ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２−サブユニットの調節配列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製されたトランスジェニック動物
【課題】ｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットの調節配列及びこれをコードする配列を含むＤＮＡを発現することによって、ニコチンの薬理学的効果、ｎＡＣｈＲの役割、ニコチン耽溺、ニコチン欠乏と関連する痴呆などに関する有用な情報を得、ｎＡＣｈＲと関連した活性、行動を回復又は調節する化合物をスクリーニングすることができるＤＮＡなどを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列及び緊縮条件下にＤＮＡにハイブリダイズする配列から実質的になる、ｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットのプロモーターを含む単離されたＤＮＡ、これを含む組換えベクター、形質転換有機体、これを導入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物など。
【解決手段】特定の塩基配列及び緊縮条件下にＤＮＡにハイブリダイズする配列から実質的になる、ｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットのプロモーターを含む単離されたＤＮＡ、これを含む組換えベクター、形質転換有機体、これを導入されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のβ2 −サブユニットのＤＮＡ及びクローンに関する。本発明は、また、β2 −サブユニットニューロンｎＡＣｈＲの調節配列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製されたトランスジェニック動物に関する。５’のフランキング配列は、プロモーターを含み、これが、ニューロンに特異的な発現をもたらす。ゲノムクローンにより、ニコチン系、及びニコチンに対する薬理学的応答におけるβ2 −サブユニット遺伝子の重要性が、証明されている。本発明は、また、ＤＮＡ配列を含むベクター、ベクターにより形質転換された細胞、本配列を有するトランスジェニック動物、及びこれらのトランスジェニック動物より誘導されるセルラインに関する。更にまた、本発明は、上述したもの全ての用途を記載するものである。
【０００２】
本明細書に引用する参考文献は、明細書の終わりに、著者及び発行年又は引用番号を記載する。
【背景技術】
【０００３】
ニューロン特異的発現
組換えＤＮＡに基づく多くの操作では、組織特異的な発現が、必要である。遺伝子導入療法における、望ましくない、又は潜在的に有害な副作用、及び操作は、適正な組織特異的発現を行うことによって、減少することができる。更に、一つのセルタイプ単独に対してある種のタンパク質の発現をコントロールすることができると、重要な治療又は解析の目的で、科学者が、これらの細胞をマッピング、認識又は精製する能力が、向上する。興味の対象である細胞が、ニューロン、又はニューロンの特定のサブセットである場合、ニューロン特異的又はサブセット特異的な発現をもたらすＤＮＡ配列が、必要となる。
【０００４】
有機体により発現されるタンパク質は、ニューロンにより、しばしば、特定の目的に利用される。これらのタンパク質の特定のサブユニット又は成分を、ニューロン組織中のみで発現させることによって、ニューロンは、その目的に応じて、タンパク質活性を、作り替える。特定の、ニューロン特異的なサブユニット、又は成分を、発見し、なぜこれらが、ニューロン組織においてのみ産生されるかを解明することによって、ニューロン特異的な発現をもたらすＤＮＡ成分への鍵が得られる。
【０００５】
アセチルコリン受容体の生物学に関する本発明者らの知識により、本発明のための重要な知見が得られた（Changeux, The New Biologist, Vol. 3, No. 5, pp. 413-429)。異なる型のアセチルコリン受容体が、異なる組織に確認されており、異なるアゴニストに応答する。その一種類であるニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、ニコチンに応答する。この型のサブグループは、ニューロンにおいてのみ確認されており、ニューロンｎＡＣｈＲと称される。
【０００６】
一般的には、５種類の型のサブユニットが、アセチルコリン受容体複合体を形成する。受容体中のサブユニットの型により、アゴニストに対する特異性が決定される。ある種の細胞群に対する特定のアセチルコリン受容体型の局在化をコントロールするのが、これらのサブユニットの発現パターンである。これらの特異的発現パターンの獲得に関与する遺伝的メカニズムにより、組織に特異的、又はより限定された細胞群に特異的な発現に対するコントロール能が得られる。本発明者らの研究は、プロモーター配列における規定された要素により、β2 −サブユニットのためのニューロン特異的な発現が得られることを示している。
【０００７】
ニコチンの薬理学的効果
上述したように、ｎＡＣｈＲは、アゴニストであるニコチンに応答する。ニコチンは、学習及び記憶を含む行動の多くの面に関与している（１，２）。ニコチンの薬理学的効果及び行動学的効果は、ニューロンｎＡＣｈＲと関係する。低用量のニコチン（２３）又はニコチン様アゴニスト（１６）を用いた研究では、脳における高親和性ｎＡＣｈＲが、受動的忌避行動に対するニコチンの効果に介在することが、示唆されている。従って、ニューロンｎＡＣｈＲが変化しているモデルシステムにより、ニコチンの薬理学的効果、認識の過程におけるニューロンｎＡＣｈＲの役割、ニコチン耽溺、及びニコチン系における欠損と関連する痴呆に関する有用な情報が、得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（α7 −サブユニットは、in vitro6,7 において、機能性ホモオリゴマーを生成することができるが）機能的ニューロンｎＡＣｈＲは、少なくとも一種類の型のα−サブユニット及び一種類の型のβ−サブユニットを含む五量体タンパク質複合体である（３〜５）。β2 −サブユニットは、本研究のために、７種類の公知のα−サブユニット及び３種の公知のβ−サブユニットから選択した（３）。脳において、広く発現されており（８〜１０）、脳のほとんどの領域では、その他のβ−サブユニットが、発現しないためである（１０）。したがって、このサブユニットの突然変異により、ＣＮＳニコチン系における有意な欠損が生じるはずである。本発明者らは、薬理学及び行動学におけるβ2 −サブユニットの関与に関して、検討を行った。トランスジェニックマウスにおいて、β2 −サブユニットを突然変異させるために、遺伝子ターゲッティングを用いた。
【０００９】
本発明者らは、ニコチンに対する高親和性結合部位が、β2 −サブユニット突然変異に対してホモ接合性である、つまりβ2 −／−であるマウスの脳には存在しないことを、発見した。更に、脳スライスの電気生理学的記録により、これらのマウス由来の視床ニューロンが、ニコチン投与に応答しないことが明らかになった。最後に、行動学的試験により、ニコチンは、連想学習の一手段である受動的忌避試験において、β2 −／−マウスの能力を、向上させないことが証明されている。逆説的に、突然変異マウスは、この試験において、非突然変異同胞種よりも、高い能力を示すことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の簡単な概要及びその有用性
本発明の特徴においては、我々は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットの調節及びコード領域を含むＤＮＡの１５kbの断片について記載する。我々は、β2 −サブユニット遺伝子のプロモーターを、in vitro及びトランスジェニックマウスにおいて特徴づけるものである。我々は、本遺伝子の正の調節に関与するＥ−ボックス及びその他の共通タンパク質結合配列を含む、数種類のＤＮＡ要素について、記載するものである。更に、我々は、β2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的な転写が、転写された配列に位置する一つを含む、少なくとも二つの負の調節要素を含むことを示すものである。
【００１１】
これらの特徴の好ましい実施態様は、特定のプロモーター配列、並びに各種細胞及び有機体におけるニューロン特異的発現のコントロールにおけるその用途に関する。１１６３bp配列及び８６２bp配列は、両者とも、ニューロン特異的発現をもたらす。その他の実施態様には、必須活性化要素を含む、図１の−２４５〜−９５の配列、及びリプレッサーを含む図１の−２４５〜−８２４の配列が含まれる。ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列からなるリプレッサー要素は、転写された領域にも存在する。これらのゲノム配列からなるある種のプラスミドについても、同様に記載する。
【００１２】
プロモーター配列は、ある種の規定された細胞におけるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現をコントロールする能力を有するため、重要である。例えば、以下に示すようなトランスジェニックマウスにおいては、トキシンなどをコードする配列は、ニューロンに対して作用し、疾患状態におけるこれらの細胞の崩壊をまねる。その他のものも、以下に記載するデータより、明らかであろう。
【００１３】
替わりに、プロモーターは、ある種のニューロンに対して、コードされた成長因子又は腫瘍発生性、腫瘍形成性若しくは不死化タンパク質をコントロールして、腫瘍発生をまねることができる。これらの細胞は、培養物中に単離及び増殖させることができる。別の用途においては、プロモーター配列は、in situ において特定のニューロンを認識、又は細胞選別技術により、ニューロンを単離するために、レポーター配列に有効に結合させることができる。単離、精製されたニューロンは、次に、in vitroにおける生化学的又は遺伝子学的解析に用いることができる。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼなどのレポーター配列については、以下に記載する。
【００１４】
本発明の別の特徴においては、本発明者らは、マウスのニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットのゲノムクローンを提供するものである。これらのクローンは、哺乳類のニコチン系及びニコチンの薬理学の解析において有用である。本発明者らは、β2 −サブユニットのゲノムクローンを、ニコチンの高親和性結合をはたきだすために用いたトランスジェニックマウスを用いた解析について、記載する。
【００１５】
記載した欠失突然変異体に加えて、β2 −サブユニットのエキソン又は調節配列に取り込まれた突然変異により、有用な突然変異トランスジェニック動物が得られるであろう。これらの突然変異は、点突然変異、欠失突然変異又は挿入突然変異であることができ、ｎＡＣｈＲの非有効な活性、又は非活性受容体を得ることができる。このような突然変異動物により、化合物の、ｎＡＣｈＲ活性若しくは機能を回復又は調節する能力を決定するための方法が、可能となり、このような方法を考案することができる。機能の調節は、受容体の数、活性若しくはその他の補償のメカニズムを、アップレギュレーティング又はダウンレギュレーティングすることによって、行うことができる。また、化合物が、記載する、又は公知（１７、２２、１８、２、１９、２１、２３、２４を参照）の行動学的解析における野生型の行動を回復又は調製する能力を決定するための方法は、突然変異動物を用いて、考案することができる。行動学的解析は、記憶、学習、不安症、運動活性及び注意力を、非処理動物又は患者と比較して、試験することからなるが、これに限定されるわけではない。したがって、ｎＡＣｈＲと関連した活性若しくは行動を回復又は調節する化合物を選択するための薬理学的解析（１２、１３、１４、１５、２０を参照）は、本発明により提供される突然変異動物により行うことができる。可能性のある治療薬の投与量及び量は、確立された技術により決定することができよう（例えば、参考文献１６を参照）。
【００１６】
トランスジェニック動物又はこれらの動物から誘導される細胞からなる現在のモデルシステムは、学習及び行動に対するニコチンの役割、ニコチンの薬理学、ニコチン耽溺、及びニコチン系における欠乏と関連する疾患の状態を解析するのに使用することができる。更に、ニコチン耽溺又はニコチン系における欠乏に対する潜在的な治療法を、トランスジェニック動物、又はこれらより誘導される細胞及びセルライン、又はファージβ2 （ＣＮＣＭ受託番号Ｉ−１５０３）のＤＮＡ断片若しくは完全なＤＮＡをトランスフェクションさせたいずれのセルラインによっても、試験することができる。これらのセルラインは、β2 −サブユニット配列を有する又はβ2 −サブユニット配列において突然変異を起こしたホモ接合又はヘテロ接合トランスジェニック動物から、直接得られる全てを含むものである。加えて、これは、天然型β2 −サブユニット配列又は突然変異β2 −サブユニット配列を用いた培養物中に形成されるセルラインを含むものである。ここで使用する技術は、例えば、PCT WO 90/11354 に引用されているそれらである。
【００１７】
高親和性ニコチン結合部位が減少しているアルツハイマー病などの痴呆症により、この欠乏の補償のための薬物をスクリーニングするために、本モデルを使用することができることが示唆される。したがって、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性を回復又は検出できる程度にもたらす能力について、化合物をスクリーニングする方法であって、本化合物を、適当なセルラインに付加する、又は本化合物を、トランスジェニック動物に導入することからなる方法を、考案することができる。本発明により得られるトランスジェニック動物及びセルラインは、これらの方法において、用いることができる。このような動物又はセルライン系は、β2 遺伝子の活性を回復又は調節することができる化合物を、選択するためにも使用することができる。
【００１８】
β2 −サブユニット遺伝子配列（野生型又はその突然変異体の断片）により得られたトランスジェニック動物は、二重トランスジェニック動物を発生させるために使用することができる。この目的のために、β2 −サブユニットトランスジェニック動物を、同一種のその他のトランスジェニック動物又は同一種の天然の突然変異動物と、交配させることができる。得られる二重トランスジェニック動物、又はそれより誘導される細胞を、親のβ2 −サブユニットトランスジェニック動物と同じ用途に使用することができる。
【００１９】
プロモーター配列及びゲノムクローンの両者は、調節タンパク質が存在するか又はしないかについて解析するために使用することができる。以下のゲルシフト法は、このような用途を、例示するものである。配列又はクローンは、放射性核種、蛍光化合物などのマーカー、又は架橋タンパク質若しくはアビジン−ビオチンなどの化合物を、取り込む又は結合させることによって、プローブとして使用することもできる。これらのプローブは、ニューロンの作用若しくはアセチルコリン受容体系に関与するタンパク質、核酸又はその他の化合物を認識或いは測定するために使用することができる。
【００２０】
有用なβ2 突然変異動物、セルライン又は配列を発生させるために、核酸配列を突然変異させる又は修飾するための公知の方法を、本発明と組み合わせて使用することができる。このような方法には、点突然変異、部位特異的突然変異誘発、欠失突然変異、挿入突然変異、相同的組換えより得られる突然変異、及びＤＮＡ若しくはＤＮＡを有する細胞の化学的又は放射線処理により得られる突然変異が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ＤＮＡ配列解析は、所望又は必要であれば、発生した突然変異を調べるために使用する。次に、突然変異動物、セルライン又は配列を、本発明者らが記載するＤＮＡ配列、システム、測定法、方法又は工程に使用する。突然変異を起こしたＤＮＡは、定義によりゲノムＤＮＡとは、異なる又は同一ではないであろう。突然変異動物は、また、ここに記載する配列を含む、又は本発明により使用可能となる第一のトランスジェニック動物を、第二の動物と交配することによって、作製する。第二の動物は、第一の動物に含まれるＤＮＡとは異なるＤＮＡを含むことができる。このような方法で、突然変異動物の各種ラインを作製することができる。
【００２１】
更にまた、ここに記載するＤＮＡ配列を、上述したように交配し、これらのＤＮＡ配列を、発現ベクターに結合させ、β2 −サブユニットタンパク質又はβ2 −サブユニット配列から誘導される突然変異体を発現させるために、組換えＤＮＡ技術が利用可能である。したがって、β2 −サブユニット又は突然変異体は、その生化学的又は行動学的活性について、解析することができる。このような方法で、有効なｎＡＣｈＲの発現を妨げる突然変異ＤＮＡ配列を、作製することができる。
【００２２】
代わりに、記載するプロモーター配列を、その他のタンパク質の発現を誘導するために、発現ベクター又はシステムにおいて使用することができる。得ることのできるＤＮＡ配列は、したがって、これらのＤＮＡ配列を転写、又はこれらのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを産生するために、本発明者らが記載するプロモーター又は調節配列に結合させることができる。
【００２３】
関連技術の記載
In situ におけるハイブリダイゼーション(Wada et al., 1989; Hill et al., 1993; Zoli et al., 1994) 及び免疫組織化学(Hill et al., 1993) による従来の研究により、これまでにクローニングされたニューロンｎＡＣｈＲサブユニットの全てが、厳密なニューロン特異的分布を示すことが証明されている。しかし、異なるサブユニットも、脳内のニューロンの小さなサブセットに対してのみ、同様に厳密な分布を示す。例えば、ｎＡＣｈＲα2 −サブユニットのトランスクリプトは、ニワトリの間脳のSpiriformis lateralis の核(Daubas et al., 1990) 又はラットの脚間核(Wada et al., 1988) においてのみ、検出される。また、β3 、β4 及びα3 −サブユニットトランスクリプトは、脊椎動物の脳における構造の小さいセットにおいてのみ検出される（Zoli et al., 1994 中の参考文献）。
【００２４】
ｎＡＣｈＲ、α4 、α5 、α6 及びβ2 −サブユニット遺伝子トランスクリプトは、比較すると、はるかに広い分布を示す（Wada eT al., 1989; Zoli et al., 1994中の参考文献）。例えば、β2 −サブユニットトランスクリプトは、ＣＮＳのニューロンの多く及び末梢ニューロンの全てに認められ、ｎＡＣｈＲを発現する(Role, 1992; Hill et al., 1993) 。
【００２５】
これらのサブユニットの発現の違いの結果、脊椎動物においては、ｎＡＣｈＲが、種により、非常に多様に存在する。それぞれの種は、ニューロンの多様なカテゴリー又はグループと関連する、定義された発現パターンを有する。例えば、内側手綱由来のニューロンは、脚間核由来のそれらと相互に結合し、それぞれが、異なる生理学的及び薬理学的特性を示す(Mulle et al., 1991)、異なるセットのｎＡＣｈＲサブユニットを発現する（参考のため、Role, 1992を参照）。
【００２６】
ニューロンにおけるｎＡＣｈＲ遺伝子転写の調節を説明する遺伝的メカニズムについては、これまで限られた情報しか得られていない。In vitroで解析を行ったニワトリα7 −サブユニット遺伝子のプロモーターに関するこれまでの研究では、転写調節を司るＤＮＡ要素を特徴づけることができなかった(Matter-Sadzinski et al., 1992) 。別の研究では、α2 −サブユニット遺伝子のプロモーターが、一部特徴づけられ、サイレンサーが、記載され、配列が決定されている（Bessis et al., 1993, Daubas et al., 1993も参照）。
【００２７】
ある種の証拠により、特にβ2 −サブユニットに関する研究が、詳細に行われている。脳のニューロンのほとんどにおいて、これは発現されている(Hill et al., 1993) 。また、β2 −トランスクリプトの出現のタイミングは、ニューロン分化のそれと、密接に平行している(Zoli et al, 1994)。従って、我々は、その転写を調節する遺伝メカニズムについて研究することを決定した。
【００２８】
本発明の簡単な記載
遺伝子構造
我々は、マウスのｎＡＣｈＲβ2 −サブユニット遺伝子の調節配列及びそれをコードする配列を含む遺伝子断片を、クローニングした。本発明者らは、調節領域の少なくとも一部が、異なる哺乳類の種においても、保存されていることを発見した。特に、ＮＲＳＥ／ＲＥ１に対応する＋１６〜＋３８bpの領域を、図１に記載する。プライマー伸長生成物のＲＮアーゼによる保護及び増幅を用いて、我々は、１カ所の大きな、そして３カ所の小さい転写開始部位を発見した（図１）。プライマーの伸長実験は、異なる２種類の逆転写酵素を用い、異なるバッチのｍＲＮＡ及び異なるプライマーにより行った。これらのＰＣＲに基づく技術により、我々は、逆転写酵素の停止部位ではなく、転写開始部位に対応する同一の断片を増幅及びサブクローニングすることができた。我々が特徴づけた転写開始部位は、最長のラット(Deneris et al., 1988)及びヒト(Anand and Lindstrom, 1990) β2 ｃＤＮＡ５’末端の位置から下流に位置する（図１を参照）。これは、ヒト及びラットでは、別の転写開始部位が、使用されていることを意味する。種間におけるこのような不一致は、筋ｎＡＣｈＲ（Duerr et al., 1994, Dong et al., 1993; Toussaint et al., 1994 も参照）のεサブユニットについては、既に証明されている。α2 −サブユニット遺伝子(Bessis et al., 1993) とは反対に、上流にエキソンは、検出することができなかった。
【００２９】
１．２kbp のフランキング領域の構造に関する解析によって、Ｓｐ１部位及びＥ−ボックスを含む核タンパク質結合のための多くの共通モチーフが示された。１．２kbの非欠失プロモーターの約９０bpが、転写され、この領域は、ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列を含む(Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992)。ポリオーマウイルス(Bourachot et al., 1989)又はｆｏｓ遺伝子(Lamb et al., 1990) などの異なる系における転写開始部位の下流に、調節要素が存在することは、既に記載されている。
【００３０】
プロモーター領域は、エキソン１に位置するＥｃｏ４７III （図１を参照）と、４．５kb上流のＢａｍＨＩ部位の間に位置する。一つの好ましい実施態様は、図１に記載した、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７III 部位の間の１１６３bpの配列である。調節配列は、Ｅｃｏ４７III 部位から２kb下流に位置するかもしれない。ｎＡＣｈＲβ2 −サブユニット配列由来の調節要素は、これらに結合した、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列のニューロン特異的発現をコントロールするために使用することができる。該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、トキシン、栄養因子、ニューロペプチド、腫瘍形成性、腫瘍発生性若しくは不死化タンパク質、又はニューロンの機能を変更することのできるその他のあらゆるタンパク質であることができる。
【００３１】
１１６３bpのプロモーターは、細胞特異的転写を達成する
１１６３bpのプロモーターは、β2 −サブユニット遺伝子の組織特異的及び一時的に特異的である転写の両者のための調節配列を含有する。一時的トランスフェクションの実験により、１１６３bpの断片は、ｎＡＣｈＲβ2 −サブユニット遺伝子の細胞特異的発現をもたらすための十分な情報を含むことが示された。我々は、同一のプロモーターが、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポーター遺伝子の厳密な細胞特異的転写をコントロールすることを示した。更に、導入遺伝子構成物は、胎児神経系の初期の発達の間、内因性β2 −サブユニット遺伝子と同一のタイミングで、活性化されると考えられる（Zoli et al., 1994)。発達の後期の段階では、末梢β2 発現ニューロンの多くは、まだ標識されている（図４Ｃ、Ｄ）。
【００３２】
トランスジェニックマウスにおいて、β2 −サブユニットプロモーターのコントロール下、β−ｇａｌを発現する２種類のライン（１３及び２６）を発生させることによって、プロモーター配列を試験した。ＣＮＳにおいては、βガラクトシダーゼ発現のパターンは、２種類のラインの間で異なっていた。正常にβ2 を発現する細胞のサブセットのみが、導入遺伝子を発現する。導入遺伝子及び内因性遺伝子の発現におけるこの種の不一致は、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ遺伝子プロモーター(Mercer et al., 1991; Hoyle et al., 1994) 又はＧＡＰ−４３遺伝子(Vanselow et al., 1994) については、既に記載されている。性器結節及び皮膚筋における導入遺伝子のライン１３においては、予想外の発現が観察された。これらの組織は、ライン２６においては、染色されないため、この発現は、導入遺伝子の組込み部位に由来すると考えられる。我々の知る限りでは、遺伝子導入により研究されたニューロンプロモーターの多くは、小さい割合の導入遺伝子ラインにおいて、異所性発現を示す(Forss-Petter et al., 1990; Kaneda et al., 1991; Banerjee et al., 1992; Hoesche et al., 1993; Logan et al., 1993, Vanselow et al., 1994)。しかし、当業界の技術では、導入遺伝子の発現パターンが、本来の遺伝子のそれを、厳密に反映又は重複しているラインの構成が可能である。詳細については、遺伝子導入操作の結果を示す参考文献を参照。
【００３３】
β−ｇａｌ陽性細胞の分布を、その他の公知のニューロンマーカーのそれと比較することによって、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ＴｒｋＡ（高親和性神経成長因子受容体）及びｐ75（低親和性神経成長要素受容体）発現細胞の分布には、類似性があることが明らかになっている(Yan and Johnson, 1988: Pioro and Cuello, 1990a, b; Ringstedt et al., 1993) 。詳細には、発達中のラットでは、ｐ75が、ほぼ全部の神経節及び中心核において発現されており（不確帯及び視床下部核以外）、これは、導入遺伝子を発現したものである(Yan and Johnson, 1988) 。ｐ75の発現は、（β2 −プロモーター導入遺伝子の発現と同様）多くの末梢神経節及び脳核においては、一時的であり、周産期又は生後早い年齢で、検出不可能なレベルに低下することも、興味深い。したがって、β2 −サブユニットプロモーターは、ｐ75の活性化によりコントロールされる要素を含み、又はβ2 導入遺伝子及びｐ75遺伝子の両者が、共通の調節要素によりコントロールされている可能性がある。
【００３４】
結論として、本プロモーターでは、脳で活性であるある種の調節要素が欠落するが、存在する調節要素が、ＰＮＳ、脊髄及び幾つかの脳構造における、細胞及び発達に特異的なβ−ガラクトシダーゼの発現を可能とするのに十分である。このプロモーターは、また、ニューロン組織における調節タンパク質を認識するための測定法に使用することもできる。
【００３５】
ＤＮＡ調節要素
β2 −サブユニット遺伝子の転写に関与するＤＮＡ要素を更に特徴づけするため、我々は、１１６３bpプロモーターを欠失又は突然変異させ、結果として得られた構成物を一時的トランスフェクションにより解析した。遠位５’末端領域内に存在するリプレッサー要素は、線維芽細胞内では活性であるが、神経芽腫内では活性でない。したがって、この要素によって少なくとも部分的に、β2 −サブユニット遺伝子のニューロン特異的発現が説明される。プロモーターを更に解析すると、５８９bpを欠失させた場合に、神経芽腫内では活性が増大するが線維芽細胞内では増大しないということが示される（図６、８６２Ｅと２８３Ｅ−Ｌｕｃｉを比較すること）。
【００３６】
ＮＲＳＥ／ＲＥ１要素は、プロモーターの３’末端に位置する。この要素は既に、ニューロン細胞内でプロモーターの活性を制限することが示されている（Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992; Li et al., 1993)。β2 −サブユニット遺伝子の１１６３bpのプロモーターにおいては、この配列の点突然変異が、線維芽細胞中の転写活性を１００倍（〜１００fold）増大させ、このことが、この配列が、β2 −サブユニット遺伝子のニューロン特異的発現に関与していることを、意味している。その上、配列を比較すると、この配列が、ラット及びヒトβ2 −サブユニットｃＤＮＡ内（Deneris et al., 1988; Anand and Lindstrom, 1990)並びに中重量ニューロフィラメント遺伝子、ＣＡＭ−Ｌ１遺伝子、カルビンジン遺伝子又は小脳Ｃａ結合タンパク質遺伝子（以下に示す表２を参照）などの神経系内で発現される遺伝子のいくつかのプロモーターの中で、高度に保存されていることが示される。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２：１１６３bpプロモーターの近位領域内の正及び負の調節要素
その他のニューロンプロモーターとの、β−サブユニットプロモーターの近位サイレンサーのアラインメント。配列は(Maue et al., 1990; Ｎａチャンネル、受託番号Ｍ３１４３３）、(Mori et al., 1990; ＳＣＧ１０、Ｍ９０４８９）、(Sauerwald et al., 1990; Synapsin Ｉ、Ｍ５５３０１）、(Kohl et al., 1992; ＣＡＭＬ１遺伝子、Ｘ６３５０９）、(Gill and Christakos, 1993; カルビンジン遺伝子、Ｌ１１８９１）、(Zopf et al., 1990; ニューロフィラメント遺伝子、Ｘ１７１０２、逆配向）から取られたものである。番号付けは Gen Bank/ＥＭＢＬライブラリ内の配列を意味する。
【００３９】
図６に記載した欠失実験は、ヌクレオチド−２４５と−９５の間に必須活性化部位が存在することを示している。この領域内でＳｐ１結合部位及びＥ−ボックスを検出することができた。Ｓｐ１部位は、汎存要素であり、一方Ｅ−ボックスは、筋肉内（ｎＡＣｈＲα1 −サブユニットについてはBessereau et al., 1994を参照）並びにニューロン内（Guillemot et al., 1993）でのいくつかの遺伝子調節メカニズムに関与してきた。２回回転軸要素も同様に、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（Yoon and Chikaraishi, 1994）、ＳＣＧ１０遺伝子（Mori et al., 1990)、ＧＡＰ４３遺伝子（Nedivi et al., 1992)のそれらなどのいくつかのニューロンプロモーター内、又はＮ−ＣＡＭ遺伝子のフランキング領域内（Chen et al., 1990)でも報告されている。以下に示す表３に示されている結果は、神経芽腫において、Ｅ−ボックス／２回回転軸内で突然変異を受けた１１６３bpのプロモーターが野生型プロモーターに比べて著しく活性が低いことを証明している。その上、ゲルシフト測定（図７）は、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、特異的複合体を結合させることができることを更に証明している。これは、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、β2 −サブユニット遺伝子の転写の活性化の少なくとも一部分を司ることを示唆している。しかし、非相同プロモーターのトランス作用実験は、Ｅ−ボックスが２７bp上流にあるＳｐ１部位と協力して、転写を正に活性化させることを示唆している。Ｅ−ボックスとＳＰ１結合部位の間のこの種の協力は、既に、筋肉ｎＡＣｈＲα1 −サブユニット転写の調節についても証明されている（Bessereau et al., 1993）。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３：１１６３bpプロモーターの近位領域内の正及び負の調節要素
１１６３bpプロモーターの近位部分内の突然変異の効果。野生型又は突然変異を受けたプロモーターの活性は、プロモーター無しのＫＳ−Ｌｕｃｉプラスミドのルシフェラーゼ活性に合わせて正常化している。ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの活性は、図３からのものである。
【００４２】
結論として、我々は、β2 −サブユニット遺伝子が、負の作用をする要素とＥ−ボックスを含む１つの正の要素により基本的に調節されることを示してきた。この二重調節は、いくつかのニューロン遺伝子に共有される一般的特長であると思われ（Mandel and Mckinnon, 1993)、ニューロン遺伝子の転写の微調節を可能にしている。その上、我々の遺伝子導入に関する研究は、１１６３bpのプロモーターが緊密なニューロン特異的発現をもたらすものの、いくつかの発達要素又はＣＮＳ特異的調節要素が欠如していることを示している。
【００４３】
図１
β2 −サブユニット遺伝子のイニシエーターＡＴＧをとり囲む領域のヌクレオチド配列
４つの垂直な矢印の頭は、転写開始部位に対応する、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及びＳＬＩＣを用いて発見された４つの末端を示す。垂直な矢印は、最長のラット（ｒ）及びヒト（ｈ）のβ2 −サブユニットｃＤＮＡクローンの５’末端に対応する位置を表わしている(Deneris et al., 1988)。図３に記載する実験に使用した欠失の終点は、配列の上に示す。イントロン内に位置するヌクレオチドは、小文字でタイプしている。
【００４４】
図２
β2 −サブユニットｍＲＮＡの５’末端のマッピング
ａ．ＲＮアーゼ保護実験。イントロン１の１５８ヌクレオチド及び上流の配列の７８９ヌクレオチド（−６３４／＋１５５）を含む32Ｐで標識されたＲＮＡプローブに対して、ＤＢＡ２マウスの脳（それぞれレーン２及び３、５及び１５μg ）及び酵母ｔＲＮＡ（レーン１、１５μg)由来の総ＲＮＡをハイブリダイズした。保護されたバンドのサイズを、ＤＮＡと比較してのＲＮＡのアクリルアミドの低移動度に応じて(Ausubel et al., 1994)、及び万能プライマーでプライミングされたＭ１３ｍｐ１８の配列との比較により評価した。ゲルの左側部分の矢印は、主要な保護バンドを指している。
ｂ．ＳＬＩＣを用いた転写開始部位の認定。図の下部は、ＳＬＩＣ又はＲＡＣＥ−ＰＣＲのために使用するオリゴヌクレオチドを記載し、その方針を示している。ＳＬＩＣ実験においては、プライマーの伸長を、オリゴヌクレオチドｐＥｘ３を用いて行った。ｃＤＮＡの最初のストランドを、その後オリゴヌクレオチドＡ５’に連結させ、結果として得られた断片を、まずオリゴヌクレオチドＡ５’−１／ｐ0 を用い次にＡ’−２／ｐ１を用いて増幅させた。その後、増幅させた断片を、１．２％のアガロースゲル上に配置した。ゲルをブロッティングし、オリゴヌクレオチドｐ２に対しハイブリダイズした。レーン１：全ＤＢＡ２マウス脳ＲＮＡ５μg 、レーン２−３：それぞれ逆転写酵素及びＲＮＡを用いないコントロール。マイナス：Ｔ４ＲＮＡポリメラーゼを省略した。ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、同じ結果を得た。
【００４５】
図３
In vitroでのβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現
プロモーター無しのプラスミド（「材料と方法」の中で記述するＫＳ−Ｌｕｃｉ）の活性に合わせて、プラスミドのルシフェラーゼ活性を正常化した。ルシフェラーゼオリゴヌクレオチド（「材料と方法」の中で記述する）を用いた、ＥＥ１，２−Ｌｕｃｉによりトランスフェクションを行ったＳＫ−Ｎ−Ｂｅから抽出したｍＲＮＡについてのＲＡＣＥ−ＰＣＲは、増幅された断片が、適正な転写開始部位について予想されたサイズを有することを示した。
【００４６】
図４
トランスジェニックマウスにおけるβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現
ａ．Ｅ１３胚の全マウント着色。矢印の頭は皮膚筋における異所的発現を指している。
ｂ．腰仙レベルでのＥ１３胚の側矢状断面内でのβ−ガラクトシダーゼ活性の検出。矢印の頭は、脊髄の前角及び背角内での標識を示す。
ｃ．同じ胚の隣接する断面内でのβ2 −サブユニットのトランスクリプトの検出。ｄｒ：背根神経節；ｔ：蓋；ｏｇ：交感神経節鎖；ｔｒ：三叉神経節。
【００４７】
図５
トランスジェニックマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現
ａ．網膜（ｒｅ）及び三叉神経節（ｔｒ）（Ｅ１４．５）の染色。
ｂ．心副交感神経節ニューロン（ｐｇ）（Ｅ１４．５）の染色。
ｃ．脊髄（ｐｌ）の横断面、ｄｒ：背根神経節、ｏｇ：交感神経節
ｄ．脊髄（ｐｌ）の腹側図。小さい方の矢印は、認識されなかったニューロンを表わす。
【００４８】
図６
β−サブユニットプロモーターの５’末端欠失を含むルシフェラーゼ融合遺伝子の発現
プラスミドは、ｎｎｎＥ−Ｌｕｃｉと呼ばれ、ここで、ｎｎｎは、挿入ヌクレオチドのサイズであり、Ｅは、５’末端制限部位（Ｅｃｏ４７III)である。矢印は、転写開始部位を表わす。ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの活性は、図３からのものである。
【００４９】
図７
ゲルシフト実験
移動度シフト実験のオートラジオグラム。使用したプローブは、32Ｐで標識した二本鎖Ｅ−Ｄオリゴヌクレオチドであった。このオリゴヌクレオチドは、Ｅ−ボックス／２回回転軸要素のみを有しており、一方オリゴヌクレオチドＳ−Ｅは、Ｓｐ１結合部位並びにＥ−ボックス／２回回転軸要素を有している。競合性オリゴヌクレオチドを、１００倍モル過剰においてのみ使用したＳ−Ｅを除き、１０倍及び１００倍のモル過剰で使用した。
【００５０】
図８は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットをコードする遺伝子の分断を示す。ａ−ｉは、マウスβ2 −サブユニット遺伝子の通常のゲノム構造である。組換え事象によって除去されたエキソンの部分は、淡い灰色で示している。ＡＴＧ：イニシエーターメチオニン。囲いは、エキソンＩ〜IVを表わす。ａ−ｉｉは、内因性β2 −サブユニット遺伝子を分断するのに使用した標的置換ベクターである。イニシエーターメチオニン及び第一のエキソンの残りが、ＮＬＳ−ｌａｃＺのコード領域及びＭＣｌneoR発現カセット25によって置き換えられている。この構成物は、ＰＣ１２細胞（図示せず）の安定なトランスフェクションの後、ｌａｃＺの発現をコントロールすることができたが、ｌａｃＺ ＤＮＡにおける明らかな組換えの欠如にもかかわらず、組換え動物中に、ｌａｃＺの発現は検出されなかった。ジフテリアトキシン−Ａ遺伝子（ＤＴＡ）26を使用して、無作為的な組込みに対して選択を実施した。ａ−ｉｉｉは、突然変異β2 −遺伝子の構造である。制限部位：Ｈ、ＨｉｎｄIII ；Ｒ、ＥｃｏＲＩ；Ｅ、Ｅｃｏ４７III ；Ｐ、ＰｓｔＩ。黒の矢印は、胚ステム（ＥＳ）細胞中の組換え事象を検出するために使用したプライマーを示す。灰色の矢印は、野生型又は突然変異β2 遺伝子を検出するために使用したプライマーを示す。ｂは、＋／＋マウス、＋／−マウス及び−／−マウスから得た末端ＤＮＡのＰＣＲ解析図である。ｃは、パネルｂで解析したものと同じマウスから得た、ＨｉｎｄIII で制限した末端ＤＮＡのサザーンブロッティング解析図である。ｄは、β2 −サブユニットに対して作製したモノクローナル抗体を用いた、全脳タンパク質のウエスタンブロッティング解析図である。
【００５１】
方法。ａ：多クローニング部位（ＭＣＳ）をＭＣｌネオカセットに挿入することにより、β2 −標的ベクターを構成した(GTC GAC GGT ACC GCC CGG GCA GGC CTG CTA GCT TAA TTA AGC GGC CGC CTC GAG GGG CCC ATG CAT GGA TCC) 。ＡＴＧに対する４．１kbのＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ４７III β2 −ゲノム断片５’及びβ2 −遺伝子の最初のイントロン内で開始する１．５kbのＰｓｔＩ β2 −ゲノム断片をＭＣＳ中にクローニングした。前記のエレクトロポレーション25により、ＨＭｌ27,28 胚ステム細胞（５×１０7 個）を、線形化した標的ベクターでトランスフェクションした。生存する２４個のＧ４１８耐性クローンをＰＣＲによって選別した（β2 −プライマー GCC CAG ACA TAG GTC ACA TGA TGG T;ネオプライマー GTT TAT TGC AGC TTA TAA TGG TTA CA）。４個が陽性であり、これらを、後にサザーンブロッティング解析によって確認した。クローンを、non-agoutiＣ５７ＢＬ／６マウスから得た３．５日齢の胚盤胞に注入し、受容性のメスに播種した。得られたオスのキメラマウスを、Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２のnon-agoutiメスと交配した。１５匹のキメラのうち、１匹が生殖系列伝達を示した。β2 ＋／−ヘテロ接合体を交配し、子孫をＰＣＲ解析によって評価した（パネルｂ）。ｂ：ＰＣＲは、９４°／１分、６５°／２分及び７２°／１分の３５サイクルであった。ｃ：前記29のようにサザーンブロッティングを実施した。標的構成に使用した１．５kbのＰｓｔＩゲノム断片を無作為的なプライミングによって標識した。ｄ：前記29のように、モノクローナル抗体２７０11を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。
【００５２】
図９及び図１０は、in situ におけるハイブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。図９は、ｎＡＣｈＲのβ2 −、α4 −及びβ4 −サブユニットをコードするｃＤＮＡの配列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを用いて、β2 ＋／＋、＋／−及び−／−マウスの脳から得た連続切片におけるそれぞれのｍＲＮＡを検出したin situ におけるハイブリダイゼーションである。視床中間区分が示されている。白の矢印は、β4 −アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標識されたＭＨｂを示す。図１０は、野生型、ヘテロ接合体及びβ2 −突然変異体のマウスの脳における高親和性結合部位を表わす、トリチウム化ニコチンを用いた受容体オートラジオグラフィーである。線条、視床及び蓋のレベルを表わす切片が示されている。
【００５３】
方法。in situ におけるハイブリダイゼーションを次のように実施した。In situ におけるハイブリダイゼーション手順。凍結した組織をクリオスタットで切断し（厚さ１４μm の切片）、ポリ−１−リシン被覆スライドに解凍しながらマウントし、−８０℃で１〜３日間貯蔵した。この処置は、Young らの方法（１９８６）にしたがって実施した。すばやく４％パラホルムアルデヒドを用いて、切片を室温で５分間固定化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したのち、エタノール及びクロロホルム中でアセチル化し、脂質を除去した（５分）。これらを、パラフィルムカバースリップの下、３７℃で２〜４時間プレハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション混合物の組成は、０．０２M トリスＨＣｌ（pH７．５）中、５０％ホルムアミド、０．６M ＮａＣｌ、０．１M ジチオトレイトール、１０％デキストラン硫酸エステル、１mMエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１ＸDenhardt溶液（５０×＝１％ウシ血清アルブミン／１％フィコール／１％ポリビニルピロリドン）、０．１mg/ml ポリＡ（Boehringer）、０．５mg/ml 酵母ＲＮＡ（Sigma)、０．０５mg/ml ニシン精液ＤＮＡ（Promega)であった。プローブを、切片３０μl 当り２，０００〜３，０００Bcq の濃度で加えた（切片当り約１５fmolに相当）。カバースリップを取り外し、まず室温で２×標準生理食塩水クエン酸（ＳＳＣ）溶液（３M ＮａＣｌ／０．３M クエン酸ナトリウム）ですすぎ（５分間２回）後、切片を、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド中４２℃で１５分間４回洗浄し、次いで１×ＳＳＣ中、室温で３０分間２回洗浄した。すべての洗浄溶液に１mMジチオトレイトールを加えた。氷冷蒸留水ですすぎ、乾燥させたのち、１０〜２０日間、Hyperfilm βmax （Amersham）に暴露し、次いで１〜２か月間、写真乳剤（NTB2、Kodak)に暴露した。
【００５４】
組織調製物の解析。種々のｍＲＮＡの標識パターンの解析を、フィルムオートラジオグラム及びエマルジョンオートラジオグラムの両者で実施した。トルイジンブルーを用いて全胚の連続切片を対染色したのち、解剖学的構造の同定を実施した。脳における解剖学的面積及び末梢神経系（ＰＮＳ）構造の認識の定義は、The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（Paxinos and Watson, 1986）、The Atlas of Developing Rat Brain （Paxinos et al., 1991）、The Atlas of Mouse Development（Kaufman, 1992)及びThe Atlas of the Prenatal Mouse Brain(Schambra et al., 1992)を含む異なるアトラスを基に実施した。脳神経節の発達に関しては、Altman and Bayerの図版及び記載（１９８２）を参照した。いくつかの中枢及び末梢構造（例えば、脳神経運動核、自律運動節）の同定を確認するために、コリンアセチルトランスフェラーゼのin situ をいくつかの切片に対して実施した。
【００５５】
２人の実験者の主観的評価に基づき、１＋（低い強度）〜３＋（高い強度）のスコアを、解剖学的構造の標識に割り当てた。２０×冷プローブで置換したのちの、高い細胞充実性をもつ非神経性組織（肝及び筋など）若しくは高い細胞外マトリックスの密度を持つ非神経性組織（軟骨など）中の粒子の密度、又は神経構造上の標識の密度を、バックグラウンド標識と考慮した。細胞レベルでカウントする粒子が存在しないとき、慎重にスコアを評価しなければならない。例えば、発現する構造の標識強度の低下は、陰性細胞の増殖又はニューロンプロセスの形成によって生じる構造中の陽性細胞の分散によるものかもしれない。オリゴヌクレオチドは同じ長さを有し、同じプロトコルにしたがって標識したが、信号強度又は異なるトランスクリプトを比較することは試みなかった。別段指定しない限り、図に示す標識は、オリゴヌクレオチドNo．３１（α3)、４７（α4)、５１（α2)及び６２（α4)を使用して得たものである（オリゴヌクレオチド特性については表２及び表３を参照）。
【００５６】
特異性のコントロール。ｍＲＮＡごとに、配列の唯一部分（例えば、ｎＡＣｈＲサブユニットの場合、Ｍ３とＭ４との間の想像上の細胞質ループ）にある２〜４個のオリゴヌクレオチドを選択した。特異性の初期評価は、Genbank ／ＥＭＢＬ中の他の既知の配列との可能な相同性を探索することによって実施した。特異性の組織学的試験には、以下を考慮した。１．ｍＲＮＡごとに２個以上のオリゴヌクレオチドプローブが、同じパターンを示す（図１）。２．成体ラットの中枢構造の標識のパターンが、他の著者たちによって確認されたもの（Wada et al., 1989; Dineley-Miller and Patrick, 1992)と一致している。３．使用した大部分のオリゴヌクレオチドが、同様なＧＣ含量をもつ４５量体である（表２及び表３）とすると、各オリゴヌクレオチドプローブが他のプローブの特異性のコントロールを構成している。４．混合物への２０倍過剰の冷プローブの添加により、標識が完全に消滅した（図２）。
【００５７】
使用したオリゴヌクレオチドプローブは、規準２を満たすことができなかったα3 ｍＲＮＡに対する４個のプローブを除き、すべてがこれらの規準を満たすものであった。ｃＲＮＡプローブに基づく以前の研究は、成体ラットにおけるこのサブユニットｍＲＮＡの比較的広い分布を示し、顕著には、大脳皮質層IV、内鼻皮質層II、前側及び腹側視床核、内側及び側方顔面神経膝核、内側手綱、後側視床下部並びに乳頭土核、松果体、Ｖ及びVII 神経の運動核、青斑、疑核及び最後野において高いレベルを示した（Wada et al., 1989)。これらの観察結果の相違に関し、成体ラット中、内側手綱、松果体の中間部、最後野、Ｖ神経の運動核及び小脳においてのみ高レベルのα3 ｍＲＮＡ信号を検出することができ、いくつか視床核及び青斑においてはレベルは低かった。この矛盾の一部は、リボプローブに比べて低いオリゴヌクレオチドプローブの感度の低さに帰すことができる。しかし、特にプローブの加水分解を組織学的手法（Wada et al., 1989)で実施する場合に、ｃＲＮＡプローブの特異的コントロールを実施する難点を考慮すると、以前にα3 ｍＲＮＡに帰属していたいくらかの標識が、から他の（ｎＡＣｈＲ関連）ＲＮＡ配列に実際に誘導することが可能である。
【００５８】
オリゴヌクレオチド：β2 ：5'-TCG CAT GTG GTC CGC AAT GAA GCG TAC GCC ATC CAC TGC TTC CCG-3' ；α4 ：5'-CCT TCT CAA CCT CTG ATG TCT TCA AGT CAG GGA CCT CAA GGG GGG-3'; β4:5'-ACC AGG CTG ACT TCA AGA CCG GGA CGC TTC ATG AAG AGG AAG GTG-3' 。Ｂ：Clarke et al.による記載30にしたがって、 3Ｈ−ニコチン結合を実施した。１４μm の冠状切片を、５０mMトリス（pH７．４）／８mM ＣａＣｌ2 ／４nM 3Ｈ−Ｌニコチン中、室温で３０分間インキュベートした。Ｌ−ニコチンビタルトレートの存在下において非特異的結合を評価した。インキュベーションに続き、切片を氷冷ＰＢＳで２分間ずつ２回すすぎ、氷冷水ですばやくすすいだ。スライドをHyperfilm 3Ｈに６０日間暴露した。
【００５９】
図１１及び１２は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパッチクランプ記録である。図１１は、野生型マウス及びβ2 −／−マウスのＭＨｂ及び前側視床における細胞からの記録を表わす。アゴニストのオフレートは、ＭＨｂにおけるほうが前側視床におけるよりも有意に大きく、その結果、二つの構造の間で異なる応答速度をもたらしている。ＭＨｂのニコチンアゴニストは、β2 −／−動物中には維持されたが、β2 −／−マウスにおいては、前側視床のニコチンアゴニストに対する応答は完全に廃されている。図１２は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスの種々の核におけるニコチンアゴニストに対する応答を示す。
【００６０】
方法。氷冷ＡＣＳＦ媒体（１２５mM ＮａＣｌ／２６mM ＮａＨＣＯ3 ／２５mM グルコース／１．２５mM ＮａＨ2 ＰＯ4 ／２．５mM ＫＣｌ／２mM ＣａＣｌ2 ／１mM ＭｇＣｌ2 、pH７．３）中、Dosakaスライサーを使用して、８〜１２日齢のマウスの視床から冠状のスライスを得た。スライスをこの同じ媒体中に１〜８時間維持した。Zeiss 顕微鏡を通してスライス中の細胞を視覚化した。１５０mM ＣｓＣｌ／１０mM ＥＧＴＡ／１０mM ＨＥＰＥＳ／４mM 二ナトリウムＡＴＰ／４mM ＭｇＣｌ2 をＫＯＨでpH７．３に調節したものを含む２〜４MOhm硬質ガラスピペットを用いて全細胞記録を得た。スライスの上方に配した直径５０μM のピペットを介して、重力により、１５０mM ＮａＣｌ／１０mM ＨＥＰＥＳ／２．５mM ＫＣｌ／２mM ＣａＣｌ2 ／１mM ＭｇＣｌ2 を含む溶液を５〜１０秒のパルスで細胞に適用した。記録は、ＣＮＱＸ（５μM)及びＧＡＢＡアンタゴニストＳＲ−９５５３１（１０μM)の存在下において実施した。電流は、Axopatch ID （Axon Instrument)パッチ増幅器によって記録し、Compaqパーソナルコンンピューターでデジタル化し、PClampプログラム（Axon Instrument)によって更に解析した。
【００６１】
図１３及び１４は、受動忌避試験におけるβ2 −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。図１３は、訓練後に賦形剤又はニコチン（１０μ/kg)のいずれかを注射したのちの、保持試験における種々のレベルの足への衝撃に対する応答を示す。訓練試行中の平均ステップスルー潜時は、突然変異マウスの場合には１７．０±３．６秒であり、それらの非突然変異同胞種の場合には１５．０±３．５秒であった。図１４は、賦形剤又はニコチン（１０μg/kg）のいずれかを注射された野生型マウスとホモ接合体β2 突然変異マウスとの間の、２．００mAmpの強度の電流衝撃を足に印加した場合の保持潜時の差を示す棒グラフである。データは、以下の分類、すなわち、野生型＋賦形剤（ｎ＝２７）；野生型＋ニコチン（ｎ＝２３）；β2 −突然変異マウス＋賦形剤（ｎ＝１７）；β2 −突然変異マウス＋ニコチン（ｎ＝１７）の平均＋／−ＳＥＭとして表わす。統計的解析は、相違の混合因数解析を使用し、続いて単純効果の事後試験を行うことによって実施した。＃、ｐ＜０．０５、賦形剤注射後の野生型対突然変異マウス；＊、ｐ＜０．０１、野生型マウスにおけるニコチン対賦形剤。
【００６２】
方法。本文に記載のように、Nordberg及びBergh の方法20並びにFaiman et al. の方法20にしたがって、受動忌避試験を実施した。ニコチンを（ビタルトレート、Sigma)０新たにＰＢＳに溶解した。訓練試行中、同量の賦形剤又はニコチンのいずれかを腹腔内注射したのち、ただちに足に電気衝撃を印加した。
【００６３】
図１５は、β2 −サブユニット遺伝子及びプロモーターの全部又は一部を含むファージ及びプラスミドの図である。プラスミドの名称においては、数字が断片の大きさを表わし、文字が、それを生成するのに使用した制限部位を表わす。
【実施例】
【００６４】
以下の記載及び実施例は、本発明の実施態様及び範囲を例示するものである。本発明は、この記載の範囲に限定されるものではない。更にこの記載及び本明細書の付随する各節及び参考として包含されている資料は、クレームの全ての実施を可能にするものである。
【００６５】
以下の例及び実施態様は、当然のことながら、当該業界において公知の技術によって修正することができる。記載又は請求されている核酸配列の変動は、本発明者らが示した効果又は利点を変えることなく、公知の方法によって生み出すことができる。したがって、かかる変動は、当記載及び本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
材料と方法
ゲノムクローンの分離
全ラットｃＤＮＡ（カリフォルニア州サンディエゴのThe Salk InstituteのJ. Boulter博士及びS. Heinemann博士から提供された）を含むＰＣＸ４９プラスミド（Deneris et al., 1988）を、ＥｃｏＲＩで切断し、２．２kbまでの（〜２．２kb）断片を単離し、マウスＤＢＡ２ゲノムＤＮＡのＥＭＢＬ３バクテリオファージライブラリをスクリーニングするためのプローブとしてこれを使用した。最初のエキソンから１５kbまで（〜１５kb）上流のＤＮＡ及び５kbまで（〜５kb）下流のＤＮＡに広がる１つの独特のクローンを得た。図１は、イニシエーターＡＴＧから１．２kb上流のヌクレオチド配列を示す。
【００６７】
ハイブリダイゼーションの条件は、このプローブのための緊縮条件を決定するために、公知の技術29により修正することができる。β2 −サブユニット配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする充分に緊縮な条件を開発するために、温度（約４５℃〜約６５℃）及びＳＳＣ緩衝液濃度（約０．１×ＳＳＣ〜約６×ＳＳＣ）などのハイブリダイゼーション条件の変更、並びに洗浄条件の温度及びそのための緩衝液の変更を行うことが可能である。したがって、このハイブリダイゼーション手順に基づき、その他のライブラリから、その他の関連する配列を単離することができる。４５℃及び６×ＳＳＣなどのハイブリダイゼーション条件を使用することによって、ヒト配列が分離されよう。
【００６８】
１９９４年１２月１３日に、パスツール研究所国立微生物培養収集所（ＣＮＣＭ）（25, Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15,フランス）において、３件の寄託が行われた。ファージ、λβ2 ｎＡＣｈＲは、受入れ番号Ｉ−１５０３として寄託されている。このファージは、マウスのニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットのエキソン全てをコードする配列及びプロモーター配列を含む１５〜２０kbのゲノムＤＮＡを含んでいる。プラスミドを有する２つのE. coli 培養物も同様に寄託された。E. coli ＤＨ５α内のプラスミドｐＳＡ９は、受託番号Ｉ−１５０１が付与されており、β2 −サブユニットのエキソン１、２及び３についてコードする領域及び調節配列を含むマウスゲノムＤＮＡ９kbを含む。E. coli ＤＨ５α内のプラスミドｐＥＡ５は、受託番号Ｉ−１５０２が付与されており、Ｅｃｏ４７−III 部位の約１．２kb上流の領域及びβ2 −サブユニットのエキソン１〜５をコードする領域を含むマウスゲノムＤＮＡ５kbを含む。本発明者らは、ＥＭＢＬ、GenBank 及びＤＤＢＪヌクレオチド配列データベースに、受託番号Ｘ８２６５５として、ここに報告するヌクレオチド配列データを寄託するつもりである。
【００６９】
転写開始部位のマッピング
ｍＲＮＡのマッピングのために、我々は、Ｅ１３期又はＥ１５期のＤＢＡ２胚から抽出した全ＲＮＡの異なるバッチを使用した。ＤＮＡ汚染を避けるため、ＲＮＡ試料をまずＤＮアーゼＩで消化させた。
ＲＮアーゼ保護。Bluescript SK (Stratagene)中に、イントロン１の一部を含むＸｂａＩ／ＰｓｔＩ断片を挿入した。その後プラスミドを、Ｂｇ１IIで線形化させ、Ｔ７プロモーターを用いてＲＮＡプローブを合成した。その後、Ausbel et al. (1994)に記載されているように、保護実験を行った。
【００７０】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Frohman et al., 1988)
ｍＲＮＡを、８０℃で５分間、プライマー１０pmolを用いて、ハイブリダイズした。供給業者が推奨する緩衝液中、３７℃で４５分間、ＭＭＬＶ４００ｕ（Gibco)を用いてｃＤＮＡの合成を行った。フェノール／クロロホルム抽出の後、ｃＤＮＡをエタノール沈降させた。３７℃で３０分間、０．２M のカコジル酸カリウム；２５mMのトリス−ＨＣｌpH６．６；２５mg/ml のＢＳＡ；１．５mMのＣｏＣｌ2 ；５０nMのｄＡＴＰ及び５０ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Boehringer）中、ターミナルトランスフェラーゼ反応を行った。フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈降の後、Promega のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、ターミナルトランスフェラーゼ反応の１０分の１を増幅させた（９４℃；５５℃；７２℃で１分、３０サイクル）。増幅させた断片を次にアガロースゲル上に配置した。ゲルをブロッティングし、オリゴヌクレオチドｐ2 にハイブリダイズした。我々は、脳からのｍＲＮＡをマッピングするため、ｃＤＮＡ合成用のプライマとしてｐＥｘ２を、そしてＰＣＲのためにｐ０／ＢＥｐＴを用いた。トランスフェクションを行った細胞からｍＲＮＡをマッピングするには、ＯＬＵＣＩ３（ｃＤＮＡの合成）及びＯＬＵＣ１２／ＢＥｐＴ（ＰＣＲ）を用いた。
【００７１】
ＳＬＩＣ（Dumas Milnes Edwards et al., 1991)
４２℃で４５分間、５０mMのトリス−ＨＣｌpH８．３；８mMのＫＣｌ；１．６mMのＭｇＣｌ2 ；５mMのスペルミジン；０．５mMのｄＮＴＰ；１u/μl のＲＮａｓｉｎ；０．１mg/ml のＢＳＡ；７０mMのβ−メルカプトエタノール；８０ｕのＡＭＶ逆転写酵素（Promega)中、プライマーとしてｐＥｘ３（６pmol) を用いて、５μg の全ＲＮＡから、まずｃＤＮＡを合成した。その後、ＮａＯＨ中でＲＮＡを分解させた。次にｃＤＮＡの第１のストランドを、オリゴヌクレオチドＡ５’と連結させた。得られた一本鎖ｃＤＮＡを、次に、オリゴヌクレオチドＡ５’−１／ｐ０及びＡ５’−２／ｐ１での２回のＰＣＲ増幅に付した（９４℃で１分；６０℃で３０秒；７２℃で４５秒で３５サイクル）。
【００７２】
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりであった。
Ａ５’：5'-CTGCATCTATCTAATGCTCCTCTCGCTACCTGCTCACTCTGCGTGACATC
Ａ５’−１：5'-GATGTCACGCAGAGTGAGCAGGTAG
Ａ５’−２：5'-AGAGTGAGCAGGTAGCGAGAGGAG
ｐ０：5'-CCAAAGCTGAACAGCAGCGCCATAG
ｐ１：5'-AGCAGCGCCATAGAGTTGGAGCACC
ｐ２：5'-AGGCGGCTGCGCGGCTTCAGCACCACGGAC
ｐＥｘ２：5'-GCCGCTCCTCTGTGTCAGTACCCAAAACCC
ｐＥｘ３：5'-ACATTGGTGGTCATGATCTG
ＢＥｐＴ：5-GCGGGATCCGAATTC(T)21 A/C/G
ＯＬＵＣＩ３：5'-CGAAGTATTCCGCGTACGTGATG
ＯＬＵＣＩ２：5'-ACCAGGGCGTATCTCTTCATAGC
【００７３】
プラスミドの構築
ＫＳ−Ｌｕｓｉ：Bluescript ＫＳの対応する部位において、ｐＳＶＯＡＬプラスミドのＨｉｎｄIII ／ＫｐｎＩ制限断片（de Wet et al., 1987)をサブクローニングした。その後、ルシフェラーゼ遺伝子の最も５’のＥｃｏＲＩ／ＢｓｍＩ（４５bp）断片を（de Wet et al., 1987)にしたがって、欠失させ、ＳａｌＩ部位で置換した。ひき続き、ポリアデニル化部位を含むＳＶ４０の３４２bpのＰｖｕII／ＨｉｎｄIII 制限断片を、アダプタを用いて、ＥａｇＩ部位にサブクローニングした。
【００７４】
ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ：λβ2 ファージの１．２kbp のＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７II断片を、アダプタを用いて、ＫＳ−ＬｕｃｉのＥａｇＩ／ＳａII部位に挿入した。「分子生物学における現行のプロトコル」（Ausubil et al., 1994）におけるように、Ｂａｌ３．１エキソヌクレアーゼを用いて、プロモーターの５’末端欠失を得た。
【００７５】
Sculptorキット（Amersham）を用いて、突然変異を導入した。ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列中、突然変異を受けた配列は、この突然変異がＮＲＳＥ要素の活性を低下させることが示されたため（Morl et al., 1992)、ACCACGGACAではなく、＋２４ACCACTTACAであった。Ｅ−ボックス配列中では、突然変異を受けた配列はTCCACTTGではなく、−１２０TCCTCAGGであった。図７は、核タンパク質が、野生型配列に結合することができるが、突然変異を受けた配列には結合できないことを示している。
【００７６】
細胞のトランスフェクション
１％のグルタミン及び１％のストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、神経芽細胞種Ｎ１Ｅ１１５、ヒトＳＫ−Ｎ−Ｂｅ、ＨｅＬａ及び３Ｔ６線維芽細胞、２９３ヒト腎細胞及びＳＶＬＴ線条体細胞（Evrard et al., 1990)を成長させた。１％のグルタミン及び１％のストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ＋１０％のＨＳ＋５％のＦＣＳ中、ＰＣ１２細胞を成長させた。
【００７７】
６０mm2 プレート当り１０5 〜４×１０5 個の細胞の割合で、細胞を播種した。翌日、１５０mMのＮａＣｌ中、２．５μl のTransfectam(ＩＢＦ／Sepracor）と混合した１μg のＤＮＡを用いて、７５０μl のＤＭＥＭ＋２％ペニシリン／ストレプトマイシン中、５〜１２時間、細胞をトランスフェクションした。４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Qiagen又はWizard prep(Promega)キットを用いて、ＤＮＡを調製した。プラスミド活性を比較する際には、全てのプラスミドを同じ日に調製した。各々のプラスミドについて少なくとも２つの異なるＤＮＡ調製物を試験した。全てのトランスフェクションを、二重に実施し、少なくとも３回繰り返した。
【００７８】
トランスジェニックマウスの産生
ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ由来のルシフェラーゼ遺伝子を切除し、ｎｌｓＬａｃＺ遺伝子で置換した（Kalderon et al., 1984)。ＴＡＥアガロースゲルからβ2 −プロモーター／ｎｌｓＬａｃＺ断片を電気溶出し、次にエタノール沈降によって更に精製し、最後にトリス−ＨＣｌ１０mM pH７．５；ＥＤＴＡ０．１mM中で再懸濁させた。ＤＮＡ溶液（３ng/ml)を、Ｃ５７ＢＬ６×ＳＪＬハイブリッドの受精卵母細胞内に注入した。組織の染色を、Mercer et al., 1991 に記載されているとおりに行った。
図８の方法も参照のこと。
【００７９】
ゲルシフト検定
「分子生物学における現行のプロトコル」におけるように、α〔32Ｐ〕ＣＴＰ及びKlenow酵素又はγ〔32Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドを標識した。核抽出物を、記載のとおり（Bessis et al., 1993)、１０7 （〜１０7 ）個までの細胞から調製した。結合のためには、１nmolの標識されたオリゴヌクレオチドを、２０μl 中１０mMのＨｅｐｅｓ pH８、１０％のグリセロール、０．１mMのＥＤＴＡ、０．１M のＮａＣｌ、２mMのＤＴＴ、０．１mg/ml のＢＳＡ、４mMのＭｇＣｌ2 、４mMのスペルミジン、１mMのＰＭＳＦ、１μg のｐｏｌｙｄＩｄＣ中、０．５μg のタンパク質抽出物と混合した。氷上で１０分間反応物をインキュベートした。その後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を、７％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【００８０】
本実験に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の配列を伴う二本鎖のものであった（下線のあるヌクレオチドは、突然変異を受けたオリゴヌクレオチドと野生型オリゴヌクレオチドの間で変更されたものである）。
Ｅ−Ｄ：5'-TCCTCCCCTAGTAGTTCCACTTGTGTTCCCTAG
Ｍｕｔ−Ｅ：5'-CCTCCCCTAGTAGTTCCTCAGGTGTTCCCTAGA
Ｓ−Ｅ：5'-CTAGCTCCGGGGCGGAGACTCCTCCCCTAGTAGTTCCACTTGTGTTCCCTAG
【００８１】
結果
β2 −サブユニットをコードする遺伝子の５’フランキング配列の特徴づけ
β2 −サブユニットをコードする遺伝子を含むλファージをクローニングし、イニシエーターＡＴＧを取り囲む領域を配列決定した（図１）。転写開始部位を、まず最初にＲＮアーゼ保護によりマッピングした（図２のａ）。この方法により我々は、少なくとも３つの開始部位を検出することができた。しかしながら、これらの実験では、わずかな付加的開始部位は検出されなかった可能性がある。主要な保護バンドのサイズは、約１５０ヌクレオチドと見積られた。開始部位をより精確に確認し、位置設定するため、我々は、プライマー伸長生成物の増幅（図２のｂ）から成るＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅；Prohman et al., 1988) 及びＳＬＩＣ（ｃＤＮＡの一本鎖連結；Dumas Milnes Edwards et al., 1991)の両方を実施した。両方の技術により、我々が図１に記載した４つの開始部位に対応する同じ断片をサブクローニングし、配列決定することが可能であった。−１３の開始部位はきわめて稀であり、ＲＮアーゼマッピングにより検出されなかったのであろう。
【００８２】
フランキング領域（図１）の配列の分析により、いくつかのコンセンサスＤＮＡ結合要素が明らかになった：すなわち、Ｓｐ１部位（−１４６）、ｃＡＭＰ応答性要素結合（ＣＲＥＢ）部位（−２８７；Sassone-Corsi, 1998)、核受容体応答要素（−３４４〜−３５６：Parker, 1993）、ＧＡＴＡ−３部位（−１０７３；Ko and Engel, 1993) 、及び弱縮重オクタマー（八量体）モチーフ（−５２２）。更に、２回回転軸対称要素内に含まれているＥ−ボックス（−１１８）を認識することができた。近位領域（−２４５〜＋８２）は同様に、ある程度の調節上の意義をもちうる異常に高いＧＣ含有量（６７％）及び多数のジヌクレオチドＣｐＧを有している(Antequera and Bird, 1993)。最終的に、ＮＲＳＥ（神経制限性サイレンサー要素；Mori et al., 1992)又はＲＥ１（制限要素；Kraner et al,, 1992)配列と同一の２０bpの配列が、１．２kbp 断片の３’末端に発見された（＋１８〜＋３８）。
【００８３】
β2 −サブユニット遺伝子のフランキング配列の１．２kbp の断片がin vitroでのニューロン特異的発現を促進する。
ルシフェラーゼ遺伝子に融合されたβ2 −サブユニット５’フランキング領域の１１６３bpのＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７III 断片（−１１２５〜＋３８）を含む構築物を生成した(de Wet et al., 1987) （プラスミドＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ）。読み過しを避けるため、β2 −サブユニット配列から上流に、ＳＶ４０のポリアデニル化部位を挿入した。次に、褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞、神経芽腫セルラインＮＩＥ１１５及びＳＫ−Ｎ−Ｂｅ、ＳＶＬＴ、線条体セルライン(Evrard et al., 1990) 、ＮＩＨ３Ｔ６又はＨｅＬａ線維芽細胞及びヒト腎セルライン２９３の中への一時的トランスフェクションにより、プラスミドＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの転写活性を試験した。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、我々は、神経芽腫及びＰＣ１２細胞は、正常に、β2 −サブユニットｍＲＮＡを発現するが、線条体ＳＶＬＴセルライン又は３Ｔ６線維芽細胞はこれを発現しないことを確認した。図３は、ＰＣ１２細胞及び神経芽腫において、１．２kbp の断片が、その他のセルラインにおけるよりもレポーター遺伝子の転写を媒介する上で、２０〜１８０倍の活性を示すことを示している。線維芽細胞、２９３細胞及びＳＶＬＴ細胞においては、１．２kbp 断片の転写活性は、プロモーター無しのベクターのそれと比べて、著しく高いものではない（図３）。したがって、β2 −サブユニットプロモーターは、これらのセルラインでは活性ではない。これらのin vitroにおけるトランスフェクション実験は、１１６３bp断片が、内因性β2 −サブユニット遺伝子の発現パターンを模擬し、かくして細胞特異的プロモーターを含むことを証明している。
【００８４】
トランスジェニックマウスにおける１１６３bpプロモーター
In vivo で１１６３bpプロモーターを試験するために、ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７III 断片を、ｎｌｓ−β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子(Kalderon et al., 1984) から上流に連鎖させた。ＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルを、コーディング配列の下流に連結した。その後、得られた４．７kbの断片を、Ｆ１ハイブリッドマウス（Ｃ５７Ｂ１６×ＳＪＬ）からの受精卵の雄前核内にマイクロインジェクションした。子孫の尾から抽出したＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の有無について分析した。３つの独立したファウンダー（founder)を得、発現についてこれを分析した。
【００８５】
２つのライン（１３及び１６）が、ニューロン内で発現を有し、３番目のラインは、全く発現しなかった。これは、１１６３bpのプロモーターが、in vivo でのニューロン特異的発現を駆動するのに充分な調節要素を含んでいることを示している。末梢神経系ＰＮＳでは、両方のラインとも同じ構造にて発現した。これとは対照的に、ＣＮＳでは、ライン２６の標識パターンは、ライン１３のそれのサブセットである。ここではライン１３だけを詳細に記述する。予想されたとおり、大部分の末梢β2 −発現神経節が、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を発現し、一方ＣＮＳでは、β2 −陽性領域のサブセットのみが、β−ｇａｌを発現した。例えば、図４のｃは、腰仙脊髄のニューロンの大部分が、β2 −サブユニットのトランスクリプトを発現し、一方、前角及び背角内のニューロンのサブユニットのみが、β−ｇａｌ活性を呈することを示している。
【００８６】
導入遺伝子の発現は、Ｅ１０．５及びＥ１１胚の末梢神経節に検出することができた。Ｅ１３全胚（図４のａ）及び更に加齢した脳（Ｅ１７、ＰＯ及び成人期）の中で、標識を検査した。Ｅ１３において、標識は、ＰＮＳ内で顕著であった：すなわち、背根神経節（ＤＲＧ、図４及び５のｃ、ｄ；脳神経と関連したいくつかの神経節（三叉神経節、図５のａ参照、膝神経節、舌咽神経節及び迷走神経節）；交感神経鎖の神経節（図５のｃ、ｄ）；網膜の神経節細胞（図５のａ）及び心壁中の推定上の副交感神経節（図５のｂ）で、標識が強力に観察された。Ｅ１３では、脳幹及び前脳の両者において、いくつかの脳脊髄幹レベルでも、陽性細胞クラスターが存在していた。染色したニューロンのクラスターは、腹面及び側面脊髄にも観察された。
【００８７】
発達の更に後期（Ｅ１７）において、陽性ニューロンが、いくつかの基底終脳核中にクラスター化して発見されたが、一方尾状−果核の中では、分散した細胞が染色された。間脳レベルでは、不確帯及び網様視床核、並びに多数の視床下部核に、陽性クラスターが存在していた。脳幹内では、脳神経の大部分の運動核（迷走神経の背面運動核を除く）が、ある程度から高いものに至るまでの標識を示した。更に、Ｖ中脳核の分散した細胞は、橋核、前置舌下神経核及びいくつかの橋中脳被蓋内の分散した細胞と同様、高度に染色されたと思われた。
【００８８】
ライン１３内のＰＯでは、陽性細胞の分布は、既に、それ以前の年令におけるよりも更に制限されているように思われた（例えば、基底終脳及び動眼神経核内の標識は、明らかに減少していた）。成体動物のＣＮＳ内では、標識された細胞は、視床下部内でのみ検出された。ライン１３では、細胞のいくつかのクラスターが、胃腸管（胃及び十二指腸）の粘膜及び膵で染色された。ライン１３の性器結節及びいくつかの表在筋に、異所性標識が検出されたが、これらの組織のいずれも、ライン２６では染色されなかった。
【００８９】
最小細胞特異的プロモーターの認識
プロモーター活性に関与する調節要素をより詳しく調査するため、我々は、１１６３bpプロモーターの５’欠失を含む一連のプロモーターを生成した。これらのプラスミドは、線維芽細胞及びＳＫ−Ｎ−Ｂｅ細胞内への一時的トランスフェクションによって試験した。これら２つのセルラインは、最も容易にトランスフェクションされたセルラインであったために選ばれたものである。更に、神経芽腫のラインは、最初末梢構造から分離され(Biedler et al., 1978)、１１６３bpプロモーターによって支持された調節要素を研究するための便利な手段となっている。
【００９０】
１５７bpが、１１６３bpプロモーター（図１に示されているプラスミド１００６Ｅ−Ｌｕｃｉ）の５’末端から欠失された時点では、神経芽腫ではルシフェラーゼ活性は、著しく変化しなかったが、線維芽細胞では増大した（図６）。３０１bpを更に欠失させた場合、残りのプロモーターの活性は、線維芽細胞内で増大し続けたが、神経芽腫内では増大し続けなかった（プラスミド８６２Ｅ−Ｌｕｃｉ、図６を参照）。したがって、１５７及び３０１bpの欠失したプラスミドは、線維芽細胞内でのみ活性であるリプレッサー要素を有する。しかしながら、トランケートされた８６２bpプロモーターは、なおもニューロン特異的活性を呈し（図６、両方のセルライン中の８６２Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を比較のこと）、このことは、１．２kbp プロモーターが、付加的な調節要素を有していることを示している。更に、−８２４と−２４５の間には、リプレッサーが存在し得た（神経芽腫内の８６２Ｅ及び２８３Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を比較のこと）。この推定上の調節要素を更には分析しなかった。実際、２８３bpプロモーター（プラスミド２８３Ｅ−Ｌｕｃｉ）は、なおも線維芽細胞よりも神経芽腫で、〜１６０倍もの活性を示し、プロモーターのこの近位部分内にもう１つのニューロン特異的調節要素が存在することが確認されている。
【００９１】
近位の２８３bpプロモーターの５’末端から１５０bpを欠失させた場合、線維芽細胞と神経芽腫の両者において、転写活性が非常に低下しているのが検出された（プラスミド１３３Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を参照のこと）。このことは、すなわち、非常に重要な正の調節要素が欠失したことを示している。これらの正の及び負の要素については、更に、プロモーターの近位部分の欠失及び突然変異研究によって調査した。
【００９２】
近位領域内の負及び正の調節要素
β2 −サブユニットプロモーターの３’末端は、推定上のタンパク質要素結合部位を含む。β2 −サブユニット遺伝子調節におけるこれらの要素の役割を分析するため、我々は、これらの結合部位に突然変異を含むプラスミドを生成した。欠失実験を用いて、−９５と−２４５の間に、活性化物質を検出した（図３参照、２８３Ｅと１３３Ｅ−Ｌｕｃｉの間の差）。ｎｔ−１１８に位置するＥ−ボックスが優れた候補であったことから、我々は、転写活性に対するこの要素におけける突然変異の効果を分析した。表３は、野生型プロモーターのそれと比べた場合の突然変異を受けたプロモーターの転写活性が４０％低下していることを示している。非ニューロン組織中のＥ−ボックスの役割は、転写の基底レベルが、線維芽細胞中で、既に低いものであったために、更に評価が困難であった。
【００９３】
プロモーターの調節におけるＥ−ボックスの役割を更に理解するため、我々はこの配列と相互作用することのできるタンパク質複合体について調査した。プローブとして３３bp配列（ｎｔ−１３５〜−１０３、オリゴヌクレオチドＥ−Ｄ）を用いて、ゲルシフト測定を行った。神経芽腫又は線維芽細胞からの核抽出物を32−Ｐ標識オリゴヌクレオチドと混合したところ、３つの複合体が観察された（図７）。これは全て、過剰の標識オリゴヌクレオチドＥ−Ｄにより、完全に置換されていた。これとは対照的に、Ｅ−ボックス／２回回転軸内で競合的オリゴヌクレオチドを突然変異させたところ、いかなる競合も見られなかった（オリゴヌクレオチドＭｕｔ．Ｅ、図７のレーン「Ｍｕｔ．Ｅ」を参照のこと）。このことは、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、核タンパク質を結合することのできる−１３５／１０３配列内に含まれる唯一の要素であることを示している。この配列は、β−サブユニットプロモーターの活性に関与すると考えられる。
【００９４】
近位領域内には、ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列も存在しており、線維芽細胞内ではサイレンサーとして作用するが、ＰＣ１２細胞又は神経芽腫内では作用しないことが示されている(Kraner et al., 1992; Li et al., 1993; Mori et al., 1992) 。１１６９bpプロモーターの存在下でのこの配列の点突然変異により、線維芽細胞内では転写活性が１０５倍に上昇したが、神経芽腫内ではわずか３倍に上昇したにすぎなかった（表３）。したがって、この配列は、β2 −サブユニット遺伝子の細胞特異的発現の少なくとも一部分を司る。
【００９５】
トランスジェニックマウスにおける高親和性ニコチン受容体の除去により、忌避学習の変化が生じる
ｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットを、胚の（ＥＳ）細胞の中で分断し、このサブユニットが欠如しているマウスをひきつづき発生させた（図８）。β2 −／−マウスは生存可能で正常に交尾し、明らかな肉体的欠損を示さなかった。脳の全体的サイズ及び組織は正常であった（例えば、図９及び図１０を参照のこと）。抗−β2 モノクローナル２７０11（図８ｄ）を用いた全脳ホモジネートのウエスタンブロット分析及びポリクローナル抗−β2 抗体9 を用いた脳全体を通しての免疫細胞化学反応は、コントロールのマウスにおいて検出された免疫反応性がβ2 −／−マウスには見られず、β＋／−マウスでは低下していたことを証明した。β2 −アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたin situ のハイブリダイゼーションによって、β2 −／−マウス内でβ2 をコードするｍＲＮＡを検出することはできなかった。
【００９６】
α4 −及びβ2 −サブユニットの分布は、脳の中で大幅に重複し、これらのサブユニットは、組み合わさってＣＮＳ12内で優性なｎＡＣｈＲイソ型タンパク質を形成すると考えられる。卵母細胞発現実験6 に基づくと、α4 −サブユニットと機能的ヘテロ五量体を形成することもできることがこれまでに確認されたのは、β4 −だけである。β4 −サブユニットは、内側手綱（ＭＨｂ）及び脚間核（ＩＰＮ)10 内での発現を伴って、β2 ＋／−マウス又はβ2 −／−マウスの脳の中で正常に発現され、β2 −サブユニットを置換するためのアップレギュレーションは脳のどこにも見られなかった（図９）。又、突然変異マウスにおいて、α4 −（図９）、α5 −又はβ3 −サブユニットのｍＲＮＡの発現が著しく変わることもなかった。
【００９７】
平衡結合実験によると、ニコチンは、α4 −及びβ2 −サブユニット13-15 の分布と一致する分布をもつ高親和性部位（１０nM13,14 に近いＫＤ）の集団に結合することが示された。β2 ＋／＋、＋／−及び−／−マウスからの脳切片内の高親和性ｎＡＣｈＲを視覚化するため、定量的受容体オートラジオグラフィを行った（図１０）。
【００９８】
In situ でのニコチン結合は、β2 −／−の動物においては完全に破壊され、β2 ＋／−の動物では全ての脳部域内で約５０％低下し、この高親和性結合を媒介する上でのβ2 −サブユニットの関与を表わしている。
【００９９】
トランスジェニックマウスの電気生理学
きわめて高いレベルのβ2 （及びα4 ）サブユニットｍＲＮＡ（図９）を発現する前部視床のニューロンを、ニコチンに対する電気生理学的応答について研究した。スライス作成に容易に利用できるこの部域は、１μM のジヒドロ−β−エリスロイジンによって遮断された１５５＋／−７３pAの平均内部電流で、野生型動物において、１０μM のニコチンに対し一貫して応答した。応答のアゴニスト順位は、in vitro6 でのα4 ／β2 −含有ニコチン性受容体について見られるものと匹敵するものであった（ニコチン＞ＤＭＰＰ＞シチジン）（図１１）。前部視床ニューロンは、アゴニスト応答の完全な回復には、数分から１時間を必要とし、このことは、受容体応答が脱感作に陥りやすいことを示唆している。その上、再現可能な応答のためには、１μM という比較的高用量が必要とされ、これは、ニコチンがその高親和性部位に結合して活性化するのではないことを意味している。したがって、脱感作されたコンホーメーションにおいては、高親和性ニコチン結合部位は、ｎＡＣｈＲであろう。
【０１００】
β2 −／−マウスにおいては、ニコチンに対する前部視床ニューロンの応答は、試験したニューロンの１００％において完全に破壊された（図１２）。コントロールとして、α3 及びβ4 の両者ともが強く発現されているＭＨｂ内のニューロンも同様に試験した。ニコチンは、野生型マウスにおいて５０５＋／−１３２ｐＡの平均内側電流をひき起こし、この応答のアゴニスト潜在性は、α3 ／β4 含有受容体についての階級（ランク）順に従っていた（シチシン＝ニコチン＞ＤＭＰＰ）（図１１）。予想したとおり、ニコチンに対するＭＨｂ内の細胞の応答は、突然変異マウスにおいて維持された。
【０１０１】
β2 サブユニットは、野生型動物8-10の神経節内で発現されるが、心拍数又は基底体温には明らかな差異は全くなかった。高用量のニコチンに対して感受性を有し、かつｎＡＣｈＲ16のβ2 ／α4 イソ型タンパク質に対して選択的である薬物によって修正されない自発的歩行活動は、β2 −／−、β＋／１、及びβ＋／＋マウスにおいて著しく異なっていなかった。
【０１０２】
認識及び行動に関する結果
２つの手順を用いて、突然変異体及び野生型マウスにおいて、学習及び記憶を試験した。モリスの水迷路17,18 は、空間的指向性学習を評価する。この試験での突然変異体マウスの能力は、可視プラットフォームタスク又は隠ぺいプラットフォームタスクで試験した場合に、野生型マウスの能力と異なっていなかった（５日間の訓練後に到達した最小水泳時間：突然変異体（ｎ＝８）：７．４＋／−１．４秒：野生型（ｎ＝８）：８．２＋／−２．０秒）。移行試験では、両者の動物群とも、同じプラットフォーム横断数で、約３５％の時間をプラットフォーム四分円内で過ごした（突然変異体：４＋／−０．４；野生型：３．９＋／−０．６）。
【０１０３】
同じくニコチン投与に対するその薬理的感受性19,20 のため選択された、受動的忌避試験を用いて、阻害性忌避応答の保持を評価した。この試験は、マウスをシャトルボックスの充分に照明されたチャンバ内に入れるトレーニングトライアルからなり、隣接する暗いチャンバ内に入るまでの時間を測定した。暗いチャンバに入った時点で、穏やかな逃避不可能な衝撃を足に与え、賦形剤又はニコチン（１０μg/kg）をマウスに注射した。２４時間後に、暗いチャンバへ入るまでの時間を測定することによって、保持を評価した。明るいチャンバ内で過ごした時間（保持潜時）は、突然変異体及び野生型マウスの両者において、加えられた足部衝撃に比例して増大した。
【０１０４】
しかしながら、ニコチンによる処置は、野生型マウスにおいてのみ約８０秒だけ上向きに曲線を移動させることによって、保持を一貫して促進した（ｐ＜０．０１）（図１３）。ニコチン投与は、突然変異マウスでは全く効力が無かった。興味深いことに、保持潜時は、突然変異体マウスについての方が、その非突然変異体で賦形剤注入された同胞よりも有意に高いものであった（ｐ＜０．０５）（図１４）。
【０１０５】
痛覚閾値が低下したか又は情動性が増大した動物においては、受動的忌避試験での保持の増加が観察できる。したがって、この実験に関与した全てのマウスについて、挙動試験を更に行った。突然変異体マウスは、足部衝撃に対する尻込み、発声又は跳躍応答について、その非突然変異体同胞との相異を示さなかった。１５分間２コンパートメント式装置内での探査活動を測定することによって、情動性を試験した21,22 。暗いコンパートメント内で過ごした平均時間；暗いコンパートメント内での歩行活動及びコンパートメント間の移動は、突然変異体と野生型マウスの間で異なっていなかった。したがって、痛覚感受性の変化も情動性の変化も、受動的忌避試験において見られた保持潜時の差異を説明することができない。
【０１０６】
低用量のニコチン23又は特異的ニコチンアゴニスト16を用いた研究は、受動的忌避に対するニコチンの効果を、脳内の高親和性ｎＡＣｈＲが媒介することを、示唆している。したがって、β2 −／−マウスには高親和性結合部位が欠如していることから、ニコチンが、この試験についてのβ2 −／−マウスの能力を変えることはできない。しかしながら、野生型マウスに比べての突然変異マウスの能力の向上は、かなり驚くべきものである。β2 −サブユニット突然変異の逆説的効果についてはいくつかの説明を提案することができる。１つの仮説は、ニコチン注入が、脱感作ひいてはｎＡＣｈＲの不活化の結果として受動的忌避についての野生型マウスの能力を向上させ、試験に対する能力の向上が導かれる、というものである。
【０１０７】
したがって、受容体の欠如したマウスの挙動は、受容体が脱感作されたマウス24の挙動を模擬していると考えられる。もう一つの可能性は、ｎＡＣｈＲが少なくとも２つの経路に存在して、反応の効果と相互作用して、受動的忌避において測定された行動を起こさせるというものである。一つの経路がもう一つの経路に比べて、生理学的により活性であるならば、不活性経路は、野生型動物におけるニコチン注入により優先的に刺激され、一方より活性な経路は、β2 −遺伝子の不活化により優先的に影響されることになる。
【０１０８】
上述の実験は、β2 −サブユニットを含むｎＡＣｈＲが、特異的学習タスクという、受動的忌避に対するニコチンの効果を媒介することを証明している。これらのマウスは、ＣＮＳにおけるニコチンの薬理的効果を研究するためのモデルシステムを提供しており、ニコチン系の欠乏が関与する認知プロセス、ニコチン嗜癖、及び痴呆における高親和性ｎＡＣｈＲの役割を解明する上で有用である。
【０１０９】
参考文献
以下の各参考文献は、参考のため、本明細書に、特に記載する。
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【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、β2 −サブユニット遺伝子のイニシエーターＡＴＧをとり囲む領域のヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、β2 −サブユニットｍＲＮＡの５’末端のマッピングを示す。
【図３】図３は、in vitroでのβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現を示す。
【図４】図４は、トランスジェニックマウスにおけるβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現を示す。
【図５】図５は、トランスジェニックマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。
【図６】図６は、β−サブユニットプロモーターの５’末端欠失を含むルシフェラーゼ融合遺伝子の発現を示す。
【図７】図７は、ゲルシフト実験を示す。
【図８】図８は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットをコードする遺伝子の分断を示す。
【図９】図９は、in situ におけるハイブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。
【図１０】図１０は、in situ におけるハイブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。
【図１１】図１１は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパッチクランプ記録を示す。
【図１２】図１２は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパッチクランプ記録を示す。
【図１３】図１３は、受動忌避試験におけるβ2 −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。
【図１４】図１４は、受動忌避試験におけるβ2 −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。
【図１５】図１５は、β2 −サブユニット遺伝子及びプロモーターの全部又は一部を含むファージ及びプラスミドを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のβ2 −サブユニットのＤＮＡ及びクローンに関する。本発明は、また、β2 −サブユニットニューロンｎＡＣｈＲの調節配列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製されたトランスジェニック動物に関する。５’のフランキング配列は、プロモーターを含み、これが、ニューロンに特異的な発現をもたらす。ゲノムクローンにより、ニコチン系、及びニコチンに対する薬理学的応答におけるβ2 −サブユニット遺伝子の重要性が、証明されている。本発明は、また、ＤＮＡ配列を含むベクター、ベクターにより形質転換された細胞、本配列を有するトランスジェニック動物、及びこれらのトランスジェニック動物より誘導されるセルラインに関する。更にまた、本発明は、上述したもの全ての用途を記載するものである。
【０００２】
本明細書に引用する参考文献は、明細書の終わりに、著者及び発行年又は引用番号を記載する。
【背景技術】
【０００３】
ニューロン特異的発現
組換えＤＮＡに基づく多くの操作では、組織特異的な発現が、必要である。遺伝子導入療法における、望ましくない、又は潜在的に有害な副作用、及び操作は、適正な組織特異的発現を行うことによって、減少することができる。更に、一つのセルタイプ単独に対してある種のタンパク質の発現をコントロールすることができると、重要な治療又は解析の目的で、科学者が、これらの細胞をマッピング、認識又は精製する能力が、向上する。興味の対象である細胞が、ニューロン、又はニューロンの特定のサブセットである場合、ニューロン特異的又はサブセット特異的な発現をもたらすＤＮＡ配列が、必要となる。
【０００４】
有機体により発現されるタンパク質は、ニューロンにより、しばしば、特定の目的に利用される。これらのタンパク質の特定のサブユニット又は成分を、ニューロン組織中のみで発現させることによって、ニューロンは、その目的に応じて、タンパク質活性を、作り替える。特定の、ニューロン特異的なサブユニット、又は成分を、発見し、なぜこれらが、ニューロン組織においてのみ産生されるかを解明することによって、ニューロン特異的な発現をもたらすＤＮＡ成分への鍵が得られる。
【０００５】
アセチルコリン受容体の生物学に関する本発明者らの知識により、本発明のための重要な知見が得られた（Changeux, The New Biologist, Vol. 3, No. 5, pp. 413-429)。異なる型のアセチルコリン受容体が、異なる組織に確認されており、異なるアゴニストに応答する。その一種類であるニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、ニコチンに応答する。この型のサブグループは、ニューロンにおいてのみ確認されており、ニューロンｎＡＣｈＲと称される。
【０００６】
一般的には、５種類の型のサブユニットが、アセチルコリン受容体複合体を形成する。受容体中のサブユニットの型により、アゴニストに対する特異性が決定される。ある種の細胞群に対する特定のアセチルコリン受容体型の局在化をコントロールするのが、これらのサブユニットの発現パターンである。これらの特異的発現パターンの獲得に関与する遺伝的メカニズムにより、組織に特異的、又はより限定された細胞群に特異的な発現に対するコントロール能が得られる。本発明者らの研究は、プロモーター配列における規定された要素により、β2 −サブユニットのためのニューロン特異的な発現が得られることを示している。
【０００７】
ニコチンの薬理学的効果
上述したように、ｎＡＣｈＲは、アゴニストであるニコチンに応答する。ニコチンは、学習及び記憶を含む行動の多くの面に関与している（１，２）。ニコチンの薬理学的効果及び行動学的効果は、ニューロンｎＡＣｈＲと関係する。低用量のニコチン（２３）又はニコチン様アゴニスト（１６）を用いた研究では、脳における高親和性ｎＡＣｈＲが、受動的忌避行動に対するニコチンの効果に介在することが、示唆されている。従って、ニューロンｎＡＣｈＲが変化しているモデルシステムにより、ニコチンの薬理学的効果、認識の過程におけるニューロンｎＡＣｈＲの役割、ニコチン耽溺、及びニコチン系における欠損と関連する痴呆に関する有用な情報が、得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（α7 −サブユニットは、in vitro6,7 において、機能性ホモオリゴマーを生成することができるが）機能的ニューロンｎＡＣｈＲは、少なくとも一種類の型のα−サブユニット及び一種類の型のβ−サブユニットを含む五量体タンパク質複合体である（３〜５）。β2 −サブユニットは、本研究のために、７種類の公知のα−サブユニット及び３種の公知のβ−サブユニットから選択した（３）。脳において、広く発現されており（８〜１０）、脳のほとんどの領域では、その他のβ−サブユニットが、発現しないためである（１０）。したがって、このサブユニットの突然変異により、ＣＮＳニコチン系における有意な欠損が生じるはずである。本発明者らは、薬理学及び行動学におけるβ2 −サブユニットの関与に関して、検討を行った。トランスジェニックマウスにおいて、β2 −サブユニットを突然変異させるために、遺伝子ターゲッティングを用いた。
【０００９】
本発明者らは、ニコチンに対する高親和性結合部位が、β2 −サブユニット突然変異に対してホモ接合性である、つまりβ2 −／−であるマウスの脳には存在しないことを、発見した。更に、脳スライスの電気生理学的記録により、これらのマウス由来の視床ニューロンが、ニコチン投与に応答しないことが明らかになった。最後に、行動学的試験により、ニコチンは、連想学習の一手段である受動的忌避試験において、β2 −／−マウスの能力を、向上させないことが証明されている。逆説的に、突然変異マウスは、この試験において、非突然変異同胞種よりも、高い能力を示すことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の簡単な概要及びその有用性
本発明の特徴においては、我々は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットの調節及びコード領域を含むＤＮＡの１５kbの断片について記載する。我々は、β2 −サブユニット遺伝子のプロモーターを、in vitro及びトランスジェニックマウスにおいて特徴づけるものである。我々は、本遺伝子の正の調節に関与するＥ−ボックス及びその他の共通タンパク質結合配列を含む、数種類のＤＮＡ要素について、記載するものである。更に、我々は、β2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的な転写が、転写された配列に位置する一つを含む、少なくとも二つの負の調節要素を含むことを示すものである。
【００１１】
これらの特徴の好ましい実施態様は、特定のプロモーター配列、並びに各種細胞及び有機体におけるニューロン特異的発現のコントロールにおけるその用途に関する。１１６３bp配列及び８６２bp配列は、両者とも、ニューロン特異的発現をもたらす。その他の実施態様には、必須活性化要素を含む、図１の−２４５〜−９５の配列、及びリプレッサーを含む図１の−２４５〜−８２４の配列が含まれる。ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列からなるリプレッサー要素は、転写された領域にも存在する。これらのゲノム配列からなるある種のプラスミドについても、同様に記載する。
【００１２】
プロモーター配列は、ある種の規定された細胞におけるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現をコントロールする能力を有するため、重要である。例えば、以下に示すようなトランスジェニックマウスにおいては、トキシンなどをコードする配列は、ニューロンに対して作用し、疾患状態におけるこれらの細胞の崩壊をまねる。その他のものも、以下に記載するデータより、明らかであろう。
【００１３】
替わりに、プロモーターは、ある種のニューロンに対して、コードされた成長因子又は腫瘍発生性、腫瘍形成性若しくは不死化タンパク質をコントロールして、腫瘍発生をまねることができる。これらの細胞は、培養物中に単離及び増殖させることができる。別の用途においては、プロモーター配列は、in situ において特定のニューロンを認識、又は細胞選別技術により、ニューロンを単離するために、レポーター配列に有効に結合させることができる。単離、精製されたニューロンは、次に、in vitroにおける生化学的又は遺伝子学的解析に用いることができる。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼなどのレポーター配列については、以下に記載する。
【００１４】
本発明の別の特徴においては、本発明者らは、マウスのニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットのゲノムクローンを提供するものである。これらのクローンは、哺乳類のニコチン系及びニコチンの薬理学の解析において有用である。本発明者らは、β2 −サブユニットのゲノムクローンを、ニコチンの高親和性結合をはたきだすために用いたトランスジェニックマウスを用いた解析について、記載する。
【００１５】
記載した欠失突然変異体に加えて、β2 −サブユニットのエキソン又は調節配列に取り込まれた突然変異により、有用な突然変異トランスジェニック動物が得られるであろう。これらの突然変異は、点突然変異、欠失突然変異又は挿入突然変異であることができ、ｎＡＣｈＲの非有効な活性、又は非活性受容体を得ることができる。このような突然変異動物により、化合物の、ｎＡＣｈＲ活性若しくは機能を回復又は調節する能力を決定するための方法が、可能となり、このような方法を考案することができる。機能の調節は、受容体の数、活性若しくはその他の補償のメカニズムを、アップレギュレーティング又はダウンレギュレーティングすることによって、行うことができる。また、化合物が、記載する、又は公知（１７、２２、１８、２、１９、２１、２３、２４を参照）の行動学的解析における野生型の行動を回復又は調製する能力を決定するための方法は、突然変異動物を用いて、考案することができる。行動学的解析は、記憶、学習、不安症、運動活性及び注意力を、非処理動物又は患者と比較して、試験することからなるが、これに限定されるわけではない。したがって、ｎＡＣｈＲと関連した活性若しくは行動を回復又は調節する化合物を選択するための薬理学的解析（１２、１３、１４、１５、２０を参照）は、本発明により提供される突然変異動物により行うことができる。可能性のある治療薬の投与量及び量は、確立された技術により決定することができよう（例えば、参考文献１６を参照）。
【００１６】
トランスジェニック動物又はこれらの動物から誘導される細胞からなる現在のモデルシステムは、学習及び行動に対するニコチンの役割、ニコチンの薬理学、ニコチン耽溺、及びニコチン系における欠乏と関連する疾患の状態を解析するのに使用することができる。更に、ニコチン耽溺又はニコチン系における欠乏に対する潜在的な治療法を、トランスジェニック動物、又はこれらより誘導される細胞及びセルライン、又はファージβ2 （ＣＮＣＭ受託番号Ｉ−１５０３）のＤＮＡ断片若しくは完全なＤＮＡをトランスフェクションさせたいずれのセルラインによっても、試験することができる。これらのセルラインは、β2 −サブユニット配列を有する又はβ2 −サブユニット配列において突然変異を起こしたホモ接合又はヘテロ接合トランスジェニック動物から、直接得られる全てを含むものである。加えて、これは、天然型β2 −サブユニット配列又は突然変異β2 −サブユニット配列を用いた培養物中に形成されるセルラインを含むものである。ここで使用する技術は、例えば、PCT WO 90/11354 に引用されているそれらである。
【００１７】
高親和性ニコチン結合部位が減少しているアルツハイマー病などの痴呆症により、この欠乏の補償のための薬物をスクリーニングするために、本モデルを使用することができることが示唆される。したがって、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性を回復又は検出できる程度にもたらす能力について、化合物をスクリーニングする方法であって、本化合物を、適当なセルラインに付加する、又は本化合物を、トランスジェニック動物に導入することからなる方法を、考案することができる。本発明により得られるトランスジェニック動物及びセルラインは、これらの方法において、用いることができる。このような動物又はセルライン系は、β2 遺伝子の活性を回復又は調節することができる化合物を、選択するためにも使用することができる。
【００１８】
β2 −サブユニット遺伝子配列（野生型又はその突然変異体の断片）により得られたトランスジェニック動物は、二重トランスジェニック動物を発生させるために使用することができる。この目的のために、β2 −サブユニットトランスジェニック動物を、同一種のその他のトランスジェニック動物又は同一種の天然の突然変異動物と、交配させることができる。得られる二重トランスジェニック動物、又はそれより誘導される細胞を、親のβ2 −サブユニットトランスジェニック動物と同じ用途に使用することができる。
【００１９】
プロモーター配列及びゲノムクローンの両者は、調節タンパク質が存在するか又はしないかについて解析するために使用することができる。以下のゲルシフト法は、このような用途を、例示するものである。配列又はクローンは、放射性核種、蛍光化合物などのマーカー、又は架橋タンパク質若しくはアビジン−ビオチンなどの化合物を、取り込む又は結合させることによって、プローブとして使用することもできる。これらのプローブは、ニューロンの作用若しくはアセチルコリン受容体系に関与するタンパク質、核酸又はその他の化合物を認識或いは測定するために使用することができる。
【００２０】
有用なβ2 突然変異動物、セルライン又は配列を発生させるために、核酸配列を突然変異させる又は修飾するための公知の方法を、本発明と組み合わせて使用することができる。このような方法には、点突然変異、部位特異的突然変異誘発、欠失突然変異、挿入突然変異、相同的組換えより得られる突然変異、及びＤＮＡ若しくはＤＮＡを有する細胞の化学的又は放射線処理により得られる突然変異が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ＤＮＡ配列解析は、所望又は必要であれば、発生した突然変異を調べるために使用する。次に、突然変異動物、セルライン又は配列を、本発明者らが記載するＤＮＡ配列、システム、測定法、方法又は工程に使用する。突然変異を起こしたＤＮＡは、定義によりゲノムＤＮＡとは、異なる又は同一ではないであろう。突然変異動物は、また、ここに記載する配列を含む、又は本発明により使用可能となる第一のトランスジェニック動物を、第二の動物と交配することによって、作製する。第二の動物は、第一の動物に含まれるＤＮＡとは異なるＤＮＡを含むことができる。このような方法で、突然変異動物の各種ラインを作製することができる。
【００２１】
更にまた、ここに記載するＤＮＡ配列を、上述したように交配し、これらのＤＮＡ配列を、発現ベクターに結合させ、β2 −サブユニットタンパク質又はβ2 −サブユニット配列から誘導される突然変異体を発現させるために、組換えＤＮＡ技術が利用可能である。したがって、β2 −サブユニット又は突然変異体は、その生化学的又は行動学的活性について、解析することができる。このような方法で、有効なｎＡＣｈＲの発現を妨げる突然変異ＤＮＡ配列を、作製することができる。
【００２２】
代わりに、記載するプロモーター配列を、その他のタンパク質の発現を誘導するために、発現ベクター又はシステムにおいて使用することができる。得ることのできるＤＮＡ配列は、したがって、これらのＤＮＡ配列を転写、又はこれらのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを産生するために、本発明者らが記載するプロモーター又は調節配列に結合させることができる。
【００２３】
関連技術の記載
In situ におけるハイブリダイゼーション(Wada et al., 1989; Hill et al., 1993; Zoli et al., 1994) 及び免疫組織化学(Hill et al., 1993) による従来の研究により、これまでにクローニングされたニューロンｎＡＣｈＲサブユニットの全てが、厳密なニューロン特異的分布を示すことが証明されている。しかし、異なるサブユニットも、脳内のニューロンの小さなサブセットに対してのみ、同様に厳密な分布を示す。例えば、ｎＡＣｈＲα2 −サブユニットのトランスクリプトは、ニワトリの間脳のSpiriformis lateralis の核(Daubas et al., 1990) 又はラットの脚間核(Wada et al., 1988) においてのみ、検出される。また、β3 、β4 及びα3 −サブユニットトランスクリプトは、脊椎動物の脳における構造の小さいセットにおいてのみ検出される（Zoli et al., 1994 中の参考文献）。
【００２４】
ｎＡＣｈＲ、α4 、α5 、α6 及びβ2 −サブユニット遺伝子トランスクリプトは、比較すると、はるかに広い分布を示す（Wada eT al., 1989; Zoli et al., 1994中の参考文献）。例えば、β2 −サブユニットトランスクリプトは、ＣＮＳのニューロンの多く及び末梢ニューロンの全てに認められ、ｎＡＣｈＲを発現する(Role, 1992; Hill et al., 1993) 。
【００２５】
これらのサブユニットの発現の違いの結果、脊椎動物においては、ｎＡＣｈＲが、種により、非常に多様に存在する。それぞれの種は、ニューロンの多様なカテゴリー又はグループと関連する、定義された発現パターンを有する。例えば、内側手綱由来のニューロンは、脚間核由来のそれらと相互に結合し、それぞれが、異なる生理学的及び薬理学的特性を示す(Mulle et al., 1991)、異なるセットのｎＡＣｈＲサブユニットを発現する（参考のため、Role, 1992を参照）。
【００２６】
ニューロンにおけるｎＡＣｈＲ遺伝子転写の調節を説明する遺伝的メカニズムについては、これまで限られた情報しか得られていない。In vitroで解析を行ったニワトリα7 −サブユニット遺伝子のプロモーターに関するこれまでの研究では、転写調節を司るＤＮＡ要素を特徴づけることができなかった(Matter-Sadzinski et al., 1992) 。別の研究では、α2 −サブユニット遺伝子のプロモーターが、一部特徴づけられ、サイレンサーが、記載され、配列が決定されている（Bessis et al., 1993, Daubas et al., 1993も参照）。
【００２７】
ある種の証拠により、特にβ2 −サブユニットに関する研究が、詳細に行われている。脳のニューロンのほとんどにおいて、これは発現されている(Hill et al., 1993) 。また、β2 −トランスクリプトの出現のタイミングは、ニューロン分化のそれと、密接に平行している(Zoli et al, 1994)。従って、我々は、その転写を調節する遺伝メカニズムについて研究することを決定した。
【００２８】
本発明の簡単な記載
遺伝子構造
我々は、マウスのｎＡＣｈＲβ2 −サブユニット遺伝子の調節配列及びそれをコードする配列を含む遺伝子断片を、クローニングした。本発明者らは、調節領域の少なくとも一部が、異なる哺乳類の種においても、保存されていることを発見した。特に、ＮＲＳＥ／ＲＥ１に対応する＋１６〜＋３８bpの領域を、図１に記載する。プライマー伸長生成物のＲＮアーゼによる保護及び増幅を用いて、我々は、１カ所の大きな、そして３カ所の小さい転写開始部位を発見した（図１）。プライマーの伸長実験は、異なる２種類の逆転写酵素を用い、異なるバッチのｍＲＮＡ及び異なるプライマーにより行った。これらのＰＣＲに基づく技術により、我々は、逆転写酵素の停止部位ではなく、転写開始部位に対応する同一の断片を増幅及びサブクローニングすることができた。我々が特徴づけた転写開始部位は、最長のラット(Deneris et al., 1988)及びヒト(Anand and Lindstrom, 1990) β2 ｃＤＮＡ５’末端の位置から下流に位置する（図１を参照）。これは、ヒト及びラットでは、別の転写開始部位が、使用されていることを意味する。種間におけるこのような不一致は、筋ｎＡＣｈＲ（Duerr et al., 1994, Dong et al., 1993; Toussaint et al., 1994 も参照）のεサブユニットについては、既に証明されている。α2 −サブユニット遺伝子(Bessis et al., 1993) とは反対に、上流にエキソンは、検出することができなかった。
【００２９】
１．２kbp のフランキング領域の構造に関する解析によって、Ｓｐ１部位及びＥ−ボックスを含む核タンパク質結合のための多くの共通モチーフが示された。１．２kbの非欠失プロモーターの約９０bpが、転写され、この領域は、ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列を含む(Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992)。ポリオーマウイルス(Bourachot et al., 1989)又はｆｏｓ遺伝子(Lamb et al., 1990) などの異なる系における転写開始部位の下流に、調節要素が存在することは、既に記載されている。
【００３０】
プロモーター領域は、エキソン１に位置するＥｃｏ４７III （図１を参照）と、４．５kb上流のＢａｍＨＩ部位の間に位置する。一つの好ましい実施態様は、図１に記載した、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７III 部位の間の１１６３bpの配列である。調節配列は、Ｅｃｏ４７III 部位から２kb下流に位置するかもしれない。ｎＡＣｈＲβ2 −サブユニット配列由来の調節要素は、これらに結合した、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列のニューロン特異的発現をコントロールするために使用することができる。該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、トキシン、栄養因子、ニューロペプチド、腫瘍形成性、腫瘍発生性若しくは不死化タンパク質、又はニューロンの機能を変更することのできるその他のあらゆるタンパク質であることができる。
【００３１】
１１６３bpのプロモーターは、細胞特異的転写を達成する
１１６３bpのプロモーターは、β2 −サブユニット遺伝子の組織特異的及び一時的に特異的である転写の両者のための調節配列を含有する。一時的トランスフェクションの実験により、１１６３bpの断片は、ｎＡＣｈＲβ2 −サブユニット遺伝子の細胞特異的発現をもたらすための十分な情報を含むことが示された。我々は、同一のプロモーターが、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポーター遺伝子の厳密な細胞特異的転写をコントロールすることを示した。更に、導入遺伝子構成物は、胎児神経系の初期の発達の間、内因性β2 −サブユニット遺伝子と同一のタイミングで、活性化されると考えられる（Zoli et al., 1994)。発達の後期の段階では、末梢β2 発現ニューロンの多くは、まだ標識されている（図４Ｃ、Ｄ）。
【００３２】
トランスジェニックマウスにおいて、β2 −サブユニットプロモーターのコントロール下、β−ｇａｌを発現する２種類のライン（１３及び２６）を発生させることによって、プロモーター配列を試験した。ＣＮＳにおいては、βガラクトシダーゼ発現のパターンは、２種類のラインの間で異なっていた。正常にβ2 を発現する細胞のサブセットのみが、導入遺伝子を発現する。導入遺伝子及び内因性遺伝子の発現におけるこの種の不一致は、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ遺伝子プロモーター(Mercer et al., 1991; Hoyle et al., 1994) 又はＧＡＰ−４３遺伝子(Vanselow et al., 1994) については、既に記載されている。性器結節及び皮膚筋における導入遺伝子のライン１３においては、予想外の発現が観察された。これらの組織は、ライン２６においては、染色されないため、この発現は、導入遺伝子の組込み部位に由来すると考えられる。我々の知る限りでは、遺伝子導入により研究されたニューロンプロモーターの多くは、小さい割合の導入遺伝子ラインにおいて、異所性発現を示す(Forss-Petter et al., 1990; Kaneda et al., 1991; Banerjee et al., 1992; Hoesche et al., 1993; Logan et al., 1993, Vanselow et al., 1994)。しかし、当業界の技術では、導入遺伝子の発現パターンが、本来の遺伝子のそれを、厳密に反映又は重複しているラインの構成が可能である。詳細については、遺伝子導入操作の結果を示す参考文献を参照。
【００３３】
β−ｇａｌ陽性細胞の分布を、その他の公知のニューロンマーカーのそれと比較することによって、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ＴｒｋＡ（高親和性神経成長因子受容体）及びｐ75（低親和性神経成長要素受容体）発現細胞の分布には、類似性があることが明らかになっている(Yan and Johnson, 1988: Pioro and Cuello, 1990a, b; Ringstedt et al., 1993) 。詳細には、発達中のラットでは、ｐ75が、ほぼ全部の神経節及び中心核において発現されており（不確帯及び視床下部核以外）、これは、導入遺伝子を発現したものである(Yan and Johnson, 1988) 。ｐ75の発現は、（β2 −プロモーター導入遺伝子の発現と同様）多くの末梢神経節及び脳核においては、一時的であり、周産期又は生後早い年齢で、検出不可能なレベルに低下することも、興味深い。したがって、β2 −サブユニットプロモーターは、ｐ75の活性化によりコントロールされる要素を含み、又はβ2 導入遺伝子及びｐ75遺伝子の両者が、共通の調節要素によりコントロールされている可能性がある。
【００３４】
結論として、本プロモーターでは、脳で活性であるある種の調節要素が欠落するが、存在する調節要素が、ＰＮＳ、脊髄及び幾つかの脳構造における、細胞及び発達に特異的なβ−ガラクトシダーゼの発現を可能とするのに十分である。このプロモーターは、また、ニューロン組織における調節タンパク質を認識するための測定法に使用することもできる。
【００３５】
ＤＮＡ調節要素
β2 −サブユニット遺伝子の転写に関与するＤＮＡ要素を更に特徴づけするため、我々は、１１６３bpプロモーターを欠失又は突然変異させ、結果として得られた構成物を一時的トランスフェクションにより解析した。遠位５’末端領域内に存在するリプレッサー要素は、線維芽細胞内では活性であるが、神経芽腫内では活性でない。したがって、この要素によって少なくとも部分的に、β2 −サブユニット遺伝子のニューロン特異的発現が説明される。プロモーターを更に解析すると、５８９bpを欠失させた場合に、神経芽腫内では活性が増大するが線維芽細胞内では増大しないということが示される（図６、８６２Ｅと２８３Ｅ−Ｌｕｃｉを比較すること）。
【００３６】
ＮＲＳＥ／ＲＥ１要素は、プロモーターの３’末端に位置する。この要素は既に、ニューロン細胞内でプロモーターの活性を制限することが示されている（Kraner et al., 1992; Mori et al., 1992; Li et al., 1993)。β2 −サブユニット遺伝子の１１６３bpのプロモーターにおいては、この配列の点突然変異が、線維芽細胞中の転写活性を１００倍（〜１００fold）増大させ、このことが、この配列が、β2 −サブユニット遺伝子のニューロン特異的発現に関与していることを、意味している。その上、配列を比較すると、この配列が、ラット及びヒトβ2 −サブユニットｃＤＮＡ内（Deneris et al., 1988; Anand and Lindstrom, 1990)並びに中重量ニューロフィラメント遺伝子、ＣＡＭ−Ｌ１遺伝子、カルビンジン遺伝子又は小脳Ｃａ結合タンパク質遺伝子（以下に示す表２を参照）などの神経系内で発現される遺伝子のいくつかのプロモーターの中で、高度に保存されていることが示される。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２：１１６３bpプロモーターの近位領域内の正及び負の調節要素
その他のニューロンプロモーターとの、β−サブユニットプロモーターの近位サイレンサーのアラインメント。配列は(Maue et al., 1990; Ｎａチャンネル、受託番号Ｍ３１４３３）、(Mori et al., 1990; ＳＣＧ１０、Ｍ９０４８９）、(Sauerwald et al., 1990; Synapsin Ｉ、Ｍ５５３０１）、(Kohl et al., 1992; ＣＡＭＬ１遺伝子、Ｘ６３５０９）、(Gill and Christakos, 1993; カルビンジン遺伝子、Ｌ１１８９１）、(Zopf et al., 1990; ニューロフィラメント遺伝子、Ｘ１７１０２、逆配向）から取られたものである。番号付けは Gen Bank/ＥＭＢＬライブラリ内の配列を意味する。
【００３９】
図６に記載した欠失実験は、ヌクレオチド−２４５と−９５の間に必須活性化部位が存在することを示している。この領域内でＳｐ１結合部位及びＥ−ボックスを検出することができた。Ｓｐ１部位は、汎存要素であり、一方Ｅ−ボックスは、筋肉内（ｎＡＣｈＲα1 −サブユニットについてはBessereau et al., 1994を参照）並びにニューロン内（Guillemot et al., 1993）でのいくつかの遺伝子調節メカニズムに関与してきた。２回回転軸要素も同様に、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（Yoon and Chikaraishi, 1994）、ＳＣＧ１０遺伝子（Mori et al., 1990)、ＧＡＰ４３遺伝子（Nedivi et al., 1992)のそれらなどのいくつかのニューロンプロモーター内、又はＮ−ＣＡＭ遺伝子のフランキング領域内（Chen et al., 1990)でも報告されている。以下に示す表３に示されている結果は、神経芽腫において、Ｅ−ボックス／２回回転軸内で突然変異を受けた１１６３bpのプロモーターが野生型プロモーターに比べて著しく活性が低いことを証明している。その上、ゲルシフト測定（図７）は、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、特異的複合体を結合させることができることを更に証明している。これは、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、β2 −サブユニット遺伝子の転写の活性化の少なくとも一部分を司ることを示唆している。しかし、非相同プロモーターのトランス作用実験は、Ｅ−ボックスが２７bp上流にあるＳｐ１部位と協力して、転写を正に活性化させることを示唆している。Ｅ−ボックスとＳＰ１結合部位の間のこの種の協力は、既に、筋肉ｎＡＣｈＲα1 −サブユニット転写の調節についても証明されている（Bessereau et al., 1993）。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３：１１６３bpプロモーターの近位領域内の正及び負の調節要素
１１６３bpプロモーターの近位部分内の突然変異の効果。野生型又は突然変異を受けたプロモーターの活性は、プロモーター無しのＫＳ−Ｌｕｃｉプラスミドのルシフェラーゼ活性に合わせて正常化している。ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの活性は、図３からのものである。
【００４２】
結論として、我々は、β2 −サブユニット遺伝子が、負の作用をする要素とＥ−ボックスを含む１つの正の要素により基本的に調節されることを示してきた。この二重調節は、いくつかのニューロン遺伝子に共有される一般的特長であると思われ（Mandel and Mckinnon, 1993)、ニューロン遺伝子の転写の微調節を可能にしている。その上、我々の遺伝子導入に関する研究は、１１６３bpのプロモーターが緊密なニューロン特異的発現をもたらすものの、いくつかの発達要素又はＣＮＳ特異的調節要素が欠如していることを示している。
【００４３】
図１
β2 −サブユニット遺伝子のイニシエーターＡＴＧをとり囲む領域のヌクレオチド配列
４つの垂直な矢印の頭は、転写開始部位に対応する、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ及びＳＬＩＣを用いて発見された４つの末端を示す。垂直な矢印は、最長のラット（ｒ）及びヒト（ｈ）のβ2 −サブユニットｃＤＮＡクローンの５’末端に対応する位置を表わしている(Deneris et al., 1988)。図３に記載する実験に使用した欠失の終点は、配列の上に示す。イントロン内に位置するヌクレオチドは、小文字でタイプしている。
【００４４】
図２
β2 −サブユニットｍＲＮＡの５’末端のマッピング
ａ．ＲＮアーゼ保護実験。イントロン１の１５８ヌクレオチド及び上流の配列の７８９ヌクレオチド（−６３４／＋１５５）を含む32Ｐで標識されたＲＮＡプローブに対して、ＤＢＡ２マウスの脳（それぞれレーン２及び３、５及び１５μg ）及び酵母ｔＲＮＡ（レーン１、１５μg)由来の総ＲＮＡをハイブリダイズした。保護されたバンドのサイズを、ＤＮＡと比較してのＲＮＡのアクリルアミドの低移動度に応じて(Ausubel et al., 1994)、及び万能プライマーでプライミングされたＭ１３ｍｐ１８の配列との比較により評価した。ゲルの左側部分の矢印は、主要な保護バンドを指している。
ｂ．ＳＬＩＣを用いた転写開始部位の認定。図の下部は、ＳＬＩＣ又はＲＡＣＥ−ＰＣＲのために使用するオリゴヌクレオチドを記載し、その方針を示している。ＳＬＩＣ実験においては、プライマーの伸長を、オリゴヌクレオチドｐＥｘ３を用いて行った。ｃＤＮＡの最初のストランドを、その後オリゴヌクレオチドＡ５’に連結させ、結果として得られた断片を、まずオリゴヌクレオチドＡ５’−１／ｐ0 を用い次にＡ’−２／ｐ１を用いて増幅させた。その後、増幅させた断片を、１．２％のアガロースゲル上に配置した。ゲルをブロッティングし、オリゴヌクレオチドｐ２に対しハイブリダイズした。レーン１：全ＤＢＡ２マウス脳ＲＮＡ５μg 、レーン２−３：それぞれ逆転写酵素及びＲＮＡを用いないコントロール。マイナス：Ｔ４ＲＮＡポリメラーゼを省略した。ＲＡＣＥ−ＰＣＲを用いて、同じ結果を得た。
【００４５】
図３
In vitroでのβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現
プロモーター無しのプラスミド（「材料と方法」の中で記述するＫＳ−Ｌｕｃｉ）の活性に合わせて、プラスミドのルシフェラーゼ活性を正常化した。ルシフェラーゼオリゴヌクレオチド（「材料と方法」の中で記述する）を用いた、ＥＥ１，２−Ｌｕｃｉによりトランスフェクションを行ったＳＫ−Ｎ−Ｂｅから抽出したｍＲＮＡについてのＲＡＣＥ−ＰＣＲは、増幅された断片が、適正な転写開始部位について予想されたサイズを有することを示した。
【００４６】
図４
トランスジェニックマウスにおけるβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現
ａ．Ｅ１３胚の全マウント着色。矢印の頭は皮膚筋における異所的発現を指している。
ｂ．腰仙レベルでのＥ１３胚の側矢状断面内でのβ−ガラクトシダーゼ活性の検出。矢印の頭は、脊髄の前角及び背角内での標識を示す。
ｃ．同じ胚の隣接する断面内でのβ2 −サブユニットのトランスクリプトの検出。ｄｒ：背根神経節；ｔ：蓋；ｏｇ：交感神経節鎖；ｔｒ：三叉神経節。
【００４７】
図５
トランスジェニックマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現
ａ．網膜（ｒｅ）及び三叉神経節（ｔｒ）（Ｅ１４．５）の染色。
ｂ．心副交感神経節ニューロン（ｐｇ）（Ｅ１４．５）の染色。
ｃ．脊髄（ｐｌ）の横断面、ｄｒ：背根神経節、ｏｇ：交感神経節
ｄ．脊髄（ｐｌ）の腹側図。小さい方の矢印は、認識されなかったニューロンを表わす。
【００４８】
図６
β−サブユニットプロモーターの５’末端欠失を含むルシフェラーゼ融合遺伝子の発現
プラスミドは、ｎｎｎＥ−Ｌｕｃｉと呼ばれ、ここで、ｎｎｎは、挿入ヌクレオチドのサイズであり、Ｅは、５’末端制限部位（Ｅｃｏ４７III)である。矢印は、転写開始部位を表わす。ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの活性は、図３からのものである。
【００４９】
図７
ゲルシフト実験
移動度シフト実験のオートラジオグラム。使用したプローブは、32Ｐで標識した二本鎖Ｅ−Ｄオリゴヌクレオチドであった。このオリゴヌクレオチドは、Ｅ−ボックス／２回回転軸要素のみを有しており、一方オリゴヌクレオチドＳ−Ｅは、Ｓｐ１結合部位並びにＥ−ボックス／２回回転軸要素を有している。競合性オリゴヌクレオチドを、１００倍モル過剰においてのみ使用したＳ−Ｅを除き、１０倍及び１００倍のモル過剰で使用した。
【００５０】
図８は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットをコードする遺伝子の分断を示す。ａ−ｉは、マウスβ2 −サブユニット遺伝子の通常のゲノム構造である。組換え事象によって除去されたエキソンの部分は、淡い灰色で示している。ＡＴＧ：イニシエーターメチオニン。囲いは、エキソンＩ〜IVを表わす。ａ−ｉｉは、内因性β2 −サブユニット遺伝子を分断するのに使用した標的置換ベクターである。イニシエーターメチオニン及び第一のエキソンの残りが、ＮＬＳ−ｌａｃＺのコード領域及びＭＣｌneoR発現カセット25によって置き換えられている。この構成物は、ＰＣ１２細胞（図示せず）の安定なトランスフェクションの後、ｌａｃＺの発現をコントロールすることができたが、ｌａｃＺ ＤＮＡにおける明らかな組換えの欠如にもかかわらず、組換え動物中に、ｌａｃＺの発現は検出されなかった。ジフテリアトキシン−Ａ遺伝子（ＤＴＡ）26を使用して、無作為的な組込みに対して選択を実施した。ａ−ｉｉｉは、突然変異β2 −遺伝子の構造である。制限部位：Ｈ、ＨｉｎｄIII ；Ｒ、ＥｃｏＲＩ；Ｅ、Ｅｃｏ４７III ；Ｐ、ＰｓｔＩ。黒の矢印は、胚ステム（ＥＳ）細胞中の組換え事象を検出するために使用したプライマーを示す。灰色の矢印は、野生型又は突然変異β2 遺伝子を検出するために使用したプライマーを示す。ｂは、＋／＋マウス、＋／−マウス及び−／−マウスから得た末端ＤＮＡのＰＣＲ解析図である。ｃは、パネルｂで解析したものと同じマウスから得た、ＨｉｎｄIII で制限した末端ＤＮＡのサザーンブロッティング解析図である。ｄは、β2 −サブユニットに対して作製したモノクローナル抗体を用いた、全脳タンパク質のウエスタンブロッティング解析図である。
【００５１】
方法。ａ：多クローニング部位（ＭＣＳ）をＭＣｌネオカセットに挿入することにより、β2 −標的ベクターを構成した(GTC GAC GGT ACC GCC CGG GCA GGC CTG CTA GCT TAA TTA AGC GGC CGC CTC GAG GGG CCC ATG CAT GGA TCC) 。ＡＴＧに対する４．１kbのＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ４７III β2 −ゲノム断片５’及びβ2 −遺伝子の最初のイントロン内で開始する１．５kbのＰｓｔＩ β2 −ゲノム断片をＭＣＳ中にクローニングした。前記のエレクトロポレーション25により、ＨＭｌ27,28 胚ステム細胞（５×１０7 個）を、線形化した標的ベクターでトランスフェクションした。生存する２４個のＧ４１８耐性クローンをＰＣＲによって選別した（β2 −プライマー GCC CAG ACA TAG GTC ACA TGA TGG T;ネオプライマー GTT TAT TGC AGC TTA TAA TGG TTA CA）。４個が陽性であり、これらを、後にサザーンブロッティング解析によって確認した。クローンを、non-agoutiＣ５７ＢＬ／６マウスから得た３．５日齢の胚盤胞に注入し、受容性のメスに播種した。得られたオスのキメラマウスを、Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２のnon-agoutiメスと交配した。１５匹のキメラのうち、１匹が生殖系列伝達を示した。β2 ＋／−ヘテロ接合体を交配し、子孫をＰＣＲ解析によって評価した（パネルｂ）。ｂ：ＰＣＲは、９４°／１分、６５°／２分及び７２°／１分の３５サイクルであった。ｃ：前記29のようにサザーンブロッティングを実施した。標的構成に使用した１．５kbのＰｓｔＩゲノム断片を無作為的なプライミングによって標識した。ｄ：前記29のように、モノクローナル抗体２７０11を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。
【００５２】
図９及び図１０は、in situ におけるハイブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。図９は、ｎＡＣｈＲのβ2 −、α4 −及びβ4 −サブユニットをコードするｃＤＮＡの配列に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを用いて、β2 ＋／＋、＋／−及び−／−マウスの脳から得た連続切片におけるそれぞれのｍＲＮＡを検出したin situ におけるハイブリダイゼーションである。視床中間区分が示されている。白の矢印は、β4 −アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標識されたＭＨｂを示す。図１０は、野生型、ヘテロ接合体及びβ2 −突然変異体のマウスの脳における高親和性結合部位を表わす、トリチウム化ニコチンを用いた受容体オートラジオグラフィーである。線条、視床及び蓋のレベルを表わす切片が示されている。
【００５３】
方法。in situ におけるハイブリダイゼーションを次のように実施した。In situ におけるハイブリダイゼーション手順。凍結した組織をクリオスタットで切断し（厚さ１４μm の切片）、ポリ−１−リシン被覆スライドに解凍しながらマウントし、−８０℃で１〜３日間貯蔵した。この処置は、Young らの方法（１９８６）にしたがって実施した。すばやく４％パラホルムアルデヒドを用いて、切片を室温で５分間固定化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したのち、エタノール及びクロロホルム中でアセチル化し、脂質を除去した（５分）。これらを、パラフィルムカバースリップの下、３７℃で２〜４時間プレハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション混合物の組成は、０．０２M トリスＨＣｌ（pH７．５）中、５０％ホルムアミド、０．６M ＮａＣｌ、０．１M ジチオトレイトール、１０％デキストラン硫酸エステル、１mMエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１ＸDenhardt溶液（５０×＝１％ウシ血清アルブミン／１％フィコール／１％ポリビニルピロリドン）、０．１mg/ml ポリＡ（Boehringer）、０．５mg/ml 酵母ＲＮＡ（Sigma)、０．０５mg/ml ニシン精液ＤＮＡ（Promega)であった。プローブを、切片３０μl 当り２，０００〜３，０００Bcq の濃度で加えた（切片当り約１５fmolに相当）。カバースリップを取り外し、まず室温で２×標準生理食塩水クエン酸（ＳＳＣ）溶液（３M ＮａＣｌ／０．３M クエン酸ナトリウム）ですすぎ（５分間２回）後、切片を、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド中４２℃で１５分間４回洗浄し、次いで１×ＳＳＣ中、室温で３０分間２回洗浄した。すべての洗浄溶液に１mMジチオトレイトールを加えた。氷冷蒸留水ですすぎ、乾燥させたのち、１０〜２０日間、Hyperfilm βmax （Amersham）に暴露し、次いで１〜２か月間、写真乳剤（NTB2、Kodak)に暴露した。
【００５４】
組織調製物の解析。種々のｍＲＮＡの標識パターンの解析を、フィルムオートラジオグラム及びエマルジョンオートラジオグラムの両者で実施した。トルイジンブルーを用いて全胚の連続切片を対染色したのち、解剖学的構造の同定を実施した。脳における解剖学的面積及び末梢神経系（ＰＮＳ）構造の認識の定義は、The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates（Paxinos and Watson, 1986）、The Atlas of Developing Rat Brain （Paxinos et al., 1991）、The Atlas of Mouse Development（Kaufman, 1992)及びThe Atlas of the Prenatal Mouse Brain(Schambra et al., 1992)を含む異なるアトラスを基に実施した。脳神経節の発達に関しては、Altman and Bayerの図版及び記載（１９８２）を参照した。いくつかの中枢及び末梢構造（例えば、脳神経運動核、自律運動節）の同定を確認するために、コリンアセチルトランスフェラーゼのin situ をいくつかの切片に対して実施した。
【００５５】
２人の実験者の主観的評価に基づき、１＋（低い強度）〜３＋（高い強度）のスコアを、解剖学的構造の標識に割り当てた。２０×冷プローブで置換したのちの、高い細胞充実性をもつ非神経性組織（肝及び筋など）若しくは高い細胞外マトリックスの密度を持つ非神経性組織（軟骨など）中の粒子の密度、又は神経構造上の標識の密度を、バックグラウンド標識と考慮した。細胞レベルでカウントする粒子が存在しないとき、慎重にスコアを評価しなければならない。例えば、発現する構造の標識強度の低下は、陰性細胞の増殖又はニューロンプロセスの形成によって生じる構造中の陽性細胞の分散によるものかもしれない。オリゴヌクレオチドは同じ長さを有し、同じプロトコルにしたがって標識したが、信号強度又は異なるトランスクリプトを比較することは試みなかった。別段指定しない限り、図に示す標識は、オリゴヌクレオチドNo．３１（α3)、４７（α4)、５１（α2)及び６２（α4)を使用して得たものである（オリゴヌクレオチド特性については表２及び表３を参照）。
【００５６】
特異性のコントロール。ｍＲＮＡごとに、配列の唯一部分（例えば、ｎＡＣｈＲサブユニットの場合、Ｍ３とＭ４との間の想像上の細胞質ループ）にある２〜４個のオリゴヌクレオチドを選択した。特異性の初期評価は、Genbank ／ＥＭＢＬ中の他の既知の配列との可能な相同性を探索することによって実施した。特異性の組織学的試験には、以下を考慮した。１．ｍＲＮＡごとに２個以上のオリゴヌクレオチドプローブが、同じパターンを示す（図１）。２．成体ラットの中枢構造の標識のパターンが、他の著者たちによって確認されたもの（Wada et al., 1989; Dineley-Miller and Patrick, 1992)と一致している。３．使用した大部分のオリゴヌクレオチドが、同様なＧＣ含量をもつ４５量体である（表２及び表３）とすると、各オリゴヌクレオチドプローブが他のプローブの特異性のコントロールを構成している。４．混合物への２０倍過剰の冷プローブの添加により、標識が完全に消滅した（図２）。
【００５７】
使用したオリゴヌクレオチドプローブは、規準２を満たすことができなかったα3 ｍＲＮＡに対する４個のプローブを除き、すべてがこれらの規準を満たすものであった。ｃＲＮＡプローブに基づく以前の研究は、成体ラットにおけるこのサブユニットｍＲＮＡの比較的広い分布を示し、顕著には、大脳皮質層IV、内鼻皮質層II、前側及び腹側視床核、内側及び側方顔面神経膝核、内側手綱、後側視床下部並びに乳頭土核、松果体、Ｖ及びVII 神経の運動核、青斑、疑核及び最後野において高いレベルを示した（Wada et al., 1989)。これらの観察結果の相違に関し、成体ラット中、内側手綱、松果体の中間部、最後野、Ｖ神経の運動核及び小脳においてのみ高レベルのα3 ｍＲＮＡ信号を検出することができ、いくつか視床核及び青斑においてはレベルは低かった。この矛盾の一部は、リボプローブに比べて低いオリゴヌクレオチドプローブの感度の低さに帰すことができる。しかし、特にプローブの加水分解を組織学的手法（Wada et al., 1989)で実施する場合に、ｃＲＮＡプローブの特異的コントロールを実施する難点を考慮すると、以前にα3 ｍＲＮＡに帰属していたいくらかの標識が、から他の（ｎＡＣｈＲ関連）ＲＮＡ配列に実際に誘導することが可能である。
【００５８】
オリゴヌクレオチド：β2 ：5'-TCG CAT GTG GTC CGC AAT GAA GCG TAC GCC ATC CAC TGC TTC CCG-3' ；α4 ：5'-CCT TCT CAA CCT CTG ATG TCT TCA AGT CAG GGA CCT CAA GGG GGG-3'; β4:5'-ACC AGG CTG ACT TCA AGA CCG GGA CGC TTC ATG AAG AGG AAG GTG-3' 。Ｂ：Clarke et al.による記載30にしたがって、 3Ｈ−ニコチン結合を実施した。１４μm の冠状切片を、５０mMトリス（pH７．４）／８mM ＣａＣｌ2 ／４nM 3Ｈ−Ｌニコチン中、室温で３０分間インキュベートした。Ｌ−ニコチンビタルトレートの存在下において非特異的結合を評価した。インキュベーションに続き、切片を氷冷ＰＢＳで２分間ずつ２回すすぎ、氷冷水ですばやくすすいだ。スライドをHyperfilm 3Ｈに６０日間暴露した。
【００５９】
図１１及び１２は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパッチクランプ記録である。図１１は、野生型マウス及びβ2 −／−マウスのＭＨｂ及び前側視床における細胞からの記録を表わす。アゴニストのオフレートは、ＭＨｂにおけるほうが前側視床におけるよりも有意に大きく、その結果、二つの構造の間で異なる応答速度をもたらしている。ＭＨｂのニコチンアゴニストは、β2 −／−動物中には維持されたが、β2 −／−マウスにおいては、前側視床のニコチンアゴニストに対する応答は完全に廃されている。図１２は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスの種々の核におけるニコチンアゴニストに対する応答を示す。
【００６０】
方法。氷冷ＡＣＳＦ媒体（１２５mM ＮａＣｌ／２６mM ＮａＨＣＯ3 ／２５mM グルコース／１．２５mM ＮａＨ2 ＰＯ4 ／２．５mM ＫＣｌ／２mM ＣａＣｌ2 ／１mM ＭｇＣｌ2 、pH７．３）中、Dosakaスライサーを使用して、８〜１２日齢のマウスの視床から冠状のスライスを得た。スライスをこの同じ媒体中に１〜８時間維持した。Zeiss 顕微鏡を通してスライス中の細胞を視覚化した。１５０mM ＣｓＣｌ／１０mM ＥＧＴＡ／１０mM ＨＥＰＥＳ／４mM 二ナトリウムＡＴＰ／４mM ＭｇＣｌ2 をＫＯＨでpH７．３に調節したものを含む２〜４MOhm硬質ガラスピペットを用いて全細胞記録を得た。スライスの上方に配した直径５０μM のピペットを介して、重力により、１５０mM ＮａＣｌ／１０mM ＨＥＰＥＳ／２．５mM ＫＣｌ／２mM ＣａＣｌ2 ／１mM ＭｇＣｌ2 を含む溶液を５〜１０秒のパルスで細胞に適用した。記録は、ＣＮＱＸ（５μM)及びＧＡＢＡアンタゴニストＳＲ−９５５３１（１０μM)の存在下において実施した。電流は、Axopatch ID （Axon Instrument)パッチ増幅器によって記録し、Compaqパーソナルコンンピューターでデジタル化し、PClampプログラム（Axon Instrument)によって更に解析した。
【００６１】
図１３及び１４は、受動忌避試験におけるβ2 −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。図１３は、訓練後に賦形剤又はニコチン（１０μ/kg)のいずれかを注射したのちの、保持試験における種々のレベルの足への衝撃に対する応答を示す。訓練試行中の平均ステップスルー潜時は、突然変異マウスの場合には１７．０±３．６秒であり、それらの非突然変異同胞種の場合には１５．０±３．５秒であった。図１４は、賦形剤又はニコチン（１０μg/kg）のいずれかを注射された野生型マウスとホモ接合体β2 突然変異マウスとの間の、２．００mAmpの強度の電流衝撃を足に印加した場合の保持潜時の差を示す棒グラフである。データは、以下の分類、すなわち、野生型＋賦形剤（ｎ＝２７）；野生型＋ニコチン（ｎ＝２３）；β2 −突然変異マウス＋賦形剤（ｎ＝１７）；β2 −突然変異マウス＋ニコチン（ｎ＝１７）の平均＋／−ＳＥＭとして表わす。統計的解析は、相違の混合因数解析を使用し、続いて単純効果の事後試験を行うことによって実施した。＃、ｐ＜０．０５、賦形剤注射後の野生型対突然変異マウス；＊、ｐ＜０．０１、野生型マウスにおけるニコチン対賦形剤。
【００６２】
方法。本文に記載のように、Nordberg及びBergh の方法20並びにFaiman et al. の方法20にしたがって、受動忌避試験を実施した。ニコチンを（ビタルトレート、Sigma)０新たにＰＢＳに溶解した。訓練試行中、同量の賦形剤又はニコチンのいずれかを腹腔内注射したのち、ただちに足に電気衝撃を印加した。
【００６３】
図１５は、β2 −サブユニット遺伝子及びプロモーターの全部又は一部を含むファージ及びプラスミドの図である。プラスミドの名称においては、数字が断片の大きさを表わし、文字が、それを生成するのに使用した制限部位を表わす。
【実施例】
【００６４】
以下の記載及び実施例は、本発明の実施態様及び範囲を例示するものである。本発明は、この記載の範囲に限定されるものではない。更にこの記載及び本明細書の付随する各節及び参考として包含されている資料は、クレームの全ての実施を可能にするものである。
【００６５】
以下の例及び実施態様は、当然のことながら、当該業界において公知の技術によって修正することができる。記載又は請求されている核酸配列の変動は、本発明者らが示した効果又は利点を変えることなく、公知の方法によって生み出すことができる。したがって、かかる変動は、当記載及び本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
材料と方法
ゲノムクローンの分離
全ラットｃＤＮＡ（カリフォルニア州サンディエゴのThe Salk InstituteのJ. Boulter博士及びS. Heinemann博士から提供された）を含むＰＣＸ４９プラスミド（Deneris et al., 1988）を、ＥｃｏＲＩで切断し、２．２kbまでの（〜２．２kb）断片を単離し、マウスＤＢＡ２ゲノムＤＮＡのＥＭＢＬ３バクテリオファージライブラリをスクリーニングするためのプローブとしてこれを使用した。最初のエキソンから１５kbまで（〜１５kb）上流のＤＮＡ及び５kbまで（〜５kb）下流のＤＮＡに広がる１つの独特のクローンを得た。図１は、イニシエーターＡＴＧから１．２kb上流のヌクレオチド配列を示す。
【００６７】
ハイブリダイゼーションの条件は、このプローブのための緊縮条件を決定するために、公知の技術29により修正することができる。β2 −サブユニット配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする充分に緊縮な条件を開発するために、温度（約４５℃〜約６５℃）及びＳＳＣ緩衝液濃度（約０．１×ＳＳＣ〜約６×ＳＳＣ）などのハイブリダイゼーション条件の変更、並びに洗浄条件の温度及びそのための緩衝液の変更を行うことが可能である。したがって、このハイブリダイゼーション手順に基づき、その他のライブラリから、その他の関連する配列を単離することができる。４５℃及び６×ＳＳＣなどのハイブリダイゼーション条件を使用することによって、ヒト配列が分離されよう。
【００６８】
１９９４年１２月１３日に、パスツール研究所国立微生物培養収集所（ＣＮＣＭ）（25, Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15,フランス）において、３件の寄託が行われた。ファージ、λβ2 ｎＡＣｈＲは、受入れ番号Ｉ−１５０３として寄託されている。このファージは、マウスのニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットのエキソン全てをコードする配列及びプロモーター配列を含む１５〜２０kbのゲノムＤＮＡを含んでいる。プラスミドを有する２つのE. coli 培養物も同様に寄託された。E. coli ＤＨ５α内のプラスミドｐＳＡ９は、受託番号Ｉ−１５０１が付与されており、β2 −サブユニットのエキソン１、２及び３についてコードする領域及び調節配列を含むマウスゲノムＤＮＡ９kbを含む。E. coli ＤＨ５α内のプラスミドｐＥＡ５は、受託番号Ｉ−１５０２が付与されており、Ｅｃｏ４７−III 部位の約１．２kb上流の領域及びβ2 −サブユニットのエキソン１〜５をコードする領域を含むマウスゲノムＤＮＡ５kbを含む。本発明者らは、ＥＭＢＬ、GenBank 及びＤＤＢＪヌクレオチド配列データベースに、受託番号Ｘ８２６５５として、ここに報告するヌクレオチド配列データを寄託するつもりである。
【００６９】
転写開始部位のマッピング
ｍＲＮＡのマッピングのために、我々は、Ｅ１３期又はＥ１５期のＤＢＡ２胚から抽出した全ＲＮＡの異なるバッチを使用した。ＤＮＡ汚染を避けるため、ＲＮＡ試料をまずＤＮアーゼＩで消化させた。
ＲＮアーゼ保護。Bluescript SK (Stratagene)中に、イントロン１の一部を含むＸｂａＩ／ＰｓｔＩ断片を挿入した。その後プラスミドを、Ｂｇ１IIで線形化させ、Ｔ７プロモーターを用いてＲＮＡプローブを合成した。その後、Ausbel et al. (1994)に記載されているように、保護実験を行った。
【００７０】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Frohman et al., 1988)
ｍＲＮＡを、８０℃で５分間、プライマー１０pmolを用いて、ハイブリダイズした。供給業者が推奨する緩衝液中、３７℃で４５分間、ＭＭＬＶ４００ｕ（Gibco)を用いてｃＤＮＡの合成を行った。フェノール／クロロホルム抽出の後、ｃＤＮＡをエタノール沈降させた。３７℃で３０分間、０．２M のカコジル酸カリウム；２５mMのトリス−ＨＣｌpH６．６；２５mg/ml のＢＳＡ；１．５mMのＣｏＣｌ2 ；５０nMのｄＡＴＰ及び５０ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Boehringer）中、ターミナルトランスフェラーゼ反応を行った。フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈降の後、Promega のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、ターミナルトランスフェラーゼ反応の１０分の１を増幅させた（９４℃；５５℃；７２℃で１分、３０サイクル）。増幅させた断片を次にアガロースゲル上に配置した。ゲルをブロッティングし、オリゴヌクレオチドｐ2 にハイブリダイズした。我々は、脳からのｍＲＮＡをマッピングするため、ｃＤＮＡ合成用のプライマとしてｐＥｘ２を、そしてＰＣＲのためにｐ０／ＢＥｐＴを用いた。トランスフェクションを行った細胞からｍＲＮＡをマッピングするには、ＯＬＵＣＩ３（ｃＤＮＡの合成）及びＯＬＵＣ１２／ＢＥｐＴ（ＰＣＲ）を用いた。
【００７１】
ＳＬＩＣ（Dumas Milnes Edwards et al., 1991)
４２℃で４５分間、５０mMのトリス−ＨＣｌpH８．３；８mMのＫＣｌ；１．６mMのＭｇＣｌ2 ；５mMのスペルミジン；０．５mMのｄＮＴＰ；１u/μl のＲＮａｓｉｎ；０．１mg/ml のＢＳＡ；７０mMのβ−メルカプトエタノール；８０ｕのＡＭＶ逆転写酵素（Promega)中、プライマーとしてｐＥｘ３（６pmol) を用いて、５μg の全ＲＮＡから、まずｃＤＮＡを合成した。その後、ＮａＯＨ中でＲＮＡを分解させた。次にｃＤＮＡの第１のストランドを、オリゴヌクレオチドＡ５’と連結させた。得られた一本鎖ｃＤＮＡを、次に、オリゴヌクレオチドＡ５’−１／ｐ０及びＡ５’−２／ｐ１での２回のＰＣＲ増幅に付した（９４℃で１分；６０℃で３０秒；７２℃で４５秒で３５サイクル）。
【００７２】
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりであった。
Ａ５’：5'-CTGCATCTATCTAATGCTCCTCTCGCTACCTGCTCACTCTGCGTGACATC
Ａ５’−１：5'-GATGTCACGCAGAGTGAGCAGGTAG
Ａ５’−２：5'-AGAGTGAGCAGGTAGCGAGAGGAG
ｐ０：5'-CCAAAGCTGAACAGCAGCGCCATAG
ｐ１：5'-AGCAGCGCCATAGAGTTGGAGCACC
ｐ２：5'-AGGCGGCTGCGCGGCTTCAGCACCACGGAC
ｐＥｘ２：5'-GCCGCTCCTCTGTGTCAGTACCCAAAACCC
ｐＥｘ３：5'-ACATTGGTGGTCATGATCTG
ＢＥｐＴ：5-GCGGGATCCGAATTC(T)21 A/C/G
ＯＬＵＣＩ３：5'-CGAAGTATTCCGCGTACGTGATG
ＯＬＵＣＩ２：5'-ACCAGGGCGTATCTCTTCATAGC
【００７３】
プラスミドの構築
ＫＳ−Ｌｕｓｉ：Bluescript ＫＳの対応する部位において、ｐＳＶＯＡＬプラスミドのＨｉｎｄIII ／ＫｐｎＩ制限断片（de Wet et al., 1987)をサブクローニングした。その後、ルシフェラーゼ遺伝子の最も５’のＥｃｏＲＩ／ＢｓｍＩ（４５bp）断片を（de Wet et al., 1987)にしたがって、欠失させ、ＳａｌＩ部位で置換した。ひき続き、ポリアデニル化部位を含むＳＶ４０の３４２bpのＰｖｕII／ＨｉｎｄIII 制限断片を、アダプタを用いて、ＥａｇＩ部位にサブクローニングした。
【００７４】
ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ：λβ2 ファージの１．２kbp のＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７II断片を、アダプタを用いて、ＫＳ−ＬｕｃｉのＥａｇＩ／ＳａII部位に挿入した。「分子生物学における現行のプロトコル」（Ausubil et al., 1994）におけるように、Ｂａｌ３．１エキソヌクレアーゼを用いて、プロモーターの５’末端欠失を得た。
【００７５】
Sculptorキット（Amersham）を用いて、突然変異を導入した。ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列中、突然変異を受けた配列は、この突然変異がＮＲＳＥ要素の活性を低下させることが示されたため（Morl et al., 1992)、ACCACGGACAではなく、＋２４ACCACTTACAであった。Ｅ−ボックス配列中では、突然変異を受けた配列はTCCACTTGではなく、−１２０TCCTCAGGであった。図７は、核タンパク質が、野生型配列に結合することができるが、突然変異を受けた配列には結合できないことを示している。
【００７６】
細胞のトランスフェクション
１％のグルタミン及び１％のストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、神経芽細胞種Ｎ１Ｅ１１５、ヒトＳＫ−Ｎ−Ｂｅ、ＨｅＬａ及び３Ｔ６線維芽細胞、２９３ヒト腎細胞及びＳＶＬＴ線条体細胞（Evrard et al., 1990)を成長させた。１％のグルタミン及び１％のストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ＋１０％のＨＳ＋５％のＦＣＳ中、ＰＣ１２細胞を成長させた。
【００７７】
６０mm2 プレート当り１０5 〜４×１０5 個の細胞の割合で、細胞を播種した。翌日、１５０mMのＮａＣｌ中、２．５μl のTransfectam(ＩＢＦ／Sepracor）と混合した１μg のＤＮＡを用いて、７５０μl のＤＭＥＭ＋２％ペニシリン／ストレプトマイシン中、５〜１２時間、細胞をトランスフェクションした。４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。Qiagen又はWizard prep(Promega)キットを用いて、ＤＮＡを調製した。プラスミド活性を比較する際には、全てのプラスミドを同じ日に調製した。各々のプラスミドについて少なくとも２つの異なるＤＮＡ調製物を試験した。全てのトランスフェクションを、二重に実施し、少なくとも３回繰り返した。
【００７８】
トランスジェニックマウスの産生
ＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ由来のルシフェラーゼ遺伝子を切除し、ｎｌｓＬａｃＺ遺伝子で置換した（Kalderon et al., 1984)。ＴＡＥアガロースゲルからβ2 −プロモーター／ｎｌｓＬａｃＺ断片を電気溶出し、次にエタノール沈降によって更に精製し、最後にトリス−ＨＣｌ１０mM pH７．５；ＥＤＴＡ０．１mM中で再懸濁させた。ＤＮＡ溶液（３ng/ml)を、Ｃ５７ＢＬ６×ＳＪＬハイブリッドの受精卵母細胞内に注入した。組織の染色を、Mercer et al., 1991 に記載されているとおりに行った。
図８の方法も参照のこと。
【００７９】
ゲルシフト検定
「分子生物学における現行のプロトコル」におけるように、α〔32Ｐ〕ＣＴＰ及びKlenow酵素又はγ〔32Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのいずれかを用いて、オリゴヌクレオチドを標識した。核抽出物を、記載のとおり（Bessis et al., 1993)、１０7 （〜１０7 ）個までの細胞から調製した。結合のためには、１nmolの標識されたオリゴヌクレオチドを、２０μl 中１０mMのＨｅｐｅｓ pH８、１０％のグリセロール、０．１mMのＥＤＴＡ、０．１M のＮａＣｌ、２mMのＤＴＴ、０．１mg/ml のＢＳＡ、４mMのＭｇＣｌ2 、４mMのスペルミジン、１mMのＰＭＳＦ、１μg のｐｏｌｙｄＩｄＣ中、０．５μg のタンパク質抽出物と混合した。氷上で１０分間反応物をインキュベートした。その後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を、７％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【００８０】
本実験に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の配列を伴う二本鎖のものであった（下線のあるヌクレオチドは、突然変異を受けたオリゴヌクレオチドと野生型オリゴヌクレオチドの間で変更されたものである）。
Ｅ−Ｄ：5'-TCCTCCCCTAGTAGTTCCACTTGTGTTCCCTAG
Ｍｕｔ−Ｅ：5'-CCTCCCCTAGTAGTTCCTCAGGTGTTCCCTAGA
Ｓ−Ｅ：5'-CTAGCTCCGGGGCGGAGACTCCTCCCCTAGTAGTTCCACTTGTGTTCCCTAG
【００８１】
結果
β2 −サブユニットをコードする遺伝子の５’フランキング配列の特徴づけ
β2 −サブユニットをコードする遺伝子を含むλファージをクローニングし、イニシエーターＡＴＧを取り囲む領域を配列決定した（図１）。転写開始部位を、まず最初にＲＮアーゼ保護によりマッピングした（図２のａ）。この方法により我々は、少なくとも３つの開始部位を検出することができた。しかしながら、これらの実験では、わずかな付加的開始部位は検出されなかった可能性がある。主要な保護バンドのサイズは、約１５０ヌクレオチドと見積られた。開始部位をより精確に確認し、位置設定するため、我々は、プライマー伸長生成物の増幅（図２のｂ）から成るＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅；Prohman et al., 1988) 及びＳＬＩＣ（ｃＤＮＡの一本鎖連結；Dumas Milnes Edwards et al., 1991)の両方を実施した。両方の技術により、我々が図１に記載した４つの開始部位に対応する同じ断片をサブクローニングし、配列決定することが可能であった。−１３の開始部位はきわめて稀であり、ＲＮアーゼマッピングにより検出されなかったのであろう。
【００８２】
フランキング領域（図１）の配列の分析により、いくつかのコンセンサスＤＮＡ結合要素が明らかになった：すなわち、Ｓｐ１部位（−１４６）、ｃＡＭＰ応答性要素結合（ＣＲＥＢ）部位（−２８７；Sassone-Corsi, 1998)、核受容体応答要素（−３４４〜−３５６：Parker, 1993）、ＧＡＴＡ−３部位（−１０７３；Ko and Engel, 1993) 、及び弱縮重オクタマー（八量体）モチーフ（−５２２）。更に、２回回転軸対称要素内に含まれているＥ−ボックス（−１１８）を認識することができた。近位領域（−２４５〜＋８２）は同様に、ある程度の調節上の意義をもちうる異常に高いＧＣ含有量（６７％）及び多数のジヌクレオチドＣｐＧを有している(Antequera and Bird, 1993)。最終的に、ＮＲＳＥ（神経制限性サイレンサー要素；Mori et al., 1992)又はＲＥ１（制限要素；Kraner et al,, 1992)配列と同一の２０bpの配列が、１．２kbp 断片の３’末端に発見された（＋１８〜＋３８）。
【００８３】
β2 −サブユニット遺伝子のフランキング配列の１．２kbp の断片がin vitroでのニューロン特異的発現を促進する。
ルシフェラーゼ遺伝子に融合されたβ2 −サブユニット５’フランキング領域の１１６３bpのＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７III 断片（−１１２５〜＋３８）を含む構築物を生成した(de Wet et al., 1987) （プラスミドＥＥ１．２−Ｌｕｃｉ）。読み過しを避けるため、β2 −サブユニット配列から上流に、ＳＶ４０のポリアデニル化部位を挿入した。次に、褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞、神経芽腫セルラインＮＩＥ１１５及びＳＫ−Ｎ−Ｂｅ、ＳＶＬＴ、線条体セルライン(Evrard et al., 1990) 、ＮＩＨ３Ｔ６又はＨｅＬａ線維芽細胞及びヒト腎セルライン２９３の中への一時的トランスフェクションにより、プラスミドＥＥ１．２−Ｌｕｃｉの転写活性を試験した。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、我々は、神経芽腫及びＰＣ１２細胞は、正常に、β2 −サブユニットｍＲＮＡを発現するが、線条体ＳＶＬＴセルライン又は３Ｔ６線維芽細胞はこれを発現しないことを確認した。図３は、ＰＣ１２細胞及び神経芽腫において、１．２kbp の断片が、その他のセルラインにおけるよりもレポーター遺伝子の転写を媒介する上で、２０〜１８０倍の活性を示すことを示している。線維芽細胞、２９３細胞及びＳＶＬＴ細胞においては、１．２kbp 断片の転写活性は、プロモーター無しのベクターのそれと比べて、著しく高いものではない（図３）。したがって、β2 −サブユニットプロモーターは、これらのセルラインでは活性ではない。これらのin vitroにおけるトランスフェクション実験は、１１６３bp断片が、内因性β2 −サブユニット遺伝子の発現パターンを模擬し、かくして細胞特異的プロモーターを含むことを証明している。
【００８４】
トランスジェニックマウスにおける１１６３bpプロモーター
In vivo で１１６３bpプロモーターを試験するために、ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ４７III 断片を、ｎｌｓ−β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子(Kalderon et al., 1984) から上流に連鎖させた。ＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルを、コーディング配列の下流に連結した。その後、得られた４．７kbの断片を、Ｆ１ハイブリッドマウス（Ｃ５７Ｂ１６×ＳＪＬ）からの受精卵の雄前核内にマイクロインジェクションした。子孫の尾から抽出したＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の有無について分析した。３つの独立したファウンダー（founder)を得、発現についてこれを分析した。
【００８５】
２つのライン（１３及び１６）が、ニューロン内で発現を有し、３番目のラインは、全く発現しなかった。これは、１１６３bpのプロモーターが、in vivo でのニューロン特異的発現を駆動するのに充分な調節要素を含んでいることを示している。末梢神経系ＰＮＳでは、両方のラインとも同じ構造にて発現した。これとは対照的に、ＣＮＳでは、ライン２６の標識パターンは、ライン１３のそれのサブセットである。ここではライン１３だけを詳細に記述する。予想されたとおり、大部分の末梢β2 −発現神経節が、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を発現し、一方ＣＮＳでは、β2 −陽性領域のサブセットのみが、β−ｇａｌを発現した。例えば、図４のｃは、腰仙脊髄のニューロンの大部分が、β2 −サブユニットのトランスクリプトを発現し、一方、前角及び背角内のニューロンのサブユニットのみが、β−ｇａｌ活性を呈することを示している。
【００８６】
導入遺伝子の発現は、Ｅ１０．５及びＥ１１胚の末梢神経節に検出することができた。Ｅ１３全胚（図４のａ）及び更に加齢した脳（Ｅ１７、ＰＯ及び成人期）の中で、標識を検査した。Ｅ１３において、標識は、ＰＮＳ内で顕著であった：すなわち、背根神経節（ＤＲＧ、図４及び５のｃ、ｄ；脳神経と関連したいくつかの神経節（三叉神経節、図５のａ参照、膝神経節、舌咽神経節及び迷走神経節）；交感神経鎖の神経節（図５のｃ、ｄ）；網膜の神経節細胞（図５のａ）及び心壁中の推定上の副交感神経節（図５のｂ）で、標識が強力に観察された。Ｅ１３では、脳幹及び前脳の両者において、いくつかの脳脊髄幹レベルでも、陽性細胞クラスターが存在していた。染色したニューロンのクラスターは、腹面及び側面脊髄にも観察された。
【００８７】
発達の更に後期（Ｅ１７）において、陽性ニューロンが、いくつかの基底終脳核中にクラスター化して発見されたが、一方尾状−果核の中では、分散した細胞が染色された。間脳レベルでは、不確帯及び網様視床核、並びに多数の視床下部核に、陽性クラスターが存在していた。脳幹内では、脳神経の大部分の運動核（迷走神経の背面運動核を除く）が、ある程度から高いものに至るまでの標識を示した。更に、Ｖ中脳核の分散した細胞は、橋核、前置舌下神経核及びいくつかの橋中脳被蓋内の分散した細胞と同様、高度に染色されたと思われた。
【００８８】
ライン１３内のＰＯでは、陽性細胞の分布は、既に、それ以前の年令におけるよりも更に制限されているように思われた（例えば、基底終脳及び動眼神経核内の標識は、明らかに減少していた）。成体動物のＣＮＳ内では、標識された細胞は、視床下部内でのみ検出された。ライン１３では、細胞のいくつかのクラスターが、胃腸管（胃及び十二指腸）の粘膜及び膵で染色された。ライン１３の性器結節及びいくつかの表在筋に、異所性標識が検出されたが、これらの組織のいずれも、ライン２６では染色されなかった。
【００８９】
最小細胞特異的プロモーターの認識
プロモーター活性に関与する調節要素をより詳しく調査するため、我々は、１１６３bpプロモーターの５’欠失を含む一連のプロモーターを生成した。これらのプラスミドは、線維芽細胞及びＳＫ−Ｎ−Ｂｅ細胞内への一時的トランスフェクションによって試験した。これら２つのセルラインは、最も容易にトランスフェクションされたセルラインであったために選ばれたものである。更に、神経芽腫のラインは、最初末梢構造から分離され(Biedler et al., 1978)、１１６３bpプロモーターによって支持された調節要素を研究するための便利な手段となっている。
【００９０】
１５７bpが、１１６３bpプロモーター（図１に示されているプラスミド１００６Ｅ−Ｌｕｃｉ）の５’末端から欠失された時点では、神経芽腫ではルシフェラーゼ活性は、著しく変化しなかったが、線維芽細胞では増大した（図６）。３０１bpを更に欠失させた場合、残りのプロモーターの活性は、線維芽細胞内で増大し続けたが、神経芽腫内では増大し続けなかった（プラスミド８６２Ｅ−Ｌｕｃｉ、図６を参照）。したがって、１５７及び３０１bpの欠失したプラスミドは、線維芽細胞内でのみ活性であるリプレッサー要素を有する。しかしながら、トランケートされた８６２bpプロモーターは、なおもニューロン特異的活性を呈し（図６、両方のセルライン中の８６２Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を比較のこと）、このことは、１．２kbp プロモーターが、付加的な調節要素を有していることを示している。更に、−８２４と−２４５の間には、リプレッサーが存在し得た（神経芽腫内の８６２Ｅ及び２８３Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を比較のこと）。この推定上の調節要素を更には分析しなかった。実際、２８３bpプロモーター（プラスミド２８３Ｅ−Ｌｕｃｉ）は、なおも線維芽細胞よりも神経芽腫で、〜１６０倍もの活性を示し、プロモーターのこの近位部分内にもう１つのニューロン特異的調節要素が存在することが確認されている。
【００９１】
近位の２８３bpプロモーターの５’末端から１５０bpを欠失させた場合、線維芽細胞と神経芽腫の両者において、転写活性が非常に低下しているのが検出された（プラスミド１３３Ｅ−Ｌｕｃｉの活性を参照のこと）。このことは、すなわち、非常に重要な正の調節要素が欠失したことを示している。これらの正の及び負の要素については、更に、プロモーターの近位部分の欠失及び突然変異研究によって調査した。
【００９２】
近位領域内の負及び正の調節要素
β2 −サブユニットプロモーターの３’末端は、推定上のタンパク質要素結合部位を含む。β2 −サブユニット遺伝子調節におけるこれらの要素の役割を分析するため、我々は、これらの結合部位に突然変異を含むプラスミドを生成した。欠失実験を用いて、−９５と−２４５の間に、活性化物質を検出した（図３参照、２８３Ｅと１３３Ｅ−Ｌｕｃｉの間の差）。ｎｔ−１１８に位置するＥ−ボックスが優れた候補であったことから、我々は、転写活性に対するこの要素におけける突然変異の効果を分析した。表３は、野生型プロモーターのそれと比べた場合の突然変異を受けたプロモーターの転写活性が４０％低下していることを示している。非ニューロン組織中のＥ−ボックスの役割は、転写の基底レベルが、線維芽細胞中で、既に低いものであったために、更に評価が困難であった。
【００９３】
プロモーターの調節におけるＥ−ボックスの役割を更に理解するため、我々はこの配列と相互作用することのできるタンパク質複合体について調査した。プローブとして３３bp配列（ｎｔ−１３５〜−１０３、オリゴヌクレオチドＥ−Ｄ）を用いて、ゲルシフト測定を行った。神経芽腫又は線維芽細胞からの核抽出物を32−Ｐ標識オリゴヌクレオチドと混合したところ、３つの複合体が観察された（図７）。これは全て、過剰の標識オリゴヌクレオチドＥ−Ｄにより、完全に置換されていた。これとは対照的に、Ｅ−ボックス／２回回転軸内で競合的オリゴヌクレオチドを突然変異させたところ、いかなる競合も見られなかった（オリゴヌクレオチドＭｕｔ．Ｅ、図７のレーン「Ｍｕｔ．Ｅ」を参照のこと）。このことは、Ｅ−ボックス／２回回転軸が、核タンパク質を結合することのできる−１３５／１０３配列内に含まれる唯一の要素であることを示している。この配列は、β−サブユニットプロモーターの活性に関与すると考えられる。
【００９４】
近位領域内には、ＮＲＳＥ／ＲＥ１配列も存在しており、線維芽細胞内ではサイレンサーとして作用するが、ＰＣ１２細胞又は神経芽腫内では作用しないことが示されている(Kraner et al., 1992; Li et al., 1993; Mori et al., 1992) 。１１６９bpプロモーターの存在下でのこの配列の点突然変異により、線維芽細胞内では転写活性が１０５倍に上昇したが、神経芽腫内ではわずか３倍に上昇したにすぎなかった（表３）。したがって、この配列は、β2 −サブユニット遺伝子の細胞特異的発現の少なくとも一部分を司る。
【００９５】
トランスジェニックマウスにおける高親和性ニコチン受容体の除去により、忌避学習の変化が生じる
ｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットを、胚の（ＥＳ）細胞の中で分断し、このサブユニットが欠如しているマウスをひきつづき発生させた（図８）。β2 −／−マウスは生存可能で正常に交尾し、明らかな肉体的欠損を示さなかった。脳の全体的サイズ及び組織は正常であった（例えば、図９及び図１０を参照のこと）。抗−β2 モノクローナル２７０11（図８ｄ）を用いた全脳ホモジネートのウエスタンブロット分析及びポリクローナル抗−β2 抗体9 を用いた脳全体を通しての免疫細胞化学反応は、コントロールのマウスにおいて検出された免疫反応性がβ2 −／−マウスには見られず、β＋／−マウスでは低下していたことを証明した。β2 −アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたin situ のハイブリダイゼーションによって、β2 −／−マウス内でβ2 をコードするｍＲＮＡを検出することはできなかった。
【００９６】
α4 −及びβ2 −サブユニットの分布は、脳の中で大幅に重複し、これらのサブユニットは、組み合わさってＣＮＳ12内で優性なｎＡＣｈＲイソ型タンパク質を形成すると考えられる。卵母細胞発現実験6 に基づくと、α4 −サブユニットと機能的ヘテロ五量体を形成することもできることがこれまでに確認されたのは、β4 −だけである。β4 −サブユニットは、内側手綱（ＭＨｂ）及び脚間核（ＩＰＮ)10 内での発現を伴って、β2 ＋／−マウス又はβ2 −／−マウスの脳の中で正常に発現され、β2 −サブユニットを置換するためのアップレギュレーションは脳のどこにも見られなかった（図９）。又、突然変異マウスにおいて、α4 −（図９）、α5 −又はβ3 −サブユニットのｍＲＮＡの発現が著しく変わることもなかった。
【００９７】
平衡結合実験によると、ニコチンは、α4 −及びβ2 −サブユニット13-15 の分布と一致する分布をもつ高親和性部位（１０nM13,14 に近いＫＤ）の集団に結合することが示された。β2 ＋／＋、＋／−及び−／−マウスからの脳切片内の高親和性ｎＡＣｈＲを視覚化するため、定量的受容体オートラジオグラフィを行った（図１０）。
【００９８】
In situ でのニコチン結合は、β2 −／−の動物においては完全に破壊され、β2 ＋／−の動物では全ての脳部域内で約５０％低下し、この高親和性結合を媒介する上でのβ2 −サブユニットの関与を表わしている。
【００９９】
トランスジェニックマウスの電気生理学
きわめて高いレベルのβ2 （及びα4 ）サブユニットｍＲＮＡ（図９）を発現する前部視床のニューロンを、ニコチンに対する電気生理学的応答について研究した。スライス作成に容易に利用できるこの部域は、１μM のジヒドロ−β−エリスロイジンによって遮断された１５５＋／−７３pAの平均内部電流で、野生型動物において、１０μM のニコチンに対し一貫して応答した。応答のアゴニスト順位は、in vitro6 でのα4 ／β2 −含有ニコチン性受容体について見られるものと匹敵するものであった（ニコチン＞ＤＭＰＰ＞シチジン）（図１１）。前部視床ニューロンは、アゴニスト応答の完全な回復には、数分から１時間を必要とし、このことは、受容体応答が脱感作に陥りやすいことを示唆している。その上、再現可能な応答のためには、１μM という比較的高用量が必要とされ、これは、ニコチンがその高親和性部位に結合して活性化するのではないことを意味している。したがって、脱感作されたコンホーメーションにおいては、高親和性ニコチン結合部位は、ｎＡＣｈＲであろう。
【０１００】
β2 −／−マウスにおいては、ニコチンに対する前部視床ニューロンの応答は、試験したニューロンの１００％において完全に破壊された（図１２）。コントロールとして、α3 及びβ4 の両者ともが強く発現されているＭＨｂ内のニューロンも同様に試験した。ニコチンは、野生型マウスにおいて５０５＋／−１３２ｐＡの平均内側電流をひき起こし、この応答のアゴニスト潜在性は、α3 ／β4 含有受容体についての階級（ランク）順に従っていた（シチシン＝ニコチン＞ＤＭＰＰ）（図１１）。予想したとおり、ニコチンに対するＭＨｂ内の細胞の応答は、突然変異マウスにおいて維持された。
【０１０１】
β2 サブユニットは、野生型動物8-10の神経節内で発現されるが、心拍数又は基底体温には明らかな差異は全くなかった。高用量のニコチンに対して感受性を有し、かつｎＡＣｈＲ16のβ2 ／α4 イソ型タンパク質に対して選択的である薬物によって修正されない自発的歩行活動は、β2 −／−、β＋／１、及びβ＋／＋マウスにおいて著しく異なっていなかった。
【０１０２】
認識及び行動に関する結果
２つの手順を用いて、突然変異体及び野生型マウスにおいて、学習及び記憶を試験した。モリスの水迷路17,18 は、空間的指向性学習を評価する。この試験での突然変異体マウスの能力は、可視プラットフォームタスク又は隠ぺいプラットフォームタスクで試験した場合に、野生型マウスの能力と異なっていなかった（５日間の訓練後に到達した最小水泳時間：突然変異体（ｎ＝８）：７．４＋／−１．４秒：野生型（ｎ＝８）：８．２＋／−２．０秒）。移行試験では、両者の動物群とも、同じプラットフォーム横断数で、約３５％の時間をプラットフォーム四分円内で過ごした（突然変異体：４＋／−０．４；野生型：３．９＋／−０．６）。
【０１０３】
同じくニコチン投与に対するその薬理的感受性19,20 のため選択された、受動的忌避試験を用いて、阻害性忌避応答の保持を評価した。この試験は、マウスをシャトルボックスの充分に照明されたチャンバ内に入れるトレーニングトライアルからなり、隣接する暗いチャンバ内に入るまでの時間を測定した。暗いチャンバに入った時点で、穏やかな逃避不可能な衝撃を足に与え、賦形剤又はニコチン（１０μg/kg）をマウスに注射した。２４時間後に、暗いチャンバへ入るまでの時間を測定することによって、保持を評価した。明るいチャンバ内で過ごした時間（保持潜時）は、突然変異体及び野生型マウスの両者において、加えられた足部衝撃に比例して増大した。
【０１０４】
しかしながら、ニコチンによる処置は、野生型マウスにおいてのみ約８０秒だけ上向きに曲線を移動させることによって、保持を一貫して促進した（ｐ＜０．０１）（図１３）。ニコチン投与は、突然変異マウスでは全く効力が無かった。興味深いことに、保持潜時は、突然変異体マウスについての方が、その非突然変異体で賦形剤注入された同胞よりも有意に高いものであった（ｐ＜０．０５）（図１４）。
【０１０５】
痛覚閾値が低下したか又は情動性が増大した動物においては、受動的忌避試験での保持の増加が観察できる。したがって、この実験に関与した全てのマウスについて、挙動試験を更に行った。突然変異体マウスは、足部衝撃に対する尻込み、発声又は跳躍応答について、その非突然変異体同胞との相異を示さなかった。１５分間２コンパートメント式装置内での探査活動を測定することによって、情動性を試験した21,22 。暗いコンパートメント内で過ごした平均時間；暗いコンパートメント内での歩行活動及びコンパートメント間の移動は、突然変異体と野生型マウスの間で異なっていなかった。したがって、痛覚感受性の変化も情動性の変化も、受動的忌避試験において見られた保持潜時の差異を説明することができない。
【０１０６】
低用量のニコチン23又は特異的ニコチンアゴニスト16を用いた研究は、受動的忌避に対するニコチンの効果を、脳内の高親和性ｎＡＣｈＲが媒介することを、示唆している。したがって、β2 −／−マウスには高親和性結合部位が欠如していることから、ニコチンが、この試験についてのβ2 −／−マウスの能力を変えることはできない。しかしながら、野生型マウスに比べての突然変異マウスの能力の向上は、かなり驚くべきものである。β2 −サブユニット突然変異の逆説的効果についてはいくつかの説明を提案することができる。１つの仮説は、ニコチン注入が、脱感作ひいてはｎＡＣｈＲの不活化の結果として受動的忌避についての野生型マウスの能力を向上させ、試験に対する能力の向上が導かれる、というものである。
【０１０７】
したがって、受容体の欠如したマウスの挙動は、受容体が脱感作されたマウス24の挙動を模擬していると考えられる。もう一つの可能性は、ｎＡＣｈＲが少なくとも２つの経路に存在して、反応の効果と相互作用して、受動的忌避において測定された行動を起こさせるというものである。一つの経路がもう一つの経路に比べて、生理学的により活性であるならば、不活性経路は、野生型動物におけるニコチン注入により優先的に刺激され、一方より活性な経路は、β2 −遺伝子の不活化により優先的に影響されることになる。
【０１０８】
上述の実験は、β2 −サブユニットを含むｎＡＣｈＲが、特異的学習タスクという、受動的忌避に対するニコチンの効果を媒介することを証明している。これらのマウスは、ＣＮＳにおけるニコチンの薬理的効果を研究するためのモデルシステムを提供しており、ニコチン系の欠乏が関与する認知プロセス、ニコチン嗜癖、及び痴呆における高親和性ｎＡＣｈＲの役割を解明する上で有用である。
【０１０９】
参考文献
以下の各参考文献は、参考のため、本明細書に、特に記載する。
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【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、β2 −サブユニット遺伝子のイニシエーターＡＴＧをとり囲む領域のヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、β2 −サブユニットｍＲＮＡの５’末端のマッピングを示す。
【図３】図３は、in vitroでのβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現を示す。
【図４】図４は、トランスジェニックマウスにおけるβ2 −サブユニットプロモーターの細胞特異的発現を示す。
【図５】図５は、トランスジェニックマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。
【図６】図６は、β−サブユニットプロモーターの５’末端欠失を含むルシフェラーゼ融合遺伝子の発現を示す。
【図７】図７は、ゲルシフト実験を示す。
【図８】図８は、ニューロンｎＡＣｈＲのβ2 −サブユニットをコードする遺伝子の分断を示す。
【図９】図９は、in situ におけるハイブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。
【図１０】図１０は、in situ におけるハイブリダイゼーション及びトリチウム化ニコチン結合を用いた、マウス脳におけるニューロンｎＡＣｈＲのマッピングを示す。
【図１１】図１１は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパッチクランプ記録を示す。
【図１２】図１２は、β2 ＋／＋マウス及び−／−マウスのＭＨｂ及び前側視床におけるニコチン誘発電流のパッチクランプ記録を示す。
【図１３】図１３は、受動忌避試験におけるβ2 −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。
【図１４】図１４は、受動忌避試験におけるβ2 −／−マウス及びそれらの野生型同胞種の能力を示す。
【図１５】図１５は、β2 −サブユニット遺伝子及びプロモーターの全部又は一部を含むファージ及びプラスミドを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１
【表１】
に示す配列及び緊縮条件下にＤＮＡにハイブリダイズする配列から実質的になる、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットのプロモーターを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用的に連鎖した請求項１記載のＤＮＡを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが、レポーター遺伝子である請求項２記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
レポーター遺伝子が、ＬａｃＺ又はルシフェラーゼである請求項３記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１又は２のヌクレオチド配列並びに緊縮条件下に核酸にハイブリダイズする配列に対して相補的な単離された核酸。
【請求項６】
請求項１の表１の約−２４５〜約−９５の配列から実質的になる、プロモーターとして作用する単離されたＤＮＡ。
【請求項７】
配列が、請求項１の表１の約−２４５〜約−８２４の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項８】
配列が、請求項１の表１の約−１３５〜約−１０３の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項９】
配列が、請求項１の表１の約＋１６〜約＋３６の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】
配列が、請求項１の表１の約−１１２５〜約−８２５の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１記載のヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項２のヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項９又は１０記載のベクターを含む形質転換有機体。
【請求項１４】
腫瘍形成性、腫瘍発生性又は不死化性の遺伝子に作用的に連鎖した請求項１のＤＮＡを含む配列を有する単離されたＤＮＡ。
【請求項１５】
すべての生殖細胞及び体細胞が請求項２記載のＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、ＤＮＡがその哺乳動物又はその哺乳動物の祖先に胚段階で導入されている哺乳動物。
【請求項１６】
請求項１５記載の哺乳動物から細胞を単離する、哺乳動物細胞をin vitroにおいて培養する方法。
【請求項１７】
マウスである請求項１５記載の哺乳動物。
【請求項１８】
哺乳動物がマウスである請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットの少なくとも１個のエキソンをコードする、クローニングされたゲノムＤＮＡ配列。
【請求項２０】
マウスニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットのためのゲノムＤＮＡクローンを単離する方法であって、マウスゲノムＤＮＡライブラリを用意し、適当な条件下に、別の哺乳動物種から得たニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットをコードするＤＮＡプローブをハイブリダイズすることを含む方法。
【請求項２１】
プラスミドｐＳＡ９。
【請求項２２】
プラスミドｐＥＡ５。
【請求項２３】
ファージλβ２ ｎＡＣｈＲ。
【請求項２４】
請求項１又は１９記載の配列から実質的になる核酸プローブ。
【請求項２５】
請求項１又は１９記載のＤＮＡ及びタンパク質を含む巨大分子複合体。
【請求項２６】
転写的に活性なタンパク質を測定又は同定する方法であって、請求項１又は１９記載のＤＮＡを、核抽出物とともに、適当な条件下にインキュベートする方法。
【請求項２７】
ＤＮＡが、オリゴヌクレオチドＥ−Ｄ、Ｍｕｔ−Ｅ又はＳ−Ｅの配列である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
非ヒト組織からニューロンを単離する方法であって、コードされたタンパク質がレポーター遺伝子であるところの請求項１５記載のトランスジェニック哺乳動物を用意し、そのレポーター遺伝子を発現するニューロンを同定し、レポーター遺伝子を発現するニューロンを他の細胞から分離することを含む方法。
【請求項２９】
非ヒトのトランスジェニック哺乳動物中のニューロンを標的にして所望のポリペプチド、タンパク質又はペプチド生成物を発現する方法であって、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットの遺伝子を、相同組換えにより、哺乳動物のゲノム中の、ＤＮＡ配列によってコードされている所望の生成物をコードするＤＮＡで置き換えることを含む方法。
【請求項３０】
ＤＮＡが点突然変異、欠失、挿入又は他の手段によって変異されたものであり、それにより、トランスジェニック哺乳動物の生化学的測定又は行動的測定により測定されるように、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性が変化している請求項１５記載の哺乳動物。
【請求項３１】
請求項３０記載の哺乳動物から産生されたセルライン。
【請求項３２】
ＤＮＡが点突然変異、欠失、挿入又は他の手段によって変異されたものであり、それにより、トランスジェニック哺乳動物の生化学的測定又は行動的測定により測定されるように、該ＤＮＡから発現されたニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットの活性が変化している請求項１又は１９記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３３】
制限酵素又は機械的せん断によって請求項２３のＤＮＡを切断することによって得ることができる単離されたＤＮＡ断片。
【請求項３４】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする非相同ＤＮＡ配列に作用的に連鎖した請求項１のＤＮＡ又は請求項１のＤＮＡの断片から実質的になるＤＮＡ。
【請求項３５】
ニューロン細胞中の作用的に連鎖したＤＮＡ配列の転写を促進するのに十分な配列を含む請求項３４記載のＤＮＡ。
【請求項３６】
そのゲノム中に、請求項１〜１０のいずれか１項記載のＤＮＡに相当する異質のヌクレオチド配列を含むセルライン。
【請求項３７】
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性を回復する、又は検出可能に生じさせる能力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、請求項３１又は３６記載のセルラインに化合物を加えるか、又は、請求項３０記載の哺乳動物中に化合物を導入することを含む方法。
【請求項３８】
請求項１若しくは１９のＤＮＡ又はそれから誘導されたＤＮＡから本質的になる突然変異組換えＤＮＡであって、β2 −サブユニット遺伝子又はその断片が、適当な発現系及びホストにおける効率的なニコチン性アセチルコリン受容体の発現を妨げるＤＮＡ。
【請求項３９】
野生型又は突然変異ＤＮＡを有する第一の哺乳動物を用意し、該第一の動物を、異なる同一ではないＤＮＡを有する第二の哺乳動物と交配させることによって発生させる請求項１５記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１】
表１
【表１】
に示す配列及び緊縮条件下にＤＮＡにハイブリダイズする配列から実質的になる、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットのプロモーターを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用的に連鎖した請求項１記載のＤＮＡを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが、レポーター遺伝子である請求項２記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
レポーター遺伝子が、ＬａｃＺ又はルシフェラーゼである請求項３記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１又は２のヌクレオチド配列並びに緊縮条件下に核酸にハイブリダイズする配列に対して相補的な単離された核酸。
【請求項６】
請求項１の表１の約−２４５〜約−９５の配列から実質的になる、プロモーターとして作用する単離されたＤＮＡ。
【請求項７】
配列が、請求項１の表１の約−２４５〜約−８２４の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項８】
配列が、請求項１の表１の約−１３５〜約−１０３の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項９】
配列が、請求項１の表１の約＋１６〜約＋３６の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】
配列が、請求項１の表１の約−１１２５〜約−８２５の配列である請求項６記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１記載のヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項２のヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項９又は１０記載のベクターを含む形質転換有機体。
【請求項１４】
腫瘍形成性、腫瘍発生性又は不死化性の遺伝子に作用的に連鎖した請求項１のＤＮＡを含む配列を有する単離されたＤＮＡ。
【請求項１５】
すべての生殖細胞及び体細胞が請求項２記載のＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、ＤＮＡがその哺乳動物又はその哺乳動物の祖先に胚段階で導入されている哺乳動物。
【請求項１６】
請求項１５記載の哺乳動物から細胞を単離する、哺乳動物細胞をin vitroにおいて培養する方法。
【請求項１７】
マウスである請求項１５記載の哺乳動物。
【請求項１８】
哺乳動物がマウスである請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットの少なくとも１個のエキソンをコードする、クローニングされたゲノムＤＮＡ配列。
【請求項２０】
マウスニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットのためのゲノムＤＮＡクローンを単離する方法であって、マウスゲノムＤＮＡライブラリを用意し、適当な条件下に、別の哺乳動物種から得たニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットをコードするＤＮＡプローブをハイブリダイズすることを含む方法。
【請求項２１】
プラスミドｐＳＡ９。
【請求項２２】
プラスミドｐＥＡ５。
【請求項２３】
ファージλβ２ ｎＡＣｈＲ。
【請求項２４】
請求項１又は１９記載の配列から実質的になる核酸プローブ。
【請求項２５】
請求項１又は１９記載のＤＮＡ及びタンパク質を含む巨大分子複合体。
【請求項２６】
転写的に活性なタンパク質を測定又は同定する方法であって、請求項１又は１９記載のＤＮＡを、核抽出物とともに、適当な条件下にインキュベートする方法。
【請求項２７】
ＤＮＡが、オリゴヌクレオチドＥ−Ｄ、Ｍｕｔ−Ｅ又はＳ−Ｅの配列である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
非ヒト組織からニューロンを単離する方法であって、コードされたタンパク質がレポーター遺伝子であるところの請求項１５記載のトランスジェニック哺乳動物を用意し、そのレポーター遺伝子を発現するニューロンを同定し、レポーター遺伝子を発現するニューロンを他の細胞から分離することを含む方法。
【請求項２９】
非ヒトのトランスジェニック哺乳動物中のニューロンを標的にして所望のポリペプチド、タンパク質又はペプチド生成物を発現する方法であって、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットの遺伝子を、相同組換えにより、哺乳動物のゲノム中の、ＤＮＡ配列によってコードされている所望の生成物をコードするＤＮＡで置き換えることを含む方法。
【請求項３０】
ＤＮＡが点突然変異、欠失、挿入又は他の手段によって変異されたものであり、それにより、トランスジェニック哺乳動物の生化学的測定又は行動的測定により測定されるように、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性が変化している請求項１５記載の哺乳動物。
【請求項３１】
請求項３０記載の哺乳動物から産生されたセルライン。
【請求項３２】
ＤＮＡが点突然変異、欠失、挿入又は他の手段によって変異されたものであり、それにより、トランスジェニック哺乳動物の生化学的測定又は行動的測定により測定されるように、該ＤＮＡから発現されたニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ2 −サブユニットの活性が変化している請求項１又は１９記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３３】
制限酵素又は機械的せん断によって請求項２３のＤＮＡを切断することによって得ることができる単離されたＤＮＡ断片。
【請求項３４】
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする非相同ＤＮＡ配列に作用的に連鎖した請求項１のＤＮＡ又は請求項１のＤＮＡの断片から実質的になるＤＮＡ。
【請求項３５】
ニューロン細胞中の作用的に連鎖したＤＮＡ配列の転写を促進するのに十分な配列を含む請求項３４記載のＤＮＡ。
【請求項３６】
そのゲノム中に、請求項１〜１０のいずれか１項記載のＤＮＡに相当する異質のヌクレオチド配列を含むセルライン。
【請求項３７】
ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体の活性を回復する、又は検出可能に生じさせる能力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、請求項３１又は３６記載のセルラインに化合物を加えるか、又は、請求項３０記載の哺乳動物中に化合物を導入することを含む方法。
【請求項３８】
請求項１若しくは１９のＤＮＡ又はそれから誘導されたＤＮＡから本質的になる突然変異組換えＤＮＡであって、β2 −サブユニット遺伝子又はその断片が、適当な発現系及びホストにおける効率的なニコチン性アセチルコリン受容体の発現を妨げるＤＮＡ。
【請求項３９】
野生型又は突然変異ＤＮＡを有する第一の哺乳動物を用意し、該第一の動物を、異なる同一ではないＤＮＡを有する第二の哺乳動物と交配させることによって発生させる請求項１５記載のトランスジェニック哺乳動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
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【図１０】
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【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００８−９９６８６（Ｐ２００８−９９６８６Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５９５３６（Ｐ２００７−２５９５３６）
【出願日】平成１９年１０月３日（２００７．１０．３）
【分割の表示】特願平７−３２６０９４の分割
【原出願日】平成７年１２月１４日（１９９５．１２．１４）
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３日（２００７．１０．３）
【分割の表示】特願平７−３２６０９４の分割
【原出願日】平成７年１２月１４日（１９９５．１２．１４）
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
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