ファネロケーテ由来のセロビオヒドロラーゼの利用
【課題】セルロースの分解に相乗効果に貢献できるセロビオヒドロラーゼ及びそのセロビオヒドロラーゼのセルロースの分解への利用を提供する。
【解決手段】 Phanerochaete chrysosporium(ファネロケーテ・クリソスポリウム)由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を含有する、セルロース分解用酵素製剤とする。
【解決手段】 Phanerochaete chrysosporium(ファネロケーテ・クリソスポリウム)由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を含有する、セルロース分解用酵素製剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース等のバイオマスを利用するためのファネロケーテ由来のセロビオヒドロラーゼの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。なかでも、セルロースの利用が期待されている。セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを効率よく単糖まで分解（糖化）するには、少なくとも３つのタイプのセルロース分解酵素（セルラーゼ）が必要であり、それらが協同して作用することによって初めて可能になると考えられている（以下、こうした効果を相乗効果ともいう。）。この３つのタイプのセルラーゼは、高分子のセルロースに対して作用するエキソ型（末端から２単糖づつ切断する）のセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）と、エンド型（ランダムに切断する）のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）と、これらの酵素によりある程度オリゴマー化されたものを単糖まで分解するβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）である。
【０００３】
結晶性セルロースを含む高分子構造部分の分解は極めて困難であり、こうした高分子構造部分を十分に分解できる酵素及びセルロース分解の相乗効果のある組合せの取得が望まれている。
【０００４】
そこで、組合せられた異なるタイプのセルラーゼが最も相乗的に作用して効率的にセルロースを分解できる組合せが種々検討されている。例えば、前記した３つの酵素の一つであるセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）には、ＧＨＦ７に属し、セルロース鎖の還元末端から切断するとされているＣＢＨ Ｉと、ＧＨＦ６に属し同非還元末端から切断するとされているＣＢＨ IIが知られているが、セロビオヒドロラーゼについても種々の報告がある。例えば、ファネロケーテ属のPhanerochaete chrysosporiumが産生するセロビオヒドロラーゼにあっては、ＣＢＨ IIよりもＣＢＨ Iの方が、他のタイプのセルラーゼと組み合わせたときのセルロース分解の相乗効果が高いとの報告がされている。例えば、Ｐｃ産生のＣＢＨ IとＰｃ産生の他のＣＢＨ Iとの組合せは、Ｐｃ産生のＣＢＨ IとＰｃ産生のＣＢＨ IIとの組合せよりも優れるとの報告がされている（非特許文献１）。また、Ｐｃ産生のＣＢＨ IとＰｃ産生のＥＧ（ＰｃＥＧ）との組合せは、ＰｃＣＢＨ IIとＰｃＥＧとの組合せよりも優れるとの報告もされている（非特許文献２）。
【０００５】
また、トリコデルマ属のTrichoderma reeseiについても、ＣＢＨ IIよりもＣＢＨ Iの方が、他のタイプのセルラーゼと組み合わせたときのセルロース分解の相乗作用が高いとの報告がされている。例えば、ＰｃＥＧIIIとＴｒＣＢＨ Iとの組合せは、ＰｃＥＧIIIとＴｒＣＢＨ IIとの組合せよりも優れるとの報告がされている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．19(2-3)：271-85
【非特許文献２】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．21(1-2)：143-59
【非特許文献３】Henrikssonら、Eur. J. Biochem. 259（1-2）：88-95
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記非特許文献１〜３を始めとして、Phanerochaete chrysosporium産生するＣＢＨ IIがＣＢＨ Iよりも他のタイプのセルラーゼに組み合わせて用いるのに好ましいとの報告はなされていない。また、Phanerochaete chrysosporiumが産生するＣＢＨIIに関しては、他の微生物起源のＥＧとの具体的な相乗効果の報告はなされていない。
【０００８】
本発明は、セルロースの分解に相乗効果に貢献できるセロビオヒドロラーゼ及びそのセロビオヒドロラーゼのセルロースの分解への利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した現状に鑑み、セルロースの分解に必要な酵素のうちセロビオヒドロラーゼに着目し、特に、Phanerochaete chrysosporiumが産生するＣＢＨ II（ＰｃＣＢＨ II）に着目した。ＰｃＣＢＨ IIは、上述のようにＰｃＣＢＨIよりセルロース分解の相乗効果に劣るとの評価がなされていたところ、本発明者らが新たに開発した評価系を用いてＰｃＣＢＨ２を評価したところ、ＰｃＣＢＨ I及び他の起源のＣＢＨと比較して相乗効果に寄与することができる酵素であるという知見を得た。さらに、このＰｃＣＢＨ IIを改変することにより相乗効果に強く貢献できるＣＢＨ IIを提供できるという知見を得た。本発明によれば、これらの知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を含有する、セルロース分解用酵素製剤が提供される。この酵素製剤において、前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有する改変体とすることができる。
【００１１】
また、前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における表１に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される１種又は２種以上を有する改変体であってもよい。
【表１】
【００１２】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼを含んでいてもよく、好ましくは、当該他起源由来のＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei、Aspergillus niger及びAspergillus oryzaeに由来するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。また、前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼを含んでいてもよく、当該ＧＨＦ１２のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ７に属するエンドグルカナーゼであってもよく、Trichoderma reesei由来及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。さらに、他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよく、Trichoderma reesei由来及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。
【００１３】
本発明の酵素製剤においては、さらに、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼを含んでいてもよい。また、本発明の酵素製剤は、Trichoderma reesei又はその形質転換体由来のセルラーゼ組成物を含有していてもよい。さらに本発明の酵素製剤は、β−グルコシダーゼを表層提示した細胞を利用したCBPプロセスを想定する場合には、グルコースによるCBHの反応阻害を回避できることから、β-グルコシダーゼを含有しなくてもよい。
【００１４】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体を含有する、セルロースを分解するために他のセルラーゼと組み合わされて使用されるセルロース分解活性増強剤が提供される。本増強剤において、前記他のセルラーゼは、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を含むことができ、前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５、ＧＨＦ７、ＧＨＦ１２及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上であってもよい。さらに、前記他起源のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei、Aspergillus niger及びAspergillus orizaeからなる群から選択される１種又は２種以上を起源とすることができる。
【００１５】
本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。本タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することが好ましい。また、本発明によれば、上記タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物が提供され、本ＤＮＡ構築物は、発現ベクターであってもよい。本発明によれば、本ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体も提供される。
【００１６】
本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列における表１に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される選択される１種又は２種以上を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質も提供される。
【００１７】
本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において表２の各改変体が有する変異の種類に示すアミノ酸変異又はこれらのアミノ酸変異に相当する変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質も提供される。
【表２】
【００１８】
また、本発明によれば、上記タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物が提供され、本ＤＮＡ構築物は、発現ベクターであってもよい。本発明によれば、本ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体も提供される。
【００１９】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を発現する、形質転換体が提供される。本形質転換体において、前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体と前記他起源のエンドグルカナーゼとを細胞表層に保持する又は細胞外に分泌していてもよい。また、β−グルコシダーゼの発現が抑制されていてもよいし、前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体及び前記他起源のエンドグルカナーゼ以外のセルラーゼであって、内在性のセルラーゼの発現が抑制されていてもよい。さらに、前記形質転換体の宿主は、非セルラーゼ生産菌であってもよい。
【００２０】
本発明によれば、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を製造する、セルロース分解用の酵素製剤の生産方法が提供される。
【００２１】
本発明によれば、セルロースの存在下、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを低分子化する工程、を備える、セルロースの低分子化産物の生産方法が提供される。この生産方法において、前記低分子化工程は、β−グルコシダーゼの非存在下でセルロースを分解して、セルロースオリゴマーを得る工程としてもよいさらに、前記低分子化工程は、前記セルロースとともにリグニン及びヘミセルロースが共存していてもよい。
【００２２】
また、本発明によれば、セルロースを原料として有用物質を生産する方法であって、セルロースの存在下、β−グルコシダーゼの非存在下で、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを分解してオリゴマーを生産する工程と、前記セルロースオリゴマーをβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを生産する工程と、を備える、生産方法が提供される。この生産方法において、前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現する酵母などのエタノール生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いるエタノール発酵工程としてもよいし、前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現する有機酸生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いる有機酸発酵工程としてもよい。グルコースを炭素源とする微生物による全てのバイオファイナリー技術に展開することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】各種のセロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図２Ａ】ＰｃＣＢＨ IIと各種ＣＢＨ I及びエンドグルカナーゼとの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図２Ｂ】ＡｏＣＢＨ IIと各種ＣＢＨ I及びエンドグルカナーゼとの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図２Ｃ】ＴｒＣＢＨ IIと各種ＣＢＨ I及びエンドグルカナーゼとの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図３】ＣＢＨ II改変体によるセルロース分解活性の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図４】ＣＢＨ II改変体によるＰＳＣ溶液の分解結果を示す図である。
【図５】ＣＢＨ II改変体によるアビセル溶液の分解結果を示す図である。
【図６】市販酵素製剤に対するＰｃＣＢＨ２及び改変体の添加効果のＰＳＣ溶液による評価結果を示す図である。
【図７】市販酵素製剤に対するＰｃＣＢＨ２の添加効果のＰＳＣプレートによる評価結果を示す図である。
【図８】市販酵素製剤に対するＰｃＣＢＨ２の添加効果の評価結果を相加予測値と実測値とから示す図である。
【図９】実施例５で得られた改変体の比活性測定結果を示す図である。
【図１０】上位11クローンの相乗効果評価結果を示す図である。
【図１１】シングル化改変体の相乗効果評価結果を示す図である。
【図１２】PcCBH2の立体構造モデルと部位特異的変異導入部位とを示す図である。
【図１３】基質結合トンネル周辺の部位特異的改変体の相乗効果評価結果を示す図である。
【図１４】相加改変体のカクテルへの添加効果評価結果を示す図である。
【図１５】相加改変体の市販酵素製剤への添加効果評価結果を示す図である。
【図１６】実バイオマス由来セルロース成分に対する添加効果評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と他起源のエンドグルカナーゼとの組合せに関し、これらを含むセルロース分解用の酵素製剤のほか、セルロース分解活性増強剤、こうした組合せでセルラーゼを発現する形質転換体、こうした酵素製剤の生産方法、こうした組合せを有用物質の生産方法等に関する。
【００２５】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ及びその改変体が、それぞれ他起源のエンドグルカナーゼと組み合わされることでセルロース分解の相乗効果に優れて貢献できる。このため、これらのセロビオヒドロラーゼと他起源のエンドグルカナーゼとの組合せによって、効率的にセルロースを分解できるようになる。したがって、この組合せをセルロースを利用する各種工程の上流側の工程で用いることで、効率的にセルロースオリゴマー、グルコースを生産でき、さらにはこれらを炭素源として用いる発酵に利用できる。また、実バイオマスに由来するリグニンやヘミセルロースが共存していても、セルロースを効率的に分解するおとができる。
【００２６】
以下、本発明の実施形態を説明するが、まず、本発明におけるPhanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ及びその改変体について説明し、次いで、酵素製剤及びセルロース分解活性増強剤としてのこれらの生産方法及び利用等について説明する。なお、ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）によるセルラーゼの分類は、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供されている。
【００２７】
（Phanerochaete chrysosporiumに由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ）
本明細書において、「Phanerochaete chrysosporiumに由来する」とは、Phanerochaete chrysosporiumに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ II）又は当該微生物の生産するタンパク質をコードする遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたＣＢＨ IIをいう。したがって、Phanerochaete chrysosporiumから取得したＣＢＨ IIをコードする遺伝子（又はその改変遺伝子）を導入した形質転換体によって生産された組換体タンパク質であるＣＢＨ IIも、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIに該当する。
【００２８】
（ＰｃＣＢＨ２）
本発明におけるＣＢＨIIの一つの態様は、天然のPhanerochaete chrysosporiumから単離されるＣＢＨ II（以下、これを改変体と区別してＰｃＣＢＨ２という。）である。典型的なアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ． ６０（１２），４３８７−４３９３（１９９４））。
【００２９】
本発明のＰｃＣＢＨ２は、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIであれば、同種の個々の菌株から採取されるものであってもよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列に基づいて他のPhanerochaete chrysosporium株から取得されたものであってもよい。ＰｃＣＢＨ２としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有していてもよく、また当該相同性アミノ酸配列からなっていてもよい。
【００３０】
ＰｃＣＢＨ２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してより好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは８５％以上の相同性、一層好ましくは９０％以上の相同性を有し、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。特定のアミノ酸配列に対する相同性は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において利用可能なblastp, psi-blast, phi-blastを用いたprotein blastやblastxなどのプログラムを利用して取得することができる。
【００３１】
ＰｃＣＢＨ２は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の全体又はその一部をプローブとして用いるとき、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるものであってもよい。本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第３版と略す）又は、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
こうして得られるＰｃＣＢＨ２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列及びこれと一定以上の相同性を有するアミノ酸配列のいずれかにおいて、また、１又は数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有していてもよく、また当該アミノ酸配列からなっていてもよい。アミノ酸変異の個数は特に限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失及び付加のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。
【００３３】
（ＰｃＣＢＨ２の改変体）
ＰｃＣＢＨ２の改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において人工的にアミノ酸変異を導入したものであり、ＣＢＨ II活性を有するタンパク質である。ＣＢＨ II活性を有するとは、ＣＢＨ II活性を有していれば足りるが、好ましくは、ＰｃＣＢＨ２と同等程度又はそれ以上のセルロース分解時における相乗効果を有していることを意味している。
【００３４】
アミノ酸変異は、各種の手法にて導入することができる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列や相同性配列をコードするＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。ＤＮＡに変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。
【００３５】
改変体としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置においてセリンがプロリンに置換（Ｓ２２Ｐ）された配列を有するものが挙げられる。かかるアミノ酸配列を配列番号４に示し、当該、アミノ酸配列をコードするＤＮＡにおける塩基配列の一例を配列番号３に示す。なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２２位に相当する位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して比較するタンパク質のアミノ酸配列の相同性を考慮しつつ、アラインメントを行い、配列番号２の２２位に相当する位置のセリンを決定することができる。
【００３６】
さらに、改変体としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列における以下の表３に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される選択される１種又は２種以上を有するものが挙げられる．なお、本明細書において、「アミノ酸変異に相当するアミノ酸変異」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して比較するタンパク質のアミノ酸配列の相同性を考慮しつつアラインメントを行って、「配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸変異に相当するアミノ酸変異」を決定できる。したがって、改変体は、特定のアミノ酸変異とそれに相当するアミノ酸変異との双方とを同時に有することはない。
以下の表３では、Ｉ群に属するアミノ酸変異は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるセルビロヒドロラーゼの全域に関する変異であり、II群に属するアミノ酸変異は、同セロビオヒドロラーゼの基質結合トンネル周辺の変異である。以下の表においては、I群に属するアミノ酸変異とII群に属するアミノ酸変異とを組み合わせて用いることが好ましい。また、以下の表３において有効性が「＊」として表記されるもの用いるのが好ましく、より好ましくは、有効性が「＊＊」として表記されるものを用いるのが好ましく、さらに好ましくは有効性が「＊＊＊」として表記されるものを用いるのが好ましい。
【表３】
【００３７】
改変体としては、より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列において以下の表４に示す各改変体が有する変異の種類に示すアミノ酸変異又はこれらのアミノ酸変異に相当する変異を有するタンパク質が挙げられる。なかでも、以下の表４において有効性が「＊＊」として表記されるものを用いるのが好ましく、有効性が「＊＊＊」として表記されるものを用いるのがさらに好ましい。特に、改変体５２〜５８として記載の改変体は、ＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ Ｉと組み合わせたときのセルロースの分解活性は、親株（野生型）の４．５倍以上であった（最大値はおおよそ６．５倍程度であった）。
【００３８】
【表４】
【００３９】
本発明におけるＰｃＣＢＨ２及びその改変体は、他の起源由来のエンドグルカナーゼと組み合わせたときに、セルロースの分解に相乗効果を有する。このような相乗効果は、以下に説明する本発明者らによる評価系（特願２００７−２４３６２６（特開２００９−７２１０２号公報）により評価することができる。
【００４０】
セルロース分解の相乗効果は、セルロースを含有する固相体からなる評価領域にＰｃＣＢＨ２又はその改変体を供給し、当該領域の固相体中のセルロースを分解させて、セルロースの消失に基づいて形成されるハロ（固相体においてバイオマスの分解により淡色化又は無色化する領域）等として検出できる。評価領域には相乗効果に寄与すると考えられる他のセルラーゼを併せて供給することができる。
【００４１】
固相体におけるセルロース消失に基づくハロは、通常、周囲よりも透明性の高い部分として形成され、そのままでも、目視等により視認することができる。ハロ検出時にコンゴレッドなどで、セルロースを染色することで明瞭にハロを検出することができる。また、バイオマスとして色素結合セルロース（例えば、Cellulose Azure、Sigma社製など）を用いた場合、セルロースの分解により色素が固相体中に拡散しハロを形成するため、容易にセルロース分解活性を検出することができる。同様に蛍光色素を結合したセルロースもバイオマスとして利用することでハロを容易に検出することができる。さらに、酸処理セルロースなどをバイオマスとして用いた場合にもセルロースの分解により透明なハロを形成するため、セルロース分解活性を容易に検出することができる。また、基質としてＣＭＣ等を用いて、ＤＮＳ法やソモギ−ネルソン法により、セルロースの分解によって生じる還元糖を検出してもよい。
【００４２】
ハロ形成用の固相体は、例えば、バイオマスを担持するゲルやフィルムが挙げられる。ゲルやフィルムの構成材料は特に限定しないで、天然又は人工の高分子材料を好ましく用いることができる。このような高分子材料としては、アガロース（寒天）を好ましく用いることができる。固相体は、例えば、ある程度精製されたバイオマスとしてのセルロースをアガロース溶液に懸濁又は溶解させた後、所定条件で固化することにより得ることができる。また、未精製のバイオマスを乾燥粉砕して得られた粉体をアガロース溶液に懸濁した後、固化することによっても得ることができる。固相体の形態及び固相体に含まれるセルロース量は、エンドグルカナーゼ活性を検出できる程度であればよい。ハロを検出するには、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）、アビセル等を用いることができるが、結晶構造を有する不溶性セルロースに対する相乗効果を評価するには、ＰＳＣやアビセルを用いることが好ましい。
【００４３】
本発明におけるＰｃＣＢＨ２及び改変体は、上述のようにタンパク質の無細胞合成系による遺伝子工学的手法によって取得することができるほか、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体において本発明のタンパク質を生産させる遺伝子工学的手法により取得することができる。形質転換体を用いた遺伝子工学的なタンパク質の生産方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４４】
本発明のＰｃＣＢＨ２及び改変体は、Phanerochaete chrysosporium又は各種微生物を宿主とする形質転換体が産生するタンパク質であるときには、これらの菌を培養して培養上清を取得し、この培養上清からＰｃＣＢＨ２及び改変体を分離・精製すればよい。分離や精製には公知のタンパク質の分離・精製法を適用すればよい。なお、ＰｃＣＢＨ２及び改変体を培養上清から分離精製することは必ずしも必要ではなく、培養上清をそのまま用いてもよい。
【００４５】
（セルロース分解用酵素製剤）
本発明のセルロース分解用酵素製剤は、ＰｃＣＢＨ２及び／又はその改変体（以下、ＰｃＣＢＨ２と改変体とを特に区別する必要がない限り、この文言に代えて単にＰｃＣＢＨ２等を用いる。）と、Phanerochaete chrysosporium以外の他の起源のエンドグルカナーゼとを含有することができる。本発明のＰｃＣＢＨ２等は、Phanerochaete chrysosporium以外の他の起源のエンドグルカナーゼと組合せてセルロースを分解するとき、セルロース分解のための相乗効果に強く寄与することが本発明者らによって初めて見出された。したがって、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼとを組み合わせる酵素製剤は、セルロース分解用として有用である。
【００４６】
本明細書において、セルロースは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体が挙げられる。グルコースの重合度は特に限定しない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースであってもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。また、セルロースは、上記したセルロースを含むセルロース含有材料であってもよい。セルロース含有材料は、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、籾殻、木材チップなどのリグノセルロース系の農産廃棄物などのいわゆる実バイオマスであってもよいし、その前処理物であってもよい。
【００４７】
他起源由来のエンドグルカナーゼにおける「他起源」とは、Phanerochaete chrysosporium以外の微生物を意味し、Phanerochaete chrysosporium以外であれば特に限定されないが、例えば、Trichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Clostridium thermocellum、Hemicola insolens、Chaetomium globosum等の公知のセルラーゼを生産又はその遺伝子を保有する菌が挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００４８】
他起源由来のエンドグルカナーゼとしては、公知の各種エンドグルカナーゼが挙げられ、これらを単独であるいは２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４９】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００５０】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。
【００５１】
本発明の酵素製剤は、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼは、ＣＢＨII及びその改変体をPhanerochaete chrysosporiumの培養物等から取得した場合においてＰｃＣＢＨ２及びその改変体とともに容易に取得できる。
【００５２】
本発明の酵素製剤は、エンドグルカナーゼ以外の他のセルラーゼを含むことができる。例えば、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ I）を含有することができる。ＣＢＨ Iは、ＣＢＨ Iが、ＰｃＣＢＨ２等と協動することにより、一層セルロース分解の相乗効果が発揮される。ＣＢＨ Iは、Phanerochaete chrysosporium由来であってもよいし、他起源であってもよい。
【００５３】
本発明の酵素製剤は、他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有していてもよい。セルラーゼ生産菌としては、特に限定されないで、適宜選択できるが、エンドグルカナーゼの起源としてTrichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００５４】
本発明の酵素製剤は、β−グルコシダーゼを含有していてもよいし、実質的に含有していなくてもよい。本発明の酵素製剤が、β−グルコシダーゼを実質的に含有していない場合、β−グルコシダーゼにより生成されるグルコースが他のセルラーゼに対して生産物阻害を生じない点において好ましい。したがって、β−グルコシダーゼを実質的に含有しない酵素製剤であれば、確実に生産物阻害を回避して、本発明者らが評価系で確認したセルロース分解の相乗効果を製剤においても得ることができる。なお、こうした酵素製剤は、グルコースにまで分解するものでなく、セルロースをセロビオース等のオリゴマーにまで分解する用途に用いることができる。
【００５５】
なお、実質的にβ−グルコシダーゼを含有しないとは、β−グルコシダーゼを含有しないほか、β−グルコシダーゼによる生産物阻害を回避又は抑制できる範囲でβ−グルコシダーゼ量を含んでいてもよいことを意味している。本発明の酵素製剤は、好ましくは、β−グルコシダーゼを含有していない。β−グルコシダーゼを実質的に含有しない酵素製剤は、例えば、内在性のβ−グルコシダーゼ遺伝子を保持しない微生物（酵母や麹菌等）や内在性のβ−グルコシダーゼ遺伝子を有するが当該遺伝子を破壊した微生物に対して、ＰｃＣＢＨ２等をコードする遺伝子並びに他起源のエンドグルカナーゼを導入した形質転換体の培養物から容易に得ることができる。
【００５６】
本発明の酵素製剤は、ＰｃＣＢＨ２等及び他起源のエンドグルカナーゼを、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００５７】
本発明の酵素製剤の生産方法は特に限定されない。例えば、他起源のエンドグルカナーゼ（上記のように他起源のセルラーゼ生産菌の培養物であってもよい）と、別に準備したＰｃＣＢＨ２等とを混合する形態であってもよいし、ＰｃＣＢＨ２等と他の起源のエンドグルカナーゼを共発現する形質転換体を培養して得られる培養物から製造する形態であってもよい。さらに、これらを適宜組み合わせる形態であってもよい。
【００５８】
（セルロース分解活性増強剤）
本発明のセルロース分解活性増強剤は、ＰｃＣＢＨ２等を含有し、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼを組み合わせて使用される。本発明におけるＰｃＣＢＨ２等は、他起源のエンドグルカナーゼと組合せてセルロースを分解するのに良好な相乗効果を発揮するため、他起源エンドグルカナーゼに組み合わせて用いる増強剤（添加剤）の形態を採ることもできる。本発明の増強剤におけるＰｃＣＢＨ２及び改変体については、上記で説明した通りの各種態様が適用される。また、本増強剤を用いるのに好ましい他起源のエンドグルカナーゼも、本発明の酵素製剤において組み合わせることの好ましいエンドグルカナーゼの各種態様が適用される。また、本発明の増強剤の組合せ先には、本発明の酵素製剤において組み合わせるのが好ましい他のセルラーゼの各種態様が適用される。
【００５９】
本発明の増強剤は、ＣＢＨ Iを含んでいてもよい。ＣＢＨ Iを含むことで、他起源のエンドグルカナーゼに組み合わされたときに、セルロース分解相乗効果が一層増強されるからである。ＣＢＨ Iとしては、好ましくは、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ I（ＰｃＣＢＨ１）が挙げられる。
【００６０】
本発明の増強剤は、ＰｃＣＢＨ２等を、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００６１】
本発明の増強剤の生産方法は、特に限定されない。天然由来のＰｃＣＢＨ２の場合には、当該ＰｃＣＢＨ２を生産する微生物を培養等してタンパク質画分又はその一部として本発明の増強剤を得ることができる。なお、改変体については、遺伝子工学的に取得して本発明の増強剤とすることができる。なお、天然由来のＰｃＣＢＨ２であっても遺伝子工学的に取得することもできる。
【００６２】
（ＤＮＡ構築物）
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明の改変体をコードするＤＮＡを含んでいる。より具体的には、配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、さらに具体的には、配列番号３に記載される塩基配列を有するＤＮＡを含んでいる。また、上記した表１に含まれるアミノ酸変異の１種又は２種以上を有する各種改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡや上記した表２に記載の各改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる。本発明のＤＮＡ構築物は、主として適当な宿主細胞の形質転換を意図した発現ベクターとしての形態を採ることができる。形質転換の手法や宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの保持形態（染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態等）に応じて、上記コード領域以外の構成要素が適宜決定される。また、ＤＮＡ構築物の形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、プラスミドやコスミドなどの適当なベクターの形態を採ることもできる。
【００６３】
なお、本発明によれば、配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド及び配列番号３に記載される塩基配列を有するポリヌクレオチド他、各種態様のＰｃＣＢＨ２及びその改変体をコードするポリヌクレオチドも提供される。ポリヌクレオチドは、化学合成法や各種ＰＣＲ法等により取得することができる。なお、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（二重鎖及び一重鎖のいずれであってもよい）、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリット等、いずれの形態であってもよい。
【００６４】
（形質転換体）
本発明の形質転換体の一態様は、本発明の改変体を発現する形質転換体であり、上記した本発明のＤＮＡ構築物で適当な宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。例えば、本発明の改変体のみを細胞表層に保持し又は細胞外に分泌する形態で発現する形質転換体は、それ自体、本発明の増強剤として利用できる。また、こうした形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の増強剤の好ましい取得源として利用できる。
【００６５】
本発明の形質展開体は、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のＥＧとを共発現する態様とすることもできる。こうした共発現形態の形質転換体によれば、セルロース分解の相乗効果を得ることができる組合せを一挙に得ることができ、酵素製剤の製造及び形質転換体によるセルロースの分解に有利である。この態様の形質転換体において発現される好ましいエンドグルカナーゼ及びそのほかのセルラーゼについては、本発明の酵素製剤に関し既に説明した各種態様が適用される。
【００６６】
本発明の上記各種態様の形質転換体を得るのにあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。遺伝子導入の宿主となる細胞は特に限定しないが、形質転換体によるセルロース分解及び酵素製剤の取得を考慮すると、例えば、Phanerochaete chrysosporium、Trichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Clostridium thermocellum、Hemicola insolens、Chaetomium globosum等の公知のセルラーゼ産生菌のほか、酵母や麹菌から選択される公知の非セルラーゼ生産菌等が挙げられる。さらに、後述する有機酸発酵やエタノール発酵等を考慮すると、非セルラーゼ生産菌でもあるSaccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属の酵母、Schizosaccharomyces pombe,等のSchizosaccharomyces属の酵母、Candida shehatae等のCandida属の酵母、Pichia stipitis等のPichia属の酵母、Hansenula属の酵母、Trichosporon属の酵母、Brettanomyces属の酵母、Pachysolen属の酵母、Yamadazyma属の酵母、Kluyveromyces marxianus, Kluveromyces lactis等のKluveromyces属の酵母が挙げられる。
【００６７】
共発現態様の形質転換体の作製にあたっては、本発明の組合せで酵素が発現されるように、宿主の種類に応じて、適宜、導入する遺伝子が決定される。例えば、Phanerochaete chrysosporiumを宿主とする場合には、ＰｃＣＢＨ２遺伝子は内在されているため、他起源の、例えば、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ遺伝子を導入すればよい。また、Trichoderma reeseiを宿主とする場合には、他起源のエンドグルカナーゼ遺伝子が内在されているため、ＰｃＣＢＨ２等をコードする外来遺伝子を導入する。さらに、非セルラーゼ生産菌に、ＰｃＣＢＨ２等及び他起源のエンドグルカナーゼをそれぞれコードする外来遺伝子を導入してもよい。
【００６８】
本発明の形質転換体においては、本発明において好適とされる組合せ以外のセルラーゼ遺伝子が発現されていてもよいが、その発現を抑制してもよい。好適な組合せ以外のセルラーゼ遺伝子の発現を抑制することで、必要なタンパク質のみをできるだけ多く発現させて、本発明の組合せによるセルロース分解相乗効果によりセルロースを効率的に分解できる。こうした形質転換体は、強力な相乗効果を発揮可能な酵素製剤の製造に有利である。
【００６９】
例えば、Trichoderma reeseiにＰｃＣＢＨ２等をコードする外来遺伝子を導入して本発明の形質転換体を得る場合、Trichoderma reeseiのＣＢＨ I、ＣＢＨ IIを発現させてもよいが、これらの遺伝子を破壊して不活性化しておいてもよい。また、酵母や麹菌から選択されるセルラーゼ非生産菌に、本発明において好適な組合せに係る酵素をコードする外来遺伝子を導入するようにして本発明の形質転換体を得ても良い。セルラーゼ非生産菌は、後述するように、内在性のβ−グルコシダーゼ遺伝子を有していないほか、外来遺伝子として導入するＰｃＣＢＨ２等やエンドグルカナーゼの発現量を調節して高発現させやすいという利点がある。こうした形質転換体は、強力な相乗効果を発揮可能な酵素製剤の製造に有利である。
【００７０】
本発明の形質転換体においては、β−グルコシダーゼの発現が抑制されていてもよい。すなわち、内在性β−グルコシダーゼ遺伝子を有する宿主を利用した形質転換体にあっては、当該遺伝子が破壊されており、内在性β−グルコシダーゼ遺伝子を有しない宿主（例えば、セルラーゼ非生産菌など）を利用した形質転換体であってもよい。β−グルコシダーゼは、既に説明したように、生産物阻害によりセルロース分解を抑制するからである。こうした形質転換体は、酵素製剤、特に、セルロースをオリゴマーにまで低分子化するための酵素製剤として好ましい。特定遺伝子の破壊は、当業者であれば適宜実施できる。
【００７１】
なお、上記した本発明のＤＮＡ構築物及び形質転換体の作製方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００７２】
なお、本発明の形質転換体においては、こうした組合せの酵素を細胞内に発現するようにしてもよいし、細胞表層に保持する又は細胞外に分泌するように構築してもよい。細胞表層に保持する形態又は細胞外に分泌する形態であれば、形質転換体をそのままセルロースに分解に利用できる。細胞外に分泌する形態は、培養上清から酵素製剤を取得するのにも有利である。
【００７３】
（酵素製剤の生産方法）
本発明によれば、本発明の共発現態様の形質転換体を用いて本発明の酵素製剤を製造する方法が提供される。本発明によれば、好ましい組合せのセルラーゼからなる酵素製剤を一挙に得ることができる。本発明の生産方法には、上記した共発現態様の形質転換体において、特に酵素製剤の製造に好ましいとされる形質転換体を用いることで、効率的にかつ強力な酵素製剤を容易に得ることができる。
【００７４】
形質転換体の培養については、用いた宿主や発現ベクター等を考慮して適宜決定される。培養により培養菌体及び／又は培養上清を取得して、これらからタンパク質を含む画分を取得し、必要に応じ分離・精製すればよい。分離や精製には公知のタンパク質の分離・精製法を適用すればよい。ＰｃＣＢＨ２や他起源エンドグルカナーゼが分泌生産される場合には、培養上清をそのまま用いることもできる。得られた酵素画分は、必要に応じて乾燥等し粉末化するなどして各種形態の酵素製剤とすることができる。
【００７５】
なお、酵素製剤が、他の他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有している場合には、こうした培養物も併せてタンパク質を分離してもよいし、本発明の共発現形質転換体とは別個に、こうした培養物からタンパク質を分離して本発明の共発現形質転換体の培養物あるいは製剤に添加してもよい。
【００７６】
（セルロースの低分子化産物の生産方法）
本発明のセルロースの低分子化産物の生産方法は、セルロースの存在下、ＰｃＣＢＨ２等と、他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを低分子化する工程を備えている。本発明によれば、効率的にセルロースを低分子化、セルロースオリゴマー又はグルコースを生産できる。グルコースまで低分子化するには、β−グルコシダーゼも用いる。
【００７７】
低分子化工程においてセルロースを効率的にセルロースオリゴマーにまで分解するには、β−グルコシダーゼの実質的な非存在下でセルロースを分解することが好ましい。こうすることで、β−グルコシダーゼによる生産物阻害の影響を回避又は抑制できる。なお、「β−グルコシダーゼの実質的な非存在下」とは、β−グルコシダーゼが存在しないほか、β−グルコシダーゼによる生産物阻害を回避又は抑制できる範囲でβ−グルコシダーゼが存在していてもよい、ことを意味している。セルロースオリゴマーを得るためには、β−グルコシダーゼはこの酵素反応系内に存在しないことが好ましい。
【００７８】
低分子化工程は、β−グルコシダーゼの非存在下、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼとを用いてセルロースを分解し、その後、得られたセルロースオリゴマーに対して、β−グルコシダーゼを供給して分解する工程とすることができる。こうすることで、効率的にセルロースをグルコースにまで分解できる。
【００７９】
低分子化工程は、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼ（例えば、商業的に入手可能な酵素製剤等）と組み合わせて用いることができる。こうすることで、優れた相乗効果は発揮することができる。例えば、セルロースやリグニンやヘミセルロースを含む稲ワラ等のリグノセルロース系バイオマス（実バイオマス）の前処理物であっても、他起源のエンドグルカナーゼとの優れた相乗効果を得ることができる。すなわち、本発明の酵素の組み合わせによれば、リグニンやヘミセルロースの存在下であっても高効率にセルロースを分解できる。特に、改変体５２〜５８は、市販酵素製剤などのセルラーゼ製剤や、ＢＧＬ＋ＥＧ＋ＣＢＨ Iと組み合わせたとき、優れた相乗効果は発揮することができる。
【００８０】
本発明の生産方法で用いるＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼとの組合せは、上記のように本発明の酵素製剤として提供されていてもよいし、また、本発明の共発現形態の形質転換体の細胞表層に提示された状態で提供されていてもよい。さらに、ＰｃＣＢＨ２等のみが酵素製剤として提供され、他起源エンドグルカナーゼが細胞表層や細胞外に分泌された形態で提供されていてもよい。細胞外への分泌及び細胞表層での保持させる方法としては、各種手法が知られているが、細胞表層提示のための公知のタンパク質や分泌用タンパク質をＰｃＣＢＨ２等や他起源のエンドグルカナーゼに連結した融合タンパク質を発現するように形質転換体を得る方法が挙げられる。
【００８１】
以上説明した、本発明のセルロースの低分子化産物の生産方法において、用いるＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼについては、既に説明した本発明の組合せの各種態様が適用される。そして、好ましい態様の組合せを用いることで、一層効率的なセルロースの分解が可能となる。
【００８２】
（有用物質生産方法）
セルロースの存在下、ＰｃＣＢＨ２等と、他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、実質的にβ−グルコシダーゼの非存在下でセルロースを分解してセルロースオリゴマーを生産する工程と、前記セルロースオリゴマーをβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを生産する工程と、を備えることができる。本発明の有用物質を生産する方法は、一旦セルロースオリゴマーとした後で、好適には、こうしたオリゴマーを回収した後、これをさらにβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを得る。こうすることで、セルロースオリゴマーをセルロースによる酵素反応の阻害を回避又は抑制して、効率的にセルロースオリゴマーを得、その後、このオリゴマーに対してβ−グルコシダーゼを作用させることで、効率的にグルコースを取得し、これを炭素源として用いて有用物質を生産できる。
【００８３】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。利用する微生物としては、特に限定しないが、酵母などのエタノール生産微生物や乳酸菌などの有機酸生産微生物が挙げられる。これらはいずれも人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。
【００８４】
例えば、本発明の有用物質生産方法は、グルコース生産工程で得られるグルコースを炭素源として利用できるが、グルコース生産工程を、β−グルコシダーゼを発現する微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いるエタノール発酵工程とすることができる。こうすることで、グルコースによる生産物阻害なく、効率的にセルロースを利用してエタノールを生産できる。また、グルコース生産工程を、β−グルコシダーゼを発現する有機酸生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いる有機酸発酵工程とすることができる。こうすることで、グルコースによる生産物阻害なく、効率的にセルロースを利用して有機酸を生産できる。
【００８５】
なお、本明細書において、「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であって、遊離の酸あるいはその塩である。「有機酸」が備える酸性基としては、カルボン酸基であることが好ましい。このような「有機酸」としては、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などが挙げられる。これらの「有機酸」は、Ｄ体、Ｌ体のほか、ＤＬ体であってもよい。「有機酸」は好ましくは、乳酸である。
【００８６】
また、有機酸生産微生物としては、乳酸を発酵する微生物として、乳酸生産酵母が挙げられ、かかる酵母としては、例えば、特開２００３−２５９８７８、特開２００４−１８７６３、特開２００５−１３７３０６、特開２００６−６２７１、特開２００６−２０６０２、特開２００６−４２７１９、特開２００６−２８３１８、特開２００６−２９６３７７、特開２００７−８９４６６、特開２００７−１７５０２９等に開示されている乳酸生産酵母等が挙げられる。
【００８７】
以上説明した、本発明の有用物質の生産方法において用いるＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼについては、既に説明した本発明の組合せの各種態様が適用される。そして、好ましい態様の組合せを用いることで、一層効率的なセルロースの分解が可能となり、有用物質を効率的に生産できるようになる。
【００８８】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） に従い行った。
【実施例１】
【００８９】
（各種セルラーゼの活性型での生産）
グリコシド結合を切断する酵素群（ＥＣ３．２．１．−）は、Glycoside Hydrolase Family（以下、ＧＨＦ）により分類されており、各種セルラーゼもこれに含まれる。相乗効果を試験するために、ＣＢＨとＥＧについて、なるべく多くのＧＨＦに分類される酵素を本実施例で評価した。ＣＢＨ（ＥＣ３．２．１．９１）は、ＧＨＦ５，６，７，９，１０，４８に分類されるものが、ＥＧ（ＥＣ．３．２．１.４）は、ＧＨＦ５,６,７,８,９,１０,１２，２６，４４，４５，４８，５１，６１，７４に分類されるものが、ＢＧＬ（ＥＣ．３．２．２１）は、ＧＨＦ１，３，９に分類されるものが報告されている。ＣＢＨについては、ＧＨＦ５，６，７，９に属するものが知られている。そこで、ＣＢＨについて、４種類のＧＨＦに分類される５種類の微生物（Trichoderma reesei、Phanerochaete chrysosporium、Aspergillus aculeatus、Aspergillus oryzae、Clostridium thermocellum）由来の１３種類を用いた。ＥＧについては、ＧＨＦ５,６,７,８,９,１２，４５，４８，６１の９種類に分類される６種類の微生物（Trichoderma reesei、Phanerochaete chrysosporium、Aspergillus aculeatus、Aspergillus oryzae、Hemicola insolens、Clostridium thermocellum、Chaetomium globosum）由来の２４種類のＥＧを用いた。ＢＧＬとしては、ＧＨＦ３に属するPhanerochaete chrysosporium由来の１種類の酵素を用いた。
【００９０】
各種セルラーゼの成熟タンパク質領域の上流側に開始コドン、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）をＰＣＲにより連結した。下流側にＴ７ターミネーターをＰＣＲにより連結した。全長のＰＣＲ産物をエタノール沈殿したものを、転写翻訳反応の鋳型として用いた。なお、鋳型ＤＮＡの作製に際し、以下の酵素をコードするＤＮＡの塩基配列については、各種酵素につき、それぞれ以下に示すアクセッション番号によってＮＣＢ１のホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から取得してＰＣＲプライマーを設計した。
PcCBH II: S76141
TrCBH II: M16190
AoCBH II: AP007169
PcCBH I: M22220
TrCBH I: X69976
AaCBH I: AB002821
AoCBH I: AB089436
TrEG I: AAA34212.1
TrEG V: Z33381
AnEG II: AF331518
AoEGII: AB195229
TrEG II: AAA34213.1
AnEGIII: AJ224451
PcEG III: AY682744
TrEG III: BAA20140
【００９１】
シャペロン（大腸菌由来のＤｎａＫ／ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ）を高発現した大腸菌を破砕後、Ｓ３０画分を還元剤（ジチオスレイトール；ＤＴＴ）未添加で調製したものを無細胞合成のための抽出液（媒体）として用いた。この抽出液に、上記の鋳型ＤＮＡ、５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．４、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、４０ｍＭクレアチンフォスフェート、０．７ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４．１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール６０００、３５μｇ／ｍｌ フォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ、３６ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１０μｇ／ｍｌ リファンピリシン、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びカビ由来ＰＤＩと１ｍＭ ＧＳＨ／０．１ｍＭ ＧＳＳＧを加え、２６℃、１〜３時間、転写翻訳共役反応を行った。
【００９２】
これらの酵素につき、カルボキシル化メチルセルロースに寒天を加えて固化させ、セルロース含有プレートを作製した。無細胞合成後の各反応液１μｌを、セルロース含有プレート上にアレイ状に添加し、酵素反応を生じさせた。反応後、染色液（コンゴーレッド）をセルロース含有プレートに滴下重層して染色し、セルラーゼ反応部分が脱色されたハロが形成されるまで脱色反応を行った。すべての反応液について、ハロが検出されたことから、実施例１の無細胞合成系でCBHを活性型で合成できることがわかった。
【実施例２】
【００９３】
（相乗効果の評価その１）
本実施例では、実施例１で無細胞合成した各種セルラーゼにつき、相乗効果に基づく不溶性のセルロースの分解を評価した。すなわち、マイクロタイタープレート上で、０．１％リン酸膨潤セルロース（以下、ＰＳＣという。）に寒天を加えて固化させ、高分子不溶性セルロース含有プレートとした。活性型で合成した実施例１のＢＧＬをすべてのスポットに１μｌづつ添加した。その上から、活性型で合成した実施例１の各種ＣＢＨ及びＥＧを、縦列と横列にそれぞれ１μｌづつ添加した。４０℃で反応後、染色液（コンゴレッド）を寒天上に滴下重層して染色し、これらセルラーゼによる反応部分が脱色されハロ（脱色されて白い部分が大きいほど、高いセルロース分解活性を持つ）が、形成されるまで脱色反応を行った。形成したハロの大きさを測定し、相対活性で表示した。ＰＳＣは、高分子セルロースであり、相乗効果が強く認められたときにのみハロを形成する評価系である。結果を図１に示す。
【００９４】
図１に示すように、ＢＧＬと各種ＥＧに対して、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ II（ＰｃＣＢＨ２）を添加した場合と比較して、顕著にセルロース分解活性が向上しており、セルロース分解のための相乗作用に強く寄与していることがわかった。ＰｃＣＢＨ IIと相乗効果を示す組み合わせに効果が高いＥＧは、ＧＨＦ５に分類されるTrichoderma reesei由来のＴｒＥＧ II及びAspergillus oryzae由来のＡｏＥＧII、ＧＨＦ１２に分類されるＴｒＥＧIIIであった。また、ＧＨＦ７に分類されるＴｒＥＧＩ及びＧＨＦ４５に分類されるＴｒＥＧＶも高い相乗効果が得られた。特に、ＰｃＣＢＨ２とＴｒＥＧ IIとの組み合わせが最も相乗効果が高かった。
【実施例３】
【００９５】
（相乗効果の評価その２）
ＣＢＨには、ＧＨＦ７に属するＣＢＨ Ｉと、ＧＨＦ６に属するＣＢＨ IIが知られていることから、ＢＧＬとＥＧに加えるＣＢＨとしては、ＣＢＨ ＩとＣＢＨIIとの双方を添加することが好ましいと考えられる。そこで、活性型で合成した実施例１のＢＧＬを実施例２と同様にして作製した高分子不溶性セルロース含有プレートスポットした上に、ＣＢＨ Ｉ及びＥＧとを各種の組合せで１μｌづつスポットしたプレートを３種類作製し、それぞれのプレートに異なるＣＢＨ IIを１μｌづつスポットした。４０℃で反応後、染色液（コンゴレッド）をプレート上に滴下重層して染色し、セルラーゼ反応部分が脱色され、ハロが形成されるまで脱色反応を行った。形成したハロの大きさを測定し、相対活性で表示した。結果を図２に示す。
【００９６】
図２Ａ〜図２Ｃに示すように、Trichoderma reesei由来のＣＢＨ II（ＴｒＣＢＨ２）(図２Ｃ)及びAspergillus aculeatus由来のＣＢＨ II（ＡｃＣＢＨ２）(図２Ｂ)を添加した場合と比較して、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ II（ＰｃＣＢＨ２）を添加した場合(図２Ａ)、顕著にセルロース分解活性が向上しており、当該酵素がセルロース分解の相乗効果に強く寄与していることがわかった。Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIと相乗効果を示す組合せに効果の高いＥＧは、ＧＨＦ５に分類されるＥＧ(Trichoderma reesei由来のＴｒＥＧII、Aspergillus niger由来ＡｎＥＧII)、ＧＨＦ１２に分類されるＥＧ（Trichoderma reesei由来のＴｒＥＧIII、Aspergillus niger由来のＡｎＥＧIII、Phanerochaete chrysosporium由来のＰｃＥＧIII）であった。
【実施例４】
【００９７】
（改変体ライブラリーの作製）
Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIのセルロース結合ドメインにランダム変異を導入した。ランダム変異は、エラープローンＰＣＲ（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５−１０ｍＭＭｇＣｌ2、０．５〜２．０ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１〜１００ｎｇ／μｌ ＭｎＰ、０．３μＭ プライマー、２５ｍＵ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）により増幅し、１００塩基当たり平均０．５個の変異（エラー率０．５％）をランダムに導入し、ライブラリーを作製した。平均１分子／ウェルまで希釈後に、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼを用いて９４℃で２分の加熱後に、９６℃で１０秒、６５℃で５秒及び７２℃で１分のサイクルを６５回繰り返し、その後７２℃で７分加熱して、１分子ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物各１μｌを鋳型として実施例１に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液９μｌに加え、転写・翻訳共役反応を行った。変異酵素ライブラリーを３８４プレート６枚に構築した。
【実施例５】
【００９８】
（高活性改変体のスクリーニング）
酵素変異ライブラリー各１μｌを、無細胞合成した実施例１で用いたのと同様のPhanerochaete chrysosporium由来のＢＧＬ、ＣＢＨ I及びTrichoderma reesei由来のＥＧIIをそれぞれ既に０．１μｌづつ実施例２で作製したのと同様の高分子不溶性セルロース含有プレート上に添加し、４０℃で反応させた結果、野生型よりもハロが大きいウェルが得られた。ハロが大きいウェルの上位２０個について、その１分子ＰＣＲ産物を大腸菌にクローン化して、各ウェルの形質転換体の４〜１０クローンについて、アミノ酸配列を決定した。変異が確認できたクローンのうち、配列が異なるものを選出し、無細胞合成を行い各改変体の分解活性を評価した。スクリーニング時と同様に、クローン化した各改変体の合成産物１μｌを、ＢＧＬ、ＥＧ、ＣＢＨ Iをそれぞれ１μｌづつスポットした高分子不溶性セルロース含有プレート上に添加し、４０℃で反応させた。その結果、変異導入前よりセルロース分解の相乗効果の高い改変体が数個得られたことがわかった。最も効果が高かった改変体について、相乗効果（ＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ Iの共存下）での高分子不溶性セルロース含有プレートでの評価結果を図３に示す。
【００９９】
図３に示すように、ＣＢＨ なし（ＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ I）と比較して、野生型であるＰｃＣＢＨ２では白色部分が大きく、さらに改変体では大きくなること（野生型の約２倍）がわかった。
【実施例６】
【０１００】
（改変体の評価）
無細胞合成した実施例１で用いたのと同様のPhanerochaete chrysosporium由来のＢＧＬ、ＣＢＨ I及びTrichoderma reesei由来のＥＧIIのそれぞれ１μｌづつを、１％ＰＳＣ又は１％アビセルを含む水溶液に添加した。そこへ、野生型ＰｃＣＢＨ２及び改変体を各１μｌ添加し、４０℃で２4時間反応後の還元糖量をＴＺアッセイ法（ＴＺ法；Jouranl of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985））により測定した。ＰＳＣ分解活性を図４に示す、アブセルロース分解活性を図５に示す。
【０１０１】
図４及び図５に示すように、いずれも野生型のＰｃＣＢＨ２活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合と、相乗効果ではなく単独でのＰＳＣ溶液分解時の還元糖量を測定した結果を示す。ＰＳＣ分解活性では、改変体は、野生型ＰｃＣＢＨ２よりも相乗効果が２．３倍強く、単独での分解活性は４倍程度強いことがわかった。アビセル分解活性は、相乗効果で１．３倍、単独活性では２．３倍であった。また、改変体のアミノ酸の置換部位はＳ２２Ｐであった。
【実施例７】
【０１０２】
（市販酵素製剤に対する添加効果その１）
１％ＰＳＣ水溶液２００μｌに、Trichoderma reesei由来の市販酵素製剤であるＳｉｇｍａ製のセルクラストＣ２７３０を４００ｎｇを加え、野生型のＰｃＣＢＨ２、改変体、ネガティブコントロール（ＣＢＨ添加なしの市販酵素製剤のみ）、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ I、Trichoderma reesei由来のＣＢＨ I、Trichoderma reesei由来のＣＢＨ II、Aspergillus aculeatus由来のＣＢＨ I、及びAspergillus oryzae由来のＣＢＨ Iの順に、無細胞合成した産物各３μｌを、それぞれ添加し、４０℃で反応させた。還元糖量を実施例６に示すＴＺ法で測定した。結果を図６に示す。
【０１０３】
図６に示すように、セルロース分解活性は、各活性からネガティブコントロールの数値を差し引いた後の野生型の分解活性を１とした相対活性で示す。野生型ＰｃＣＢＨ２を添加した場合、他種微生物由来のＣＢＨを添加した場合と比較して分解活性が高いことがわかった。また、野生型と改変体との比較では、改変体の方が添加効果が高かった。
【実施例８】
【０１０４】
（酵母による発現と精製）
野生型ＰｃＣＢＨ２（Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ II）をＰＣＲで増幅し、酵母分泌発現ベクターであるｐＲＳ４３６ＧＡＰＳＳＲＧにサブクローニングした。ｐＲＳ４３６ＧＡＰＳＳＲＧは、ＴＤＨ３プロモーターの下流に、分泌シグナルをもち菌体に酵素を分泌させることが可能である。本ベクターを酵母（ＭＴ８−２株）に形質転換し、ＳＤ−ＵＲＡ寒天培地（Yeast-nitrogen base without amino acids without ammonium sulfate１．７ｇ、カザミノ酸５ｇ、アミノ酸ミックス、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ、脱イオン水１０００ｍｌ）で３０℃で３日間培養した。本培養は、ファーメンターを用いてｐＨを５．５に維持しながら行った。生育したコロニーをＳＤ−ＵＲＡ液体培地で前培養し、ＯＤ６００＝０．１となるように本培養液５００ｍｌに植菌し、２５℃で３日間培養した。
【０１０５】
培養上清を回収し、硫安濃度７０％で硫安沈殿を行った。硫安沈殿後のタンパク質をバッファ（１Ｍ硫安、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)）で溶解し、限外ろ過で完全にバッファ置換したサンプルを精製用サンプルとした。
【０１０６】
同様のバッファで膨潤したアビセル溶液（アビセル１０ｇ、バッファー４０ｍｌ）２ｍｌをカラムに詰めアビセルカラムを作製した。ペリスタポンプを用いて１ｍｌ／分の流速でサンプルをカラムに流した。その後、同バッファー２０ｍｌ（流速１ｍｌ／分）で洗浄し、滅菌水で溶出した（流速０．５ｍｌ／分）。１ｍｌづつ回収した画分を、カルボキシメチルセルロース含有寒天のプレートに滴下してセルロース分解活性を確認後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、活性型のＣＢＨ IIをほぼ単一バンドにまで精製できた。バイオラッド社のプロテインアッセイキットによりタンパク質を定量した。
【実施例９】
【０１０７】
（市販酵素製剤に対する添加効果その２）
【０１０８】
実施例８で得られた野生型ＰｃＣＢＨ２のTrichoderma reesei由来の市販酵素製剤に対しての添加効果を評価した。市販酵素製剤として、Ｓｉｇｍａ製のセルクラストＣ２７３０を用い、上段には各６０ｎｇ／μｌ、下段には１２０μｇ／μｌをそれぞれ１μｌ、０．１％ＰＳＣ含有プレートにスポットした。縦列には、左からネガティブコントロール（ＣＢＨなし）、ＰｃＣＢＨ２（１００ｎｇ／μｌ）をそれぞれ１μｌ、酵素製剤スポットの上から滴下し、４０℃で反応させた。２４時間後にコンゴレッドにより染色した。結果を図７に示す。
【０１０９】
図７に示すように、ネガティブコントロールと比較すると、ＰｃＣＢＨ２をスポットした場合ではハロが大きい傾向があることがわかった。ハロの大きさから、ＰｃＣＢＨ２を添加した場合の分解活性は、ネガティブコントロールの約１．５〜２倍であった。したがって、市販酵素製剤にＰｃＣＢＨ２を添加することで、セルロース分解効果を高める相乗効果が得られることがわかった。
【実施例１０】
【０１１０】
（市販酵素製剤に対する添加効果その３）
Trichoderma reesei由来の市販酵素製剤Ｓｉｇｍａ製のセルクラストＣ２７３０に対してのＰｃＣＢＨ２の添加効果を評価した。無細胞合成したＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ Ｉのそれぞれ１μｌづつを、１％ＰＳＣ含有水溶液２００μｌに、セルクラスト０〜４００ｎｇ及びＰｃＣＢＨ２ １００〜０ｎｇを添加した。４０℃で２４時間反応後の還元糖量をＴＺアッセイ法（ＴＺ法；Jouranl of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985））により測定した。各濃度におけるセルクラスト単独とＰｃＣＢＨ２単独での活性を加算した相加予測値を図８に示す。
【０１１１】
図８に示すように、相加予測値よりも実測値のほうがＰＳＣ分解活性が高く、添加による相乗効果が認められた。また、ＰｃＣＢＨ２の添加濃度はセルクラストの添加濃度の１／４程度であっても効果があることがわかった。
【実施例１１】
【０１１２】
実施例５で得られたS22P改変体の他、２番目に活性が高かったQ2H改変体（配列番号２で表されるアミノ酸配列において第２番目のグルタミンがヒスチジンに置換した改変体である。表２に改変体１として示す。）について、合成量を合わせて比活性を測定した。合成量の測定は、無細胞合成時に蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を取り込ませ合成産物を蛍光ラベルした後、蛍光イメージアナライザー（FLA9000：富士フィルム株式会社）で検出、画像解析ソフトであるMulti Gaugeで解析を行った。無細胞合成したBGL、EG、CBHIのそれぞれ0.2μｌずつを、0.5％PSCを含む水溶液に添加した。そこへ、野生型PcCBH2、S22P改変体、Q2H改変体について、野生型PcCBH2での1μｌ相当量を添加し、40℃で15時間反応後の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。図９に、野生型PcCBH2活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。図９に示すように、Ｓ２２Ｐ改変体及びＱ２Ｈ改変体は、いずれも野生型よりも相乗効果を示した。
【実施例１２】
【０１１３】
（PcCBH2の触媒ドメイン変異ライブラリーの作成）
実施例６で得られたS22P改変体を親遺伝子として、ランダム変異を導入した。error-prone PCR（10 mM Tris-HClpH 9.0， 50 mM KCl， 0.1％TritonX-100， 5-10 mM MgCl2， 0.5-2.0 mM MnCl2， 0.2 mM dATP， 0.2 mM dGTP，1 mM dCTP，1 mM dTTP，1-100 ng／μl DNA， 0.3μM primer， 25 mU／μl Promega Taq DNA polymerase）により増幅し、100塩基当たり平均0.5個の変異（error率0.5％）をランダムに導入し、ライブラリーを作製した。PCR産物各1μlを鋳型として実施例1に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液7μlに加え、転写・翻訳共役反応を行った。変異酵素ライブラリーを384プレート8枚に構築した。
【実施例１３】
【０１１４】
（スクリーニング方法）
酵素変異ライブラリー各1μlを、無細胞合成したBGL、EG、CBHIをそれぞれ0.1μlずつ加えた0.25％PSC溶液100μlに添加し、40℃で24時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をソモギ-ネルソン法により測定した。その結果、親遺伝子であるS22P改変体よりも還元糖量が向上したウェルが複数得られた。還元糖量の上位61ウェルについて、そのPCR産物を大腸菌にクローン化して、各ウェルの形質転換体の4〜10クローンについて再度ソモギ-ネルソン法により還元糖量を測定した。そのうち上位60クローンについて、アミノ酸配列を決定した。スクリーニングで得られた60クローンのうち配列が異なるものを、実施例１１と同様にして合成量を合わせて比活性を測定した。その結果、比活性において親遺伝子であるS22P改変体よりも相乗効果が高い改変体が複数得られた。
【実施例１４】
【０１１５】
（スクリーニングで得られた改変体の評価結果）
実施例１３で得られた改変体のうち、上位11クローンの比活性を実施例１１と同様に測定した結果を図１０に示す。なお、以下の実施例において図表等において用いる改変体の種類は、表２に示す改変体の種類を表している。図１０に示すように、最も活性の高かった改変体１２では親遺伝子であるS22P改変体と比較して、相乗効果で２倍程度PSC分解活性が向上していた。アミノ酸置換はS22Pの他にGln2His（Q2H）、Leu29Pro（L29P）、Asn191His（N191H）のアミノ酸が置換されていた。Gln2His（Q2H）は、実施例５のスクリーニング時に取得した2番目に活性が高かったQ2H改変体（改変体１）（実施例１１）と同じ位置の変異であった。他の改変体のアミノ酸置換を表５に示す。
【０１１６】
【表５】
【実施例１５】
【０１１７】
（シングル化改変体の結果）
実施例１４において比活性の向上していた改変体で、かつ複数の変異をもつクローンについて、変異を分離する事で、S22P改変体と比較した場合の各変異の影響を評価した。評価した改変体の一覧を表６に示す。無細胞合成したBGL、EG、CBHIをそれぞれ0.4μlずつ加えた0.5％PSC溶液200μlに、実施例１１と同様にして合成量を測定した無細胞合成産物を添加し、40℃で数時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、S22P改変体と比較して活性の向上が見られた改変体４、７、１４、１８が有する変異のうち、S22P以外の変異であるS60L、V28A、L29P、N191Hの4変異を有効な変異とした。
【０１１８】
【表６】
【実施例１６】
【０１１９】
（PcCBH2立体構造モデルの構築）
CBHは主にセルロース結合ドメインと触媒ドメインが存在しており、両者はリンカーでつながった構造をとることが知られている。両ドメインの構造は、X線解析により別々に解かれており、CBHIIの触媒ドメインとしては、以下の2種類の酵素の構造がPDB（Protein Data Book）に報告されている。Trichoderma reesei由来CBHII （以下、TrCBH2）とCellotetraose complex ； PDB Ｎo. 1QK2、及びHumicola insolens 由来CBHIIとCellotetraose and Glucose complex ； PDB Ｎo. 2BVWである。PcCBH2の触媒ドメイン部分のアミノ酸配列のみを、genebankのPSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)で相同性検索した結果のうち、PDBに登録がある配列の上位２種類は、上記CBHIIの触媒ドメインであった。PcCBH2モデル構築の参照タンパク質として、相同性が高い方（56％）であるTrCBH2（PDB：1QK2）を用いることとした。
【０１２０】
分子の表示・モデルの構築・構造安定化計算等は、アクセルリス社製InsightIIを用いて実施した。PcCBH2とTrCBH2(1QK2)のアミノ酸配列のアライメント結果を基に、ホモロジーモデリングを行った。構築したモデルPcCBH2-CDとモデル構築時の参照タンパク質としたTrCBH2(1QK2)の主鎖構造の重ね合わせを行った結果、主鎖構造はほぼ一致しており、CBHの特徴である触媒アミノ酸残基、基質結合部位のトンネル、トンネル上部のループ構造が確認できたことから、ある程度信頼性のあるモデルが構築できたと考えられた。
【実施例１７】
【０１２１】
（基質結合トンネル周辺の部位特異的改変体の作成）
実施例１６で構築したモデルを元に、セルロース鎖結合トンネル周辺のアミノ酸で、基質結合や基質移動に影響を及ぼす可能性があると推測され、かつ、他のCBH2で完全保存されていないアミノ酸１７ヵ所を抽出した（図１２）。野生型PcCBH2のこれらのアミノ酸残基を表７に示す通りに置換した各種改変体を作製し、合成量当たりの活性を評価した。すなわち、無細胞合成したBGL、EG、CBHIのそれぞれ0.2μｌを加えた１％PSCに、野生型PcCBH2、または各種改変体について、野生型での1μｌ相当量を添加し、40℃で15時間反応後の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。結果を図１３に示す。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
図１３には、野生型PcCBH2の活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。図１３に示すように、野生型PcCBH2の２倍程度向上していた改変体は１１種類（表２中の改変体の番号：２３、２７、２８、３２、３４，３５、３６、３７、３９、４０、４２）、1.5倍程度向上していた改変体は１０種類（同：２４、２６、３１、３８、４１、４４、４５、４９、５０、５１）、1.3倍程度向上していた改変体は１１種類（２０、２１、２２、２５、２９、３０、３３、４３、４６、４７、４８）であった。特に、配列番号２において269番目のアミノ酸残基は、Trp（野生型）とPhe以外の他のアミノ酸に変換した場合に顕著に活性が向上することがわかった。疎水性で芳香環をもつアミノ酸残基が活性発現に影響していると推測される。また、266番目のTrp（野生型）は、モデルを構築した際に、最も揺らぎが大きいアミノ酸であった。アラニンに置換することで活性が向上したことから、酵素活性発現の安定性に寄与している可能性が示唆される。その他、活性が向上した改変体の置換アミノ酸残基は、263番目のHis（H263T、H263F）と99番目のTyr（Y99T）であった。
【実施例１８】
【０１２４】
（相加改変体の作製）
変異の相加は、実施例１１で有効変異を明らかにしたS22PとQ2H、実施例１５で抽出したV28A、L29P、S60L、N191H、実施例１７で抽出したW269A、W269R、W269M、Y99T、H263F、W266A、実施例１４から推測されるL132V、F382Sを候補とした。これらの内、S22P、Q2H、L29P、N191Hは改変体１２に含まれる変異である。そこで、変異の相加は改変体１２をベースに、表８に示す通り、５２〜５８の７種類の相加改変体の作製を実施した。
【０１２５】
【表８】
【実施例１９】
【０１２６】
（相加改変体によるカクテル効果）
表８に示す改変体について、無細胞合成したBGL、EG、CBHIをそれぞれ0.2μlずつ加えた0.5％PSC溶液200μlに、合成量を測定した無細胞合成産物を添加し、40℃で4時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。図１４に、野生型PcCBH2の活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。
【０１２７】
相加のベースとした改変体１２と比較して、無細胞合成したBGL、EG、CBHIとのカクテルによる相乗効果は、改変体５２〜５８で向上しており、野生型と比較すると約4.5〜6.5倍であった。また、市販酵素製剤との相乗効果は、改変体５５で最も高く、野生型の約6.5倍であった。有効変異を相加して行くことにより更に活性が向上できる可能性が示された。
【実施例２０】
【０１２８】
（相加改変体による市販酵素製剤添加効果）
表９に示す改変体について、市販酵素製剤（Sigma製のセルクラストC2730）を400ng加えた0.5％PSC溶液200μlに、合成量を測定した無細胞合成産物を添加し、40℃で４時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。図１５に、野生型PcCBH2の活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。図１５に示すように、改変体１２及び相加改変体５２〜５８では、市販酵素製剤添加時の相乗効果が、野生型の約3.5〜6.5倍に向上していることがわかった。
【実施例２１】
【０１２９】
（実バイオマス由来セルロース成分の市販酵素製剤による分解時の相乗効果）
水熱処理後の稲わらのセルロース成分に、市販酵素製剤（Sigma製のセルクラストC2730）を200mg／gバイオマスとなるように添加（図１６の市販酵素製剤200）し、50℃で反応後に溶液のグルコース濃度を液体クロマトグラフィーにより測定した。更にPcCBH2を2％（w/v）添加した場合を図１６の市販酵素製剤＋PcCBH2に示す。2％のPcCBH2を添加しただけで、24時間後のグルコース生成量は、市販酵素製剤を400mg／gバイオマスとなるように添加した場合（図１６の市販酵素製剤400）と同等の効果を示すことがわかった。実バイオマスを簡単な前処理したセルロース画分には、セルロース以外にリグニンやヘミセルロース成分が残存することから、純品のセルロースよりも分解効率低下することが懸念されるが、PcCBH2では実バイオマス由来セルロース成分の分解試験においても顕著な相乗効果が認められることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース等のバイオマスを利用するためのファネロケーテ由来のセロビオヒドロラーゼの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有限である石油資源を代替するものとして、植物の光合成作用に由来するバイオマスへの期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。なかでも、セルロースの利用が期待されている。セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを効率よく単糖まで分解（糖化）するには、少なくとも３つのタイプのセルロース分解酵素（セルラーゼ）が必要であり、それらが協同して作用することによって初めて可能になると考えられている（以下、こうした効果を相乗効果ともいう。）。この３つのタイプのセルラーゼは、高分子のセルロースに対して作用するエキソ型（末端から２単糖づつ切断する）のセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）と、エンド型（ランダムに切断する）のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）と、これらの酵素によりある程度オリゴマー化されたものを単糖まで分解するβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）である。
【０００３】
結晶性セルロースを含む高分子構造部分の分解は極めて困難であり、こうした高分子構造部分を十分に分解できる酵素及びセルロース分解の相乗効果のある組合せの取得が望まれている。
【０００４】
そこで、組合せられた異なるタイプのセルラーゼが最も相乗的に作用して効率的にセルロースを分解できる組合せが種々検討されている。例えば、前記した３つの酵素の一つであるセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）には、ＧＨＦ７に属し、セルロース鎖の還元末端から切断するとされているＣＢＨ Ｉと、ＧＨＦ６に属し同非還元末端から切断するとされているＣＢＨ IIが知られているが、セロビオヒドロラーゼについても種々の報告がある。例えば、ファネロケーテ属のPhanerochaete chrysosporiumが産生するセロビオヒドロラーゼにあっては、ＣＢＨ IIよりもＣＢＨ Iの方が、他のタイプのセルラーゼと組み合わせたときのセルロース分解の相乗効果が高いとの報告がされている。例えば、Ｐｃ産生のＣＢＨ IとＰｃ産生の他のＣＢＨ Iとの組合せは、Ｐｃ産生のＣＢＨ IとＰｃ産生のＣＢＨ IIとの組合せよりも優れるとの報告がされている（非特許文献１）。また、Ｐｃ産生のＣＢＨ IとＰｃ産生のＥＧ（ＰｃＥＧ）との組合せは、ＰｃＣＢＨ IIとＰｃＥＧとの組合せよりも優れるとの報告もされている（非特許文献２）。
【０００５】
また、トリコデルマ属のTrichoderma reeseiについても、ＣＢＨ IIよりもＣＢＨ Iの方が、他のタイプのセルラーゼと組み合わせたときのセルロース分解の相乗作用が高いとの報告がされている。例えば、ＰｃＥＧIIIとＴｒＣＢＨ Iとの組合せは、ＰｃＥＧIIIとＴｒＣＢＨ IIとの組合せよりも優れるとの報告がされている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．19(2-3)：271-85
【非特許文献２】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．21(1-2)：143-59
【非特許文献３】Henrikssonら、Eur. J. Biochem. 259（1-2）：88-95
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記非特許文献１〜３を始めとして、Phanerochaete chrysosporium産生するＣＢＨ IIがＣＢＨ Iよりも他のタイプのセルラーゼに組み合わせて用いるのに好ましいとの報告はなされていない。また、Phanerochaete chrysosporiumが産生するＣＢＨIIに関しては、他の微生物起源のＥＧとの具体的な相乗効果の報告はなされていない。
【０００８】
本発明は、セルロースの分解に相乗効果に貢献できるセロビオヒドロラーゼ及びそのセロビオヒドロラーゼのセルロースの分解への利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した現状に鑑み、セルロースの分解に必要な酵素のうちセロビオヒドロラーゼに着目し、特に、Phanerochaete chrysosporiumが産生するＣＢＨ II（ＰｃＣＢＨ II）に着目した。ＰｃＣＢＨ IIは、上述のようにＰｃＣＢＨIよりセルロース分解の相乗効果に劣るとの評価がなされていたところ、本発明者らが新たに開発した評価系を用いてＰｃＣＢＨ２を評価したところ、ＰｃＣＢＨ I及び他の起源のＣＢＨと比較して相乗効果に寄与することができる酵素であるという知見を得た。さらに、このＰｃＣＢＨ IIを改変することにより相乗効果に強く貢献できるＣＢＨ IIを提供できるという知見を得た。本発明によれば、これらの知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を含有する、セルロース分解用酵素製剤が提供される。この酵素製剤において、前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有する改変体とすることができる。
【００１１】
また、前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における表１に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される１種又は２種以上を有する改変体であってもよい。
【表１】
【００１２】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼを含んでいてもよく、好ましくは、当該他起源由来のＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei、Aspergillus niger及びAspergillus oryzaeに由来するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。また、前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼを含んでいてもよく、当該ＧＨＦ１２のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reeseiのエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ７に属するエンドグルカナーゼであってもよく、Trichoderma reesei由来及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。さらに、他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよく、Trichoderma reesei由来及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上とすることができる。
【００１３】
本発明の酵素製剤においては、さらに、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼを含んでいてもよい。また、本発明の酵素製剤は、Trichoderma reesei又はその形質転換体由来のセルラーゼ組成物を含有していてもよい。さらに本発明の酵素製剤は、β−グルコシダーゼを表層提示した細胞を利用したCBPプロセスを想定する場合には、グルコースによるCBHの反応阻害を回避できることから、β-グルコシダーゼを含有しなくてもよい。
【００１４】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体を含有する、セルロースを分解するために他のセルラーゼと組み合わされて使用されるセルロース分解活性増強剤が提供される。本増強剤において、前記他のセルラーゼは、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を含むことができ、前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５、ＧＨＦ７、ＧＨＦ１２及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上であってもよい。さらに、前記他起源のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei、Aspergillus niger及びAspergillus orizaeからなる群から選択される１種又は２種以上を起源とすることができる。
【００１５】
本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。本タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することが好ましい。また、本発明によれば、上記タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物が提供され、本ＤＮＡ構築物は、発現ベクターであってもよい。本発明によれば、本ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体も提供される。
【００１６】
本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列における表１に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される選択される１種又は２種以上を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質も提供される。
【００１７】
本発明によれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において表２の各改変体が有する変異の種類に示すアミノ酸変異又はこれらのアミノ酸変異に相当する変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質も提供される。
【表２】
【００１８】
また、本発明によれば、上記タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物が提供され、本ＤＮＡ構築物は、発現ベクターであってもよい。本発明によれば、本ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体も提供される。
【００１９】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を発現する、形質転換体が提供される。本形質転換体において、前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体と前記他起源のエンドグルカナーゼとを細胞表層に保持する又は細胞外に分泌していてもよい。また、β−グルコシダーゼの発現が抑制されていてもよいし、前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体及び前記他起源のエンドグルカナーゼ以外のセルラーゼであって、内在性のセルラーゼの発現が抑制されていてもよい。さらに、前記形質転換体の宿主は、非セルラーゼ生産菌であってもよい。
【００２０】
本発明によれば、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を製造する、セルロース分解用の酵素製剤の生産方法が提供される。
【００２１】
本発明によれば、セルロースの存在下、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを低分子化する工程、を備える、セルロースの低分子化産物の生産方法が提供される。この生産方法において、前記低分子化工程は、β−グルコシダーゼの非存在下でセルロースを分解して、セルロースオリゴマーを得る工程としてもよいさらに、前記低分子化工程は、前記セルロースとともにリグニン及びヘミセルロースが共存していてもよい。
【００２２】
また、本発明によれば、セルロースを原料として有用物質を生産する方法であって、セルロースの存在下、β−グルコシダーゼの非存在下で、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを分解してオリゴマーを生産する工程と、前記セルロースオリゴマーをβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを生産する工程と、を備える、生産方法が提供される。この生産方法において、前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現する酵母などのエタノール生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いるエタノール発酵工程としてもよいし、前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現する有機酸生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いる有機酸発酵工程としてもよい。グルコースを炭素源とする微生物による全てのバイオファイナリー技術に展開することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】各種のセロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図２Ａ】ＰｃＣＢＨ IIと各種ＣＢＨ I及びエンドグルカナーゼとの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図２Ｂ】ＡｏＣＢＨ IIと各種ＣＢＨ I及びエンドグルカナーゼとの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図２Ｃ】ＴｒＣＢＨ IIと各種ＣＢＨ I及びエンドグルカナーゼとの組合せによるセルロース分解の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図３】ＣＢＨ II改変体によるセルロース分解活性の相乗効果の評価結果を示す図である。
【図４】ＣＢＨ II改変体によるＰＳＣ溶液の分解結果を示す図である。
【図５】ＣＢＨ II改変体によるアビセル溶液の分解結果を示す図である。
【図６】市販酵素製剤に対するＰｃＣＢＨ２及び改変体の添加効果のＰＳＣ溶液による評価結果を示す図である。
【図７】市販酵素製剤に対するＰｃＣＢＨ２の添加効果のＰＳＣプレートによる評価結果を示す図である。
【図８】市販酵素製剤に対するＰｃＣＢＨ２の添加効果の評価結果を相加予測値と実測値とから示す図である。
【図９】実施例５で得られた改変体の比活性測定結果を示す図である。
【図１０】上位11クローンの相乗効果評価結果を示す図である。
【図１１】シングル化改変体の相乗効果評価結果を示す図である。
【図１２】PcCBH2の立体構造モデルと部位特異的変異導入部位とを示す図である。
【図１３】基質結合トンネル周辺の部位特異的改変体の相乗効果評価結果を示す図である。
【図１４】相加改変体のカクテルへの添加効果評価結果を示す図である。
【図１５】相加改変体の市販酵素製剤への添加効果評価結果を示す図である。
【図１６】実バイオマス由来セルロース成分に対する添加効果評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と他起源のエンドグルカナーゼとの組合せに関し、これらを含むセルロース分解用の酵素製剤のほか、セルロース分解活性増強剤、こうした組合せでセルラーゼを発現する形質転換体、こうした酵素製剤の生産方法、こうした組合せを有用物質の生産方法等に関する。
【００２５】
本発明によれば、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ及びその改変体が、それぞれ他起源のエンドグルカナーゼと組み合わされることでセルロース分解の相乗効果に優れて貢献できる。このため、これらのセロビオヒドロラーゼと他起源のエンドグルカナーゼとの組合せによって、効率的にセルロースを分解できるようになる。したがって、この組合せをセルロースを利用する各種工程の上流側の工程で用いることで、効率的にセルロースオリゴマー、グルコースを生産でき、さらにはこれらを炭素源として用いる発酵に利用できる。また、実バイオマスに由来するリグニンやヘミセルロースが共存していても、セルロースを効率的に分解するおとができる。
【００２６】
以下、本発明の実施形態を説明するが、まず、本発明におけるPhanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ及びその改変体について説明し、次いで、酵素製剤及びセルロース分解活性増強剤としてのこれらの生産方法及び利用等について説明する。なお、ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）によるセルラーゼの分類は、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供されている。
【００２７】
（Phanerochaete chrysosporiumに由来しＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ）
本明細書において、「Phanerochaete chrysosporiumに由来する」とは、Phanerochaete chrysosporiumに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産するＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ II）又は当該微生物の生産するタンパク質をコードする遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られたＣＢＨ IIをいう。したがって、Phanerochaete chrysosporiumから取得したＣＢＨ IIをコードする遺伝子（又はその改変遺伝子）を導入した形質転換体によって生産された組換体タンパク質であるＣＢＨ IIも、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIに該当する。
【００２８】
（ＰｃＣＢＨ２）
本発明におけるＣＢＨIIの一つの態様は、天然のPhanerochaete chrysosporiumから単離されるＣＢＨ II（以下、これを改変体と区別してＰｃＣＢＨ２という。）である。典型的なアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている（Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂａｉａｌ． ６０（１２），４３８７−４３９３（１９９４））。
【００２９】
本発明のＰｃＣＢＨ２は、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIであれば、同種の個々の菌株から採取されるものであってもよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列に基づいて他のPhanerochaete chrysosporium株から取得されたものであってもよい。ＰｃＣＢＨ２としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有していてもよく、また当該相同性アミノ酸配列からなっていてもよい。
【００３０】
ＰｃＣＢＨ２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してより好ましくは８０％以上の相同性、さらに好ましくは８５％以上の相同性、一層好ましくは９０％以上の相同性を有し、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。特定のアミノ酸配列に対する相同性は、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において利用可能なblastp, psi-blast, phi-blastを用いたprotein blastやblastxなどのプログラムを利用して取得することができる。
【００３１】
ＰｃＣＢＨ２は、また、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の全体又はその一部をプローブとして用いるとき、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるものであってもよい。本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第３版と略す）又は、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
こうして得られるＰｃＣＢＨ２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列及びこれと一定以上の相同性を有するアミノ酸配列のいずれかにおいて、また、１又は数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有していてもよく、また当該アミノ酸配列からなっていてもよい。アミノ酸変異の個数は特に限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失及び付加のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。
【００３３】
（ＰｃＣＢＨ２の改変体）
ＰｃＣＢＨ２の改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において人工的にアミノ酸変異を導入したものであり、ＣＢＨ II活性を有するタンパク質である。ＣＢＨ II活性を有するとは、ＣＢＨ II活性を有していれば足りるが、好ましくは、ＰｃＣＢＨ２と同等程度又はそれ以上のセルロース分解時における相乗効果を有していることを意味している。
【００３４】
アミノ酸変異は、各種の手法にて導入することができる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列や相同性配列をコードするＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。ＤＮＡに変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。
【００３５】
改変体としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２２位又はそれに相当する位置においてセリンがプロリンに置換（Ｓ２２Ｐ）された配列を有するものが挙げられる。かかるアミノ酸配列を配列番号４に示し、当該、アミノ酸配列をコードするＤＮＡにおける塩基配列の一例を配列番号３に示す。なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列の２２位に相当する位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して比較するタンパク質のアミノ酸配列の相同性を考慮しつつ、アラインメントを行い、配列番号２の２２位に相当する位置のセリンを決定することができる。
【００３６】
さらに、改変体としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列における以下の表３に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される選択される１種又は２種以上を有するものが挙げられる．なお、本明細書において、「アミノ酸変異に相当するアミノ酸変異」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して比較するタンパク質のアミノ酸配列の相同性を考慮しつつアラインメントを行って、「配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸変異に相当するアミノ酸変異」を決定できる。したがって、改変体は、特定のアミノ酸変異とそれに相当するアミノ酸変異との双方とを同時に有することはない。
以下の表３では、Ｉ群に属するアミノ酸変異は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるセルビロヒドロラーゼの全域に関する変異であり、II群に属するアミノ酸変異は、同セロビオヒドロラーゼの基質結合トンネル周辺の変異である。以下の表においては、I群に属するアミノ酸変異とII群に属するアミノ酸変異とを組み合わせて用いることが好ましい。また、以下の表３において有効性が「＊」として表記されるもの用いるのが好ましく、より好ましくは、有効性が「＊＊」として表記されるものを用いるのが好ましく、さらに好ましくは有効性が「＊＊＊」として表記されるものを用いるのが好ましい。
【表３】
【００３７】
改変体としては、より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列において以下の表４に示す各改変体が有する変異の種類に示すアミノ酸変異又はこれらのアミノ酸変異に相当する変異を有するタンパク質が挙げられる。なかでも、以下の表４において有効性が「＊＊」として表記されるものを用いるのが好ましく、有効性が「＊＊＊」として表記されるものを用いるのがさらに好ましい。特に、改変体５２〜５８として記載の改変体は、ＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ Ｉと組み合わせたときのセルロースの分解活性は、親株（野生型）の４．５倍以上であった（最大値はおおよそ６．５倍程度であった）。
【００３８】
【表４】
【００３９】
本発明におけるＰｃＣＢＨ２及びその改変体は、他の起源由来のエンドグルカナーゼと組み合わせたときに、セルロースの分解に相乗効果を有する。このような相乗効果は、以下に説明する本発明者らによる評価系（特願２００７−２４３６２６（特開２００９−７２１０２号公報）により評価することができる。
【００４０】
セルロース分解の相乗効果は、セルロースを含有する固相体からなる評価領域にＰｃＣＢＨ２又はその改変体を供給し、当該領域の固相体中のセルロースを分解させて、セルロースの消失に基づいて形成されるハロ（固相体においてバイオマスの分解により淡色化又は無色化する領域）等として検出できる。評価領域には相乗効果に寄与すると考えられる他のセルラーゼを併せて供給することができる。
【００４１】
固相体におけるセルロース消失に基づくハロは、通常、周囲よりも透明性の高い部分として形成され、そのままでも、目視等により視認することができる。ハロ検出時にコンゴレッドなどで、セルロースを染色することで明瞭にハロを検出することができる。また、バイオマスとして色素結合セルロース（例えば、Cellulose Azure、Sigma社製など）を用いた場合、セルロースの分解により色素が固相体中に拡散しハロを形成するため、容易にセルロース分解活性を検出することができる。同様に蛍光色素を結合したセルロースもバイオマスとして利用することでハロを容易に検出することができる。さらに、酸処理セルロースなどをバイオマスとして用いた場合にもセルロースの分解により透明なハロを形成するため、セルロース分解活性を容易に検出することができる。また、基質としてＣＭＣ等を用いて、ＤＮＳ法やソモギ−ネルソン法により、セルロースの分解によって生じる還元糖を検出してもよい。
【００４２】
ハロ形成用の固相体は、例えば、バイオマスを担持するゲルやフィルムが挙げられる。ゲルやフィルムの構成材料は特に限定しないで、天然又は人工の高分子材料を好ましく用いることができる。このような高分子材料としては、アガロース（寒天）を好ましく用いることができる。固相体は、例えば、ある程度精製されたバイオマスとしてのセルロースをアガロース溶液に懸濁又は溶解させた後、所定条件で固化することにより得ることができる。また、未精製のバイオマスを乾燥粉砕して得られた粉体をアガロース溶液に懸濁した後、固化することによっても得ることができる。固相体の形態及び固相体に含まれるセルロース量は、エンドグルカナーゼ活性を検出できる程度であればよい。ハロを検出するには、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）、アビセル等を用いることができるが、結晶構造を有する不溶性セルロースに対する相乗効果を評価するには、ＰＳＣやアビセルを用いることが好ましい。
【００４３】
本発明におけるＰｃＣＢＨ２及び改変体は、上述のようにタンパク質の無細胞合成系による遺伝子工学的手法によって取得することができるほか、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体において本発明のタンパク質を生産させる遺伝子工学的手法により取得することができる。形質転換体を用いた遺伝子工学的なタンパク質の生産方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４４】
本発明のＰｃＣＢＨ２及び改変体は、Phanerochaete chrysosporium又は各種微生物を宿主とする形質転換体が産生するタンパク質であるときには、これらの菌を培養して培養上清を取得し、この培養上清からＰｃＣＢＨ２及び改変体を分離・精製すればよい。分離や精製には公知のタンパク質の分離・精製法を適用すればよい。なお、ＰｃＣＢＨ２及び改変体を培養上清から分離精製することは必ずしも必要ではなく、培養上清をそのまま用いてもよい。
【００４５】
（セルロース分解用酵素製剤）
本発明のセルロース分解用酵素製剤は、ＰｃＣＢＨ２及び／又はその改変体（以下、ＰｃＣＢＨ２と改変体とを特に区別する必要がない限り、この文言に代えて単にＰｃＣＢＨ２等を用いる。）と、Phanerochaete chrysosporium以外の他の起源のエンドグルカナーゼとを含有することができる。本発明のＰｃＣＢＨ２等は、Phanerochaete chrysosporium以外の他の起源のエンドグルカナーゼと組合せてセルロースを分解するとき、セルロース分解のための相乗効果に強く寄与することが本発明者らによって初めて見出された。したがって、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼとを組み合わせる酵素製剤は、セルロース分解用として有用である。
【００４６】
本明細書において、セルロースは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体が挙げられる。グルコースの重合度は特に限定しない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースであってもよい。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体であってもよい。セルロース は、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。さらに、セルロースは、天然由来のものでも、人為的に合成したものでもよい。セルロースの由来も特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。また、セルロースは、上記したセルロースを含むセルロース含有材料であってもよい。セルロース含有材料は、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラ、籾殻、木材チップなどのリグノセルロース系の農産廃棄物などのいわゆる実バイオマスであってもよいし、その前処理物であってもよい。
【００４７】
他起源由来のエンドグルカナーゼにおける「他起源」とは、Phanerochaete chrysosporium以外の微生物を意味し、Phanerochaete chrysosporium以外であれば特に限定されないが、例えば、Trichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Clostridium thermocellum、Hemicola insolens、Chaetomium globosum等の公知のセルラーゼを生産又はその遺伝子を保有する菌が挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００４８】
他起源由来のエンドグルカナーゼとしては、公知の各種エンドグルカナーゼが挙げられ、これらを単独であるいは２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４９】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００５０】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。
【００５１】
本発明の酵素製剤は、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼは、ＣＢＨII及びその改変体をPhanerochaete chrysosporiumの培養物等から取得した場合においてＰｃＣＢＨ２及びその改変体とともに容易に取得できる。
【００５２】
本発明の酵素製剤は、エンドグルカナーゼ以外の他のセルラーゼを含むことができる。例えば、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ I）を含有することができる。ＣＢＨ Iは、ＣＢＨ Iが、ＰｃＣＢＨ２等と協動することにより、一層セルロース分解の相乗効果が発揮される。ＣＢＨ Iは、Phanerochaete chrysosporium由来であってもよいし、他起源であってもよい。
【００５３】
本発明の酵素製剤は、他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有していてもよい。セルラーゼ生産菌としては、特に限定されないで、適宜選択できるが、エンドグルカナーゼの起源としてTrichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００５４】
本発明の酵素製剤は、β−グルコシダーゼを含有していてもよいし、実質的に含有していなくてもよい。本発明の酵素製剤が、β−グルコシダーゼを実質的に含有していない場合、β−グルコシダーゼにより生成されるグルコースが他のセルラーゼに対して生産物阻害を生じない点において好ましい。したがって、β−グルコシダーゼを実質的に含有しない酵素製剤であれば、確実に生産物阻害を回避して、本発明者らが評価系で確認したセルロース分解の相乗効果を製剤においても得ることができる。なお、こうした酵素製剤は、グルコースにまで分解するものでなく、セルロースをセロビオース等のオリゴマーにまで分解する用途に用いることができる。
【００５５】
なお、実質的にβ−グルコシダーゼを含有しないとは、β−グルコシダーゼを含有しないほか、β−グルコシダーゼによる生産物阻害を回避又は抑制できる範囲でβ−グルコシダーゼ量を含んでいてもよいことを意味している。本発明の酵素製剤は、好ましくは、β−グルコシダーゼを含有していない。β−グルコシダーゼを実質的に含有しない酵素製剤は、例えば、内在性のβ−グルコシダーゼ遺伝子を保持しない微生物（酵母や麹菌等）や内在性のβ−グルコシダーゼ遺伝子を有するが当該遺伝子を破壊した微生物に対して、ＰｃＣＢＨ２等をコードする遺伝子並びに他起源のエンドグルカナーゼを導入した形質転換体の培養物から容易に得ることができる。
【００５６】
本発明の酵素製剤は、ＰｃＣＢＨ２等及び他起源のエンドグルカナーゼを、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００５７】
本発明の酵素製剤の生産方法は特に限定されない。例えば、他起源のエンドグルカナーゼ（上記のように他起源のセルラーゼ生産菌の培養物であってもよい）と、別に準備したＰｃＣＢＨ２等とを混合する形態であってもよいし、ＰｃＣＢＨ２等と他の起源のエンドグルカナーゼを共発現する形質転換体を培養して得られる培養物から製造する形態であってもよい。さらに、これらを適宜組み合わせる形態であってもよい。
【００５８】
（セルロース分解活性増強剤）
本発明のセルロース分解活性増強剤は、ＰｃＣＢＨ２等を含有し、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼを組み合わせて使用される。本発明におけるＰｃＣＢＨ２等は、他起源のエンドグルカナーゼと組合せてセルロースを分解するのに良好な相乗効果を発揮するため、他起源エンドグルカナーゼに組み合わせて用いる増強剤（添加剤）の形態を採ることもできる。本発明の増強剤におけるＰｃＣＢＨ２及び改変体については、上記で説明した通りの各種態様が適用される。また、本増強剤を用いるのに好ましい他起源のエンドグルカナーゼも、本発明の酵素製剤において組み合わせることの好ましいエンドグルカナーゼの各種態様が適用される。また、本発明の増強剤の組合せ先には、本発明の酵素製剤において組み合わせるのが好ましい他のセルラーゼの各種態様が適用される。
【００５９】
本発明の増強剤は、ＣＢＨ Iを含んでいてもよい。ＣＢＨ Iを含むことで、他起源のエンドグルカナーゼに組み合わされたときに、セルロース分解相乗効果が一層増強されるからである。ＣＢＨ Iとしては、好ましくは、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ I（ＰｃＣＢＨ１）が挙げられる。
【００６０】
本発明の増強剤は、ＰｃＣＢＨ２等を、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００６１】
本発明の増強剤の生産方法は、特に限定されない。天然由来のＰｃＣＢＨ２の場合には、当該ＰｃＣＢＨ２を生産する微生物を培養等してタンパク質画分又はその一部として本発明の増強剤を得ることができる。なお、改変体については、遺伝子工学的に取得して本発明の増強剤とすることができる。なお、天然由来のＰｃＣＢＨ２であっても遺伝子工学的に取得することもできる。
【００６２】
（ＤＮＡ構築物）
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明の改変体をコードするＤＮＡを含んでいる。より具体的には、配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、さらに具体的には、配列番号３に記載される塩基配列を有するＤＮＡを含んでいる。また、上記した表１に含まれるアミノ酸変異の１種又は２種以上を有する各種改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡや上記した表２に記載の各改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる。本発明のＤＮＡ構築物は、主として適当な宿主細胞の形質転換を意図した発現ベクターとしての形態を採ることができる。形質転換の手法や宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの保持形態（染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態等）に応じて、上記コード領域以外の構成要素が適宜決定される。また、ＤＮＡ構築物の形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、プラスミドやコスミドなどの適当なベクターの形態を採ることもできる。
【００６３】
なお、本発明によれば、配列番号４に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド及び配列番号３に記載される塩基配列を有するポリヌクレオチド他、各種態様のＰｃＣＢＨ２及びその改変体をコードするポリヌクレオチドも提供される。ポリヌクレオチドは、化学合成法や各種ＰＣＲ法等により取得することができる。なお、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（二重鎖及び一重鎖のいずれであってもよい）、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリット等、いずれの形態であってもよい。
【００６４】
（形質転換体）
本発明の形質転換体の一態様は、本発明の改変体を発現する形質転換体であり、上記した本発明のＤＮＡ構築物で適当な宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。例えば、本発明の改変体のみを細胞表層に保持し又は細胞外に分泌する形態で発現する形質転換体は、それ自体、本発明の増強剤として利用できる。また、こうした形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の増強剤の好ましい取得源として利用できる。
【００６５】
本発明の形質展開体は、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のＥＧとを共発現する態様とすることもできる。こうした共発現形態の形質転換体によれば、セルロース分解の相乗効果を得ることができる組合せを一挙に得ることができ、酵素製剤の製造及び形質転換体によるセルロースの分解に有利である。この態様の形質転換体において発現される好ましいエンドグルカナーゼ及びそのほかのセルラーゼについては、本発明の酵素製剤に関し既に説明した各種態様が適用される。
【００６６】
本発明の上記各種態様の形質転換体を得るのにあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることができる。遺伝子導入の宿主となる細胞は特に限定しないが、形質転換体によるセルロース分解及び酵素製剤の取得を考慮すると、例えば、Phanerochaete chrysosporium、Trichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Clostridium thermocellum、Hemicola insolens、Chaetomium globosum等の公知のセルラーゼ産生菌のほか、酵母や麹菌から選択される公知の非セルラーゼ生産菌等が挙げられる。さらに、後述する有機酸発酵やエタノール発酵等を考慮すると、非セルラーゼ生産菌でもあるSaccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属の酵母、Schizosaccharomyces pombe,等のSchizosaccharomyces属の酵母、Candida shehatae等のCandida属の酵母、Pichia stipitis等のPichia属の酵母、Hansenula属の酵母、Trichosporon属の酵母、Brettanomyces属の酵母、Pachysolen属の酵母、Yamadazyma属の酵母、Kluyveromyces marxianus, Kluveromyces lactis等のKluveromyces属の酵母が挙げられる。
【００６７】
共発現態様の形質転換体の作製にあたっては、本発明の組合せで酵素が発現されるように、宿主の種類に応じて、適宜、導入する遺伝子が決定される。例えば、Phanerochaete chrysosporiumを宿主とする場合には、ＰｃＣＢＨ２遺伝子は内在されているため、他起源の、例えば、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ遺伝子を導入すればよい。また、Trichoderma reeseiを宿主とする場合には、他起源のエンドグルカナーゼ遺伝子が内在されているため、ＰｃＣＢＨ２等をコードする外来遺伝子を導入する。さらに、非セルラーゼ生産菌に、ＰｃＣＢＨ２等及び他起源のエンドグルカナーゼをそれぞれコードする外来遺伝子を導入してもよい。
【００６８】
本発明の形質転換体においては、本発明において好適とされる組合せ以外のセルラーゼ遺伝子が発現されていてもよいが、その発現を抑制してもよい。好適な組合せ以外のセルラーゼ遺伝子の発現を抑制することで、必要なタンパク質のみをできるだけ多く発現させて、本発明の組合せによるセルロース分解相乗効果によりセルロースを効率的に分解できる。こうした形質転換体は、強力な相乗効果を発揮可能な酵素製剤の製造に有利である。
【００６９】
例えば、Trichoderma reeseiにＰｃＣＢＨ２等をコードする外来遺伝子を導入して本発明の形質転換体を得る場合、Trichoderma reeseiのＣＢＨ I、ＣＢＨ IIを発現させてもよいが、これらの遺伝子を破壊して不活性化しておいてもよい。また、酵母や麹菌から選択されるセルラーゼ非生産菌に、本発明において好適な組合せに係る酵素をコードする外来遺伝子を導入するようにして本発明の形質転換体を得ても良い。セルラーゼ非生産菌は、後述するように、内在性のβ−グルコシダーゼ遺伝子を有していないほか、外来遺伝子として導入するＰｃＣＢＨ２等やエンドグルカナーゼの発現量を調節して高発現させやすいという利点がある。こうした形質転換体は、強力な相乗効果を発揮可能な酵素製剤の製造に有利である。
【００７０】
本発明の形質転換体においては、β−グルコシダーゼの発現が抑制されていてもよい。すなわち、内在性β−グルコシダーゼ遺伝子を有する宿主を利用した形質転換体にあっては、当該遺伝子が破壊されており、内在性β−グルコシダーゼ遺伝子を有しない宿主（例えば、セルラーゼ非生産菌など）を利用した形質転換体であってもよい。β−グルコシダーゼは、既に説明したように、生産物阻害によりセルロース分解を抑制するからである。こうした形質転換体は、酵素製剤、特に、セルロースをオリゴマーにまで低分子化するための酵素製剤として好ましい。特定遺伝子の破壊は、当業者であれば適宜実施できる。
【００７１】
なお、上記した本発明のＤＮＡ構築物及び形質転換体の作製方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００７２】
なお、本発明の形質転換体においては、こうした組合せの酵素を細胞内に発現するようにしてもよいし、細胞表層に保持する又は細胞外に分泌するように構築してもよい。細胞表層に保持する形態又は細胞外に分泌する形態であれば、形質転換体をそのままセルロースに分解に利用できる。細胞外に分泌する形態は、培養上清から酵素製剤を取得するのにも有利である。
【００７３】
（酵素製剤の生産方法）
本発明によれば、本発明の共発現態様の形質転換体を用いて本発明の酵素製剤を製造する方法が提供される。本発明によれば、好ましい組合せのセルラーゼからなる酵素製剤を一挙に得ることができる。本発明の生産方法には、上記した共発現態様の形質転換体において、特に酵素製剤の製造に好ましいとされる形質転換体を用いることで、効率的にかつ強力な酵素製剤を容易に得ることができる。
【００７４】
形質転換体の培養については、用いた宿主や発現ベクター等を考慮して適宜決定される。培養により培養菌体及び／又は培養上清を取得して、これらからタンパク質を含む画分を取得し、必要に応じ分離・精製すればよい。分離や精製には公知のタンパク質の分離・精製法を適用すればよい。ＰｃＣＢＨ２や他起源エンドグルカナーゼが分泌生産される場合には、培養上清をそのまま用いることもできる。得られた酵素画分は、必要に応じて乾燥等し粉末化するなどして各種形態の酵素製剤とすることができる。
【００７５】
なお、酵素製剤が、他の他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有している場合には、こうした培養物も併せてタンパク質を分離してもよいし、本発明の共発現形質転換体とは別個に、こうした培養物からタンパク質を分離して本発明の共発現形質転換体の培養物あるいは製剤に添加してもよい。
【００７６】
（セルロースの低分子化産物の生産方法）
本発明のセルロースの低分子化産物の生産方法は、セルロースの存在下、ＰｃＣＢＨ２等と、他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを低分子化する工程を備えている。本発明によれば、効率的にセルロースを低分子化、セルロースオリゴマー又はグルコースを生産できる。グルコースまで低分子化するには、β−グルコシダーゼも用いる。
【００７７】
低分子化工程においてセルロースを効率的にセルロースオリゴマーにまで分解するには、β−グルコシダーゼの実質的な非存在下でセルロースを分解することが好ましい。こうすることで、β−グルコシダーゼによる生産物阻害の影響を回避又は抑制できる。なお、「β−グルコシダーゼの実質的な非存在下」とは、β−グルコシダーゼが存在しないほか、β−グルコシダーゼによる生産物阻害を回避又は抑制できる範囲でβ−グルコシダーゼが存在していてもよい、ことを意味している。セルロースオリゴマーを得るためには、β−グルコシダーゼはこの酵素反応系内に存在しないことが好ましい。
【００７８】
低分子化工程は、β−グルコシダーゼの非存在下、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼとを用いてセルロースを分解し、その後、得られたセルロースオリゴマーに対して、β−グルコシダーゼを供給して分解する工程とすることができる。こうすることで、効率的にセルロースをグルコースにまで分解できる。
【００７９】
低分子化工程は、ＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼ（例えば、商業的に入手可能な酵素製剤等）と組み合わせて用いることができる。こうすることで、優れた相乗効果は発揮することができる。例えば、セルロースやリグニンやヘミセルロースを含む稲ワラ等のリグノセルロース系バイオマス（実バイオマス）の前処理物であっても、他起源のエンドグルカナーゼとの優れた相乗効果を得ることができる。すなわち、本発明の酵素の組み合わせによれば、リグニンやヘミセルロースの存在下であっても高効率にセルロースを分解できる。特に、改変体５２〜５８は、市販酵素製剤などのセルラーゼ製剤や、ＢＧＬ＋ＥＧ＋ＣＢＨ Iと組み合わせたとき、優れた相乗効果は発揮することができる。
【００８０】
本発明の生産方法で用いるＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼとの組合せは、上記のように本発明の酵素製剤として提供されていてもよいし、また、本発明の共発現形態の形質転換体の細胞表層に提示された状態で提供されていてもよい。さらに、ＰｃＣＢＨ２等のみが酵素製剤として提供され、他起源エンドグルカナーゼが細胞表層や細胞外に分泌された形態で提供されていてもよい。細胞外への分泌及び細胞表層での保持させる方法としては、各種手法が知られているが、細胞表層提示のための公知のタンパク質や分泌用タンパク質をＰｃＣＢＨ２等や他起源のエンドグルカナーゼに連結した融合タンパク質を発現するように形質転換体を得る方法が挙げられる。
【００８１】
以上説明した、本発明のセルロースの低分子化産物の生産方法において、用いるＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼについては、既に説明した本発明の組合せの各種態様が適用される。そして、好ましい態様の組合せを用いることで、一層効率的なセルロースの分解が可能となる。
【００８２】
（有用物質生産方法）
セルロースの存在下、ＰｃＣＢＨ２等と、他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、実質的にβ−グルコシダーゼの非存在下でセルロースを分解してセルロースオリゴマーを生産する工程と、前記セルロースオリゴマーをβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを生産する工程と、を備えることができる。本発明の有用物質を生産する方法は、一旦セルロースオリゴマーとした後で、好適には、こうしたオリゴマーを回収した後、これをさらにβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを得る。こうすることで、セルロースオリゴマーをセルロースによる酵素反応の阻害を回避又は抑制して、効率的にセルロースオリゴマーを得、その後、このオリゴマーに対してβ−グルコシダーゼを作用させることで、効率的にグルコースを取得し、これを炭素源として用いて有用物質を生産できる。
【００８３】
有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましい。利用する微生物としては、特に限定しないが、酵母などのエタノール生産微生物や乳酸菌などの有機酸生産微生物が挙げられる。これらはいずれも人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。
【００８４】
例えば、本発明の有用物質生産方法は、グルコース生産工程で得られるグルコースを炭素源として利用できるが、グルコース生産工程を、β−グルコシダーゼを発現する微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いるエタノール発酵工程とすることができる。こうすることで、グルコースによる生産物阻害なく、効率的にセルロースを利用してエタノールを生産できる。また、グルコース生産工程を、β−グルコシダーゼを発現する有機酸生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いる有機酸発酵工程とすることができる。こうすることで、グルコースによる生産物阻害なく、効率的にセルロースを利用して有機酸を生産できる。
【００８５】
なお、本明細書において、「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であって、遊離の酸あるいはその塩である。「有機酸」が備える酸性基としては、カルボン酸基であることが好ましい。このような「有機酸」としては、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などが挙げられる。これらの「有機酸」は、Ｄ体、Ｌ体のほか、ＤＬ体であってもよい。「有機酸」は好ましくは、乳酸である。
【００８６】
また、有機酸生産微生物としては、乳酸を発酵する微生物として、乳酸生産酵母が挙げられ、かかる酵母としては、例えば、特開２００３−２５９８７８、特開２００４−１８７６３、特開２００５−１３７３０６、特開２００６−６２７１、特開２００６−２０６０２、特開２００６−４２７１９、特開２００６−２８３１８、特開２００６−２９６３７７、特開２００７−８９４６６、特開２００７−１７５０２９等に開示されている乳酸生産酵母等が挙げられる。
【００８７】
以上説明した、本発明の有用物質の生産方法において用いるＰｃＣＢＨ２等と他起源のエンドグルカナーゼについては、既に説明した本発明の組合せの各種態様が適用される。そして、好ましい態様の組合せを用いることで、一層効率的なセルロースの分解が可能となり、有用物質を効率的に生産できるようになる。
【００８８】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） に従い行った。
【実施例１】
【００８９】
（各種セルラーゼの活性型での生産）
グリコシド結合を切断する酵素群（ＥＣ３．２．１．−）は、Glycoside Hydrolase Family（以下、ＧＨＦ）により分類されており、各種セルラーゼもこれに含まれる。相乗効果を試験するために、ＣＢＨとＥＧについて、なるべく多くのＧＨＦに分類される酵素を本実施例で評価した。ＣＢＨ（ＥＣ３．２．１．９１）は、ＧＨＦ５，６，７，９，１０，４８に分類されるものが、ＥＧ（ＥＣ．３．２．１.４）は、ＧＨＦ５,６,７,８,９,１０,１２，２６，４４，４５，４８，５１，６１，７４に分類されるものが、ＢＧＬ（ＥＣ．３．２．２１）は、ＧＨＦ１，３，９に分類されるものが報告されている。ＣＢＨについては、ＧＨＦ５，６，７，９に属するものが知られている。そこで、ＣＢＨについて、４種類のＧＨＦに分類される５種類の微生物（Trichoderma reesei、Phanerochaete chrysosporium、Aspergillus aculeatus、Aspergillus oryzae、Clostridium thermocellum）由来の１３種類を用いた。ＥＧについては、ＧＨＦ５,６,７,８,９,１２，４５，４８，６１の９種類に分類される６種類の微生物（Trichoderma reesei、Phanerochaete chrysosporium、Aspergillus aculeatus、Aspergillus oryzae、Hemicola insolens、Clostridium thermocellum、Chaetomium globosum）由来の２４種類のＥＧを用いた。ＢＧＬとしては、ＧＨＦ３に属するPhanerochaete chrysosporium由来の１種類の酵素を用いた。
【００９０】
各種セルラーゼの成熟タンパク質領域の上流側に開始コドン、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）をＰＣＲにより連結した。下流側にＴ７ターミネーターをＰＣＲにより連結した。全長のＰＣＲ産物をエタノール沈殿したものを、転写翻訳反応の鋳型として用いた。なお、鋳型ＤＮＡの作製に際し、以下の酵素をコードするＤＮＡの塩基配列については、各種酵素につき、それぞれ以下に示すアクセッション番号によってＮＣＢ１のホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から取得してＰＣＲプライマーを設計した。
PcCBH II: S76141
TrCBH II: M16190
AoCBH II: AP007169
PcCBH I: M22220
TrCBH I: X69976
AaCBH I: AB002821
AoCBH I: AB089436
TrEG I: AAA34212.1
TrEG V: Z33381
AnEG II: AF331518
AoEGII: AB195229
TrEG II: AAA34213.1
AnEGIII: AJ224451
PcEG III: AY682744
TrEG III: BAA20140
【００９１】
シャペロン（大腸菌由来のＤｎａＫ／ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ）を高発現した大腸菌を破砕後、Ｓ３０画分を還元剤（ジチオスレイトール；ＤＴＴ）未添加で調製したものを無細胞合成のための抽出液（媒体）として用いた。この抽出液に、上記の鋳型ＤＮＡ、５６．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．４、１．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、４０ｍＭクレアチンフォスフェート、０．７ｍＭ ２０アミノ酸ミックス、４．１％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール６０００、３５μｇ／ｍｌ フォリン酸、０．２ｍｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ、３６ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．１５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１０μｇ／ｍｌ リファンピリシン、７．７μｇ／ｍｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びカビ由来ＰＤＩと１ｍＭ ＧＳＨ／０．１ｍＭ ＧＳＳＧを加え、２６℃、１〜３時間、転写翻訳共役反応を行った。
【００９２】
これらの酵素につき、カルボキシル化メチルセルロースに寒天を加えて固化させ、セルロース含有プレートを作製した。無細胞合成後の各反応液１μｌを、セルロース含有プレート上にアレイ状に添加し、酵素反応を生じさせた。反応後、染色液（コンゴーレッド）をセルロース含有プレートに滴下重層して染色し、セルラーゼ反応部分が脱色されたハロが形成されるまで脱色反応を行った。すべての反応液について、ハロが検出されたことから、実施例１の無細胞合成系でCBHを活性型で合成できることがわかった。
【実施例２】
【００９３】
（相乗効果の評価その１）
本実施例では、実施例１で無細胞合成した各種セルラーゼにつき、相乗効果に基づく不溶性のセルロースの分解を評価した。すなわち、マイクロタイタープレート上で、０．１％リン酸膨潤セルロース（以下、ＰＳＣという。）に寒天を加えて固化させ、高分子不溶性セルロース含有プレートとした。活性型で合成した実施例１のＢＧＬをすべてのスポットに１μｌづつ添加した。その上から、活性型で合成した実施例１の各種ＣＢＨ及びＥＧを、縦列と横列にそれぞれ１μｌづつ添加した。４０℃で反応後、染色液（コンゴレッド）を寒天上に滴下重層して染色し、これらセルラーゼによる反応部分が脱色されハロ（脱色されて白い部分が大きいほど、高いセルロース分解活性を持つ）が、形成されるまで脱色反応を行った。形成したハロの大きさを測定し、相対活性で表示した。ＰＳＣは、高分子セルロースであり、相乗効果が強く認められたときにのみハロを形成する評価系である。結果を図１に示す。
【００９４】
図１に示すように、ＢＧＬと各種ＥＧに対して、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ II（ＰｃＣＢＨ２）を添加した場合と比較して、顕著にセルロース分解活性が向上しており、セルロース分解のための相乗作用に強く寄与していることがわかった。ＰｃＣＢＨ IIと相乗効果を示す組み合わせに効果が高いＥＧは、ＧＨＦ５に分類されるTrichoderma reesei由来のＴｒＥＧ II及びAspergillus oryzae由来のＡｏＥＧII、ＧＨＦ１２に分類されるＴｒＥＧIIIであった。また、ＧＨＦ７に分類されるＴｒＥＧＩ及びＧＨＦ４５に分類されるＴｒＥＧＶも高い相乗効果が得られた。特に、ＰｃＣＢＨ２とＴｒＥＧ IIとの組み合わせが最も相乗効果が高かった。
【実施例３】
【００９５】
（相乗効果の評価その２）
ＣＢＨには、ＧＨＦ７に属するＣＢＨ Ｉと、ＧＨＦ６に属するＣＢＨ IIが知られていることから、ＢＧＬとＥＧに加えるＣＢＨとしては、ＣＢＨ ＩとＣＢＨIIとの双方を添加することが好ましいと考えられる。そこで、活性型で合成した実施例１のＢＧＬを実施例２と同様にして作製した高分子不溶性セルロース含有プレートスポットした上に、ＣＢＨ Ｉ及びＥＧとを各種の組合せで１μｌづつスポットしたプレートを３種類作製し、それぞれのプレートに異なるＣＢＨ IIを１μｌづつスポットした。４０℃で反応後、染色液（コンゴレッド）をプレート上に滴下重層して染色し、セルラーゼ反応部分が脱色され、ハロが形成されるまで脱色反応を行った。形成したハロの大きさを測定し、相対活性で表示した。結果を図２に示す。
【００９６】
図２Ａ〜図２Ｃに示すように、Trichoderma reesei由来のＣＢＨ II（ＴｒＣＢＨ２）(図２Ｃ)及びAspergillus aculeatus由来のＣＢＨ II（ＡｃＣＢＨ２）(図２Ｂ)を添加した場合と比較して、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ II（ＰｃＣＢＨ２）を添加した場合(図２Ａ)、顕著にセルロース分解活性が向上しており、当該酵素がセルロース分解の相乗効果に強く寄与していることがわかった。Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIと相乗効果を示す組合せに効果の高いＥＧは、ＧＨＦ５に分類されるＥＧ(Trichoderma reesei由来のＴｒＥＧII、Aspergillus niger由来ＡｎＥＧII)、ＧＨＦ１２に分類されるＥＧ（Trichoderma reesei由来のＴｒＥＧIII、Aspergillus niger由来のＡｎＥＧIII、Phanerochaete chrysosporium由来のＰｃＥＧIII）であった。
【実施例４】
【００９７】
（改変体ライブラリーの作製）
Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ IIのセルロース結合ドメインにランダム変異を導入した。ランダム変異は、エラープローンＰＣＲ（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５−１０ｍＭＭｇＣｌ2、０．５〜２．０ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１〜１００ｎｇ／μｌ ＭｎＰ、０．３μＭ プライマー、２５ｍＵ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）により増幅し、１００塩基当たり平均０．５個の変異（エラー率０．５％）をランダムに導入し、ライブラリーを作製した。平均１分子／ウェルまで希釈後に、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼを用いて９４℃で２分の加熱後に、９６℃で１０秒、６５℃で５秒及び７２℃で１分のサイクルを６５回繰り返し、その後７２℃で７分加熱して、１分子ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物各１μｌを鋳型として実施例１に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液９μｌに加え、転写・翻訳共役反応を行った。変異酵素ライブラリーを３８４プレート６枚に構築した。
【実施例５】
【００９８】
（高活性改変体のスクリーニング）
酵素変異ライブラリー各１μｌを、無細胞合成した実施例１で用いたのと同様のPhanerochaete chrysosporium由来のＢＧＬ、ＣＢＨ I及びTrichoderma reesei由来のＥＧIIをそれぞれ既に０．１μｌづつ実施例２で作製したのと同様の高分子不溶性セルロース含有プレート上に添加し、４０℃で反応させた結果、野生型よりもハロが大きいウェルが得られた。ハロが大きいウェルの上位２０個について、その１分子ＰＣＲ産物を大腸菌にクローン化して、各ウェルの形質転換体の４〜１０クローンについて、アミノ酸配列を決定した。変異が確認できたクローンのうち、配列が異なるものを選出し、無細胞合成を行い各改変体の分解活性を評価した。スクリーニング時と同様に、クローン化した各改変体の合成産物１μｌを、ＢＧＬ、ＥＧ、ＣＢＨ Iをそれぞれ１μｌづつスポットした高分子不溶性セルロース含有プレート上に添加し、４０℃で反応させた。その結果、変異導入前よりセルロース分解の相乗効果の高い改変体が数個得られたことがわかった。最も効果が高かった改変体について、相乗効果（ＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ Iの共存下）での高分子不溶性セルロース含有プレートでの評価結果を図３に示す。
【００９９】
図３に示すように、ＣＢＨ なし（ＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ I）と比較して、野生型であるＰｃＣＢＨ２では白色部分が大きく、さらに改変体では大きくなること（野生型の約２倍）がわかった。
【実施例６】
【０１００】
（改変体の評価）
無細胞合成した実施例１で用いたのと同様のPhanerochaete chrysosporium由来のＢＧＬ、ＣＢＨ I及びTrichoderma reesei由来のＥＧIIのそれぞれ１μｌづつを、１％ＰＳＣ又は１％アビセルを含む水溶液に添加した。そこへ、野生型ＰｃＣＢＨ２及び改変体を各１μｌ添加し、４０℃で２4時間反応後の還元糖量をＴＺアッセイ法（ＴＺ法；Jouranl of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985））により測定した。ＰＳＣ分解活性を図４に示す、アブセルロース分解活性を図５に示す。
【０１０１】
図４及び図５に示すように、いずれも野生型のＰｃＣＢＨ２活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合と、相乗効果ではなく単独でのＰＳＣ溶液分解時の還元糖量を測定した結果を示す。ＰＳＣ分解活性では、改変体は、野生型ＰｃＣＢＨ２よりも相乗効果が２．３倍強く、単独での分解活性は４倍程度強いことがわかった。アビセル分解活性は、相乗効果で１．３倍、単独活性では２．３倍であった。また、改変体のアミノ酸の置換部位はＳ２２Ｐであった。
【実施例７】
【０１０２】
（市販酵素製剤に対する添加効果その１）
１％ＰＳＣ水溶液２００μｌに、Trichoderma reesei由来の市販酵素製剤であるＳｉｇｍａ製のセルクラストＣ２７３０を４００ｎｇを加え、野生型のＰｃＣＢＨ２、改変体、ネガティブコントロール（ＣＢＨ添加なしの市販酵素製剤のみ）、Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ I、Trichoderma reesei由来のＣＢＨ I、Trichoderma reesei由来のＣＢＨ II、Aspergillus aculeatus由来のＣＢＨ I、及びAspergillus oryzae由来のＣＢＨ Iの順に、無細胞合成した産物各３μｌを、それぞれ添加し、４０℃で反応させた。還元糖量を実施例６に示すＴＺ法で測定した。結果を図６に示す。
【０１０３】
図６に示すように、セルロース分解活性は、各活性からネガティブコントロールの数値を差し引いた後の野生型の分解活性を１とした相対活性で示す。野生型ＰｃＣＢＨ２を添加した場合、他種微生物由来のＣＢＨを添加した場合と比較して分解活性が高いことがわかった。また、野生型と改変体との比較では、改変体の方が添加効果が高かった。
【実施例８】
【０１０４】
（酵母による発現と精製）
野生型ＰｃＣＢＨ２（Phanerochaete chrysosporium由来のＣＢＨ II）をＰＣＲで増幅し、酵母分泌発現ベクターであるｐＲＳ４３６ＧＡＰＳＳＲＧにサブクローニングした。ｐＲＳ４３６ＧＡＰＳＳＲＧは、ＴＤＨ３プロモーターの下流に、分泌シグナルをもち菌体に酵素を分泌させることが可能である。本ベクターを酵母（ＭＴ８−２株）に形質転換し、ＳＤ−ＵＲＡ寒天培地（Yeast-nitrogen base without amino acids without ammonium sulfate１．７ｇ、カザミノ酸５ｇ、アミノ酸ミックス、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ、脱イオン水１０００ｍｌ）で３０℃で３日間培養した。本培養は、ファーメンターを用いてｐＨを５．５に維持しながら行った。生育したコロニーをＳＤ−ＵＲＡ液体培地で前培養し、ＯＤ６００＝０．１となるように本培養液５００ｍｌに植菌し、２５℃で３日間培養した。
【０１０５】
培養上清を回収し、硫安濃度７０％で硫安沈殿を行った。硫安沈殿後のタンパク質をバッファ（１Ｍ硫安、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)）で溶解し、限外ろ過で完全にバッファ置換したサンプルを精製用サンプルとした。
【０１０６】
同様のバッファで膨潤したアビセル溶液（アビセル１０ｇ、バッファー４０ｍｌ）２ｍｌをカラムに詰めアビセルカラムを作製した。ペリスタポンプを用いて１ｍｌ／分の流速でサンプルをカラムに流した。その後、同バッファー２０ｍｌ（流速１ｍｌ／分）で洗浄し、滅菌水で溶出した（流速０．５ｍｌ／分）。１ｍｌづつ回収した画分を、カルボキシメチルセルロース含有寒天のプレートに滴下してセルロース分解活性を確認後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、活性型のＣＢＨ IIをほぼ単一バンドにまで精製できた。バイオラッド社のプロテインアッセイキットによりタンパク質を定量した。
【実施例９】
【０１０７】
（市販酵素製剤に対する添加効果その２）
【０１０８】
実施例８で得られた野生型ＰｃＣＢＨ２のTrichoderma reesei由来の市販酵素製剤に対しての添加効果を評価した。市販酵素製剤として、Ｓｉｇｍａ製のセルクラストＣ２７３０を用い、上段には各６０ｎｇ／μｌ、下段には１２０μｇ／μｌをそれぞれ１μｌ、０．１％ＰＳＣ含有プレートにスポットした。縦列には、左からネガティブコントロール（ＣＢＨなし）、ＰｃＣＢＨ２（１００ｎｇ／μｌ）をそれぞれ１μｌ、酵素製剤スポットの上から滴下し、４０℃で反応させた。２４時間後にコンゴレッドにより染色した。結果を図７に示す。
【０１０９】
図７に示すように、ネガティブコントロールと比較すると、ＰｃＣＢＨ２をスポットした場合ではハロが大きい傾向があることがわかった。ハロの大きさから、ＰｃＣＢＨ２を添加した場合の分解活性は、ネガティブコントロールの約１．５〜２倍であった。したがって、市販酵素製剤にＰｃＣＢＨ２を添加することで、セルロース分解効果を高める相乗効果が得られることがわかった。
【実施例１０】
【０１１０】
（市販酵素製剤に対する添加効果その３）
Trichoderma reesei由来の市販酵素製剤Ｓｉｇｍａ製のセルクラストＣ２７３０に対してのＰｃＣＢＨ２の添加効果を評価した。無細胞合成したＢＧＬ、ＥＧ及びＣＢＨ Ｉのそれぞれ１μｌづつを、１％ＰＳＣ含有水溶液２００μｌに、セルクラスト０〜４００ｎｇ及びＰｃＣＢＨ２ １００〜０ｎｇを添加した。４０℃で２４時間反応後の還元糖量をＴＺアッセイ法（ＴＺ法；Jouranl of Biochemical and Biophysical Methods, 11（1985））により測定した。各濃度におけるセルクラスト単独とＰｃＣＢＨ２単独での活性を加算した相加予測値を図８に示す。
【０１１１】
図８に示すように、相加予測値よりも実測値のほうがＰＳＣ分解活性が高く、添加による相乗効果が認められた。また、ＰｃＣＢＨ２の添加濃度はセルクラストの添加濃度の１／４程度であっても効果があることがわかった。
【実施例１１】
【０１１２】
実施例５で得られたS22P改変体の他、２番目に活性が高かったQ2H改変体（配列番号２で表されるアミノ酸配列において第２番目のグルタミンがヒスチジンに置換した改変体である。表２に改変体１として示す。）について、合成量を合わせて比活性を測定した。合成量の測定は、無細胞合成時に蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を取り込ませ合成産物を蛍光ラベルした後、蛍光イメージアナライザー（FLA9000：富士フィルム株式会社）で検出、画像解析ソフトであるMulti Gaugeで解析を行った。無細胞合成したBGL、EG、CBHIのそれぞれ0.2μｌずつを、0.5％PSCを含む水溶液に添加した。そこへ、野生型PcCBH2、S22P改変体、Q2H改変体について、野生型PcCBH2での1μｌ相当量を添加し、40℃で15時間反応後の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。図９に、野生型PcCBH2活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。図９に示すように、Ｓ２２Ｐ改変体及びＱ２Ｈ改変体は、いずれも野生型よりも相乗効果を示した。
【実施例１２】
【０１１３】
（PcCBH2の触媒ドメイン変異ライブラリーの作成）
実施例６で得られたS22P改変体を親遺伝子として、ランダム変異を導入した。error-prone PCR（10 mM Tris-HClpH 9.0， 50 mM KCl， 0.1％TritonX-100， 5-10 mM MgCl2， 0.5-2.0 mM MnCl2， 0.2 mM dATP， 0.2 mM dGTP，1 mM dCTP，1 mM dTTP，1-100 ng／μl DNA， 0.3μM primer， 25 mU／μl Promega Taq DNA polymerase）により増幅し、100塩基当たり平均0.5個の変異（error率0.5％）をランダムに導入し、ライブラリーを作製した。PCR産物各1μlを鋳型として実施例1に示す組成の無細胞タンパク質合成反応液7μlに加え、転写・翻訳共役反応を行った。変異酵素ライブラリーを384プレート8枚に構築した。
【実施例１３】
【０１１４】
（スクリーニング方法）
酵素変異ライブラリー各1μlを、無細胞合成したBGL、EG、CBHIをそれぞれ0.1μlずつ加えた0.25％PSC溶液100μlに添加し、40℃で24時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をソモギ-ネルソン法により測定した。その結果、親遺伝子であるS22P改変体よりも還元糖量が向上したウェルが複数得られた。還元糖量の上位61ウェルについて、そのPCR産物を大腸菌にクローン化して、各ウェルの形質転換体の4〜10クローンについて再度ソモギ-ネルソン法により還元糖量を測定した。そのうち上位60クローンについて、アミノ酸配列を決定した。スクリーニングで得られた60クローンのうち配列が異なるものを、実施例１１と同様にして合成量を合わせて比活性を測定した。その結果、比活性において親遺伝子であるS22P改変体よりも相乗効果が高い改変体が複数得られた。
【実施例１４】
【０１１５】
（スクリーニングで得られた改変体の評価結果）
実施例１３で得られた改変体のうち、上位11クローンの比活性を実施例１１と同様に測定した結果を図１０に示す。なお、以下の実施例において図表等において用いる改変体の種類は、表２に示す改変体の種類を表している。図１０に示すように、最も活性の高かった改変体１２では親遺伝子であるS22P改変体と比較して、相乗効果で２倍程度PSC分解活性が向上していた。アミノ酸置換はS22Pの他にGln2His（Q2H）、Leu29Pro（L29P）、Asn191His（N191H）のアミノ酸が置換されていた。Gln2His（Q2H）は、実施例５のスクリーニング時に取得した2番目に活性が高かったQ2H改変体（改変体１）（実施例１１）と同じ位置の変異であった。他の改変体のアミノ酸置換を表５に示す。
【０１１６】
【表５】
【実施例１５】
【０１１７】
（シングル化改変体の結果）
実施例１４において比活性の向上していた改変体で、かつ複数の変異をもつクローンについて、変異を分離する事で、S22P改変体と比較した場合の各変異の影響を評価した。評価した改変体の一覧を表６に示す。無細胞合成したBGL、EG、CBHIをそれぞれ0.4μlずつ加えた0.5％PSC溶液200μlに、実施例１１と同様にして合成量を測定した無細胞合成産物を添加し、40℃で数時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、S22P改変体と比較して活性の向上が見られた改変体４、７、１４、１８が有する変異のうち、S22P以外の変異であるS60L、V28A、L29P、N191Hの4変異を有効な変異とした。
【０１１８】
【表６】
【実施例１６】
【０１１９】
（PcCBH2立体構造モデルの構築）
CBHは主にセルロース結合ドメインと触媒ドメインが存在しており、両者はリンカーでつながった構造をとることが知られている。両ドメインの構造は、X線解析により別々に解かれており、CBHIIの触媒ドメインとしては、以下の2種類の酵素の構造がPDB（Protein Data Book）に報告されている。Trichoderma reesei由来CBHII （以下、TrCBH2）とCellotetraose complex ； PDB Ｎo. 1QK2、及びHumicola insolens 由来CBHIIとCellotetraose and Glucose complex ； PDB Ｎo. 2BVWである。PcCBH2の触媒ドメイン部分のアミノ酸配列のみを、genebankのPSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)で相同性検索した結果のうち、PDBに登録がある配列の上位２種類は、上記CBHIIの触媒ドメインであった。PcCBH2モデル構築の参照タンパク質として、相同性が高い方（56％）であるTrCBH2（PDB：1QK2）を用いることとした。
【０１２０】
分子の表示・モデルの構築・構造安定化計算等は、アクセルリス社製InsightIIを用いて実施した。PcCBH2とTrCBH2(1QK2)のアミノ酸配列のアライメント結果を基に、ホモロジーモデリングを行った。構築したモデルPcCBH2-CDとモデル構築時の参照タンパク質としたTrCBH2(1QK2)の主鎖構造の重ね合わせを行った結果、主鎖構造はほぼ一致しており、CBHの特徴である触媒アミノ酸残基、基質結合部位のトンネル、トンネル上部のループ構造が確認できたことから、ある程度信頼性のあるモデルが構築できたと考えられた。
【実施例１７】
【０１２１】
（基質結合トンネル周辺の部位特異的改変体の作成）
実施例１６で構築したモデルを元に、セルロース鎖結合トンネル周辺のアミノ酸で、基質結合や基質移動に影響を及ぼす可能性があると推測され、かつ、他のCBH2で完全保存されていないアミノ酸１７ヵ所を抽出した（図１２）。野生型PcCBH2のこれらのアミノ酸残基を表７に示す通りに置換した各種改変体を作製し、合成量当たりの活性を評価した。すなわち、無細胞合成したBGL、EG、CBHIのそれぞれ0.2μｌを加えた１％PSCに、野生型PcCBH2、または各種改変体について、野生型での1μｌ相当量を添加し、40℃で15時間反応後の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。結果を図１３に示す。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
図１３には、野生型PcCBH2の活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。図１３に示すように、野生型PcCBH2の２倍程度向上していた改変体は１１種類（表２中の改変体の番号：２３、２７、２８、３２、３４，３５、３６、３７、３９、４０、４２）、1.5倍程度向上していた改変体は１０種類（同：２４、２６、３１、３８、４１、４４、４５、４９、５０、５１）、1.3倍程度向上していた改変体は１１種類（２０、２１、２２、２５、２９、３０、３３、４３、４６、４７、４８）であった。特に、配列番号２において269番目のアミノ酸残基は、Trp（野生型）とPhe以外の他のアミノ酸に変換した場合に顕著に活性が向上することがわかった。疎水性で芳香環をもつアミノ酸残基が活性発現に影響していると推測される。また、266番目のTrp（野生型）は、モデルを構築した際に、最も揺らぎが大きいアミノ酸であった。アラニンに置換することで活性が向上したことから、酵素活性発現の安定性に寄与している可能性が示唆される。その他、活性が向上した改変体の置換アミノ酸残基は、263番目のHis（H263T、H263F）と99番目のTyr（Y99T）であった。
【実施例１８】
【０１２４】
（相加改変体の作製）
変異の相加は、実施例１１で有効変異を明らかにしたS22PとQ2H、実施例１５で抽出したV28A、L29P、S60L、N191H、実施例１７で抽出したW269A、W269R、W269M、Y99T、H263F、W266A、実施例１４から推測されるL132V、F382Sを候補とした。これらの内、S22P、Q2H、L29P、N191Hは改変体１２に含まれる変異である。そこで、変異の相加は改変体１２をベースに、表８に示す通り、５２〜５８の７種類の相加改変体の作製を実施した。
【０１２５】
【表８】
【実施例１９】
【０１２６】
（相加改変体によるカクテル効果）
表８に示す改変体について、無細胞合成したBGL、EG、CBHIをそれぞれ0.2μlずつ加えた0.5％PSC溶液200μlに、合成量を測定した無細胞合成産物を添加し、40℃で4時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。図１４に、野生型PcCBH2の活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。
【０１２７】
相加のベースとした改変体１２と比較して、無細胞合成したBGL、EG、CBHIとのカクテルによる相乗効果は、改変体５２〜５８で向上しており、野生型と比較すると約4.5〜6.5倍であった。また、市販酵素製剤との相乗効果は、改変体５５で最も高く、野生型の約6.5倍であった。有効変異を相加して行くことにより更に活性が向上できる可能性が示された。
【実施例２０】
【０１２８】
（相加改変体による市販酵素製剤添加効果）
表９に示す改変体について、市販酵素製剤（Sigma製のセルクラストC2730）を400ng加えた0.5％PSC溶液200μlに、合成量を測定した無細胞合成産物を添加し、40℃で４時間反応させた。反応液を遠心分離し、得られた上清の還元糖量をTZアッセイ法により測定した。図１５に、野生型PcCBH2の活性を１とした相対活性で、相乗効果で評価した場合の結果を示す。図１５に示すように、改変体１２及び相加改変体５２〜５８では、市販酵素製剤添加時の相乗効果が、野生型の約3.5〜6.5倍に向上していることがわかった。
【実施例２１】
【０１２９】
（実バイオマス由来セルロース成分の市販酵素製剤による分解時の相乗効果）
水熱処理後の稲わらのセルロース成分に、市販酵素製剤（Sigma製のセルクラストC2730）を200mg／gバイオマスとなるように添加（図１６の市販酵素製剤200）し、50℃で反応後に溶液のグルコース濃度を液体クロマトグラフィーにより測定した。更にPcCBH2を2％（w/v）添加した場合を図１６の市販酵素製剤＋PcCBH2に示す。2％のPcCBH2を添加しただけで、24時間後のグルコース生成量は、市販酵素製剤を400mg／gバイオマスとなるように添加した場合（図１６の市販酵素製剤400）と同等の効果を示すことがわかった。実バイオマスを簡単な前処理したセルロース画分には、セルロース以外にリグニンやヘミセルロース成分が残存することから、純品のセルロースよりも分解効率低下することが懸念されるが、PcCBH2では実バイオマス由来セルロース成分の分解試験においても顕著な相乗効果が認められることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Phanerochaete chrysosporium(ファネロケーテ・クリソスポリウム)由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、
Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、
を含有する、セルロース分解用酵素製剤。
【請求項２】
前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有する改変体である、請求項１に記載の酵素製剤。
【請求項３】
前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における以下の表に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される１種又は２種以上を有する改変体である、請求項１又は２に記載の酵素製剤。
【表９】
【請求項４】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５、ＧＨＦ７、ＧＨＦ１２及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項５】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５に属し、かつ、Trichoderma reesei（トリコデルマ・リーゼイ）由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger（アスペルギルス・ニガー）由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae（アスペルギルス・オリザ)由来のエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項６】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ１２に属し、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項７】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ７に属し、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項８】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼである、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項９】
さらに、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼを含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項１０】
Trichoderma reesei又はその形質転換体由来のセルラーゼ組成物を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項１１】
実質的にβ−グルコシダーゼを含有しない、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項１２】
Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体を含有する、セルロースを分解するために他のセルラーゼと組み合わされて使用されるセルロース分解活性増強剤。
【請求項１３】
前記他のセルラーゼは、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を含む、請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１４】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５、ＧＨＦ７、ＧＨＦ１２及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上である、請求項１３に記載の増強剤。
【請求項１５】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei、Aspergillus niger及びAspergillus oryzaeから選択される１種又は２種以上を起源とする、請求項１４に記載の増強剤。
【請求項１６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列における以下の表に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される１種又は２種以上を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【表１０】
【請求項１９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において以下の表に示す各改変体が有する変異の種類に示すアミノ酸変異又はこれらのアミノ酸変異に相当する変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【表１１】
【請求項２０】
請求項１６又は１７に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
発現ベクターである、請求項２０又は２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
請求項２０又は２１に記載のＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体。
【請求項２４】
Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を発現する、形質転換体。
【請求項２５】
前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体と前記他起源のエンドグルカナーゼとを細胞表層に保持する又は細胞外に分泌する、請求項２４に記載の形質転換体。
【請求項２６】
β−グルコシダーゼの発現が抑制されている、請求項２４又は２５に記載の形質転換体。
【請求項２７】
前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体及び前記他起源のエンドグルカナーゼ以外のセルラーゼであって、内在性のセルラーゼの発現が抑制されている、請求項２４〜２６のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項２８】
前記形質転換体は、非セルラーゼ生産菌である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれかに記載の形質転換体を用いて、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を製造する、セルロース分解用の酵素製剤の生産方法。
【請求項３０】
セルロースの存在下、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを低分子化する工程、を備える、セルロースの低分子化産物の生産方法。
【請求項３１】
前記低分子化工程は、β−グルコシダーゼの非存在下でセルロースを分解して、セルロースオリゴマーを得る工程である、請求項３０に記載の生産方法。
【請求項３２】
前記低分子化工程は、前記セルロースとともにリグニン及びヘミセルロースが共存している、請求項３０又は３１に記載の生産方法。
【請求項３３】
セルロースを原料として有用物質を生産する方法であって、
セルロースの存在下、β−グルコシダーゼの非存在下で、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを分解してオリゴマーを生産する工程と、
前記セルロースオリゴマーをβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを生産する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項３４】
前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現するエタノール生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いるエタノール発酵工程である、請求項３３に記載の生産方法。
【請求項３５】
前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現する有機酸生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いる有機酸発酵工程である、請求項３３に記載の生産方法。
【請求項１】
Phanerochaete chrysosporium(ファネロケーテ・クリソスポリウム)由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、
Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、
を含有する、セルロース分解用酵素製剤。
【請求項２】
前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有する改変体である、請求項１に記載の酵素製剤。
【請求項３】
前記改変体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における以下の表に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される１種又は２種以上を有する改変体である、請求項１又は２に記載の酵素製剤。
【表９】
【請求項４】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５、ＧＨＦ７、ＧＨＦ１２及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項５】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５に属し、かつ、Trichoderma reesei（トリコデルマ・リーゼイ）由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger（アスペルギルス・ニガー）由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae（アスペルギルス・オリザ)由来のエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項６】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ１２に属し、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項７】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ７に属し、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼから選択される、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項８】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼである、請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項９】
さらに、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼを含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項１０】
Trichoderma reesei又はその形質転換体由来のセルラーゼ組成物を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項１１】
実質的にβ−グルコシダーゼを含有しない、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵素製剤。
【請求項１２】
Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体を含有する、セルロースを分解するために他のセルラーゼと組み合わされて使用されるセルロース分解活性増強剤。
【請求項１３】
前記他のセルラーゼは、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を含む、請求項１２に記載の増強剤。
【請求項１４】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、ＧＨＦ５、ＧＨＦ７、ＧＨＦ１２及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上である、請求項１３に記載の増強剤。
【請求項１５】
前記他起源のエンドグルカナーゼは、Trichoderma reesei、Aspergillus niger及びAspergillus oryzaeから選択される１種又は２種以上を起源とする、請求項１４に記載の増強剤。
【請求項１６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列における２２位又はこれに相当する位置において、セリンがプロリンに置換されたアミノ酸変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列における以下の表に示すアミノ酸変異及びこれらに相当するアミノ酸変異からなる群から選択される１種又は２種以上を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【表１０】
【請求項１９】
配列番号２に記載のアミノ酸配列において以下の表に示す各改変体が有する変異の種類に示すアミノ酸変異又はこれらのアミノ酸変異に相当する変異を有し、ＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。
【表１１】
【請求項２０】
請求項１６又は１７に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
発現ベクターである、請求項２０又は２１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
請求項２０又は２１に記載のＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体。
【請求項２４】
Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を発現する、形質転換体。
【請求項２５】
前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体と前記他起源のエンドグルカナーゼとを細胞表層に保持する又は細胞外に分泌する、請求項２４に記載の形質転換体。
【請求項２６】
β−グルコシダーゼの発現が抑制されている、請求項２４又は２５に記載の形質転換体。
【請求項２７】
前記セロビオヒドロラーゼ又はその改変体及び前記他起源のエンドグルカナーゼ以外のセルラーゼであって、内在性のセルラーゼの発現が抑制されている、請求項２４〜２６のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項２８】
前記形質転換体は、非セルラーゼ生産菌である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれかに記載の形質転換体を用いて、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を製造する、セルロース分解用の酵素製剤の生産方法。
【請求項３０】
セルロースの存在下、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを低分子化する工程、を備える、セルロースの低分子化産物の生産方法。
【請求項３１】
前記低分子化工程は、β−グルコシダーゼの非存在下でセルロースを分解して、セルロースオリゴマーを得る工程である、請求項３０に記載の生産方法。
【請求項３２】
前記低分子化工程は、前記セルロースとともにリグニン及びヘミセルロースが共存している、請求項３０又は３１に記載の生産方法。
【請求項３３】
セルロースを原料として有用物質を生産する方法であって、
セルロースの存在下、β−グルコシダーゼの非存在下で、Phanerochaete chrysosporium由来であってＧＨＦ６に属するセロビオヒドロラーゼ又はその改変体と、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のエンドグルカナーゼと、を用いて、セルロースを分解してオリゴマーを生産する工程と、
前記セルロースオリゴマーをβ−グルコシダーゼで分解してグルコースを生産する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項３４】
前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現するエタノール生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いるエタノール発酵工程である、請求項３３に記載の生産方法。
【請求項３５】
前記グルコース生産工程は、β−グルコシダーゼを発現する有機酸生産微生物を用いて前記セルロースオリゴマーを分解し、得られるグルコースを炭素源として用いる有機酸発酵工程である、請求項３３に記載の生産方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−４１９９６（Ｐ２０１０−４１９９６Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６６７１２（Ｐ２００９−１６６７１２）
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願、平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／セルロースエタノール高効率製造のための環境調和型統合プロセス開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願、平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／セルロースエタノール高効率製造のための環境調和型統合プロセス開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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