パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学スキャフォルド
バイオマテリアルおよび誘導組織工学用途のための三次元スキャフォルドを形成するために一つにされる複数の合成または天然ポリマー膜構造を備えるスタック型ラメラ構造体を開発した。それぞれの層がそれぞれのラメラの構築中に配置される二次元または三次元ナノおよびマイクロトポグラフィー形状に互いに類似しているかまたは異なる二次元または三次元ナノおよびマイクロトポグラフィー形状を有し、かつ、それらの配向は三次元構造の相の構築中に調節される。そのような構造体を、ヒト初代細胞を用いる人工角膜の開発に利用した。この人工角膜でラメラ構造の構成要素のパターン付表面は天然角膜に本来ある配向コラーゲン構造に似ている。三次元パターン付構造の同様の利用は、整列ＥＣＭ構造が必須である組織、例えば靱帯、骨、腱、皮膚、に行われうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子ナノパターン付ビルディングブロックおよびマイクロパターン付ビルディングブロックを使用することによって三次元バイオマテリアルまたは組織工学構造体の表面トポグラフィーの精密制御を導入することによってバイオマテリアルおよび組織工学スキャフォルドの能力を改良することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
組織の損傷や損失の修復のための移植に代わる方法として、組織工学は、細胞成長を許容し、生体内条件下で分解され、再構築されるスキャフォルドを利用する。多くの組織工学スキャフォルドは、細胞が成長するのに十分なスペースを提供し、かつ、分子および細胞を拡散させるランダムな孔を有するようにデザインされている。組織工学スキャフォルドの表面にある細胞に物理的または化学的刺激が提示されると、再構築プロセスが大いに影響されることが示されてきた。細胞の応答は、整列細胞外基質分泌物に対する細胞配向から、よりわずかな変化、例えば分化度、に至るまでさまざまである。多くの組織にとって、複雑な細胞外基質構造は組織の機能に不可欠であり、組織特性は一般的にＥＣＭ分子、例えばコラーゲンおよびエラスチン、の配向および細胞の分布に依存する。
【０００３】
天然組織は、一般的に、それぞれ個々の層に互いに特定の空間配向で配置された一種類よりも多くの細胞を含む。この配向および分離は、これらの組織の機能性に重要である。一例として、角膜組織は、５つの別個の層および３つの異なる種類の細胞を含み、この空間構成は、人工角膜を製造するために模倣されるべきである。従って、一種類よりも多い細胞を有する複合組織用の組織工学スキャフォルドは、異種細胞間の必要な分離を提供すべきであり、同時に、利用可能な物理的および化学的刺激によって異種細胞間の相互作用をさせるべきである。
【０００４】
現在の組織工学スキャフォルドデザインのほとんどは、均質形態、例えば孔の分布がランダムな発泡体、であるか、または、表面だけが二次元もしくは三次元形状を有するかのいずれかであり、結局、細胞の二次元配向にしか作用しない。異種細胞は、異なる領域のトポグラフィー（タイプおよび大きさ）に対して反応し、組織工学スキャフォルドにおけるこれらの違いの正確な模倣がその能力を改良しうる。例えば、表面刺激に対する角膜上皮細胞と実質細胞との応答が全く異なり、それぞれの細胞種の最適表面トポグラフィー形状のサイズが異なることが証明されている。従って、特有の二次元もしくは三次元特性を有するラメラを備える三次元構造体は、それぞれの層に異なるトポグラフィー形状を提供し、複合マルチレイヤー多細胞組織に好適なスキャフォルドの作成を可能にする。従って、組織工学および非組織工学用にデザインされるバイオマテリアルは、開発された構造体の利益を享受する。
【０００５】
加えて、パターン付の層を有し、スタックされてマルチレイヤー構造体を形成している、細胞を有さないバイオマテリアルは、また、その組織化の増加のために、従って、それが模倣し、かつ／または取って代わる組織に更に一層似るために、単一層非パターン付バイオマテリアルよりも好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、予め製造された天然ポリマーまたは合成ポリマー由来の個々のラメラでつくられた三次元マルチラメラ構造体であって、バイオマテリアルの性能または細胞の挙動に影響を与えるようにデザインされたマイクロ−またはナノ−スケールの表面形状を有する三次元マルチラメラ構造体を記述している。この発明は、さまざまなポリマーのために開発された、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有する三次元構造体、および三次元スキャフォルドのさまざまな製造方法を含む。本発明は、更に、一般的にバイオマテリアル、特に、組織、特に特定の標的組織、角膜、用のスキャフォルドの組織工学へのこれらの構造の適用にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の例示的な説明を、異なる二種類の高分子物質、１）ポリエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）（（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ）とポリ（３−ヒドロキシ絡酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢＶ）、および２）コラーゲン、を用いて行う。かいつまんで言うと、マイクロスケールのトポグラフィー形状を有するコラーゲン膜とＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶ膜とを、フォトリソグラフィ技術およびソフトリソグラフィ技術とその次のソルベントキャスティングを使用することによって製造した。次に、特定の用途に所望される機械特性を慎重に検討して決定される特定の接触地点に熱を加えることによってこれらのソリッド膜を一つにした。開発された第二の方法は、局所的に濡らすための微量の適切な溶媒の接触地点への適用と次の乾燥プロセスである。第三の方法は、架橋剤溶液の適用を含み、二つの層の付着強度は、架橋剤の濃度、量およびタイプによって制御されうる。
【０００８】
以下の本発明の態様の詳細な説明および関連図面、図およびそれらの説明、は一例にすぎない。従って、限定や実例であると見なすべきではない。以下の詳細な説明を読み、理解すると、本発明の別の形態および側面が当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本明細書に組み込まれて本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の一以上の例示態様を概略的に説明し、上記概要および下記の好ましい態様の詳細な説明と共に本発明の本質を説明する役割を果たす。
【図１ａ】パターン付コラーゲンフィルムのＳＥＭ顕微鏡写真
【図１ｂ】パターン付コラーゲンフィルムの立体顕微鏡写真（倍率３０倍）
【図１ｃ】コラーゲンフィルムベースの三次元マルチレイヤー構造体の立体顕微鏡写真。それぞれの層においてパターンの方向が次の層に対して直行している。コラーゲンフィルムの透明性のために下の層が見える。
【図１ｄ】ヒト角膜実質細胞が植えられているインキュベーション１４日後のコラーゲンフィルムマルチレイヤーの蛍光顕微鏡写真（ＤＡＰＩで細胞核を染色）
【図１ｅ】別のタイプの細胞（Ｄ４０７網膜色素上皮細胞）が植えられているインキュベーション７日後の単一パターン付コラーゲンフィルム層の蛍光顕微鏡写真（ＤＡＰＩで細胞核を染色）
【図１ｆ】ヒト角膜実質細胞が植えられているインキュベーション７日後の単一パターン付コラーゲンフィルムの蛍光顕微鏡写真（アクリジンオレンジで細胞核を染色）
【図１ｇ】インキュベーション７日後のパターン付コラーゲンフィルムの単一層におけるＦＩＴＣ標識ファロイジン染色細胞骨格要素（ｆ−アクチン）の分布およびヒト角膜実質細胞の配向を示す蛍光顕微鏡写真
【図１ｈ】Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって決定された３層コラーゲンフィルムマルチレイヤーにおけるヒト角膜実質細胞の増殖速度。組織培養ポリスチレンを対照として使用した。
【図２ａ】Ａ３パターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルム二層のＳＥＭ顕微鏡写真。パターン軸が互いに直行する配向でフィルムを一つにした。
【図２ｂ】Ｄ４０７網膜色素上皮細胞が植えられているパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムのインキュベーション１日後の蛍光顕微鏡写真（アクリジンオレンジで細胞核を染色）
【図２ｃ】Ｄ４０７網膜色素上皮細胞が植えられているパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムのインキュベーション７日後の蛍光顕微鏡写真（アクリジンオレンジで細胞核を染色）。パターン寸法が他と異なる。
【図２ｄ】ヒト角膜実質細胞が植えられているパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムのインキュベーション２１日後の蛍光顕微鏡写真（ＤＡＰＩで細胞核を染色）
【図３】テンプレートの拡大透視図（Ａ：溝幅、Ｂ：畝幅、ｈ：溝の深さ、θ：傾斜角）
【図４ａ】テンプレートの光学顕微鏡写真（マイクロパターン付Ｓｉテンプレート−３５０倍）（Ｓｍ：平滑非パターン付領域、ＭＰ：マイクロパターン付領域、Ｇｒｏｏｖｅ：溝、Ｒｉｄｇｅ：畝）
【図４ｂ】テンプレートから得られるポリマーフィルムの光学顕微鏡写真（マイクロパターン付ＰＨＢＶ−Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡフィルム−１００倍）（Ｓｍ：平滑非パターン付領域、ＭＰ：マイクロパターン付領域、Ｇｒｏｏｖｅ：溝、Ｒｉｄｇｅ：畝）
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明において開発されたプロセスにおいて、天然または合成由来のポリマーを使用した。
【００１１】
コラーゲンの溶液およびさまざまな比の天然由来のポリエステルと合成由来のポリエステルとのブレンドの溶液をさまざまな濃度で製造した。
【００１２】
ポリエステルの例として、Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとのブレンドを使用した。溶液をパターン付テンプレートに注いだ。このパターン付テンプレートは、フォトリソグラフィによってシリコンウエハー上に製造されるかまたは「平行な溝と畝」のデザインをシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートに転写することによって得られる。テンプレートと逆の表面パターンを有する膜構造をソルベントキャスティングによって製造した。テンプレート構造は、任意のトポグラフィー形状、例えば任意の傾斜角の傾斜面並びにさまざまな畝および溝の寸法によってつながれる畝または溝、のテンプレート構造である。任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー（ｐｉｌｌａｒ）、二次元ストライプ、スクエア、円など、がフォトリソグラフィによって得られるか、または、ナノスケールのパターン化に関してはあらゆる三次元デザインの必要性に合わせるために電子ビームリソグラフィもしくは干渉リソグラフィもしくはエンボスもしくはコンタクトプリンティング（ｃｏｎｔａｃｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）もしくはＡＦＭベースのリソグラフィによって得られる。
【００１３】
天然ポリマーの三次元構造は一般的に厳しい処理に非常に弱いので、三次元コラーゲンマルチレイヤーの構築に関する穏やかな化学的方法を発明した。コラーゲンの酢酸溶液をマイクロパターン付テンプレートに注ぎ、溶液を自然乾燥した後、形成されるコラーゲンフィルムを剥がした。コラーゲン溶液としてさまざまな溶液が使用されうる。一例として、０．５Ｍ酢酸中の１５ｍｇ／ｍＬ溶液０．２ｍＬが供給されうる。これらのフィルムを安定化するために、架橋手順を行った。それらの架橋は、ＥＤＣおよびＮＨＳにおけるインキュベーションによって達成された。一例として、架橋は、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ５．５）中の３３ｍＭ ＥＤＣおよび６ｍＭ ＮＨＳの中で室温における２時間のインキュベーションによって達成される。構造体をＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ９．１）で１時間洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌを用いて連続して洗浄した。いくつかの架橋フィルムの互いへの付着を、コラーゲンの希釈溶媒、０．１％酢酸、の添加によって達成した。溶媒添加は、溶媒の濃度および量に依存して局所的な溶解をある程度引き起こす。次の自然乾燥は、溶媒と接触する位置における同時の溶解および乾燥に起因して膜と膜との間の接触を引き起こす。
【００１４】
コラーゲン溶液および濃厚架橋溶液を伴う、コラーゲンフィルムを付着させる第二の手法を開発した。コラーゲン溶液を所望の接触地点に適用して二つの層の間のグルーの役割を果たさせ、コラーゲン溶液の添加後、ＥＤＣ／ＮＨＳからなる濃厚架橋溶液を添加して溶液中のコラーゲンを二つの膜に付着させた。この方法で、パラメータ、例えばコラーゲンおよび架橋剤溶液の濃度、を変えることによって接触強度が細かく調節されうる。
【００１５】
Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶ膜を、有機溶媒、例えばクロロホルムまたはジクロロメタン、中のＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとの溶液のソルベントキャスティングによって形成してテンプレートのパターンの逆のパターン寸法を有するマイクロパターン付膜を製造した。さまざまな寸法およびジオメトリーを有するマイクロパターン付シリコンテンプレートをフォトリソグラフィおよび次の化学エッチングによって製造した。形成された膜をピーリングによって取り外し（平均フィルム厚４２μｍ）、四隅に熱を加え、これらの地点においてポリマーフィルムを溶融させることによって互いに付着させた。代わりに、コラーゲン構造体の場合と同様に溶媒の液滴を隅につけること（このことが溶媒の量に依存してポリマー局所的な溶解をある程度引き起こす。）によって付着を行ってもよい。構造の自然乾燥が、溶媒と接触する地点における同時の溶解および乾燥に起因して、二つの膜の間の接触を引き起こす。
【００１６】
接着／接触地点の数、表面トポグラフィー形状の相対的配向、これらの形状のサイズおよびジオメトリー、それぞれのフィルム層の寸法並びに層の数は、標的組織に特有の必要性に従って製造プロセス中に調節されうる。それぞれ異なる有機体および細胞を有する組織の層が要求される場合、さまざまな配向のマルチレイヤーを別個に製造し、次に一つにしてマルチレイヤー多配向構造を有する構造体をつくる。存在する異種細胞間に高いレベルの相互作用が必要である場合、または溶質、成長因子、生物活性剤の移動のために透過性の増加が必要である場合、所望の寸法の適切な溶質粒子の添加と、次の、これらの粒子のみを溶解してフィルム材料を溶解しない適切な溶媒による溶解と、によってフィルムを部分的に多孔性にしてもよい。類似した特性が、微粒子および電磁照射に曝すことによる孔の形成によって達成されうる。生物活性剤、例えば成長因子、の漸進供給が必要である場合、これらの薬剤は膜に溶解されうる。
【実施例】
【００１７】
フィルム製造
三種のフィルム、１）タイプＩパターンのパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルム、２）タイプＩＩパターンのパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルム、および３）タイプＩパターンの逆のパターン付コラーゲンフィルム、を得た。フィルムは、前に記述したようにソルベントキャスティングによって製造された。パターンのジオメトリーおよび寸法を表１に示す。
【表１】
【００１８】
マルチレイヤーの製造
複数のパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムを、フィルムの隅の熱処理によって一つにした。この方法によって最大８層までの（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムがうまく一つにされた。
【００１９】
パターン付コラーゲンフィルムを、コラーゲン溶液およびＥＤＣ／ＮＨＳ溶液の連続適用によって一つにした。この方法によって最大３層までのコラーゲンフィルムを互いに他着させた。
【００２０】
これらの三次元構造体は特に角膜組織工学のために製造されたので、互いに対するパターンの配向は天然角膜実質構造に似るように直交であった。
【００２１】
４℃において滅菌ＥｔＯＨ（７０％）中に２時間浸漬することによってマルチレイヤーを滅菌した。次に構造体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。
【００２２】
生体外研究
ヒト角膜実質細胞培養を初代細胞株の継代数２において開始し、継代数８まで増殖させた。全ての実験で継代数４〜８の角膜実質細胞を使用した。角膜実質細胞培地５００ｍＬの組成は、二酸化炭素インキュベータ中３７℃、５％ＣＯ２においてＤＭＥＭ高グルコース２２５ｍＬ、Ｈａｍ Ｆ１２培地２２５ｍｌ、新生仔牛血清５０ｍＬ、ヒト組み換えｂ−ＦＧＦ １０ｎｇ／ｍＬ、アンフォテリシン（１μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００ＵＩ／ｍＬ）であった。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して細胞を継代した。
【００２３】
Ｄ４０７網膜色素上皮細胞（継代数５〜１５）を、二酸化炭素インキュベータ中３７℃、５％ＣＯ２において、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００単位／ｍＬストレプトマイシンを用いて補強された高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して細胞を継代した。
【００２４】
０．０５％トリプシンを３７℃において５分間使用することによって角膜実質細胞およびＤ４０７細胞を組織培養フラスコから分離し、次に３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、それぞれの培地に再懸濁した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（デンマークのＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ）を使用して細胞数をカウントした。それぞれの構造体に５００００細胞／２０μＬを植え、これらの構造体を３０分間そっとして細胞を付着させた。３０分後、培地５００μＬをそれぞれの構造体に補った。それらをＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）において２１日間インキュベートした。培地を毎日補充した。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）を対照として使用した。
【００２５】
ＳＥＭキャラクタリゼーション
ＳＥＭのために、試料をカコジル酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）および蒸留水で洗浄し、凍結乾燥した。金でスパッタコーティングした後にサンプルをＳＥＭで分析した。
【００２６】
蛍光染色
蛍光顕微鏡検査（日本のオリンパス製のＩＸ ７０）のために、試料を最初にグルタルアルデヒド（２．５％）で二時間固定し、次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で二回洗浄した。アクリジンオレンジで染色されるサンプルをＨＣｌ（０．１Ｍ）で１分間洗浄し、アクリジンオレンジを添加した。１５分後、アクリジンオレンジを取り除き、サンプルを蒸留水で洗浄した。細胞を励起波長領域４５０〜４８０ｎｍにおいて蛍光顕微鏡下で観察した。
【００２７】
ＤＡＰＩおよびファロイジン染色のために、フィルム上の細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。次に細胞膜を透過性にするために細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５分間処理し、再度ＰＢＳで３回洗浄した。次にサンプルを室温においてブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））中で３０分間インキュベートし、３７℃において染色溶液中に１時間入れた。染色溶液はＰＢＳ溶液中の０．１％ＢＳＡの中の１％ファロイジンと０．１％ＤＡＰＩとであった。インキュベーション後、サンプルをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下において、ファロイジンに関しては４５０〜４８０ｎｍの励起波長で、ＤＡＰＩに関しては３３０〜３８５ｎｍの励起波長で検査した。
【００２８】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖速度を決定するために、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞増殖アッセイを行った。角膜実質細胞を植えたマルチレイヤーに関して１日、４日、７日、および１０日の時点において、培地を廃棄し、サンプルを滅菌ＰＢＳで数回洗浄した。次に５％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ溶液５００μＬを添加し、サンプルをＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを含む培地を収集し、それらの５７０および６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計によって決定した。次に、細胞の代謝活動による染料の還元率を、還元型染料と酸化型染料との吸光係数を使用して決定した。次に既知の細胞数の存在下における染料の還元率を使用して作図された較正曲線を使用することによって細胞数を決定した。
【００２９】
本発明の方法の簡単な説明
この発明において、さまざまなポリマーのための、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有するバイオマテリアルおよび／または三次元スキャフォルドのさまざまな製造方法を開発した。
【００３０】
これらの方法の主な工程は以下に挙げるものである。
・コラーゲンの溶液、およびＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとのブレンドの溶液をさまざまな濃度で製造する。
・シリコンウエハー上にフォトリソグラフィによって製造されたかまたは「平行な溝と畝」もしくは「交互スクエアピット」のデザインをシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートに転写することによって得られたパターン付テンプレートにポリマー溶液を注ぐ。
・テンプレートと同一かまたは逆の表面パターンを有する膜構造をソルベントキャスティングによって製造する。
・テンプレート構造は、任意のトポグラフィー形状、例えば任意の傾斜角の傾斜面およびさまざまな畝と溝との寸法によってつながった畝または溝、のテンプレート構造である。任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー、二次元ストライプ、スクエア、円などが、あらゆる三次元デザインの必要性に合わせて、フォトリソグラフィによってかまたはナノスケールのパターン化に関しては電子ビームリソグラフィまたは干渉リソグラフィ、フォトリソグラフィまたはエンボスまたはコンタクトプリンティングまたはＡＦＭベースのリソグラフィによって得られる。
・使用されるポリマーがコラーゲンである場合、三次元コラーゲンマルチレイヤーの構築に関する穏やかな化学的方法を開発する。天然ポリマーの三次元構造は、一般的に厳しい処理に非常に敏感である。
・濃度２〜２５ｍｇ／ｍＬ（好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲン溶液（酢酸中）をマイクロパターン付きのテンプレートに注ぐ。濃度領域の下限は、非常に低い厚さおよび低い機械的特性に起因し、上限は、適切な加工を妨げる過剰な粘度に起因する。
・テンプレートに注がれるコラーゲン溶液の量は、テンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬである。厚さおよび機械的強度が十分でない薄すぎるフィルムを防ぐために、５０マイクロリットル未満でなく、そのような小さなエリアに高い容積を維持することが可能でなく、更に、生じるフィルムが厚すぎ、硬すぎ、かつ、透明性が低くなるので、１ｍＬよりも多くない。
・溶液を乾燥した後、形成されるコラーゲンフィルムを剥がす。
・乾燥を室温においてガスや空気の循環なしに１０〜２４時間で達成する。温度が高いか、空気もしくはガスの循環があるか、加熱されるか、または、使用される溶液の容積が低いと、乾燥時間が短くなる。
・これらのフィルムを安定化するために架橋処理を行う。
・緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液（好ましくはｐＨ ５．５）、中の３３ｍＭ ＥＤＣおよびＮＨＳの中で室温における２時間のインキュベーションによって架橋を達成する。緩衝液のｐＨは、４〜６である。なぜなら、このｐＨ範囲外ではＥＤＣの反応性が減少するからである。架橋時間は、要求される架橋度に依存して、温度＋４〜３７℃（上限は３７℃よりも高い温度におけるコラーゲンの変性に起因する。）において３０分〜４時間である。
・架橋は、グルタルアルデヒド、ゲニピン、デンドリマーなどによって達成されうる。
・構造体を緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液、で１時間洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌと２Ｍ ＮａＣｌとで連続的に洗浄する。緩衝液は、好ましくはＮａ２ＨＰＯ４であり、そのｐＨは好ましくは９．１である。
・薄いコラーゲンの溶媒、０．１％酢酸、の液滴の適用によっていくつかの架橋フィルムを互いに付着させる。
・溶媒の適用は、溶媒の濃度および量に依存して、局所的な溶解をある程度引き起こす。次の乾燥が、溶媒と接触する位置における同時の溶解および乾燥に起因して、膜と膜との間の接触をつくる。
・有機溶媒中にさまざまな濃度でさまざまな比のポリエステルのブレンドの溶液を製造する。
・ポリエステルは好ましくはＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶである。
・有機溶媒中のＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとの溶液のソルベントキャスティングによってフィルムを形成してマイクロパターン付きの膜であって、パターン寸法がテンプレートのパターン寸法と逆の膜を製造した。有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタンなどである。
・ポリマー溶液濃度は、有機溶媒中、２〜１０％、好ましくは４％である。十分な厚さおよび機械的強度を達成するために２％よりも低くなく、適切なフィルムの形成のための適切な粘度を達成するために１０％よりも高くない。
・さまざまな寸法およびジオメトリーのマイクロパターン付きのシリコンテンプレートをフォトリソグラフィおよび次の化学エッチングによって製造した。
・Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとのブレンドの比は、さまざまな透明性および剛性のフィルムを得るために、１：０〜０：１、好ましくは１：１である。
・テンプレートに注がれるＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとの溶液は、テンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬである。厚さおよび機械的強度が不充分な薄すぎるフィルムを防ぐために５０μＬよりも少なくなく、そのような小さなエリアに高い容積を維持することが可能でなく、更に、生じるフィルムが厚すぎ、硬すぎ、かつ、透明性が低くなるので、１ｍＬよりも多くない。
・乾燥は、ガスまたは空気の循環や真空の適用や加熱をせずに室温において１０時間以上で達成される。より短い時間は、溶媒保持および不適切な性能をもたらしうる。温度が高いか、空気もしくはガスの循環があるか、真空が適用されるか、または、使用される溶液容積が低い場合、乾燥時間が短くなりうる。
・形成される膜をピーリングによって取り外し（平均フィルム厚４２マイクロメートル）、４隅に熱を加え、これらの地点のポリマーフィルムを溶融させることによって膜同士を互いに付着させた。
・代わりに、溶媒の液滴を４隅につけること（このことが溶媒の量に依存してある程度ポリマーの局所溶解を引き起こす。）によって付着させてもよい。
・構造の乾燥が、溶媒と接触する地点における同時の溶解および乾燥に起因して、二つの膜の間の接触を引き起こす。
【００３１】
代わりの方法の簡単な説明
コラーゲン溶液および濃架橋溶液を伴うコラーゲンフィルムの第二の付着手法を開発した。
【００３２】
・コラーゲン溶液が所望の接触地点に適用されて二つの連続層の間のグルーの役割を果たした。
・コラーゲン溶液の添加後、ＥＤＣ／ＮＨＳからなる濃架橋溶液を添加して溶液中のコラーゲンを二つの膜に付着させた。
・この方法で、パラメータ、例えばコラーゲンおよび架橋剤溶液の濃度、を変えることによって、接触の強度が細かく調節されうる。
【００３３】
次のコラーゲンフィルム層を互いに付着させる第三の手法は、接着剤、例えばフィブリングルーまたはシアノアクリレート、の適用である。
【００３４】
接着／接触地点の数、表面トポグラフィー形状の相対配向、形状のサイズおよびジオメトリー、それぞれのフィルム層の寸法並びに層の数は、標的組織の特性の要求に従って、製造プロセス中に調節されうる。
【００３５】
テンプレート構造は、任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー、二次元ストライプ、スクエア、円、である。
【００３６】
テンプレートは、任意の三次元デザインの必要性に合わせるために、フォトリソグラフィか、電子ビームリソグラフィか、干渉リソグラフィか、エンボスか、コンタクトプリンティングか、または、ＡＦＭベースのリソグラフィによって得られる。
【００３７】
テンプレート上のデザインは、ナノレベルであってもマイクロレベルであってもよい。
【００３８】
この構造体は、標的組織に適切な細胞が植えられうる。
【００３９】
この構造体は、標的組織の細胞集団に応じて、一種類以上の細胞が植えられうる。
【００４０】
組織の層であって、それぞれの層が異なる有機体および細胞を有する層が要求される場合、さまざまな配向の複数の層を別個に製造し、一つにしてマルチレイヤー、多配向、かつ多細胞の構造体をつくってもよい。
【００４１】
存在する異種細胞間に高レベルの相互作用が必要であるか、または溶質、成長因子、生物活性剤の移動のために透過性の増加が必要である場合、含まれる所望の寸法の溶質粒子を、適切な溶媒であって、これらの粒子のみを溶解し、フィルム材料を溶解しない溶媒で浸出することによってフィルムを部分的に多孔性にしてもよい。孔の作成は、電磁線または微粒子放射線の適用によっても行われうる。
【００４２】
生物活性剤、例えば成長因子、の漸進供給が必要とされる場合、これらの薬剤をフィルム中に溶解してもよい。
【００４３】
この方法は、天然ポリマーおよび合成ポリマー、例えばキトサン、ＮＩＰＡＭ、ＰＤＭＳ、ＰＣＬ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸または生分解性ポリマーと非分解性ポリマーとのブレンド、に適用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子ナノパターン付ビルディングブロックおよびマイクロパターン付ビルディングブロックを使用することによって三次元バイオマテリアルまたは組織工学構造体の表面トポグラフィーの精密制御を導入することによってバイオマテリアルおよび組織工学スキャフォルドの能力を改良することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
組織の損傷や損失の修復のための移植に代わる方法として、組織工学は、細胞成長を許容し、生体内条件下で分解され、再構築されるスキャフォルドを利用する。多くの組織工学スキャフォルドは、細胞が成長するのに十分なスペースを提供し、かつ、分子および細胞を拡散させるランダムな孔を有するようにデザインされている。組織工学スキャフォルドの表面にある細胞に物理的または化学的刺激が提示されると、再構築プロセスが大いに影響されることが示されてきた。細胞の応答は、整列細胞外基質分泌物に対する細胞配向から、よりわずかな変化、例えば分化度、に至るまでさまざまである。多くの組織にとって、複雑な細胞外基質構造は組織の機能に不可欠であり、組織特性は一般的にＥＣＭ分子、例えばコラーゲンおよびエラスチン、の配向および細胞の分布に依存する。
【０００３】
天然組織は、一般的に、それぞれ個々の層に互いに特定の空間配向で配置された一種類よりも多くの細胞を含む。この配向および分離は、これらの組織の機能性に重要である。一例として、角膜組織は、５つの別個の層および３つの異なる種類の細胞を含み、この空間構成は、人工角膜を製造するために模倣されるべきである。従って、一種類よりも多い細胞を有する複合組織用の組織工学スキャフォルドは、異種細胞間の必要な分離を提供すべきであり、同時に、利用可能な物理的および化学的刺激によって異種細胞間の相互作用をさせるべきである。
【０００４】
現在の組織工学スキャフォルドデザインのほとんどは、均質形態、例えば孔の分布がランダムな発泡体、であるか、または、表面だけが二次元もしくは三次元形状を有するかのいずれかであり、結局、細胞の二次元配向にしか作用しない。異種細胞は、異なる領域のトポグラフィー（タイプおよび大きさ）に対して反応し、組織工学スキャフォルドにおけるこれらの違いの正確な模倣がその能力を改良しうる。例えば、表面刺激に対する角膜上皮細胞と実質細胞との応答が全く異なり、それぞれの細胞種の最適表面トポグラフィー形状のサイズが異なることが証明されている。従って、特有の二次元もしくは三次元特性を有するラメラを備える三次元構造体は、それぞれの層に異なるトポグラフィー形状を提供し、複合マルチレイヤー多細胞組織に好適なスキャフォルドの作成を可能にする。従って、組織工学および非組織工学用にデザインされるバイオマテリアルは、開発された構造体の利益を享受する。
【０００５】
加えて、パターン付の層を有し、スタックされてマルチレイヤー構造体を形成している、細胞を有さないバイオマテリアルは、また、その組織化の増加のために、従って、それが模倣し、かつ／または取って代わる組織に更に一層似るために、単一層非パターン付バイオマテリアルよりも好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、予め製造された天然ポリマーまたは合成ポリマー由来の個々のラメラでつくられた三次元マルチラメラ構造体であって、バイオマテリアルの性能または細胞の挙動に影響を与えるようにデザインされたマイクロ−またはナノ−スケールの表面形状を有する三次元マルチラメラ構造体を記述している。この発明は、さまざまなポリマーのために開発された、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有する三次元構造体、および三次元スキャフォルドのさまざまな製造方法を含む。本発明は、更に、一般的にバイオマテリアル、特に、組織、特に特定の標的組織、角膜、用のスキャフォルドの組織工学へのこれらの構造の適用にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の例示的な説明を、異なる二種類の高分子物質、１）ポリエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）（（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ）とポリ（３−ヒドロキシ絡酸−ｃｏ−３−ヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢＶ）、および２）コラーゲン、を用いて行う。かいつまんで言うと、マイクロスケールのトポグラフィー形状を有するコラーゲン膜とＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶ膜とを、フォトリソグラフィ技術およびソフトリソグラフィ技術とその次のソルベントキャスティングを使用することによって製造した。次に、特定の用途に所望される機械特性を慎重に検討して決定される特定の接触地点に熱を加えることによってこれらのソリッド膜を一つにした。開発された第二の方法は、局所的に濡らすための微量の適切な溶媒の接触地点への適用と次の乾燥プロセスである。第三の方法は、架橋剤溶液の適用を含み、二つの層の付着強度は、架橋剤の濃度、量およびタイプによって制御されうる。
【０００８】
以下の本発明の態様の詳細な説明および関連図面、図およびそれらの説明、は一例にすぎない。従って、限定や実例であると見なすべきではない。以下の詳細な説明を読み、理解すると、本発明の別の形態および側面が当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本明細書に組み込まれて本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の一以上の例示態様を概略的に説明し、上記概要および下記の好ましい態様の詳細な説明と共に本発明の本質を説明する役割を果たす。
【図１ａ】パターン付コラーゲンフィルムのＳＥＭ顕微鏡写真
【図１ｂ】パターン付コラーゲンフィルムの立体顕微鏡写真（倍率３０倍）
【図１ｃ】コラーゲンフィルムベースの三次元マルチレイヤー構造体の立体顕微鏡写真。それぞれの層においてパターンの方向が次の層に対して直行している。コラーゲンフィルムの透明性のために下の層が見える。
【図１ｄ】ヒト角膜実質細胞が植えられているインキュベーション１４日後のコラーゲンフィルムマルチレイヤーの蛍光顕微鏡写真（ＤＡＰＩで細胞核を染色）
【図１ｅ】別のタイプの細胞（Ｄ４０７網膜色素上皮細胞）が植えられているインキュベーション７日後の単一パターン付コラーゲンフィルム層の蛍光顕微鏡写真（ＤＡＰＩで細胞核を染色）
【図１ｆ】ヒト角膜実質細胞が植えられているインキュベーション７日後の単一パターン付コラーゲンフィルムの蛍光顕微鏡写真（アクリジンオレンジで細胞核を染色）
【図１ｇ】インキュベーション７日後のパターン付コラーゲンフィルムの単一層におけるＦＩＴＣ標識ファロイジン染色細胞骨格要素（ｆ−アクチン）の分布およびヒト角膜実質細胞の配向を示す蛍光顕微鏡写真
【図１ｈ】Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイによって決定された３層コラーゲンフィルムマルチレイヤーにおけるヒト角膜実質細胞の増殖速度。組織培養ポリスチレンを対照として使用した。
【図２ａ】Ａ３パターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルム二層のＳＥＭ顕微鏡写真。パターン軸が互いに直行する配向でフィルムを一つにした。
【図２ｂ】Ｄ４０７網膜色素上皮細胞が植えられているパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムのインキュベーション１日後の蛍光顕微鏡写真（アクリジンオレンジで細胞核を染色）
【図２ｃ】Ｄ４０７網膜色素上皮細胞が植えられているパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムのインキュベーション７日後の蛍光顕微鏡写真（アクリジンオレンジで細胞核を染色）。パターン寸法が他と異なる。
【図２ｄ】ヒト角膜実質細胞が植えられているパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムのインキュベーション２１日後の蛍光顕微鏡写真（ＤＡＰＩで細胞核を染色）
【図３】テンプレートの拡大透視図（Ａ：溝幅、Ｂ：畝幅、ｈ：溝の深さ、θ：傾斜角）
【図４ａ】テンプレートの光学顕微鏡写真（マイクロパターン付Ｓｉテンプレート−３５０倍）（Ｓｍ：平滑非パターン付領域、ＭＰ：マイクロパターン付領域、Ｇｒｏｏｖｅ：溝、Ｒｉｄｇｅ：畝）
【図４ｂ】テンプレートから得られるポリマーフィルムの光学顕微鏡写真（マイクロパターン付ＰＨＢＶ−Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡフィルム−１００倍）（Ｓｍ：平滑非パターン付領域、ＭＰ：マイクロパターン付領域、Ｇｒｏｏｖｅ：溝、Ｒｉｄｇｅ：畝）
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明において開発されたプロセスにおいて、天然または合成由来のポリマーを使用した。
【００１１】
コラーゲンの溶液およびさまざまな比の天然由来のポリエステルと合成由来のポリエステルとのブレンドの溶液をさまざまな濃度で製造した。
【００１２】
ポリエステルの例として、Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとのブレンドを使用した。溶液をパターン付テンプレートに注いだ。このパターン付テンプレートは、フォトリソグラフィによってシリコンウエハー上に製造されるかまたは「平行な溝と畝」のデザインをシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートに転写することによって得られる。テンプレートと逆の表面パターンを有する膜構造をソルベントキャスティングによって製造した。テンプレート構造は、任意のトポグラフィー形状、例えば任意の傾斜角の傾斜面並びにさまざまな畝および溝の寸法によってつながれる畝または溝、のテンプレート構造である。任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー（ｐｉｌｌａｒ）、二次元ストライプ、スクエア、円など、がフォトリソグラフィによって得られるか、または、ナノスケールのパターン化に関してはあらゆる三次元デザインの必要性に合わせるために電子ビームリソグラフィもしくは干渉リソグラフィもしくはエンボスもしくはコンタクトプリンティング（ｃｏｎｔａｃｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）もしくはＡＦＭベースのリソグラフィによって得られる。
【００１３】
天然ポリマーの三次元構造は一般的に厳しい処理に非常に弱いので、三次元コラーゲンマルチレイヤーの構築に関する穏やかな化学的方法を発明した。コラーゲンの酢酸溶液をマイクロパターン付テンプレートに注ぎ、溶液を自然乾燥した後、形成されるコラーゲンフィルムを剥がした。コラーゲン溶液としてさまざまな溶液が使用されうる。一例として、０．５Ｍ酢酸中の１５ｍｇ／ｍＬ溶液０．２ｍＬが供給されうる。これらのフィルムを安定化するために、架橋手順を行った。それらの架橋は、ＥＤＣおよびＮＨＳにおけるインキュベーションによって達成された。一例として、架橋は、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ５．５）中の３３ｍＭ ＥＤＣおよび６ｍＭ ＮＨＳの中で室温における２時間のインキュベーションによって達成される。構造体をＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ９．１）で１時間洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌを用いて連続して洗浄した。いくつかの架橋フィルムの互いへの付着を、コラーゲンの希釈溶媒、０．１％酢酸、の添加によって達成した。溶媒添加は、溶媒の濃度および量に依存して局所的な溶解をある程度引き起こす。次の自然乾燥は、溶媒と接触する位置における同時の溶解および乾燥に起因して膜と膜との間の接触を引き起こす。
【００１４】
コラーゲン溶液および濃厚架橋溶液を伴う、コラーゲンフィルムを付着させる第二の手法を開発した。コラーゲン溶液を所望の接触地点に適用して二つの層の間のグルーの役割を果たさせ、コラーゲン溶液の添加後、ＥＤＣ／ＮＨＳからなる濃厚架橋溶液を添加して溶液中のコラーゲンを二つの膜に付着させた。この方法で、パラメータ、例えばコラーゲンおよび架橋剤溶液の濃度、を変えることによって接触強度が細かく調節されうる。
【００１５】
Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶ膜を、有機溶媒、例えばクロロホルムまたはジクロロメタン、中のＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとの溶液のソルベントキャスティングによって形成してテンプレートのパターンの逆のパターン寸法を有するマイクロパターン付膜を製造した。さまざまな寸法およびジオメトリーを有するマイクロパターン付シリコンテンプレートをフォトリソグラフィおよび次の化学エッチングによって製造した。形成された膜をピーリングによって取り外し（平均フィルム厚４２μｍ）、四隅に熱を加え、これらの地点においてポリマーフィルムを溶融させることによって互いに付着させた。代わりに、コラーゲン構造体の場合と同様に溶媒の液滴を隅につけること（このことが溶媒の量に依存してポリマー局所的な溶解をある程度引き起こす。）によって付着を行ってもよい。構造の自然乾燥が、溶媒と接触する地点における同時の溶解および乾燥に起因して、二つの膜の間の接触を引き起こす。
【００１６】
接着／接触地点の数、表面トポグラフィー形状の相対的配向、これらの形状のサイズおよびジオメトリー、それぞれのフィルム層の寸法並びに層の数は、標的組織に特有の必要性に従って製造プロセス中に調節されうる。それぞれ異なる有機体および細胞を有する組織の層が要求される場合、さまざまな配向のマルチレイヤーを別個に製造し、次に一つにしてマルチレイヤー多配向構造を有する構造体をつくる。存在する異種細胞間に高いレベルの相互作用が必要である場合、または溶質、成長因子、生物活性剤の移動のために透過性の増加が必要である場合、所望の寸法の適切な溶質粒子の添加と、次の、これらの粒子のみを溶解してフィルム材料を溶解しない適切な溶媒による溶解と、によってフィルムを部分的に多孔性にしてもよい。類似した特性が、微粒子および電磁照射に曝すことによる孔の形成によって達成されうる。生物活性剤、例えば成長因子、の漸進供給が必要である場合、これらの薬剤は膜に溶解されうる。
【実施例】
【００１７】
フィルム製造
三種のフィルム、１）タイプＩパターンのパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルム、２）タイプＩＩパターンのパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルム、および３）タイプＩパターンの逆のパターン付コラーゲンフィルム、を得た。フィルムは、前に記述したようにソルベントキャスティングによって製造された。パターンのジオメトリーおよび寸法を表１に示す。
【表１】
【００１８】
マルチレイヤーの製造
複数のパターン付（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムを、フィルムの隅の熱処理によって一つにした。この方法によって最大８層までの（Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ−ＰＨＢＶフィルムがうまく一つにされた。
【００１９】
パターン付コラーゲンフィルムを、コラーゲン溶液およびＥＤＣ／ＮＨＳ溶液の連続適用によって一つにした。この方法によって最大３層までのコラーゲンフィルムを互いに他着させた。
【００２０】
これらの三次元構造体は特に角膜組織工学のために製造されたので、互いに対するパターンの配向は天然角膜実質構造に似るように直交であった。
【００２１】
４℃において滅菌ＥｔＯＨ（７０％）中に２時間浸漬することによってマルチレイヤーを滅菌した。次に構造体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。
【００２２】
生体外研究
ヒト角膜実質細胞培養を初代細胞株の継代数２において開始し、継代数８まで増殖させた。全ての実験で継代数４〜８の角膜実質細胞を使用した。角膜実質細胞培地５００ｍＬの組成は、二酸化炭素インキュベータ中３７℃、５％ＣＯ２においてＤＭＥＭ高グルコース２２５ｍＬ、Ｈａｍ Ｆ１２培地２２５ｍｌ、新生仔牛血清５０ｍＬ、ヒト組み換えｂ−ＦＧＦ １０ｎｇ／ｍＬ、アンフォテリシン（１μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびペニシリン（１００ＵＩ／ｍＬ）であった。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して細胞を継代した。
【００２３】
Ｄ４０７網膜色素上皮細胞（継代数５〜１５）を、二酸化炭素インキュベータ中３７℃、５％ＣＯ２において、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００単位／ｍＬストレプトマイシンを用いて補強された高グルコースＤＭＥＭ中で培養した。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して細胞を継代した。
【００２４】
０．０５％トリプシンを３７℃において５分間使用することによって角膜実質細胞およびＤ４０７細胞を組織培養フラスコから分離し、次に３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、それぞれの培地に再懸濁した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（デンマークのＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ）を使用して細胞数をカウントした。それぞれの構造体に５００００細胞／２０μＬを植え、これらの構造体を３０分間そっとして細胞を付着させた。３０分後、培地５００μＬをそれぞれの構造体に補った。それらをＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）において２１日間インキュベートした。培地を毎日補充した。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）を対照として使用した。
【００２５】
ＳＥＭキャラクタリゼーション
ＳＥＭのために、試料をカコジル酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）および蒸留水で洗浄し、凍結乾燥した。金でスパッタコーティングした後にサンプルをＳＥＭで分析した。
【００２６】
蛍光染色
蛍光顕微鏡検査（日本のオリンパス製のＩＸ ７０）のために、試料を最初にグルタルアルデヒド（２．５％）で二時間固定し、次にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で二回洗浄した。アクリジンオレンジで染色されるサンプルをＨＣｌ（０．１Ｍ）で１分間洗浄し、アクリジンオレンジを添加した。１５分後、アクリジンオレンジを取り除き、サンプルを蒸留水で洗浄した。細胞を励起波長領域４５０〜４８０ｎｍにおいて蛍光顕微鏡下で観察した。
【００２７】
ＤＡＰＩおよびファロイジン染色のために、フィルム上の細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで二回洗浄した。次に細胞膜を透過性にするために細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５分間処理し、再度ＰＢＳで３回洗浄した。次にサンプルを室温においてブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））中で３０分間インキュベートし、３７℃において染色溶液中に１時間入れた。染色溶液はＰＢＳ溶液中の０．１％ＢＳＡの中の１％ファロイジンと０．１％ＤＡＰＩとであった。インキュベーション後、サンプルをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下において、ファロイジンに関しては４５０〜４８０ｎｍの励起波長で、ＤＡＰＩに関しては３３０〜３８５ｎｍの励起波長で検査した。
【００２８】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖速度を決定するために、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞増殖アッセイを行った。角膜実質細胞を植えたマルチレイヤーに関して１日、４日、７日、および１０日の時点において、培地を廃棄し、サンプルを滅菌ＰＢＳで数回洗浄した。次に５％Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ溶液５００μＬを添加し、サンプルをＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを含む培地を収集し、それらの５７０および６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計によって決定した。次に、細胞の代謝活動による染料の還元率を、還元型染料と酸化型染料との吸光係数を使用して決定した。次に既知の細胞数の存在下における染料の還元率を使用して作図された較正曲線を使用することによって細胞数を決定した。
【００２９】
本発明の方法の簡単な説明
この発明において、さまざまなポリマーのための、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有するバイオマテリアルおよび／または三次元スキャフォルドのさまざまな製造方法を開発した。
【００３０】
これらの方法の主な工程は以下に挙げるものである。
・コラーゲンの溶液、およびＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとのブレンドの溶液をさまざまな濃度で製造する。
・シリコンウエハー上にフォトリソグラフィによって製造されたかまたは「平行な溝と畝」もしくは「交互スクエアピット」のデザインをシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートに転写することによって得られたパターン付テンプレートにポリマー溶液を注ぐ。
・テンプレートと同一かまたは逆の表面パターンを有する膜構造をソルベントキャスティングによって製造する。
・テンプレート構造は、任意のトポグラフィー形状、例えば任意の傾斜角の傾斜面およびさまざまな畝と溝との寸法によってつながった畝または溝、のテンプレート構造である。任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー、二次元ストライプ、スクエア、円などが、あらゆる三次元デザインの必要性に合わせて、フォトリソグラフィによってかまたはナノスケールのパターン化に関しては電子ビームリソグラフィまたは干渉リソグラフィ、フォトリソグラフィまたはエンボスまたはコンタクトプリンティングまたはＡＦＭベースのリソグラフィによって得られる。
・使用されるポリマーがコラーゲンである場合、三次元コラーゲンマルチレイヤーの構築に関する穏やかな化学的方法を開発する。天然ポリマーの三次元構造は、一般的に厳しい処理に非常に敏感である。
・濃度２〜２５ｍｇ／ｍＬ（好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲン溶液（酢酸中）をマイクロパターン付きのテンプレートに注ぐ。濃度領域の下限は、非常に低い厚さおよび低い機械的特性に起因し、上限は、適切な加工を妨げる過剰な粘度に起因する。
・テンプレートに注がれるコラーゲン溶液の量は、テンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬである。厚さおよび機械的強度が十分でない薄すぎるフィルムを防ぐために、５０マイクロリットル未満でなく、そのような小さなエリアに高い容積を維持することが可能でなく、更に、生じるフィルムが厚すぎ、硬すぎ、かつ、透明性が低くなるので、１ｍＬよりも多くない。
・溶液を乾燥した後、形成されるコラーゲンフィルムを剥がす。
・乾燥を室温においてガスや空気の循環なしに１０〜２４時間で達成する。温度が高いか、空気もしくはガスの循環があるか、加熱されるか、または、使用される溶液の容積が低いと、乾燥時間が短くなる。
・これらのフィルムを安定化するために架橋処理を行う。
・緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液（好ましくはｐＨ ５．５）、中の３３ｍＭ ＥＤＣおよびＮＨＳの中で室温における２時間のインキュベーションによって架橋を達成する。緩衝液のｐＨは、４〜６である。なぜなら、このｐＨ範囲外ではＥＤＣの反応性が減少するからである。架橋時間は、要求される架橋度に依存して、温度＋４〜３７℃（上限は３７℃よりも高い温度におけるコラーゲンの変性に起因する。）において３０分〜４時間である。
・架橋は、グルタルアルデヒド、ゲニピン、デンドリマーなどによって達成されうる。
・構造体を緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液、で１時間洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌと２Ｍ ＮａＣｌとで連続的に洗浄する。緩衝液は、好ましくはＮａ２ＨＰＯ４であり、そのｐＨは好ましくは９．１である。
・薄いコラーゲンの溶媒、０．１％酢酸、の液滴の適用によっていくつかの架橋フィルムを互いに付着させる。
・溶媒の適用は、溶媒の濃度および量に依存して、局所的な溶解をある程度引き起こす。次の乾燥が、溶媒と接触する位置における同時の溶解および乾燥に起因して、膜と膜との間の接触をつくる。
・有機溶媒中にさまざまな濃度でさまざまな比のポリエステルのブレンドの溶液を製造する。
・ポリエステルは好ましくはＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶである。
・有機溶媒中のＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとの溶液のソルベントキャスティングによってフィルムを形成してマイクロパターン付きの膜であって、パターン寸法がテンプレートのパターン寸法と逆の膜を製造した。有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタンなどである。
・ポリマー溶液濃度は、有機溶媒中、２〜１０％、好ましくは４％である。十分な厚さおよび機械的強度を達成するために２％よりも低くなく、適切なフィルムの形成のための適切な粘度を達成するために１０％よりも高くない。
・さまざまな寸法およびジオメトリーのマイクロパターン付きのシリコンテンプレートをフォトリソグラフィおよび次の化学エッチングによって製造した。
・Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとのブレンドの比は、さまざまな透明性および剛性のフィルムを得るために、１：０〜０：１、好ましくは１：１である。
・テンプレートに注がれるＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡとＰＨＢＶとの溶液は、テンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬである。厚さおよび機械的強度が不充分な薄すぎるフィルムを防ぐために５０μＬよりも少なくなく、そのような小さなエリアに高い容積を維持することが可能でなく、更に、生じるフィルムが厚すぎ、硬すぎ、かつ、透明性が低くなるので、１ｍＬよりも多くない。
・乾燥は、ガスまたは空気の循環や真空の適用や加熱をせずに室温において１０時間以上で達成される。より短い時間は、溶媒保持および不適切な性能をもたらしうる。温度が高いか、空気もしくはガスの循環があるか、真空が適用されるか、または、使用される溶液容積が低い場合、乾燥時間が短くなりうる。
・形成される膜をピーリングによって取り外し（平均フィルム厚４２マイクロメートル）、４隅に熱を加え、これらの地点のポリマーフィルムを溶融させることによって膜同士を互いに付着させた。
・代わりに、溶媒の液滴を４隅につけること（このことが溶媒の量に依存してある程度ポリマーの局所溶解を引き起こす。）によって付着させてもよい。
・構造の乾燥が、溶媒と接触する地点における同時の溶解および乾燥に起因して、二つの膜の間の接触を引き起こす。
【００３１】
代わりの方法の簡単な説明
コラーゲン溶液および濃架橋溶液を伴うコラーゲンフィルムの第二の付着手法を開発した。
【００３２】
・コラーゲン溶液が所望の接触地点に適用されて二つの連続層の間のグルーの役割を果たした。
・コラーゲン溶液の添加後、ＥＤＣ／ＮＨＳからなる濃架橋溶液を添加して溶液中のコラーゲンを二つの膜に付着させた。
・この方法で、パラメータ、例えばコラーゲンおよび架橋剤溶液の濃度、を変えることによって、接触の強度が細かく調節されうる。
【００３３】
次のコラーゲンフィルム層を互いに付着させる第三の手法は、接着剤、例えばフィブリングルーまたはシアノアクリレート、の適用である。
【００３４】
接着／接触地点の数、表面トポグラフィー形状の相対配向、形状のサイズおよびジオメトリー、それぞれのフィルム層の寸法並びに層の数は、標的組織の特性の要求に従って、製造プロセス中に調節されうる。
【００３５】
テンプレート構造は、任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー、二次元ストライプ、スクエア、円、である。
【００３６】
テンプレートは、任意の三次元デザインの必要性に合わせるために、フォトリソグラフィか、電子ビームリソグラフィか、干渉リソグラフィか、エンボスか、コンタクトプリンティングか、または、ＡＦＭベースのリソグラフィによって得られる。
【００３７】
テンプレート上のデザインは、ナノレベルであってもマイクロレベルであってもよい。
【００３８】
この構造体は、標的組織に適切な細胞が植えられうる。
【００３９】
この構造体は、標的組織の細胞集団に応じて、一種類以上の細胞が植えられうる。
【００４０】
組織の層であって、それぞれの層が異なる有機体および細胞を有する層が要求される場合、さまざまな配向の複数の層を別個に製造し、一つにしてマルチレイヤー、多配向、かつ多細胞の構造体をつくってもよい。
【００４１】
存在する異種細胞間に高レベルの相互作用が必要であるか、または溶質、成長因子、生物活性剤の移動のために透過性の増加が必要である場合、含まれる所望の寸法の溶質粒子を、適切な溶媒であって、これらの粒子のみを溶解し、フィルム材料を溶解しない溶媒で浸出することによってフィルムを部分的に多孔性にしてもよい。孔の作成は、電磁線または微粒子放射線の適用によっても行われうる。
【００４２】
生物活性剤、例えば成長因子、の漸進供給が必要とされる場合、これらの薬剤をフィルム中に溶解してもよい。
【００４３】
この方法は、天然ポリマーおよび合成ポリマー、例えばキトサン、ＮＩＰＡＭ、ＰＤＭＳ、ＰＣＬ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸または生分解性ポリマーと非分解性ポリマーとのブレンド、に適用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
・さまざまな濃度のコラーゲン溶液を製造する工程
・コラーゲン溶液をパターン付テンプレートに注ぐ工程
・該テンプレートの表面パターンと同一であるかまたは逆の表面パターンを有するフィルム構造をソルベントキャスティングによって製造する工程
・該マイクロパターン付テンプレート上に形成されたコラーゲンフィルムを乾燥し、剥がす工程
・架橋処理を行って該フィルムを安定化する工程
・該フィルムを洗浄する工程
・いくつかの架橋フィルムを互いに付着させる工程
を特徴とする、さまざまなポリマーのための、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有するパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２】
コラーゲン溶液濃度が２〜２５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３】
テンプレートに注ぐコラーゲン溶液の量がテンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬであることを特徴とする、請求項１または２に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項４】
該パターン付テンプレートが、シリコンウエハー上にフォトリソグラフィによって製造されるかまたはシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートにデザインを転写することによって得られることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項５】
任意のガスまたは空気循環を伴って室温において１０〜２４時間で乾燥を行うことを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項６】
温度が高いか、空気もしくはガス循環があるか、または使用される溶液の容積が低くなると乾燥時間が短くなりうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項７】
架橋が好ましくはＥＤＣおよびＮＨＳ中のインキュベーションによって達成されうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項８】
架橋が好ましくは緩衝液中のＥＤＣおよびＮＨＳ中のインキュベーションによって達成されうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項９】
架橋が好ましくはリン酸緩衝液中のＥＤＣおよびＮＨＳ中のインキュベーションによって達成されうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１０】
ｐＨ４〜６の範囲の外でＥＤＣの反応性が低くなるので、緩衝液のｐＨが４〜６、好ましくは５．５であることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１１】
架橋時間が、温度＋４〜３７℃において、要求される架橋度に依存して３０分〜４時間であり、該上限はそれよりも高い温度におけるコラーゲンの変性のためであり、好ましくは室温において２時間であることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１２】
架橋をグルタルアルデヒド、ゲニピン、デンドリマーによって達成することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１３】
該フィルムを緩衝液で洗浄することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１４】
該フィルムをリン酸緩衝液で洗浄することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１５】
該フィルムを好ましくはＮａ２ＨＰＯ４で１時間洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌで連続して洗浄することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１６】
次の層を溶媒適用によって互いに付着させることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１７】
次の層を架橋剤とコラーゲンとの溶液混合物の適用によって互いに付着させることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１８】
次の層を接着剤、例えばフィブリングルー、の適用によって互いに付着させることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１９】
・有機溶媒中にさまざまな濃度でさまざまな比のポリマーブレンドの溶液を製造する工程
・該ポリマーブレンドの溶液をパターン付テンプレートに注ぐ工程
・ソルベントキャスティングによってテンプレートの表面パターンと同一かまたは逆の表面パターンを有するフィルム構造を製造する工程
・形成されるポリマーフィルムのブレンドを乾燥し、剥がす工程
・いくつかのフィルムを互いに付着させる工程
を特徴とする、さまざまなポリマーのための、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有するパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２０】
ポリマーブレンドの溶液が好ましくはポリエステルＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶであることを特徴とする、請求項１９に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２１】
有機溶媒がクロロホルムまたはジクロロメタンであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２２】
Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶの溶液濃度が２〜１０％、好ましくは４％であることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２３】
Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶのブレンド比が１：０〜０：１、好ましくは１：１であることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２４】
テンプレートに注がれるＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶの溶液の量がテンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬであることを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２５】
該パターン付テンプレートがフォトリソグラフィによってシリコンウエハー上に製造されるかまたはシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートにデザインを転写することによって得られることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２６】
乾燥が、室温において任意のガスもしくは空気循環または真空適用または加熱を伴って１０時間以上で達成されることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２７】
温度が高いか、空気もしくはガス循環があるか、真空が適用されるか、または使用される溶液の容積が少ない場合に乾燥時間が短縮されることを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２８】
次の層を加熱によって互いに付着させることを特徴とする、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２９】
次の層を溶媒の適用によって互いに付着させることを特徴とする、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３０】
次の層を接着剤、例えばシアノアクリレート、の適用によって互いに付着させることを特徴とする、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３１】
該テンプレート構造が任意のトポグラフィー形状、例えば任意の傾斜角の傾斜面によってつながれたさまざまな寸法の畝と溝、のテンプレート構造であることを特徴とする、請求項１または１９に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３２】
接着／接触地点の数、表面トポロジー形状の相対配向、該形状のサイズおよびジオメトリー、それぞれのフィルム層の寸法並びに層の数が、製造プロセス中に標的組織の特定の要求に従って調節されることを特徴とする、請求項１または１９または３１に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３３】
該テンプレート構造が任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー、二次元ストライプ、スクエア、円、であることを特徴とする、請求項１または１９または３１または３２に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３４】
該テンプレートが任意の三次元デザインの必要性に合わせるためのフォトリソグラフィまたは電子ビームリソグラフィまたは干渉リソグラフィまたはエンボス、またはコンタクトプリンティングまたはＡＦＭベースのリソグラフィのいずれかによって得られることを特徴とする、請求項１または１９または３１または３２または３３に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３５】
テンプレート上のデザインがナノレベルであるかまたはマイクロレベルであることを特徴とする、請求項１または１９または３１または３２または３３または３４に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３６】
再構成される標的組織に適切な細胞が該構造体に植えられることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項３７】
標的組織の細胞集団に応じて一種類以上の細胞が該構造体に植えられることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項３８】
それぞれ異なる有機体および細胞を有する組織の層が要求される場合、さまざまな配向の複数の層を別個に製造し、一つにして、マルチレイヤー、多配向かつ多細胞の構造体をつくることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項３９】
存在する異種細胞間で高レベルの相互作用が必要であるか、または、溶質、成長因子、生物活性剤の移動のために高い透過性が必要とされる場合、溶質粒子のみを溶解し、フィルム材料を溶解しない適切な溶媒中で所望の寸法の溶質粒子の添加を浸出するかまたは電磁線もしくは微粒子放射線の適用によってフィルムが部分的に多孔性にされることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項４０】
生物活性剤、例えば成長因子、の漸進供給が必要とされ、かつ、これらの活性剤がフィルム中に溶解されうることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項４１】
該方法が天然および合成ポリマー、例えばキトサン、ＮＩＰＡＭ、ＰＤＭＳ、ＰＣＬ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸または生分解性ポリマーと非分解性ポリマーとのブレンド、に適用されることを特徴とする、従前請求項のいずれかに記載のパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項１】
・さまざまな濃度のコラーゲン溶液を製造する工程
・コラーゲン溶液をパターン付テンプレートに注ぐ工程
・該テンプレートの表面パターンと同一であるかまたは逆の表面パターンを有するフィルム構造をソルベントキャスティングによって製造する工程
・該マイクロパターン付テンプレート上に形成されたコラーゲンフィルムを乾燥し、剥がす工程
・架橋処理を行って該フィルムを安定化する工程
・該フィルムを洗浄する工程
・いくつかの架橋フィルムを互いに付着させる工程
を特徴とする、さまざまなポリマーのための、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有するパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２】
コラーゲン溶液濃度が２〜２５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３】
テンプレートに注ぐコラーゲン溶液の量がテンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬであることを特徴とする、請求項１または２に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項４】
該パターン付テンプレートが、シリコンウエハー上にフォトリソグラフィによって製造されるかまたはシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートにデザインを転写することによって得られることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項５】
任意のガスまたは空気循環を伴って室温において１０〜２４時間で乾燥を行うことを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項６】
温度が高いか、空気もしくはガス循環があるか、または使用される溶液の容積が低くなると乾燥時間が短くなりうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項７】
架橋が好ましくはＥＤＣおよびＮＨＳ中のインキュベーションによって達成されうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項８】
架橋が好ましくは緩衝液中のＥＤＣおよびＮＨＳ中のインキュベーションによって達成されうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項９】
架橋が好ましくはリン酸緩衝液中のＥＤＣおよびＮＨＳ中のインキュベーションによって達成されうることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１０】
ｐＨ４〜６の範囲の外でＥＤＣの反応性が低くなるので、緩衝液のｐＨが４〜６、好ましくは５．５であることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１１】
架橋時間が、温度＋４〜３７℃において、要求される架橋度に依存して３０分〜４時間であり、該上限はそれよりも高い温度におけるコラーゲンの変性のためであり、好ましくは室温において２時間であることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１２】
架橋をグルタルアルデヒド、ゲニピン、デンドリマーによって達成することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１３】
該フィルムを緩衝液で洗浄することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１４】
該フィルムをリン酸緩衝液で洗浄することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１５】
該フィルムを好ましくはＮａ２ＨＰＯ４で１時間洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌおよび２Ｍ ＮａＣｌで連続して洗浄することを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１６】
次の層を溶媒適用によって互いに付着させることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１７】
次の層を架橋剤とコラーゲンとの溶液混合物の適用によって互いに付着させることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１８】
次の層を接着剤、例えばフィブリングルー、の適用によって互いに付着させることを特徴とする、従前請求項のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項１９】
・有機溶媒中にさまざまな濃度でさまざまな比のポリマーブレンドの溶液を製造する工程
・該ポリマーブレンドの溶液をパターン付テンプレートに注ぐ工程
・ソルベントキャスティングによってテンプレートの表面パターンと同一かまたは逆の表面パターンを有するフィルム構造を製造する工程
・形成されるポリマーフィルムのブレンドを乾燥し、剥がす工程
・いくつかのフィルムを互いに付着させる工程
を特徴とする、さまざまなポリマーのための、ラメラの配向に関して物理的にも化学的にもさまざまな寸法およびデザインを有し、かつ、さまざまなサイズの表面形状およびさまざまな厚さのマルチラメラ構造を有するパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２０】
ポリマーブレンドの溶液が好ましくはポリエステルＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶであることを特徴とする、請求項１９に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２１】
有機溶媒がクロロホルムまたはジクロロメタンであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２２】
Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶの溶液濃度が２〜１０％、好ましくは４％であることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２３】
Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶのブレンド比が１：０〜０：１、好ましくは１：１であることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２４】
テンプレートに注がれるＰ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡおよびＰＨＢＶの溶液の量がテンプレート表面１平方ｃｍあたり５０μＬ〜１ｍＬであることを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２５】
該パターン付テンプレートがフォトリソグラフィによってシリコンウエハー上に製造されるかまたはシリコンウエハー製の第一テンプレートから第二テンプレートにデザインを転写することによって得られることを特徴とする、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２６】
乾燥が、室温において任意のガスもしくは空気循環または真空適用または加熱を伴って１０時間以上で達成されることを特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２７】
温度が高いか、空気もしくはガス循環があるか、真空が適用されるか、または使用される溶液の容積が少ない場合に乾燥時間が短縮されることを特徴とする、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２８】
次の層を加熱によって互いに付着させることを特徴とする、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項２９】
次の層を溶媒の適用によって互いに付着させることを特徴とする、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３０】
次の層を接着剤、例えばシアノアクリレート、の適用によって互いに付着させることを特徴とする、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３１】
該テンプレート構造が任意のトポグラフィー形状、例えば任意の傾斜角の傾斜面によってつながれたさまざまな寸法の畝と溝、のテンプレート構造であることを特徴とする、請求項１または１９に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３２】
接着／接触地点の数、表面トポロジー形状の相対配向、該形状のサイズおよびジオメトリー、それぞれのフィルム層の寸法並びに層の数が、製造プロセス中に標的組織の特定の要求に従って調節されることを特徴とする、請求項１または１９または３１に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３３】
該テンプレート構造が任意のタイプのマイクロパターン、例えばコブルストーン、ピラー、二次元ストライプ、スクエア、円、であることを特徴とする、請求項１または１９または３１または３２に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３４】
該テンプレートが任意の三次元デザインの必要性に合わせるためのフォトリソグラフィまたは電子ビームリソグラフィまたは干渉リソグラフィまたはエンボス、またはコンタクトプリンティングまたはＡＦＭベースのリソグラフィのいずれかによって得られることを特徴とする、請求項１または１９または３１または３２または３３に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３５】
テンプレート上のデザインがナノレベルであるかまたはマイクロレベルであることを特徴とする、請求項１または１９または３１または３２または３３または３４に記載の、さまざまなポリマーのための、パターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルドの製造方法。
【請求項３６】
再構成される標的組織に適切な細胞が該構造体に植えられることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項３７】
標的組織の細胞集団に応じて一種類以上の細胞が該構造体に植えられることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項３８】
それぞれ異なる有機体および細胞を有する組織の層が要求される場合、さまざまな配向の複数の層を別個に製造し、一つにして、マルチレイヤー、多配向かつ多細胞の構造体をつくることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項３９】
存在する異種細胞間で高レベルの相互作用が必要であるか、または、溶質、成長因子、生物活性剤の移動のために高い透過性が必要とされる場合、溶質粒子のみを溶解し、フィルム材料を溶解しない適切な溶媒中で所望の寸法の溶質粒子の添加を浸出するかまたは電磁線もしくは微粒子放射線の適用によってフィルムが部分的に多孔性にされることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項４０】
生物活性剤、例えば成長因子、の漸進供給が必要とされ、かつ、これらの活性剤がフィルム中に溶解されうることを特徴とする、従前請求項のいずれかの記載に従って得られるパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【請求項４１】
該方法が天然および合成ポリマー、例えばキトサン、ＮＩＰＡＭ、ＰＤＭＳ、ＰＣＬ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸または生分解性ポリマーと非分解性ポリマーとのブレンド、に適用されることを特徴とする、従前請求項のいずれかに記載のパターン付スタック型バイオマテリアルおよび／または組織工学三次元スキャフォルド。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５２１９８５（Ｐ２０１０−５２１９８５Ａ）
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５００８８６（Ｐ２０１０−５００８８６）
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＴＲ２００７／００００２５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５１６０
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０９２６５１９５）
【氏名又は名称原語表記】Ｖａｓｉｆ ＨＡＳＩＲＣＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＴＲ２００７／００００２５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１５１６０
【国際公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【出願人】（５０９２６５１９５）
【氏名又は名称原語表記】Ｖａｓｉｆ ＨＡＳＩＲＣＩ
【Ｆターム（参考）】
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