ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法
【課題】夾雑物の混入、低分子量化、不純物およびエンドトキシンなどの問題がないことで医薬として利用が可能となるヒアルロン酸類を工業的規模で分離・精製することができる簡便な方法を提供する。
【解決手段】ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填に接触させる工程を含んでなる、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【解決手段】ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填に接触させる工程を含んでなる、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液からヒアルロン酸及び／又はその塩（以下、総称してヒアルロン酸類という）を分離・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用途が開かれている。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、工業規模では、鶏の鶏冠等からの抽出物により製造されているが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入したり、組織内に含まれるヒアルロニダーゼ等によって低分子量化されやすい。従って高分子量で高純度に精製されたものは、コスト高になる。
【０００３】
これら問題点を解決するため、発酵法によりヒアルロン酸を製造することが行なわれている。ヒアルロン酸がストレプトコッカス属のある群のバクテリアにより生産されることは、古くから知られ、多くの報告がある（非特許文献１及び特許文献１）。発酵法によって製造されるヒアルロン酸は、抽出法と比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値は大きい。
【０００４】
しかしながら、発酵液には、低分子化合物が不純物として存在することから、それらを分離除去して高純度のヒアルロン酸製品を得る方法が検討されてきた。例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を分離し、さらにフロリジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を吸着させる方法がある（特許文献２）。また、マクロレティキュラー型アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱物質、蛋白質等を除去するヒアルロン酸の精製法が開示されている（特許文献３）。しかしながら、これらの精製法により得られたヒアルロン酸は、エンドトキシンの除去が不十分であり、医薬として使用することができなかった。
【０００５】
本発明者らは、ヒアルロン酸類を精製する方法についてさらなる検討を行い、エンドトキシン、蛋白質、核酸等を除去するためにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法（特許文献４）及びヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後、シリカゲルに接触させる方法について提案した（特許文献５）。しかしながら、これらの方法においても、工業的規模で医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには、（ｉ）不純物のアルミナ、シリカゲル等への吸着量が少ないので、アルミナやシリカゲルを多量に消費する、（ｉｉ）ヒアルロン酸類の回収率が低い、などの課題が残っていた。
【０００６】
また、強塩基性イオン交換樹脂を用いてエンドトキシンを含む溶液からヒアルロン酸を精製する方法が開示されている（特許文献６）。しかしながら、この方法を用いてエンドトキシンを除去する場合、プレチャージした後にＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、分画するという操作が必要となり、エンドトキシン除去を目的とするプロセスとしては操作が煩雑かつ効率が悪いので、工業的規模でヒアルロン酸類を精製するのには適さなかった。
【０００７】
さらに、ポリカチオンのマルチアタッチメント効果を利用するエンドトキシン吸着除去剤等も開発されている。しかしながら、これらのエンドトキシン吸着除去剤は、電荷の相違を利用してエンドトキシンを含む蛋白質含有液から蛋白質を精製する目的で開発されたものであり、ヒアルロン酸がエンドトキシンと同様にポリアニオンであることから、ヒアルロン酸含有液からのエンドトキシン除去効率は、蛋白質のそれと同程度を期待することはできない（非特許文献２）。
【特許文献１】特開昭６３−１２３３９２号公報
【特許文献２】公表特許昭６２−５０１４７１号公報
【特許文献３】特開昭６３−１２２９３号公報
【特許文献４】特開平１−３１３５０３号公報
【特許文献５】特開平２−１０３２０４号公報
【特許文献６】国際公開２００２−００４４７１号公報
【非特許文献１】ジェービー・ウールコック（J. B. Woolcock）, ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（J. Gen. Microbiol.）, 85, 372-375（1976）
【非特許文献２】高分子論文集, 64, 821 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、工業的規模で実施可能な方法であって、かつ医薬として利用可能なヒアルロン酸類を精製できる方法の開発が望まれていた。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便に医薬として利用可能なヒアルロン酸類を分離・精製することができ、工業的規模で実施できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヒアルロン酸類を高純度に精製する簡便な方法の開発という課題について、これまでにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法、ヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後にシリカゲルに接触させる方法、強塩基性イオン交換樹脂を用いてヒアルロン酸類を精製する方法などを検討してきた。しかしながら、何れの方法も、工業的規模で利用するには操作が煩雑、もしくは、医薬として使用できる程度までヒアルロン酸類を精製できないなど、課題を解決するには至らなかった。
そこで、本発明者らは、主として研究されている、電荷の違いを利用したヒアルロン酸類の精製方法から発想を転換し、当業者の間では、通常水系で使用されないこと及び担体が比較的高価であるという事実によりヒアルロン酸の精製には適さないと考えられていた逆相クロマトグラフィーを用いてヒアルロン酸類の精製を試みた。その結果、逆相クロマトグラフィーを用いてエンドトキシンを含むヒアルロン酸類含有液からヒアルロン酸類の精製が可能であることが見出された。さらなる鋭意検討の結果、従来の方法に比較して非常に効率的にその目的が達せられる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法であって、前記精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程を含んでなり、前記逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法を提供する。本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩が精製される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、エンドトキシン、蛋白質、核酸等の除去された高純度なヒアルロン酸類を、簡便かつ高収率かつ工業的規模で製造することができる。またこの方法で得られたヒアルロン酸類は医薬用途、特にエンドトキシン量が低いことが必須となる関節への注射剤などに用いることができる。
【００１２】
さらに、本発明は、逆相クロマトグラフィー用充填剤として、担体に置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものを用いてもよい。置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させた担体を用いることにより、より高純度なヒアルロン酸及び／又はその塩の精製が実施可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態のヒアルロン酸類は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、又はヒアルロン酸とヒアルロン酸の塩の混合物を包含してもよい。ヒアルロン酸類の由来は特に限定されないが、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品の品質を一定に保持しやすい発酵法により生産されたものが好ましい。
【００１４】
発酵法によるヒアルロン酸はストレプトコッカス属のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。発酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、または、特許文献１に記したストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。
【００１５】
そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物をグルコース、シュークロース等の炭素源、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩等を用いた培地中で好気的に培養して得られる培養液を、ヒアルロン酸が０．１〜５ｇ／Ｌ濃度になるように希釈後、既知の方法、例えば遠心分離、濾過、凝集剤、カーボン、ゼオライト等などの方法で除菌した液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることによりヒアルロン酸類を精製することが可能である。
【００１６】
医薬品として使用できるヒアルロン酸類を製造する場合には、上記の除菌液を更に精製処理した後に逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが望ましい。この精製処理としては、透析処理による低分子化合物の除去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去、アルコール、アセトン、ジオキサン等の水溶性有機溶剤添加による析出分離後の再溶解、等を挙げることができ、これら処理は、単独あるいは組み合わせて実施することができる。ここで、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類は、エンドトキシン、蛋白質、核酸等の不純物を実質的に含有しない。なお、「実質的に含有しない」とは、不純物が一分子も含まれないことを意味するのではなく、不純物が含まれていないと当業者に認識される程度（現在の技術では検出できない程度、もしくは目的の用途に影響が出ない程度）を意味するものである。仮に、将来的に分析技術が進歩して分子単位での検出が可能になったとしても、本願における「実質的に含有しない」とは、本願における記載に基づいて解釈すべきである。例えば、「医薬として使用できる」ヒアルロン酸類中の蛋白質含有率は、０．０５％以下であることを意味する。また、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類中のエンドトキシン含有量は、例えば、ヒアルロン酸１ｍｇ中０．０５ＥＵ以下（０．０５ＥＵ／ｍｇ）、好ましくは０．０３ＥＵ／ｍｇ以下、０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、０．００５ＥＵ／ｍｇ以下、０．００３ＥＵ／ｍｇ以下、０．００２ＥＵ／ｍｇ以下、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ以下である。また、「関節への注射剤として使用できる」ヒアルロン酸類中のエンドトキシン含有量は、０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、又は０．００５ＥＵ／ｍｇ以下である。また、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類中の核酸含有量は、０．１％以下、もしくは検出限界以下の含有量である。
【００１７】
本実施形態において用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体は、シリカゲル又は、ポリビニルアルコール等の合成樹脂の球状又は破砕状のものが好ましく、その平均粒径は、１μｍから約１００μｍのものが好ましく、より好ましくは１０μｍから約５０μｍのものである。当業者であれば、平均粒径が小さいほど単位長あたりのカラム理論段数は大きくなるが、カラムの圧力損失も大きくなることなどを考慮して、適した粒径を選択することができる。また、本実施形態において用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に、置換又は未置換の炭化水素基を結合させたものであり、特に鎖長が炭素数８以上のものを用いることを特徴とする。その例として、オクチル基、オクタデシル基、およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、炭化水素基の鎖長の炭素数が大きいほど強い保持力を有するので、当業者であれば、炭化水素基の鎖長の炭素数を調節することで、固定相における保持力を調節することができる。また、官能基として、フェニル基、ジオール基、ニトリル基、アミノ基などを用いて固定相の極性を調節することもできる。
【００１８】
鎖長が炭素数8以下の置換又は未置扱の炭化水素基として、例えばトリメチル基、ブチル基、フェニル基、シアノプロピル基、アミノプロピル基等が挙げられるが、後述の実施例に示すように、これらはヒアルロン酸の精製には適さない。
【００１９】
本実施形態に適するものとして、例えば市販されているオクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤〔YMC・GEL C8−120−S5（YMC製）〕、〔YMC・GEL C8−300−S5（YMC製）〕、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤〔YMC・GEL ODS−AM−120−S50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−A120−S30／50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−AQ60−S50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−AQ−120−S50（YMC製）〕、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた充填剤〔TSK-GEL Octadecyl−4PW（30）（東ソー製）〕などが挙げられる。これらの充填剤は、品質が安定しており、かつ入手が容易である点で適しているが、これらに制限されるものではない。
【００２０】
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる溶媒は、水及び有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）もしくはＤＭＳＯなどの混合溶媒系に塩を含むものが一般的に用いられる。水を用いることにより、溶媒の極性が増大することから、本実施形態においては、塩を含むヒアルロン酸類水溶液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが特に良い。
【００２１】
本実施形態では、硫安、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を用いて、溶媒のｐＨを調節することができるが、これらに制限されるものではない。
【００２２】
溶媒の塩濃度により、保持力が変化することが知られているが、本実施形態において、ヒアルロン酸類含有液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるに当たり、ヒアルロン酸類含有液は、水系で、塩濃度は５〜３０００ｍＭがよく、より好ましくは、１０〜１０００ｍＭがよい。
【００２３】
また、溶媒のｐＨを調整することにより、溶質のイオン化を制御することができるが、本実施形態のｐＨは、３〜８が好ましく、６〜８が特に好ましい。
【００２４】
また、温度を一定にすることにより安定した成績を得ることが可能であるが、本実施形態における温度は０〜４０℃が好ましく、より好ましくは１０〜３０℃がよい。
【００２５】
また、ヒアルロン酸類の濃度を調整することにより、効率的に精製することができるが、本実施形態のヒアルロン酸類の濃度は、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．５〜２ｇ／Ｌである。
【００２６】
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる方法としては、ヒアルロン酸類含有液に逆相クロマトグラフィー用充填剤を添加して、バッチ式で撹拌する方法と、充填塔等に充填後にヒアルロン酸類含有液を通液処理する方法、またその組合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択により、１回の処理で十分である。
【００２７】
エンドトキシン、蛋白質、核酸等の不純物を除去する能力の低下した逆相クロマトグラフィー用充填剤は、通常の脱着、洗浄、再生処理で簡単に初期の性能に回復させることが出来る。アルカリ洗浄を行う場合、担体の材質としてシリカゲルを用いると、シリカゲルは塩基性条件下で溶解してしまうことから、合成樹脂を用いることが好ましい。
【００２８】
本実施形態の方法は、工業的規模で実施可能であるが、ここでいう「工業的規模」とは、例えば、少なくとも１００ｋｇ／年以上の規模でヒアルロン酸類を精製できることをいう。もしくは、０．１ｋｇ／時間以上の精製効率でヒアルロン酸類を精製可能であることをいう。また、コストを考慮しても、産業的に利用可能であることをいう。
【００２９】
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させたヒアルロン酸類含有液は、必要ならば、pH調整や孔径０．２〜１μｍのメンブレンフィルターを用いる精密濾過を行なった後、有機溶剤沈殿法で分離後、真空乾燥等により、乾燥品とすることができる。
【００３０】
以下に本実施形態の精製方法の作用効果について説明する。
本実施形態の精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数8以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩が精製される。
【００３１】
また、実施形態の精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が、その他の塩を含む場合であってもヒアルロン酸及び／又はその塩を精製できる。そのため、鶏の鶏冠等からの抽出物や発酵法により生産されたヒアルロン酸及び又はその塩の含有液のｐＨをその他の塩で調節することができ、効率的にヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。
【００３２】
さらに、実施形態の精製方法は、エンドトキシンを含むヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液から、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。そのため、例えば、ヒアルロン酸及び／又はその塩の生産においてエンドトキシンが混入する場合であっても、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。
【００３３】
さらに、実施形態の精製方法は、逆相クロマトグラフィー用充填剤として、担体に置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものを用いてもよい。置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させた担体を用いることにより、より高純度なヒアルロン酸及び／又はその塩の精製が実施可能となる。
【００３４】
さらに、実施形態の精製方法は、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体として合成樹脂を用いてもよい。合成樹脂は幅広いｐＨの範囲で用いることができるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製において、移動相として塩基性溶媒や酸性溶媒を用いることもできる。
【００３５】
さらに、実施形態の精製方法は、医薬として使用できるヒアルロン酸を精製することもできる。本発明の精製方法は、エンドトキシン、蛋白質、核酸等を除去することができるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩を医薬用途に用いることができる。
【００３６】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示に過ぎない。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を参考例及び実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
［参考例］
粗製ヒアルロン酸ナトリウムの製造
ストレプトコツカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）を用いて培養した培養液１５Ｌを純水で５０Ｌに希釈し（ヒアルロン酸ナトリウム濃度１．１０ｇ／Ｌ）、遠心分離、ホローファイバー型限外濾過を行い、菌体と培地成分を除いた。
このヒアルロン酸類含有液５００ｍＬに食塩１５ｇを溶解、ｐＨ７に調節後、エタノール７５０ｍＬで析出、エタノール１００ｍＬで洗浄を行い、４０℃で真空乾燥し、０．５ｇの粗製ヒアルロン酸ナトリウムを得た。
分析結果を表１に示す。
【００３８】
［実施例１］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、オクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL C8−120−S5、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。
その後、０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液に食塩３０ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２Ｌで析出し、エタノール３００ｍＬでの洗浄を３回行い４０℃で真空乾燥して０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
【００３９】
［実施例２］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。
得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００４０】
［比較例１］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの３０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液に溶解し、アルミナ（昭和電工製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後、０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
【００４１】
［比較例２］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、ブチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL C4-120-S5、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。
その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
［表１］
注１）ヒアルロン酸ナトリウム１ｍｇあたり
【００４２】
［実施例３］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの３０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。
得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
【００４３】
［実施例４］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの水溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
【００４４】
［実施例５］
内径０．８ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を２０ｍＬ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム水溶液の順に平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを１Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２０（ｈ−１）で通液した。
得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
【００４５】
［実施例６］
内径５ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を２００ｍＬ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム水溶液の順に平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２０（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
【００４６】
［実施例７］
内径５ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（TSK−GEL Octadecyl−4PW（30）、東ソー製）を２００ｍＬ充填し、３％塩化ナトリウム水溶液で平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム２０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２５（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
【００４７】
［実施例８］
実施例６で使用したカラムに０．４％水酸化ナトリウム溶液を通液し、同溶液に２４時間浸漬した。３％塩化ナトリウム水溶液で平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム２０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムに再度ＳＶ＝２５（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
［表２］
注１）ヒアルロン酸ナトリウム１ｍｇあたり
【００４８】
測定法
１）蛋白質：精製ヒアルロン酸ナトリウムを０．１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解しローリー法にて行った。
２）エンドトキシン：生化学工業社製トキシカラーシステムにより処理液を直接比色分析することにより行った。
３）核酸：０．１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
（考察）
上記実施例は、逆相クロマトグラフィーを用いることによって、医薬として利用可能なヒアルロン酸類を分離・精製することができることを示すものである。さらに、逆相クロマトグラフィーを用いることにより、粗製ヒアルロン酸類含有液からワンパスで医薬として使用できるヒアルロン酸類が得られるため、煩雑な操作を必要とせず、効率的であり、工業的規模での精製にも適している。また、逆相クロマトグラフィーを用いた精製方法は、０．１ｋｇ／時間以上でヒアルロン酸類を精製可能であり、工業的規模で実施可能であった。
【００５０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液からヒアルロン酸及び／又はその塩（以下、総称してヒアルロン酸類という）を分離・精製する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用途が開かれている。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、工業規模では、鶏の鶏冠等からの抽出物により製造されているが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入したり、組織内に含まれるヒアルロニダーゼ等によって低分子量化されやすい。従って高分子量で高純度に精製されたものは、コスト高になる。
【０００３】
これら問題点を解決するため、発酵法によりヒアルロン酸を製造することが行なわれている。ヒアルロン酸がストレプトコッカス属のある群のバクテリアにより生産されることは、古くから知られ、多くの報告がある（非特許文献１及び特許文献１）。発酵法によって製造されるヒアルロン酸は、抽出法と比べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値は大きい。
【０００４】
しかしながら、発酵液には、低分子化合物が不純物として存在することから、それらを分離除去して高純度のヒアルロン酸製品を得る方法が検討されてきた。例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を分離し、さらにフロリジルのようなケイ酸マグネシウムのカラムに不純物を吸着させる方法がある（特許文献２）。また、マクロレティキュラー型アニオン交換樹脂を用いて、発酵液から発熱物質、蛋白質等を除去するヒアルロン酸の精製法が開示されている（特許文献３）。しかしながら、これらの精製法により得られたヒアルロン酸は、エンドトキシンの除去が不十分であり、医薬として使用することができなかった。
【０００５】
本発明者らは、ヒアルロン酸類を精製する方法についてさらなる検討を行い、エンドトキシン、蛋白質、核酸等を除去するためにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法（特許文献４）及びヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後、シリカゲルに接触させる方法について提案した（特許文献５）。しかしながら、これらの方法においても、工業的規模で医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには、（ｉ）不純物のアルミナ、シリカゲル等への吸着量が少ないので、アルミナやシリカゲルを多量に消費する、（ｉｉ）ヒアルロン酸類の回収率が低い、などの課題が残っていた。
【０００６】
また、強塩基性イオン交換樹脂を用いてエンドトキシンを含む溶液からヒアルロン酸を精製する方法が開示されている（特許文献６）。しかしながら、この方法を用いてエンドトキシンを除去する場合、プレチャージした後にＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、分画するという操作が必要となり、エンドトキシン除去を目的とするプロセスとしては操作が煩雑かつ効率が悪いので、工業的規模でヒアルロン酸類を精製するのには適さなかった。
【０００７】
さらに、ポリカチオンのマルチアタッチメント効果を利用するエンドトキシン吸着除去剤等も開発されている。しかしながら、これらのエンドトキシン吸着除去剤は、電荷の相違を利用してエンドトキシンを含む蛋白質含有液から蛋白質を精製する目的で開発されたものであり、ヒアルロン酸がエンドトキシンと同様にポリアニオンであることから、ヒアルロン酸含有液からのエンドトキシン除去効率は、蛋白質のそれと同程度を期待することはできない（非特許文献２）。
【特許文献１】特開昭６３−１２３３９２号公報
【特許文献２】公表特許昭６２−５０１４７１号公報
【特許文献３】特開昭６３−１２２９３号公報
【特許文献４】特開平１−３１３５０３号公報
【特許文献５】特開平２−１０３２０４号公報
【特許文献６】国際公開２００２−００４４７１号公報
【非特許文献１】ジェービー・ウールコック（J. B. Woolcock）, ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（J. Gen. Microbiol.）, 85, 372-375（1976）
【非特許文献２】高分子論文集, 64, 821 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、工業的規模で実施可能な方法であって、かつ医薬として利用可能なヒアルロン酸類を精製できる方法の開発が望まれていた。本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便に医薬として利用可能なヒアルロン酸類を分離・精製することができ、工業的規模で実施できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヒアルロン酸類を高純度に精製する簡便な方法の開発という課題について、これまでにヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させる方法、ヒアルロン酸類含有液をアルミナに接触させた後にシリカゲルに接触させる方法、強塩基性イオン交換樹脂を用いてヒアルロン酸類を精製する方法などを検討してきた。しかしながら、何れの方法も、工業的規模で利用するには操作が煩雑、もしくは、医薬として使用できる程度までヒアルロン酸類を精製できないなど、課題を解決するには至らなかった。
そこで、本発明者らは、主として研究されている、電荷の違いを利用したヒアルロン酸類の精製方法から発想を転換し、当業者の間では、通常水系で使用されないこと及び担体が比較的高価であるという事実によりヒアルロン酸の精製には適さないと考えられていた逆相クロマトグラフィーを用いてヒアルロン酸類の精製を試みた。その結果、逆相クロマトグラフィーを用いてエンドトキシンを含むヒアルロン酸類含有液からヒアルロン酸類の精製が可能であることが見出された。さらなる鋭意検討の結果、従来の方法に比較して非常に効率的にその目的が達せられる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法であって、前記精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程を含んでなり、前記逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法を提供する。本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩が精製される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、エンドトキシン、蛋白質、核酸等の除去された高純度なヒアルロン酸類を、簡便かつ高収率かつ工業的規模で製造することができる。またこの方法で得られたヒアルロン酸類は医薬用途、特にエンドトキシン量が低いことが必須となる関節への注射剤などに用いることができる。
【００１２】
さらに、本発明は、逆相クロマトグラフィー用充填剤として、担体に置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものを用いてもよい。置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させた担体を用いることにより、より高純度なヒアルロン酸及び／又はその塩の精製が実施可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態のヒアルロン酸類は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、又はヒアルロン酸とヒアルロン酸の塩の混合物を包含してもよい。ヒアルロン酸類の由来は特に限定されないが、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品の品質を一定に保持しやすい発酵法により生産されたものが好ましい。
【００１４】
発酵法によるヒアルロン酸はストレプトコッカス属のバクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。発酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、または、特許文献１に記したストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄９０２７号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。
【００１５】
そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物をグルコース、シュークロース等の炭素源、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩等を用いた培地中で好気的に培養して得られる培養液を、ヒアルロン酸が０．１〜５ｇ／Ｌ濃度になるように希釈後、既知の方法、例えば遠心分離、濾過、凝集剤、カーボン、ゼオライト等などの方法で除菌した液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることによりヒアルロン酸類を精製することが可能である。
【００１６】
医薬品として使用できるヒアルロン酸類を製造する場合には、上記の除菌液を更に精製処理した後に逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが望ましい。この精製処理としては、透析処理による低分子化合物の除去、精密濾過処理による水不溶微粒子の除去、アルコール、アセトン、ジオキサン等の水溶性有機溶剤添加による析出分離後の再溶解、等を挙げることができ、これら処理は、単独あるいは組み合わせて実施することができる。ここで、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類は、エンドトキシン、蛋白質、核酸等の不純物を実質的に含有しない。なお、「実質的に含有しない」とは、不純物が一分子も含まれないことを意味するのではなく、不純物が含まれていないと当業者に認識される程度（現在の技術では検出できない程度、もしくは目的の用途に影響が出ない程度）を意味するものである。仮に、将来的に分析技術が進歩して分子単位での検出が可能になったとしても、本願における「実質的に含有しない」とは、本願における記載に基づいて解釈すべきである。例えば、「医薬として使用できる」ヒアルロン酸類中の蛋白質含有率は、０．０５％以下であることを意味する。また、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類中のエンドトキシン含有量は、例えば、ヒアルロン酸１ｍｇ中０．０５ＥＵ以下（０．０５ＥＵ／ｍｇ）、好ましくは０．０３ＥＵ／ｍｇ以下、０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、０．００５ＥＵ／ｍｇ以下、０．００３ＥＵ／ｍｇ以下、０．００２ＥＵ／ｍｇ以下、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ以下である。また、「関節への注射剤として使用できる」ヒアルロン酸類中のエンドトキシン含有量は、０．０１ＥＵ／ｍｇ以下、又は０．００５ＥＵ／ｍｇ以下である。また、「医薬品として使用できる」ヒアルロン酸類中の核酸含有量は、０．１％以下、もしくは検出限界以下の含有量である。
【００１７】
本実施形態において用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体は、シリカゲル又は、ポリビニルアルコール等の合成樹脂の球状又は破砕状のものが好ましく、その平均粒径は、１μｍから約１００μｍのものが好ましく、より好ましくは１０μｍから約５０μｍのものである。当業者であれば、平均粒径が小さいほど単位長あたりのカラム理論段数は大きくなるが、カラムの圧力損失も大きくなることなどを考慮して、適した粒径を選択することができる。また、本実施形態において用いられる逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に、置換又は未置換の炭化水素基を結合させたものであり、特に鎖長が炭素数８以上のものを用いることを特徴とする。その例として、オクチル基、オクタデシル基、およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、炭化水素基の鎖長の炭素数が大きいほど強い保持力を有するので、当業者であれば、炭化水素基の鎖長の炭素数を調節することで、固定相における保持力を調節することができる。また、官能基として、フェニル基、ジオール基、ニトリル基、アミノ基などを用いて固定相の極性を調節することもできる。
【００１８】
鎖長が炭素数8以下の置換又は未置扱の炭化水素基として、例えばトリメチル基、ブチル基、フェニル基、シアノプロピル基、アミノプロピル基等が挙げられるが、後述の実施例に示すように、これらはヒアルロン酸の精製には適さない。
【００１９】
本実施形態に適するものとして、例えば市販されているオクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤〔YMC・GEL C8−120−S5（YMC製）〕、〔YMC・GEL C8−300−S5（YMC製）〕、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤〔YMC・GEL ODS−AM−120−S50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−A120−S30／50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−AQ60−S50（YMC製）〕、〔YMC・GEL ODS−AQ−120−S50（YMC製）〕、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた充填剤〔TSK-GEL Octadecyl−4PW（30）（東ソー製）〕などが挙げられる。これらの充填剤は、品質が安定しており、かつ入手が容易である点で適しているが、これらに制限されるものではない。
【００２０】
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる溶媒は、水及び有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）もしくはＤＭＳＯなどの混合溶媒系に塩を含むものが一般的に用いられる。水を用いることにより、溶媒の極性が増大することから、本実施形態においては、塩を含むヒアルロン酸類水溶液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させることが特に良い。
【００２１】
本実施形態では、硫安、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を用いて、溶媒のｐＨを調節することができるが、これらに制限されるものではない。
【００２２】
溶媒の塩濃度により、保持力が変化することが知られているが、本実施形態において、ヒアルロン酸類含有液を逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるに当たり、ヒアルロン酸類含有液は、水系で、塩濃度は５〜３０００ｍＭがよく、より好ましくは、１０〜１０００ｍＭがよい。
【００２３】
また、溶媒のｐＨを調整することにより、溶質のイオン化を制御することができるが、本実施形態のｐＨは、３〜８が好ましく、６〜８が特に好ましい。
【００２４】
また、温度を一定にすることにより安定した成績を得ることが可能であるが、本実施形態における温度は０〜４０℃が好ましく、より好ましくは１０〜３０℃がよい。
【００２５】
また、ヒアルロン酸類の濃度を調整することにより、効率的に精製することができるが、本実施形態のヒアルロン酸類の濃度は、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．５〜２ｇ／Ｌである。
【００２６】
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる方法としては、ヒアルロン酸類含有液に逆相クロマトグラフィー用充填剤を添加して、バッチ式で撹拌する方法と、充填塔等に充填後にヒアルロン酸類含有液を通液処理する方法、またその組合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択により、１回の処理で十分である。
【００２７】
エンドトキシン、蛋白質、核酸等の不純物を除去する能力の低下した逆相クロマトグラフィー用充填剤は、通常の脱着、洗浄、再生処理で簡単に初期の性能に回復させることが出来る。アルカリ洗浄を行う場合、担体の材質としてシリカゲルを用いると、シリカゲルは塩基性条件下で溶解してしまうことから、合成樹脂を用いることが好ましい。
【００２８】
本実施形態の方法は、工業的規模で実施可能であるが、ここでいう「工業的規模」とは、例えば、少なくとも１００ｋｇ／年以上の規模でヒアルロン酸類を精製できることをいう。もしくは、０．１ｋｇ／時間以上の精製効率でヒアルロン酸類を精製可能であることをいう。また、コストを考慮しても、産業的に利用可能であることをいう。
【００２９】
逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させたヒアルロン酸類含有液は、必要ならば、pH調整や孔径０．２〜１μｍのメンブレンフィルターを用いる精密濾過を行なった後、有機溶剤沈殿法で分離後、真空乾燥等により、乾燥品とすることができる。
【００３０】
以下に本実施形態の精製方法の作用効果について説明する。
本実施形態の精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、担体に鎖長が炭素数8以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩が精製される。
【００３１】
また、実施形態の精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が、その他の塩を含む場合であってもヒアルロン酸及び／又はその塩を精製できる。そのため、鶏の鶏冠等からの抽出物や発酵法により生産されたヒアルロン酸及び又はその塩の含有液のｐＨをその他の塩で調節することができ、効率的にヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。
【００３２】
さらに、実施形態の精製方法は、エンドトキシンを含むヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液から、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。そのため、例えば、ヒアルロン酸及び／又はその塩の生産においてエンドトキシンが混入する場合であっても、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することができる。
【００３３】
さらに、実施形態の精製方法は、逆相クロマトグラフィー用充填剤として、担体に置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものを用いてもよい。置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させた担体を用いることにより、より高純度なヒアルロン酸及び／又はその塩の精製が実施可能となる。
【００３４】
さらに、実施形態の精製方法は、逆相クロマトグラフィー用充填剤の担体として合成樹脂を用いてもよい。合成樹脂は幅広いｐＨの範囲で用いることができるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製において、移動相として塩基性溶媒や酸性溶媒を用いることもできる。
【００３５】
さらに、実施形態の精製方法は、医薬として使用できるヒアルロン酸を精製することもできる。本発明の精製方法は、エンドトキシン、蛋白質、核酸等を除去することができるため、ヒアルロン酸及び／又はその塩を医薬用途に用いることができる。
【００３６】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示に過ぎない。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を参考例及び実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
［参考例］
粗製ヒアルロン酸ナトリウムの製造
ストレプトコツカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）を用いて培養した培養液１５Ｌを純水で５０Ｌに希釈し（ヒアルロン酸ナトリウム濃度１．１０ｇ／Ｌ）、遠心分離、ホローファイバー型限外濾過を行い、菌体と培地成分を除いた。
このヒアルロン酸類含有液５００ｍＬに食塩１５ｇを溶解、ｐＨ７に調節後、エタノール７５０ｍＬで析出、エタノール１００ｍＬで洗浄を行い、４０℃で真空乾燥し、０．５ｇの粗製ヒアルロン酸ナトリウムを得た。
分析結果を表１に示す。
【００３８】
［実施例１］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、オクチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL C8−120−S5、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。
その後、０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液に食塩３０ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２Ｌで析出し、エタノール３００ｍＬでの洗浄を３回行い４０℃で真空乾燥して０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
【００３９】
［実施例２］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。
得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表１に示す。
【００４０】
［比較例１］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの３０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液に溶解し、アルミナ（昭和電工製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後、０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
【００４１】
［比較例２］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、ブチル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL C4-120-S5、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。
その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液は、実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表１に示す。
［表１］
注１）ヒアルロン酸ナトリウム１ｍｇあたり
【００４２】
［実施例３］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの３０Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。
得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
【００４３】
［実施例４］
参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを、１Ｌの水溶液に溶解し、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を３０ｇ添加して３０分撹拌した。その後０．４５μｍの精密濾過膜で濾過処理を行なった。得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
【００４４】
［実施例５］
内径０．８ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を２０ｍＬ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム水溶液の順に平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１ｇを１Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２０（ｈ−１）で通液した。
得られた液を実施例１と同様に処理し、０．９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果を表２に示す。
【００４５】
［実施例６］
内径５ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基をシリカゲルに化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（YMC・GEL ODS−AQ−120−S50、YMC製）を２００ｍＬ充填し、エタノール、水、塩化ナトリウム水溶液の順に平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム１０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２０（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
【００４６】
［実施例７］
内径５ｃｍ、高さ１０ｃｍのガラスカラムに、オクタデシル基を合成樹脂に化学的に結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤（TSK−GEL Octadecyl−4PW（30）、東ソー製）を２００ｍＬ充填し、３％塩化ナトリウム水溶液で平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム２０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムにＳＶ＝２５（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
【００４７】
［実施例８］
実施例６で使用したカラムに０．４％水酸化ナトリウム溶液を通液し、同溶液に２４時間浸漬した。３％塩化ナトリウム水溶液で平衡化し、参考例で得られた粗製ヒアルロン酸ナトリウム２０ｇを１０Ｌの５００ｍＭの塩化ナトリウム溶液に溶解し、上記カラムに再度ＳＶ＝２５（ｈ−１）で通液した。
得られた液に食塩３００ｇを溶解し、ｐＨ７に調整後、エタノール２０Ｌで析出し、エタノール３Ｌでの洗浄を３回行い、４０℃で真空乾燥して、９ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
分析結果を表２に示す。
［表２］
注１）ヒアルロン酸ナトリウム１ｍｇあたり
【００４８】
測定法
１）蛋白質：精製ヒアルロン酸ナトリウムを０．１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解しローリー法にて行った。
２）エンドトキシン：生化学工業社製トキシカラーシステムにより処理液を直接比色分析することにより行った。
３）核酸：０．１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４９】
（考察）
上記実施例は、逆相クロマトグラフィーを用いることによって、医薬として利用可能なヒアルロン酸類を分離・精製することができることを示すものである。さらに、逆相クロマトグラフィーを用いることにより、粗製ヒアルロン酸類含有液からワンパスで医薬として使用できるヒアルロン酸類が得られるため、煩雑な操作を必要とせず、効率的であり、工業的規模での精製にも適している。また、逆相クロマトグラフィーを用いた精製方法は、０．１ｋｇ／時間以上でヒアルロン酸類を精製可能であり、工業的規模で実施可能であった。
【００５０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法であって、前記精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程を含んでなり、前記逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が、さらに他の塩を含むことを特徴とする、請求項1に記載の精製方法。
【請求項３】
エンドトキシンを含むヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液から、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記逆相クロマトグラフィー用充填剤が、担体に、置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものであることを特徴とする、請求項１ないし３に記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項５】
前記逆相クロマトグラフィー用充填剤が、担体として合成樹脂を用いたものであることを特徴とする、請求項１ないし４に記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項６】
前記精製方法により精製されたヒアルロン酸及び／又はその塩が、医薬として使用できることを特徴とする、請求項１ないし５に記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項１】
ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法であって、前記精製方法は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液を、逆相クロマトグラフィー用充填剤に接触させる工程を含んでなり、前記逆相クロマトグラフィー用充填剤は、担体に鎖長が炭素数８以上の置換又は未置換の炭化水素基を結合させた逆相クロマトグラフィー用充填剤であることを特徴とする、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液が、さらに他の塩を含むことを特徴とする、請求項1に記載の精製方法。
【請求項３】
エンドトキシンを含むヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液から、ヒアルロン酸及び／又はその塩を精製することを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記逆相クロマトグラフィー用充填剤が、担体に、置換又は未置換のオクタデシル基及び／又はこれらの末端を改変した官能基を結合させたものであることを特徴とする、請求項１ないし３に記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項５】
前記逆相クロマトグラフィー用充填剤が、担体として合成樹脂を用いたものであることを特徴とする、請求項１ないし４に記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項６】
前記精製方法により精製されたヒアルロン酸及び／又はその塩が、医薬として使用できることを特徴とする、請求項１ないし５に記載のヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【公開番号】特開２０１０−５３２５９（Ｐ２０１０−５３２５９Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２０５５３（Ｐ２００８−２２０５５３）
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（０００００３２９６）電気化学工業株式会社 (1,539)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（０００００３２９６）電気化学工業株式会社 (1,539)
【Ｆターム（参考）】
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