ニーム種子由来の悪性腫瘍治療薬
【課題】新たな悪性腫瘍治療薬の提供。
【解決手段】エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。
【解決手段】エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍治療薬、特に植物由来の成分を有効成分とする悪性腫瘍治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物中には数多くの生理活性物質が含まれており、植物から医薬品を抽出することは長年行なわれてきている。植物由来の悪性腫瘍治療薬としては、イチイ科の植物からの抽出物であるパクリタキセル（タキソール）；クロタキカズラ科クサミズキ、タマミズキ科カンレンボクに含まれるアルカロイドであるカンプトテシン；及びキョウチクトウ科ニチニチソウに含まれるインドールアルカロイドであるビンクリスチン、ビンブラスチン等が知られている。
【０００３】
センダン科の植物であるインドセンダン（Melia azadirachta L.；別名ニーム）の抽出物には数多くの成分が含まれており、それらは収斂剤、鎮痙剤、健胃剤、強壮剤、動物忌避剤等として有用であることが知られている（特許文献１）。また、特許文献２には、センダン科植物の抽出物に抗腫瘍活性があることが記載されているが、その活性物質の分子サイズは５，０００前後であると記載されている。
【特許文献１】特開平８−２３９３０６号公報
【特許文献２】特開２００４−２５６４２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、植物中から新規な悪性腫瘍治療薬を探索することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、インドセンダンの種子の有機溶媒抽出物を対象として抗腫瘍活性及びアポトーシス誘導能を指標にスクリーニングしたところ、分子量の小さい特定の四環性化合物が優れた抗腫瘍活性及びアポトーシス誘導能を有し、悪性腫瘍治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の悪性腫瘍治療薬は、優れた抗腫瘍活性を有し、その作用は癌細胞に対するアポトーシス誘導能によるものであると考えられる。従って、新たな悪性腫瘍治療薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤（以下、悪性腫瘍治療薬等という）は、エポキシアザジラジオン（１）、ゲデュニン（２）、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン（３）及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノール（４）から選ばれる化合物を有効成分とするものである。これらの化合物は、それぞれ次の式（１）〜（４）で表される。
【０００９】
【化１】
【００１０】
これらの化合物（１）〜（４）は、インドセンダン（ニーム）の種子から抽出することにより得ることができる。例えば、ニーム種子を粉砕し、ｎ−ヘキサンで抽出した後、その抽出物をさらにメタノールで抽出し、メタノール画分を塩化メチレン画分と水画分に分け、当該塩化メチレン画分からカラムクロマトグラフィーにより分画すれば、上記化合物（１）〜（４）が得られる。
【００１１】
後記実施例から明らかなように、化合物（１）〜（４）は、白血病細胞、悪性黒色腫細胞等に対して優れた細胞傷害活性を有する。また、その細胞傷害活性はアポトーシス誘導活性に基づくものである。従って、化合物（１）〜（４）、あるいはこれらの化合物を含有するニーム抽出物は、ヒトを含む哺乳動物の悪性腫瘍治療薬として有用である。
本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫などの血液や造血組織の腫瘍及び固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍としては、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられる。
【００１２】
本発明の医薬は、化合物（１）〜（４）、あるいは前記抽出物に賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などの剤形に製剤化することによって得られる。
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、化合物（１）〜（４）として、１日当り約１〜５００mg／kgを１〜４回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００１３】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１４】
実施例１（化合物（１）〜（４）の抽出、分画、単離）
乾燥ニーム種子（６２９ｇ）を乳鉢で破砕した後、ｎ−ヘキサンを用いて抽出［脱脂］（６０〜８０℃、２Ｌ×３回）し、ろ過後溶媒を減圧留去しｎ−ヘキサン抽出物（８０ｇ）を得た。脱脂残渣をさらにメタノールを用いて抽出（室温、２Ｌ×３回）し、ろ過後溶媒を減圧留去しメタノール抽出物（２０６ｇ）を得た。メタノール抽出物（２０５ｇ）を塩化メチレン−水（１：１）にて溶剤分別を行い、塩化メチレン画分（３６ｇ）と水画分（１６５ｇ）を得た。
【００１５】
塩化メチレン画分（２２ｇ）をシリカゲル（ゲル重量８４４ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［１：０（２０００ｍＬ）、９５：５（２０００ｍＬ）、９：１（２５００ｍＬ）、８：２（２０００ｍＬ）、７：３（３５００ｍＬ）、６：４（３０００ｍＬ）、１：１（５５００ｍＬ）、４：６（２０００ｍＬ）、３：７（４０００ｍＬ）、２：８（３５００ｍＬ）、０：１（３５００ｍＬ）ｖ／ｖ］、メタノール（３０００ｍＬ）を用い，１８画分［Ｆｒ．Ａ（０．０３４２ｇ），Ｆｒ．Ｂ（１．５１７３ｇ）、Ｆｒ．Ｃ（０．４０９９ｇ）、Ｆｒ．Ｄ（０．１６８８ｇ）、Ｆｒ．Ｅ（０．２９０２ｇ）、Ｆｒ．Ｆ（０．１９４１ｇ）、Ｆｒ．Ｇ（０．５２７３ｇ）、Ｆｒ．Ｈ（２．３７１０ｇ）、Ｆｒ．Ｉ（１．６２９１ｇ）、Ｆｒ．Ｊ（２．５４７３ｇ）、Ｆｒ．Ｋ（１．１１７９ｇ）、Ｆｒ．Ｌ（０．６５７１ｇ）、Ｆｒ．Ｍ（０．２３２９ｇ）、Ｆｒ．Ｎ（０．４５２１ｇ）、Ｆｒ．Ｏ（１．１８３７ｇ）、Ｆｒ．Ｐ（０．１４８３ｇ）、Ｆｒ．Ｑ（２．７２３９ｇ）、Ｆｒ．Ｒ（７．２７８７ｇ）］に分画した。
【００１６】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ（２．２７２１ｇ）をシリカゲル（ゲル重量１５０ｇ）カラムクロマトグラフィーを用いて分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［９：１（７００ｍＬ）、７：３（４５０ｍＬ）、６：４（９５０ｍＬ）、５５：４５（６００ｍＬ）、１：１（７００ｍＬ）、４５：５５（５００ｍＬ）、４：６（５００ｍＬ）、３：７（６００ｍＬ）、２：８（６００ｍＬ）、１：９（５００ｍＬ）］、酢酸エチル（６００ｍＬ）、酢酸エチル−メタノール［８：２（５００ｍＬ）］、ＭｅＯＨ（６５０ｍＬ）を用い、１５画分［Ｆｒ．Ｈ−１（２２．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−２（５．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−３（６．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−４（８５．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５（８９１．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−６（１１１．２ｍｇ），Ｆｒ．Ｈ−７（３４４．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−８（５９．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−９（１０１．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１０（１８５．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１１（７６．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１２（１０４．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１３（２９１．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１４（６９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１５（２７７．３ｍｇ）］に分画した。
【００１７】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−５（８９１．８ｍｇ）はシリカゲル（ゲル重量３８ｇ）を用いてさらに分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［８：２（５８０ｍＬ）、６：４（１８０ｍＬ）、４：６（１９０ｍＬ）］、酢酸エチル（２００ｍＬ）、酢酸エチル−メタノール［１：１（９０ｍＬ）］、ＭｅＯＨ（８０ｍＬ）を用い、１０画分［Ｆｒ．Ｈ−５−１（２．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−２（２８．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−３（３９１．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−４（１７２．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−５（２３．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−６（４０．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−７（６５．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−８（２９．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−９（１２．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−１０（１１２．８ｍｇ）］に分画した。
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−５−３（９８．８ｍｇ）及びＦｒ．Ｈ−５−４（１１３．２ｍｇ）について逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ−ＩＩ、１０φ×２５０ｍｍ、センシュー科学（株）製；溶離液：メタノール−水＝７：３（酢酸０．１％）；流速：３．０ｍＬ／分）を行ない、エポキシアザジラジオン（１；保持時間３１．４分）を併せて２７．３ｍｇ単離した。
【００１８】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−７（３４４．９ｍｇ）はシリカゲル（ゲル重量１７ｇ）カラムクロマトグラフィーを用いて分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［７：３（３１０ｍＬ）、６：４（２８０ｍＬ）、１：１（１７０ｍＬ）］、酢酸エチル（２００ｍＬ）、酢酸エチル−メタノール［１：１（１６０ｍＬ）］、メタノール（１２０ｍＬ）を用い、８画分［Ｆｒ．Ｈ−７−１（１．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−２（４９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−３（１３８．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−４（６８．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−５（１０．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−６（１１．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−７（８．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−８（２６．８ｍｇ）］に分画した。
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−７−３（１２０．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−４（６１．９ｍｇ）及びＦｒ．Ｉ（１９１．８ｍｇ）について逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ−ＩＩ、１０φ×２５０ｍｍ；溶離液：メタノール−水＝７：３；流速：３．０ｍＬ／分）を行ない、ゲデュニン（２；保持時間２０．４分）を併せて２４．３ｍｇ単離した。
【００１９】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｋ（１．０８６０ｇ）について逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ−ＩＩ、１０φ×２５０ｍｍ；溶離液：メタノール−水＝７：３；流速：３．０ｍＬ／分）を行ない、１７−エピ−１７−ハイドロキシアザジラジオン（３；２４．７ｍｇ、保持時間１０．２分）、７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノール（４；７．９ｍｇ、保持時間２９．６分）を得た。
【００２０】
化合物（１）は文献値1) との1Ｈ ＮＭＲ及びＭＳデータの比較により同定した。
エポキシアザジラジオン（１） ESI-MS m/z 489 [M + Na]+, 505 [M + K]+. 1H-NMR (600 MHz, CDCl3)：δ 1.04 (3H, s, H3-18), 1.07 (3H, s, H3-28), 1.08 (3H, s, H3-29),1.21 (3H, s, H3-30), 1.22 (3H, s, H3-19), 2.03 (3H, s, OAc), 2.18 (1H, dd, J = 3.2, 13.0 Hz, H-5), 2.63 (1H, dd, J = 3.8, 12.7 Hz, H-9), 3.41 (1H, s, H-15), 3.89 (1H, s, H-17), 4.73 (1H, t, J = 2.8 Hz, H-7), 5.88 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22),6.24 (1H , m, H-22), 7.16 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-2), 7.40 (1H, t, J = 1.8 Hz, H-23), 7.56 (1H, m, H-21).
【００２１】
化合物（２）は文献値2) との1Ｈ ＮＭＲ及びＭＳデータの比較により同定した。
ゲデュニン（２） HR-ESI-MS m/z 505.2235 [C28H34O7Na [M + Na]+ : 505.2202]. 1H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.07 (3H, s, H3-28), 1.08 (3H, s, H3-29), 1.16 (3H, s, H3-18), 1.23 (3H, s, H3-19), 1.25 (3H, s, H3-30), 2.11 (3H, s, OAc), 2.17 (1H, dd, J = 2.4, 13.4 Hz, H-5), 2.49 (1H, dd, J = 6.1, 12.7 Hz, H-9), 3.53 (1H, s, H-15), 4.56 (1H, dd, J = 2.2, 3.3 Hz, H-7), 5.62 (1H, s, H-17), 5.87 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-2), 6.34 (1H, br.s, H-22), 7.10 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-1), 7.42 (2H, d, J = 1.5 Hz, H-21 and 23).
【００２２】
化合物（３）は既知化合物だが、スペクトル値の記載されている文献がないので２次元（２Ｄ）−ＮＭＲを解析することで構造の確認を行った。
１７−エピ−１７−ハイドロキシアザジラジオン（３） 白色結晶. IR (KBr)νcm-1：3462 (O-H), 2960, 2878 (C-H), 1736,1716 (C=O α,β-不飽和エノン部), 1667 (C=Oエステル部), 1591 (C=C), 1245, 1028 (C-Oエステル部). [α]D：-57.14°(c 0.21, クロロホルム). HR-ESI-MS m/z 489.2246 [C28H34O6Na [M + Na]+ : 489.2253]. UVλmaxEtOHnm (log ε): 233 (4.18). 1H-NMR (600 MHz, CDCl3)：δ 1.086 (3H, s, H3-28), 1.093 (3H, s, H3-29), 1.19 (3H, s, H3-19), 1.27 (3H, s, H3-18), 1.37 (3H, s, H3-30), 1.59 (2H, m, H2-12), 1.69 (1H, m, Hβ-11), 1.92 (1H, m, Hα-6), 1.96 (3H, s, OAc), 1.98 (1H, m, Hα-11), 2.01 (1H, m, Hβ-6), 2.21 (1H, dd, J = 2.7, 13.1 Hz, H-5), 2.43 (1H, dd, J = 6.9, 11.9 Hz, H-9), 5.34 (1H, t, J = 3.1 Hz, H-7), 5.89 (1H, d, J = 10.3 Hz, H-2), 6.02 (1H, s, H-15), 6.23 (1H, dd, J = 0.7, 1.9 Hz, H-22), 7.12 (1H, d, J = 10.3 Hz, H-1), 7.19 (1H, t, J = 1.4 Hz, H-23), 7.32 (1H, t, J = 1.7 Hz,H-21). 13C-NMR (150MHz, CDCl3)：δ 15.8 (C-11), 19.0 (C-19), 20.9 (-O-CO-Me), 21.2 (C-28), 23.5 (C-6), 25.0 (C-18), 25.5 (C-12), 27.0 (C-29), 27.2 (C-30), 38.4 (C-9), 40.0 (C-10), 44.0 (C-4), 44.8 (C-8), 46.1 (C-5), 51.8 (C-13), 73.8 (C-7), 84.7 (C-17), 109.5 (C-22), 121.0 (C-15), 125.9 (C-2), 127.1 (C-20), 139.7 (C-23), 142.9 (C-21), 156.7 (C-1), 169.7 (-O-CO-Me), 193.4 (C-14), 203.9 (C-3), 206.4 (C-16).
【００２３】
化合物（４）は文献値3)との1Ｈ ＮＭＲ及びＭＳデータの比較により同定した。
７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノール（４） ESI-MS：m/z 513 [M + H]+, 535 [M + Na]+, 551 [M + K]+. 1H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.00 (3H, s, H-30), 1.03 (3H, s, H-28), 1.11 (3H, s, H-29), 1.31 (3H, s, H-19), 1.42(3H, s, H-18), 3.41(1H, s, H-17), 5.63(1H, t, J = 2.7 Hz, H-7), 5.92 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-2), 5.94 (1H, s, H-15), 6.20 (1H, m, H-22), 7.19 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-1), 7.39 (4H, m, H-21, H-23, H-3′, H-5′), 7.54 (1H, m, H-4′), 7.91 (2H, dd, J = 1.0, 8.3 Hz, H-2′, H-6′).
【００２４】
参考文献
1) D. Lavie, E. C. Levy, Meliane-Meliacin Relationship, Tetrahedron, 27(16), 3941-3947 (1971)
2) S. A. Khalid, H. Duddeck, M. G. Sierra, Isolation and Characterization of an Antimalarial Agent of the Neem Tree Azadirachta indica, J. Nat. Prod., 52 (5), 922-927 (1989).
3) W. Kraus, R. Cramer, G. Sawitzki, Tetranortriterpenoids from the Seeds of Azadirachta indica, Phytochemistry, 20 (1), 117-120 (1981).
【００２５】
実施例２（抗腫瘍活性）
抗腫瘍活性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロミド）法により測定した。
９６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した腫瘍細胞（３×１０3ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を１００μＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃，飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０-4、１×１０-5、１×１０-6Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを０．２μＬずつそれぞれに添加し、４８時間腫瘍細胞に作用させた。次に、０．５％ＭＴＴ液を１０μＬ加え、３時間後に反応停止液（０．０４ＮＨＣｌ／イソプロパノール）を１００μＬ加え反応を停止させた。よくピペッティングをした後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍ（ｔｏｐ）及び６５５ｎｍ（ｂｏｔｔｏｍ）における吸光度を測定した。各検体の各濃度における細胞生存率は、コントロール群に対する百分率により求め、そこからＥＣ50値を算出した。腫瘍細胞としては、悪性黒色腫であるＣＲＬ１５７９及び白血病細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を用いた。また、陽性対照としてシスプラチンを用いた。
【００２６】
その結果、表１に示すように、化合物（１）〜（４）は強力な抗腫瘍剤として知られているシスプラチンと同等の強い抗腫瘍活性を有することが判明した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
実施例３（アポトーシス誘導能）
アポトーシス誘導能は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色法で核染色することにより試験した。
６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した細胞（（ＣＲＬ１５７９：２×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を２ｍＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃，飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０-4、１×１０-5、１×１０-6Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを４μＬずつそれぞれに添加し、２４時間細胞に作用させた。次に、０．０５％Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液を１００μＬ加え、３０分後に蛍光顕微鏡にて位相差像及び蛍光像を撮影し、細胞の形態変化を観察した。
その結果、化合物（３）、（４）は、いずれも１〜１０μＭで、核の凝集化及び断片化が認められることから、ＣＲＬ１５７９及びJurkat細胞に対する細胞傷害活性はアポトーシス誘導によるものであることが判明した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍治療薬、特に植物由来の成分を有効成分とする悪性腫瘍治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物中には数多くの生理活性物質が含まれており、植物から医薬品を抽出することは長年行なわれてきている。植物由来の悪性腫瘍治療薬としては、イチイ科の植物からの抽出物であるパクリタキセル（タキソール）；クロタキカズラ科クサミズキ、タマミズキ科カンレンボクに含まれるアルカロイドであるカンプトテシン；及びキョウチクトウ科ニチニチソウに含まれるインドールアルカロイドであるビンクリスチン、ビンブラスチン等が知られている。
【０００３】
センダン科の植物であるインドセンダン（Melia azadirachta L.；別名ニーム）の抽出物には数多くの成分が含まれており、それらは収斂剤、鎮痙剤、健胃剤、強壮剤、動物忌避剤等として有用であることが知られている（特許文献１）。また、特許文献２には、センダン科植物の抽出物に抗腫瘍活性があることが記載されているが、その活性物質の分子サイズは５，０００前後であると記載されている。
【特許文献１】特開平８−２３９３０６号公報
【特許文献２】特開２００４−２５６４２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、植物中から新規な悪性腫瘍治療薬を探索することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、インドセンダンの種子の有機溶媒抽出物を対象として抗腫瘍活性及びアポトーシス誘導能を指標にスクリーニングしたところ、分子量の小さい特定の四環性化合物が優れた抗腫瘍活性及びアポトーシス誘導能を有し、悪性腫瘍治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の悪性腫瘍治療薬は、優れた抗腫瘍活性を有し、その作用は癌細胞に対するアポトーシス誘導能によるものであると考えられる。従って、新たな悪性腫瘍治療薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤（以下、悪性腫瘍治療薬等という）は、エポキシアザジラジオン（１）、ゲデュニン（２）、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン（３）及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノール（４）から選ばれる化合物を有効成分とするものである。これらの化合物は、それぞれ次の式（１）〜（４）で表される。
【０００９】
【化１】
【００１０】
これらの化合物（１）〜（４）は、インドセンダン（ニーム）の種子から抽出することにより得ることができる。例えば、ニーム種子を粉砕し、ｎ−ヘキサンで抽出した後、その抽出物をさらにメタノールで抽出し、メタノール画分を塩化メチレン画分と水画分に分け、当該塩化メチレン画分からカラムクロマトグラフィーにより分画すれば、上記化合物（１）〜（４）が得られる。
【００１１】
後記実施例から明らかなように、化合物（１）〜（４）は、白血病細胞、悪性黒色腫細胞等に対して優れた細胞傷害活性を有する。また、その細胞傷害活性はアポトーシス誘導活性に基づくものである。従って、化合物（１）〜（４）、あるいはこれらの化合物を含有するニーム抽出物は、ヒトを含む哺乳動物の悪性腫瘍治療薬として有用である。
本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫などの血液や造血組織の腫瘍及び固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍としては、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられる。
【００１２】
本発明の医薬は、化合物（１）〜（４）、あるいは前記抽出物に賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などの剤形に製剤化することによって得られる。
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、化合物（１）〜（４）として、１日当り約１〜５００mg／kgを１〜４回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００１３】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１４】
実施例１（化合物（１）〜（４）の抽出、分画、単離）
乾燥ニーム種子（６２９ｇ）を乳鉢で破砕した後、ｎ−ヘキサンを用いて抽出［脱脂］（６０〜８０℃、２Ｌ×３回）し、ろ過後溶媒を減圧留去しｎ−ヘキサン抽出物（８０ｇ）を得た。脱脂残渣をさらにメタノールを用いて抽出（室温、２Ｌ×３回）し、ろ過後溶媒を減圧留去しメタノール抽出物（２０６ｇ）を得た。メタノール抽出物（２０５ｇ）を塩化メチレン−水（１：１）にて溶剤分別を行い、塩化メチレン画分（３６ｇ）と水画分（１６５ｇ）を得た。
【００１５】
塩化メチレン画分（２２ｇ）をシリカゲル（ゲル重量８４４ｇ）カラムクロマトグラフィーにより分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［１：０（２０００ｍＬ）、９５：５（２０００ｍＬ）、９：１（２５００ｍＬ）、８：２（２０００ｍＬ）、７：３（３５００ｍＬ）、６：４（３０００ｍＬ）、１：１（５５００ｍＬ）、４：６（２０００ｍＬ）、３：７（４０００ｍＬ）、２：８（３５００ｍＬ）、０：１（３５００ｍＬ）ｖ／ｖ］、メタノール（３０００ｍＬ）を用い，１８画分［Ｆｒ．Ａ（０．０３４２ｇ），Ｆｒ．Ｂ（１．５１７３ｇ）、Ｆｒ．Ｃ（０．４０９９ｇ）、Ｆｒ．Ｄ（０．１６８８ｇ）、Ｆｒ．Ｅ（０．２９０２ｇ）、Ｆｒ．Ｆ（０．１９４１ｇ）、Ｆｒ．Ｇ（０．５２７３ｇ）、Ｆｒ．Ｈ（２．３７１０ｇ）、Ｆｒ．Ｉ（１．６２９１ｇ）、Ｆｒ．Ｊ（２．５４７３ｇ）、Ｆｒ．Ｋ（１．１１７９ｇ）、Ｆｒ．Ｌ（０．６５７１ｇ）、Ｆｒ．Ｍ（０．２３２９ｇ）、Ｆｒ．Ｎ（０．４５２１ｇ）、Ｆｒ．Ｏ（１．１８３７ｇ）、Ｆｒ．Ｐ（０．１４８３ｇ）、Ｆｒ．Ｑ（２．７２３９ｇ）、Ｆｒ．Ｒ（７．２７８７ｇ）］に分画した。
【００１６】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ（２．２７２１ｇ）をシリカゲル（ゲル重量１５０ｇ）カラムクロマトグラフィーを用いて分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［９：１（７００ｍＬ）、７：３（４５０ｍＬ）、６：４（９５０ｍＬ）、５５：４５（６００ｍＬ）、１：１（７００ｍＬ）、４５：５５（５００ｍＬ）、４：６（５００ｍＬ）、３：７（６００ｍＬ）、２：８（６００ｍＬ）、１：９（５００ｍＬ）］、酢酸エチル（６００ｍＬ）、酢酸エチル−メタノール［８：２（５００ｍＬ）］、ＭｅＯＨ（６５０ｍＬ）を用い、１５画分［Ｆｒ．Ｈ−１（２２．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−２（５．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−３（６．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−４（８５．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５（８９１．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−６（１１１．２ｍｇ），Ｆｒ．Ｈ−７（３４４．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−８（５９．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−９（１０１．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１０（１８５．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１１（７６．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１２（１０４．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１３（２９１．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１４（６９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−１５（２７７．３ｍｇ）］に分画した。
【００１７】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−５（８９１．８ｍｇ）はシリカゲル（ゲル重量３８ｇ）を用いてさらに分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［８：２（５８０ｍＬ）、６：４（１８０ｍＬ）、４：６（１９０ｍＬ）］、酢酸エチル（２００ｍＬ）、酢酸エチル−メタノール［１：１（９０ｍＬ）］、ＭｅＯＨ（８０ｍＬ）を用い、１０画分［Ｆｒ．Ｈ−５−１（２．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−２（２８．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−３（３９１．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−４（１７２．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−５（２３．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−６（４０．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−７（６５．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−８（２９．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−９（１２．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−５−１０（１１２．８ｍｇ）］に分画した。
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−５−３（９８．８ｍｇ）及びＦｒ．Ｈ−５−４（１１３．２ｍｇ）について逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ−ＩＩ、１０φ×２５０ｍｍ、センシュー科学（株）製；溶離液：メタノール−水＝７：３（酢酸０．１％）；流速：３．０ｍＬ／分）を行ない、エポキシアザジラジオン（１；保持時間３１．４分）を併せて２７．３ｍｇ単離した。
【００１８】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−７（３４４．９ｍｇ）はシリカゲル（ゲル重量１７ｇ）カラムクロマトグラフィーを用いて分画を行った。溶出溶媒としてはｎ−ヘキサン−酢酸エチル［７：３（３１０ｍＬ）、６：４（２８０ｍＬ）、１：１（１７０ｍＬ）］、酢酸エチル（２００ｍＬ）、酢酸エチル−メタノール［１：１（１６０ｍＬ）］、メタノール（１２０ｍＬ）を用い、８画分［Ｆｒ．Ｈ−７−１（１．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−２（４９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−３（１３８．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−４（６８．５ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−５（１０．３ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−６（１１．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−７（８．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−８（２６．８ｍｇ）］に分画した。
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｈ−７−３（１２０．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｈ−７−４（６１．９ｍｇ）及びＦｒ．Ｉ（１９１．８ｍｇ）について逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ−ＩＩ、１０φ×２５０ｍｍ；溶離液：メタノール−水＝７：３；流速：３．０ｍＬ／分）を行ない、ゲデュニン（２；保持時間２０．４分）を併せて２４．３ｍｇ単離した。
【００１９】
塩化メチレン画分Ｆｒ．Ｋ（１．０８６０ｇ）について逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ−ＩＩ、１０φ×２５０ｍｍ；溶離液：メタノール−水＝７：３；流速：３．０ｍＬ／分）を行ない、１７−エピ−１７−ハイドロキシアザジラジオン（３；２４．７ｍｇ、保持時間１０．２分）、７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノール（４；７．９ｍｇ、保持時間２９．６分）を得た。
【００２０】
化合物（１）は文献値1) との1Ｈ ＮＭＲ及びＭＳデータの比較により同定した。
エポキシアザジラジオン（１） ESI-MS m/z 489 [M + Na]+, 505 [M + K]+. 1H-NMR (600 MHz, CDCl3)：δ 1.04 (3H, s, H3-18), 1.07 (3H, s, H3-28), 1.08 (3H, s, H3-29),1.21 (3H, s, H3-30), 1.22 (3H, s, H3-19), 2.03 (3H, s, OAc), 2.18 (1H, dd, J = 3.2, 13.0 Hz, H-5), 2.63 (1H, dd, J = 3.8, 12.7 Hz, H-9), 3.41 (1H, s, H-15), 3.89 (1H, s, H-17), 4.73 (1H, t, J = 2.8 Hz, H-7), 5.88 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22),6.24 (1H , m, H-22), 7.16 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-2), 7.40 (1H, t, J = 1.8 Hz, H-23), 7.56 (1H, m, H-21).
【００２１】
化合物（２）は文献値2) との1Ｈ ＮＭＲ及びＭＳデータの比較により同定した。
ゲデュニン（２） HR-ESI-MS m/z 505.2235 [C28H34O7Na [M + Na]+ : 505.2202]. 1H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.07 (3H, s, H3-28), 1.08 (3H, s, H3-29), 1.16 (3H, s, H3-18), 1.23 (3H, s, H3-19), 1.25 (3H, s, H3-30), 2.11 (3H, s, OAc), 2.17 (1H, dd, J = 2.4, 13.4 Hz, H-5), 2.49 (1H, dd, J = 6.1, 12.7 Hz, H-9), 3.53 (1H, s, H-15), 4.56 (1H, dd, J = 2.2, 3.3 Hz, H-7), 5.62 (1H, s, H-17), 5.87 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-2), 6.34 (1H, br.s, H-22), 7.10 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-1), 7.42 (2H, d, J = 1.5 Hz, H-21 and 23).
【００２２】
化合物（３）は既知化合物だが、スペクトル値の記載されている文献がないので２次元（２Ｄ）−ＮＭＲを解析することで構造の確認を行った。
１７−エピ−１７−ハイドロキシアザジラジオン（３） 白色結晶. IR (KBr)νcm-1：3462 (O-H), 2960, 2878 (C-H), 1736,1716 (C=O α,β-不飽和エノン部), 1667 (C=Oエステル部), 1591 (C=C), 1245, 1028 (C-Oエステル部). [α]D：-57.14°(c 0.21, クロロホルム). HR-ESI-MS m/z 489.2246 [C28H34O6Na [M + Na]+ : 489.2253]. UVλmaxEtOHnm (log ε): 233 (4.18). 1H-NMR (600 MHz, CDCl3)：δ 1.086 (3H, s, H3-28), 1.093 (3H, s, H3-29), 1.19 (3H, s, H3-19), 1.27 (3H, s, H3-18), 1.37 (3H, s, H3-30), 1.59 (2H, m, H2-12), 1.69 (1H, m, Hβ-11), 1.92 (1H, m, Hα-6), 1.96 (3H, s, OAc), 1.98 (1H, m, Hα-11), 2.01 (1H, m, Hβ-6), 2.21 (1H, dd, J = 2.7, 13.1 Hz, H-5), 2.43 (1H, dd, J = 6.9, 11.9 Hz, H-9), 5.34 (1H, t, J = 3.1 Hz, H-7), 5.89 (1H, d, J = 10.3 Hz, H-2), 6.02 (1H, s, H-15), 6.23 (1H, dd, J = 0.7, 1.9 Hz, H-22), 7.12 (1H, d, J = 10.3 Hz, H-1), 7.19 (1H, t, J = 1.4 Hz, H-23), 7.32 (1H, t, J = 1.7 Hz,H-21). 13C-NMR (150MHz, CDCl3)：δ 15.8 (C-11), 19.0 (C-19), 20.9 (-O-CO-Me), 21.2 (C-28), 23.5 (C-6), 25.0 (C-18), 25.5 (C-12), 27.0 (C-29), 27.2 (C-30), 38.4 (C-9), 40.0 (C-10), 44.0 (C-4), 44.8 (C-8), 46.1 (C-5), 51.8 (C-13), 73.8 (C-7), 84.7 (C-17), 109.5 (C-22), 121.0 (C-15), 125.9 (C-2), 127.1 (C-20), 139.7 (C-23), 142.9 (C-21), 156.7 (C-1), 169.7 (-O-CO-Me), 193.4 (C-14), 203.9 (C-3), 206.4 (C-16).
【００２３】
化合物（４）は文献値3)との1Ｈ ＮＭＲ及びＭＳデータの比較により同定した。
７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノール（４） ESI-MS：m/z 513 [M + H]+, 535 [M + Na]+, 551 [M + K]+. 1H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.00 (3H, s, H-30), 1.03 (3H, s, H-28), 1.11 (3H, s, H-29), 1.31 (3H, s, H-19), 1.42(3H, s, H-18), 3.41(1H, s, H-17), 5.63(1H, t, J = 2.7 Hz, H-7), 5.92 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-2), 5.94 (1H, s, H-15), 6.20 (1H, m, H-22), 7.19 (1H, d, J = 10.2 Hz, H-1), 7.39 (4H, m, H-21, H-23, H-3′, H-5′), 7.54 (1H, m, H-4′), 7.91 (2H, dd, J = 1.0, 8.3 Hz, H-2′, H-6′).
【００２４】
参考文献
1) D. Lavie, E. C. Levy, Meliane-Meliacin Relationship, Tetrahedron, 27(16), 3941-3947 (1971)
2) S. A. Khalid, H. Duddeck, M. G. Sierra, Isolation and Characterization of an Antimalarial Agent of the Neem Tree Azadirachta indica, J. Nat. Prod., 52 (5), 922-927 (1989).
3) W. Kraus, R. Cramer, G. Sawitzki, Tetranortriterpenoids from the Seeds of Azadirachta indica, Phytochemistry, 20 (1), 117-120 (1981).
【００２５】
実施例２（抗腫瘍活性）
抗腫瘍活性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロミド）法により測定した。
９６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した腫瘍細胞（３×１０3ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を１００μＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃，飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０-4、１×１０-5、１×１０-6Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを０．２μＬずつそれぞれに添加し、４８時間腫瘍細胞に作用させた。次に、０．５％ＭＴＴ液を１０μＬ加え、３時間後に反応停止液（０．０４ＮＨＣｌ／イソプロパノール）を１００μＬ加え反応を停止させた。よくピペッティングをした後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍ（ｔｏｐ）及び６５５ｎｍ（ｂｏｔｔｏｍ）における吸光度を測定した。各検体の各濃度における細胞生存率は、コントロール群に対する百分率により求め、そこからＥＣ50値を算出した。腫瘍細胞としては、悪性黒色腫であるＣＲＬ１５７９及び白血病細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を用いた。また、陽性対照としてシスプラチンを用いた。
【００２６】
その結果、表１に示すように、化合物（１）〜（４）は強力な抗腫瘍剤として知られているシスプラチンと同等の強い抗腫瘍活性を有することが判明した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
実施例３（アポトーシス誘導能）
アポトーシス誘導能は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色法で核染色することにより試験した。
６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した細胞（（ＣＲＬ１５７９：２×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を２ｍＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃，飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０-4、１×１０-5、１×１０-6Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを４μＬずつそれぞれに添加し、２４時間細胞に作用させた。次に、０．０５％Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液を１００μＬ加え、３０分後に蛍光顕微鏡にて位相差像及び蛍光像を撮影し、細胞の形態変化を観察した。
その結果、化合物（３）、（４）は、いずれも１〜１０μＭで、核の凝集化及び断片化が認められることから、ＣＲＬ１５７９及びJurkat細胞に対する細胞傷害活性はアポトーシス誘導によるものであることが判明した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。
【請求項２】
エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【請求項１】
エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とする悪性腫瘍治療薬。
【請求項２】
エポキシアザジラジオン、ゲデュニン、１７−エピ−１７−ヒドロキシアザジラジオン及び７−Ｏ−ベンゾイルニンボシノールから選ばれる化合物を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【公開番号】特開２００９−２７４９５６（Ｐ２００９−２７４９５６Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３０２３９（Ｐ２００６−２３０２３９）
【出願日】平成１８年８月２８日（２００６．８．２８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２８日（２００６．８．２８）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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