ヒトアンジオポイエチン−２に対する高親和性ヒト抗体
本発明は、アンジオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）に結合する抗体及びその使用方法を供する。本発明のいくつかの実施態様によると、抗体はヒトＡｎｇ−２に結合する完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、とりわけ、血管形成を含む１つ又はそれ以上のＡｎｇ−２の生物学的活性に関わる疾患又は障害の処置のために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的な抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、生物学的過程であり、それによって新しい血管が形成される。異常な血管形成は、例えば、増殖性網膜症、関節リュウマチ及び乾癬を含むいくつかの病状（disease condition）と関係がある。また、血管形成は、腫瘍の成長及び維持のために重要であることが十分に確立されている。アンジオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）は、Ｔｉｅ−２受容体（Ｔｉｅ−２）に対するリガンドであり、血管形成に関与することが示されている。Ａｎｇ−２は、業界ではＡｎｇ−２リガンドとも呼ばれる（特許文献１；非特許文献１）。
【０００３】
Ａｎｇ−２に結合する抗体及び他のペプチド性インヒビターは、特許文献２、３、４、５及び６に記載されている。業界では、血管形成によって引き起こされる又は悪化する疾患（disease）及び病態（condition）を処置する（treat）ために使用できる、Ａｎｇ−２抗体を含む新規なＡｎｇ−２調節剤が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，６４３，７５５号
【特許文献２】米国特許第６，１６６，１８５号
【特許文献３】米国特許第７，５２１，０５３号
【特許文献４】米国特許第７，２０５，２７５号
【特許文献５】米国特許第２００６／００１８９０９号
【特許文献６】米国特許第２００６／０２４６０７１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yancopoulos et al., 2000, Nature 407:242-248
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトＡｎｇ−２に結合するヒト抗体を提供する。本発明者らは、さまざまな証拠及び研究から見て、関連する分子のＡｎｇ−１に結合しない又は拮抗しないＡｎｇ−２インヒビターの必要性を認識してきた。例えば、これまでの研究は、Ａｎｇ−１が、止血（例えば、Li et al., 2001, Thrombosis and Haemostasis 85:191-374を参照）及び血漿漏出に対して成人血管系の防御（例えば、Thurston et al., 2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston et al., 1999, Science 286:2511-2514を参照）に果たす有益な役割を示し又は示唆してきた。このことから、本発明者らは、或る抗脈管形成による治療状況においては、Ａｎｇ−１活性を保存することが有利である可能性を認識した。従って、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合するが、Ａｎｇ−１には実質的に結合しない抗体を提供する。本発明はまた、Ａｎｇ−２とその受容体Ｔｉｅ−２の間の相互作用を阻害するが、Ａｎｇ−１とＴｉｅ−２の間の相互作用を実質的に阻害しない抗体を包含する。本発明の抗体は、とりわけ、Ａｎｇ−２の血管形成促進活性を阻害するため及び血管形成の過程によって起こされる又はそれに関連する疾患及び障害を処置するために有用である。
【０００７】
本発明の抗体は、完全（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であってもよく又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖフラグメント）だけを含んでもよく、及び機能性に影響を与えるように、例えば残存エフェクター機能を排除するように改変されてもよい。
【０００８】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４７４、４７８、４８２、４９８、５０２、５０６、５１４及び５１６から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号１８、４２、６６、１６２、２１０、２６６及び４３４から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【０００９】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、４５６、４６６、４７６、４８０、４９０、５００及び５０４から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号２０、４４、６８、１６４、２１２、２７４、及び４４２から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００１０】
特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００及び５０２／５０４から成るグループから選択されるＨＣＶＲとＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列対を含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１８／２０、４２／４４、６６／６８、１６２／１６４、２１０／２１２、２６６／２７４、及び４３４／４４２のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む。
【００１１】
次の態様では、本発明は、配列番号８、３２、５６、８０、１０４、１２８、１５２、１７６、２００、２２４、２４８、２７２、２９６、３２０、３４４、３６８、３９２、４１６、４４０、４６４、４８８及び５１２から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；又は配列番号１６、４０、６４、８８、１１２、１３６、１６０、１８４、２０８、２３２、２５６、２８０、３０４、３２８、３５２、３７６、４００、４２４、４４８、４７２及び４９６から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
或る実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、３２／４０、５６／６４、８０／８８、１０４／１１２、１２８／１３６、１５２／１６０、１７６／１８４、２００／２０８、２２４／２３２、２４８／２５６、２７２／２８０、２９６／３０４、３２０／３２８、３４４／３５２、３６８／３７６、３９２／４００、４１６／４２４、４４０／４４８、４６４／４７２、及び ４８８／４９６から成るグループから選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、３２／４０、５６／６４、１５２／１６０、２００／２０８、２７２／２８０、及び４４０／４４８から成るグループから選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。これらのＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３対を有するＡｎｇ−２抗体の限定されない例は、それぞれ、Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｍ７２４、及びＨ２Ｍ７４４と命名された抗体である。
【００１３】
更なる実施態様では、本発明は、配列番号４、２８、５２、７６、１００、１２４、１４８、１７２、１９６、２２０、２４４、２６８、２９２、３１６、３４０、３６４、３８８、４１２、４３６、４６０、４８４及び５０８から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号６、３０、５４、７８、１０２、１２６、１５０、１７４、１９８、２２２、２４６、２７０、２９４、３１８、３４２、３６６、３９０、４１４、４３８、４６２、４８６及び５１０から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２、３６、６０、８４、１０８、１３２、１５６、１８０、２０４、２２８、２５２、２７６、３００、３２４、３４８、３７２、３９６、４２０、４４４、４６８及び４９２から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；及び配列番号１４、３８、６２、８６、１１０、１３４、１５８、１８２、２０６、２３０、２５４、２７８、３０２、３２６、３５０、３７４、３９８、４２２、４４６、４７０及び ４９４から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを更に含む、抗体又はそのフラグメントを含む。
【００１４】
或る限定されない、例示的な本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、それぞれ、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４及び１６（例えば、Ｈ１Ｈ６８５）；（ｉｉ）配列番号２８、３０、３２、３６、３８及び４０ （例えば、Ｈ１Ｈ６９０）；（ｉｉｉ）配列番号５２、５４、５６、６０、６２及び６４（例えば、Ｈ１Ｈ６９１）；（ｉｖ）配列番号１４８、１５０、１５２、１５６、１５８及び１６０（例えば、Ｈ１Ｈ６９６）；（ｖ）配列番号１９６、１９８、２００、２０４、２０６及び２０８（例えば、Ｈ１Ｈ７０６）；（ｖｉ）配列番号２６８、２７０、２７２、２７６、２７８及び２８０（例えば、Ｈ１Ｍ７２４）；及び（ｖｉｉ）配列番号４３６、４３８、４４０、４４４、４４６及び４４８（例えば、Ｈ２Ｍ７４４）から成るグループから選択される、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１５】
関連する実施態様では、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで、抗体又はフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、及び５０２／５０４から成るグループから選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列内に含まれる、重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメイン（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１８／２０、４２／４４、６６／６８、１６２／１６４、２１０／２１２、２６６／２７４、及び４３４／４４２のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ内に含まれるＣＤＲ配列を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、抗Ａｎｇ−２抗体又はそのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を運ぶ組み換え発現ベクター、及びそのようなベクターが導入された宿主細胞は、抗体産生が可能な条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによる抗体の製造方法であるので、本発明に包含される。
【００１７】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１、１７、２１、２５、４１、４５、４９、６５、６９、７３、８９、９３、９７、１１３、１１７、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、１６９、１８５、１８９、１９３、２０９、２１３、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、２６５、２８１、２８５、２８９、３０５、３０９、３１３、３２９、３３３、３３７、３５３、３５７、３６１、３７７、３８１、３８５、４０１、４０５、４０９、４２５、４２９、４３３、４４９、４５３、４５７、４７３、４７７、４８１、４９７、５０１、５０５、５１３及び５１５から成るグループから選択される核酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＶＲを含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１７、４１、６５、１６１、２０９、２６５及び４３３から成るグループから選択される核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む。
【００１８】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号９、１９、２３、３３、４３、４７、５７、６７、７１、８１、９１、９５、１０５、１１５、１１９、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、１６７、１７７、１８７、１９１、２０１、２１１、２１５、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、２７３、２８３、２８７、２９７、３０７、３１１、３２１、３３１、３３５、３４５、３５５、３５９、３６９、３７９、３８３、３９３、４０３、４０７、４１７、４２７, ４３１, ４４１, ４５１, ４５５, ４６５, ４７５, ４７９, ４８９, ４９９及び５０３から成るグループから選択される核酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＶＲを含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１９、４３、６７、１６３、２１１、２７３及び４４１から成るグループから選択される核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。
【００１９】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、４１５、４３９、４６３、４８７及び５１１から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン；及び配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１、３７５、３９９、４２３、４４７、４７１及び４９５から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７／１５、３１／３９、５５／６３、１５１／１５９、１９９／２０７、２７１／２７９、及び４３９／４４７から成るグループから選択される核酸配列対によってコードされるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列を含む。
【００２０】
更なる実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、さらに、配列番号３、２７、５１、７５、９９、１２３、１４７、１７１、１９５、２１９、２４３、２６７、２９１、３１５、３３９、３６３、３８７、４１１、４３５、４５９、４８３及び５０７から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、４１３、４３７、４６１、４８５及び５０９から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、３５、５９、８３、１０７、１３１、１５５、１７９、２０３、２２７、２５１、２７５、２９９、３２３、３４７、３７１、３９５、４１９、４４３、４６７及び４９１から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン；配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９、３７３、３９７、４２１、４４５、４６９及び４９３から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインを含む。
【００２１】
１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１７及び１９；配列番号４１及び４３；配列番号６５及び６７；配列番号１６１及び１６３；配列番号２０９及び２１１；配列番号２６５及び２７３；又は配列番号４３３及び４４１の核酸配列によってコードされる重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００２２】
本発明は、修飾された糖鎖付加パターンを有する抗Ａｎｇ−２抗体を包含する。幾つかの応用において、望ましくない糖付加部位を除去する修飾は有用であってもよい。例えば、本発明は、本明細書に記載されるいかなる抗体の修飾バージョンをも包含し、ここで修飾バージョンは、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失させて、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高める（Shield et al. (2002) JBC 277:26733を参照）。他の応用では、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を変更（modify）するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する組み換えヒト抗体又はそのフラグメント及び薬学的に許容される担体又は希釈剤含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、Ａｎｇ−２インヒビター及び第２の治療剤を併合した組成物を特色とする。１つの実施態様では、Ａｎｇ−２インヒビターは、抗体又はそのフラグメントである。１つの実施態様では、第２の治療剤は、Ａｎｇ−２インヒビターと有利に併用されるいかなる薬剤でもある。Ａｎｇ−２インヒビターと有利に併用し得る例示的な薬剤としては、限定することなく、血管形成を阻害又は低減するいかなる薬剤、他のがん治療剤、抗炎症剤、サイトカインインヒビター、成長因子インヒビター、抗造血性因子、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、抗ウイルス剤及び抗生物質が挙げられる。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、抗Ａｎｇ−２抗体又は本発明の抗体の抗原結合部分を用いてＡｎｇ−２活性を阻害する方法を提供し、ここで治療方法は、抗体又は本発明の抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む。処置される疾患は、Ａｎｇ−２活性の除去、阻害又は低減によって改善、緩和、阻害又は防止されるいかなる疾患又は病態である。好ましくは、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又は抗体フラグメントは、血管形成の過程によって起こされる、関連する、又は永続化するいかなる疾患又は状態を処置するのに有用である。本発明の或る実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合部分は、がんの処置に有用である。がん治療に関連して、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合部分は、単独で、又は他の抗がん治療抗体、化学療法剤及び／又は放射線治療と併用して投与することができる。本発明の他の実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の目の疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症など、及び／又は１つ又はそれ以上の炎症性又は感染性疾患の処置に有用である。
【００２５】
他の実施態様は、次の詳細な説明の概説から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ヒトＡｎｇ−２のＣ末端８８アミノ酸（配列番号５１８の４０９〜４９６残基）と対応するヒトＡｎｇ−１のアミノ酸配列（配列番号５３１）のアラインメントである。ｈＡｎｇ−１とｈＡｎｇ−２の間で異なる残基は黒影に白文字で示す。星印（＊）は、結晶構造解析によってヒトＴｉｅ−２と相互作用することが示されたｈＡｎｇ−２のアミノ酸を示す。Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532（2006) を参照されたい。三角形（▲）は、ｈＡｎｇ−２とｈＡｎｇ−１の間で異なる、Ｔｉｅ−２相互作用アミノ酸の位置を示す。
【図２】パネルＡ〜Ｃは、Ａｎｇ−２結合分子が、Ａｎｇ−１誘導のＴｉｅ−２リン酸化を阻害する、又は阻害しない程度を説明するウェスタンブロットの結果を示す。
【図３】実施例１３のＡｎｇ−２ＦＤ−ｍＦｃ点突然変異体の結合実験の要約であり、試験した様々な抗体及びペプチボディについての、解離のＴ1/2が野生型に対して５倍を超える低下をもたらすアミノ酸変化（黒丸●で示す）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を説明する前に、本発明は、記載された特定の方法及び実験条件に限定されないと理解すべきである、なぜなら、そのような方法及び条件は変化し得る。また、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書に使われる述語は、特定の実施態様を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【００２８】
他に定義されない限り、本明細書に使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する業界の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に使われるように、用語の「約」は、特定の列挙された数値に関して使われるとき、列挙された値からわずか１％だけ変化してもよい値を意味する。例えば、本明細書に使われるように、「約１００」の表現は、９９及び１０１並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００２９】
本明細書に記載されるものに類似した又は同等のいかなる方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用できるが、好ましい方法及び材料は今から説明する。
【００３０】
定義
本明細書に使われるように、用語の「アンジオポイエチン−２」または「Ａｎｇ−２」は、ヒト以外の種（例えば、「マウスＡｎｇ−２」、「サルＡｎｇ−２」、など）として特定されない限り、ヒトＡｎｇ−２又はその生物学的に活性なフラグメント（例えば、インビボ又はインビトロで血管形成を誘導することができるＡｎｇ−２タンパク質のフラグメント）を指す。ヒトＡｎｇ−２は、配列番号５１７で示される核酸配列によってコードされ、配列番号５１８のアミノ酸配列を有する。マウス及びサルＡｎｇ−２タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ受託番号ＮＰ＿０３１４５２及びＢＡＥ８９７０５．１のもとにＮＣＢＩプロテインシーケンスデータベースから入手できる。
【００３１】
用語の「アンジオポイエチン−１」または「Ａｎｇ−１」は、ヒト以外の種（例えば、「マウスＡｎｇ−１」、「サルＡｎｇ−１」、など）として特定されない限り、ヒトＡｎｇ−１又はその生物学的に活性なフラグメントを指す。ヒトＡｎｇ−１は、受託番号ＡＡＢ５０５５７のもとにＮＣＢＩプロテインシーケンスデータベースに記載のアミノ酸配列を有する。用語の「Ｔｉｅ−２」（業界では「ＴＥＫ」とも呼ばれる）は、ヒト以外の種（例えば、「マウスＴｉｅ−２」、「サルＴｉｅ−２」、など）として特定されない限り、ヒトＴｉｅ−２又はその生物学的に活性なフラグメントを指す。ヒトＴｉｅ−２は、受託番号ＡＡＡ６１１３０のもとにＮＣＢＩプロテインシーケンスデータベースに記載のアミノ酸配列を有する。
【００３２】
本明細書に使われるように、用語の「抗体」は、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィドボンドで相互接続した４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を指すことを意図する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶHと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣH１、ＣH２及びＣH３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶLと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH及びＶL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼ばれる超過変性の領域に細分することができる。それぞれのＶH及びＶLは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。本発明の違う実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲｓは、ヒト生殖細胞系の配列と同じであってもよく、又は天然に若しくは人工的に修飾されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの並列解析に基づいて定義すればよい。
【００３３】
本明細書に使われるように、用語の「抗体」はまた、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントを包含する。本明細書に使われる用語の、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいかなる天然の、酵素的に取得できる、合成の、若しくは遺伝子組み換えされた、ポリペプチド又は糖タンパク質を包含する。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、完全な抗体分子から、タンパク質分解的消化又は抗体可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組み換え遺伝子工学技術などのいかなる好適な標準的技術を駆使して誘導してもよい。そのようなＤＮＡは、既知である及び／又は例えば、市販品、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリー）から容易に入手できる、又は合成することができる。ＤＮＡは、配列が決定されそして化学的に、又は例えば、１つ又はそれ以上の可変及び／又は定常ドメインを好適な立体配置（configuration）に配置するため、又はコドンを導入する、システイン残基を創る、アミノ酸を修飾、付加若しくは削除するなどのために、分子生物学の技術を使用して操作されてもよい。
【００３４】
抗原結合フラグメントの限定されない例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、抗体の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣したアミノ酸残基から成る最小認識ユニットが挙げられる。二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びミニ抗体などの、他の遺伝子組み換えされた分子も、本明細書に用いられる「抗原結合フラグメント」の表現に包含される。
【００３５】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、いかなるサイズ又はアミノ酸組成であってもよく、一般に１つ又はそれ以上のフレームワーク配列に隣接した又はフレーム内にある少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶLドメインを伴うＶHドメインを有する抗原結合フラグメントは、互いに対してどのような好適な配置に可変ドメインが位置してもよい。例えば、可変領域は、二量体であり、ＶH−ＶH、ＶH−ＶL又はＶL−ＶLドメイン二量体であってもよい。或いは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶH又はＶLドメインを含んでもよい。
【００３６】
或る実施態様では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含めばよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出されてもよい、可変及び定常ドメインの、限定されない、例示的な立体配置としては、（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３；及び（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。可変及び定常ドメインの任意の立体配置では、上記のいかなる例示的な立体配置を含めて、可変及び定常ドメインは、互いに直接連結しても、全部の又は部分的なヒンジ若しくはリンカー領域によって連結してもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸から成り、それは１つのポリペプチド分子内の隣接する可変及び／又は定常ドメインの間にフレキシブル又はセミフレキシブルな連結を生じさせる。その上、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、上記の可変及び定常ドメイン立体配置のいずれかの、互いに及び／又は１つ又はそれ以上の単量体ＶH又はＣLドメインが非共有で連結した（例えば、ジスルフィド架橋による）、ホモダイマー又はヘテロダイマー（又は、他の多量体）を含んでもよい。
【００３７】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗体の抗原結合フラグメントは、典型的に少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで、それぞれの可変ドメインは別々の抗原又は同じ抗原の異なるエピトープと特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む多重特異性抗体フォーマットは、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの関連で用いるために、業界で利用可能な通常の技術を用いて適合させてもよい。
【００３８】
抗体の定常領域は、補体を固定し細胞依存性細胞傷害を仲介する抗体の能力にとって重要である。従って、抗体のイソタイプは、抗体が細胞傷害性を仲介するために望ましいかどうかに基づいて選択すればよい。
【００３９】
本明細書に使われる用語の「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲｓ特にＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム又は部位特異的突然変異生成又はインビボの体細胞変異によって誘導される変異）を含んでもよい。しかし、本明細書に使われる用語の「ヒト抗体」は、マウス等の他の哺乳類の生殖細胞由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。
【００４０】
本明細書に使われる用語の「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段によって調製された、発現された、創出された又は単離した、宿主細胞に移入された組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体（以下にさらに説明する）、組み換え体、組み合わせのヒト抗体ライブラリーから単離した抗体（以下にさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（Taylor et al.（1992）Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列に挿入することを含む、いかなる他の手段によって調製された、発現された、創出された又は単離した抗体など、全てのヒト抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかしながら、或る実施態様では、そのような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異生成（又は、ヒトＩｇ配列用のトランスジェニック動物が用いられる場合は、インビボ体細胞突然変異生成）に供され、従って組み換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞のＶH及びＶL配列に由来し及び関連しているが、インビボのヒト抗体生殖細胞のレパートリー内に天然には存在しないかも知れない配列である。
【００４１】
ヒト抗体は、ヒンジの不均質に関係した２つの形態で存在することができる。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間の重鎖ジスルフィド架橋で結合された、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物（construct）を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド架橋によって連結されず、約７５〜８０ｋＤａの分子は、共有結合した軽鎖及び重鎖で構成されて形成される（半抗体）。これらの形態は、アフィニティー精製後であっても、分離することは極めて困難である。
【００４２】
様々な無傷のＩｇＧイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域イソタイプに関連する構造的な違いによるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域での単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、一般にヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて観察されるレベルに、著しく低下させることができる（Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105）。本発明は、例えば、産生において、目的の抗体形態の収率を改善するために望ましい、ヒンジ、ＣH２又はＣH３領域に１つ又はそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。
【００４３】
本明細書に使われる「単離した抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ヒトＡｎｇ−２又はヒトＡｎｇ−２フラグメントに特異的に結合する単離した抗体は、ヒトＡｎｇ−２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことを意図する。用語の「特異的に結合する」などは、抗体又はその抗体の抗原結合フラグメントが、生理的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、約１×１０-8Ｍ又はそれ以下のＫDによって特徴付けることができる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、業界に周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、などが挙げられる。しかし、ヒトＡｎｇ−２と特異的に結合する単離した抗体は、他の種からのＡｎｇ−２分子などの他の抗原への交差反応性を有してもよい。その上、単離した抗体は、他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まなければよい。
【００４４】
本明細書に使われる「中和」又は「遮断」抗体は、そのＡｎｇ−２への結合が、Ａｎｇ−２とその受容体（Ｔｉｅ−２）との相互作用を遮断する及び／又はＡｎｇ−２の少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。Ａｎｇ−２中和又は遮断抗体によって起こされる阻害は、適切なアッセイを用いて検出できる限り、必ずしも完全である必要はない。Ａｎｇ−２阻害を検出するための典型的なアッセイは、本明細書の他の場所で説明する。
【００４５】
本明細書で説明する完全ヒト抗Ａｎｇ−２抗体は、相当する生殖細胞配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含んでもよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば公開の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞配列と比較することによって、容易に確定することができる。本発明は、抗体、及び本明細書に開示したいずれかのアミノ酸配列から由来するその抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸は、相当する１つ又は複数の生殖細胞残基に又は相当する生殖細胞残基の保存アミノ酸置換（天然又は非天然の）に復帰突然変異される（その様な配列変化は、本明細書では「生殖細胞復帰突然変異」と呼ぶ）。当業者は、本明細書に開示された重鎖及び軽鎖可変領域の配列から始めて、１つ又はそれ以上の個々の生殖細胞復帰突然変異又はそれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。或る実施態様では、ＶH及び／又はＶLドメイン内の全てのフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は、生殖細胞配列に復帰突然変異される。他の実施態様では、特定の残基だけが生殖細胞配列に復帰突然変異される、例えば変異残基だけがＦＲ１の最初の８アミノ酸内に又はＦＲ４の最後の８アミノ酸内に認められ、又は変異残基だけがＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３内に認められる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ又はそれ以上の生殖細胞復帰突然変異のいかなる組み合わせを含んでもよい、即ち、ここで、或る個々の残基は生殖細胞配列に復帰突然変異されるが、生殖細胞配列と異なる或る他の残基は保存される。一度得られた、１つ又はそれ以上の生殖細胞復帰突然変異を含む抗体及び抗体の抗原結合フラグメントは、改善した結合特異性、高い結合親和性、改善した又は亢進したアンタゴニスト的又はアゴニスト的な生物学的特性（場合によって）、低下した免疫原性などの１つ又はそれ以上の所望する特性を、容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた抗体及び抗体の抗原結合フラグメントは、本発明内に包含される。
【００４６】
本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗Ａｎｇ−２抗体を包含する。例えば、本発明は、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０又はそれより少ない、８又はそれより少ない、６又はそれより少ない、４又はそれより少ないなどの保存的アミノ酸置換を持つＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗Ａｎｇ−２抗体を含む。１つの実施態様では、抗体は、８又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、６又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、４又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、２又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。１つの実施態様では、抗体は、８又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、６又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、４又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、２又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００４７】
本明細書で使われる用語の「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて、バイオセンサー・マトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの相互作用解析を可能にする光学的現象を指す。
【００４８】
本明細書で使われる用語の「ＫD」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
【００４９】
用語の「エピトープ」は、抗体分子の可変領域内のパラトープとして知られる特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定基を指す。単一の抗原は、複数のエピトープを有してもよい。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる区域に結合してもよく、異なる生物学的作用を有してもよい。エピトープは、立体配座でも直線状でもよい。立体配座のエピトープは、直鎖ポリペプチドの異なる部分からの空間的に並列したアミノ酸によって形成される。直線状のエピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基によって形成されるものである。或る状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含んでもよい。
【００５０】
用語の「実質的な同一性」又は「実質的に同一な」は、核酸又はそのフラグメントに言及するとき、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を使って別の核酸（又はその相補鎖）と最適に位置合わせをしたとき、以下で検討するようにＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐなどのよく知られた配列同一性のアルゴリズムによって測定したとき、少なくとも約９５％、そしてより好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照の核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、場合によっては、参照の核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。
【００５１】
ポリペプチドに適用されるように、用語の「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイト（default gap weight）を用いて、例えばプログラムのＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に位置合わせした場合、少なくとも９５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学特性（例えば、荷電又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されることである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性は実質的に変えない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が互いに保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整されてもよい。この調整を行う手段は、同業者に周知である。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。類似した化学的特性の側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；及び（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン、が挙げられる。好まれる保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。或いは、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445に公開されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで、正の値を有する任意の変更である。「中程度に保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで、負でない値を有する任意の変更である。
【００５２】
配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドの配列類似性は、一般に配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、さまざまな置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を用いて類似する配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含み、それらは、種の異なる生物由来の相同のポリペプチドなどの近縁ポリペプチド間、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質間の、配列相同性又は配列同一性を測定するために、デフォルトパラメータを用いて使用することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨パラメータを用いるＦＡＳＴＡ、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１内のプログラム、を使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー及びサーチ配列間の最良重複領域の位置合わせ及びパーセント配列同一性を提供する（上記Pearson (2000)参照）。別の、本発明の配列と、異なる生物由来の大多数の配列を含むデータベースを比較するときの好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いたコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ，特にＢＬＡＳＴＰ又はＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410及びAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402を参照されたい。
【００５３】
ヒト抗体の製造
完全ヒトモノクローナル抗体を含めたモノクローナル抗体を産生させる方法は、業界に知られている。いずれのそのような既知の方法も、本発明との関連において、ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、本明細書に開示されるいずれの例示的な抗Ａｎｇ−２抗体の１つ又はそれ以上の抗原結合及び／又は機能的な性質を持つ、ヒト抗体を作るために使用することができる。
【００５４】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術又はモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を用いて、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＡｎｇ−２に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。下記の実験の項におけるように、抗体は、特徴付けられ、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい性質に選択される。マウス定常領域を望ましいヒト定常領域で置き換えて、本発明の全ヒト抗体、例えば、野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４を生成する。選択される定常領域は特定の使用に従って変わってもよいが、高親和性抗原結合及び標的特異性の性質は可変領域に存在する。
【００５５】
生物学的等価性
本発明の抗Ａｎｇ−２抗体及び抗体フラグメントは、記載された抗体のものとは異なるが、ヒトＡｎｇ−２に結合する能力を保持したアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較したとき、１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含むが、記載された抗体のそれと本質的に等価な生物学的活性を示す。同じように、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したとき、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含むが、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又は抗体フラグメントと本質的に生物学的等価な抗Ａｎｇ−２抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を包含する。そのような変異アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は上記で検討した。
【００５６】
２つの抗原結合タンパク質、即ち抗体は、もし、例えば、それらが薬学的な同等物又は薬学的な代替物であり、同様な実験条件下で同じモル投与量を単回投与又は複数回投与で投与したとき、それらの吸収の速度及び程度に有意な違いを示さないなら、生物学的等価と見なされる。幾つかの抗体は、もしそれらの吸収の程度は同等であるが吸収の速度は同等でないなら同等物又は薬学的代替物と考えられ、なおかつ、そのような吸収速度の違いは、意図的であり、標識に反映され、例えば連用の際の効果的な体内薬物濃度の達成に必須ではなく、試験される特定の製剤にとって医学的に重要でないと考えられるので、生物学的等価と見なしてもよい。
【００５７】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、もし、安全性、純度、及び力価に、臨床的に有意な違いが無ければ、生物学的等価である。
【００５８】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、もし患者が、参照製剤と生物学的製剤の間で１回又はそれ以上の交換が、そのような交換なしに継続した治療と比較して、臨床的に有意な免疫原性の変化の誘導、又は効果の減退を含む、副作用リスクの予想される上昇無しに可能なら、生物学的等価である。
【００５９】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、もしそれら両者が、使用の条件に対して共通のメカニズム又は作用メカニズムで作動するなら、そのようなメカニズムが既知である限りにおいて、生物学的等価である。
【００６０】
生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法で立証され得る。生物学的等価性の指標としては、例えば，（ａ）抗体又はその代謝物の濃度が、血液、血漿、血清、又は他の生物学的流体中で、時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳類でのインビボテスト；（ｂ）ヒトインビボ生体学的利用能データと相関する、及びそれを合理的に予測するインビトロテスト；（ｃ）抗体（又はその対象）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳類でのインビボテスト；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又は生体学的利用能若しくは生物学的等価性を確証する、十分にコントロールされた臨床試験、が挙げられる。
【００６１】
本発明の抗Ａｎｇ−２抗体の生物学的等価性変異形は、例えば、残基若しくは配列に様々な置換をさせる又は生物学的活性に必要のない末端若しくは内部の残基若しくは配列を削除することによって、構築されてもよい。例えば、生物学的活性に重要でないシステイン残基は、再生する際に不必要な又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、削除する又は他のアミノ酸で置き換えることができる。
【００６２】
抗体の生物学的及び治療的特徴
一般に、本発明の抗体は、固相に固定化した又は液相中のいずれかの抗原への結合によって測定して、１００ｐＭ未満のＫDで、典型的には５０ｐＭ未満のＫDで、或る実施態様では４０ｐＭ未満のＫDで、ヒトＡｎｇ−２に結合する。
【００６３】
また、本発明の或る例示的な抗Ａｎｇ−２抗体は、１つ又はそれ以上の以下の特徴を示す：（１）ヒトＡｎｇ−２に結合するがマウスＡｎｇ−２に結合しない能力；（２）ヒトＡｎｇ−２及びマウスＡｎｇ−２に結合する能力；（３）ヒトＡｎｇ−２に結合するがヒトＡｎｇ−１、−３又は−４に結合しない能力；（４）ヒトＡｎｇ−２に結合するがマウスＡｎｇ−１、−３又は−４に結合しない能力；（５）ヒトＡｎｇ−２及びヒトＡｎｇ−１、−３又は−４に結合する能力；（６）ヒトＡｎｇ−２及びマウスＡｎｇ−１、−３又は−４に結合する能力；（７）ヒトＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（８）ヒトＡｎｇ−２のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（９）マウスＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１０）マウスＡｎｇ−２のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１１）ヒトＡｎｇ−１のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１２）ヒトＡｎｇ−１のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１３）マウスＡｎｇ−１のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１４）マウスＡｎｇ−１のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１５）ヒトＡｎｇ−２で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１６）ヒトＡｎｇ−２で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１７）マウスＡｎｇ−２で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１８）マウスＡｎｇ−２で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１９）ヒトＡｎｇ−１で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２０）ヒトＡｎｇ−１で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２１）マウスＡｎｇ−１で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２２）マウスＡｎｇ−１で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２３）実験モデル（例えば、ＭＣＦ−７細胞を含有するマトリゲル栓をヌードマウスの皮下に移植することによって誘導される血管形成）におけるインビボ血管形成を阻害する能力；及び／又は（２４）マウス異種移植片モデルで腫瘍体積を抑制又は減少させる能力。
【００６４】
本発明はまた、Ａｎｇ−２フィブロネクチン様ドメインを含むが、Ａｎｇ−２Ｎ末端のコイルドコイル・ドメインを欠如した構造（construct）（その様な構造は、本明細書では「Ａｎｇ−２ＦＤ」と呼ぶ）に高い親和性で結合する抗体も包含する。例示的なＡｎｇ−２ＦＤ構造としては、ヒトＡｎｇ−２ＦＤ（配列番号５１９）、マウスＡｎｇ−２ＦＤ（配列番号５２０）、及びサルＡｎｇ−２ＦＤ（配列番号５２１）が挙げられる。ヒト、マウス及びサルのＡｎｇ−２ＦＤ構造は、単量体又は二量体でもよい。Ａｎｇ−２ＦＤ構造はまた、Ａｎｇ−２ＦＤ分子に接続したヒト又はマウスＦｃドメインなどの、他の非Ａｎｇ−２アミノ酸配列を含んでもよい。別の例示的なＡｎｇ−２ＦＤ構造は、本明細書では「ｈＢＡ２」（又はヒト「ｂｏｗ−Ａｎｇ２」）と呼ばれ、それはヒト又はマウスＦｃドメインを経由して互いに結合し、蝶ネクタイ様の立体配置を形成するヒトＡｎｇ−２フィブリノーゲン様ドメインの四量体である。通常、ｈＢＡ２は、２つのＡｎｇ−２二量体から成り、ここでそれぞれのＡｎｇ−２二量体は、Ｆｃドメインを通して互いに連結した２つのＡｎｇ−２フィブロネクチン様ドメインを含む。例示的なｈＢＡ２構成要素としては、ｈＢＡ２−ｈＩｇＧ１（配列番号５２２）及びｈＢＡ２−ｍＩｇＧ２ａ（配列番号５２３）に指定されたポリペプチドが挙げられる。予想外に、本発明の或る抗Ａｎｇ−２抗体は、既知のコントロールＡｎｇ−２抗体よりもかなり高い親和性でＡｎｇ−２ＦＤ構造に結合することが見出された（本明細書に記載の実施例を参照）。
【００６５】
ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤ構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合とは、抗Ａｎｇ−２抗体が、ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤと３００ｐＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤと高親和性で結合する抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤと３００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１９０ｐＭ未満、１８０ｐＭ未満、１７０ｐＭ未満、１６０ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１４０ｐＭ未満、１３０ｐＭ未満、１２０ｐＭ未満、１１０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満、８０ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６０ｐＭ未満又は５０ｐＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６６】
サル二量体Ａｎｇ−２ＦＤ構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合とは、抗Ａｎｇ−２抗体がサル二量体Ａｎｇ−２ＦＤと５００ｐＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、サル二量体Ａｎｇ−２ＦＤと高親和性で結合する抗Ａｎｇ−２抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、サル二量体Ａｎｇ−２ＦＤと５００ｐＭ未満、４５０ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３５０ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１９０ｐＭ未満、１８０ｐＭ未満、１７０ｐＭ未満、１６０ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１４０ｐＭ未満、１３０ｐＭ未満、１２０ｐＭ未満、１１０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満、又は８０ｐＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６７】
ヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤ構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合は、抗Ａｎｇ−２抗体がヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤと４０ｎＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、ヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤと高親和性で結合する抗Ａｎｇ−２抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、ヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤと４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、又は０．６ｎＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６８】
ｈＢＡ２構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合は、抗Ａｎｇ−２抗体がｈＢＡ２と８０ｐＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、ｈＢＡ２と高親和性で結合する抗Ａｎｇ−２抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、ｈＢＡ２と８０ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６５ｐＭ未満、６０ｐＭ未満、５５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４５ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３５ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１８ｐＭ未満、１６ｐＭ未満、１４ｐＭ未満、又は１２ｐＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６９】
本発明は、Ａｎｇ−２に結合するがＡｎｇ−１とは実質的に結合しない抗体を包含する。本明細書で使われる様に、抗体が表面に捕捉され、捕捉された抗体上に、完全野生型ヒトＡｎｇ−１を約２５ｎＭの濃度で、約６０μＬ／分の流速で、約３分間２５℃で注入される、表面プラズモン共鳴アッセイで、Ａｎｇ−２に対する結合を試験したとき、もしも抗体が、約１ｎＭを超える、例えば、約５ｎＭを超える、約１０ｎＭを超える、約５０ｎＭを超える、約１００ｎＭを超える、約１５０ｎＭを超える、約２００ｎＭを超える、約２５０ｎＭを超える、約３００ｎＭを超える、約３５０ｎＭを超える、約４００ｎＭを超える、約４５０ｎＭを超える、約５００ｎＭを超える、又はそれ以上のＫDを示すなら、抗体は「実質的にＡｎｇ−１に結合しない」。（例えば、実施例４を参照）。また、そのようなアッセイ又はそれと同等のもので試験したとき、抗体がＡｎｇ−１との結合を示せないなら、抗体は「実質的にＡｎｇ−１に結合しない」。
【００７０】
本発明はまた、Ａｎｇ−２のＴｉｅ−２との結合を遮断するが、Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を実質的に遮断しない抗体を包含する。本明細書で使用されるように、もし、抗体をＡｎｇ−１抗原と約１００：１（抗体：抗原）の比でプレミックスし、２５℃で約６０分間インキュベーションし、次に平衡化した混合物をＴｉｅ−２で被覆した表面上の表面プラズモン共鳴（５μＬ／分、２５℃）によってＴｉｅ−２に対する結合を試験したとき、Ｔｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量が、関係のないコントロール分子の存在下でＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量の少なくとも５０％であるなら、抗体は「Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を実質的に遮断しない」。（例えば、実施例６を参照）。例えば、抗体とのプレインキュベーションの後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量が、上記の実験条件下で関係のないコントロール分子とプレインキュベーションの後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％であるなら、抗体は「Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を実質的に遮断しない」と見なされる。
【００７１】
さらに、本発明は、Ａｎｇ−２の生物学的活性（例えば、Ａｎｇ−２媒介のＴｉｅ−２リン酸化；Ａｎｇ−２誘導の血管形成など）を遮断又は実質的に減衰させるが、Ａｎｇ−１の対応する生物学的活性（Ａｎｇ−１媒介のＴｉｅ−２のリン酸化；Ａｎｇ−１誘導の血管形成など）を遮断又は実質的に減衰させない抗体を包含する。抗体が上記で挙げた１つ又はそれ以上の性質を満足するかどうかを測定するために有用なアッセイ及び試験は、当業者によって直ちに理解され、そして容易に実施されるだろう、及び／又は本開示から十分に確認できるだろう。例えば、下記に詳述する実験方法は、ある抗体がＡｎｇ−２及び／又はＡｎｇ−１に結合するか否か；Ａｎｇ−２及び／又はＡｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を遮断するか否か；Ａｎｇ−２及び／又はＡｎｇ−１が媒介するＴｉｅ−２のリン酸化を阻害するか否か；等々を測定するために使用できる。
【００７２】
エピトープマッピング及び関連する技術
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥのその高親和性受容体への結合を遮断するもの）を選別するために、「抗体（Antibodies）」Harlow and Lane著、（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY）に記載されているような、通常のクロスブロッキング・アッセイを行うことができる。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット（Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63）、又はペプチド切断解析が挙げられる。また、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、及び化学修飾などの方法が使用できる（Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496）。
【００７３】
用語の「エピトープ」は、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位に言及する。Ｂ細胞エピトープは、隣接（contiguous）アミノ酸又はタンパク質の三次元折り畳みによって並列した隣接アミノ酸の両者から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に変性溶媒に接触しても保持されるのに対し、三次元の折り畳みで形成されたエピトープは、一般に変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、一般的に少なくとも３個、より普通には少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸を特異な空間的構造に含む。
【００７４】
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られる修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、同じ抗原に対して指向した大多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的又は酵素的に修飾した抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って分類する方法である（米国特許第２００４／０１０１９２０号）。各カテゴリーは別のカテゴリーによって表わされるエピトープと明らかに異なる又は部分的に重複するいずれかのユニークなエピトープを反映する。この技術により、特徴付けの焦点を遺伝学的に独特な抗体に合わせることができるなど、遺伝学的に同一な抗体の急速な分別が可能になる。ハイブリドーマのスクリーニングに適用したとき、ＭＡＰは、所望する性質を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類するために使用してもよい。
【００７５】
抗Ａｎｇ−２抗体は、アミノ末端コイルドコイル・ドメイン内又はカルボキシ末端フィブリノーゲン様ドメイン（「ＦＤ」）内のエピトープに結合することができる。本発明の好ましい実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体及びその抗体の抗原結合フラグメントは、ＦＤ内のエピトープに結合する。
【００７６】
Ｔｉｅ−２と相互作用するＡｎｇ−２のＦＤ内のアミノ酸は、結晶構造解析によって解明されている。Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (May 2006) を参照。Ａｎｇ−２のＴｉｅ−２への結合を遮断するがＡｎｇ−１のＴｉｅ−２への結合を実質的に遮断しない抗体に関して（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ、下記の実施例５及び６を参照）、そのような抗体が結合するエピトープは、（ａ）Ｔｉｅ−２と相互作用する及び（２）Ａｎｇ−１の対応するアミノ酸に一致しないＡｎｇ−２の１つ又はそれ以上のアミノ酸を含んでもよい（図１を参照）。従って、そのようなＡｎｇ−２優先的抗体が結合するエピトープは、ｈＡｎｇ―２（配列番号５１８）の１つ又はそれ以上の次のアミノ酸：Ｓ−４１７；Ｋ−４３２；Ｉ−４３４；Ｎ−４６７；Ｆ−４６９；Ｙ−４７５；又はＳ−４８０を含んでもよい。例えば、本発明者らは、Ａｎｇ−２（配列番号５１８）のアミノ酸Ｆ−４６９、Ｙ−４７５、及びＳ−４８０と相互作用する抗体は、Ａｎｇ−１よりもＡｎｇ−２と優先的に相互作用すること、そしてこの優先的結合が治療的な利点を有し得ることを発見した。従って、本発明は、ヒトアンジオポイエチン２（ｈＡｎｇ−２）に特異的に結合するがｈＡｎｇ−１には実質的に結合しない抗Ａｎｇ−２抗体を含み、ここで抗体は、アミノ酸Ｆ−４６９、Ｙ−４７５、及びＳ−４８０を含むｈＡｎｇ−２（配列番号５１８）上のエピトープに結合する。同様に、本発明は、ｈＡｎｇ−２のｈＴｉｅ−２への結合を遮断するがｈＡｎｇ−１のｈＴｉｅ−２への結合を実質的に遮断しない抗Ａｎｇ−２抗体を含み、ここで抗体は、アミノ酸Ｆ−４６９、Ｙ−４７５、及びＳ−４８０を含むｈＡｎｇ−２（配列番号５１８）上のエピトープに結合する。
【００７７】
本発明は、本明細書に記載されたいかなる特定の例示的な抗体（例えば、Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｍ７２４及び／又はＨ２Ｍ７４４）のいずれかと同じエピトープに結合する抗Ａｎｇ−２抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載された特定の例示的な抗体（例えば、Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｍ７２４及び／又はＨ２Ｍ７４４）のいずれかとのＡｎｇ−２への結合を競合する抗Ａｎｇ−２抗体を含む。
【００７８】
抗体が、参照の抗Ａｎｇ−２抗体と同じエピトープに結合するか、又は結合を競合するかは、業界に周知の方法を使うことによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗Ａｎｇ−２抗体と同じエピトープに結合するかを測定するために、参照の抗体が、飽和する条件下で、Ａｎｇ−２タンパク質又はペプチドに結合するのを可能にする。次に、試験抗体のＡｎｇ−２分子に対する結合能力を評価する。もし、試験抗体が、参照の抗Ａｎｇ−２抗体で飽和結合された後のＡｎｇ−２に結合することができれば、試験抗体は参照の抗Ａｎｇ−２抗体と異なるエピトープに結合すると、結論することができる。一方、もし、試験抗体が、参照の抗Ａｎｇ−２抗体で飽和結合された後のＡｎｇ−２分子に結合することができなければ、試験抗体は本発明の参照の抗Ａｎｇ−２抗体によって結合したエピトープと同じエピトープに結合し得る。次に、観察された試験抗体の結合性の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するのか、又は立体的遮断（又は他の現象）が、観察された結合性の欠如に関与するのかを確認するために、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を行うことができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又はその他業界で利用できる定量的又は定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。本発明の或る実施態様によると、競合結合アッセイ（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502を参照）で測定して、もし、例えば、１、５、１０、２０又は１００倍過剰の１つの抗体が、もう１つの抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％又はさらに９９％遮断するなら、２つの抗体は同じ（又は重複する）エピトープに結合する。或いは、もし、１つの抗体の結合性を低下させる又は除去する抗原中の基本的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低下させるか又は除去するなら、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。もし、１つの抗体の結合性を低下させる又は除去するサブセットだけのアミノ酸変異が、他方の結合性を低下させる又は除去するなら、２つの抗体は「重複したエピトープ」を有するとみなされる。
【００７９】
抗体が参照の抗Ａｎｇ−２抗体と結合を競合するかどうかを測定するために、上記の結合方法論を２つの方向で行った：第１の方向では、参照の抗体を飽和条件下でＡｎｇ−２分子に結合させ、次にＡｎｇ−２分子に対する試験抗体の結合性を評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でＡｎｇ−２分子に結合させ、次にＡｎｇ−２分子に対する参照抗体の結合性を評価する。もし、両方向において、最初の（飽和する）抗体だけがＡｎｇ−２分子に結合できるなら、試験抗体と参照抗体はＡｎｇ−２への結合を競合すると結論される。当業者には分かるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、必ずしも参照の抗体と同じエピトープに結合する必要はなく、重複する又は隣接するエピトープに結合することによって参照の抗体の結合を立体的に遮断してもよい。
【００８０】
種特異性及び種交差反応性
本発明の或る実施態様によると、抗Ａｎｇ−２抗体は、ヒトＡｎｇ−２に結合するが他の種由来のＡｎｇ−２に結合しない。或いは、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、或る実施態様では、ヒトＡｎｇ−２及び１つ又はそれ以上の非ヒト種由来のＡｎｇ−２に結合する。例えば、本発明のＡｎｇ−２抗体は、ヒトＡｎｇ−２に結合し、場合によって、１つ又はそれ以上のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲサル又はチンパンジーＡｎｇ−２に結合しても又は結合しなくてもよい。
【００８１】
免疫複合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬物、免疫抑制剤又はラジオアイソトープなどの治療部分に抱合した（conjugated）抗Ａｎｇ−２モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒性薬としては、細胞にとって有害になるいかなる薬剤が挙げられる。免疫複合体を形成するために好適な細胞毒性薬及び化学療法剤の例は、業界に知られており、例えば、国際公開公報第０５／１０３０８１号を参照されたい。
【００８２】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってもよい。多重特異性ｍＡｂは、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であっても、又は１つより多い標的ポリペプチドに対する抗原結合ドメインを包含してもよい。例えば、Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69を参照。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又はその部分は、別の機能分子、例えば別のペプチド又はタンパク質、と連結させる又は共発現させて多重特異性分子を形成させることができる。例えば、抗体又はそのフラグメントは、別の抗体又は抗体フラグメントなどの１つ又はそれ以上の分子的実体と機能的に連結させて、第２の結合特異性を持つ二重特異性又は多重特異性抗体を製造することができる。
【００８３】
本発明との関連で使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）のＣH３ドメイン及び第２のＩｇのＣH３ドメインの使用を含み、ここで第１及び第２のＩｇのＣH３ドメインは、互いに少なくとも１つのアミノ酸が異なり、そしてアミノ酸相違のない二重特異性抗体と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸の相違が、二重特異性抗体のプロテインＡに対する結合性を低下させる。１つの実施態様において、第１のＩｇのＣH３ドメインは、プロテインＡに結合し、そして第２のＩｇのＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変などのプロテインＡ結合性を低下若しくは無効にする変異を含む（ＩＭＧＴエクソンによる付番；ＥＵ付番によるＹ４３６Ｆ）。第２のＣH３は、さらにＹ９６Ｆ改変を含んでもよい（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）。第２のＣH３内に見出されてもよいさらなる改変としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ, Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２I）；及びＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体フォーマット上の変異は、本発明の範囲内に期待（contemplate）される。
【００８４】
治療用製剤及び投与
本発明は、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、移送、送達、耐性などを改善するために製剤に組み込まれる、さらに１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び他の薬剤（本明細書では、まとめて「薬学的に許容される担体又は希釈剤」と呼ぶ）を含んでもよい。数多くの適切な製剤は、全ての薬剤師に知られる処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに見いだすことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、（カチオン性又はアニオン性）リピド含有小胞（vesicle）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（さまざまな分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及び半固体混合物含有カーボワックスが挙げられる。Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311も参照されたい。
【００８５】
抗体の投与量は、投与対象の年齢及び大きさ、標的疾患、状態、投与経路などによって変わってもよい。好ましい投与量は、一般に体重又は体表面積に従って計算される。本発明の抗体を、Ａｎｇ−２活性が関与する成人患者の状態又は疾患を処置するために使うとき、本発明の抗体を通常約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重で、静脈内に投与することが有利であり得る。状態の重篤性によって処置の頻度及び期間を調整することができる。Ａｎｇ−２抗体を投与するための効果的な用量及びスケジュールは、実験的に決定してもよい；例えば、患者の進展を定期に評価モニタリングすることができ、従って投与量を調整することができる。さらに、業界によく知られる方法（例えば、Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351）を用いて、種間の用量の拡大縮小（scaling）を行うことができる。
【００８６】
種々の送達システムが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる、例えば、リポソーム、ミクロパーティクル、又はマイクロカプセルへの封入、変異ウイルス、受容体介在エンドサイトーシスを発現することができる組み換え体細胞（例えば、Wu et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）。導入の方法としては、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び口腔の経路が挙げられる。組成物は、任意の都合の良い経路で、例えば、注入（infusion）又はボーラス投与によって、上皮又は粘膜皮膚裏層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を経由する吸収によって、そして他の生物学的活性薬剤と共に投与してもよい。投与は、全身的又は局所的であればよい。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、例えば、標準の針及びシリンジを用いて皮下又は静脈内に送達させることができる。また、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、容易に本発明の医薬組成物を送達するのに適用される。そのようなペン送達デバイスは再使用可能又は使い捨てであってよい。再使用可能ペン送達デバイスは、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一旦、カートリッジ内の全部の医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄することができ、そして医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。ペン送達デバイスは、その後再使用できる。使い捨てのペン送達デバイスには、交換可能なカートリッジは無い。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、予め医薬組成物が充填されデバイス内のリザーバに保持された状態で売られている（come）。一旦リザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全部が破棄される。
【００８８】
多数の再使用可能ペン及び自己注射器送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、もちろん限定されないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark）、ＢＤ（商標）ペン（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Sanofi-Aventis, Frankfurt,
Germany）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン送達デバイスの例としては、もちろん限定されないが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Sanofi-Aventis）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Novo Nordisk）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Eli Lilly）が挙げられる。
【００８９】
目の障害を処置するために、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、例えば点眼薬、結膜下注射、結膜下埋め込み、硝子体内注射、硝子体内埋め込み、テノン嚢下注射、又はテノン嚢下埋め込みによって投与されてもよい。
【００９０】
医薬組成物はまた、小胞に入れて、特にリポソームで送達することができる（Langer 1990 Science 249:1527-1533；Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365；Lopez-Berestein, 同書, pp. 317-327を参照）。
【００９１】
特定の状況において、医薬組成物は制御放出システムで送達させることができる。１つの実施態様では、ポンプが使われてもよい（Langer, 上掲; Sefton 1987 CRC Crit. Ref.
Biomed. Eng. 14:201を参照）。別の実施態様では、ポリマー材料を使うことができる。さらに別の実施態様では、制御放出システムは組成物の標的の近傍に置くことができ、従って必要なのは全身投与量のほんの一部分だけである（例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138を参照）。
【００９２】
注射可能な製剤には、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射製剤は、公知の方法で製造してもよい。例えば、注射製剤は、例えば上記の抗体又はその塩を、従来注射用に使われる無菌の水性溶媒又は油性溶媒に溶解、懸濁又は乳化することによって製造してもよい。注射用の水性溶媒としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張液などがあり、それらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤｛例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加化合物｝などとの組合せで使用されてもよい。油性溶媒としては、例えばゴマ油、大豆油などが用いられ、それらはベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどとの組合せで使用されてもよい。そのようにして製造された注射液は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【００９３】
有利には、上記の経口又は非経口用の医薬組成物は、活性成分の投与量に適合する単位投与量の製剤に製造される。そのような単位投与量の製剤としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、一般に単位投与量の製剤当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射液の形態では、前述の抗体が約５〜約１００ｍｇで含まれることが好ましくそして他の剤形には約１０〜約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。
【００９４】
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、とりわけ、血管形成に関係する疾患又は障害を含めて、Ａｎｇ−２活性が関係するいかなる疾患又は障害の処置、予防及び／又は改善のために有用である。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、例えば、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、消化管、男女生殖器官、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫システム、造血細胞及び骨髄、肝臓及び尿道、並びに眼などの特殊感覚器官に発生する原発性及び／又は転移性腫瘍を処置するために使用してもよい。或る実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の次のがん：腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、又はメラノーマ、を処置するために使われる。
【００９５】
本発明の抗体及び抗原結合フラグメントはまた、１つ又はそれ以上の眼の障害の処置に有用であり得る。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントで処置できる例示的な眼の障害としては、例えば、加齢に関連した黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び他の脈絡膜血管新生、血液漏出、網膜浮腫及び炎症に関連した眼の障害が挙げられる。加えるに、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、緑内障手術に対して初期の血管及びリンパ管形成並びに緑内障手術後の濾過胞へのマクロファージ動員を遮断し、臨床転帰を改善するアジュバントとして投与してもよい。
【００９６】
本発明の他の実施態様では、抗体又は抗原結合フラグメントは、高血圧、糖尿病（非インスリン依存性糖尿病を含む）、乾癬、関節炎（関節リュウマチを含む）、ぜんそく、敗血症、腎臓病及び傷害に関連する浮腫、脳梗塞又は腫瘍を処置するために使用される。
【００９７】
Ａｎｇ−２発現は、さまざまな炎症性及び／又は感染性疾患の重症度と相関することが示されている（例えば、Siner et al., 2009, Shock 31:348-353; Yeo et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):105:17097-17102を参照）。従って、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、１つ又はそれ以上の炎症性又は感染性疾患を処置、予防又は改善するために使用することができる。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体を投与することによって処置、予防又は改善することができる例示的な感染性疾患としては、限定されないが、マラリア（Plasmodium falciparum感染）、ウイルス性出血熱（例えば、デング熱）、リケッチア感染症、毒素性ショック症候群、敗血症、Ｃ型肝炎、バルトネラ・バシリフォルミス（Bartonella bacilliformis）感染症、リーシュマニア症、マイコバクテリア感染症、エプスタイン・バー・ウイルス感染症が挙げられる。
【００９８】
併用療法
併用療法には、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体と、例えば別のＡｎｇ−２アンタゴニスト（例えば、抗Ａｎｇ−２抗体、ペプチボディ（peptibody）、又はＣＶＸ−０６０（米国特許第７，５２１，４２５号参照）などのＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ）が挙げられる。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、例えばＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号参照、（また、本明細書で「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質（fusion protein）」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼインヒビター（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ又はパゾパニブ）、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、ＲＥＧＮ４２１などの米国特許第２００９／０１４２３５４号に開示の抗ＤＬＬ４抗体）など）と共に、又は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体又はＥＧＦＲ活性の低分子インヒビター）と共に投与してもよい。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体と併用で有利に投与されてもよい他の薬剤としては、低分子サイトカインインヒビター及びＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインと又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含む、サイトカインインヒビターが挙げられる。本発明はまた、本明細書で言及される抗Ａｎｇ−２抗体のいずれかと１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ，又は前記サイトカインのいずれかのインヒビターとの治療的組み合わせを含み、ここでインヒビターは、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；又は二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニ抗体及び最小認識ユニットなどの他の工学的分子）である。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、抗ウイルス剤、鎮痛剤、副腎皮質ステロイド及び／又はＮＳＡＩＤとの併用で投与してもよい。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、放射線療法及び／又は従来の化学療法を含む治療計画の一部として投与してもよい。１つ又はそれ以上のさらなる薬剤と併用する場合、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、他の薬剤の投与の前に、同時に（例えば、同一の製剤で若しくは別々の製剤で）又は後に投与してもよい。
【００９９】
抗体の診断的使用
本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、例えば診断の目的で、サンプル中のＡｎｇ−２を検出及び／又は測定するために使用してもよい。例えば、抗Ａｎｇ−２抗体又はそのフラグメントは、Ａｎｇ−２の異常発現（例えば、過剰発現、低発現、発現の欠如など）によって特徴付けられる状態又は疾患を診断するために使用してもよい。例示的なＡｎｇ−２の診断的アッセイは、例えば、患者から得たサンプルを本発明の抗Ａｎｇ−２抗体と接触させることを含み、ここで抗Ａｎｇ−２抗体は、検出可能な標識又はレポータ分子で標識されている。或いは、標識されていない抗Ａｎｇ−２抗体は、それ自身が検出可能に標識された第２の抗体と組み合わせて診断的用途に使用することができる。検出可能な標識又はレポータ分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、又は125Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアナート、若しくはローダミンなどの蛍光又は化学発光部分；又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼなどの酵素であればよい。サンプル中のＡｎｇ−２を検出又は測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイとしては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのようにして作りそして使うかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するもので、本発明者らが自分らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して、正確性を確保する努力はされているが、幾つかの実験的なエラー及び偏差を考慮すべきである。特に断りのない限り、割合は重量による割合、分子量は平均分子量、温度は摂氏温度、そして圧力は大気圧又はその近傍である。
【０１０１】
〔実施例１〕：ヒトＡｎｇ−２に対するヒト抗体の生成
ヒトＡｎｇ−２抗原を、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに直接投与した。抗体免疫応答は、Ａｎｇ−２特異的免疫アッセイでモニターした。目的の免疫応答が得られたら、脾臓細胞を採取し、その生存能力を保存しハイブリドーマ細胞株を形成させるためにマウスミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞株は、スクリーニングし選択してＡｎｇ−２特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を用いて、数個の抗Ａｎｇ−２キメラ抗体（即ち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを持つ抗体）を得た；この方法で生成された例示的な抗体は、次のように命名した：Ｈ１Ｍ７２４、Ｈ１Ｍ７２７、Ｈ１Ｍ７２８、Ｈ２Ｍ７３０、Ｈ１Ｍ７３２、Ｈ１Ｍ７３７、Ｈ２Ｍ７４２、Ｈ２Ｍ７４３、Ｈ２Ｍ７４４、Ｈ１Ｍ７４９、Ｈ２Ｍ７５０及びＨ１Ｍ８１０。
【０１０２】
抗Ａｎｇ−２抗体はまた、米国特許第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載されるように、ミエローマ細胞と融合させることなく、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を用いて、数個の完全ヒトＡｎｇ−２抗体（即ち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを持つ抗体）を得た；この方法で生成された例示的な抗体は、次のように命名した：Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９３、Ｈ１Ｈ６９４、Ｈ１Ｈ６９５、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０４、Ｈ１Ｈ７０６及びＨ１Ｈ７０７。
【０１０３】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗Ａｎｇ−２抗体の生物学的特性は、以下に記載される実施例で詳細に説明される。
【０１０４】
〔実施例２〕：可変（variable）遺伝子利用解析
産生された抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローン化し配列を決定した。抗体の核酸配列及び予測されるアミノ酸配列から、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の遺伝子使用を同定した（表１）。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
表２は、選択された抗Ａｎｇ−２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列対並びにそれらの対応する抗体識別子を示す。Ｎ、Ｐ及びＧの記号表示は、同じＣＤＲ配列を持つが、ＣＤＲ配列から外れた領域（即ち、フレームワーク領域）に配列変異を持つ重鎖及び軽鎖を有する抗体を指す。従って、特定の抗体のＮ、Ｐ及びＧ変異体は、それらの重鎖及び軽鎖可変領域内に同じＣＤＲ配列を有するが、フレームワーク領域内に変更を含む。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
以下の実施例で使われるコントロール構造（control construct）
さまざまなコントロール構造（抗Ａｎｇ−２抗体及び抗Ａｎｇ−２ペプチボディ）は、比較の目的で以下の実験に含めた。コントロール構造は次のように命名した：コントロールＩ：米国特許第２００６／００１８９０９号に記載のように（また、Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516を参照）、「Ａｂ５３６（ＴＨＷ）」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを持つヒト抗Ａｎｇ−２抗体；コントロ
ールＩＩ：米国特許第７，２０５，２７５号に記載のように（また、Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516を参照）、「２ＸＣｏｎ４（Ｃ）」のアミノ酸配列を有するヒトＡｎｇ−２に結合するペプチボディ；コントロールＩＩＩ：米国特許第７，１３８，３７０号に記載のように、「Ｌ１−７」のアミノ酸配列を有するヒトＡｎｇ−２に結合するペプチボディ；コントロールＩＶ：米国特許第２００６／０２４６０７１号に記載のように、「３．１９．３」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを持つヒト抗Ａｎｇ−２抗体；及びコントロールＶ：国際公開公報第２００９／０９７３２５号に記載のように、「ＭＥＤＩ１／５」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを持つヒト抗Ａｎｇ−２抗体。（すべてのコントロール構造が全実施例に使われるとは限らない）。以下の表で、記号の「Ａｂ」及び「Ｐｂ」は、それぞれ抗体及びペプチボディ・コントロールを同定するために含めた（即ち、コントロールＩ＝Ａｂ；コントロールＩＩ＝Ｐｂ；コントロールＩＩＩ＝Ｐｂ；コントロールＩＶ＝Ａｂ；及びコントロールＶ＝Ａｂ）。
【０１０９】
〔実施例３〕：抗原結合親和力測定
選択され精製されたＡｎｇ−２抗体と、ヒト（配列番号５１９）、マウス（Mus musculus；配列番号５２０）及びサル（Macca fascicularis；配列番号５２１）のヒトＩｇＧ１（配列番号５２８）とコンジュゲートしたＡｎｇ−２（Ａｎｇ−２ＦＤ）の二量体フィブロネクチン様ドメインとの結合の平衡解離定数（ＫD値）は、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイを用いた表面動力学によって測定した。抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＣＭ５センサーチップに直接アミンカップリングで作られたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体表面、ヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体（Southern Biotech, Birmingham, AL）表面又はヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA）表面に捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。異なる濃度（５０ｎＭ〜６．２５ｎＭの範囲）のタンパク質を、捕捉された抗体表面上に１００μＬ／分で９０秒間注入した。抗原・抗体の結合及び解離は、室温で、リアルタイムにモニターした。ＫD及び抗原／抗体複合体解離の半減期を計算するために、動力学的解析を行った。結果は、下の表３にまとめた。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
上記の実験は、ヒトＩｇＧ１上にクローン化された、選択され精製された抗Ａｎｇ−２抗体を用いて繰り返した。結果は、下の表４にまとめた。
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
さらに異種間親和性を評価するために、選択された抗Ａｎｇ−２抗体を用いて、異なる２つの温度でさらなる結合実験を行った。それぞれの選択された抗体又はコントロール構造を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で作られたヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体表面に４０μＬ／分で１分間捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。ヒト、サル及びマウスＡｎｇ−２ＦＤ−Ｆｃを、２５ｎＭ又は０．７８ｎＭの濃度で、捕捉された抗体表面上に６０μＬ／分の流速で３分間注入し、抗原・抗体の解離を２５℃又は３７℃のいずれかで、リアルタイムに２０分間モニターした。
【０１１４】
結果は、下の表５（２５℃結合）及び表６（３７℃結合）にまとめた。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
別の実験で、ヒト「蝶ネクタイＡｎｇ−２」の四量体構造（「ｈＢＡ２」）に結合する選択され精製された抗体のＫD値を（上記の方法を用いて）測定した。ｈＢＡ２は２つの二量体から成り、それぞれの二量体は互いにヒトＦｃドメインによって連結した２つのＡｎｇ−２フィブロネクチン様ドメインを含む。ｈＢＡ２の二量体成分のアミノ酸配列は、配列番号５２２で示される。結果を、下の表７にまとめた。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
さらに別の実験において、野生型ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２−ＷＴ；配列番号５１８）及びヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２ＦＤ）のフィブリノーゲン様ドメインに結合する選択され精製された抗体のＫD値を（上記のように）測定した。結果は、下の表８にまとめた。
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
【表８】
【０１２１】
選択された抗Ａｎｇ−２抗体の単量体ｈＡｎｇ−２ＦＤに対する２５℃及び３７℃における結合特性を測定するために、さらなる実験を行った。それぞれの選択された抗体又はコントロール構造を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で作られたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体表面に４０μＬ／分の流速で１分間捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。ヒトＡｎｇ−２ＦＤを、５００ｎＭ又は７．８ｎＭの濃度で、捕捉された抗体表面上に６０μＬ／分の流速で３分間注入し、抗原・抗体の解離を２５℃又は３７℃のいずれかで、リアルタイムに２０分間モニターした。
【０１２２】
結果は、下の表９（２５℃結合）及び表１０（３７℃結合）にまとめた。Ｎ／Ｄ＝測定されない。
【０１２３】
【表９】
【０１２４】
この実施例に示すように、実施例１に従って生成された数個の抗Ａｎｇ−２抗体は、コントロールと同等又はそれより高い親和性でＡｎｇ−２構造に結合する。例えば、抗体Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ７２４及びＨ１Ｈ７４４は、二量体ヒトＡｎｇ−２−ＦＤとそれぞれ７１．４、７９、１１５、及び１１４ｐＭのＫDで結合したのに対して、コントロールＩの抗体は、二量体ヒトＡｎｇ−２−ＦＤと３９９ｐＭのＫDで結合した（表４を参照）。同様に、抗体Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ７２４及びＨ１Ｈ７４４は、ヒトＢＡ２（四量体Ａｎｇ−２フィブリノーゲン様ドメイン構造）とそれぞれ１１．９、１７．９、２３．３及び１７．２ｐＭのＫDで結合したのに対して、コントロールＩの抗体は、ｈＢＡ２と８３ｐＭのＫDで結合した（表７を参照）。従って、コントロール構造と比較すると、多くの本発明の抗体は、Ａｎｇ−２に対して増強した結合性を示した。抗体のＨ１Ｈ６８５Ｐは、コントロール構造と比較すると、Ａｎｇ−２に対して特に強固な結合特性を示した。
【０１２５】
〔実施例４〕：Ａｎｇ−１を超すＡｎｇ−２に対する優先的結合
選択された抗体がＡｎｇ−２及びＡｎｇ−１の両者に結合するかどうか、又はそれらが選択的にＡｎｇ−２だけに結合するかどうかを確認するために、結合実験（プラズモン共鳴アッセイ）を行った。それぞれの選択された抗体又はコントロール構造を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で作られたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体表面に４０μＬ／分の流速で１分間捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。完全野生型ヒトＡｎｇ−１又はＡｎｇ−２を、２５ｎＭ又は０．７８ｎＭの濃度で、捕捉された抗体表面上に６０μＬ／分の流速で３分間注入し、抗原−抗体の解離を２５℃又は３７℃のいずれかで、リアルタイムに２０分間モニターした。
【０１２６】
これらの実験結果を、下の表１１〜１４にまとめた。Ｎ／Ｄ＝測定されない。「非結合（No binding）」は、これらの実験で用いた特定の実験条件下で、検出可能な結合は観察されないことを意味する。
【０１２７】
【表１０】
【０１２８】
【表１１】
【０１２９】
【表１２】
【０１３０】
【表１３】
【０１３１】
これらの結果は、Ｈ１Ｈ６８５Ｐは高い親和性でＡｎｇ−２に結合するがＡｎｇ−１とは結合しないという点で、本実験で試験した抗体の中でユニークであることを示す。唯一、Ａｎｇ−２に結合するがＡｎｇ−１に結合しない他の構造はコントロールＩＩＩである。しかし、コントロールＩＩＩはペプチボディでありそして本実験で試験した全ての他の抗体はＡｎｇ−２及びＡｎｇ−１の両者に結合することを重要視すべきである。Ａｎｇ−２結合に対する選択性は、Ａｎｇ−２及びＡｎｇ−１の両者に結合する抗体にはない、治療的利益をＨ１Ｈ６８５Ｐに与える可能性がある。
【０１３２】
〔実施例５〕：ヒトＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２結合の阻害
Ｔｉｅ−２はＡｎｇ−２の天然受容体である。ヒトＴｉｅ−２（ｈＴｉｅ−２）に対するＡｎｇ−２の結合を遮断する抗Ａｎｇ−２抗体の能力について試験した。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ（マウスＩｇＧとコンジュゲートしたヒトＴｉｅ−２から成るキメラ構造；配列番号５２５）を、２μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルプレート上にコーティングし、一晩インキュベートした後洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で４回洗浄した。プレートは次に、０．５％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）を含むＰＢＳ（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）を用いて、室温で１時間ブロッキングした。別のプレートで、精製抗Ａｎｇ−２抗体を、出発濃度５０ｎＭで、プレートを横切って連続的に３倍に希釈した。ヒトＩｇＧとコンジュゲートしたヒト、マウス又はサルのＡｎｇ−２ＦＤタンパク質（Ａｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃ）をそれぞれ２ｎＭ、８ｎＭ、又は２ｎＭの終濃度で添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体／Ａｎｇ−２ＦＤ−Ｆｃ混合物を、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃを含むプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃタンパク質に結合したＡｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃの検出は、抗ヒトＩｇＧ抗体とコンジュゲートした西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA）によって測定し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用した標準的な比色反応によって展開させた。吸光度はＯＤ450で０．１秒間読み取った。１６．６７ｎＭの選択された抗Ａｎｇ−２抗体による、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃに対するＡｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃ結合の遮断パーセントは、表１５に示した。
【０１３３】
【表１４】
【０１３４】
同じような実験で、選択され精製された、ヒトＩｇＧ１上にクローン化された抗Ａｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２ＦＤの結合を遮断する能力を（上記のように）試験した。１６．６７ｎＭの選択された抗Ａｎｇ−２抗体による、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃに対するＡｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃ結合の遮断パーセントは、表１６に示した。ＮＴ：試験しない。
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
別の実験で、選択され精製された抗Ａｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対する２０ｐＭのビオチン化ｈＢＡ２の結合を遮断する能力を（上記のように）試験した。この実験のために、ヒスチジン標識をコンジュゲートしたヒトＴｉｅ−２（ｈＴｉｅ−２−Ｈｉｓ；配列番号５２６）を上記のｈＴｉｅ−２−ｍＦｃと同様の方法で使用した。５ｎＭからの抗体濃度は連続的に３倍に希釈した。ＩＣ50（阻害濃度）値は、Ｔｉｅ−２に対するビオチン−ｈＢＡ２結合に由来するシグナルの５０％遮断に必要な抗体量を計算することによって求めた。各抗体の平均ＩＣ50値は、別の２つの実験を基に算定した。結果は、表１７にまとめた。ＮＢ：５ｎＭの濃度で遮断が観察されない。
【０１３７】
【表１６】
【０１３８】
同様の実験で、選択され精製された、ヒトＩｇＧ１上にクローン化された抗Ａｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対するビオチン化ｈＢＡ２の結合を遮断する能力を（上記のように）試験した。結果は、表１８に示した。ＮＢ：５ｎＭの濃度で遮断が観察されない。
【０１３９】
【表１７】
【０１４０】
本実施例は、実施例１の方法に従って生成された幾つかの抗Ａｎｇ−２抗体が、Ａｎｇ−２のフィブリノーゲン様ドメインとその受容体（Ｔｉｅ−２）との相互作用を、コントロールの抗体と同等又はそれ以上の強さで遮断したことを示す。例えば、抗体のＨ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９５、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０４、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｈ７０７、Ｈ１Ｈ７２４及びＨ１Ｈ７４４のそれぞれは、コントロール構造で観察された結果と同様に（表１６を参照）、Ｔｉｅ−２受容体に対するヒト、マウス及びサルのＡｎｇ−２ＦＤ構造に９５％以上の遮断を起こした。
【０１４１】
〔実施例６〕：ヒトＴｉｅ−２に対する完全Ａｎｇ−２及びＡｎｇ−１の結合の阻害
Ｔｉｅ−２は、Ａｎｇ−１並びにＡｎｇ−２に対する受容体である。従って、本実施例では、いくつかの抗Ａｎｇ−２抗体の、ヒトＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２又はＡｎｇ−１の結合を遮断する能力を測定し比較した。
【０１４２】
本実施例で示されるＥＬＩＳＡ実験は、実施例５の実験と同様の方法で行った。つまり、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ（マウスＩｇＧとコンジュゲートしたヒトＴｉｅ−２から成るキメラ構造；配列番号５２５）を、２μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルプレート上にコーティングし、一晩インキュベートした後洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で４回洗浄した。プレートは次に、０．５％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）を含むＰＢＳ（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）を用いて、室温で１時間ブロッキングした。別のプレートで、精製抗Ａｎｇ−２抗体及びコントロール構造を、出発濃度３００ｎＭで、プレートを横切って連続的に３倍に希釈した。６Ｘヒスチジン・タグ（R&D Systems, Minneapolis, MN）とコンジュゲートした完全ヒトＡｎｇ−２又はＡｎｇ−１タンパク質を０．６ｎＭの終濃度で添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体／抗原混合物をｈＴｉｅ−２−ｍＦｃを含むプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃタンパク質に結合したＡｎｇ−２−Ｈｉｓ又はＡｎｇ−１−Ｈｉｓの検出は、抗ヒトＩｇＧ抗体とコンジュゲートした西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA）によって測定し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用した標準的な比色反応によって展開させた。吸光度はＯＤ450で０．１秒間読み取った。ＩＣ50（阻害濃度）値は、Ｔｉｅ−２に対するヒトＡｎｇ−２又はＡｎｇ−１の結合に由来するシグナルの５０％遮断に必要な抗体量を計算することによって求めた。ＩＣ50の観点で表した結果を、表１９のカラム（１）及び（２）に示した。抗体又はコントロール構造が、ｈＡｎｇ−１／Ｔｉｅ−２相互作用を遮断する程度と比較したｈＡｎｇ−２／Ｔｉｅ−２相互作用を遮断する程度は、カラム（３）に示されるＩＣ50の倍率差に反映される；即ち、カラム（３）の高い数字は、ｈＡｎｇ−１／Ｔｉｅ−２相互作用よりもｈＡｎｇ−２／Ｔｉｅ−２相互作用を遮断する能力が大きいことを示す。
【０１４３】
【表１８】
【０１４４】
Ｔｉｅ−２に対するＡｎｇ−１の結合を遮断する選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体の能力をさらに評価する目的で、バイオセンサー表面プラズモン共鳴実験を行った。本実験では、ヒトＴｉｅ−２完全細胞外ドメイン構造（ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ−ｅｃｔｏ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上にアミンカップリングさせ、受容体でコーティングされた表面を作成した。選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体及びコントロール構造、１μＭ（抗原に対して100倍過剰）を、１０ｎＭのｈＡｎｇ−１−ＷＴとプレミックスし、続いて２５℃で６０分間インキュベートして抗体−抗原結合を平衡に至らしめ、平衡溶液を形成させた。平衡溶液は、２５℃で、受容体表面上に５μＬ／分で５分間注入した。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃに対するｈＡｎｇ−１−ＷＴの結合に起因する共鳴単位（ＲＵ）の変化を測定した。ゼロ％遮断のベースラインを設定するために、ｈＡｎｇ−１に結合しない無関係のペプチボディを本実験に含め、そしてヒトＴｉｅ−２−ｍＦｃ構造を、遮断のポジティブ・コントロールとして使用した。抗体とプレインキュベーション後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量は、ネガティブ・コントロールとプレインキュベーション後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量のパーセントとして表し、表２０に示した。（Ｔｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量が多いほど抗体による遮断の程度が低いことを意味する）。
【０１４５】
【表１９】
【０１４６】
上述の実験を、異なる量のＡｎｇ−２遮断剤及びコントロールを用いて繰り返した。特に、ヒトＴｉｅ−２の完全細胞外ドメイン構造（ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ−ｅｃｔｏ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上にアミンカップリングさせ、受容体でコーティングされた表面を作成した。選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体及びコントロール構造（５０又は１５０ｎＭ）を、ｈＡｎｇ−２−ＷＴ（２５ｎＭ）と混合し、続いて２５℃で６０分間インキュベートして抗体−抗原結合を平衡に至らしめた。平衡溶液は、２５℃で、受容体表面上に１０μＬ／分で５分間注入した。選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−１−ＷＴの結合を遮断する能力を評価するため、抗体を３つの濃度（５０、１００又は１０００ｎＭ）で試験し１０ｎＭのｈＡｎｇ−１−ＷＴとインキュベートする以外は同じ手順に準じた。ｈＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２−ＷＴ又はｈＡｎｇ−１−ＷＴの結合に起因する共鳴単位（ＲＵ）の変化を測定した。ゼロ％遮断のベースラインを設定するために、どちらのアンジオポイエチンとも結合しない無関係の抗体を本実験に含め、そしてヒトＴｉｅ−２−ｍＦｃ構造を遮断のポジティブ・コントロールとして使用した。結果は、表２１（ｈＴｉｅ−２表面に適用したｈＡｎｇ−１）及び２２（ｈＴｉｅ−２表面に適用したｈＡｎｇ−２）にまとめた。
【０１４７】
【表２０】
【０１４８】
これらの実験で得られた結果は、Ｈ１Ｈ６８５ＰがＡｎｇ−１よりもＡｎｇ−２に優先的に結合することを示した前の結果（実施例４を参照）と一致する。具体的には、本実施例からの結果は、幾つかの抗Ａｎｇ−２抗体（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ及びＨ１Ｈ７０６Ｐ）はヒトＴｉｅ−２に対するヒトＡｎｇ−１の結合を有意には遮断しないことを示す、にもかかわらず、他の実験でこれらの抗体はＡｎｇ−２とＴｉｅ−２の相互作用を強く遮断することが明示された（実施例５、表１６を参照）。さらに、これらの実験で、コントロールＩＩＩペプチボディを除いて、どのコントロール構造も、Ｈ１Ｈ６８５Ｐの様な本発明の典型的な抗Ａｎｇ−２抗体と同じ程度のＡｎｇ−１を越えたＡｎｇ−２との優先的な結合／遮断を示さなかった。
【０１４９】
〔実施例７〕：抗Ａｎｇ−２抗体によるＡｎｇ−２媒介Ｔｉｅ−２リン酸化の阻害
本発明の発明者らは、Ａｎｇ−２の発現が、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）内で転写因子ＦＯＸＯ１によって誘導できることを明らかにした（Daly et al. 2006 PNAS
103:15491）。さらに、本発明者らは、ＦＯＸＯ１をコードするアデノウイルスによるＨＵＶＥＣの感染は、Ａｎｇ−２の発現及び分泌、続いてＴｉｅ−２リン酸化の活性化引き起こすことを示した（Daly et al. 2006 PNAS 103:15491）。
【０１５０】
抗Ａｎｇ−２抗体の、Ｔｉｅ−２リン酸化を阻害する能力を試験した。つまり、７×１０5のＨＵＶＥＣｓ（Vec Technologies, Rensselaer, NY）を、６ｃｍ細胞培養用ディッシュ内の３．５ｍＬのＭＣＤＢ１３１コンプリート培地（Vec Technologies, Rensselaer, NY）に播種した。翌日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）で洗浄し、２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；コントロール）又はヒトＦＯＸＯ１（Daly et al. 2004 Genes Dev. 18:1060）のいずれかをコードする組み換えアデノウイルスを、１０ｐｆｕ／細胞の濃度で細胞に添加し、４時間インキュベートした。次に、細胞をＭＣＤＢ１３１で洗浄し、抗Ａｎｇ−２抗体を０．５μｇ／ｍＬの濃度で含む２ｍＬのＭＣＤＢ１３１を加えた。感染後２０時間に、細胞を溶解させ、Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15491-15496 (2006) に記載されたように、Ｔｉｅ−２免疫沈降を行った。免疫グロブリンを１時間、プロテインＡ／Ｇビーズ（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）上に集めた。ビーズは冷溶解バッファーで洗浄し、ホスホチロシン（Millipore, Billerica, MA）又はＴｉｅ−２に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットで分析するためにＳＤＳサンプルバッファーに再懸濁させた。シグナルは、ＨＲＰをコンジュゲートした第２の抗体及びＥＣＬ試薬（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて検出した。Ｘ線フィルムを走査し、ホスホＴｉｅ−２及びＴｉｅ−２シグナルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２比は、各抗Ａｎｇ−２抗体の％阻害（即ち、％阻害＝コントロールに比較したときのホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２の低下率）を測定するために用いた。例えば、コントロールサンプルで観測されるレベルへのＴｉｅ−２リン酸化の減少は、１００％阻害であると考えられる。観測された％阻害（それぞれ、２５〜５０％、５０〜７５％、７５〜１００％）に従って、試験した各抗Ａｎｇ−２抗体の相対的な阻害（＋、＋＋、＋＋＋）は、表２３に示した。
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
本実施例で示されたように、実施例１の方法に従って生成された抗Ａｎｇ−２抗体は、コントロールＩ抗体よりも大幅にＴｉｅ−２リン酸化を阻害した。特に、抗体Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９３、Ｈ１Ｈ６９５、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０４、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｈ７０７、Ｈ１Ｍ７２４、Ｈ１Ｍ７４４及びＨ１Ｍ７５０で、強い阻害が観察された。
【０１５３】
〔実施例８〕：Ａｎｇ−１媒介Ｔｉｅ−２リン酸化の阻害
前の実施例で示したように、Ａｎｇ−２は、Ｔｉｅ−２のリン酸化を媒介する。Ａｎｇ−１もまた、Ｔｉｅ−２のリン酸化を促進させる。本実施例では、選択された抗Ａｎｇ−
２抗体の、Ａｎｇ−１が媒介するＴｉｅ−２のリン酸化を遮断する能力を評価した。
【０１５４】
ＥＡ．ｈｙ９２６細胞（Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3734-3737 (1983)）を、１０％ＦＢＳ、ＨＡＴ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有した１０ｍＬのＤＭＥＭに、１０ｃｍディッシュ当たり５×１０6細胞を播種した。２４時間後、細胞を、１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ中で１時間、血清飢餓状態にした。次に細胞を、４００ｎＭの関係のないイソ型コントロール抗体（“９Ｅ１０”）若しくは抗Ａｎｇ−２抗体のＨ１Ｈ６８５Ｐ、又は１０〜４００ｎＭの範囲の濃度のコントロール物質（コントロールＩ、コントロールＩＩ、コントロールＩＶ、又はコントロールＶ）のいずれかの存在下、５００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＡｎｇ−１（R&D Systems）で１０分間刺激した。
【０１５５】
インキュベーションの後、細胞を溶解し、Ｔｉｅ−２は、Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15491-15496 (2006) に記載されている様に、免疫沈降させた。免疫複合体は、プロテインＡ／Ｇビーズ（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と６０分間インキュベーションして集めた。ビーズは冷溶解バッファーで洗浄し、結合したタンパク質は、ＳＤＳサンプルバッファー中で加熱することによって溶出させた。サンプルは次に、Ｔｉｅ−２又はホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（クローン４Ｇ１０、Millipore, Billerica, MA）を用いたウェスタンブロット解析に供した。結果は図２に示した。
【０１５６】
シグナルは、ＨＲＰをコンジュゲートした第２の抗体及びＥＣＬ試薬（GE Healthcare,
Piscataway, NJ）を用いて検出した。Ｘ線フィルムを走査し、ホスホＴｉｅ−２及びＴｉｅ−２シグナルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２比は、各抗体又はペプチボディの％阻害を決定するために使用した。％阻害＝コントロールサンプル（４００ｎＭｎｏイソ型コントロール抗体）と比較したときのホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２の低下率。
【０１５７】
コントロール抗体９Ｅ１０の存在下で、Ａｎｇ−１はＴｉｅ−２のリン酸化を強力に活性化させた（図２、パネルＡ：レーン２及び３をレーン１と比較する）。試験した全てのコントロール物質は、コントロールＩＩ（図２、パネルＢ：レーン１７）は５０ｎＭで、コントロールＩＶ（図２、パネルＡ：レーン１１）は１００ｎＭで並びにコントロールＩ（図２、パネルＢ：レーン２４）及びコントロールＶ（図２、パネルＣ：レーン９）は２００ｎＭで完全な阻害が起こり、Ｔｉｅ−２のリン酸化を有意に阻害した。これに反して、Ｈ１Ｈ６８５Ｐは、４００ｎＭでも有意な阻害作用を有さない（図２、パネルＡ：レーン４〜８）。これらの結果は、Ａｎｇ−１よりもＡｎｇ−２に対するＨ１Ｈ６８５Ｐの特異性のさらなる確証を提供する。
【０１５８】
〔実施例９〕：抗Ａｎｇ−２抗体による腫瘍増殖の阻害
選択され精製された抗Ａｎｇ−２抗体の腫瘍増殖に対する作用を、２つの腫瘍細胞株を用いて測定した。
【０１５９】
ＰＣ３（ヒト前立腺がん細胞株）
手短に言うと、５×１０6個のＰＣ３細胞を含む１００μＬの成長因子削減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）を、６〜８週齢の雄性ＮＣｒヌードマウス（Taconic, Hudson,
NY）の側腹部に皮下注入した。腫瘍の体積が平均約２００ｍｍ3に達した後、マウスを、処置用に無作為にグループ分けした。各処置グループのマウスには、抗Ａｎｇ−２抗体、Ｆｃタンパク質、又はコントロール構造を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、週２回で約３週間、腹腔内注射によって（表２４）、又は２．５、１２．５、若しくは２５ｍｇ／ｋｇの濃度で、週２回で約３週間、皮下注射によって（表２５）投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した。腫瘍重量及び増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃタンパク質の測定値との対比から計算した。結果は、表２４及び２５にまとめた。
【０１６０】
【表２２】
【０１６１】
上に示したように、抗体のＨ１Ｈ７４４Ｎ及びＨ１Ｈ６８５Ｐは、ＰＣ３マウス腫瘍モデルで、コントロール構造と比較して、特に著明な抗腫瘍活性を示した。
【０１６２】
ＰＣ３マウス腫瘍モデル及び違う実験抗体（２ｍｇ／ｋｇで投与、週２回）を使った同様な実験の結果を、表２６及び２７に示した。
【０１６３】
【表２３】
【０１６４】
ＣＯＬＯ２０５（ヒト結腸直腸腺がん細胞株）
手短に言うと、２×１０6個のＣＯＬＯ２０５細胞を含む１００μＬの無血清培地を、６〜８週齢の雄性ＮＣｒヌードマウス（Taconic, Hudson, NY）の側腹部に皮下注入した。腫瘍の体積が平均約１５０ｍｍ3に達した後、マウスを、抗体処置グループ又はＦｃタンパク質処置グループに無作為にグループ分けした。各処置グループのマウスは、抗Ａｎｇ−２抗体又はＦｃタンパク質を４ｍｇ／ｋｇの濃度で、週２回で約２週間、腹腔内注射によって投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した。腫瘍重量及び増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。「平均腫瘍増殖」は、処置開始時（腫瘍が約１５０ｍｍ3のとき）からの平均増殖を表す。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃタンパク質の測定値との対比から計算した。結果は、表２８にまとめた。
【０１６５】
【表２４】
【０１６６】
Ｈ１Ｈ６８５Ｐの効果、特にＣＯＬＯ２０５の増殖に対する効果を評価するために、同様な実験を行った。つまり、２×１０6個のＣＯＬＯ２０５細胞を含む１００μＬの無血清培地を、９〜１１週齢の雄性ＳＣＩＤ ＣＢ１７マウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍が約１２５ｍｍ3に達したとき、マウスを無作為に５グループ（ｎ＝７〜８マウス／グループ）に分け、Ｆｃタンパク質（１５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ（５又は２５ｍｇ／ｋｇ）又はコントロールＩＩ（５又は２５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、１９日間処置した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した。処置開始からの腫瘍重量及び増殖の平均は、各グループについて計算した。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃコントロールグループとの対比から計算した。結果は、表２９にまとめた。
【０１６７】
【表２５】
【０１６８】
ＰＣ３マウス腫瘍モデルと同様に、Ｈ１Ｈ６８５Ｐを含めて本発明の抗体のうちのいくつかは、ＣＯＬＯ２０５マウスモデルで実質的な抗腫瘍活性を示し、そしてそれはコントロール分子によって示された抗腫瘍活性と少なくとも同等であった。
【０１６９】
〔実施例１０〕：腫瘍増殖の阻害並びに抗Ａｎｇ−２抗体及びＶＥＧＦインヒビターの併用による潅流
抗Ａｎｇ−２抗体とＶＥＧＦインヒビターとの組み合わせがＣＯＬＯ２０５異種移植片の増殖に及ぼす作用を測定するため、２×１０6細胞を６〜８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍の平均体積が約３５０ｍｍ3に達したとき、マウスを無作為に４グループ（ｎ＝６マウス／グループ）に分け、ヒトＦｃタンパク質（７．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（米国特許第７，０８７，４１１号を参照）（２．５ｍｇ／ｋｇ）又はＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用で処置した。マウスには、１０日の処置にわたって合計３回投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定した。処置開始からの腫瘍増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍増殖の低下パーセントは、Ｆｃタンパク質の測定値との対比から計算した。結果は、表３０に示した。
【０１７０】
【表２６】
【０１７１】
本実験の結果は、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用が腫瘍増殖の低下を引き起こすことを示し、そしてそれは、どちらの成分単独によって引き起こされる腫瘍増殖の低下パーセントよりも大きかった。
【０１７２】
併用の有効性を示すさらなる証拠を提供するため、ＭＭＴ腫瘍の増殖に及ぼすＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ併用の効果を評価した。０．５×１０6細胞を６〜８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍の平均体積が約４００ｍｍ3に達したとき、マウスを無作為に４グループ（ｎ＝１１マウス／グループ）に分け、ヒトＦｃタンパク質（１７．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（５ｍｇ／ｋｇ）又はＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用で処置した。Ｆｃ及びＨ１Ｈ６８５Ｐは、９日にわたって３回投与した。ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ及び併用グループは、１２日にわたって４回投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した（それらのサイズが大きいため、Ｆｃ及びＨ１Ｈ６８５Ｐグループからの腫瘍は、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ及び併用グループからの腫瘍よりも３日前に採取した）。処置開始からの腫瘍増殖及び腫瘍重量の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃコントロールグループとの対比から計算した。結果は、表３１に示した。
【０１７３】
【表２７】
【０１７４】
これらの結果は、単独の薬剤処置に比べて、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの強い腫瘍阻害効果を裏付ける。
【０１７５】
Ｈ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用が、腫瘍血管機能に対して単独の薬剤よりも大きな影響を有するかどうかを測定するため、マイクロ超音波（VisualSonics' Vevo 770 imaging system）を使用し、腫瘍潅流の変化を評価した。ＣＯＬＯ２０５腫瘍を約１２５ｍｍ3に増殖させ、次にマウスをＨ１Ｈ６８５Ｐ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ又は両薬剤の併用で２４時間処置した。処置の後、腫瘍血管潅流を、コントラスト増強マイクロ超音波２Ｄ画像収集及び腫瘍に入る造影剤の量を表す「ウォッシュ−イン（wash-in）」曲線の解析に基づいて測定した。平均（平均＋／−標準偏差）腫瘍潅流を、各グループについて計算した。低下パーセントは、Ｆｃコントロールグループとの対比から計算した。結果は、表３２に示した。
【０１７６】
【表２８】
【０１７７】
併用処置が潅流に及ぼす亢進した作用と一致して、腫瘍切片の抗ＣＤ３１染色は、併用が腫瘍血管密度に対してより強く作用することを示した（データの表示無し）。腫瘍血管系の機能に対してＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ併用が亢進した作用を持つことは、腫瘍増殖に対する併用療法の作用増強に対して、可能性がある説明を与える。
【０１７８】
〔実施例１１〕：抗Ａｎｇ−２抗体及び化学療法剤の併用による腫瘍増殖の阻害
化学療法剤と併用したＨ１Ｈ６８５Ｐの腫瘍増殖に及ぼす影響を試験するため、２．５×１０6個のＣＯＬＯ２０５腫瘍細胞を８〜９週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍の平均体積が約１５０ｍｍ3に達したとき（移植後１７日目）
、マウスを無作為に４グループ（ｎ＝５マウス／グループ）に分け、次のように処置した：第１のグループは、１５ｍｇ／ｋｇのＦｃで皮下に及び５−ＦＵの賦形剤で腹腔内に処置し；第２のグループは、１５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ６８５Ｐで皮下に処置し；第３のグループは、７５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内に処置し；第４のグループは、１５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ６８５Ｐで皮下に及び７５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内に併用で処置した。マウスは、合計３回処置され、３〜４日毎に投与された。腫瘍体積は実験を通して週２回測定した。処置開始から３８日目までの腫瘍増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍増殖の低下パーセントは、コントロールグループの測定値との対比から計算した。結果は、表３３に示した。
【０１７９】
【表２９】
【０１８０】
本実験の結果から、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ及び５−ＦＵの併用は、別々に投与したどちらの物質よりも腫瘍増殖に大きな低下をもたらした。
【０１８１】
〔実施例１２〕：抗Ａｎｇ−２抗体は眼血管形成を阻害する
本実施例では、選択された抗Ａｎｇ−２抗体のマウスモデルの網膜血管化に及ぼす作用を評価した。
【０１８２】
実験の１セットには、野生型マウスを使用した。別のセットでは、野生型マウスＡｎｇ−２の代わりにヒトＡｎｇ−２を発現するマウス（「ｈｕ−Ａｎｇ−２マウス」と命名）を使用した。２日齢のマウス（Ｐ２）に、コントロールＦｃ又は選択された抗Ａｎｇ−２抗体のいずれかを１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。３日後（Ｐ５で）、幼獣らを安楽死させて眼球を摘出し、４％ＰＦＡ中で３０分間固定した。網膜を切開し、バンデリア豆（Griffonia simplicifolia）レクチン−１で３時間又は４℃で１晩染色して脈管構造を可視可させ、顕微鏡スライド上に平らに載せた。画像はNikon Eclipse 80i顕微鏡カメラで撮り、Adobe Photoshop CS3、Fovea 4.0及びScion 1.63ソフトウェアを用いて解析した。
【０１８３】
表面の脈管構造で覆われた網膜の面積を測定し、抗体活性の読み出しとして使用した。Ｆｃ処置のコントロールと比較して、抗体で処置したマウスの脈管領域のサイズの減少は、表３４に提示した。脈管領域の減少パーセントは、抗体の抗血管形成力を反映する。（Ｎ／Ｄ＝測定しない）。
【０１８４】
【表３０】
【０１８５】
本実施例で示すように、本発明の選択された抗Ａｎｇ−２抗体は、インビボで眼血管形成を実質的に阻害しており、従って、他の治療状況におけるこれらの抗体の抗血管形成の潜在能力を反映している。
【０１８６】
〔実施例１３〕：抗体結合に重要なＡｎｇ−２のアミノ酸
ｈＡｎｇ−２と本発明の抗ｈＡｎｇ−２ｍＡｂの結合をさらに特徴付けるために、それぞれが単一の点突然変異を含む７つの変異ｈＡｎｇ２−ＦＤ−ｍＦｃタンパク質を作成した。突然変異のために選択したアミノ酸は、ｈＴｉｅ−２と相互作用する領域における、ｈＡｎｇ−２とｈＡｎｇ−１の間の配列の違いを基にした（図１）。特に、結晶構造解析に基づいてＴｉｅ−２と相互作用すると思われるＡｎｇ−２のフィブリノーゲン様ドメイン（ＦＤ）内のアミノ酸で、Ａｎｇ−１の対応するアミノ酸と異なるアミノ酸を、それぞれ対応するｈＡｎｇ−１の残基に変異させた。この例の結果は、Ａｎｇ−２に優先的に結合する抗体が相互作用するＡｎｇ−２のアミノ酸残基を示す。即ち、もし、Ａｎｇ−２の特定の残基（又は複数の残基）がＡｎｇ−１の対応する残基に変えられ、Ａｎｇ−２に優先的に結合する抗体の結合が実質的に低下したなら、抗体はｈＡｎｇ−２のその特定の残基と相互作用すると結論することができる。
【０１８７】
この実験では、７つのｈＡｎｇ２−ＦＤ−ｍＦｃ変異タンパク質のそれぞれは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で創られた抗マウスＦｃ表面に捕捉された（約１４７〜２８３ＲＵ）。次に、１００ｎＭの各Ａｎｇ−２抗体（又は、場合によってペプチボディ）を、捕捉されたｍＦｃ−標識ｈＡｎｇ−２ＦＤタンパク質表面に５０μＬ／分の流速で１８０秒間注入し、変異ｈＡｎｇ２−ＦＤ−ｍＦｃと抗体の解離を、２５℃で２０分間、リアルタイムでモニターした。結果は、表３５ａ〜３５ｄ及び図３に示した。
【０１８８】
【表３１】
【０１８９】
【表３２】
【０１９０】
【表３３】
【０１９１】
【表３４】
【０１９２】
本発明のために、抗Ａｎｇ−２抗体は、もし、その残基がＡｎｇ−１の相当する残基に変異した場合に、本実施例で用いた実験条件下で、解離のＴ1/2が野生型構造で観察される解離のＴ1/2より少なくとも５倍少ないなら、特定のＡｎｇ−２アミノ酸と相互作用すると見なされる。この定義に照らして、抗体のＨ１Ｈ６８５Ｐは、試験した抗体の中で、Ｆ４６９、Ｙ４７５及びＳ４８０と相互作用するという点において、ユニークであるように見える。Ｈ１Ｈ６８５Ｐはまた、Ａｎｇ−１を越えてＡｎｇ−２と強く優先的な結合をする故にユニークであるので、Ｆ４６９、Ｙ４７５及びＳ４８０は、Ａｎｇ−２とＡｎｇ−１の免疫学的な同定を可能にするエピトープを含むと結論することができる。この実験で試験した他の抗体／ペプチボディは、これらの残基のたかだか１個または２個と相互作用する；即ち、Ｈ１Ｈ７４４Ｎ及びコントロールＩはＹ４７５と相互作用し；コントロールＩＩＩはＹ４７５及びＳ４８０と相互作用し；そしてコントロールＶはＦ４６９と相互作用すると思われる。興味あることに、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２の両者とＴｉｅ−２との結合を同じ効力で遮断することが示されたコントロールＩＩは、この実験で確認されたどのＡｎｇ−２特異的アミノ酸とも相互作用しない。
【０１９３】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。確かに、本明細書に記載されたことに加えて本発明の様々な変更は、上述の説明から当業者には明らかになる。そのような変更は、添付の請求項の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的な抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、生物学的過程であり、それによって新しい血管が形成される。異常な血管形成は、例えば、増殖性網膜症、関節リュウマチ及び乾癬を含むいくつかの病状（disease condition）と関係がある。また、血管形成は、腫瘍の成長及び維持のために重要であることが十分に確立されている。アンジオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）は、Ｔｉｅ−２受容体（Ｔｉｅ−２）に対するリガンドであり、血管形成に関与することが示されている。Ａｎｇ−２は、業界ではＡｎｇ−２リガンドとも呼ばれる（特許文献１；非特許文献１）。
【０００３】
Ａｎｇ−２に結合する抗体及び他のペプチド性インヒビターは、特許文献２、３、４、５及び６に記載されている。業界では、血管形成によって引き起こされる又は悪化する疾患（disease）及び病態（condition）を処置する（treat）ために使用できる、Ａｎｇ−２抗体を含む新規なＡｎｇ−２調節剤が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，６４３，７５５号
【特許文献２】米国特許第６，１６６，１８５号
【特許文献３】米国特許第７，５２１，０５３号
【特許文献４】米国特許第７，２０５，２７５号
【特許文献５】米国特許第２００６／００１８９０９号
【特許文献６】米国特許第２００６／０２４６０７１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yancopoulos et al., 2000, Nature 407:242-248
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヒトＡｎｇ−２に結合するヒト抗体を提供する。本発明者らは、さまざまな証拠及び研究から見て、関連する分子のＡｎｇ−１に結合しない又は拮抗しないＡｎｇ−２インヒビターの必要性を認識してきた。例えば、これまでの研究は、Ａｎｇ−１が、止血（例えば、Li et al., 2001, Thrombosis and Haemostasis 85:191-374を参照）及び血漿漏出に対して成人血管系の防御（例えば、Thurston et al., 2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston et al., 1999, Science 286:2511-2514を参照）に果たす有益な役割を示し又は示唆してきた。このことから、本発明者らは、或る抗脈管形成による治療状況においては、Ａｎｇ−１活性を保存することが有利である可能性を認識した。従って、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合するが、Ａｎｇ−１には実質的に結合しない抗体を提供する。本発明はまた、Ａｎｇ−２とその受容体Ｔｉｅ−２の間の相互作用を阻害するが、Ａｎｇ−１とＴｉｅ−２の間の相互作用を実質的に阻害しない抗体を包含する。本発明の抗体は、とりわけ、Ａｎｇ−２の血管形成促進活性を阻害するため及び血管形成の過程によって起こされる又はそれに関連する疾患及び障害を処置するために有用である。
【０００７】
本発明の抗体は、完全（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であってもよく又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖフラグメント）だけを含んでもよく、及び機能性に影響を与えるように、例えば残存エフェクター機能を排除するように改変されてもよい。
【０００８】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４７４、４７８、４８２、４９８、５０２、５０６、５１４及び５１６から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号１８、４２、６６、１６２、２１０、２６６及び４３４から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【０００９】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、４５６、４６６、４７６、４８０、４９０、５００及び５０４から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号２０、４４、６８、１６４、２１２、２７４、及び４４２から成るグループから選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００１０】
特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００及び５０２／５０４から成るグループから選択されるＨＣＶＲとＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列対を含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１８／２０、４２／４４、６６／６８、１６２／１６４、２１０／２１２、２６６／２７４、及び４３４／４４２のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む。
【００１１】
次の態様では、本発明は、配列番号８、３２、５６、８０、１０４、１２８、１５２、１７６、２００、２２４、２４８、２７２、２９６、３２０、３４４、３６８、３９２、４１６、４４０、４６４、４８８及び５１２から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；又は配列番号１６、４０、６４、８８、１１２、１３６、１６０、１８４、２０８、２３２、２５６、２８０、３０４、３２８、３５２、３７６、４００、４２４、４４８、４７２及び４９６から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
或る実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、３２／４０、５６／６４、８０／８８、１０４／１１２、１２８／１３６、１５２／１６０、１７６／１８４、２００／２０８、２２４／２３２、２４８／２５６、２７２／２８０、２９６／３０４、３２０／３２８、３４４／３５２、３６８／３７６、３９２／４００、４１６／４２４、４４０／４４８、４６４／４７２、及び ４８８／４９６から成るグループから選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。１つの実施態様では、抗体又は抗体の抗原結合部分は、配列番号８／１６、３２／４０、５６／６４、１５２／１６０、２００／２０８、２７２／２８０、及び４４０／４４８から成るグループから選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。これらのＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３対を有するＡｎｇ−２抗体の限定されない例は、それぞれ、Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｍ７２４、及びＨ２Ｍ７４４と命名された抗体である。
【００１３】
更なる実施態様では、本発明は、配列番号４、２８、５２、７６、１００、１２４、１４８、１７２、１９６、２２０、２４４、２６８、２９２、３１６、３４０、３６４、３８８、４１２、４３６、４６０、４８４及び５０８から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号６、３０、５４、７８、１０２、１２６、１５０、１７４、１９８、２２２、２４６、２７０、２９４、３１８、３４２、３６６、３９０、４１４、４３８、４６２、４８６及び５１０から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２、３６、６０、８４、１０８、１３２、１５６、１８０、２０４、２２８、２５２、２７６、３００、３２４、３４８、３７２、３９６、４２０、４４４、４６８及び４９２から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；及び配列番号１４、３８、６２、８６、１１０、１３４、１５８、１８２、２０６、２３０、２５４、２７８、３０２、３２６、３５０、３７４、３９８、４２２、４４６、４７０及び ４９４から成るグループから選択されるアミノ酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを更に含む、抗体又はそのフラグメントを含む。
【００１４】
或る限定されない、例示的な本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、それぞれ、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４及び１６（例えば、Ｈ１Ｈ６８５）；（ｉｉ）配列番号２８、３０、３２、３６、３８及び４０ （例えば、Ｈ１Ｈ６９０）；（ｉｉｉ）配列番号５２、５４、５６、６０、６２及び６４（例えば、Ｈ１Ｈ６９１）；（ｉｖ）配列番号１４８、１５０、１５２、１５６、１５８及び１６０（例えば、Ｈ１Ｈ６９６）；（ｖ）配列番号１９６、１９８、２００、２０４、２０６及び２０８（例えば、Ｈ１Ｈ７０６）；（ｖｉ）配列番号２６８、２７０、２７２、２７６、２７８及び２８０（例えば、Ｈ１Ｍ７２４）；及び（ｖｉｉ）配列番号４３６、４３８、４４０、４４４、４４６及び４４８（例えば、Ｈ２Ｍ７４４）から成るグループから選択される、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１５】
関連する実施態様では、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで、抗体又はフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、及び５０２／５０４から成るグループから選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列内に含まれる、重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメイン（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１８／２０、４２／４４、６６／６８、１６２／１６４、２１０／２１２、２６６／２７４、及び４３４／４４２のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ内に含まれるＣＤＲ配列を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、抗Ａｎｇ−２抗体又はそのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を運ぶ組み換え発現ベクター、及びそのようなベクターが導入された宿主細胞は、抗体産生が可能な条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによる抗体の製造方法であるので、本発明に包含される。
【００１７】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１、１７、２１、２５、４１、４５、４９、６５、６９、７３、８９、９３、９７、１１３、１１７、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、１６９、１８５、１８９、１９３、２０９、２１３、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、２６５、２８１、２８５、２８９、３０５、３０９、３１３、３２９、３３３、３３７、３５３、３５７、３６１、３７７、３８１、３８５、４０１、４０５、４０９、４２５、４２９、４３３、４４９、４５３、４５７、４７３、４７７、４８１、４９７、５０１、５０５、５１３及び５１５から成るグループから選択される核酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＶＲを含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１７、４１、６５、１６１、２０９、２６５及び４３３から成るグループから選択される核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む。
【００１８】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号９、１９、２３、３３、４３、４７、５７、６７、７１、８１、９１、９５、１０５、１１５、１１９、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、１６７、１７７、１８７、１９１、２０１、２１１、２１５、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、２７３、２８３、２８７、２９７、３０７、３１１、３２１、３３１、３３５、３４５、３５５、３５９、３６９、３７９、３８３、３９３、４０３、４０７、４１７、４２７, ４３１, ４４１, ４５１, ４５５, ４６５, ４７５, ４７９, ４８９, ４９９及び５０３から成るグループから選択される核酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＶＲを含む。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１９、４３、６７、１６３、２１１、２７３及び４４１から成るグループから選択される核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。
【００１９】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、４１５、４３９、４６３、４８７及び５１１から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン；及び配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１、３７５、３９９、４２３、４４７、４７１及び４９５から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号７／１５、３１／３９、５５／６３、１５１／１５９、１９９／２０７、２７１／２７９、及び４３９／４４７から成るグループから選択される核酸配列対によってコードされるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列を含む。
【００２０】
更なる実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、さらに、配列番号３、２７、５１、７５、９９、１２３、１４７、１７１、１９５、２１９、２４３、２６７、２９１、３１５、３３９、３６３、３８７、４１１、４３５、４５９、４８３及び５０７から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、４１３、４３７、４６１、４８５及び５０９から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、３５、５９、８３、１０７、１３１、１５５、１７９、２０３、２２７、２５１、２７５、２９９、３２３、３４７、３７１、３９５、４１９、４４３、４６７及び４９１から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン；配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９、３７３、３９７、４２１、４４５、４６９及び４９３から成るグループから選択されるヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する実質的に同一な配列、によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインを含む。
【００２１】
１つの実施態様では、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１７及び１９；配列番号４１及び４３；配列番号６５及び６７；配列番号１６１及び１６３；配列番号２０９及び２１１；配列番号２６５及び２７３；又は配列番号４３３及び４４１の核酸配列によってコードされる重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００２２】
本発明は、修飾された糖鎖付加パターンを有する抗Ａｎｇ−２抗体を包含する。幾つかの応用において、望ましくない糖付加部位を除去する修飾は有用であってもよい。例えば、本発明は、本明細書に記載されるいかなる抗体の修飾バージョンをも包含し、ここで修飾バージョンは、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失させて、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高める（Shield et al. (2002) JBC 277:26733を参照）。他の応用では、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を変更（modify）するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する組み換えヒト抗体又はそのフラグメント及び薬学的に許容される担体又は希釈剤含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、Ａｎｇ−２インヒビター及び第２の治療剤を併合した組成物を特色とする。１つの実施態様では、Ａｎｇ−２インヒビターは、抗体又はそのフラグメントである。１つの実施態様では、第２の治療剤は、Ａｎｇ−２インヒビターと有利に併用されるいかなる薬剤でもある。Ａｎｇ−２インヒビターと有利に併用し得る例示的な薬剤としては、限定することなく、血管形成を阻害又は低減するいかなる薬剤、他のがん治療剤、抗炎症剤、サイトカインインヒビター、成長因子インヒビター、抗造血性因子、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、抗ウイルス剤及び抗生物質が挙げられる。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、抗Ａｎｇ−２抗体又は本発明の抗体の抗原結合部分を用いてＡｎｇ−２活性を阻害する方法を提供し、ここで治療方法は、抗体又は本発明の抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む。処置される疾患は、Ａｎｇ−２活性の除去、阻害又は低減によって改善、緩和、阻害又は防止されるいかなる疾患又は病態である。好ましくは、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又は抗体フラグメントは、血管形成の過程によって起こされる、関連する、又は永続化するいかなる疾患又は状態を処置するのに有用である。本発明の或る実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合部分は、がんの処置に有用である。がん治療に関連して、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合部分は、単独で、又は他の抗がん治療抗体、化学療法剤及び／又は放射線治療と併用して投与することができる。本発明の他の実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の目の疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症など、及び／又は１つ又はそれ以上の炎症性又は感染性疾患の処置に有用である。
【００２５】
他の実施態様は、次の詳細な説明の概説から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ヒトＡｎｇ−２のＣ末端８８アミノ酸（配列番号５１８の４０９〜４９６残基）と対応するヒトＡｎｇ−１のアミノ酸配列（配列番号５３１）のアラインメントである。ｈＡｎｇ−１とｈＡｎｇ−２の間で異なる残基は黒影に白文字で示す。星印（＊）は、結晶構造解析によってヒトＴｉｅ−２と相互作用することが示されたｈＡｎｇ−２のアミノ酸を示す。Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532（2006) を参照されたい。三角形（▲）は、ｈＡｎｇ−２とｈＡｎｇ−１の間で異なる、Ｔｉｅ−２相互作用アミノ酸の位置を示す。
【図２】パネルＡ〜Ｃは、Ａｎｇ−２結合分子が、Ａｎｇ−１誘導のＴｉｅ−２リン酸化を阻害する、又は阻害しない程度を説明するウェスタンブロットの結果を示す。
【図３】実施例１３のＡｎｇ−２ＦＤ−ｍＦｃ点突然変異体の結合実験の要約であり、試験した様々な抗体及びペプチボディについての、解離のＴ1/2が野生型に対して５倍を超える低下をもたらすアミノ酸変化（黒丸●で示す）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を説明する前に、本発明は、記載された特定の方法及び実験条件に限定されないと理解すべきである、なぜなら、そのような方法及び条件は変化し得る。また、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書に使われる述語は、特定の実施態様を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
【００２８】
他に定義されない限り、本明細書に使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する業界の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に使われるように、用語の「約」は、特定の列挙された数値に関して使われるとき、列挙された値からわずか１％だけ変化してもよい値を意味する。例えば、本明細書に使われるように、「約１００」の表現は、９９及び１０１並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００２９】
本明細書に記載されるものに類似した又は同等のいかなる方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用できるが、好ましい方法及び材料は今から説明する。
【００３０】
定義
本明細書に使われるように、用語の「アンジオポイエチン−２」または「Ａｎｇ−２」は、ヒト以外の種（例えば、「マウスＡｎｇ−２」、「サルＡｎｇ−２」、など）として特定されない限り、ヒトＡｎｇ−２又はその生物学的に活性なフラグメント（例えば、インビボ又はインビトロで血管形成を誘導することができるＡｎｇ−２タンパク質のフラグメント）を指す。ヒトＡｎｇ−２は、配列番号５１７で示される核酸配列によってコードされ、配列番号５１８のアミノ酸配列を有する。マウス及びサルＡｎｇ−２タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ受託番号ＮＰ＿０３１４５２及びＢＡＥ８９７０５．１のもとにＮＣＢＩプロテインシーケンスデータベースから入手できる。
【００３１】
用語の「アンジオポイエチン−１」または「Ａｎｇ−１」は、ヒト以外の種（例えば、「マウスＡｎｇ−１」、「サルＡｎｇ−１」、など）として特定されない限り、ヒトＡｎｇ−１又はその生物学的に活性なフラグメントを指す。ヒトＡｎｇ−１は、受託番号ＡＡＢ５０５５７のもとにＮＣＢＩプロテインシーケンスデータベースに記載のアミノ酸配列を有する。用語の「Ｔｉｅ−２」（業界では「ＴＥＫ」とも呼ばれる）は、ヒト以外の種（例えば、「マウスＴｉｅ−２」、「サルＴｉｅ−２」、など）として特定されない限り、ヒトＴｉｅ−２又はその生物学的に活性なフラグメントを指す。ヒトＴｉｅ−２は、受託番号ＡＡＡ６１１３０のもとにＮＣＢＩプロテインシーケンスデータベースに記載のアミノ酸配列を有する。
【００３２】
本明細書に使われるように、用語の「抗体」は、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィドボンドで相互接続した４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を指すことを意図する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶHと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣH１、ＣH２及びＣH３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶLと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH及びＶL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼ばれる超過変性の領域に細分することができる。それぞれのＶH及びＶLは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。本発明の違う実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲｓは、ヒト生殖細胞系の配列と同じであってもよく、又は天然に若しくは人工的に修飾されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの並列解析に基づいて定義すればよい。
【００３３】
本明細書に使われるように、用語の「抗体」はまた、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントを包含する。本明細書に使われる用語の、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいかなる天然の、酵素的に取得できる、合成の、若しくは遺伝子組み換えされた、ポリペプチド又は糖タンパク質を包含する。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、完全な抗体分子から、タンパク質分解的消化又は抗体可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組み換え遺伝子工学技術などのいかなる好適な標準的技術を駆使して誘導してもよい。そのようなＤＮＡは、既知である及び／又は例えば、市販品、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリー）から容易に入手できる、又は合成することができる。ＤＮＡは、配列が決定されそして化学的に、又は例えば、１つ又はそれ以上の可変及び／又は定常ドメインを好適な立体配置（configuration）に配置するため、又はコドンを導入する、システイン残基を創る、アミノ酸を修飾、付加若しくは削除するなどのために、分子生物学の技術を使用して操作されてもよい。
【００３４】
抗原結合フラグメントの限定されない例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、抗体の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣したアミノ酸残基から成る最小認識ユニットが挙げられる。二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びミニ抗体などの、他の遺伝子組み換えされた分子も、本明細書に用いられる「抗原結合フラグメント」の表現に包含される。
【００３５】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、いかなるサイズ又はアミノ酸組成であってもよく、一般に１つ又はそれ以上のフレームワーク配列に隣接した又はフレーム内にある少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶLドメインを伴うＶHドメインを有する抗原結合フラグメントは、互いに対してどのような好適な配置に可変ドメインが位置してもよい。例えば、可変領域は、二量体であり、ＶH−ＶH、ＶH−ＶL又はＶL−ＶLドメイン二量体であってもよい。或いは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶH又はＶLドメインを含んでもよい。
【００３６】
或る実施態様では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含めばよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出されてもよい、可変及び定常ドメインの、限定されない、例示的な立体配置としては、（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３；及び（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。可変及び定常ドメインの任意の立体配置では、上記のいかなる例示的な立体配置を含めて、可変及び定常ドメインは、互いに直接連結しても、全部の又は部分的なヒンジ若しくはリンカー領域によって連結してもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸から成り、それは１つのポリペプチド分子内の隣接する可変及び／又は定常ドメインの間にフレキシブル又はセミフレキシブルな連結を生じさせる。その上、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、上記の可変及び定常ドメイン立体配置のいずれかの、互いに及び／又は１つ又はそれ以上の単量体ＶH又はＣLドメインが非共有で連結した（例えば、ジスルフィド架橋による）、ホモダイマー又はヘテロダイマー（又は、他の多量体）を含んでもよい。
【００３７】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗体の抗原結合フラグメントは、典型的に少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで、それぞれの可変ドメインは別々の抗原又は同じ抗原の異なるエピトープと特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む多重特異性抗体フォーマットは、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの関連で用いるために、業界で利用可能な通常の技術を用いて適合させてもよい。
【００３８】
抗体の定常領域は、補体を固定し細胞依存性細胞傷害を仲介する抗体の能力にとって重要である。従って、抗体のイソタイプは、抗体が細胞傷害性を仲介するために望ましいかどうかに基づいて選択すればよい。
【００３９】
本明細書に使われる用語の「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲｓ特にＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム又は部位特異的突然変異生成又はインビボの体細胞変異によって誘導される変異）を含んでもよい。しかし、本明細書に使われる用語の「ヒト抗体」は、マウス等の他の哺乳類の生殖細胞由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。
【００４０】
本明細書に使われる用語の「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段によって調製された、発現された、創出された又は単離した、宿主細胞に移入された組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体（以下にさらに説明する）、組み換え体、組み合わせのヒト抗体ライブラリーから単離した抗体（以下にさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（Taylor et al.（1992）Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列に挿入することを含む、いかなる他の手段によって調製された、発現された、創出された又は単離した抗体など、全てのヒト抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかしながら、或る実施態様では、そのような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異生成（又は、ヒトＩｇ配列用のトランスジェニック動物が用いられる場合は、インビボ体細胞突然変異生成）に供され、従って組み換え抗体のＶH及びＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞のＶH及びＶL配列に由来し及び関連しているが、インビボのヒト抗体生殖細胞のレパートリー内に天然には存在しないかも知れない配列である。
【００４１】
ヒト抗体は、ヒンジの不均質に関係した２つの形態で存在することができる。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間の重鎖ジスルフィド架橋で結合された、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物（construct）を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド架橋によって連結されず、約７５〜８０ｋＤａの分子は、共有結合した軽鎖及び重鎖で構成されて形成される（半抗体）。これらの形態は、アフィニティー精製後であっても、分離することは極めて困難である。
【００４２】
様々な無傷のＩｇＧイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域イソタイプに関連する構造的な違いによるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域での単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、一般にヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて観察されるレベルに、著しく低下させることができる（Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105）。本発明は、例えば、産生において、目的の抗体形態の収率を改善するために望ましい、ヒンジ、ＣH２又はＣH３領域に１つ又はそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。
【００４３】
本明細書に使われる「単離した抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ヒトＡｎｇ−２又はヒトＡｎｇ−２フラグメントに特異的に結合する単離した抗体は、ヒトＡｎｇ−２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことを意図する。用語の「特異的に結合する」などは、抗体又はその抗体の抗原結合フラグメントが、生理的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、約１×１０-8Ｍ又はそれ以下のＫDによって特徴付けることができる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、業界に周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、などが挙げられる。しかし、ヒトＡｎｇ−２と特異的に結合する単離した抗体は、他の種からのＡｎｇ−２分子などの他の抗原への交差反応性を有してもよい。その上、単離した抗体は、他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まなければよい。
【００４４】
本明細書に使われる「中和」又は「遮断」抗体は、そのＡｎｇ−２への結合が、Ａｎｇ−２とその受容体（Ｔｉｅ−２）との相互作用を遮断する及び／又はＡｎｇ−２の少なくとも１つの生物学的機能の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。Ａｎｇ−２中和又は遮断抗体によって起こされる阻害は、適切なアッセイを用いて検出できる限り、必ずしも完全である必要はない。Ａｎｇ−２阻害を検出するための典型的なアッセイは、本明細書の他の場所で説明する。
【００４５】
本明細書で説明する完全ヒト抗Ａｎｇ−２抗体は、相当する生殖細胞配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含んでもよい。そのような突然変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば公開の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞配列と比較することによって、容易に確定することができる。本発明は、抗体、及び本明細書に開示したいずれかのアミノ酸配列から由来するその抗体の抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸は、相当する１つ又は複数の生殖細胞残基に又は相当する生殖細胞残基の保存アミノ酸置換（天然又は非天然の）に復帰突然変異される（その様な配列変化は、本明細書では「生殖細胞復帰突然変異」と呼ぶ）。当業者は、本明細書に開示された重鎖及び軽鎖可変領域の配列から始めて、１つ又はそれ以上の個々の生殖細胞復帰突然変異又はそれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。或る実施態様では、ＶH及び／又はＶLドメイン内の全てのフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は、生殖細胞配列に復帰突然変異される。他の実施態様では、特定の残基だけが生殖細胞配列に復帰突然変異される、例えば変異残基だけがＦＲ１の最初の８アミノ酸内に又はＦＲ４の最後の８アミノ酸内に認められ、又は変異残基だけがＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３内に認められる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ又はそれ以上の生殖細胞復帰突然変異のいかなる組み合わせを含んでもよい、即ち、ここで、或る個々の残基は生殖細胞配列に復帰突然変異されるが、生殖細胞配列と異なる或る他の残基は保存される。一度得られた、１つ又はそれ以上の生殖細胞復帰突然変異を含む抗体及び抗体の抗原結合フラグメントは、改善した結合特異性、高い結合親和性、改善した又は亢進したアンタゴニスト的又はアゴニスト的な生物学的特性（場合によって）、低下した免疫原性などの１つ又はそれ以上の所望する特性を、容易に試験することができる。この一般的な方法で得られた抗体及び抗体の抗原結合フラグメントは、本発明内に包含される。
【００４６】
本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗Ａｎｇ−２抗体を包含する。例えば、本発明は、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０又はそれより少ない、８又はそれより少ない、６又はそれより少ない、４又はそれより少ないなどの保存的アミノ酸置換を持つＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗Ａｎｇ−２抗体を含む。１つの実施態様では、抗体は、８又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、６又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、４又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、２又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。１つの実施態様では、抗体は、８又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、６又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、４又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様では、抗体は、２又はそれより少ない保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００４７】
本明細書で使われる用語の「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて、バイオセンサー・マトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの相互作用解析を可能にする光学的現象を指す。
【００４８】
本明細書で使われる用語の「ＫD」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
【００４９】
用語の「エピトープ」は、抗体分子の可変領域内のパラトープとして知られる特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定基を指す。単一の抗原は、複数のエピトープを有してもよい。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる区域に結合してもよく、異なる生物学的作用を有してもよい。エピトープは、立体配座でも直線状でもよい。立体配座のエピトープは、直鎖ポリペプチドの異なる部分からの空間的に並列したアミノ酸によって形成される。直線状のエピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基によって形成されるものである。或る状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含んでもよい。
【００５０】
用語の「実質的な同一性」又は「実質的に同一な」は、核酸又はそのフラグメントに言及するとき、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を使って別の核酸（又はその相補鎖）と最適に位置合わせをしたとき、以下で検討するようにＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐなどのよく知られた配列同一性のアルゴリズムによって測定したとき、少なくとも約９５％、そしてより好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照の核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、場合によっては、参照の核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。
【００５１】
ポリペプチドに適用されるように、用語の「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイト（default gap weight）を用いて、例えばプログラムのＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に位置合わせした場合、少なくとも９５％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学特性（例えば、荷電又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されることである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性は実質的に変えない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が互いに保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整されてもよい。この調整を行う手段は、同業者に周知である。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照されたい。類似した化学的特性の側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；及び（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン、が挙げられる。好まれる保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。或いは、保存的置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445に公開されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで、正の値を有する任意の変更である。「中程度に保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで、負でない値を有する任意の変更である。
【００５２】
配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドの配列類似性は、一般に配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、さまざまな置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を用いて類似する配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含み、それらは、種の異なる生物由来の相同のポリペプチドなどの近縁ポリペプチド間、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質間の、配列相同性又は配列同一性を測定するために、デフォルトパラメータを用いて使用することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨パラメータを用いるＦＡＳＴＡ、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１内のプログラム、を使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー及びサーチ配列間の最良重複領域の位置合わせ及びパーセント配列同一性を提供する（上記Pearson (2000)参照）。別の、本発明の配列と、異なる生物由来の大多数の配列を含むデータベースを比較するときの好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いたコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ，特にＢＬＡＳＴＰ又はＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410及びAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402を参照されたい。
【００５３】
ヒト抗体の製造
完全ヒトモノクローナル抗体を含めたモノクローナル抗体を産生させる方法は、業界に知られている。いずれのそのような既知の方法も、本発明との関連において、ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、本明細書に開示されるいずれの例示的な抗Ａｎｇ−２抗体の１つ又はそれ以上の抗原結合及び／又は機能的な性質を持つ、ヒト抗体を作るために使用することができる。
【００５４】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術又はモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を用いて、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＡｎｇ−２に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。下記の実験の項におけるように、抗体は、特徴付けられ、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい性質に選択される。マウス定常領域を望ましいヒト定常領域で置き換えて、本発明の全ヒト抗体、例えば、野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４を生成する。選択される定常領域は特定の使用に従って変わってもよいが、高親和性抗原結合及び標的特異性の性質は可変領域に存在する。
【００５５】
生物学的等価性
本発明の抗Ａｎｇ−２抗体及び抗体フラグメントは、記載された抗体のものとは異なるが、ヒトＡｎｇ−２に結合する能力を保持したアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較したとき、１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含むが、記載された抗体のそれと本質的に等価な生物学的活性を示す。同じように、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したとき、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含むが、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又は抗体フラグメントと本質的に生物学的等価な抗Ａｎｇ−２抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を包含する。そのような変異アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は上記で検討した。
【００５６】
２つの抗原結合タンパク質、即ち抗体は、もし、例えば、それらが薬学的な同等物又は薬学的な代替物であり、同様な実験条件下で同じモル投与量を単回投与又は複数回投与で投与したとき、それらの吸収の速度及び程度に有意な違いを示さないなら、生物学的等価と見なされる。幾つかの抗体は、もしそれらの吸収の程度は同等であるが吸収の速度は同等でないなら同等物又は薬学的代替物と考えられ、なおかつ、そのような吸収速度の違いは、意図的であり、標識に反映され、例えば連用の際の効果的な体内薬物濃度の達成に必須ではなく、試験される特定の製剤にとって医学的に重要でないと考えられるので、生物学的等価と見なしてもよい。
【００５７】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、もし、安全性、純度、及び力価に、臨床的に有意な違いが無ければ、生物学的等価である。
【００５８】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、もし患者が、参照製剤と生物学的製剤の間で１回又はそれ以上の交換が、そのような交換なしに継続した治療と比較して、臨床的に有意な免疫原性の変化の誘導、又は効果の減退を含む、副作用リスクの予想される上昇無しに可能なら、生物学的等価である。
【００５９】
１つの実施態様では、２つの抗原結合タンパク質は、もしそれら両者が、使用の条件に対して共通のメカニズム又は作用メカニズムで作動するなら、そのようなメカニズムが既知である限りにおいて、生物学的等価である。
【００６０】
生物学的等価性は、インビボ及びインビトロの方法で立証され得る。生物学的等価性の指標としては、例えば，（ａ）抗体又はその代謝物の濃度が、血液、血漿、血清、又は他の生物学的流体中で、時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳類でのインビボテスト；（ｂ）ヒトインビボ生体学的利用能データと相関する、及びそれを合理的に予測するインビトロテスト；（ｃ）抗体（又はその対象）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒト又は他の哺乳類でのインビボテスト；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又は生体学的利用能若しくは生物学的等価性を確証する、十分にコントロールされた臨床試験、が挙げられる。
【００６１】
本発明の抗Ａｎｇ−２抗体の生物学的等価性変異形は、例えば、残基若しくは配列に様々な置換をさせる又は生物学的活性に必要のない末端若しくは内部の残基若しくは配列を削除することによって、構築されてもよい。例えば、生物学的活性に重要でないシステイン残基は、再生する際に不必要な又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、削除する又は他のアミノ酸で置き換えることができる。
【００６２】
抗体の生物学的及び治療的特徴
一般に、本発明の抗体は、固相に固定化した又は液相中のいずれかの抗原への結合によって測定して、１００ｐＭ未満のＫDで、典型的には５０ｐＭ未満のＫDで、或る実施態様では４０ｐＭ未満のＫDで、ヒトＡｎｇ−２に結合する。
【００６３】
また、本発明の或る例示的な抗Ａｎｇ−２抗体は、１つ又はそれ以上の以下の特徴を示す：（１）ヒトＡｎｇ−２に結合するがマウスＡｎｇ−２に結合しない能力；（２）ヒトＡｎｇ−２及びマウスＡｎｇ−２に結合する能力；（３）ヒトＡｎｇ−２に結合するがヒトＡｎｇ−１、−３又は−４に結合しない能力；（４）ヒトＡｎｇ−２に結合するがマウスＡｎｇ−１、−３又は−４に結合しない能力；（５）ヒトＡｎｇ−２及びヒトＡｎｇ−１、−３又は−４に結合する能力；（６）ヒトＡｎｇ−２及びマウスＡｎｇ−１、−３又は−４に結合する能力；（７）ヒトＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（８）ヒトＡｎｇ−２のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（９）マウスＡｎｇ−２のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１０）マウスＡｎｇ−２のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１１）ヒトＡｎｇ−１のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１２）ヒトＡｎｇ−１のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１３）マウスＡｎｇ−１のヒトＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１４）マウスＡｎｇ−１のマウスＴｉｅ−２に対する結合を遮断する能力；（１５）ヒトＡｎｇ−２で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１６）ヒトＡｎｇ−２で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１７）マウスＡｎｇ−２で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１８）マウスＡｎｇ−２で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（１９）ヒトＡｎｇ−１で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２０）ヒトＡｎｇ−１で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２１）マウスＡｎｇ−１で誘導されるヒトＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２２）マウスＡｎｇ−１で誘導されるマウスＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力；（２３）実験モデル（例えば、ＭＣＦ−７細胞を含有するマトリゲル栓をヌードマウスの皮下に移植することによって誘導される血管形成）におけるインビボ血管形成を阻害する能力；及び／又は（２４）マウス異種移植片モデルで腫瘍体積を抑制又は減少させる能力。
【００６４】
本発明はまた、Ａｎｇ−２フィブロネクチン様ドメインを含むが、Ａｎｇ−２Ｎ末端のコイルドコイル・ドメインを欠如した構造（construct）（その様な構造は、本明細書では「Ａｎｇ−２ＦＤ」と呼ぶ）に高い親和性で結合する抗体も包含する。例示的なＡｎｇ−２ＦＤ構造としては、ヒトＡｎｇ−２ＦＤ（配列番号５１９）、マウスＡｎｇ−２ＦＤ（配列番号５２０）、及びサルＡｎｇ−２ＦＤ（配列番号５２１）が挙げられる。ヒト、マウス及びサルのＡｎｇ−２ＦＤ構造は、単量体又は二量体でもよい。Ａｎｇ−２ＦＤ構造はまた、Ａｎｇ−２ＦＤ分子に接続したヒト又はマウスＦｃドメインなどの、他の非Ａｎｇ−２アミノ酸配列を含んでもよい。別の例示的なＡｎｇ−２ＦＤ構造は、本明細書では「ｈＢＡ２」（又はヒト「ｂｏｗ−Ａｎｇ２」）と呼ばれ、それはヒト又はマウスＦｃドメインを経由して互いに結合し、蝶ネクタイ様の立体配置を形成するヒトＡｎｇ−２フィブリノーゲン様ドメインの四量体である。通常、ｈＢＡ２は、２つのＡｎｇ−２二量体から成り、ここでそれぞれのＡｎｇ−２二量体は、Ｆｃドメインを通して互いに連結した２つのＡｎｇ−２フィブロネクチン様ドメインを含む。例示的なｈＢＡ２構成要素としては、ｈＢＡ２−ｈＩｇＧ１（配列番号５２２）及びｈＢＡ２−ｍＩｇＧ２ａ（配列番号５２３）に指定されたポリペプチドが挙げられる。予想外に、本発明の或る抗Ａｎｇ−２抗体は、既知のコントロールＡｎｇ−２抗体よりもかなり高い親和性でＡｎｇ−２ＦＤ構造に結合することが見出された（本明細書に記載の実施例を参照）。
【００６５】
ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤ構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合とは、抗Ａｎｇ−２抗体が、ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤと３００ｐＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤと高親和性で結合する抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、ヒト又はマウス二量体Ａｎｇ−２ＦＤと３００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１９０ｐＭ未満、１８０ｐＭ未満、１７０ｐＭ未満、１６０ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１４０ｐＭ未満、１３０ｐＭ未満、１２０ｐＭ未満、１１０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満、８０ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６０ｐＭ未満又は５０ｐＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６６】
サル二量体Ａｎｇ−２ＦＤ構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合とは、抗Ａｎｇ−２抗体がサル二量体Ａｎｇ−２ＦＤと５００ｐＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、サル二量体Ａｎｇ−２ＦＤと高親和性で結合する抗Ａｎｇ−２抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、サル二量体Ａｎｇ−２ＦＤと５００ｐＭ未満、４５０ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３５０ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１９０ｐＭ未満、１８０ｐＭ未満、１７０ｐＭ未満、１６０ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１４０ｐＭ未満、１３０ｐＭ未満、１２０ｐＭ未満、１１０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満、又は８０ｐＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６７】
ヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤ構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合は、抗Ａｎｇ−２抗体がヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤと４０ｎＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、ヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤと高親和性で結合する抗Ａｎｇ−２抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、ヒト単量体Ａｎｇ−２ＦＤと４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、又は０．６ｎＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６８】
ｈＢＡ２構造に結合する抗Ａｎｇ−２抗体の関連において、高親和性結合は、抗Ａｎｇ−２抗体がｈＢＡ２と８０ｐＭ未満のＫDで結合することを意味する。例えば、ｈＢＡ２と高親和性で結合する抗Ａｎｇ−２抗体としては、２５℃で、表面プラズモン共鳴で測定して、ｈＢＡ２と８０ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、７０ｐＭ未満、６５ｐＭ未満、６０ｐＭ未満、５５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４５ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３５ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１８ｐＭ未満、１６ｐＭ未満、１４ｐＭ未満、又は１２ｐＭ未満のＫDで結合する抗体が挙げられる。
【００６９】
本発明は、Ａｎｇ−２に結合するがＡｎｇ−１とは実質的に結合しない抗体を包含する。本明細書で使われる様に、抗体が表面に捕捉され、捕捉された抗体上に、完全野生型ヒトＡｎｇ−１を約２５ｎＭの濃度で、約６０μＬ／分の流速で、約３分間２５℃で注入される、表面プラズモン共鳴アッセイで、Ａｎｇ−２に対する結合を試験したとき、もしも抗体が、約１ｎＭを超える、例えば、約５ｎＭを超える、約１０ｎＭを超える、約５０ｎＭを超える、約１００ｎＭを超える、約１５０ｎＭを超える、約２００ｎＭを超える、約２５０ｎＭを超える、約３００ｎＭを超える、約３５０ｎＭを超える、約４００ｎＭを超える、約４５０ｎＭを超える、約５００ｎＭを超える、又はそれ以上のＫDを示すなら、抗体は「実質的にＡｎｇ−１に結合しない」。（例えば、実施例４を参照）。また、そのようなアッセイ又はそれと同等のもので試験したとき、抗体がＡｎｇ−１との結合を示せないなら、抗体は「実質的にＡｎｇ−１に結合しない」。
【００７０】
本発明はまた、Ａｎｇ−２のＴｉｅ−２との結合を遮断するが、Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を実質的に遮断しない抗体を包含する。本明細書で使用されるように、もし、抗体をＡｎｇ−１抗原と約１００：１（抗体：抗原）の比でプレミックスし、２５℃で約６０分間インキュベーションし、次に平衡化した混合物をＴｉｅ−２で被覆した表面上の表面プラズモン共鳴（５μＬ／分、２５℃）によってＴｉｅ−２に対する結合を試験したとき、Ｔｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量が、関係のないコントロール分子の存在下でＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量の少なくとも５０％であるなら、抗体は「Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を実質的に遮断しない」。（例えば、実施例６を参照）。例えば、抗体とのプレインキュベーションの後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量が、上記の実験条件下で関係のないコントロール分子とプレインキュベーションの後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％であるなら、抗体は「Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を実質的に遮断しない」と見なされる。
【００７１】
さらに、本発明は、Ａｎｇ−２の生物学的活性（例えば、Ａｎｇ−２媒介のＴｉｅ−２リン酸化；Ａｎｇ−２誘導の血管形成など）を遮断又は実質的に減衰させるが、Ａｎｇ−１の対応する生物学的活性（Ａｎｇ−１媒介のＴｉｅ−２のリン酸化；Ａｎｇ−１誘導の血管形成など）を遮断又は実質的に減衰させない抗体を包含する。抗体が上記で挙げた１つ又はそれ以上の性質を満足するかどうかを測定するために有用なアッセイ及び試験は、当業者によって直ちに理解され、そして容易に実施されるだろう、及び／又は本開示から十分に確認できるだろう。例えば、下記に詳述する実験方法は、ある抗体がＡｎｇ−２及び／又はＡｎｇ−１に結合するか否か；Ａｎｇ−２及び／又はＡｎｇ−１のＴｉｅ−２との結合を遮断するか否か；Ａｎｇ−２及び／又はＡｎｇ−１が媒介するＴｉｅ−２のリン酸化を阻害するか否か；等々を測定するために使用できる。
【００７２】
エピトープマッピング及び関連する技術
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥのその高親和性受容体への結合を遮断するもの）を選別するために、「抗体（Antibodies）」Harlow and Lane著、（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY）に記載されているような、通常のクロスブロッキング・アッセイを行うことができる。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット（Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63）、又はペプチド切断解析が挙げられる。また、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、及び化学修飾などの方法が使用できる（Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496）。
【００７３】
用語の「エピトープ」は、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位に言及する。Ｂ細胞エピトープは、隣接（contiguous）アミノ酸又はタンパク質の三次元折り畳みによって並列した隣接アミノ酸の両者から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に変性溶媒に接触しても保持されるのに対し、三次元の折り畳みで形成されたエピトープは、一般に変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、一般的に少なくとも３個、より普通には少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸を特異な空間的構造に含む。
【００７４】
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られる修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、同じ抗原に対して指向した大多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的又は酵素的に修飾した抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って分類する方法である（米国特許第２００４／０１０１９２０号）。各カテゴリーは別のカテゴリーによって表わされるエピトープと明らかに異なる又は部分的に重複するいずれかのユニークなエピトープを反映する。この技術により、特徴付けの焦点を遺伝学的に独特な抗体に合わせることができるなど、遺伝学的に同一な抗体の急速な分別が可能になる。ハイブリドーマのスクリーニングに適用したとき、ＭＡＰは、所望する性質を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類するために使用してもよい。
【００７５】
抗Ａｎｇ−２抗体は、アミノ末端コイルドコイル・ドメイン内又はカルボキシ末端フィブリノーゲン様ドメイン（「ＦＤ」）内のエピトープに結合することができる。本発明の好ましい実施態様では、抗Ａｎｇ−２抗体及びその抗体の抗原結合フラグメントは、ＦＤ内のエピトープに結合する。
【００７６】
Ｔｉｅ−２と相互作用するＡｎｇ−２のＦＤ内のアミノ酸は、結晶構造解析によって解明されている。Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (May 2006) を参照。Ａｎｇ−２のＴｉｅ−２への結合を遮断するがＡｎｇ−１のＴｉｅ−２への結合を実質的に遮断しない抗体に関して（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ、下記の実施例５及び６を参照）、そのような抗体が結合するエピトープは、（ａ）Ｔｉｅ−２と相互作用する及び（２）Ａｎｇ−１の対応するアミノ酸に一致しないＡｎｇ−２の１つ又はそれ以上のアミノ酸を含んでもよい（図１を参照）。従って、そのようなＡｎｇ−２優先的抗体が結合するエピトープは、ｈＡｎｇ―２（配列番号５１８）の１つ又はそれ以上の次のアミノ酸：Ｓ−４１７；Ｋ−４３２；Ｉ−４３４；Ｎ−４６７；Ｆ−４６９；Ｙ−４７５；又はＳ−４８０を含んでもよい。例えば、本発明者らは、Ａｎｇ−２（配列番号５１８）のアミノ酸Ｆ−４６９、Ｙ−４７５、及びＳ−４８０と相互作用する抗体は、Ａｎｇ−１よりもＡｎｇ−２と優先的に相互作用すること、そしてこの優先的結合が治療的な利点を有し得ることを発見した。従って、本発明は、ヒトアンジオポイエチン２（ｈＡｎｇ−２）に特異的に結合するがｈＡｎｇ−１には実質的に結合しない抗Ａｎｇ−２抗体を含み、ここで抗体は、アミノ酸Ｆ−４６９、Ｙ−４７５、及びＳ−４８０を含むｈＡｎｇ−２（配列番号５１８）上のエピトープに結合する。同様に、本発明は、ｈＡｎｇ−２のｈＴｉｅ−２への結合を遮断するがｈＡｎｇ−１のｈＴｉｅ−２への結合を実質的に遮断しない抗Ａｎｇ−２抗体を含み、ここで抗体は、アミノ酸Ｆ−４６９、Ｙ−４７５、及びＳ−４８０を含むｈＡｎｇ−２（配列番号５１８）上のエピトープに結合する。
【００７７】
本発明は、本明細書に記載されたいかなる特定の例示的な抗体（例えば、Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｍ７２４及び／又はＨ２Ｍ７４４）のいずれかと同じエピトープに結合する抗Ａｎｇ−２抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載された特定の例示的な抗体（例えば、Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｍ７２４及び／又はＨ２Ｍ７４４）のいずれかとのＡｎｇ−２への結合を競合する抗Ａｎｇ−２抗体を含む。
【００７８】
抗体が、参照の抗Ａｎｇ−２抗体と同じエピトープに結合するか、又は結合を競合するかは、業界に周知の方法を使うことによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗Ａｎｇ−２抗体と同じエピトープに結合するかを測定するために、参照の抗体が、飽和する条件下で、Ａｎｇ−２タンパク質又はペプチドに結合するのを可能にする。次に、試験抗体のＡｎｇ−２分子に対する結合能力を評価する。もし、試験抗体が、参照の抗Ａｎｇ−２抗体で飽和結合された後のＡｎｇ−２に結合することができれば、試験抗体は参照の抗Ａｎｇ−２抗体と異なるエピトープに結合すると、結論することができる。一方、もし、試験抗体が、参照の抗Ａｎｇ−２抗体で飽和結合された後のＡｎｇ−２分子に結合することができなければ、試験抗体は本発明の参照の抗Ａｎｇ−２抗体によって結合したエピトープと同じエピトープに結合し得る。次に、観察された試験抗体の結合性の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するのか、又は立体的遮断（又は他の現象）が、観察された結合性の欠如に関与するのかを確認するために、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を行うことができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又はその他業界で利用できる定量的又は定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。本発明の或る実施態様によると、競合結合アッセイ（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502を参照）で測定して、もし、例えば、１、５、１０、２０又は１００倍過剰の１つの抗体が、もう１つの抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％又はさらに９９％遮断するなら、２つの抗体は同じ（又は重複する）エピトープに結合する。或いは、もし、１つの抗体の結合性を低下させる又は除去する抗原中の基本的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低下させるか又は除去するなら、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。もし、１つの抗体の結合性を低下させる又は除去するサブセットだけのアミノ酸変異が、他方の結合性を低下させる又は除去するなら、２つの抗体は「重複したエピトープ」を有するとみなされる。
【００７９】
抗体が参照の抗Ａｎｇ−２抗体と結合を競合するかどうかを測定するために、上記の結合方法論を２つの方向で行った：第１の方向では、参照の抗体を飽和条件下でＡｎｇ−２分子に結合させ、次にＡｎｇ−２分子に対する試験抗体の結合性を評価する。第２の方向では、試験抗体を飽和条件下でＡｎｇ−２分子に結合させ、次にＡｎｇ−２分子に対する参照抗体の結合性を評価する。もし、両方向において、最初の（飽和する）抗体だけがＡｎｇ−２分子に結合できるなら、試験抗体と参照抗体はＡｎｇ−２への結合を競合すると結論される。当業者には分かるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、必ずしも参照の抗体と同じエピトープに結合する必要はなく、重複する又は隣接するエピトープに結合することによって参照の抗体の結合を立体的に遮断してもよい。
【００８０】
種特異性及び種交差反応性
本発明の或る実施態様によると、抗Ａｎｇ−２抗体は、ヒトＡｎｇ−２に結合するが他の種由来のＡｎｇ−２に結合しない。或いは、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、或る実施態様では、ヒトＡｎｇ−２及び１つ又はそれ以上の非ヒト種由来のＡｎｇ−２に結合する。例えば、本発明のＡｎｇ−２抗体は、ヒトＡｎｇ−２に結合し、場合によって、１つ又はそれ以上のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲサル又はチンパンジーＡｎｇ−２に結合しても又は結合しなくてもよい。
【００８１】
免疫複合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬物、免疫抑制剤又はラジオアイソトープなどの治療部分に抱合した（conjugated）抗Ａｎｇ−２モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞毒性薬としては、細胞にとって有害になるいかなる薬剤が挙げられる。免疫複合体を形成するために好適な細胞毒性薬及び化学療法剤の例は、業界に知られており、例えば、国際公開公報第０５／１０３０８１号を参照されたい。
【００８２】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってもよい。多重特異性ｍＡｂは、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であっても、又は１つより多い標的ポリペプチドに対する抗原結合ドメインを包含してもよい。例えば、Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69を参照。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又はその部分は、別の機能分子、例えば別のペプチド又はタンパク質、と連結させる又は共発現させて多重特異性分子を形成させることができる。例えば、抗体又はそのフラグメントは、別の抗体又は抗体フラグメントなどの１つ又はそれ以上の分子的実体と機能的に連結させて、第２の結合特異性を持つ二重特異性又は多重特異性抗体を製造することができる。
【００８３】
本発明との関連で使用できる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）のＣH３ドメイン及び第２のＩｇのＣH３ドメインの使用を含み、ここで第１及び第２のＩｇのＣH３ドメインは、互いに少なくとも１つのアミノ酸が異なり、そしてアミノ酸相違のない二重特異性抗体と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸の相違が、二重特異性抗体のプロテインＡに対する結合性を低下させる。１つの実施態様において、第１のＩｇのＣH３ドメインは、プロテインＡに結合し、そして第２のＩｇのＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変などのプロテインＡ結合性を低下若しくは無効にする変異を含む（ＩＭＧＴエクソンによる付番；ＥＵ付番によるＹ４３６Ｆ）。第２のＣH３は、さらにＹ９６Ｆ改変を含んでもよい（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）。第２のＣH３内に見出されてもよいさらなる改変としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ, Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２I）；及びＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体フォーマット上の変異は、本発明の範囲内に期待（contemplate）される。
【００８４】
治療用製剤及び投与
本発明は、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体又はその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、移送、送達、耐性などを改善するために製剤に組み込まれる、さらに１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び他の薬剤（本明細書では、まとめて「薬学的に許容される担体又は希釈剤」と呼ぶ）を含んでもよい。数多くの適切な製剤は、全ての薬剤師に知られる処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに見いだすことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、（カチオン性又はアニオン性）リピド含有小胞（vesicle）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（さまざまな分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及び半固体混合物含有カーボワックスが挙げられる。Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311も参照されたい。
【００８５】
抗体の投与量は、投与対象の年齢及び大きさ、標的疾患、状態、投与経路などによって変わってもよい。好ましい投与量は、一般に体重又は体表面積に従って計算される。本発明の抗体を、Ａｎｇ−２活性が関与する成人患者の状態又は疾患を処置するために使うとき、本発明の抗体を通常約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重で、静脈内に投与することが有利であり得る。状態の重篤性によって処置の頻度及び期間を調整することができる。Ａｎｇ−２抗体を投与するための効果的な用量及びスケジュールは、実験的に決定してもよい；例えば、患者の進展を定期に評価モニタリングすることができ、従って投与量を調整することができる。さらに、業界によく知られる方法（例えば、Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351）を用いて、種間の用量の拡大縮小（scaling）を行うことができる。
【００８６】
種々の送達システムが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる、例えば、リポソーム、ミクロパーティクル、又はマイクロカプセルへの封入、変異ウイルス、受容体介在エンドサイトーシスを発現することができる組み換え体細胞（例えば、Wu et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）。導入の方法としては、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び口腔の経路が挙げられる。組成物は、任意の都合の良い経路で、例えば、注入（infusion）又はボーラス投与によって、上皮又は粘膜皮膚裏層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を経由する吸収によって、そして他の生物学的活性薬剤と共に投与してもよい。投与は、全身的又は局所的であればよい。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、例えば、標準の針及びシリンジを用いて皮下又は静脈内に送達させることができる。また、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、容易に本発明の医薬組成物を送達するのに適用される。そのようなペン送達デバイスは再使用可能又は使い捨てであってよい。再使用可能ペン送達デバイスは、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一旦、カートリッジ内の全部の医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄することができ、そして医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。ペン送達デバイスは、その後再使用できる。使い捨てのペン送達デバイスには、交換可能なカートリッジは無い。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、予め医薬組成物が充填されデバイス内のリザーバに保持された状態で売られている（come）。一旦リザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全部が破棄される。
【００８８】
多数の再使用可能ペン及び自己注射器送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、もちろん限定されないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark）、ＢＤ（商標）ペン（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Sanofi-Aventis, Frankfurt,
Germany）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン送達デバイスの例としては、もちろん限定されないが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Sanofi-Aventis）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Novo Nordisk）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Eli Lilly）が挙げられる。
【００８９】
目の障害を処置するために、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、例えば点眼薬、結膜下注射、結膜下埋め込み、硝子体内注射、硝子体内埋め込み、テノン嚢下注射、又はテノン嚢下埋め込みによって投与されてもよい。
【００９０】
医薬組成物はまた、小胞に入れて、特にリポソームで送達することができる（Langer 1990 Science 249:1527-1533；Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365；Lopez-Berestein, 同書, pp. 317-327を参照）。
【００９１】
特定の状況において、医薬組成物は制御放出システムで送達させることができる。１つの実施態様では、ポンプが使われてもよい（Langer, 上掲; Sefton 1987 CRC Crit. Ref.
Biomed. Eng. 14:201を参照）。別の実施態様では、ポリマー材料を使うことができる。さらに別の実施態様では、制御放出システムは組成物の標的の近傍に置くことができ、従って必要なのは全身投与量のほんの一部分だけである（例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138を参照）。
【００９２】
注射可能な製剤には、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射製剤は、公知の方法で製造してもよい。例えば、注射製剤は、例えば上記の抗体又はその塩を、従来注射用に使われる無菌の水性溶媒又は油性溶媒に溶解、懸濁又は乳化することによって製造してもよい。注射用の水性溶媒としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張液などがあり、それらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤｛例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加化合物｝などとの組合せで使用されてもよい。油性溶媒としては、例えばゴマ油、大豆油などが用いられ、それらはベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどとの組合せで使用されてもよい。そのようにして製造された注射液は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【００９３】
有利には、上記の経口又は非経口用の医薬組成物は、活性成分の投与量に適合する単位投与量の製剤に製造される。そのような単位投与量の製剤としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、一般に単位投与量の製剤当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射液の形態では、前述の抗体が約５〜約１００ｍｇで含まれることが好ましくそして他の剤形には約１０〜約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。
【００９４】
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、とりわけ、血管形成に関係する疾患又は障害を含めて、Ａｎｇ−２活性が関係するいかなる疾患又は障害の処置、予防及び／又は改善のために有用である。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、例えば、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、消化管、男女生殖器官、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫システム、造血細胞及び骨髄、肝臓及び尿道、並びに眼などの特殊感覚器官に発生する原発性及び／又は転移性腫瘍を処置するために使用してもよい。或る実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の次のがん：腎細胞がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、又はメラノーマ、を処置するために使われる。
【００９５】
本発明の抗体及び抗原結合フラグメントはまた、１つ又はそれ以上の眼の障害の処置に有用であり得る。本発明の抗体及び抗原結合フラグメントで処置できる例示的な眼の障害としては、例えば、加齢に関連した黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び他の脈絡膜血管新生、血液漏出、網膜浮腫及び炎症に関連した眼の障害が挙げられる。加えるに、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、緑内障手術に対して初期の血管及びリンパ管形成並びに緑内障手術後の濾過胞へのマクロファージ動員を遮断し、臨床転帰を改善するアジュバントとして投与してもよい。
【００９６】
本発明の他の実施態様では、抗体又は抗原結合フラグメントは、高血圧、糖尿病（非インスリン依存性糖尿病を含む）、乾癬、関節炎（関節リュウマチを含む）、ぜんそく、敗血症、腎臓病及び傷害に関連する浮腫、脳梗塞又は腫瘍を処置するために使用される。
【００９７】
Ａｎｇ−２発現は、さまざまな炎症性及び／又は感染性疾患の重症度と相関することが示されている（例えば、Siner et al., 2009, Shock 31:348-353; Yeo et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):105:17097-17102を参照）。従って、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、１つ又はそれ以上の炎症性又は感染性疾患を処置、予防又は改善するために使用することができる。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体を投与することによって処置、予防又は改善することができる例示的な感染性疾患としては、限定されないが、マラリア（Plasmodium falciparum感染）、ウイルス性出血熱（例えば、デング熱）、リケッチア感染症、毒素性ショック症候群、敗血症、Ｃ型肝炎、バルトネラ・バシリフォルミス（Bartonella bacilliformis）感染症、リーシュマニア症、マイコバクテリア感染症、エプスタイン・バー・ウイルス感染症が挙げられる。
【００９８】
併用療法
併用療法には、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体と、例えば別のＡｎｇ−２アンタゴニスト（例えば、抗Ａｎｇ−２抗体、ペプチボディ（peptibody）、又はＣＶＸ−０６０（米国特許第７，５２１，４２５号参照）などのＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ）が挙げられる。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、例えばＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号参照、（また、本明細書で「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質（fusion protein）」とも呼ばれる）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼインヒビター（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ又はパゾパニブ）、抗ＤＬＬ４抗体（例えば、ＲＥＧＮ４２１などの米国特許第２００９／０１４２３５４号に開示の抗ＤＬＬ４抗体）など）と共に、又は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体又はＥＧＦＲ活性の低分子インヒビター）と共に投与してもよい。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体と併用で有利に投与されてもよい他の薬剤としては、低分子サイトカインインヒビター及びＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインと又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含む、サイトカインインヒビターが挙げられる。本発明はまた、本明細書で言及される抗Ａｎｇ−２抗体のいずれかと１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ，又は前記サイトカインのいずれかのインヒビターとの治療的組み合わせを含み、ここでインヒビターは、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）2フラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；又は二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニ抗体及び最小認識ユニットなどの他の工学的分子）である。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、抗ウイルス剤、鎮痛剤、副腎皮質ステロイド及び／又はＮＳＡＩＤとの併用で投与してもよい。本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、放射線療法及び／又は従来の化学療法を含む治療計画の一部として投与してもよい。１つ又はそれ以上のさらなる薬剤と併用する場合、本発明の抗Ａｎｇ−２抗体は、他の薬剤の投与の前に、同時に（例えば、同一の製剤で若しくは別々の製剤で）又は後に投与してもよい。
【００９９】
抗体の診断的使用
本発明の抗Ａｎｇ−２抗体はまた、例えば診断の目的で、サンプル中のＡｎｇ−２を検出及び／又は測定するために使用してもよい。例えば、抗Ａｎｇ−２抗体又はそのフラグメントは、Ａｎｇ−２の異常発現（例えば、過剰発現、低発現、発現の欠如など）によって特徴付けられる状態又は疾患を診断するために使用してもよい。例示的なＡｎｇ−２の診断的アッセイは、例えば、患者から得たサンプルを本発明の抗Ａｎｇ−２抗体と接触させることを含み、ここで抗Ａｎｇ−２抗体は、検出可能な標識又はレポータ分子で標識されている。或いは、標識されていない抗Ａｎｇ−２抗体は、それ自身が検出可能に標識された第２の抗体と組み合わせて診断的用途に使用することができる。検出可能な標識又はレポータ分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、又は125Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアナート、若しくはローダミンなどの蛍光又は化学発光部分；又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼなどの酵素であればよい。サンプル中のＡｎｇ−２を検出又は測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイとしては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのようにして作りそして使うかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するもので、本発明者らが自分らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して、正確性を確保する努力はされているが、幾つかの実験的なエラー及び偏差を考慮すべきである。特に断りのない限り、割合は重量による割合、分子量は平均分子量、温度は摂氏温度、そして圧力は大気圧又はその近傍である。
【０１０１】
〔実施例１〕：ヒトＡｎｇ−２に対するヒト抗体の生成
ヒトＡｎｇ−２抗原を、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに直接投与した。抗体免疫応答は、Ａｎｇ−２特異的免疫アッセイでモニターした。目的の免疫応答が得られたら、脾臓細胞を採取し、その生存能力を保存しハイブリドーマ細胞株を形成させるためにマウスミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞株は、スクリーニングし選択してＡｎｇ−２特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を用いて、数個の抗Ａｎｇ−２キメラ抗体（即ち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを持つ抗体）を得た；この方法で生成された例示的な抗体は、次のように命名した：Ｈ１Ｍ７２４、Ｈ１Ｍ７２７、Ｈ１Ｍ７２８、Ｈ２Ｍ７３０、Ｈ１Ｍ７３２、Ｈ１Ｍ７３７、Ｈ２Ｍ７４２、Ｈ２Ｍ７４３、Ｈ２Ｍ７４４、Ｈ１Ｍ７４９、Ｈ２Ｍ７５０及びＨ１Ｍ８１０。
【０１０２】
抗Ａｎｇ−２抗体はまた、米国特許第２００７／０２８０９４５Ａ１号に記載されるように、ミエローマ細胞と融合させることなく、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を用いて、数個の完全ヒトＡｎｇ−２抗体（即ち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを持つ抗体）を得た；この方法で生成された例示的な抗体は、次のように命名した：Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９３、Ｈ１Ｈ６９４、Ｈ１Ｈ６９５、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０４、Ｈ１Ｈ７０６及びＨ１Ｈ７０７。
【０１０３】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗Ａｎｇ−２抗体の生物学的特性は、以下に記載される実施例で詳細に説明される。
【０１０４】
〔実施例２〕：可変（variable）遺伝子利用解析
産生された抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローン化し配列を決定した。抗体の核酸配列及び予測されるアミノ酸配列から、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の遺伝子使用を同定した（表１）。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
表２は、選択された抗Ａｎｇ−２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列対並びにそれらの対応する抗体識別子を示す。Ｎ、Ｐ及びＧの記号表示は、同じＣＤＲ配列を持つが、ＣＤＲ配列から外れた領域（即ち、フレームワーク領域）に配列変異を持つ重鎖及び軽鎖を有する抗体を指す。従って、特定の抗体のＮ、Ｐ及びＧ変異体は、それらの重鎖及び軽鎖可変領域内に同じＣＤＲ配列を有するが、フレームワーク領域内に変更を含む。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
以下の実施例で使われるコントロール構造（control construct）
さまざまなコントロール構造（抗Ａｎｇ−２抗体及び抗Ａｎｇ−２ペプチボディ）は、比較の目的で以下の実験に含めた。コントロール構造は次のように命名した：コントロールＩ：米国特許第２００６／００１８９０９号に記載のように（また、Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516を参照）、「Ａｂ５３６（ＴＨＷ）」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを持つヒト抗Ａｎｇ−２抗体；コントロ
ールＩＩ：米国特許第７，２０５，２７５号に記載のように（また、Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516を参照）、「２ＸＣｏｎ４（Ｃ）」のアミノ酸配列を有するヒトＡｎｇ−２に結合するペプチボディ；コントロールＩＩＩ：米国特許第７，１３８，３７０号に記載のように、「Ｌ１−７」のアミノ酸配列を有するヒトＡｎｇ−２に結合するペプチボディ；コントロールＩＶ：米国特許第２００６／０２４６０７１号に記載のように、「３．１９．３」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを持つヒト抗Ａｎｇ−２抗体；及びコントロールＶ：国際公開公報第２００９／０９７３２５号に記載のように、「ＭＥＤＩ１／５」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを持つヒト抗Ａｎｇ−２抗体。（すべてのコントロール構造が全実施例に使われるとは限らない）。以下の表で、記号の「Ａｂ」及び「Ｐｂ」は、それぞれ抗体及びペプチボディ・コントロールを同定するために含めた（即ち、コントロールＩ＝Ａｂ；コントロールＩＩ＝Ｐｂ；コントロールＩＩＩ＝Ｐｂ；コントロールＩＶ＝Ａｂ；及びコントロールＶ＝Ａｂ）。
【０１０９】
〔実施例３〕：抗原結合親和力測定
選択され精製されたＡｎｇ−２抗体と、ヒト（配列番号５１９）、マウス（Mus musculus；配列番号５２０）及びサル（Macca fascicularis；配列番号５２１）のヒトＩｇＧ１（配列番号５２８）とコンジュゲートしたＡｎｇ−２（Ａｎｇ−２ＦＤ）の二量体フィブロネクチン様ドメインとの結合の平衡解離定数（ＫD値）は、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイを用いた表面動力学によって測定した。抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＣＭ５センサーチップに直接アミンカップリングで作られたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体表面、ヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体（Southern Biotech, Birmingham, AL）表面又はヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA）表面に捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。異なる濃度（５０ｎＭ〜６．２５ｎＭの範囲）のタンパク質を、捕捉された抗体表面上に１００μＬ／分で９０秒間注入した。抗原・抗体の結合及び解離は、室温で、リアルタイムにモニターした。ＫD及び抗原／抗体複合体解離の半減期を計算するために、動力学的解析を行った。結果は、下の表３にまとめた。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
上記の実験は、ヒトＩｇＧ１上にクローン化された、選択され精製された抗Ａｎｇ−２抗体を用いて繰り返した。結果は、下の表４にまとめた。
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
さらに異種間親和性を評価するために、選択された抗Ａｎｇ−２抗体を用いて、異なる２つの温度でさらなる結合実験を行った。それぞれの選択された抗体又はコントロール構造を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で作られたヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体表面に４０μＬ／分で１分間捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。ヒト、サル及びマウスＡｎｇ−２ＦＤ−Ｆｃを、２５ｎＭ又は０．７８ｎＭの濃度で、捕捉された抗体表面上に６０μＬ／分の流速で３分間注入し、抗原・抗体の解離を２５℃又は３７℃のいずれかで、リアルタイムに２０分間モニターした。
【０１１４】
結果は、下の表５（２５℃結合）及び表６（３７℃結合）にまとめた。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】
別の実験で、ヒト「蝶ネクタイＡｎｇ−２」の四量体構造（「ｈＢＡ２」）に結合する選択され精製された抗体のＫD値を（上記の方法を用いて）測定した。ｈＢＡ２は２つの二量体から成り、それぞれの二量体は互いにヒトＦｃドメインによって連結した２つのＡｎｇ−２フィブロネクチン様ドメインを含む。ｈＢＡ２の二量体成分のアミノ酸配列は、配列番号５２２で示される。結果を、下の表７にまとめた。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
さらに別の実験において、野生型ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２−ＷＴ；配列番号５１８）及びヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２ＦＤ）のフィブリノーゲン様ドメインに結合する選択され精製された抗体のＫD値を（上記のように）測定した。結果は、下の表８にまとめた。
【０１１９】
【表７】
【０１２０】
【表８】
【０１２１】
選択された抗Ａｎｇ−２抗体の単量体ｈＡｎｇ−２ＦＤに対する２５℃及び３７℃における結合特性を測定するために、さらなる実験を行った。それぞれの選択された抗体又はコントロール構造を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で作られたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体表面に４０μＬ／分の流速で１分間捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。ヒトＡｎｇ−２ＦＤを、５００ｎＭ又は７．８ｎＭの濃度で、捕捉された抗体表面上に６０μＬ／分の流速で３分間注入し、抗原・抗体の解離を２５℃又は３７℃のいずれかで、リアルタイムに２０分間モニターした。
【０１２２】
結果は、下の表９（２５℃結合）及び表１０（３７℃結合）にまとめた。Ｎ／Ｄ＝測定されない。
【０１２３】
【表９】
【０１２４】
この実施例に示すように、実施例１に従って生成された数個の抗Ａｎｇ−２抗体は、コントロールと同等又はそれより高い親和性でＡｎｇ−２構造に結合する。例えば、抗体Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ７２４及びＨ１Ｈ７４４は、二量体ヒトＡｎｇ−２−ＦＤとそれぞれ７１．４、７９、１１５、及び１１４ｐＭのＫDで結合したのに対して、コントロールＩの抗体は、二量体ヒトＡｎｇ−２−ＦＤと３９９ｐＭのＫDで結合した（表４を参照）。同様に、抗体Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ７２４及びＨ１Ｈ７４４は、ヒトＢＡ２（四量体Ａｎｇ−２フィブリノーゲン様ドメイン構造）とそれぞれ１１．９、１７．９、２３．３及び１７．２ｐＭのＫDで結合したのに対して、コントロールＩの抗体は、ｈＢＡ２と８３ｐＭのＫDで結合した（表７を参照）。従って、コントロール構造と比較すると、多くの本発明の抗体は、Ａｎｇ−２に対して増強した結合性を示した。抗体のＨ１Ｈ６８５Ｐは、コントロール構造と比較すると、Ａｎｇ−２に対して特に強固な結合特性を示した。
【０１２５】
〔実施例４〕：Ａｎｇ−１を超すＡｎｇ−２に対する優先的結合
選択された抗体がＡｎｇ−２及びＡｎｇ−１の両者に結合するかどうか、又はそれらが選択的にＡｎｇ−２だけに結合するかどうかを確認するために、結合実験（プラズモン共鳴アッセイ）を行った。それぞれの選択された抗体又はコントロール構造を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で作られたヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体表面に４０μＬ／分の流速で１分間捕捉させ、捕捉された抗体表面を形成させた。完全野生型ヒトＡｎｇ−１又はＡｎｇ−２を、２５ｎＭ又は０．７８ｎＭの濃度で、捕捉された抗体表面上に６０μＬ／分の流速で３分間注入し、抗原−抗体の解離を２５℃又は３７℃のいずれかで、リアルタイムに２０分間モニターした。
【０１２６】
これらの実験結果を、下の表１１〜１４にまとめた。Ｎ／Ｄ＝測定されない。「非結合（No binding）」は、これらの実験で用いた特定の実験条件下で、検出可能な結合は観察されないことを意味する。
【０１２７】
【表１０】
【０１２８】
【表１１】
【０１２９】
【表１２】
【０１３０】
【表１３】
【０１３１】
これらの結果は、Ｈ１Ｈ６８５Ｐは高い親和性でＡｎｇ−２に結合するがＡｎｇ−１とは結合しないという点で、本実験で試験した抗体の中でユニークであることを示す。唯一、Ａｎｇ−２に結合するがＡｎｇ−１に結合しない他の構造はコントロールＩＩＩである。しかし、コントロールＩＩＩはペプチボディでありそして本実験で試験した全ての他の抗体はＡｎｇ−２及びＡｎｇ−１の両者に結合することを重要視すべきである。Ａｎｇ−２結合に対する選択性は、Ａｎｇ−２及びＡｎｇ−１の両者に結合する抗体にはない、治療的利益をＨ１Ｈ６８５Ｐに与える可能性がある。
【０１３２】
〔実施例５〕：ヒトＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２結合の阻害
Ｔｉｅ−２はＡｎｇ−２の天然受容体である。ヒトＴｉｅ−２（ｈＴｉｅ−２）に対するＡｎｇ−２の結合を遮断する抗Ａｎｇ−２抗体の能力について試験した。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ（マウスＩｇＧとコンジュゲートしたヒトＴｉｅ−２から成るキメラ構造；配列番号５２５）を、２μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルプレート上にコーティングし、一晩インキュベートした後洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で４回洗浄した。プレートは次に、０．５％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）を含むＰＢＳ（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）を用いて、室温で１時間ブロッキングした。別のプレートで、精製抗Ａｎｇ−２抗体を、出発濃度５０ｎＭで、プレートを横切って連続的に３倍に希釈した。ヒトＩｇＧとコンジュゲートしたヒト、マウス又はサルのＡｎｇ−２ＦＤタンパク質（Ａｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃ）をそれぞれ２ｎＭ、８ｎＭ、又は２ｎＭの終濃度で添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体／Ａｎｇ−２ＦＤ−Ｆｃ混合物を、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃを含むプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃタンパク質に結合したＡｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃの検出は、抗ヒトＩｇＧ抗体とコンジュゲートした西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA）によって測定し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用した標準的な比色反応によって展開させた。吸光度はＯＤ450で０．１秒間読み取った。１６．６７ｎＭの選択された抗Ａｎｇ−２抗体による、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃに対するＡｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃ結合の遮断パーセントは、表１５に示した。
【０１３３】
【表１４】
【０１３４】
同じような実験で、選択され精製された、ヒトＩｇＧ１上にクローン化された抗Ａｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２ＦＤの結合を遮断する能力を（上記のように）試験した。１６．６７ｎＭの選択された抗Ａｎｇ−２抗体による、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃに対するＡｎｇ−２ＦＤ−ｈＦｃ結合の遮断パーセントは、表１６に示した。ＮＴ：試験しない。
【０１３５】
【表１５】
【０１３６】
別の実験で、選択され精製された抗Ａｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対する２０ｐＭのビオチン化ｈＢＡ２の結合を遮断する能力を（上記のように）試験した。この実験のために、ヒスチジン標識をコンジュゲートしたヒトＴｉｅ−２（ｈＴｉｅ−２−Ｈｉｓ；配列番号５２６）を上記のｈＴｉｅ−２−ｍＦｃと同様の方法で使用した。５ｎＭからの抗体濃度は連続的に３倍に希釈した。ＩＣ50（阻害濃度）値は、Ｔｉｅ−２に対するビオチン−ｈＢＡ２結合に由来するシグナルの５０％遮断に必要な抗体量を計算することによって求めた。各抗体の平均ＩＣ50値は、別の２つの実験を基に算定した。結果は、表１７にまとめた。ＮＢ：５ｎＭの濃度で遮断が観察されない。
【０１３７】
【表１６】
【０１３８】
同様の実験で、選択され精製された、ヒトＩｇＧ１上にクローン化された抗Ａｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対するビオチン化ｈＢＡ２の結合を遮断する能力を（上記のように）試験した。結果は、表１８に示した。ＮＢ：５ｎＭの濃度で遮断が観察されない。
【０１３９】
【表１７】
【０１４０】
本実施例は、実施例１の方法に従って生成された幾つかの抗Ａｎｇ−２抗体が、Ａｎｇ−２のフィブリノーゲン様ドメインとその受容体（Ｔｉｅ−２）との相互作用を、コントロールの抗体と同等又はそれ以上の強さで遮断したことを示す。例えば、抗体のＨ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９５、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０４、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｈ７０７、Ｈ１Ｈ７２４及びＨ１Ｈ７４４のそれぞれは、コントロール構造で観察された結果と同様に（表１６を参照）、Ｔｉｅ−２受容体に対するヒト、マウス及びサルのＡｎｇ−２ＦＤ構造に９５％以上の遮断を起こした。
【０１４１】
〔実施例６〕：ヒトＴｉｅ−２に対する完全Ａｎｇ−２及びＡｎｇ−１の結合の阻害
Ｔｉｅ−２は、Ａｎｇ−１並びにＡｎｇ−２に対する受容体である。従って、本実施例では、いくつかの抗Ａｎｇ−２抗体の、ヒトＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２又はＡｎｇ−１の結合を遮断する能力を測定し比較した。
【０１４２】
本実施例で示されるＥＬＩＳＡ実験は、実施例５の実験と同様の方法で行った。つまり、ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ（マウスＩｇＧとコンジュゲートしたヒトＴｉｅ−２から成るキメラ構造；配列番号５２５）を、２μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルプレート上にコーティングし、一晩インキュベートした後洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で４回洗浄した。プレートは次に、０．５％ＢＳＡ（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）を含むＰＢＳ（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）を用いて、室温で１時間ブロッキングした。別のプレートで、精製抗Ａｎｇ−２抗体及びコントロール構造を、出発濃度３００ｎＭで、プレートを横切って連続的に３倍に希釈した。６Ｘヒスチジン・タグ（R&D Systems, Minneapolis, MN）とコンジュゲートした完全ヒトＡｎｇ−２又はＡｎｇ−１タンパク質を０．６ｎＭの終濃度で添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体／抗原混合物をｈＴｉｅ−２−ｍＦｃを含むプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃタンパク質に結合したＡｎｇ−２−Ｈｉｓ又はＡｎｇ−１−Ｈｉｓの検出は、抗ヒトＩｇＧ抗体とコンジュゲートした西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA）によって測定し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用した標準的な比色反応によって展開させた。吸光度はＯＤ450で０．１秒間読み取った。ＩＣ50（阻害濃度）値は、Ｔｉｅ−２に対するヒトＡｎｇ−２又はＡｎｇ−１の結合に由来するシグナルの５０％遮断に必要な抗体量を計算することによって求めた。ＩＣ50の観点で表した結果を、表１９のカラム（１）及び（２）に示した。抗体又はコントロール構造が、ｈＡｎｇ−１／Ｔｉｅ−２相互作用を遮断する程度と比較したｈＡｎｇ−２／Ｔｉｅ−２相互作用を遮断する程度は、カラム（３）に示されるＩＣ50の倍率差に反映される；即ち、カラム（３）の高い数字は、ｈＡｎｇ−１／Ｔｉｅ−２相互作用よりもｈＡｎｇ−２／Ｔｉｅ−２相互作用を遮断する能力が大きいことを示す。
【０１４３】
【表１８】
【０１４４】
Ｔｉｅ−２に対するＡｎｇ−１の結合を遮断する選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体の能力をさらに評価する目的で、バイオセンサー表面プラズモン共鳴実験を行った。本実験では、ヒトＴｉｅ−２完全細胞外ドメイン構造（ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ−ｅｃｔｏ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上にアミンカップリングさせ、受容体でコーティングされた表面を作成した。選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体及びコントロール構造、１μＭ（抗原に対して100倍過剰）を、１０ｎＭのｈＡｎｇ−１−ＷＴとプレミックスし、続いて２５℃で６０分間インキュベートして抗体−抗原結合を平衡に至らしめ、平衡溶液を形成させた。平衡溶液は、２５℃で、受容体表面上に５μＬ／分で５分間注入した。ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃに対するｈＡｎｇ−１−ＷＴの結合に起因する共鳴単位（ＲＵ）の変化を測定した。ゼロ％遮断のベースラインを設定するために、ｈＡｎｇ−１に結合しない無関係のペプチボディを本実験に含め、そしてヒトＴｉｅ−２−ｍＦｃ構造を、遮断のポジティブ・コントロールとして使用した。抗体とプレインキュベーション後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量は、ネガティブ・コントロールとプレインキュベーション後にＴｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量のパーセントとして表し、表２０に示した。（Ｔｉｅ−２に結合したＡｎｇ−１の量が多いほど抗体による遮断の程度が低いことを意味する）。
【０１４５】
【表１９】
【０１４６】
上述の実験を、異なる量のＡｎｇ−２遮断剤及びコントロールを用いて繰り返した。特に、ヒトＴｉｅ−２の完全細胞外ドメイン構造（ｈＴｉｅ−２−ｍＦｃ−ｅｃｔｏ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上にアミンカップリングさせ、受容体でコーティングされた表面を作成した。選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体及びコントロール構造（５０又は１５０ｎＭ）を、ｈＡｎｇ−２−ＷＴ（２５ｎＭ）と混合し、続いて２５℃で６０分間インキュベートして抗体−抗原結合を平衡に至らしめた。平衡溶液は、２５℃で、受容体表面上に１０μＬ／分で５分間注入した。選択された抗ｈＡｎｇ−２抗体の、ｈＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−１−ＷＴの結合を遮断する能力を評価するため、抗体を３つの濃度（５０、１００又は１０００ｎＭ）で試験し１０ｎＭのｈＡｎｇ−１−ＷＴとインキュベートする以外は同じ手順に準じた。ｈＴｉｅ−２に対するＡｎｇ−２−ＷＴ又はｈＡｎｇ−１−ＷＴの結合に起因する共鳴単位（ＲＵ）の変化を測定した。ゼロ％遮断のベースラインを設定するために、どちらのアンジオポイエチンとも結合しない無関係の抗体を本実験に含め、そしてヒトＴｉｅ−２−ｍＦｃ構造を遮断のポジティブ・コントロールとして使用した。結果は、表２１（ｈＴｉｅ−２表面に適用したｈＡｎｇ−１）及び２２（ｈＴｉｅ−２表面に適用したｈＡｎｇ−２）にまとめた。
【０１４７】
【表２０】
【０１４８】
これらの実験で得られた結果は、Ｈ１Ｈ６８５ＰがＡｎｇ−１よりもＡｎｇ−２に優先的に結合することを示した前の結果（実施例４を参照）と一致する。具体的には、本実施例からの結果は、幾つかの抗Ａｎｇ−２抗体（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ及びＨ１Ｈ７０６Ｐ）はヒトＴｉｅ−２に対するヒトＡｎｇ−１の結合を有意には遮断しないことを示す、にもかかわらず、他の実験でこれらの抗体はＡｎｇ−２とＴｉｅ−２の相互作用を強く遮断することが明示された（実施例５、表１６を参照）。さらに、これらの実験で、コントロールＩＩＩペプチボディを除いて、どのコントロール構造も、Ｈ１Ｈ６８５Ｐの様な本発明の典型的な抗Ａｎｇ−２抗体と同じ程度のＡｎｇ−１を越えたＡｎｇ−２との優先的な結合／遮断を示さなかった。
【０１４９】
〔実施例７〕：抗Ａｎｇ−２抗体によるＡｎｇ−２媒介Ｔｉｅ−２リン酸化の阻害
本発明の発明者らは、Ａｎｇ−２の発現が、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）内で転写因子ＦＯＸＯ１によって誘導できることを明らかにした（Daly et al. 2006 PNAS
103:15491）。さらに、本発明者らは、ＦＯＸＯ１をコードするアデノウイルスによるＨＵＶＥＣの感染は、Ａｎｇ−２の発現及び分泌、続いてＴｉｅ−２リン酸化の活性化引き起こすことを示した（Daly et al. 2006 PNAS 103:15491）。
【０１５０】
抗Ａｎｇ−２抗体の、Ｔｉｅ−２リン酸化を阻害する能力を試験した。つまり、７×１０5のＨＵＶＥＣｓ（Vec Technologies, Rensselaer, NY）を、６ｃｍ細胞培養用ディッシュ内の３．５ｍＬのＭＣＤＢ１３１コンプリート培地（Vec Technologies, Rensselaer, NY）に播種した。翌日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）で洗浄し、２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；コントロール）又はヒトＦＯＸＯ１（Daly et al. 2004 Genes Dev. 18:1060）のいずれかをコードする組み換えアデノウイルスを、１０ｐｆｕ／細胞の濃度で細胞に添加し、４時間インキュベートした。次に、細胞をＭＣＤＢ１３１で洗浄し、抗Ａｎｇ−２抗体を０．５μｇ／ｍＬの濃度で含む２ｍＬのＭＣＤＢ１３１を加えた。感染後２０時間に、細胞を溶解させ、Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15491-15496 (2006) に記載されたように、Ｔｉｅ−２免疫沈降を行った。免疫グロブリンを１時間、プロテインＡ／Ｇビーズ（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）上に集めた。ビーズは冷溶解バッファーで洗浄し、ホスホチロシン（Millipore, Billerica, MA）又はＴｉｅ−２に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットで分析するためにＳＤＳサンプルバッファーに再懸濁させた。シグナルは、ＨＲＰをコンジュゲートした第２の抗体及びＥＣＬ試薬（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて検出した。Ｘ線フィルムを走査し、ホスホＴｉｅ−２及びＴｉｅ−２シグナルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２比は、各抗Ａｎｇ−２抗体の％阻害（即ち、％阻害＝コントロールに比較したときのホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２の低下率）を測定するために用いた。例えば、コントロールサンプルで観測されるレベルへのＴｉｅ−２リン酸化の減少は、１００％阻害であると考えられる。観測された％阻害（それぞれ、２５〜５０％、５０〜７５％、７５〜１００％）に従って、試験した各抗Ａｎｇ−２抗体の相対的な阻害（＋、＋＋、＋＋＋）は、表２３に示した。
【０１５１】
【表２１】
【０１５２】
本実施例で示されたように、実施例１の方法に従って生成された抗Ａｎｇ−２抗体は、コントロールＩ抗体よりも大幅にＴｉｅ−２リン酸化を阻害した。特に、抗体Ｈ１Ｈ６８５、Ｈ１Ｈ６９０、Ｈ１Ｈ６９１、Ｈ１Ｈ６９３、Ｈ１Ｈ６９５、Ｈ１Ｈ６９６、Ｈ１Ｈ７０４、Ｈ１Ｈ７０６、Ｈ１Ｈ７０７、Ｈ１Ｍ７２４、Ｈ１Ｍ７４４及びＨ１Ｍ７５０で、強い阻害が観察された。
【０１５３】
〔実施例８〕：Ａｎｇ−１媒介Ｔｉｅ−２リン酸化の阻害
前の実施例で示したように、Ａｎｇ−２は、Ｔｉｅ−２のリン酸化を媒介する。Ａｎｇ−１もまた、Ｔｉｅ−２のリン酸化を促進させる。本実施例では、選択された抗Ａｎｇ−
２抗体の、Ａｎｇ−１が媒介するＴｉｅ−２のリン酸化を遮断する能力を評価した。
【０１５４】
ＥＡ．ｈｙ９２６細胞（Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3734-3737 (1983)）を、１０％ＦＢＳ、ＨＡＴ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有した１０ｍＬのＤＭＥＭに、１０ｃｍディッシュ当たり５×１０6細胞を播種した。２４時間後、細胞を、１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ中で１時間、血清飢餓状態にした。次に細胞を、４００ｎＭの関係のないイソ型コントロール抗体（“９Ｅ１０”）若しくは抗Ａｎｇ−２抗体のＨ１Ｈ６８５Ｐ、又は１０〜４００ｎＭの範囲の濃度のコントロール物質（コントロールＩ、コントロールＩＩ、コントロールＩＶ、又はコントロールＶ）のいずれかの存在下、５００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＡｎｇ−１（R&D Systems）で１０分間刺激した。
【０１５５】
インキュベーションの後、細胞を溶解し、Ｔｉｅ−２は、Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15491-15496 (2006) に記載されている様に、免疫沈降させた。免疫複合体は、プロテインＡ／Ｇビーズ（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と６０分間インキュベーションして集めた。ビーズは冷溶解バッファーで洗浄し、結合したタンパク質は、ＳＤＳサンプルバッファー中で加熱することによって溶出させた。サンプルは次に、Ｔｉｅ−２又はホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（クローン４Ｇ１０、Millipore, Billerica, MA）を用いたウェスタンブロット解析に供した。結果は図２に示した。
【０１５６】
シグナルは、ＨＲＰをコンジュゲートした第２の抗体及びＥＣＬ試薬（GE Healthcare,
Piscataway, NJ）を用いて検出した。Ｘ線フィルムを走査し、ホスホＴｉｅ−２及びＴｉｅ−２シグナルを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２比は、各抗体又はペプチボディの％阻害を決定するために使用した。％阻害＝コントロールサンプル（４００ｎＭｎｏイソ型コントロール抗体）と比較したときのホスホＴｉｅ−２／Ｔｉｅ−２の低下率。
【０１５７】
コントロール抗体９Ｅ１０の存在下で、Ａｎｇ−１はＴｉｅ−２のリン酸化を強力に活性化させた（図２、パネルＡ：レーン２及び３をレーン１と比較する）。試験した全てのコントロール物質は、コントロールＩＩ（図２、パネルＢ：レーン１７）は５０ｎＭで、コントロールＩＶ（図２、パネルＡ：レーン１１）は１００ｎＭで並びにコントロールＩ（図２、パネルＢ：レーン２４）及びコントロールＶ（図２、パネルＣ：レーン９）は２００ｎＭで完全な阻害が起こり、Ｔｉｅ−２のリン酸化を有意に阻害した。これに反して、Ｈ１Ｈ６８５Ｐは、４００ｎＭでも有意な阻害作用を有さない（図２、パネルＡ：レーン４〜８）。これらの結果は、Ａｎｇ−１よりもＡｎｇ−２に対するＨ１Ｈ６８５Ｐの特異性のさらなる確証を提供する。
【０１５８】
〔実施例９〕：抗Ａｎｇ−２抗体による腫瘍増殖の阻害
選択され精製された抗Ａｎｇ−２抗体の腫瘍増殖に対する作用を、２つの腫瘍細胞株を用いて測定した。
【０１５９】
ＰＣ３（ヒト前立腺がん細胞株）
手短に言うと、５×１０6個のＰＣ３細胞を含む１００μＬの成長因子削減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）を、６〜８週齢の雄性ＮＣｒヌードマウス（Taconic, Hudson,
NY）の側腹部に皮下注入した。腫瘍の体積が平均約２００ｍｍ3に達した後、マウスを、処置用に無作為にグループ分けした。各処置グループのマウスには、抗Ａｎｇ−２抗体、Ｆｃタンパク質、又はコントロール構造を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、週２回で約３週間、腹腔内注射によって（表２４）、又は２．５、１２．５、若しくは２５ｍｇ／ｋｇの濃度で、週２回で約３週間、皮下注射によって（表２５）投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した。腫瘍重量及び増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃタンパク質の測定値との対比から計算した。結果は、表２４及び２５にまとめた。
【０１６０】
【表２２】
【０１６１】
上に示したように、抗体のＨ１Ｈ７４４Ｎ及びＨ１Ｈ６８５Ｐは、ＰＣ３マウス腫瘍モデルで、コントロール構造と比較して、特に著明な抗腫瘍活性を示した。
【０１６２】
ＰＣ３マウス腫瘍モデル及び違う実験抗体（２ｍｇ／ｋｇで投与、週２回）を使った同様な実験の結果を、表２６及び２７に示した。
【０１６３】
【表２３】
【０１６４】
ＣＯＬＯ２０５（ヒト結腸直腸腺がん細胞株）
手短に言うと、２×１０6個のＣＯＬＯ２０５細胞を含む１００μＬの無血清培地を、６〜８週齢の雄性ＮＣｒヌードマウス（Taconic, Hudson, NY）の側腹部に皮下注入した。腫瘍の体積が平均約１５０ｍｍ3に達した後、マウスを、抗体処置グループ又はＦｃタンパク質処置グループに無作為にグループ分けした。各処置グループのマウスは、抗Ａｎｇ−２抗体又はＦｃタンパク質を４ｍｇ／ｋｇの濃度で、週２回で約２週間、腹腔内注射によって投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した。腫瘍重量及び増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。「平均腫瘍増殖」は、処置開始時（腫瘍が約１５０ｍｍ3のとき）からの平均増殖を表す。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃタンパク質の測定値との対比から計算した。結果は、表２８にまとめた。
【０１６５】
【表２４】
【０１６６】
Ｈ１Ｈ６８５Ｐの効果、特にＣＯＬＯ２０５の増殖に対する効果を評価するために、同様な実験を行った。つまり、２×１０6個のＣＯＬＯ２０５細胞を含む１００μＬの無血清培地を、９〜１１週齢の雄性ＳＣＩＤ ＣＢ１７マウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍が約１２５ｍｍ3に達したとき、マウスを無作為に５グループ（ｎ＝７〜８マウス／グループ）に分け、Ｆｃタンパク質（１５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ（５又は２５ｍｇ／ｋｇ）又はコントロールＩＩ（５又は２５ｍｇ／ｋｇ）で週２回、１９日間処置した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した。処置開始からの腫瘍重量及び増殖の平均は、各グループについて計算した。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃコントロールグループとの対比から計算した。結果は、表２９にまとめた。
【０１６７】
【表２５】
【０１６８】
ＰＣ３マウス腫瘍モデルと同様に、Ｈ１Ｈ６８５Ｐを含めて本発明の抗体のうちのいくつかは、ＣＯＬＯ２０５マウスモデルで実質的な抗腫瘍活性を示し、そしてそれはコントロール分子によって示された抗腫瘍活性と少なくとも同等であった。
【０１６９】
〔実施例１０〕：腫瘍増殖の阻害並びに抗Ａｎｇ−２抗体及びＶＥＧＦインヒビターの併用による潅流
抗Ａｎｇ−２抗体とＶＥＧＦインヒビターとの組み合わせがＣＯＬＯ２０５異種移植片の増殖に及ぼす作用を測定するため、２×１０6細胞を６〜８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍の平均体積が約３５０ｍｍ3に達したとき、マウスを無作為に４グループ（ｎ＝６マウス／グループ）に分け、ヒトＦｃタンパク質（７．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（米国特許第７，０８７，４１１号を参照）（２．５ｍｇ／ｋｇ）又はＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用で処置した。マウスには、１０日の処置にわたって合計３回投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定した。処置開始からの腫瘍増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍増殖の低下パーセントは、Ｆｃタンパク質の測定値との対比から計算した。結果は、表３０に示した。
【０１７０】
【表２６】
【０１７１】
本実験の結果は、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用が腫瘍増殖の低下を引き起こすことを示し、そしてそれは、どちらの成分単独によって引き起こされる腫瘍増殖の低下パーセントよりも大きかった。
【０１７２】
併用の有効性を示すさらなる証拠を提供するため、ＭＭＴ腫瘍の増殖に及ぼすＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ併用の効果を評価した。０．５×１０6細胞を６〜８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍の平均体積が約４００ｍｍ3に達したとき、マウスを無作為に４グループ（ｎ＝１１マウス／グループ）に分け、ヒトＦｃタンパク質（１７．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（５ｍｇ／ｋｇ）又はＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用で処置した。Ｆｃ及びＨ１Ｈ６８５Ｐは、９日にわたって３回投与した。ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ及び併用グループは、１２日にわたって４回投与した。腫瘍体積は実験を通して週２回測定し、腫瘍重量は実験の終わりに腫瘍切除したときに測定した（それらのサイズが大きいため、Ｆｃ及びＨ１Ｈ６８５Ｐグループからの腫瘍は、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ及び併用グループからの腫瘍よりも３日前に採取した）。処置開始からの腫瘍増殖及び腫瘍重量の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍重量及び増殖の低下パーセントは、Ｆｃコントロールグループとの対比から計算した。結果は、表３１に示した。
【０１７３】
【表２７】
【０１７４】
これらの結果は、単独の薬剤処置に比べて、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの強い腫瘍阻害効果を裏付ける。
【０１７５】
Ｈ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐの併用が、腫瘍血管機能に対して単独の薬剤よりも大きな影響を有するかどうかを測定するため、マイクロ超音波（VisualSonics' Vevo 770 imaging system）を使用し、腫瘍潅流の変化を評価した。ＣＯＬＯ２０５腫瘍を約１２５ｍｍ3に増殖させ、次にマウスをＨ１Ｈ６８５Ｐ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ又は両薬剤の併用で２４時間処置した。処置の後、腫瘍血管潅流を、コントラスト増強マイクロ超音波２Ｄ画像収集及び腫瘍に入る造影剤の量を表す「ウォッシュ−イン（wash-in）」曲線の解析に基づいて測定した。平均（平均＋／−標準偏差）腫瘍潅流を、各グループについて計算した。低下パーセントは、Ｆｃコントロールグループとの対比から計算した。結果は、表３２に示した。
【０１７６】
【表２８】
【０１７７】
併用処置が潅流に及ぼす亢進した作用と一致して、腫瘍切片の抗ＣＤ３１染色は、併用が腫瘍血管密度に対してより強く作用することを示した（データの表示無し）。腫瘍血管系の機能に対してＨ１Ｈ６８５Ｐ＋ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ併用が亢進した作用を持つことは、腫瘍増殖に対する併用療法の作用増強に対して、可能性がある説明を与える。
【０１７８】
〔実施例１１〕：抗Ａｎｇ−２抗体及び化学療法剤の併用による腫瘍増殖の阻害
化学療法剤と併用したＨ１Ｈ６８５Ｐの腫瘍増殖に及ぼす影響を試験するため、２．５×１０6個のＣＯＬＯ２０５腫瘍細胞を８〜９週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの右側後ろ側腹部の皮下に移植した。腫瘍の平均体積が約１５０ｍｍ3に達したとき（移植後１７日目）
、マウスを無作為に４グループ（ｎ＝５マウス／グループ）に分け、次のように処置した：第１のグループは、１５ｍｇ／ｋｇのＦｃで皮下に及び５−ＦＵの賦形剤で腹腔内に処置し；第２のグループは、１５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ６８５Ｐで皮下に処置し；第３のグループは、７５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内に処置し；第４のグループは、１５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ６８５Ｐで皮下に及び７５ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで腹腔内に併用で処置した。マウスは、合計３回処置され、３〜４日毎に投与された。腫瘍体積は実験を通して週２回測定した。処置開始から３８日目までの腫瘍増殖の平均値（平均＋／−標準偏差）は、各処置グループについて計算した。腫瘍増殖の低下パーセントは、コントロールグループの測定値との対比から計算した。結果は、表３３に示した。
【０１７９】
【表２９】
【０１８０】
本実験の結果から、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ及び５−ＦＵの併用は、別々に投与したどちらの物質よりも腫瘍増殖に大きな低下をもたらした。
【０１８１】
〔実施例１２〕：抗Ａｎｇ−２抗体は眼血管形成を阻害する
本実施例では、選択された抗Ａｎｇ−２抗体のマウスモデルの網膜血管化に及ぼす作用を評価した。
【０１８２】
実験の１セットには、野生型マウスを使用した。別のセットでは、野生型マウスＡｎｇ−２の代わりにヒトＡｎｇ−２を発現するマウス（「ｈｕ−Ａｎｇ−２マウス」と命名）を使用した。２日齢のマウス（Ｐ２）に、コントロールＦｃ又は選択された抗Ａｎｇ−２抗体のいずれかを１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。３日後（Ｐ５で）、幼獣らを安楽死させて眼球を摘出し、４％ＰＦＡ中で３０分間固定した。網膜を切開し、バンデリア豆（Griffonia simplicifolia）レクチン−１で３時間又は４℃で１晩染色して脈管構造を可視可させ、顕微鏡スライド上に平らに載せた。画像はNikon Eclipse 80i顕微鏡カメラで撮り、Adobe Photoshop CS3、Fovea 4.0及びScion 1.63ソフトウェアを用いて解析した。
【０１８３】
表面の脈管構造で覆われた網膜の面積を測定し、抗体活性の読み出しとして使用した。Ｆｃ処置のコントロールと比較して、抗体で処置したマウスの脈管領域のサイズの減少は、表３４に提示した。脈管領域の減少パーセントは、抗体の抗血管形成力を反映する。（Ｎ／Ｄ＝測定しない）。
【０１８４】
【表３０】
【０１８５】
本実施例で示すように、本発明の選択された抗Ａｎｇ−２抗体は、インビボで眼血管形成を実質的に阻害しており、従って、他の治療状況におけるこれらの抗体の抗血管形成の潜在能力を反映している。
【０１８６】
〔実施例１３〕：抗体結合に重要なＡｎｇ−２のアミノ酸
ｈＡｎｇ−２と本発明の抗ｈＡｎｇ−２ｍＡｂの結合をさらに特徴付けるために、それぞれが単一の点突然変異を含む７つの変異ｈＡｎｇ２−ＦＤ−ｍＦｃタンパク質を作成した。突然変異のために選択したアミノ酸は、ｈＴｉｅ−２と相互作用する領域における、ｈＡｎｇ−２とｈＡｎｇ−１の間の配列の違いを基にした（図１）。特に、結晶構造解析に基づいてＴｉｅ−２と相互作用すると思われるＡｎｇ−２のフィブリノーゲン様ドメイン（ＦＤ）内のアミノ酸で、Ａｎｇ−１の対応するアミノ酸と異なるアミノ酸を、それぞれ対応するｈＡｎｇ−１の残基に変異させた。この例の結果は、Ａｎｇ−２に優先的に結合する抗体が相互作用するＡｎｇ−２のアミノ酸残基を示す。即ち、もし、Ａｎｇ−２の特定の残基（又は複数の残基）がＡｎｇ−１の対応する残基に変えられ、Ａｎｇ−２に優先的に結合する抗体の結合が実質的に低下したなら、抗体はｈＡｎｇ−２のその特定の残基と相互作用すると結論することができる。
【０１８７】
この実験では、７つのｈＡｎｇ２−ＦＤ−ｍＦｃ変異タンパク質のそれぞれは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップに直接化学結合で創られた抗マウスＦｃ表面に捕捉された（約１４７〜２８３ＲＵ）。次に、１００ｎＭの各Ａｎｇ−２抗体（又は、場合によってペプチボディ）を、捕捉されたｍＦｃ−標識ｈＡｎｇ−２ＦＤタンパク質表面に５０μＬ／分の流速で１８０秒間注入し、変異ｈＡｎｇ２−ＦＤ−ｍＦｃと抗体の解離を、２５℃で２０分間、リアルタイムでモニターした。結果は、表３５ａ〜３５ｄ及び図３に示した。
【０１８８】
【表３１】
【０１８９】
【表３２】
【０１９０】
【表３３】
【０１９１】
【表３４】
【０１９２】
本発明のために、抗Ａｎｇ−２抗体は、もし、その残基がＡｎｇ−１の相当する残基に変異した場合に、本実施例で用いた実験条件下で、解離のＴ1/2が野生型構造で観察される解離のＴ1/2より少なくとも５倍少ないなら、特定のＡｎｇ−２アミノ酸と相互作用すると見なされる。この定義に照らして、抗体のＨ１Ｈ６８５Ｐは、試験した抗体の中で、Ｆ４６９、Ｙ４７５及びＳ４８０と相互作用するという点において、ユニークであるように見える。Ｈ１Ｈ６８５Ｐはまた、Ａｎｇ−１を越えてＡｎｇ−２と強く優先的な結合をする故にユニークであるので、Ｆ４６９、Ｙ４７５及びＳ４８０は、Ａｎｇ−２とＡｎｇ−１の免疫学的な同定を可能にするエピトープを含むと結論することができる。この実験で試験した他の抗体／ペプチボディは、これらの残基のたかだか１個または２個と相互作用する；即ち、Ｈ１Ｈ７４４Ｎ及びコントロールＩはＹ４７５と相互作用し；コントロールＩＩＩはＹ４７５及びＳ４８０と相互作用し；そしてコントロールＶはＦ４６９と相互作用すると思われる。興味あることに、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２の両者とＴｉｅ−２との結合を同じ効力で遮断することが示されたコントロールＩＩは、この実験で確認されたどのＡｎｇ−２特異的アミノ酸とも相互作用しない。
【０１９３】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。確かに、本明細書に記載されたことに加えて本発明の様々な変更は、上述の説明から当業者には明らかになる。そのような変更は、添付の請求項の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアンジオポイエチン−２（ｈＡｎｇ−２）と特異的に結合するが、ｈＡｎｇ−１と実質的に結合しない、単離したヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体又は抗原結合フラグメントが、Ｆ４６９、Ｙ４７５、及びＳ４８０から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むｈＡｎｇ−２（配列番号５１８）上のエピトープに結合する、請求項１に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体又は抗原結合フラグメントが、アミノ酸Ｆ４６９、Ｙ４７５、及びＳ４８０を含むｈＡｎｇ−２上のエピトープに結合する、請求項２に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体又は抗原結合フラグメントが、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約８０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、又は約１０ｐＭ未満のＫDでｈＡｎｇ−２に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体又は抗原結合フラグメントが、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約１ｎＭを越える、約１０ｎＭを越える、約５０ｎＭを越える、又は約１００ｎＭを越えるＫDでｈＡｎｇ−１に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗体又は抗原結合フラグメントが、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、ｈＡｎｇ−１に対していかなる結合も示さない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗体又は抗原結合フラグメントが、（ａ）アミノ酸Ｆ４６９、Ｙ４７５、及びＳ４８０を含むＡｎｇ−２上のエピトープに結合し；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約８０ｐＭ未満のＫDでｈＡｎｇ−２に結合し；及び（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで試験した場合、ｈＡｎｇ−１に対していかなる結合も示さない、請求項２に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲｓを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ−１（ＨＣＤＲ−１）、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ−２、配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ−３、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ−１（ＬＣＤＲ−１）、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ−２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ−３を含む、請求項８に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及び配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
抗体又は抗原結合フラグメントが、ｈＴｉｅ−２に対するｈＡｎｇ−２の結合を遮断するがｈＴｉｅ−２に対するｈＡｎｇ−１の結合を実質的に遮断しない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらにＶＥＧＦアンタゴニストを含む、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼインヒビター及びＶＥＧＦ阻害融合タンパク質から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲｓを含む抗体と同じＡｎｇ−２上のエピトープに結合する、単離したヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲｓを含む抗体と、ｈＡｎｇ−２への結合で競合する、単離したヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
腫瘍を有する患者を処置するときに使用するための、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
高血圧、糖尿病、ぜんそく、敗血症、腎臓病、浮腫又は眼疾患を有する患者を処置するときに使用するための、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
腫瘍を有する患者を処置するときに使用するための薬剤の製造における、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２１】
高血圧、糖尿病、ぜんそく、敗血症、腎臓病、浮腫又は眼疾患を有する患者を処置するときに使用するための薬剤の製造における、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２２】
腫瘍を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、上記方法。
【請求項２３】
高血圧、糖尿病、ぜんそく、敗血症、腎臓病、浮腫及び眼疾患から選択される疾患又は障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、上記方法。
【請求項１】
ヒトアンジオポイエチン−２（ｈＡｎｇ−２）と特異的に結合するが、ｈＡｎｇ−１と実質的に結合しない、単離したヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体又は抗原結合フラグメントが、Ｆ４６９、Ｙ４７５、及びＳ４８０から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むｈＡｎｇ−２（配列番号５１８）上のエピトープに結合する、請求項１に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体又は抗原結合フラグメントが、アミノ酸Ｆ４６９、Ｙ４７５、及びＳ４８０を含むｈＡｎｇ−２上のエピトープに結合する、請求項２に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体又は抗原結合フラグメントが、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約８０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、又は約１０ｐＭ未満のＫDでｈＡｎｇ−２に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体又は抗原結合フラグメントが、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約１ｎＭを越える、約１０ｎＭを越える、約５０ｎＭを越える、又は約１００ｎＭを越えるＫDでｈＡｎｇ−１に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗体又は抗原結合フラグメントが、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、ｈＡｎｇ−１に対していかなる結合も示さない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗体又は抗原結合フラグメントが、（ａ）アミノ酸Ｆ４６９、Ｙ４７５、及びＳ４８０を含むＡｎｇ−２上のエピトープに結合し；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、約８０ｐＭ未満のＫDでｈＡｎｇ−２に結合し；及び（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで試験した場合、ｈＡｎｇ−１に対していかなる結合も示さない、請求項２に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲｓを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ−１（ＨＣＤＲ−１）、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ−２、配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ−３、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ−１（ＬＣＤＲ−１）、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ−２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ−３を含む、請求項８に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ及び配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
抗体又は抗原結合フラグメントが、ｈＴｉｅ−２に対するｈＡｎｇ−２の結合を遮断するがｈＴｉｅ−２に対するｈＡｎｇ−１の結合を実質的に遮断しない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
抗体又は抗原結合フラグメントが、配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらにＶＥＧＦアンタゴニストを含む、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼインヒビター及びＶＥＧＦ阻害融合タンパク質から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲｓを含む抗体と同じＡｎｇ−２上のエピトープに結合する、単離したヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲｓを含む抗体と、ｈＡｎｇ−２への結合で競合する、単離したヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
腫瘍を有する患者を処置するときに使用するための、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
高血圧、糖尿病、ぜんそく、敗血症、腎臓病、浮腫又は眼疾患を有する患者を処置するときに使用するための、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
腫瘍を有する患者を処置するときに使用するための薬剤の製造における、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２１】
高血圧、糖尿病、ぜんそく、敗血症、腎臓病、浮腫又は眼疾患を有する患者を処置するときに使用するための薬剤の製造における、請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又は抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２２】
腫瘍を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、上記方法。
【請求項２３】
高血圧、糖尿病、ぜんそく、敗血症、腎臓病、浮腫及び眼疾患から選択される疾患又は障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に請求項１〜１１又は１６〜１７のいずれか１項に記載の単離した抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、上記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５００９７０（Ｐ２０１３−５００９７０Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２９４３（Ｐ２０１２−５２２９４３）
【出願日】平成２２年７月２７日（２０１０．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３２９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４４６９
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２７日（２０１０．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３２９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４４６９
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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