バイオマスの区画化併行複発酵
酵素の最終産物阻害の軽減をもたらす糖化プロセスおよび発酵プロセスの区画化を提供する、バイオマスの併行複発酵のための方法および装置が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオマス糖化および生成された糖類の発酵の分野に関する。具体的には、酵素の最終産物阻害の軽減をもたらす糖化プロセスおよび発酵プロセスの区画化を提供する、バイオマスの併行複発酵のための方法および装置が開示される。
【背景技術】
【０００２】
バイオマス（セルロース系およびリグノセルロース系）供給原料および廃棄物（例えば、農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙スラッジ、ならびに都市および産業の固形廃棄物）は、化学物質、プラスチック、燃料および飼料の生成のための、潜在的に多量の再生可能な供給原料を提供する。セルロース系およびリグノセルロース系の供給原料ならびに廃棄物は、セルロース、ヘミセルロースおよびペクチンを含む炭水化物ポリマーからなり、一般に、様々な化学的手段、機械的手段および酵素による手段（酵素糖化）により処理されて、主としてヘキソースおよびペントース糖類を放出し、次いで、微生物によって有用な生成物に変換され得る。
【０００３】
バイオマスの酵素糖化は、糖化容器中のセロビオースおよびグルコースの蓄積をもたらし、これが、エキソセルラーゼの最終産物阻害を生じ、セルロース加水分解を減速させる。キシラナーゼのフィードバック阻害を生じてヘミセルロース加水分解を減速させるキシロビオースも生成される。グルカンおよびキシランの加水分解の減速は、より高濃度の酵素の添加により部分的に緩和され得るが、この解決策は、このプロセスのコストを増加させる。
【０００４】
酵素糖化の間の最終産物阻害に対処するためのこれまでの方法は、糖化および発酵の２つの工程が合わされた平行複発酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＦ；非特許文献１）の使用を含む。
【０００５】
バイオ燃料生産の間にＳＳＦにおいてこれらの２つのプロセス工程を合わせることは、より低い資本コストを有し、バイオ燃料生成物の存在が、発酵汚染（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の危険性を低下させる（非特許文献２）。さらに、この方法では、形成されたグルコースは発酵微生物によって消費され、β−グルコシダーゼおよびセロビオヒドロラーゼの両酵素の最終産物阻害を緩和する。これにより、セルロースからのセロビオースの形成、およびそのグルコースへの加水分解が加速され、セルロースからグルコースへの変換の速度を上昇させる。グルコースからフルクトースへおよびキシロースからキシルロースへの可逆的な変換が最終産物阻害を部分的に緩和する、グルコース最終産物阻害を緩和することへの別のアプローチが、特許文献１に記載された。
【０００６】
Ｋｌｅｉら（非特許文献３）は、酵素反応器として使用される中空糸限外濾過膜カートリッジ中にアスペルギッルス・ポエニキス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）由来の固定化β−グルコシダーゼを使用し、これによりセロビオースの加水分解を行うことを検討した。この系は、セルロースの糖化の間のトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼの循環のためにも使用された。中空糸膜の利用は、セルロースの連続処理を可能にし、セルラーゼ所要量を著しく減少させる。
【０００７】
特許文献２では、併行複発酵は、固体支持体に吸着された再使用可能なエンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼ酵素によって行われた。
【０００８】
特許文献３は、中空糸膜反応器中の、蒸気爆砕された藁からのアセトンおよびブタノールの製造のための、合わされた酵素加水分解および連続発酵を記載している。藁の酵素加水分解のために使用されるセルラーゼ酵素は、高効率および低コストのためにこの膜反応器を使用して再利用され得ることが示された。
【０００９】
上記の方法は、それぞれ糖化プロセスを部分的に改善したものであり、糖化の間の最終産物阻害を、ごく僅かにしか緩和しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０１８３２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第４，２２０，７２１号明細書
【特許文献３】中国公告特許第１０１１７３３０６号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｋａｇｉ，Ｍら，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，１９７７中，５５１−５７１
【非特許文献２】Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｍａｓｓ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，３：３０１−３０７，１９９２
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．（１９８１）１１ Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｅｎｅｒｇｙ Ｐｒｏｄ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅ．，３ｒｄ，５９３−６０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当該技術分野において開示された方法があるにもかかわらず、併行複発酵の間の酵素糖化の最終産物阻害という問題に対処するために、より効率的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、ある特定のオリゴ糖加水分解酵素が隔離されている中空糸循環ループを使用する、前処理バイオマスの区画化併行複発酵のための方法および装置を提供することにより、上記の問題を解決する。当該方法および装置は、前処理バイオマスの糖化の間に糖化酵素のフィードバック阻害を引き起こし得るバイオマス成分の除去をもたらして、糖化の間の発酵性糖類の放出を改善し、かつ糖化効率の上昇によって標的生成物の収率を上昇させる。
【００１４】
本発明の１つの態様は、糖化容器および別個の発酵容器を含む前処理バイオマスを処理するための装置であって、前記容器同士は、２つの外部循環ループとこれらの２つの外部循環ループを連結しかつ半透膜を含む中空糸循環ループとによって連結されており、前記装置は、前処理バイオマスの区画化併行複発酵を提供する、装置に関する。
【００１５】
別の態様において、図２に従う装置が提供され、前記装置は、第１の外部循環ループ（２）に連結された糖化容器（１）を含み、前記第１の外部循環ループ（２）は、中空糸循環ループ（３）の第１の半透膜（１０）の外部にありかつその第１の半透膜（１０）に連結されており；前記中空糸循環ループ（３）は、この中空糸循環ループ（３）の第２の半透膜（１１）の外部にありかつその第２の半透膜（１１）に連結されている第２の外部循環ループ（４）に連結されており；前記第２の外部循環ループ（４）は、標的生成物のための排出口（６）を有する発酵容器（５）に連結されている。この装置は、第１の外部循環ループ（２）のための第１の循環ポンプ（７）と、第２の外部循環ループ（４）のための第２の循環ポンプ（８）と、内部中空糸ループ（３）のための第３の循環ポンプ（９）とを含む一連の循環ポンプをさらに含み得る。
【００１６】
別の態様において、前処理バイオマスを処理する方法が提供され、前記方法は、
（ａ）図２に記載される本発明の装置を供給する工程と、
（ｂ）前処理されたバルクバイオマスと糖化酵素集合体との混合物を前記装置の糖化容器（１）に供給する工程であって、前記混合物は、糖化によって高分子量成分および低分子量成分の両方を生成する工程と、
（ｃ）少なくとも１種の隔離された酵素を中空糸循環ループ（３）中に供給する工程と、
（ｄ）ある量の（ｂ）の混合物を、第１の循環ループを通して、第１の中空糸半透膜（１０）上に送達する工程であって、これにより、（ｂ）の混合物の前記高分子量成分は前記膜を通って拡散せず、当該混合物の前記低分子量成分は前記膜を通って中空糸循環ループ（３）中へと拡散する工程と、
（ｅ）（ｄ）において当該中空糸循環ループ（３）中へと拡散する低分子量成分を、前記中空糸循環ループ中で前記少なくとも１種の隔離された酵素によって加水分解する工程であって、これにより、発酵性糖類を含む加水分解生成物が形成される工程と、
（ｆ）発酵性糖類を含む加水分解生成物を第２の半透膜（１１）を通って第２の循環ループ（４）中および発酵容器（５）へと送達する工程と
を包含し、前処理バイオマス成分は循環ポンプによって当該装置全体にわたって循環される。別の態様において、（ｆ）の発酵容器へと送達される（ｅ）の発酵性糖類は、少なくとも１種の微生物によって少なくとも１種の標的生成物に変換される。
【００１７】
上記の方法の別の態様において、第１および第２の半透膜の存在が、前記糖化容器および発酵容器中への１種以上の隔離された酵素の拡散を妨げることにより、その酵素の減少を防止する。
【００１８】
上記の方法の別の態様において、バイオマスに対する前記隔離された酵素の作用によって形成された加水分解生成物は、前記発酵容器へと送達され、糖化容器中での最終産物フィードバック阻害を緩和する。
【００１９】
上記の方法の別の態様において、前記第１および第２の半透膜の分子量透過性は、約１０〜約３０キロダルトンである。
【００２０】
本発明の別の態様において、前処理バイオマスの区画化併行複発酵のための方法が提供され、前記方法は、（ａ）前処理バイオマスおよび糖化酵素集合体を糖化容器に供給する工程であって、これにより糖化生成物が形成され、１つ以上の半透膜を通って移動され、１種以上のさらなる隔離された酵素を含む少なくとも１つの区画を通過し、これにより発酵性糖類を含む加水分解生成物が形成される工程と、（ｂ）前記加水分解生成物を、標的生成物への発酵のための別個の発酵容器へと送達する工程とを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】様々な糖化酵素比での、酸／塩基で前処理されたサトウキビバガスからのモノマーグルコースの理論収量に対するパーセントとして表される、０〜１２０ｈの糖化の時間的経過を図示している。糖化は、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）（ｐＨ４．６）、１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗ／ｖ）および０．０１％ＮａＮ３（ｗ／ｖ）の存在下で、１１％の固形分配合量で行われた。酵素比（ｍｇタンパク質／ｇセルロース）は、それぞれ、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、およびＮｏｖｏｚｙｍｅ １８８の酵素について、４：３：８、８：３：４、６：３：６、６：６：１２、１２：６：１．２および１２：６：１２であった。
【図１Ｂ】その様々な酵素比についての図１Ａからの１２０ｈにおけるモノマーグルコース収率の比較を図示している。
【図２】別個の糖化容器および発酵容器が２つの外部循環ループおよび中空糸循環ループによって連結されている、区画化併行複発酵装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
出願人らは、引用した参考文献すべての全内容を本開示に明確に援用する。別段の記載がない限り、百分率、部、比などは全て、重量による。商標は大文字で示される。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、ある範囲、好ましい範囲、または上方の好ましい値および下方の好ましい値の列記として与えられる場合、これは、範囲が別個に開示されているか否かに関わらず、任意の上方の範囲限界または好ましい値と、任意の下方の範囲限界または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。本明細書にある数値範囲が記載される場合、別段の記載がない限り、その範囲は、その端点、ならびにその範囲内の全ての整数および有理数を含むことが意図される。本発明の範囲が、範囲を定義する際に記載される具体的な値に限定されることは意図されていない。
【００２３】
本発明の装置および方法は、中空糸半透膜と、別個の糖化容器および発酵容器を連結するための中空糸循環ループとを使用することにより、区画化併行複発酵（ＣＳＳＦ）の間の酵素糖化の最終産物阻害の緩和を提供する。
【００２４】
定義
明確にするために、本明細書で使用される用語は、本明細書に記載されるとおりに、またはかかる用語が本発明の当業者により理解されるであろうとおりに、理解されるべきである。本明細書で使用されるある特定の用語の追加的な説明が、以下に与えられる。
【００２５】
「グルコース」は、Ｃ１にアルデヒド（ヘミアセタール）官能基を有する、化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有する６個の炭素原子を含有する単糖である。
【００２６】
「グルカン」は、グリコシド結合によって結合された、β−１，４−結合したＤ−グルコースモノマーの多糖をいう。
【００２７】
「アラビノース」は、アルデヒド官能基を含む５個の炭素原子を含有する単糖である。
【００２８】
「キシロース」は、Ｃ１にアルデヒド（ヘミアセタール）官能基を有する、化学式Ｃ５Ｈ１０Ｏ５を有する５個の炭素原子を含有する単糖である。
【００２９】
「セロビオース」は、β（１，４）グリコシド結合で結合した２つのグルコース分子の縮合から誘導される二糖である。
【００３０】
「セロビオヒドロラーゼ」は、還元末端および非還元末端でセルロースからセロビオース単位を切断する酵素をいう。
【００３１】
「キシロビオース」は、キシロースモノマーの間にβ−１，４グリコシド結合を有する、キシロースモノマーの二糖である。
【００３２】
「β−キシロシダーゼ」は、β−グリコシド結合によって結合されたキシロース含有オリゴマー（例えば、キシロビオース）を切断する酵素群をいう。
【００３３】
「β−キシロビオシダーゼ（ｘｙｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ）」は、キシロビオースをキシロースへと加水分解する酵素である。
【００３４】
「キシラン」は、β−１，４−結合したＤ−キシロース単位から主として構成される直鎖状の多糖をいい、これは、他の糖類（例えば、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロース）による分岐を含有し得る。
【００３５】
「キシラナーゼ」は、直鎖状の多糖およびオリゴ糖であるβ−１，４−キシランをキシロースおよびキシロースオリゴマーへと分解する酵素をいう。一部のキシラナーゼは、キシロースの分岐鎖オリゴマーに対して作用する。
【００３６】
「β−グルコシダーゼ」は、２つのグルコース分子またはグルコース置換分子を結合するβ１−＞４結合（すなわち、二糖セロビオース）に対して作用する酵素である。β−グルコシダーゼは、グルコースの放出を伴うβ−Ｄ−グルコシド中の末端の非還元性残基の加水分解を触媒する。
【００３７】
「アラビノフラノシダーゼ」は、アラビノース含有キシラン中の末端の非還元性のα−Ｌ−アラビノフラノシド残基を加水分解する酵素をいう。
【００３８】
「エキソセルラーゼ」は、セルロースの還元末端および非還元末端からセロビオースを放出する酵素をいう。
【００３９】
「分岐鎖キシロースオリゴマー」は、アラビノースおよびキシロースの分岐があるオリゴキシロース主鎖をいう。
【００４０】
「分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素」は、分岐鎖キシロースオリゴマーを加水分解するキシラナーゼをいう。
【００４１】
「半透膜」および「半透膜フィルター」は、本明細書において相互交換可能に使用され、ある特定の大きさ、形状または特性までの物質のみの通過を可能にする物理的障壁として機能する膜をいう。本方法において有用な半透膜の例としては、ポリスルホン、ヒドロキシル化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、およびポリエーテルイミドのうちの１つ以上から作製される膜が挙げられる。
【００４２】
「中空糸半透膜」および「中空糸半透膜フィルター」は、中空で半透性の繊維から作製される半透膜の一種である。中空糸半透膜は、大きい表面対容積比を有する。
【００４３】
「第１の半透膜」は、バイオマスの糖化の結果生じた特定の成分の、糖化容器から中空糸循環ループへの移動を可能にする中空糸半透膜をいう。
【００４４】
「第２の半透膜」は、中空糸循環ループ中の隔離された酵素によって生成される糖類の、第２の外部循環ループへの移動を可能にする中空糸半透膜をいう。この第１および第２の中空糸半透膜はともに、類似の材料（例えば、上に示された材料）から作製される。
【００４５】
「標的生成物の選択的除去」または「選択的に除去される標的生成物」は、発酵容器内のいずれの他の成分も除去することなく、標的生成物を除去することを意味する。
【００４６】
「区画化併行複発酵（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ＣＳＳＦ）」は、この文脈において、１種以上の糖類の発酵および前処理バイオマスの糖化が、少なくとも１つの循環ループによって連結された別個の容器中で同時に行われるプロセスをいう。
【００４７】
「発酵」は、微生物を使用して化学基質を（好気性プロセスまたは嫌気性プロセスのいずれかを介して）標的生成物に変換することを意味する。
【００４８】
「発酵容器」は、微生物による基質の標的生成物への発酵に適するような、本発明における使用に適した任意の容器を意味する。
【００４９】
「加水分解生成物」は、バイオマスの糖化の結果生じる生成物をいう。加水分解生成物中の糖化生成物は、加水分解を行う糖化酵素の違いおよび加水分解を行う時間の長さの違いによって異なるであろう。効果的な糖化は、発酵性糖類を含有する加水分解生成物を生成する。
【００５０】
「発酵性糖類」は、１種もしくは複数種の標的生成物を生成するための発酵プロセスにおいて微生物によって炭素源として使用され得る単糖を主として含む（一部の二糖が依然として存在し得る）糖内容物をいう。
【００５１】
「循環ポンプ」は、種々の循環ループ中の液状懸濁物が、装置中を循環し、移動するようにするポンプをいう。
【００５２】
「標的生成物」は、発酵によって生成される化学物質、燃料、または化学的構成単位をいう。生成物は、広い意味で使用され、タンパク質（例えば、ペプチド、酵素および抗体を含む）などの分子を包含する。また、エタノールおよびブタノールも、この標的生成物の定義の範囲内で企図される。
【００５３】
「バイオマス」は、セルロース系およびヘミセルロース系物質を含む、任意のリグノセルロース系物質（例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、庭ゴミ、木材、林業廃棄物およびこれらの組み合わせ、ならびにさらに後述されるもの）をいう。このバイオマスは、多糖およびオリゴ糖を含む炭水化物内容物を有し、リグニン、タンパク質および脂質などのさらなる成分も含み得る。
【００５４】
「前処理バイオマス」は、酵素糖化を促進する任意の手段によって処理されたバイオマスである。
【００５５】
「糖化」または「酵素糖化」は、加水分解酵素の作用による多糖からの発酵性糖類の生成をいう。前処理バイオマスからの発酵性糖類の生成は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素による酵素糖化によって起こる。
【００５６】
「糖化容器」は、バイオマスの糖化のための、本発明における使用に適した任意の容器を意味する。酵素糖化が行われる糖化容器は、前処理バイオマスを含み得る。
【００５７】
「酵素集合体」または「糖化酵素集合体」は、加水分解酵素の集まりである。これらの酵素は、典型的に、微生物によって分泌される。この糖化酵素集合体は、典型的に、１つ以上のセルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、およびエステラーゼを含むであろう。本発明において、糖化容器に加えられる糖化酵素集合体は、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含む必要はない。なぜなら、これらは中空糸循環ループ中に含まれるからである。
【００５８】
「隔離された酵素」は、本明細書で使用される場合、中空糸循環ループ内に隔離された酵素であって、バイオマスのグルコースオリゴマーならびに直鎖および分岐鎖キシロースオリゴマーを加水分解することができるもの（例えば、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、ならびにアラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼ）をいう。
【００５９】
「最終産物フィードバック阻害」は、酵素反応の生成物の蓄積が最終産物の形成につながる反応を阻害する状況をいう。本開示において、例えば、エキソセルラーゼは、セロビオースによって、およびある程度まではグルコースによって、フィードバック阻害され、キシラナーゼは、キシロビオースによって、およびある程度まではキシロースによって、フィードバック阻害される。β−グルコシダーゼは、その生成物であるグルコースによってフィードバック阻害される。β−キシロビオシダーゼは、その生成物であるキシロースによって阻害される。
【００６０】
「循環ループ」は、糖化容器または発酵容器のいずれかの内容物が、それぞれ、中空糸循環ループに隣接した第１または第２の半透膜の外面上を循環するようにする液体循環ループをいう。
【００６１】
「第１の外部循環ループ」は、糖化容器からのバイオマスおよび糖化酵素集合体が、中空糸循環ループの第１の半透膜の外面上を通るようにする流体循環ループである。
【００６２】
「第２の外部循環ループ」は、発酵容器の内容物が、中空糸循環ループの第２の半透膜の外面上を通るようにする流体循環ループであり、その膜を横切って拡散するグルコース、キシロースおよびアラビノースを捕えて、それらを発酵容器へと送達する。
【００６３】
「中空糸循環ループ」は、第１および第２の半透膜フィルターおよび１種以上の隔離された酵素を含む流体循環ループをいい、そこで酵素加水分解が行われ、生成物は、糖化容器と発酵容器との間を第１および第２の外部循環ループを介してその第１および第２の半透膜を通って輸送される。
【００６４】
「ある特定の成分の選択的送達」は、糖化されたバイオマスのある特定の大きさの成分（例えば、オリゴ糖（例えば、セロビオース、キシロビオースおよび分岐鎖キシロースオリゴマー））の、糖化容器から第１の半透膜フィルターを通って中空糸循環ループへの、および第２の半透膜フィルターを通って発酵容器への送達をいう。
【００６５】
「高分子量成分」は、中空糸ループの半透膜フィルターを通って拡散し得ない、３０ＫＤよりも大きい分子量を有するバイオマスの成分をいう。
【００６６】
「低分子量成分」は、中空糸ループの半透膜フィルターを通って拡散し得る、３０ＫＤ未満の分子量を有するバイオマスの成分をいう。
【００６７】
バイオマス
本明細書に記載される方法に適したバイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ゴミ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシの穂軸、作物残渣（例えば、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉）、草、小麦、麦藁、大麦、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、粉砕により得られる成分（穀物、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および灌木のもの）、野菜、果実、花ならびに動物糞尿が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
バイオマスは、単一の供給源に由来しても良いし、または２つ以上の供給源に由来する混合物を含むこともできる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または茎もしくは柄と葉との混合物を含み得る。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明にとって有用なバイオマスは、比較的高い炭水化物含有量を有し、比較的密度が高く、かつ／または収集、輸送、貯蔵および／もしくは取扱いが比較的容易である。別の実施形態において、バイオマスは、農業残渣（例えば、トウモロコシの茎葉、麦藁、大麦藁、燕麦藁、稲藁、キャノーラ藁、および大豆の茎葉）；草（例えば、スイッチグラス、茅、コードグラス、およびクサヨシ）；繊維処理残渣（例えば、トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプ工場微繊維（ｐｕｌｐ ｍｉｌｌ ｆｉｎｅｓ）および廃棄物（ｒｅｊｅｃｔｓ）ならびにサトウキビバガス）；モロコシ；林業廃棄物（例えば、アスペン材、他の硬木材、軟木材およびおがくず）；および使用済み古紙製品；ならびに他の作物または十分に豊富なリグノセルロース系物質を包含し得る。さらに別の実施形態において、有用なバイオマスは、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの茎葉、サトウキビバガスおよびスイッチグラスを含む。
【００７０】
糖化に先立つバイオマスの前処理
バイオマスにおいて、結晶性のセルロースフィブリルは、ヘミセルロースマトリクス中に埋め込まれており、次にこのヘミセルロースマトリクスは、外側のリグニン層に囲まれている。バイオマスの前処理には、後の酵素糖化プロセスをより効果的にするために、通常、このリグニン障壁を変性することが求められる。バイオマスを前処理してそれを糖化に向けて調製する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｓｕ，Ｔ．−Ａ．，１９９６，「Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍａｓｓ（バイオマスの前処理）」，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（バイオエタノールに関するハンドブック：製造および利用），Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中，１７９−２１２；Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，Ｓｉｎｇｈ，Ａ．，１９９３および米国特許第７，５０３，９８１号明細書、米国特許第７，５０４，２４５号明細書、米国特許第７，４１３８，８２号明細書、国際公開第２００８／１１２２９１号パンフレット）。前処理方法には、例えば、希酸加水分解（Ｔ．Ａ．ＬｌｏｙｄおよびＣ．Ｅ Ｗｙｍａｎ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：１９６７，２００５）、アンモニア繊維爆砕（Ａｍｍｏｎｉａ Ｆｉｂｅｒ Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ：ＡＦＥＸ）技術（Ｆ．Ｔｅｙｍｏｕｒｉら，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：２０１４，２００５），ｐＨ制御液熱水処理（ｐＨ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（Ｎ．Ｍｏｓｉｅｒら，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：１９８６，２００５）、アンモニア水再利用法（ａｑｕｅｏｕｓ ａｍｍｏｎｉａ ｒｅｃｙｃｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ：ＡＲＰ）（Ｔ．Ｈ．ＫｉｍおよびＹ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：２００７，２００５）、石灰前処理（Ｓ．ＫｉｍおよびＭ．Ｔ．Ｈｏｌｚａｐｐｌｅ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：１９９４，２００５）およびイオン液体前処理（米国特許出願公開第２００８／０２２７１６２号明細書）がある。
【００７１】
バイオマス前処理のために、前処理の温度、ｐＨ、時間および反応物の濃度、１種以上の付加的な試薬の濃度、バイオマス濃度、バイオマスの種類および粒径が関連している。したがって、これらの可変因子は、前処理プロセスを最適化するために、バイオマスの種類ごとに必要に応じて調整され得る。
【００７２】
本発明の方法のバイオマスは、上記の方法のいずれかによって前処理され得る。あるいは、１つの実施形態においては、糖化に向けて本発明の方法のバイオマスを調製するために、バイオマスは、最初に１００ｍＭ Ｈ２ＳＯ４で１２１℃にて１時間にわたり前処理され、そして水で洗浄され得る。
【００７３】
１つの実施形態において、望ましくない分解生成物およびリグニン断片を除去するために、バイオマス残渣は、さらに、２．９％ＮａＯＨ（ｗ／ｖ）を含有する６９％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）中に懸濁され、そしてステンレス鋼製圧力容器（１９ｍＬ容量）中で、１７５℃の温度にて１４０分間にわたり加熱され、室温まで冷却され、濾過され、６９％ＥｔＯＨで洗浄され得る。別の実施形態において、前処理バイオマスは、風乾され得る。乾燥は、従来の手段（例えば、周囲温度での真空へのもしくは大気圧の気流への曝露、および／またはオーブンもしくは真空オーブン中での加熱）によって行われ得る。
【００７４】
乾燥された前処理バイオマスは、次いで、グルカン、キシランおよび酸不溶性リグニンの濃度を測定するために、当該技術分野においてよく知られた分析手段を用いて分析され得る。乾燥された前処理バイオマスのグルカンおよびキシランの含有量は、糖化プロセスでの所要酵素配合量を決定するために使用される。
【００７５】
糖化
前処理バイオマスは、糖化酵素集合体の存在下で加水分解され、オリゴ糖および／または単糖を加水分解生成物として放出し得る。糖化プロセスを改善するために、Ｔｗｅｅｎ ２０もしくはＴｗｅｅｎ ８０またはポリオキシエチレン（例えば、ＰＥＧ ２０００、４０００または８０００）などの界面活性剤が加えられ得る。他の界面活性剤（例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，３５４，７４３Ｂ２号明細書に記載されているもの）も使用され得る。バイオマス処理のための糖化酵素および方法は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）において概説されている。糖化酵素集合体は、１つ以上のグリコシダーゼを含み得る。このグリコシダーゼは、セルロース加水分解グリコシダーゼ、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ、およびデンプン加水分解グリコシダーゼからなる群から選択され得る。糖化酵素集合体中の他の酵素としては、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼ、ならびにアセチルおよびフェルロイルエステラーゼが挙げられ得る。
【００７６】
糖化酵素集合体は、二糖、オリゴ糖、および多糖のグリコシド結合を加水分解しかつ一般群「ヒドロラーゼ」（ＥＣ ３．）の酵素分類ＥＣ ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（酵素命名法）１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，補遺１（１９９３），補遺２（１９９４），補遺３（１９９５），補遺４（１９９７）および補遺５付き［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０，１９９９にある］）中に見出される群「グリコシダーゼ」から主として（しかし限定的にではなく）選択される１つ以上の酵素を含む。本発明の方法において有用なグリコシダーゼは、グリコシダーゼが加水分解するバイオマス成分によって分類され得る。本発明の方法にとって有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ）は、キシロースおよびアラビノースを含有する分岐鎖オリゴマーを加水分解する。
【００７７】
さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ １．１１．１．ｘ）、およびアセチル（ＥＣ ３．１．１．６）およびフェルロイル（ＥＣ ３．１．１．７３）エステラーゼなどの他の活性を糖化酵素集合体に加えてバイオマスの他の成分からの多糖の放出を助けることは、有用であり得る。多糖加水分解酵素を産生する微生物は、多くの場合に、異なる基質特異性を有するいくつかの酵素、または酵素群によって触媒される活性（例えば、セルロース分解）を示すということは当該技術分野においてよく知られている。したがって、微生物由来の「セルラーゼ」は、全ての酵素がセルロース加水分解活性に寄与し得る酵素群を含み得る。市販されている酵素調製物または市販されていない酵素調製物（例えば、セルラーゼ）は、その酵素を得るために利用された精製方法に応じて多くの酵素を含み得る。したがって、本発明の方法の糖化酵素集合体は「セルラーゼ」のような酵素活性を含み得るが、この活性は２つ以上の酵素によって触媒され得るものであることが認識される。
【００７８】
上に示したように、本発明において、糖化容器に加えられる糖化酵素集合体は、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含有する必要はない。これらの酵素のうちの１種以上が、中空糸循環ループ内で隔離されることになる。ポリマー状およびオリゴマー状の両方のキシロースに作用するキシラナーゼ酵素は、糖化容器の中の糖化酵素集合体中に含まれてもよく、さらに中空糸循環ループ内に隔離されてもよい。
【００７９】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）など、単離された形態で商業的に入手され得る。また、糖化酵素は、未精製であり得、一種の細胞抽出物または全細胞調製物として提供され得る。酵素は、複数種の糖化酵素を発現するように操作された組換え微生物を使用して生成され得る。当業者であれば、集合体において使用する酵素の有効量を決定し、最適な酵素活性が得られるように条件を調整する方法を知っているであろう。また、当業者であれば、選択された条件下で、所与の前処理生成物の最適な糖化を得るために集合体内に必要とされる酵素活性のクラスを最適化する方法も知っているであろう。
【００８０】
好ましくは、糖化反応は、糖化酵素についての温度最適条件およびｐＨ最適条件で、またはその付近で行われる。本発明の方法において糖化酵素集合体とともに使用される温度最適条件は、約１５℃〜約１００℃の範囲である。別の実施形態において、温度最適条件は、約２０℃〜約８０℃の範囲、最も典型的には４５〜５０℃の範囲である。ｐＨ最適条件は、約２〜約１１の範囲であり得る。別の実施形態においては、本発明の方法において糖化酵素集合体とともに使用されるｐＨ最適条件は、約４〜約５．５の範囲である。
【００８１】
糖化は、約数分〜約１２０時間、好ましくは約数分〜約４８時間の時間にわたって行われ得る。反応の時間は、酵素の濃度および比活性、ならびに使用される基質、その濃度（すなわち、固形分配合量）、ならびに環境条件（例えば、温度およびｐＨ）によって決まる。当業者は、特定の基質および糖化酵素集合体とともに使用されるべき温度、ｐＨおよび時間の最適条件を容易に決定し得る。
【００８２】
糖化は、回分式でまたは連続プロセスとして行われ得る。また、糖化は、１つの工程でまたは多くの工程で行われ得る。例えば、糖化のために必要とされる種々の酵素は、異なるｐＨまたは温度最適条件を示し得る。一次処理が、ある温度およびｐＨで１種もしくは複数種の酵素を用いて行われ、続いて、二次または三次（または、より高次）の処理が、異なる温度および／またはｐＨで異なる１種もしくは複数種の酵素を用いて行われ得る。また、逐次的な工程で異なる酵素を用いる処理は、同じｐＨおよび／もしくは温度で行われるか、または異なるｐＨおよび温度で、例えば、より高いｐＨおよび温度で安定かつより活性なヘミセルラーゼを用い、続いてより低いｐＨおよび温度で活性なセルラーゼを用いて行われ得る。
【００８３】
糖化に続くバイオマスからの糖類の可溶化の程度は、単糖およびオリゴ糖の放出を測定することによってモニタリングされ得る。単糖およびオリゴ糖を測定する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、還元糖類の濃度は、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２６−４２８，１９５９）を用いて測定され得る。あるいは、糖類は、後述するように、適切なカラムを用いてＨＰＬＣで測定され得る。
【００８４】
区画化ＳＳＦ
本発明の方法において、区画化ＳＳＦ（ＣＳＳＦ）は、前処理バイオマスの糖化の間の、糖化酵素集合体中に典型的に存在する糖化酵素のうちのいくつかの酵素のフィードバック阻害を除去するために開発された。場合によっては、生成物フィードバック阻害は、より多くの酵素を糖化容器に加え、その結果、糖化の間のフィードバック阻害に起因する酵素活性の減少を小さくすることによって、ある程度は克服され得る。しかしながら、より多くの酵素を糖化プロセスに加えることは、加水分解反応を促進する一方で、費用がかかり、プロセスの総コストを増加させる。糖化酵素のその最終産物によるフィードバック阻害という問題を解消するためには、最終産物を絶えず除去して、その蓄積を回避する必要がある。
【００８５】
本例においては、糖化酵素のフィードバック阻害は、ＣＳＳＦを適用し、加水分解酵素のうちのいくつかを別個の区画（例えば、中空糸循環ループ）中に隔離することを通して緩和される。糖化容器から第１の半透膜フィルターを介して別個の酵素含有区画中への酵素の基質の拡散は、糖化容器中のその基質の濃度を低下させ、それにより、糖化酵素集合体酵素のそれらの生成物によるフィードバック阻害の可能性を除去する。酵素含有区画中の隔離された酵素（例えば、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、およびアラビノフラノシダーゼ）は、それらの基質を所望の単糖生成物へと加水分解する。この生成物は第２の半透膜を通って移動し、この第２の半透膜から発酵容器中へと拡散する。第１および第２の半透膜はともに、１０〜約３０ｋＤａの分子量カットオフを有しており、小分子（すなわち、低分子分岐鎖キシロースオリゴマーを含む、可溶性オリゴ糖）の透過のみを可能にするであろう。隔離された酵素は、第１または第２の半透膜を透過することができないため、その別個の区画中に留まる。二糖のその単糖への加水分解、およびそれらの標的生成物への変換は、糖化容器中の酵素の最終産物阻害を減少させる。酵素を中空糸循環ループ中に隔離することは、酵素回収プロセスを必要とすることなく、糖化の間のそれらの反復使用を可能にする。別個の糖化容器および発酵容器を有することは、それらの容器が異なる温度で運転されることを可能にし、そしてまた、消化されていないバイオマスに発酵細胞が付着するのを防ぐ。
【００８６】
中空糸半透膜
１つの実施形態において、半透膜は、中空糸半透膜である。中空糸半透膜は、高い膜充填密度、高い表面／容積比、衛生的な設計という独特の利点を提供し、その構造的完全性および構造ゆえに、中空糸半透膜は、透過液逆圧（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｂａｃｋｐｒｅｓｓｕｒｅ）に耐えることができ、したがって、システムの設計および操作における柔軟性を可能にする。
【００８７】
中空糸半透膜は、ある特定の大きさ、形状または特性までの物質のみの通過を可能にする物理的障壁として機能するものであり、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（中空糸の製造および利用），Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，Ｒｅｖ．，第１９４巻，Ｊ．Ｓｃｏｔｔ編，１９８１，Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，ＮＪ．およびＳｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（合成膜），Ｍ．Ｂ．Ｃｈｅｎｗｅｔｈ編，ｐ．６３，１９８６，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹおよびＬｅｅｐｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａｓ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｒｅｖｉｅｗ（バイオ燃料および生化学物質の回収における膜分離：最新報告），Ｓｅｐ．Ｐｕｒｉｆ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｐｐ．９９−１９４，１９９２）。中空糸半透膜の２つの基本的な形態は、「等方性」および「異方性」の形態である。膜分離は、これらの形態を使用することによって達成される。
【００８８】
「異方性」の構成は、支持する多孔性構造物の上にできた緻密な、半透性の、極めて薄いスキン層を含有する。「等方性」の微孔性ポリスルホン半透膜は、キャスティング液（ｃａｓｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の配合とキャスティング条件との特定の組み合わせを用いることにより調製され得る。中空糸膜も平膜も、このようにして調製され得る。等方性膜は、スキン層がなく、膜全体にわたる均一な多孔性によって特徴づけられる。本明細書に開示される方法の目的のために、両方の種類の中空糸半透膜が使用され得る。
【００８９】
中空糸濾過プロセスにおいては、相変化は関与せず、潜熱は必要とされないので、中空糸半透膜システムは、エネルギー要求が大きくない。さらに、中空糸半透膜は、モジュール容積当りの膜表面が大きい。したがって、中空糸半透膜の大きさが他の種類の膜より小さくなり得る一方で、中空糸半透膜は、より高い性能を提供することができる。
【００９０】
中空糸半透膜には柔軟性があり、中空糸半透膜は「インサイド・アウト」または「アウドサイド・イン」プロセスによって濾過を行い得る。さらに、中空糸半透膜は、他の種類の単位操作と比べて低い運転費を有する。中空糸半透膜バイオリアクターは当該技術分野において知られている（国際公開第２００７／００４１７０号パンフレットおよび国際公開第２００８／００６４９４号パンフレットおよび国際公開第２００７／１２０４４９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２／０１６４７３１号明細書）および（Ｅｎｇａｓｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．，３５：９９−１０５，１９８０ならびにＫｉｔａｎｏ，Ｈ．およびＩｓｅ，Ｎ．，Ｔｒｅａｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：５−７，１９８４）。中空糸半透膜バイオリアクターは連続的に操作され得、高い表面対容積比という利点を有し得る。これらの系では、生体触媒（酵素および／または微生物）は、「遊離」しているかまたは「固定化」されているかのいずれかで使用され得る。
【００９１】
中空糸半透膜は、任意の種類の意図された用途に種々の細孔径で利用できる。本発明の方法のために、半透膜は１０〜約３０ｋＤａの分子量カットオフを有しており、小分子（すなわち、低分子分岐鎖キシロースオリゴマーを含む可溶性オリゴ糖）の通過のみを可能にするであろうから、中空糸循環ループの領域内に隔離された嵩高い酵素が糖化容器および発酵容器の中に漏入するのを防ぎ、糖化容器中の前処理バイオマスを中空糸循環ループの酵素および発酵容器から隔離する。
【００９２】
本発明の方法において使用される中空糸半透膜は、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ヒドロキシル化ポリスルホン（ＯＨＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン（ＯＨＰＥＳ）、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、またはこれらの任意の組み合わせなどの材料から作製され得る。
【００９３】
糖化を促進しかつ酵素阻害を防止するための中空糸循環ループの利用
１つの実施形態において、本発明の方法は、２つの中空糸半透膜を有する少なくとも１種のオリゴ糖加水分解酵素が隔離された中空糸循環ループを介して一緒に結合された、別個の糖化容器および発酵容器における、前処理バイオマスの糖化および結果として生じる糖類の望ましい標的生成物への発酵のための、ＣＳＳＦの利用を可能にする。
【００９４】
前処理バイオマスは、前処理バイオマスが作用を受けて高分子量成分および低分子量成分を生成する糖化容器に、糖化酵素集合体とともに加えられる。糖化されたバイオマスの成分は、第１の循環ループを通って第１の中空糸半透膜フィルターへと送達される。半透膜は、前処理バイオマスの高分子量成分の拡散を妨げるが、可溶性の低分子量成分（３０ｋＤａ未満）の拡散を可能にする。この分子量の成分は、半透膜を透過して、少なくとも１種の隔離された糖化酵素を含有する中空糸循環ループに入る。
【００９５】
中空糸循環ループ内の隔離された酵素は、中空糸循環ループにおいて拡散した１種以上の低分子量オリゴ糖に作用し、これにより、少なくとも１種の糖生成物が形成される。次いで、こうして形成された生成物は、第２の半透膜フィルターを通って第２の循環ループ中および発酵容器へと送達され、この発酵容器において、その生成物は、適切な微生物によって標的生成物へと発酵される。
【００９６】
１つの実施形態において、隔離された酵素は、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含み得る。糖化されたバイオマスのセロビオース、キシロビオースおよび分岐鎖キシロースオリゴマーは、第１の中空糸半透膜を通って拡散し、中空糸循環ループに入り、そこで、それらは、β−グルコシダーゼ、β−キシロビオシダーゼおよび分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素によって、それぞれグルコース、キシロースおよびアラビノースへと加水分解される。隔離された酵素（例えば、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼおよびアラビノフラノシダーゼ）に対するグルコース、キシロースおよびアラビノースのいずれのフィードバック阻害も、第２の半透膜を通って第２の循環ループおよび発酵容器中への生成物の移動によって緩和され、この発酵容器において、その生成物は、発酵で生体触媒により消費される。次いで、隔離された酵素は再利用されて、第１の外部循環ループを介して糖化容器からのより多くの基質に作用する。この系は、糖化容器および中空糸循環ループの両方において酵素の最終産物フィードバック阻害を緩和しつつ、隔離された酵素の費用効果の高い再使用を可能にする。また、隔離された酵素は固定化されて、中空糸循環ループの内容物がその固定化酵素を含有するマトリクス上を通るようにもし得る。このような固定化は、（例えば、熱変性に対する）酵素のさらなる安定化をもたらし得る。別個の容器を使用することにより、糖化および発酵の異なる温度要求に付随する問題は解消される。発酵容器中で生じるまたは容器間を輸送される熱は、ヒートポンプを使用することによって糖化容器へと送達され得る。また、発酵容器中の微生物は、消化されていないバイオマスとは直接接触しておらず、バイオマスへの細胞吸着による発酵能力の低下の可能性も解消される。標的生成物の除去も、消化されていないまたは不完全に消化されたバイオマスの不存在下で行われる。
【００９７】
ＣＳＳＦのための装置およびプロセス
１つの実施形態において、糖化容器および別個の発酵容器を含む前処理バイオマスを処理するための装置であって、前記容器同士は、２つの外部循環ループとこれらの２つの外部循環ループを連結しかつ半透膜を含む中空糸循環ループとによって連結されており、前記装置は、前処理バイオマスの区画化併行複発酵を提供するものである、装置において、ＣＳＳＦは行われる。
【００９８】
本発明の装置の１つの実施形態が図２に示される。この図は、次のとおりの、糖化および発酵のための別個の容器が２つの外部循環ループおよび中空糸循環ループを介して連結されている、前処理バイオマスのＣＳＳＦのための装置のブロック図を図示している。糖化容器（１）；第１の外部循環ループ（２）；中空糸循環ループ（３）；第２の外部循環ループ（４）；発酵容器（５）；標的生成物のための排出口（６）；第１の外部循環ループのための第１の循環ポンプ（７）；第２の外部循環ループのための第２の循環ポンプ（８）；中空糸ループのための第３の循環ポンプ（９）；中空糸循環ループの第１の半透膜（１０）および中空糸循環ループ（３）の第２の半透膜（１１）。
【００９９】
１つの実施形態において、図２の装置を用いる方法は次のとおりである。典型的には３５℃〜５５℃の温度および４〜約６のｐＨで維持される糖化容器（１）は、セロビオース、キシロビオース、キシロースオリゴマーを含有する部分的に糖化されたバイオマスと、糖化酵素集合体とを含有する。第１の外部循環ループ（２）は、バイオマスおよび糖化酵素集合体が、糖化容器から第１の中空糸半透膜（１０）の外側上を通るようにするものであり、この第１の中空糸半透膜（１０）の内側は、中空糸循環ループ（３）の一部である。バイオマスの多糖および糖化集合体の酵素は、それらの分子サイズが大きいため、中空糸半透膜を透過して中空糸循環ループに入ることから排除されるが、セロビオース、キシロビオースおよび分岐鎖キシロースオリゴマーなどのより小さい分子はこの膜を透過し得る。β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼおよび分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素は、中空糸循環ループ内に隔離されている。β−グルコシダーゼは、第１の半透膜（１０）を透過し得る小さい可溶性の基質（セロビオース）に作用する。β−キシロビオシダーゼ、β−キシロシダーゼ型の酵素は、同じく第１の半透膜を透過し得るキシロビオースをキシロースに変換する。分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素は、キシロースおよびアラビノースへと加水分解されるべき、第１の半透膜を透過し得る分岐鎖キシロースオリゴマー（例えば、α−１，２結合を介してキシロースオリゴマー主鎖に結合したＬ−アラビノース）を変換する。こうして中空糸循環ループ中で生成されたグルコース、キシロースおよびアラビノースは、第２の半透膜（１１）および第２の外部循環ループ（４）を介して発酵容器（５）へと送達され、そこで、それらは、微生物によって１種もしくは複数種の標的生成物に変換される。中空糸ループ中の第２のポンプ（９）は、隔離された酵素を連続的に再循環させ、それらの酵素のそれぞれの反応における反復使用を可能にする。酵素の反復使用、および当該プロセスのために必要とされる酵素の全体量の減少は、著しい全体的なコスト節減をもたらす。さらに、この開示される方法は、リグノセルロース系基質および発酵微生物が同じ容器中にある必要性を回避し、したがって、温度の両立不能性などの課題を克服する独特のＣＳＳＦプロセスである。発酵容器（６）中の標的生成物の除去は、プロセス全体を完結に導く助けとなる。第１および第３の外部ループポンプ（７）および（８）は、糖化容器、発酵容器および中空糸循環ループの間の種々の成分の再循環を可能にする。
【０１００】
本方法においては、微生物は消化されていないバイオマスと直接接触していないので、バイオマスへの細胞吸着による発酵能力の低下の可能性が解消される。
【０１０１】
発酵容器からの（例えば、蒸留、選択透過膜、パーベーパレーションまたは他の適切な方法による）標的生成物の除去もまた、消化されていないバイオマスの存在によって妨げられない。
【０１０２】
糖化容器および発酵容器は当該技術分野においてよく知られており、当業者は、それらの利用に関して精通している。
【０１０３】
標的生成物への発酵
適切な微生物を用いた種々の発酵方法が、前処理された糖化されたバイオマスから放出される発酵性糖類を変換して標的生成物を生成するために使用され得る。本発明の方法には、流加回分発酵系または連続発酵系が使用され得る。これらの方法は当該技術分野においてよく知られており、当業者は、それらの利用に関して精通している。「流加回分」発酵プロセスは、発酵が進行するにつれて基質が添加されるということを除いて典型的な回分系を含む。回分発酵および流加回分発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られている。例は、参照により本明細書に援用される、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー：工業微生物学のテキスト），第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．中、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）において見出され得る。本発明の方法は、「連続」発酵方法にも適合可能であると予想される。連続発酵は、発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等しい量の馴化培地が処理のために除去される開放系である。
【０１０４】
様々な種類の増殖培地が、本発明において使用され得る。このような増殖培地には、例えば、酵母抽出物、特定のアミノ酸、ホスフェート、窒素源、塩、および微量元素が補充され得る。特定の生体触媒によって作製される特定の生成物の生成のために必要とされる成分（例えば、プラスミドを維持するための抗生物質または酵素触媒反応において必要とされる補因子）もまた含まれ得る。さらなる糖類もまた、全糖濃度を高めるために含まれ得る。
【０１０５】
温度および／またはヘッドスペースガスも、１種もしくは複数種の発酵微生物にとって有用な条件に応じて調整され得る。発酵は、好気性または嫌気性の発酵であり得る。本明細書に記載される方法によれば、１種以上の糖類の発酵および糖化は、同時に行われるが、別個の区画において行われ、区画化併行複発酵（ＣＳＳＦ）と定義される。
【０１０６】
糖類の標的生成物への発酵は、１種以上の適切な微生物（例えば、細菌、糸状菌および酵母）によって行われ得る。野生型微生物および組換え微生物の両方が、使用され得る。このような微生物としては、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ジュモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミュセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンディダ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトミュセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バキッルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバキッルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
標的生成物としては、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセリン、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール、およびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸、およびキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジン、セリン、およびトレオニン）；ガス（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および一酸化炭素（ＣＯ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
発酵プロセスはまた、消費用アルコール産業（例えば、ビールおよびワイン）、乳製品産業（例えば、発酵乳製品）、皮革工業、およびタバコ産業において使用されるプロセスも包含する。
【０１０９】
上記のものに加えて、さらなる一般製品（例えば、有機生成物、化学物質、燃料、汎用化学品および特殊化学品（例えば、キシロース、アセトン、アセテート、グリシン、リジン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸）、ならびに動物飼料）（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．，およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１５：７７７−７９３，１９９９；ならびにＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（セルロースのバイオコンバージョン技術），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（バイオエタノールに関するハンドブック：製造および利用），Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６中，１７９−２１２；ならびにＲｙｕ，Ｄ．Ｄ．Ｙ．，およびＭａｎｄｅｌｓ，Ｍ．，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（セルラーゼ：生合成および利用），Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２：９１−１０２，１９８０）が、本発明の方法を使用して製造され得る。
【０１１０】
潜在的な副産物（例えば、発酵性炭水化物からの種々の有機生成物）もまた、生成され得る。糖化および発酵の後に残る、リグニンを多量に含有する残渣は、リグニン由来の化学物質、化学的構成単位に変換されるか、または動力生産（ｐｏｗｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のために使用され得る。
【０１１１】
標的生成物は、本明細書に記載されるとおりの、中空糸含有循環ループを通って発酵容器への、前処理された糖化されたバイオマスのある特定の成分の移動に続いて生成され得る。
【０１１２】
標的生成物は、蒸留のような方法により、選択透過膜、もしくはパーベーパレーションを使用して、または回分式のもしくは連続的な発酵ブロスの補給によって非選択的に、発酵容器から除去され得る。標的生成物の除去は、反応全体を完結に導く助けとなる。
【実施例】
【０１１３】
本発明を、以下の実施例においてさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、あくまでも例示として与えられるものと理解されるべきである。上記の検討およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認し得、その精神および範囲から逸脱することなく本発明に様々な変更および修正を加えて、本発明を様々な使用および条件に適合させ得る。
【０１１４】
材料
糖化酵素は次の供給源から入手した。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）ならびにＮｏｖｏｚｙｍｅ １８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，２８８０ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。
【０１１５】
サトウキビバガスは、Ｗｉｌｅｙナイフミルで粉砕して１ｍｍ篩に通したものを、本明細書において使用した。
【０１１６】
実施例において使用される略語
次の略語を、実施例において使用する。「℃」は摂氏またはセ氏であり、「％」はパーセントであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「ｈ」は時間であり、「ｒｐｍ」は毎分回転数であり、「ＥｔＯＨ」はエタノールであり、「ｍｇ／ｍＬ」は１ミリリットル当りのミリグラム数であり、「ｇ／１００ｍＬ」は１００ミリリットル当りのグラム数であり、「Ｎ」は規定濃度であり、「ｇ」はグラムであり、「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウムであり、「ｖ／ｖ」は容量に対する容量であり、「ｍｍ」はミリメートルであり、「ｍＬ／ｍｉｎ」は毎分当りのミリリットル数であり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｍＭ」はミリモルであり、「ｍｇタンパク質／ｇセルロース」はセルロース１ｇ当りのタンパク質のミリグラム数を表し、「ｋＤａ」はキロダルトンを表す。
【０１１７】
実施例１
β−グルコシダーゼ濃度の増加はバイオマス糖化の間の最終産物阻害を軽減することによりセルラーゼの所要量を減少させる
糖化のためのバイオマスを調製するために、最初にバイオマスを、本明細書に記載されるとおりに前処理した。ナイフミルで粉砕したサトウキビバガス（２ｇ）を、１５ｍＬの１００ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中に懸濁させ、この懸濁液を、１２１℃にて１時間にわたり密封ガラスバイアル中でオートクレーブにかけた。内容物を冷却し、焼結プラスチックフィルター（ｆｒｉｔｔｅｄ ｐｌａｓｔｉｃ ｆｉｌｔｅｒ）を含有する２つの使い捨てクロマトグラフィーカラムカートリッジに入れ、これを１５ｍＬの円錐チューブに入れ、ＲＣ−５Ｂ Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中のＨＳ−４スイング型バケットローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ）を用い、３０００ｒｐｍで室温にて遠心分離して、前処理バイオマスを洗浄した。各カラムを５ｍＬのＨ２Ｏで３回洗浄した後、各々を、ＮａＯＨ（５ｍｇ／１．７５ｍＬ）およびアントラキノン（１ｍｇ／１．７５ｍＬ）を加えたＨ２Ｏ中６９％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ ２．５ｍＬで２回洗浄した。３．８ｇ（乾燥分１．４ｇ）の重さであった湿潤前処理バイオマス残渣を、さらなる４．６ｇの洗浄液中に懸濁させた。この懸濁液をステンレス鋼圧力容器（１９ｍＬ内容積）に入れ、蓋締めし、１７５℃にて１４０分間加熱した。この圧力容器を室温まで冷却し、内容物を、上記のとおりに２つのクロマトグラフィーカラムカートリッジ中で遠心分離した。各カラム中の前処理バイオマスをＨ２Ｏ中６９％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ １．５ｍＬで４回洗浄した。次いで、この前処理バイオマス残渣を風乾した（乾燥バイオマス 約９２％）。
【０１１８】
この風乾された前処理バイオマス試料（７８．７％グルカン、５．５％キシラン）を、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中に、約１１％の固形分配合量で懸濁させた。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、およびＮｏｖｏｚｙｍｅ １８８を、異なる比および異なるセルロース１ｇ当り濃度で加えた。これらの比（ｍｇタンパク質／ｇセルロース）は、４：３：８、８：３：４、６：３：６、６：６：１２、１２：６：１．２および１２：６：１２であった。さらに、１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗ／ｖ）および０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を加えた。約０．５ｍＬの試料容量を、２個のガラスビーズ（３ｍｍ）を含有する６ｍＬのねじ蓋バイアルに加え、回転振盪器（２５０ｒｐｍ）上で４６℃にてインキュベートした。インキュベーションの開始から４時間後および開始後２４時間毎にアリコートを取り出し、分析のために０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で４１．２５倍に希釈した。試料をＳｐｉｎ−Ｘフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ．Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に通して濾過し、その濾液をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００／１２００，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で分析した。ＢｉｏＲａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ Ａｍｉｎｅｘカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用し、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を移動相として用いて、放出される糖類を分画した。このカラムを６０℃で維持し、流量を０．６ｍＬ／ｍｉｎで維持した。５５℃で維持した屈折率検出器を使用して、溶出した糖類を検出した。
【０１１９】
図１Ａは、様々な酵素配合量でのバイオマスの糖化の時間的経過を、糖化についてのみのパーセント理論収量として表わされるモノマーグルコースの収率に関して示している。図１Ｂは、様々な酵素比についての図１Ａからの１２０時間でのモノマーグルコースの収率の比較を示している。セルロース１ｇ当り［６：３：６］、［６：６：１２］および［１２：６：１．２］のＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８の配合量を使用した酵素糖化実験は、１２０時間のインキュベーションでほぼ同じ収率を示した。これらの結果は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ酵素の配合量の低下が、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８（ほとんどβ−グルコシダーゼ）の配合量の増加により相殺され得ることを示している。これらの結果に基づけば、β−グルコシダーゼが安定で再使用可能であるならば、そのβ−グルコシダーゼの再使用可能性およびセルラーゼのいくらかに取って代わるその能力は、生成されたモノマー糖の量当りのセルラーゼ酵素のコスト削減をもたらし得る。
【０１２０】
実施例２（予測的）
二重中空糸循環ループがβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素を閉じ込めて最終産物阻害を緩和しそれらの再利用を可能にする
実施例１に開示された結果に基づけば、バイオマス糖化生成物が除去され、かつβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素が再利用されるプロセスは、発酵性糖類の生成について著しいコスト節減をもたらし得る。
【０１２１】
図２に、半透性中空糸循環ループにより結合された糖化および発酵のための別個の容器を使用する連続ＳＳＦ装置の略図を示す。糖化容器（１）は、４６℃およびｐＨ５で維持される。前処理バイオマスを、セルラーゼおよびキシラナーゼと一緒にこの糖化容器に加える。酵素糖化反応により生成される低分子のヘキソースおよびペントースオリゴマー（セロビオースおよびキシロビオースを含む）を、第１の外部循環ループ（２）を介して第１の半透性中空糸膜（１０）まで移動させ、ここでそれらのオリゴマーはその膜を透過して中空糸循環ループ（３）に入る。この中空糸循環ループは、隔離されたβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素を含有する。これらの酵素は、３０ｋＤａの分子量カットオフを有するその中空糸膜を通って拡散し得ない大きい分子である。しかしながら、この半透膜は、小分子の反応物（セロビオースおよびキシロビオース）およびこれらの反応物の生成物（グルコースおよびキシロース）を透過させ得る。β−グルコシダーゼおよびβキシロビオシダーゼ酵素は、セロビオースおよびキシロビオースを、グルコースおよびキシロースへと加水分解する。こうして形成されたグルコースおよびキシロースを第２の半透膜（１１）まで移動させ、そしてその膜を通して第２の外部循環ループ（４）および発酵容器（５）中に移動させる。この発酵容器は、３０〜３３℃およびｐＨ５．８で維持され得、標的生成物（例えば、エタノールまたはブタノール）の生成に必要な増殖培地および適切な１種もしくは複数種の微生物を含有する。発酵の間、その標的生成物は、排出口（６）を介してこの発酵容器から除去され得る。発酵容器からの生成物の（例えば、スパージングによる、または選択透過膜を介した、もしくはパーベーパレーションによる）除去は、反応を完結に導く助けとなる。循環ループ（２）は、セロビオースおよびキシロビオースが部分的に消耗したバイオマスを糖化容器に戻す。第１および第３の循環ポンプ（７）および（８）は、それぞれ第１および第２の外部ループの内容物を循環させる。第２の循環ポンプ（９）は、内部中空糸循環ループの内容物（β−グルコシダーゼおよびβキシロビオシダーゼ酵素を含む）を、さらなる一連の反応のために循環させる。こうして、糖化容器中のエキソセルラーゼおよびキシラナーゼの最終産物阻害が、内部中空糸ループ内に含まれているβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素により緩和され、これにより、反応全体が完結に導かれ、バイオマスの標的生成物への変換のためのより経済的なプロセスがもたらされる。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオマス糖化および生成された糖類の発酵の分野に関する。具体的には、酵素の最終産物阻害の軽減をもたらす糖化プロセスおよび発酵プロセスの区画化を提供する、バイオマスの併行複発酵のための方法および装置が開示される。
【背景技術】
【０００２】
バイオマス（セルロース系およびリグノセルロース系）供給原料および廃棄物（例えば、農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙スラッジ、ならびに都市および産業の固形廃棄物）は、化学物質、プラスチック、燃料および飼料の生成のための、潜在的に多量の再生可能な供給原料を提供する。セルロース系およびリグノセルロース系の供給原料ならびに廃棄物は、セルロース、ヘミセルロースおよびペクチンを含む炭水化物ポリマーからなり、一般に、様々な化学的手段、機械的手段および酵素による手段（酵素糖化）により処理されて、主としてヘキソースおよびペントース糖類を放出し、次いで、微生物によって有用な生成物に変換され得る。
【０００３】
バイオマスの酵素糖化は、糖化容器中のセロビオースおよびグルコースの蓄積をもたらし、これが、エキソセルラーゼの最終産物阻害を生じ、セルロース加水分解を減速させる。キシラナーゼのフィードバック阻害を生じてヘミセルロース加水分解を減速させるキシロビオースも生成される。グルカンおよびキシランの加水分解の減速は、より高濃度の酵素の添加により部分的に緩和され得るが、この解決策は、このプロセスのコストを増加させる。
【０００４】
酵素糖化の間の最終産物阻害に対処するためのこれまでの方法は、糖化および発酵の２つの工程が合わされた平行複発酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＳＳＦ；非特許文献１）の使用を含む。
【０００５】
バイオ燃料生産の間にＳＳＦにおいてこれらの２つのプロセス工程を合わせることは、より低い資本コストを有し、バイオ燃料生成物の存在が、発酵汚染（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の危険性を低下させる（非特許文献２）。さらに、この方法では、形成されたグルコースは発酵微生物によって消費され、β−グルコシダーゼおよびセロビオヒドロラーゼの両酵素の最終産物阻害を緩和する。これにより、セルロースからのセロビオースの形成、およびそのグルコースへの加水分解が加速され、セルロースからグルコースへの変換の速度を上昇させる。グルコースからフルクトースへおよびキシロースからキシルロースへの可逆的な変換が最終産物阻害を部分的に緩和する、グルコース最終産物阻害を緩和することへの別のアプローチが、特許文献１に記載された。
【０００６】
Ｋｌｅｉら（非特許文献３）は、酵素反応器として使用される中空糸限外濾過膜カートリッジ中にアスペルギッルス・ポエニキス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）由来の固定化β−グルコシダーゼを使用し、これによりセロビオースの加水分解を行うことを検討した。この系は、セルロースの糖化の間のトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼの循環のためにも使用された。中空糸膜の利用は、セルロースの連続処理を可能にし、セルラーゼ所要量を著しく減少させる。
【０００７】
特許文献２では、併行複発酵は、固体支持体に吸着された再使用可能なエンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼ酵素によって行われた。
【０００８】
特許文献３は、中空糸膜反応器中の、蒸気爆砕された藁からのアセトンおよびブタノールの製造のための、合わされた酵素加水分解および連続発酵を記載している。藁の酵素加水分解のために使用されるセルラーゼ酵素は、高効率および低コストのためにこの膜反応器を使用して再利用され得ることが示された。
【０００９】
上記の方法は、それぞれ糖化プロセスを部分的に改善したものであり、糖化の間の最終産物阻害を、ごく僅かにしか緩和しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０１８３２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第４，２２０，７２１号明細書
【特許文献３】中国公告特許第１０１１７３３０６号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｋａｇｉ，Ｍら，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，１９７７中，５５１−５７１
【非特許文献２】Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｍａｓｓ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ，３：３０１−３０７，１９９２
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．（１９８１）１１ Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｅｎｅｒｇｙ Ｐｒｏｄ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅ．，３ｒｄ，５９３−６０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当該技術分野において開示された方法があるにもかかわらず、併行複発酵の間の酵素糖化の最終産物阻害という問題に対処するために、より効率的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、ある特定のオリゴ糖加水分解酵素が隔離されている中空糸循環ループを使用する、前処理バイオマスの区画化併行複発酵のための方法および装置を提供することにより、上記の問題を解決する。当該方法および装置は、前処理バイオマスの糖化の間に糖化酵素のフィードバック阻害を引き起こし得るバイオマス成分の除去をもたらして、糖化の間の発酵性糖類の放出を改善し、かつ糖化効率の上昇によって標的生成物の収率を上昇させる。
【００１４】
本発明の１つの態様は、糖化容器および別個の発酵容器を含む前処理バイオマスを処理するための装置であって、前記容器同士は、２つの外部循環ループとこれらの２つの外部循環ループを連結しかつ半透膜を含む中空糸循環ループとによって連結されており、前記装置は、前処理バイオマスの区画化併行複発酵を提供する、装置に関する。
【００１５】
別の態様において、図２に従う装置が提供され、前記装置は、第１の外部循環ループ（２）に連結された糖化容器（１）を含み、前記第１の外部循環ループ（２）は、中空糸循環ループ（３）の第１の半透膜（１０）の外部にありかつその第１の半透膜（１０）に連結されており；前記中空糸循環ループ（３）は、この中空糸循環ループ（３）の第２の半透膜（１１）の外部にありかつその第２の半透膜（１１）に連結されている第２の外部循環ループ（４）に連結されており；前記第２の外部循環ループ（４）は、標的生成物のための排出口（６）を有する発酵容器（５）に連結されている。この装置は、第１の外部循環ループ（２）のための第１の循環ポンプ（７）と、第２の外部循環ループ（４）のための第２の循環ポンプ（８）と、内部中空糸ループ（３）のための第３の循環ポンプ（９）とを含む一連の循環ポンプをさらに含み得る。
【００１６】
別の態様において、前処理バイオマスを処理する方法が提供され、前記方法は、
（ａ）図２に記載される本発明の装置を供給する工程と、
（ｂ）前処理されたバルクバイオマスと糖化酵素集合体との混合物を前記装置の糖化容器（１）に供給する工程であって、前記混合物は、糖化によって高分子量成分および低分子量成分の両方を生成する工程と、
（ｃ）少なくとも１種の隔離された酵素を中空糸循環ループ（３）中に供給する工程と、
（ｄ）ある量の（ｂ）の混合物を、第１の循環ループを通して、第１の中空糸半透膜（１０）上に送達する工程であって、これにより、（ｂ）の混合物の前記高分子量成分は前記膜を通って拡散せず、当該混合物の前記低分子量成分は前記膜を通って中空糸循環ループ（３）中へと拡散する工程と、
（ｅ）（ｄ）において当該中空糸循環ループ（３）中へと拡散する低分子量成分を、前記中空糸循環ループ中で前記少なくとも１種の隔離された酵素によって加水分解する工程であって、これにより、発酵性糖類を含む加水分解生成物が形成される工程と、
（ｆ）発酵性糖類を含む加水分解生成物を第２の半透膜（１１）を通って第２の循環ループ（４）中および発酵容器（５）へと送達する工程と
を包含し、前処理バイオマス成分は循環ポンプによって当該装置全体にわたって循環される。別の態様において、（ｆ）の発酵容器へと送達される（ｅ）の発酵性糖類は、少なくとも１種の微生物によって少なくとも１種の標的生成物に変換される。
【００１７】
上記の方法の別の態様において、第１および第２の半透膜の存在が、前記糖化容器および発酵容器中への１種以上の隔離された酵素の拡散を妨げることにより、その酵素の減少を防止する。
【００１８】
上記の方法の別の態様において、バイオマスに対する前記隔離された酵素の作用によって形成された加水分解生成物は、前記発酵容器へと送達され、糖化容器中での最終産物フィードバック阻害を緩和する。
【００１９】
上記の方法の別の態様において、前記第１および第２の半透膜の分子量透過性は、約１０〜約３０キロダルトンである。
【００２０】
本発明の別の態様において、前処理バイオマスの区画化併行複発酵のための方法が提供され、前記方法は、（ａ）前処理バイオマスおよび糖化酵素集合体を糖化容器に供給する工程であって、これにより糖化生成物が形成され、１つ以上の半透膜を通って移動され、１種以上のさらなる隔離された酵素を含む少なくとも１つの区画を通過し、これにより発酵性糖類を含む加水分解生成物が形成される工程と、（ｂ）前記加水分解生成物を、標的生成物への発酵のための別個の発酵容器へと送達する工程とを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】様々な糖化酵素比での、酸／塩基で前処理されたサトウキビバガスからのモノマーグルコースの理論収量に対するパーセントとして表される、０〜１２０ｈの糖化の時間的経過を図示している。糖化は、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）（ｐＨ４．６）、１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗ／ｖ）および０．０１％ＮａＮ３（ｗ／ｖ）の存在下で、１１％の固形分配合量で行われた。酵素比（ｍｇタンパク質／ｇセルロース）は、それぞれ、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、およびＮｏｖｏｚｙｍｅ １８８の酵素について、４：３：８、８：３：４、６：３：６、６：６：１２、１２：６：１．２および１２：６：１２であった。
【図１Ｂ】その様々な酵素比についての図１Ａからの１２０ｈにおけるモノマーグルコース収率の比較を図示している。
【図２】別個の糖化容器および発酵容器が２つの外部循環ループおよび中空糸循環ループによって連結されている、区画化併行複発酵装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
出願人らは、引用した参考文献すべての全内容を本開示に明確に援用する。別段の記載がない限り、百分率、部、比などは全て、重量による。商標は大文字で示される。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、ある範囲、好ましい範囲、または上方の好ましい値および下方の好ましい値の列記として与えられる場合、これは、範囲が別個に開示されているか否かに関わらず、任意の上方の範囲限界または好ましい値と、任意の下方の範囲限界または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。本明細書にある数値範囲が記載される場合、別段の記載がない限り、その範囲は、その端点、ならびにその範囲内の全ての整数および有理数を含むことが意図される。本発明の範囲が、範囲を定義する際に記載される具体的な値に限定されることは意図されていない。
【００２３】
本発明の装置および方法は、中空糸半透膜と、別個の糖化容器および発酵容器を連結するための中空糸循環ループとを使用することにより、区画化併行複発酵（ＣＳＳＦ）の間の酵素糖化の最終産物阻害の緩和を提供する。
【００２４】
定義
明確にするために、本明細書で使用される用語は、本明細書に記載されるとおりに、またはかかる用語が本発明の当業者により理解されるであろうとおりに、理解されるべきである。本明細書で使用されるある特定の用語の追加的な説明が、以下に与えられる。
【００２５】
「グルコース」は、Ｃ１にアルデヒド（ヘミアセタール）官能基を有する、化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有する６個の炭素原子を含有する単糖である。
【００２６】
「グルカン」は、グリコシド結合によって結合された、β−１，４−結合したＤ−グルコースモノマーの多糖をいう。
【００２７】
「アラビノース」は、アルデヒド官能基を含む５個の炭素原子を含有する単糖である。
【００２８】
「キシロース」は、Ｃ１にアルデヒド（ヘミアセタール）官能基を有する、化学式Ｃ５Ｈ１０Ｏ５を有する５個の炭素原子を含有する単糖である。
【００２９】
「セロビオース」は、β（１，４）グリコシド結合で結合した２つのグルコース分子の縮合から誘導される二糖である。
【００３０】
「セロビオヒドロラーゼ」は、還元末端および非還元末端でセルロースからセロビオース単位を切断する酵素をいう。
【００３１】
「キシロビオース」は、キシロースモノマーの間にβ−１，４グリコシド結合を有する、キシロースモノマーの二糖である。
【００３２】
「β−キシロシダーゼ」は、β−グリコシド結合によって結合されたキシロース含有オリゴマー（例えば、キシロビオース）を切断する酵素群をいう。
【００３３】
「β−キシロビオシダーゼ（ｘｙｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ）」は、キシロビオースをキシロースへと加水分解する酵素である。
【００３４】
「キシラン」は、β−１，４−結合したＤ−キシロース単位から主として構成される直鎖状の多糖をいい、これは、他の糖類（例えば、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロース）による分岐を含有し得る。
【００３５】
「キシラナーゼ」は、直鎖状の多糖およびオリゴ糖であるβ−１，４−キシランをキシロースおよびキシロースオリゴマーへと分解する酵素をいう。一部のキシラナーゼは、キシロースの分岐鎖オリゴマーに対して作用する。
【００３６】
「β−グルコシダーゼ」は、２つのグルコース分子またはグルコース置換分子を結合するβ１−＞４結合（すなわち、二糖セロビオース）に対して作用する酵素である。β−グルコシダーゼは、グルコースの放出を伴うβ−Ｄ−グルコシド中の末端の非還元性残基の加水分解を触媒する。
【００３７】
「アラビノフラノシダーゼ」は、アラビノース含有キシラン中の末端の非還元性のα−Ｌ−アラビノフラノシド残基を加水分解する酵素をいう。
【００３８】
「エキソセルラーゼ」は、セルロースの還元末端および非還元末端からセロビオースを放出する酵素をいう。
【００３９】
「分岐鎖キシロースオリゴマー」は、アラビノースおよびキシロースの分岐があるオリゴキシロース主鎖をいう。
【００４０】
「分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素」は、分岐鎖キシロースオリゴマーを加水分解するキシラナーゼをいう。
【００４１】
「半透膜」および「半透膜フィルター」は、本明細書において相互交換可能に使用され、ある特定の大きさ、形状または特性までの物質のみの通過を可能にする物理的障壁として機能する膜をいう。本方法において有用な半透膜の例としては、ポリスルホン、ヒドロキシル化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、およびポリエーテルイミドのうちの１つ以上から作製される膜が挙げられる。
【００４２】
「中空糸半透膜」および「中空糸半透膜フィルター」は、中空で半透性の繊維から作製される半透膜の一種である。中空糸半透膜は、大きい表面対容積比を有する。
【００４３】
「第１の半透膜」は、バイオマスの糖化の結果生じた特定の成分の、糖化容器から中空糸循環ループへの移動を可能にする中空糸半透膜をいう。
【００４４】
「第２の半透膜」は、中空糸循環ループ中の隔離された酵素によって生成される糖類の、第２の外部循環ループへの移動を可能にする中空糸半透膜をいう。この第１および第２の中空糸半透膜はともに、類似の材料（例えば、上に示された材料）から作製される。
【００４５】
「標的生成物の選択的除去」または「選択的に除去される標的生成物」は、発酵容器内のいずれの他の成分も除去することなく、標的生成物を除去することを意味する。
【００４６】
「区画化併行複発酵（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ＣＳＳＦ）」は、この文脈において、１種以上の糖類の発酵および前処理バイオマスの糖化が、少なくとも１つの循環ループによって連結された別個の容器中で同時に行われるプロセスをいう。
【００４７】
「発酵」は、微生物を使用して化学基質を（好気性プロセスまたは嫌気性プロセスのいずれかを介して）標的生成物に変換することを意味する。
【００４８】
「発酵容器」は、微生物による基質の標的生成物への発酵に適するような、本発明における使用に適した任意の容器を意味する。
【００４９】
「加水分解生成物」は、バイオマスの糖化の結果生じる生成物をいう。加水分解生成物中の糖化生成物は、加水分解を行う糖化酵素の違いおよび加水分解を行う時間の長さの違いによって異なるであろう。効果的な糖化は、発酵性糖類を含有する加水分解生成物を生成する。
【００５０】
「発酵性糖類」は、１種もしくは複数種の標的生成物を生成するための発酵プロセスにおいて微生物によって炭素源として使用され得る単糖を主として含む（一部の二糖が依然として存在し得る）糖内容物をいう。
【００５１】
「循環ポンプ」は、種々の循環ループ中の液状懸濁物が、装置中を循環し、移動するようにするポンプをいう。
【００５２】
「標的生成物」は、発酵によって生成される化学物質、燃料、または化学的構成単位をいう。生成物は、広い意味で使用され、タンパク質（例えば、ペプチド、酵素および抗体を含む）などの分子を包含する。また、エタノールおよびブタノールも、この標的生成物の定義の範囲内で企図される。
【００５３】
「バイオマス」は、セルロース系およびヘミセルロース系物質を含む、任意のリグノセルロース系物質（例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、庭ゴミ、木材、林業廃棄物およびこれらの組み合わせ、ならびにさらに後述されるもの）をいう。このバイオマスは、多糖およびオリゴ糖を含む炭水化物内容物を有し、リグニン、タンパク質および脂質などのさらなる成分も含み得る。
【００５４】
「前処理バイオマス」は、酵素糖化を促進する任意の手段によって処理されたバイオマスである。
【００５５】
「糖化」または「酵素糖化」は、加水分解酵素の作用による多糖からの発酵性糖類の生成をいう。前処理バイオマスからの発酵性糖類の生成は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素による酵素糖化によって起こる。
【００５６】
「糖化容器」は、バイオマスの糖化のための、本発明における使用に適した任意の容器を意味する。酵素糖化が行われる糖化容器は、前処理バイオマスを含み得る。
【００５７】
「酵素集合体」または「糖化酵素集合体」は、加水分解酵素の集まりである。これらの酵素は、典型的に、微生物によって分泌される。この糖化酵素集合体は、典型的に、１つ以上のセルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、およびエステラーゼを含むであろう。本発明において、糖化容器に加えられる糖化酵素集合体は、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含む必要はない。なぜなら、これらは中空糸循環ループ中に含まれるからである。
【００５８】
「隔離された酵素」は、本明細書で使用される場合、中空糸循環ループ内に隔離された酵素であって、バイオマスのグルコースオリゴマーならびに直鎖および分岐鎖キシロースオリゴマーを加水分解することができるもの（例えば、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、ならびにアラビノフラノシダーゼおよびキシラナーゼ）をいう。
【００５９】
「最終産物フィードバック阻害」は、酵素反応の生成物の蓄積が最終産物の形成につながる反応を阻害する状況をいう。本開示において、例えば、エキソセルラーゼは、セロビオースによって、およびある程度まではグルコースによって、フィードバック阻害され、キシラナーゼは、キシロビオースによって、およびある程度まではキシロースによって、フィードバック阻害される。β−グルコシダーゼは、その生成物であるグルコースによってフィードバック阻害される。β−キシロビオシダーゼは、その生成物であるキシロースによって阻害される。
【００６０】
「循環ループ」は、糖化容器または発酵容器のいずれかの内容物が、それぞれ、中空糸循環ループに隣接した第１または第２の半透膜の外面上を循環するようにする液体循環ループをいう。
【００６１】
「第１の外部循環ループ」は、糖化容器からのバイオマスおよび糖化酵素集合体が、中空糸循環ループの第１の半透膜の外面上を通るようにする流体循環ループである。
【００６２】
「第２の外部循環ループ」は、発酵容器の内容物が、中空糸循環ループの第２の半透膜の外面上を通るようにする流体循環ループであり、その膜を横切って拡散するグルコース、キシロースおよびアラビノースを捕えて、それらを発酵容器へと送達する。
【００６３】
「中空糸循環ループ」は、第１および第２の半透膜フィルターおよび１種以上の隔離された酵素を含む流体循環ループをいい、そこで酵素加水分解が行われ、生成物は、糖化容器と発酵容器との間を第１および第２の外部循環ループを介してその第１および第２の半透膜を通って輸送される。
【００６４】
「ある特定の成分の選択的送達」は、糖化されたバイオマスのある特定の大きさの成分（例えば、オリゴ糖（例えば、セロビオース、キシロビオースおよび分岐鎖キシロースオリゴマー））の、糖化容器から第１の半透膜フィルターを通って中空糸循環ループへの、および第２の半透膜フィルターを通って発酵容器への送達をいう。
【００６５】
「高分子量成分」は、中空糸ループの半透膜フィルターを通って拡散し得ない、３０ＫＤよりも大きい分子量を有するバイオマスの成分をいう。
【００６６】
「低分子量成分」は、中空糸ループの半透膜フィルターを通って拡散し得る、３０ＫＤ未満の分子量を有するバイオマスの成分をいう。
【００６７】
バイオマス
本明細書に記載される方法に適したバイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ゴミ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシの穂軸、作物残渣（例えば、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉）、草、小麦、麦藁、大麦、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、粉砕により得られる成分（穀物、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および灌木のもの）、野菜、果実、花ならびに動物糞尿が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
バイオマスは、単一の供給源に由来しても良いし、または２つ以上の供給源に由来する混合物を含むこともできる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または茎もしくは柄と葉との混合物を含み得る。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明にとって有用なバイオマスは、比較的高い炭水化物含有量を有し、比較的密度が高く、かつ／または収集、輸送、貯蔵および／もしくは取扱いが比較的容易である。別の実施形態において、バイオマスは、農業残渣（例えば、トウモロコシの茎葉、麦藁、大麦藁、燕麦藁、稲藁、キャノーラ藁、および大豆の茎葉）；草（例えば、スイッチグラス、茅、コードグラス、およびクサヨシ）；繊維処理残渣（例えば、トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプ工場微繊維（ｐｕｌｐ ｍｉｌｌ ｆｉｎｅｓ）および廃棄物（ｒｅｊｅｃｔｓ）ならびにサトウキビバガス）；モロコシ；林業廃棄物（例えば、アスペン材、他の硬木材、軟木材およびおがくず）；および使用済み古紙製品；ならびに他の作物または十分に豊富なリグノセルロース系物質を包含し得る。さらに別の実施形態において、有用なバイオマスは、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの茎葉、サトウキビバガスおよびスイッチグラスを含む。
【００７０】
糖化に先立つバイオマスの前処理
バイオマスにおいて、結晶性のセルロースフィブリルは、ヘミセルロースマトリクス中に埋め込まれており、次にこのヘミセルロースマトリクスは、外側のリグニン層に囲まれている。バイオマスの前処理には、後の酵素糖化プロセスをより効果的にするために、通常、このリグニン障壁を変性することが求められる。バイオマスを前処理してそれを糖化に向けて調製する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｓｕ，Ｔ．−Ａ．，１９９６，「Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍａｓｓ（バイオマスの前処理）」，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（バイオエタノールに関するハンドブック：製造および利用），Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中，１７９−２１２；Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，Ｓｉｎｇｈ，Ａ．，１９９３および米国特許第７，５０３，９８１号明細書、米国特許第７，５０４，２４５号明細書、米国特許第７，４１３８，８２号明細書、国際公開第２００８／１１２２９１号パンフレット）。前処理方法には、例えば、希酸加水分解（Ｔ．Ａ．ＬｌｏｙｄおよびＣ．Ｅ Ｗｙｍａｎ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：１９６７，２００５）、アンモニア繊維爆砕（Ａｍｍｏｎｉａ Ｆｉｂｅｒ Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ：ＡＦＥＸ）技術（Ｆ．Ｔｅｙｍｏｕｒｉら，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：２０１４，２００５），ｐＨ制御液熱水処理（ｐＨ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（Ｎ．Ｍｏｓｉｅｒら，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：１９８６，２００５）、アンモニア水再利用法（ａｑｕｅｏｕｓ ａｍｍｏｎｉａ ｒｅｃｙｃｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ：ＡＲＰ）（Ｔ．Ｈ．ＫｉｍおよびＹ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：２００７，２００５）、石灰前処理（Ｓ．ＫｉｍおよびＭ．Ｔ．Ｈｏｌｚａｐｐｌｅ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９６：１９９４，２００５）およびイオン液体前処理（米国特許出願公開第２００８／０２２７１６２号明細書）がある。
【００７１】
バイオマス前処理のために、前処理の温度、ｐＨ、時間および反応物の濃度、１種以上の付加的な試薬の濃度、バイオマス濃度、バイオマスの種類および粒径が関連している。したがって、これらの可変因子は、前処理プロセスを最適化するために、バイオマスの種類ごとに必要に応じて調整され得る。
【００７２】
本発明の方法のバイオマスは、上記の方法のいずれかによって前処理され得る。あるいは、１つの実施形態においては、糖化に向けて本発明の方法のバイオマスを調製するために、バイオマスは、最初に１００ｍＭ Ｈ２ＳＯ４で１２１℃にて１時間にわたり前処理され、そして水で洗浄され得る。
【００７３】
１つの実施形態において、望ましくない分解生成物およびリグニン断片を除去するために、バイオマス残渣は、さらに、２．９％ＮａＯＨ（ｗ／ｖ）を含有する６９％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）中に懸濁され、そしてステンレス鋼製圧力容器（１９ｍＬ容量）中で、１７５℃の温度にて１４０分間にわたり加熱され、室温まで冷却され、濾過され、６９％ＥｔＯＨで洗浄され得る。別の実施形態において、前処理バイオマスは、風乾され得る。乾燥は、従来の手段（例えば、周囲温度での真空へのもしくは大気圧の気流への曝露、および／またはオーブンもしくは真空オーブン中での加熱）によって行われ得る。
【００７４】
乾燥された前処理バイオマスは、次いで、グルカン、キシランおよび酸不溶性リグニンの濃度を測定するために、当該技術分野においてよく知られた分析手段を用いて分析され得る。乾燥された前処理バイオマスのグルカンおよびキシランの含有量は、糖化プロセスでの所要酵素配合量を決定するために使用される。
【００７５】
糖化
前処理バイオマスは、糖化酵素集合体の存在下で加水分解され、オリゴ糖および／または単糖を加水分解生成物として放出し得る。糖化プロセスを改善するために、Ｔｗｅｅｎ ２０もしくはＴｗｅｅｎ ８０またはポリオキシエチレン（例えば、ＰＥＧ ２０００、４０００または８０００）などの界面活性剤が加えられ得る。他の界面活性剤（例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，３５４，７４３Ｂ２号明細書に記載されているもの）も使用され得る。バイオマス処理のための糖化酵素および方法は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）において概説されている。糖化酵素集合体は、１つ以上のグリコシダーゼを含み得る。このグリコシダーゼは、セルロース加水分解グリコシダーゼ、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ、およびデンプン加水分解グリコシダーゼからなる群から選択され得る。糖化酵素集合体中の他の酵素としては、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼ、ならびにアセチルおよびフェルロイルエステラーゼが挙げられ得る。
【００７６】
糖化酵素集合体は、二糖、オリゴ糖、および多糖のグリコシド結合を加水分解しかつ一般群「ヒドロラーゼ」（ＥＣ ３．）の酵素分類ＥＣ ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（酵素命名法）１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，補遺１（１９９３），補遺２（１９９４），補遺３（１９９５），補遺４（１９９７）および補遺５付き［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０，１９９９にある］）中に見出される群「グリコシダーゼ」から主として（しかし限定的にではなく）選択される１つ以上の酵素を含む。本発明の方法において有用なグリコシダーゼは、グリコシダーゼが加水分解するバイオマス成分によって分類され得る。本発明の方法にとって有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ）は、キシロースおよびアラビノースを含有する分岐鎖オリゴマーを加水分解する。
【００７７】
さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ １．１１．１．ｘ）、およびアセチル（ＥＣ ３．１．１．６）およびフェルロイル（ＥＣ ３．１．１．７３）エステラーゼなどの他の活性を糖化酵素集合体に加えてバイオマスの他の成分からの多糖の放出を助けることは、有用であり得る。多糖加水分解酵素を産生する微生物は、多くの場合に、異なる基質特異性を有するいくつかの酵素、または酵素群によって触媒される活性（例えば、セルロース分解）を示すということは当該技術分野においてよく知られている。したがって、微生物由来の「セルラーゼ」は、全ての酵素がセルロース加水分解活性に寄与し得る酵素群を含み得る。市販されている酵素調製物または市販されていない酵素調製物（例えば、セルラーゼ）は、その酵素を得るために利用された精製方法に応じて多くの酵素を含み得る。したがって、本発明の方法の糖化酵素集合体は「セルラーゼ」のような酵素活性を含み得るが、この活性は２つ以上の酵素によって触媒され得るものであることが認識される。
【００７８】
上に示したように、本発明において、糖化容器に加えられる糖化酵素集合体は、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含有する必要はない。これらの酵素のうちの１種以上が、中空糸循環ループ内で隔離されることになる。ポリマー状およびオリゴマー状の両方のキシロースに作用するキシラナーゼ酵素は、糖化容器の中の糖化酵素集合体中に含まれてもよく、さらに中空糸循環ループ内に隔離されてもよい。
【００７９】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）など、単離された形態で商業的に入手され得る。また、糖化酵素は、未精製であり得、一種の細胞抽出物または全細胞調製物として提供され得る。酵素は、複数種の糖化酵素を発現するように操作された組換え微生物を使用して生成され得る。当業者であれば、集合体において使用する酵素の有効量を決定し、最適な酵素活性が得られるように条件を調整する方法を知っているであろう。また、当業者であれば、選択された条件下で、所与の前処理生成物の最適な糖化を得るために集合体内に必要とされる酵素活性のクラスを最適化する方法も知っているであろう。
【００８０】
好ましくは、糖化反応は、糖化酵素についての温度最適条件およびｐＨ最適条件で、またはその付近で行われる。本発明の方法において糖化酵素集合体とともに使用される温度最適条件は、約１５℃〜約１００℃の範囲である。別の実施形態において、温度最適条件は、約２０℃〜約８０℃の範囲、最も典型的には４５〜５０℃の範囲である。ｐＨ最適条件は、約２〜約１１の範囲であり得る。別の実施形態においては、本発明の方法において糖化酵素集合体とともに使用されるｐＨ最適条件は、約４〜約５．５の範囲である。
【００８１】
糖化は、約数分〜約１２０時間、好ましくは約数分〜約４８時間の時間にわたって行われ得る。反応の時間は、酵素の濃度および比活性、ならびに使用される基質、その濃度（すなわち、固形分配合量）、ならびに環境条件（例えば、温度およびｐＨ）によって決まる。当業者は、特定の基質および糖化酵素集合体とともに使用されるべき温度、ｐＨおよび時間の最適条件を容易に決定し得る。
【００８２】
糖化は、回分式でまたは連続プロセスとして行われ得る。また、糖化は、１つの工程でまたは多くの工程で行われ得る。例えば、糖化のために必要とされる種々の酵素は、異なるｐＨまたは温度最適条件を示し得る。一次処理が、ある温度およびｐＨで１種もしくは複数種の酵素を用いて行われ、続いて、二次または三次（または、より高次）の処理が、異なる温度および／またはｐＨで異なる１種もしくは複数種の酵素を用いて行われ得る。また、逐次的な工程で異なる酵素を用いる処理は、同じｐＨおよび／もしくは温度で行われるか、または異なるｐＨおよび温度で、例えば、より高いｐＨおよび温度で安定かつより活性なヘミセルラーゼを用い、続いてより低いｐＨおよび温度で活性なセルラーゼを用いて行われ得る。
【００８３】
糖化に続くバイオマスからの糖類の可溶化の程度は、単糖およびオリゴ糖の放出を測定することによってモニタリングされ得る。単糖およびオリゴ糖を測定する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、還元糖類の濃度は、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３１：４２６−４２８，１９５９）を用いて測定され得る。あるいは、糖類は、後述するように、適切なカラムを用いてＨＰＬＣで測定され得る。
【００８４】
区画化ＳＳＦ
本発明の方法において、区画化ＳＳＦ（ＣＳＳＦ）は、前処理バイオマスの糖化の間の、糖化酵素集合体中に典型的に存在する糖化酵素のうちのいくつかの酵素のフィードバック阻害を除去するために開発された。場合によっては、生成物フィードバック阻害は、より多くの酵素を糖化容器に加え、その結果、糖化の間のフィードバック阻害に起因する酵素活性の減少を小さくすることによって、ある程度は克服され得る。しかしながら、より多くの酵素を糖化プロセスに加えることは、加水分解反応を促進する一方で、費用がかかり、プロセスの総コストを増加させる。糖化酵素のその最終産物によるフィードバック阻害という問題を解消するためには、最終産物を絶えず除去して、その蓄積を回避する必要がある。
【００８５】
本例においては、糖化酵素のフィードバック阻害は、ＣＳＳＦを適用し、加水分解酵素のうちのいくつかを別個の区画（例えば、中空糸循環ループ）中に隔離することを通して緩和される。糖化容器から第１の半透膜フィルターを介して別個の酵素含有区画中への酵素の基質の拡散は、糖化容器中のその基質の濃度を低下させ、それにより、糖化酵素集合体酵素のそれらの生成物によるフィードバック阻害の可能性を除去する。酵素含有区画中の隔離された酵素（例えば、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、およびアラビノフラノシダーゼ）は、それらの基質を所望の単糖生成物へと加水分解する。この生成物は第２の半透膜を通って移動し、この第２の半透膜から発酵容器中へと拡散する。第１および第２の半透膜はともに、１０〜約３０ｋＤａの分子量カットオフを有しており、小分子（すなわち、低分子分岐鎖キシロースオリゴマーを含む、可溶性オリゴ糖）の透過のみを可能にするであろう。隔離された酵素は、第１または第２の半透膜を透過することができないため、その別個の区画中に留まる。二糖のその単糖への加水分解、およびそれらの標的生成物への変換は、糖化容器中の酵素の最終産物阻害を減少させる。酵素を中空糸循環ループ中に隔離することは、酵素回収プロセスを必要とすることなく、糖化の間のそれらの反復使用を可能にする。別個の糖化容器および発酵容器を有することは、それらの容器が異なる温度で運転されることを可能にし、そしてまた、消化されていないバイオマスに発酵細胞が付着するのを防ぐ。
【００８６】
中空糸半透膜
１つの実施形態において、半透膜は、中空糸半透膜である。中空糸半透膜は、高い膜充填密度、高い表面／容積比、衛生的な設計という独特の利点を提供し、その構造的完全性および構造ゆえに、中空糸半透膜は、透過液逆圧（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｂａｃｋｐｒｅｓｓｕｒｅ）に耐えることができ、したがって、システムの設計および操作における柔軟性を可能にする。
【００８７】
中空糸半透膜は、ある特定の大きさ、形状または特性までの物質のみの通過を可能にする物理的障壁として機能するものであり、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（中空糸の製造および利用），Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，Ｒｅｖ．，第１９４巻，Ｊ．Ｓｃｏｔｔ編，１９８１，Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，ＮＪ．およびＳｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（合成膜），Ｍ．Ｂ．Ｃｈｅｎｗｅｔｈ編，ｐ．６３，１９８６，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹおよびＬｅｅｐｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａｓ：ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｒｅｖｉｅｗ（バイオ燃料および生化学物質の回収における膜分離：最新報告），Ｓｅｐ．Ｐｕｒｉｆ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｐｐ．９９−１９４，１９９２）。中空糸半透膜の２つの基本的な形態は、「等方性」および「異方性」の形態である。膜分離は、これらの形態を使用することによって達成される。
【００８８】
「異方性」の構成は、支持する多孔性構造物の上にできた緻密な、半透性の、極めて薄いスキン層を含有する。「等方性」の微孔性ポリスルホン半透膜は、キャスティング液（ｃａｓｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の配合とキャスティング条件との特定の組み合わせを用いることにより調製され得る。中空糸膜も平膜も、このようにして調製され得る。等方性膜は、スキン層がなく、膜全体にわたる均一な多孔性によって特徴づけられる。本明細書に開示される方法の目的のために、両方の種類の中空糸半透膜が使用され得る。
【００８９】
中空糸濾過プロセスにおいては、相変化は関与せず、潜熱は必要とされないので、中空糸半透膜システムは、エネルギー要求が大きくない。さらに、中空糸半透膜は、モジュール容積当りの膜表面が大きい。したがって、中空糸半透膜の大きさが他の種類の膜より小さくなり得る一方で、中空糸半透膜は、より高い性能を提供することができる。
【００９０】
中空糸半透膜には柔軟性があり、中空糸半透膜は「インサイド・アウト」または「アウドサイド・イン」プロセスによって濾過を行い得る。さらに、中空糸半透膜は、他の種類の単位操作と比べて低い運転費を有する。中空糸半透膜バイオリアクターは当該技術分野において知られている（国際公開第２００７／００４１７０号パンフレットおよび国際公開第２００８／００６４９４号パンフレットおよび国際公開第２００７／１２０４４９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２／０１６４７３１号明細書）および（Ｅｎｇａｓｓｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．，３５：９９−１０５，１９８０ならびにＫｉｔａｎｏ，Ｈ．およびＩｓｅ，Ｎ．，Ｔｒｅａｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：５−７，１９８４）。中空糸半透膜バイオリアクターは連続的に操作され得、高い表面対容積比という利点を有し得る。これらの系では、生体触媒（酵素および／または微生物）は、「遊離」しているかまたは「固定化」されているかのいずれかで使用され得る。
【００９１】
中空糸半透膜は、任意の種類の意図された用途に種々の細孔径で利用できる。本発明の方法のために、半透膜は１０〜約３０ｋＤａの分子量カットオフを有しており、小分子（すなわち、低分子分岐鎖キシロースオリゴマーを含む可溶性オリゴ糖）の通過のみを可能にするであろうから、中空糸循環ループの領域内に隔離された嵩高い酵素が糖化容器および発酵容器の中に漏入するのを防ぎ、糖化容器中の前処理バイオマスを中空糸循環ループの酵素および発酵容器から隔離する。
【００９２】
本発明の方法において使用される中空糸半透膜は、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ヒドロキシル化ポリスルホン（ＯＨＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン（ＯＨＰＥＳ）、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、またはこれらの任意の組み合わせなどの材料から作製され得る。
【００９３】
糖化を促進しかつ酵素阻害を防止するための中空糸循環ループの利用
１つの実施形態において、本発明の方法は、２つの中空糸半透膜を有する少なくとも１種のオリゴ糖加水分解酵素が隔離された中空糸循環ループを介して一緒に結合された、別個の糖化容器および発酵容器における、前処理バイオマスの糖化および結果として生じる糖類の望ましい標的生成物への発酵のための、ＣＳＳＦの利用を可能にする。
【００９４】
前処理バイオマスは、前処理バイオマスが作用を受けて高分子量成分および低分子量成分を生成する糖化容器に、糖化酵素集合体とともに加えられる。糖化されたバイオマスの成分は、第１の循環ループを通って第１の中空糸半透膜フィルターへと送達される。半透膜は、前処理バイオマスの高分子量成分の拡散を妨げるが、可溶性の低分子量成分（３０ｋＤａ未満）の拡散を可能にする。この分子量の成分は、半透膜を透過して、少なくとも１種の隔離された糖化酵素を含有する中空糸循環ループに入る。
【００９５】
中空糸循環ループ内の隔離された酵素は、中空糸循環ループにおいて拡散した１種以上の低分子量オリゴ糖に作用し、これにより、少なくとも１種の糖生成物が形成される。次いで、こうして形成された生成物は、第２の半透膜フィルターを通って第２の循環ループ中および発酵容器へと送達され、この発酵容器において、その生成物は、適切な微生物によって標的生成物へと発酵される。
【００９６】
１つの実施形態において、隔離された酵素は、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含み得る。糖化されたバイオマスのセロビオース、キシロビオースおよび分岐鎖キシロースオリゴマーは、第１の中空糸半透膜を通って拡散し、中空糸循環ループに入り、そこで、それらは、β−グルコシダーゼ、β−キシロビオシダーゼおよび分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素によって、それぞれグルコース、キシロースおよびアラビノースへと加水分解される。隔離された酵素（例えば、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼおよびアラビノフラノシダーゼ）に対するグルコース、キシロースおよびアラビノースのいずれのフィードバック阻害も、第２の半透膜を通って第２の循環ループおよび発酵容器中への生成物の移動によって緩和され、この発酵容器において、その生成物は、発酵で生体触媒により消費される。次いで、隔離された酵素は再利用されて、第１の外部循環ループを介して糖化容器からのより多くの基質に作用する。この系は、糖化容器および中空糸循環ループの両方において酵素の最終産物フィードバック阻害を緩和しつつ、隔離された酵素の費用効果の高い再使用を可能にする。また、隔離された酵素は固定化されて、中空糸循環ループの内容物がその固定化酵素を含有するマトリクス上を通るようにもし得る。このような固定化は、（例えば、熱変性に対する）酵素のさらなる安定化をもたらし得る。別個の容器を使用することにより、糖化および発酵の異なる温度要求に付随する問題は解消される。発酵容器中で生じるまたは容器間を輸送される熱は、ヒートポンプを使用することによって糖化容器へと送達され得る。また、発酵容器中の微生物は、消化されていないバイオマスとは直接接触しておらず、バイオマスへの細胞吸着による発酵能力の低下の可能性も解消される。標的生成物の除去も、消化されていないまたは不完全に消化されたバイオマスの不存在下で行われる。
【００９７】
ＣＳＳＦのための装置およびプロセス
１つの実施形態において、糖化容器および別個の発酵容器を含む前処理バイオマスを処理するための装置であって、前記容器同士は、２つの外部循環ループとこれらの２つの外部循環ループを連結しかつ半透膜を含む中空糸循環ループとによって連結されており、前記装置は、前処理バイオマスの区画化併行複発酵を提供するものである、装置において、ＣＳＳＦは行われる。
【００９８】
本発明の装置の１つの実施形態が図２に示される。この図は、次のとおりの、糖化および発酵のための別個の容器が２つの外部循環ループおよび中空糸循環ループを介して連結されている、前処理バイオマスのＣＳＳＦのための装置のブロック図を図示している。糖化容器（１）；第１の外部循環ループ（２）；中空糸循環ループ（３）；第２の外部循環ループ（４）；発酵容器（５）；標的生成物のための排出口（６）；第１の外部循環ループのための第１の循環ポンプ（７）；第２の外部循環ループのための第２の循環ポンプ（８）；中空糸ループのための第３の循環ポンプ（９）；中空糸循環ループの第１の半透膜（１０）および中空糸循環ループ（３）の第２の半透膜（１１）。
【００９９】
１つの実施形態において、図２の装置を用いる方法は次のとおりである。典型的には３５℃〜５５℃の温度および４〜約６のｐＨで維持される糖化容器（１）は、セロビオース、キシロビオース、キシロースオリゴマーを含有する部分的に糖化されたバイオマスと、糖化酵素集合体とを含有する。第１の外部循環ループ（２）は、バイオマスおよび糖化酵素集合体が、糖化容器から第１の中空糸半透膜（１０）の外側上を通るようにするものであり、この第１の中空糸半透膜（１０）の内側は、中空糸循環ループ（３）の一部である。バイオマスの多糖および糖化集合体の酵素は、それらの分子サイズが大きいため、中空糸半透膜を透過して中空糸循環ループに入ることから排除されるが、セロビオース、キシロビオースおよび分岐鎖キシロースオリゴマーなどのより小さい分子はこの膜を透過し得る。β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼおよび分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素は、中空糸循環ループ内に隔離されている。β−グルコシダーゼは、第１の半透膜（１０）を透過し得る小さい可溶性の基質（セロビオース）に作用する。β−キシロビオシダーゼ、β−キシロシダーゼ型の酵素は、同じく第１の半透膜を透過し得るキシロビオースをキシロースに変換する。分岐鎖キシロースオリゴマー加水分解酵素は、キシロースおよびアラビノースへと加水分解されるべき、第１の半透膜を透過し得る分岐鎖キシロースオリゴマー（例えば、α−１，２結合を介してキシロースオリゴマー主鎖に結合したＬ−アラビノース）を変換する。こうして中空糸循環ループ中で生成されたグルコース、キシロースおよびアラビノースは、第２の半透膜（１１）および第２の外部循環ループ（４）を介して発酵容器（５）へと送達され、そこで、それらは、微生物によって１種もしくは複数種の標的生成物に変換される。中空糸ループ中の第２のポンプ（９）は、隔離された酵素を連続的に再循環させ、それらの酵素のそれぞれの反応における反復使用を可能にする。酵素の反復使用、および当該プロセスのために必要とされる酵素の全体量の減少は、著しい全体的なコスト節減をもたらす。さらに、この開示される方法は、リグノセルロース系基質および発酵微生物が同じ容器中にある必要性を回避し、したがって、温度の両立不能性などの課題を克服する独特のＣＳＳＦプロセスである。発酵容器（６）中の標的生成物の除去は、プロセス全体を完結に導く助けとなる。第１および第３の外部ループポンプ（７）および（８）は、糖化容器、発酵容器および中空糸循環ループの間の種々の成分の再循環を可能にする。
【０１００】
本方法においては、微生物は消化されていないバイオマスと直接接触していないので、バイオマスへの細胞吸着による発酵能力の低下の可能性が解消される。
【０１０１】
発酵容器からの（例えば、蒸留、選択透過膜、パーベーパレーションまたは他の適切な方法による）標的生成物の除去もまた、消化されていないバイオマスの存在によって妨げられない。
【０１０２】
糖化容器および発酵容器は当該技術分野においてよく知られており、当業者は、それらの利用に関して精通している。
【０１０３】
標的生成物への発酵
適切な微生物を用いた種々の発酵方法が、前処理された糖化されたバイオマスから放出される発酵性糖類を変換して標的生成物を生成するために使用され得る。本発明の方法には、流加回分発酵系または連続発酵系が使用され得る。これらの方法は当該技術分野においてよく知られており、当業者は、それらの利用に関して精通している。「流加回分」発酵プロセスは、発酵が進行するにつれて基質が添加されるということを除いて典型的な回分系を含む。回分発酵および流加回分発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られている。例は、参照により本明細書に援用される、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（バイオテクノロジー：工業微生物学のテキスト），第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．中、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）において見出され得る。本発明の方法は、「連続」発酵方法にも適合可能であると予想される。連続発酵は、発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等しい量の馴化培地が処理のために除去される開放系である。
【０１０４】
様々な種類の増殖培地が、本発明において使用され得る。このような増殖培地には、例えば、酵母抽出物、特定のアミノ酸、ホスフェート、窒素源、塩、および微量元素が補充され得る。特定の生体触媒によって作製される特定の生成物の生成のために必要とされる成分（例えば、プラスミドを維持するための抗生物質または酵素触媒反応において必要とされる補因子）もまた含まれ得る。さらなる糖類もまた、全糖濃度を高めるために含まれ得る。
【０１０５】
温度および／またはヘッドスペースガスも、１種もしくは複数種の発酵微生物にとって有用な条件に応じて調整され得る。発酵は、好気性または嫌気性の発酵であり得る。本明細書に記載される方法によれば、１種以上の糖類の発酵および糖化は、同時に行われるが、別個の区画において行われ、区画化併行複発酵（ＣＳＳＦ）と定義される。
【０１０６】
糖類の標的生成物への発酵は、１種以上の適切な微生物（例えば、細菌、糸状菌および酵母）によって行われ得る。野生型微生物および組換え微生物の両方が、使用され得る。このような微生物としては、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ジュモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミュセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンディダ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトミュセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バキッルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバキッルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
標的生成物としては、アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセリン、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール、およびキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、コハク酸、およびキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジン、セリン、およびトレオニン）；ガス（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、および一酸化炭素（ＣＯ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
発酵プロセスはまた、消費用アルコール産業（例えば、ビールおよびワイン）、乳製品産業（例えば、発酵乳製品）、皮革工業、およびタバコ産業において使用されるプロセスも包含する。
【０１０９】
上記のものに加えて、さらなる一般製品（例えば、有機生成物、化学物質、燃料、汎用化学品および特殊化学品（例えば、キシロース、アセトン、アセテート、グリシン、リジン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸）、ならびに動物飼料）（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．，およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．，Ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１５：７７７−７９３，１９９９；ならびにＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（セルロースのバイオコンバージョン技術），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（バイオエタノールに関するハンドブック：製造および利用），Ｗｙｍａｎ，Ｃ．Ｅ．編，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６中，１７９−２１２；ならびにＲｙｕ，Ｄ．Ｄ．Ｙ．，およびＭａｎｄｅｌｓ，Ｍ．，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（セルラーゼ：生合成および利用），Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２：９１−１０２，１９８０）が、本発明の方法を使用して製造され得る。
【０１１０】
潜在的な副産物（例えば、発酵性炭水化物からの種々の有機生成物）もまた、生成され得る。糖化および発酵の後に残る、リグニンを多量に含有する残渣は、リグニン由来の化学物質、化学的構成単位に変換されるか、または動力生産（ｐｏｗｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のために使用され得る。
【０１１１】
標的生成物は、本明細書に記載されるとおりの、中空糸含有循環ループを通って発酵容器への、前処理された糖化されたバイオマスのある特定の成分の移動に続いて生成され得る。
【０１１２】
標的生成物は、蒸留のような方法により、選択透過膜、もしくはパーベーパレーションを使用して、または回分式のもしくは連続的な発酵ブロスの補給によって非選択的に、発酵容器から除去され得る。標的生成物の除去は、反応全体を完結に導く助けとなる。
【実施例】
【０１１３】
本発明を、以下の実施例においてさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、あくまでも例示として与えられるものと理解されるべきである。上記の検討およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認し得、その精神および範囲から逸脱することなく本発明に様々な変更および修正を加えて、本発明を様々な使用および条件に適合させ得る。
【０１１４】
材料
糖化酵素は次の供給源から入手した。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）ならびにＮｏｖｏｚｙｍｅ １８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，２８８０ Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。
【０１１５】
サトウキビバガスは、Ｗｉｌｅｙナイフミルで粉砕して１ｍｍ篩に通したものを、本明細書において使用した。
【０１１６】
実施例において使用される略語
次の略語を、実施例において使用する。「℃」は摂氏またはセ氏であり、「％」はパーセントであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「ｈ」は時間であり、「ｒｐｍ」は毎分回転数であり、「ＥｔＯＨ」はエタノールであり、「ｍｇ／ｍＬ」は１ミリリットル当りのミリグラム数であり、「ｇ／１００ｍＬ」は１００ミリリットル当りのグラム数であり、「Ｎ」は規定濃度であり、「ｇ」はグラムであり、「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウムであり、「ｖ／ｖ」は容量に対する容量であり、「ｍｍ」はミリメートルであり、「ｍＬ／ｍｉｎ」は毎分当りのミリリットル数であり、「ｍｉｎ」は分であり、「ｍＭ」はミリモルであり、「ｍｇタンパク質／ｇセルロース」はセルロース１ｇ当りのタンパク質のミリグラム数を表し、「ｋＤａ」はキロダルトンを表す。
【０１１７】
実施例１
β−グルコシダーゼ濃度の増加はバイオマス糖化の間の最終産物阻害を軽減することによりセルラーゼの所要量を減少させる
糖化のためのバイオマスを調製するために、最初にバイオマスを、本明細書に記載されるとおりに前処理した。ナイフミルで粉砕したサトウキビバガス（２ｇ）を、１５ｍＬの１００ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中に懸濁させ、この懸濁液を、１２１℃にて１時間にわたり密封ガラスバイアル中でオートクレーブにかけた。内容物を冷却し、焼結プラスチックフィルター（ｆｒｉｔｔｅｄ ｐｌａｓｔｉｃ ｆｉｌｔｅｒ）を含有する２つの使い捨てクロマトグラフィーカラムカートリッジに入れ、これを１５ｍＬの円錐チューブに入れ、ＲＣ−５Ｂ Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中のＨＳ−４スイング型バケットローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ）を用い、３０００ｒｐｍで室温にて遠心分離して、前処理バイオマスを洗浄した。各カラムを５ｍＬのＨ２Ｏで３回洗浄した後、各々を、ＮａＯＨ（５ｍｇ／１．７５ｍＬ）およびアントラキノン（１ｍｇ／１．７５ｍＬ）を加えたＨ２Ｏ中６９％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ ２．５ｍＬで２回洗浄した。３．８ｇ（乾燥分１．４ｇ）の重さであった湿潤前処理バイオマス残渣を、さらなる４．６ｇの洗浄液中に懸濁させた。この懸濁液をステンレス鋼圧力容器（１９ｍＬ内容積）に入れ、蓋締めし、１７５℃にて１４０分間加熱した。この圧力容器を室温まで冷却し、内容物を、上記のとおりに２つのクロマトグラフィーカラムカートリッジ中で遠心分離した。各カラム中の前処理バイオマスをＨ２Ｏ中６９％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ １．５ｍＬで４回洗浄した。次いで、この前処理バイオマス残渣を風乾した（乾燥バイオマス 約９２％）。
【０１１８】
この風乾された前処理バイオマス試料（７８．７％グルカン、５．５％キシラン）を、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）中に、約１１％の固形分配合量で懸濁させた。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、およびＮｏｖｏｚｙｍｅ １８８を、異なる比および異なるセルロース１ｇ当り濃度で加えた。これらの比（ｍｇタンパク質／ｇセルロース）は、４：３：８、８：３：４、６：３：６、６：６：１２、１２：６：１．２および１２：６：１２であった。さらに、１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗ／ｖ）および０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を加えた。約０．５ｍＬの試料容量を、２個のガラスビーズ（３ｍｍ）を含有する６ｍＬのねじ蓋バイアルに加え、回転振盪器（２５０ｒｐｍ）上で４６℃にてインキュベートした。インキュベーションの開始から４時間後および開始後２４時間毎にアリコートを取り出し、分析のために０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で４１．２５倍に希釈した。試料をＳｐｉｎ−Ｘフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ．Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に通して濾過し、その濾液をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００／１２００，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で分析した。ＢｉｏＲａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ Ａｍｉｎｅｘカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用し、０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を移動相として用いて、放出される糖類を分画した。このカラムを６０℃で維持し、流量を０．６ｍＬ／ｍｉｎで維持した。５５℃で維持した屈折率検出器を使用して、溶出した糖類を検出した。
【０１１９】
図１Ａは、様々な酵素配合量でのバイオマスの糖化の時間的経過を、糖化についてのみのパーセント理論収量として表わされるモノマーグルコースの収率に関して示している。図１Ｂは、様々な酵素比についての図１Ａからの１２０時間でのモノマーグルコースの収率の比較を示している。セルロース１ｇ当り［６：３：６］、［６：６：１２］および［１２：６：１．２］のＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ：Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８の配合量を使用した酵素糖化実験は、１２０時間のインキュベーションでほぼ同じ収率を示した。これらの結果は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ酵素の配合量の低下が、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ １８８（ほとんどβ−グルコシダーゼ）の配合量の増加により相殺され得ることを示している。これらの結果に基づけば、β−グルコシダーゼが安定で再使用可能であるならば、そのβ−グルコシダーゼの再使用可能性およびセルラーゼのいくらかに取って代わるその能力は、生成されたモノマー糖の量当りのセルラーゼ酵素のコスト削減をもたらし得る。
【０１２０】
実施例２（予測的）
二重中空糸循環ループがβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素を閉じ込めて最終産物阻害を緩和しそれらの再利用を可能にする
実施例１に開示された結果に基づけば、バイオマス糖化生成物が除去され、かつβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素が再利用されるプロセスは、発酵性糖類の生成について著しいコスト節減をもたらし得る。
【０１２１】
図２に、半透性中空糸循環ループにより結合された糖化および発酵のための別個の容器を使用する連続ＳＳＦ装置の略図を示す。糖化容器（１）は、４６℃およびｐＨ５で維持される。前処理バイオマスを、セルラーゼおよびキシラナーゼと一緒にこの糖化容器に加える。酵素糖化反応により生成される低分子のヘキソースおよびペントースオリゴマー（セロビオースおよびキシロビオースを含む）を、第１の外部循環ループ（２）を介して第１の半透性中空糸膜（１０）まで移動させ、ここでそれらのオリゴマーはその膜を透過して中空糸循環ループ（３）に入る。この中空糸循環ループは、隔離されたβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素を含有する。これらの酵素は、３０ｋＤａの分子量カットオフを有するその中空糸膜を通って拡散し得ない大きい分子である。しかしながら、この半透膜は、小分子の反応物（セロビオースおよびキシロビオース）およびこれらの反応物の生成物（グルコースおよびキシロース）を透過させ得る。β−グルコシダーゼおよびβキシロビオシダーゼ酵素は、セロビオースおよびキシロビオースを、グルコースおよびキシロースへと加水分解する。こうして形成されたグルコースおよびキシロースを第２の半透膜（１１）まで移動させ、そしてその膜を通して第２の外部循環ループ（４）および発酵容器（５）中に移動させる。この発酵容器は、３０〜３３℃およびｐＨ５．８で維持され得、標的生成物（例えば、エタノールまたはブタノール）の生成に必要な増殖培地および適切な１種もしくは複数種の微生物を含有する。発酵の間、その標的生成物は、排出口（６）を介してこの発酵容器から除去され得る。発酵容器からの生成物の（例えば、スパージングによる、または選択透過膜を介した、もしくはパーベーパレーションによる）除去は、反応を完結に導く助けとなる。循環ループ（２）は、セロビオースおよびキシロビオースが部分的に消耗したバイオマスを糖化容器に戻す。第１および第３の循環ポンプ（７）および（８）は、それぞれ第１および第２の外部ループの内容物を循環させる。第２の循環ポンプ（９）は、内部中空糸循環ループの内容物（β−グルコシダーゼおよびβキシロビオシダーゼ酵素を含む）を、さらなる一連の反応のために循環させる。こうして、糖化容器中のエキソセルラーゼおよびキシラナーゼの最終産物阻害が、内部中空糸ループ内に含まれているβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロビオシダーゼ酵素により緩和され、これにより、反応全体が完結に導かれ、バイオマスの標的生成物への変換のためのより経済的なプロセスがもたらされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化容器および別個の発酵容器を含む前処理バイオマスを処理するための装置であって、該容器同士が、２つの外部循環ループと、該２つの外部循環ループを連結しかつ半透膜を含む中空糸循環ループとによって連結されており、該装置が、前処理バイオマスの区画化併行複発酵を提供する、装置。
【請求項２】
前記装置が、第１の外部循環ループ（２）に連結された糖化容器（１）を含み、ここで前記第１の外部循環ループ（２）は、中空糸循環ループ（３）の第１の半透膜（１０）の外部にありかつ該第１の半透膜（１０）に連結されており；該中空糸循環ループ（３）は、中空糸循環ループ（３）の第２の半透膜（１１）の外部にありかつ該第２の半透膜（１１）に連結されている第２の外部循環ループ（４）に連結されており；そして該第２の外部循環ループ（４）は、標的生成物のための排出口（６）を有する発酵容器（５）に連結されている、図２に従う、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
第１の外部循環ループ（２）のための第１の循環ポンプ（７）と、第２の外部循環ループ（４）のための第２の循環ポンプ（８）と、内部中空糸ループ（３）のための第３の循環ポンプ（９）とを含む一連の循環ポンプをさらに含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
半透膜が、ポリスルホン、ヒドロキシル化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、およびポリエーテルイミドからなる群から選択される材料から作製される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項５】
半透膜が、約１０〜約３０キロダルトンの分子量透過性を有する、請求項１または２に記載の装置。
【請求項６】
中空糸循環ループ（３）が、隔離された糖化酵素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前処理バイオマスを処理する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の装置を備える工程と；
（ｂ）前処理バイオマスと糖化酵素集合体との混合物を該装置の糖化容器（１）に供給する工程であって、該混合物が、糖化によって高分子量成分および低分子量成分の両方を生成する、工程と；
（ｃ）少なくとも１つの隔離された酵素を中空糸循環ループ（３）中に供給する工程と；
（ｄ）ある量の（ｂ）の混合物を、第１の循環ループを通して、第１の中空糸半透膜（１０）上に送達する工程であって、これにより、（ｂ）の混合物の上記高分子量成分は上記膜を通して拡散せず、混合物の上記低分子量成分は該膜を通して上記中空糸循環ループ（３）中に拡散する、工程と；
（ｅ）（ｄ）の中空糸循環ループ（３）中に拡散する該低分子量成分を、該中空糸循環ループ中で上記少なくとも１つの隔離された酵素によって加水分解する工程であって、これにより、発酵性糖類を含む加水分解物が形成される、工程と；
（ｆ）発酵性糖類を含む加水分解物を第２の半透膜（１１）を通して第２の循環ループ（４）中および発酵容器（５）に送達する工程と；
を包含し、前処理バイオマス成分は循環ポンプによって前記装置全体にわたって循環され、前処理バイオマスが処理される、上記方法。
【請求項８】
（ｂ）の前記糖化酵素集合体は、セルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、リグニナーゼおよびエステラーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｃ）の隔離された酵素は、可溶性分岐鎖キシロースオリゴマーを加水分解し得る、β−グルコシダーゼ β−キシロシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ｆ）の発酵容器に送達される（ｅ）の発酵性糖類が、少なくとも１つの微生物によって少なくとも１つの標的生成物に変換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
標的生成物が、前記発酵容器から選択的に取り出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマスに対する前記隔離された酵素の作用によって形成された加水分解物が、前記発酵容器に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）の前記隔離された酵素は、複数回再利用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の半透膜および前記第２の半透膜は、各々、ポリスルホン、ヒドロキシル化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、およびポリエーテルイミドからなる群から選択される材料から作製される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前処理バイオマスの区画化併行複発酵のための方法であって、（ａ）前処理バイオマスおよび糖化酵素集合体を糖化容器に供給する工程であって、これにより糖化生成物が形成され、１つまたはそれより多い半透膜を通して移動し、１つまたはそれより多いさらなる隔離された酵素を含む少なくとも１つの区画を通過し、これにより発酵性糖類を含む加水分解物が形成される工程と；（ｂ）該加水分解物を、標的生成物への発酵のための別個の発酵容器に送達する工程と；を包含する、上記方法。
【請求項１】
糖化容器および別個の発酵容器を含む前処理バイオマスを処理するための装置であって、該容器同士が、２つの外部循環ループと、該２つの外部循環ループを連結しかつ半透膜を含む中空糸循環ループとによって連結されており、該装置が、前処理バイオマスの区画化併行複発酵を提供する、装置。
【請求項２】
前記装置が、第１の外部循環ループ（２）に連結された糖化容器（１）を含み、ここで前記第１の外部循環ループ（２）は、中空糸循環ループ（３）の第１の半透膜（１０）の外部にありかつ該第１の半透膜（１０）に連結されており；該中空糸循環ループ（３）は、中空糸循環ループ（３）の第２の半透膜（１１）の外部にありかつ該第２の半透膜（１１）に連結されている第２の外部循環ループ（４）に連結されており；そして該第２の外部循環ループ（４）は、標的生成物のための排出口（６）を有する発酵容器（５）に連結されている、図２に従う、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
第１の外部循環ループ（２）のための第１の循環ポンプ（７）と、第２の外部循環ループ（４）のための第２の循環ポンプ（８）と、内部中空糸ループ（３）のための第３の循環ポンプ（９）とを含む一連の循環ポンプをさらに含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
半透膜が、ポリスルホン、ヒドロキシル化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、およびポリエーテルイミドからなる群から選択される材料から作製される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項５】
半透膜が、約１０〜約３０キロダルトンの分子量透過性を有する、請求項１または２に記載の装置。
【請求項６】
中空糸循環ループ（３）が、隔離された糖化酵素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前処理バイオマスを処理する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の装置を備える工程と；
（ｂ）前処理バイオマスと糖化酵素集合体との混合物を該装置の糖化容器（１）に供給する工程であって、該混合物が、糖化によって高分子量成分および低分子量成分の両方を生成する、工程と；
（ｃ）少なくとも１つの隔離された酵素を中空糸循環ループ（３）中に供給する工程と；
（ｄ）ある量の（ｂ）の混合物を、第１の循環ループを通して、第１の中空糸半透膜（１０）上に送達する工程であって、これにより、（ｂ）の混合物の上記高分子量成分は上記膜を通して拡散せず、混合物の上記低分子量成分は該膜を通して上記中空糸循環ループ（３）中に拡散する、工程と；
（ｅ）（ｄ）の中空糸循環ループ（３）中に拡散する該低分子量成分を、該中空糸循環ループ中で上記少なくとも１つの隔離された酵素によって加水分解する工程であって、これにより、発酵性糖類を含む加水分解物が形成される、工程と；
（ｆ）発酵性糖類を含む加水分解物を第２の半透膜（１１）を通して第２の循環ループ（４）中および発酵容器（５）に送達する工程と；
を包含し、前処理バイオマス成分は循環ポンプによって前記装置全体にわたって循環され、前処理バイオマスが処理される、上記方法。
【請求項８】
（ｂ）の前記糖化酵素集合体は、セルラーゼ、キシラナーゼ、グリコシダーゼ、リグニナーゼおよびエステラーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｃ）の隔離された酵素は、可溶性分岐鎖キシロースオリゴマーを加水分解し得る、β−グルコシダーゼ β−キシロシダーゼおよびキシラナーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ｆ）の発酵容器に送達される（ｅ）の発酵性糖類が、少なくとも１つの微生物によって少なくとも１つの標的生成物に変換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
標的生成物が、前記発酵容器から選択的に取り出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマスに対する前記隔離された酵素の作用によって形成された加水分解物が、前記発酵容器に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）の前記隔離された酵素は、複数回再利用される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の半透膜および前記第２の半透膜は、各々、ポリスルホン、ヒドロキシル化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ヒドロキシル化ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、およびポリエーテルイミドからなる群から選択される材料から作製される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前処理バイオマスの区画化併行複発酵のための方法であって、（ａ）前処理バイオマスおよび糖化酵素集合体を糖化容器に供給する工程であって、これにより糖化生成物が形成され、１つまたはそれより多い半透膜を通して移動し、１つまたはそれより多いさらなる隔離された酵素を含む少なくとも１つの区画を通過し、これにより発酵性糖類を含む加水分解物が形成される工程と；（ｂ）該加水分解物を、標的生成物への発酵のための別個の発酵容器に送達する工程と；を包含する、上記方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図１Ｂ】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０４３３９（Ｐ２０１３−５０４３３９Ａ）
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９８５９（Ｐ２０１２−５２９８５９）
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８８５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３４８７１
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８８５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３４８７１
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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