ヌクレオシド合成のための耐熱性生物触媒組合せ
本発明は、ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換え発現ベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクターに関する。
本発明はさらに、リン酸イオンの存在下での糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化方法であって、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）（ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣ＿００２７５４．１）またはその組合せの使用を含んでなる方法に関する。
本発明はさらに、リン酸イオンの存在下での糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化方法であって、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）（ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣ＿００２７５４．１）またはその組合せの使用を含んでなる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属す。
【背景技術】
【０００２】
（デオキシ）ヌクレオシドは、リボース糖またはデオキシリボース糖（これらは環状ペントースである）と結合したプリンまたはピリミジンのような塩基からなるグリコシルアミンである。これらの例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。ヌクレオシド類似体は、逆転写酵素阻害剤またはＲＮＡもしくはＤＮＡ合成の連鎖停止剤として働くその能力のために、抗ウイルス薬および抗癌薬として広く用いられている［１］。
【０００３】
ヌクレオシド類似体の化学合成は、立体選択的に達成されてはいるが、高価なまたは汚染性の試薬を使用し［２］、ともすれば時間のかかる多段階プロセスを含んでいる。生物触媒反応は位置選択的および立体選択的であり、副生成物含量の低減を可能とするので、生物触媒法はヌクレオシドの化学合成に代わる有望な選択肢である。生物触媒法で特に注目されるのは、図１および２に示されているような一般的可逆反応［３］を触媒する酵素による、糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間の酵素的トランスグリコシル化である。
【０００４】
ヌクレオシドホスホリラーゼは、哺乳類細胞および細菌に広く分布しているトランスフェラーゼであり、ヌクレオシド代謝サルベージ経路において中枢的役割を果たす。それらは二重の機能性を有する。一方で、それらは無機リン酸塩の存在下でリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのグリコシド結合の可逆的切断を触媒して、塩基とリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸を生成する。プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを用いるこれらの酵素反応を図１に示す。他方、これらの酵素はプリン塩基またはピリミジン塩基とヌクレオシドとの間のリン酸依存性ペントース転移（すなわち、トランスグリコシル化反応）を触媒して、種々の塩基を有するヌクレオシドを生成する。図２はヌクレオシドホスホリラーゼを用いたワンポット合成の例を示す。
【０００５】
ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼとを組み合わせて用いる場合、用いる出発材料によって、供与ピリミジンヌクレオシドからプリンまたはピリミジン受容塩基への、ならびに供与プリンヌクレオシドからピリミジンまたはプリン受容塩基への糖の転移を可能とする［４］。結果として、種々の供給源、主として細菌に由来するヌクレオシドホスホリラーゼが、ヌクレオシド類似体の酵素的合成の手段として用いられてきた。
【０００６】
本質的に、これらの酵素は、酵素的トランスグリコシル化により改変されたヌクレオシドを得るための多くの研究においてヌクレオシドホスホリラーゼの供給源として用いられてきた種々の微生物株、特に、好熱細菌（すなわち、４５℃〜８０℃の間の温度で生育する細菌）において記載されている。しかしながら、これらの研究で目的生成物の収率は十分に高かったが、トランスグリコシル化に必要な酵素活性の量または比率は至適化されていなかった［５］。それらは反応時間の相当な延長（最大数日）かまたは必要な転換深度に到達させるために用いる細菌バイオマスの増大のいずれかを要した。
【０００７】
その他、トランスグリコシル化プロセスを開発する際には、大量の基質および生成物の可溶化が困難であり、それらの多くが室温の水性媒体中での可溶性が低いという別の問題も生じる。この問題は高温を用いれば解決することができるが、これらのより過酷な反応条件で十分に安定な酵素が必要となる。
【０００８】
古細菌(Archaea)は生命の３つのドメインのうちの１つである単細胞微生物の群であり、その他は真正細菌(Bacteria)と真核生物(Eukarya)である。それらはかつてタクソン細菌下で古細菌(Archaebacteria)と呼ばれていたが、現在では、分けられて別のものであると考えられている。古細菌ドメインは現在、ユリ古細菌門(Euryarchaeota)とクレン古細菌門(Crenarchaeota)という２つの主要な門に分けられている。ユリ古細菌門として、メタン生成微生物、高度好塩菌、好熱好酸性および数種の超好熱菌の混合物が挙げらる。これに対し、クレン古細菌は超好熱菌のみが挙げられる。超好熱菌は、６０℃を超え、最適には８０℃を超える、極めて高熱の環境で生育する生物である。
【０００９】
Cacciapuoti et al.［６〜８］は、超好熱古細菌由来の２つのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）を記載し、特に、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来の酵素５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンホスホリラーゼＩＩ（ＳｓＭＴＡＰＩＩ、ＥＣ２．４．２．２８）およびパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰｆＰＮＰ）を開示している。パイロコッカス・フリオサス酵素は最初にＭＴＡＰＩＩとの注釈が付けられたが、メチルチオアデノシンを切断できなかったことからＰＮＰと改称された。スルホロブス・ソルファタリカスはクレン古細菌に属し、パイロコッカス・フリオサスはユリ古細菌に属す。上記のＥＣコードは、酵素をそれらが触媒する反応によって分類する、International Union of Biochemistry and Molecular Biologyにより提供されている慣例の酵素名である。
【００１０】
超好熱菌由来の特徴的なほとんどの酵素は、宿主生物の至適増殖温度付近の温度に至適活性がある。クローニングし、大腸菌(Escherichia coli)のような中温性宿主で発現させた場合、超好熱酵素は通常それらの熱特性を保持する。この酵素は、宿主生物の至適増殖温度よりはるかに高い温度に至適活性がある場合もある［９］。また、生物の至適増殖温度より１０℃〜２０℃低い温度に至適活性があると記載されている酵素もある［１０〜１１］。しかしながら、スルホロブス・ソルファタリカス５’−メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（６つのサブユニット内ジスルフィド架橋を含む６量体酵素）は、中温性宿主で発現させると、不適切なジスルフィド架橋を形成し、天然酵素よりも安定性および好熱性が低い［１２］。
【００１１】
テルモプロテウス綱(Thermoprotei)は超好熱クラスのクレン古細菌である。古細菌テルモプロテウス綱で配列決定され利用可能なゲノムから、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）に関する配列は３つのみ、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）に関する配列は３つのみ見つかった。これらの６つのタンパク質はそれぞれＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬに、テルモフィルム・ペンデンス(Thermofilum pendens)（Ｈｒｋ５株）由来の仮説タンパク質は受託番号：Ａ１ＲＷ９０（Ａ１ＲＷ９０＿ＴＨＥＰＤ）；スルホロブス・ソルファタリカスの仮説タンパク質はＱ９７Ｙ３０（Ｑ９７Ｙ３０＿ＳＵＬＳＯ）；スタフィロテルムス・マリナス(Staphylothermus marinus)（ＡＴＣＣ４３５８８／ＤＳＭ３６３９／Ｆ１株）由来の仮説タンパク質はＡ３ＤＭＥ１（Ａ３ＤＭＥ１＿ＳＴＡＭＦ）；アエロピルム・ペルニクス(アエロピルム・ペルニクス)由来の仮説タンパク質はＱ９ＹＡ３４（Ｑ９ＹＡ３４＿ＡＥＲＰＥ）；ハイパーサーマス・ブチリカス（ＤＳＭ５４５６／ＪＣＭ９４０３株）由来の仮説タンパク質はＡ２ＢＪ０６（Ａ２ＢＪ０６＿ＨＹＰＢＵ）；およびアシディロブス・サッカロボランス(Acidilobus saccharovorans)（ＤＳＭ１６７０５／ＶＫＭＢ−２４７１／３４５−１５株）由来の仮説タンパク質はＤ９ＰＺＮ７（Ｄ９ＰＺＮ７＿ＡＣＩＳ３）のアクセッション番号で登録されている。これらの配列は総て、未検証との注釈がついており、古細菌におけるそれらの存在はコンピューターで確認されたに過ぎないことを意味する。
【００１２】
たとえ多くの遺伝子が大腸菌(Escherichia coli)で首尾よく高収率で発現できたとしても、超好熱菌由来のいくつかのタンパク質は、１つには稀なコドン利用のために、発現が低いか全く発現しない。実際に、本発明者らの知る限り、上記遺伝子のいずれかの発現に成功したというグループはまだない。
【００１３】
上記の欠点を鑑みて、また、技術的な難しさを鑑みて、本発明者らは予期しないことに、実施可能な組換えベクターを作製し、重要なことには、６０℃より高い温度に至適活性がある組換えホスホリラーゼを得ることができた。本発明の耐熱性かつ化学的に安定な触媒は、古細菌テルモプロテウス綱に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）、およびウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．３）であり、ここで、ＰＮＰアーゼはスルホロブス・ソルファタリカスに由来し（配列番号７）、ＵＰアーゼはアエロピルム・ペルニクスに由来する（配列番号８）。
【００１４】
特に、驚くべきことに、超好熱テルモプロテウス綱に由来する組換えヌクレオシドホスホリラーゼは高い耐熱性、高い触媒効率および１００℃付近またはそれを超える温度での至適酵素活性のような独特な構造機能特性を有することが判明した。これらの組換え酵素は、天然および修飾ヌクレオシド類似体の工業生産を目的とするトランスグリコシル化反応のために、細胞溶解液の形態で、かつ、粗抽出液または精製抽出液の形態で使用できるのが有利である。それらは特に、水性媒体中、有機溶媒中、６０℃〜１２０℃の温度で、またはこれらのパラメーターの組合せで、トランスグリコシル化を触媒して、多くの多様な種類のヌクレオシドを許容される生産収率、反応時間で、経済的な量の酵素を用いて生産するため用途が広い。重要なことには、本発明に記載の生物触媒は、基質または反応生成物を可溶化するために、有機溶媒、６０℃より高い温度またはその双方の存在を必要とする生物変換反応に使用可能である。これらのホスホリラーゼは、水に不溶な基質と反応させるのが理想的である。これらのホスホリラーゼのもう１つの利点はそれらの有機溶媒耐性にあり、すなわち、それらは数反応サイクルの間、再利用することができる。
【００１５】
より有利には、本発明は、ヌクレオシドのワンポット合成に有用なテルモプロテウス綱ヌクレオシドホスホリラーゼの組合せを提供する。酵素は、天然ヌクレオシドまたは類似体ヌクレオシドを生産するために、１段階（ワンポット）合成法または２段階合成法において使用することができる。１段階合成では、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、糖に結合された塩基を別の選択肢に変更するために同じバッチを用いる。２段階では、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、ピリミジンヌクレオシドの糖の遊離に用いられ、次に、１−リン酸−糖が単離され、その後、別の溶液で、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いてプリン塩基をその糖と結合させる。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換えベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクターに関する。
【００１７】
さらに、本発明は、リン酸イオンの存在下で糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化法に関し、前記方法は、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）(National Center for Biotechnology Information Reference Sequence：ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿００２７５４．１）、またはその組合せの使用を含んでなることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ヌクレオシドホスホリラーゼにより触媒される２つの酵素反応の例を示す。上段の１つ目の反応は、オキソニウム様中間体を介したＳＮ１様機構によって起こる加リン酸分解であり、α−リボース−１−リン酸が得られる。２つ目の反応は、リン酸が塩基により置換されるＳＮ２機構によって起こり、β−ヌクレオシドが得られる［１３］。このスキームでは、ウリジンヌクレオシドホスホリラーゼは、ウリジンのＣ−Ｎグリコシド結合の加リン酸分解切断を触媒し、リボース−１−リン酸とウラシルとが得られる。プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（アデノシンヌクレオシドホスホリラーゼ）は第二の基質としての無機オルトリン酸（Ｐｉ）の存在下でグリコシド結合の切断を触媒し、プリン塩基とリボース（デオキシリボース）−１−リン酸とを生じる。天然基質では、これらの反応は可逆的である。
【図２】ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素を用いたワンポット合成のスキーム。
【図３】図３は、クローニング前の最初の発現ベクターｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）の遺伝子地図を示す。ベクター長６３１５ヌクレオチド。Ｔ７プロモーター：塩基２０９〜２２５；Ｔ７プロモータープライミング部位：塩基２０９〜２２８；ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）：塩基２２８〜２５２；リボソーム結合部位（ＲＢＳ）：塩基２８２〜２８８；Ｈｉｓパッチ（ＨＰ）チオレドキシンＯＲＦ：塩基２９８〜６２７；ＴｒｘＦｕｓフォワードプライミング部位：塩基６０７〜６２４；ＥＫ認識部位：塩基６４３〜６５７；ＴＯＰＯ（商標）認識部位１：塩基６７０〜６７４；オーバーハング：塩基６７５〜６７８；ＴＯＰＯ（商標）認識部位２：塩基６７９〜６８３；Ｖ５エピトープ：塩基７００〜７４１；ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）領域：塩基７５１〜７６８；Ｔ７リバースプライミング部位：塩基８２２〜８４１；Ｔ７転写終結領域：塩基７８３〜９１１；ｂｌａプロモーター：塩基１４０７〜１５０５；アンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子（ＯＲＦ）：塩基１５０６〜２３６６；ｐＢＲ３２２オリジン：塩基２５１１〜３１８４；ＲＯＰ ＯＲＦ：塩基３５５２〜３７４３（相補鎖）；ｌａｃＩ ＯＲＦ：塩基５０５５〜６１４６（相補鎖）。
【図４】図４は、５つの温度と３つのｐＨ値とを組み合わせて、温度とｐＨの７つの組合せとした「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」を示す。
【図５】ＵＰアーゼ活性に対するｐＨと温度との相互作用効果を示すコンタープロット。データは、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウエアを用い、Response Surface Methodology (RSM)で統計学的解析した。この酵素は高い好熱性を表し、その活性は最高アッセイ温度（１００℃）まで急速に増加し、この活性は中性（６．５〜７．５）前後、好ましくは７．０前後に明確なｐＨ至適を示した。
【図６】ＰＮＰアーゼ活性に対するｐＨと温度の相互作用効果を示すコンタープロット。データは、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウエアを用い、Response Surface Methodology (RSM)で統計学的解析した。この酵素は高い好熱性を表し、その活性は最高アッセイ温度（１００℃）まで急速に増加し、この活性は中性（６．５〜７．０）前後に明確なｐＨ至適を示した。
【図７】図７は、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）ａ．ｋ．ａ． ｄｅｏＤ遺伝子のコード領域のＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００６７６６。
【図８】図８は、アエロピルム・ペルニクスのピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）ａ．ｋ．ａ． ｕｄｐ遺伝子のコード領域のＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８５４。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明は、ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換え発現ベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクターに関する。
【００２０】
アエロピルム・ペルニクスおよびスルホロブス・ソルファタリカスは９０℃を超える高温で増殖することができる超好熱古細菌である。古細菌は、真核生物および原核生物とは異なる第３の生物群に属す。古細菌は原始生物の系統を引くと考えられ、進化もせず、通常の温度環境にも適応しなかった特殊な生物である。
【００２１】
ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼは、それらの細胞内の天然環境では、工業レベルで所望されるような高収率で、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体の合成ができない。この重大な制限を克服するために、本発明者らは、ｕｄｐ遺伝子およびｄｅｏＤ遺伝子と、細菌のような選択された宿主においてヌクレオシドホスホリラーゼを過剰発現させるのに適当なエレメントとを含んでなる発現ベクターを設計すべく組換えＤＮＡ技術を用いてきた。設計された発現ベクターはまた、種々のホスホリラーゼの可溶化および精製を助ける。
【００２２】
本発明のベクターは、種々のヌクレオシドホスホリラーゼをコードするヌクレオチド配列と、前記ベクターの宿主細胞内での選択および自己複製を可能とするヌクレオチド配列とを含んでなる。
【００２３】
組換え発現ベクターの構築は従来の組換えＤＮＡ技術、すなわち、無細胞系においてＤＮＡセグメントを連結する手法を用いて行う。
【００２４】
「ベクター」とは、適当な大きさの別のＤＮＡ断片が、そのベクターの自己複製能を消失することなく組み込まれ（クローニングされ）得るウイルス、プラスミドまたは高等生物の細胞に起源するＤＮＡ分子を意味する。例としては、プラスミド、コスミド、および酵母人工染色体がある。ベクターは多くの場合、いくつかの供給源由来のＤＮＡ配列を含有する組換え分子である。「発現ベクター」とは、クローニングされた遺伝子または遺伝子群の転写および翻訳を可能とするのに必要な制御または調節配列をさらに含んでなるベクターを意味する。本発明には環状または線状化ＤＮＡベクターが有用である。
【００２５】
本発明のベクターの宿主細胞内での選択および自己複製を可能とするためには、選択されるベクターは選択された宿主細胞に適合しなければならない。好ましい実施形態では、前記ベクターを選択可能とし、大腸菌で自己複製可能とするヌクレオチド配列は、選択された大腸菌株のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをプロモーターと結合可能とする遺伝子をコードするＴ７プロモーターである。「選択可能」とは、そのベクターが後代細菌で安定を維持することを意味する。選択は、ベクター中の適当な選択マーカー遺伝子（そのマーカー遺伝子の発現によって、そのベクターで形質転換された細胞の同定が可能になる）の導入に応じたストリンジェントな培地条件によって達成される。選択マーカー遺伝子は多くの場合、抗生物質耐性遺伝子である。本発明に関して好ましい選択マーカー遺伝子は、カナマイシン、テトラサイクリン、カルベニシリン、より好ましくはアンピシリンである。
【００２６】
本発明はさらに、上述の組換え発現ベクターのいずれか一方または双方の組換え発現ベクターを同じ宿主細胞内に含んでなる宿主細胞に関する。
【００２７】
「宿主細胞」とは、ＰＮＰアーゼまたはＵＰアーゼヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベクターで形質転換された細胞を意味する。組換えＤＮＡベクターの別の態様では、宿主細胞にヌクレオシドホスホリラーゼを生産させ、培地条件が好適である場合に、前記ヌクレオシドホスホリラーゼはヌクレオシドの取得を触媒する。本発明の特定の実施形態では、それぞれスルホロブス・ソルファタリカスおよびアエロピルム・ペルニクス由来のＰＮＰアーゼ遺伝子およびＵＰアーゼ遺伝子をＤＮＡ発現ベクターに導入した。図７および図８は、本発明に関連する核酸およびアミノ酸配列、すなわち、それぞれスルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤの核酸配列（配列番号７）およびアエロピルム・ペルニクスｕｄｐ（配列番号８）の核酸配列の一覧である。
【００２８】
当業者ならば、ヌクレオシド生産を最大にするために、最初のベクターおよび宿主細胞株から構成される発現系を適宜選択することができる。
【００２９】
一実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。
【００３０】
特定の実施形態では、大腸菌はＢＬ２１細菌株に属す。大腸菌ＢＬ２１に好適な発現ベクターは、例えばｐＥＴベクター、ｔｒｃＨｉｓベクターおよびｐＵＢベクター（これらは総てInvitrogen製）、ならびにｐＧＥＸベクターおよびＧＳＴベクター（Amersham製）である。大腸菌ＤＨ５α細菌株とｐＵＣベクターとの組合せ、および大腸菌Ｆ’とＰＳＬベクター、ＰＥＺＺベクターまたはＭ１３ベクター（これらは総てAmersham製）との組合せも本発明において有用である。
【００３１】
一実施形態において、宿主細胞は処理されたものであっても溶解液の形態であってもよい。
【００３２】
本発明はさらに、リン酸イオンの存在下での糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化法に関し、該方法は、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）（ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣ＿００２７５４．１）またはそれらの組合せの使用を含んでなることを特徴とする。
【００３３】
「糖供与ヌクレオシド」とは、β−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖と結合した核酸塩基（単に塩基と呼ぶことが多い）からなるグリコシルアミンを意味する。「糖供与ヌクレオシド」としては、限定されるものではないが、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシン、ならびにＤ−リボースまたは２’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシド；２’位、３’位および／または５’位が修飾されたリボース基を含むヌクレオシド；および糖がβ−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−キシロース、３’−デオキシリボース、３’，５’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、５’−デオキシリボース、２’，５’−ジデオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、３’−アミノ−３’−デオキシリボース、または２’−フルオロ−２’−デオキシリボースであるヌクレオシドが挙げられる。
【００３４】
「受容塩基」とは、核酸塩基、ヌクレオチド塩基、窒素塩基、または単に塩基を意味する。本来、塩基はＤＮＡまたはＲＮＡの一部である。主要な核酸塩基はシトシン、グアニン、アデニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、チミン（ＤＮＡ）およびウラシル（ＲＮＡ）であり、それぞれＣ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＵと省略される。本発明において「受容塩基」とは、修飾された核酸塩基および類似体核酸塩基を含んでなるものを意味する。ＤＮＡの場合、最も一般的な修飾塩基は５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）である。ＲＮＡの場合には、多くの修飾塩基が存在し、シュードウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、リボチミジン（ｒＴ）および７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が挙げられる。ヒポキサンチンおよびキサンチンは、突然変異誘発物質の存在によって作出される多くの塩基のうちの２つである。受容塩基の他の例としては、天然または置換ピリミジンおよびプリン塩基；１位、２位、６位の１箇所以上で置換されたプリン塩基；３位、５位の１箇所以上で置換されたピリミジン塩基；およびプリン、２−アザプリン、８−アザプリン、１−デアザプリン（イミダゾピリジン）、３−デアザプリン、７−デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−メルカプトプリンが挙げられる。
【００３５】
このトランスグリコシル化法は、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、および特に、ヌクレオシド部分またはその類似体を含んでなる、含む、または、からなる活性医薬成分(active pharmaceutical ingredients)（ＡＰＩ）の調製に有用である。ＡＰＩを薬品（医薬品）の製造に用いることを意図する任意の物質または物質の混合物として理解すれば、それは薬剤の製造に用いる場合には、薬品の有効成分となる。このような物質は薬理活性または疾病の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防における他の効果を与えること、または身体の構造および機能に影響を与えることを意図する(Eudralex, Part II of volume 4 EU Guidelines to Good Manufacturing Practice)。
【００３６】
ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）とプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ；Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）との組合せは、供与ヌクレオシドから受容塩基へ糖部分を効率的に転移させる。
【００３７】
出発材料として他のピリミジンヌクレオシドおよびピリミジン塩基を用いてピリミジンヌクレオシドを製造する場合には、ＵＰアーゼ単独の使用で十分であるが、ＰＮＰアーゼもこの加リン酸分解工程に寄与し得るので、ＰＮＰアーゼおよびＵＰアーゼの両酵素を使用することが好ましい。これに対し、出発材料として他のプリンヌクレオシドおよびプリン塩基を用いてプリンヌクレオシドを製造する場合には、ＰＮＰアーゼおよびＵＰアーゼ双方の使用も好ましい。他方、ピリミジンヌクレオシドからプリンヌクレオシドへ、例えば、ウリジンから２，６ジアミノプリンリボシドへの反応である場合には、ＰＮＰアーゼおよびＵＰアーゼの両酵素を用いる方が、別々に各酵素を用いるよりもはるかに上手く行く。
【００３８】
好ましくは、トランスグリコシル化法はＵＰアーゼとＰＮＰアーゼとの組合せを用いる。特にトランスグリコシル化反応に最適な生物触媒を得るためには、粗細胞溶解液または明澄化した粗酵素溶液を種々の割合で混合すればよい。
【００３９】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、アエロピルム・ペルニクスのＵＰアーゼおよびスルホロブス・ソルファタリカスのＰＮＰアーゼは、上記および以下に示される実施形態のいずれか一つに従って宿主細胞により提供される。
【００４０】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法において、ＵＰアーゼ、ＰＮＰアーゼまたはそれらの組合せは溶解液の形態で用いられる。
【００４１】
一実施形態において、トランスグリコシル化法は、（ｉ）宿主細胞を好適な培養培地で培養する工程；（ｉｉ）ＵＰアーゼ、ＰＮＰアーゼまたはその双方を過剰発現させる工程；（ｉｉｉ）所望により細胞溶解液を作製する工程；（ｉｖ）糖供与ヌクレオシド、受容塩基およびリン酸イオンを加える工程；および（ｖ）反応混合物からヌクレオシドを回収する工程を含んでなる。
【００４２】
特定の実施形態では、ベクターを含んでなる大腸菌形質転換体は、トリプトン、酵母抽出液、塩化ナトリウム、ならびにカナマイシン、テトラサイクリン、カルベニシリンおよびアンピシリンからなる群から選択される抗生物質を含んでなる培養培地中、好ましくは３７℃にて、およそ６００ｎｍの波長で光学密度が０．５〜０．８となるまで増殖させてもよい。次に、培養物にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１００ｍｇ／ｌとなるように加え、６〜１２時間の間３７℃で誘導を行えばよい。細胞は４℃で遠心分離することにより回収することができ、細胞ペレットは３回の凍結−解凍サイクルによって溶解させればよい。これらの組換え宿主細胞は当業者に公知の標準的な技術によって破砕すればよい。得られた細胞溶解液はそのまま生物触媒として用いてもよいし、あるいは遠心分離を行って細胞残渣を除去し、明澄化した粗酵素溶液を得てもよい。本明細書において「生物触媒」とは、基質の生成物への変換、この場合にはヌクレオシドの生体変換を触媒し得る任意の生物学的存在を意味する。
【００４３】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドは、Ｄ−リボースおよび２’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシ；２’位、３’位および／または５’位で修飾されたリボース基を含むヌクレオシド；および糖がβ−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−キシロース、３’−デオキシリボース、３’，５’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、５’−デオキシリボース、２’，５’−ジデオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、３’−アミノ−３’−デオキシリボース、２’−フルオロ−２’−デオキシリボースであるヌクレオシドから選択される。
【００４４】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、受容塩基は、天然または置換ピリミジン塩基およびプリン塩基；プリン環の１位、２位、６位またはその組合せの位置で置換されたプリン塩基；ピリミジン環の３位、５位またはその組合せの位置で置換されたピリミジン塩基；例えば、プリン、２−アザプリン、８−アザプリン、１−デアザプリン（イミダゾピリジン）、３−デアザプリン、７−デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−メルカプトプリンから選択される。
【００４５】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、得られるヌクレオシド類似体は当技術分野で知られているような活性医薬成分（ＡＰＩ）である。
【００４６】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、該方法は６０〜１００℃の間で行われる。
【００４７】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、水性媒体中、または非プロトン性極性共溶媒系で行われる。
【００４８】
一実施形態において、非プロトン性極性共溶媒系はジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、またはその任意の組合せから選択される。
【００４９】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は２，６−ジアミノプリンである。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、糖部分の供与体としてウリジンまたは２’−デオキシウリジンを用いる、ヌクレオシドのワンポット合成を提供するが、これは本発明の組換えＵＰアーゼ酵素がこれらの基質に最も特異的であるからである。しかしながら、この酵素は、Ｂ．ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)などの多くの下等生物であいにく見られるように［１４］、ウリジン、２’−デオキシウリジンと他のピリミジンヌクレオシドを識別しないので、いずれかの糖部分供与体とともに使用することができる。
【００５１】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は５−フルオロウラシルである。
【００５２】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は５−トリフルオロメチルウラシルである。
【００５３】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基はトランス−ゼアチンである。
【００５４】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は２−クロロ−６−メチルアミノプリンである。
【００５５】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は６−ジメチルアミノプリンである。
【００５６】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は６−メルカプトプリンである。
【００５７】
「耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼ」とは、熱に安定で、耐熱性があり、別の反応を果たすのに十分なヌクレオシドホスホリラーゼ活性を保持し、かつ、トランスグリコシル化反応を果たすのに必要な時間、温度上昇に曝されても不可逆的に変性しない（不活性にならない）酵素を意味する。
【００５８】
以下に示す実施例の目的は、その適用分野の限定を構成するものではなく、本発明を説明することである。
【実施例】
【００５９】
上述のように、本発明によるトランスグリコシル化反応は、ＵＰアーゼまたはＰＮＰアーゼ生産細胞から得られたＵＰアーゼ酵素およびＰＮＰアーゼ酵素を用いて行った。このような細胞は、好ましくは、多量のＵＰアーゼまたはＰＮＰアーゼを発現することができる遺伝的に改変された大腸菌細胞である。このような細胞を得る方法、酵素およびそれらの特徴、ならびにいくつかのヌクレオシド類似体の生産を、以下に示す添付の実施例で示す。
【００６０】
実施例１
大腸菌ｄｅｏＤの構築
スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）配列はＧｅｎＢａｎｋで受託番号ＡＥ００６７６６として見出された。この遺伝子を、２単位のＰｌａｔｉｏｎｕｍ Ｐｆｘ酵素(Invitrogen)、１ｍＭ ＭｇＳＯ４および１×酵素増幅バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰおよび０．３μＭの各プライマーを、スルホロブス・ソルファタリカスＰ２由来のオリゴヌクレオチド5’-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3’（スルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤフォワード；配列番号１）および5’-aatcagttttaagaatcttaaggtaat-3’（スルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤリバース；配列番号２）［１５］とともに用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、初期変性工程９４℃で３０分、その後、変性工程９４℃で１分、アニーリング／伸長工程６０℃で１．５分および６８℃で１分の温度サイクル３６回で行った。３６サイクルの後、サンプルを６８℃に１０分、最後に４℃に曝した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そのゲルからＤＮＡバンドを精製した（Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．（商標）ＵＶ−Ｆｒｅｅゲル精製キット、Invitrogen）。増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子を保持するｐＵＣ１８ベクター［１７］のポリリンカー領域にクローニングした。クローニング領域を完全に配列決定したところ、データバンク配列と完全に同一であることが判明した。
【００６１】
実施例２
大腸菌ｕｄｐの構築
アエロピルム・ペルニクスのピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）配列はＧｅｎＢａｎｋで受託番号ＮＣ＿０００８５４．２として見出された。この遺伝子を、２単位のＰｌａｔｉｏｎｕｍ Ｐｆｘ酵素(Invitrogen)、１ｍＭ ＭｇＳＯ４および１×酵素増幅バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰおよび０．３μＭの各プライマーを、アエロピルム・ペルニクスＫ１由来のオリゴヌクレオチド5’-caccgtggcccgctacgttctcctc-3’（アエロピルム・ペルニクスｕｄｐフォワード；配列番号３）および5’-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3’（アエロピルム・ペルニクス リバース；配列番号４）［１６］とともに用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は初期変性工程９４℃で３０分、その後、変性工程９４℃で１分、アニーリング／伸長工程６０℃で１．５分および６８℃で１分の温度サイクル３６回で行った。３６サイクルの後、サンプルを６８℃に１０分、最後に４℃に曝した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そのゲルからＤＮＡバンドを精製した（Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．（商標）ＵＶ−Ｆｒｅｅゲル精製キット、Invitrogen）。増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子を保持するｐＵＣ１８ベクター［１７］のポリリンカー領域にクローニングした。クローニング領域を完全に配列決定したところ、データバンク配列と完全に同一であることが判明した。
【００６２】
実施例３
ｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）ベクターへのクローニングおよび細胞の形質転換
アエロピルム・ペルニクスｕｄｐ遺伝子配列およびスルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を、プラスミド複製のためのｐＢＲ３２２ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝子、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの結合が可能なＴ７プロモーター、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が存在しない場合に発現の阻害を可能等するｌａｃオペレーター、ＲＮＡの翻訳のためのリボソーム結合部位、融合タンパク質の溶解度を高めるためのＨｉｓパッチ−チオレドキシン、ならびに融合タンパク質の検出および精製のためのポリヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を含んでなるｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（ｐＥＴ１０２ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（商標）発現キット、Invitrogen）にクローニングした（図３）。このベクターを熱ショックにより、異種遺伝子の調節発現に用いられる市販株である大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴ１０２ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（商標）発現キット、Invitrogen）に導入した。これはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含んでなり、これにより、この株はＩＰＴＧによる組換えタンパク質の過剰発現のためのＴ７プロモーターを含んでなるｐＥＴベクターの使用に適合するようになる。
【００６３】
得られた組換えベクターを、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ １０単位で処理することによって分析した。陽性クローンを、シーケンシングプライマーＴｒｘＦｕｓフォワード5’TTCCTCGACGCTAACCTG3’（配列番号５）およびＴ７リバース5’TAGTTATTGCTCAGGGGTGG3’（配列番号６）を用いて配列決定した。
【００６４】
実施例４
組換え株の発酵
本発明が関連する組換え株をそれぞれ、アンピシリンを添加したトリプチケースソイ（toripticase soy）固体培地、ｐＨ＝７にてバッチ様式で培養した。この培養物の１コロニーを、Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏパウダー１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌおよびＮａＣｌ ５ｇ／ｌを含有する栄養ブロスｎ°２(Oxoid)に、２００ｍｇ／ｌアンピシリンを添加したものに通した。これを３７℃で激しく振盪しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。発現プラスミドを保持する大腸菌株を６００ｎｍでの光学密度が０．６となるまで増殖させた後、ＩＰＴＧ（最大１００ｍｇ／ｌ）を加え、さらに８時間培養を続けた。発酵が完了したところで培養培地を遠心分離し、細胞ペレットを３０ｍＭのｐＨ７リン酸バッファーで洗浄した。得られたバイオマスを使用するまで−２０℃で保存した。
【００６５】
実施例５
ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼの部分精製（細胞溶解液の調製）
タンパク質の部分精製については、酵素ＵＰアーゼまたはＰＮＰアーゼを発現する組換え株の培養物から遠心分離または精密濾過により分離した細胞ペーストを、リゾチーム１６０ｍｇを添加して０℃で１時間インキュベートした後に、超急速凍結−解凍サイクル（−８０℃／３７℃）を行い、最後にデオキシリボヌクレアーゼＩ １，０００単位を加えて粘度を下げることによって破砕した。
【００６６】
実施例６
ＵＰアーゼ酵素の酵素活性の測定
ＵＰアーゼ発現細胞の懸濁液を含んでなり、ｐＨ７．０のリン酸カリウムバッファーで１：１００（容量／容量）に希釈した遠心分離済み細胞溶解液１００マイクロリットルを、３０℃でプレインキュベートしたｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸バッファー中７５ｍＭのウリジン溶液８００マイクロリットルに加えた。５分後に１ｍｌの２Ｎ ＨＣｌを加えることでこの加リン酸分解反応を停止させた。この反応混合物のアリコートを、２５０×４．６ｍｍのサイズのＫｒｏｍａｓｉｌ １００−５Ｃ１８(Akzo Nobel)カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。溶出は４％メタノール水溶液を用いて行った。この細胞溶解液の酵素活性を、ｍｌ当たりの単位（ウラシルのμモル／分／ｍｌ）で表し、同じ条件で溶出した標準ウラシル溶液に対して比例計算した。およそ５９０単位／ｍｌの遠心分離済み細胞溶解液が回収された。
【００６７】
実施例７
ＰＮＰアーゼ酵素の酵素活性の測定
ＰＮＰアーゼ発現細胞の懸濁液を含んでなり、ｐＨ７．０のリン酸カリウムバッファーで１：１００（容量／容量）に希釈した遠心分離済み細胞溶解液１００マイクロリットルを、３０℃でプレインキュベートしたｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸バッファー中６０ｍＭのイノシン溶液８００マイクロリットルに加えた。正確に１０分後に１ｍｌの２Ｎ ＨＣｌを加えることでこの加リン酸分解反応を停止させた。この反応混合物のアリコートを、２５０×４．６ｍｍのサイズのＫｒｏｍａｓｉｌ １００−５Ｃ１８(Akzo Nobel)カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。溶出は４％メタノール水溶液を用いて行った。この細胞溶解液の酵素活性をｍｌ当たりの単位（ヒポキサンチンのμモル／分／ｍｌ）で表し、同じ条件で溶出した標準ヒポキサンチン溶液に対して比例計算した。およそ３１０単位／ｍｌの遠心分離済み細胞溶解液が回収された。
【００６８】
実施例８
トランスグリコシル化触媒活性の測定
トランスグリコシル化触媒活性の測定については、実施例６および７の場合と同様に測定したＵＰアーゼ：ＰＮＰアーゼ酵素活性比が約１：１となるように溶解液を混合することにより、ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼの双方を含有する細胞溶解液の混合物を作製した。トランスグリコシル化反応は以下の条件において分析的規模で行った：２５０μｌの細胞溶解液（ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼ各酵素活性１４単位に相当）を、以下の組成：４ｍＭ １−β−Ｄ−リボフラノシルウラシル（ウリジンヌクレオシド）、４ｍＭアデニン塩基、３０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７を有する１０ｍｌの溶液に加え、サーモスタットで６０℃に制御した。６０℃で１．５時間後、混合物を１：５希釈し、氷冷することにより反応を停止させた。アデニン塩基の９−β−Ｄ−リボフラノシルアデニン（アデノシンヌクレオシド）の生物変換のパーセンテージは、反応混合物のアリコートを、２５０×４．６ｍｍのサイズのＫｒｏｍａｓｉｌ １００−５Ｃ１８(Akzo Nobel)カラムを用い、４％メタノール−水溶液で溶出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析することにより測定した。トランスグリコシル化触媒活性を、単位／ｍｌ（１．５時間で形成されたＡｒａ−Ａのμモル／細胞溶解液混合物ｍｌ）または単位／湿潤樹脂ｇ（１．５時間で形成されたＤ−リボフラノシルアデニンのμモル／細胞溶解液ｍｌ）で表し、同じ条件でＨＰＬＣにより溶出された標準的なＤ−リボフラノシルアデニン溶液に対して比例計算した。これらの条件下で、約５５パーセントのアデノシンヌクレオシドが形成された（およそ９単位／細胞溶解液ｍｌ）。
【００６９】
実施例９
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に対する温度およびｐＨの効果
ヌクレオシドホスホリラーゼの性能に対するｐＨおよび温度の影響を、「実験計画法」を用いて検討した。最大酵素活性が得られる条件を確認するために種々の温度と種々のｐＨ値を組み合わせた。実験範囲を８０℃〜１００℃およびｐＨ５．５〜８．５の間と定義した。図４に示されるように、「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」に従って５つの温度を３つのｐＨと組み合わせて、温度とｐＨの７つの組合せとした。基質を選択された反応溶液および温度で酵素を伴わずにインキュベートした後、酵素を加え、選択された条件でインキュベートした。これらのサンプルをＰＮＰアーゼまたはＵＰアーゼ酵素の酵素活性を測定するために上記のように処理した。活性値は対応する観測最大値（１００％）に対するパーセンテージとして表した。結果はそれぞれ図５および６に示す。
【００７０】
実施例１０
耐熱性
酵素の耐熱性は８０℃でアッセイした。ｐＨ７．０〜７．２のリン酸カリウムバッファーで１：１００または１：１０００容量／容量希釈した、ＵＰアーゼまたは／およびＰＮＰアーゼ発現細胞の懸濁液（細胞溶解液）１００〜２００マイクロリットルの間の酵素アリコートを調製した。これらの生物触媒を８０℃で種々の時間インキュベートした。加熱後、これらの溶液をすぐに氷上で保持し、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定は実施例６および７に記載のようにして行った。８０℃で１０時間後にヌクレオシドホスホリラーゼ活性の失活は見られなかった。
【００７１】
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に対する溶媒の効果
有機共溶媒は反応に慣用され、単離される酵素は比較的高濃度の共溶媒の条件下で生存できなければならない。実験はメタノール（プロトン性極性溶媒）およびジメチルスルホキシド（非プロトン性の極性溶媒）などの有機溶媒の存在下で実施した。本発明のヌクレオシドホスホリラーゼ酵素は有機溶媒に耐性があり、５および１０容量％の有機溶媒を含有するバッファー溶液中で活性を示した。
【００７２】
表１ 数種の有機溶媒に対するＰＮＰアーゼ酵素の安定性
【表１】
ａＰＮＰアーゼ酵素を含んでなる細胞溶解液の相対的活性を、２種類の濃度の有機溶媒で、実施例７に記載の標準アッセイを用いて測定し、その相対的活性を、ＰＮＰアーゼ酵素を含むが有機溶媒を含まない細胞溶解液の活性と比較した。ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＭｅＯＨ：メタノール。
【００７３】
表２ 数種の有機溶媒に対するＵＰアーゼ酵素の安定性
【表２】
ｂＵＰアーゼ酵素を含んでなる細胞溶解液の相対的活性を、２種類の濃度の有機溶媒で、実施例６に記載の標準アッセイを用いて測定し、その相対的活性を、ＵＰアーゼ酵素を含むが有機溶媒を含まない細胞溶解液の活性と比較した。ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＭｅＯＨ：メタノール。
【００７４】
実施例１１
一般的な生物変換手順
ワンポットトランスグリコシル化反応は、反応試験内で穏やかに攪拌しながら、選択した反応温度およびｐＨで行った。用いた細胞溶解液混合物の触媒的トランスグリコシル化活性は約１２単位／ｍｌであった（実施例８で測定した通り）。ＰＮＰアーゼ：ＵＰアーゼ活性比が１：１となるように調製した細胞溶解液混合物を用いてヌクレオシドを作製した。
【００７５】
基質は、下記のものであった：
１）２’−デオキシリボース−１−リン酸またはリボース−１−リン酸供与体として働く天然２’−デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシド
２）糖の１位に結合している第二の天然または合成プリン塩基またはピリミジン塩基、
【００７６】
反応が終了したところで、反応混合物を遠心分離し、その後、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過装置（ＹＭ−３膜）を用いて濾過し、製造者が示しているプロトコールに従って生成物を分離した。連続反応（一般に３〜５回の間）のため、新たに調製した反応混合物を添加することにより生物触媒を再循環させることができる。濾過溶液は上記と同じ条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニタリングした。生物変換収率を塩基類似体の初期濃度に基づいて計算した。
【００７７】
実施例１２
２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
プリンヌクレオシドの製造は、これらの塩基の水性媒体中での溶解度が低いためにより困難である。本発明では、本発明者らは、この問題を解決するために酵素競合特性を用いた。本発明者らが用いた戦略は、これらの基質の溶解度を高めるための有機共溶媒および／または高温の使用を包含した。
【００７８】
１２．１ 共溶媒を用いた２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
アッセイは６０℃にて、５および１０％の非プロトン性二極性共溶媒中で行い、１２単位／ｍｌの細胞溶解液を、下記組成：
１． １５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２． ５ｍＭ２，６−ジアミノプリン、および
３． ３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
の基質溶液を含み、サーモスタットで６０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００７９】
５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。表３に、共溶媒の存在下で製造された２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率を示す。得られた２，６−ジアミノプリンヌクレオシド（２，６−ジアミノプリンリボシドまたは２，６−ジアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。これらの反応では、生成物が高収率で得られた（８０％超）。
【００８０】
表３ ６０℃で種々の％の共溶媒を用いた場合の２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率。ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【表３】
【００８１】
１２．２． 共溶媒を使用しない２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
共溶媒を用いない２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造は、このプリン塩基の水溶解度が限定されているために８０℃を超える温度でのみ行うことができた。アッセイは種々の温度（８０、９０および１００℃）で行った。１２単位／ｍｌの細胞溶解液を、下記組成：
１． １５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２． ５ｍＭ２，６−ジアミノプリン、および
３． ３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
の基質溶液を含み、サーモスタットで選択された温度に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００８２】
５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。表３に、共溶媒の存在下で製造された２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率を示す。得られた２，６−ジアミノプリンヌクレオシド（２，６−ジアミノプリンリボシドまたは２，６−ジアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。表４に、有機溶媒を用いずに製造した２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率を示す。この反応の生物変換収率はアッセイした総ての温度で８０％前後であった。
【００８３】
表４ 有機共溶媒を用いない場合の種々の温度での２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率
【表４】
【００８４】
実施例１３
他のヌクレオシドの製造
トランスグリコシル化反応を種々の受容塩基を用いて行った。これらの反応は、８０℃で種々の時間、プリン塩基の場合には共溶媒として１０％ＤＭＳＯを用い、また、ピリミジン受容塩基の場合には共溶媒を用いずに行った。生物変換のパーセンテージを受容塩基の初期濃度に対して比例計算し、反応混合物のＨＰＬＣ分析により測定した。
【００８５】
１３．１ トリフルオロメチルウラシルヌクレオシドの製造
約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌの触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
７．５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２．５ｍＭトリフルオロメチルウラシル、および
２０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃の間に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００８６】
８０℃で３時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。反応の生物変換収率は６０％より高かった。得られたトリフルオロメチルウラシルヌクレオシド（トリフルオロメチルウリジンまたは２’−デオキシトリフルオロメチルウリジン）をＨＰＬＣにより分析した。
【００８７】
１３．２ ５−フルオロウラシルヌクレオシドの製造
５−フルオロウラシルヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
７．５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２．５ｍＭ５−フルオロウラシル、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００８８】
８０℃で３時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。反応の生物変換収率は５０％より高かった。得られた５−フルオロウラシルヌクレオシド（５−フルオロウリジンおよび５−フルオロ−２’−デオキシウリジン）をＨＰＬＣにより分析した。
【００８９】
１３．３ トランス−ゼアチンヌクレオシドの製造
トランス−ゼアチンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
７．５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２．５ｍＭトランス−ゼアチン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９０】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は８０％より高かった。得られたトランス−ゼアチンヌクレオシド（トランス−ゼアチンリボシドおよびトランス−ゼアチンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９１】
１３．４ ２−クロロ−６−メチルアミノプリンヌクレオシドの製造プロセス
２−クロロ−６−メチルアミノプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
１５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
５ｍＭ２−クロロ−６−メチルアミノプリン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９２】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は８０％より高かった。得られた２−クロロ−６−メチルアミノプリンヌクレオシド（２−クロロ−６−メチルアミノプリンリボシドおよび２−クロロ−６−メチルアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９３】
１３．５ ６−ジメチルアミノプリンヌクレオシドの製造
６−ジメチルアミノプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
１５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
５ｍＭ６−ジメチルアミノプリン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９４】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は８０％より高かった。得られた６−ジメチルアミノプリンヌクレオシド（６−ジメチルアミノプリンリボシドおよび６−ジメチルアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９５】
１３．６ ６−メルカプトプリンヌクレオシドの製造
６−メルカプトプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
１５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
５ｍＭ６−メルカプトプリン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９６】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は５０％より高かった。得られた６−メルカプトプリンヌクレオシド（６−メルカプトプリンリボシドおよび６−メルカプトプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９７】
本明細書に引用されている総ての刊行物、特許および特許出願は、個々に引用することにより本明細書の一部とされるかのように、引用することによりその全内容が本発明の一部とされる。
【参照文献】
【００９８】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属す。
【背景技術】
【０００２】
（デオキシ）ヌクレオシドは、リボース糖またはデオキシリボース糖（これらは環状ペントースである）と結合したプリンまたはピリミジンのような塩基からなるグリコシルアミンである。これらの例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。ヌクレオシド類似体は、逆転写酵素阻害剤またはＲＮＡもしくはＤＮＡ合成の連鎖停止剤として働くその能力のために、抗ウイルス薬および抗癌薬として広く用いられている［１］。
【０００３】
ヌクレオシド類似体の化学合成は、立体選択的に達成されてはいるが、高価なまたは汚染性の試薬を使用し［２］、ともすれば時間のかかる多段階プロセスを含んでいる。生物触媒反応は位置選択的および立体選択的であり、副生成物含量の低減を可能とするので、生物触媒法はヌクレオシドの化学合成に代わる有望な選択肢である。生物触媒法で特に注目されるのは、図１および２に示されているような一般的可逆反応［３］を触媒する酵素による、糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間の酵素的トランスグリコシル化である。
【０００４】
ヌクレオシドホスホリラーゼは、哺乳類細胞および細菌に広く分布しているトランスフェラーゼであり、ヌクレオシド代謝サルベージ経路において中枢的役割を果たす。それらは二重の機能性を有する。一方で、それらは無機リン酸塩の存在下でリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのグリコシド結合の可逆的切断を触媒して、塩基とリボース−１−リン酸またはデオキシリボース−１−リン酸を生成する。プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを用いるこれらの酵素反応を図１に示す。他方、これらの酵素はプリン塩基またはピリミジン塩基とヌクレオシドとの間のリン酸依存性ペントース転移（すなわち、トランスグリコシル化反応）を触媒して、種々の塩基を有するヌクレオシドを生成する。図２はヌクレオシドホスホリラーゼを用いたワンポット合成の例を示す。
【０００５】
ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼとプリンヌクレオシドホスホリラーゼとを組み合わせて用いる場合、用いる出発材料によって、供与ピリミジンヌクレオシドからプリンまたはピリミジン受容塩基への、ならびに供与プリンヌクレオシドからピリミジンまたはプリン受容塩基への糖の転移を可能とする［４］。結果として、種々の供給源、主として細菌に由来するヌクレオシドホスホリラーゼが、ヌクレオシド類似体の酵素的合成の手段として用いられてきた。
【０００６】
本質的に、これらの酵素は、酵素的トランスグリコシル化により改変されたヌクレオシドを得るための多くの研究においてヌクレオシドホスホリラーゼの供給源として用いられてきた種々の微生物株、特に、好熱細菌（すなわち、４５℃〜８０℃の間の温度で生育する細菌）において記載されている。しかしながら、これらの研究で目的生成物の収率は十分に高かったが、トランスグリコシル化に必要な酵素活性の量または比率は至適化されていなかった［５］。それらは反応時間の相当な延長（最大数日）かまたは必要な転換深度に到達させるために用いる細菌バイオマスの増大のいずれかを要した。
【０００７】
その他、トランスグリコシル化プロセスを開発する際には、大量の基質および生成物の可溶化が困難であり、それらの多くが室温の水性媒体中での可溶性が低いという別の問題も生じる。この問題は高温を用いれば解決することができるが、これらのより過酷な反応条件で十分に安定な酵素が必要となる。
【０００８】
古細菌(Archaea)は生命の３つのドメインのうちの１つである単細胞微生物の群であり、その他は真正細菌(Bacteria)と真核生物(Eukarya)である。それらはかつてタクソン細菌下で古細菌(Archaebacteria)と呼ばれていたが、現在では、分けられて別のものであると考えられている。古細菌ドメインは現在、ユリ古細菌門(Euryarchaeota)とクレン古細菌門(Crenarchaeota)という２つの主要な門に分けられている。ユリ古細菌門として、メタン生成微生物、高度好塩菌、好熱好酸性および数種の超好熱菌の混合物が挙げらる。これに対し、クレン古細菌は超好熱菌のみが挙げられる。超好熱菌は、６０℃を超え、最適には８０℃を超える、極めて高熱の環境で生育する生物である。
【０００９】
Cacciapuoti et al.［６〜８］は、超好熱古細菌由来の２つのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）を記載し、特に、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)由来の酵素５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンホスホリラーゼＩＩ（ＳｓＭＴＡＰＩＩ、ＥＣ２．４．２．２８）およびパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰｆＰＮＰ）を開示している。パイロコッカス・フリオサス酵素は最初にＭＴＡＰＩＩとの注釈が付けられたが、メチルチオアデノシンを切断できなかったことからＰＮＰと改称された。スルホロブス・ソルファタリカスはクレン古細菌に属し、パイロコッカス・フリオサスはユリ古細菌に属す。上記のＥＣコードは、酵素をそれらが触媒する反応によって分類する、International Union of Biochemistry and Molecular Biologyにより提供されている慣例の酵素名である。
【００１０】
超好熱菌由来の特徴的なほとんどの酵素は、宿主生物の至適増殖温度付近の温度に至適活性がある。クローニングし、大腸菌(Escherichia coli)のような中温性宿主で発現させた場合、超好熱酵素は通常それらの熱特性を保持する。この酵素は、宿主生物の至適増殖温度よりはるかに高い温度に至適活性がある場合もある［９］。また、生物の至適増殖温度より１０℃〜２０℃低い温度に至適活性があると記載されている酵素もある［１０〜１１］。しかしながら、スルホロブス・ソルファタリカス５’−メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（６つのサブユニット内ジスルフィド架橋を含む６量体酵素）は、中温性宿主で発現させると、不適切なジスルフィド架橋を形成し、天然酵素よりも安定性および好熱性が低い［１２］。
【００１１】
テルモプロテウス綱(Thermoprotei)は超好熱クラスのクレン古細菌である。古細菌テルモプロテウス綱で配列決定され利用可能なゲノムから、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）に関する配列は３つのみ、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）に関する配列は３つのみ見つかった。これらの６つのタンパク質はそれぞれＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬに、テルモフィルム・ペンデンス(Thermofilum pendens)（Ｈｒｋ５株）由来の仮説タンパク質は受託番号：Ａ１ＲＷ９０（Ａ１ＲＷ９０＿ＴＨＥＰＤ）；スルホロブス・ソルファタリカスの仮説タンパク質はＱ９７Ｙ３０（Ｑ９７Ｙ３０＿ＳＵＬＳＯ）；スタフィロテルムス・マリナス(Staphylothermus marinus)（ＡＴＣＣ４３５８８／ＤＳＭ３６３９／Ｆ１株）由来の仮説タンパク質はＡ３ＤＭＥ１（Ａ３ＤＭＥ１＿ＳＴＡＭＦ）；アエロピルム・ペルニクス(アエロピルム・ペルニクス)由来の仮説タンパク質はＱ９ＹＡ３４（Ｑ９ＹＡ３４＿ＡＥＲＰＥ）；ハイパーサーマス・ブチリカス（ＤＳＭ５４５６／ＪＣＭ９４０３株）由来の仮説タンパク質はＡ２ＢＪ０６（Ａ２ＢＪ０６＿ＨＹＰＢＵ）；およびアシディロブス・サッカロボランス(Acidilobus saccharovorans)（ＤＳＭ１６７０５／ＶＫＭＢ−２４７１／３４５−１５株）由来の仮説タンパク質はＤ９ＰＺＮ７（Ｄ９ＰＺＮ７＿ＡＣＩＳ３）のアクセッション番号で登録されている。これらの配列は総て、未検証との注釈がついており、古細菌におけるそれらの存在はコンピューターで確認されたに過ぎないことを意味する。
【００１２】
たとえ多くの遺伝子が大腸菌(Escherichia coli)で首尾よく高収率で発現できたとしても、超好熱菌由来のいくつかのタンパク質は、１つには稀なコドン利用のために、発現が低いか全く発現しない。実際に、本発明者らの知る限り、上記遺伝子のいずれかの発現に成功したというグループはまだない。
【００１３】
上記の欠点を鑑みて、また、技術的な難しさを鑑みて、本発明者らは予期しないことに、実施可能な組換えベクターを作製し、重要なことには、６０℃より高い温度に至適活性がある組換えホスホリラーゼを得ることができた。本発明の耐熱性かつ化学的に安定な触媒は、古細菌テルモプロテウス綱に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）、およびウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．３）であり、ここで、ＰＮＰアーゼはスルホロブス・ソルファタリカスに由来し（配列番号７）、ＵＰアーゼはアエロピルム・ペルニクスに由来する（配列番号８）。
【００１４】
特に、驚くべきことに、超好熱テルモプロテウス綱に由来する組換えヌクレオシドホスホリラーゼは高い耐熱性、高い触媒効率および１００℃付近またはそれを超える温度での至適酵素活性のような独特な構造機能特性を有することが判明した。これらの組換え酵素は、天然および修飾ヌクレオシド類似体の工業生産を目的とするトランスグリコシル化反応のために、細胞溶解液の形態で、かつ、粗抽出液または精製抽出液の形態で使用できるのが有利である。それらは特に、水性媒体中、有機溶媒中、６０℃〜１２０℃の温度で、またはこれらのパラメーターの組合せで、トランスグリコシル化を触媒して、多くの多様な種類のヌクレオシドを許容される生産収率、反応時間で、経済的な量の酵素を用いて生産するため用途が広い。重要なことには、本発明に記載の生物触媒は、基質または反応生成物を可溶化するために、有機溶媒、６０℃より高い温度またはその双方の存在を必要とする生物変換反応に使用可能である。これらのホスホリラーゼは、水に不溶な基質と反応させるのが理想的である。これらのホスホリラーゼのもう１つの利点はそれらの有機溶媒耐性にあり、すなわち、それらは数反応サイクルの間、再利用することができる。
【００１５】
より有利には、本発明は、ヌクレオシドのワンポット合成に有用なテルモプロテウス綱ヌクレオシドホスホリラーゼの組合せを提供する。酵素は、天然ヌクレオシドまたは類似体ヌクレオシドを生産するために、１段階（ワンポット）合成法または２段階合成法において使用することができる。１段階合成では、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、糖に結合された塩基を別の選択肢に変更するために同じバッチを用いる。２段階では、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、ピリミジンヌクレオシドの糖の遊離に用いられ、次に、１−リン酸−糖が単離され、その後、別の溶液で、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いてプリン塩基をその糖と結合させる。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換えベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクターに関する。
【００１７】
さらに、本発明は、リン酸イオンの存在下で糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化法に関し、前記方法は、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）(National Center for Biotechnology Information Reference Sequence：ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿００２７５４．１）、またはその組合せの使用を含んでなることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ヌクレオシドホスホリラーゼにより触媒される２つの酵素反応の例を示す。上段の１つ目の反応は、オキソニウム様中間体を介したＳＮ１様機構によって起こる加リン酸分解であり、α−リボース−１−リン酸が得られる。２つ目の反応は、リン酸が塩基により置換されるＳＮ２機構によって起こり、β−ヌクレオシドが得られる［１３］。このスキームでは、ウリジンヌクレオシドホスホリラーゼは、ウリジンのＣ−Ｎグリコシド結合の加リン酸分解切断を触媒し、リボース−１−リン酸とウラシルとが得られる。プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（アデノシンヌクレオシドホスホリラーゼ）は第二の基質としての無機オルトリン酸（Ｐｉ）の存在下でグリコシド結合の切断を触媒し、プリン塩基とリボース（デオキシリボース）−１−リン酸とを生じる。天然基質では、これらの反応は可逆的である。
【図２】ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素を用いたワンポット合成のスキーム。
【図３】図３は、クローニング前の最初の発現ベクターｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）の遺伝子地図を示す。ベクター長６３１５ヌクレオチド。Ｔ７プロモーター：塩基２０９〜２２５；Ｔ７プロモータープライミング部位：塩基２０９〜２２８；ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）：塩基２２８〜２５２；リボソーム結合部位（ＲＢＳ）：塩基２８２〜２８８；Ｈｉｓパッチ（ＨＰ）チオレドキシンＯＲＦ：塩基２９８〜６２７；ＴｒｘＦｕｓフォワードプライミング部位：塩基６０７〜６２４；ＥＫ認識部位：塩基６４３〜６５７；ＴＯＰＯ（商標）認識部位１：塩基６７０〜６７４；オーバーハング：塩基６７５〜６７８；ＴＯＰＯ（商標）認識部位２：塩基６７９〜６８３；Ｖ５エピトープ：塩基７００〜７４１；ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）領域：塩基７５１〜７６８；Ｔ７リバースプライミング部位：塩基８２２〜８４１；Ｔ７転写終結領域：塩基７８３〜９１１；ｂｌａプロモーター：塩基１４０７〜１５０５；アンピシリン（ｂｌａ）耐性遺伝子（ＯＲＦ）：塩基１５０６〜２３６６；ｐＢＲ３２２オリジン：塩基２５１１〜３１８４；ＲＯＰ ＯＲＦ：塩基３５５２〜３７４３（相補鎖）；ｌａｃＩ ＯＲＦ：塩基５０５５〜６１４６（相補鎖）。
【図４】図４は、５つの温度と３つのｐＨ値とを組み合わせて、温度とｐＨの７つの組合せとした「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」を示す。
【図５】ＵＰアーゼ活性に対するｐＨと温度との相互作用効果を示すコンタープロット。データは、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウエアを用い、Response Surface Methodology (RSM)で統計学的解析した。この酵素は高い好熱性を表し、その活性は最高アッセイ温度（１００℃）まで急速に増加し、この活性は中性（６．５〜７．５）前後、好ましくは７．０前後に明確なｐＨ至適を示した。
【図６】ＰＮＰアーゼ活性に対するｐＨと温度の相互作用効果を示すコンタープロット。データは、「Ｍｉｎｉｔａｂ」ソフトウエアを用い、Response Surface Methodology (RSM)で統計学的解析した。この酵素は高い好熱性を表し、その活性は最高アッセイ温度（１００℃）まで急速に増加し、この活性は中性（６．５〜７．０）前後に明確なｐＨ至適を示した。
【図７】図７は、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）ａ．ｋ．ａ． ｄｅｏＤ遺伝子のコード領域のＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００６７６６。
【図８】図８は、アエロピルム・ペルニクスのピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）ａ．ｋ．ａ． ｕｄｐ遺伝子のコード領域のＤＮＡ配列（配列番号８）を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８５４。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明は、ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換え発現ベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクターに関する。
【００２０】
アエロピルム・ペルニクスおよびスルホロブス・ソルファタリカスは９０℃を超える高温で増殖することができる超好熱古細菌である。古細菌は、真核生物および原核生物とは異なる第３の生物群に属す。古細菌は原始生物の系統を引くと考えられ、進化もせず、通常の温度環境にも適応しなかった特殊な生物である。
【００２１】
ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼは、それらの細胞内の天然環境では、工業レベルで所望されるような高収率で、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体の合成ができない。この重大な制限を克服するために、本発明者らは、ｕｄｐ遺伝子およびｄｅｏＤ遺伝子と、細菌のような選択された宿主においてヌクレオシドホスホリラーゼを過剰発現させるのに適当なエレメントとを含んでなる発現ベクターを設計すべく組換えＤＮＡ技術を用いてきた。設計された発現ベクターはまた、種々のホスホリラーゼの可溶化および精製を助ける。
【００２２】
本発明のベクターは、種々のヌクレオシドホスホリラーゼをコードするヌクレオチド配列と、前記ベクターの宿主細胞内での選択および自己複製を可能とするヌクレオチド配列とを含んでなる。
【００２３】
組換え発現ベクターの構築は従来の組換えＤＮＡ技術、すなわち、無細胞系においてＤＮＡセグメントを連結する手法を用いて行う。
【００２４】
「ベクター」とは、適当な大きさの別のＤＮＡ断片が、そのベクターの自己複製能を消失することなく組み込まれ（クローニングされ）得るウイルス、プラスミドまたは高等生物の細胞に起源するＤＮＡ分子を意味する。例としては、プラスミド、コスミド、および酵母人工染色体がある。ベクターは多くの場合、いくつかの供給源由来のＤＮＡ配列を含有する組換え分子である。「発現ベクター」とは、クローニングされた遺伝子または遺伝子群の転写および翻訳を可能とするのに必要な制御または調節配列をさらに含んでなるベクターを意味する。本発明には環状または線状化ＤＮＡベクターが有用である。
【００２５】
本発明のベクターの宿主細胞内での選択および自己複製を可能とするためには、選択されるベクターは選択された宿主細胞に適合しなければならない。好ましい実施形態では、前記ベクターを選択可能とし、大腸菌で自己複製可能とするヌクレオチド配列は、選択された大腸菌株のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをプロモーターと結合可能とする遺伝子をコードするＴ７プロモーターである。「選択可能」とは、そのベクターが後代細菌で安定を維持することを意味する。選択は、ベクター中の適当な選択マーカー遺伝子（そのマーカー遺伝子の発現によって、そのベクターで形質転換された細胞の同定が可能になる）の導入に応じたストリンジェントな培地条件によって達成される。選択マーカー遺伝子は多くの場合、抗生物質耐性遺伝子である。本発明に関して好ましい選択マーカー遺伝子は、カナマイシン、テトラサイクリン、カルベニシリン、より好ましくはアンピシリンである。
【００２６】
本発明はさらに、上述の組換え発現ベクターのいずれか一方または双方の組換え発現ベクターを同じ宿主細胞内に含んでなる宿主細胞に関する。
【００２７】
「宿主細胞」とは、ＰＮＰアーゼまたはＵＰアーゼヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベクターで形質転換された細胞を意味する。組換えＤＮＡベクターの別の態様では、宿主細胞にヌクレオシドホスホリラーゼを生産させ、培地条件が好適である場合に、前記ヌクレオシドホスホリラーゼはヌクレオシドの取得を触媒する。本発明の特定の実施形態では、それぞれスルホロブス・ソルファタリカスおよびアエロピルム・ペルニクス由来のＰＮＰアーゼ遺伝子およびＵＰアーゼ遺伝子をＤＮＡ発現ベクターに導入した。図７および図８は、本発明に関連する核酸およびアミノ酸配列、すなわち、それぞれスルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤの核酸配列（配列番号７）およびアエロピルム・ペルニクスｕｄｐ（配列番号８）の核酸配列の一覧である。
【００２８】
当業者ならば、ヌクレオシド生産を最大にするために、最初のベクターおよび宿主細胞株から構成される発現系を適宜選択することができる。
【００２９】
一実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。
【００３０】
特定の実施形態では、大腸菌はＢＬ２１細菌株に属す。大腸菌ＢＬ２１に好適な発現ベクターは、例えばｐＥＴベクター、ｔｒｃＨｉｓベクターおよびｐＵＢベクター（これらは総てInvitrogen製）、ならびにｐＧＥＸベクターおよびＧＳＴベクター（Amersham製）である。大腸菌ＤＨ５α細菌株とｐＵＣベクターとの組合せ、および大腸菌Ｆ’とＰＳＬベクター、ＰＥＺＺベクターまたはＭ１３ベクター（これらは総てAmersham製）との組合せも本発明において有用である。
【００３１】
一実施形態において、宿主細胞は処理されたものであっても溶解液の形態であってもよい。
【００３２】
本発明はさらに、リン酸イオンの存在下での糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化法に関し、該方法は、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）（ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣ＿００２７５４．１）またはそれらの組合せの使用を含んでなることを特徴とする。
【００３３】
「糖供与ヌクレオシド」とは、β−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖と結合した核酸塩基（単に塩基と呼ぶことが多い）からなるグリコシルアミンを意味する。「糖供与ヌクレオシド」としては、限定されるものではないが、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシン、ならびにＤ−リボースまたは２’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシド；２’位、３’位および／または５’位が修飾されたリボース基を含むヌクレオシド；および糖がβ−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−キシロース、３’−デオキシリボース、３’，５’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、５’−デオキシリボース、２’，５’−ジデオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、３’−アミノ−３’−デオキシリボース、または２’−フルオロ−２’−デオキシリボースであるヌクレオシドが挙げられる。
【００３４】
「受容塩基」とは、核酸塩基、ヌクレオチド塩基、窒素塩基、または単に塩基を意味する。本来、塩基はＤＮＡまたはＲＮＡの一部である。主要な核酸塩基はシトシン、グアニン、アデニン（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、チミン（ＤＮＡ）およびウラシル（ＲＮＡ）であり、それぞれＣ、Ｇ、Ａ、ＴおよびＵと省略される。本発明において「受容塩基」とは、修飾された核酸塩基および類似体核酸塩基を含んでなるものを意味する。ＤＮＡの場合、最も一般的な修飾塩基は５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）である。ＲＮＡの場合には、多くの修飾塩基が存在し、シュードウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、リボチミジン（ｒＴ）および７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）が挙げられる。ヒポキサンチンおよびキサンチンは、突然変異誘発物質の存在によって作出される多くの塩基のうちの２つである。受容塩基の他の例としては、天然または置換ピリミジンおよびプリン塩基；１位、２位、６位の１箇所以上で置換されたプリン塩基；３位、５位の１箇所以上で置換されたピリミジン塩基；およびプリン、２−アザプリン、８−アザプリン、１−デアザプリン（イミダゾピリジン）、３−デアザプリン、７−デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−メルカプトプリンが挙げられる。
【００３５】
このトランスグリコシル化法は、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、および特に、ヌクレオシド部分またはその類似体を含んでなる、含む、または、からなる活性医薬成分(active pharmaceutical ingredients)（ＡＰＩ）の調製に有用である。ＡＰＩを薬品（医薬品）の製造に用いることを意図する任意の物質または物質の混合物として理解すれば、それは薬剤の製造に用いる場合には、薬品の有効成分となる。このような物質は薬理活性または疾病の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防における他の効果を与えること、または身体の構造および機能に影響を与えることを意図する(Eudralex, Part II of volume 4 EU Guidelines to Good Manufacturing Practice)。
【００３６】
ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）とプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ；Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）との組合せは、供与ヌクレオシドから受容塩基へ糖部分を効率的に転移させる。
【００３７】
出発材料として他のピリミジンヌクレオシドおよびピリミジン塩基を用いてピリミジンヌクレオシドを製造する場合には、ＵＰアーゼ単独の使用で十分であるが、ＰＮＰアーゼもこの加リン酸分解工程に寄与し得るので、ＰＮＰアーゼおよびＵＰアーゼの両酵素を使用することが好ましい。これに対し、出発材料として他のプリンヌクレオシドおよびプリン塩基を用いてプリンヌクレオシドを製造する場合には、ＰＮＰアーゼおよびＵＰアーゼ双方の使用も好ましい。他方、ピリミジンヌクレオシドからプリンヌクレオシドへ、例えば、ウリジンから２，６ジアミノプリンリボシドへの反応である場合には、ＰＮＰアーゼおよびＵＰアーゼの両酵素を用いる方が、別々に各酵素を用いるよりもはるかに上手く行く。
【００３８】
好ましくは、トランスグリコシル化法はＵＰアーゼとＰＮＰアーゼとの組合せを用いる。特にトランスグリコシル化反応に最適な生物触媒を得るためには、粗細胞溶解液または明澄化した粗酵素溶液を種々の割合で混合すればよい。
【００３９】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、アエロピルム・ペルニクスのＵＰアーゼおよびスルホロブス・ソルファタリカスのＰＮＰアーゼは、上記および以下に示される実施形態のいずれか一つに従って宿主細胞により提供される。
【００４０】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法において、ＵＰアーゼ、ＰＮＰアーゼまたはそれらの組合せは溶解液の形態で用いられる。
【００４１】
一実施形態において、トランスグリコシル化法は、（ｉ）宿主細胞を好適な培養培地で培養する工程；（ｉｉ）ＵＰアーゼ、ＰＮＰアーゼまたはその双方を過剰発現させる工程；（ｉｉｉ）所望により細胞溶解液を作製する工程；（ｉｖ）糖供与ヌクレオシド、受容塩基およびリン酸イオンを加える工程；および（ｖ）反応混合物からヌクレオシドを回収する工程を含んでなる。
【００４２】
特定の実施形態では、ベクターを含んでなる大腸菌形質転換体は、トリプトン、酵母抽出液、塩化ナトリウム、ならびにカナマイシン、テトラサイクリン、カルベニシリンおよびアンピシリンからなる群から選択される抗生物質を含んでなる培養培地中、好ましくは３７℃にて、およそ６００ｎｍの波長で光学密度が０．５〜０．８となるまで増殖させてもよい。次に、培養物にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１００ｍｇ／ｌとなるように加え、６〜１２時間の間３７℃で誘導を行えばよい。細胞は４℃で遠心分離することにより回収することができ、細胞ペレットは３回の凍結−解凍サイクルによって溶解させればよい。これらの組換え宿主細胞は当業者に公知の標準的な技術によって破砕すればよい。得られた細胞溶解液はそのまま生物触媒として用いてもよいし、あるいは遠心分離を行って細胞残渣を除去し、明澄化した粗酵素溶液を得てもよい。本明細書において「生物触媒」とは、基質の生成物への変換、この場合にはヌクレオシドの生体変換を触媒し得る任意の生物学的存在を意味する。
【００４３】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドは、Ｄ−リボースおよび２’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシ；２’位、３’位および／または５’位で修飾されたリボース基を含むヌクレオシド；および糖がβ−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−キシロース、３’−デオキシリボース、３’，５’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、５’−デオキシリボース、２’，５’−ジデオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、３’−アミノ−３’−デオキシリボース、２’−フルオロ−２’−デオキシリボースであるヌクレオシドから選択される。
【００４４】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、受容塩基は、天然または置換ピリミジン塩基およびプリン塩基；プリン環の１位、２位、６位またはその組合せの位置で置換されたプリン塩基；ピリミジン環の３位、５位またはその組合せの位置で置換されたピリミジン塩基；例えば、プリン、２−アザプリン、８−アザプリン、１−デアザプリン（イミダゾピリジン）、３−デアザプリン、７−デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−メルカプトプリンから選択される。
【００４５】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、得られるヌクレオシド類似体は当技術分野で知られているような活性医薬成分（ＡＰＩ）である。
【００４６】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、該方法は６０〜１００℃の間で行われる。
【００４７】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、水性媒体中、または非プロトン性極性共溶媒系で行われる。
【００４８】
一実施形態において、非プロトン性極性共溶媒系はジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、またはその任意の組合せから選択される。
【００４９】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は２，６−ジアミノプリンである。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、糖部分の供与体としてウリジンまたは２’−デオキシウリジンを用いる、ヌクレオシドのワンポット合成を提供するが、これは本発明の組換えＵＰアーゼ酵素がこれらの基質に最も特異的であるからである。しかしながら、この酵素は、Ｂ．ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)などの多くの下等生物であいにく見られるように［１４］、ウリジン、２’−デオキシウリジンと他のピリミジンヌクレオシドを識別しないので、いずれかの糖部分供与体とともに使用することができる。
【００５１】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は５−フルオロウラシルである。
【００５２】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は５−トリフルオロメチルウラシルである。
【００５３】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基はトランス−ゼアチンである。
【００５４】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は２−クロロ−６−メチルアミノプリンである。
【００５５】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は６−ジメチルアミノプリンである。
【００５６】
一実施形態において、本発明のトランスグリコシル化法では、糖供与ヌクレオシドはウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基は６−メルカプトプリンである。
【００５７】
「耐熱性ヌクレオシドホスホリラーゼ」とは、熱に安定で、耐熱性があり、別の反応を果たすのに十分なヌクレオシドホスホリラーゼ活性を保持し、かつ、トランスグリコシル化反応を果たすのに必要な時間、温度上昇に曝されても不可逆的に変性しない（不活性にならない）酵素を意味する。
【００５８】
以下に示す実施例の目的は、その適用分野の限定を構成するものではなく、本発明を説明することである。
【実施例】
【００５９】
上述のように、本発明によるトランスグリコシル化反応は、ＵＰアーゼまたはＰＮＰアーゼ生産細胞から得られたＵＰアーゼ酵素およびＰＮＰアーゼ酵素を用いて行った。このような細胞は、好ましくは、多量のＵＰアーゼまたはＰＮＰアーゼを発現することができる遺伝的に改変された大腸菌細胞である。このような細胞を得る方法、酵素およびそれらの特徴、ならびにいくつかのヌクレオシド類似体の生産を、以下に示す添付の実施例で示す。
【００６０】
実施例１
大腸菌ｄｅｏＤの構築
スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）配列はＧｅｎＢａｎｋで受託番号ＡＥ００６７６６として見出された。この遺伝子を、２単位のＰｌａｔｉｏｎｕｍ Ｐｆｘ酵素(Invitrogen)、１ｍＭ ＭｇＳＯ４および１×酵素増幅バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰおよび０．３μＭの各プライマーを、スルホロブス・ソルファタリカスＰ２由来のオリゴヌクレオチド5’-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3’（スルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤフォワード；配列番号１）および5’-aatcagttttaagaatcttaaggtaat-3’（スルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤリバース；配列番号２）［１５］とともに用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、初期変性工程９４℃で３０分、その後、変性工程９４℃で１分、アニーリング／伸長工程６０℃で１．５分および６８℃で１分の温度サイクル３６回で行った。３６サイクルの後、サンプルを６８℃に１０分、最後に４℃に曝した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そのゲルからＤＮＡバンドを精製した（Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．（商標）ＵＶ−Ｆｒｅｅゲル精製キット、Invitrogen）。増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子を保持するｐＵＣ１８ベクター［１７］のポリリンカー領域にクローニングした。クローニング領域を完全に配列決定したところ、データバンク配列と完全に同一であることが判明した。
【００６１】
実施例２
大腸菌ｕｄｐの構築
アエロピルム・ペルニクスのピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）配列はＧｅｎＢａｎｋで受託番号ＮＣ＿０００８５４．２として見出された。この遺伝子を、２単位のＰｌａｔｉｏｎｕｍ Ｐｆｘ酵素(Invitrogen)、１ｍＭ ＭｇＳＯ４および１×酵素増幅バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰおよび０．３μＭの各プライマーを、アエロピルム・ペルニクスＫ１由来のオリゴヌクレオチド5’-caccgtggcccgctacgttctcctc-3’（アエロピルム・ペルニクスｕｄｐフォワード；配列番号３）および5’-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3’（アエロピルム・ペルニクス リバース；配列番号４）［１６］とともに用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は初期変性工程９４℃で３０分、その後、変性工程９４℃で１分、アニーリング／伸長工程６０℃で１．５分および６８℃で１分の温度サイクル３６回で行った。３６サイクルの後、サンプルを６８℃に１０分、最後に４℃に曝した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そのゲルからＤＮＡバンドを精製した（Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．（商標）ＵＶ−Ｆｒｅｅゲル精製キット、Invitrogen）。増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子を保持するｐＵＣ１８ベクター［１７］のポリリンカー領域にクローニングした。クローニング領域を完全に配列決定したところ、データバンク配列と完全に同一であることが判明した。
【００６２】
実施例３
ｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）ベクターへのクローニングおよび細胞の形質転換
アエロピルム・ペルニクスｕｄｐ遺伝子配列およびスルホロブス・ソルファタリカスｄｅｏＤ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を、プラスミド複製のためのｐＢＲ３２２ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝子、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの結合が可能なＴ７プロモーター、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が存在しない場合に発現の阻害を可能等するｌａｃオペレーター、ＲＮＡの翻訳のためのリボソーム結合部位、融合タンパク質の溶解度を高めるためのＨｉｓパッチ−チオレドキシン、ならびに融合タンパク質の検出および精製のためのポリヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を含んでなるｐＥＴ１０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（ｐＥＴ１０２ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（商標）発現キット、Invitrogen）にクローニングした（図３）。このベクターを熱ショックにより、異種遺伝子の調節発現に用いられる市販株である大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴ１０２ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（商標）発現キット、Invitrogen）に導入した。これはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含んでなり、これにより、この株はＩＰＴＧによる組換えタンパク質の過剰発現のためのＴ７プロモーターを含んでなるｐＥＴベクターの使用に適合するようになる。
【００６３】
得られた組換えベクターを、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ １０単位で処理することによって分析した。陽性クローンを、シーケンシングプライマーＴｒｘＦｕｓフォワード5’TTCCTCGACGCTAACCTG3’（配列番号５）およびＴ７リバース5’TAGTTATTGCTCAGGGGTGG3’（配列番号６）を用いて配列決定した。
【００６４】
実施例４
組換え株の発酵
本発明が関連する組換え株をそれぞれ、アンピシリンを添加したトリプチケースソイ（toripticase soy）固体培地、ｐＨ＝７にてバッチ様式で培養した。この培養物の１コロニーを、Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏパウダー１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌおよびＮａＣｌ ５ｇ／ｌを含有する栄養ブロスｎ°２(Oxoid)に、２００ｍｇ／ｌアンピシリンを添加したものに通した。これを３７℃で激しく振盪しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。発現プラスミドを保持する大腸菌株を６００ｎｍでの光学密度が０．６となるまで増殖させた後、ＩＰＴＧ（最大１００ｍｇ／ｌ）を加え、さらに８時間培養を続けた。発酵が完了したところで培養培地を遠心分離し、細胞ペレットを３０ｍＭのｐＨ７リン酸バッファーで洗浄した。得られたバイオマスを使用するまで−２０℃で保存した。
【００６５】
実施例５
ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼの部分精製（細胞溶解液の調製）
タンパク質の部分精製については、酵素ＵＰアーゼまたはＰＮＰアーゼを発現する組換え株の培養物から遠心分離または精密濾過により分離した細胞ペーストを、リゾチーム１６０ｍｇを添加して０℃で１時間インキュベートした後に、超急速凍結−解凍サイクル（−８０℃／３７℃）を行い、最後にデオキシリボヌクレアーゼＩ １，０００単位を加えて粘度を下げることによって破砕した。
【００６６】
実施例６
ＵＰアーゼ酵素の酵素活性の測定
ＵＰアーゼ発現細胞の懸濁液を含んでなり、ｐＨ７．０のリン酸カリウムバッファーで１：１００（容量／容量）に希釈した遠心分離済み細胞溶解液１００マイクロリットルを、３０℃でプレインキュベートしたｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸バッファー中７５ｍＭのウリジン溶液８００マイクロリットルに加えた。５分後に１ｍｌの２Ｎ ＨＣｌを加えることでこの加リン酸分解反応を停止させた。この反応混合物のアリコートを、２５０×４．６ｍｍのサイズのＫｒｏｍａｓｉｌ １００−５Ｃ１８(Akzo Nobel)カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。溶出は４％メタノール水溶液を用いて行った。この細胞溶解液の酵素活性を、ｍｌ当たりの単位（ウラシルのμモル／分／ｍｌ）で表し、同じ条件で溶出した標準ウラシル溶液に対して比例計算した。およそ５９０単位／ｍｌの遠心分離済み細胞溶解液が回収された。
【００６７】
実施例７
ＰＮＰアーゼ酵素の酵素活性の測定
ＰＮＰアーゼ発現細胞の懸濁液を含んでなり、ｐＨ７．０のリン酸カリウムバッファーで１：１００（容量／容量）に希釈した遠心分離済み細胞溶解液１００マイクロリットルを、３０℃でプレインキュベートしたｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸バッファー中６０ｍＭのイノシン溶液８００マイクロリットルに加えた。正確に１０分後に１ｍｌの２Ｎ ＨＣｌを加えることでこの加リン酸分解反応を停止させた。この反応混合物のアリコートを、２５０×４．６ｍｍのサイズのＫｒｏｍａｓｉｌ １００−５Ｃ１８(Akzo Nobel)カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。溶出は４％メタノール水溶液を用いて行った。この細胞溶解液の酵素活性をｍｌ当たりの単位（ヒポキサンチンのμモル／分／ｍｌ）で表し、同じ条件で溶出した標準ヒポキサンチン溶液に対して比例計算した。およそ３１０単位／ｍｌの遠心分離済み細胞溶解液が回収された。
【００６８】
実施例８
トランスグリコシル化触媒活性の測定
トランスグリコシル化触媒活性の測定については、実施例６および７の場合と同様に測定したＵＰアーゼ：ＰＮＰアーゼ酵素活性比が約１：１となるように溶解液を混合することにより、ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼの双方を含有する細胞溶解液の混合物を作製した。トランスグリコシル化反応は以下の条件において分析的規模で行った：２５０μｌの細胞溶解液（ＵＰアーゼおよびＰＮＰアーゼ各酵素活性１４単位に相当）を、以下の組成：４ｍＭ １−β−Ｄ−リボフラノシルウラシル（ウリジンヌクレオシド）、４ｍＭアデニン塩基、３０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７を有する１０ｍｌの溶液に加え、サーモスタットで６０℃に制御した。６０℃で１．５時間後、混合物を１：５希釈し、氷冷することにより反応を停止させた。アデニン塩基の９−β−Ｄ−リボフラノシルアデニン（アデノシンヌクレオシド）の生物変換のパーセンテージは、反応混合物のアリコートを、２５０×４．６ｍｍのサイズのＫｒｏｍａｓｉｌ １００−５Ｃ１８(Akzo Nobel)カラムを用い、４％メタノール−水溶液で溶出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析することにより測定した。トランスグリコシル化触媒活性を、単位／ｍｌ（１．５時間で形成されたＡｒａ−Ａのμモル／細胞溶解液混合物ｍｌ）または単位／湿潤樹脂ｇ（１．５時間で形成されたＤ−リボフラノシルアデニンのμモル／細胞溶解液ｍｌ）で表し、同じ条件でＨＰＬＣにより溶出された標準的なＤ−リボフラノシルアデニン溶液に対して比例計算した。これらの条件下で、約５５パーセントのアデノシンヌクレオシドが形成された（およそ９単位／細胞溶解液ｍｌ）。
【００６９】
実施例９
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に対する温度およびｐＨの効果
ヌクレオシドホスホリラーゼの性能に対するｐＨおよび温度の影響を、「実験計画法」を用いて検討した。最大酵素活性が得られる条件を確認するために種々の温度と種々のｐＨ値を組み合わせた。実験範囲を８０℃〜１００℃およびｐＨ５．５〜８．５の間と定義した。図４に示されるように、「Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリックス」に従って５つの温度を３つのｐＨと組み合わせて、温度とｐＨの７つの組合せとした。基質を選択された反応溶液および温度で酵素を伴わずにインキュベートした後、酵素を加え、選択された条件でインキュベートした。これらのサンプルをＰＮＰアーゼまたはＵＰアーゼ酵素の酵素活性を測定するために上記のように処理した。活性値は対応する観測最大値（１００％）に対するパーセンテージとして表した。結果はそれぞれ図５および６に示す。
【００７０】
実施例１０
耐熱性
酵素の耐熱性は８０℃でアッセイした。ｐＨ７．０〜７．２のリン酸カリウムバッファーで１：１００または１：１０００容量／容量希釈した、ＵＰアーゼまたは／およびＰＮＰアーゼ発現細胞の懸濁液（細胞溶解液）１００〜２００マイクロリットルの間の酵素アリコートを調製した。これらの生物触媒を８０℃で種々の時間インキュベートした。加熱後、これらの溶液をすぐに氷上で保持し、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定は実施例６および７に記載のようにして行った。８０℃で１０時間後にヌクレオシドホスホリラーゼ活性の失活は見られなかった。
【００７１】
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性に対する溶媒の効果
有機共溶媒は反応に慣用され、単離される酵素は比較的高濃度の共溶媒の条件下で生存できなければならない。実験はメタノール（プロトン性極性溶媒）およびジメチルスルホキシド（非プロトン性の極性溶媒）などの有機溶媒の存在下で実施した。本発明のヌクレオシドホスホリラーゼ酵素は有機溶媒に耐性があり、５および１０容量％の有機溶媒を含有するバッファー溶液中で活性を示した。
【００７２】
表１ 数種の有機溶媒に対するＰＮＰアーゼ酵素の安定性
【表１】
ａＰＮＰアーゼ酵素を含んでなる細胞溶解液の相対的活性を、２種類の濃度の有機溶媒で、実施例７に記載の標準アッセイを用いて測定し、その相対的活性を、ＰＮＰアーゼ酵素を含むが有機溶媒を含まない細胞溶解液の活性と比較した。ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＭｅＯＨ：メタノール。
【００７３】
表２ 数種の有機溶媒に対するＵＰアーゼ酵素の安定性
【表２】
ｂＵＰアーゼ酵素を含んでなる細胞溶解液の相対的活性を、２種類の濃度の有機溶媒で、実施例６に記載の標準アッセイを用いて測定し、その相対的活性を、ＵＰアーゼ酵素を含むが有機溶媒を含まない細胞溶解液の活性と比較した。ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＭｅＯＨ：メタノール。
【００７４】
実施例１１
一般的な生物変換手順
ワンポットトランスグリコシル化反応は、反応試験内で穏やかに攪拌しながら、選択した反応温度およびｐＨで行った。用いた細胞溶解液混合物の触媒的トランスグリコシル化活性は約１２単位／ｍｌであった（実施例８で測定した通り）。ＰＮＰアーゼ：ＵＰアーゼ活性比が１：１となるように調製した細胞溶解液混合物を用いてヌクレオシドを作製した。
【００７５】
基質は、下記のものであった：
１）２’−デオキシリボース−１−リン酸またはリボース−１−リン酸供与体として働く天然２’−デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシド
２）糖の１位に結合している第二の天然または合成プリン塩基またはピリミジン塩基、
【００７６】
反応が終了したところで、反応混合物を遠心分離し、その後、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過装置（ＹＭ−３膜）を用いて濾過し、製造者が示しているプロトコールに従って生成物を分離した。連続反応（一般に３〜５回の間）のため、新たに調製した反応混合物を添加することにより生物触媒を再循環させることができる。濾過溶液は上記と同じ条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニタリングした。生物変換収率を塩基類似体の初期濃度に基づいて計算した。
【００７７】
実施例１２
２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
プリンヌクレオシドの製造は、これらの塩基の水性媒体中での溶解度が低いためにより困難である。本発明では、本発明者らは、この問題を解決するために酵素競合特性を用いた。本発明者らが用いた戦略は、これらの基質の溶解度を高めるための有機共溶媒および／または高温の使用を包含した。
【００７８】
１２．１ 共溶媒を用いた２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
アッセイは６０℃にて、５および１０％の非プロトン性二極性共溶媒中で行い、１２単位／ｍｌの細胞溶解液を、下記組成：
１． １５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２． ５ｍＭ２，６−ジアミノプリン、および
３． ３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
の基質溶液を含み、サーモスタットで６０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００７９】
５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。表３に、共溶媒の存在下で製造された２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率を示す。得られた２，６−ジアミノプリンヌクレオシド（２，６−ジアミノプリンリボシドまたは２，６−ジアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。これらの反応では、生成物が高収率で得られた（８０％超）。
【００８０】
表３ ６０℃で種々の％の共溶媒を用いた場合の２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率。ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【表３】
【００８１】
１２．２． 共溶媒を使用しない２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造
共溶媒を用いない２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの製造は、このプリン塩基の水溶解度が限定されているために８０℃を超える温度でのみ行うことができた。アッセイは種々の温度（８０、９０および１００℃）で行った。１２単位／ｍｌの細胞溶解液を、下記組成：
１． １５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２． ５ｍＭ２，６−ジアミノプリン、および
３． ３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
の基質溶液を含み、サーモスタットで選択された温度に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００８２】
５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。表３に、共溶媒の存在下で製造された２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率を示す。得られた２，６−ジアミノプリンヌクレオシド（２，６−ジアミノプリンリボシドまたは２，６−ジアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。表４に、有機溶媒を用いずに製造した２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率を示す。この反応の生物変換収率はアッセイした総ての温度で８０％前後であった。
【００８３】
表４ 有機共溶媒を用いない場合の種々の温度での２，６−ジアミノプリンヌクレオシドの生産収率
【表４】
【００８４】
実施例１３
他のヌクレオシドの製造
トランスグリコシル化反応を種々の受容塩基を用いて行った。これらの反応は、８０℃で種々の時間、プリン塩基の場合には共溶媒として１０％ＤＭＳＯを用い、また、ピリミジン受容塩基の場合には共溶媒を用いずに行った。生物変換のパーセンテージを受容塩基の初期濃度に対して比例計算し、反応混合物のＨＰＬＣ分析により測定した。
【００８５】
１３．１ トリフルオロメチルウラシルヌクレオシドの製造
約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌの触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
７．５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２．５ｍＭトリフルオロメチルウラシル、および
２０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃の間に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００８６】
８０℃で３時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。反応の生物変換収率は６０％より高かった。得られたトリフルオロメチルウラシルヌクレオシド（トリフルオロメチルウリジンまたは２’−デオキシトリフルオロメチルウリジン）をＨＰＬＣにより分析した。
【００８７】
１３．２ ５−フルオロウラシルヌクレオシドの製造
５−フルオロウラシルヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
７．５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２．５ｍＭ５−フルオロウラシル、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００８８】
８０℃で３時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。反応の生物変換収率は５０％より高かった。得られた５−フルオロウラシルヌクレオシド（５−フルオロウリジンおよび５−フルオロ−２’−デオキシウリジン）をＨＰＬＣにより分析した。
【００８９】
１３．３ トランス−ゼアチンヌクレオシドの製造
トランス−ゼアチンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
７．５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
２．５ｍＭトランス−ゼアチン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９０】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は８０％より高かった。得られたトランス−ゼアチンヌクレオシド（トランス−ゼアチンリボシドおよびトランス−ゼアチンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９１】
１３．４ ２−クロロ−６−メチルアミノプリンヌクレオシドの製造プロセス
２−クロロ−６−メチルアミノプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
１５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
５ｍＭ２−クロロ−６−メチルアミノプリン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９２】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は８０％より高かった。得られた２−クロロ−６−メチルアミノプリンヌクレオシド（２−クロロ−６−メチルアミノプリンリボシドおよび２−クロロ−６−メチルアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９３】
１３．５ ６−ジメチルアミノプリンヌクレオシドの製造
６−ジメチルアミノプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
１５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
５ｍＭ６−ジメチルアミノプリン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９４】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は８０％より高かった。得られた６−ジメチルアミノプリンヌクレオシド（６−ジメチルアミノプリンリボシドおよび６−ジメチルアミノプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９５】
１３．６ ６−メルカプトプリンヌクレオシドの製造
６−メルカプトプリンヌクレオシドは上記のように製造した。約１２単位／細胞溶解液ｍｌのトランスグリコシル化活性を有する１ｍｌ触媒（細胞溶解液）を、下記組成：
１５ｍＭウリジン／２’−デオキシウリジン、
５ｍＭ６−メルカプトプリン、および
３０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７
を含み、サーモスタットで８０℃に保持した１５０ｍｌの溶液に加えた。
【００９６】
これらのアッセイは、上記の条件を用い、共溶媒としての１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で行った。８０℃で５時間後、反応混合物を４℃、２０００×ｇで３０分、カットオフ３０００Ｄａを備えたAmicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA)での遠心分離により濾過し、濾液を回収した。この反応の生物変換収率は５０％より高かった。得られた６−メルカプトプリンヌクレオシド（６−メルカプトプリンリボシドおよび６−メルカプトプリンデオキシリボシド）をＨＰＬＣにより分析した。
【００９７】
本明細書に引用されている総ての刊行物、特許および特許出願は、個々に引用することにより本明細書の一部とされるかのように、引用することによりその全内容が本発明の一部とされる。
【参照文献】
【００９８】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換え発現ベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が大腸菌である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が溶解液の形態である、請求項２〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
リン酸イオンの存在下での糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化方法であって、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）（ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣ＿００２７５４．１）またはその組合せの使用を含んでなる、方法。
【請求項６】
アエロピルム・ペルニクスのＵＰアーゼおよびスルホロブス・ソルファタリカスのＰＮＰアーゼが、請求項２〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞により提供される、請求項５に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項７】
得られる製品が、活性医薬成分（ＡＰＩ）またはその中間体である、請求項５〜６のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項８】
糖供与ヌクレオシドが、Ｄ−リボースまたは２’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシド；２’位、３’位および／または５’位が修飾されたリボース基を含むヌクレオシド；および糖がβ−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−キシロース、３’−デオキシリボース、３’，５’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、５’−デオキシリボース、２’，５’−ジデオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、３’−アミノ−３’−デオキシリボース、または２’−フルオロ−２’−デオキシリボースであるヌクレオシドから選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項９】
受容塩基が、天然または置換されたピリミジンおよびプリン塩基；１位、２位、６位の１箇所以上で置換されたプリン塩基；３位、５位の１箇所以上で置換されたピリミジン塩基；およびプリン、２−アザプリン、８−アザプリン、１−デアザプリン（イミダゾピリジン）、３−デアザプリン、７−デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−メルカプトプリンから選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１０】
６０〜１００℃の間で行われる、請求項５〜９のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１１】
水性媒体中、または非プロトン性極性共溶媒系で行われる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１２】
非プロトン性極性共溶媒系が、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフランおよびジメチルホルムアミドから選択される、請求項１１に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１３】
糖供与ヌクレオシドが、ウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基が、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリンおよび６−メルカプトプリンから選択される、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１】
ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ、Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）をコードする配列、ｂ）ウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼＥ．Ｃ．２．４．２．３）をコードする配列、ｃ）またはその双方を含んでなる組換え発現ベクターであって、該配列はそれぞれ好適な発現宿主において前記ホスホリラーゼの生産を指令する１以上の制御配列に機能的に連結され、これら配列は古細菌テルモプロテウス綱に由来するものであり、ＰＮＰアーゼがスルホロブス・ソルファタリカス由来であり（配列番号７）、ＵＰアーゼがアエロピルム・ペルニクス由来である（配列番号８）ことを特徴とする、組換え発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が大腸菌である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が溶解液の形態である、請求項２〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
リン酸イオンの存在下での糖供与ヌクレオシドと受容塩基との間のトランスグリコシル化方法であって、アエロピルム・ペルニクスのウリジンホスホリラーゼ（ＵＰアーゼ）（ＮＣ＿０００８５４．２）、スルホロブス・ソルファタリカスのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）（ＮＣ＿００２７５４．１）またはその組合せの使用を含んでなる、方法。
【請求項６】
アエロピルム・ペルニクスのＵＰアーゼおよびスルホロブス・ソルファタリカスのＰＮＰアーゼが、請求項２〜４のいずれか一項に記載の宿主細胞により提供される、請求項５に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項７】
得られる製品が、活性医薬成分（ＡＰＩ）またはその中間体である、請求項５〜６のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項８】
糖供与ヌクレオシドが、Ｄ−リボースまたは２’−デオキシリボースを含む天然または修飾ヌクレオシド；２’位、３’位および／または５’位が修飾されたリボース基を含むヌクレオシド；および糖がβ−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−キシロース、３’−デオキシリボース、３’，５’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、５’−デオキシリボース、２’，５’−ジデオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、３’−アミノ−３’−デオキシリボース、または２’−フルオロ−２’−デオキシリボースであるヌクレオシドから選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項９】
受容塩基が、天然または置換されたピリミジンおよびプリン塩基；１位、２位、６位の１箇所以上で置換されたプリン塩基；３位、５位の１箇所以上で置換されたピリミジン塩基；およびプリン、２−アザプリン、８−アザプリン、１−デアザプリン（イミダゾピリジン）、３−デアザプリン、７−デアザプリン、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−メルカプトプリンから選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１０】
６０〜１００℃の間で行われる、請求項５〜９のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１１】
水性媒体中、または非プロトン性極性共溶媒系で行われる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１２】
非プロトン性極性共溶媒系が、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフランおよびジメチルホルムアミドから選択される、請求項１１に記載のトランスグリコシル化方法。
【請求項１３】
糖供与ヌクレオシドが、ウリジンおよび２’−デオキシウリジンから選択され、受容塩基が、２，６−ジアミノプリン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、トランス−ゼアチン、２−クロロ−６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリンおよび６−メルカプトプリンから選択される、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のトランスグリコシル化方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５１４７９７（Ｐ２０１３−５１４７９７Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５３３９（Ｐ２０１２−５４５３３９）
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７０５８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７６８９４
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２１６３９１２）プラスミア、ビオテク、ソシエダッド、リミターダ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＬＡＳＭＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ，Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７０５８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７６８９４
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２１６３９１２）プラスミア、ビオテク、ソシエダッド、リミターダ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＬＡＳＭＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ，Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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