キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体、ならびにその調製法および使用法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００４年９月１０日に出願された米国特許仮出願番号６０／６０８，４９４の優先権を主張し、この特許は全体として本発明の一部として参照される。
本発明は一般に、悪性疾患を治療するためのヒト化抗体および抗体／薬物接合体（すなわち、免疫接合体）に関する。さらに詳細には、本発明はヒト化抗５Ｔ４抗体、前記抗体を調製するための単離された可変領域核酸およびポリペプチド、ならびに抗５Ｔ４／細胞毒素接合体、特に抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性薬物療法のために開発された薬物接合体は、標的特異性治療薬である。この概念は、所定の標的細胞集団について結合特異性を有する担体分子に治療薬をカップリングさせることを含む。高親和性モノクローナル抗体の利用可能性は、免疫療法、すなわち、抗体を標的とする薬物の開発を促進してきた。モノクローナル抗体と接合した治療薬は、細胞毒素、生物反応修飾物質、酵素（たとえば、リボヌクレアーゼ）、アポトーシス誘発タンパク質およびペプチド、ならびに放射性同位元素を包含する。抗体／細胞毒素接合体はしばしば免疫細胞毒素と称し、一方、抗体および低分子量薬物、たとえば、メトトレキサートおよびアドリアマイシンからなる抗体／薬物接合体は化学抗体／薬物接合体と呼ばれる。免疫賦活剤は、リンホカインなどの調節機能を有することが知られている生物反応修飾物質、成長因子、および補体活性化コブラ毒因子（ＣＶＦ）を含有する。放射性抗体／薬物接合体は、放射性同位元素からなり、これはその放射線により細胞を殺すための治療薬として使用できるか、あるいは画像化のために使用できる。抗体により薬物を腫瘍細胞に送達することは、正常組織におけるその取り込みを最小限に抑えることにより薬物の殺腫瘍効果を増大させる。たとえば、レフ（Ｒｅｆｆ）ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ９：１５２−６６；シーバー（Ｓｉｅｖｅｒｓ）（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．補遺４６：Ｓ１８−２２；ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）（２００１）Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：１９５−２０１参照。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ））は商業的に入手可能な抗体／薬物接合体であって、この原理に従って作用し、高齢の患者における急性骨髄性白血病の治療に関して承認されているものである。シーバーズ（Ｓｉｅｖｅｒｓ）ら、（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３：３６７８−８４参照。この場合において、標的分子は、カリケアマイシンと接合する抗ＣＤ３３モノクローナル抗体である。
【０００３】
ヒトにおける免疫療法は、一つには非ヒトモノクローナル抗体に対する反対反応のために制限されてきた。齧歯類抗体を用いた当初の臨床試験により、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）およびヒト抗ラット抗体（ＨＡＲＡ）は反応し、これは抗体の迅速な除去に至ることが明らかになった。以来、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ抗体、およびトランスジェニックマウスまたはファージディスプレーライブラリーを用いて調製されるヒト抗体をはじめとする、免疫原性の低い抗体が開発されている。モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−５；クィーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９−３３；ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）ら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）１０：１４５５−６０；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、（１９９４）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１；マーク（Ｍａｒｋｓ）ら、（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−９７参照。ＨＡＭＡ反応を回避することにより、治療反応を達成するために高用量および反復投与が可能になる。
【０００４】
キメラ抗体は、組み換えクローニング技術を用いて調製され、非ヒト種抗体（すなわち、抗原で免疫化される種）からの抗原結合部位を含有する可変領域、およびヒト免疫グロブリンからの定常領域が含められる。ヒト化抗体は、キメラ抗体の１種であり、抗原結合に関与する可変領域のこれらの残基のみが非ヒト種由来であり、残りの可変領域残基ならびに定常領域はヒトである。ヒト化抗体は従来のキメラ抗体よりも免疫原性が低く、ヒトに投与された後に改善された安定性を示す。ベニンコサ（Ｂｅｎｉｎｃｏｓａ）ら、（２０００）Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９２：８１０−６；カロフォノス（Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ）ら、（１９９４）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ：１８４２−５０；スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）ら、（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ． １７：１１０−５参照。
【０００５】
薬物ターゲティングの候補抗体は、腫瘍胎児抗原、すなわち、胎児細胞および新生細胞上に存在する抗原を認識し、主として正常成人細胞にはない抗体を包含する。たとえば、マグデレナト（Ｍａｇｄｅｌｅｎａｔ）（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５０：１３３−４３参照。５Ｔ４腫瘍胎児抗原は、４２ｋＤａの非グリコシル化コアを含む、７２ｋＤａの高度にグリコシル化された膜貫通糖タンパク質である（ホール（Ｈｏｌｅ）ら、（１９８８）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｃｎｅｒ ５７：２３９−４６、ホール（Ｈｏｌｅ）ら、（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５：１７９−８４；ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ８９／０７９４７；米国特許第５，８６９，０５３号参照）。５Ｔ４は、２つのロイシンリッチな繰り返し（ＬＲＲ）および介在する親水性領域により特徴づけられ、標的療法に使用可能な抗原である細胞外ドメインを含む（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９３１９−２４）。
【０００６】
ヒト５Ｔ４は、膀胱癌、乳ガン、子宮頸ガン、子宮内膜癌、肺ガン、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、胃ガン、および睾丸癌をはじめとする多くの種類の癌において発現され、胎盤の栄養細胞合胞体層を除いては、正常細胞には実質的にない（たとえば、サウサール（Ｓｏｕｔｈａｌｌ）ら、（１９９０）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１： ８９−９５（正常および悪性組織における５Ｔ４抗原の免疫組織学的分布（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｃｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ５Ｔ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ））；ミーケ（Ｍｉｅｋｅ）ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３： １９２３−１９３０ （腫瘍細胞上の低い細胞間接着分子１および高い５Ｔ４発現は、結腸直腸癌患者における無病生存率の低下と相関する（ｌｏｗ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １およびｈｉｇｈ ５Ｔ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ））；スタージンスカ（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９４）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６９： ８９９−９０２（直腸結腸癌における５Ｔ４腫瘍胎児抗原発現の予後的意義（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ５Ｔ４ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））；スタージンスカ（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９２）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６６： ８６７−８６９ （直腸結腸癌および胃ガンにおける５Ｔ４抗原の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ５Ｔ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌおよびｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９９０）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１： ９６−１００ （子宮頸ガンにおける５Ｔ４抗原の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ５Ｔ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ））；コナー（Ｃｏｎｎｏｒ）およびスターン（Ｓｔｅｒｎ）（１９９）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： １０２９−１０３４（子宮頸ガンにおけるＭＨＣクラス−Ｉ発現の喪失（ｌｏｓｓ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ−Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ））；アリ（Ａｌｉ）ら、（２００１）Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７： ５７−６４（正常、異形成および悪性口腔粘膜上の５Ｔ４腫瘍胎児抗原の発現のパターン（ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５Ｔ４ ｏｎｃｏｆｏｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｎｏｒｍａｌ、ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａ））； ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ８９／０７９４７；米国特許第５，８６９，０５３号参照）。たとえば、５Ｔ４の発現がないと報告されている組織としては、肝臓、皮膚、脾臓、胸腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、副腎、および卵巣が挙げられる。限局性または低い５Ｔ４の発現を有すると報告されている組織としては、肝臓、皮膚、脾臓、リンパ節、扁桃腺、甲状腺、前立腺、および精嚢が挙げられる。５Ｔ４の弱〜中拡散発現は、腎臓、肺、膵臓、咽頭、および胃腸管において報告されている。５Ｔ４の高い発現を有すると報告されている唯一の組織は合胞体栄養細胞層であり；５Ｔ４は正常血清または妊婦の血清にもなかった（すなわち、＜１０ ｎｇ／ｍｌのレベル）。腫瘍における５Ｔ４の過剰発現は、疾患の進行と相関し、５Ｔ４発現の評価は短期的予後の患者を特定するための有用な方法であることが示唆されている（マルダー（Ｍｕｌｄｅｒ）ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３；１９２３−３０、ナガヌマ（Ｎａｇａｎｕｍａ）ら、（２００２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２：１０３３−８、ストラジンスカ（Ｓｔｒａｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６９：８９９−９０２、ストラジンスカ（Ｓｔｒａｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１０：４７９−８４、リングレイ（Ｗｒｉｎｇｌｅｙ）ら、（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ５ ２６９−２７４））。
【０００７】
５Ｔ４抗体の立体構造エピトープを認識するｍＡｂ５Ｔ４（Ｈ８抗体とも呼ばれる）（ショー（Ｓｈａｗ）ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６３：１３６−４５、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９８／５５６０７）、ラットモノクローナル抗体（ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６６：３５３−６５）、および５Ｔ４マウスモノクローナル抗体（米国特許第５，８６９，０５３号）をはじめとするいくつかの非ヒト抗５Ｔ４抗体が記載されている。単鎖抗５Ｔ４抗体、ならびに治療分子と融合した抗５Ｔ４抗体配列を含む融合タンパク質も記載されている。たとえば、ヒトＩｇＧ１定常ドメインまたはネズミＢ７．１の細胞外ドメインと融合した抗５Ｔ４抗体配列は、５Ｔ４発現腫瘍細胞系の細胞崩壊を誘発する（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：８８４−９６、ショー（Ｓｈａｗ）ら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５２４：２３８−４６；米国特許出願公開番号２００３／００１８００４）。同様に、スーパー抗原と融合した単鎖抗５Ｔ４抗体は、インビトロで非小細胞肺癌細胞のＴ細胞依存性細胞崩壊を刺激し得る（フォースバーグ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ）ら、（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１２９−３６）。ＰＮＵ−２１４９３６、突然変異スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトサイトトキシンＡ（ＳＥＡ）と融合したモノクローナル抗体５Ｔ４のネズミＦａｂフラグメントを用いた第Ｉ相臨床試験は、限定された細胞毒性および多少の抗腫瘍反応を示した（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、（２００４）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２２（４）：６０２−６０９）。別の治療法として、癌の治療に関して組み換え５Ｔ４ワクチンが示唆されている（マルリャン（Ｍｕｌｒｙａｎ）ら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１：１１２９−３７；英国特許出願公開番号２，３７０，５７１および２，３７８，７０４；欧州特許出願公開番号ＥＰ１，１６０，３２３および１，１５２，０６０）。
【特許文献１】米国特許仮出願番号６０／６０８，４９４明細書
【特許文献２】ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ８９／０７９４７明細書
【特許文献３】米国特許第５，８６９，０５３号明細書
【特許文献４】ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９８／５５６０７明細書
【特許文献５】米国特許出願公開番号２００３／００１８００４明細書
【特許文献６】英国特許出願公開番号２，３７０，５７１明細書
【特許文献７】英国特許出願公開番号２，３７８，７０４明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開番号ＥＰ１，１６０，３２３明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開番号ＥＰ１，１５２，０６０明細書
【非特許文献１】レフ（Ｒｅｆｆ）ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ９：１５２−６６
【非特許文献２】シーバーズ（Ｓｉｅｖｅｒｓ）（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６ 補遺：Ｓ１８−２２
【非特許文献３】ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）（２００１）Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：１９５−２０１
【非特許文献４】シーバーズ（Ｓｉｅｖｅｒｓ）ら、（１９９９）Ｂｌｏｏｄ ９３：３６７８−８４
【非特許文献５】モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−５
【非特許文献６】クィーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９−３３
【非特許文献７】ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）ら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）１０：１４５５−６０
【非特許文献８】グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、（１９９４）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１
【非特許文献９】マーク（Ｍａｒｋｓ）ら、（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−９７
【非特許文献１０】ベニンコサ（Ｂｅｎｉｎｃｏｓａ）ら、（２０００）Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９２：８１０−６
【非特許文献１１】カロフォノス（Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ）ら、（１９９４）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ：１８４２−５０
【非特許文献１２】スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）ら、（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ． １７：１１０−５
【非特許文献１３】マグデレナト（Ｍａｇｄｅｌｅｎａｔ）（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５０：１３３−４３
【非特許文献１４】ホール（Ｈｏｌｅ）ら、（１９８８）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５７：２３９−４６
【非特許文献１５】ホール（Ｈｏｌｅ）ら、（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５：１７９−８４
【非特許文献１６】マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９３１９−２４
【非特許文献１７】サウサール（Ｓｏｕｔｈａｌｌ）ら、（１９９０）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１： ８９−９５
【非特許文献１８】ミーケ（Ｍｉｅｋｅ）ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３： １９２３−１９３０
【非特許文献１９】スタージンスカ（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９４）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６９： ８９９−９０２
【非特許文献２０】スタージンスカ（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９２）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６６： ８６７−８６９
【非特許文献２１】ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９９０）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６１： ９６−１００
【非特許文献２２】コナー（Ｃｏｎｎｏｒ）およびスターン（Ｓｔｅｒｎ）（１９９）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： １０２９−１０３４
【非特許文献２３】アリ（Ａｌｉ）ら、（２００１）Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７： ５７−６４
【非特許文献２４】マルダー（Ｍｕｌｄｅｒ）ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３；１９２３−３０
【非特許文献２５】ナガヌマ（Ｎａｇａｎｕｍａ）ら、（２００２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２２：１０３３−８
【非特許文献２６】ストラジンスカ（Ｓｔｒａｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６９：８９９−９０２
【非特許文献２７】ストラジンスカ（Ｓｔｒａｚｙｎｓｋａ）ら、（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１０：４７９−８４
【非特許文献２８】リングレイ（Ｗｒｉｎｇｌｅｙ）ら、（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ５ ２６９−２７４
【非特許文献２９】ショー（Ｓｈａｗ）ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６３：１３６−４５
【非特許文献３０】ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３６６： ３５３−６５
【非特許文献３１】マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：８８４−９６
【非特許文献３２】ショー（Ｓｈａｗ）ら、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５２４：２３８−４６
【非特許文献３３】フォースバーグ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ）ら、（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１２９−３６
【非特許文献３４】チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、（２００４）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２２（４）：６０２−６０９
【非特許文献３５】マルリャン（Ｍｕｌｒｙａｎ）ら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１：１１２９−３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
免疫療法の潜在的な標的として５Ｔ４に相当興味があるにもかかわらず、治療薬に結合した抗５Ｔ４抗体を用いる療法は記載されていない。本発明は、ヒト化抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体、ならびに開示された抗体および抗体／薬物接合体を製造する方法ならびにその治療的使用法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体および抗体フラグメント、ならびにその調製法および使用法を提供する。本発明の抗５Ｔ４抗体は、少なくとも１つの軽鎖または少なくとも１つの重鎖、あるいはそのフラグメントを含み、ここにおいて、キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントは、（ａ）少なくとも約１ｘ１０^−７ Ｍ〜約１ｘ１０^−１２ Ｍの結合親和力でヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合するか；（ｂ）１ｘ１０^−１１ Ｍよりも高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合するか；（ｃ）５ｘ１０^−１１ Ｍよりも高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合するか；（ｄ）ヒト５Ｔ４抗原と結合するネズミＨ８抗５Ｔ４抗体の結合親和力よりも高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合するか；（ｅ）インビボで５Ｔ４発現細胞を特異的に標的とするか；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗体とヒト５Ｔ４抗原との結合に関して競合するか；（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つにより結合したエピトープと特異的に結合するか；あるいは（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗原結合ドメインを含む。本発明のキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体は、ヒト定常領域由来である定常領域、たとえば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含む。たとえば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は配列番号２５または８５〜８９のいずれか一つのアミノ酸配列を含み得る。もう一つ別の例として、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域は２４１位でプロリンを含み得る。
【００１０】
本発明の代表的なキメラ抗５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸１〜１０７を含む軽鎖可変領域配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列１〜１２０を含む重鎖可変領域配列、あるいは（ｃ）配列番号１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖、および配列番号２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む抗体を包含する。さらなる代表的なキメラ抗５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖；あるいは（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体を包含する。
【００１１】
本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は、（ａ）ヒト抗体フレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域；および（ｂ）配列番号１７の軽鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲあるいは配列番号１８の重鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体を包含する。たとえば、ヒト抗体フレームワーク領域の残基は、（ａ）ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系クローン、ＶκＩＩＩサブグループ、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系クローンのヒト抗体軽鎖フレームワーク領域；（ｂ）ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）からなる群から選択されるヒト抗体重鎖フレームワーク領域；（ｃ）（ｂ）の重鎖フレームワーク領域のコンセンサス配列；あるいは（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のフレームワーク領域と少なくとも９５％同一であるフレームワーク領域を含み得る。
【００１２】
本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は、配列番号１７または１８の２以上のＣＤＲ、たとえば、配列番号１７の軽鎖可変領域の２または全３個のＣＤＲ、あるいは配列番号１８の重鎖可変領域の２または全３個のＣＤＲ、あるいは配列番号１７の軽鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲおよび配列番号１８の重鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲ、あるいは配列番号１７および１８のすべてのＣＤＲも含むことができる。
【００１３】
本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１７または２３のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１７と少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列；あるいは（ｃ）配列番号２３と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域も含み得る。同様に、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は：（ａ）配列番号２２または８１のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２２の核酸と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号８１の核酸配列と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）配列番号２２または配列番号８１の相補体と特異的にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸を含む核酸によりコード化される軽鎖可変領域配列を含むことができる。
【００１４】
本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１８、１９、および２１のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１８と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１９と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列；あるいは（ｄ）配列番号２１と少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域も含み得る。同様に、本発明のヒト化抗体は、（ａ）配列番号２０、８２、または８３のヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２０または配列番号８３の核酸と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号８２の核酸と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）配列番号２０、８２、および８３のいずれか一つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸を含む核酸によりコード化される重鎖可変領域配列を含むことができる。
【００１５】
本発明のさらなる代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号５の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号６の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｂ）配列番号５の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号６の重鎖アミノ酸配列；（ｃ）配列番号７の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｄ）配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８の重鎖アミノ酸配列；（ｅ）配列番号９の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域 、および配列番号１０の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｆ）配列番号９の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１０の重鎖アミノ酸配列；（ｇ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｈ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１２の重鎖アミノ酸配列；（ｉ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（ｊ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８４の重鎖アミノ酸配列；（ｋ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに（ｌ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８の重鎖アミノ酸配列を含む抗体を包含する。
【００１６】
（ａ）本発明のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント；および（ｂ）抗体に直接的または間接的に結合した薬物を含む、薬物送達のための抗体／薬物接合体も提供される。代表的な薬物としては、治療薬、たとえば、細胞毒素、放射性同位元素、免疫調節剤、血管新生阻害剤、抗増殖剤、抗増殖剤、アポトーシス誘発剤、化学療法薬、および治療用核酸が挙げられる。細胞毒素は、たとえば、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または酵素であってよい。抗生物質細胞毒素、たとえば、カリケアマイシン、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシン、またはその誘導体、たとえば、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジドが抗ガン治療に特に有用である。
【００１７】
開示された抗５Ｔ４抗体／薬物接合体は、抗体を薬物と結合させるリンカーを含む。代表的なリンカーとしては、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、および４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）が挙げられる。抗体／薬物接合体は、ポリエチレングリコールまたは薬物取り込みを向上させる他の薬剤も含むことができる。
【００１８】
本発明はさらに、式：
５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）_ｍ
（式中、５Ｔ４Ａｂはキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントであり；Ｘは、抗５Ｔ４抗体と反応し得る任意の反応性基の生成物を含むリンカーであり；Ｗは薬物であり；ｍは生成された接合生成物の平均装填量であり；（−Ｘ−Ｗ）_ｍは薬物誘導体である）を有する抗体／薬物接合体を調製する方法を提供する。この方法に従って、薬物誘導体がキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントに添加され、ここにおいて、薬物はキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントの３〜１０重量％である。薬物誘導体およびキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントを次に、約７〜９の範囲のｐＨを有する、非求核性タンパク質適合性の緩衝溶液中でインキュベートして、抗体／薬物接合体を生成させ、ここにおいて、溶液はさらに（ｉ）適当な有機共溶媒、および（ｉｉ）少なくとも１つの胆汁酸またはその塩を含む１つまたは複数の添加剤をさらに含み、インキュベーションは、約３０℃〜約３５℃の範囲の温度で、約１５分〜約２４時間の範囲の時間行われる。結果として得られた接合体を次いでクロマトグラフィー分離プロセスに付して、３〜１０重量％の薬物の範囲のローディングで、低い接合フラクション（ＬＣＦ）を有する抗体／薬物接合体を、未接合キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント、薬物誘導体、および凝集した接合体から分離する。この方法により生成される抗体／薬物接合体も提供される。
【００１９】
薬物を５Ｔ４発現細胞に送達するために、本発明は、これにより、（ｉ）キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）直接または間接的にヒト化抗５Ｔ４抗体と結合した薬物を含む抗体／薬物接合体と細胞が接触させられる方法を提供する。開示された方法に従って、薬物が標的細胞内に取り込まれる。治療法も開示され、この方法は、５Ｔ４陽性癌を有する対象に、治療的に有効な量の、（ｉ）キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント、および（ｉｉ）直接または間接的に抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメントと結合した治療薬を含む抗５Ｔ４抗体／薬物接合体を投与することを含む。本発明の抗５Ｔ４療法は、改善された効果を得るために任意の他の公知治療法と組み合わせることができる。第二の治療薬を抗５Ｔ４抗体／薬物接合体との組み合わせにおいて、同時に、あるいは任意の順序で連続して投与することができる。
【００２０】
キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体
Ｈ８はハイブリドーマ生成モノクローナルマウスＩｇＧ１抗体であって、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９８／５５６０７およびＦｏｒｓｂｅｒｇら、（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１９）：１２４４３０−１２４３６において記載されているものである。本発明のキメラ抗５Ｔ４抗体は、ネズミ抗５Ｔ４抗体の可変領域配列およびヒト抗体配列由来の追加の残基を含む。本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は、マウス抗５Ｔ４抗体Ｈ８からの抗原結合残基およびヒト抗体配列由来の追加の残基を含む。開示されたキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体は従って、キメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８抗体とも呼ばれる。代表的なキメラおよびヒト化Ｈ８抗体は図２７Ａ〜２７Ｆに記載されている。
【００２１】
抗体なる用語は、免疫グロブリンタンパク質、あるいは抗原結合部位（たとえば、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦｖフラグメント、あるいは少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域または少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖領域を有するタンパク質）を含む抗体フラグメントをさす。本発明のヒト化抗体は、ジアボディー、四量体抗体、単鎖抗体、四価抗体、多特異的抗体（たとえば、二特異的抗体）、ドメイン特異的抗体であって、特定のエピトープを認識するもの（たとえば、Ｈ８抗体により結合したエピトープを認識する抗体）を包含する。
【００２２】
抗５Ｔ４抗体なる用語は、５Ｔ４抗原、特にヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合する抗体をいう。５Ｔ４抗原は、トロホブラスト細胞および多くのガン細胞種の表面上に見られる７２ ｋＤａ非グリコシル化リンタンパク質である。ホール（Ｈｏｌｅ）ら、（１９８８）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５７：２３９−４６；ホール（Ｈｏｌｅ）ら、（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５：１７９−１８４；ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ８９／０７９４７；米国特許第５，８６９，０５３号参照。
【００２３】
結合なる用語は、２個の分子、たとえば、抗原と抗体間の親和力を意味する。本明細書において用いられる場合、特異的結合とは、複数の異なる抗原を含む異種サンプルにおける抗体の抗原に対する選択的結合を意味する。抗体の抗原に対する結合は、結合親和力が、少なくとも約１０^−７ Ｍ以上、たとえば、少なくとも約１０^−８ Ｍ以上、たとえば、少なくとも約１０^−９ Ｍ以上、少なくとも約１０^−１１ Ｍ以上、または少なくとも約１０^−１２ Ｍ 以上であるならば特異的である。たとえば、本発明の抗体のヒト５Ｔ４抗原に対する特異的結合は、少なくとも約１ ｘ １０^−７〜約１ ｘ １０^−１２の範囲の結合を包含する。本発明の抗体のヒト５Ｔ４抗原に対する特異的結合は、少なくとも約３ ｘ １０^−１０ Ｍ〜約１２ ｘ １０^−１０ Ｍの範囲、たとえば、約４ ｘ １０^−１０ Ｍ〜約９ ｘ １０^−１０ Ｍの範囲内、またはたとえば約７ ｘ １０^−１０ Ｍ〜約１２ ｘ １０^−１０ Ｍの範囲内、またはたとえば約７ ｘ １０^−１０ Ｍ〜約９ ｘ １０^−１０ Ｍの範囲内、またはたとえば約９ ｘ １０^−１０ Ｍ〜約１２ ｘ １０^−１０ Ｍの範囲内、またはたとえば約１１ ｘ １０^−１０ Ｍ〜約１２ ｘ １０^−１０ Ｍの範囲内の結合、あるいはさらに高い結合親和力、たとえば、約１．０ ｘ １０^−１１ Ｍ〜約１０ ｘ １０^−１１ Ｍ、または約１．０ ｘ １０^−１１ Ｍ〜約５ ｘ １０^−１１ Ｍ、または約５．０ ｘ １０^−１１ Ｍ〜約１０ ｘ １０^−１１ Ｍの結合を包含する。特異的結合なる語句は、対象に投与された場合の５Ｔ４発現細胞に対する選択的ターゲティングも意味する。
【００２４】
キメラ抗体なる用語は、本明細書において、少なくとも２個の異なる種からの配列を含む抗体を説明するために使用される。ヒト化抗体は、キメラ抗体の１種である。キメラ抗５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；（ｂ）配列番号１の軽鎖アミノ酸配列および配列番号２の重鎖アミノ酸配列；あるいは（ｃ）配列番号３の軽鎖アミノ酸配列および配列番号４の重鎖アミノ酸配列を含むことができる。
【００２５】
ヒト化なる用語は、本明細書においては、抗原結合に関与する可変領域残基（すなわち、相補性決定領域の残基および抗原結合に関与する任意の他の残基）が非ヒト種由来であり、残りの可変領域残基（すなわち、フレームワーク領域の残基）および定常領域が、少なくとも一部、ヒト抗体配列由来である抗体を記載するために使用される。ヒト化抗体の可変領域および定常領域の残基は非ヒト源由来であってもよい。ヒト化抗体の可変領域は、ヒト化（すなわち、ヒト化軽鎖または重鎖可変領域）としても記載される。非ヒト種は、典型的には抗原での免疫化に使用されるもの、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類、あるいは他のヒト以外の哺乳動物種である。
【００２６】
本発明の代表的なキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体は、少なくとも１つの軽鎖または少なくとも１つの重鎖、あるいはそのフラグメントを含み、ここにおいて、キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントは、（ａ）ヒト５Ｔ４抗原と少なくとも約１ ｘ １０^−７ Ｍ〜約１ ｘ １０^−１２ Ｍの結合親和力で特異的に結合するか；（ｂ）ヒト５Ｔ４抗原と１ ｘ １０^−１１ Ｍより高い結合親和力で特異的に結合するか；（ｃ）ヒト５Ｔ４抗原と５ ｘ １０^−１１ Ｍより高い結合親和力で特異的に結合するか；（ｄ）ヒト５Ｔ４抗原と、ネズミＨ８抗５Ｔ４抗体のヒト５Ｔ４抗原に対する結合よりも高い結合親和力で特異的に結合するか；（ｅ）インビボで５Ｔ４発現細胞を特異的に標的とするか；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗体と、ヒト５Ｔ４抗原に対する結合に関して競合するか；（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つにより結合するエピトープに対して特異的に結合するか；あるいは（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗原結合ドメインを含む。
【００２７】
ネズミＨ８抗５Ｔ４抗体は５Ｔ４の膜貫通ドメインに近い立体構造エピトープを認識することが証明されている。構造および免疫原性に関して重要であるグリコシル化、および分子内ジスルフィド結合が抗体の結合に必要とされる。Ｈ８抗５Ｔ４抗体はマウス５Ｔ４と結合しないが、マウスとヒト５Ｔ４間には８４％の同一性があり、７のＮ−結合グリコシル化部位のうちの６は２者の間で保存される。Ｎ末端およびＣ末端システインもマウスとヒト５Ｔ４間で完全に保存される。ネズミＨ８抗体は、アミノ酸１９２でのＮ結合グリコシル化部位が除去される場合、ヒト５Ｔ４と結合することも証明されている（ショー（Ｓｈａｗ）ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３６５： １３７−１４５）。Ｈ８抗５Ｔ４抗体がマウスＬＲＲ２を有するヒト／マウス５Ｔ４キメラ（残基１７３〜３６１がヒト残基１７３〜３５５と置換）と結合せず、さらに抗体は逆キメラと結合しないことを示唆するいくつかの証拠がある。キメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８抗体がどちらも、マウス残基２８２〜３６１を含有する５Ｔ４キメラと結合することを示唆する証拠もある。この証拠は、Ｈ８エピトープがアミノ酸１７３および２５２の間に位置するという結論を導く。さらなる証拠は、キメラＨ８が、マウス残基１７３〜２５８を含有するヒト／マウス抗５Ｔ４キメラと結合しないが、ヒト化Ｈ８抗体はさらに高い濃度で弱い結合を有することを示唆する。
【００２８】
天然に存在する抗体は、約１５０，０００ダルトンのテトラマー（Ｈ_２Ｌ_２）糖タンパク質であって、２つの同じ軽（Ｌ）鎖および２つの同じ重（Ｈ）鎖からなる。２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに結合し、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖と結合する。軽鎖および重鎖のそれぞれは、アミノ末端可変領域および定常領域によりさらに特徴づけられる。可変なる用語は、可変ドメインのある部分が抗体のうちで配列において大きく異なり、その特定の抗原についての各抗体の結合親和力および特異性を実質的に決定する。軽鎖および重鎖のそれぞれの可変領域は、整列して抗原結合ドメインを形成する。代表的なヒト化Ｈ８可変領域は図２４Ａ〜２２Ｃ（配列番号１７、１８、１９、２１、および２３）に記載されている。
【００２９】
テトラマー構造を有する抗体は、天然に存在する抗体と同様に、標準的技術を用いて組み換えにより調製することができる。組み換えにより生成された抗体は、単一の軽鎖および重鎖対の可変領域が抗原結合領域を含む単鎖抗体、およびヒト化抗５Ｔ４抗体の可変領域がエフェクター配列、たとえば、Ｆｃドメイン、サイトカイン、免疫刺激物質、細胞毒素、または任意の他の治療用タンパク質と融合する融合タンパク質も含む。たとえば、ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよび米国特許第４，１９６，２６５号；第４，９４６，７７８号；第５，０９１，５１３号；第５，１３２，４０５号；第５，２６０，２０３号；第５，６７７，４２７号；第５，８９２，０１９号；第５，９８５，２７９号；第６，０５４，５６１号参照。
【００３０】
ホモ二量体およびヘテロ二量体を包含する２つの無傷テトラマー抗体を含む四価抗体（Ｈ_４Ｌ_４）は、たとえば、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ０２／０９６９４８に記載されているようにして調製できる。抗体二量体は、ヘテロ二機能的クロスリンカーを用いて、鎖間ジスルフィド結合形成を促進する、システイン残基の抗体定常領域中への導入（ウォルフ（Ｗｏｌｆｆ）ら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−４）、あるいは組み換え体を生成させて、二重定常領域を含める（スチーブンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）ら、（１９８９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ，３：２１９−３０）ことによっても調製できる。
【００３１】
相補性決定領域またはＣＤＲなる用語は、抗原結合に関与する抗体可変領域の残基を意味する。ＣＤＲの多くの定義が一般的に使われている。Ｋａｂａｔの定義は、配列変可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的ループ領域の位置に基づく。ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ法の妥協案である。軽鎖可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｂＭアルゴリズムに従って、２４および３４（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０および５６（ＣＤＲ２−Ｌ）、および８９および９７（ＣＤＲ３−Ｌ）位の残基により結合している。Ｋａｂａｔの定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは３１および３５Ｂ位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０および６５位（ＣＤＲ２−Ｈ）、ならびに９５および１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）の残基により結合している。Ｃｈｏｔｈｉａの定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは２６および３２位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５２および５６位（ＣＤＲ２−Ｈ）、ならびに９５および１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）（Ｃｈｏｔｈｉａに従ってナンバリング）の残基により結合している。ＡｂＭの定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは、２６および３５Ｂ位（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０および５８位（ＣＤＲ２−Ｈ）、ならびに９５および１０２位（ＣＤＲ３−Ｈ）（Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）の残基により結合している。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ９２６８９２７２；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３： １２１１５３；ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）ら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １： １２６；およびリーズ（Ｒｅｅｓ）ら、（１９９６）Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ． （ｅｄ．）、タンパク質構造予測（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）、オックスフォード大学出版部、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐｐ． １４１１７２参照。
【００３２】
特異性決定領域またはＳＤＲなる用語は、超可変残基に対応する、抗原と直接的に相互作用するＣＤＲ内の残基である。（パドラン（Ｐａｄｌａｎ）ら、（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−９）参照。
【００３３】
フレームワーク残基は、超可変残基以外の可変領域の残基である。ヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するために使用できる重鎖可変領域の代表的なヒトフレームワークは、ＤＰ−７５およびＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７ （ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８ （ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３、ならびにＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）のフレームワーク領域を包含する。前記の個々の配列に基づくコンセンサスフレームワーク配列も使用することができる。図２１〜２３参照。代表的な軽鎖可変領域のヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞系クローンＤＰＫ２４および生殖細胞系クローンサブグループＶκＩＩＩおよびＶκＩを包含し、そのそれぞれは、Ｈ８軽鎖可変領域と比較した場合に６０％より高いアミノ酸同一性を示す。図１８〜２０参照。
【００３４】
開示されたヒト化抗５Ｔ４抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびその任意のイソタイプ（たとえば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソタイプ）のいずれか一つからの定常領域由来である。ヒトイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）およびヒトイソタイプにおける特定のアミノ酸の修飾は、宿主防御機構の活性化を向上または排除し、本発明のヒト化抗体の生体内分布を変更することができる。（レフ（Ｒｅｆｆ）ら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ９：１５２−６６）参照。
【００３５】
以下に記載するように、ベニアリング、相補性決定領域（ＣＤＲ）のグラフティング、短縮されたＣＤＲのグラフティング、特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティング、およびＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリをはじめとする様々な方法のいずれか一つを用いてヒト化抗体を調製することができる。これらの一般法は標準的突然変異生成および合成技術と組み合わせて、任意の所望の配列を有する抗５Ｔ４抗体を生成させることができる。
【００３６】
ベニアリングは、ヒトアミノ酸配列を有する抗体の溶媒接触可能な外側を再表面化することにより、齧歯類または他の非ヒト抗体において潜在的免疫原性アミノ酸配列を減少させる概念に基づく。かくして、ベニアされた抗体は、ヒト抗体に対してそれほど異質でないようである。パドラン（Ｐａｄｌａｎ）（１９９１）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９−９８参照。非ヒト抗体は、（１）ヒト抗体のフレームワーク領域における同じ位置のものとことなる非ヒト抗体における露出した外部フレームワーク残基を同定し、そして（２）ヒト抗体におけるこれらの同じ位置を典型的に占有するアミノ酸で同定された残基を置換することによりベニアされる。
【００３７】
ＣＤＲのグラフティングは、アクセプター抗体（たとえば、ヒト抗体）の１つまたは複数のＣＤＲをドナー抗体(たとえば、非ヒト抗体)のＣＤＲと置換することにより行われる。アクセプター抗体は、候補アクセプター抗体およびドナー抗体間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択することができ、さらに修飾して類似した残基を導入することができる。たとえば、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトサブグループＩコンセンサス配列の重鎖可変領域であって、任意に１、２８、４８、６７、６９、７１、および９３の１つまたは複数の位置で非ヒトドナー残基を有してもよいものを含んでもよい。別の例として、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトサブグループＩコンセンサス配列の軽鎖可変領域であって、任意に非ヒトドナー残基を２、３、４、３７、３８、４５および６０の１つまたは複数の位置で有してもよいものを含んでもよい。ＣＤＲグラフティング後に、ドナーおよび／またはアクセプター配列にさらに変更を加えて、抗体結合および機能性を最適化することができる。ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９１／０９９６７参照。
【００３８】
短縮されたＣＤＲのグラフティングは関連する方法である。短縮されたＣＤＲは、特異性決定残基および隣接するアミノ酸、たとえば、軽鎖における２７ｄ〜３４、５０〜５５および８９〜９６位のもの、および重鎖における３１〜３５ｂ、５０〜５８、および９５〜１０１位のものを含む（Ｋａｂａｔら（１９８７）のナンバリング法））。パドラン（Ｐａｄｌａｎ）ら、（１９９５）ＰＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−９参照。特異性決定残基（ＳＤＲ）のグラフティングは、結合特異性および抗体結合部位の親和性が、相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれの内の最も可変性の高い残基により決定されるという理解を前提とする。抗体−抗原複合体の三次元構造の分析は、利用可能なアミノ酸配列データの分析と併せて、ＣＤＲ内のそれぞれの位置で生じるアミノ酸残基の構造的相違性に基づいて配列可変性のモデルを作るために使用した。パドラン（Ｐａｄｌａｎ）ら、（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９： １３３−１３９参照。特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる、接触残基からなる最小免疫原性ポリペプチド配列が同定され、ヒトフレームワーク領域上にグラフトされる。
【００３９】
Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎの方法に従って、ヒトフレームワーク領域は関連する非ヒト抗体の各フレームワーク領域と実質的な配列同一性を有することが確認されており、非ヒト抗体のＣＤＲは異なるヒトフレームワーク領域の複合体上にグラフトされる。本発明の抗体の調製に有用である関連する方法は、米国特許出願公開番号２００３／００４０６０６に記載されている。
【００４０】
本明細書において開示されるヒト化抗５Ｔ４抗体は、典型的には少なくとも１つのヒト化軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含む。従って、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は、前記のようなベニアリング、短縮されたＣＤＲまたはＳＤＲのグラフティング、あるいはＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリにより調製された軽鎖可変領域、および非ヒト抗体の重鎖可変領域（たとえば、Ｈ８抗体または他の非ヒト抗５Ｔ４抗体）を含むことができる。別法として、非ヒト抗体の軽鎖可変領域をヒト化重鎖可変領域と組み合わせることができる。
【００４１】
本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は（ａ）配列番号１７の軽鎖可変領域または配列番号１８の重鎖可変領域のＣＤＲから選択される非ヒト抗５Ｔ４抗体の１つまたは複数のＣＤＲ、たとえば、配列番号１７の軽鎖可変領域または配列番号１８の重鎖可変領域のＣＤＲから選択される２以上のＣＤＲを有する抗体；（ｂ）配列番号１７の２または３のＣＤＲを有する可変領域を含む軽鎖を有する抗体；および（ｃ）配列番号１８の２または３のＣＤＲを有する可変領域を含む重鎖を有する抗体を含む。本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体はさらに（ａ）配列番号１７または２３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列；（ｂ）配列番号１７と少なくとも７８％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列；または（ｃ）配列番号２３と少なくとも８１％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体も含む。機能的ヒト化抗５Ｔ４抗体（すなわち、５Ｔ４抗原と特異的に結合する抗５Ｔ４抗体）の軽鎖可変領域は（ａ）配列番号２２または配列番号８１の核酸；（ｂ）配列番号２２の核酸と少なくとも９０％同一である核酸；（ｃ）配列番号８１の核酸と少なくとも９１％同一である核酸；または（ｄ）配列番号２２または配列番号８１の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、たとえば、６５℃での０．１ＸＳＳＣの最終洗浄条件で特異的にハイブリッド形成する核酸によりコード化することができる。
【００４２】
本発明の代表的なヒト化抗５Ｔ４抗体は（ａ）配列番号１８、１９、および２１のいずれか一つに記載されている重鎖可変領域アミノ酸配列；（ｂ）配列番号１８と少なくとも８３％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列；（ｃ）配列番号１９と少なくとも８１％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列；または（ｄ）配列番号２１と少なくとも８６％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体を含む。機能的ヒト化抗５Ｔ４抗体（すなわち、５Ｔ４抗原と特異的に結合する抗５Ｔ４抗体）の重鎖可変領域は（ａ）配列番号２０、８２、および８３のいずれか一つの核酸；（ｂ）配列番号２０の核酸と少なくとも９１％同一である核酸；（ｃ）配列番号８２の核酸と少なくとも９４％同一である核酸；（ｄ）配列番号８３の核酸と少なくとも９１％同一である核酸；または（ｅ）配列番号２０、８２、および８３のいずれか一つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、たとえば６℃で０．１ＸＳＳＣの最終洗浄条件で特異的にハイブリッド形成する核酸によりコード化することができる。
【００４３】
ヒト化抗５Ｔ４抗体は（ａ）配列番号５の残基１〜１０７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６の残基１〜１２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；（ｂ）配列番号５の軽鎖アミノ酸配列および配列番号６の重鎖アミノ酸配列；（ｃ）配列番号７の残基１〜１０７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；（ｄ）配列番号７の軽鎖アミノ酸配列および配列番号８の重鎖アミノ酸配列；（ｅ）配列番号９の残基１〜１０７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０の残基１〜１２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；（ｆ）ａ配列番号９の軽鎖アミノ酸配列および配列番号１０の重鎖アミノ酸配列；（ｇ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；あるいは（ｈ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列および配列番号１２の重鎖アミノ酸配列を含むことができる。
【００４４】
第一鎖の可変領域（すなわち、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）がヒト化され、第二鎖の可変領域がヒト化されてない（すなわち、ヒト以外の種において生成された抗体の可変領域）、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体を構築することができる。これらの抗体は、本明細書において、半ヒト化抗体と称する。たとえば、抗５Ｔ４抗体は配列番号１７または２３のヒト化軽鎖可変領域、および非ヒト抗５Ｔ４抗体の重鎖可変領域、たとえば、配列番号１４のネズミＨ８重鎖可変領域を含むことができる。別法として、抗５Ｔ４抗体は非ヒト抗５Ｔ４抗体のヒト化可変領域、たとえば、配列番号１６のネズミＨ８軽鎖可変領域、および配列番号１８、１９、または２１のいずれか一つのヒト化重鎖可変領域を含むことができる。ネズミＨ８以外の抗５Ｔ４非ヒト抗体を用いて、半ヒト化抗体、たとえば、ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）ら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６６：３５３−６５により記載されているラットモノクローナル抗体を調製することができる。
【００４５】
開示されたヒト化抗５Ｔ４抗体の変異体は、様々な変化、置換、挿入、および欠失を含むように容易に調製することができ、ここにおいて、このような変化は使用において利益をもたらす。たとえば、抗体の血清半減期を増大させるために、まだ存在しないならば、サルベージレセプター結合エピトープを抗体重鎖配列中に組み入れることができる。米国特許第５，７３９，２７７号参照。抗体安定性を向上させるためのさらなる修飾は、残基２４１のセリンをプロリンで置換するＩｇＧ４の修飾を包含する。エンガル（Ａｎｇａｌ）ら、（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８参照。他の有用な変化は、抗体を薬物と接合させる際の効率を最適化するために必要な置換を包含する。たとえば、抗体をそのカルボキシル末端で修飾して、薬物結合のためのアミノ酸を含めることができ、たとえば、１つまたは複数のシステイン残基を添加することができる。定常領域を修飾して、炭水化物または他の部分の結合のための部位を導入することができる。
【００４６】
本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体の変異体は、部位特異的突然変異誘発法、または組み換え法を包含する標準的組み換え技術を用いて生成させることができる。ヒト化抗５Ｔ４抗体の多様なレパートリーは、トランスジェニック非ヒト動物において遺伝子配列および遺伝子変換法により調製でき（米国特許公開番号２００３／００１７５３４）、これは次いで、機能分析を用いて関連する活性について試験される。本発明の特定の具体例において、抗５Ｔ４変異体は、親和性成熟プロトコル、たとえば、ＣＤＲの突然変異（ヤン（Ｙａｎｇ）ら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３）、鎖シャッフリング（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０：７７９−７８３）、イー・コリの突然変異誘発株の使用（ロー（Ｌｏｗ）ら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８）、ＤＮＡシャッフリング（パテン（Ｐａｔｔｅｎ）ら、（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−７３３）、ファージディスプレー（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７−８８）、および性ＰＣＲ（クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）ら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１）を包含する。免疫療法用途に関して、関連する機能分析は、実施例に記載されるように、ヒト５Ｔ４抗原に対する特異的結合、細胞毒素に接合した場合の抗体の内在化、および腫瘍を有する動物に投与された場合の腫瘍部位へのターゲティングを包含する。実施例１〜１１参照。
【００４７】
本発明はさらに、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体を発現する細胞および細胞系を提供する。代表的な宿主細胞は、哺乳動物およびヒト細胞、たとえば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＣＯＳ細胞を包含する。ヘテロローガスな構築物を宿主細胞中に形質転換した後に安定な細胞系を生成させる方法は、当該分野において公知である。代表的な非哺乳動物宿主細胞は、昆虫細胞（ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら、（１９９３）Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０（２−３）：１０３−１１２）を包含する。抗体は、トランスジェニック動物（ホーデバイン（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ）（２００２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３（６）：６２５−６２９）およびトランスジェニック植物(シルバーグ（Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ）ら、（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６０（３）：４３３−４５）においても生成させることができる。
【００４８】
Ｉ．Ａ．キメラおよびヒト化抗５Ｔ４核酸
本発明はさらに、抗５Ｔ４軽鎖および重鎖可変領域をコード化する単離された核酸を提供する。単離された核酸は、本明細書において開示されるように、ヒト化５Ｔ４抗体を調製するために使用できる。
【００４９】
核酸分子および核酸なる用語は、それぞれ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖、二本鎖、または三本鎖形態におけるそのポリマーを意味する。特に限定されない限り、この用語は、参考天然核酸と類似した性質を有する天然のヌクレオチドの公知類似体を含有する核酸を包含する。核酸分子または核酸なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＲＮＡの代わりにも用いられ得る。核酸は、有機体をはじめとする任意の生物源から合成することができるか、あるいは誘導することができる。ヒト化５Ｔ４抗体をコード化する核酸をクローンするための代表的な方法は実施例５に記載されている。
【００５０】
本発明の代表的な核酸は、配列番号２０、２２、８１、８２、または８３のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸は、配列番号２０、２２、８１、８２、または８３のいずれか一つの実質的に同一、たとえば、配列番号２０、８１、または８３のいずれか一つと少なくとも９１％同一であるか、あるいは配列番号２２と少なくとも９０％同一であるか、あるいは配列番号８２と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列を含んでもよい。本明細書において以下に記載するように、クエリー配列として配列番号２０、２２、８１、８２、または８３のいずれか一つの完全長配列を用いた配列比較アルゴリズムを用いて、あるいは目視検査により、最大一致に関して比較する。実施例５および表６も参照。
【００５１】
開示されたヒト化Ｈ８可変領域核酸に対して特定の最小割合の同一性を有する実質的に同一の核酸に関して、実質的に同一の配列は、配列番号２０、８１、または８３に対して少なくとも約９２％同一、たとえば少なくとも９３％同一、あるいは少なくとも９４％同一、あるいは少なくとも９５％同一、あるいは少なくとも９６％同一、あるいは少なくとも９７％同一、あるいは少なくとも９８％同一、あるいは少なくとも９９％同一であり得る。同様に、実質的に同一の配列は、配列番号２２と少なくとも約９１％同一、たとえば、約９２％同一、あるいは少なくとも９３％同一、あるいは少なくとも９４％同一、あるいは少なくとも９５％同一、あるいは少なくとも９６％同一、あるいは少なくとも９７％同一、あるいは少なくとも９７％同一、あるいは少なくとも９８％同一、あるいは少なくとも９９％同一である配列；および配列番号８２と少なくとも９５％同一、たとえば少なくとも９６％同一、あるいは少なくとも９７％同一、あるいは少なくとも９８％同一、あるいは少なくとも９９％同一である配列も含む。
【００５２】
実質的に同一の配列は多形配列である。多形なる用語は、集団における２以上の遺伝的に決定された選択的配列または対立遺伝子の発生をいう。対立遺伝子相違は１塩基対程度に小さい。
【００５３】
実質的に同一の配列は、サイレント突然変異を含む配列をはじめとする突然変異配列を含むこともできる。突然変異は、１つまたは複数の残基変化、１つまたは複数の残基の欠失、または１つまたは複数の追加残基の挿入を含むことができる。
【００５４】
実質的に同一の核酸はさらに、配列番号２０、２２、８１、８２、および８３のいずれか一つの完全長とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成するか、または実質的にハイブリッド形成する核酸と特定される。核酸ハイブリダイゼーションに関連して、比較される２つの核酸配列はプローブまたは標的と表示することができる。プローブは参考核酸分子であり、標的は試験核酸分子であって、しばしば核酸分子の異質集団内で見いだされる。標的配列は試験配列と同義である。
【００５５】
ハイブリダイゼーション実験または分析に用いられる好ましいヌクレオチド配列は、本発明の核酸分子の少なくとも約１４〜４０ヌクレオチド配列に対して相補性であるか、またはこれを模倣するプローブ配列を含む。好ましくは、プローブは１４〜２０、または所望によりさらに長いヌクレオチド、たとえば、３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００、または５００ヌクレオチドあるいは配列番号２０、２２、８１、８２、および８３のいずれか一つの完全長までを含む。このようなフラグメントは、たとえば、化学合成によるか、核酸増幅技術を適用するか、または組み換え体産生のために組み換えベクター中に選択された配列を導入することにより容易に調製できる。
【００５６】
特異的にハイブリッド形成するという用語は、配列が複合核酸混合物（たとえば、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対してのみの分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成をいう。
【００５７】
実質的にハイブリッド形成するという語句は、プローブ核酸分子と標的核酸分子間の相補ハイブリダイゼーションを意味し、所望のハイブリダイゼーションを達成するためにハイブリダイゼーションメディアの厳密性を軽減することにより対応できる軽微な不適合を包含する。
【００５８】
サザンおよびノザンブロット分析などの核酸ハイブリダイゼーション実験に関連したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件は、配列依存性かつ環境依存性である。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成についての広範囲に及ぶ指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、第Ｉ部、第２章、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見いだされる。一般に、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特性の配列の融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。典型的には、ストリンジェントな条件下で、プローブはその標的配列と特異的にハイブリッド形成するが、他の配列とはハイブリッド形成しない。
【００５９】
Ｔ_ｍは、標的配列の５０％が完全に合致したプローブとハイブリッド形成する温度（所定のイオン強度およびｐＨ）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴ_ｍに等しくなるように選択される。約１００より多い相補残基を有する相補核酸のサザンまたはノザンブロット分析のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド中、１ｍｇのヘパリンとともに４２℃で一夜ハイブリダイゼーションすることである。非常にストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で０．１ＸＳＳＣ中１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、６５℃で０．２ＸＳＳＣ中１５分である。ＳＳＣ緩衝液の説明については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。しばしば、高ストリンジェント洗浄の前にバックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェント洗浄が行われる。約１００より多いヌクレオチドの二本鎖に関する中ストリンジェント洗浄条件の一例は、４５℃で１ＸＳＳＣ中１５分である。約１００より多いヌクレオチドの二本鎖に関する低ストリンジェント洗浄の一例は、４０℃で４Ｘ〜６ＸＳＳＣ中１５分である。短いプローブ（たとえば、約１０〜５０ヌクレオチド）に関して、ストリンジェントな条件は典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で約１Ｍ未満のＮａ^＋イオンの塩濃度、典型的には約０．０１〜１ＭのＮａ^＋イオン濃度（または他の塩）を含み、温度は典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーション分析における未関連プローブについて得られるものの２倍（以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００６０】
以下は、本発明の参考ヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するために使用できるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例である：プローブヌクレオチド配列は好ましくは標的ヌクレオチド配列と７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃で標的ヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、続いて２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０℃で洗浄され；さらに好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリッド形成し、続いて１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０℃で洗浄され；さらに好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリッド形成し、続いて０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０℃で洗浄され；さらに好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリッド形成し、続いて０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中５０℃で洗浄され；さらに好ましくは、プローブおよび標的配列は７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリッド形成し、続いて０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中６５℃で洗浄される。
【００６１】
２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらなる形跡は、この核酸によりコード化されるタンパク質が実質的に同一であるか、全体的な三次元構造を共有するか、あるいは生物学的機能が等しいことである。これらの用語は、本明細書において以下でさらに定義される。ストリンジェントは条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一であるならば、実質的に同一である。これは、たとえば、２つのヌクレオチド配列が遺伝子コードにより許容される保存的に置換された変異体を含む場合に起こり得る。
【００６２】
保存的に置換された変異体なる用語は、縮重コドン置換を有する核酸配列を意味し、ここにおいて、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第三の位置は、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている。バッツァー（Ｂａｔｚｅｒ）ら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：５０８１；オオツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）ら、（１９８５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８；およびロッソリニ（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ）ら、（１９９４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８参照。
【００６３】
本発明の核酸は、配列番号２０、２２、８１、８２、および８３のいずれか一つに対して相補性の核酸、ならびに配列番号２０、２２、８１、８２、および８３のいずれか一つの核酸および相補核酸の配列および延長された配列を含む。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、相補配列なる用語は、塩基対間の水素結合の形成により互いにペアリングできる逆平行のヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列をさす。本明細書において用いられる場合、相補配列なる用語は、以下に記載するような同じヌクレオチド配列比較法により評価できるように、実質的に相補性であるか、または本明細書において記載されるような、比較的ストリンジェントな条件下で問題の核酸セグメントとハイブリッド形成できると定義されるヌクレオチド配列を意味する。相補核酸セグメントの具体例はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）なる用語は、さらに長い核酸配列の一部を含む核酸の配列をいう。列の例は、本明細書においてすでに記載したようなプローブ、またはプライマーである。本明細書において用いられるプライマーなる用語は、約８以上の、選択された核酸分子のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは１０〜２０ヌクレオチド、さらに好ましくは２０〜３０ヌクレオチドの連続した配列をさす。本発明のプライマーは本発明の核酸分子上で重合を開始するために十分な長さかつ適当な配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００６６】
延長された配列なる用語は、核酸中に組み入れられたヌクレオチド（または他の類似の分子）の添加をさす。たとえば、ポリメラーゼ（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ）は核酸分子の３’末端で配列を添加することができる。加えて、ヌクレオチド配列は、他のＤＮＡ配列、たとえば、プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、および他のコーディングセグメントと組み合わせることができる。従って、本発明は、組み換え体発現のためのベクターをはじめとする開示された核酸を含むベクターを提供することもでき、ここにおいて、本発明の核酸は操作的に機能的プロモーターと結合される。
【００６７】
操作的に結合したという用語は、本明細書において用いられる場合、ヌクレオチド配列の転写がプロモーター領域により制御され、調節されるような、プロモーター領域とヌクレオチド配列間の機能的組み合わせをさす。プロモーター領域をヌクレオチド配列に操作的に結合させる技術は当該分野において公知である。
【００６８】
ベクターなる用語は、本明細書において、宿主細胞においてその複製を可能にするヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ベクターは、ベクター内でのヌクレオチド配列の結紮を可能にするヌクレオチド配列を含むこともでき、ここにおいて、かかるヌクレオチド配列も宿主細胞において複製される。代表的なベクターとしては、プラスミド、コスミド、およびウイルスベクターが挙げられる。
【００６９】
本発明の核酸は、クローン、合成、変更、突然変異形成、またはその組み合わせをすることができる。核酸を単離するために用いられる標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において公知である。塩基対変化、欠失、または小挿入を生じさせるための部位特異性突然変異誘発は当該分野において公知である。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（編）（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；シルヘビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、（１９８４）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；グローバーおよびヘイムズ（Ｇｌｏｖｅｒ ＆ Ｈａｍｅｓ）（１９９５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（編）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【００７０】
Ｉ．Ｂ． キメラおよびヒト化抗５Ｔ４ポリペプチド
本発明は単離されたヒト化抗５Ｔ４ポリペプチドも提供する。本発明の代表的な軽鎖および重鎖ポリペプチドは配列番号１〜１２として記載されている。代表的な軽鎖可変領域ポリペプチドおよび重鎖可変領域ポリペプチドはそれぞれ配列番号１７および２３ならびに配列番号１８、１９、および２１として記載されている。
【００７１】
ポリペプチドおよびタンパク質なる用語は、それぞれ、ペプチド結合により結合したアミノ酸の一本鎖から構成される化合物をいう。本発明の抗体はポリペプチドまたはタンパク質とも呼ばれる。本発明のポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、遺伝的にコード化されたアミノ酸、非遺伝的にコード化されたアミノ酸、およびその組み合わせを含む。ポリペプチドはＬ形およびＤ形アミノ酸の両方を包含する。
【００７２】
代表的な非遺伝的にコード化されたアミノ酸は、これに限定されないが、２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４−ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリシン；アロ−ヒドロキシリシン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）；Ｎ−メチルイソロイシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチンを包含する。
【００７３】
代表的な誘導化アミノ酸は、たとえば、遊離アミノ基が誘導化されてアミン塩酸塩を形成する分子、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を包含する。遊離カルボキシル基は誘導化されて塩、メチルおよびエチルエステルあるいは他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導化されてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。
【００７４】
本発明は、ヒト化抗５Ｔ４ポリペプチドの機能的フラグメント、たとえば、可変領域ポリペプチドも提供する。開示された配列よりも長い機能的ポリペプチド配列も提供される。たとえば、１つまたは複数のアミノ酸を抗体ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に添加することができる。このような追加のアミノ酸は、精製用途を包含するが、これに限定されない様々な用途において用いることができる。延長されたタンパク質を調製する方法は当該分野において公知である。
【００７５】
本発明のポリペプチドは（ａ）配列番号１７または２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ポリペプチド；（ｂ）配列番号１７と少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ポリペプチド；および（ｃ）配列番号２３と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本発明のさらなるポリペプチドは（ａ）配列番号１８、１９、および２１のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ポリペプチド；（ｂ）配列番号１８と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ポリペプチド；（ｃ）配列番号１９と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ポリペプチド；および（ｄ）配列番号２１と少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書において以下に記載するように、クエリー配列として配列番号１７、１８、１９、２１、または２３のいずれか一つの完全長配列を用いた配列比較アルゴリズムを用いて、あるいは目視検査により、配列を最大一致について比較する。実施例５も参照。
【００７６】
開示されたヒト化Ｈ８可変領域ポリペプチドに対して特定の最低率の同一性を有する実質的に同一のポリペプチドに関して、実質的に同一のポリペプチドは、配列番号１７、１８、１９、２１、または２３のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも約８７％同一である、たとえば少なくとも８８％同一であるか、または少なくとも８９％同一であるか、または少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９１％同一であるか、または少なくとも９２％同一であるか、または少なくとも９３％同一であるか、または少なくとも９４％同一であるか、または少なくとも９５％同一であるか、または少なくとも９６％同一であるか、または少なくとも９７％同一であるか、または少なくとも９８％同一であるか、または少なくとも９９％同一である。本発明は、本明細書において開示された核酸のいずれか一つによりコード化されるポリペプチドをさらに含む。
【００７７】
実質的に同一のタンパク質は、開示されたヒト化可変領域ポリペプチドおよび可変領域抗体のいずれか一つの保存的に置換された変異体であるアミノ酸を含むタンパク質を包含する。保存的に置換された変異体なる用語は、１つまたは複数の残基が機能的に類似した残基で保存的に置換され、開示されたキメラおよびヒト化Ｈ８抗体のいずれかと類似した親和力でヒト抗５Ｔ４抗体と特異的に結合するアミノ酸を含むポリペプチドをいう。保存的に置換された変異体なる語句は、残基が化学的に誘導された残基で置換されているペプチドも包含する。
【００７８】
保存的置換の例は、１つの非極性（疎水性）残基、たとえば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンともう一つ別のものに関する置換を包含し；１つの極性（親水性）残基のもう一つ別のものに関する置換、たとえば、アルギニンとリシン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間；１つの塩基性残基、たとえばリシン、アルギニンまたはヒスチジンともう一つ別のものについての置換；あるいは１つの酸性残基、たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸のもう一つ別のものについての置換を包含する。
【００７９】
本発明の単離されたポリペプチドは、様々な当業者に公知の標準的技術を用いて精製し、特徴づけることができる。たとえば、シュレーダーおよびリュブケ（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＆ Ｌｕｂｋｅ（１９６５）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、ｒｅｖ．ｅｄ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（編）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【００８０】
Ｉ．Ｃ． ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較
２以上のヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連して、同一または同一性（％）なる用語は、同じであるか、または本明細書において開示された配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または目視検査により測定されるように、最大一致に関して比較し、整列した場合に同じである、特定の比率のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２以上の配列または列を意味する。
【００８１】
ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して実質的に同一という用語は、特定の配列が１つまたは複数の欠失、置換、または付加により天然に存在する配列と異なり、その全体的影響はヒト化抗５Ｔ４核酸またはポリペプチドの生物学的機能を保持することを意味する。
【００８２】
２以上の配列の比較に関して、典型的には１つの配列は、これに対して１つまたは複数の試験配列が比較される参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータープログラムに入力し、必要ならば列座標を表示し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを選択する。次いで配列比較アルゴリズムは、選択されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する指定された試験配列についての配列同一性（％）を計算する。
【００８３】
比較のための配列の最適整列を、たとえば、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ）（１９８１）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ ２：４８２−４８９の局所同一性アルゴリズムによるか、ニードルマンおよびヴンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ）（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３の相同性配列アルゴリズムによるか、あるいはピアソンおよびリプマン（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ）（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８の類似性検索法によるか、これらのアルゴリズムの電子計算実施によるか（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、あるいは目視検査により、構築することができる。一般的には、オースベル（編）（１９９５）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【００８４】
配列同一性（％）および配列類似性を決定する好ましいアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の公開情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータは、整合の感度および速度を決定する。２つのヌクレオチド配列の比較のために、ＢＬＡＳＴｎデフォルトパラメータは、Ｗ＝１１（ワード長）およびＥ＝１０（期待値）に設定され、組成の複雑性が低いクエリー配列の残基をマスクするための複雑性が低いフィルターの使用も含む。２つのアミノ酸配列の比較に関して、ＢＬＡＳＴｐプログラムデフォルトパラメータはＷ＝３（ワード長）、Ｅ＝１０（期待値）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用、存在＝１１および伸長＝１のギャップコスト、および組成の複雑性が低いクエリー配列の残基をマスクするための低複雑性フィルターの使用に設定される。実施例５参照。
【００８５】
Ｉ．Ｄ．機能分析
本発明はさらに、５Ｔ４結合活性、細胞表面上に提示される５Ｔ４抗原に対する結合後の細胞内在化、および対象における５Ｔ４発現細胞に対するターゲティングをはじめとするヒト化抗５Ｔ４抗体の活性を特徴づけるためのインビトロおよびインビボ分析を開示する。細胞毒素と接合した場合、本発明の開示された抗体は、５Ｔ４発現ガン細胞の成長の阻害および／または５Ｔ４発現細胞における細胞の死の誘発を包含する抗ガン活性を惹起することができる。本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は前記活性の１つまたは複数を含み得る。
【００８６】
ヒト化抗５Ｔ４抗体の５Ｔ４抗原に対する結合を検出する技術、たとえば、実施例５に記載されているようなＢＩＡＣＯＲＥ^Ｒ分析は当該分野において公知である。さらなる代表的技術は、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーおよび他の免疫化学法を包含する。たとえば、マンソン（Ｍａｎｓｏｎ）（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ；イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）（１９９９）ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅおよびＲａｐｉｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。単離された５Ｔ４抗原または５Ｔ４発現細胞を用いて抗原結合分析を行うことができる。実施例１および５参照。
【００８７】
抗ガン活性なる用語は、一般に、存在するガン細胞を破壊する能力、またはガン細胞の成長を遅延または防止する能力を説明するために使用される。癌なる用語は、対象における任意の組織の一次および転移腫瘍および癌腫、たとえば、癌腫および造血器悪性腫瘍、たとえば白血病およびリンパ腫をさす。抗ガン活性を測定するためのインビトロ検定は実施例２および８に記載されており、代表的動物モデルは実施例３、４、および９に記載されている。
【００８８】
成長阻害なる用語は、本明細書においては、抗５Ｔ４抗体が５Ｔ４発現細胞を排除するか、あるいは５Ｔ４発現細胞の増殖を防止または軽減する能力を記載するために使用される。実施例２〜４および８〜９において記載されるように、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は癌細胞成長を阻害することができる。細胞成長阻害の迅速なインビトロ評価のためのさらなる代表的な方法は、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（２００１）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４：８５−９８に記載されている。
【００８９】
細胞死を誘発する能力は、プログラムされた細胞死の誘発を含み、これは核ＤＮＡ変性、核退化および凝縮、膜一体性の喪失、およびファゴサイトーシスを包含する。細胞を評価するための代表的な分析法は、ホーブズ（Ｈｏｖｅｓ）ら、（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１：１２７−３４；ペン（Ｐｅｎｇ）ら、（２００２）Ｃｈｉｎ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｊ． １７：１７−２１；ヤスハラ（Ｙａｓｕｈａｒａ）ら、（２００３）Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５１：８７３−８５に記載されている。
【００９０】
ＩＩ．抗５Ｔ４抗体／薬物接合体
本発明はさらに、本発明のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体を含む抗体／薬物接合体を提供する。さらに、抗体／薬物接合体を調製して、薬物を抗体に直接的または間接的のいずれかで結合させる方法も提供される。本発明の抗体／薬物接合体は一般式５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）_ｍ：
（式中：
５Ｔ４Ａｂは本明細書において記載されるキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントである；
Ｘは、抗体フラグメントの抗５Ｔ４抗体と反応できる任意の反応性基の生成物を含むリンカーである；
Ｗは薬物である；
ｍは精製された接合生成物の平均装填量である（たとえば、ｍは薬物が接合体の約３〜１０重量％を構成するようなものである）；
（−Ｘ−Ｗ）_ｍ は薬物誘導体である）
を有する。
【００９１】
本発明の抗体／薬物接合体を調製する方法も提供される。一例として、式５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）_ｍの抗体／薬物接合体は（ａ）薬物誘導体をキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体に添加し（ここにおいて、薬物はキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体の３〜１０重量％である）；（ｂ）薬物誘導体およびキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体を、約７〜９の範囲のｐＨを有する非求核性タンパク質適合性緩衝溶液中でインキュベートして、抗体／薬物接合体を生成させ（ここにおいて、溶液はさらに、（ｉ）適当な有機共溶媒、および（ｉｉ）少なくとも１つの胆汁酸またはその塩を含む１つまたは複数の添加剤を含み、インキュベーションは約３０℃〜約３５℃の範囲の温度で約１５分から約２４時間の範囲の時間で行われる）；（ｃ）工程（ｂ）において生成した接合体をクロマトグラフィー分離プロセスに付して、３〜１０重量％の薬物の範囲の装填量および低接合フラクション（ＬＣＦ）を用いて抗体／薬物接合体を未接合キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体、薬物誘導体、および凝集した接合体から分離することにより調製することができる。
【００９２】
ＩＩ．Ａ．薬物
本明細書において用いられる薬物なる用語は、生物学的または検出可能な活性を有する任意の物質、たとえば、治療薬、検出可能な標識、結合剤など、およびインビトロで代謝されて活性剤になるプロドラッグをさす。薬物なる用語は、薬物が本発明の抗体と接合できるように官能化された薬物誘導体も包含する。一般に、これらの種類の接合体は免疫接合体と呼ばれる。
【００９３】
治療薬なる用語は、これを必要とする対象における状態を治療または予防するために使用できる任意の組成物をさす。特に、本発明において有用な薬物は、抗ガン剤を包含する。５Ｔ４発現細胞は、扁平上皮／腺腫様肺ガン（非小細胞肺ガン）、浸潤性乳ガン、結腸直腸癌、胃ガン、扁平上皮子宮頸ガン、浸潤性子宮内膜腺癌、侵襲性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛腫からのガン細胞を包含する。
【００９４】
代表的治療薬は、細胞毒素、放射性同位元素、化学療法薬、免疫調節薬、血管新生阻害剤、抗増殖剤、アポトーシス誘発剤、ならびに細胞増殖抑制および細胞溶解酵素（たとえば、ＲＮＡｓｅ）を包含する。薬物は治療用核酸、たとえば、免疫調節役をコード化する遺伝子、血管新生阻害剤、抗増殖剤、またはアポトーシス誘発剤も包含する。これらの薬物ディスクリプタは相互排他的でなく、従って治療薬は１つまたは複数の前記用語を用いて記載することができる。たとえば、選択された放射性同位元素は細胞毒素でもある。治療薬は、薬理学的に許容される塩、酸または前記のいずれかの誘導体として調製することができる。一般に、薬物として放射性同位元素を有する接合体は、放射性免疫接合体と称し、薬物として化学療法薬を有するものは化学免疫接合体と称する。
【００９５】
免疫接合体において用いられる好適な薬物の例は、タキサン、メイタンシン、ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン、カリケアマイシンおよび他のエンジイン、およびオーリスタチンを包含する。他の例は、抗葉酸剤、ビンカアルカロイド、およびアントラサイクリンを包含する。植物毒素、他の生物活性タンパク質、酵素（すなわち、ＡＤＥＰＴ）、放射性同位元素、光線感作物質（すなわち、光線力学療法）を免疫接合体においても使用できる。加えて、接合体は細胞毒性剤、たとえば、リポソームまたはポリマーとして第二担体を用いて調製することができる。
【００９６】
細胞毒素なる用語は一般に、細胞の機能を阻害または防止し、および／または結果として細胞を破壊する薬剤を意味する。代表的な細胞毒素は、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡと結合し、崩壊させるアルキル化剤、ならびにタンパク質合成または本質的細胞タンパク質の機能を乱す薬剤、たとえば、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素、およびサイクリンを包含する。代表的な細胞毒素は、これに限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピタルビシン、バルルビシン、シタラビン、ジェムサイタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノサイタビン、アザシチジン、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロキスリジン、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン、フロキスリジン、フルダラビン、ゴウゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフリン、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルロウラシル、エトポシド、タクソール、タクソール類似体、プラチン類、たとえばシスプラチンおよびカルボプラチン、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、タモキシフェン、イダルビシン、ドラスタチン／アウリスタチン、ヘミアステルリン、エスペラマイシンおよびマイタンシノイドを包含する。
【００９７】
本発明の特定の具体例において、細胞毒素は抗生物質、たとえば、カリケアマイシンであり、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体、たとえば、ガンマ−カリケアマイシン（γ_１）ともよばれる。米国特許第４，９７０，１９８号参照。ガンマカリケアマイシンヒドラジド誘導体の抗体接合体に関する初期の研究により、インビトロの抗原ベースの細胞毒性および異種移植片実験における活性が示された。これらの接合体の治療指数は、当初は、有効性の低い誘導体、Ｎ−アセチルガンマを使用することにより改善された。ジメチル置換基を添加することにより、すべてのカリケアマイシン接合体において存在するジスルフィド結合を安定化することより、さらなる改善がなされた。本発明の抗体／薬物接合体の調製における使用に好適なカリケアマイシンのさらなる例は、米国特許第４，６７１，９５８号；第５，０５３，３９４号；第５，０３７，６５１号；第５，０７９，２３３号；および第５，１０８，９１２号に開示され；これらの特許は全体として本発明の一部として参照される。これらの化合物はメチルトリスルフィドを含有し、これを適当なチオールと反応させて、ジスルフィドを形成することができ、同時に、官能基、たとえば、ヒドラジドまたはカリケアマイシンを抗５Ｔ４抗体と接合させるために有用な他の官能基が導入される。ジメチル置換基の添加によるすべてのカリケアマイシン接合体において存在するジスルフィド結合の安定化は、さらなる改善をもたらす。これにより、Ｎ−アセチルガンマカリケアマイシンジメチルヒドラジド、またはＮＡｃ−ガンマＤＭＨ（ＣＬ−１８４，５３８）を、接合に関して最適化された誘導体の一つとして選択することができる。カリケアマイシンのジスルフィド類似体も用いることができ、これらはたとえば、米国特許第５，６０６，０４０号および第５，７７０，７１０号に記載されている類似体であり、これらの特許はその全体として本発明の一部として参照される。
【００９８】
放射線療法用途のために、本発明のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体は高エネルギ放射性同位元素を含むことができる。同位体は、たとえば、抗体中に存在するシステイン残基で抗体に直接結合することができるか、あるいは抗体と放射性同位元素の結合を媒介するためにキレーターを用いることができる。放射線療法に好適な放射性同位元素としては、これらに限定されないが、α−エミッター、β−エミッター、およびオージェ電子が挙げられる。診断用途に関して、有用な放射性同位元素としては、陽電子エミッターおよびγ−エミッターが挙げられる。本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体はさらに、たとえば、抗体のチロシン残基上でヨウ素化して、抗体の検出および治療効果を促進することができる。
【００９９】
抗５Ｔ４抗体と接合することができる代表的な放射性同位元素としては、^１８フッ素、^６４銅、^６５銅、^６７ガリウム、^６８ガリウム、^７７臭素、^８０ｍ臭素、^９５ルテニウム、^９７ルテニウム、^１０３ルテニウム、^１０５ルテニウム、^９９ｍテクネチウム、^１０７水銀、^２０３水銀、^１２３ヨウ素、^１２４ヨウ素、^１２５ヨウ素、^１２６ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３ヨウ素、^１１１インジウム、^１１３インジウム、^９９ｍレニウム、^１０５レニウム、^１０１レニウム、^１８６レニウム、^１８８レニウム、^１２１テルル、^９９テクネチウム、^１２２ｍテルル、^１２５ｍテルル、^１６５ツリウム、^１６７ツリウム、^１６８ツリウム、^９０イットリウム、およびこれらから誘導される窒化物または酸化物形態が挙げられる。他の好適な放射性同位元素としては、アルファエミッター、たとえば、^２１３ビスマス、^２１３鉛、および^２２５アクチニウムが挙げられる。
【０１００】
血管形成および抑制された免疫応答は、悪性疾患ならびに腫瘍成長、浸潤、および転移において主要な役割を果たす。従って、本発明の方法において有用な薬物は、免疫応答および／またはインビボで抗血管形成応答を誘発できるものも包含する。
【０１０１】
免疫応答なる用語は、脊椎動物対象の免疫系による抗原または抗原決定基に対する応答、たとえば、体液性免疫応答（たとえば、抗原特異性抗体の産生）および細胞性免疫応答（たとえば、リンパ球増殖）を意味する。代表的な免疫調節薬は、サイトカイン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロン、および成長因子（たとえば、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）、およびホルモン、たとえば、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン（テストステロン、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ^Ｒ（フルオキシメステロン）、プロゲスチン（ＭＥＧＡＣＥ^Ｒ（メゲストロールアセテート）、ＰＲＯＶＥＲＡ^Ｒ（メドロキシプロゲステロンアセテート））、およびコルチコステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）を包含する。
【０１０２】
本発明において有用な免疫調節薬は、腫瘍に対するホルモン作用をブロックする抗ホルモンおよびサイトカイン産生を抑制するか、自己抗原発現を減少調節するか、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤も包含する。代表的な抗ホルモンは、抗エストロゲン、たとえば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オナプンストン、およびトレミフェン；ならびに抗アンドロゲン、たとえば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；および抗副腎剤を包含する。代表的な免疫抑制剤は、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプゾン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣフラグメントの抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド、たとえば、グルココルチコステロイド、サイトカインまたはサイトカインレセプター拮抗物質（たとえば、抗インターフェロン抗体、抗ＩＬ１０抗体、抗ＴＮＦ（抗体、抗ＩＬ２抗体）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプターフラグメント、およびＴ細胞レセプター抗体を包含する。
【０１０３】
代表的な抗血管新生阻害剤は、血管形成の阻害剤、たとえば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤（たとえば、２−メトキシエストラジオールビス−スルファメート（２−ＭｅＯＥ２ｂビスＭＡＴＥ））、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジンタンパク質、クラスＩインターフェロン、インターロイキン１２、プロタミン、アンギオスタチン、ラミニン、エンドスタチン、およびプロラクチンフラグメントを包含する。
【０１０４】
抗増殖剤およびアポトーシス誘発剤は、ＰＰＡＲ−ガンマのアクチベータ（たとえば、シクロペンタノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧｓ））、レチノイド、トリテルピノイド（たとえば、シクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリーデラン、ダマラン、ククルビタシン、およびリモノイドトリテルペノイド）、ＥＧＦレセプターの阻害剤（たとえば、ＨＥＲ４）、ランパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ^Ｒ（１，２５−ジヒドロドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡ^Ｒ（レトロゾン））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレーター（たとえば、３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ））、アポプチン（ニワトリ貧血症ウイルスからのウイルスタンパク質３ − ＶＰ３）、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘発性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナル化のアクチベーター、およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル化の阻害剤（たとえば、ＵＣＮ−０１およびゲルダナマイシン）を包含する。
【０１０５】
代表的な化学療法薬は、アルキル化剤、たとえば、チオテパおよびシクロスホスファミド；アルキルスルホネート、たとえば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、たとえば、ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、およびウレドパ；エチレンイミンおよびメチルアメラミン、たとえば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン；ナイトロジェンマスタード、たとえば、クロロアムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メチオレタミン、メチオレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファルニド、ウラシルマスタード；ニトロス尿素、たとえば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、たとえば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝剤、たとえば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、たとえば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサート；プリン類似体、たとえば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、たとえば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン、５−ＥＵ；アンドロゲン、たとえば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎、たとえば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、たとえば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファリニドグリコシド；アミノレブリニン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；ガリウムニトレート；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、たとえばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ^Ｒ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ^Ｒ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ ｏｆ Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；キオラムブシル；ジェムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、たとえば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アイニオプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；およびカペシタビンを包含する。
【０１０６】
本明細書において開示され、本発明の治療法に従って使用されるキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体と接合できるさらなる治療薬としては、これらに限定されないが、光線力学療法に関しては感光剤（米国特許公開番号２００２／０１９７２６２および米国特許第５，９５２，３２９号）；温熱療法に関しては磁性粒子（米国特許公開番号２００３／００３２９９５）；結合剤、たとえば、ペプチド、リガンド、細胞接着リガンドなど、ならびにプロドラッグ、たとえば、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロサイトシンおよび他の５−フルオリジンプロドラッグであって、さらに活性な細胞毒性のない薬物に変換できるものが挙げられる。
【０１０７】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体を用いた診断法に関して、薬物は、インビトロまたはインビボでの５Ｔ４発現細胞の存在を検出するために使用できる検出可能な標識を含んでもよい。臨床診断用途に関して有用な放射性同位元素は、インビボで検出可能な標識、たとえば、シンチグラフィー、磁気共鳴映像法、または超音波を使用して検出可能な標識を包含する。有用なシンチグラフィー標識は、陽電子エミッターおよびγ−エミッターを包含する。磁気源映像法の代表的な造影剤は、常磁性または超常磁性イオン（たとえば、鉄、銅、マンガン、クロム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウムおよびガドリニウム）、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤を包含する。超音波検出法に関して、多孔性無機粒子中に気体または液体を捕捉することができ、これはマイクロバブル造影剤として放出される。インビトロ検出に関して、有用な検出可能な標識は、蛍光プローブ、エピトープ、または放射性標識を包含する。
【０１０８】
ＩＩ．Ｂ リンカー分子
薬物はリンカー分子により本発明のキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体と直接または間接的のいずれかで接合される。リンカー分子は安定または加水分解可能であり、これにより細胞侵入後に放出される。これにより薬物が抗体から開裂される主なメカニズムは、リソソーム（ヒドラゾン、アセタール、およびシス−アコニテート様アミド）の酸性ｐＨにおける加水分解、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド開裂、およびジスルフィドの還元を包含する。これらの開裂の多様なメカニズムの結果として、薬物を抗体に結合させるメカニズムは大きく異なり、任意の好適なリンカーを使用できる。好ましくは、接合法は、最小の低接合フラクション（ＬＣＦ、ほとんど未接合の抗体のフラクション）、すなわち、約１０％未満を有するサンプルを産生する。
【０１０９】
好適な接合法の一例は、ヒドラジドおよび他の求核試薬の、抗体上に天然に存在する炭水化物の酸化により生じるアルデヒドに対する接合に依存する。所望の薬物放出特性をもたらす、カルボニル基が導入されたヒドラゾン含有接合体を調製できる。一端にジスルフィド、中間にアルキル鎖、他端にヒドラジン誘導体を有する接合体も調製することができる。アントラサイクリンは、この技術を用いて抗体に接合させることができる細胞毒素の一例である。
【０１１０】
ヒドラゾン以外の官能基を含有するリンカーは、リソソームの酸性環境において開裂される可能性を有する。たとえば、接合体は、細胞内で開裂可能なヒドラゾン以外の部位、たとえば、エステル、アミド、およびアセタール／ケタールを含有する、チオール反応性リンカーから作ることができる。カンプトテシンはこれらのリンカーを使用して接合できる細胞毒性剤の一つである。５〜７員環ケトンから調製されるケタールおよび細胞毒性剤に結合した酸素の一つを有するもの、および抗体結合のためにリンカーに結合する他のものも用いることができる。アントラサイクリンもこれらのリンカーを使用する好適な細胞毒素の一例である。
【０１１１】
ｐＨ感受性リンカーの種類の別の例は、シス−アコニテートであり、これはアミド結合と近接したカルボン酸を有する。カルボン酸は酸性リソソームにおけるアミド加水分解を促進する。数種の他の構造を有する、同様の加水分解速度促進を達成するリンカーも使用できる。Ｃ−９で結合したリンカーで接合できるメイタンシノイドは細胞毒素の一例である。
【０１１２】
薬物接合体の別の有望な放出法は、リソソーム酵素によるペプチドの酵素加水分解である。一例において、ペプチドはアミド結合によりパラ−アミノベンジルアルコールに結合し、カーバメートまたはカーボネートがベンジルアルコールと細胞毒性剤間で形成される。ペプチドの開裂は、アミノベンジルカーバメートまたはカーボネートの崩壊または自己犠牲につながる。この方法により例示される細胞毒性剤は、アントラサイクリン、タキサン、マイトマイシンＣ、およびアウリスタチンを包含する。一例において、カーバメートの代わりにリンカーの崩壊によりフェノールを放出することもできる。別のバリエーションにおいて、パラメルカプトベンジルカーバメートまたはカーボネートの崩壊を開始するために、ジスルフィド還元が使用される。
【０１１３】
抗体に接合した多くの細胞毒性剤は、もしあったとしても、水溶性が低く、このことは接合体の凝集のために、接合体に対する薬物のローディングを制限し得る。これを克服するための一方法は、可溶化基をリンカーに添加することである。ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて調製された接合体、たとえば、抗体に結合したＰＥＧ二酸、チオール−酸、またはマレイミド−酸、ジペプチドスペーサー、およびアントラセリンまたはデュオカルマイシン類似体のアミンに結合したアミドを用いることができる。もう一つ別の例は、細胞毒性剤に結合したＰＥＧ含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製される接合体である。ＰＥＧ基を組み入れる方法は、凝集および薬物ローディングにおける制限を克服するのに有益であり得る。
【０１１４】
本発明の抗体／薬物接合体の調製に好ましい代表的なリンカーは、式：
（ＣＯ−Ａｌｋ^１−Ｓｐ^１−Ａｒ−Ｓｐ^２−Ａｌｋ^２−Ｃ（Ｚ^１）＝Ｑ−Ｓｐ）
（式中：
Ａｌｋ^ｌおよびＡｌｋ^２は独立して、結合あるいは分岐または非分岐（Ｃ_ｌ−Ｃ_１０）アルキレン鎖である；
Ｓｐ^１は結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’−、−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ’−Ｙ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｚであり、ここにおいて、Ｘ、Ｙ、およびＺは独立して、結合、−ＮＲ’−、−Ｓ−、または−Ｏ−である。ただし、ｎ＝０である場合、ＹおよびＺの少なくとも１つは結合でなければならず、Ａｒ’は１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであって、所望により、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’、ｏｒ −Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、または３個の基で置換されていてもよい。ただし、Ａｌｋ^１が結合である場合、Ｓｐ^１は結合である；
ｎは０〜５の整数である；
Ｒ’は分岐または非分岐（Ｃ_１−Ｃ_５）鎖であって、所望により、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ_１−Ｃ_３）ジアルキルアミノ、または（Ｃ_１−Ｃ_３）トリアルキルアンモニウム−Ａ⁻（ここにおいて、Ａ⁻ は塩を形成する医薬的に許容されるアニオンである）の１または２個の基により置換されていてもよい；
Ａｒは、１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであって、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’（ここにおいて、ｎおよびＲ’は前記定義の通りである）の１、２、または３個の基で置換されていてもよいもの、あるいは１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリデンまたは
【化１】

であって、各ナフチリデンまたはフェノチアジンは所望により、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、または−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’（ここにおいて、ｎおよびＲ’は前記定義の通りである）の１、２、３、または４個の基で置換されていてもよい。ただし、Ａｒがフェノチアジンである場合、Ｓｐ^１は窒素にのみ結合される結合である；
Ｓｐ^２は、結合、−Ｓ−、または−Ｏ−である。ただし、Ａｌｋ^２が結合である場合、Ｓｐ^２は結合である；
Ｚ^１は、Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、またはフェニルであって、所望により、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’（ここにおいて、ｎおよびＲ’は前記定義の通りである）の１、２、または３個の基で置換されていてもよい；
Ｓｐは直鎖または分岐鎖二価または三価（Ｃ_１−Ｃ_１８）ラジカル、あるいは三価アリールまたはヘテロアリールラジカル、二価または三価（Ｃ_３−Ｃ_１８）シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルラジカル、二価または三価アリール−またはヘテロアリール−アリール（Ｃ_１−Ｃ_１８）ラジカル、二価または三価シクロアルキル−またはヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ_１−Ｃ_１８）ラジカルあるいは二価または三価（Ｃ_２−Ｃ_１８）不飽和アルキルラジカルであり、ここにおいて、ヘテロアリールは、好ましくは、フリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノクマリニル、またはフェナジニルであり、Ｓｐが三価ラジカルである場合、Ｓｐは低級（Ｃ_１−Ｃ_５）ジアルキルアミノ、低級（Ｃ_１−Ｃ_５）アルコキシ、ヒドロキシ、または低級（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキルチオ基でさらに置換されていてもよい；
Ｑは＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である）
のリンカーを包含する。
【０１１５】
好ましくは、Ａｌｋ^１は分岐または非分岐（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルキレン鎖であり；Ｓｐ’は結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲ’であり、ここにおいて、Ｒ’は前記定義の通りである。ただし、Ａｌｋ^１が結合である場合、Ｓｐ^１は結合である；
Ａｒは、１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであって、所望により、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、または３個の基で置換されていてもよいものであるか（ここにおいて、ｎおよびＲ’は前記定義の通りである）、あるいはＡｒは、１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリデンであって、それぞれは所望により、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、３、または４個の基で置換されていてもよい；
Ｚ^１は（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、またはフェニルであって、所望により、（Ｃ_１−Ｃ_５）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシ、（Ｃ_１−Ｃ_４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’、または−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、または３個の基で置換されていてもよい；Ａｌｋ^２およびＳｐ^２は一緒になって結合である；ＳｐおよびＱは直前に定義した通りである。
【０１１６】
米国特許第５，７７３，００１号（その全体として本発明の一部として参照される）は、カリケアマイシンから調製される求核薬、特にヒドラジドおよび関連する求核試薬とともに使用できるリンカーを開示している。これらのリンカーは、薬物およびリンカー間で形成される結合が加水分解可能である場合に、さらに良好な活性が得られる場合において特に有用である。これらのリンカーは、２つの官能基、たとえば（１）抗体との反応のための基（たとえば、カルボン酸）、および（２）薬物との反応のためのカルボニル基（たとえば、アルデヒドまたはケトン）を含有する。カルボニル基は、薬物上のヒドラジド基と反応して、ヒドラゾン結合を形成することができる。この結合は加水分解可能であり、標的細胞との結合後に接合体からの治療剤の放出を許容する。
【０１１７】
一例として、キメラまたはヒト化Ｈ８抗体は、（１）細胞毒性薬誘導体を抗５Ｔ４抗体に添加する（ここにおいて、細胞毒性薬は、タンパク質担体の４．５〜１１重量％である）；（２）細胞毒性薬誘導体および抗５Ｔ４抗体を、約７〜９の範囲のｐＨを有する非求核性、タンパク質適合性、緩衝溶液中でインキュベートして、モノマー細胞毒性薬／抗体接合体を産生する（ここにおいて、溶液はさらに（ａ）好適な有機共溶媒、および（ｂ）少なくとも１つのＣ_６−Ｃ_１８カルボン酸またはその塩を含む添加剤を含み、インキュベーションは約３０℃〜約３５℃の範囲の温度で、約１５分から２４時間行われる）；および（３）工程（２）において産生された接合体をクロマトグラフィー分離プロセスに付して、モノマー接合体を３重量％〜１０重量％の細胞毒性薬および１０％未満の低接合フラクション（ＬＣＦ）で未接合抗体、薬物誘導体、および凝集した接合体から分離することにより、細胞毒性薬に接合させることができる。
【０１１８】
工程（３）のクロマトグラフィー分離は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外濾過／膜分離精製法（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはセファクリルＳ−２００クロマトグラフィーなどのプロセスを包含する。クロマトグラフィー分離は、フェニルセファロース６高速流クロマトグラフィーメディア、ブチルセファロース４高速流クロマトグラフィーメディア、オクチルセファロース４高速流クロマトグラフィーメディア、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌエーテル−６５０Ｍクロマトグラフィーメディア、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐメチルＨＩＣメディアまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチルＨＩＣメディアを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により行うことができる。
【０１１９】
抗Ｈ８抗体／薬物接合体の代表的な調製法は、米国同時係属出願公開番号２００４−０８２７６４Ａ１および米国特許出願番号１０／６９９，８７４（全体として本発明の一部として参照される）においてＣＭＣ−５４４の調製法に関して記載されているものを包含する。接合は、次の条件を用いて行うことができる：１０ ｍｇ／ｍｌ抗体、８．５％（ｗ／ｗ）カリケアマイシン誘導体、３７．５ ｍＭデカン酸ナトリウム、９％ （ｖ／ｖ）エタノール、５０ ｍＭ ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、ｐＨ ８．５、３２℃、１時間を包含する。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ブチルセファロースＦＦ樹脂、０．６５ Ｍリン酸カリウムローディング緩衝液、０．４９ Ｍ リン酸カリウム洗浄緩衝液、および４ ｍＭリン酸カリウム溶出緩衝液を用いて行うことができる。緩衝液交換は、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過／膜分離精製法、または他の好適な手段により達成することができる。抗体／薬物接合体は、１．５％デキストラン−４０、０．９％シュークロース、０．０１％ ＴＷＥＥＮ^Ｒ−８０、２０ ｍＭトリス／５０ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０中で処方することができる。５％シュークロース、０．０１％ ＴＷＥＥＮ^Ｒ−８０、２０ ｍＭトリス／１０ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０を含有する別の処方溶液も使用できる。凍結乾燥サイクルは処方に基づいて調節される。処方の濃度は、０．５ ｍｇ接合体／ｍｌである。それぞれのバイアルは１ ｍｇの接合体を含み得る。すなわち、２ ｍｌの充填量である。他の充填体積、たとえば５ｍｌ充填量を所望により調製することができる。
【０１２０】
他の代表的な方法は、ＣＭＤ−１９３に関して記載されているものを包含し、同時係属中の米国特許出願番号１１／０８０，５８７にも記載されている。接合は、次の条件を用いて行うことができる：１０ ｍｇ／ｍｌ抗体、７％ （ｗ／ｗ）カリケアマイシン誘導体、１０ ｍＭデオキシコレート、５０ ｍＭ ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、９％ （ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ ８．２、３２℃、１時間。反応を０．６６ Ｍリン酸カリウム ｐＨ ８．５６で１０倍に希釈し、ブチルセファロースＦＦ樹脂、０．６０ Ｍリン酸カリウムローディング緩衝液および洗浄緩衝液、および２０ ｍＭトリス／２５ ｍＭ ＮａＣｌ溶出緩衝液を用いてＨＩＣを行うことができる。緩衝液交換は、限外濾過／再生セルロース膜を用いた膜分離精製法を用いて行うことができる。接合体を２０ ｍＭトリス／１０ ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ８．０（１０ ｄｉａｖｏｌｕｍｅｓ）に対して膜分離精製することができる。抗体／薬物接合体を５％シュークロース、０．０１％ ＴＷＥＥＮ^Ｒ−８０、２０ ｍＭトリス／１０ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０中で処方することができる。処方後のバルク接合体の濃度は１ ｍｇ／ｍｌであり、バイアル充填量は５ ｍｇ／バイアル、すなわち、５ ｍｌ充填量であるか、あるいは他の充填体積を所望により調製することができる。
【０１２１】
本発明の特定の具体例において、使用されるリンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である。抗体／薬物接合体は、β−カリケアマイシン、γ−カリケアマイシンまたはＮ−アセチルγ−カリケアマイシン、あるいはその誘導体を、３−メルカプト−３−メチルブタノイルヒドラジド、ＡｃＢｕｔリンカー、および本発明の抗５Ｔ４抗体と反応させることにより調製される。たとえば、米国特許第５，７７３，００１号参照。このリンカーは、循環において安定である接合体を産生し、１日あたり推定２％のＮＡｃ−γＤＭＨを放出し、これは酸性リソソームにおいて容易にＮＡｃ−ガンマＤＭＨを放出する。本発明の他の具体例において、抗体／薬物接合体は、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）または４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）をリンカー分子として使用して調製される。実施例２参照。
【０１２２】
放射性同位元素の接合に関して有用な代表的リンカーは、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）−イソチオシアネート、スクシニミジル６−ヒドラジニウムニコチネートヒドロクロリド（ＳＨＮＨ）、およびヘキサメチルプロピレンアミンオキシム（ＨＭＰＡＯ）を包含する（バッカー（Ｂａｋｋｅｒ）ら、（１９９０）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１５０１−９、チャットパディエイ（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ）ら、（２００１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２８：７４１−４、デワンジー（Ｄｅｗａｎｊｅｅ）ら、（１９９４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３５：１０５４−６３、クレニング（Ｋｒｅｎｎｉｎｇ）ら、（１９８９）Ｌａｎｃｅｔ １；２４２−４、サギウチ（Ｓａｇｉｕｃｈｉ）ら、（２００１）Ａｎｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１５：２６７−７０）；米国特許第６，０２４，９３８参照）。別法として、ターゲティング分子を誘導化させて、放射性同位元素を直接これに結合させることができる（ユー（Ｙｏｏ）ら、（１９９７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３８：２９４−３００）。ヨウ素化法も当該分野において公知であり、代表的方法は、たとえば、クレニング（Ｋｒｅｎｎｉｎｇ）ら、（１９８９）Ｌａｎｃｅｔ １：２４２−４およびバッカー（Ｂａｋｋｅｒ）ら、（１９９０）Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ３１：１５０１−９において見いだすことができる。
【０１２３】
抗体／薬物接合体あたりの薬物分子の数をさらに増大させるために、薬物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、たとえば直鎖または分岐鎖ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーと接合させることができる。ＰＥＧモノマーは次式：
−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）−
を有するものである。薬物および／またはペプチド類似体をＰＥＧと直接または間接的に、すなわち、適当なスペーサー基、たとえば糖を介して結合させることができる。ＰＥＧ／抗体／薬物組成物は、薬物安定性およびインビボでの標的部位への送達を促進するために、さらなる親油性および／または親水性部分も含むことができる。ＰＥＧ含有組成物の代表的な調製法は特に、米国特許第６，４６１，６０３号；第６，３０９，６３３号；および第５，６４８，０９５号において見いだすことができる。
【０１２４】
カリケアマイシンをはじめとする多くの薬物の疎水性の結果、抗体／薬物接合体が凝集する。さらに高い薬物装填量／収量および凝集が軽減されたモノマー抗体／薬物接合体を産生するために、（ｉ）共溶媒としてプロピレングリコールおよび（ｉｉ）少なくとも１種のＣ_６−Ｃ_１８カルボン酸を含む添加剤を含有する、非求核タンパク質適合性緩衝溶液中で、接合反応を行うことができる。有用な酸としては、Ｃ_７〜Ｃ_１２酸、たとえば、オクタン酸またはカプリル酸、あるいはその塩が挙げられる。プロピレングリコール以外の他のタンパク質適合性有機共溶媒、たとえば、エチレングリコール、エタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなども使用できる。薬物を接合混合物中に移すために有機共溶媒の一部または全部が使用される。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステルまたは他の同等に活性化されたエステルを用いた抗体／薬物接合体の調製に有用な緩衝液としては、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝液）が挙げられる。接合反応において用いられる緩衝溶液は遊離アミンおよび求核試薬が実質的にない。別の方法として、ｔ−ブタノールを含有し、添加剤を追加していない非求核タンパク質適合性緩衝溶液中で接合反応を行うことができる。たとえば、米国特許第５，７１２，３７４号および第５，７１４，５８６号参照。接合のさらなる方法およびカリケアマイシン含有接合体は、米国特許第５，７３９，１１６号および第５，８７７，２９６号に開示されている。
【０１２５】
モノマー接合体を形成するための最適反応条件は、温度、ｐＨ、カリケアマイシン誘導体投入量、および添加剤濃度などの反応変数を変えることにより経験的に決定することができる。プロピレングリコールの代表的な量は、全溶液の１０％〜６０％、たとえば１０％〜４０％の範囲、または約３０体積％である。少なくとも１つのＣ_６−Ｃ_１８カルボン酸またはその塩を含む添加剤の代表的な量は、２０ ｍＭ〜１００ ｍＭ、たとえば、４０ ｍＭ〜９０ ｍＭ、または約６０ ｍＭ〜９０ ｍＭの範囲である。Ｃ_６−Ｃ_１８カルボン酸またはその塩の濃度を１５０〜３００ ｍＭに増加させることができ、共溶媒を１％〜１０％に減少させることができる。本発明の代表例において、カルボン酸はオクタン酸、デカン酸、または対応する塩である。たとえば、２００ ｍＭのカプリル酸を５％プロピレングリコールまたはエタノールとともに使用することができる。接合反応は、若干高い温度（３０〜３５^ｏＣ）およびｐＨ（８．２〜８．７）で行うことができる。抗体の濃度は１〜１５ ｍｇ／ｍｌの範囲であり、カリケアマイシン誘導体、たとえば、Ｎ−アセチルガンマ−カリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔ ＯＳｕエステルの濃度は、抗体の約４．５重量％〜１１重量％の範囲である。他の薬物の接合に好適な条件は、実験を行うことなく当業者が決定することができる。
【０１２６】
ＩＩ．Ｃ．抗体／薬物接合体の精製
接合後、モノマー接合体を未接合反応物質および／または接合体の凝集形態から、通常の方法、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、またはクロマト分画（ＣＦ）により分離することができる。精製された接合体は、モノマーであり、通常、３重量％〜１０重量％の薬物を含有する。抗体／薬物接合体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製することもでき、これは、たとえば、（１）ＬＣＦ含量ならびに凝集物を有効に減少させることができること；（２）大きな反応体積の調節；および（３）生成物の最小希釈など、ＳＥＣにまさるいくつかの利点をもたらす。生産規模の使用に好適な高容量ＨＩＣメディアは、フェニルセファロース６高速流クロマトグラフィーメディア、ブチルセファロース４高速流クロマトグラフィーメディア、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌエーテル−６５０Ｍクロマトグラフィーメディア、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐメチルＨＩＣメディアまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチルＨＩＣメディアを含む。限外濾過／膜分離精製法も緩衝液交換に使用できる。
【０１２７】
代表的な精製法において、遠心分離細胞除去工程、タンパク質Ａ親和性捕捉工程と、それに続く１または２の直交クロマトグラフィー研磨工程、ウイルス濾過工程、および濃縮および処方のための接線流濾過工程を包含する複数の工程が行われる。精製法は、好ましくは、５％未満の凝集物、２０ｐｐｍ未満のタンパク質Ａ、５０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、および５０％を超える全体的回収率で生成物を産生する。
【０１２８】
典型的なヒト化抗５Ｔ４／カリケアマイシン調製物は、主に（約９５％）、抗体１モルあたり５〜７モルのカリケアマイシンを含有する接合した抗体を含有する。接合体は、実験室スケール（１０−２００ ｍｇ）で再現可能に調製される。薬物装填量は、μｇカリケアマイシン／ｍｇ ｍＡｂとして表され、カリケアマイシン濃度（μｇ／ｍＬ）を抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）で割ることにより決定される。これらの値は、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍで接合体溶液のＵＶ吸光度を測定することにより決定される。これは平均装填量であり、実際の装填量は平均装填量値を中心とする疑似ガウス分布であることに注目することが重要である。すなわち、抗体の一部が平均よりも多量に装填され、抗体の一部は平均よりも少量で装填される。分析的ＨＩＣ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高性能液体クロマトグラフィー）を用いて測定できる未接合抗体（低接合フラクション）は、接合カリケアマイシンをほとんどまたは全く有さない抗体の集団である。この値は、抗体に関するカリケアマイシン分布の測定値であり、投与されたカリケアマイシンの量に一般的に影響を及ぼさない。ＥＬＩＳＡを用いて測定できる未接合カリケアマイシンは、抗体に対して接合されず、全カリケアマイシンの割合で表されるカリケアマイシンの量をいう。薬物装填分析は、未接合および接合カリケアマイシンを識別しない。未接合カリケアマイシンの量は、薬物ローディングを用いた場合に検出できないか、あるいは無視でき、従って、これらの分析は接合カリケアマイシンの量を有効に測定する。
【０１２９】
ヒト化抗５Ｔ４カリケアマイシン接合体の放出および安定性試験に関する分析のために分析法を用いることができる。接合体は、同一性（ＩＥＦ）、強度（全タンパク質および全カリケアマイシン装填量）、純度（未接合カリケアマイシン、低接合抗体、凝集物含量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元）、および免疫親和性（抗原結合ＥＬＩＳＡ）に関して評価することができる。当業者に公知のさらなる分析を用いることができる。これらの分析を用いて、バッチ間の一貫性を商業的製造において維持することができる。
【０１３０】
ＩＩ．Ｄ．抗体／薬物接合体の薬物動態
Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ５Ｔ４を標的とする免疫接合体の薬物動態を評価し、様々な動物における未接合カリケアマイシンの薬物動態と比較することができる。たとえば、これは、メスヌードマウス、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、およびメスカニクイザルに１回静脈内ボーラス投与した後に行うことができる。抗５Ｔ４抗体の薬物動態は、一般に、様々な種における低クリアランス、低体積の分布、および長い見かけの終末半減期により特徴づけられる。未接合カリケアマイシン誘導体の血清濃度は定量限界より低いと予想される。単回投与毒性範囲実験におけるこれらの接合体についての毒性プロフィールは、相当する用量での他の抗体／カリケアマイシン接合体について得られるものと同様であると予想される。
【０１３１】
ＩＩＩ．キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体の使用
本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体は、５Ｔ４発現細胞に関連する用途についてインビトロおよびインビボの両方で有用である。実施例１において記載されるように、５Ｔ４発現ガン細胞は、扁平上皮／腺腫性肺ガン（非小細胞肺ガン）、浸潤性乳ガン、結腸直腸癌、胃ガン、扁平上皮子宮頸ガン、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛腫を包含する。５Ｔ４は、気管支、胸部、結腸、直腸、胃、頸部、子宮内膜、膵臓、卵巣、絨毛、および精嚢の癌腫に関して高レベルで検出された。
【０１３２】
インビボ用途に関して、開示されたヒト化抗体の薬物担体としての有用性は、そのターゲティング分子として挙動する能力に依存する。ターゲティングなる用語は、対照組織と比較したペプチドまたはペプチド類似体の標的組織における優先的運動および／または蓄積をさす。本明細書において用いられる標的組織なる用語は、５Ｔ４発現細胞、すなわち、対象に投与された後の本発明の抗体／薬物接合体の蓄積に関して意図される部位を含む組織をいう。本明細書において用いられる対照組織なる用語は、投与された抗体／薬物接合体の結合および／または蓄積が実質的にないと思われる部位、すなわち、５Ｔ４発現細胞が実質的にない組織をさす。本明細書において用いられる選択的ターゲティングなる用語は、標的組織における抗体／薬物接合体の量が対照組織におけるペプチド類似体の量より約２倍高くなるような、たとえば、約５倍以上、または約１０倍以上になるような抗体／薬物接合体の優先的局在化をさす。
【０１３３】
ＩＩＩ．Ａ．インビトロ適用
本発明はヒト化５Ｔ４抗体を使用するインビトロの方法を提供する。たとえば、開示された抗体は単独または細胞毒性剤または５Ｔ４陽性癌細胞と特異的に結合して、かかる細胞を細胞サンプルから除去する他の薬物との組み合わせのいずれかにおいて用いることができる。
【０１３４】
細胞毒素と接合した抗５Ｔ４抗体を含む抗体／薬物接合体と５Ｔ４発現細胞を接触させることにより、標的細胞崩壊のための方法も提供される。実施例３および８参照。細胞毒性剤を含む抗体／薬物接合体と細胞を接触させることにより、５Ｔ４発現細胞の増殖を抑制するための方法および５Ｔ４発現細胞のアポトーシスを誘発する方法も提供される。５Ｔ４発現細胞の抗体／薬物接合体との接触は、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【０１３５】
ＩＩＩ．Ｂ．診断および検出法
本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は、５Ｔ４抗原を特異的に結合するその能力に基づいて、インビトロおよびインビボでの５Ｔ４＋細胞の検出においても有用性を有する。５Ｔ４発現細胞を検出する方法は：（ａ）細胞を含む生物学的サンプルを調製し；（ｂ）インビトロでヒト化抗５Ｔ４抗体を生物学的サンプルと接触させ（ここにおいて、抗体は検出可能な標識を含む）；（ｃ）検出可能な標識を検出し、これにより５Ｔ４発現細胞が検出可能になることを含む。
【０１３６】
開示された検出法は、たとえば、診断に有用であるとして、手術中の援助を提供するために、あるいは用量決定のためにインビボでも行うことができる。標識されたヒト化抗５Ｔ４抗体を対象に投与した後で結合に十分な時間の後、抗体により結合した５Ｔ４発現細胞の生体内分布を可視化することができる。開示された診断法は、処理法と組み合わせて使用することができる。加えて、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体は検出および治療の二重の目的で投与することができる。
【０１３７】
代表的な非浸潤性検出法は、シンチグラフィー（たとえば、ＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピューター断層撮影法）、ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影法）、ガンマカメラ画像化、および直線走査）、磁気共鳴映像法（たとえば、通常の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、陽子磁気共鳴分光学（ＭＲＳ）、拡散強調画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像法（ｆＭＲＩ））、および超音波を包含する。
【０１３８】
ＩＩＩ．Ｃ．治療用途
本発明はさらに、対象において５Ｔ４発現ガン細胞の細胞崩壊を誘発するために有用な方法および組成物にも関する。従って、開示された方法は、癌成長の阻害、たとえば、遅延型腫瘍成長および転移の阻害に有用である。一つの操作様式に拘束されることを意図しないが、ヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体の抗原誘導ターゲティング（たとえば、実施例３、４、および９参照）ならびに受動的ターゲティング（たとえば、実施例１０参照）は抗腫瘍効果に寄与し得る。
【０１３９】
開示された抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体を用いて治療可能な代表的な癌としては、胸部、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、胆管、小腸、腎臓、膀胱および尿路上皮を含む尿路、女性生殖系、頸部、子宮、卵巣、男性生殖系、前立腺、精嚢、睾丸、内分泌腺、甲状腺、副腎、脳下垂体、皮膚、骨、軟組織、血管、脳、神経、眼、髄膜における５Ｔ４発現原発および転移性腫瘍が挙げられる。特に、本発明の開示された抗５Ｔ４抗体／薬物接合体は、非小細胞肺ガン、転移性乳ガン、および膵臓癌の治療に、第二次単剤療法として、また一次併用療法の一部として使用できる。標的癌は、胸部、結腸、胃、食道、膵臓、十二指腸、肺、膀胱および腎臓癌および胃および島細胞神経内分泌腫瘍を包含するルイスＹ炭水化物抗原を発現することもできる。米国特許第６，３１０，１８５号参照。
【０１４０】
開示された方法は、ホジキンリンパ腫細胞および非ホジキンリンパ腫細胞をはじめとするＴ４発現白血病およびリンパ腫細胞にも関する。リンパ腫細胞は、無痛性、悪性、低悪性度、中悪性度、または抗悪性度リンパ腫細胞である。
【０１４１】
従って、本発明のヒト化抗５Ｔ４抗体／カリケアマイシン接合体で治療されるべき患者は、これに限定されないが、５Ｔ４抗原の高い発現を包含するバイオマーカー発現に基づいて選択することができ、その結果、腫瘍発生または組織ではなく強化された標的発現に関して選択された患者集団が得られる。標的発現は、細胞染色の強度と併せて細胞染色の数の関数として測定することができる。たとえば、５Ｔ４の高発現の区分は、３＋（１〜４のスケールで）のレベルで５Ｔ４について陽性の免疫組織学的染色により試験された、３０％を超える（すなわち、４０％、５０％または６０％）細胞を有する患者を包含し、一方、５Ｔ４の中発現は、１＋〜２＋での２０％を超える細胞染色を有する患者を包含する。
【０１４２】
５Ｔ４抗原の発現以外のバイオマーカーを、たとえば、多剤耐性（ＭＤＲ）に基づく腫瘍のキャラクタライゼーションを包含する患者の選択にも用いることができる。ほぼ５０パーセントのヒトの癌は、化学療法に対して完全に耐性であるか、または一時的にのみ反応し、その後、通常に使用される抗ガン剤により影響を受けないかのいずれかである。この現象は、ＭＤＲと称し、ある種の腫瘍により本質的に発現され、一方、他のものは化学療法処置を受けた後にＭＤＲを獲得する。薬物排出ポンプＰ−糖タンパク質は、細胞毒性化学療法に関連するＭＤＲの大部分を媒介する。癌患者腫瘍標本中に存在するＭＤＲメカニズムの表現型および機能分析は、特定の腫瘍種における化学療法に対して耐性と特異的ＭＤＲメカニズムを関係づけるために行うことができる。
【０１４３】
本明細書において用いられる癌なる用語は、非新生物増殖性疾患も包含する。従って、本発明の方法は、過形成、化生、あるいは特に異形成（かかる異常成長状態に関する総説については、デバイタ・ジュニア（ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．）ら、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ： ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ、第６版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ参照）の治療または予防も意図される。
【０１４４】
癌成長なる用語は、一般に、癌内のより発展した形態への変化を示唆する指数を意味する。従って、癌成長の阻害を評価する指数は、これに限定されないが、癌細胞生存率における減少、腫瘍体積または形態の減少（たとえば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像化法を使用して決定される）、遅延型腫瘍成長、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型過敏症皮膚試験における向上した性能、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性における増加、および腫瘍特異性抗原のレベルにおける減少を包含する。遅延型腫瘍成長なる用語は、腫瘍が特定の量に成長するために必要な時間の減少を意味する。たとえば、治療は、腫瘍が測定の初日（０日）に対して３倍の体積に増大するために必要な時間または１ｃｍ^３に成長するために必要な時間を遅延させることができる。
【０１４５】
ＩＩＩ．Ｄ．処方
本発明のキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体を安全かつ有効な臨床用途のために容易に調製し、処方することができる。対象に投与するために好適な処方は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、抗菌剤および抗真菌剤（たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール）、処方を意図される受容者の体液と等張にするための溶質（たとえば、糖、塩、およびポリアルコール）、懸濁化剤、および増粘剤を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液を包含する。好適な溶媒としては、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびその混合物が挙げられる。処方は、単剤または多剤容器、たとえば、密封アンプルおよびバイアル中で提示することができ、対象に投与するか、またはその後に意図される用途に適当な同位体で放射標識するために使用直前に無菌液体担体を添加するだけでよい凍結またはフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。本発明の抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体は好ましくは以下に記載される有効用量として処方される。
【０１４６】
一例として、代表的な抗５Ｔ４抗体処方は、４０ ｍｇ／ｍｌの抗体または抗体／薬物接合体、２５ ｍＭのアセテート、１５０ ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール、０．０２％のポリソルベート２０（ｐＨ ５．０）を含み、２〜８℃で貯蔵して２年の最低保存寿命を有する。もう一つ別の例として、抗５Ｔ４抗体処方は、９．０ ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム中１０ ｍｇ／ｍｌの抗体または抗体／薬物接合体、７．３５ ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および無菌水を含む（ｐＨ ６．５）。実験マウスモデルに投与される抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体の代表的な処方は、２μｇまたは４μｇのカリケアマイシンを含み（実施例３、４、および７参照）、これはヒトへの投与に関して相応に増減することができる。
【０１４７】
抗５Ｔ４抗体または抗体／薬物接合体の安定な凍結乾燥処方は（ａ）抗体／薬物接合体を溶解させて、凍結防止剤を１．５重量％〜５重量％の濃度、ポリマー充填剤を０．５重量％〜１．５重量％の濃度、電解質を０．０１Ｍ〜０．１Ｍの濃度、溶解促進剤を０．００５重量％〜０．０５重量％の濃度、溶液の最終ｐＨが７．８〜８．２になるように５〜５０ｍＭの濃度で緩衝剤、および水含む溶液中０．５〜２ ｍｇ／ｍｌの最終濃度にし；（ｂ）前記溶液をバイアル中に＋５℃〜１０℃の温度で分注し；（ｃ）溶液を−３５℃〜−５０℃の凝固点で凍結させ；（ｄ）凍結した溶液を−１０℃〜−４０℃の棚温度、２０〜８０ミクロンの一次乾燥圧で、２４〜７８時間、初期乾燥工程に付し；（ｅ）凍結乾燥された工程（ｄ）の生成物を＋１０℃〜＋３５℃の棚温度で２０〜８０ミクロンの乾燥圧で１５〜３０時間、二次乾燥工程に付すことにより調製できる。
【０１４８】
凍結防止剤の凍結乾燥に有用な代表的な凍結防止剤としては、アルジトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ポリエチレングリコール、アルドン酸、ウロン酸、糖酸、アルドース、ケトース、アミノ糖、アルジトール、イノシトール、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、グルコース、フルクトース、グルコン酸、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、メチルα−グルコピラノシド、マルトース、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトン、ソルボース、グルカル酸エリスロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリスルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、シュークロース、トレハロース、ノイラミン酸、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプン、シュークロース、グルコース、ラクトース、トレハロース、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロールおよびペンタエリスリトールが挙げられる。
【０１４９】
たとえば、凍結防止剤シュークロースは、１．５重量％の濃度で用いることができ、ポリマー充填剤デキストラン４０またはヒドロキシエチルデンプン４０は０．９重量％の濃度で用いることができ、凍結乾燥溶液において用いられる電解質は、塩化ナトリウムであり、これは０．０５Ｍの濃度で存在し、緩衝剤トロメタミンは０．０２Ｍの濃度で用いることができる。溶解度促進剤（たとえば、界面活性剤、たとえば、ポリソルベート８０）は凍結乾燥プロセスの間にも用いることができる。通常、この溶解度促進剤は、界面活性剤である。凍結乾燥された処方を調製するための代表的な工程は、バイアルを−４５℃の温度で凍結させることを含み；凍結した溶液を６０ミクロンの一次乾燥圧および−３０℃の棚温度で６０時間、初期凍結乾燥工程に付し；凍結乾燥された生成物を６０ミクロンの乾燥圧、＋２５℃の棚温度で２４時間二次乾燥工程に付す。
【０１５０】
抗５Ｔ４抗体および抗体／薬物接合体は医薬的に許容される担体、たとえば、大きく、ゆっくりと代謝される高分子、たとえば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子中で処方される。医薬的に許容される塩、たとえば、鉱酸塩、たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩、あるいは有機酸の塩、たとえば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩も用いることができる。処方はさらに、液体、たとえば、水、塩溶液、グリセロール、およびエタノール、および／または補助剤、たとえば、湿潤剤または乳化剤を含むことができるか、あるいはｐＨ緩衝物質がかかる組成物中に存在してもよい。かかる担体は、患者により摂取されるために、組成物が錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリーおよび懸濁剤に処方されるのを可能にする。
【０１５１】
ＩＩＩ．Ｅ．用量および投与
ヒト化抗５Ｔ４抗体は、非経口的に、たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与により投与することができる。組成物を肺経路に送達するために、組成物をエアゾルまたは粗スプレーとして、すなわち、経鼻投与で投与することができる。髄腔内または髄内投与は、中枢神経系（ＣＮＳ）およびＣＮＳ関連性癌の治療に用いることができる。本発明の抗５Ｔ４抗体は、経真皮、経皮、局所、経腸、膣内、舌下または経直腸的でも投与することができる。送達法は、治療される状態および部位、抗体処方の種類、および組成物の治療効力などの検討事項に基づいて選択される。静脈内投与は病院において慣例的に使用される。
【０１５２】
本発明は、有効量のヒト化抗５Ｔ４抗体が対象に投与されると定めている。有効量なる用語は、本明細書においては、所望の生物学的応答を惹起するために十分なヒト化抗５Ｔ４抗体の量を記載するために用いられる。たとえば、癌を有する対象に投与される場合、有効量は、抗ガン活性、たとえば、癌細胞崩壊、ガン細胞増殖の阻害、ガン細胞アポトーシスの誘発、ガン細胞抗原の減少、遅延型腫瘍成長、および転移の阻害を惹起するために十分な量を含む。腫瘍収縮は、有効性の臨床代理マーカーとしてよく承認されている。もう一つ別のよく承認された有効性のマーカーは、無増悪生存率である。抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体は、一般に、重要な有効性評価基準において少なくとも２５％の改善、たとえば、メジアン生存率、腫瘍進行までの時間、および全体的応答率において改善を示す。
【０１５３】
一般に、有効な用量は、約０．０１ ｍｇ／ｍ^２から約５０ ｍｇ／ｍ^２の範囲、たとえば、約０．１ ｍｇ／ｍ^２から約２０ ｍｇ／ｍ^２、または約１５ ｍｇ／ｍ^２であり、この用量は、抗５Ｔ４抗体の量に基づいて、あるいは抗体／カリケアマイシン調製物中のカリケアマイシンの量に基づいて計算される。実験マウスモデルに投与される抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体の代表的な用量は、２μｇまたは４μｇカリケアマイシン（実施例３〜４および９参照）を含み、この量はヒトへの投与に関して、相応して増減することができる。たとえば、本発明の抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体は、ヒト患者に３週間ごとに１回、６サイクルまで投与することができる。放射性標識された抗５Ｔ４抗体に関して、有効な用量は、典型的には、放射性同位元素および抗体の結合親和力に基づいて、約１ ｍＣｉ〜約３００ ｍＣｉ、通常、約５ ｍＣｉ〜１００ ｍＣｉである。
【０１５４】
開示されたキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体を用いた５Ｔ４−陽性細胞の検出に関して、検出可能な量の本発明の組成物が対象に投与される。検出可能な量は、本明細書において診断組成物に言及するために用いられる場合、抗体の存在をインビトロまたはインビボで決定できるようなキメラまたはヒト化Ｈ８抗体の量をいう。放射性同位元素を用いたシンチグラフィー画像化に関して、放射性同位元素の典型的な量は、約１０μＣｉ〜５０ｍＣｉ、または約１００μＣｉ〜２５ｍＣｉ、または約５００μＣｉ〜２０ｍＣｉ、または約１ｍＣｉ〜１０ｍＣｉ、または約１０ｍＣｉの活性を包含し得る。
【０１５５】
本発明の組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、所望の診断または治療結果を達成するために有効である量の組成物を投与するために変化し得る。投与計画も変化し得る。単回注射または頻回注射を用いることができる。選択された用量レベルおよび投与計画は、治療組成物の活性および安定性（すなわち、半減期）、処方、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、検出および／または治療される疾患または障害、および治療される対象の健康状態および以前の病歴をはじめとする様々な因子に依存するであろう。
【０１５６】
本発明の任意の抗５Ｔ４または抗体／薬物接合体に関して、治療的に有効な用量は、まず、細胞培養分析において、あるいは動物モデル、通常、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、および／または霊長類においてのいずれかで評価することができる。動物モデルは、適当な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用できる。このような情報は次いでヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用できる。典型的には、最小用量が投与され、用量を制限する細胞毒性がない場合は用量を増大させる。有効量または用量の決定および調節、ならびにかかる調節をいつ、どのようにして行うかの評価は、医学分野における通常の技術を有する人には公知である。
【０１５７】
処方、用量、投与計画、および測定可能な治療結果に関するさらなる指針については、バーコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）ら、（２０００）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；エバディ（Ｅｂａｄｉ）（１９９８）ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ ＳｃｉｅｎｃｅおよびＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；カッツン（Ｋａｔｚｕｎｇ）（２００１）Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ／ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂ． Ｄｉｖ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ハードマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら、（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ；スパイトおよびホルフォード（Ｓｐｅｉｇｈｔ ＆ Ｈｏｌｆｏｒｄ）（１９９７）Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｃｈｏｉｃｅｓ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＵｓｅおよびＥｃｏｎｏｍｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ参照。
【０１５８】
ＩＩＩ．Ｆ．併用療法
開示された抗５Ｔ４抗体は、初期治療として、または通常の療法に対して無反応な状態の治療のために投与することができる。加えて、開示された抗５Ｔ４抗体は、他の治療（たとえば、外科的切除、放射線療法、追加の標的化抗ガン剤または全身性抗ガン剤など）と組み合わせて用いることができ、これにより相加的または相乗治療効果の惹起および／またはある抗ガン剤の肝細胞毒性を低下させる。本発明のキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体は、追加の薬剤と同時投与または同時処方、あるいはいずれかの順序での連続投与のために処方することができる。
【０１５９】
併用療法に有用な代表的な薬剤としては、本明細書において抗５Ｔ４／薬物接合体の調製に有用であると前記されている任意の薬物が挙げられる。本発明のキメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体は、他の治療抗体および抗体／薬物接合体、たとえば、開示されたヒト化抗５Ｔ４抗体以外の抗５Ｔ４抗体、ならびに抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０（たとえば、ＲＩＴＵＸＡＮ^Ｒ、ＺＥＶＡＬＩＮ^Ｒ、ＢＥＸＸＡＲ^Ｒ）、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３３抗体（たとえば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ^Ｒ）、抗ＣＤ３３抗体／薬物接合体、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体（たとえば、Ｈｕ３Ｓ１９３、Ｍｔｈｕ３Ｓ１９３、ＡＧｍｔｈｕ３Ｓ１９３）、抗ＨＥＲ−２抗体（たとえば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ^Ｒ（トラスツズマブ）、ＭＤＸ−２１０、ＯＭＮＩＴＡＲＧ^Ｒ（パーツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４））、抗ＣＤ５２抗体（たとえば、ＣＡＭＰＡＴＨ^Ｒ）、抗ＥＧＦＲ抗体（たとえば、ＥＲＢＩＴＵＸ^Ｒ（セツキシマブ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ））、抗ＶＥＧＦ抗体（たとえば、ＡＶＡＳＴＩＮ^Ｒ（ベバシズマブ））、抗ＤＮＡ／ヒストン複合抗体（たとえば、ｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ）、抗ＣＥＡ抗体（たとえば、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、ＹＭＢ−１００３）ｈＬＭ６０９、抗ＣＤ４７抗体（たとえば、６Ｈ９）、抗ＶＥＧＦＲ２（またはキナーゼ挿入ドメイン含有レセプター、ＫＤＲ）抗体（たとえば、ＩＭＣ−１Ｃ１１）、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（たとえば、ＩＮＧ−１）、抗ＦＡＰ抗体（たとえば、シブロツズマブ）、抗ＤＲ４抗体（たとえば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ）、抗プロゲステロンレセプター抗体（たとえば、２Ｃ５）、抗ＣＡ１９．９抗体（たとえば、ＧＩＶＡＲＥＸ^Ｒ）および抗フィブリン抗体（たとえば、ＭＨ−１）との組み合わせにおいて用いることもできる。
【０１６０】
抗５Ｔ４抗体／薬物接合体は、治療計画の一部として細胞毒性剤の１つまたは複数の組み合わせとともに投与することができる。この目的のために有用な細胞毒性製剤は、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシンおよびビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）；ＡＢＶ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン）と交互のＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）と交互のＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニゾン）；ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタリビンおよびシスプラチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレジゾロン、ＨＤシタラビン、およびシスプラチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）；およびＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）；ＤＨＡＰ（シスプラチン、高用量シタラビンおよびデキサメタゾン）；ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン）；ＰＶ（シスプラチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）；ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）；ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）；ＩＭ（イホスファミド、マイトマイシン）；ＩＥ（イホスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イホスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イホスファミド、シスプラチン）；ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン、イホスファミド、エトポシド）；ビオレルビンおよびシスプラチン；カルボプラチンおよびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン）；ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；およびＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン、ビンクリスチン）を包含する。
【０１６１】
抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体は、全身性抗ガン剤、たとえば、エピチロン（ＢＭＳ−２４７５５０、Ｅｐｏ−９０６）、タキサンの組成変更物（Ａｂｒａｘａｎｅ、Ｘｙｏｔａｘ）、マイクロチューブリン阻害剤（ＭＳＴ−９９７、ＴＴＩ−２３７）との組み合わせ、あるいは標的化細胞毒素、たとえば、ＣＭＤ−１９３およびＳＧＮ−１５との組み合わせにおいて用いることができる。さらなる有用な抗ガン剤としては、ＴＡＸＯＴＥＲＥ^Ｒ、ＴＡＲＣＥＶＡ^Ｒ、ＧＥＭＺＡＲ^Ｒ（ジェムシタビン）、５−ＦＵ、ＡＶＡＳＴＩＮ^Ｒ、ＥＲＢＩＴＵＸ^Ｒ、ＴＲＯＶＡＸ^Ｒ、アナツモマブマフェナトクス、レトラゾール、ドセタキセル、およびアントラサイクリンが挙げられる。
【０１６２】
併用療法に関して、ヒト化抗５Ｔ４抗体および追加の治療または診断薬は、意図される治療または診断の実行に好適な時間枠内で投与される。従って、単剤を実質的に同時（すなわち、単一の処方として、あるいは数分または数時間以内で）あるいは任意の順序で連続的に投与することができる。たとえば、単剤処理は互いに約１年以内、たとえば、約１０、８、６、４、または２ヶ月以内、あるいは４、３、２または１週以内、あるいは約５、４、３、２または１日以内に投与することができる。抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体および第二の治療薬の投与は、好ましくは、それぞれ単独の投与よりも高い効果を惹起する。
【０１６３】
（実施例）
以下の実施例は本発明の様式を説明するために記載される。以下の実施例のある態様は、共同発明者らにより本発明の実施において功を奏することが見いだされるか、あるいは意図される技術に関して記載される。これらの実施例は、共同実験者の標準的試験実施を説明する。本開示および当業者の一般的レベルに照らして、以下の実施例は例示のみを意図し、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更、修飾、および修正を用いることができることは当業者には理解されるであろう。
【実施例１】
【０１６４】
正常および悪性組織における５Ｔ４発現
５Ｔ４抗原をガン治療の標的として考慮するために、正常および悪性組織上の５Ｔ４の分布を決定した。５Ｔ４は様々な腫瘍組織の表面上で高レベルで観察され、疾患の進行と相関するある場合において、ほとんどの正常細胞に実質的に存在しなかった。この発現特性は、５Ｔ４が癌免疫療法の妥当な標的であることを示唆した。
【０１６５】
標準的技術、たとえばウェスタンブロットに従って、ネズミＨ８抗５Ｔ４抗体を用いて正常および癌性組織における５Ｔ４の発現を分析した。様々な抗体および接合体の５Ｔ４に対する親和力をプラズモン共鳴またはＦＡＣＳ分析により検証した。Ｈ８はハイブリドーマ生成モノクローナルマウスＩｇＧ１抗体であって、これはＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ ９８／５５６０７およびフォースバーグ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ）ら、（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１９）：１２４４３０−１２４３６において記載されている。インビトロよびインビボ分析において正の対照として使用するために、５Ｔ４を発現するベクターをＣＴ２６マウス結腸癌およびＭＤＡＭＢ４３５ヒト乳ガン細胞中に形質転換することにより、再現可能に高レベルの５Ｔ４を発現する腫瘍細胞を構築した。図１および表１参照。
【０１６６】
試験した腫瘍サンプルには、扁平上皮／腺腫性肺ガン（非小細胞肺ガン）、浸潤性乳ガン、結腸直腸癌、胃ガン、扁平上皮子宮頸ガン、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛腫が含まれていた。５Ｔ４は、気管支、胸部、結腸、直腸、胃、頸部、子宮内膜、膵臓、卵巣、絨毛および精嚢の癌上で高レベルで検出された。５Ｔ４抗原（たとえば、同種または異種）の細胞表面分布は、腫瘍の種類に応じて様々であった。
【０１６７】
５Ｔ４抗原の細胞局在化を分析するために、５Ｔ４発現細胞を単層として培養し、次いでビオチニル化ネズミＨ８抗体に暴露した。細胞溶解後、アビジン結合により膜結合５Ｔ４抗原を分離し、非アビジン結合フラクションにおいて細胞内５Ｔ４を検出した。図２参照。
【０１６８】
細胞表面上に存在する５Ｔ４抗原の割合を定量化するために、ＣＴ２６／５Ｔ４のビオチニル化および対照培養物の抽出物をアビジンでコーティングされたビーズと混合した。ウェスタンブロット分析を上清中のタンパク質に関して行い、５Ｔ４の量を濃度測定により評価した。図３Ａ〜３Ｂ参照。サンプルの希釈およびＨ８反応性バンドの光学密度により決定される線形回帰直線の式に基づいて、式：１００＊（１−内部光学密度／全光学密度）を用いて、細胞膜上の５Ｔ４の量（５Ｔ４Ｍ）を計算した。５Ｔ４Ｍを３つの細胞種に関して計算した：ＣＴ２６／５Ｔ４、２４％；ＰＣ３−ＭＭ２、１５％；Ｎ８７、４１％。
【０１６９】
ＤＬＤ−１細胞（ヒト結腸癌細胞）、Ｎ８７細胞（ヒト胃ガン細胞）、ＰＣ３−ＭＭ２細胞（ヒト前立腺癌細胞）、およびＰＣ３細胞（ヒト前立腺癌細胞）上の５Ｔ４の膜局在化 を、ビオチニル化細胞培養物のアビジン除去後にウェスタンブロット分析により決定した。図４参照。ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト乳ガン細胞）上の５Ｔ４の膜局在化をＦＡＣＳ分析により決定した。図５Ａ〜５Ｂ参照。５Ｔ４のＮ８７、ＰＣ１４ＰＥ６、およびＮＣＩ−Ｈ１５７細胞上の膜局在化をＦＡＣＳ分析により決定した。図６参照。５Ｔ４抗原のＰＣ３−ＭＭ２細胞上の膜局在化は組織サンプル中の組織化学検出によっても決定された。
【０１７０】
５Ｔ４抗原に結合した後にＨ８抗体が取り込まれるかどうかを評価するために、細胞表面で検出される抗体の量を数時間にわたって確認した。Ｈ８がＣＴ２６／５Ｔ４細胞の表面から消失することは、５Ｔ４／Ｈ８複合体が取り込まれたことを示す。図７参照。
【０１７１】
表１は、腫瘍細胞における５Ｔ４発現をまとめる。結腸直腸癌、胃ガン、および卵巣癌において、５Ｔ４の発現は、疾患の進行と直接的に関連する。乳ガンにおいて、転移性小節上で５Ｔ４染色の増大した強度が観察された。しかしながら、一次腫瘍における５Ｔ４発現と疾患の段階の間に相関関係は見いだされなかった。表２参照。
【０１７２】
【表１】

【０１７３】
【表２】

【実施例２】
【０１７４】
抗５Ｔ４−カリケアマイシン（ＣＭ）接合体の調製およびキャラクタライゼーション
抗体／薬物接合体の調製のためにネズミＨ８抗体を使用した。接合体を次いでインビトロで、ヒト５Ｔ４抗原と結合し、ガン細胞の細胞崩壊を誘発する能力について試験した。３つのリンカー：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸 （ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）および４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）を用いて、カリケアマイシンをＨ８に結紮した。Ｈ８−カリケアマイシン接合体中のカリケアマイシンの量を増大させるために、たとえば、ＰＥＧ−ＳＰＡ、ＰＥＧ−ＳＢＡ、およびＰＥＧ−ビス−マレイミドを用いて、カリケアマイシンと接合させる前に抗体をＰＥＧに接合させた。表４において、Ｈ８−カリケアマイシン接合体のそれぞれの効率がＥＤ５０として記載され、これは未処理対照に対して細胞培養物の５０％減少を引き起こす接合体または遊離薬物として供与されるカリケアマイシンの量である。生体染色色素（ＭＴＳ）を用いて細胞の数を測定した。
【０１７５】
ＡｃＢｕｔ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸）酸加水分解可能なリンカーによるカリケアマイシンのＨ８に対する直接結合は、困難であることが判明し、主に凝集した接合体および抗体あたり少量（約１モル／モル）のＣＭを有する接合体を生成した。結果として得られる複合体の低レベルの接合および凝集性はこれらの複合体を使用に不適当にした。
【０１７６】
安定なアミドリンカー（４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸）によるカリケアマイシンのＨ８に対する結合の結果、５Ｔ４陰性カウンターパートと比較した場合、５Ｔ４発現癌に対して２００倍細胞毒性の高い接合体が得られた。図８および表４参照。この選択性にもかかわらず、接合体は遊離カリケアマイシンよりも細胞毒性が低く、培地１ｍｌあたり５００ｎｇカリケアマイシンの濃度で細胞培養物を完全に破壊できなかった。
【０１７７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｈ８、カリケアマイシン、およびＡｃＢｕｔリンカーを使用して調製された接合体は、凝集物を形成せず、Ｈ８ １モルあたり約６モルカリケアマイシンの装填量を有していた。試験された数種のＰＥＧは、Ｈ８の５Ｔ４に対する結合を５０％〜９０％減少させた。表３参照。
【０１７８】
【表３】

＊５Ｔ４に対する結合のフラクションは抗体修飾後になくなった。
【０１７９】
結合の減少にもかかわらず、２つのＨ８ＰＥＧ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ接合体、Ｈ８ＰＥＧ２Ｋ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨおよびＨ８ＰＥＧｍａｌ２−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、インビトロで５Ｔ４発現細胞の細胞崩壊の誘発に選択的に有効であることが証明された。選択的細胞毒性は、約３０％の結合活性しか保持しないＨ８−カリケアマイシン接合体について観察された。Ｈ８ＰＥＧ２Ｋ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨも、遊離カリケアマイシンよりも細胞毒性が高く、培地１ｍｌあたり５００ｎｇカリケアマイシンの濃度で細胞培養物を完全に破壊した。図９Ａ〜９Ｂおよび表４参照。
【０１８０】
【表４】

【実施例３】
【０１８１】
Ｈ８−カリケアマイシン接合体の抗腫瘍効果
皮下異種移植片を使用
インビボでＨ８−カリケアマイシン接合体の細胞毒性を評価するために、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現するヒト乳ガン細胞）、ＮＣＩ−Ｈ１５７細胞（ヒト非小細胞肺ガン細胞）、ＰＣ１４ＰＥ６細胞（ヒト非小細胞肺ガン細胞）、またはＮ８７細胞（ヒト胃ガン細胞）の皮下注射によりヌードマウスにおいて腫瘍を調製した。腫瘍を有するマウスに合計３回、４日間隔で、すなわち、１、５、および９日に腹腔内注射することによりＨ８−カリケアマイシン接合体および対照化合物を投与した。Ｈ８−カリケアマイシン接合体は、すべての種類の腫瘍の成長を阻害した。図１０、１１Ａ〜１１Ｂ、１２、１３Ａ〜１３Ｂ、および１４参照。
【実施例４】
【０１８２】
Ｈ８−カリケアマイシン接合体の抗腫瘍効果
ヒト肺ガンの同所移植モデルを使用
Ｈ８−カリケアマイシン接合体を有する抗体のターゲティング能力をさらに評価するために、基本的に、オン（Ｏｎｎ）ら、（２００３）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ９（１５）：５５３２−５５３９ｎより記載されているようにして、非小細胞および小細胞癌の同所移植モデルを使用した。簡単に言うと、ヒト肺腺癌（ＰＣ１４ＰＥ６）細胞をヌードマウスの尾静脈中に注射し、これは次いで移動して、肺において腫瘍を形成した。腫瘍は肺柔組織において充実性結節として現れ、懸濁された腫瘍細胞を含有する血性胸水の原因となった。図１５Ａ〜１５Ｇ参照。対照化合物およびＨ８−カリケアマイシン接合体の注射を腹腔内注射により腫瘍を有するマウスに、腫瘍細胞の注射後６日に開始して、合計３回、４日間隔で、すなわち６、１０、および１４日に投与した。Ｈ８−カリケアマイシン接合体の投与の結果、腫瘍を有する動物の生存率が増加した。図１６参照。未接合Ｈ８抗体または対照接合体ＣＭＡの投与は、胸水を減少させなかった。しかしながら、ＣＭＳは腫瘍を有するマウスの平均生存率を若干増大させた。図１７参照。
【実施例５】
【０１８３】
ヒト化抗５Ｔ４抗体の調製およびキャラクタライゼーション
ネズミＨ８抗体およびヒト抗体配列から誘導される配列を使用して、キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体を調製した。本発明の代表的な抗体の配列を図２７Ａ〜２７Ｆに示す。
【０１８４】
ネズミＨ８重鎖および軽鎖可変領域配列およびヒト定常領域配列を有するキメラＨ８抗体を構築した（図２７Ａ〜２７Ｂ）。キメラおよびヒト化Ｈ８抗体を調製するために使用された代表的なヒト定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトカッパ、およびヒトＩｇＧ４を有するものを包含する。突然変異は任意に、定常領域エフェクター機能、たとえば、細胞依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、補体溶解、および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を変更するために導入された。図２６Ａ〜２６Ｂ参照。ＩｇＧ定常領域をコード化する配列のクローニングに関して、イントロン配列は任意に欠失させることができる。実施例６参照。１つの抗体鎖がネズミＨ８可変領域（キメラ抗体におけるような）を含み、他の抗体鎖がヒト化Ｈ８可変領域を含む抗体、すなわち半ヒト化抗体を調製した（図２７Ｃ）。
【０１８５】
ヒトまたは実質的ヒトフレームワーク領域上にグラフトされたネズミＨ８のＣＤＲを含めるためにヒト化Ｈ８可変領域を構築した。配列多様性ならびに構造ループ領域の位置に基づいたＡｂＭ定義を用いてネズミＨ８抗体のＣＤＲを同定した。ヒトアクセプターフレームワークをこれらがネズミＨ８抗体のフレームワーク領域と実質的に類似していること、または可変領域サブファミリーのコンセンサス配列と最も類似しているということに基づいて選択した。図１８〜２３参照。さらにヒトにおけるフレームワークの場所も考慮するて、広範囲に表された配列が数の少ない配列よりも好ましかった。たとえば、抗原接着に関与すると考えられるネズミ残基および／または抗原結合部位の構造的完全性に関与する残基を回復するために、ヒトフレームワークアクセプター配列のさらなる突然変異が行われた。アミノ酸配列をＣＨＯ細胞のコドン選択について最適化するために、また制限酵素部位を除去するために最適化した。ペプチド構造予想プログラムを使用して、ヒト化可変重および軽鎖配列を分析して、ヒト化デザインにより導入された翻訳後タンパク質修飾部位を同定し、回避した。この方法を使用して、３バージョンのヒト化Ｈ８可変領域を構築した。バージョン１は抗体一体性および抗原結合に重要であると考えられるフレームワーク配列内の位置にネズミＨ８残基を保持する。バージョン２はＣＤＲにおいてのみネズミ残基を保持する。バージョン３は、コンセンサス可変領域配列を重鎖アクセプターフレームワークとして使用する以外はバージョン２と同様である。バージョン３の軽鎖可変領域はバージョン２抗体のものと同じである。図２４Ａ〜２４Ｃ参照。
【０１８６】
ＳＭＡＲＴ^Ｒ ｃＤＮＡ合成（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とそれに続いてＰＣＲ増幅を用いて、Ｈ８抗５Ｔ４抗体可変重および軽領域をクローンした。オリゴ（ｄＴ）およびＳＭＡＲＴ^Ｒ ＩＩＡオリゴとＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、Ｈ８ハイブリドーマ細胞から単離された１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、ＳＭＡＲＴ^Ｒ ＩＩＡオリゴ配列にアニールするプライマーおよびヒト定常領域特異性プライマー（軽鎖についてはマウスカッパ、重鎖についてはマウスＩｇＧ１）とＶＥＮＴ^Ｒポリメラーゼを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。重鎖および軽鎖ＰＣＲ生成物をｐＥＤ６発現ベクター中にサブクローンし、核酸配列を決定した。この方法は、ＤＮＡ配列の予備知識が必要でない点で有利である。加えて、結果として得られるＤＮＡ配列は縮重ＰＣＲプライマーの使用により変更されない。
【０１８７】
ネズミＨ８のヌクレオチド配列を公開されたヌクレオチド配列と比較した場合に、いくつかの相違点が認められる（ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ ９８／５５６０７およびフォースバーグ（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ）ら、（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１９）：１２４４３０−１２４３６）。指摘された相違は、タンパク質配列を変更しない。重鎖可変領域のアミノ酸１３３のコドンにおいて存在するＴ（公開）対Ｃの相違は、それぞれコドンＡＣＴおよびＡＣＣと相関する。ＡＣＴおよびＡＣＣはどちらもアミノ酸トレオニン（Ｔ）をコードする。重鎖可変領域のアミノ酸１３８のコドンにおいて存在するＴ（公開）対Ｃの相違は、それぞれコドンＴＣＴおよびＴＣＣと相関する。ＴＣＴおよびＴＣＣはどちらもアミノ酸セリン（Ｓ）をコードする。軽鎖可変領域のアミノ酸１２６のコドンにおいて存在するＡ（公開）対Ｃの相違は、それぞれコドンＡＴＡおよびＡＴＣと相関する。ＡＴＡおよびＡＴＣはどちらもアミノ酸イソロイシン（Ｉ）をコードする。
【０１８８】
ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域の構築に関して、ＤＰＫ２４生殖細胞系配列ＶＬ−ＩＶ／Ｂ３座をアクセプターフレームワークとして使用した。ＤＰＫ２４配列はネズミＨ８軽鎖可変領域と６８％同一であり、ネズミＨ８軽鎖フレームワーク配列と比較した場合に、１８アミノ酸置換を含有する。ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１はネズミＨ８残基Ｓ４３、Ｓ４９、およびＦ８７を保持していた。発現を増大させることが確認された突然変異は、Ｆ１０Ｓ、Ｔ４５Ｋ、Ｉ６３Ｓ、Ｙ６７Ｓ、Ｆ７３Ｌ、およびＴ７７Ｓを含む。図１８参照。
【０１８９】
生殖細胞系クローンサブグループＶκＩＩＩおよびＶκＩの軽鎖可変領域のフレームワーク領域を用いてヒト化抗体を構築した。図１９〜２０参照。特に、軽鎖ＶκＩＩＩサブグループフレームワーク領域を含む抗体および開示されたヒト化Ｈ８抗体バージョン１は、どちらも高度に発現され、安定である。ＶκＩＩＩ生殖細胞系フレームワークＬ１６、Ｌ２、Ａ２７、Ｌ６、Ｌ１０、およびＬ２５に基づくＨ８軽鎖可変領域のヒト化に関して９の突然変異（Ｔ７Ｓ、Ｄ１７Ｅ、Ｖ１９Ａ、Ｓ５０Ｙ、Ｉ６３Ｓ、Ｙ６７Ｓ、Ｆ７３Ｌ、Ｔ７７Ｓ、およびＦ８７Ｙ）がヒト化Ｈ８抗体バージョン２中に導入され、結合親和性を損なわない。同様に、サブグループＶκＩからの生殖細胞系フレームワークに基づくＨ８軽鎖可変領域のヒト化に関して１０の突然変異（Ｔ７Ｓ、Ｆ１０Ｓ、Ｖ１９Ａ、Ｔ４６Ｋ、Ｓ５０Ｙ、Ｉ６３Ｓ、Ｔ６７Ｓ、Ｆ７３Ｌ、Ｔ７７Ｓ、およびＦ８７Ｙ）は、結合親和力に影響を及ぼすことなくヒト化Ｈ８抗体中に導入される。加えて、Ｈ８軽鎖可変領域の１、９、１０、１２、１５、２２、４３、４５、および８３位のアミノ酸の置換は抗原結合に影響を及ぼさない。
【０１９０】
ヒト化Ｈ８重鎖可変領域の構築に関して、ＤＰ７５生殖細胞系配列ＶＨ−Ｉ／１−０２座をアクセプター配列として使用した。ＤＰ７５配列は、ネズミＨ８重鎖可変領域と６５％同一であり、ネズミＨ８重鎖フレームワーク配列と比較した場合に２８のアミノ酸置換を含有する。ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１は、重鎖および軽鎖可変領域との抗原接着に重要であるネズミＨ８残基Ｋ３８およびＳ４０、ならびに可変領域およびＣＤＲ２との抗原接着に重要であるＩ４８を保持していた。図２１参照。別法として、重鎖可変領域サブグループコンセンサス配列を使用して、ヒト化Ｈ８重鎖バージョン３を調製した。コンセンサス配列は、ネズミＨ８重鎖フレームワーク配列と比較した場合に、２５のアミノ酸置換を含有する。図２２〜２３参照。
【０１９１】
重複するオリゴヌクレオチドをアニールし、ヒト抗体定常領域を含有するｐＥＤ６発現ベクター中にこれらを結紮することにより、ヒト化Ｈ８重鎖および軽鎖可変領域を構築した。ＰＣＲ突然変異誘発または部位特異性突然変異誘発を用いてもヒト化重鎖および軽鎖可変領域を構築することができる。オリゴヌクレオチドのデザインは、ＣＨＯ細胞発現のコドン使用の最適化および制限酵素部位の除去を含んでいた。Ｂｇｌ ＩＩ制限部位をＨ８可変重鎖領域から除去した。ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１を合成するために使用されるオリゴヌクレオチドは配列番号２７〜３２に記載される。ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン２を合成するために使用されるオリゴヌクレオチドは配列番号３３〜３６に記載される。ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１を合成するために使用されるオリゴヌクレオチドは配列番号３７〜４４に記載される。ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン２を合成するために使用されるオリゴヌクレオチドは配列番号３７、３９〜４２、および４４〜４６に記載される。ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン３を合成するために使用されるオリゴヌクレオチドは配列番号３７、４０、４１、および４４〜４８に記載される。
【０１９２】
ヒト化Ｈ８可変領域配列の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴｐ検索（タンパク質クエリー配列について）は、期待値＝１０、ワード長＝３、低複雑度フィルター、およびＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスのデフォルトパラメータを用いて行われ、存在＝１１、および伸長＝１のギャップコストが許容された。期待値＝１０、ワード長＝１１、および低複雑度フィルターを使用してＢＬＡＳＴｎ検索（ヌクレオチドクエリー配列について）が行われた。ＢＬＡＳＴ検索の結果をクエリー配列に関連する配列のリストとして報告し、Ｅ値の順にランク付けし、この値はデータベースにおいて特定された適合の統計的有意性の指標である。ＢＬＡＳＴ分析に用いられるヒト化可変領域配列に最も密接に関連する配列は、表５（ＢＬＡＳＴｐ）および表６（ＢＬＡＳＴｎ）に特定されている。ＢＬＡＳＴの結果および最も密接に関連する対象配列と各クエリー配列の整列を図２５Ａ〜２５Ｏに示す。
【０１９３】
【表５】

【０１９４】
【表６】

【０１９５】
キメラおよびヒト化抗体を発現できることを確認するために、本発明の代表的な抗５Ｔ４抗体をコード化するプラスミドでＣＯＳ−１細胞を一時的にトランスフェクトした。４８時間後、細胞培地を分析して、ＥＬＩＳＡを用いてヒトＩｇＧ抗体のレベルを決定した。表７に示すように、抗５Ｔ４抗体のすべてが発現された。
【０１９６】
【表７】

ｍＶＨ：ネズミＨ８重鎖可変領域
ｍＶＬ：ネズミＨ８軽鎖可変領域
ｈＶＨ１：ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１
ｈＶＬ１：ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１
ｈＶＨ２：ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン２
ｈＶＬ２：ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン２
【０１９７】
キメラおよびヒト化Ｈ８抗体の結合特異性および親和性を評価するために、ＣＭ５チップ上に固定化されたヒト化５Ｔ４抗原を用いてＢＩＡＣＯＲＥ^Ｒ分析を行った。ＢＩＡＣＯＲＥ^Ｒ技術は、前記層上に固定化された５Ｔ４抗原との抗体の結合による表面層での屈折率における変化を利用する。結合は、表面から屈折するレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により検出される。シグナル動力学オンレートおよびオフレートの分析により、非特異性および特異性相互作用間の区別が可能になる。使用される抗体の濃度は、１２．５ ｎＭ〜２００ ｎＭの範囲であった。表８参照。キメラ、半ヒト化、およびヒト化Ｈ８抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥ^Ｒ分析におけるネズミＨ８抗体と同様に挙動した。
【０１９８】
【表８】

ｍＶＨ：ネズミＨ８重鎖可変領域
ｍＶＬ：ネズミＨ８軽鎖可変領域
ｈＶＨ１：ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１
ｈＶＬ１：ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１
ｈＶＨ２：ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン２
ｈＶＬ２：ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン２
ｈＶＨ３：ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン３
【０１９９】
結合の選択性を評価するために、ＦＡＣＳ分析を行って、表示された濃度で、ネズミＨ８、Ｈ８のキメラバージョン、およびＨ８のヒト化バージョンを用いて、ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞上またはＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞上で５Ｔ４抗原を検出した。すべての抗体は、５Ｔ４発現細胞に対して選択的結合を示す。図２８Ａ〜２８Ｂ参照。
【０２００】
以下のように競合性結合分析を使用して、キメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８バージョン１〜３の結合性を決定した。ＥＬＩＳＡプレートをヒト５Ｔ４抗原でコーティングした。各ウェルに、１００μｌの１μｇ／ｍｌＰＢＳ−ＣＭＦ（ｐＨ７．２）中５Ｔ４抗原を添加した。プレートを一夜４℃でインキュベートした。抗原でコーティングした後、プレートを０．０２％ＰＢＳ−ＣＭＦ中カゼインのブロッキング溶液（ｐＨ７．２）中で２〜４時間、室温で洗浄した。２５０ｎｇ／ｍｌキメラＨ８抗体の分析緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ ＢＳＡ ＋ ０．０２％ ＴＷＥＥＮ^Ｒ−２０）中連続希釈を調製し、コーティングされ、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１〜２時間インキュベートした。プレートを２００μｌの０．０３％ＰＢＳ中ＴＷＥＥＮ^Ｒ−２０で４回洗浄した。ウェルごとに１００μｌのＢＩＯＦＸ^Ｒ ＴＭＢ（Ｂｉｏｆｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ． ｏｆ Ｒａｎｄａｌｌｓｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を添加した後、シグナルを１０〜１５分間室温で生成させた。１００μｌ／ウェルの０．１８Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより、反応を停止させた。穏やかに撹拌しながら、すべてのインキュベーションおよび洗浄工程を行った。ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで読み取った。ＯＤ_４５０（平均された重複データポイント）をビオチニル化抗体濃度の関数としてプロットすることにより、抗原に対するビオチニル化抗体結合のＥＤ５０を測定した。前記のようなコーティングされ、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートを調製し、かかるプレートに試験抗体の連続希釈を計算されたＥＤ５０濃度のビオチニル化キメラＨ８抗体とともに移すことにより、競合性ＥＬＩＳＡを行った。分析緩衝液中１：１０，０００に希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰを用いてビオチン標識を増幅し、続いて前記のようなシグナル発生、定量化を行った。図２９参照。
【０２０１】
５Ｔ４抗体との結合後にヒト化抗５Ｔ４抗体が取り込まれるかどうかを評価するために、実施例１に記載されるようなＦＡＣＳ分析を用いて、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の細胞表面で検出される抗体の量を測定した。キメラＨ８抗体およびＨ８抗体／カリケアマイシン接合体に関して観察されるように、ヒト化Ｈ８抗体は５Ｔ４発現細胞により取り込まれた。図３０参照。
【実施例６】
【０２０２】
ヒト化Ｈ８抗体の一時的および安定な発現
ヒト化Ｈ８抗体の大規模産生のために、ヒト化Ｈ８バージョン１〜３を発現する安定なＣＨＯ細胞系を調製した。初期段階として、ＣＯＳ−１細胞においてコード化ベクターを一時的発現した後に抗体産生のレベルを評価した。ヒト化Ｈ８重鎖および軽鎖をコード化するＤＮＡをそれぞれビシストロン発現ベクターｐＳＭＥＤ２（メトトレキサート耐性）およびｐＳＭＥＮ２（ネオマイシン耐性）中にサブクローンした。３つのヒト化Ｈ８抗体を類似したレベルで発現させ、このレベルはキメラＨ８抗体について観察されるよりも高かった。図３１参照。
【０２０３】
ＣＨＯ細胞における発現に関して、３つのイントロンを除去することにより、ヒトＩｇＧ４突然変異定常領域をさらに最適化し、この結果、ヒト化Ｈ８抗体のさらに高い発現および安定性が得られた。ｐＳＭＥＤ２＿ｈｕＨ８重鎖およびｐＳＭＥＮ２＿ｈｕＨ８軽鎖を前適応させたＣＨＯ Ｄｕｋｘ細胞系１５３．８中に同時遺伝子導入することにより、ヒト化Ｈ８抗体を発現するＣＨＯ細胞系を調製した。５０ｎＭメトトレキサート中で選択された、リードクローンの発現レベルは１７ ｍｇ／リットル／２４時の平均力価および１０μｇ／１０^６細胞／２４時の平均細胞増殖率を有していた。５０ｎＭメトトレキサートおよびＧ４１８（１ ｍｇ／ｍｌ）中で選択されたリードプールは、８ ｍｇ／リットル／２４時の平均力価を有し、その平均細胞増殖率は６μｇ／１０^６細胞／２４時であった。
【実施例７】
【０２０４】
ヒト化Ｈ８カリケアマイシン接合体の調製およびキャラクタライゼーション
本質的に実施例２に記載されているようにして、ヒト化Ｈ８抗体をカリケアマイシンに接合させた。添加剤デオキシコレートおよびデカン酸ナトリウムはそれぞれ低レベルの未接合タンパク質および凝集物とともに接合体を産生した。表９参照。
【０２０５】
【表９】

【０２０６】
本質的に実施例２に記載されているようにして、プラズモン共鳴により、ネズミＨ８、ヒト化Ｈ８、およびヒト化Ｈ８カリケアマイシン接合体の結合動力学を比較した。接合体サンプルは、タンパク質１ｍｇあたり６１μｇのＣａｌｉｃｈＤＭＨ、１％の遊離抗体、および１．４ ％の凝集物を含有していた。ヒト化Ｈ８バージョン２−カリケアマイシン接合体の結合特性は、ネズミＨ８−カリケアマイシン接合体に匹敵し（表１０）、このことは、抗体のヒト化も、カリケアマイシンへの接合も、５Ｔ４に対する結合に影響を及ぼさないことを示す。これらの結果は、フローサイトメトリーを使用して、５Ｔ４発現腫瘍細胞上の抗体および接合体の結合を決定することにより、独立して確認された。
【０２０７】
【表１０】

【実施例８】
【０２０８】
インビトロでのヒト化Ｈ８カリケアマイシン接合体の抗腫瘍効果
インビトロでのヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体の細胞毒性を評価するために、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現するヒト乳ガン細胞）およびＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞（対照細胞）を抗体−カリケアマイシン接合体または遊離カリケアマイシンの存在下、本質的にＢｏｇｈａｅｒｔら、（２００４）、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１０：４５３８−４５４９に記載されているようにして培養した。表１１において、各薬剤の細胞毒性はＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として記載され、この値は、未接合対照に対して細胞培養物の５０％減少を引き起こす接合体または遊離薬剤として投与されたカリケアマイシンの量である。培養物中の細胞の数は、薬物を９６時間暴露後に生体染色色素（ＭＴＳ）を用いて決定された。ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞に添加された場合に、ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞に添加された場合よりも、ＥＤ５０または接合体は一貫して低かった（３倍から６倍）。
【０２０９】
球状成長に好適な方法で、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４およびＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞を用いて、ヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体の細胞毒性を評価した。このモデルは、発現する腫瘍の条件に似て、細胞毒性薬に対して特有の高い耐性を有する。このモデルのもう一つ別の利点は、これがさらに長い培養期間を可能にすることである。抗体−カリケアマイシン接合体または遊離カリケアマイシンの存在下で１４４時間培養後、各回転楕円体の寸法を測定した。表１２に示すように、ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨのＥＤ５０は、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞に添加された場合、ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞に添加された場合よりも６倍低かった。
【０２１０】
いずれかの分析法を使用すると、ヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体は、遊離カリケアマイシンまたはＣＭＡ−６７６、抗ＣＤ３３−カリケアマイシン接合体と比較した場合に、細胞毒性の誘発および球状成長の阻害に実質的にさらに有効であった。ＰＣ１４ＰＥ６細胞の選択的細胞毒性は、コロニー形成分析および球体分析において明らかにすることができるが、生体染色色素分析においては明らかにできない。結果は、接合体の細胞毒性は細胞により発現された５Ｔ４の量と直接関係することを示す。加えて、接合体は遊離薬物（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）または対照接合体（ＣＭＡ−６７６）よりも有効である。
【０２１１】
【表１１】

ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：遊離カリケアマイシン
ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を使用してカリケアマイシンに接合させたヒト化Ｈ８抗体
ＣＭＡ−６７６：カリケアマイシンに対する抗ＣＤ３３抗体接合体
実験Ａ ＆ Ｂ：別の日に行われた実験
【０２１２】
【表１２】

ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：遊離カリケアマイシン
ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合させたヒト化Ｈ８抗体
ＣＭＡ−６７６：カリケアマイシンに対する抗ＣＤ３３抗体接合体
【実施例９】
【０２１３】
ヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体の抗腫瘍効果
皮下異種移植片を使用
インビボでヒト化 Ｈ８−カリケアマイシン接合体の細胞毒性を評価するために、Ｎ８７細胞（ヒト胃ガン細胞）、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現するヒト乳ガン細胞）、またはＰＣ１４ＰＥ６細胞（ヒト非小細胞肺ガン細胞）の皮下注射によりヌードマウスにおいて腫瘍を調製した。ヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体および対照薬剤を腹腔内注射により腫瘍を有するマウスに合計３回、４日間隔で、すなわち、約０．０８ ｃｍ^３（図３３Ａ〜３３Ｃ、３４Ａ〜３４Ｃ、３５Ａ〜３５Ｃ、および３５Ｅ）のサイズに達した腫瘍の選択後１、５、および９日、あるいは１．０８ ｃｍ^３（図３５Ｄ）のサイズに達した腫瘍の選択後１９、２３、および２７日に投与した。一つの実験において、腫瘍が再発した動物を処置した（図３５Ｅ）。合計１１匹の動物をヒト化 Ｈ８−カリケアマイシン接合体で処置し、１３匹の動物を表示された対照物質で処置した。
【０２１４】
治療に対する反応率を初回投与後９９日に測定した。完全反応率（ＣＲ）は、グループの平均初期腫瘍体積以下の腫瘍サイズの生存マウスの割合である。部分反応率（ＰＲ）は、グループの平均初期腫瘍体積の２倍以下の腫瘍サイズの生存マウスの割合である。合計反応（ＴＲ）はＣＲおよびＰＲの合計である。無反応（ＮＲ）は（１００−ＴＲ）として計算される。図３３Ｃ、３４Ｃ、および３５Ｃ参照。ヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体はあらゆる種類の腫瘍の成長を阻害した。図３３Ａ〜３３Ｂ、３４Ａ〜３４Ｂ、３５Ａ〜３５Ｄ、および３６Ａ〜３６Ｂ参照。ＰＣ１４ＰＥ６細胞を阻害するために必要なｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ、すなわち、最小有効用量は、最大非致死量よりも少なくとも１６倍低い。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】発ガン性細胞系における５Ｔ４発現を評価するためのウェスタンブロット分析の結果を示す。ウェスタンブロットは、培養された細胞の溶解物ならびにヌードマウスにおける同種移植腫瘍から生成した。ＣＴ２６／ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子を発現するＣＴ２６マウス結腸癌細胞；ＣＴ２６／５Ｔ４：５Ｔ４抗原を発現するＣＴ２６細胞。
【図２】細胞系をビオチンにさらした後のＣＴ２６／５Ｔ４およびＣＴ２６／ｎｅｏサンプルのウェスタンブロット分析の結果を示す。サンプルＡは、ビオチニル化され、アビジンと結合できる５Ｔ４のフラクションである。サンプルＳは、細胞抽出物をアビジンで沈殿させた後の上清中に存在する５Ｔ４の残存量である。これは、ビオチニル化されず、したがって細胞プラズマ中に位置するフラクションを表す。５Ｔ４は、膜（Ａ）および細胞内（Ｓ）フラクションの両方において検出される。
【図３Ａ−３Ｂ】細胞内５Ｔ４抗原対膜結合５Ｔ４抗原を定量化するための実験の結果を示す。図３Ａは表示されたように希釈されたＣＴ２６／５Ｔ４細胞を用いて調製されたウェスタンブロットを示す。ビオチニル化サンプルは、アビジンを用いたビオチニル化サンプルの除去後のサンプル中に存在する５Ｔ４の残存量、すなわち、非膜結合５Ｔ４の量を表す。全サンプルは、残存量およびアビジンにより除去された量の合計、すなわち、非膜結合および膜結合５Ｔ４抗原の量を表す。図３Ｂは、サンプルの希釈およびＨ８反応性バンドの光学密度により決められる線形回帰曲線を示す。膜結合５Ｔ４抗原の量は、全サンプルの光学密度とアビジン除去後のビオチニル化サンプルの光学密度の間の差として表される。実施例１において記載するように、細胞膜上の５Ｔ４（５Ｔ４Ｍ）の量は、ＣＴ２６／５Ｔ４細胞中の全細胞５Ｔ４の２４％と計算された。
【図４】ＣＴ２６／５Ｔ４細胞、ＤＬＤ−１細胞（ヒト結腸癌細胞）、Ｎ８７細胞（ヒト胃ガン細胞）、ＰＣ３−ＭＭ２細胞（ヒト前立腺癌細胞）、およびＰＣ３細胞（ヒト前立腺癌細胞）の細胞表面上の５Ｔ４抗原を示すウェスタンブロット結果を示す。
【図５Ａ−５Ｂ】５Ｔ４抗原の膜局在化を検出するためのＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞において、Ｈ８シグナルは、対照ＩｇＧと一致する（図５Ａ）。対照的に、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞において、Ｈ８抗体から得られるシグナルは、対照抗体よりも１００倍以上大きく、このことは、細胞膜上に５Ｔ４が存在することを示す（図５Ｂ）。黒色：５Ｔ４抗原の検出、灰色：対照ＩｇＧによる検出。
【図６】Ｎ８７（ヒト胃ガン細胞）、ＰＣ１４ＰＥ６（ヒト肺ガン細胞）、およびＮＣＩ−Ｈ１５７細胞（ヒトは肺ガン細胞）の膜上の５Ｔ４抗原を検出するためのＦＡＣＳ分析の結果を示す。それぞれの場合において、Ｈ８抗体から得られるシグナルは対照抗体よりも約１０倍大きく、このことは、細胞膜上の５Ｔ４の存在を示す。灰色：５Ｔ４抗原の検出、黒色：対照ＩｇＧによる検出。
【図７】ＣＴ２６／５Ｔ４細胞の細胞表面上および細胞培養培地中で検出される、蛍光標識されたＨ８抗体の測定を表す折れ線グラフである。膜結合抗体の平均蛍光は、時間の関数として減少した。抗体は培地中に放出されなかった。これらの結果は、Ｈ８抗体／５Ｔ４複合体がＣＴ２６／５Ｔ４細胞により取り込まれないことを示す。
【図８】リンカーとして４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を使用してカリケアマイシンに接合したＨ８抗体を含む抗５Ｔ４接合体にさらされたＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の選択的細胞崩壊を示す折れ線グラフである。
【図９Ａ−９Ｂ】リンカーとして４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を使用してカリケアマイシンに接合されたＰＥＧ化されたＨ８抗体を含む抗５Ｔ４接合体（Ｈ８ＰＥＧ２Ｋ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）にさらされた５Ｔ４発現細胞の選択的細胞崩壊を示す折れ線グラフである。実施例２参照。図９Ａは、５Ｔ４抗原が欠損したＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞は、遊離カリケアマイシンによるのとほぼ等しくＨ８ＰＥＧ２Ｋ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨによる細胞崩壊を受けやすい。図９Ｂは、遊離カリケアマイシンと比較した、Ｈ８ＰＥＧ２Ｋ−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨにさらされた５Ｔ４発現細胞の向上された細胞崩壊を示す。
【図１０】表示されたリンカーを用いて調製されたＨ８−カリケアマイシン接合体にさらされたＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４腫瘍の成長阻害を示す折れ線グラフである。ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；Ｈ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体；Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：３−アセチルフェニル酸性酸を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体；Ｈ８−Ａｍｉｄｅ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体；Ｈ８ＰＥＧ（ｍａｌ２）−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸 （ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合されたＰＥＧ化Ｈ８抗体。
【図１１Ａ−１１Ｂ】対照物質（図１１Ａ）またはＨ８−カリケアマイシン接合体（図１１Ｂ）の存在下でのＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４腫瘍の成長阻害を示す折れ線グラフである。ＣＭＡ、カリケアマイシンに接合した抗ＣＤ３３抗体（負の対照、すなわち、標的とされる抗原が欠損した細胞による接合体の腫瘍取り込みによる細胞毒性を評価するために使用）；ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；Ｈ８＋ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：Ｈ８抗体およびカリケアマイシンの混合物（未接合）；ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：遊離カリケアマイシン；Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：３−アセチルフェニル酸性酸を用いてカリケアマイシンに接合したＨ８抗体；Ｈ８−アミド−ＣａｌｉｃｈＤＭＡ：４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を用いてカリケアマイシンに接合したＨ８抗体。
【図１２】表示されたＨ８−カリケアマイシン接合体または対照物質にさらされたＮＣＩ−Ｈ１５７腫瘍の成長阻害を示す折れ線グラフである。Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：３−アセチルフェニル酸性酸を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体；Ｈ８−アミド−ＣａｌｉｃｈＤＭＡ：４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体；ＣＭＡ：カリケアマイシンに接合された抗ＣＤ３３抗体（負の対照）；ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；Ｈ８：未接合Ｈ８抗体。
【図１３Ａ−１３Ｂ】対照物質（図１３Ａ）またはＨ８−カリケアマイシン接合体（図１３Ｂ）の存在下でのＮ８７腫瘍の成長阻害を示す折れ線グラフである。ＣＭＡ：カリケアマイシンに接合した抗ＣＤ３３抗体（正の対照）；ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；Ｈ８＋ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：Ｈ８抗体およびカリケアマイシンの混合物（未接合）；ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：遊離カリケアマイシン；Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：３−アセチルフェニル酸性酸を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体；Ｈ８−アミド−ＣａｌｉｃｈＤＭＡ：４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を用いてカリケアマイシンに接合されたＨ８抗体。
【図１４】Ｈ８／カリケアマイシン接合体または対照物質にさらされたＰＣ１４ＰＥ６腫瘍の成長阻害を示す折れ線グラフである。Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：３−アセチルフェニル酸性酸を用いてカリケアマイシンに接合させたＨ８抗体；Ｈ８−アミド−ＣａｌｉｃｈＤＭＡ：４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸を用いてカリケアマイシンに接合させたＨ８抗体；ＣＭＡ：カリケアマイシンに接合させた抗ＣＤ３３抗体（負の対照）；ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；Ｈ８：未接合Ｈ８抗体。
【図１５Ａ−１５Ｇ】肺ガンの同所モデルの正常な肺および腫瘍に冒された肺の画像である。図１５Ａは、摘出された正常マウス肺の写真であり；心臓は暗く見える。図１５Ｂは、ＰＣ１４ＰＥ６腫瘍細胞を静脈注射した後に腫瘍塊に冒された、摘出されたマウス肺の写真である（実施例４参照）；Ｈ：心臓。図１５Ｃは、肺の衰弱後の胸部を示す巨視的画像（４倍）である。肺結節（ＬＮ）は、正常肺組織（Ｌ）と区別可能である。胸腔は出血液（胸水、ＰＥ）で満たされていた。図１５Ｄ〜１５Ｇは、パラフィンが埋め込まれた肺および心臓組織のヘマトキシリンおよびエオシンで染色された部分の顕微鏡写真であり、腫瘍の浸潤および正常組織の破壊の程度を示す。図１５Ｄ〜１５Ｅは、胸腔（１５Ｄ）および心膜（１５Ｅ）における腫瘍細胞の浸潤を示す。図１５Ｆ〜１５Ｇは、肺胞周囲腔における腫瘍素式の増殖による機能性肺組織の減少を示す。
【図１６】表示された治療を受けた、同所性肺腫瘍を有するマウスの生存率（％）を示す折れ線グラフである。すべての治療薬は、ＰＣ１４ＰＥ６細胞の注射後６日に腹腔内投与された。実施例４参照。Ｈ８（太い黒色実線）：未接合ネズミＨ８抗体；ＰＢＳ（白色実線）：リン酸塩緩衝塩溶液；ＣＭＡ ２（細い黒色実線）：２μｇカリケアマイシンの用量で投与された、カリケアマイシンと接合した抗ＣＤ３３抗体；ＣＭＡ ４（細かい破線）：４μｇカリケアマイシンの用量で投与された、カリケアマイシンに接合された抗ＣＤ３３抗体；Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ ２（大きな破線）：２μｇカリケアマイシンの用量で投与された、Ｈ８−カリケアマイシン接合体；Ｈ８−ＡｃＰａｃ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ ４（大きな破線）、４μｇのカリケアマイシンの用量で投与されたＨ８−カリケアマイシン接合体。２μｇの用量または４μｇの用量で投与されたＨ８−カリケアマイシン接合体についての結果は１２０日間にわたって識別可能であった。それぞれの処置群には１０匹の動物が含まれていた。各治療計画は、それぞれの投与の間隔が４日で３回腹腔内投与することからなっていた。
【図１７】表示された防止処理後の肺腫瘍で死亡したマウスの胸膜堆積を示す棒グラフである。ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；Ｈ８：未接合Ｈ８抗体；ＣＭＡ ２：２μｇの用量で投与されたカリケアマイシンに接合した抗ＣＤ３３抗体；ＣＭＡ ４：４μｇ／用量で投与されたカリケアマイシンに接合した抗ＣＤ３３抗体接合体；ｎ：動物の数。胸水体積は、未接合Ｈ８抗体または対照接合ＣＭＳの投与後に減少しなかった。
【図１８】ネズミＨ８軽鎖可変領域（配列番号１６のアミノ酸２１〜１２７）およびＤＰＫ２４生殖細胞系クローン（配列番号６３）の配列である。囲まれた配列：ＣＤＲｓ；星印：ネズミＨ８のアミノ酸がヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１中に保持されている位置、およびヒト化ＤＰＫ２４のアミノ酸がヒト化軽鎖可変領域バージョン２中に保持されている位置；下線を施した残基：抗体発現を増大させる突然変異。
【図１９】サブグループＶκＩＩＩのヒト軽鎖可変領域配列（配列番号６５〜７０）およびネズミＨ８軽鎖可変領域（配列番号１６のアミノ酸２１〜１２７）の配列である。Ｈ８フレームワーク配列と比較した場合にヒトフレームワーク配列において異なる残基に下線を施した。Ｈ８のヒト化に関して、Ｈ８における対応する位置での１つまたは複数の残基をヒトフレームワーク配列の残基で置換する。囲まれた配列：ＣＤＲ。
【図２０】サブグループＶκＩのヒト軽鎖可変領域配列（配列番号７１〜８０）およびネズミＨ８軽鎖可変領域（配列番号１６のアミノ酸２１〜１２７）の配列である。Ｈ８のヒト化に関しては、Ｈ８における対応する位置での１つまたは複数の残基がヒトフレームワーク配列の残基で置換されている。囲まれた配列：ＣＤＲ。
【図２１】ネズミＨ８重鎖可変領域（配列番号１４のアミノ酸２０〜１３９）およびＤＰ７５生殖細胞系クローン（配列番号６４）の配列である。囲まれた配列：ＣＤＲ；星印：ネズミＨ８のアミノ酸がヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１（すなわち、Ｋ３８、Ｓ４０、およびＩ４８）において保持される位置、およびヒトＤＰ７５のアミノ酸がヒト化重鎖可変領域バージョン２において保持される位置。
【図２２】サブグループＩのヒト重鎖可変領域配列（配列番号５２〜６０）およびこれより誘導されるコンセンサスフレームワーク配列（配列番号４９〜５１）の配列である。
【図２３】ネズミＨ８重鎖可変領域（配列番号１４のアミノ酸２０〜１３９）および重鎖可変領域サブグループＩのコンセンサス配列由来のヒト化重鎖可変領域、すなわち、ヒト化重鎖可変領域バージョン３（配列番号１９）の配列である。囲まれた配列：ＣＤＲ。
【図２４Ａ−２４Ｃ】ヒト化抗５Ｔ４抗体の代表的軽鎖可変領域配列（図２４Ａ）および重鎖可変領域配列（図２４Ｂ〜２４Ｃ）の配列を示す。
【図２５Ａ−２５Ｏ】ヒト化可変領域をクエリー配列として使用して行われたＢＬＡＳＴ分析の結果を示す。表６および７も参照。
【図２６Ａ−２６Ｂ】ヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するために使用される代表的なヒト定常領域の配列を示す。
【図２７Ａ−２７Ｇ】代表的な抗５Ｔ４抗体の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を示す。図２７Ａは、（ａ）ネズミＨ８軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号１）、ならびに（ｂ）ネズミＨ８重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域を含む重鎖（配列番号２）を有するキメラ抗５Ｔ４抗体を示す。図２７Ｂは、（ａ）ネズミＨ８軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号３）、ならびに（ｂ）ネズミＨ８重鎖可変領域および突然変異ヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖（配列番号４）を有するキメラ抗５Ｔ４抗体を示す。図２７Ｃは、（ａ）ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号５）、ならびに（ｂ）ネズミＨ８重鎖可変領域および突然変異ヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖（配列番号６）を有する半ヒト抗５Ｔ抗体を示す。図２７Ｄは、（ａ）ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号７）、ならびに（ｂ）ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１および突然変異ヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖（配列番号８）を有するヒト化抗５Ｔ４抗体を示す。図２７Ｅは、（ａ）ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン１およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号９）、ならびに（ｂ）ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン２およびヒトＩｇＧ１定常領域を含む重鎖（配列番号１０）を有するヒト化抗５Ｔ４抗体を示す。図２７Ｆは、（ａ）ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン２およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号１１）、ならびに（ｂ）ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン２および突然変異ヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖（配列番号１２）を有するヒト化抗５Ｔ４抗体を示す。図２７Ｇは、 （ａ）ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域バージョン２およびヒトカッパ定常領域を含む軽鎖（配列番号１１）、ならびに（ｂ）ヒト化Ｈ８重鎖可変領域 バージョン３および突然変異ヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖（配列番号８４）を有するヒト化抗５Ｔ４抗体を示す。一重下線：可変領域；囲まれた配列：ＣＤＲ；星印：プロリン突然変異。
【図２８Ａ−２８Ｂ】ネズミＨ８、Ｈ８のキメラ体、およびＨ８のヒト化体を表示された濃度で使用した、ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞（図２８Ａ）またはＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（図２８Ｂ）上の５Ｔ４抗原を検出するためのＦＡＣＳ分析の結果を示す。すべての抗体は、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞に対して選択的結合を示す。
【図２９】キメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８バージョン１〜３の結合特性を示す折れ線グラフであり、競合結合検定を用いて測定された。キメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８バージョン１〜３のＩＣ５０は、それぞれ、１．０ Ｘ １０^−９Ｍ、１．０ Ｘ １０^−９Ｍ、１．４ Ｘ １０^−９Ｍ、および１．５ Ｘ １０^−９Ｍであった。実施例５参照。
【図３０】２５時間にわたる、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の細胞表面上のキメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８抗体の検出を示す折れ線グラフである。観察期間にわたって検出のレベルが減少することは、両抗体の取り込みを示す。実験期間中、ならし培地において検出可能な抗体は存在しなかった。
【図３１】ＣＯＳ−１細胞におけるキメラＨ８抗体およびヒト化Ｈ８バージョン１〜３の一時的発現のレベルを示す棒グラフである。３種のヒト化Ｈ８抗体が類似したレベルで発現され（バージョン１、４．４ ｍｇ／Ｌ／４８時；バージョン２、２．７ ｍｇ／Ｌ／４８時；バージョン３、３．９ ｍｇ／Ｌ／４８時）、これはキメラＨ８抗体について観察された値（０．６ ｍｇ／Ｌ／４８時）よりも大きかった。実施例６参照。
【図３２Ａ−３２Ｂ】、表示された濃度でＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合したヒト化Ｈ８抗体）にさらされた１４４時間後のインビトロでのＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏおよびＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の球状成長の阻害を示す折れ線グラフである。
【図３３Ａ−３３Ｃ】対照物質（図３３Ａ）またはヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体（図３３Ｂ）の存在下でのＮ８７腫瘍の成長阻害および応答計算（図３３Ｃ）を示す折れ線グラフである。ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；ｈｕＨ８＋ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：Ｈ８抗体およびカリケアマイシンの混合物（未接合）；ＣＭＡ：カリケアマイシンに接合した抗ＣＤ３３抗体；ＣＭＣ：カリケアマイシンに接合した抗ＣＤ２２抗体；ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合させたヒト化Ｈ８抗体；（４）：４μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（２）：２μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（１）：１μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；矢印：１、５、および９日での投与計画；ＣＲ：完全応答；ＰＲ：部分的応答；ＴＲ：応答なし；ＮＲ：応答なし。実施例９参照。
【図３４Ａ−３４Ｃ】対照物質（図３４Ａ）またはヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体（図３４Ｂ）の存在下でのＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４腫瘍の成長阻害および応答計算（図３４Ｃ）を示す折れ線グラフである。ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；ｈｕＨ８＋ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：Ｈ８抗体およびカリケアマイシンの混合物（未接合）；ＣＭＡ：カリケアマイシンに接合させた抗ＣＤ３３抗体；ＣＭＣ：カリケアマイシンに接合させた抗ＣＤ２２抗体；ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合させたヒト化Ｈ８抗体；（４）：４μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（２）：２μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（１）：１μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；矢印：１、５、および９日の投与計画；ＣＲ：完全応答；ＰＲ：部分応答；ＴＲ：応答なし；ＮＲ：応答なし。実施例９参照。
【図３５Ａ−３５Ｅ】対照物質（図３５Ａ）またはヒト化Ｈ８−カリケアマイシン接合体（図３５Ｂ、３５Ｄ、３５Ｅ）の存在下でのＰＣ１４ＰＥ６腫瘍の成長阻害および計算応答（図３５Ｃ）を示す折れ線グラフである。図３５Ａ〜３５Ｃは、新規成長腫瘍に関するデータを提示し、図３５Ｄは、再発した腫瘍の治療に関するデータを提示する。ＰＢＳ：リン酸塩緩衝塩溶液；ｈｕＨ８＋ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：Ｈ８抗体およびカリケアマイシンの混合物（未接合）；ＣＭＡ：カリケアマイシンに接合させた抗ＣＤ３３抗体；ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ：４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合させたヒト化Ｈ８抗体；（４）４μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（２）：２μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（１）：１μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；（４＊）：接合体での治療前に腫瘍を約１．０８ ｃｍ^３まで成長させた後に４μｇカリケアマイシンの用量で投与された抗体−カリケアマイシン接合体；矢印：１、５、および９日の投与計画（図３５Ａ、３５Ｂ、および３５Ｄ）、または１９、２３、および２７日の投与計画（図３５Ｃ）；ＣＲ：完全応答；ＰＲ：部分応答；ＴＲ：応答なし；ＮＲ：応答なし。実施例９参照。
【図３６Ａ−３６Ｂ】ビヒクル（リン酸塩緩衝塩溶液）（図３６７Ａ）またはｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンに接合させたヒト化Ｈ８抗体）（図３６Ｂ）で処理した２１日後のＰＣ１４ＰＥ６腫瘍を有するマウスの写真を示す。ＰＣ１４ＰＥ６腫瘍は、ビヒクルまたはヒト化Ｈ８−カリケアマイシンが投与された時に約８０ ｍｍ^３であった。薬物は、４μｇカリケアマイシン／用量を合計３回腹腔内注射により投与され、各投与は３日あけた。図３６Ａ中、矢印は目に見える腫瘍を特定する。図３６Ｂ中、点線で囲まれた部分はＰＣ１４ＰＥ６腫瘍が退縮した部分を示す。実施例９参照。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの軽鎖または少なくとも１つの重鎖を含むキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体、あるいはそのキメラまたはヒト化フラグメントであって、抗体または抗体フラグメントが、
（ａ）少なくとも約１×１０^−７Ｍ〜約１×１０^−１２Ｍの結合親和力でヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合するか；
（ｂ）１×１０^−１１Ｍより高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合するか；
（ｃ）５×１０^−１１Ｍより高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合するか；
（ｄ）ヒト５Ｔ４抗原と結合するネズミＨ８抗５Ｔ４抗体の結合親和力よりも高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合するか；
（ｅ）インビボで５Ｔ４発現細胞を特異的に標的とするか；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗体とヒト５Ｔ４抗原に対する結合に関して競合するか；
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つにより結合したエピトープと特異的に結合するか；あるいは
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗原結合ドメインを含む、キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体。
【請求項２】
ヒト定常領域由来の定常領域を含む請求項１記載のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント。
【請求項３】
ヒト軽鎖定常領域がヒトカッパ軽鎖定常領域由来である請求項２記載のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント。
【請求項４】
ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域由来である請求項２記載のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント。
【請求項５】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、配列番号２５または８５〜８９のいずれか一つのアミノ酸配列を含む請求項４記載のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント。
【請求項６】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が２４１位でプロリンを含む請求項４記載のキメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント。
【請求項７】
軽鎖可変領域配列が配列番号１のアミノ酸１〜１０７を含む請求項１記載のキメラ抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
重鎖可変領域配列が配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む請求項１記載のキメラ抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項９】
軽鎖が配列番号１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む可変領域を含み、重鎖が配列番号２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む可変領域を含む請求項１記載のキメラ抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１０】
（ａ）軽鎖が配列番号１のアミノ酸配列を含み、重鎖が配列番号２のアミノ鎖配列を含みむか；あるいは
（ｂ）軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含み、重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラ抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１１】
少なくとも１つの軽鎖または少なくとも１つの重鎖の可変領域が：
（ａ）ヒト抗体フレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域；および
（ｂ）配列番号１７の軽鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲまたは配列番号１８の重鎖可変領域の１つまたは複数のＣＤＲを含む、請求項１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１２】
フレームワーク領域が：
（ａ）ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系クローン、ＶκＩＩＩサブグループ、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系クローンのヒト抗体軽鎖フレームワーク領域；
（ｂ）ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）からなる群から選択されるヒト抗体重鎖フレームワーク領域；
（ｃ）（ｂ）の重鎖フレームワーク領域のコンセンサス配列；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のフレームワーク領域と少なくとも９５％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３】
配列番号１７または１８の少なくとも２つのＣＤＲを含む請求項１１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１４】
軽鎖が配列番号１７の３つのＣＤＲのうち少なくとも２つを含む可変領域を含む、請求項１３記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】
軽鎖が配列番号１７の３つのＣＤＲを含む可変領域を含む請求項１４記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１６】
重鎖が配列番号１８の３つのＣＤＲのうちの少なくとも２つを含む可変領域を含む請求項１１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１７】
重鎖が配列番号１８の３つのＣＤＲを含む可変領域を含む請求項１６記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１８】
軽鎖が配列番号１７〜１８のＣＤＲを含む請求項１１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項１９】
軽鎖可変領域配列が：
（ａ）配列番号１７または２３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１７と少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２３と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２０】
軽鎖可変領域配列が：
（ａ）配列番号２２または８１のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２２の核酸と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号８１の核酸と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列；または
（ｄ）配列番号２２または配列番号８１の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸を含む核酸によりコード化される、請求項１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２１】
重鎖可変領域配列が：
（ａ）配列番号１８、１９および２１のいずれか一つに記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１８と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１９と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列；または
（ｄ）配列番号２１と少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２２】
重鎖可変領域配列が：
（ａ）配列番号２０、８２または８３のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２０または配列番号８３の核酸と少なくとも９１％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号８２の核酸と少なくとも９４％同一であるヌクレオチド配列；あるいは
（ｄ）配列番号２０、８２および８３のいずれか一つの相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸を含む核酸によりコード化される、請求項１記載のヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２３】
（ａ）配列番号５の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号６の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号５の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号６の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２４】
（ａ）配列番号７の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２５】
（ａ）配列番号９の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号９の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１０の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２６】
（ａ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１２の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２７】
（ａ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番８４の重鎖アミノ酸配列を含む、ヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２８】
（ａ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８の重鎖アミノ酸配列を含むヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメント。
【請求項２９】
（ａ）キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメント；および
（ｂ）該抗体または抗体フラグメントと直接的または間接的に結合する薬物を含む、薬物を送達するための抗体／薬物接合体。
【請求項３０】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）少なくとも約１×１０^−７Ｍ〜約１×１０^−１２Ｍの結合親和力でヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合するか；
（ｂ）１×１０^−１１Ｍより高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合するか；
（ｃ）５×１０^−１１Ｍより高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合するか；
（ｄ）ヒト５Ｔ４抗原と結合するネズミＨ８抗５Ｔ４抗体の結合親和力よりも高い結合親和力でヒト５Ｔ４抗原と特異的に結合するか；
（ｅ）インビボで５Ｔ４発現細胞を特異的に標的とするか；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗体とヒト５Ｔ４抗原に対する結合に関して競合するか；
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つにより結合したエピトープと特異的に結合するか；あるいは
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つの抗原結合ドメインを含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３１】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）配列番号５の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号６の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号５の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号６の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３２】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）配列番号７の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号７の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３３】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）配列番号９の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号９の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１０の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３４】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１２の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号１２の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３５】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８４の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３６】
キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントが：
（ａ）配列番号１１の残基１〜１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８の残基１〜１２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｂ）配列番号１１の軽鎖アミノ酸配列、および配列番号８の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３７】
薬物が、細胞毒素、放射性同位元素、免疫調節薬、血管新生阻害薬、抗増殖剤、アポトーシス誘発剤、化学療法薬、および治療用核酸からなる群から選択される治療薬である請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３８】
治療薬が細胞毒素である請求項３７記載の抗体／薬物接合体。
【請求項３９】
細胞毒素が、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または酵素である、請求項３８記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４０】
細胞毒素が抗生物質である請求項３９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４１】
抗生物質がカリケアマイシンである請求項４０記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４２】
カリケアマイシンがカリケアマイシンのＮ−アセチル誘導体またはジスルフィド類似体である請求項４１記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４３】
カリケアマイシンがＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンである請求項４２記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４４】
薬物がリンカーにより抗体と結合する請求項２９記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４５】
リンカーが、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）、およびその誘導体からなる群から選択される、請求項４４記載の抗体／薬物接合体。
【請求項４６】
（ｉ）キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントと、（ｉｉ）直接的または間接的にヒト化抗５Ｔ４抗体または抗体フラグメントと結合する薬物とを含む抗体／薬物接合体と細胞を接触させることを含む、５Ｔ４発現細胞に薬物を送達する方法。
【請求項４７】
薬物が標的細胞中に取り込まれる請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
５Ｔ４陽性癌を有する対象を治療する方法であって、
（ｉ）キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントと、（ｉｉ）該キメラまたはヒト化抗５Ｔ４抗体あるいは抗体フラグメントと直接的または間接的に結合する治療剤とを含む、治療的に有効な量の抗５Ｔ４抗体／薬物接合体を対象に投与することを含む方法。
【請求項４９】
抗５Ｔ４抗体／薬物接合体が抗５Ｔ４抗体／カリケアマイシン接合体であり、第二の治療薬を投与することをさらに含み、抗５Ｔ４／カリケアマイシン接合体および第二の治療薬が同時に、またはいずれかの順序で連続して投与される、請求項４８記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１５Ｄ】

【図１５Ｅ】

【図１５Ｆ】

【図１５Ｇ】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２５Ｃ】

【図２５Ｄ】

【図２５Ｅ】

【図２５Ｆ】

【図２５Ｇ】

【図２５Ｈ】

【図２５Ｉ】

【図２５Ｊ】

【図２５Ｋ】

【図２５Ｌ】

【図２５Ｍ】

【図２５Ｎ】

【図２５Ｏ】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２７Ｄ】

【図２７Ｅ】

【図２７Ｆ】

【図２７Ｇ】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

【図３３Ｃ】

【図３４Ａ】

【図３４Ｂ】

【図３４Ｃ】

【図３５Ａ】

【図３５Ｂ】

【図３５Ｃ】

【図３５Ｄ】

【図３５Ｅ】

【図３６Ａ】

【図３６Ｂ】

【公表番号】特表２００８−５１２４８５（Ｐ２００８−５１２４８５Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３１３７５（Ｐ２００７−５３１３７５）
【出願日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３２１９６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３１６５３
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】