の線部分での冠状断の写真である。さらに中脳部分を４領域に切りけ、ＶからＶＬを差し引いたサブトラクションを行った。Ｍｅｓ：正中面（ｍｅｓａｌ）、Ｄ：背側（ｄｏｒｓａｌ）、ＤＬ：背側側方（ｄｏｒｓａｌ ｌａｔｅｒａｌ）、ＶＬ：腹側側方（ｖｅｎｔｒａｌ ｌａｔｅｒａｌ）、及びＶ：腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）。
【図２】Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のｍＲＮＡのマウスＥ１２．５中脳における発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により解析した結果を示す写真である。
【図３】Ｌｍｘ１ａ及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質のマウスＥ１２．５中脳における共発現を免疫染色法により検出した結果を示す写真である。
【図４】Ｌｍｘ１ａ及びＥｎ１タンパク質のマウスＥ１２．５中脳の中脳における共発現を免疫染色法で検出した結果を示す写真である。
【図５】ｍｏｕｓｅＥ１２．５中脳におけるＬｍｘ１ａの発現及びＢｒｄＵの取り込みを免疫染色法で検出した結果を示す写真である。Ｌｍｘ１ａはドーパミンニューロン増殖前駆細胞において発現していることが示された。
【図６】Ｌｍｘ１ａ及びＤＡＴ ｍＲＮＡの出生後７日マウス中脳における発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により検出した結果を示す写真である。矢印は中脳黒質領域を示す。
【図７】ヒト成体脳領域におけるＬｍｘ１ａの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で検出した結果を示す写真である。ＳＮ：黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ Ｎｉｇｒａ）、Ｐｕ：被殻（Ｐｕｔａｍｅｎ）、ＣＣ：大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｃｏｒｔｅｘ）、Ｃｅ：小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、Ｈｉ：海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）、ＭＯ：延髄（Ｍｅｄｕｌｌａ Ｏｂｌｏｎｇａｔａ）、ＣＮ：尾状核（Ｃａｕｄａｔｅ Ｎｕｃｌｅｕｓ）、及びＰｏ：脳橋（Ｐｏｎｓ）。
【図８】Ｌｍｘ１ａ及びドーパミン産生ニューロン特異的マーカー遺伝子の発現タイミングを模式的に示す図である。横軸は、ドーパミン産生ニューロンの発生と成熟の時間を示す。Ｌｍｘ１ａは全ての分化段階のドーパミン産生ニューロンに発現すると考えられた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜マーカーポリヌクレオチドプローブ＞
本発明の「ドーパミン産生ニューロンマーカーポリヌクレオチドプローブ」は、増殖前及び増殖後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、並びにドーパミン産生ニューロンを選択及び／または検出するマーカーとして使用されるものである。該ポリヌクレオチドは、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から成体におけるドーパミン産生ニューロンまで、全ての分化段階を通じて発現するＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を検出できるものである。Ｌｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列は公知である。例えば、マウスＬｍｘ１ａの配列は、Ｎａｔｕｒｅ ４０３：７６４−７６９（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ ４２０：５６３−５７３（２００２）及びＭｅｃｈ．Ｄｅｖ．１１８：２２５−２２８（２００２）等の文献を参照することができ、ＧｅｎＢａｎｋにもＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０３３６５２として登録されている。またヒトＬｍｘ１ａは、Ｇｅｎｅ ２９０：２１７−２２５（２００２）に報告されている。ヒトＬｍｘ１ａのゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＨ０１１５１７として登録されており、６Ａ変異体（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿１７７３９８）等のアイソフォームも報告されている。
【００１５】
ここで、「マーカーポリヌクレオチドプローブ」とは、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでプローブとして利用可能であることが知られており、本発明のマーカーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブとなるマーカーポリヌクレオチドプローブとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。ｍＲＮＡの発現の有無によりＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を検出する場合には、Ｌｍｘ１ａをコードする領域を使用することが好ましい。マウスＬｍｘ１ａのアミノ酸配列は、ＮＰ＿３８７５０１．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録されており、ＮＭ＿０３３６５２の配列中、２２０番目から１３６８番目の塩基がそのコード領域であり、具体的配列を配列番号：１４に示した。また、ヒトＬｍｘ１ａのアミノ酸配列も公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＡＡＬ８２８９２．１等）、その具体的な配列を配列番号：１６、１８に示した。
【００１６】
また、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブは、天然以外の塩基、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等を必要に応じて含んでいてもよい。
【００１７】
本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブは、ドーパミン産生ニューロン特異的に発現するＬｍｘ１ａのｍＲＮＡに相補的な塩基配列を含む。例えば、マウスＬｍｘ１ａのｃＤＮＡの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３６５２として登録されており、その具体的配列を配列番号：１３に示した。該ｃＤＮＡに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドは、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブとして使用され得る。さらに、マウスＬｍｘ１ａのアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿３８７５０１．１として登録されているが（配列番号：１４）、それをコードする塩基配列は上述のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３６５２の塩基配列（配列番号：１３）に加えて、遺伝子暗号の縮重により該塩基配列とは異なる塩基配列が考えられる。そのような縮重配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。さらに、縮重配列以外にもＬｍｘ１ａ遺伝子（配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明のし得るマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。
また、同様にヒトについてもＬｍｘ１ａの配列が知られており（配列番号：１５、１７）、ヒトＬｍｘ１ａのｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドと縮重の関係を有するポリヌクレオチド、さらにはヒトＬｍｘ１ａ遺伝子（配列番号：１５、１７）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。
【００１８】
ここで、或る「塩基配列に対して相補的」とは、塩基配列が鋳型に対して完全に対になっている場合のみならず、そのうちの少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９７％、９８％または９９％）が対になっているものも含む。このような高い相同性を有する遺伝子同士は、同一の機能を示すポリペプチドをコードしている可能性が高いことが知られている。ここで、対になっているとは、鋳型となるポリヌクレオチドの塩基配列中のアデニン（Ａ）に対してチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））、ＴまたはＵに対しＡ、シトシン（Ｃ）に対しグアニン（Ｇ）、そしてＧに対しＣが対応して鎖が形成されていることを意味する。そして特定のヌクレオチド鎖同士の塩基配列レベルでの相同性は、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいた塩基配列の相同性を決定するためのプログラムとして、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）が開発されており、マーカーポリヌクレオチドプローブと鋳型の配列の相同性を決定するのに使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照することができる。
【００１９】
Ｌｍｘ１ａにはオルタナティブアイソフォーム及びアレリック変異体が存在する可能性がある。そのようなアイソフォーム及びアレリック変異体の発現を検出できるポリペプチドも本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブとして利用することができる。また、上述したように、互いに高い相同性を有する遺伝子同士は同一の機能を有するポリペプチドをコードしている可能性が高い。そして、このような高い相同性を有するポリヌクレオチドは、多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対形成することができる。そこで、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブには、ドーパミン産生ニューロン特異的に発現するＬｍｘ１ａをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドが包含される。これらのアイソフォーム、アレリック変異体、及び高い相同性を有するポリヌクレオチドは、例えば、公知のＬｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列を元にプローブを作成し、該プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作成方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを利用することもできる。
【００２０】
以下、より具体的なｃＤＮＡライブラリーの作製について説明する。まず、Ｌｍｘ１ａを発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９）等の公知の手法により全ＲＮＡを調製する。続いて、調製した全ＲＮＡよりｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いてｍＲＮＡを精製する。または、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような、直接ｍＲＮＡを調製するためのキットを利用してｍＲＮＡを得ることもできる。次に、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）のようなｃＤＮＡ合成のためのキットも市販されている。その他の方法として、ｃＤＮＡはＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２９１９−３２）により合成、及び増幅させてもよい。また、全長率の高いｃＤＮＡライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ（１９９４）Ｇｅｎｅ １３８：１７１−４；Ｓｕｚｕｋｉ（１９９７）Ｇｅｎｅ ２００：１４９−５６）等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたｃＤＮＡは、適当なベクター中に組み込む。
【００２１】
本発明におけるハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」及び「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分間の洗浄を３回行い、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分間の洗浄を３回行い、最後に１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分間の洗浄を２回行うことができる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分間の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分間の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、Ｌｍｘ１ａのアイソフォーム、アレリック変異体、及び他種生物由来の対応する遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ ９．４７−９．５８）、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ ６．３−６．４）、『ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．』（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ ２．１０）を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、公知のＬｍｘ１ａの塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、さらには９６％、９７％、９８％または９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、同一の相同性の決定と同様にＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−８；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）によって決定することができる。上述の塩基配列についてのプログラムＢＬＡＳＴＮの他に、このアルゴリズムに基づいたアミノ酸配列についての同一性を決定するためのプログラムとしてＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）が開発されており、アミノ酸レベルでの同一性を決定するために利用可能である。具体的な解析方法については先に述べたように、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照することができる。
【００２３】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）により、Ｌｍｘ１ａのアイソフォーム及びアレリック変異体等のＬｍｘ１ａと類似した構造及び機能を有する遺伝子を、公知のＬｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列を基にプライマーを設計し、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヒトを含む霊長類等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
【００２４】
ポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）により確認することができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００２５】
さらに、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブはＬｍｘ１ａの発現を特異的に検出することができれば良いことから、上記（１）Ｌｍｘ１ａのｍＲＮＡに相補的な配列、（２）Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な配列、及び（３）Ｌｍｘ１ａのｍＲＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の各塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドが含まれる。このような少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｌｍｘ１ａ ｍＲＮＡの発現を検出するためのプローブ、Ｌｍｘ１ａ ｍＲＮＡを増幅して検出するためのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして利用することができる。通常、プローブとして使用する場合には、１５〜１００、好ましくは１５〜３５個の塩基より構成されたポリヌクレオチドであることが望ましい。また、プライマーとして使用する場合には、少なくとも１５個以上、好ましくは３０個前後の塩基より構成されるポリヌクレオチドが望ましい。プライマーとして使用する場合には、ポリヌクレオチドの３’末端側の領域を標的とする配列に対して相補的にし、５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。このような少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｌｍｘ１ａ ｍＲＮＡに対してハイブリダイズすることができる。
【００２６】
本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブは、Ｌｍｘ１ａを発現する細胞より上述のハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等を利用して調製することができる。また、Ｌｍｘ１ａの公知の配列情報に基づいて化学合成により製造することもできる。特に組織中のＲＮＡの検出に好ましいとされるリボプローブは、クローニングしたＬｍｘ１ａ遺伝子またはその一部をプラスミドベクターｐＳＰ６４に逆方向に挿入し、挿入した配列部分をランオフ転写することにより得ることができる。ｐＳＰ６４はＳＰ６プロモーターを含むものであるが、その他、ファージＴ３、Ｔ７プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを組み合わせてリボプローブを作製する方法も公知である。
【００２７】
＜抗体＞
本発明により、ドーパミン産生ニューロンの組織免疫染色等に利用することができる抗Ｌｍｘ１ａ抗体が提供される。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）ｐｐ．２６９−３１５）、ヒト化抗体、多特異性抗体（ＬｅＤｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５８−６２；Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．７８：１１８−３２；Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ（１９８６）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０５：１７６−２６０；ＶａｎＤｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：９４４−９）、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。さらに本発明の抗体は必要に応じ、ＰＥＧ等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、ＧＳＴ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることもできる。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。
【００２８】
本発明の抗体は、（１）Ｌｍｘ１ａ遺伝子（配列番号：１３、１５、１７）によりコードされるポリペプチド、（２）Ｌｍｘ１ａポリペプチド（配列番号：１４、１６、１８）、（３）Ｌｍｘ１ａポリペプチド（配列番号：１４、１６、１８）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列（配列番号：１３、１５、１７）に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるポリペプチド、並びに（５）前記（１）〜（４）のポリペプチドのうちの抗体を誘導し得る抗原性を備えている一部断片、例えば、少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）、のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００２９】
本発明の抗体は、Ｌｍｘ１ａポリペプチド若しくはその断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として製造することができる。また、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの短い断片はウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等のキャリアに結合させて免疫原として用いてもよい。また、Ｌｍｘ１ａポリペプチドまたはその断片と共に、アルミニウムアジュバント、完全（または不完全）フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。
【００３０】
ヒト、マウス等由来の天然Ｌｍｘ１ａを本発明の抗体を得るための「Ｌｍｘ１ａポリペプチド」として挙げることができる。また、Ｌｍｘ１ａポリペプチドを構成するアミノ酸残基は天然アミノ酸でも、修飾されたものであっても良い。さらに、その他のペプチド配列により修飾された融合蛋白質も本明細書中のＬｍｘ１ａポリペプチドに含まれる。
【００３１】
本発明の抗体を得るためのＬｍｘ１ａポリペプチドは、Ｌｍｘ１ａの抗原性を有していればよく、天然Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが包含される。１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドで元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４０９−１３）。ある蛋白質において、元の蛋白質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７），Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１−８．５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２：２７１−５；Ｋｉｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２；Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６）。
【００３２】
本発明の抗体には、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの一部に対して特異的な抗体も含まれる。即ち、本発明の抗体を得るためのＬｍｘ１ａポリペプチドには、Ｌｍｘ１ａの全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、Ｌｍｘ１ａの少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片である。特に好ましい断片としては、Ｌｍｘ１ａのアミノ末端、カルボキシル末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。αヘリックス及びαヘリックス形成領域、α両親媒性領域、βシート及びβシート形成領域、β両親媒性領域、基質結合領域、高抗原指数領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、ターン及びターン形成領域、並びに表面形成領域を含む断片がＬｍｘ１ａポリペプチド断片に含まれる。本明細書におけるＬｍｘ１ａポリペプチド断片は、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。ポリペプチドの抗原決定部位は、蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−２２）、二次構造を解析する方法（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ（１９７８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−７６）により推定し、さらにコンピュータープログラム（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５４０−６（１９８５））または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
【００３３】
Ｌｍｘ１ａポリペプチド、及びポリペプチド断片は、Ｌｍｘ１ａを発現する細胞、組織または臓器よりその物理的性質に基づいて単離することができる。または、公知の遺伝子組換え技術、化学的な合成法等により製造することもできる。例えば、Ｌｍｘ１ａポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで製造する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスレーション（Ｄａｓｓｏ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３１２９−４４）の方法に従って、細胞を含まない試験管内の系でポリペプチドを製造することができる。それに対して、細胞を用いてポリペプチドを製造する場合には、まず所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞を選択して該発現ベクターにより形質転換する。続いて、形質転換された宿主細胞をポリペプチド発現が最も効率よく行われる条件下で培養することにより、所望のポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
ポリペプチドを発現させるためのベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ等の種々の由来のベクターを挙げることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７））。ベクターは制御配列を有し、ベクターが導入された宿主細胞内で所望のポリヌクレオチドが発現されるように、ポリヌクレオチドは該制御配列下に結合される。ここで、「制御配列」とは、宿主細胞が原核生物であれば、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターが含まれる。また宿主細胞が真核生物の場合には、プロモーター及びターミネーターが含まれ、場合によってトランスアクチベーター、転写因子、転写物を安定化するポリＡシグナル、スプライシング及びポリアデニル化シグナル等が含まれる。このような制御配列は、それに連結されるポリヌクレオチドの発現に必要とされる全ての構成成分を含む。ベクターには更に選択のためのマーカーが含まれていてもよい。その他、細胞内で発現されたポリペプチドを小胞体内腔、細胞外、またはグラム陰性菌を宿主とする場合にはペリプラズム内へと移行させるために必要とされるシグナルペプチドを目的のポリペプチドに付加するように発現できる塩基配列を発現ベクターに組み込むこともできる。このようなシグナルペプチドとしては、異種蛋白質由来の各種シグナルペプチドが公知であり利用できる。さらに、必要に応じリンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の挿入を行ってもよい。
【００３５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるポリペプチドの発現を可能にするベクターとしては、ｐＢＥＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を例示することができる。また、原核細胞宿主における発現に適した種々のベクターが公知である（『微生物学基礎講座８遺伝子工学』（共立出版）等参照）。当業者であれば、選択した宿主に適したベクター及びベクターの宿主への導入方法を適宜選択することができる。種々の宿主細胞が公知である。例えば、酵母、カビ等の真菌類、高等植物、昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類等の細胞、種々の培養細胞系（ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ミエローマ、Ｖｅｒｏ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９号公報）等）もＬｍｘ１ａポリペプチド及びその抗原性断片を発現させる宿主として利用することができ、各細胞に適したベクター系、ベクターの宿主細胞への導入手法も公知である。さらに、動物の生体内（Ｓｕｓｕｍｕ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−４；Ｌｕｂｏｎ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．４：１−５４等参照）、及び植物体において外来蛋白質を発現させる方法も公知でありＬｍｘ１ａポリヌクレオチドを発現させるために利用することができる。
【００３６】
ベクターへのＤＮＡの挿入は、制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）Ｓｅｃｔｉｏｎ ５．６１−５．６３）。また必要に応じ、使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高い塩基配列を選択し、Ｌｍｘ１ａポリペプチド発現ベクターを設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：ｒ４３−７４）。Ｌｍｘ１ａポリペプチドを産生する宿主は、Ｌｍｘ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に含むものであるが、該ポリヌクレオチドが適切に発現される限り、該ポリヌクレオチド自身のプロモーター支配下にあっても、ゲノム中に組み込まれていても、または染色体外の構造として保持されていても良い。
【００３７】
宿主細胞の培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、動物細胞を宿主とする場合、ＤＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、ＭＥＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １２２：５０１（１９５２））、ＲＰＭＩ１６４０（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、１９９（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１（１９５０））、ＩＭＤＭ等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加し、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
【００３８】
通常、遺伝子組換え技術により製造されたＬｍｘ１ａポリペプチドはまず、ポリペプチドが細胞外に分泌される場合には培地を、宿主がトランスジェニック生物の場合には体液等を、細胞内に産生される場合には細胞を溶解した溶解物を回収する。そして、蛋白質の精製方法として公知の塩析、蒸留、各種クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ゲル濾過、限外濾過、再結晶、酸抽出、透析、免疫沈降、溶媒沈澱、溶媒抽出、硫安またはエタノール沈澱等を適宜組み合わせることにより所望のポリペプチドを精製する。クロマトグラフィーとしては、アニオンまたはカチオン交換等のイオン交換、アフィニティー、逆相、吸着、ゲル濾過、疎水性、ヒドロキシアパタイト、ホスホセルロース、レクチンクロマトグラフィー等が公知である（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。各種カラムを使用して、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーにより蛋白質の精製を行うことができる。また、例えば、ＧＳＴとの融合蛋白質として所望の蛋白質を発現させた場合には、グルタチオンカラムを用いた精製法が有効である。一方、ヒスチジンタグを付加した融合蛋白質とした場合にはニッケルカラムを用いた精製法が利用できる。Ｌｍｘ１ａポリペプチドを融合蛋白質として製造した場合には、必要に応じて精製後にトロンビンまたはファクターＸａ等の酵素を使用して不要な部分を切断することもできる。
【００３９】
天然由来のポリペプチドをその物理的性質に基づいて精製し、本発明の抗体を得るための抗原として利用してもよい。さらに、精製したポリペプチドを必要に応じキモトリプシン、グルコシダーゼ、トリプシン、プロテインキナーゼ、リシルエンドペプチダーゼ等の酵素を用いて修飾することもできる。一方、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの断片は、上述のＬｍｘ１ａポリペプチドと同様の化学合成及び遺伝子工学的な手法に加えて、ペプチダーゼ等の適当な酵素を使用したＬｍｘ１ａポリペプチドの切断により製造することもできる。
【００４０】
ドーパミン産生ニューロン特異的なポリクローナル抗体は、例えば、精製されたＬｍｘ１ａポリペプチドまたはその断片を、必要に応じアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より採取される血清より得ることができる。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましくはフロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２−１１．１３）を参照することができる。
【００４１】
また、モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等と用いて融合してハイブリドーマを作成する。細胞の融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６）に準じて行うことができる。ミエローマ細胞としては、特に、薬剤により融合細胞を選択できるようにする細胞が好ましい。このような薬剤による選択が可能なミエローマを使用した場合、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノプレテリン及びチミジンを含む培養液（ＨＡＴ培養液）で培養することにより融合されたハイブリドーマを選択することができる。次に、作成されたハイブリドーマの中から、Ｌｍｘ１ａポリペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。また、具体的な方法として、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１）を参照することもできる。
【００４２】
ハイブリドーマは、その他、最初にＥＢウイルスに感染させたヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞（Ｕ２６６等）と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法（特開昭６３−１７６８８号公報）によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる（ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９３／０２２２７；ＷＯ９４／０２６０２；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６等）。ハイブリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
【００４３】
また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ（１９９０）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｅｓ ＬＴＤ．，ＵＫ参照）。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）からクローニングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産生させる。このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。代表的な組換え型の抗体として、非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト抗体由来フレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げられる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−９；Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−６；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：９９−１２１（１９９１））。
【００４４】
抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造することができる。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９６８−７６；Ｂｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：６５２−６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８６）１２１：６６３−９；Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３２−７参照）。
【００４５】
多特異性抗体には、二特異性抗体（ＢｓＡｂ）、ダイアボディ（Ｄｂ）等が含まれる。多特異性抗体は、（１）異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法（Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｏｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｌｌ．７８：１１８−３２）、（２）異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを融合する方法（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−９）、（３）異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子（４種類のＤＮＡ）によりマウス骨髄種細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクトした後、二特異性の一価部分を単離する方法（Ｚｉｍｍｅｒｅｍａｎｎ（１９８６）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０５：１７６−２６０；Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：９４４−９）等により作製することができる。一方、Ｄｂは遺伝子融合により構築される二価の２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１参照）。
【００４６】
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインＡ及びＧを用いて行うことができる。その他、抗体以外のポリペプチドと同様に、上記した蛋白質精製技術によって精製することもできる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインＡを利用する場合、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のプロテインＡカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等により決定することができる。
【００４７】
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法により測定する場合、本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、次いでＬｍｘ１ａポリペプチドを添加した後、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産生細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加されている標識の検出を行う。即ち、二次抗体が例えばアルカリホスファターゼで標識されている場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の市販の系を使用することもできる。
【００４８】
＜ドーパミン産生ニューロンの検出＞
本発明によりドーパミン産生ニューロンを選択的に検出する方法が提供された。分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞から成熟ドーパミン産生ニューロンを含む全ての分化段階のドーパミン産生ニューロンをＬｍｘ１ａの発現を指標として検出することができる。本発明のポリヌクレオチドまたは抗体を用いたドーパミン産生ニューロンを検出する方法は、パーキンソン病等、ドーパミン産生ニューロンの脱落が関連する疾患の診断において使用することができる。ドーパミン産生ニューロンは、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体を用いて検出することができる。
【００４９】
より具体的には、本発明は、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブとドーパミン産生ニューロンを含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含むドーパミン産生ニューロンを検出する方法を提供するものである。該方法においては、マーカーポリヌクレオチドプローブを好ましくは放射性同位体または非放射性化合物で標識しておく。例えば、標識するための放射性同位体としては、３５Ｓ、３Ｈ等を挙げることができる。放射標識したマーカーポリヌクレオチドプローブを用いた場合、エマルションオートラジオグラフィーにより銀粒子を検出することによりマーカーと結合するＲＮＡを検出することができる。また、マーカーポリヌクレオチドプローブ標識のため慣用の非放射性同位体としては、ビオチン、ジゴキシゲニン等が公知である。ビオチン標識マーカーの検出は、例えば、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識したアビジンを用いて行うことができる。一方、ジゴキシゲニン標識マーカーの検出には、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識した抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。酵素標識を使用する場合には、酵素の基質と共にインキュベートし、安定な色素をマーカー位置に沈着させることで検出を行う。特に蛍光を利用した、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は簡便な、ドーパミン産生ニューロンの検出に好ましい方法である。
【００５０】
また、本発明により、抗Ｌｍｘ１ａ抗体とドーパミン産生ニューロンを含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含むドーパミン産生ニューロンの検出方法が提供される。即ち、ドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞を含むことが予測される細胞試料と本発明の抗体とを接触させ、抗体に結合する細胞を選択することでＬｍｘ１ａポリペプチドを発現している細胞、成熟ドーパミン産生ニューロンから増殖前の前駆細胞を含む全分化段階のドーパミン産生ニューロンを検出・選択することができる。また、この検出・選択を簡便にするために、本発明の抗体を固相に固定化したり、標識化することもできる。検出目的の場合には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン等の技術を組み合わせることができる。選択したドーパミン産生ニューロンやその前駆細胞の精製を必要とする場合には、本発明の抗体をアフィニティークロマトグラフィーに応用することができる。
【００５１】
また本発明のマーカーと既存のドーパミン産生ニューロンあるいはその前駆細胞を検出するマーカーとを組合せることにより、前駆細胞と成熟ニューロンとの選別、さらには前駆細胞の中でも分裂前前後の細胞を選別することも可能となる。
例えば、前駆細胞と成熟ニューロンとの選別は、マーカーとしてＬｍｘ１ａと、ＤＡＴおよび／またはＡＤＨ２とを組合せることにより実施することができる。Ｌｍｘ１ａ遺伝子は上述の通り分裂前の前駆細胞から成熟ドーパミン産生ニューロンまでの分化において広範囲で発現が確認されている。一方、ＤＡＴ、ＡＤＨ２遺伝子は、後述する実施例に示す通りドーパミン産生ニューロンへ分化した後に発現する。したがって、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは本発明の抗体により検出するともに、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現が検出された細胞における、ＤＡＴ遺伝子、ＡＤＨ２遺伝子の一方または双方の発現を解析することにより、前駆細胞と成熟したニューロンとを区別して検出・選択を行うことができる。
【００５２】
本発明の第一のドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞の検出・選択方法はとしては、次の（ａ）、（ｂ）工程が含まれる。
（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００５３】
本発明の第二のドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞の検出・選択方法はとしては、次の（ａ）、（ｂ）工程が含まれる。
（ａ）Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００５４】
上記第一の方法および第二の方法のいずれにおいても（ａ）工程において、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現が解析される。第一の方法のようにＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を転写レベルで検出するためには、「Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド」が用いられる。このポリヌクレオチドは、上述した本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブを利用することができる。第二の方法のようにＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を翻訳レベルで検出するためには、「Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体」が用いられる。この抗体は上述した本発明の抗Ｌｍｘ１ａ抗体を用いることができる。このようにいずれの方法において、（ａ）工程においても、Ｌｍｘ１ａの発現が解析される。
（ｂ）工程では、成熟ドーパミン産生ニューロンに分化した細胞であるかを検討するために、ＤＡＴおよび／またはＡＤＨ２遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づき検討する。
このＤＡＴ遺伝子の発現を転写産物に基づいて検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、ＤＡＴｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＤＡＴ検出用ポリヌクレオチドは、ＤＡＴｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）ＤＡＴｃＤＮＡ（配列番号３９、４１）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）ＤＡＴ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：４０、４２に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）配列番号：３９、４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＤＡＴ遺伝子の発現を検出する場合には、ＤＡＴと結合する抗体を用いる。ＤＡＴと結合する抗体としては、（１）ＤＡＴポリペプチド（配列番号：４０または４２）、（２）ＤＡＴポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４０または４２）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００５５】
同様に、ＡＤＨ２遺伝子の発現を転写産物に基づいて検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、ＡＤＨ２ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＡＤＨ２検出用ポリヌクレオチドは、ＡＤＨ２ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）ＡＤＨ２ｃＤＮＡ（配列番号４３、４５）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）ＤＡＴ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：４４、４６に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）ＡＤＨ２ｃＤＮＡ（配列番号：４３、４５）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＡＤＨ２遺伝子の発現を検出する場合には、ＡＤＨ２と結合する抗体を用いる。ＡＤＨ２と結合する抗体としては、（１）ＡＤＨ２ポリペプチド（配列番号：４４または４６）、（２）ＡＤＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４４または４６）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００５６】
上述のように、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現が検出された細胞群からＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出された細胞群を差分することにより、前駆細胞を選択的に検出・選択することができる。なお、このＬｍｘ１ａ遺伝子発現の検出と、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現の検出は同時に行っても、前後して行ってもよい。同時に行う場合には、一例としては、それぞれ検出するためのプローブ等に異なる標識を付加することにより、同時にそれぞれの遺伝子発現を検出してもよい。また前後して行う場合には、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現が検出された細胞を選択してから、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現の有無を確認してもよく。また、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出されなかった細胞群に対して、Ｌｍｘ１ａ遺伝子を発現する群を選択してもよい。
【００５７】
次に、前駆細胞中の分裂前後の細胞群を区別して検出・選択する場合には、マーカーとして（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子と、（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子とを組合せることにより実施することができる。
Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨは、前駆細胞のうち、分裂停止後に発現する遺伝子群である。そのため、これら遺伝子の発現は、分裂停止後の前駆細胞を見分ける際に利用し得る。一方、Ｌｍｘ１ａ遺伝子は、分裂停止前の増殖中の前駆細胞においても発現している。そのため、Ｌｍｘ１ａ遺伝子を発現し、かつ（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３またはＴＨが発現していない細胞を検出・選択することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のうちでも分裂停止前の増殖前駆細胞の検出・選択が可能となる。
【００５８】
具体的には、本発明の第一のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を分裂停止前後の前駆細胞とで分けて検出または選択する方法は、次の（ａ）および（ｂ）工程から構成される。
（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００５９】
本発明の第二のドーパミン産生ニューロン前駆細胞をを分裂停止前後の前駆細胞とで分けて検出または選択する方法は、次の（ａ）および（ｂ）工程から構成される。
（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００６０】
上記第一の方法、第二の方法のいずれにおいても、（ａ）工程は、上述した「Ｌｍｘ１ａとＤＡＴ等とを用いて前駆細胞を選択する方法」と同様に、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づいて検出する。なお、このＬｍｘ１ａ遺伝子発現を検出する方法、材料は、上述した「Ｌｍｘ１ａとＤＡＴ等とを用いて前駆細胞を選択する方法」と同様である。
（ｂ）工程では、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のうち分裂停止後の前駆細胞を見分けるために、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づいて解析する。
【００６１】
「Ｌｍｘ１ｂ遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｌｍｘ１ｂｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＬｍｘ１ｂ検出用ポリヌクレオチドは、Ｌｍｘ１ｂｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｌｍｘ１ｂｃＤＮＡ（配列番号１９、２１）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｌｍｘ１ｂ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：２０、２２に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）配列番号：１９、２１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＬｍｘ１ｂ遺伝子の発現を検出する場合には、Ｌｍｘ１ｂと結合する抗体を用いる。Ｌｍｘ１ｂと結合する抗体としては、（１）Ｌｍｘ１ｂポリペプチド（配列番号：２０または２２）、（２）Ｌｍｘ１ｂポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２０または２２）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６２】
「Ｎｕｒｒ１遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｎｕｒｒ１ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＮｕｒｒ１検出用ポリヌクレオチドは、Ｎｕｒｒ１ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｎｕｒｒ１ｃＤＮＡ（配列番号２３、２５）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｎｕｒｒ１遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：２４、２６に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）Ｎｕｒｒ１ｃＤＮＡ（配列番号：２３、２５）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＮｕｒｒ１遺伝子の発現を検出する場合には、Ｎｕｒｒ１と結合する抗体を用いる。Ｎｕｒｒ１と結合する抗体としては、（１）Ｎｕｒｒ１ポリペプチド（配列番号：２４または２６）、（２）Ｎｕｒｒ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２４または２６）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６３】
「Ｅｎ１遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｅｎ１ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＥｎ１検出用ポリヌクレオチドは、Ｅｎ１ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｅｎ１ｃＤＮＡ（配列番号２７、２９）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｅｎ１遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：２８、３０に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）Ｅｎ１ｃＤＮＡ（配列番号：２７、２９）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＥｎ１遺伝子の発現を検出する場合には、Ｅｎ１と結合する抗体を用いる。Ｅｎ１と結合する抗体としては、（１）Ｅｎ１ポリペプチド（配列番号：２８または３０）、（２）Ｅｎ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２８または３０）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６４】
「Ｐｔｘ３遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｐｔｘ３ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＰｔｘ３検出用ポリヌクレオチドは、Ｐｔｘ３ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｐｔｘ３ｃＤＮＡ（配列番号３１、３３）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｐｔｘ３遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：３２、３４に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）Ｐｔｘ３ｃＤＮＡ（配列番号：３１、３３）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＡＤＨ２遺伝子の発現を検出する場合には、Ｐｔｘ３と結合する抗体を用いる。Ｐｔｘ３と結合する抗体としては、（１）Ｐｔｘ３ポリペプチド（配列番号：３２または３４）、（２）Ｐｔｘ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３２または３４）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６５】
「ＴＨ遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、ＴＨｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＴＨ検出用ポリヌクレオチドは、ＴＨｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）ＴＨｃＤＮＡ（配列番号：３５、３７）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）ＴＨ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：３６、３８に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）ＴＨｃＤＮＡ（配列番号：３５、３７）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＴＨ遺伝子の発現を検出する場合には、ＴＨと結合する抗体を用いる。ＴＨと結合する抗体としては、（１）ＴＨポリペプチド（配列番号：３６または３８）、（２）ＴＨポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３６または３８）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
これら（ｂ）工程で使用し得るマーカー遺伝子のうち、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１をマーカーとして選択することが好ましい。これら三つの遺伝子の発現は、分裂停止後直ちに検出することができることから、前駆細胞の分裂停止前後の細胞をより正確に区別して検出、選択することが可能となる。
【００６６】
上述のように、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現が検出された細胞群からＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３またはＴＨ遺伝子の発現が検出された細胞群を差分することにより、前駆細胞のうち、分裂停止前の増殖前駆細胞を選択的に検出・選択することができる。
上記においては、（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現検出工程、（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現検出工程の順で説明をしたが、本方法はこの順に制限されるものではない。
Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現の検出と、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現検出を異なる標識等を用いて同時行ってもよい。また、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現検出の後にＬｍｘ１ａ遺伝子発現の検出を行ってもよい。この場合、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現が検出されなかった細胞群に対して、Ｌｍｘ１ａ遺伝子を発現する群を選択することにより、増殖前駆細胞を選択することができる。
【００６７】
上記前駆細胞を分裂停止前後で区別して検出・選択する方法にさらに、上述した成熟ドーパミン産生ニューロンに分化した細胞を検出するマーカー、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現検出工程を加えることにより、「分裂停止前ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞」、「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞」、「成熟ドーパミン産生ニューロン」とを区別して検出・選択することができる。
一例を示せば、先ず、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を上述したプローブまたは抗体等を用いて検出し、ドーパミン産生ニューロンおよび前駆細胞を選択する。次いで、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現を指標に選択された細胞群のうち、ＤＡＴ遺伝子またはＡＤＨ２遺伝子の発現をそれぞれのプローブまたは抗体等により検討する。ここで、ＤＡＴ遺伝子またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出された細胞は、成熟ドーパミン産生ニューロンとして検出・選択される。一方、ＤＡＴ遺伝子またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出されなかった細胞群は、さらにＬｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子の発現を検討する。ここで、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子の発現が検出された細胞は分裂停止後の前駆細胞であり、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子の発現が検出されなかった細胞は分裂停止前増殖前駆細胞であると、識別することができる。なお、本発明におけるドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞の選択・検出方法は、ここで示した検出の順序には制限されることはなく、検出工程の順序は任意に決定することができる。
【００６８】
また、本発明のドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞等の検出・選択方法に使用するプローブ・プライマーの設計条件、ストリンジェントな条件、ハイブリダイズの定義については、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現検出用プローブ・プライマーにおける条件等と同様である。また、本発明のドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞等の検出・選択方法に使用する抗体の作成の方法、抗体の種類などについても、上記抗Ｌｍｘ１ａ抗体と同様である。
【００６９】
また、本発明はドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキットを提供する。上述のように、本発明のＬｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択される１または複数の遺伝子に対するマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体を組合せることにより、前駆細胞を選択的に、または前駆細胞における分裂停止前後の細胞群を区別して検出・選択することが可能となった。したがって、上記Ｌｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択される１または複数の遺伝子に対するマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体とを組合せた試薬セットは、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキットとして有用である。例えば、ここでＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群から、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨのいずれか一つまたは複数を選択し、そのマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体と、Ｌｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体とを組合せることにより、前駆細胞のうち、分裂停止前後の前駆細胞を識別して検出・選択するキットとして有効となる。またＤＡＴまたはＡＤＨ２を選択し、そのマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体と、Ｌｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体とを組合せることにより、前駆細胞と成熟ニューロンとを識別して検出・選択するキットとして有効となる。
【００７０】
＜ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング＞
Ｌｍｘ１ａは比較的早い発生段階からドーパミン産生ニューロン特異的に発現するマーカーであるので、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも考えられる。即ち、適当な細胞試料に被験物質を作用させ、Ｌｍｘ１ａの発現を検出することにより、該被験物質にドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力があるかどうかを決定することができる。従って、本発明はＬｍｘ１ａの発現を指標とするドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供するものである。Ｌｍｘ１ａの発現は、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体のいずれかを用いて検出することができる。
【００７１】
ここで使用する細胞試料は好ましくは、中脳腹側領域の細胞、または多分化能を有するＥＳ細胞等、ドーパミン産生ニューロンへと分化誘導され得る細胞を含む細胞試料である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドーパミン産生ニューロンの分化誘導は、公知のＥＳ細胞、骨髄間質細胞、神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）等の細胞を出発材料とする方法が公知である。さらに、線条体及び皮質等の通常非ドーパミン産生神経組織からドーパミン産生細胞を誘導する方法も知られている（特表平１０−５０９３１９号公報）。従って、好ましくはこれらの細胞をドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬の候補化合物を作用させる細胞試料として用いる。
【００７２】
ここで、細胞と接触させる被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。本方法によりスクリーニングされた被験物質は、ドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を示す。従って、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬として、ドーパミン産生ニューロンにおける何等かの欠陥が病因となっている疾病の治療薬候補となり得、有用と考えられる。
【００７３】
細胞の分化は、被験物質と接触させない場合におけるＬｍｘ１ａ発現のレベルと比較することにより判定することができる。また、Ｌｍｘ１ａ発現と合わせ、細胞の状態を比較することにより細胞の分化の判定を行ってもよい。例えば、細胞の分化を、顕微鏡下において形態学的な観察を行うこと、または、細胞で産生されるドーパミン等の物質を検出、定量して検出してもよい。
【００７４】
＜Ｌｍｘ１ａの発現領域解析＞
Ｌｍｘ１ａの発現制御領域は、Ｌｍｘ１ａの遺伝子配列を利用してゲノムＤＮＡから公知の方法によってクローニングすることができる。例えば、Ｓ１マッピング法のような転写開始点の特定方法（細胞工学 別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，東京大学医科学研究所制癌研究部編，秀潤社（１９９３）ｐｐ．３６２−３７４）が公知であり、利用できる。一般に、遺伝子の発現制御領域は、遺伝子の５’末端の１５〜１００ｂｐ、好ましくは３０〜５０ｂｐをプローブＤＮＡとして利用して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングすることができる。このようにして得られるクローンは、１０ｋｂｐ以上の５’非翻訳領域を含むものであるので、次にエキソヌクレアーゼ等により処理し短縮化または断片化する。最後に、短縮された発現制御領域の候補を含む配列部分をレポーター遺伝子を利用して、その発現の有無、強さ、制御等について評価し、Ｌｍｘ１ａ発現制御領域の活性維持のための最小必要単位を決定することができる。
【００７５】
遺伝子の発現制御領域は、Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ等のプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ．／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔｍｌ；Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １９９６ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ ｅｄ．，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，（１９９６））を用いて予測することもできる。さらに、発現制御領域の活性最小単位を予測するプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｃｉ．ｃｂｓ．ｕｍｎ．ｅｄｕ．／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｏｓｃａｎ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃａｎ．ｈｔｍ；Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：９２３−３２）も公知であり、用いることができる。
【００７６】
このようにして単離された、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現領域は、ｉｎ ｖｉｖｏでドーパミン産生ニューロンの全ての発生段階において、ドーパミン産生ニューロン特異的に所望のポリペプチド／蛋白質を産生するのに利用することができる。また、Ｌｍｘ１ａは比較的早い発生段階からドーパミン産生ニューロン特異的に発現するマーカーであるので、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも考えられる。即ち、まず、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現領域の制御下に検出可能なレポーター遺伝子を導入したベクターを作成し、該ベクターで形質転換した適当な細胞を作成する。次に、該細胞を被験物質と接触させ、該被験物質によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうかを検出する。レポーター遺伝子の発現が検出された場合、該被験物質は、ドーパミン産生ニューロンの分化を誘導すると判定される。
【００７７】
＜Ｌｍｘ１ａ結合蛋白質＞
ホメオボックス遺伝子がコードする蛋白質では類似した６０アミノ酸残基から成る配列が保存されている。この保存された領域はホメオドメインと呼ばれ、ホメオドメインをコードするＤＮＡ領域はホメオボックスと称される。ホメオドメインはヘリックス・ターン・ヘリックス構造をとるＤＮＡ結合ドメインを構成し、ＤＮＡの二本鎖の溝に入り込み特定の塩基配列に結合する。それによりホメオボックス遺伝子の産物は、他の遺伝子の転写を活性化または不活性化する転写因子として機能すると考えられている。一方、ＬＩＭドメインは６つのシステインと１つのヒスチジンの位置が保存された６０アミノ酸残基からなる、Ｚｎフィンガーと類似した構造を示す。Ｚｎフィンガーと異なりＤＮＡ結合能は検出されておらず、蛋白質間の相互作用に関与していると考えられている。ＬＩＭドメインが、ホメオドメインと分子内結合することにより、ホメオドメインの機能を抑制し、活性化蛋白質がＬＩＭドメインと結合することによりホメオドメインがＤＮＡ結合活性を示すようになると考えられている。
Ｌｍｘ１ａ遺伝子は、ＬＩＭドメインを持つホメオボックス遺伝子であることから、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性化蛋白質と結合して他の遺伝子の転写を制御していると考えられる。従って、Ｌｍｘ１ａと結合する蛋白質は、ドーパミン産生ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化、成熟及び／または機能を制御するのに利用できる可能性がある。Ｌｍｘ１ａに対する結合蛋白質の同定においては、まず、Ｌｍｘ１ａと候補蛋白質とを接触させ、結合の有無を検定する。この際、Ｌｍｘ１ａを担体に固定することもできる。候補蛋白質は特に限定されるものではない。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、海洋生物由来の天然成分、各種細胞の抽出物、公知化合物及びペプチド、植物由来の天然成分、生体組織抽出物、微生物の培養上清、並びにファージディスプレイ法等によりランダムに製造されたペプチド群（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−１０（１９９１））が挙げられる。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、実際にＬｍｘ１ａと相互作用している蛋白質を探す上では、特にドーパミン産生ニューロンにおいて発現している蛋白質を候補蛋白質とすることが好ましい。また、結合の検出を容易にするために、候補蛋白質は標識しても良い。
【００７８】
＜Ｌｍｘ１ａの発現抑制＞
本発明により、Ｌｍｘ１ａが増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から分裂停止後までの全ての分化段階を含むドーパミン産生ニューロンに発現されることが明らかにされた。その結果、Ｌｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏにおける分化、成熟及び／または機能に関与していることが考えられた。従って、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を阻害するものは、ドーパミン産生ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化、成熟及び／または機能を制御するのに利用できる可能性がある。遺伝子の発現を阻害し得るものとして、例えば、アンチセンス、リボザイム及び２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。従って、本発明はこのようなアンチセンス、リボザイム及び２本鎖ＲＮＡを提供するものである。
【００７９】
アンチセンスが標的遺伝子の発現を抑制する機構としては、（１）３重鎖形成による転写開始阻害、（２）ＲＮＡポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（３）合成中のＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、（４）イントロン−エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（５）スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（６）ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による、ｍＲＮＡの細胞質への移行抑制、（７）キャッピング部位またはポリＡ付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（８）翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（９）リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（１０）ｍＲＮＡ翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（１１）核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島及び井上『新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７（１９９３））。
【００８０】
本発明のＬｍｘ１ａアンチセンス核酸は、上述の（１）〜（１１）のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。即ち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードするＤＮＡは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなく、効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上であり通常３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内、より好ましくは１０００ｂｐ以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の配列情報を基に、ホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９−２１）等により調製することができる。
【００８１】
リボザイムとは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザイム（ｌａｒｇｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びスモールリボザイム（ｓｍａｌｌ ｌｉｂｏｙｍｅ）に分類される。ラージリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に５’−リン酸と３’−ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザイムは、さらに（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのトランスエステル化反応を行うグループＩイントロンＲＮＡ、（２）ラリアット構造を経る二段階反応により自己スプライシングを行うグループＩＩイントロンＲＮＡ、及び（３）加水分解反応によるｔＲＮＡ前駆体を５’側で切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ成分に分類される。それに対して、スモールリボザイムは、比較的小さな構造単位（４０ｂｐ程度）であり、ＲＮＡを切断して、５’−ヒドロキシル基と２’−３’環状リン酸を生じさせる。スモールリボザイムには、ハンマーヘッド型（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）、ヘアピン型（Ｂｕｚａｙａｎ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４９；Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０：１１２）等のリボザイムが含まれる。リボザイムは、改変及び合成が容易なため多様な改良方法が公知であり、例えば、リボザイムの基質結合部を標的部位近くのＲＮＡ配列と相補的となるように設計することにより、標的ＲＮＡ中の塩基配列ＵＣ、ＵＵまたはＵＡを認識して切断するハンマーヘッド型リボザイムを作ることができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８：２２５；小泉誠及び大塚栄子（１９９０）蛋白質核酸酵素３５：２１９１；Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７０５９）。ヘアピン型のリボザイムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である（Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０：１１２）。
【００８２】
本発明のアンチセンス核酸及びリボザイムは、細胞内における遺伝子の発現を制御するために、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス由来のベクター、リポソーム等を利用した非ウイルスベクター、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡとしてｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法により遺伝子治療に用いることもできる。
【００８３】
１９９８年に、線虫においてＲＮＡ同士が邪魔し合い働きを失う現象（ＲＮＡ干渉）が観察された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１）。ＲＮＡ干渉とは、二本鎖の人工ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有するＲＮＡが分解される現象である。その後の研究により、ＲＮＡ干渉等のＲＮＡサイレンシングの現象は、欠陥を持つｍＲＮＡの排除、並びにトランスポゾン、ウイルス等の寄生体に対する防御のための細胞機構であることが示唆されている。現在では、多くの遺伝子の発現を抑制するためのツールとして、二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が利用されており、病気の原因遺伝子等の発現抑制をｓｉＲＮＡを用いて行うことにより病気を治療・予防する方法も検討されている。本発明のｓｉＲＮＡは、Ｌｍｘ１ａのｍＲＮＡの転写を阻害する限り、特に限定されない。通常、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの配列に対するセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せであり、少なくとも１０個から標的ｍＲＮＡと同じ個数までのヌクレオチド長を有する。好ましくは、１５〜７５個、より好ましくは１８〜５０個、さらに好ましくは２０〜２５個のヌクレオチド長である。
Ｌｍｘ１ａ発現を抑制するために、ｓｉＲＮＡは公知の方法により細胞に導入することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを構成する二本のＲＮＡ鎖を、一本鎖上にコードするＤＮＡを設計し、該ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を該発現ベクターで形質転換し、ｓｉＲＮＡをヘアピン構造を有する二本鎖ＲＮＡとして細胞内で発現させることができる。トランスフェクションにより持続的にｓｉＲＮＡを産生するプラスミド発現ベクターも設計されている（例えば、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ Ｖｅｃｔｏｒ、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ Ｖｅｃｔｏｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。
ｓｉＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的ｓｉＲＮＡをスクリーニングするためのキット（例えば、ＢＤ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））等も市販されており利用可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
［実施例１］ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子の単離及び配列解析
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、Ｅ１２．５マウス中脳腹側領域を背腹方向にさらに二つの領域に切り分けて、ドーパミン産生ニューロンを含む最も腹側の領域に特異的に発現する遺伝子をサブトラクション（Ｎ−ＲＤＡ）法により同定した。単離した断片の一つはＬｍｘ１ａをコードするｃＤＮＡ断片であった。Ｌｍｘ１ａは、ＬＩＭドメイン及びホメオドメインを含む蛋白質をコードしている。
１．Ｎ−ＲＤＡ法
１−１．アダプターの調製
下記のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、１００μＭに調製した。
（ａｄ２：ａｄ２Ｓ＋ａｄ２Ａ、ａｄ３：ａｄ３Ｓ＋ａｄ３Ａ、ａｄ４：ａｄ４Ｓ＋ａｄ４Ａ、ａｄ５：ａｄ５Ｓ＋ａｄ５Ａ、ａｄ１３：ａｄ１３Ｓ＋ａｄ１３Ａ）
ａｄ２Ｓ：ｃａｇｃｔｃｃａｃａａｃｃｔａｃａｔｃａｔｔｃｃｇｔ（配列番号：１）
ａｄ２Ａ：ａｃｇｇａａｔｇａｔｇｔ（配列番号：２）
ａｄ３Ｓ：ｇｔｃｃａｔｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇｔ（配列番号：３）
ａｄ３Ａ：ａｃｃａｇａｇｔｃｔｃａ（配列番号：４）
ａｄ４Ｓ：ｃｔｇａｔｇｇｇｔｇｔｃｔｔｃｔｇｔｇａｇｔｇｔｇｔ（配列番号：５）
ａｄ４Ａ：ａｃａｃａｃｔｃａｃａｇ（配列番号：６）
ａｄ５Ｓ：ｃｃａｇｃａｔｃｇａｇａａｔｃａｇｔｇｔｇａｃａｇｔ（配列番号：７）
ａｄ５Ａ：ａｃｔｇｔｃａｃａｃｔｇ（配列番号：８）
ａｄ１３Ｓ：ｇｔｃｇａｔｇａａｃｔｔｃｇａｃｔｇｔｃｇａｔｃｇｔ（配列番号：９）
ａｄ１３Ａ：ａｃｇａｔｃｇａｃａｇｔ（配列番号：１０）
１−２．ｃＤＮＡ合成
日本ＳＬＣより入手したマウス１２．５日胚より中脳腹側を切り出し、さらに背腹方向に２つの領域に切り分けた。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。制限酵素ＲｓａＩで消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、１５サイクルのＰＣＲでｃＤＮＡを増幅した。増幅条件は７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。Ｎ−ＲＤＡのＰＣＲはすべて以下の反応液組成で行った。
１−３．Ｄｒｉｖｅｒの作製
ａｄ２Ｓで増幅したｃＤＮＡをさらに５サイクルのＰＣＲで増幅した。増幅条件は９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを精製し、ＲｓａＩ消化した。１回のサブトラクションに３μｇずつ使用した。
１−４．Ｔｅｓｔｅｒの作製
ａｄ２Ｓで増幅したｃＤＮＡをさらに５サイクルのＰＣＲで増幅した。増幅条件は９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを精製し、ＲｓａＩ消化した。６０ｎｇのＲｓａＩ消化ｃＤＮＡにａｄ３を付加した。
１−５．サブトラクション１回目
上記３及び４で作製したＴｅｓｔｅｒおよびＤｒｉｖｅｒを混合し、エタノール沈殿した後に、１ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １μｌに溶解した。９８℃５分の後、１ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ＋１Ｍ ＮａＣｌ １μｌを加えた。さらに９８℃５分の後、６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたｃＤＮＡをａｄ３Ｓをプライマーとして１０サイクルのＰＣＲで増幅した後（７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１０サイクル行った）、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）で消化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。さらに１３サイクルのＰＣＲで増幅した。増幅条件は９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１３サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
１−６．均一化
サブトラクション１回目で増幅したｃＤＮＡ ８ｎｇに２ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １μｌを加えた。９８℃５分の後、１ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ＋１Ｍ ＮａＣｌ ２μｌを加えた。さらに９８℃５分の後、６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたｃＤＮＡをＲｓａＩで消化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。これをａｄ３Ｓをプライマーとして１１サイクルのＰＣＲで増幅した後（９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１１サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした）ＲｓａＩで消化し、ａｄ４を付加した。
１−７．サブトラクション２回目
上記６でａｄ４を付加したｃＤＮＡ ２０ｎｇをＴｅｓｔｅｒとして、上記３のＤｒｉｖｅｒと混合し、さらに、上記５と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にＲｓａＩ消化したｃＤＮＡにａｄ５を付加した。
１−８．サブトラクション３回目
上記７でａｄ５を付加したｃＤＮＡ ２ｎｇをＴｅｓｔｅｒとして、上記３のＤｒｉｖｅｒと混合し、さらに、上記５と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にＲｓａＩ消化したｃＤＮＡにａｄ１３を付加した。
１−９．サブトラクション４回目
上記８でａｄ１３を付加したｃＤＮＡ ２ｎｇをＴｅｓｔｅｒとして、上記３のＤｒｉｖｅｒと混合し、以下、上記５と同様の方法でサブトラクションを行った。増幅したｃＤＮＡをｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を解析した。
【００８５】
［実施例２］Ｌｍｘ１ａの発現解析
１．Ｌｍｘ１ａがドーパミン産生ニューロンに発現することを確認するため、以下のプロトコールによりｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＬｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のｍＲＮＡの発現解析を行った。Ｎｕｒｒ１及びＴＨは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されることが知られているマーカーである。また、Ｌｍｘ１ｂは、増殖前駆細胞の段階では非常に低レベルで発現され、分裂停止後に高レベルに発現し始めることが知られている転写因子マーカーである。
まず、マウス１２．５日胚を摘出し４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）で４℃、２時間固定した後、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）で４℃、一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に４％ＰＦＡで室温３０分間再固定した。ＰＢＳで洗浄した後、ハイブリダイゼーション（１μｇ／ｍｌＤＩＧ化ＲＮＡプローブ、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５０μｇ／ｍｌ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ，５０μｇ／ｍｌ Ｈｅｐａｒｉｎ）を６８℃で４０時間行った。その後、洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ）を６８℃で行い、ＲＮａｓｅ処理（０．０５μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ）を室温５分間行った。０．２ｘＳＳＣで６８℃の洗浄、１ｘＴＢＳＴで室温の洗浄ののち、ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ：Ｒｏｃｈｅ）を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＡＫＯ）を４℃で一晩反応させ、洗浄（１ｘＴＢＳＴ、２ｍＭ Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＤＡＫＯ）を基質として発色させた。
【００８６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる発現解析の結果、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるＥ１２．５で、Ｌｍｘ１ａはＴＨ、Ｌｍｘ１ｂ及びＮｕｒｒ１と同様に中脳最腹側部に発現することが明らかになった（図２）。
【００８７】
２．次にＬｍｘ１ａ特異的抗体を用いてＬｍｘ１ａ蛋白質の発現を確認した。さらに、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーであるＴＨ及びＥｎ１との二重染色も行った。Ｅｎ１はドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されるマーカーである。
抗Ｌｍｘ１ａポリクローナル抗体は、まず免疫に必要な抗原をＬｍｘ１ａの２７１−３０７アミノ酸にあたるＤＮＡ領域とＧＳＴをｆｕｓｉｏｎさせたｖｅｃｔｏｒをＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９株）にＴｒａｎｓｆｏｒｍした後ＩＰＴＧによって発現誘導して回収を行った。回収後、ウサギに免疫を行った後に採血し、その血清から免疫に用いたＧＳＴ−Ｌｍｘ１ａ抗原によるａｆｆｉｎｉｔｙ精製を行うことによって得られた。
マウス１２．５日胚を摘出し４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）で４℃、２時間固定したのち、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）で４℃、一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で３０分乾燥させ、ＰＢＳ（−）で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース）を室温、３０分間行い、一次抗体を室温、１時間反応させた後、さらに４℃、一晩反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（−）で、室温、１５分間の洗浄を３回行った。次に蛍光標識した２次抗体を室温、１時間反応させ、同様に洗浄を行った後、ＰＢＳ（−）によって室温、１０分間洗浄し、封入した。
その結果、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと同様の発現パターンが認められた（図３及び４）。Ｌｍｘ１ａ蛋白質は、Ｅ１２．５中脳においてｍＲＮＡだけでなく蛋白質としても発現していることが明らかになった。ＴＨ及びＥｎ１との二重染色の結果では、Ｌｍｘ１ａのこれらの蛋白質との同一細胞での共発現が確認され、発現領域も背−腹方向で完全に一致することが明らかになった（図３及び４）。ＴＨ及びＥｎ１と比べＬｍｘ１ａは脳質側にも発現が認められた。この領域は将来ドーパミンニューロンに分化する増殖前駆細胞が存在する領域（脳質領域（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｚｏｎｅ（ＶＺ））である。
３．そこで、Ｌｍｘ１ａが増殖前駆細胞に発現することを確認するために、マウスＥ１２．５中脳におけるＢｒｄＵの取込みとＬｍｘ１ａの発現を免疫染色法により検出した。
マウスＥ１２．５胎児を摘出する２時間前に妊娠マウスの腹腔へＢｒｄＵ（ｓｉｇｍａ）を注入し（１０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ０．９％ ｓａｌｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｇｉｖｅ ５０ｕｇ／ｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、増殖細胞のＤＮＡ中へＢｒｄＵを取り込ませた。通常の免疫染色と同様に切片を作成し、まず抗Ｌｍｘ１ａ抗体を用いてＬｍｘ１ａタンパクを検出した後、再固定（２％ＰＦＡ、室温、３０分）、塩酸処理を施し（２Ｎ ＨＣｌ、３７℃、３０分）、引き続いて抗ＢｒｄＵ抗体を用いてＢｒｄＵを検出した。
その結果、ＶＺ領域のＬｍｘ１ａ陽性細胞の多くでＢｒｄＵが取込まれていることが明らかになった（図５）。
４．出生後のマウスのドーパミン産生ニューロンにおけるＬｍｘ１ａ発現についても調べた。マウスＥ１２．５胚に代えて、出生後７日目（Ｐ７）の中脳の切片を用い、比較するマーカーとしてドーパミン産生ニューロンマーカーＤＡＴを使用した以外、上記１．の方法によりＬｍｘ１ａのマウスＰ７中脳における発現を検出した。ＤＡＴは、ドーパミン産生ニューロンの成熟が進んで初めて発現することが知られているマーカーである。
その結果、ＤＡＴの発現する領域でＬｍｘ１ａが発現していることが明らかになった（図６）。
５．さらに、ヒトにおいてもＬｍｘ１ａがドーパミン産生ニューロン特異的に発現するかについて、成体脳領域ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを行うことにより調べた。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入したヒト脳各種領域ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇに対して、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。このうち１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
２分インキュベートした。Ｎ−ＲＤＡのＰＣＲはすべて以下の反応液組成で行った。
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の反応を３７サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
以下の配列のプライマーを使用した。
Ｈｕｍａｎ Ｌｍｘ１ａ：ＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号：１１）／
ＣＡＣＣＡＣＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣ（配列番号：１２）
その結果、ヒトにおいてもＬｍｘ１ａはドーパミン産生ニューロンの存在する中脳黒質領域に発現することが明らかになった（図７）。また、海馬等他の脳領域においてもマウスと同様の発現を示し、成体のドーパミン産生ニューロンにおいても発現が維持されていることが明らかになった。
以上の結果をもとにＬｍｘ１ａのドーパミン産生ニューロンにおける発現のタイミングを他のドーパミン産生ニューロンマーカーと比較した（図８）。Ｌｍｘ１ａは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体において発現が維持される。一方、公知のＮｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３及びＴＨは分裂停止後に初めて発現が誘導され、ＤＡＴ及びＡＤＨ２は発現が進んで初めて発現を開始する。Ｌｍｘ１ｂは増殖前駆細胞でも発現が認められるが、非常に発現レベルが低く、分裂停止後に高レベルで発現する。このように公知のマーカーと発現パターンを異にするＬｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
Ｌｍｘ１ａは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体においてもドーパミン産生ニューロンにおいて発現が維持されることが明らかにされた。一方、公知のＮｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３及びＴＨ等のドーパミン産生ニューロンマーカーは、分裂停止後に初めて発現が誘導され、ＤＡＴ及びＡＤＨ２は発現が進んで初めて発現を開始する。Ｌｍｘ１ｂは増殖前駆細胞でも発現が認められるが、非常に発現レベルが低く、分裂停止後に高レベルで発現する。このように公知のマーカーと発現パターンを異にし、増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から分裂停止後までの全ての分化段階を含むドーパミン産生ニューロンに特異的に発現するＬｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなるものと考えられる（図８参照）。
【００８９】
Ｌｍｘ１ａは、公知のマーカーと比べ、最も初期に発現するマーカーであることから、細胞における該Ｌｍｘ１ａの発現を指標とすることにより、安全面、生存率及びネットワーク形成能の面でもパーキンソン病を含む神経変性疾患に対する移植治療に適した細胞を選択することを可能にする。さらに、最も初期に発現するマーカーであるという点からも、特にドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング時の有効なマーカーとなることが期待される。このような分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞（ニューロン形成における初期の前駆細胞）から成熟した細胞まで、幅広い分化段階にわたって発現している遺伝子は、ニューロンの成熟過程に関与する種々の因子、及びニューロンの機能の発現に関与する種々の因子を明らかにする上でも役立つものと考えられる。そして、このような因子の解明は、神経変性疾患の治療に大きく貢献することが予期される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドーパミン産生ニューロンにおいて特異的に発現している遺伝子Ｌｍｘ１ａに関する。該遺伝子の発現または該遺伝子によりコードされる蛋白質の発現を検出することにより、パーキンソン病（ＰＤ）等の神経変性疾患の移植治療において用いられるドーパミン産生ニューロン及びその前駆細胞を効率的に分離することができる。
【背景技術】
【０００２】
ドーパミン系は、哺乳動物の脳において重要な運動調節、ホルモン分泌調節、情動調節等に関与する非常に重要な系である。従って、ドーパミン作動性神経伝達における異常は、様々な神経系の障害を引き起こす。例えば、パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐体外路系の神経変性疾患である（ＨＡＲＲＩＳＯＮ’Ｓ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ 第２巻第２３版，Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４）ｐｐ．２２７５−７）。パーキンソン病の治療法としては、産生されるドーパミン量の低下を補うためにＬ−ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を経口投与する方法が主に採られているが、効果の持続性が良くないことが知られている。
【０００３】
失われたドーパミン産生ニューロンを補うために、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む６〜９週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する治療法も試みられている（米国特許第５６９０９２７号；Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４１−８；Ｆｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４９−５５；Ｗｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５５６−６３；Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１１１８−２４；Ｄｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｒａｉｎ １１９：４１−５０；Ｌｏｐｅｚ−Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｐ．Ｐｒｏｃ．２９：９７７−８０）。しかし、現在のところ、この方法では細胞の供給面、倫理面（Ｒｏｓｅｎｓｔａｉｎ（１９９５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３：１０６；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．３３：１０３１−７）で問題がある。また、感染汚染の危険性、免疫学的な移植片拒絶（Ｌｏｐｅｚ−Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｐ．Ｐｒｏｃ．２９：９７７−８０；Ｗｉｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｒｕｄｉｎ（１９８８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：２８７−３２４）、胎児組織が糖分解よりも脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９９５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３：１０６）等の様々な面で問題が指摘されている。
【０００４】
倫理面や供給不足の問題を解決するために、例えばブタ由来の皮質、線条、及び中脳細胞を用いる方法も提案されている（例えば、特表平１０−５０８４８７号公報；特表平１０−５０８４８８号公報；特表平１０−５０９０３４号公報参照）。この方法においては、拒絶反応を抑制するため、細胞表面上の抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）を改変するという煩雑な操作が必要とされる。移植片拒絶を解消する方法としては、例えば、セルトーリ細胞を同時に移植することにより、局在的に免疫抑制する方法も提案されている（特表平１１−５０９１７０号公報；特表平１１−５０１８１８号公報；Ｓｅｌａｗｒｙ ａｎｄ Ｃａｍｅｒｏｎ（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２：１２３−９）。ＭＨＣがマッチする血縁者、他人の骨髄、骨髄バンク、及び臍帯血バンク等から移植細胞を得ることも可能であるが、患者自身の細胞を用いることができれば、余計な操作や手間なしに拒絶反応の問題も解決することができる。
【０００５】
そこで、中絶胎児由来の細胞に代えて、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞、骨髄間質細胞などの非神経系細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドーパミン産生ニューロンの分化系の移植材料としての利用が有望視されている。実際、ラットパーキンソン病モデルの病変線条へのＥＳ細胞移植により機能的なドーパミン産生ニューロンが形成されたとの報告もある（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：５０−５６）。将来的にはＥＳ細胞若しくは患者本人の持つ神経幹細胞からの再生治療の重要性が増してくるものと思われる。
【０００６】
神経組織の損傷の治療においては脳機能の再構築が必要となり、周囲の細胞と適切なリンクを形成する（ネットワーク形成）ために成熟した細胞ではなくニューロンへとｉｎ ｖｉｖｏにおいて分化し得る細胞を移植する必要がある。ニューロン前駆細胞の移植において上述した供給面以外で問題となるのは、前駆細胞が不均一な細胞集団へと分化する可能性がある点である。例えば、パーキンソン病の治療においては、カテコールアミン含有ニューロンの中でもドーパミン産生ニューロンを選択的に移植することが必要である。これまで、パーキンソン病の治療に用いることが提案されている移植細胞としては、線条体（Ｌｉｎｄｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６：６１５−３１；Ｗｉｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５５６−６３）、ヒト胎児神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ＮＴ２Ｚ細胞の有糸分裂後ヒトニューロン（特表平９−５０５０５５４号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）、ドーパミン等のカテコールアミンを産生するように外来遺伝子によりトランスフェクトされた細胞、骨髄ストロマ細胞（特表２００２−５０４５０３号公報；特表２００２−５１３５４５号公報）、遺伝子改変されたＥＳ細胞（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８：５０−５６）等が挙げられる。しかしながらいずれも、ドーパミン産生ニューロンまたはドーパミン産生ニューロンへと分化する細胞のみを含むものではない。
【０００７】
未分化な細胞集団からドーパミン産生ニューロンを選択的に濃縮・分離する方法としては、ドーパミン産生ニューロンで発現するチロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）等の遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現するレポーター遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、蛍光を発する細胞を分離することにより、ドーパミン産生ニューロンを生きたまま可視化して濃縮・分離、または同定する方法（特開２００２−５１７７５号公報）が提案されている。この方法は、外来遺伝子の導入という煩雑な工程を不可欠とするものであり、さらに、遺伝子治療に用いることを目的とする場合、レポーター遺伝子の存在は毒性、免疫原性の面からも問題である。
【０００８】
Ｌｍｘ１ａは、発生中の脊髄の上衣板（最も背側の領域で分化誘導因子を分泌するオーガナイザー領域。ニューロンはここからは発生しない）、神経堤、菱脳の菱唇、発生中の大脳半球の後部において発現されているＬＩＭ型ホメオボックス遺伝子として同定された（非特許文献１及び２）。ＩＩ型脳回欠損のモデル動物であるｄｒｅｈｅｒ変異体マウスでは、Ｌｍｘ１ａの常染色体劣性変異が生じていることが明らかにされている（非特許文献１）。さらに、Ｌｍｘ１ａの変異によりｑｕｅｕｅ ｃｏｕｒｔｅ（ｑｃ）ラットにおける中枢神経系病変が引き起こされることも知られている（非特許文献３〜５）。Ｌｍｘ１ａ遺伝子は胎仔期ばかりでなく生後も発現し、大脳皮質や小脳の構築に寄与している。
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３：７６４−７６９
【非特許文献２】Ｆａｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８（１−２）：２２５−２２８
【非特許文献３】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｅ ２００１ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌｓ
【非特許文献４】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｅ １５ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
【非特許文献５】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０００）第１７回日本疾患モデル動物学会記録
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現時点でのパーキンソン病（ＰＤ）移植治療における大きな問題の一つは、中絶胎児の中脳腹側領域あるいは分化誘導されるドーパミン産生ニューロン前駆細胞は、いずれも多種の細胞の混合物である点である。神経回路形成における安全性を考えると、目的の細胞種のみを分離してから用いるのが望ましく、また腫瘍形成の危険性を考慮すれば、分裂停止後の神経細胞を分離してから使用することが良いと考えられる。さらに、細胞の移植先の脳内での生存や、正しくネットワーク形成する能力を考えると、より早期の前駆細胞を分離することにより治療効果を増大させ得ると期待される。そこで、本発明者は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子の単離を試みた。その結果、分裂停止直前及び後の神経前駆細胞で一過性に発現する遺伝子の一つとして、Ｌｒｐ４（ＷＯ ２００４／０６５５９９）及び新規遺伝子６５Ｂ１３（ＷＯ ２００４／０３８０１８）の単離に成功している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、Ｅ１２．５マウス中脳腹側領域を背腹方向にさらに２つの領域に切り分けて、ドーパミン産生ニューロンを含む最も腹側の領域に特異的に発現する遺伝子をサブトラクション法（Ｎ−ＲＤＡ；ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ法；ＲＤＡ法（Ｌｉｓｔｓｙｎ ＮＡ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１１：３０３−７）を改良（「ＤＮＡ断片の量の均一化方法及びサブストラクション法」（ＷＯ ０２／１０３００７））により同定した。単離した断片の一つとして、Ｌｍｘ１ａをコードするｃＤＮＡ断片が得られた。これまで、Ｌｍｘ１ａは間脳から脊髄にかけての最背側の上衣板（ｒｏｏｆ ｐｌａｔｅ）領域、海馬及び小脳に発現することが報告されている。しかしながら、ドーパミン産生ニューロン特異的に発現していることは知られていなかった。
【００１１】
Ｌｍｘ１ａは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体において発現が維持されていた。このようにＬｍｘ１ａは、公知のマーカーとは異なった発現パターンを示した。特に増殖中の前駆細胞の段階から発現する遺伝子としての特徴を有する。そのため増殖中前駆細胞を含めたドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなる考えられた。また、公知のマーカーとの併用により、増殖中の前駆細胞と分裂停止後の前駆細胞の選別も可能にした。このように、本発明は、公知のマーカーと比較し、最も初期に発現するマーカーであるという点からも、特にドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング時の有効なマーカーとなることが期待された。
【００１２】
本発明は、具体的には次に示す通りである。
＜１＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む方法。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
＜２＞ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、上記＜１＞記載の方法。
＜３＞以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
＜４＞ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、上記＜３＞記載の試薬。
＜５＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む、方法。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
＜６＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜５＞記載の方法。
＜７＞下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
＜８＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜７＞記載の試薬。
＜９＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜１０＞さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方の遺伝子若しくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、上記＜９＞記載の方法。
＜１１＞（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、上記＜９＞記載の方法。
＜１２＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜１３＞ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列である、上記＜９＞乃至上記＜１２＞記載の方法。
＜１４＞上記＜３＞または上記＜４＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜１５＞上記＜３＞または上記＜４＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜１６＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜１７＞さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、上記＜１６＞記載の方法。
＜１８＞（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、上記＜１６＞記載の方法。
＜１９＞ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
＜２０＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜１６＞乃至上記＜１９＞記載の方法。
＜２１＞上記＜７＞または上記＜８＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜２２＞上記＜７＞または上記＜８＞記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
＜２３＞ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、以下の（ｂ−１）〜（ｂ−６）に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物を検出する工程
（ｂ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
＜２４＞ポリヌクレオチドが少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列である、上記＜２３＞記載の方法。
＜２５＞ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、下記（ｂ−１）から（ｂ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子翻訳産物を検出する工程、
（ｂ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の翻訳産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
＜２６＞一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、上記＜２５＞記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ドーパミン産生ニューロンマーカー遺伝子チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のマウスＥ１２．５中脳腹側での発現を示す写真である。左側は、矢状断の写真である。右側は、左側の写真の線部分での冠状断の写真である。さらに中脳部分を４領域に切りけ、ＶからＶＬを差し引いたサブトラクションを行った。Ｍｅｓ：正中面（ｍｅｓａｌ）、Ｄ：背側（ｄｏｒｓａｌ）、ＤＬ：背側側方（ｄｏｒｓａｌ ｌａｔｅｒａｌ）、ＶＬ：腹側側方（ｖｅｎｔｒａｌ ｌａｔｅｒａｌ）、及びＶ：腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）。
【図２】Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のｍＲＮＡのマウスＥ１２．５中脳における発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により解析した結果を示す写真である。
【図３】Ｌｍｘ１ａ及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質のマウスＥ１２．５中脳における共発現を免疫染色法により検出した結果を示す写真である。
【図４】Ｌｍｘ１ａ及びＥｎ１タンパク質のマウスＥ１２．５中脳の中脳における共発現を免疫染色法で検出した結果を示す写真である。
【図５】ｍｏｕｓｅＥ１２．５中脳におけるＬｍｘ１ａの発現及びＢｒｄＵの取り込みを免疫染色法で検出した結果を示す写真である。Ｌｍｘ１ａはドーパミンニューロン増殖前駆細胞において発現していることが示された。
【図６】Ｌｍｘ１ａ及びＤＡＴ ｍＲＮＡの出生後７日マウス中脳における発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により検出した結果を示す写真である。矢印は中脳黒質領域を示す。
【図７】ヒト成体脳領域におけるＬｍｘ１ａの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で検出した結果を示す写真である。ＳＮ：黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ Ｎｉｇｒａ）、Ｐｕ：被殻（Ｐｕｔａｍｅｎ）、ＣＣ：大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｃｏｒｔｅｘ）、Ｃｅ：小脳（Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、Ｈｉ：海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）、ＭＯ：延髄（Ｍｅｄｕｌｌａ Ｏｂｌｏｎｇａｔａ）、ＣＮ：尾状核（Ｃａｕｄａｔｅ Ｎｕｃｌｅｕｓ）、及びＰｏ：脳橋（Ｐｏｎｓ）。
【図８】Ｌｍｘ１ａ及びドーパミン産生ニューロン特異的マーカー遺伝子の発現タイミングを模式的に示す図である。横軸は、ドーパミン産生ニューロンの発生と成熟の時間を示す。Ｌｍｘ１ａは全ての分化段階のドーパミン産生ニューロンに発現すると考えられた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜マーカーポリヌクレオチドプローブ＞
本発明の「ドーパミン産生ニューロンマーカーポリヌクレオチドプローブ」は、増殖前及び増殖後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、並びにドーパミン産生ニューロンを選択及び／または検出するマーカーとして使用されるものである。該ポリヌクレオチドは、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から成体におけるドーパミン産生ニューロンまで、全ての分化段階を通じて発現するＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を検出できるものである。Ｌｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列は公知である。例えば、マウスＬｍｘ１ａの配列は、Ｎａｔｕｒｅ ４０３：７６４−７６９（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ ４２０：５６３−５７３（２００２）及びＭｅｃｈ．Ｄｅｖ．１１８：２２５−２２８（２００２）等の文献を参照することができ、ＧｅｎＢａｎｋにもＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿０３３６５２として登録されている。またヒトＬｍｘ１ａは、Ｇｅｎｅ ２９０：２１７−２２５（２００２）に報告されている。ヒトＬｍｘ１ａのゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＨ０１１５１７として登録されており、６Ａ変異体（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ＿１７７３９８）等のアイソフォームも報告されている。
【００１５】
ここで、「マーカーポリヌクレオチドプローブ」とは、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでプローブとして利用可能であることが知られており、本発明のマーカーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブとなるマーカーポリヌクレオチドプローブとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。ｍＲＮＡの発現の有無によりＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を検出する場合には、Ｌｍｘ１ａをコードする領域を使用することが好ましい。マウスＬｍｘ１ａのアミノ酸配列は、ＮＰ＿３８７５０１．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録されており、ＮＭ＿０３３６５２の配列中、２２０番目から１３６８番目の塩基がそのコード領域であり、具体的配列を配列番号：１４に示した。また、ヒトＬｍｘ１ａのアミノ酸配列も公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号 ＡＡＬ８２８９２．１等）、その具体的な配列を配列番号：１６、１８に示した。
【００１６】
また、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブは、天然以外の塩基、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等を必要に応じて含んでいてもよい。
【００１７】
本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブは、ドーパミン産生ニューロン特異的に発現するＬｍｘ１ａのｍＲＮＡに相補的な塩基配列を含む。例えば、マウスＬｍｘ１ａのｃＤＮＡの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３６５２として登録されており、その具体的配列を配列番号：１３に示した。該ｃＤＮＡに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドは、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブとして使用され得る。さらに、マウスＬｍｘ１ａのアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿３８７５０１．１として登録されているが（配列番号：１４）、それをコードする塩基配列は上述のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３６５２の塩基配列（配列番号：１３）に加えて、遺伝子暗号の縮重により該塩基配列とは異なる塩基配列が考えられる。そのような縮重配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。さらに、縮重配列以外にもＬｍｘ１ａ遺伝子（配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明のし得るマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。
また、同様にヒトについてもＬｍｘ１ａの配列が知られており（配列番号：１５、１７）、ヒトＬｍｘ１ａのｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドと縮重の関係を有するポリヌクレオチド、さらにはヒトＬｍｘ１ａ遺伝子（配列番号：１５、１７）に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブに含まれる。
【００１８】
ここで、或る「塩基配列に対して相補的」とは、塩基配列が鋳型に対して完全に対になっている場合のみならず、そのうちの少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９７％、９８％または９９％）が対になっているものも含む。このような高い相同性を有する遺伝子同士は、同一の機能を示すポリペプチドをコードしている可能性が高いことが知られている。ここで、対になっているとは、鋳型となるポリヌクレオチドの塩基配列中のアデニン（Ａ）に対してチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））、ＴまたはＵに対しＡ、シトシン（Ｃ）に対しグアニン（Ｇ）、そしてＧに対しＣが対応して鎖が形成されていることを意味する。そして特定のヌクレオチド鎖同士の塩基配列レベルでの相同性は、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいた塩基配列の相同性を決定するためのプログラムとして、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）が開発されており、マーカーポリヌクレオチドプローブと鋳型の配列の相同性を決定するのに使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照することができる。
【００１９】
Ｌｍｘ１ａにはオルタナティブアイソフォーム及びアレリック変異体が存在する可能性がある。そのようなアイソフォーム及びアレリック変異体の発現を検出できるポリペプチドも本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブとして利用することができる。また、上述したように、互いに高い相同性を有する遺伝子同士は同一の機能を有するポリペプチドをコードしている可能性が高い。そして、このような高い相同性を有するポリヌクレオチドは、多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で対形成することができる。そこで、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブには、ドーパミン産生ニューロン特異的に発現するＬｍｘ１ａをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドが包含される。これらのアイソフォーム、アレリック変異体、及び高い相同性を有するポリヌクレオチドは、例えば、公知のＬｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列を元にプローブを作成し、該プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作成方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを利用することもできる。
【００２０】
以下、より具体的なｃＤＮＡライブラリーの作製について説明する。まず、Ｌｍｘ１ａを発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９）等の公知の手法により全ＲＮＡを調製する。続いて、調製した全ＲＮＡよりｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いてｍＲＮＡを精製する。または、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような、直接ｍＲＮＡを調製するためのキットを利用してｍＲＮＡを得ることもできる。次に、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）のようなｃＤＮＡ合成のためのキットも市販されている。その他の方法として、ｃＤＮＡはＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２９１９−３２）により合成、及び増幅させてもよい。また、全長率の高いｃＤＮＡライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ（１９９４）Ｇｅｎｅ １３８：１７１−４；Ｓｕｚｕｋｉ（１９９７）Ｇｅｎｅ ２００：１４９−５６）等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたｃＤＮＡは、適当なベクター中に組み込む。
【００２１】
本発明におけるハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件として「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」及び「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分間の洗浄を３回行い、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分間の洗浄を３回行い、最後に１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分間の洗浄を２回行うことができる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分間の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分間の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、Ｌｍｘ１ａのアイソフォーム、アレリック変異体、及び他種生物由来の対応する遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ ９．４７−９．５８）、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ ６．３−６．４）、『ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．』（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ ２．１０）を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、公知のＬｍｘ１ａの塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、さらには９６％、９７％、９８％または９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、同一の相同性の決定と同様にＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−８；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７）によって決定することができる。上述の塩基配列についてのプログラムＢＬＡＳＴＮの他に、このアルゴリズムに基づいたアミノ酸配列についての同一性を決定するためのプログラムとしてＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）が開発されており、アミノ酸レベルでの同一性を決定するために利用可能である。具体的な解析方法については先に述べたように、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照することができる。
【００２３】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）により、Ｌｍｘ１ａのアイソフォーム及びアレリック変異体等のＬｍｘ１ａと類似した構造及び機能を有する遺伝子を、公知のＬｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列を基にプライマーを設計し、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ヒトを含む霊長類等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
【００２４】
ポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）により確認することができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００２５】
さらに、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブはＬｍｘ１ａの発現を特異的に検出することができれば良いことから、上記（１）Ｌｍｘ１ａのｍＲＮＡに相補的な配列、（２）Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な配列、及び（３）Ｌｍｘ１ａのｍＲＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の各塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドが含まれる。このような少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｌｍｘ１ａ ｍＲＮＡの発現を検出するためのプローブ、Ｌｍｘ１ａ ｍＲＮＡを増幅して検出するためのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして利用することができる。通常、プローブとして使用する場合には、１５〜１００、好ましくは１５〜３５個の塩基より構成されたポリヌクレオチドであることが望ましい。また、プライマーとして使用する場合には、少なくとも１５個以上、好ましくは３０個前後の塩基より構成されるポリヌクレオチドが望ましい。プライマーとして使用する場合には、ポリヌクレオチドの３’末端側の領域を標的とする配列に対して相補的にし、５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。このような少なくとも連続した１５塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、Ｌｍｘ１ａ ｍＲＮＡに対してハイブリダイズすることができる。
【００２６】
本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブは、Ｌｍｘ１ａを発現する細胞より上述のハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等を利用して調製することができる。また、Ｌｍｘ１ａの公知の配列情報に基づいて化学合成により製造することもできる。特に組織中のＲＮＡの検出に好ましいとされるリボプローブは、クローニングしたＬｍｘ１ａ遺伝子またはその一部をプラスミドベクターｐＳＰ６４に逆方向に挿入し、挿入した配列部分をランオフ転写することにより得ることができる。ｐＳＰ６４はＳＰ６プロモーターを含むものであるが、その他、ファージＴ３、Ｔ７プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを組み合わせてリボプローブを作製する方法も公知である。
【００２７】
＜抗体＞
本発明により、ドーパミン産生ニューロンの組織免疫染色等に利用することができる抗Ｌｍｘ１ａ抗体が提供される。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）ｐｐ．２６９−３１５）、ヒト化抗体、多特異性抗体（ＬｅＤｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５８−６２；Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．７８：１１８−３２；Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ（１９８６）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０５：１７６−２６０；ＶａｎＤｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：９４４−９）、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。さらに本発明の抗体は必要に応じ、ＰＥＧ等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、ＧＳＴ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることもできる。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。
【００２８】
本発明の抗体は、（１）Ｌｍｘ１ａ遺伝子（配列番号：１３、１５、１７）によりコードされるポリペプチド、（２）Ｌｍｘ１ａポリペプチド（配列番号：１４、１６、１８）、（３）Ｌｍｘ１ａポリペプチド（配列番号：１４、１６、１８）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、（４）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の塩基配列（配列番号：１３、１５、１７）に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるポリペプチド、並びに（５）前記（１）〜（４）のポリペプチドのうちの抗体を誘導し得る抗原性を備えている一部断片、例えば、少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）、のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００２９】
本発明の抗体は、Ｌｍｘ１ａポリペプチド若しくはその断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として製造することができる。また、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの短い断片はウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等のキャリアに結合させて免疫原として用いてもよい。また、Ｌｍｘ１ａポリペプチドまたはその断片と共に、アルミニウムアジュバント、完全（または不完全）フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。
【００３０】
ヒト、マウス等由来の天然Ｌｍｘ１ａを本発明の抗体を得るための「Ｌｍｘ１ａポリペプチド」として挙げることができる。また、Ｌｍｘ１ａポリペプチドを構成するアミノ酸残基は天然アミノ酸でも、修飾されたものであっても良い。さらに、その他のペプチド配列により修飾された融合蛋白質も本明細書中のＬｍｘ１ａポリペプチドに含まれる。
【００３１】
本発明の抗体を得るためのＬｍｘ１ａポリペプチドは、Ｌｍｘ１ａの抗原性を有していればよく、天然Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが包含される。１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドで元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４０９−１３）。ある蛋白質において、元の蛋白質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７），Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１−８．５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２：２７１−５；Ｋｉｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−９２；Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６）。
【００３２】
本発明の抗体には、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの一部に対して特異的な抗体も含まれる。即ち、本発明の抗体を得るためのＬｍｘ１ａポリペプチドには、Ｌｍｘ１ａの全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、Ｌｍｘ１ａの少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片である。特に好ましい断片としては、Ｌｍｘ１ａのアミノ末端、カルボキシル末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。αヘリックス及びαヘリックス形成領域、α両親媒性領域、βシート及びβシート形成領域、β両親媒性領域、基質結合領域、高抗原指数領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、ターン及びターン形成領域、並びに表面形成領域を含む断片がＬｍｘ１ａポリペプチド断片に含まれる。本明細書におけるＬｍｘ１ａポリペプチド断片は、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。ポリペプチドの抗原決定部位は、蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−２２）、二次構造を解析する方法（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ（１９７８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−７６）により推定し、さらにコンピュータープログラム（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５４０−６（１９８５））または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
【００３３】
Ｌｍｘ１ａポリペプチド、及びポリペプチド断片は、Ｌｍｘ１ａを発現する細胞、組織または臓器よりその物理的性質に基づいて単離することができる。または、公知の遺伝子組換え技術、化学的な合成法等により製造することもできる。例えば、Ｌｍｘ１ａポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで製造する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスレーション（Ｄａｓｓｏ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３１２９−４４）の方法に従って、細胞を含まない試験管内の系でポリペプチドを製造することができる。それに対して、細胞を用いてポリペプチドを製造する場合には、まず所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞を選択して該発現ベクターにより形質転換する。続いて、形質転換された宿主細胞をポリペプチド発現が最も効率よく行われる条件下で培養することにより、所望のポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
ポリペプチドを発現させるためのベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ等の種々の由来のベクターを挙げることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７））。ベクターは制御配列を有し、ベクターが導入された宿主細胞内で所望のポリヌクレオチドが発現されるように、ポリヌクレオチドは該制御配列下に結合される。ここで、「制御配列」とは、宿主細胞が原核生物であれば、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターが含まれる。また宿主細胞が真核生物の場合には、プロモーター及びターミネーターが含まれ、場合によってトランスアクチベーター、転写因子、転写物を安定化するポリＡシグナル、スプライシング及びポリアデニル化シグナル等が含まれる。このような制御配列は、それに連結されるポリヌクレオチドの発現に必要とされる全ての構成成分を含む。ベクターには更に選択のためのマーカーが含まれていてもよい。その他、細胞内で発現されたポリペプチドを小胞体内腔、細胞外、またはグラム陰性菌を宿主とする場合にはペリプラズム内へと移行させるために必要とされるシグナルペプチドを目的のポリペプチドに付加するように発現できる塩基配列を発現ベクターに組み込むこともできる。このようなシグナルペプチドとしては、異種蛋白質由来の各種シグナルペプチドが公知であり利用できる。さらに、必要に応じリンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の挿入を行ってもよい。
【００３５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるポリペプチドの発現を可能にするベクターとしては、ｐＢＥＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を例示することができる。また、原核細胞宿主における発現に適した種々のベクターが公知である（『微生物学基礎講座８遺伝子工学』（共立出版）等参照）。当業者であれば、選択した宿主に適したベクター及びベクターの宿主への導入方法を適宜選択することができる。種々の宿主細胞が公知である。例えば、酵母、カビ等の真菌類、高等植物、昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類等の細胞、種々の培養細胞系（ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ミエローマ、Ｖｅｒｏ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９号公報）等）もＬｍｘ１ａポリペプチド及びその抗原性断片を発現させる宿主として利用することができ、各細胞に適したベクター系、ベクターの宿主細胞への導入手法も公知である。さらに、動物の生体内（Ｓｕｓｕｍｕ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−４；Ｌｕｂｏｎ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．４：１−５４等参照）、及び植物体において外来蛋白質を発現させる方法も公知でありＬｍｘ１ａポリヌクレオチドを発現させるために利用することができる。
【００３６】
ベクターへのＤＮＡの挿入は、制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）Ｓｅｃｔｉｏｎ ５．６１−５．６３）。また必要に応じ、使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高い塩基配列を選択し、Ｌｍｘ１ａポリペプチド発現ベクターを設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：ｒ４３−７４）。Ｌｍｘ１ａポリペプチドを産生する宿主は、Ｌｍｘ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に含むものであるが、該ポリヌクレオチドが適切に発現される限り、該ポリヌクレオチド自身のプロモーター支配下にあっても、ゲノム中に組み込まれていても、または染色体外の構造として保持されていても良い。
【００３７】
宿主細胞の培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、動物細胞を宿主とする場合、ＤＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、ＭＥＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １２２：５０１（１９５２））、ＲＰＭＩ１６４０（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、１９９（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１（１９５０））、ＩＭＤＭ等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加し、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
【００３８】
通常、遺伝子組換え技術により製造されたＬｍｘ１ａポリペプチドはまず、ポリペプチドが細胞外に分泌される場合には培地を、宿主がトランスジェニック生物の場合には体液等を、細胞内に産生される場合には細胞を溶解した溶解物を回収する。そして、蛋白質の精製方法として公知の塩析、蒸留、各種クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ゲル濾過、限外濾過、再結晶、酸抽出、透析、免疫沈降、溶媒沈澱、溶媒抽出、硫安またはエタノール沈澱等を適宜組み合わせることにより所望のポリペプチドを精製する。クロマトグラフィーとしては、アニオンまたはカチオン交換等のイオン交換、アフィニティー、逆相、吸着、ゲル濾過、疎水性、ヒドロキシアパタイト、ホスホセルロース、レクチンクロマトグラフィー等が公知である（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。各種カラムを使用して、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーにより蛋白質の精製を行うことができる。また、例えば、ＧＳＴとの融合蛋白質として所望の蛋白質を発現させた場合には、グルタチオンカラムを用いた精製法が有効である。一方、ヒスチジンタグを付加した融合蛋白質とした場合にはニッケルカラムを用いた精製法が利用できる。Ｌｍｘ１ａポリペプチドを融合蛋白質として製造した場合には、必要に応じて精製後にトロンビンまたはファクターＸａ等の酵素を使用して不要な部分を切断することもできる。
【００３９】
天然由来のポリペプチドをその物理的性質に基づいて精製し、本発明の抗体を得るための抗原として利用してもよい。さらに、精製したポリペプチドを必要に応じキモトリプシン、グルコシダーゼ、トリプシン、プロテインキナーゼ、リシルエンドペプチダーゼ等の酵素を用いて修飾することもできる。一方、Ｌｍｘ１ａポリペプチドの断片は、上述のＬｍｘ１ａポリペプチドと同様の化学合成及び遺伝子工学的な手法に加えて、ペプチダーゼ等の適当な酵素を使用したＬｍｘ１ａポリペプチドの切断により製造することもできる。
【００４０】
ドーパミン産生ニューロン特異的なポリクローナル抗体は、例えば、精製されたＬｍｘ１ａポリペプチドまたはその断片を、必要に応じアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より採取される血清より得ることができる。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましくはフロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２−１１．１３）を参照することができる。
【００４１】
また、モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等と用いて融合してハイブリドーマを作成する。細胞の融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６）に準じて行うことができる。ミエローマ細胞としては、特に、薬剤により融合細胞を選択できるようにする細胞が好ましい。このような薬剤による選択が可能なミエローマを使用した場合、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノプレテリン及びチミジンを含む培養液（ＨＡＴ培養液）で培養することにより融合されたハイブリドーマを選択することができる。次に、作成されたハイブリドーマの中から、Ｌｍｘ１ａポリペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。また、具体的な方法として、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１）を参照することもできる。
【００４２】
ハイブリドーマは、その他、最初にＥＢウイルスに感染させたヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞（Ｕ２６６等）と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法（特開昭６３−１７６８８号公報）によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる（ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９３／０２２２７；ＷＯ９４／０２６０２；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６等）。ハイブリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
【００４３】
また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ（１９９０）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｅｓ ＬＴＤ．，ＵＫ参照）。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）からクローニングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産生させる。このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。代表的な組換え型の抗体として、非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト抗体由来フレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げられる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−９；Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−６；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：９９−１２１（１９９１））。
【００４４】
抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造することができる。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９６８−７６；Ｂｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：６５２−６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８６）１２１：６６３−９；Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３２−７参照）。
【００４５】
多特異性抗体には、二特異性抗体（ＢｓＡｂ）、ダイアボディ（Ｄｂ）等が含まれる。多特異性抗体は、（１）異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法（Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｏｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｌｌ．７８：１１８−３２）、（２）異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを融合する方法（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−９）、（３）異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子（４種類のＤＮＡ）によりマウス骨髄種細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクトした後、二特異性の一価部分を単離する方法（Ｚｉｍｍｅｒｅｍａｎｎ（１９８６）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０５：１７６−２６０；Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：９４４−９）等により作製することができる。一方、Ｄｂは遺伝子融合により構築される二価の２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１参照）。
【００４６】
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインＡ及びＧを用いて行うことができる。その他、抗体以外のポリペプチドと同様に、上記した蛋白質精製技術によって精製することもできる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインＡを利用する場合、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のプロテインＡカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等により決定することができる。
【００４７】
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法により測定する場合、本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、次いでＬｍｘ１ａポリペプチドを添加した後、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産生細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加されている標識の検出を行う。即ち、二次抗体が例えばアルカリホスファターゼで標識されている場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の市販の系を使用することもできる。
【００４８】
＜ドーパミン産生ニューロンの検出＞
本発明によりドーパミン産生ニューロンを選択的に検出する方法が提供された。分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞から成熟ドーパミン産生ニューロンを含む全ての分化段階のドーパミン産生ニューロンをＬｍｘ１ａの発現を指標として検出することができる。本発明のポリヌクレオチドまたは抗体を用いたドーパミン産生ニューロンを検出する方法は、パーキンソン病等、ドーパミン産生ニューロンの脱落が関連する疾患の診断において使用することができる。ドーパミン産生ニューロンは、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体を用いて検出することができる。
【００４９】
より具体的には、本発明は、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブとドーパミン産生ニューロンを含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含むドーパミン産生ニューロンを検出する方法を提供するものである。該方法においては、マーカーポリヌクレオチドプローブを好ましくは放射性同位体または非放射性化合物で標識しておく。例えば、標識するための放射性同位体としては、３５Ｓ、３Ｈ等を挙げることができる。放射標識したマーカーポリヌクレオチドプローブを用いた場合、エマルションオートラジオグラフィーにより銀粒子を検出することによりマーカーと結合するＲＮＡを検出することができる。また、マーカーポリヌクレオチドプローブ標識のため慣用の非放射性同位体としては、ビオチン、ジゴキシゲニン等が公知である。ビオチン標識マーカーの検出は、例えば、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識したアビジンを用いて行うことができる。一方、ジゴキシゲニン標識マーカーの検出には、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識した抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。酵素標識を使用する場合には、酵素の基質と共にインキュベートし、安定な色素をマーカー位置に沈着させることで検出を行う。特に蛍光を利用した、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は簡便な、ドーパミン産生ニューロンの検出に好ましい方法である。
【００５０】
また、本発明により、抗Ｌｍｘ１ａ抗体とドーパミン産生ニューロンを含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含むドーパミン産生ニューロンの検出方法が提供される。即ち、ドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞を含むことが予測される細胞試料と本発明の抗体とを接触させ、抗体に結合する細胞を選択することでＬｍｘ１ａポリペプチドを発現している細胞、成熟ドーパミン産生ニューロンから増殖前の前駆細胞を含む全分化段階のドーパミン産生ニューロンを検出・選択することができる。また、この検出・選択を簡便にするために、本発明の抗体を固相に固定化したり、標識化することもできる。検出目的の場合には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン等の技術を組み合わせることができる。選択したドーパミン産生ニューロンやその前駆細胞の精製を必要とする場合には、本発明の抗体をアフィニティークロマトグラフィーに応用することができる。
【００５１】
また本発明のマーカーと既存のドーパミン産生ニューロンあるいはその前駆細胞を検出するマーカーとを組合せることにより、前駆細胞と成熟ニューロンとの選別、さらには前駆細胞の中でも分裂前前後の細胞を選別することも可能となる。
例えば、前駆細胞と成熟ニューロンとの選別は、マーカーとしてＬｍｘ１ａと、ＤＡＴおよび／またはＡＤＨ２とを組合せることにより実施することができる。Ｌｍｘ１ａ遺伝子は上述の通り分裂前の前駆細胞から成熟ドーパミン産生ニューロンまでの分化において広範囲で発現が確認されている。一方、ＤＡＴ、ＡＤＨ２遺伝子は、後述する実施例に示す通りドーパミン産生ニューロンへ分化した後に発現する。したがって、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは本発明の抗体により検出するともに、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現が検出された細胞における、ＤＡＴ遺伝子、ＡＤＨ２遺伝子の一方または双方の発現を解析することにより、前駆細胞と成熟したニューロンとを区別して検出・選択を行うことができる。
【００５２】
本発明の第一のドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞の検出・選択方法はとしては、次の（ａ）、（ｂ）工程が含まれる。
（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００５３】
本発明の第二のドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞の検出・選択方法はとしては、次の（ａ）、（ｂ）工程が含まれる。
（ａ）Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００５４】
上記第一の方法および第二の方法のいずれにおいても（ａ）工程において、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現が解析される。第一の方法のようにＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を転写レベルで検出するためには、「Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド」が用いられる。このポリヌクレオチドは、上述した本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブを利用することができる。第二の方法のようにＬｍｘ１ａ遺伝子の発現を翻訳レベルで検出するためには、「Ｌｍｘ１ａのアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体」が用いられる。この抗体は上述した本発明の抗Ｌｍｘ１ａ抗体を用いることができる。このようにいずれの方法において、（ａ）工程においても、Ｌｍｘ１ａの発現が解析される。
（ｂ）工程では、成熟ドーパミン産生ニューロンに分化した細胞であるかを検討するために、ＤＡＴおよび／またはＡＤＨ２遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づき検討する。
このＤＡＴ遺伝子の発現を転写産物に基づいて検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、ＤＡＴｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＤＡＴ検出用ポリヌクレオチドは、ＤＡＴｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）ＤＡＴｃＤＮＡ（配列番号３９、４１）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）ＤＡＴ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：４０、４２に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）配列番号：３９、４１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＤＡＴ遺伝子の発現を検出する場合には、ＤＡＴと結合する抗体を用いる。ＤＡＴと結合する抗体としては、（１）ＤＡＴポリペプチド（配列番号：４０または４２）、（２）ＤＡＴポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４０または４２）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００５５】
同様に、ＡＤＨ２遺伝子の発現を転写産物に基づいて検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、ＡＤＨ２ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＡＤＨ２検出用ポリヌクレオチドは、ＡＤＨ２ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）ＡＤＨ２ｃＤＮＡ（配列番号４３、４５）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）ＤＡＴ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：４４、４６に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）ＡＤＨ２ｃＤＮＡ（配列番号：４３、４５）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＡＤＨ２遺伝子の発現を検出する場合には、ＡＤＨ２と結合する抗体を用いる。ＡＤＨ２と結合する抗体としては、（１）ＡＤＨ２ポリペプチド（配列番号：４４または４６）、（２）ＡＤＨ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４４または４６）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００５６】
上述のように、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現が検出された細胞群からＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出された細胞群を差分することにより、前駆細胞を選択的に検出・選択することができる。なお、このＬｍｘ１ａ遺伝子発現の検出と、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現の検出は同時に行っても、前後して行ってもよい。同時に行う場合には、一例としては、それぞれ検出するためのプローブ等に異なる標識を付加することにより、同時にそれぞれの遺伝子発現を検出してもよい。また前後して行う場合には、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現が検出された細胞を選択してから、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現の有無を確認してもよく。また、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出されなかった細胞群に対して、Ｌｍｘ１ａ遺伝子を発現する群を選択してもよい。
【００５７】
次に、前駆細胞中の分裂前後の細胞群を区別して検出・選択する場合には、マーカーとして（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子と、（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子とを組合せることにより実施することができる。
Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨは、前駆細胞のうち、分裂停止後に発現する遺伝子群である。そのため、これら遺伝子の発現は、分裂停止後の前駆細胞を見分ける際に利用し得る。一方、Ｌｍｘ１ａ遺伝子は、分裂停止前の増殖中の前駆細胞においても発現している。そのため、Ｌｍｘ１ａ遺伝子を発現し、かつ（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３またはＴＨが発現していない細胞を検出・選択することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のうちでも分裂停止前の増殖前駆細胞の検出・選択が可能となる。
【００５８】
具体的には、本発明の第一のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を分裂停止前後の前駆細胞とで分けて検出または選択する方法は、次の（ａ）および（ｂ）工程から構成される。
（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００５９】
本発明の第二のドーパミン産生ニューロン前駆細胞をを分裂停止前後の前駆細胞とで分けて検出または選択する方法は、次の（ａ）および（ｂ）工程から構成される。
（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程
【００６０】
上記第一の方法、第二の方法のいずれにおいても、（ａ）工程は、上述した「Ｌｍｘ１ａとＤＡＴ等とを用いて前駆細胞を選択する方法」と同様に、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づいて検出する。なお、このＬｍｘ１ａ遺伝子発現を検出する方法、材料は、上述した「Ｌｍｘ１ａとＤＡＴ等とを用いて前駆細胞を選択する方法」と同様である。
（ｂ）工程では、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のうち分裂停止後の前駆細胞を見分けるために、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択される１または複数の遺伝子の発現を転写または翻訳産物に基づいて解析する。
【００６１】
「Ｌｍｘ１ｂ遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｌｍｘ１ｂｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＬｍｘ１ｂ検出用ポリヌクレオチドは、Ｌｍｘ１ｂｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｌｍｘ１ｂｃＤＮＡ（配列番号１９、２１）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｌｍｘ１ｂ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：２０、２２に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）配列番号：１９、２１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＬｍｘ１ｂ遺伝子の発現を検出する場合には、Ｌｍｘ１ｂと結合する抗体を用いる。Ｌｍｘ１ｂと結合する抗体としては、（１）Ｌｍｘ１ｂポリペプチド（配列番号：２０または２２）、（２）Ｌｍｘ１ｂポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２０または２２）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６２】
「Ｎｕｒｒ１遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｎｕｒｒ１ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＮｕｒｒ１検出用ポリヌクレオチドは、Ｎｕｒｒ１ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｎｕｒｒ１ｃＤＮＡ（配列番号２３、２５）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｎｕｒｒ１遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：２４、２６に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）Ｎｕｒｒ１ｃＤＮＡ（配列番号：２３、２５）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＮｕｒｒ１遺伝子の発現を検出する場合には、Ｎｕｒｒ１と結合する抗体を用いる。Ｎｕｒｒ１と結合する抗体としては、（１）Ｎｕｒｒ１ポリペプチド（配列番号：２４または２６）、（２）Ｎｕｒｒ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２４または２６）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６３】
「Ｅｎ１遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｅｎ１ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＥｎ１検出用ポリヌクレオチドは、Ｅｎ１ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｅｎ１ｃＤＮＡ（配列番号２７、２９）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｅｎ１遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：２８、３０に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）Ｅｎ１ｃＤＮＡ（配列番号：２７、２９）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＥｎ１遺伝子の発現を検出する場合には、Ｅｎ１と結合する抗体を用いる。Ｅｎ１と結合する抗体としては、（１）Ｅｎ１ポリペプチド（配列番号：２８または３０）、（２）Ｅｎ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２８または３０）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６４】
「Ｐｔｘ３遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、Ｐｔｘ３ｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＰｔｘ３検出用ポリヌクレオチドは、Ｐｔｘ３ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）Ｐｔｘ３ｃＤＮＡ（配列番号３１、３３）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）Ｐｔｘ３遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：３２、３４に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）Ｐｔｘ３ｃＤＮＡ（配列番号：３１、３３）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＡＤＨ２遺伝子の発現を検出する場合には、Ｐｔｘ３と結合する抗体を用いる。Ｐｔｘ３と結合する抗体としては、（１）Ｐｔｘ３ポリペプチド（配列番号：３２または３４）、（２）Ｐｔｘ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３２または３４）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
【００６５】
「ＴＨ遺伝子」の発現を転写レベルで検出するための検出用ポリヌクレオチドとしては、ＴＨｍＲＮＡを検出し得るポリヌクレオチドを用いる。こうしたＴＨ検出用ポリヌクレオチドは、ＴＨｍＲＮＡにハイブリダイズし得る（１）ＴＨｃＤＮＡ（配列番号：３５、３７）に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ、ＤＮＡ、（２）ＴＨ遺伝子暗号の縮重配列である、配列番号：３６、３８に記載のアミノ酸配列をコードした塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、（３）ＴＨｃＤＮＡ（配列番号：３５、３７）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。一方、翻訳レベルでＴＨ遺伝子の発現を検出する場合には、ＴＨと結合する抗体を用いる。ＴＨと結合する抗体としては、（１）ＴＨポリペプチド（配列番号：３６または３８）、（２）ＴＨポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３６または３８）において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（３）これら（１）または（２）のポリペプチドのうち少なくとも６アミノ酸残基を有するポリペプチド断片のいずれかに対して特異的な抗体である。
これら（ｂ）工程で使用し得るマーカー遺伝子のうち、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１をマーカーとして選択することが好ましい。これら三つの遺伝子の発現は、分裂停止後直ちに検出することができることから、前駆細胞の分裂停止前後の細胞をより正確に区別して検出、選択することが可能となる。
【００６６】
上述のように、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現が検出された細胞群からＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３またはＴＨ遺伝子の発現が検出された細胞群を差分することにより、前駆細胞のうち、分裂停止前の増殖前駆細胞を選択的に検出・選択することができる。
上記においては、（ａ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現検出工程、（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現検出工程の順で説明をしたが、本方法はこの順に制限されるものではない。
Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現の検出と、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現検出を異なる標識等を用いて同時行ってもよい。また、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現検出の後にＬｍｘ１ａ遺伝子発現の検出を行ってもよい。この場合、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子発現が検出されなかった細胞群に対して、Ｌｍｘ１ａ遺伝子を発現する群を選択することにより、増殖前駆細胞を選択することができる。
【００６７】
上記前駆細胞を分裂停止前後で区別して検出・選択する方法にさらに、上述した成熟ドーパミン産生ニューロンに分化した細胞を検出するマーカー、ＤＡＴ遺伝子および／またはＡＤＨ２遺伝子の発現検出工程を加えることにより、「分裂停止前ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞」、「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞」、「成熟ドーパミン産生ニューロン」とを区別して検出・選択することができる。
一例を示せば、先ず、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を上述したプローブまたは抗体等を用いて検出し、ドーパミン産生ニューロンおよび前駆細胞を選択する。次いで、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現を指標に選択された細胞群のうち、ＤＡＴ遺伝子またはＡＤＨ２遺伝子の発現をそれぞれのプローブまたは抗体等により検討する。ここで、ＤＡＴ遺伝子またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出された細胞は、成熟ドーパミン産生ニューロンとして検出・選択される。一方、ＤＡＴ遺伝子またはＡＤＨ２遺伝子の発現が検出されなかった細胞群は、さらにＬｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子の発現を検討する。ここで、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子の発現が検出された細胞は分裂停止後の前駆細胞であり、Ｌｍｘ１ｂ等のマーカー遺伝子の発現が検出されなかった細胞は分裂停止前増殖前駆細胞であると、識別することができる。なお、本発明におけるドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞の選択・検出方法は、ここで示した検出の順序には制限されることはなく、検出工程の順序は任意に決定することができる。
【００６８】
また、本発明のドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞等の検出・選択方法に使用するプローブ・プライマーの設計条件、ストリンジェントな条件、ハイブリダイズの定義については、Ｌｍｘ１ａ遺伝子発現検出用プローブ・プライマーにおける条件等と同様である。また、本発明のドーパミン産生ニューロンまたはその前駆細胞等の検出・選択方法に使用する抗体の作成の方法、抗体の種類などについても、上記抗Ｌｍｘ１ａ抗体と同様である。
【００６９】
また、本発明はドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキットを提供する。上述のように、本発明のＬｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択される１または複数の遺伝子に対するマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体を組合せることにより、前駆細胞を選択的に、または前駆細胞における分裂停止前後の細胞群を区別して検出・選択することが可能となった。したがって、上記Ｌｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択される１または複数の遺伝子に対するマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体とを組合せた試薬セットは、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキットとして有用である。例えば、ここでＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群から、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨのいずれか一つまたは複数を選択し、そのマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体と、Ｌｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体とを組合せることにより、前駆細胞のうち、分裂停止前後の前駆細胞を識別して検出・選択するキットとして有効となる。またＤＡＴまたはＡＤＨ２を選択し、そのマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗体と、Ｌｍｘ１ａマーカーポリヌクレオチドまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体とを組合せることにより、前駆細胞と成熟ニューロンとを識別して検出・選択するキットとして有効となる。
【００７０】
＜ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング＞
Ｌｍｘ１ａは比較的早い発生段階からドーパミン産生ニューロン特異的に発現するマーカーであるので、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも考えられる。即ち、適当な細胞試料に被験物質を作用させ、Ｌｍｘ１ａの発現を検出することにより、該被験物質にドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力があるかどうかを決定することができる。従って、本発明はＬｍｘ１ａの発現を指標とするドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供するものである。Ｌｍｘ１ａの発現は、本発明のマーカーポリヌクレオチドプローブまたは抗Ｌｍｘ１ａ抗体のいずれかを用いて検出することができる。
【００７１】
ここで使用する細胞試料は好ましくは、中脳腹側領域の細胞、または多分化能を有するＥＳ細胞等、ドーパミン産生ニューロンへと分化誘導され得る細胞を含む細胞試料である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドーパミン産生ニューロンの分化誘導は、公知のＥＳ細胞、骨髄間質細胞、神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）等の細胞を出発材料とする方法が公知である。さらに、線条体及び皮質等の通常非ドーパミン産生神経組織からドーパミン産生細胞を誘導する方法も知られている（特表平１０−５０９３１９号公報）。従って、好ましくはこれらの細胞をドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬の候補化合物を作用させる細胞試料として用いる。
【００７２】
ここで、細胞と接触させる被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。本方法によりスクリーニングされた被験物質は、ドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を示す。従って、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬として、ドーパミン産生ニューロンにおける何等かの欠陥が病因となっている疾病の治療薬候補となり得、有用と考えられる。
【００７３】
細胞の分化は、被験物質と接触させない場合におけるＬｍｘ１ａ発現のレベルと比較することにより判定することができる。また、Ｌｍｘ１ａ発現と合わせ、細胞の状態を比較することにより細胞の分化の判定を行ってもよい。例えば、細胞の分化を、顕微鏡下において形態学的な観察を行うこと、または、細胞で産生されるドーパミン等の物質を検出、定量して検出してもよい。
【００７４】
＜Ｌｍｘ１ａの発現領域解析＞
Ｌｍｘ１ａの発現制御領域は、Ｌｍｘ１ａの遺伝子配列を利用してゲノムＤＮＡから公知の方法によってクローニングすることができる。例えば、Ｓ１マッピング法のような転写開始点の特定方法（細胞工学 別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，東京大学医科学研究所制癌研究部編，秀潤社（１９９３）ｐｐ．３６２−３７４）が公知であり、利用できる。一般に、遺伝子の発現制御領域は、遺伝子の５’末端の１５〜１００ｂｐ、好ましくは３０〜５０ｂｐをプローブＤＮＡとして利用して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングすることができる。このようにして得られるクローンは、１０ｋｂｐ以上の５’非翻訳領域を含むものであるので、次にエキソヌクレアーゼ等により処理し短縮化または断片化する。最後に、短縮された発現制御領域の候補を含む配列部分をレポーター遺伝子を利用して、その発現の有無、強さ、制御等について評価し、Ｌｍｘ１ａ発現制御領域の活性維持のための最小必要単位を決定することができる。
【００７５】
遺伝子の発現制御領域は、Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ等のプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ．／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔｍｌ；Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １９９６ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ ｅｄ．，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，（１９９６））を用いて予測することもできる。さらに、発現制御領域の活性最小単位を予測するプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｃｉ．ｃｂｓ．ｕｍｎ．ｅｄｕ．／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｏｓｃａｎ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃａｎ．ｈｔｍ；Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：９２３−３２）も公知であり、用いることができる。
【００７６】
このようにして単離された、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現領域は、ｉｎ ｖｉｖｏでドーパミン産生ニューロンの全ての発生段階において、ドーパミン産生ニューロン特異的に所望のポリペプチド／蛋白質を産生するのに利用することができる。また、Ｌｍｘ１ａは比較的早い発生段階からドーパミン産生ニューロン特異的に発現するマーカーであるので、ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも考えられる。即ち、まず、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現領域の制御下に検出可能なレポーター遺伝子を導入したベクターを作成し、該ベクターで形質転換した適当な細胞を作成する。次に、該細胞を被験物質と接触させ、該被験物質によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるかどうかを検出する。レポーター遺伝子の発現が検出された場合、該被験物質は、ドーパミン産生ニューロンの分化を誘導すると判定される。
【００７７】
＜Ｌｍｘ１ａ結合蛋白質＞
ホメオボックス遺伝子がコードする蛋白質では類似した６０アミノ酸残基から成る配列が保存されている。この保存された領域はホメオドメインと呼ばれ、ホメオドメインをコードするＤＮＡ領域はホメオボックスと称される。ホメオドメインはヘリックス・ターン・ヘリックス構造をとるＤＮＡ結合ドメインを構成し、ＤＮＡの二本鎖の溝に入り込み特定の塩基配列に結合する。それによりホメオボックス遺伝子の産物は、他の遺伝子の転写を活性化または不活性化する転写因子として機能すると考えられている。一方、ＬＩＭドメインは６つのシステインと１つのヒスチジンの位置が保存された６０アミノ酸残基からなる、Ｚｎフィンガーと類似した構造を示す。Ｚｎフィンガーと異なりＤＮＡ結合能は検出されておらず、蛋白質間の相互作用に関与していると考えられている。ＬＩＭドメインが、ホメオドメインと分子内結合することにより、ホメオドメインの機能を抑制し、活性化蛋白質がＬＩＭドメインと結合することによりホメオドメインがＤＮＡ結合活性を示すようになると考えられている。
Ｌｍｘ１ａ遺伝子は、ＬＩＭドメインを持つホメオボックス遺伝子であることから、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性化蛋白質と結合して他の遺伝子の転写を制御していると考えられる。従って、Ｌｍｘ１ａと結合する蛋白質は、ドーパミン産生ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化、成熟及び／または機能を制御するのに利用できる可能性がある。Ｌｍｘ１ａに対する結合蛋白質の同定においては、まず、Ｌｍｘ１ａと候補蛋白質とを接触させ、結合の有無を検定する。この際、Ｌｍｘ１ａを担体に固定することもできる。候補蛋白質は特に限定されるものではない。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、海洋生物由来の天然成分、各種細胞の抽出物、公知化合物及びペプチド、植物由来の天然成分、生体組織抽出物、微生物の培養上清、並びにファージディスプレイ法等によりランダムに製造されたペプチド群（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−１０（１９９１））が挙げられる。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、実際にＬｍｘ１ａと相互作用している蛋白質を探す上では、特にドーパミン産生ニューロンにおいて発現している蛋白質を候補蛋白質とすることが好ましい。また、結合の検出を容易にするために、候補蛋白質は標識しても良い。
【００７８】
＜Ｌｍｘ１ａの発現抑制＞
本発明により、Ｌｍｘ１ａが増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から分裂停止後までの全ての分化段階を含むドーパミン産生ニューロンに発現されることが明らかにされた。その結果、Ｌｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏにおける分化、成熟及び／または機能に関与していることが考えられた。従って、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の発現を阻害するものは、ドーパミン産生ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化、成熟及び／または機能を制御するのに利用できる可能性がある。遺伝子の発現を阻害し得るものとして、例えば、アンチセンス、リボザイム及び２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。従って、本発明はこのようなアンチセンス、リボザイム及び２本鎖ＲＮＡを提供するものである。
【００７９】
アンチセンスが標的遺伝子の発現を抑制する機構としては、（１）３重鎖形成による転写開始阻害、（２）ＲＮＡポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（３）合成中のＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、（４）イントロン−エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（５）スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（６）ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による、ｍＲＮＡの細胞質への移行抑制、（７）キャッピング部位またはポリＡ付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（８）翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（９）リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（１０）ｍＲＮＡ翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（１１）核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島及び井上『新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７（１９９３））。
【００８０】
本発明のＬｍｘ１ａアンチセンス核酸は、上述の（１）〜（１１）のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。即ち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードするＤＮＡは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなく、効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上であり通常３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内、より好ましくは１０００ｂｐ以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の配列情報を基に、ホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９−２１）等により調製することができる。
【００８１】
リボザイムとは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザイム（ｌａｒｇｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びスモールリボザイム（ｓｍａｌｌ ｌｉｂｏｙｍｅ）に分類される。ラージリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に５’−リン酸と３’−ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザイムは、さらに（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのトランスエステル化反応を行うグループＩイントロンＲＮＡ、（２）ラリアット構造を経る二段階反応により自己スプライシングを行うグループＩＩイントロンＲＮＡ、及び（３）加水分解反応によるｔＲＮＡ前駆体を５’側で切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ成分に分類される。それに対して、スモールリボザイムは、比較的小さな構造単位（４０ｂｐ程度）であり、ＲＮＡを切断して、５’−ヒドロキシル基と２’−３’環状リン酸を生じさせる。スモールリボザイムには、ハンマーヘッド型（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）、ヘアピン型（Ｂｕｚａｙａｎ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４９；Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０：１１２）等のリボザイムが含まれる。リボザイムは、改変及び合成が容易なため多様な改良方法が公知であり、例えば、リボザイムの基質結合部を標的部位近くのＲＮＡ配列と相補的となるように設計することにより、標的ＲＮＡ中の塩基配列ＵＣ、ＵＵまたはＵＡを認識して切断するハンマーヘッド型リボザイムを作ることができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８：２２５；小泉誠及び大塚栄子（１９９０）蛋白質核酸酵素３５：２１９１；Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７０５９）。ヘアピン型のリボザイムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である（Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０：１１２）。
【００８２】
本発明のアンチセンス核酸及びリボザイムは、細胞内における遺伝子の発現を制御するために、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス由来のベクター、リポソーム等を利用した非ウイルスベクター、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡとしてｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法により遺伝子治療に用いることもできる。
【００８３】
１９９８年に、線虫においてＲＮＡ同士が邪魔し合い働きを失う現象（ＲＮＡ干渉）が観察された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１）。ＲＮＡ干渉とは、二本鎖の人工ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有するＲＮＡが分解される現象である。その後の研究により、ＲＮＡ干渉等のＲＮＡサイレンシングの現象は、欠陥を持つｍＲＮＡの排除、並びにトランスポゾン、ウイルス等の寄生体に対する防御のための細胞機構であることが示唆されている。現在では、多くの遺伝子の発現を抑制するためのツールとして、二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）が利用されており、病気の原因遺伝子等の発現抑制をｓｉＲＮＡを用いて行うことにより病気を治療・予防する方法も検討されている。本発明のｓｉＲＮＡは、Ｌｍｘ１ａのｍＲＮＡの転写を阻害する限り、特に限定されない。通常、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの配列に対するセンス鎖及びアンチセンス鎖の組合せであり、少なくとも１０個から標的ｍＲＮＡと同じ個数までのヌクレオチド長を有する。好ましくは、１５〜７５個、より好ましくは１８〜５０個、さらに好ましくは２０〜２５個のヌクレオチド長である。
Ｌｍｘ１ａ発現を抑制するために、ｓｉＲＮＡは公知の方法により細胞に導入することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを構成する二本のＲＮＡ鎖を、一本鎖上にコードするＤＮＡを設計し、該ＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を該発現ベクターで形質転換し、ｓｉＲＮＡをヘアピン構造を有する二本鎖ＲＮＡとして細胞内で発現させることができる。トランスフェクションにより持続的にｓｉＲＮＡを産生するプラスミド発現ベクターも設計されている（例えば、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ Ｖｅｃｔｏｒ、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ Ｖｅｃｔｏｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。
ｓｉＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的ｓｉＲＮＡをスクリーニングするためのキット（例えば、ＢＤ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））等も市販されており利用可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
［実施例１］ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子の単離及び配列解析
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、Ｅ１２．５マウス中脳腹側領域を背腹方向にさらに二つの領域に切り分けて、ドーパミン産生ニューロンを含む最も腹側の領域に特異的に発現する遺伝子をサブトラクション（Ｎ−ＲＤＡ）法により同定した。単離した断片の一つはＬｍｘ１ａをコードするｃＤＮＡ断片であった。Ｌｍｘ１ａは、ＬＩＭドメイン及びホメオドメインを含む蛋白質をコードしている。
１．Ｎ−ＲＤＡ法
１−１．アダプターの調製
下記のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、１００μＭに調製した。
（ａｄ２：ａｄ２Ｓ＋ａｄ２Ａ、ａｄ３：ａｄ３Ｓ＋ａｄ３Ａ、ａｄ４：ａｄ４Ｓ＋ａｄ４Ａ、ａｄ５：ａｄ５Ｓ＋ａｄ５Ａ、ａｄ１３：ａｄ１３Ｓ＋ａｄ１３Ａ）
ａｄ２Ｓ：ｃａｇｃｔｃｃａｃａａｃｃｔａｃａｔｃａｔｔｃｃｇｔ（配列番号：１）
ａｄ２Ａ：ａｃｇｇａａｔｇａｔｇｔ（配列番号：２）
ａｄ３Ｓ：ｇｔｃｃａｔｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇｔ（配列番号：３）
ａｄ３Ａ：ａｃｃａｇａｇｔｃｔｃａ（配列番号：４）
ａｄ４Ｓ：ｃｔｇａｔｇｇｇｔｇｔｃｔｔｃｔｇｔｇａｇｔｇｔｇｔ（配列番号：５）
ａｄ４Ａ：ａｃａｃａｃｔｃａｃａｇ（配列番号：６）
ａｄ５Ｓ：ｃｃａｇｃａｔｃｇａｇａａｔｃａｇｔｇｔｇａｃａｇｔ（配列番号：７）
ａｄ５Ａ：ａｃｔｇｔｃａｃａｃｔｇ（配列番号：８）
ａｄ１３Ｓ：ｇｔｃｇａｔｇａａｃｔｔｃｇａｃｔｇｔｃｇａｔｃｇｔ（配列番号：９）
ａｄ１３Ａ：ａｃｇａｔｃｇａｃａｇｔ（配列番号：１０）
１−２．ｃＤＮＡ合成
日本ＳＬＣより入手したマウス１２．５日胚より中脳腹側を切り出し、さらに背腹方向に２つの領域に切り分けた。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。制限酵素ＲｓａＩで消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、１５サイクルのＰＣＲでｃＤＮＡを増幅した。増幅条件は７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。Ｎ−ＲＤＡのＰＣＲはすべて以下の反応液組成で行った。
１−３．Ｄｒｉｖｅｒの作製
ａｄ２Ｓで増幅したｃＤＮＡをさらに５サイクルのＰＣＲで増幅した。増幅条件は９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを精製し、ＲｓａＩ消化した。１回のサブトラクションに３μｇずつ使用した。
１−４．Ｔｅｓｔｅｒの作製
ａｄ２Ｓで増幅したｃＤＮＡをさらに５サイクルのＰＣＲで増幅した。増幅条件は９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを精製し、ＲｓａＩ消化した。６０ｎｇのＲｓａＩ消化ｃＤＮＡにａｄ３を付加した。
１−５．サブトラクション１回目
上記３及び４で作製したＴｅｓｔｅｒおよびＤｒｉｖｅｒを混合し、エタノール沈殿した後に、１ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １μｌに溶解した。９８℃５分の後、１ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ＋１Ｍ ＮａＣｌ １μｌを加えた。さらに９８℃５分の後、６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたｃＤＮＡをａｄ３Ｓをプライマーとして１０サイクルのＰＣＲで増幅した後（７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１０サイクル行った）、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）で消化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。さらに１３サイクルのＰＣＲで増幅した。増幅条件は９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１３サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
１−６．均一化
サブトラクション１回目で増幅したｃＤＮＡ ８ｎｇに２ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １μｌを加えた。９８℃５分の後、１ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ＋１Ｍ ＮａＣｌ ２μｌを加えた。さらに９８℃５分の後、６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたｃＤＮＡをＲｓａＩで消化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。これをａｄ３Ｓをプライマーとして１１サイクルのＰＣＲで増幅した後（９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１１サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした）ＲｓａＩで消化し、ａｄ４を付加した。
１−７．サブトラクション２回目
上記６でａｄ４を付加したｃＤＮＡ ２０ｎｇをＴｅｓｔｅｒとして、上記３のＤｒｉｖｅｒと混合し、さらに、上記５と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にＲｓａＩ消化したｃＤＮＡにａｄ５を付加した。
１−８．サブトラクション３回目
上記７でａｄ５を付加したｃＤＮＡ ２ｎｇをＴｅｓｔｅｒとして、上記３のＤｒｉｖｅｒと混合し、さらに、上記５と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にＲｓａＩ消化したｃＤＮＡにａｄ１３を付加した。
１−９．サブトラクション４回目
上記８でａｄ１３を付加したｃＤＮＡ ２ｎｇをＴｅｓｔｅｒとして、上記３のＤｒｉｖｅｒと混合し、以下、上記５と同様の方法でサブトラクションを行った。増幅したｃＤＮＡをｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＡＢＩ３１００シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を解析した。
【００８５】
［実施例２］Ｌｍｘ１ａの発現解析
１．Ｌｍｘ１ａがドーパミン産生ニューロンに発現することを確認するため、以下のプロトコールによりｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＬｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のｍＲＮＡの発現解析を行った。Ｎｕｒｒ１及びＴＨは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されることが知られているマーカーである。また、Ｌｍｘ１ｂは、増殖前駆細胞の段階では非常に低レベルで発現され、分裂停止後に高レベルに発現し始めることが知られている転写因子マーカーである。
まず、マウス１２．５日胚を摘出し４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）で４℃、２時間固定した後、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）で４℃、一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に４％ＰＦＡで室温３０分間再固定した。ＰＢＳで洗浄した後、ハイブリダイゼーション（１μｇ／ｍｌＤＩＧ化ＲＮＡプローブ、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５０μｇ／ｍｌ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ，５０μｇ／ｍｌ Ｈｅｐａｒｉｎ）を６８℃で４０時間行った。その後、洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ）を６８℃で行い、ＲＮａｓｅ処理（０．０５μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ）を室温５分間行った。０．２ｘＳＳＣで６８℃の洗浄、１ｘＴＢＳＴで室温の洗浄ののち、ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ：Ｒｏｃｈｅ）を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＡＫＯ）を４℃で一晩反応させ、洗浄（１ｘＴＢＳＴ、２ｍＭ Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＤＡＫＯ）を基質として発色させた。
【００８６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる発現解析の結果、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるＥ１２．５で、Ｌｍｘ１ａはＴＨ、Ｌｍｘ１ｂ及びＮｕｒｒ１と同様に中脳最腹側部に発現することが明らかになった（図２）。
【００８７】
２．次にＬｍｘ１ａ特異的抗体を用いてＬｍｘ１ａ蛋白質の発現を確認した。さらに、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーであるＴＨ及びＥｎ１との二重染色も行った。Ｅｎ１はドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されるマーカーである。
抗Ｌｍｘ１ａポリクローナル抗体は、まず免疫に必要な抗原をＬｍｘ１ａの２７１−３０７アミノ酸にあたるＤＮＡ領域とＧＳＴをｆｕｓｉｏｎさせたｖｅｃｔｏｒをＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９株）にＴｒａｎｓｆｏｒｍした後ＩＰＴＧによって発現誘導して回収を行った。回収後、ウサギに免疫を行った後に採血し、その血清から免疫に用いたＧＳＴ−Ｌｍｘ１ａ抗原によるａｆｆｉｎｉｔｙ精製を行うことによって得られた。
マウス１２．５日胚を摘出し４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）で４℃、２時間固定したのち、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）で４℃、一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で３０分乾燥させ、ＰＢＳ（−）で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース）を室温、３０分間行い、一次抗体を室温、１時間反応させた後、さらに４℃、一晩反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（−）で、室温、１５分間の洗浄を３回行った。次に蛍光標識した２次抗体を室温、１時間反応させ、同様に洗浄を行った後、ＰＢＳ（−）によって室温、１０分間洗浄し、封入した。
その結果、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと同様の発現パターンが認められた（図３及び４）。Ｌｍｘ１ａ蛋白質は、Ｅ１２．５中脳においてｍＲＮＡだけでなく蛋白質としても発現していることが明らかになった。ＴＨ及びＥｎ１との二重染色の結果では、Ｌｍｘ１ａのこれらの蛋白質との同一細胞での共発現が確認され、発現領域も背−腹方向で完全に一致することが明らかになった（図３及び４）。ＴＨ及びＥｎ１と比べＬｍｘ１ａは脳質側にも発現が認められた。この領域は将来ドーパミンニューロンに分化する増殖前駆細胞が存在する領域（脳質領域（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｚｏｎｅ（ＶＺ））である。
３．そこで、Ｌｍｘ１ａが増殖前駆細胞に発現することを確認するために、マウスＥ１２．５中脳におけるＢｒｄＵの取込みとＬｍｘ１ａの発現を免疫染色法により検出した。
マウスＥ１２．５胎児を摘出する２時間前に妊娠マウスの腹腔へＢｒｄＵ（ｓｉｇｍａ）を注入し（１０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ ０．９％ ｓａｌｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｇｉｖｅ ５０ｕｇ／ｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、増殖細胞のＤＮＡ中へＢｒｄＵを取り込ませた。通常の免疫染色と同様に切片を作成し、まず抗Ｌｍｘ１ａ抗体を用いてＬｍｘ１ａタンパクを検出した後、再固定（２％ＰＦＡ、室温、３０分）、塩酸処理を施し（２Ｎ ＨＣｌ、３７℃、３０分）、引き続いて抗ＢｒｄＵ抗体を用いてＢｒｄＵを検出した。
その結果、ＶＺ領域のＬｍｘ１ａ陽性細胞の多くでＢｒｄＵが取込まれていることが明らかになった（図５）。
４．出生後のマウスのドーパミン産生ニューロンにおけるＬｍｘ１ａ発現についても調べた。マウスＥ１２．５胚に代えて、出生後７日目（Ｐ７）の中脳の切片を用い、比較するマーカーとしてドーパミン産生ニューロンマーカーＤＡＴを使用した以外、上記１．の方法によりＬｍｘ１ａのマウスＰ７中脳における発現を検出した。ＤＡＴは、ドーパミン産生ニューロンの成熟が進んで初めて発現することが知られているマーカーである。
その結果、ＤＡＴの発現する領域でＬｍｘ１ａが発現していることが明らかになった（図６）。
５．さらに、ヒトにおいてもＬｍｘ１ａがドーパミン産生ニューロン特異的に発現するかについて、成体脳領域ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲを行うことにより調べた。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入したヒト脳各種領域ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇに対して、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。このうち１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
２分インキュベートした。Ｎ−ＲＤＡのＰＣＲはすべて以下の反応液組成で行った。
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒の反応を３７サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
以下の配列のプライマーを使用した。
Ｈｕｍａｎ Ｌｍｘ１ａ：ＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号：１１）／
ＣＡＣＣＡＣＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣ（配列番号：１２）
その結果、ヒトにおいてもＬｍｘ１ａはドーパミン産生ニューロンの存在する中脳黒質領域に発現することが明らかになった（図７）。また、海馬等他の脳領域においてもマウスと同様の発現を示し、成体のドーパミン産生ニューロンにおいても発現が維持されていることが明らかになった。
以上の結果をもとにＬｍｘ１ａのドーパミン産生ニューロンにおける発現のタイミングを他のドーパミン産生ニューロンマーカーと比較した（図８）。Ｌｍｘ１ａは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体において発現が維持される。一方、公知のＮｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３及びＴＨは分裂停止後に初めて発現が誘導され、ＤＡＴ及びＡＤＨ２は発現が進んで初めて発現を開始する。Ｌｍｘ１ｂは増殖前駆細胞でも発現が認められるが、非常に発現レベルが低く、分裂停止後に高レベルで発現する。このように公知のマーカーと発現パターンを異にするＬｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
Ｌｍｘ１ａは、増殖中の前駆細胞の段階から分裂停止後も、さらには成体においてもドーパミン産生ニューロンにおいて発現が維持されることが明らかにされた。一方、公知のＮｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３及びＴＨ等のドーパミン産生ニューロンマーカーは、分裂停止後に初めて発現が誘導され、ＤＡＴ及びＡＤＨ２は発現が進んで初めて発現を開始する。Ｌｍｘ１ｂは増殖前駆細胞でも発現が認められるが、非常に発現レベルが低く、分裂停止後に高レベルで発現する。このように公知のマーカーと発現パターンを異にし、増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞から分裂停止後までの全ての分化段階を含むドーパミン産生ニューロンに特異的に発現するＬｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンの検出において有用なマーカーとなるものと考えられる（図８参照）。
【００８９】
Ｌｍｘ１ａは、公知のマーカーと比べ、最も初期に発現するマーカーであることから、細胞における該Ｌｍｘ１ａの発現を指標とすることにより、安全面、生存率及びネットワーク形成能の面でもパーキンソン病を含む神経変性疾患に対する移植治療に適した細胞を選択することを可能にする。さらに、最も初期に発現するマーカーであるという点からも、特にドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング時の有効なマーカーとなることが期待される。このような分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞（ニューロン形成における初期の前駆細胞）から成熟した細胞まで、幅広い分化段階にわたって発現している遺伝子は、ニューロンの成熟過程に関与する種々の因子、及びニューロンの機能の発現に関与する種々の因子を明らかにする上でも役立つものと考えられる。そして、このような因子の解明は、神経変性疾患の治療に大きく貢献することが予期される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む方法。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、請求項３記載の試薬。
【請求項５】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む、方法。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
【請求項６】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
【請求項８】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項７記載の試薬。
【請求項９】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項１０】
さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方の遺伝子若しくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列（ヒト）からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した１５塩基を有する塩基配列である、請求項９乃至１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項３または４記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項１５】
請求項３または４記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項１６】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項１７】
さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項２０】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項１６乃至１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項７または８記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項２２】
請求項７または８記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項２３】
ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、以下の（ｂ−１）〜（ｂ−６）に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物を検出する工程
（ｂ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した１５塩基を有する塩基配列である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、下記（ｂ−１）から（ｂ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子翻訳産物を検出する工程、
（ｂ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の翻訳産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
【請求項２６】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項２５記載の方法。
【請求項１】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む方法。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１３記載の塩基配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長を有する、請求項３記載の試薬。
【請求項５】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程を含む、方法。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
【請求項６】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
下記（１）から（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するための試薬。
（１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
【請求項８】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項７記載の試薬。
【請求項９】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項１０】
さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方の遺伝子若しくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載の塩基配列に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドとドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ａ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列（ヒト）からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した１５塩基を有する塩基配列である、請求項９乃至１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項３または４記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項１５】
請求項３または４記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項１６】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３およびＴＨからなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物と結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項１７】
さらに（ｃ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
（ｂ）工程において、選択された遺伝子がＬｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、またはＥｎ１のいずれか一つまたはこれらのうちの複数である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を検出または選択する方法であって、
（ａ）下記（ａ−１）から（ａ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体をドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料に接触させる工程、
（ａ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ａ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ａ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ａ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ａ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ）ＤＡＴおよびＡＤＨ２から選択された一方もしくは双方の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは該選択された遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を含むと考えられる細胞試料と、を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項２０】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項１６乃至１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項７または８記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項２２】
請求項７または８記載の試薬と、Ｌｍｘ１ｂ、Ｎｕｒｒ１、Ｅｎ１、Ｐｔｘ３、ＴＨ、ＤＡＴおよびＡＤＨ２からなる群より選択された１または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを含む、ドーパミン産生ニューロンおよび／またはその前駆細胞を識別するためのキット。
【請求項２３】
ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、以下の（ｂ−１）〜（ｂ−６）に記載のいずれかの塩基配列からなる遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物を検出する工程
（ｂ−１）配列番号：１３記載の塩基配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｂ−４）配列番号：１５または１７記載の塩基配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードした塩基配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の転写産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドが、少なくとも連続した１５塩基を有する塩基配列である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ドーパミン産生ニューロン分化誘導試薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）ドーパミン産生ニューロンに分化し得る細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた後の前記細胞に、下記（ｂ−１）から（ｂ−６）のいずれかに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を接触させて、Ｌｍｘ１ａ遺伝子翻訳産物を検出する工程、
（ｂ−１）配列番号：１４記載のアミノ酸配列
（ｂ−２）配列番号：１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−３）配列番号：１３記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｂ−４）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列
（ｂ−５）配列番号：１６または１８記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｂ−６）配列番号：１５または１７記載の塩基配列からなる遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされたアミノ酸配列
（ｃ）Ｌｍｘ１ａ遺伝子の翻訳産物が検出された場合に、被験物質がドーパミン産生ニューロンの分化を誘導する能力を有すると判定する工程、
を含む方法。
【請求項２６】
一部配列からなるポリペプチドが、少なくとも連続した６アミノ酸残基を有する、請求項２５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５２１９０
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５８１１（Ｐ２００５−５１５８１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７５７４
【国際出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７５７４
【国際出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【Ｆターム（参考）】
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