ニワトリＬＩＦタンパク質およびその利用
【課題】 トランスジェニックニワトリを作出するために必須であるニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化阻害因子を供給すること。
【解決手段】 ニワトリＬＩＦタンパク質を安定に発現する細胞株を取得して、当該タンパク質を首尾よく単離および精製し、さらに当該タンパク質を大量生産する。
【解決手段】 ニワトリＬＩＦタンパク質を安定に発現する細胞株を取得して、当該タンパク質を首尾よく単離および精製し、さらに当該タンパク質を大量生産する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリＬＩＦタンパク質を恒常的に得るための原核生物株または真核生物細胞株、ならびに当該細胞株によって産生されるニワトリＬＩＦタンパク質およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物固有の遺伝子の機能解析は、特定の遺伝子が導入された動物、または特定の遺伝子がノックアウトされた動物を作出することによって、飛躍的に進歩した。このような動物、すなわち、トランスジェニック動物は、医学生物学だけでなく広範な研究領域において使用されており、各領域における研究開発に大きな進歩をもたらしている。
【０００３】
ニワトリは、有用な産業動物であり、（１）飼育コストが低い、（２）産子数が多い、（３）卵生であるために胚操作が簡便である、などの理由によって、ウシ、ブタ、ヒツジに代わるトランスジェニック動物の有力な候補として注目されている。トランスジェニックニワトリの作出が可能になれば、有用物質を生産するために、トランスジェニックニワトリを動物工場として用いることができ、応用分野のさらなる広がりが期待できる。
【０００４】
トランスジェニック動物の作出方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するトランスジェニック法、および、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を介する遺伝子導入法が挙げられる。ＥＳ細胞は、ジーンターゲッティング法によってゲノムの特定の位置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすることができることから、現在広く応用されている細胞である。ＥＳ細胞法は、内因性の遺伝子をターゲティングするための強力なツールとして使用されており、ＥＳ細胞法を用いて種々のテーゲティングマウスが作出されている。また、生殖系列によって高頻度に分化する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）法は、ＥＳ細胞法とともに有効な手段であると考えられている。
【０００５】
ＥＳ細胞を用いる場合、遺伝子操作中に細胞分化を抑制することが重要である。ＥＳ細胞を培養する際、フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞を用いるか、または分化を抑制するための因子としてのＬＩＦ（白血病阻止因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を使用する必要がある。
【０００６】
白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、ＩＬ−６ファミリーサイトカインの１つである。ＬＩＦは、マウス骨髄性白血病細胞株Ｍ１をマクロファージへと分化させる因子として同定された（例えば、非特許文献１を参照のこと）。しかし、現在では、マウスＥＳ細胞を未分化状態で維持するために必須のサイトカインであることが知られており（例えば、非特許文献２を参照のこと）、マウスＥＳ細胞培養の簡便化またはトランスジェニックマウスの作出において利用されている。また、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を用いて作製されたマウスまたはヒト由来のリコンビナントＬＩＦタンパク質が市販されている。
【０００７】
マウス以外では、メダカ、ウサギ、ブタ、サルおよびヒトのＥＳ細胞またはＥＧ細胞がこれまでに単離されている。しかし、導入遺伝子を首尾よく生殖系へ導入し得るのはマウスおよびニワトリだけである。また、ニワトリではＥＳ細胞またはＥＧ細胞を首尾よく培養することができず、細胞の安定な系が未だ確立されていない。これまで、マウスＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｍＬＩＦ）またはヒトＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｈＬＩＦ）を種々のサイトカインと組合わせて使用してニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の安定な細胞株を確立しようと試みられているが、未だ達成されていない。
【０００８】
鳥類では、ＬＩＦだけでなく他のＩＬ−６ファミリーサイトカインに関しても解析が進んでいない。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８の相同遺伝子がニワトリにおいて見出されているが、これらは哺乳動物におけるホモログとアミノ酸レベルで２０〜４０％程度の相同性しか有さない。また、哺乳動物由来のＩＬ−１およびＩＬ−２は、その固有の効果をニワトリ細胞に対して発揮することができない（例えば、非特許文献３および４を参照のこと）。
【０００９】
ニワトリＥＳ細胞の培養系を確立することを目的として、本発明者らは、ニワトリのＬＩＦ遺伝子をクローニングし、原核生物宿主を用いて当該遺伝子がコードするタンパク質を組換え発現させた（例えば、特許文献１および非特許文献５を参照のこと）。
【００１０】
具体的には、本発明者らは、ＬＰＳで刺激したニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）を用いたサブトラクション法によって、ニワトリＬＩＦ遺伝子断片を得、この断片の塩基配列からＲＡＣＥ法によって完全長のニワトリＬＩＦ遺伝子をクローニングした。
【００１１】
配列決定したニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡは７８９ｂｐであり、推定２１１アミノ酸からなるＬＩＦタンパク質をコードする。ニワトリＬＩＦは、マウスＬＩＦおよびヒトＬＩＦと比較した場合、アミノ酸レベルでの相同性は３９〜４３％とかなり低いものであったが、６箇所のシステイン残基の位置は完全に保存されていた。また、種々のニワトリ細胞および組織におけるｍＲＮＡの発現解析の結果、ニワトリＬＩＦ遺伝子は、全ての細胞および組織において発現していた。
【００１２】
また、種々のニワトリ細胞および組織におけるニワトリＬＩＦ遺伝子の発現を確認した。さらに大腸菌を用いて作製したニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質が、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を抑制することを確認した。
【特許文献１】特開２００３−９８６９公報（平成１５年１月１４日公開）
【非特許文献１】Ｔｏｍｉｄａ，Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，１０９７８−１０９８２（１９８４）
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６，６８８−６９０（１９８８）
【非特許文献３】Ｋｌａｓｉｎｇ，Ｋ．Ｃ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏ．１１，３８５−３９４（１９８７）
【非特許文献４】Ｓｃｈａｕｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏ．１２，８２３−８３１（１９８８）
【非特許文献５】Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２３），２４５１４−２４５２０（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これまでマウスおよび／またはニワトリのＥＳ細胞の培養には、大腸菌発現系を用いた原核型ｒｍＬＩＦが利用されている。原核型ｒｍＬＩＦは比較的簡便に生産することができるので大量生産されているが、原核型ｒｃｈＬＩＦは、大腸菌発現系では封入体（インクルージョンボディー）を形成してしまうので、タンパク質の精製効率が非常に低く、大量生産することは非常に困難であった。すなわち、ニワトリＬＩＦタンパク質を市場に供給するためには大量生産する必要があるが、大腸菌発現系ではそれが不可能であった。
【００１４】
また、大腸菌によって大量生産を行った場合、ＬＰＳなどのエンドトキシンが混入する危険性が高いので、精製タンパク質の質に致命的な影響を与え、ニワトリＬＩＦタンパク質を胚性幹細胞の培養液中に直接投与して作用させることができなくなる。そのため、大腸菌等の原核生物細胞を宿主細胞として産生させたタンパク質は、非常に厳密で高度な精製を必要とする。
【００１５】
さらに、原核生物細胞を用いて組換え発現させたタンパク質（原核型のリコンビナントタンパク質）においては、翻訳後修飾が起こらない。また、原核型のタンパク質は、正確な立体構造をとらない場合が多い。そのため、翻訳後修飾を必要とする真核生物由来のタンパク質において、その生物活性が制限されていることが多い。また、ニワトリＬＩＦタンパク質において、サイトカインとしての活性発現には糖鎖が重要であると考えられる。
【００１６】
このように、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の培養系を確立するためには、市場に容易に供給することができる程度のｒｃｈＬＩＦを得ること、および所望の生物活性を有するｒｃｈＬＩＦを得ることが必要である。
【００１７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、正しい立体構造を取りかつ糖鎖付加型である真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して取得すること、さらに、真核型ｒｃｈＬＩＦを用いてニワトリＥＳ細胞またはＥＧ細胞の細胞株を確立し、トランスジェニックニワトリを作出することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、公知の大腸菌発現系において独自の創意工夫を重ねることによって、真核型のニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。
【００２４】
本発明に係るポリペプチドにおいて、上記糖鎖がハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースであることが好ましい。
【００２５】
本発明において、上記真核生物宿主がＣＨＯ−Ｋ７細胞またはＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞であることが好ましい。
【００２６】
本発明に係るベクターは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る細胞は、上記のポリペプチドを安定して産生することを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る馴化培地は、上記の細胞を培養することによって得られることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係るポリペプチド生産方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記のポリペプチドを含むことを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の細胞を含むことを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の馴化培地を含むことを特徴としている。
【００３３】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００３４】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。
【００３５】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。
【００３６】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記のポリペプチドを用いることを特徴としている。
【００３７】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。
【００３８】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の馴化培地を用いることを特徴としている。
【００３９】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００４０】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。
【００４１】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。
【００４２】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記のポリペプチドとともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４３】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記の細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４４】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記の馴化培地とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４５】
本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドに特異的に結合することを特徴としている。
【００４６】
本発明に係る抗体は、配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴としている。
【発明の効果】
【００４７】
本発明を用いれば、物理化学的に安定なニワトリＬＩＦタンパク質を安定して供給することができる。また、本発明を用いれば、これまで困難であったニワトリの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）の未分化状態をより効率よく維持させて、安定な細胞株を樹立することができる。さらに本発明を用いれば、トランスジェニックニワトリを作出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
上述したように、本発明者らは、独自の創意工夫を重ねることによって、真核型のニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。
【００４９】
以下、本発明に係るポリペプチド、およびその利用について詳述する。
【００５０】
（１）ポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００５１】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００５２】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、および真核生物宿主（例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００５３】
１つの局面において、本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＬＩＦ活性」は、初期胚由来の細胞の未分化状態を維持する活性、特に、ＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を阻害する活性が意図される。本発明に係るポリペプチドは、特に、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を阻害することが好ましい。マウスまたはヒト由来のＬＩＦタンパク質は、ニワトリ胚由来の細胞に対して実用的なＬＩＦ活性を有さない。
【００５４】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００５５】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつＬＩＦ活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号１に示される塩基配列の７５〜７０７位からなるポリヌクレオチドによってコードされ、シグナル配列（配列番号１に示される塩基配列の７５位〜１４６位によってコードされる配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２４位）を含む。ＬＩＦ活性を有する成熟型のポリペプチドは、当該シグナル配列が切断された形態（配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）であるが、本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」に包含される。
【００５７】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００５８】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５９】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのＬＩＦ活性を変化させない。
【００６０】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００６１】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００６２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＬＩＦ活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００６３】
１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００６４】
他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００６５】
別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００６８】
さらに別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００６９】
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
【００７０】
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【００７１】
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００７２】
さらなる実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドは、特定の糖鎖が付加されていることによって、物理化学的に安定でありかつ生物活性が高い。好ましい糖鎖としては、ハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースが挙げられる。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号［ ］によって示される細胞（寄託手続き中）によって産生されることを特徴としている。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、上記細胞より分泌された成熟形態のｒｃｈＬＩＦである。成熟形態ｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号５に示される塩基配列からなる）。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号［ ］によって示される細胞によって産生されることによって、常に一定条件で、均質なタンパク質として精製することができる。
【００７４】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００７５】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００７６】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。
【００７７】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【００７８】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００７９】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されてもよい。
【００８０】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【００８１】
下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物、培養キットまたは培養方法において有用である。
【００８２】
このように、本発明に係るポリペプチドは、ニワトリ胚細胞の未分化状態を維持することができるポリペプチドであって、少なくとも、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるかまたはその活性を保持した変異体であればよいといえる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００８３】
つまり、本発明の目的は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＬＩＦ活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００８４】
（２）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００８５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００８６】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（または数百個以上）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。
【００８８】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００８９】
別の局面において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体にハイブリダイズすることが好ましい。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００９０】
別の局面において、本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９１】
本発明に係るオリゴヌクレオチドがＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のｖｈｄ遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）ｖｈｄ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるｖｈｄのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００９２】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００９３】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００９４】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００９５】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ＩＮ２４（ニワトリ単核球白血病細胞株）、肝臓、または胸腺のような生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。
【００９６】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。
【００９７】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたはＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるＬＩＦ活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００９８】
つまり、本発明の目的は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００９９】
（３）本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
（Ａ）ベクター
本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを産生するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ｐＧＥＸ、ｐＳｅｃＴａｇ２などが好ましい。例えば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１００】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１０１】
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１０２】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【０１０３】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢなどの薬剤耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養については、カナマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリンまたはアンピシリンなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。ニワトリ由来の細胞を用いる場合は、ジェネティシンまたはネオマイシンは適しておらず、Ｚｅｏｃｉｎが好ましい。
【０１０４】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１０５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ニワトリ由来の培養細胞（ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞、ＬＭＨ細胞）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などを挙げることができるが、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞が好ましい。
【０１０６】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１０７】
本発明に係るベクターを使用して上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【０１０８】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む真核細胞発現用ベクターであればよいといえる。
【０１０９】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する真核細胞発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した真核細胞発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１０】
（Ｂ）形質転換体
本発明は、上述したＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【０１１１】
本発明に係る形質転換体は、上述したＬＩＦ活性を有するポリペプチドが発現されることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましい。
【０１１２】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを、ポリペプチドが発現され得るように真核生物中に導入することによって取得される。好ましくは、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを安定して発現する細胞である。最も好ましくは、本発明に係る形質転換体は、受託番号［ ］によって示される細胞である。受託番号［ ］によって示される細胞より分泌されたｒｃｈＬＩＦは成熟形態である。成熟形態ｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号５に示される塩基配列からなる）。本発明に係るポリペプチドを安定的に発現する細胞は、ＥＳ細胞またはＥＧ細胞を培養する際のフィーダー細胞として使用することができる。
【０１１３】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【０１１４】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るベクターを用いることを特徴とする。
【０１１５】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、真核生物宿主を用いる組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１１６】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本発明に係るポリペプチドは、成熟形態で細胞から分泌されるので、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞の培養上清から回収することができる。好ましい細胞としては、受託番号［ ］によって示される細胞が挙げられる。このような細胞を用いる場合、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、培養上清を回収する工程を包含する。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含してもよい。
【０１１８】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１１９】
つまり、本発明の目的は、真核生物宿主を用いてＬＩＦ活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１２０】
（Ｄ）培養組成物、培養キットまたは培養方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を含む培養組成物を提供する。本発明に係る培養組成物は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞が、培養培地中に含まれる形態であっても、必要に応じて培養培地に添加される形態であってもよい。本発明に係る培養組成物に含まれるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。本明細書中で使用される場合、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地自体もまた培養組成物に包含される。
【０１２１】
本発明に係るポリペプチドを含む培養組成物は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。
【０１２２】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備える培養キットを提供する。本発明に係る培養キットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係る培養キットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２３】
本発明に係るポリペプチドを備える培養キットは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係る培養キットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。
【０１２４】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いる培養方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を培養培地中に添加する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２５】
本発明に係るポリペプチドを用いる培養方法は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係る培養方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。
【０１２６】
（Ｅ）トランスジェニックニワトリを作出するためのキットおよび方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備えるトランスジェニックニワトリを作出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係るキットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２７】
本発明に係るキットは、トランスジェニックニワトリを作出する際に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の未分化状態を維持するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係るトランスジェニックニワトリを作出するためのキットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。
【０１２８】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いてトランスジェニックニワトリを作出するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２９】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、トランスジェニックニワトリを作出する際に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともに培養してこれらの細胞の未分化状態を維持することが好ましい。本発明に係るトランスジェニックニワトリを作出するための方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。
【０１３０】
トランスジェニックニワトリを作出するためには、ニワトリの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）を首尾よく継代培養しなければならない。ニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞について、従来の培養方法は、トランスジェニックニワトリを作製するには大きな問題点を有する。具体的には、ＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞について、公知のいずれの培養方法を用いて培養しても全能性（生殖系列（精子または卵子）に分化する能力）を維持しているのは初代培養時のみであり、継代培養後は全能性を消失している。このことは、ＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞へ遺伝子を導入した後、継代培養を経てトランスジェニックニワトリを作出することが不可能であることを示す。
【０１３１】
ニワトリＥＳ様細胞を培養する方法を以下に示す。
【０１３２】
４．５ｇ／ＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ） ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基本培地とし、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、２％ニワトリ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１μＭの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノールとともに、サイトカインを添加した培地を用いる。添加するサイトカインとしては、従来、ＦＧＦ２（１ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＧＦ−１（１〜５ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＳＣＦまたはマウスＳＣＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、マウスＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）（必要に応じてさらに哺乳類由来のＩＬ−６ファミリーサイトカイン数種、可溶型ＩＬ−６受容体など）が用いられているが、これらの代わりに、またはこれらに加えて、本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｒｃｈＬＩＦタンパク質）を用い、以下の手順に従って培養を行う：
１．放卵直後の受精卵から濃厚卵白を取り除き、胚を上向きに置く。
２．胚が中央に位置するように濾紙で作製したリングをかぶせ、リングの外枠に沿ってはさみで胚をカットする。
３．濾紙リングに張り付いた胚をピンセットで取り出し、卵黄のついた方を上にしてＰＢＳ中に置き、卵黄を丁寧に取り除く。
４．胚の明領域（中心部分）を直径２〜３ｍｍのピペット等で抜き、抜いた細胞塊を回収する。
５．低濃度のトリプシン等で細胞塊をばらばらにする。
６．１０５×細胞／ｃｍ２の割合で上記培養液中に細胞を播き、７．５％ＣＯ２条件下にて３７℃で培養する。
７．細胞の状態を確認しながら３〜６日毎に培地交換を行う。
８．ＳＳＥＡ−１もしくはＥＭＡ−１の抗原が発現維持されているか否か、またはアルカリフォスファタ-ゼ活性によって、胚の未分化状態が維持されているか否かを判断する。
【０１３３】
ニワトリＥＧ様細胞を培養する方法を以下に示す。
【０１３４】
４．５ｇ／ＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ） ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅを基本培地とし、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、２％ニワトリ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１μＭの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール、２０μｇ／ｍＬ ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎとともに、サイトカインを添加した培地を用いる。添加するサイトカインとしては、従来、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ−１１（０．０４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＳＣＦまたはマウスＳＣＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、マウスＬＩＦ（５〜１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）が用いられているが、これらの代わりに、またはこれらに加えて、本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｒｃｈＬＩＦタンパク質）を用いて培養を行う。
【０１３５】
ニワトリＥＧ様細胞の培養には孵卵２．５日ごろに胚血液中に存在する循環始原生殖細胞（ｃＰＧＣ）または孵卵５〜５．５日ごろに生殖原基に到達した生殖腺始原生殖細胞（ｇＰＧＣ）の利用が行われているが、培養が可能と報告されているのはｇＰＧＣである。以下にその手順を述べる：
１，孵卵５日ごろの受精卵から生殖原基に相当する部分を取り出す。
２．０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で生殖原基をばらばらにし、５％ＣＯ２条件下、上記培地中にて３７℃で７〜１０日間培養する。
３．緩やかなピペッティング操作でＥＧ様細胞のコロニーを回収し、先に培養しておいたニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上にて、上記培地中、５％ＣＯ２条件下にて３７℃で７〜１０日間培養する。
４．ＳＳＥＡ−１もしくはＥＭＡ−１の抗原が発現維持されているか否か、またはＰＡＳ染色陽性であるか否かによって、胚の未分化状態が維持されているか否かを判断する。
【０１３６】
トランスジェニックニワトリを作出するためには、遺伝子を導入した後少なくとも４〜５代の継代が可能なニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞を得る必要がある。本発明に係る真核型のニワトリＬＩＦポリペプチド（ｒｃｈＬＩＦ）は、マウスＬＩＦタンパク質（ｒｍＬＩＦ）よりも効果が明らかに高い。このようなｒｃｈＬＩＦを用いることによって、添加サイトカインを減らすことが可能であり、真核型ニワトリＬＩＦをベースにした全能性維持および生殖系列への分化能維持を実現することができる培地および培養方法を開発することができる。また、このような培地および培養方法を用いる、有用遺伝子を導入した後のニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞の継代培養時において、組み込まれた遺伝子が相同遺伝子組み換えで導入されていることを確認し、選抜されたＥＳ細胞またはＥＧ細胞をニワトリ胚に戻して、キメラを作出する。さらに、戻し交配を行えば、トランスジェニックニワトリを得ることができる。
【０１３７】
（Ｆ）抗体
本発明は、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。より詳細には、本発明に係る抗体は、ニワトリＬＩＦタンパク質には結合するがマウスＬＩＦタンパク質には結合しない。
【０１３８】
一実施形態において、本発明に係る抗体は、ＬＩＦタンパク質依存的なＳＴＡＴ３活性化を阻害することができる。すなわち、本実施形態に係る抗体は、ＬＩＦ活性を阻害することができる。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１３９】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【０１４０】
〔実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
本発明者らは、非特許文献５に記載の方法に従って、原核型のｒｃｈＬＩＦを精製した。原核型のＬＩＦは、図１に示すような塩基配列およびアミノ酸配列を有する。図２には、ニワトリＬＩＦアミノ酸配列をヒトまたはマウスのＬＩＦアミノ酸配列と比較した。
【０１４１】
原核型のｒｃｈＬＩＦを、電気泳動によって分離した後、ゲルをＣＢＢ染色によって可視化した（図３）。その結果、原核型ｒｃｈＬＩＦは、純度が９０％以上であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１９ｋＤａのおおよその分子量を有することがわかった（１ｍＬ培養から１〜５μｇ）。
【０１４２】
〔実施例２：ＣＨＯ細胞におけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
使用した真核生物細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を図４に示す。このベクターは分泌シグナルとしてＩｇκ鎖リーダー配列と、検出精製用タンパクとしてＣ末にはｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンＴａｇとが付加されている。なお、本実施形態において、真核型ｒｃｈＬＩＦの発現実験にｐＳｅｃＴａｇ２Ａを利用したが、他のベクターも利用可能であることを当業者は容易に理解する。
【０１４３】
ＬＰＳで刺激したＩＮ２４細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートとして、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するプライマー（ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＧ：配列番号７）およびＸｈｏＩ部位を有するプライマー（ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡ：配列番号８）を用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、シグナルペプチドを有さない成熟型のニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいない。このｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＬＩＦｍｈ）を作製した。このベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクション法を用いて導入した。リポフェクション法は、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ含有培地中で培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定して保有する細胞（すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローニングした細胞を数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株を得た。
【０１４４】
真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株をＺｅｏｃｉｎ含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（φ２２ｎｍ）によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。Ｈｉｓ−Ｔａｇタンパク質の精製にはＰｒｏＢｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１ｍＬのレジンに対して４０ｍＬの培養上清を吸着させ、レジンの４倍量の洗浄液で８回洗浄した後、溶出した（レジンと等量の溶出液×１０回）。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルの銀染色および抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）（または抗ｔａｇ抗体）を用いたイムノブロッティング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）については、以下の実施例７で詳述する。
【０１４５】
回収したタンパク質をＰＢＳで透析した。タンパク質量を定量した後、液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。また、精製した真核型ｒｃｈＬＩＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した（図７）。真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、１ｍＬ培養上清中０．５μｇの真核型ｒｃｈＬＩＦを産生した。
【０１４６】
〔実施例３：ニワトリ細胞におけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
ニワトリ細胞を用いて取得したｒｃｈＬＩＦは、ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦより活性が強いことが期待されるので、ニワトリ細胞株に真核型ｒｃｈＬＩＦを産生させることを試みた。
【０１４７】
ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩｇκ鎖リーダー配列、ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンＴａｇの部分を全て配列番号３および図５に示した塩基配列に置き換えて挿入したベクターを構築した（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈ）。この塩基配列から翻訳される真核型ｒｃｈＬＩＦのアミノ酸配列を配列番号４および図５に示す。配列番号３および図５に示した塩基配列は、ニワトリ細胞株に真核型ｒｃｈＬＩＦを発現させ、分泌された真核型ｒｃｈＬＩＦの精製が簡便であるように、開始コドンおよびリーダー配列を含むニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列全長の終始コドンの直前に６×ヒスチジンタグの塩基配列を付加している。図５に示すように、このアミノ酸配列中のリーダー部分（図中下線部）はニワトリ細胞中の翻訳後修飾により切断され、リーダー部分が除かれた形態で真核型ｒｃｈＬＩＦが細胞外に分泌される。配列中には原核型にはない糖鎖が付加されることが予想される領域を示す。
【０１４８】
ニワトリ細胞株としては、ＬＭＨ細胞が、組換え発現系によく使用されている。ＬＭＨ細胞は市販されており、増殖力が強いため培養が容易であり、遺伝子導入効率も高いので、タンパク質の強制発現などによく使われている（エストロジェンレセプター強制発現ＬＭＨ株はＡＴＣＣより市販されており、ホルモン応答研究などで広く使われている）。ＬＭＨ細胞を用いてｒｃｈＬＩＦを取得することを試みたが、ニワトリＬＩＦ発現ベクターを導入してｒｃｈＬＩＦを強制発現させるとＬＭＨ細胞の死滅が生じ、どのような工夫を重ねてもｒｃｈＬＩＦを安定的に産生する細胞株を得ることができなかった。
【０１４９】
ＬＭＨ細胞以外にニワトリ由来の接着系細胞株としてＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞が知られている。しかし、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は市販されておらず、増殖力が弱く、細胞培養が難しく、遺伝子導入効率が低いという欠点を有する。遺伝子導入効率が低く増殖力も弱い細胞は組換え発現には適さないことは当業者には明らかであり、実際、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を用いてタンパク質を強制発現させた報告は皆無であった。よって、ニワトリＬＩＦ組換えタンパク質をニワトリ由来の細胞から取得することは一見不可能であった。
【０１５０】
本発明者らは、ＬＭＨ細胞の死滅の原因がｒｃｈＬＩＦの生物活性（すなわち、文化抑制作用）に起因すると考え、ＬＭＨなど分化程度の高い細胞の利用は難しいが、ニワトリ初期胚線維芽細胞由来であるＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、培養条件を首尾よく設定すれば、ＬＩＦ発現依存的な細胞の死滅が生じることなく、ＬＩＦ強制発現下でも正常に増殖するのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を用いてｒｃｈＬＩＦの取得を試みた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２は、ＬＭＨ細胞など他のニワトリ培養細胞株よりも増殖力および遺伝子導入効率がはるかに劣るため、培養およびクローニングを行なうために試行錯誤を重ねた。しかし、本発明者らは、培養条件等工夫を重ねることによってｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＣＣ−ＯＵ２株を得ることに成功した（図６）。
【０１５１】
具体的には、ＬＰＳで刺激したＩＮ２４細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートとして、５’末端にＮｈｅＩ部位を有するプライマー（ＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣ：配列番号９）およびＥｃｏＲＩ部位を有するプライマー（ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧ：配列番号１０）を用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、シグナルペプチドを有するニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。このｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）周辺のＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈ）を作製した。このベクターをＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞にリポフェクション法を用いて導入した。リポフェクション法は、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ含有培地中で培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定して保有する細胞（すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローニングした細胞を数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株を得た。
【０１５２】
その結果、上述した培養条件下では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ｒｃｈＬＩＦを強制発現させても死滅しなかった。
【０１５３】
具体的には、上述したｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈをニワトリＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株にリポフェクション法により導入した。導入後に細胞をＺｅｏｃｉｎ含有培地を用いて培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定に保有する細胞（ベクターを安定に保有する）を選択した。その際、一過性の発現が終了した細胞の死滅が起こり、生細胞の密度は著しく低下し、最終的には、単独の細胞がディッシュに点在する程度となる。通常このような低密度でのＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の培養は困難であり、次第に分裂能を失い死滅する。そこで、９０％馴化培地による培地交換を週一回程度行い、継代は月一度程度にまで控えた。継代の際のトリプシン処理はできるだけ短時間（３分程度）とし、細胞回収のための遠心分離も１０００ｒｐｍで３分間程度と、できるだけ細胞にダメージが加わらないようにした。このようにして数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株（すなわち、導入遺伝子を安定に保有する細胞）を選択し、コロニークローニングによってクローニングした。樹立した真核型ｒｃｈＬＩＦ産生細胞株を、常法に従って−８０℃で凍結保存した。
【０１５４】
タンパク質に付加したＨｉｓ−Ｔａｇを利用して、ニッケルカラムによりタンパク質を精製した。具体的には、真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株をＺｅｏｃｉｎ含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（φ２２ｎｍ）によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。Ｈｉｓ−Ｔａｇタンパク質の精製にはＰｒｏＢｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１ｍＬのレジンに対して４０ｍＬの培養上清を吸着させ、レジンの４倍量の洗浄液で８回洗浄した後、溶出した（レジンと等量の溶出液×１０回）。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルの銀染色および抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）（または抗ｔａｇ抗体）を用いたイムノブロッティング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。
【０１５５】
回収したタンパク質をＰＢＳで透析した。タンパク質量を定量後、液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。また、精製した真核型ｒｃｈＬＩＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した（図７）。真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、増殖速度は遅いが、真核型ｒｃｈＬＩＦの大量調製が可能となった（１ｍＬ培養上清から５μｇ）。
【０１５６】
図７に示すように、真核型ｒｃｈＬＩＦは、ＣＨＯ産生またはＣＨＣＣ−ＯＵ２産生のいずれもが原核型ｒｃｈＬＩＦよりも泳動度が遅く、複数のバンドとして検出された。
【０１５７】
次に、抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）を用いたウエスタンブロッティング法により、ｒｃｈＬＩＦを検出した。具体的には、１００ｎｇ／レーンのタンパク質を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１８０ｍＶで３時間の条件下でＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写した。このメンブレンを、５％脱脂粉乳中にて室温で１時間ブロッキングした後、一次抗体（上述した抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２））とともに４℃で一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、二次抗体（ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇ抗体）とともに室温で１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（アマシャム）を用いて目的のバンドを検出した。その結果、図８に示したように、ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦは２０〜３７ｋＤａの間に、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦは１９〜３０ｋＤａの間に、いずれも数本のバンドとして検出された。これは、糖鎖の付加の状況が異なることに起因して異なる分子量の真核型ｒｃｈＬＩＦが産生されていることを示す。
【０１５８】
〔実施例４：真核型ニワトリＬＩＦタンパク質における糖鎖付加〕
１００ｎｇ／レーンのタンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１８０ｍＶで３時間の条件下でＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写した。このメンブレンをメタノールで処理した後、ＴＢＳで洗浄した。次いで、ＴＢＳ中５％のＢＳＡを用いて、このメンブレンを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ中１％のレクチン液とともに室温で１時間インキュベートした。レクチンとしては、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｌｅｃｔｉｎ Ｋｉｔ Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、レクチンが特異的に結合したバンドを検出した。
【０１５９】
レクチン（ＣｏｎＡ、ＲＣＡ、ＷＧＡ）染色を行った結果を図９に示す。図９に示したように真核型ｒｃｈＬＩＦが特異的に染色された。
【０１６０】
この結果より、全ての真核型ｒｃｈＬＩＦはハイマンノース型Ｎ結合の糖鎖、バイセクティングＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸を有すること（ＣｏｎＡ、およびＷＧＡ）、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦはβ結合ガラクトースを有すること（ＲＣＡ）が示された。以上の結果から、真核型ｒｃｈＬＩＦは、糖鎖付加において、ＣＨＯ産生系とニワトリ細胞産生系との間で異なることがわかった。
【０１６１】
〔実施例５：種々のｒｃｈＬＩＦの生物活性〕
ｒｃｈＬＩＦの生物活性はニワトリＥＳ細胞（ニワトリ胚盤葉細胞）の未分化状態を維持する活性として測定することができる。
【０１６２】
精製した真核型ｒｃｈＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）をニワトリＥＳ細胞の培養系に添加して８日間培養した。ＬＩＦ非添加の条件下では、ニワトリＥＳ細胞は嚢胞性胚葉体を形成し未分化状態が維持されない（図１０−１）。原核型ｒｃｈＬＩＦを添加した条件下では、ニワトリＥＳ細胞は未分化状態を７日間維持したが、培養８日目には嚢胞性胚葉体が出現した（図１０−２）。ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦ添加の条件下では、小型の嚢胞性胚葉体が多数検出され、未分化状態が維持されていない（図１０−３）。これらに対して、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦ添加の条件下では、ニワトリＥＳ細胞が８日間の培養後も未分化状態を維持し、かつ嚢胞性胚葉体がほとんど形成されていないことがわかった（図１０−４）。
【０１６３】
以上の結果は、ニワトリＥＳ細胞の培養にはｒｃｈＬＩＦであれば効果（未分化状態の維持）を奏するが、原核型ｒｃｈＬＩＦよりも真核型ｒｃｈＬＩＦの方がより好ましく、特にニワトリ細胞が産生する真核型ｒｃｈＬＩＦが最も効果が高いことを示す。また、原核型ｒｃｈＬＩＦよりも真核型ｒｃｈＬＩＦの方がニワトリＥＳ細胞の未分化状態を長く維持することがわかった。
【０１６４】
〔実施例６：種々のｒｃｈＬＩＦの安定性〕
これまでの結果からニワトリＥＳ細胞の培養系にニワトリ細胞株が産生した真核型ｒｃｈＬＩＦの効果が高いことがわかった。そこで次に糖鎖付加によるタンパク質の安定性の試験を行った。原核型ｒｃｈＬＩＦおよび真核型ｒｃｈＬＩＦを高温（５０℃または８０℃）で６時間保温した場合、さらに、酸性（ｐＨ２．８）またはアルカリ性（ｐＨ１０．６）で６時間室温インキュベートして、リコンビナントタンパク質分解の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。また各処理条件による生物活性の変化をニワトリＥＳ細胞培養系へ添加して調べた。
【０１６５】
その結果、図１１に示したように原核型ｒｃｈＬＩＦでは８０℃の熱処理とアルカリ処理でバンドの減少が確認された。また真核型ｒｃｈＬＩＦでは８０℃処理により低分子のバンドの減少が認められたがそれ以外にバンドの減少は認められず、種々の処理に対して真核型ｒｃｈＬＩＦは極めて安定であることがわかった。
【０１６６】
次に、原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦをニワトリＥＳ細胞の培養系に２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して嚢胞性胚葉体の出現を指標にＬＩＦの生物活性を測定した。
【０１６７】
その結果、図１２に示したように、原核型ｒｃｈＬＩＦを使用した場合には多数の嚢胞性胚葉体の出現が認められたが、真核型ｒｃｈＬＩＦを使用した場合にニワトリＥＳ細胞は、円形のコロニーを形成したまま嚢胞性胚葉体の出現は全く認められなかった。以上の結果は、真核型ｒｃｈＬＩＦはその生物活性においても種々の処理に対して極めて安定であることを示している。
【０１６８】
〔実施例７：ニワトリＬＩＦタンパクに対する抗体〕
原核型ニワトリＬＩＦタンパク質全長を免疫原として抗ＬＩＦ抗体を作製した。免疫原はフロイントアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後２週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の３日前に行ない、尾静脈注射による免疫を行った。
【０１６９】
マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、得られた抗体は、マウスＬＩＦタンパク質とニワトリＬＩＦタンパク質との間の交差反応を示さなかった。
【０１７０】
上述の実施例で示したように、胚盤葉細胞に対する生物活性および／またはＳＴＡＴ３のリン酸化において、ｒｃｈＬＩＦとｒｍＬＩＦとの間で違いがあることが明らかである。この違いは、両者間のアミノ酸配列が大きく異なることに起因し、その結果、リガンド／レセプター相互作用が異なっていることが考えられる。そこで、ＬＩＦにおけるリガンド／レセプター相互作用に関連する領域を解析することを目的として、ｒｃｈＬＩＦとレセプターとの結合に関与することが予想される領域（すなわち、ｒｃｈＬＩＦの親水性領域）に対する抗体を作製した。
【０１７１】
具体的には、シグナルペプチドを除いた成熟型ニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸第２３〜３５位（ＥＱＴＲＲＱＶＡＬＬＮＡＴ：配列番号１１）、第９６〜１１１位（ＧＮＩＴＲＤＱＥＥＬＮＰＭＡＫＥ：配列番号１２）、または第１４８〜１６４位（ＧＬＩＳＮＬＴＣＬＬＣＫＨＹＮＩＦ：配列番号１３）からなる合成ペプチドとキャリアータンパク質（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ，Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標） Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ，ＰＩＥＲＣＥ）との複合体を免疫原とした。免疫原は水酸化アルミニウムゲルアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後２週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の３日前に行い、尾静脈注射による免疫を行った。
【０１７２】
マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、いずれの抗体においてもマウスＬＩＦタンパク質とニワトリＬＩＦタンパク質との間の交差反応は検出されなかった。さらに、これらの抗体は、ｒｃｈＬＩＦ依存的なＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。ｓ
さらに、ニワトリＬＩＦタンパク質全長に対するモノクローナル抗体および上記ペプチドに対するモノクローナル抗体を作製した。四次免疫を行った後、血清中の抗体価が十分上昇したことを確認したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。脾細胞は融合用親株細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と融合させ、ＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）選択培地中で、融合細胞を選択した。ｒｃｈＬＩＦを抗原としたＥＬＩＳＡ法およびウエスタンブロット法（ＷＢ）を用いて、抗ニワトリＬＩＦ抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、限界希釈法によりクローニングを行い、ニワトリＬＩＦタンパク質全長に対するマウス抗ニワトリＬＩＦモノクローナル抗体（ＨＵＬ１）および成熟型ニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸第１４８〜１６４位（配列番号１３）を特異的に認識するマウス抗ニワトリＬＩＦモノクローナル抗体（ＨＵＬ２）を得た。さらに、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてこれらの抗体のサブクラスを調べたところ、ＨＵＬ１はＩｇＧ２ｂ、ＨＵＬ２はＩｇＡであることが確認された。
【０１７３】
得られたモノクローナル抗体はいずれも、ウエスタンブロッティング解析の結果、原核型ニワトリＬＩＦタンパク質および真核型ニワトリＬＩＦタンパク質の両方を強く認識することがわかった。特に、ＨＵＬ２は、ｒｃｈＬＩＦ依存的な胚盤葉細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
ニワトリＬＩＦタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）は、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害して未分化状態を維持させるために有効である。特に、真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生された真核型ｒｃｈＬＩＦは、物理化学的に安定であり、かつ生物活性が非常に高い。本発明者らは、このような真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に供給することができる細胞を得ることによって、トランスジェニックニワトリの作出に不可欠なニワトリＬＩＦタンパク質を大量生産することを可能にした。このような真核型ｒｃｈＬＩＦを用いれば、所望のトランスジェニックニワトリを容易に作出することができ、所望の動物工場として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、ニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列およびニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２Ａは、ＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列を、マウス、ヒトおよびニワトリ間で比較したアラインメントを示す図である。図２Ｂは、マウス、ヒトおよびニワトリ間でのＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列の同一性を示す図である。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系から精製したｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後ＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図４】図４は、真核生物細胞用の発現構築物を示す図である。
【図５】図５は、真核生物細胞用のベクターに挿入したニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するニワトリＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を示す写真である。
【図７】図７は、真核型ｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図８】図８は、抗ニワトリＬＩＦ抗体を用いたイムノブロッティング法により検出した真核型ｒｃｈＬＩＦを示す写真である。
【図９】図９は、真核型ｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後レクチン染色した結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、ニワトリ胚盤葉細胞の培養系に真核型ｒｃｈＬＩＦを添加した際の、嚢胞性胚葉体の形成および細胞未分化状態の維持を示す写真である。
【図１１】図１１は、熱処理およびアルカリ処理を施した原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図１２】図１２は、ニワトリ胚盤葉細胞の培養系に原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦを添加した際の、嚢胞性胚葉体の形成を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリＬＩＦタンパク質を恒常的に得るための原核生物株または真核生物細胞株、ならびに当該細胞株によって産生されるニワトリＬＩＦタンパク質およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物固有の遺伝子の機能解析は、特定の遺伝子が導入された動物、または特定の遺伝子がノックアウトされた動物を作出することによって、飛躍的に進歩した。このような動物、すなわち、トランスジェニック動物は、医学生物学だけでなく広範な研究領域において使用されており、各領域における研究開発に大きな進歩をもたらしている。
【０００３】
ニワトリは、有用な産業動物であり、（１）飼育コストが低い、（２）産子数が多い、（３）卵生であるために胚操作が簡便である、などの理由によって、ウシ、ブタ、ヒツジに代わるトランスジェニック動物の有力な候補として注目されている。トランスジェニックニワトリの作出が可能になれば、有用物質を生産するために、トランスジェニックニワトリを動物工場として用いることができ、応用分野のさらなる広がりが期待できる。
【０００４】
トランスジェニック動物の作出方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するトランスジェニック法、および、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を介する遺伝子導入法が挙げられる。ＥＳ細胞は、ジーンターゲッティング法によってゲノムの特定の位置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすることができることから、現在広く応用されている細胞である。ＥＳ細胞法は、内因性の遺伝子をターゲティングするための強力なツールとして使用されており、ＥＳ細胞法を用いて種々のテーゲティングマウスが作出されている。また、生殖系列によって高頻度に分化する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）法は、ＥＳ細胞法とともに有効な手段であると考えられている。
【０００５】
ＥＳ細胞を用いる場合、遺伝子操作中に細胞分化を抑制することが重要である。ＥＳ細胞を培養する際、フィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞を用いるか、または分化を抑制するための因子としてのＬＩＦ（白血病阻止因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ））を使用する必要がある。
【０００６】
白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、ＩＬ−６ファミリーサイトカインの１つである。ＬＩＦは、マウス骨髄性白血病細胞株Ｍ１をマクロファージへと分化させる因子として同定された（例えば、非特許文献１を参照のこと）。しかし、現在では、マウスＥＳ細胞を未分化状態で維持するために必須のサイトカインであることが知られており（例えば、非特許文献２を参照のこと）、マウスＥＳ細胞培養の簡便化またはトランスジェニックマウスの作出において利用されている。また、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を用いて作製されたマウスまたはヒト由来のリコンビナントＬＩＦタンパク質が市販されている。
【０００７】
マウス以外では、メダカ、ウサギ、ブタ、サルおよびヒトのＥＳ細胞またはＥＧ細胞がこれまでに単離されている。しかし、導入遺伝子を首尾よく生殖系へ導入し得るのはマウスおよびニワトリだけである。また、ニワトリではＥＳ細胞またはＥＧ細胞を首尾よく培養することができず、細胞の安定な系が未だ確立されていない。これまで、マウスＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｍＬＩＦ）またはヒトＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｈＬＩＦ）を種々のサイトカインと組合わせて使用してニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の安定な細胞株を確立しようと試みられているが、未だ達成されていない。
【０００８】
鳥類では、ＬＩＦだけでなく他のＩＬ−６ファミリーサイトカインに関しても解析が進んでいない。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８の相同遺伝子がニワトリにおいて見出されているが、これらは哺乳動物におけるホモログとアミノ酸レベルで２０〜４０％程度の相同性しか有さない。また、哺乳動物由来のＩＬ−１およびＩＬ−２は、その固有の効果をニワトリ細胞に対して発揮することができない（例えば、非特許文献３および４を参照のこと）。
【０００９】
ニワトリＥＳ細胞の培養系を確立することを目的として、本発明者らは、ニワトリのＬＩＦ遺伝子をクローニングし、原核生物宿主を用いて当該遺伝子がコードするタンパク質を組換え発現させた（例えば、特許文献１および非特許文献５を参照のこと）。
【００１０】
具体的には、本発明者らは、ＬＰＳで刺激したニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）を用いたサブトラクション法によって、ニワトリＬＩＦ遺伝子断片を得、この断片の塩基配列からＲＡＣＥ法によって完全長のニワトリＬＩＦ遺伝子をクローニングした。
【００１１】
配列決定したニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡは７８９ｂｐであり、推定２１１アミノ酸からなるＬＩＦタンパク質をコードする。ニワトリＬＩＦは、マウスＬＩＦおよびヒトＬＩＦと比較した場合、アミノ酸レベルでの相同性は３９〜４３％とかなり低いものであったが、６箇所のシステイン残基の位置は完全に保存されていた。また、種々のニワトリ細胞および組織におけるｍＲＮＡの発現解析の結果、ニワトリＬＩＦ遺伝子は、全ての細胞および組織において発現していた。
【００１２】
また、種々のニワトリ細胞および組織におけるニワトリＬＩＦ遺伝子の発現を確認した。さらに大腸菌を用いて作製したニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質が、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を抑制することを確認した。
【特許文献１】特開２００３−９８６９公報（平成１５年１月１４日公開）
【非特許文献１】Ｔｏｍｉｄａ，Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，１０９７８−１０９８２（１９８４）
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６，６８８−６９０（１９８８）
【非特許文献３】Ｋｌａｓｉｎｇ，Ｋ．Ｃ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏ．１１，３８５−３９４（１９８７）
【非特許文献４】Ｓｃｈａｕｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏ．１２，８２３−８３１（１９８８）
【非特許文献５】Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２３），２４５１４−２４５２０（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これまでマウスおよび／またはニワトリのＥＳ細胞の培養には、大腸菌発現系を用いた原核型ｒｍＬＩＦが利用されている。原核型ｒｍＬＩＦは比較的簡便に生産することができるので大量生産されているが、原核型ｒｃｈＬＩＦは、大腸菌発現系では封入体（インクルージョンボディー）を形成してしまうので、タンパク質の精製効率が非常に低く、大量生産することは非常に困難であった。すなわち、ニワトリＬＩＦタンパク質を市場に供給するためには大量生産する必要があるが、大腸菌発現系ではそれが不可能であった。
【００１４】
また、大腸菌によって大量生産を行った場合、ＬＰＳなどのエンドトキシンが混入する危険性が高いので、精製タンパク質の質に致命的な影響を与え、ニワトリＬＩＦタンパク質を胚性幹細胞の培養液中に直接投与して作用させることができなくなる。そのため、大腸菌等の原核生物細胞を宿主細胞として産生させたタンパク質は、非常に厳密で高度な精製を必要とする。
【００１５】
さらに、原核生物細胞を用いて組換え発現させたタンパク質（原核型のリコンビナントタンパク質）においては、翻訳後修飾が起こらない。また、原核型のタンパク質は、正確な立体構造をとらない場合が多い。そのため、翻訳後修飾を必要とする真核生物由来のタンパク質において、その生物活性が制限されていることが多い。また、ニワトリＬＩＦタンパク質において、サイトカインとしての活性発現には糖鎖が重要であると考えられる。
【００１６】
このように、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の培養系を確立するためには、市場に容易に供給することができる程度のｒｃｈＬＩＦを得ること、および所望の生物活性を有するｒｃｈＬＩＦを得ることが必要である。
【００１７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、正しい立体構造を取りかつ糖鎖付加型である真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して取得すること、さらに、真核型ｒｃｈＬＩＦを用いてニワトリＥＳ細胞またはＥＧ細胞の細胞株を確立し、トランスジェニックニワトリを作出することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、公知の大腸菌発現系において独自の創意工夫を重ねることによって、真核型のニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。
【００２４】
本発明に係るポリペプチドにおいて、上記糖鎖がハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースであることが好ましい。
【００２５】
本発明において、上記真核生物宿主がＣＨＯ−Ｋ７細胞またはＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞であることが好ましい。
【００２６】
本発明に係るベクターは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る細胞は、上記のポリペプチドを安定して産生することを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る馴化培地は、上記の細胞を培養することによって得られることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係るポリペプチド生産方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記のポリペプチドを含むことを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の細胞を含むことを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の馴化培地を含むことを特徴としている。
【００３３】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００３４】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。
【００３５】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。
【００３６】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記のポリペプチドを用いることを特徴としている。
【００３７】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。
【００３８】
本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の馴化培地を用いることを特徴としている。
【００３９】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００４０】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。
【００４１】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。
【００４２】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記のポリペプチドとともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４３】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記の細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４４】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、上記の馴化培地とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。
【００４５】
本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドに特異的に結合することを特徴としている。
【００４６】
本発明に係る抗体は、配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴としている。
【発明の効果】
【００４７】
本発明を用いれば、物理化学的に安定なニワトリＬＩＦタンパク質を安定して供給することができる。また、本発明を用いれば、これまで困難であったニワトリの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）の未分化状態をより効率よく維持させて、安定な細胞株を樹立することができる。さらに本発明を用いれば、トランスジェニックニワトリを作出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
上述したように、本発明者らは、独自の創意工夫を重ねることによって、真核型のニワトリＬＩＦリコンビナントタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。
【００４９】
以下、本発明に係るポリペプチド、およびその利用について詳述する。
【００５０】
（１）ポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００５１】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００５２】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、および真核生物宿主（例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００５３】
１つの局面において、本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＬＩＦ活性」は、初期胚由来の細胞の未分化状態を維持する活性、特に、ＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を阻害する活性が意図される。本発明に係るポリペプチドは、特に、ニワトリのＥＳ細胞またはＥＧ細胞の分化を阻害することが好ましい。マウスまたはヒト由来のＬＩＦタンパク質は、ニワトリ胚由来の細胞に対して実用的なＬＩＦ活性を有さない。
【００５４】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００５５】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつＬＩＦ活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号１に示される塩基配列の７５〜７０７位からなるポリヌクレオチドによってコードされ、シグナル配列（配列番号１に示される塩基配列の７５位〜１４６位によってコードされる配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜２４位）を含む。ＬＩＦ活性を有する成熟型のポリペプチドは、当該シグナル配列が切断された形態（配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）であるが、本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」に包含される。
【００５７】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００５８】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５９】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのＬＩＦ活性を変化させない。
【００６０】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００６１】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００６２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＬＩＦ活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００６３】
１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００６４】
他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００６５】
別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００６８】
さらに別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００６９】
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
【００７０】
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【００７１】
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００７２】
さらなる実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドは、特定の糖鎖が付加されていることによって、物理化学的に安定でありかつ生物活性が高い。好ましい糖鎖としては、ハイマンノース型Ｎ結合、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、またはβ結合ガラクトースが挙げられる。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号［ ］によって示される細胞（寄託手続き中）によって産生されることを特徴としている。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、上記細胞より分泌された成熟形態のｒｃｈＬＩＦである。成熟形態ｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号５に示される塩基配列からなる）。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号［ ］によって示される細胞によって産生されることによって、常に一定条件で、均質なタンパク質として精製することができる。
【００７４】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００７５】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００７６】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。
【００７７】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【００７８】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００７９】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されてもよい。
【００８０】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【００８１】
下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物、培養キットまたは培養方法において有用である。
【００８２】
このように、本発明に係るポリペプチドは、ニワトリ胚細胞の未分化状態を維持することができるポリペプチドであって、少なくとも、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるかまたはその活性を保持した変異体であればよいといえる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００８３】
つまり、本発明の目的は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＬＩＦ活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００８４】
（２）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００８５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００８６】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（または数百個以上）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。
【００８８】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００８９】
別の局面において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体にハイブリダイズすることが好ましい。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００９０】
別の局面において、本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９１】
本発明に係るオリゴヌクレオチドがＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のｖｈｄ遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）ｖｈｄ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるｖｈｄのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００９２】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００９３】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００９４】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００９５】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ＩＮ２４（ニワトリ単核球白血病細胞株）、肝臓、または胸腺のような生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。
【００９６】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。
【００９７】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたはＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるＬＩＦ活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００９８】
つまり、本発明の目的は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００９９】
（３）本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
（Ａ）ベクター
本発明は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを産生するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ｐＧＥＸ、ｐＳｅｃＴａｇ２などが好ましい。例えば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１００】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１０１】
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１０２】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【０１０３】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢなどの薬剤耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養については、カナマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリンまたはアンピシリンなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。ニワトリ由来の細胞を用いる場合は、ジェネティシンまたはネオマイシンは適しておらず、Ｚｅｏｃｉｎが好ましい。
【０１０４】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１０５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ニワトリ由来の培養細胞（ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞、ＬＭＨ細胞）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などを挙げることができるが、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞が好ましい。
【０１０６】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１０７】
本発明に係るベクターを使用して上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にＬＩＦ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【０１０８】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む真核細胞発現用ベクターであればよいといえる。
【０１０９】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する真核細胞発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した真核細胞発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１０】
（Ｂ）形質転換体
本発明は、上述したＬＩＦ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【０１１１】
本発明に係る形質転換体は、上述したＬＩＦ活性を有するポリペプチドが発現されることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ましい。
【０１１２】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを、ポリペプチドが発現され得るように真核生物中に導入することによって取得される。好ましくは、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを安定して発現する細胞である。最も好ましくは、本発明に係る形質転換体は、受託番号［ ］によって示される細胞である。受託番号［ ］によって示される細胞より分泌されたｒｃｈＬＩＦは成熟形態である。成熟形態ｒｃｈＬＩＦは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号５に示される塩基配列からなる）。本発明に係るポリペプチドを安定的に発現する細胞は、ＥＳ細胞またはＥＧ細胞を培養する際のフィーダー細胞として使用することができる。
【０１１３】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【０１１４】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るベクターを用いることを特徴とする。
【０１１５】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、真核生物宿主を用いる組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１１６】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本発明に係るポリペプチドは、成熟形態で細胞から分泌されるので、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞の培養上清から回収することができる。好ましい細胞としては、受託番号［ ］によって示される細胞が挙げられる。このような細胞を用いる場合、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、培養上清を回収する工程を包含する。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含してもよい。
【０１１８】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１１９】
つまり、本発明の目的は、真核生物宿主を用いてＬＩＦ活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１２０】
（Ｄ）培養組成物、培養キットまたは培養方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を含む培養組成物を提供する。本発明に係る培養組成物は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞が、培養培地中に含まれる形態であっても、必要に応じて培養培地に添加される形態であってもよい。本発明に係る培養組成物に含まれるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。本明細書中で使用される場合、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地自体もまた培養組成物に包含される。
【０１２１】
本発明に係るポリペプチドを含む培養組成物は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。
【０１２２】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備える培養キットを提供する。本発明に係る培養キットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係る培養キットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２３】
本発明に係るポリペプチドを備える培養キットは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係る培養キットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。
【０１２４】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いる培養方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を培養培地中に添加する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２５】
本発明に係るポリペプチドを用いる培養方法は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係る培養方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。
【０１２６】
（Ｅ）トランスジェニックニワトリを作出するためのキットおよび方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備えるトランスジェニックニワトリを作出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係るキットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２７】
本発明に係るキットは、トランスジェニックニワトリを作出する際に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の未分化状態を維持するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ましい。本発明に係るトランスジェニックニワトリを作出するためのキットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。
【０１２８】
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いてトランスジェニックニワトリを作出するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。
【０１２９】
本発明に係るトランスジェニックニワトリ作出方法は、トランスジェニックニワトリを作出する際に、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともに培養してこれらの細胞の未分化状態を維持することが好ましい。本発明に係るトランスジェニックニワトリを作出するための方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。
【０１３０】
トランスジェニックニワトリを作出するためには、ニワトリの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）を首尾よく継代培養しなければならない。ニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞について、従来の培養方法は、トランスジェニックニワトリを作製するには大きな問題点を有する。具体的には、ＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞について、公知のいずれの培養方法を用いて培養しても全能性（生殖系列（精子または卵子）に分化する能力）を維持しているのは初代培養時のみであり、継代培養後は全能性を消失している。このことは、ＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞へ遺伝子を導入した後、継代培養を経てトランスジェニックニワトリを作出することが不可能であることを示す。
【０１３１】
ニワトリＥＳ様細胞を培養する方法を以下に示す。
【０１３２】
４．５ｇ／ＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ） ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基本培地とし、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、２％ニワトリ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１μＭの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノールとともに、サイトカインを添加した培地を用いる。添加するサイトカインとしては、従来、ＦＧＦ２（１ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＧＦ−１（１〜５ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ−１１（１ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＳＣＦまたはマウスＳＣＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、マウスＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）（必要に応じてさらに哺乳類由来のＩＬ−６ファミリーサイトカイン数種、可溶型ＩＬ−６受容体など）が用いられているが、これらの代わりに、またはこれらに加えて、本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｒｃｈＬＩＦタンパク質）を用い、以下の手順に従って培養を行う：
１．放卵直後の受精卵から濃厚卵白を取り除き、胚を上向きに置く。
２．胚が中央に位置するように濾紙で作製したリングをかぶせ、リングの外枠に沿ってはさみで胚をカットする。
３．濾紙リングに張り付いた胚をピンセットで取り出し、卵黄のついた方を上にしてＰＢＳ中に置き、卵黄を丁寧に取り除く。
４．胚の明領域（中心部分）を直径２〜３ｍｍのピペット等で抜き、抜いた細胞塊を回収する。
５．低濃度のトリプシン等で細胞塊をばらばらにする。
６．１０５×細胞／ｃｍ２の割合で上記培養液中に細胞を播き、７．５％ＣＯ２条件下にて３７℃で培養する。
７．細胞の状態を確認しながら３〜６日毎に培地交換を行う。
８．ＳＳＥＡ−１もしくはＥＭＡ−１の抗原が発現維持されているか否か、またはアルカリフォスファタ-ゼ活性によって、胚の未分化状態が維持されているか否かを判断する。
【０１３３】
ニワトリＥＧ様細胞を培養する方法を以下に示す。
【０１３４】
４．５ｇ／ＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ） ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅを基本培地とし、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、２％ニワトリ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１μＭの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン）、０．１６ｍＭ β−メルカプトエタノール、２０μｇ／ｍＬ ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎとともに、サイトカインを添加した培地を用いる。添加するサイトカインとしては、従来、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ−１１（０．０４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＳＣＦまたはマウスＳＣＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、マウスＬＩＦ（５〜１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）が用いられているが、これらの代わりに、またはこれらに加えて、本発明に係るポリペプチド（すなわち、ｒｃｈＬＩＦタンパク質）を用いて培養を行う。
【０１３５】
ニワトリＥＧ様細胞の培養には孵卵２．５日ごろに胚血液中に存在する循環始原生殖細胞（ｃＰＧＣ）または孵卵５〜５．５日ごろに生殖原基に到達した生殖腺始原生殖細胞（ｇＰＧＣ）の利用が行われているが、培養が可能と報告されているのはｇＰＧＣである。以下にその手順を述べる：
１，孵卵５日ごろの受精卵から生殖原基に相当する部分を取り出す。
２．０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で生殖原基をばらばらにし、５％ＣＯ２条件下、上記培地中にて３７℃で７〜１０日間培養する。
３．緩やかなピペッティング操作でＥＧ様細胞のコロニーを回収し、先に培養しておいたニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上にて、上記培地中、５％ＣＯ２条件下にて３７℃で７〜１０日間培養する。
４．ＳＳＥＡ−１もしくはＥＭＡ−１の抗原が発現維持されているか否か、またはＰＡＳ染色陽性であるか否かによって、胚の未分化状態が維持されているか否かを判断する。
【０１３６】
トランスジェニックニワトリを作出するためには、遺伝子を導入した後少なくとも４〜５代の継代が可能なニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞を得る必要がある。本発明に係る真核型のニワトリＬＩＦポリペプチド（ｒｃｈＬＩＦ）は、マウスＬＩＦタンパク質（ｒｍＬＩＦ）よりも効果が明らかに高い。このようなｒｃｈＬＩＦを用いることによって、添加サイトカインを減らすことが可能であり、真核型ニワトリＬＩＦをベースにした全能性維持および生殖系列への分化能維持を実現することができる培地および培養方法を開発することができる。また、このような培地および培養方法を用いる、有用遺伝子を導入した後のニワトリＥＳ様細胞およびＥＧ様細胞の継代培養時において、組み込まれた遺伝子が相同遺伝子組み換えで導入されていることを確認し、選抜されたＥＳ細胞またはＥＧ細胞をニワトリ胚に戻して、キメラを作出する。さらに、戻し交配を行えば、トランスジェニックニワトリを得ることができる。
【０１３７】
（Ｆ）抗体
本発明は、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。より詳細には、本発明に係る抗体は、ニワトリＬＩＦタンパク質には結合するがマウスＬＩＦタンパク質には結合しない。
【０１３８】
一実施形態において、本発明に係る抗体は、ＬＩＦタンパク質依存的なＳＴＡＴ３活性化を阻害することができる。すなわち、本実施形態に係る抗体は、ＬＩＦ活性を阻害することができる。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１３９】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【０１４０】
〔実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
本発明者らは、非特許文献５に記載の方法に従って、原核型のｒｃｈＬＩＦを精製した。原核型のＬＩＦは、図１に示すような塩基配列およびアミノ酸配列を有する。図２には、ニワトリＬＩＦアミノ酸配列をヒトまたはマウスのＬＩＦアミノ酸配列と比較した。
【０１４１】
原核型のｒｃｈＬＩＦを、電気泳動によって分離した後、ゲルをＣＢＢ染色によって可視化した（図３）。その結果、原核型ｒｃｈＬＩＦは、純度が９０％以上であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１９ｋＤａのおおよその分子量を有することがわかった（１ｍＬ培養から１〜５μｇ）。
【０１４２】
〔実施例２：ＣＨＯ細胞におけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
使用した真核生物細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を図４に示す。このベクターは分泌シグナルとしてＩｇκ鎖リーダー配列と、検出精製用タンパクとしてＣ末にはｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンＴａｇとが付加されている。なお、本実施形態において、真核型ｒｃｈＬＩＦの発現実験にｐＳｅｃＴａｇ２Ａを利用したが、他のベクターも利用可能であることを当業者は容易に理解する。
【０１４３】
ＬＰＳで刺激したＩＮ２４細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートとして、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するプライマー（ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＧ：配列番号７）およびＸｈｏＩ部位を有するプライマー（ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡ：配列番号８）を用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、シグナルペプチドを有さない成熟型のニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいない。このｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＬＩＦｍｈ）を作製した。このベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞にリポフェクション法を用いて導入した。リポフェクション法は、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ含有培地中で培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定して保有する細胞（すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローニングした細胞を数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株を得た。
【０１４４】
真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株をＺｅｏｃｉｎ含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（φ２２ｎｍ）によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。Ｈｉｓ−Ｔａｇタンパク質の精製にはＰｒｏＢｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１ｍＬのレジンに対して４０ｍＬの培養上清を吸着させ、レジンの４倍量の洗浄液で８回洗浄した後、溶出した（レジンと等量の溶出液×１０回）。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルの銀染色および抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）（または抗ｔａｇ抗体）を用いたイムノブロッティング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）については、以下の実施例７で詳述する。
【０１４５】
回収したタンパク質をＰＢＳで透析した。タンパク質量を定量した後、液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。また、精製した真核型ｒｃｈＬＩＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した（図７）。真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、１ｍＬ培養上清中０．５μｇの真核型ｒｃｈＬＩＦを産生した。
【０１４６】
〔実施例３：ニワトリ細胞におけるニワトリＬＩＦタンパク質の発現〕
ニワトリ細胞を用いて取得したｒｃｈＬＩＦは、ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦより活性が強いことが期待されるので、ニワトリ細胞株に真核型ｒｃｈＬＩＦを産生させることを試みた。
【０１４７】
ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩｇκ鎖リーダー配列、ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンＴａｇの部分を全て配列番号３および図５に示した塩基配列に置き換えて挿入したベクターを構築した（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈ）。この塩基配列から翻訳される真核型ｒｃｈＬＩＦのアミノ酸配列を配列番号４および図５に示す。配列番号３および図５に示した塩基配列は、ニワトリ細胞株に真核型ｒｃｈＬＩＦを発現させ、分泌された真核型ｒｃｈＬＩＦの精製が簡便であるように、開始コドンおよびリーダー配列を含むニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列全長の終始コドンの直前に６×ヒスチジンタグの塩基配列を付加している。図５に示すように、このアミノ酸配列中のリーダー部分（図中下線部）はニワトリ細胞中の翻訳後修飾により切断され、リーダー部分が除かれた形態で真核型ｒｃｈＬＩＦが細胞外に分泌される。配列中には原核型にはない糖鎖が付加されることが予想される領域を示す。
【０１４８】
ニワトリ細胞株としては、ＬＭＨ細胞が、組換え発現系によく使用されている。ＬＭＨ細胞は市販されており、増殖力が強いため培養が容易であり、遺伝子導入効率も高いので、タンパク質の強制発現などによく使われている（エストロジェンレセプター強制発現ＬＭＨ株はＡＴＣＣより市販されており、ホルモン応答研究などで広く使われている）。ＬＭＨ細胞を用いてｒｃｈＬＩＦを取得することを試みたが、ニワトリＬＩＦ発現ベクターを導入してｒｃｈＬＩＦを強制発現させるとＬＭＨ細胞の死滅が生じ、どのような工夫を重ねてもｒｃｈＬＩＦを安定的に産生する細胞株を得ることができなかった。
【０１４９】
ＬＭＨ細胞以外にニワトリ由来の接着系細胞株としてＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞が知られている。しかし、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は市販されておらず、増殖力が弱く、細胞培養が難しく、遺伝子導入効率が低いという欠点を有する。遺伝子導入効率が低く増殖力も弱い細胞は組換え発現には適さないことは当業者には明らかであり、実際、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を用いてタンパク質を強制発現させた報告は皆無であった。よって、ニワトリＬＩＦ組換えタンパク質をニワトリ由来の細胞から取得することは一見不可能であった。
【０１５０】
本発明者らは、ＬＭＨ細胞の死滅の原因がｒｃｈＬＩＦの生物活性（すなわち、文化抑制作用）に起因すると考え、ＬＭＨなど分化程度の高い細胞の利用は難しいが、ニワトリ初期胚線維芽細胞由来であるＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、培養条件を首尾よく設定すれば、ＬＩＦ発現依存的な細胞の死滅が生じることなく、ＬＩＦ強制発現下でも正常に増殖するのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を用いてｒｃｈＬＩＦの取得を試みた。ＣＨＣＣ−ＯＵ２は、ＬＭＨ細胞など他のニワトリ培養細胞株よりも増殖力および遺伝子導入効率がはるかに劣るため、培養およびクローニングを行なうために試行錯誤を重ねた。しかし、本発明者らは、培養条件等工夫を重ねることによってｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＣＣ−ＯＵ２株を得ることに成功した（図６）。
【０１５１】
具体的には、ＬＰＳで刺激したＩＮ２４細胞から抽出した総ＲＮＡをテンプレートとして、５’末端にＮｈｅＩ部位を有するプライマー（ＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＡＴＣＣＣＣ：配列番号９）およびＥｃｏＲＩ部位を有するプライマー（ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧ：配列番号１０）を用いるＲＴ−ＰＣＲを行い、シグナルペプチドを有するニワトリＬＩＦ ｃＤＮＡをクローニングした。このｃＤＮＡは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。このｃＤＮＡを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）周辺のＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈ）を作製した。このベクターをＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞にリポフェクション法を用いて導入した。リポフェクション法は、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、Ｚｅｏｃｉｎ含有培地中で培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定して保有する細胞（すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローニングした細胞を数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株を得た。
【０１５２】
その結果、上述した培養条件下では、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ｒｃｈＬＩＦを強制発現させても死滅しなかった。
【０１５３】
具体的には、上述したｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ｃＬＩＦｈをニワトリＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株にリポフェクション法により導入した。導入後に細胞をＺｅｏｃｉｎ含有培地を用いて培養することによって、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を安定に保有する細胞（ベクターを安定に保有する）を選択した。その際、一過性の発現が終了した細胞の死滅が起こり、生細胞の密度は著しく低下し、最終的には、単独の細胞がディッシュに点在する程度となる。通常このような低密度でのＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の培養は困難であり、次第に分裂能を失い死滅する。そこで、９０％馴化培地による培地交換を週一回程度行い、継代は月一度程度にまで控えた。継代の際のトリプシン処理はできるだけ短時間（３分程度）とし、細胞回収のための遠心分離も１０００ｒｐｍで３分間程度と、できるだけ細胞にダメージが加わらないようにした。このようにして数ヶ月間Ｚｅｏｃｉｎ添加培地中で培養することによって真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株（すなわち、導入遺伝子を安定に保有する細胞）を選択し、コロニークローニングによってクローニングした。樹立した真核型ｒｃｈＬＩＦ産生細胞株を、常法に従って−８０℃で凍結保存した。
【０１５４】
タンパク質に付加したＨｉｓ−Ｔａｇを利用して、ニッケルカラムによりタンパク質を精製した。具体的には、真核型ｒｃｈＬＩＦを安定して発現する細胞株をＺｅｏｃｉｎ含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（φ２２ｎｍ）によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。Ｈｉｓ−Ｔａｇタンパク質の精製にはＰｒｏＢｏｎｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１ｍＬのレジンに対して４０ｍＬの培養上清を吸着させ、レジンの４倍量の洗浄液で８回洗浄した後、溶出した（レジンと等量の溶出液×１０回）。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルの銀染色および抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）（または抗ｔａｇ抗体）を用いたイムノブロッティング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。
【０１５５】
回収したタンパク質をＰＢＳで透析した。タンパク質量を定量後、液体窒素で急冷して−８０℃で凍結保存した。また、精製した真核型ｒｃｈＬＩＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した（図７）。真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、増殖速度は遅いが、真核型ｒｃｈＬＩＦの大量調製が可能となった（１ｍＬ培養上清から５μｇ）。
【０１５６】
図７に示すように、真核型ｒｃｈＬＩＦは、ＣＨＯ産生またはＣＨＣＣ−ＯＵ２産生のいずれもが原核型ｒｃｈＬＩＦよりも泳動度が遅く、複数のバンドとして検出された。
【０１５７】
次に、抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２）を用いたウエスタンブロッティング法により、ｒｃｈＬＩＦを検出した。具体的には、１００ｎｇ／レーンのタンパク質を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１８０ｍＶで３時間の条件下でＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写した。このメンブレンを、５％脱脂粉乳中にて室温で１時間ブロッキングした後、一次抗体（上述した抗ＬＩＦ抗体（ＨＵＬ２））とともに４℃で一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、二次抗体（ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇ抗体）とともに室温で１時間インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ（アマシャム）を用いて目的のバンドを検出した。その結果、図８に示したように、ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦは２０〜３７ｋＤａの間に、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦは１９〜３０ｋＤａの間に、いずれも数本のバンドとして検出された。これは、糖鎖の付加の状況が異なることに起因して異なる分子量の真核型ｒｃｈＬＩＦが産生されていることを示す。
【０１５８】
〔実施例４：真核型ニワトリＬＩＦタンパク質における糖鎖付加〕
１００ｎｇ／レーンのタンパク質を１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、１８０ｍＶで３時間の条件下でＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に転写した。このメンブレンをメタノールで処理した後、ＴＢＳで洗浄した。次いで、ＴＢＳ中５％のＢＳＡを用いて、このメンブレンを室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ中１％のレクチン液とともに室温で１時間インキュベートした。レクチンとしては、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｌｅｃｔｉｎ Ｋｉｔ Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、レクチンが特異的に結合したバンドを検出した。
【０１５９】
レクチン（ＣｏｎＡ、ＲＣＡ、ＷＧＡ）染色を行った結果を図９に示す。図９に示したように真核型ｒｃｈＬＩＦが特異的に染色された。
【０１６０】
この結果より、全ての真核型ｒｃｈＬＩＦはハイマンノース型Ｎ結合の糖鎖、バイセクティングＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸を有すること（ＣｏｎＡ、およびＷＧＡ）、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦはβ結合ガラクトースを有すること（ＲＣＡ）が示された。以上の結果から、真核型ｒｃｈＬＩＦは、糖鎖付加において、ＣＨＯ産生系とニワトリ細胞産生系との間で異なることがわかった。
【０１６１】
〔実施例５：種々のｒｃｈＬＩＦの生物活性〕
ｒｃｈＬＩＦの生物活性はニワトリＥＳ細胞（ニワトリ胚盤葉細胞）の未分化状態を維持する活性として測定することができる。
【０１６２】
精製した真核型ｒｃｈＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）をニワトリＥＳ細胞の培養系に添加して８日間培養した。ＬＩＦ非添加の条件下では、ニワトリＥＳ細胞は嚢胞性胚葉体を形成し未分化状態が維持されない（図１０−１）。原核型ｒｃｈＬＩＦを添加した条件下では、ニワトリＥＳ細胞は未分化状態を７日間維持したが、培養８日目には嚢胞性胚葉体が出現した（図１０−２）。ＣＨＯ産生真核型ｒｃｈＬＩＦ添加の条件下では、小型の嚢胞性胚葉体が多数検出され、未分化状態が維持されていない（図１０−３）。これらに対して、ニワトリ細胞株産生真核型ｒｃｈＬＩＦ添加の条件下では、ニワトリＥＳ細胞が８日間の培養後も未分化状態を維持し、かつ嚢胞性胚葉体がほとんど形成されていないことがわかった（図１０−４）。
【０１６３】
以上の結果は、ニワトリＥＳ細胞の培養にはｒｃｈＬＩＦであれば効果（未分化状態の維持）を奏するが、原核型ｒｃｈＬＩＦよりも真核型ｒｃｈＬＩＦの方がより好ましく、特にニワトリ細胞が産生する真核型ｒｃｈＬＩＦが最も効果が高いことを示す。また、原核型ｒｃｈＬＩＦよりも真核型ｒｃｈＬＩＦの方がニワトリＥＳ細胞の未分化状態を長く維持することがわかった。
【０１６４】
〔実施例６：種々のｒｃｈＬＩＦの安定性〕
これまでの結果からニワトリＥＳ細胞の培養系にニワトリ細胞株が産生した真核型ｒｃｈＬＩＦの効果が高いことがわかった。そこで次に糖鎖付加によるタンパク質の安定性の試験を行った。原核型ｒｃｈＬＩＦおよび真核型ｒｃｈＬＩＦを高温（５０℃または８０℃）で６時間保温した場合、さらに、酸性（ｐＨ２．８）またはアルカリ性（ｐＨ１０．６）で６時間室温インキュベートして、リコンビナントタンパク質分解の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。また各処理条件による生物活性の変化をニワトリＥＳ細胞培養系へ添加して調べた。
【０１６５】
その結果、図１１に示したように原核型ｒｃｈＬＩＦでは８０℃の熱処理とアルカリ処理でバンドの減少が確認された。また真核型ｒｃｈＬＩＦでは８０℃処理により低分子のバンドの減少が認められたがそれ以外にバンドの減少は認められず、種々の処理に対して真核型ｒｃｈＬＩＦは極めて安定であることがわかった。
【０１６６】
次に、原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦをニワトリＥＳ細胞の培養系に２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して嚢胞性胚葉体の出現を指標にＬＩＦの生物活性を測定した。
【０１６７】
その結果、図１２に示したように、原核型ｒｃｈＬＩＦを使用した場合には多数の嚢胞性胚葉体の出現が認められたが、真核型ｒｃｈＬＩＦを使用した場合にニワトリＥＳ細胞は、円形のコロニーを形成したまま嚢胞性胚葉体の出現は全く認められなかった。以上の結果は、真核型ｒｃｈＬＩＦはその生物活性においても種々の処理に対して極めて安定であることを示している。
【０１６８】
〔実施例７：ニワトリＬＩＦタンパクに対する抗体〕
原核型ニワトリＬＩＦタンパク質全長を免疫原として抗ＬＩＦ抗体を作製した。免疫原はフロイントアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後２週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の３日前に行ない、尾静脈注射による免疫を行った。
【０１６９】
マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、得られた抗体は、マウスＬＩＦタンパク質とニワトリＬＩＦタンパク質との間の交差反応を示さなかった。
【０１７０】
上述の実施例で示したように、胚盤葉細胞に対する生物活性および／またはＳＴＡＴ３のリン酸化において、ｒｃｈＬＩＦとｒｍＬＩＦとの間で違いがあることが明らかである。この違いは、両者間のアミノ酸配列が大きく異なることに起因し、その結果、リガンド／レセプター相互作用が異なっていることが考えられる。そこで、ＬＩＦにおけるリガンド／レセプター相互作用に関連する領域を解析することを目的として、ｒｃｈＬＩＦとレセプターとの結合に関与することが予想される領域（すなわち、ｒｃｈＬＩＦの親水性領域）に対する抗体を作製した。
【０１７１】
具体的には、シグナルペプチドを除いた成熟型ニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸第２３〜３５位（ＥＱＴＲＲＱＶＡＬＬＮＡＴ：配列番号１１）、第９６〜１１１位（ＧＮＩＴＲＤＱＥＥＬＮＰＭＡＫＥ：配列番号１２）、または第１４８〜１６４位（ＧＬＩＳＮＬＴＣＬＬＣＫＨＹＮＩＦ：配列番号１３）からなる合成ペプチドとキャリアータンパク質（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ，Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標） Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ，ＰＩＥＲＣＥ）との複合体を免疫原とした。免疫原は水酸化アルミニウムゲルアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後２週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の３日前に行い、尾静脈注射による免疫を行った。
【０１７２】
マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、いずれの抗体においてもマウスＬＩＦタンパク質とニワトリＬＩＦタンパク質との間の交差反応は検出されなかった。さらに、これらの抗体は、ｒｃｈＬＩＦ依存的なＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。ｓ
さらに、ニワトリＬＩＦタンパク質全長に対するモノクローナル抗体および上記ペプチドに対するモノクローナル抗体を作製した。四次免疫を行った後、血清中の抗体価が十分上昇したことを確認したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。脾細胞は融合用親株細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と融合させ、ＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｍ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）選択培地中で、融合細胞を選択した。ｒｃｈＬＩＦを抗原としたＥＬＩＳＡ法およびウエスタンブロット法（ＷＢ）を用いて、抗ニワトリＬＩＦ抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、限界希釈法によりクローニングを行い、ニワトリＬＩＦタンパク質全長に対するマウス抗ニワトリＬＩＦモノクローナル抗体（ＨＵＬ１）および成熟型ニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸第１４８〜１６４位（配列番号１３）を特異的に認識するマウス抗ニワトリＬＩＦモノクローナル抗体（ＨＵＬ２）を得た。さらに、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてこれらの抗体のサブクラスを調べたところ、ＨＵＬ１はＩｇＧ２ｂ、ＨＵＬ２はＩｇＡであることが確認された。
【０１７３】
得られたモノクローナル抗体はいずれも、ウエスタンブロッティング解析の結果、原核型ニワトリＬＩＦタンパク質および真核型ニワトリＬＩＦタンパク質の両方を強く認識することがわかった。特に、ＨＵＬ２は、ｒｃｈＬＩＦ依存的な胚盤葉細胞のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害した。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
ニワトリＬＩＦタンパク質（ｒｃｈＬＩＦ）は、ニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害して未分化状態を維持させるために有効である。特に、真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生された真核型ｒｃｈＬＩＦは、物理化学的に安定であり、かつ生物活性が非常に高い。本発明者らは、このような真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に供給することができる細胞を得ることによって、トランスジェニックニワトリの作出に不可欠なニワトリＬＩＦタンパク質を大量生産することを可能にした。このような真核型ｒｃｈＬＩＦを用いれば、所望のトランスジェニックニワトリを容易に作出することができ、所望の動物工場として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１は、ニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列およびニワトリＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２Ａは、ＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列を、マウス、ヒトおよびニワトリ間で比較したアラインメントを示す図である。図２Ｂは、マウス、ヒトおよびニワトリ間でのＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列の同一性を示す図である。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系から精製したｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後ＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図４】図４は、真核生物細胞用の発現構築物を示す図である。
【図５】図５は、真核生物細胞用のベクターに挿入したニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、真核型ｒｃｈＬＩＦを安定に発現するニワトリＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を示す写真である。
【図７】図７は、真核型ｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図８】図８は、抗ニワトリＬＩＦ抗体を用いたイムノブロッティング法により検出した真核型ｒｃｈＬＩＦを示す写真である。
【図９】図９は、真核型ｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後レクチン染色した結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、ニワトリ胚盤葉細胞の培養系に真核型ｒｃｈＬＩＦを添加した際の、嚢胞性胚葉体の形成および細胞未分化状態の維持を示す写真である。
【図１１】図１１は、熱処理およびアルカリ処理を施した原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦを電気泳動した後銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図１２】図１２は、ニワトリ胚盤葉細胞の培養系に原核型ｒｃｈＬＩＦまたは真核型ｒｃｈＬＩＦを添加した際の、嚢胞性胚葉体の形成を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
上記真核生物宿主がＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする真核生物宿主に用いる発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを安定して産生することを特徴とする細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞を培養することによって得られる馴化培地。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞を用いることを特徴とするポリペプチド生産方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の細胞を含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の馴化培地を含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。
【請求項１４】
請求項７に記載の細胞を備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。
【請求項１５】
請求項８に記載の馴化培地を備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。
【請求項１７】
請求項７に記載の細胞を用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。
【請求項１８】
請求項８に記載の馴化培地を用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出キット。
【請求項２０】
請求項７に記載の細胞を備えることを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出キット。
【請求項２１】
請求項８に記載の馴化培地を備えることを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出キット。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドとともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出方法。
【請求項２３】
請求項７記載の細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出方法。
【請求項２４】
請求項８に記載の馴化培地とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出方法。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２６】
配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴とする抗体。
【請求項１】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
上記真核生物宿主がＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする真核生物宿主に用いる発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを安定して産生することを特徴とする細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞を培養することによって得られる馴化培地。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞を用いることを特徴とするポリペプチド生産方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の細胞を含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の馴化培地を含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。
【請求項１４】
請求項７に記載の細胞を備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。
【請求項１５】
請求項８に記載の馴化培地を備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。
【請求項１７】
請求項７に記載の細胞を用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。
【請求項１８】
請求項８に記載の馴化培地を用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出キット。
【請求項２０】
請求項７に記載の細胞を備えることを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出キット。
【請求項２１】
請求項８に記載の馴化培地を備えることを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出キット。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドとともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出方法。
【請求項２３】
請求項７記載の細胞とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出方法。
【請求項２４】
請求項８に記載の馴化培地とともにニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジェニックニワトリ作出方法。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２６】
配列番号１１〜１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴とする抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−３１０４３（Ｐ２００８−３１０４３Ａ）
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３６７４７（Ｐ２００４−３３６７４７）
【出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（８０３０００１０４）財団法人ひろしま産業振興機構 (70)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１９日（２００４．１１．１９）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（８０３０００１０４）財団法人ひろしま産業振興機構 (70)
【Ｆターム（参考）】
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