フィブロネクチンのエクストラドメインＢに対する特異的結合親和性を有する修飾ユビキチンタンパク質
本発明は、修飾ユビキチンから得られ、高い親和性でフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能な、新規ヘテロ多量体タンパク質に関する。さらに、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分を融合した前記組換えタンパク質を含む、融合タンパク質に関する。本発明は、さらに、医療用治療方法における前記タンパク質の使用を対象とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能な、新規ヘテロ多量体タンパク質に関する。さらに、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した前記ヘテロ多量体結合タンパク質を含む、融合タンパク質に関する。本発明は、さらに、このようなヘテロ多量体結合タンパク質または融合タンパク質の製造方法、および、前記ヘテロ多量体結合タンパク質を含む医薬組成物および／または診断用組成物を対象とする。さらに、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリーに関する。
【０００２】
さらなる実施形態において、本発明は、前記ヘテロ多量体結合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および、前記タンパク質、前記融合タンパク質、前記ベクターおよび／または前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を対象とする。好ましい実施形態において、前記ヘテロ多量体結合タンパク質または前記融合タンパク質は、薬物または診断用薬剤に含まれる。さらに、前記組換えタンパク質または前記融合タンパク質の製造方法、ならびに、医学的治療方法における前記タンパク質についても記載されている。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリンではないアミノ酸からなる結合分子の需要が高まりつつある。現在に至るまで、抗体は、最もよく確立された結合分子に類別されるが、免疫グロブリン分子にはいくつかの主要な欠点があるため、高い親和性と特異性でリガンドをターゲットとするために、新しい結合分子が、なお求められている。免疫グロブリン分子は、非常に容易に製造でき、ほとんど全てのターゲットを対象とするが、極めて複雑な分子構造を有している。そのため、容易に取扱い可能な、より小さな分子によって、抗体を代用することが絶えず求められている。これら代替結合剤は、例えば、疾病の診断、予防、および治療の医療分野において、有用である。
【０００４】
相対的に規定された三次元構造を有するタンパク質は、通常、足場タンパク質と呼ばれ、前記代替結合剤の設計の開始物質として用いられる。これら足場タンパク質は、一般的に、特異的またはランダムな配列のバリエーションを許容する、１以上の領域を含んでおり、そのような配列のランダム化は、しばしば、特異的結合分子を選択できる、タンパク質ライブラリーの製造のため行われる。抗体よりもサイズが小さく、且つ、ターゲット抗原への親和性が、抗体に匹敵するか、あるいはより高い分子は、薬物動態的な性質および免疫原性の点から、抗体よりも優れていると予想される。
【０００５】
従前の多くのアプローチは、結合タンパク質の開始物質として足場タンパク質を用いている。例えば、国際公開第９９／１６８７３号パンフレット（特許文献１）において、特定のリガンドに結合活性を示すリポカリンファミリー（いわゆるアンチカリン）の修飾タンパク質が開発された。リポカリンファミリーのペプチド構造は、遺伝子工学的方法を用いて、天然のリガンド結合ポケットにおけるアミノ酸置換によって修飾されている。免疫グロブリンのように、アンチカリンは、分子構造の同定または結合に使用できる。抗体と類似する方法で、可動性ループ構造が修飾され、これらの修飾により、天然のものとは異なるリガンドの認識が可能となる。
【０００６】
国際公開第０１／０４１４４号パンフレット（特許文献２）には、それ自体には結合部分がないβシート構造タンパク質のタンパク質表面における、結合ドメインの人工的な生成が記載されている。この手法によれば、高い親和性と特異性でリガンドと相互作用する、新規に生成された人工結合ドメイン（例えば、眼水晶体構造タンパク質であるγクリスタンのバリエーション）が得られる。アンチカリンに関して先に述べたような可動性ループ構造から形成される、すでに存在する結合部位の修飾とは対照的に、これらの結合ドメインは、βシートの表面に新規に生成される。しかし、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、新規結合特性を生じるための、相対的に大きなタンパク質の改変について記載されているのみである。国際公開第０１／０４１４４号パンフレットのタンパク質は、その大きさのため、ある程度の労力を必要とする方法でしか、遺伝子工学レベルで修飾できない。さらに、これまで公開されたタンパク質においては、タンパク質の全体構造を維持するために、全アミノ酸のうち、比較的小さいパーセンテージのみが修飾されていた。そのため、従前は存在しない結合特性の発生に利用できるのは、タンパク質表面の比較的に小さい領域のみである。さらに、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、γ−クリスタンへの結合特性の生成のみが記載されている。
【０００７】
国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット（特許文献３）には、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の製造が記載されている。ユビキチンは、小さい単量体の細胞質タンパク質であり、配列が高度に保存され、原虫から脊椎動物にいたるまでの全ての公知の真核細胞に存在する。生物において、ユビキチンは、細胞タンパク質のコントロールされた分解の制御において重要な役割を担う。この目的のために、分解予定のタンパク質は、酵素カスケードを通過する間に、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖と共有結合し、この標識により選択的に分解される。最近の研究結果によると、ユビキチンまたはユビキチンによるタンパク質の標識は、それぞれ、数種のタンパク質の移入または遺伝子制御等の他の細胞プロセスにおいても、重要な役割を担っている。
【０００８】
その生理的機能の明確化に加え、ユビキチンは、そもそもその構造およびタンパク質の化学特性のために、研究対象となっている。ユビキチンのポリペプチド鎖は、非常にコンパクトなα／β構造に折りたたまれた７６アミノ酸からなる（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７（非特許文献１））。前記ポリペプチド鎖のほぼ８７％は、水素結合によって、二次構造エレメントの形成に関与する。二次構造は、３．５αヘリックスターン、ならびに４つの鎖からなる逆平行βシートである。これらの要素の特徴的な配置（逆平行βシートがタンパク質表面に露出し、その裏側にαヘリックスがパックされ、これが前記逆平行βシート上に垂直に延びている）は、一般的に、いわゆるユビキチン様フォールディングモチーフと考えられている。さらなる構造的な特徴は、αヘリックスとβシートの間のタンパク質内側における、標識疎水性領域である。
【０００９】
ユビキチンの人工的な調製は、そのサイズが小さいため、化学合成によっても、生物学的手法によっても行うことができる。有利なフォールディング特性のため、ユビキチンは、大腸菌等の微生物を使用した遺伝子工学により、比較的大量に、そのサイトゾルまたは細胞膜周辺腔に製造できる。一般的に、後者のストラテジーは、周辺質において酸化状態が優勢であるため、分泌タンパク質の製造に使用される。簡易且つ効果的な細菌調製のために、ユビキチンは、その製造に問題がある他の外来タンパク質に対する融合パートナーとして使用できる。ユビキチンとの融合によって、溶解度の改善およびそれによる製造収率の改善が、達成できる。
【００１０】
抗体または他の代替足場と比べ、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）ともいう）は、多くの利点を有している。例えば、小さいサイズ、高い安定性、高い親和性、高い特異性、費用対効果の高い微生物による製造、血清半減期の調整等である。しかしながら、特定のターゲットに対する高い親和性の新しい治療方法の点から、それらのタンパク質をさらに開発する必要がある。国際公開第０５／０５７３０号パンフレット（特許文献４）には、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が、概略的に記載されているが、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂとの特異的且つ高親和性の結合を得るために、ユビキチンタンパク質を修飾する方法は、記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９９／１６８７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０４１４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０５／０５７３０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９７／４５５４４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０７／０５４１２０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９９／５８５７０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／６２８００号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０６／１１９８９７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０７／１２８５６３号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０１／６２２９８号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０７／１１５８３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７
【非特許文献２】Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット（特許文献５）には、組換え結合タンパク質が記載されており、ＦＹＮキナーゼのＳｒｃホモロジー３ドメイン（ＳＨ３）が、新しい結合タンパク質を得るために使用されている。タンパク質治療および／またはタンパク質診断を開発するために、ＲＴループおよび／またはＳｒｃループの変異によりターゲット特異性を設計できることが見出された。足場として利用されるリポカリンにおいてと同様に、変異誘発されたアミノ酸残基は、抗体／抗原結合機能の基礎をなす原理を擬態する、可変性および可動性のループ領域内に存在している。相互作用部位の全体的な可動性は、これによって抗体がエピトープに結合するものであるが、主にエントロピーによって駆動されるプロセスである。しかしながら、このプロセスは、可動相補性決定領域の会合による移動度の欠失によって、不利なエントロピーの寄与を導く。それとは反対に、足場としてユビキチンを使用し、本願発明者は、そもそもアミノ酸残基を可動性ループ領域内では変更せず、βシートの領域の強固で不動のβ鎖またはβ鎖の近くに隣接した領域内で変更した。ＥＤ−Ｂとの結合領域である、ユビキチンの不動且つ強固なβ鎖またはβ鎖の近くに隣接した範囲において、アミノ酸残基を選択する利点は、特に以下のとおりである。結合パートナーは、強い結合に適した相補的形状をすでに示していると考えられている。したがって、これらの相互作用は、結合パートナーのより強固な構造の形状、電荷、および親水性／疎水性要素における相補性に関与する。これらの強固な本体の相補作用は、界面を最適化し、生物機能を適応させる。
【００１４】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、健康な組織および体液において大量に発現する、重要なクラスの高分子量細胞外マトリックス糖タンパク質である。これらの主な役割は、細胞と多くの異なる細胞外マトリックスとの接着の促進である。培養下の非形質転換細胞の表面におけるフィブロネクチンの存在、ならびに形質転換細胞の場合におけるそれらの不在により、フィブロネクチンは、重要な接着タンパク質として同定された。フィブロネクチンは、多数の様々な他の分子、例えば、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびフィブリンと相互作用し、細胞の形状および細胞骨格の形成を制御する。さらに、それらは、胚形成の間の細胞移入および細胞分化に関与する。それらは、創傷の治療においても、重要な役割を担い、マクロファージおよび他の免疫細胞の移入を促進し、また、血餅の形成においても、血管の損傷領域への血小板の接着を可能とすることにより、重要な役割を担う。
【００１５】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、プライマリーＲＮＡ転写物の代替スプライシングによってフィブロネクチン分子に挿入された、小さいドメインである。前記分子は、細胞外マトリックスのフィブロネクチン分子において、存在するかまたは取去されているかのいずれかであり、新しい血管の周辺に大量に発現するが、全ての成常成人の組織（子宮と卵巣を除く）においては、実質的に検出不能であるため、血管新生や組織の再構築と関連する最も選択的なマーカーの一つとなっている。ＥＤ−Ｂは、主として癌に関与することが知られている。高レベルのＥＤ−Ｂ発現は、胸、非小細胞肺、結腸直腸、膵臓、ヒトの肌、肝細胞、頭蓋内髄膜腫、グリオブラストーマを含む多くのヒトの固体癌のエンティティにおける一次病変、ならびに転移性部位において検出された（Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５（非特許文献２））。さらに、ＥＤ−Ｂは、診断剤と結合でき、診断ツールとして有利に使用できる。一例として、例えば、動脈硬化プラークの分子の画像化や、例えば、癌患者の免疫シンチグラフィーによる、癌検出おける使用があげられる。さらに多くの診断用に使用できると考えられる。
【００１６】
フィブロネクチンのヒトエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）の９１アミノ酸のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。前記タンパク質の発現のため、開始メチオニンを加えなければならない。ＥＤ−Ｂは、哺乳類、例えば、げっ歯類、ウシ、霊長類、肉食動物、ヒト等に大量に存在する。ヒトＥＤ−Ｂと１００％の配列同一性を有する動物の例は、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウマ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）である。
【００１７】
ＥＤ−Ｂは、新生血管構造に特異的に蓄積し、癌における分子介入のターゲットとなる。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する抗体または抗体断片の多くは、当該技術分野において、癌および他の兆候の潜在的な治療薬として公知である（例えば、国際公開第９７／４５５４４号パンフレット（特許文献６）、国際公開第０７／０５４１２０号パンフレット（特許文献７）、国際公開第９９／５８５７０号パンフレット（特許文献８）、国際公開第０１／６２８００号パンフレット（特許文献９）参照）。ヒト一本鎖Ｆｖ抗体断片ＳｃＦｖＬ１９（Ｌ１９ともいう）は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに特異的であり、実験腫瘍モデルおよび癌患者の両方において、選択的に新生脈管構造の腫瘍（ｔｕｍｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を標的にすることが確認されている。さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインと、抗ＥＤ−Ｂ抗体または抗ＥＤ−Ｂ抗体断片を含むコンジュゲートは、特に、癌、血管新生または腫瘍の成長を阻害する医薬製造のための標的薬剤として記載されている（例えば、国際公開第０６／１１９８９７号パンフレット（特許文献１０）、国際公開第０７／１２８５６３号パンフレット（特許文献１１）、国際公開第０１／６２２９８号パンフレット（特許文献１２）参照）。細胞傷害性または免疫刺激薬剤のような適切なエフェクター機能と抱合させた、抗ＥＤ−Ｂ抗体またはＬ１９等抗ＥＤ−Ｂ抗体断片による固体腫瘍の新生脈管構造の選択的なターゲティングは、動物実験では成功することが判明している。膵臓癌の治療のため、インターロイキン−２（ＩＬ−２）部と抗ＥＤ−Ｂ抗体部とを含む融合タンパク質を、小分子ゲムシタビン（２’−デオキシ−２’、２’−デフルオロロシチジン）と併用した（例えば、国際公開第０７／１１５８３７号パンフレット（特許文献１３）参照）。
【００１８】
前記先行技術文献には、新しいＥＤ−Ｂ結合タンパク質の製造のため、抗体を含む様々な足場タンパク質を使用することが記載されている。現在入手可能な化合物よるＥＤ−Ｂのターゲティングには、ある種の不都合が伴う。ＥＤ−Ｂ抗原に対して、同等またはより高い親和性を有する、より小さい分子（本発明の、ヘテロ多量体ユビキチンに基づくＥＤ−Ｂ結合タンパク質等）は、抗体や他の結合タンパク質に対して、顕著な利点を有すると期待される。
【００１９】
癌は、世界的に主要な死亡原因であるため、癌治療のための改善された薬剤の必要性が高まっている。現在の化学療法剤および放射線治療は、選択性が低いという欠点があり、多くの化学療法剤は、腫瘍部位に蓄積せず、そのため腫瘍内において十分なレベルに到達できない。癌を効果的に治療する、強力な医薬品に対する需要が存在する。
【００２０】
本発明の課題は、フィブロネクチンの細胞外ドメイン（ＥＤ−Ｂ）に非常に高い親和性で特異的に結合できる、ユビキチンベースのヘテロ多量体結合タンパク質の提供である。本発明のさらなる課題は、例えば、癌の治療に使用する、ＥＤ−Ｂに非常に高い結合特異性を有する新規の結合タンパク質の同定および提供である。さらに、前記ヘテロ多量体結合分子を製造するための方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記課題は、提出した独立請求項の主題によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項、ならびに下記の記載、実施例および図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、種々の腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生を列記した表を示す。
【図２】図２は、ＥＤ−Ｂへの驚くほど強力な結合親和性を有することが見出された、さらなる１６種類の配列のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。
【図３】図３は、修飾ユビキチン単量体からなる四量体と比較した、修飾ユビキチン単量体のＫｄ値を、表に示す。
【図４Ａ】図４Ａは、単量体４１Ｂ１０についての、Ｋｄ＝９．４５μＭの結合親和性を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４１Ｂ１０が異なる第２単量体と結合して得られた４６Ｈ９についての、Ｋｄ＝１３１ｎＭの結合親和性を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合エフェクター融合タンパク質の模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、前記修飾ユビキチンエフェクター接合５Ｅ１−ＴＮＦコンジュゲートが、アポトースシス促進活性（Ｌ９２９アポトーシスアッセイで測定）を有すること示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１Ｈ４−ＴＮＦα融合物のＥＤ−Ｂへの結合親和性（Ｋｄ＝１５．１ｎＭ）が高いことを示す。
【図６Ａ】図６は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【図６Ｂ】図６Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ）。
【図６Ｃ】図６Ｂは、遺伝学的にサイトカインＴＮＦαに融合し、前記ヘテロ二量体２４Ｈ１２が多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ）。
【図６Ｄ】図６Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体クローン９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。
【図６Ｅ】図６Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図６Ｆ】図６Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図７】図７は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。
【図８】図８は、配列アライメントを示す。
【図９】図９は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。
【図１０】図１０は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１１】図１１は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１２】図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。
【図１３】図１３は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１４】図１４は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、固定化されたヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）ヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への結合を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、固定化されたマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞への結合を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、固定化されたマウスＳＴ−２細胞への結合を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、哺乳類組織切片における、ターゲットへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、野生型ユビキチンとの比較における、腫瘍組織での１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性についての、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）（Ｌ９２９細胞）によるテストを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性についての、細胞ベースアッセイ（Ｌ９２９細胞）によるテストを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ターゲットであるＥＤ−Ｂへの、ヘテロ二量体ユビキチン１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い選択性を証明している。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、培養細胞における変異体１０４１−Ｄ１１で観察された高い結合特異性が、１０４１−Ｄ１１がＴＮＦαに融合されても維持されることを示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦαに融合した変異体１０４１−Ｄ１１とメルファランとの併用による、７日間のマウスの処置期間中のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的腫瘍成長を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
より具体的には、本願発明者は、ヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合可能なタンパク質を提供する。前記タンパク質は、２つの単量体（ユビキチンユニット）が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含み、さらなる修飾、好ましくは、他のアミノ酸の置換を任意で含み、
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％および少なくとも９０％の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する前記タンパク質の特異的結合親和性がＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍであり、前記タンパク質が、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示す。
【００２４】
好ましい実施形態において、前記タンパク質は、組換えタンパク質である。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態では、各単量体ユビキチンユニットにおいて、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、７、８、９個または全てのアミノ酸が、修飾される。本発明においては、各単量体ユニット、すなわち、第１ユニットおよび第２ユニットにおいて、これらの変異は、それぞれ組み合わせることができると理解される。例えば、前記第１ユニットが、６つの修飾を含むことができ、一方、前記第２ユニットが、７つまたは８つの修飾を含み、前記第１単量体ユニットが８つの修飾を、前記第２単量体ユニットが７つの修飾を含んでもよい、等である。前述に列挙する各アミノ酸は、前記第１ユニット、前記第２ユニットから選択でき、その後、前記両ユニットは、組み合わせられる。好ましい置換は、以下に記載する。
【００２６】
「フィブロネクチンのエクストラドメインＢ」または省略した「ＥＤ−Ｂ」は、配列番号２との配列同一性が、少なくとも７０％、任意に７５％以上、さらに任意に８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％以上、または１００％を示し、上記のＥＤ−Ｂの機能性を有する、全てのタンパク質を含む。
【００２７】
「結合可能なタンパク質」または「結合タンパク質」は、さらに後述するＥＤ−Ｂに対する結合ドメインを含むユビキチンタンパク質を指す。このようなユビキチンベースの結合タンパク質は、いずれも、例えば、多量体化部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー等の結合ドメインでない付加的なタンパク質ドメイン、および／または、非タンパク性のポリマー分子を含んでもよい。非タンパク性のポリマー分子は、例えば、ヒドロキシエチルでんぷん、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン等である。
【００２８】
抗体およびそのフラグメントは、当業者に周知である。前記本発明の結合タンパク質は、抗体またはそのフラグメント、例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖフラグメント等ではない。また、前記本発明の結合ドメインは、抗体に存在する免疫グロブリンフォールドを含まない。
【００２９】
本明細書において、「リガンド」、「ターゲット」および「結合パートナー」は、同意語として使用され、置き換え可能である。リガンドは、前述のヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質に、ここで定義される親和性をもって結合可能な任意の分子である。
【００３０】
「ユビキチンタンパク質」は、配列番号１のユビキチン、および、下記の定義によるその修飾物を包含する。ユビキチンは、真核生物において、高度に保存されている。例えば、今日まで研究されてきた全ての哺乳類において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。ヒト、げっ歯類、ブタおよび霊長類由来のユビキチン分子が、特に好ましい。また、任意の他の真核生物起源のユビキチンを使用することもできる。例えば、酵母由来のユビキチンは、配列番号１と３つのアミノ酸が異なるのみである。前記「ユビキチンタンパク質」に包含される前記ユビキチンタンパク質は、通常、配列番号１に対し、７０％を超える、好ましくは７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、または９７％までのアミノ酸同一性を示す。
【００３１】
「修飾ユビキチンタンパク質」は、前記ユビキチンタンパク質の修飾、アミノ酸の置換、挿入または欠失のいずれか一つ、または、それらの組み合わせを指す。ただし、上記修飾のいずれか一つによりなされる修飾で、最も好ましいのは置換である。前記修飾数は、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つであるアミノ酸同一性を有する、前記修飾単量体ユビキチンユニットのように、厳密に限定されている。それゆえ、単量体ユニットにおける全置換数は、８０％のアミノ酸同一性に対応して、最大で１５個のアミノ酸に限定される。前記ヘテロ二量体ユビキチン分子における修飾アミノ酸の全数は、前記ヘテロ二量体タンパク質に基づく、２０％のアミノ酸の修飾に対応して、３０個である。前記二量体修飾ユビキチンタンパク質の前記アミノ酸同一性は、配列番号１の基本単量体配列を有する二量体非修飾ユビキチンタンパク質と比較して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つから選択される。
【００３２】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度の決定には、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， ｖｏｌ． １２： ３３７− ３５７， １９９１）またはＣｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２（２２）： ４６７３−４６８０， １９９４．）。好ましくは、配列番号１に対する前記修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【００３３】
前記本発明の「ヘテロ二量体融合タンパク質」または「ヘテロ二量体タンパク質」は、２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質と考えられる。前記２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質は、前記特異的結合パートナーであるＥＤ−Ｂに対する一価の結合特性（結合ドメイン）を共同でもたらす、２つの相互作用結合ドメイン領域を有する。ヘテロ二量体は、２つの単量体ユビキチン分子の融合により得られ、これらの両分子は、前述のように異なる修飾がなされる。
【００３４】
一価の結合活性を有するヘテロ多量体結合タンパク質（ここでは、ヘテロ二量体タンパク質）を生成するための、異なる修飾ユビキチン単量体の多量体化の利点は、ＥＤ−Ｂに対する新規な高親和性の結合特性を発生するために修飾され得るアミノ酸残基の総数の増加にある。主要な利点は、多くのアミノ酸が修飾されても、ＥＤ−Ｂに対する前記新規に生成された結合タンパク質の足場全体の安定性の低下させることなく、タンパク質の化学的完全性（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が維持されることである。ＥＤ−Ｂに対する新規結合部位を発生させるために修飾され得る残基の総数は、前記修飾残基が２つの単量体ユビキチンタンパク質に割り当てられることで増加する。修飾数は、修飾単量体ユビキチン分子数に応じて、２倍にできる。ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質のモジュール構造は、２つの単量体ユビキチン分子に前記修飾アミノ酸が含まれると、前記修飾アミノ酸の総数を増加できる。本発明の方法は、ＥＤ−Ｂに対する一価の特異性（一つのシングルエピトープ）を有するヘテロ二量体ユビキチン分子の同定を提供する。
【００３５】
したがって、これらの修飾残基の全量が、前記二量体を形成する前記２つの単量体ユニットに割り振られるため、結合パートナーに対して共通の結合部位を有するヘテロ二量体の使用は、最終的な結合分子の前記タンパク質の化学的完全性に過度に影響を与えない修飾残基数を増加させる可能性を切り開く。ＥＤ−Ｂに結合する前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質ライブラリーに存在する。
【００３６】
「一価」は、前記修飾二量体ユビキチンの前記第１および前記第２単量体ユニットにおいて生成された両結合領域が共に、ＥＤ−Ｂに相乗的に組み合わせられるように結合する機能、すなわち、両結合領域が、共同で一価の結合活性を形成する役割を果たす機能と理解されるべきである。前記二量体分子における前記第１および前記第２修飾ユビキチン両方の各結合領域を、別々に取り除いた場合、ＥＤ−Ｂへの結合は、前記二量体分子より明らかに効率および親和性が低下するだろう。前記修飾ユビキチンが、各単量体タンパク質を単独で使用するよりも、より効率的にＥＤ−Ｂに結合可能となるように、両結合領域は、アミノ酸の連続領域として前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質表面に形成されるユビキチン結合部位を形成する。本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後に、前記２つの単量体タンパク質が互いに連結されるのではなく、既に前記ヘテロ二量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。最も有力な結合ユビキチン分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した単量体ユビキチンユニット同士を連結することにより、これらの分子を得てもよい。
【００３７】
本発明によれば、１つのリガンドに結合する前記２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、例えば、遺伝学的手法を使用して、互いにヘッドトゥテイル融合で結合される。前記異なる修飾融合ユビキチン単量体は、一価で結合し、両方の「結合ドメイン領域」（「ＢＤＲ」）が共に作用する場合にのみ効果的である。「結合ドメイン領域」は、前記ターゲットへの結合に関与する、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸が修飾されたユビキチン単量体における領域として定義される。
【００３８】
前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する前記修飾および結合ユビキチン単量体は、一つの連続的な結合領域を介して同じエピトープに結合する。前記ヘテロマーのこの連続的な領域は、２つの異なる修飾ユビキチン単量体により形成される前記２つのモジュールの両結合決定領域により形成される。
【００３９】
「ヘッドトゥテイル融合」は、２つのタンパク質が、前記二量体に含まれるユニット数に応じて、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ方向においてそれらを連結することにより、互いに融合することと理解される。このヘッドトゥテイル融合において、前記ユビキチン単量体は、リンカーを介すことなく、直接連結されてもよい。または、前記ユビキチン単量体の融合は、リンカーを介して行うことができる。前記リンカーは、例えば、少なくともＧＩＧのアミノ酸配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧのアミノ酸配列を有するリンカー、または、任意の他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられる。２つのユビキチン単量体の遺伝学的融合用の他のリンカーも、当該技術分野では公知であり、使用できる。
【００４０】
本発明の前記修飾ユビキチンタンパク質は、ターゲットまたはリガンド（両用語は、同じ意味として使用される）としてのＥＤ−Ｂに対する新規な結合親和性を有する人工タンパク質である。「置換」は、例えば、元のアミノ酸への化学基もしくは残基の置換または付加によるアミノ酸の化学的修飾も含む。βシート領域の少なくとも一つのβシート鎖に位置するアミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接した３個までのアミノ酸に位置するアミノ酸を含む前記タンパク質の少なくとも一つの表面露出領域におけるアミノ酸の置換が、重要である。
【００４１】
本発明によれば、ＥＤ−Ｂに特異的な新規の結合ドメイン発生のための前記アミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸に行うことができる。すなわち、ＥＤ−Ｂに対する新規の結合特性を発生させる修飾のために、任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用できるように、アミノ酸が、置換されたアミノ酸のそれと同様の特定の化学的特性または側鎖を有する必要はない。
【００４２】
本発明によれば、前記選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくは、ランダム変異導入法による遺伝学的レベルでの突然変異、すわなち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、前記各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物において行われる。
【００４３】
置換は、特に、ユビキチンタンパク質のβシートの４つのβ鎖の表面露出アミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接する３つ以内の表面露出アミノ酸において行われる。各β鎖は、通常、５〜７個のアミノ酸からなる。配列番号１に関して、例えば、前記β鎖は、通常、アミノ酸残基２〜７、１２〜１６、４１〜４５および６５〜７１を包含する。付加的に且つ好ましく修飾され得る領域は、前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸（すなわち、１番目、２番目または３番目）の部位を含む。付加的に且つ好ましく修飾され得る前記好ましい領域は、特に、アミノ酸残基８〜１１、６２〜６４および７２〜７５を含む。前記好ましい領域は、２つのβ鎖が互いに結合したβターンを含む。好ましいβターンは、アミノ酸残基６２〜６４があげられる。前記βシート鎖に密接する最も好ましいアミノ酸は、８位のアミノ酸である。また、アミノ酸置換のさらなる好ましい例は、３６、４４、７０および／または７１位である。例えば、付加的に且つ好ましく修飾され得る領域は、６２、６３および６４位のアミノ酸（３個のアミノ酸）、７２、７３位のアミノ酸（２個のアミノ酸）または８位のアミノ酸（１個のアミノ酸）を含む。
【００４４】
好ましい実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸に限定され、それに応じて、前記二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個のアミノ酸に限定される。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらなる実施形態において、欠失は行われない。
【００４５】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質が、請求項で特定され明細書で説明された前記置換に加えて、１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を含む場合には、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）に与えられる前記アミノ酸部位を、対応するタンパク質同士で分配するために、前記修飾ユビキチンについてアライメントさせなければならない。融合タンパク質の場合（後述を参照）、各単量体ユビキチンサブユニットのナンバリング（およびアライメント）は、同様の方法、すなわち、例えば、各サブユニットの１位のアミノ酸から開始される二量体のアライメントによりなされる。
【００４６】
単量体ユビキチン、好ましくは、例えば、ヒト等の哺乳類由来の単量体ユビキチンにおいて、β鎖または前記βシート鎖に隣接する３個以内のアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％が修飾されることができ、好ましくは置換され、本発明によれば、従来は存在しなかった結合特性が発生する。最大で、β鎖または前記βシート鎖に隣接する３個以内のアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の約５０％、さらに好ましくは最大で約４０％、約３５％、約３０％以下、または約２５％以下が修飾され、好ましくは置換される。通常、一つのβ鎖において、１〜４個のアミノ酸が修飾される。一実施形態では、好ましくは、第１β鎖および第４β鎖、例えば、２〜７位もしくは６５〜７１位のアミノ酸残基の領域において、６個のアミノ酸のうちの３個が修飾される。
【００４７】
ヘテロ二量体の構成ユニットとして使用される本発明の修飾単量体ユビキチンは、合計でアミノ酸の２０％以下を占める。これを考慮すると、配列番号１に対する前記修飾ユビキチンタンパク質の配列同一性は、少なくとも８０％である。本発明のさらなる実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、さらに、少なくとも９０％、少なくとも９２％、または少なくとも９５％である。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、９７％以上のアミノ酸配列同一性の前記修飾ユビキチンタンパク質をも包含する。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチンは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、３、４、５、６、または７個のアミノ酸において修飾される。他の実施形態において、これらの部位において修飾されるユビキチンは、既に前修飾（ｐｒｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）されていた。例えば、さらなる修飾は、７４および７５位のアミノ酸または４５位のアミノ酸における修飾を含むことができ、この修飾により、より良好な安定性またはタンパク質化学特性を発生する。修飾ユビキチン単量体は、配列番号１のユビキチンにおける、合計９、１０、１１、１２、１３、１４および、最大で１５個のアミノ酸が修飾され、好ましくは置換されることで得られる。一例によれば、修飾単量体ユビキチンは、１４個の置換および１個の欠失を有するものが得られた。ユビキチンの総アミノ酸数に基づいて、これは、約２０％の割合に相当する。このことは、非常に驚くべきことであり、通常、もっと低い割合で、十分にタンパク質のフォールディングを阻害してしまうため、予測できなかったことである。
【００４９】
本発明の一実施形態において、これらのアミノ酸は、タンパク質表面上に連続的な領域を形成する、新規なＥＤ−Ｂ結合特性を有する領域の発生のために修飾される。このようにして、ＥＤ−Ｂへの結合特性を有する連続的な領域を発生させることができる。本発明において、「連続的な領域」は、以下の通りである。側鎖の電荷、空間的構造および疎水性／親水性により、それに対応して、アミノ酸は、その環境と相互作用する。前記環境は、溶媒、通常は、水または、例えば、空間的に近いアミノ酸等の他の分子であり得る。タンパク質に関する構造情報および各種ソフトウェアの手段により、前記タンパク質表面の特徴を決定できる。例えば、タンパク質の原子と溶媒との接触領域を、この接触領域がどのような構造であるか、溶媒に接触しやすい表面領域はどれか、または、前記改変が表面においてどのように分布しているか、についての情報を含むこの方法により可視化できる。連続的な領域は、例えば、適切なソフトウェアを使用したこの種の可視化により明らかにされ得る。このような方法は、当業者に公知である。本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体が、新規な結合特性の発生のために修飾される表面上の前記連続的な領域として使用され得る。一実施形態において、この目的のための修飾は、αへリックス領域を含んでもよい。ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質において、結合決定領域は、１つの結合決定領域の２倍の長さを有する１つの連続的な領域を共同で形成する、２つの前記表面露出領域を含む。
【００５０】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位の少なくとも一方を含む、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の修飾が、重要である。前記「βシート構造」は、本質的にシート状で、ほぼ完全に伸長されている（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ）ことにより定義される。一方、ポリペプチド鎖の連続したセグメントから形成されるαへリックスに対して、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域により形成され得る。このようにして、一次構造において離れて位置する領域同士が、近傍同士となることができる。β鎖は、概して、５〜１０個のアミノ酸長を有し（通常は、ユビキチンにおける５〜６残基）、ほぼ完全なストレッチ構造を有する。前記β鎖は、互いに近接し、一方の鎖のＣＯ基と他方の鎖のＮＨ基との間で水素結合が形成される。逆もまた同様である。βシートは、複数の鎖から形成され、シート状構造を有し、Ｃα原子の部位が、シート状平面の上方または下方の間で交互に入れ替わる。アミノ酸側鎖は、このパターンに追随し、そして、上端もしくは下端に向く。前記β鎖の方向により、前記シートは、平行シートおよび逆平行シートに分類される。本発明によれば、両方とも、変異可能であり、請求されたタンパク質の調製に使用可能である。
【００５１】
前記β鎖および前記βシート構造の突然変異のために、表面に近いβ鎖または前記β鎖（前記βシートの１つの鎖）に隣接する３つ以内のアミノ酸部位が、ユビキチンにおいて選択される。表面露出アミノ酸は、利用可能なＸ線結晶構造により同定できる。利用できる結晶構造がない場合、利用可能な一次構造または３次元タンパク質構造モデルに関して、表面露出βシート領域および個々のアミノ酸部位の接触性を予測するコンピュータ解析手法による試みをなし得る。このようにして、潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を入手し得る。さらなる開示は、例えば、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７ Ａｐｒ ５； １９４（３）：５３１−４４． Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｂｕｇｇ Ｃ．Ｅ．， Ｃｏｏｋ Ｗ．Ｊから得ることができる。
【００５２】
前記βシートまたは前記β鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位における修飾を行えるが、突然変異を生成させるアミノ酸部位の前選択は時間がかかるため、除外し得る。前記βシート構造または前記βシート鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸をコードするＤＮＡ領域を、ＤＮＡ環境（ＤＮＡ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）から単離し、ランダム突然変異に供し、その後、それらを予め除去したタンパク質をコードするＤＮＡに再度組み込む。続いて、所望の結合特性を有する変異体の選択工程を行う。
【００５３】
本発明の他の実施形態において、表面に近い、前記β鎖または前記β鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位は、前述のように選択され、これらの選択された領域内部の突然変異誘発された前記アミノ酸部位は、同定される。ついで、このようにして選択されたアミノ酸部位は、部位特異的突然変異によりＤＮＡレベルで、突然変異され得る。すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが、予め選択された他の特定のアミノ酸をコードするコドンにより置換され、または、この置換がランダム突然変異との関連で行われる。前記置換されるアミノ酸部位は、新規な部分をコードするコドンのみではなく、未定のアミノ酸も定義される。
【００５４】
「表面露出アミノ酸」は、周囲の溶媒に接触可能なアミノ酸である。タンパク質におけるアミノ酸の接触性が、モデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙにおけるアミノ酸の接触性と比較して８％以上である場合、前記アミノ酸は、「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域または個々のアミノ酸部位は、それぞれ、本発明により選択される、潜在的な結合パートナーに対する好ましい結合部位でもある。また、参考文献として、Ｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ７０９ − ７１３， ａｎｄ Ｓｈｒａｋｅ ＆ Ｒｕｐｌｅｙ， １９７３ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７９（２）：３５１−３７１があげられ、開示の全てを、本願に取り込む。
【００５５】
元のタンパク質および互いのタンパク質から新たに発生させた人工結合部位の領域における、アミノ酸置換によるユビキチンタンパク質足場の変異体を、対象とされた各配列セグメントのターゲット突然変異により、発生できる。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性／親水性等の所定の特性を有するアミノ酸を、それぞれ、各特性を有するアミノ酸で交換または置換できる。置換の他に、「突然変異」、「修飾」および「交換」は、挿入および欠失も含む。タンパク質レベルにおいて、前記修飾を、当業者に公知の方法によるアミノ酸側鎖の化学的改変により行ってもよい。
【００５６】
ユビキチンの突然変異方法
各配列セグメントの突然変異の開始点として、例えば、当業者に公知の方法により、調製され、改変され、増幅されたユビキチンのｃＤＮＡを使用できる。一次配列の比較的狭い領域（例えば、１〜３個のアミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬および方法が利用可能である（「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；「Ｍｕｔａｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、Ｂｉｏｒａｄ）。大きい領域の部位特異的な突然変異には、具体的な態様として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当業者に利用可能である。この目的のために、所望の部位が変性された塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合は、例えば、変異の誘導に使用できる。これは、イノシン等のゲノムＤＮＡに自然には発生しない塩基対類似体の使用によってもなされ得る。
【００５７】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位の１つ以上の突然変異の開始点は、例えば、ユビキチンのｃＤＮＡでもよいし、ゲノムＤＮＡでもよい。また、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子は、合成的に調製されてもよい。
【００５８】
突然変異に利用可能な公知の他の手法は、部位特異的突然変異の方法、ランダム突然変異の方法、ＰＣＲを使用する突然変異または類似の方法である。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、突然変異が生成される前記アミノ酸部位は予め定められている。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるべきアミノ酸に関して、請求項１の限定を満たすように行われる。いずれの場合にも、異なる変異のライブラリーは、通常、公知の方法によりスクリーニングされて確立される。修飾されたユビキチンタンパク質について、十分な構造情報が利用可能な場合には、通常、修飾されるアミノ酸の前選択が、特に簡易に行われ得る。
【００６０】
本発明によれば、例えば、標的変異、および、従来技術であるＰＣＲ、化学的突然変異、細菌の突然変異誘発株を使用する、長い配列セグメントの突然変異を使用できる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記突然変異は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）を使用できることも理解すべきである。前記βシート構造が維持されるように、前記変異が行われる。通常、前記突然変異は、タンパク質の表面上に露出される安定なβシート領域の外側で行われるのが好ましい。それには、部位特異的突然変異およびランダム突然変異の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異は、市販のキットにより発生できる。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（ＵＳ５，７８９，１６６；ＵＳ４，８７３，１９２参照）があげられる。
【００６２】
より広い領域を部位特異的突然変異に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異される領域は、変異された部位および変異されていない部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入され得る（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。このためには、エラー率の高いポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の度合いを高め、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングの手法により組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異戦略についての報告として、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０の報告が提供される。選択されたＤＮＡ領域に、このランダム突然変異を行うためにも、突然変異に使用されるＤＮＡカセットを、構築しなければならない。
【００６３】
ランダム修飾は、当該技術分野において、十分に確立された公知の方法により行われる。「ランダムに修飾されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列」は、いくつかの部位が、ヌクレオチドまたはアミノ酸により挿入、欠失または置換され、特性が予測できないヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。多くの場合、挿入された前記ランダムヌクレオチド（アミノ酸）配列、または、ヌクレオチド（アミノ酸）配列は、「完全にランダム」であろう（例えば、ランダム化合成またはＰＣＲを介した突然変異の結果として）。ただし、前記ランダム配列は、共通の機能的特性（例えば、発現産物のリガンドへの反応性）を有する配列を含み得る。また、前記ランダム配列は、最終的な発現産物が、例えば、異なるアミノ酸の分布においても、完全にランダムな配列であるという意味で、ランダムでもよい。
【００６４】
ランダム化された断片をベクター中に適切に導入するために、本発明では、前記ランダムヌクレオチドは、部位特異的ＰＣＲを介した突然変異の方式により、発現ベクター中に導入されるのが好ましい。ただし、他の選択肢は、当業者に公知であり、例えば、合成ランダム配列ライブラリーを同様にベクターに挿入可能である。
【００６５】
融合ＰＣＲにより変異体またはライブラリーを発生させるために、例えば、３回のＰＣＲ反応を行ってもよい。２回のＰＲＣ反応は、部分的に重なった中間体フラグメントを発生するように行われる。３回目のＰＣＲ反応は、前記中間体フラグメントを融合するように行われる。
【００６６】
ライブラリーまたは変異体株の構築方法は、所望の制限酵素認識部位周辺のプライマー（制限酵素認識部位プライマー）の第１セット、および、例えば、目的のコドンの上流および下流周辺のプライマー（変異原性プライマー）の第２セットを構築する工程を含んでもよい。制限酵素認識部位プライマーは、フォワード制限酵素認識部位プライマーおよびリバース制限酵素認識部位プライマーを含む。変異原性プライマーは、フォワード変異原性プライマーおよびリバース変異原性プライマーを含む。一実施形態において、前記プライマーは、目的のコドンの上流および下流について構築される。前記制限酵素認識部位プライマーおよび前記変異原性プライマーは、第１中間体フラグメントおよび第２中間体フラグメントの構築に使用される。２回のＰＣＲ反応により、これらの直線状の中間体フラグメントが生成される。これらの各直線状の中間体フラグメントは、少なくとも一つの目的の変異コドン、フランキングヌクレオチド配列および切断部位を含む。前記３回目のＰＣＲ反応では、前記２つの中間体フラグメントならびに前記フォワード制限酵素認識部位プライマーおよび前記リバース制限酵素認識部位プライマーが使用され、直線状の融合産物が生成される。一方、前記直線状の産物の結合していない末端は、制限酵素で切断され、前記直線状の産物に付着末端が作製される。前記直線状の産物の前記付着末端は、ＤＮＡリガーゼの使用により融合され、環状の産物、例えば、環状のポリヌクレオチド配列が生成される。
【００６７】
前記中間体フラグメントの構築のために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの２つのセットについての設計および合成が行われる。前記２つのセットは、制限酵素切断部位をおよびそのフランキングヌクレオチド配列を含む第１セット、ならびに、目的の変異コドンを少なくとも一つ含む第２セット（変異原性プライマー）を含む。当業者は、前記変異の数が所望の変異アミノ酸修飾の数に対応することを認識するであろう。本願発明者は、他の制限酵素が前記工程に使用可能かを熟考した。この切断部位の正確な位置、ならびに、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの対応する配列は、適宜改変され得る。当該技術分野において利用可能な他の方法も、代替として使用され得る。
【００６８】
本発明において、足場に導入される発現産物のランダム化フラグメントを有することを除けば、少なくとも一つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列に融合される、ランダム化ヌクレオチド配列を有することにより、融合パートナーに前記ランダム配列を連結する必要がある。融合パートナーは、例えば、前記発現産物の発現および／または精製／単離および／または、さらに安定化を促進できる。
【００６９】
本発明の一例によれば、単量体ユビキチンの２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換を、非常に簡易にＰＣＲの手段により行うことができる。前述の部位が、前記タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端の近くに位置しているためである。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡ鎖の５’末端および３’末端である。そこで、突然変異ＰＣＲ反応に使用される前記第１オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される２、４、６および／または８位のコドンから離れており、ユビキチンの配列におけるアミノ末端のコード鎖に対応する。したがって、前記第２オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位から離れており、少なくとも部分的に、カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コード鎖に対応する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドにより、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として単量体ユビキチンをコードするＤＮＡ配列を使用して行うことができる。
【００７０】
また、得られた増幅産物を、例えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを使用する、他のポリメラーゼ連鎖反応に添加できる。本発明によれば、所定のハプテンまたは抗原に対する結合特性を有するユビキチン変異体の単離のための次の選択工程での使用に適したベクター系中に得られた前記遺伝子カセットを導入するのが好ましい。
【００７１】
ユビキチンの修飾領域
基本的に、結合パートナーであるＥＤ−Ｂに接触可能かどうか、および、タンパク質の全体構造が、推測上修飾に耐性を示すかどうかで、修飾領域は、選択され得る。
【００７２】
表面露出β鎖における修飾の他に、前記タンパク質の他の表面露出領域も修飾でき、前記β鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位において行われるのが好ましい。これらの修飾領域は、新規に発生させるＥＤ−Ｂに対する高い結合親和性に関与する。
【００７３】
本発明の他の任意の実施形態において、前記タンパク質における４つのβ鎖の１つもしくは２つにおけるアミノ酸、好ましくは２つにおけるアミノ酸、または、好ましくは前記４つのβ鎖の２つに隣接する３つ以内のアミノ酸部位が、修飾され、新規の結合特性が発生する。前記４つのβ鎖の３つもしくは４つにおける修飾、または前記β鎖の３つもしくは４つに隣接する３つ以内のアミノ酸部位の修飾も、ＥＤ−Ｂ結合発生のために、任意で行ってもよい。
【００７４】
アミノ末端およびカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸、または、アミノ末端およびカルボキシ末端鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、ＥＤ−Ｂへの新規の結合部位を発生させる。この点において、前記カルボキシ末端βシート鎖に隣接する４つ以内のアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、および、前記アミノ末端β鎖に隣接する１つ以内のアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換される。
【００７５】
哺乳類のユビキチン、好ましくはヒトのユビキチンにおける下記の部位の表面露出アミノ酸の少なくとも３つが、修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換される：２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位。前記アミノ酸グループの少なくとも４つのアミノ酸は、結合パートナーであるＥＤ−Ｂに対して従来は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の発生に特に適していることが見出された、ユビキチンの表面に連続的な表面露出領域を形成する。これらのアミノ酸残基の少なくとも３つは、修飾されなければならない。任意に、前記アミノ酸残基の３、４、５、６、７、８、９または１０個が修飾され、任意にアミノ酸残基の付加を組み合わせることもできる。
【００７６】
上記修飾後、本願発明者は、実施例で述べるアミノ酸修飾ユビキチン配列が、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０−９以下）でＥＤ−Ｂと結合することを見出した。
【００７７】
融合タンパク質
他の好ましい実施形態において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した、前記本発明の結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した、前記本発明のヘテロ二量体結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分、例えば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンド、例えば、治療または診断に関連する放射線核種を含んでもよい。低分子の有機化合物または非アミノ酸化合物、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等を含んでもよい。本発明の好ましい一実施形態において、前記ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合ヘテロマー分子は、治療または診断特性を有するタンパク質またはペプチドに、共有的にまたは非共有的に接合される。
【００７９】
ＥＤ−Ｂ結合能を有するユビキチンベースの融合タンパク質の取得方法について、いくつかの例を、以下に示す。
ａ）ユビキチンに存在するリジン残基を介した前記タンパク質の接合；
ｂ）システイン残基を介した前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質の接合
前記システイン残基は、Ｃ末端に位置するか、または任意の他の部位（例えば、２４もしくは５７位のアミノ酸残基）に位置し得る；マレイミド選択的成分による接合；
ｃ）ペプチド性またはタンパク質性の接合−遺伝学的融合（好ましくはＣ末端またはＮ末端）
ｄ）タグに基づく融合−前記ターゲットタンパク質ＥＤ−ＢのＣ末端またはＮ末端に位置するタンパク質またはペプチド。融合「タグ」、例えば、ポリヒスチジン（特に、放射性標識に関する）。
【００８０】
補助目的のタンパク質に共有的および非共有的に付着するための、これらおよび他の方法は、当該技術分野において周知であるので、さらに詳細には説明しない。
【００８１】
前記活性成分は、サイトカイン、好ましくは、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ（ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ）、ＭＩＰ（ＭＩＰ−１−α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β）、ＴＧＦ−β ＬＩＦ１ ＣＤ８０、ＣＤ−４０リガンド Ｂ７０、ＬＴ−β、Ｆａｓ−リガンド、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチン、フラクタルカイン等からなる群から選択されるサイトカインである。
【００８２】
本発明において使用される最も好ましいサイトカインの一つは、ＴＮＦαである。炎症性サイトカインであるＴＮＦは、哺乳類の体内において、抗腫瘍作用を含む複数の活性を有する。ＴＮＦは、ヒトにおいて、有効量では許容できない毒性を示すために、近年、臨床的に適切ではなくなっている。近年、ＴＮＦは、メルファラン等の細胞増殖抑制物質との併用で、治療に使用される。
【００８３】
さらに任意に、前記ヘテロ多量体ユビキチン結合タンパク質に接合可能な前記活性成分は、毒性化合物、好ましくは、低分子有機化合物またはポリペプチド、任意に、毒性化合物、例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、トランケート緑膿菌外毒素Ａ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ）、組換えゲロニン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシンーＡ鎖（Ｒｉｃｉｎ−Ａ ｃｈａｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）、マデュロペプチン（ｍａｄｕｒｏｐｅｐｔｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）からなる群から選択される毒性化合物である。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態において、前記本発明のヘテロ多量体ユビキチン結合タンパク質は、人工アミノ酸を含んでもよい。
【００８５】
前記本発明の融合タンパク質のさらなる実施形態において、前記活性成分は、蛍光色素、好ましくは、ガンマ放射同位体のグループの放射線核種のいずれか、好ましくは、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、または陽電子放出体のグループ、好ましくは、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉ、またはベータ放出体のグループ、好ましくは、１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、またはアルファ放射体のグループ、好ましくは、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ；Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒまたはＣｙ ｄｙｅｓ（Ｂｅｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５１ （１２）： １６９９−１７１２， ２００３）；光増感剤；プロコアグラント因子、好ましくは、組織因子（例えば、ｔＴＦ（断ち切った組織因子）；プロドラッグ活性の酵素、好ましくは、カルボキシぺプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群から選択される一つの酵素；および／または機能性Ｆｃドメイン、好ましくは、ヒト機能性Ｆｃドメインからなる群から選択される一つの成分である。
【００８６】
本発明の融合タンパク質に関するさらなる実施形態は、さらに、血清半減期を調整する成分、好ましくは、ポリエチレングリコール、アルブミン結合ペプチドおよび免疫グロブリンからなる群から選択される成分を含む。
【００８７】
結合特性（解離定数）
前記本発明の融合タンパク質の結合特異性は、Ｋｄで与えられる非融合タンパク質で前述のように定義したのと同様である。本発明によれば、特異的結合親和性を定義する「Ｋｄ」は、１０−７〜１０−１２Ｍの範囲である。１０−５Ｍ以下の値であれば、定量化可能な結合親和性であると考えられる。適用に応じて、Ｋｄの値は、例えば、クロマトグラフィーへの適用の場合には、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍが好ましく、または、診断もしくは治療への適用の場合には、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍが好ましい。さらに好ましい結合親和性は、１０−７〜１０−１０Ｍであり、好ましくは、１０−１１Ｍである。
【００８８】
前記結合親和性を決定する方法は、それ自体公知であり、例えば、下記の方法から選択できる：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により提供される）、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、超遠心分析法、ＦＡＣＳ。
【００８９】
上記修飾後、本願発明者は、実施例で述べるアミノ酸修飾ユビキチン配列が、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０−１０Ｍ以下）でターゲットと結合することを見出した。
【００９０】
ユビキチンの二量体化
本発明において、「二量体」は、２つの単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質であると考えられる。前記二量体が２つの異なる修飾単量体を含む場合、前記二量体は、「ヘテロマー二量体」または「ヘテロ二量体」と呼ばれる。したがって、前記本発明の「ヘテロ二量体」は、特異的結合パートナーＥＤ−Ｂに対して共同で一価の結合特性を示す、２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質の融合物であると考えられる。前記本発明の修飾ヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合ユビキチンタンパク質は、各単量体ユビキチンタンパク質を個々にスクリーニングし、その後、これら２つを結合することによっては、得ることができず、前記ＥＤ−Ｂリガンドへの共同での一価の結合活性を示す第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットからなるヘテロ二量体をスクリーニングすることにより、得ることができることを強調しておく。前記各サブユニットは、ＥＤ−Ｂへの結合親和性がかなり制限され、結合した二量体修飾ユビキチンタンパク質のみが、前述の優れた結合特性を有することが期待される（例えば、図４参照）。
【００９１】
本発明によれば、遺伝学的にヘッドトゥテイルで結合された２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、ＥＤ−Ｂの同じエピトープに結合し、両方の結合ドメイン領域が共に作用することでのみ効果を示す。前記単量体の前記ＢＤＲは、単独の連続的な結合領域を形成する。
【００９２】
したがって、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに効果的に結合する、前記本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、二量体化される。前述のように、前記単量体は、直接連結されてもよいし、リンカーを介して連結されてもよい。種々の取り得るリンカーが、使用され得る。
【００９３】
各単量体ユビキチンは、２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の修飾を示す。前記単量体タンパク質は、遺伝学的に互いに融合される。前記ターゲットへの結合は、前記ＢＤＲの共同によりなされる。すなわち、前記ＢＤＲは、共同して、フィブロネクチンの前記ＥＤ−Ｂドメインに一価で結合可能な、共通の結合領域を一つ形成する。
【００９４】
ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチンへテロ二量体
Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２ＭでＥＤ−Ｂに結合し、フィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示す、前記本発明のユビキチンのヘテロ二量体は、下記の２つの選択肢から選択される。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換、および、
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
【００９５】
実施形態において、前記融合タンパク質は、第１ユビキチン単量体の６、８、６３〜６６位のアミノ酸の置換、ならびに、第２ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位、および、任意に２位のアミノ酸の置換を有する、前記ユビキチン単量体が、遺伝学的に融合されたヘテロ二量体であり、好ましくは、
前記第１ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換、
８位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファンまたはフェニルアラニン（Ｗ、Ｆ）への置換、
６３位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換、
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への置換；
前記第２ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）への置換
６２位におけるグルタミン（Ｑ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換
６３位におけるリジン（Ｋ）のセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換
任意に、２位におけるグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｋ）への置換が好ましい。
【００９６】
得られた修飾ユビキチンへテロ二量体が、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍでフィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対する特異的結合親和性を示し、フィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示し、且つ、ユビキチンタンパク質の構造的安定性が破壊されず、妨害されない限り、各単量体におけるこれらの置換の選択肢は、互いに組み合わせることができる。
【００９７】
最も好ましい置換は、下記のとおりある。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＦおよびＴ６６Ｐの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５ＷおよびＴ６６Ｅの置換；任意にさらにＱ２Ｒの置換、または
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｘ、Ｌ８Ｘ、Ｑ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｅ６４Ｘ、Ｓ６５ＸおよびＴ６６Ｘの置換；任意にさらにＱ２Ｘの置換、Ｘは、任意のアミノ酸（図２参照）。
【００９８】
ＥＤ−Ｂへの結合タンパク質を発生させる前記第１ユビキチン単量体において、特に好ましい置換は、下記のとおりである。
２位：Ｑ→Ｔ、４位：Ｆ→Ｗ、６位：Ｋ→Ｈ、６２位：Ｑ→Ｎ、６３位：Ｋ→Ｆ、６４位：Ｅ→Ｋ、６５位：Ｓ→Ｌ、６６位：Ｔ→Ｓ
【００９９】
２つの単量体のヘッドトゥテイルでの結合には、リンカーを使用しなくてもよいし、どのようなリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたは、ＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列もしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列のリンカーである。
【０１００】
好ましい実施形態において、２つの結合決定領域（ＢＤＲ）を有し、ＥＤ−Ｂに対して共に作用するユビキチンヘテロ二量体は、配列番号３３または３４のアミノ酸配列を含む。さらに好ましいタンパク質は、下記配列（配列番号４７）が提示される。下記配列において、ＸＸＸＸは、どのようなアミノ酸でよい。リンカーは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列が使用される。他の種類のリンカー、またはリンカーなしも、代替可能と理解される。
【化１】
【０１０１】
これらの配列のタンパク質のコンセンサス配列の例を、図２に示す。
【０１０２】
薬学的活性成分としてＴＮＦαを含む、前記本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有する。
【０１０３】
本発明のさらなる態様において、本発明は、前述のタンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをも包含する。また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明に包含される。
【０１０４】
本発明のさらなる態様において、前述のタンパク質もしくは融合タンパク質、および／または、前記本発明の組換えタンパク質もしくは組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞は、包含される。
【０１０５】
本発明のタンパク質の使用、例えば、ＥＤ−Ｂに対する特異的結合特性を有し、ＴＮＦα等のエフェクターに融合したヘテロ二量体ユビキチンの使用
前記本発明の修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する診断薬、および治療薬の調製に使用される。前記本発明のタンパク質は、例えば、直接的なエフェクター分子（修飾物質、拮抗物質、作用物質）または抗原認識ドメインとして使用できる。ＥＤ−Ｂ抗原が大量に出現する腫瘍の例を、図１の表に示す。
【０１０６】
選択する融合パートナーに応じて、本発明の医薬組成物は、癌、例えば、乳癌および結腸直腸癌、またはＥＤ−Ｂが大量に出現する任意の他の腫瘍性疾患（図１に列記したこれらの例を参照）に適用される。
【０１０７】
前記組成物は、治療上の有効量を含むように適応される。投与量は、治療対象の組織、疾患の種類、患者の年齢および体重、ならびにさらに公知の要因によって決まる。
【０１０８】
前記組成物は、薬学的または診断的に許容されるキャリアを含み、任意に、さらに、従来公知の助剤および添加剤を含み得る。これらは、特に制限されず、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩類、緩衝剤、着色剤等を含む。
【０１０９】
前記医薬組成物は、局所塗布用の液状製剤、クリーム、ローションの剤形；エアロゾル；粉末、細粒、錠剤、座剤、カプセル剤の剤形；エマルジョン、リポソーム製剤の剤形とし得る。前記組成物は、無菌、非発熱原性、等張性で、薬学的に従来公知で許容される添加剤を含むことが好ましい。また、Ｕ．Ｓ． ＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）の規則を参照できる。
【０１１０】
ヒトおよび獣医学の医薬療法および予防法の分野において、少なくとも一つの本発明のヘテロマーＥＤ−Ｂ結合ユビキチンタンパク質を含む、薬学的に有効な薬剤を、それ自体公知な方法により調製できる。生薬製剤に応じて、これらの組成物を、注射、点滴、全身投与、直腸投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与または他の従来から使用されている投与方法により、非経口的に投与できる。医薬品の種類は、治療対象の疾患の種類、疾患の重症度、治療対象の患者、および医学分野の当業者に公知の他の要因によって決まる。
【０１１１】
一実施形態において、前記医薬組成物は、前記本発明のタンパク質、融合タンパク質またはこれらの混合物を含み、さらに、１以上の化学療法剤、好ましくは、下記表に示すものから選択される化学療法剤を含む。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
好ましい実施形態において、前記化学療法剤は、メルファラン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ダクチノマイシン、フルオロデオキシウラシル、シスプラチン、パクリタキセルおよびゲムシタビン、またはキナーゼ阻害剤群から選択される。
【０１１４】
本発明の「医薬組成物」は、組成物の形態で提供されてもよい。種々の活性成分および希釈剤および／または担体は、互いに混合され、混合製剤の形態でもよい。前記活性成分は、部分的にまたは全体的に別々の形態で存在する。このような混合または混合製剤の一例は、複数の部品からなるキットである。
【０１１５】
本発明の「組成物」は、少なくとも２つの薬理学的な活性化合物を含む。これらの化合物は、同時に投与してもよいし、１分〜数日の時間間隔で個々に投与してもよい。これらの化合物は、同じ経路で投与してもよいし、異なる経路、例えば、一方の活性化合物を経口投与し、他方の活性化合物を非経口投与することも可能である。また、前記活性化合物は、一つの薬剤、例えば、一つの点滴液に処方されてもよいし、個々に処方された両化合物を含むキットとして処方されてもよい。また、両方の化合物は、２以上の包装でも提供可能である。
【０１１６】
特に好ましい組み合わせは、前記本発明の融合タンパク質ならびにメルファランおよび／またはドキソルビシン（リポソーム製剤）である。ＡＴＣ Ｌ０１分類の抗悪性腫瘍剤以外に、前記本発明のＴＮＦ融合タンパク質は、サイトカインおよびその誘導体、放射性医薬品、治療用細胞（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）ならびにナノ粒子を含む、他の抗悪性腫瘍剤と併用できる。
【０１１７】
腫瘍透過処理活性により、前記本発明のＴＮＦ融合タンパク質は（また、前記本発明の他の組換えタンパク質／融合タンパク質も）、世界保健機関により設定された解剖治療化学分類法（ＡＴＣ）において、Ｌ０１に示される全ての抗悪性腫瘍剤と併用できる。
【０１１８】
驚くべきことに、ＴＮＦαに融合したユビキチンヘテロ二量体の融合タンパク質、好ましくは、配列番号３５または３６の配列を有する融合タンパク質が、治療において有利に適用できることがわかった。ＴＮＦαは、毒性が高いため、通常、最小治療閾を下回る低用量でしか投与できない（このため、治療的に不活性である）。ＴＮＦαの毒性のため、治療的に有効な濃度への到達には、ＴＮＦαを使用する際、現在、四肢分離かん流アプローチが選択される。四肢かん流は、腕および足に直接抗癌剤を輸送するのに使用できる医療技術である。四肢への血流および四肢からの血流を、止血帯で一次的に停止させ、抗癌剤を直接四肢の血液に注入する。これにより、癌が発生している領域に高い投与量のＴＮＦαを、患者に受け入れさせることができる。
【０１１９】
しかし、前記本発明のＴＮＦα融合タンパク質を適用することにより、非毒性であって且つ治療的に有効な濃度でＴＮＦαを投与できる。ＴＮＦαは、前記本発明の（結合）融合タンパク質に連結されるため、疾病部位（例えば、腫瘍部位）に直接活性を示し、「遊離」のＴＮＦαを、徹底的に低減できる。
【０１２０】
前記本発明の融合タンパク質としてＴＮＦαを投与することにより、ＴＮＦαによる全身性の副作用を、著しく低減できる。前記本発明のＴＮＦα融合タンパク質の使用により、治療効果に達するためのＴＮＦαの全投与量を、大幅に低減でき、特に化学療法剤（上記参照）との併用において、全身の腫瘍の治療に有利に使用できる（四肢かん流の必要性および制約がない）。
【０１２１】
さらなる実施形態において、前記医薬組成物は、複数の部品からなるキットの形態でもよく、前記本発明の組換えユビキチンタンパク質／融合タンパク質、および１以上の化学療法剤が個々に提供される。
【０１２２】
前記本発明のヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の製造方法
前記本発明のＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、例えば、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、任意の従来公知の種々の技術により、または、市販の自動合成装置により調製できる。一方、従来の遺伝子組換え技術単独で、または、従来の合成技術との組み合わせにより、調製することもできる。
【０１２３】
本発明の他の態様において、組換え修飾ユビキチンタンパク質の発生方法が提供される。前記方法は、少なくとも下記の工程を含む。
ａ）単量体ユビキチンタンパク質から生じる異なる修飾がなされた二量体ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つの修飾ユビキチン単量体を含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含む、前記工程
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
ｂ）潜在的なリガンドとして、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であり、
前記修飾二量体ユビキチンタンパク質は、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程。
任意に、
ｅ）前記修飾二量体ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性で、単離する工程
【０１２４】
任意に、前記修飾は、ＤＮＡレベルでの遺伝子工学、および、原核生物、真核生物またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける修飾タンパク質の発現により行われてもよい。
【０１２５】
さらなる実施形態において、前記修飾工程は、化学的合成工程を含む。
【０１２６】
本発明の一態様において、異なる修飾がなされたタンパク質群は、互いに異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質をコードする、２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することにより得られる。
【０１２７】
さらなる態様において、前記修飾へテロ二量体ユビキチンタンパク質を、薬学的活性成分、任意に、サイトカイン、好ましくは、ＴＮＦα、または、診断用活性成分と融合させるように、また、前記組換え修飾へテロ二量体ユビキチンタンパク質を、前記薬学的活性成分、任意に、ＴＮＦα、または、前記診断用活性成分を介して形成されるように、前記方法は適用される。
【０１２８】
本発明によれば、修飾タンパク質は、さらに、化学的合成により調製されてもよい。この実施形態において、請求項１の前記ｃ）工程からｄ）工程は、一つの工程で行われる。
【０１２９】
さらなる態様において、本発明は、前記本発明のヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を形成する、前述の修飾単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリーに関する。
【０１３０】
本発明のさらなる態様において、前述の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーが提供され、各ライブラリーは、ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合され、前記ライブラリーは、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする。前記相互結合は、当業者に公知のリンカーまたは前述のリンカーのいずれか１つにより行われる。本発明の一実施形態において、ＴＮＦαは、同時に薬学的活性化合物としての役割も果たすリンカーとして使用される。
【０１３１】
複合ライブラリーの製造は、実施例１で概要を述べる。ただし、ライブラリーの品質に注意を払わなければならない。足場技術におけるライブラリーの品質は、そもそも、複雑性（個々の変異体の数）および機能性（得られた候補の構造的およびタンパク質の化学的完全性）に左右される。両方の特性が互いにネガティブな影響を与える場合もあり、前記足場における修飾部位の数の増加によるライブラリーの複雑性の増大が、変異体のタンパク質の化学的完全性の低下をまねくおそれもある。これにより、溶解度、凝集性が低下し、および／または収量が低下する場合もある。この理由は、エネルギー的に良好なタンパク質パッケージを有する本来の足場から大きく逸脱するためである。
【０１３２】
このため、適切な足場ライブラリーを構築するために、両極端な、ターゲットへの結合性を最適化するために、本来の配列に可能な限り多くの変異を導入すること、および、ネガティブなタンパク質化学的効果を避けるために、可能なかぎり本来の一次配列を保存することの間で、天秤にかけることとなる。
【０１３３】
本開示は、前記本発明の態様または実施形態を考慮して、前述の特徴の考え得る組み合わせも包含することに留意する。
【０１３４】
ターゲットであるＥＤ−Ｂに対する結合親和性を有する修飾ユビキチンタンパク質の選択、および、結合親和性を発生させる修飾アミノ酸の決定
例えば、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つのＤＮＡライブラリーが、各単量体ユビキチンユニットにおいて、選択されたアミノ酸に異なる修飾をすることにより確立された後、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得るために、これらのライブラリーは、例えば、リンカー技術により遺伝学的に融合される。本発明によれば、これらのライブラリーのＤＮＡがタンパク質を発現し、このようにして得られた修飾二量体タンパク質がＥＤ−Ｂに接触されて、結合親和性が存在する場合には、パートナーへの結合が可能となる。
【０１３５】
接触工程およびスクリーニング工程が、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質について、既に行われていることが本発明の重要な態様である。この工程により、ＥＤ−Ｂへの一価の結合活性を提供するユビキチンタンパク質のスクリーニングが可能である。
【０１３６】
本発明における接触は、適切な提示方法および選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、または細菌表面ディスプレイ等の方法、好ましくは、ファージディスプレイ方法により、行われることが好ましい。徹底した開示のために、下記の参考文献を参照できる；Ｈｏｅｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．． ３ （１９９３）， ５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２ （１９９２）， ５９７−６０４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９６）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。前述の方法は、当業者に公知であり、本発明における修飾に使用できる。
【０１３７】
本発明によれば、前記修飾タンパク質が、所定の結合パートナーに対して、定量化できる結合親和性を有するかどうかの決定は、１以上の下記の方法により行うことが好ましい：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、および超遠心分析法。
【０１３８】
ファージディスプレイ選択法
本願に適用されるファージディスプレイ法の一種は、結合特性を示すユビキチン変異体についての、本発明における選択手法の一例として、後述する。同様に、例えば、細菌上（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１（９）：８２５−８３２）もしくは酵母細胞上に提示する方法（ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ； Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１１）：１３０３−１０）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９４（１０）：４９３７−４９４２； Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ， １９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（２４）：５１３２−５１３４）、ｃｉｓディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０１（９）：２８０６−２８１０）もしくはｍＲＮＡディスプレイ等の無細胞選択システムを、適用できる。後者の場合、遺伝子型および表現型の一過性の物理的な結合が、リボソームを介して、適切なｍＲＮＡへのタンパク質変異体の連結により達成される。
【０１３９】
前記ファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換え変異体は、繊維状ファージ上に提示される。一方、この変異体のコードＤＮＡは、一本鎖の形状でファージエンベロープパッケージされ、同時に提示される。このため、親和性濃縮の枠組みにおいて、所定の特性を有する変異体を、ライブラリーから選択でき、その遺伝情報を、それぞれ、適切な細菌に感染させることにより増幅でき、また異なる濃縮サイクルに添加できる。ファージ表面での変異したユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくはＰｅｌＢシグナル配列、および、前記ファージのカプシドまたは表面タンパク質への遺伝子融合により達成され、カプシドタンパク ｐＩＩＩまたはそのフラグメントのカルボキシ末端融合が好ましい。また、コードされた融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる検出および／または精製のためのアフィニティータグもしくは抗体エピトープ、または、前記親和性濃縮過程における融合タンパク質の特異的切断のためのプロテアーゼ認識配列等のさらなる機能性成分を含んでもよい。また、例えば、ユビキチン変異体の遺伝子およびファージカプシドタンパク質またはそのフラグメントのコード領域の間に、アンバー停止コドンを存在させてもよい。前記アンバー停止コドンは、１つのアミノ酸の導入により、部分的に、適切なサプレッサー株における翻訳の際に認識されない。
【０１４０】
ＥＤ−Ｂへの結合特性を有するユビキチン変異体の単離に関する選択工程に適切であり、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入された細菌ベクターは、ファージミドという。中でも、繊維状ファージの遺伝子間領域（例えば、Ｍ１３もしくはｆ１）、または、その部分を含む。例えば、Ｍ１３Ｋ０７等のヘルパーファージによる前記ファージミドを輸送する細菌細胞の重複感染の際、ファージカプシド中に、ファージミドＤＮＡの閉鎖鎖がパッケージングされる。このようにして発生したファージミドは、細菌により分泌され、前記カプシドタンパク質 ｐＩＩＩまたはそのフラグメントとの融合により、コードされた各ユビキチン変異体を、細菌表面に提示する。本来のｐＩＩＩカプシドタンパク質は、適切な細菌株への再感染できるように、ファージミドに存在する。このため、対応するＤＮＡの増幅の可能性は、保持される。このため、前記ユビキチン変異体の表現型、すなわち、潜在的な結合特性とその遺伝子型との間の物理的な結合が、確保される。
【０１４１】
得られたファージミドを、当業者に公知の手法により、ファージ上に提示されたユビキチン変異体のＥＤ−Ｂへの結合により選択できる。このために、前記提示されたユビキチン変異体は、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一次的に固定化され、結合しない変異体を分離した後に、特異的に溶出し得る。前記溶出は、例えば、１００ｍＭ トリエチルアミン等の基本溶液により行うことが好ましい。また、前記溶出は、酸性条件下で、タンパク質分解または感染細菌の直接添加により行うことができる。このようにして、得られたファージミドは、ＥＤ−Ｂへの結合特性を有するユビキチン変異体の、連続的な選択サイクルおよび増幅サイクルにより、再度増幅され、濃縮され得る。
【０１４２】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、ファージミドの形態、すなわち、ファージに融合され、または、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、可溶性のタンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、または前記文献に記載されている。前記特性評価は、例えば、単離された変異体の一次配列のＤＮＡ配列の決定を含んでもよい。また、単離された変異体の親和性および特異性は、例えば、標準的な生化学的方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、超遠心分析法、またはその他の方法により検出できる。安定性分析については、例えば、化学的または物理的変性についての分光法が、当業者に公知である。
【０１４３】
リボソームディスプレイ選択法
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチン変異体のリボソームディスプレイ法を、無細胞転写／翻訳系の手法により準備し、対応するｍＲＮＡおよびリボソームが複合体として提示される。このために、前述のＤＮＡライブラリーは、基礎として使用され、変異体の遺伝子は、対応する発現およびタンパク質生合成の制御配列との融合の形態で提示される。前記遺伝子ライブラリー３’末端での前記停止コドンの欠失、および、初期の３つのタンパク質からなる複合体に適した実験条件（低温、高濃度のＭｇ２＋）により、前記ｍＲＮＡリボソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳中において維持される。
【０１４４】
各単量体ユビキチンユニットにおける選択されたアミノ酸の異なる修飾により、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが確立された後に、本発明によれば、前記修飾二量体は、結合親和性を有する場合には、ＥＤ−Ｂに接触され、パートナー同士の結合を可能にする。これらのタンパク質ライブラリーは、前記修飾タンパク質と前記ＥＤ−Ｂターゲットタンパク質との間で接触可能な方法で、前記修飾タンパク質を提示する任意の他の方法をディスプレイし、または使用する、ディスプレイ法ライブラリーの形態でもよい。前記ディスプレイ法は、任意に、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＴＡＴファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイ法である。
【０１４５】
１０−７〜１０−１２Ｍの範囲のＫｄの特異的結合親和性によるＥＤ−Ｂへの結合活性に関して、修飾ユビキチン変異体の選択を、当業者に公知の方法により行うことができる。このために、例えば、リボソーム複合体で提示される前記ユビキチン変異体は、それぞれ、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一時的に固定化され、または、溶液中で結合した後に磁性粒子に結合され得る。非結合変異体の分離に続けて、結合活性を有する変異体の遺伝子情報を、リボソーム複合体の破壊により、ｍＲＮＡの形態で特異的に溶出できる。前記溶出は、５０ｍＭ ＥＤＴＡで行うのが好ましい。このようにして得られた前記ｍＲＮＡは、単離され、適切な方法を使用してＤＮＡに逆転写され（逆転写反応）、このようにして得られた前記ＤＮＡは、再度増幅され得る。
【０１４６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳、選択および増幅の連続サイクルにより、所定のハプテンまたは抗原に結合特性を有するユビキチン変異体を、濃縮できる。
【０１４７】
ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の特性評価
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、前述のように、可溶性のタンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、前記文献に記載されている。
【０１４８】
好ましくは、所定の結合パートナーに対する結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、検出されたタンパク質の単離工程および／または濃縮工程が続く。
【０１４９】
前記本発明の修飾ユビキチンタンパク質の発現に続いて、それ自体公知の方法によりさらに、精製および濃縮される。前記選択された方法は、例えば、使用する発現ベクター、宿主組織、使用する意図した領域、タンパク質の大きさ、およびその他の要因等、それ自体当業者に公知の複数の要因により決定される。簡易に精製するために、前記本発明の修飾タンパク質は、分離材料への高い親和性を有する他のペプチド配列に融合させることができる。ユビキチンタンパク質の機能性に有害な効果を有さないか、または、特定のプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能な融合が、好ましく選択される。このような方法は、それ自体当業者に公知である。
【０１５０】
図面の簡単な説明
図１は、種々の腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生を列記した表を示す。
【０１５１】
図２は、ＥＤ−Ｂへの驚くほど強力な結合親和性を有することが見出された、さらなる１６種類の配列のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。前記コンセンサスアミノ酸部位は、前記第１単量体の結合決定領域である、２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位である。一方、コンセンサスアミノ酸置換は、Ｑ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓである。図２に示すように、４種類のファミリーの配列を濃縮できた（コンセンサス配列、文字サイズはアミノ酸の発生頻度に対応する）。８５および８７位は、前記ヘテロ二量体タンパク質において、前記第２単量体における６および８位に対応する部位であり、１４１〜１４５位は、６２〜６４位に対応する。暗青色で示したＴＷＨＮＦＫＬＳは、１０７１−Ｃ１２由来である。赤色で示した残基は、前記４種類のファミリーの配列のうちの１種類に属する。赤色で示した残基が、主に濃縮され（１７８／４５７配列）、ＨＩＴ ＥＬＩＳＡによれば、最も強力な結合分子を含む。
【０１５２】
図３は、親和性を向上させた四量体化を示す。修飾ユビキチン単量体からなる四量体と比較した、修飾ユビキチン単量体のＫｄ値を、表に示す。ユビキチン変異体５Ｅ１および１Ｈ４を、例として示す。ＥＤ−Ｂ結合を、ｃ−ＦＮ（細胞性フィブロネクチン）への結合と比較する。前記図は、前記単量体（５Ｅ１は４．５１μＭ、１Ｈ４は９．９８μＭ）と比較したターゲットであるＥＤ−Ｂへの四量体変異体（例えば、５Ｅ１は５６ｎＭ、１Ｈ４は１．４ｎＭ）の結合において、親和性が著しく高いことを示している。
【０１５３】
図４は、ヘテロ二量体を発生させる、前方（第１）修飾ユビキチン単量体（ＢＤＲ１を有する）と異なる修飾がされた後方（第２）ユビキチン単量体（ＢＤＲ２を有する）との遺伝子組み換えが、親和性および特異性を有意に向上させることを示す。細胞および組織切片に結合する前記修飾ユビキチン分子を、Ｂｉａｃｏｒｅ、蛍光偏光測定により分析した。ヒトＥＤ−Ｂへの複数の変異体の結合の濃度依存性ＥＬＩＳＡ（ｃｏｎｃ．−ＥＬＩＳＡ）を示す。
【０１５４】
図４Ａは、単量体４１Ｂ１０についての、Ｋｄ＝９．４５μＭの結合親和性を示す。
【０１５５】
図４Ｂは、４１Ｂ１０が異なる第２単量体と結合して得られた４６Ｈ９についての、Ｋｄ＝１３１ｎＭの結合親和性を示す。
【０１５６】
図５は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）と融合した特異的変異体を示す。前記融合タンパク質は、前記修飾ユビキチン単量体を三量体形成し、生物学的に活性な分子である。
【０１５７】
図５Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合エフェクター融合タンパク質の模式図である。同図において、緑色（上部の構造）は、エフェクター、例えば、サイトカイン、好ましくは、ＴＮＦα；茶色、薄い茶色は、前記修飾ユビキチン単量体（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標））である。
【０１５８】
図５Ｂは、前記修飾ユビキチンエフェクター接合５Ｅ１−ＴＮＦコンジュゲートが、アポトースシス促進活性（Ｌ９２９アポトーシスアッセイで測定）を有すること示す。
【０１５９】
図５Ｃは、１Ｈ４−ＴＮＦα融合物のＥＤ−Ｂへの結合親和性（Ｋｄ＝１５．１ｎＭ）が高いことを示す（一致した線により連結された黒丸）。ＢＳＡへの結合をコントロールとしてプロットした（線により連結されていない黒丸）。
【０１６０】
図６は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
・修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合サイトカイン融合物のアポトーシス誘導活性：ＥＣ５０ ０．７８±０．２４ｐＭ
・遊離サイトカインのアポトーシス誘導活性：ＥＣ５０ ３．１４±３．５９ｐＭ
【０１６１】
図６Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ）。
【０１６２】
図６Ｂは、遺伝学的にサイトカインＴＮＦαに融合し、前記ヘテロ二量体２４Ｈ１２が多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ）。
【０１６３】
図６Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体クローン９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。細胞基質のフィブロネクチンをコントロールとして使用した場合と比較して、ターゲットであるＥＤ−Ｂに対して、Ｋｄ ＥＬＩＺＡ値が向上され、前記ターゲットへの特異的結合が確認された。
【０１６４】
図６Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜１５μＭ ９Ｅ１２）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、前記ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析するチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析した。会合解離曲線の分析からは、Ｋｄを、決定できなかった。
【０１６５】
図６Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜１５μＭ ４１Ｂ１０）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、前記ヘテロ二量体変異体４１Ｂ１０とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析するチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、６２３ｎＭ（６２３×１０−９Ｍ、６．２×１０−７Ｍ）であった。
【０１６６】
図７は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。前記異なる変異体は、小文字でマークされる共通の配列モジュールを共有する。前記変異体について、ＥＤ−Ｂ結合を分析した。図７は、修飾ユビキチンへテロ二量体が得られる、単量体の種々の組み合わせを示す。ヘテロ二量体変異体４６−Ａ５、５０−Ｇ１１および４６−Ｈ４は、すべて同一の、ＢＤＲ１を有する第１（前方）修飾単量体（同図において、「ａ」で示す）を有するが、第２（後方）ユビキチン単量体は、ＢＤＲ２における異なる部位が修飾されている。変異体５２−Ｄ１０および５２−Ｂ３は、ＢＤＲ１を有する４６−Ｈ９と比較して、異なる第１（前方）修飾単量体を有し、ＢＤＲ２を有する同一の第２（後方）ユビキチン単量体（同図において、「ｅ」で示す）を有している。
【０１６７】
前記修飾ユビキチンヘテロ二量体は、下記配列を有する：
４６−Ｈ４：配列番号２５、４５−Ｈ９：配列番号２６、４６−Ａ５：配列番号２７、５０−Ｇ１１：配列番号２８、５２−Ｂ３：配列番号２９、５２−Ｄ１０：配列番号３０。
【０１６８】
実験過程において、配列ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１）を有するＨｉｓタグにより、前述の配列を修飾した。
【０１６９】
図７に示すように、４６−Ｈ４は、ＥＤ−Ｂへの優れた結合親和性を有する（Ｋｄ＝１８９ｎＭ）。４６−Ａ５および５２−Ｄ１０は、結合活性を有さない。また、他の修飾ユビキチンタンパク質は、ＥＤ−Ｂへの結合活性が４６−Ｈ４と比較して低い。したがって、ヘテロ二量体変異体における両単量体が、ターゲットへの高い結合親和性のために必要とされると結論付けることができ、両単量体がターゲットに対する一価の結合を示す。
【０１７０】
高いＥＤ−Ｂ結合活性を有する前記修飾ユビキチンヘテロ二量体４６−Ｈ９は、前記２つの単量体の両結合ドメイン領域における下記のアミノ酸置換により、野生型ユビキチン単量体と比較して同定される。
前記第１モジュール（ＢＤＲ１）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール（ＢＤＲ２）において、（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５０Ｇ１１
前記第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュールにおいて、（ｃ）Ｋ６Ｍ、Ｌ８Ｒ、Ｑ６２Ｍ、Ｋ６３Ｎ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｒ、Ｔ６６Ｌ
４６Ｈ４
前記第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュールにおいて、（ｄ）Ｋ６Ｇ、Ｌ８Ｗ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ｑ、Ｅ６４Ｑ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｒ
５２Ｂ３
前記第１モジュールにおいて、（ｇ）Ｑ２Ｒ、Ｆ４Ｐ、Ｋ６Ｙ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｒ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）において、Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５２Ｄ１０（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュールにおいて、Ｑ２Ｖ、Ｆ４Ｃ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｇ、Ｔ６６Ｄ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）において、（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
４６Ａ５（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュールにおいて、（ｂ）Ｋ６Ｌ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｌ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ
【０１７１】
図８は、配列アライメントを示す。１行目：野生型ユビキチンタンパク質の２つの単量体（１行目）は、７７位から８８位までの１２個のアミノ酸のリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧにより結合される。ＢＤＲ２を有する第２単量体は、８９位のメチオニンから始まる。この二量体野生型ユビキチンタンパク質は、第１単量体および第２単量体の２つのＢＤＲにおいて異なる修飾を有する、前記修飾へテロ二量体変異体４６−Ｈ９（２行目）で整列されている。ターゲットへの一価の結合のために、両ＢＤＲは、ターゲットとの結合において、共に作用する。
【０１７２】
図９は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。前記第２単量体の最後のＣ末端アミノ酸において、グリシンからアラニンに置換されている。３行目は、二量体である野生型ユビキチンであり、リンカーアライメントを示さない（このため、７７位のメチオニンから第２単量体が開始する）、「Ｕｂｉ−Ｄｉｍｅｒ ｗｔ」を示す。４行目は、ヒトの野生型ユビキチンである「Ｕｂｉ−Ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ」を示す。
【０１７３】
図１０は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ＝６．９×１０−９Ｍ）。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９−ｔ０という）への結合親和性を示すことを、黒丸で示し、この変異体が、ネガティブコントロール（６７８９−ｔ０という）には結合しないこと（白丸）と比較する。
【０１７４】
図１１は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。
【０１７５】
図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜２００ｎＭ １０４１−Ｄ１１）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化された、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９という）への結合を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）であり、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体の長期間における半減期を示すｋｏｆｆ率は、７．７×１０−４ｓ−１であった。
【０１７６】
図１３は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。マウス血清もしくはラット血清またはコントロールとしてのＰＢＳＴ中での、３７℃で１時間での前記変異体のプレインキュベーション等について、種々の条件を示す。Ｋｄ値は、すべて１０〜２０ｎＭである。したがって、ＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体１０４１−Ｄ１１の結合は、血清による顕著な影響を受けないと結論付けることができる。
【０１７７】
図１４は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【０１７８】
図１４Ａは、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体形成を示す。３回のＨＰＬＣのランを重ねている。ＳＥ−ＨＰＬＣ後の、保持時間２１．６５１分の青色のピークは、純粋な１０４１−Ｄ１１に由来し、保持時間２６．２８９分の黒色のピークは、フィブロネクチンフラグメント６７Ｂ８９を表し、保持時間２１．４０７分の赤色のピークは、１０４１−Ｄ１１と６７Ｂ８９との混合物の結果を示す。１０４１−Ｄ１１のピークの保持時間が短くなる側へのシフト、および、６７Ｂ８９のピークの消失は、１０４１−Ｄ１１と可溶性ＥＤ−Ｂとの複合体の形成を示す。
【０１７９】
図１４Ｂは、３回のＳＥ−ＨＰＬＣのラン、１０４１−Ｄ１１（青色、２１．９４４分）、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９（黒色、２６．２８９分）および１０４１−Ｄ１１と６７８９との混合物（２１．９２９分および２６．２８９分にピークを有する赤色線）を重ねて示す。前記１０４１−Ｄ１１のピークのシフトは、ほとんど観察されなかった。６７８９のピークが消失しなかったこととあわせて、この事実は、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９に、有意に結合しないことを示す。
【０１８０】
図１５は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の培養細胞への結合を示す。
【０１８１】
図１５Ａは、固定化されたヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。図１５において、１列目は、抗ＥＤ−Ｂ抗体を使用したコントロールを示し、２列目は、タンパク質濃度５８．７ｎＭでの変異体のインキュベーションを示し、３列目は、１０倍高濃度（５８７ｎＭ）の１０４１−Ｄ１１タンパク質でのインキュベーションを示し、４列目は、ＰＢＳでのネガティブコントロールである。１行目において、ヒトＷｉ３８繊維芽細胞を、位相差で示し、２行目において、免疫蛍光法で示し、３行目において、核のＤＡＰＩ染色を示す。前記変異体１０４１−Ｄ１１は、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、Ｗｉ３８に結合すると結論付けることができる。ＥＤＢを低レベルで発現するＮＨＤＦ細胞を使用するコントロールを行った（データ示さず）。前記変異体は、それらの細胞には結合しなかった。
【０１８２】
図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）ヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への結合を示す。前記ネガティブコントロールのＮＨＤＦ細胞は、主要な正常繊維芽細胞であり、ＥＤＢ−フィブロネクチンを低レベルで発現する。１行目および３行目は、種々のタンパク質濃度での変異体およびネガティブコントロールを示す。２行目および４行目は、ＥＤＢ抗体を使用するコントロールのインキュベーションを示す。１〜２行目は、前記変異体とＷｉ３８細胞株へのポジティブコントロールを示す。３〜４行目は、ＮＨＤＦ細胞のインキュベーションを示す。前記変異体１０４１−Ｄ１１が、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、Ｗｉ３８に結合するのが観察できた。
【０１８３】
図１５Ｃは、固定化されたマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞への結合を示す。前記変異体について、３つの異なるタンパク質濃度（１、１０、５０ｎＭ）でテストした。１行目は、細胞への前記変異体（ＳＰＶＦ−２８−１０４１−４１１−ＴｓＸ９）を示し、２行目は、ポジティブコントロール（Ｆｖ２８−ＥＤＢ−抗体）を示し、３行目は、ネガティブコントロール（ＵＢ２＿ＴｓＳ９；配列番号１に相当する非修飾ユビキチン）でのインキュベーションを示す。前記変異体１０４１−Ｄ１１が、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、マウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞に結合するのが観察できた。
【０１８４】
図１５Ｄは、固定化されたマウスＳＴ−２細胞への結合を示す。前記変異体について、３つの異なるタンパク質濃度（１、１０、５０ｎＭ）でテストした。１行目は、細胞への前記変異体（ＳＰＶＦ−２８−１０４１−４１１−ＴｓＸ９）を示し、２行目は、ポジティブコントロール（Ｆｖ２８−ＥＤＢ−抗体）を示し、３行目は、ネガティブコントロール（ＵＢ２＿ＴｓＳ９；配列番号１に相当する非修飾ユビキチン）でのインキュベーションを示す。前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１が、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、マウスＢａｌｂ ＳＴ−２細胞に結合するのを観察できた。
【０１８５】
図１６Ａは、哺乳類組織切片における、ターゲットへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。７つの検体からのＦ９腫瘍細胞について、評価した。１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の異なる濃度でのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の免疫組織学的検査において、マウス由来のＦ９腫瘍でのＥＤ−Ｂ特異的血管染色（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示した。ＥＤ−Ｂは、腫瘍血管構造の高特異的マーカーである。ターゲットタンパク質であるＥＤ−Ｂは、血管の反管腔側に局在する。変異体１０４１−Ｄ１１は、特異的にＦ９腫瘍由来の組織切片において、血管構造を装飾する。得られた結果は、抗体フラグメントＬ１９に匹敵する。さらに、４８組織をテストした。ＦＤＡ関連パネルにおける４８通りの組織について、非特異的な染色は観察されなかった。
【０１８６】
図１６Ｂは、野生型ユビキチン（同図において、Ｕｂ２（ＮＣＰ２））との比較における、腫瘍組織での１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。Ｆ９腫瘍組織について、３０分から１６時間の間の異なる時点で、１０４１−Ｄ１１および野生型ユビキチンの存在を分析した。腫瘍組織における１０４１−Ｄ１１の最も高い蓄積は、投与後３０分および１６時間で観察された。一方、Ｆ９腫瘍組織における野生型ユビキチンの蓄積は、低かった。前記変異体は、野生型ユビキチンと比較して、ＥＤ−Ｂを発現する腫瘍に濃縮される。このことは、腫瘍組織への１０４１−Ｄ１１の直接的ターゲッティングの証拠となる。また、癌モデルにおける腫瘍への１０４１−Ｄ１１のｂｌｏｏｄ−ｒａｔｉｏは、動物における１０４１−Ｄ１１変異体ｉｎ ｖｉｖｏ活性を明らかに証明している（データを示さず）。
【０１８７】
図１７は、ＴＮＦα融合タンパク質１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する高い選択性および特異性を示す。
【０１８８】
図１７Ａおよび１７Ｂ：１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性を、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）（Ｌ９２９細胞）によりテストした。前記両図は、前記１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質（図１７Ｂ）が、遊離ＴＮＦαと同程度に活性であることを、明らかに示している。
【０１８９】
図１７Ｃは、ターゲットであるＥＤ−Ｂへの、ヘテロ二量体ユビキチン１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い選択性を証明している。前記ヒトＥＤ−Ｂフィブロネクチンドメイン６７Ｂ８９は、１０４１−Ｄ１１変異体に、見かけのＫＤ値１．８ｎＭで結合され（黒丸）、ターゲットへの高い親和性を示す。ＥＤ−Ｂドメインを欠損するヒトフィブロネクチン（ｈ６７８９）は、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦαに結合されない（白丸）。
【０１９０】
図１７Ｄ＋Ｅは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。結果から、ＫＤ値１．１３ｎＭを示す１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い親和性が証明された。
【０１９１】
図１７Ｆは、培養細胞における変異体１０４１−Ｄ１１で観察された高い結合特異性が、１０４１−Ｄ１１がＴＮＦαに融合されても維持されることを示す。前記融合タンパク質は、ＥＤＢ発現細胞に特異的に結合する。したがって、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質は、非常に高い親和性および特異性でターゲットであるＥＤ−Ｂ（ターゲット（＋））に結合する。ＥＤ−Ｂを含まない血清（ターゲット（−））では、交差反応は観察されなかった。
【０１９２】
図１８は、ＴＮＦαに融合した変異体１０４１−Ｄ１１とメルファランとの併用による、７日間のマウスの処置期間中のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的腫瘍成長を示す。データから、細胞増殖抑制剤であるメルファランと組み合わせた１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαは、ｍＴＮＦαとメルファランとの組み合わせ、またはメルファラン単独の場合より効果的に、相対的腫瘍成長を減少させることが、明らかに示された。７日間の処置後の前記腫瘍成長は、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαによる高効率での減少を示す。このことは、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαとメルファランとの併用による腫瘍治療の効能の明らかな証拠である。ＥＤ−Ｂは、マウスおよびヒトを含む、種々の哺乳類において同一である。このため、前記結果から、ヒトにおける変異体１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαの性能が、予測される。
【実施例】
【０１９３】
下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供するものである。本発明は、特に、ユビキチンの修飾を例にあげて実証されている。しかし、本発明は、これに限定されず、以下の実施例は、単に、前述の記載に基づいた本発明の実施可能性を示しているにすぎない。本発明の完全な開示のため、本願および付属書類に引用されている文献についても言及しているが、これらの引用文献は全て、引用により、その開示全体が本願に取り込まれている。
【０１９４】
［実施例１］
修飾ユビキチンタンパク質に基づくヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の同定
【０１９５】
ライブラリーの構築とクローニング
特に示さない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されているような、確立された組換え遺伝学的手法を使用した。合計１５の選択されたアミノ酸部位における協調した変異誘発によって、高度な複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを用意した。ＮＮＫトリプレットによって置換された修飾アミノ酸は、近位（第１）ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸、および遠位（第２）ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸を含む。両ユビキチン単量体は、少なくともＧＩＧ配列、または少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するグリシン／セリンリンカーによって遺伝的に結合（ヘッドトゥテイル配置）しており、リンカー配列の例としては、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号３２）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられるが、その他のリンカーでもよい。
【０１９６】
ＴＡＴファージディスプレイ選択
ヘテロ二量体ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを使用し、ターゲットに対して濃縮した。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットは、タンパク質結合表面上に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して、非特異的に固定化され得る。ビオチンを介するストレプトアビジンビーズまたはニュートラアビジンストリップ上への固定化が好ましい。ターゲット結合ファージは、溶液中または固定化ターゲット上のいずれかにおいて選択される。例えば、ビオチン化され固定化されたターゲットとファージとを、インキュベートし、続いて、マトリックスに結合したファージの洗浄およびマトリックス結合ファージの溶出を行う。ターゲットのインキュベーションに続く各サイクルにおいて、前記ビーズを磁力により溶液から分離し、数回洗浄した。最初の選択サイクルにおいて、ビオチン化ターゲットを、ニュートラアビジンストリップに固定化し、一方、２回目から４回目のサイクルにおいて、溶液における選択を行い、続いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に、ターゲットとファージとの複合体を固定化した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のファージを、酸性溶液での溶出により遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のファージ溶出を行った。溶出したファージを再増幅した。バインダーの特異性を誘導するため、選択に際し、ターゲットに類似するタンパク質を含めてもよい。
【０１９７】
ＴＡＴファージディスプレイ選択の代替：リボソームディスプレイ選択
ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてリボソームディスプレイを使用して、ターゲットに対して濃縮した（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００７、Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットを、標準的な方法によってビオチン化し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。リボソーム、ｍＲＮＡおよび新生ユビキチンポリペプチドを含む三元複合体を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓ（登録商標） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて構築した。選択の一次ラウンドを２回行い、三元複合体をインキュベートし、続いて、類似する選択のラウンドを２回行った。ターゲットインキュベーションに続く各サイクルにおいて、ビーズを磁力により溶液から分離し、ストリンジェンシーを増加させながら、リボソームディスプレイバッファーで洗浄した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のｍＲＮＡをリボソームから遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のｍＲＮＡの溶出を行った（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ２００４）。各サイクルの後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、アメリカ）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製、ドイツ）を用いて、ＲＮＡの精製とｃＤＮＡの合成を行った。
【０１９８】
濃縮プールのクローニング
４回目の選択サイクルの後、合成ｃＤＮＡを、Ｆ１プライマー（ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧ）（配列番号９）およびＷＵＢＩ（ｃｏ）ＲＤ＿ｘｈｏプライマー（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧ）（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより増幅し、制限ヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、アメリカ）で切断し、適合性付着端を介して発現ベクターｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）に連結した。
【０１９９】
単一コロニーのヒット解析
ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）への形質転換の後、アンピシリン耐性単一コロニーを、２００μｌ ＳＯＢＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２０ｇ／ｌ グルコースを含むＳＯＢ培地）において、３７℃で６時間培養した。５００μｌの自己誘導培地ＺＹＭ−５０５２（Ｓｔｕｄｉｅｒ社製、２００５）を用い、９６ディープウェルプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ社製、イギリス）において、３７℃で１６時間培養することにより、ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチンを発現させた。４℃、３６００×ｇで、１５分間遠心分離して、細胞を回収した。その後、ウェルあたり３００μｌの溶解バッファーを用いて、３７℃で３０分間インキュベートし、前記細胞を溶解した。前記溶解バッファーは、０．２×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチーム（ＶＷＲ社製、ドイツ）、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｒｏｔｈ社製、ドイツ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．２Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（ＶＷＲ社製、ドイツ）を含む、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）とした。４℃、３６００×ｇで、３０分間遠心分離した後、得られた上清を、４μｇ／ｍｌ ＥＤ−Ｂ、およびセイヨウワサビぺルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とのユビキチン特異的ＦａｂフラグメントコンジュゲートでコートしたＮｕｎｃ ＭｅｄｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、アメリカ）を用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。検出試薬としてＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ社製、ドイツ）を用いた。ウェルあたり５０μｌの０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて、黄色を発色させ、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍと６２０ｎｍを測定した。
【０２００】
通常、数回、例えば、４サイクルの選択ディスプレイを、ＥＤ−Ｂに対して行った。最後の２サイクルの選択において、結合分子を、過剰量の遊離ＥＤ−Ｂを用いて溶出した。これらのＥＤ−Ｂ結合変異体を、他のものとの間で同定した。
４６Ｈ９配列
MGIVVRTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIPHPTLLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVHTMTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIKPIAELHLVLRLRGG（配列番号６）
９Ｅ１２配列
MRIPVYTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIPPFARLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVMTRTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIMNARLLHLVLRLRGG（配列番号７）
２２Ｄ１配列
MLILVRTLTDKTITLEVEPSDTIGNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNISVGAMLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVLTWTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIRRLPPLHLVLRLRGG（配列番号８）
【０２０１】
野生型ユビキチン単量体（Ｕｂｉ ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ）と野生型ユビキチン二量体（ｕｂｉ ｄｉｍｅｒ ｗｔ）、野生型ユビキチンタンパク質（図９におけるＵｂ２−ＴｓＸ、各単量体の４５位の置換およびＣ末端に２つの置換を有する）、および修飾ユビキチンヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１との配列アライメントを、図９に示す。デユビキチナーゼは、ユビキチンのＧＧの後ろを切断し、ＡＡの後ろを切断しないため、Ｕｂ２−ＴｓＸにおいて、前記単量体のＣ末端の置換（ＧＧからＡＡ）は、血清における安定性を増加させる。野生型ユビキチンの二次構造は、前記Ｃ末端における置換を有するユビキチンと比較して、ほぼ同一である。
【０２０２】
１０４１−Ｄ１１（図９、配列番号３６）または１０４５−Ｄ１０と呼ばれる、優れたＥＤ−Ｂ結合親和性を有する修飾ユビキチンは、野生型と比較して、後述のアミノ酸置換によって同定される。
第１モジュール
Ｋ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、Ｔ６６Ｐ
第２モジュール
Ｋ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、Ｔ６６Ｅ
任意に、Ｑ２Ｒ（当該置換は、変異体１０４１−Ｄ１１に存在し、変異体１０４５−Ｄ１０には存在しない）
融合タンパク質に適した好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたはＧＩＧ配列のリンカーである。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。
【０２０３】
さらに好ましい例として、下記の配列のタンパク質（配列番号４７）が提示され、前記配列において、前記配列のＸＸＸＸは、どのようなアミノ酸でもよい。リンカーとして、ここでは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧが使用される（イタリックで示す）。ただし、他の種類のリンカー、またはリンカーなしも、代替可能である。
【化２】
タンパク質の例と、これらの配列とのコンセンサス配列は、図２に示す。
【０２０４】
［実施例２］
ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチン変異体とヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）からの融合タンパク質の生成
【０２０５】
前記変異体を、修飾ユビキチン、例えば、ヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１と、マウスまたはヒトＴＮＦαとの間の融合タンパク質として、大腸菌内で発現させる。融合タンパク質のタンパク質解析は、タンパク質発現と純度、非凝集能、細胞培養におけるＴＮＦα活性、ターゲットタンパク質ＥＤ−Ｂへの親和性、選択性、細胞培養における特異的結合を含む。Ｆ９腫瘍を有するマウスにおける腫瘍の縮小を誘導するための動物実験における必須条件は、マウスＴＮＦαとの融合物である。
【０２０６】
工程１：融合タンパク質のクローニングのためのベクターの生成（ｐＥＴＳＵＭＯ−ＴＮＦα）
ｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔは、修飾ベクターｐＥＴＳＵＭＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）であり、付加マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の挿入によって修飾されている。ｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔへのＴＮＦαのクローン化から開始し、ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチン変異体を挿入するための制限部位を導入した。得られた構築物は、下記ＤＮＡ配列（配列番号１１）の構造体Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＴＮＦαの構造を有する。
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTAGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGTGCGTAGCAGCAGCCGTACCCCGAGCGATAAACCGGTGGCGCATGTGGTGGCGAATCCGCAGGCGGAAGGCCAGCTGCAGTGGCTGAACCGTCGTGCGAATGCGCTGCTGGCCAACGGCGTGGAACTGCGTGATAATCAGCTGGTTGTGCCGAGCGAAGGCCTGTATCTGATTTATAGCCAGGTGCTGTTTAAAGGCCAGGGCTGCCCGAGCACCCATGTGCTGCTGACCCATACCATTAGCCGTATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAACCTGCTGTCTGCGATTAAAAGCCCGTGCCAGCGTGAAACCCCGGAAGGCGCGGAAGCGAAACCGTGGTATGAACCGATTTATCTGGGCGGCGTGTTTCAGCTGGAAAAAGGCGATCGTCTGAGCGCGGAAATTAACCGTCCGGATTATCTGGATTTTGCGGAAAGCGGCCAGGTGTATTTTGGCATTATTGCGCTGTAATAA
【０２０７】
ＴＮＦα配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位の導入により、ＰＣＲで増幅した。
使用したプライマーは、以下の通りである。
【化３】
前記ｆｗプライマー（配列番号１２）は、ＴＮＦαの最初の１５塩基対（下線部）を認識し、ＢａｍＨＩ配列（太字部）を有する。前記ｒｅｖプライマー（配列番号１３）は、ＴＮＦαの最後の塩基対、終止コドン（下線部）およびＸｈｏＩ制限部位（太字部）を含む。
【０２０８】
ＰＣＲ反応ミックス（１００μｌ）
８４．５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×Ｐｗｏバッファー＋Ｍｇ；
２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（＝２００μＭ）；
各０．５μｌ １００μＭ プライマーｆｗ／ｒｅｖ（＝各０．５μＭ）；
２μｌ ＤＮＡ（＝０．２５μｇ）；
０．５μｌ Ｐｗｏポリメラーゼ（＝２．５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）
【０２０９】
ＰＣＲプログラム
９４℃で３分、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分（工程２〜４：３０サイクル）、７２℃で５分、続いて４℃で処理し、続いて、Ｑｉａｇｅｎ−ＭｉｎＥｌｕｔｅ−Ｋｉｔ（１０μｌ ＥＢに溶出）によるＰＣＲ産物の精製を行った。前記ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限およびライゲーションにより、ベクターｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔのＭＣＳに導入した。
【０２１０】
制限ミックス（１００μｌ）
ベクター：８３μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢａｍＨＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ），
１．５μｌ ＸｈｏＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
１．６５μｌ ベクター；
３ｈ、３７℃でインキュベーション
ＰＣＲ産物：７６．５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢａｍＨＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ），
１．５μｌ ＸｈｏＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
８μｌ 挿入断片；
３ｈ、３７℃でインキュベーション
１％アガロースゲル（１００Ｖ、６０分間ラン）において制限ミックスを分離；
切断されたベクターフラグメント（５６５９ｂｐ）と挿入断片（４９１ｂｐ）を、Ｑｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製（３０μｌ ＥＢに溶出）。
【０２１１】
ライゲーション（２０μｌ）
１５．２μｌ Ｈ２Ｏ；
２μｌ １０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼバッファー；
２．２６μｌ ベクター（２００ｎｇ）；
０．５４μｌ 挿入断片（４０ｎｇ）
５分間、６５℃でインキュベーション；
１６℃に冷却；
１μｌ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（＝３Ｕ；ＮＥＢ）添加；
１６時間、１６℃でインキュベーション
【０２１２】
ＮａＡｃ／イソプロパノール沈殿
ライゲーションミクスチャー（２０μｌ）＋２．２μｌ ３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）＋２２．２μｌ イソプロパノール；
３０分間、−２０℃；
１５分間、４℃、１３０００Ｕｐｍ；
５００μｌの７０％ ＥｔＯＨにペレットを再懸濁；
スピン；
１０μｌのＨ２Ｏにペレットを再懸濁
【０２１３】
形質転換
エレクトロコンピテントＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（４０μｌアリコート）と１０μｌのライゲーション産物とを混合；
０．１ｃｍ エレクトロポレーションキュベットに移動；
エレクトロポレーターでパルスを印加（１．８ｋＶ、５０μＦ、１００ Ｏｈｍ）；
３７℃、２２０Ｕｐｍ、４５分間、１ｍｌのＳＯＣ培地と、溶液とをインキュベート；
カナマイシン含有ＬＢプレートに、１００μｌを播き、３７℃、一晩インキュベーション
【０２１４】
工程２：修飾ユビキチンベースのＥＤＢ融合タンパク質のクローニング
ＥＤＢ結合修飾ユビキチンベースの変異体とＴＮＦαとの融合物の生成のために、ＰＣＲにより、対象であるＥＤＢ修飾ユビキチンベースの配列をｐＥＴ２０ｂベクターから増幅し、ＢｓａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入する。この方法は、単量体および二量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体に好適である。単量体ＷＴユビキチン（Ｗｕｂｉ）用のプライマーは、下記のとおりである。
【化４】
【０２１５】
前記ｆｗプライマー（配列番号１４）は、修飾ユビキチンの最初の１５塩基対（下線部）を認識し、ＢｓａＩ配列（太字部）を有する。前記ｒｅｖプライマー（配列番号１５）は、修飾ユビキチンの最後の１５塩基対を認識し、アミノ酸リンカー（ＳＧＧＧＧ配列）およびＢａｍＨＩ制限部位（太字部分）を挿入する。修飾ユビキチンベースの変異体それぞれについて、特異的ｆｗプライマーを使用する。単量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体１Ｈ４、５Ｅ１および４Ｂ１０のプライマーは、下記のとおりである。
【化５】
【０２１６】
前記ｒｅｖプライマーは、全ての単量体修飾ユビキチンベースの変異体に使用する。二量体修飾ユビキチンベースの変異体用のｒｅｖプライマーは、下記のとおりである。
【化６】
【０２１７】
二量体ＷＴユビキチン（ＷｕｂｉＨｕｂｉ）のクローニング用および二量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体用のｆｗプライマーは、下記のとおりである。
【化７】
【０２１８】
ＰＣＲミックス（１００μｌ）
８４．５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×Ｐｗｏバッファー＋Ｍｇ；
２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（＝２００μＭ）；
各０．５μｌ １００μＭ プライマーｆｗ／ｒｅｖ（＝０．５μＭ）；
２μｌ ＤＮＡ（変異体により決定）；
０．５μｌ Ｐｗｏポリメラーゼ（＝２．５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）
【０２１９】
ＰＣＲプログラム
１．９４℃で３分
２．９４℃で３０秒
３．６０℃で３０秒
４．７２℃で２分（工程２〜４：３０サイクル）
５．７２℃で５分、続いて４℃
【０２２０】
アガロースゲルでＰＣＲ産物を精製し、必要なバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ−ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製する。ＢｓａＩ−ＢａｍＨＩ制限により、前記ＰＣＲ産物をクローニングする（ｐＥＴＳＵＭＯ−ＴＮＦα内に）。
【０２２１】
制限ミックス（１００μｌ）
７５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢｓａＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
８μｌ ＤＮＡ（ベクターまたはＰＣＲ産物）２時間、５０℃でインキュベーション、
１０分間、６５℃、
３μｌ ＢａｍＨＩの添加（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）、
２時間、３７℃
１％アガロースゲルにおいて制限ミックスを分離；
切断されたベクターフラグメントおよび挿入断片を、Ｑｉａｇｅｎ−ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製（３０μｌ ＥＢに溶出）。
【０２２２】
ライゲーション（２０μｌ）
１２．５μｌ Ｈ２Ｏ；
２μｌ １０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼバッファー；
５μｌ ベクター（６６ｎｇ）；
０．５μｌ 挿入断片（変異体の種類により変わる）
５分間、６５℃でインキュベーション；
１６℃に冷却；
１μｌ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（＝３Ｕ；ＮＥＢ）添加；
１６時間、１６℃でインキュベーション
【０２２３】
ＮａＡｃ／イソプロパノール沈殿（工程１参照）
【０２２４】
形質転換
エレクトロコンピテントＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞の形質転換は、前述のとおりである。結果として、下記の融合構築物が得られた。すなわち、Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−修飾ユビキチン−ＳＧＧＧＧ−ＴＮＦαを有するｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔにおけるＥＤＢ修飾ユビキチンとＴＮＦαとの融合構築物である（単量体修飾ユビキチンの場合、３５９個のアミノ酸からなり、二量体修飾ユビキチンの場合、４４７個のアミノ酸からなる）。
【０２２５】
［実施例３］
ユビキチンベースのＴＮＦα融合タンパク質の発現と精製
【０２２６】
ＤＮＡ配列解析により、ＳＵＭＯ−ＴＮＦα融合タンパク質の正しい配列が示された。変異体の発現のために、前培養物をＬＢ／カナマイシンで１：１００に希釈し、前記培養液を、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）０．５まで、２００ｒｐｍ、３７℃で攪拌することで、クローンを振とうフラスコで培養した。発現は、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加で誘導した。３０℃、４時間、２００ｒｐｍで、培養を続けた。４℃、６０００×ｇで２０分間遠心分離し、細菌細胞を回収した。前記細胞ぺレットを、ベンゾナーゼおよびリゾチームを含むＮＰＩ２０バッファー３０ｍｌに懸濁した。細胞を、氷上で超音波処理（３×２０秒）によって破砕した。懸濁液を、４℃、４００００×ｇで３０分間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む上清を得た。両タンパク質を、室温でのアフィニティークロマトグラフィーにより、精製した。Ｎｉ−アガロース（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の一本のカラムを、５０ｍｌのＮＰＩ−２０で平衡化した。可溶性タンパク質を含む前記上清を、前記カラムにアプライし、続いて、ＮＰＩ−２０で洗浄した。前記結合タンパク質を、ＮＰＩ−２０から５０％ＮＰＩ−５００（１００ｍｌ）の直線勾配で溶出した。各画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その純度を解析した。好適な画分をプールし、ＳＵＭＯヒドロラーゼ切断バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、１．６×６０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に、流速１ｍｌ／分で、アプライした。
【０２２７】
切断反応は、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書にしたがって行った。切断後、前記タンパク質をＮｉ−アガロースカラム（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。Ｈｉｓタグ化ＳＵＭＯヒドロラーゼおよびＨｉｓタグ化ＳＵＭＯは、前記カラムに結合し、正しい融合タンパク質（Ｈｉｓタグフリー）は、前記カラムを通過した。前記タンパク質の純度は、ｒｐＨＰＬＣ解析およびゲル電気泳動によって、証明した。前記三量体（ＴＮＦαを介する）が正しい分子量を有することは、分析用ＳＥＣ解析（１０／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて確認した。
【０２２８】
［実施例４］
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体のヒトＥＤ−Ｂに対する結合分析
【０２２９】
実施例４Ａ：濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
ユビキチンベースの変異体のヒトＥＤ−Ｂに対する結合を、濃度依存ＥＬＩＳＡによって分析した。精製タンパク質を、ヒトＥＤ−Ｂ、ＢＳＡおよび細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）でコーティングされた複数のＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに、量を増加させてアプライした。ウェルあたり抗原５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）でのコーティングを、４０℃で一晩行った。前記プレートを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４；ＰＢＳＴ）で洗浄した後、前記ウェルを、３７℃で２時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；３％ ＢＳＡ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてブロッキングした。前記ウェルを、ＰＢＳＴでさらに３回洗浄した。前記ウェルにおいて、異なる濃度の修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質（５０μｌ量）を、室温で１時間インキュベートした（図１０、開始濃度として、５００ｎＭの１０４１−Ｄ１１タンパク質を使用した）。ＰＢＳＴで前記ウェルを洗浄した後、抗ユビキチンｆａｂフラグメント（ＡｂｙＤ）ＰＯＤコンジュゲートを、ＰＢＳＴに適切に希釈（例えば、１：２０００または１：６５００）して、アプライした。前記プレートを、ウェルあたり３００μｌのバッファーＰＢＳＴで、３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。ウェルあたり５０μｌの０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させ、前記ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅ ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを用いて読み取った。参照波長を６２０ｎｍとして、４５０ｎｍで吸光光度測定を行った。図１は、みかけＫＤ値１１ｎＭという、ＥＤ−Ｂに対する１Ｈ４の特異的結合を明瞭に示している。変異体５Ｅ１は、みかけＫＤ値７．７μＭ、４Ｂ１０は、みかけＫＤ値２８０ｎＭを、それぞれ示している。図１０は、変異体１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性を示す（ＫＤ＝６．９ｎＭ）。このように、ユビキチン野生型のわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）により、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２３０】
実施例４Ｂ：競合的濃度依存ＥＬＩＳＡによる、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
競合的濃度依存ＥＬＩＳＡにより、量が増加する遊離のターゲットの存在下、フィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９）を含む固定化ＥＤ−Ｂに対するユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を分析した。ＥＬＩＳＡの条件は、１０４１−Ｄ１１タンパク質を、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）（０μＭ〜１０μＭ）、またはネガティブコントロール６７８９（０μＭ〜１０μＭ）で、１時間プレインキュベートし、その後、その混合物を、Ｍｅｄｉｓｏｒｐ−ｐｌａｔｅ上に配置したターゲット６７Ｂ８９に添加した以外は、実施例５Ａで述べたとおりである。これに続き、前記変異体を、対応する抗体によって検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ；希釈度１：６５００）。図１１は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂに対して非常に高い結合親和性を有することを示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。図１０に示した結果が裏付けられている。すなわち、ユビキチン野生型のわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）のみにより、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２３１】
実施例４Ｃ：結合活性の血清安定性を同時に分析する、濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当該技術分野における公知の方法により、前述（実施例５Ａおよび５Ｂ）と同様に、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９ともいう）を、マイクロタイタープレートにコーティングし、前記変異体を、ＥＤ−Ｂに結合させ、特異的ユビキチン抗体により検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ）。この分析において、前記変異体は、異なる方法で処理した。すなわち、前記変異体を、３７℃で１時間、マウス血清中でインキュベートする処理（図１３参照、青丸部分）、前記変異体を、３７℃で１時間、ラット血清中でインキュベートする処理（図１３、赤丸部分）、または、前記変異体を、３７℃で１時間、ＰＢＳでインキュベートする処理（図１３、黒丸部分）である。図１３は、変異体１０４１−Ｄ１１の全てのＫＤが、１０．３ｎＭ（ＰＢＳ）から２０．７４ｎＭ（マウス血清）の間にあることを示す。
【０２３２】
実施例４Ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析による修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当業者に公知の方法を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化したフィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９という）を含むＥＤ−Ｂに対する結合について、前記変異体を異なる濃度で分析した（例えば、０〜２００ｎＭの変異体、好ましくは１０４１−Ｄ１１）。得られたデータは、ＢＩＡ評価ソフトウェアおよび１：１−Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｆｉｔｔｉｎｇにより処理した。図１２に示すように、変異体１０４１−Ｄ１１のＫＤは、１．０ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝７．６×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝７．７×１０−４ｓ−１であった。図１７Ｄに示すように、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαのＫＤは、１．１３ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝４．５×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝５．０×１０−４ｓ−１であった。
【０２３３】
実施例４Ｅ：ＳＥ−ＨＰＬＣによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の複合体構造の分析
複合体構造の分析のために、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）（Ｖ＝３ｍｌ）を使用し、５０μｌのタンパク質をアプライした。さらなる条件は、バッファー：１×ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、流速：０．３ｍｌ／分、ラン：４５分（サンプルの注入：１５分後）とした。
【０２３４】
条件：０．７２ｎｍｏｌ １０４１−Ｄ１１タンパク質＋０．７２ｎｍｏｌ ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９またはネガティブコントロール６７８９ともいう）を、室温で１時間インキュベートし、複合体構造を分析するために、カラムにアプライした。図１４では、前記変異体のみを黒で示し、ターゲットＥＤ−Ｂのみを青で示し、ＥＤ−Ｂとの複合体を構成する変異体結合をピンクで示す。図１４Ａは、前記変異体を有するＥＤ−Ｂを示す。図１４Ｂは、ＥＤ−Ｂを有さない変異体を示す。同図は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）と複合体を構築するが、６７８９とは複合体を構築しないことを示す。
【０２３５】
［実施例５］
ＴＮＦαの生物学的分析
【０２３６】
ＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体の生理学的ＴＮＦα活性を、Ｌ９２９アポトーシス分析によって決定した（Ｆｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８４ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ６８：１６７−１７５）。この分析では、ＴＮＦαが、ピコモル範囲のＥＣ５０値で、アクチノマイシンＤ感受性細胞の細胞死を効果的に促進する。細胞を、ＦＢＳと抗生物質を含む培地に再懸濁した。密度３．５×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液１００μｌを、９６ウェル標準細胞培養プレートのウェルに播き、加湿したＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベートした。その後、前記培養培地を除去し、ＦＢＳ、アクチノマイシンＤおよび抗生物質を含む培地５０μｌを各ウェルに加え、その後、さらに３０分間インキュベートした。その後、５０μｌのテスト項目と、１０−７から１０−１８Ｍの適切な濃度範囲のＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体またはヒト組換えＴＮＦαコントロールを添加した。さらに４８時間インキュベートした後、細胞生存の尺度である代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて決定した。
【０２３７】
１つのテスト項目あたり、少なくとも３通りの独立した実験を行い、各実験は３回行った。ＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合タンパク質の各テストは、分析間のばらつきの情報を得るために、ヒト組換えＴＮＦαの投与量範囲のテストと並行させた。
【０２３８】
定量評価は、ＥＣ５０値、すなわち、半数の細胞の生存を促進するテスト項目濃度による値に基づく。
【表２】
ｍｕｂ：修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合
【０２３９】
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体の、１つのユビキチン単量体構築物（Ｗｕｂｉ）および３つのユビキチン二量体構築物のＴＮＦαを分析した。ＴＮＦα部分に結合した修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体に依存して、ＴＮＦαに関連する活性は、約１桁分増加（ＳＰＷＦ−２８＿２４−Ｈ１２＿ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）または減少した（ＳＰＷＦ−２８＿２２−Ｄ１＿ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、Ｗｕｂｉ−Ｈｕｂｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）。変異体１０４１−Ｄ１１ ＴＮＦα分析は、図１７参照。
【０２４０】
［実施例６］
細胞培養分析におけるユビキチン変異体の結合分析
【０２４１】
培養細胞に対する前記変異体１０４１−Ｄ１１の結合をテストした。ＥＤ−Ｂが高発現レベルである正常ヒト胎児肺線維芽細胞（Ｗｉ３８細胞）、マウス胚性線維芽細胞株（Ｂａｌｂ ３Ｔ３）、マウス骨髄（ＳＴ−２）または単球／マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）由来のストローマ細胞株、ＮＨＤＦ細胞およびマウス線維芽細胞（ＬＭ）を含む、異なる培養細胞を分析した。
【０２４２】
前記変異体１０４１−Ｄ１１（異なる濃度）またはＥＤ−Ｂ特異的抗体（５００ｎＭ ＦＶ２８ ＣＨ４／Ｆ１ １×ＰＢＳ）を、Ｗｉ３８細胞（６００００細胞／ｍｌ、ＡＴＣＣ由来）とともにインキュベートし（１時間、３７℃）、その後、メタノールで固定化し（５分、−２０℃）、ブロッキングした（５％ウマ／ＰＢＳ、１時間）。その後、ｒａｂｂｉｔ−ａ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ−ＩｇＧ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 Ａ００８７５、１：５００）とともに１時間インキュベートし、ａ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ＊Ａｌｅｘａ４８８−ＡＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ａ１１００８、１：１０００）とともに１時間インキュベートした。核を、ＤＡＰＩで染色した。図１５Ａの１列目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールを示し、２列目は、５８．７ｎＭのタンパク質濃度での変異体のインキュベーションを示し、３列目は、１０倍高濃度（５８７ｎＭ）の１０４１−Ｄ１１タンパク質のインキュベーションを示し、４列目は、ＰＢＳでのネガティブコントロールである。１行目には、ヒトＷｉ３８線維芽細胞を位相差で示し、２行目には、免疫蛍光法を示し、３行目には、ＤＡＰＩ染色を示す。これらの写真から、前記変異体１０４１−Ｄ１１は、細胞外マトリックスに含まれるＥＤ−Ｂに対する高い特異性で、固定化Ｗｉ３８細胞に結合すると結論づけられる。ネガティブコントロール細胞型ＮＨＤＦは、ＥＤＢフィブロネクチンを低レベルで発現する主要な正常線維芽細胞である（データを示さず）。前記変異体は、それらの細胞に結合しない。
【０２４３】
図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）Ｗｉ３８細胞での変異体１０４１−Ｄ１１の分析を示す。ネガティブコントロール細胞型ＮＨＤＦは、ＥＤＢフィブロネクチンを低レベルで発現する主要な正常線維芽細胞である。前記細胞を、チャンバースライドに播いた（ＮＵＮＣ、６０００細胞／ｍｌ）。結合能の分析のため、前記細胞を、−２０℃で５分間、１００％ＭｅＯＨで固定した。非特異的結合をブロックするために、前記細胞を、３７℃で１時間、５％ウマ血清でインキュベートした。前記細胞を、異なる濃度の前記変異体１０４１−Ｄ１１と、ポジティブコントロールであるＥＤ−Ｂ特異的抗体ＦＶ２８ ＣＨ４／Ｆ１またはネガティブコントロールであるＵＢ＿２とで、室温で１時間、テストした。ｒａｂｂｉｔ−ａ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ−ＩｇＧ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 Ａ００８７５、１：５００）との１時間のインキュベーション、ａ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ＊ Ａｌｅｘａ４８８−ＡＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ａ１１００８、１：１０００）との１時間のインキュベーションにより、機能を証明した（ｐｒｏｖｉｎｇ）。核を、ＤＡＰＩで染色した。図１５Ｂの１行目および３行目は、異なるタンパク質濃度の変異体およびネガティブコントロールを示す。２行目および４行目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールのインキュベーションを示す。最初の２行は、Ｗｉ３８細胞株における前記変異体とポジティブコントロールを示す。３行目および４行目は、ＮＨＤＦ細胞のインキュベーションを示す。写真からわかるように、前記変異体１０４１−Ｄ１１は、細胞外マトリックスに含まれるＥＤ−Ｂに対する高い特異性で、バイタル（ｖｉｔａｌ）Ｗｉ３８細胞に結合することがわかる。低ＥＤＢを含まないＮＨＤＦ細胞を用いた対照試験を行った（データ示さず）。前記変異体は、それらの細胞に結合しない。
【０２４４】
異なる細胞タイプ、例えば、Ｂａｌｂ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、Ｋａｔ−Ｎｒ．３０−２００２）、Ｒａｗ（Ｌｏｎｚａ社製、Ｋａｔ−Ｎｒ．ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）、ＳＴ−２（Ｌｏｎｚａ社製、Ｋａｔ−Ｎｒ．ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）を用いて、同様の実験を行った。図１５ＣおよびＤは、ＥＤ−Ｂの結合が、マウスＢａｌｂ３Ｔ３とＳＴ−２細胞に高い特異性であることを示す。単球／マクロファージ（Ｒａｗ）への結合は、見られなかった（データ示さず）。
【０２４５】
概要を前述したとおり、図１６Ａは、組織切片における１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。７サンプルからのＦ９腫瘍組織を評価した。５００ｎＭ １０４１−Ｄ１１を用いた免疫組織化学から、マウス由来のＦ９腫瘍におけるＥＤ−Ｂ特異的血管が染色される結果が得られた。ＥＤ−Ｂは、腫瘍脈管構造に対する高い特異性のマーカーである。ターゲットタンパク質ＥＤＢは、血管の反管腔側に位置する。１０４１−Ｄ１１は、Ｆ９腫瘍由来の組織切片において、血管構造を特異的に装飾する。得られた結果は、抗体フラグメントＬ１９の組織特異性に匹敵する。さらに、４８組織をテストした。ＦＤＡ関連パネルにおいて、４８組織のいずれにも、非特異的染色は観察されなかった。図１６Ｂは、野生型ユビキチンと比較した、腫瘍細胞における１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。このように、ＥＤ−Ｂに特異的に結合する修飾ユビキチンベースの融合タンパク質は、癌に対するＥＤ−Ｂに基づくターゲット治療に好適である。
【０２４６】
［実施例７］
１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
【０２４７】
１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαの治療上の有効性を確立するために、化合物をマウスモデルのＦ９テラトーマ（Ｂｏｒｓｉ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２， ４３８４−４３９２参照）によりテストした。マウスにおけるＥＤ−Ｂ発現は、ｉｎ ｖｉｖｏの状態でヒトに匹敵し、癌に対する１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαの治療上の影響、好ましくはこれをメルファラン等の細胞傷害性化合物と併用した際の治療上の影響を、評価するのに適している。Ｆ９テラトーマは、高い血管密度を有する高悪性度の腫瘍である。Ｂｏｒｓｉ ｅｔ ａｌには、ＥＤＢ抗体を介するマウスＴＮＦαのターゲティングは、メルファランの有効性を向上させ、それは腫瘍の成長の遅延によって実証されていると記載されている。有効性研究のための実験計画は、Ｂｏｒｓｉ、２００３から採用した。
【０２４８】
ステージ１では、腫瘍と体重、体重減少および生存との割合に関係するエンドポイントについて、薬理的に活性かつ許容可能な投与量を明らかにした。本願発明者は、１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαが、最も高い投与量（６．７５ｐｍｏｌ／ｇ）で許容されるが、腫瘍の成長に対して抑制効果を有さず（３、４および８日後に体重の１０％を上回る→動物死亡）、一方、最も低投与量（０．２５ｐｍｏｌ／ｇ）の１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαが、腫瘍の成長を遅らせるようであることを見出した。使用したさらに別の投薬グループでは、投与量２．２５ｐｍｏｌ／ｇ １０４１Ｄ１１−ＴＮＦαから、低下させた。
【０２４９】
研究のステージ２では、腫瘍成長の遅延をエンドポイントとするメルファランの投与量依存的な有効性を明らかにした（動物体重減少＞１０％、腫瘍＞体重の１０％、腫瘍の潰瘍化）。研究では、１０４１Ｄ１１／ｍＴＮＦαおよびマウスＴＮＦαについて、メルファランとの併用をテストした。１６８匹の動物を使用し、１４投薬グループ（グループあたり８匹のマウス、Ｆ９腫瘍の大きさが３００〜４００ｍｍ３の時点で採用）について、テストサンプルを静脈（ｉ．ｖ．）に投与し、２４時間後にメルファランを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。表１は、投薬スケジュールを示す。
【表３】
【０２５０】
図１８は、処置期間中（７日間）の相対的腫瘍成長を示す。図１８ａは、メルファランと併用した本発明の化合物１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαが、メルファランと併用したｍＴＮＦαまたはメルファラン単独よりも効果的に、相対的腫瘍成長を減少させることを明確に示す。処置後７日間の腫瘍成長速度は、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαによる腫瘍の有意な減少を示す。これは、メルファランとの併用の有効性の明確な証拠である。
【０２５１】
刊行物
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２． Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌ， Ｊ．， Ｍ． Ｌａｎｇ， Ｍ． Ｈａｕｓｍａｎｎ， Ｓ． Ｎ． Ｌｅｅｂ， Ｗ． Ｆａｌｋ， Ｊ． Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ， Ｍ． Ｇｏｋｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｒｏｇｌｅｒ． ２００７． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ ＥＤ−Ａ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＣＤ） ｍｕｃｏｓａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ ２２：６１１−２３．
３． Ｄｕｂｉｎ， Ｄ．， Ｊ． Ｈ． Ｐｅｔｅｒｓ， Ｌ． Ｆ． Ｂｒｏｗｎ， Ｂ． Ｌｏｇａｎ， Ｋ． Ｃ． Ｋｅｎｔ， Ｂ． Ｂｅｒｓｅ， Ｓ． Ｂｅｒｖｅｎ， Ｂ． Ｃｅｒｃｅｋ， Ｂ． Ｇ． Ｓｈａｒｉｆｉ， Ｒ． Ｅ． Ｐｒａｔｔ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂａｌｌｏｏｎ ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １５：１９５８−６７．
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９． Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ， Ａ．， Ｈ． Ｊ． Ｂａｅｌｄｅ， Ｌ． Ｊ． Ｖｌｅｍｉｎｇ， Ｅ． ｄｅ Ｈｅｅｒ， ａｎｄ Ｊ． Ａ． Ｂｒｕｉｊｎ． ２００１． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９３：２５６−６２．
１０． Ｌｉｐｏｖｓｅｋ， Ｄ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００４）． Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０， ５１−６７．
１１． Ｏｈａｓｈｉ， Ｈ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ．， Ｙｉｎｇ， Ｂ．Ｗ．， ａｎｄ Ｕｅｄａ， Ｔ． （２００７）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３５２， ２７０−２７６．
１２． Ｓｔｕｄｉｅｒ， Ｆ．Ｗ． （２００５）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４１， ２０７−２３４．
１３． Ｚａｈｎｄ， Ｃ．， Ａｍｓｔｕｔｚ， Ｐ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００７）． Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｔａｒｇｅｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ２６９−２７９．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能な、新規ヘテロ多量体タンパク質に関する。さらに、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した前記ヘテロ多量体結合タンパク質を含む、融合タンパク質に関する。本発明は、さらに、このようなヘテロ多量体結合タンパク質または融合タンパク質の製造方法、および、前記ヘテロ多量体結合タンパク質を含む医薬組成物および／または診断用組成物を対象とする。さらに、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリーに関する。
【０００２】
さらなる実施形態において、本発明は、前記ヘテロ多量体結合タンパク質または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および、前記タンパク質、前記融合タンパク質、前記ベクターおよび／または前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を対象とする。好ましい実施形態において、前記ヘテロ多量体結合タンパク質または前記融合タンパク質は、薬物または診断用薬剤に含まれる。さらに、前記組換えタンパク質または前記融合タンパク質の製造方法、ならびに、医学的治療方法における前記タンパク質についても記載されている。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリンではないアミノ酸からなる結合分子の需要が高まりつつある。現在に至るまで、抗体は、最もよく確立された結合分子に類別されるが、免疫グロブリン分子にはいくつかの主要な欠点があるため、高い親和性と特異性でリガンドをターゲットとするために、新しい結合分子が、なお求められている。免疫グロブリン分子は、非常に容易に製造でき、ほとんど全てのターゲットを対象とするが、極めて複雑な分子構造を有している。そのため、容易に取扱い可能な、より小さな分子によって、抗体を代用することが絶えず求められている。これら代替結合剤は、例えば、疾病の診断、予防、および治療の医療分野において、有用である。
【０００４】
相対的に規定された三次元構造を有するタンパク質は、通常、足場タンパク質と呼ばれ、前記代替結合剤の設計の開始物質として用いられる。これら足場タンパク質は、一般的に、特異的またはランダムな配列のバリエーションを許容する、１以上の領域を含んでおり、そのような配列のランダム化は、しばしば、特異的結合分子を選択できる、タンパク質ライブラリーの製造のため行われる。抗体よりもサイズが小さく、且つ、ターゲット抗原への親和性が、抗体に匹敵するか、あるいはより高い分子は、薬物動態的な性質および免疫原性の点から、抗体よりも優れていると予想される。
【０００５】
従前の多くのアプローチは、結合タンパク質の開始物質として足場タンパク質を用いている。例えば、国際公開第９９／１６８７３号パンフレット（特許文献１）において、特定のリガンドに結合活性を示すリポカリンファミリー（いわゆるアンチカリン）の修飾タンパク質が開発された。リポカリンファミリーのペプチド構造は、遺伝子工学的方法を用いて、天然のリガンド結合ポケットにおけるアミノ酸置換によって修飾されている。免疫グロブリンのように、アンチカリンは、分子構造の同定または結合に使用できる。抗体と類似する方法で、可動性ループ構造が修飾され、これらの修飾により、天然のものとは異なるリガンドの認識が可能となる。
【０００６】
国際公開第０１／０４１４４号パンフレット（特許文献２）には、それ自体には結合部分がないβシート構造タンパク質のタンパク質表面における、結合ドメインの人工的な生成が記載されている。この手法によれば、高い親和性と特異性でリガンドと相互作用する、新規に生成された人工結合ドメイン（例えば、眼水晶体構造タンパク質であるγクリスタンのバリエーション）が得られる。アンチカリンに関して先に述べたような可動性ループ構造から形成される、すでに存在する結合部位の修飾とは対照的に、これらの結合ドメインは、βシートの表面に新規に生成される。しかし、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、新規結合特性を生じるための、相対的に大きなタンパク質の改変について記載されているのみである。国際公開第０１／０４１４４号パンフレットのタンパク質は、その大きさのため、ある程度の労力を必要とする方法でしか、遺伝子工学レベルで修飾できない。さらに、これまで公開されたタンパク質においては、タンパク質の全体構造を維持するために、全アミノ酸のうち、比較的小さいパーセンテージのみが修飾されていた。そのため、従前は存在しない結合特性の発生に利用できるのは、タンパク質表面の比較的に小さい領域のみである。さらに、国際公開第０１／０４１４４号パンフレットには、γ−クリスタンへの結合特性の生成のみが記載されている。
【０００７】
国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット（特許文献３）には、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の製造が記載されている。ユビキチンは、小さい単量体の細胞質タンパク質であり、配列が高度に保存され、原虫から脊椎動物にいたるまでの全ての公知の真核細胞に存在する。生物において、ユビキチンは、細胞タンパク質のコントロールされた分解の制御において重要な役割を担う。この目的のために、分解予定のタンパク質は、酵素カスケードを通過する間に、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖と共有結合し、この標識により選択的に分解される。最近の研究結果によると、ユビキチンまたはユビキチンによるタンパク質の標識は、それぞれ、数種のタンパク質の移入または遺伝子制御等の他の細胞プロセスにおいても、重要な役割を担っている。
【０００８】
その生理的機能の明確化に加え、ユビキチンは、そもそもその構造およびタンパク質の化学特性のために、研究対象となっている。ユビキチンのポリペプチド鎖は、非常にコンパクトなα／β構造に折りたたまれた７６アミノ酸からなる（Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７（非特許文献１））。前記ポリペプチド鎖のほぼ８７％は、水素結合によって、二次構造エレメントの形成に関与する。二次構造は、３．５αヘリックスターン、ならびに４つの鎖からなる逆平行βシートである。これらの要素の特徴的な配置（逆平行βシートがタンパク質表面に露出し、その裏側にαヘリックスがパックされ、これが前記逆平行βシート上に垂直に延びている）は、一般的に、いわゆるユビキチン様フォールディングモチーフと考えられている。さらなる構造的な特徴は、αヘリックスとβシートの間のタンパク質内側における、標識疎水性領域である。
【０００９】
ユビキチンの人工的な調製は、そのサイズが小さいため、化学合成によっても、生物学的手法によっても行うことができる。有利なフォールディング特性のため、ユビキチンは、大腸菌等の微生物を使用した遺伝子工学により、比較的大量に、そのサイトゾルまたは細胞膜周辺腔に製造できる。一般的に、後者のストラテジーは、周辺質において酸化状態が優勢であるため、分泌タンパク質の製造に使用される。簡易且つ効果的な細菌調製のために、ユビキチンは、その製造に問題がある他の外来タンパク質に対する融合パートナーとして使用できる。ユビキチンとの融合によって、溶解度の改善およびそれによる製造収率の改善が、達成できる。
【００１０】
抗体または他の代替足場と比べ、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）ともいう）は、多くの利点を有している。例えば、小さいサイズ、高い安定性、高い親和性、高い特異性、費用対効果の高い微生物による製造、血清半減期の調整等である。しかしながら、特定のターゲットに対する高い親和性の新しい治療方法の点から、それらのタンパク質をさらに開発する必要がある。国際公開第０５／０５７３０号パンフレット（特許文献４）には、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が、概略的に記載されているが、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂとの特異的且つ高親和性の結合を得るために、ユビキチンタンパク質を修飾する方法は、記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９９／１６８７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０４１４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／１０６３６８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０５／０５７３０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９７／４５５４４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０７／０５４１２０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９９／５８５７０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／６２８００号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０６／１１９８９７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０７／１２８５６３号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０１／６２２９８号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０７／１１５８３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ， １９８７
【非特許文献２】Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット（特許文献５）には、組換え結合タンパク質が記載されており、ＦＹＮキナーゼのＳｒｃホモロジー３ドメイン（ＳＨ３）が、新しい結合タンパク質を得るために使用されている。タンパク質治療および／またはタンパク質診断を開発するために、ＲＴループおよび／またはＳｒｃループの変異によりターゲット特異性を設計できることが見出された。足場として利用されるリポカリンにおいてと同様に、変異誘発されたアミノ酸残基は、抗体／抗原結合機能の基礎をなす原理を擬態する、可変性および可動性のループ領域内に存在している。相互作用部位の全体的な可動性は、これによって抗体がエピトープに結合するものであるが、主にエントロピーによって駆動されるプロセスである。しかしながら、このプロセスは、可動相補性決定領域の会合による移動度の欠失によって、不利なエントロピーの寄与を導く。それとは反対に、足場としてユビキチンを使用し、本願発明者は、そもそもアミノ酸残基を可動性ループ領域内では変更せず、βシートの領域の強固で不動のβ鎖またはβ鎖の近くに隣接した領域内で変更した。ＥＤ−Ｂとの結合領域である、ユビキチンの不動且つ強固なβ鎖またはβ鎖の近くに隣接した範囲において、アミノ酸残基を選択する利点は、特に以下のとおりである。結合パートナーは、強い結合に適した相補的形状をすでに示していると考えられている。したがって、これらの相互作用は、結合パートナーのより強固な構造の形状、電荷、および親水性／疎水性要素における相補性に関与する。これらの強固な本体の相補作用は、界面を最適化し、生物機能を適応させる。
【００１４】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、健康な組織および体液において大量に発現する、重要なクラスの高分子量細胞外マトリックス糖タンパク質である。これらの主な役割は、細胞と多くの異なる細胞外マトリックスとの接着の促進である。培養下の非形質転換細胞の表面におけるフィブロネクチンの存在、ならびに形質転換細胞の場合におけるそれらの不在により、フィブロネクチンは、重要な接着タンパク質として同定された。フィブロネクチンは、多数の様々な他の分子、例えば、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびフィブリンと相互作用し、細胞の形状および細胞骨格の形成を制御する。さらに、それらは、胚形成の間の細胞移入および細胞分化に関与する。それらは、創傷の治療においても、重要な役割を担い、マクロファージおよび他の免疫細胞の移入を促進し、また、血餅の形成においても、血管の損傷領域への血小板の接着を可能とすることにより、重要な役割を担う。
【００１５】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、プライマリーＲＮＡ転写物の代替スプライシングによってフィブロネクチン分子に挿入された、小さいドメインである。前記分子は、細胞外マトリックスのフィブロネクチン分子において、存在するかまたは取去されているかのいずれかであり、新しい血管の周辺に大量に発現するが、全ての成常成人の組織（子宮と卵巣を除く）においては、実質的に検出不能であるため、血管新生や組織の再構築と関連する最も選択的なマーカーの一つとなっている。ＥＤ−Ｂは、主として癌に関与することが知られている。高レベルのＥＤ−Ｂ発現は、胸、非小細胞肺、結腸直腸、膵臓、ヒトの肌、肝細胞、頭蓋内髄膜腫、グリオブラストーマを含む多くのヒトの固体癌のエンティティにおける一次病変、ならびに転移性部位において検出された（Ｍｅｎｒａｄ ｕ． Ｍｅｎｓｓｅｎ， ２００５（非特許文献２））。さらに、ＥＤ−Ｂは、診断剤と結合でき、診断ツールとして有利に使用できる。一例として、例えば、動脈硬化プラークの分子の画像化や、例えば、癌患者の免疫シンチグラフィーによる、癌検出おける使用があげられる。さらに多くの診断用に使用できると考えられる。
【００１６】
フィブロネクチンのヒトエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）の９１アミノ酸のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。前記タンパク質の発現のため、開始メチオニンを加えなければならない。ＥＤ−Ｂは、哺乳類、例えば、げっ歯類、ウシ、霊長類、肉食動物、ヒト等に大量に存在する。ヒトＥＤ−Ｂと１００％の配列同一性を有する動物の例は、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウマ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ハイイロオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）である。
【００１７】
ＥＤ−Ｂは、新生血管構造に特異的に蓄積し、癌における分子介入のターゲットとなる。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する抗体または抗体断片の多くは、当該技術分野において、癌および他の兆候の潜在的な治療薬として公知である（例えば、国際公開第９７／４５５４４号パンフレット（特許文献６）、国際公開第０７／０５４１２０号パンフレット（特許文献７）、国際公開第９９／５８５７０号パンフレット（特許文献８）、国際公開第０１／６２８００号パンフレット（特許文献９）参照）。ヒト一本鎖Ｆｖ抗体断片ＳｃＦｖＬ１９（Ｌ１９ともいう）は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに特異的であり、実験腫瘍モデルおよび癌患者の両方において、選択的に新生脈管構造の腫瘍（ｔｕｍｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を標的にすることが確認されている。さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４またはＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカインと、抗ＥＤ−Ｂ抗体または抗ＥＤ−Ｂ抗体断片を含むコンジュゲートは、特に、癌、血管新生または腫瘍の成長を阻害する医薬製造のための標的薬剤として記載されている（例えば、国際公開第０６／１１９８９７号パンフレット（特許文献１０）、国際公開第０７／１２８５６３号パンフレット（特許文献１１）、国際公開第０１／６２２９８号パンフレット（特許文献１２）参照）。細胞傷害性または免疫刺激薬剤のような適切なエフェクター機能と抱合させた、抗ＥＤ−Ｂ抗体またはＬ１９等抗ＥＤ−Ｂ抗体断片による固体腫瘍の新生脈管構造の選択的なターゲティングは、動物実験では成功することが判明している。膵臓癌の治療のため、インターロイキン−２（ＩＬ−２）部と抗ＥＤ−Ｂ抗体部とを含む融合タンパク質を、小分子ゲムシタビン（２’−デオキシ−２’、２’−デフルオロロシチジン）と併用した（例えば、国際公開第０７／１１５８３７号パンフレット（特許文献１３）参照）。
【００１８】
前記先行技術文献には、新しいＥＤ−Ｂ結合タンパク質の製造のため、抗体を含む様々な足場タンパク質を使用することが記載されている。現在入手可能な化合物よるＥＤ−Ｂのターゲティングには、ある種の不都合が伴う。ＥＤ−Ｂ抗原に対して、同等またはより高い親和性を有する、より小さい分子（本発明の、ヘテロ多量体ユビキチンに基づくＥＤ−Ｂ結合タンパク質等）は、抗体や他の結合タンパク質に対して、顕著な利点を有すると期待される。
【００１９】
癌は、世界的に主要な死亡原因であるため、癌治療のための改善された薬剤の必要性が高まっている。現在の化学療法剤および放射線治療は、選択性が低いという欠点があり、多くの化学療法剤は、腫瘍部位に蓄積せず、そのため腫瘍内において十分なレベルに到達できない。癌を効果的に治療する、強力な医薬品に対する需要が存在する。
【００２０】
本発明の課題は、フィブロネクチンの細胞外ドメイン（ＥＤ−Ｂ）に非常に高い親和性で特異的に結合できる、ユビキチンベースのヘテロ多量体結合タンパク質の提供である。本発明のさらなる課題は、例えば、癌の治療に使用する、ＥＤ−Ｂに非常に高い結合特異性を有する新規の結合タンパク質の同定および提供である。さらに、前記ヘテロ多量体結合分子を製造するための方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記課題は、提出した独立請求項の主題によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項、ならびに下記の記載、実施例および図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、種々の腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生を列記した表を示す。
【図２】図２は、ＥＤ−Ｂへの驚くほど強力な結合親和性を有することが見出された、さらなる１６種類の配列のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。
【図３】図３は、修飾ユビキチン単量体からなる四量体と比較した、修飾ユビキチン単量体のＫｄ値を、表に示す。
【図４Ａ】図４Ａは、単量体４１Ｂ１０についての、Ｋｄ＝９．４５μＭの結合親和性を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、４１Ｂ１０が異なる第２単量体と結合して得られた４６Ｈ９についての、Ｋｄ＝１３１ｎＭの結合親和性を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合エフェクター融合タンパク質の模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、前記修飾ユビキチンエフェクター接合５Ｅ１−ＴＮＦコンジュゲートが、アポトースシス促進活性（Ｌ９２９アポトーシスアッセイで測定）を有すること示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１Ｈ４−ＴＮＦα融合物のＥＤ−Ｂへの結合親和性（Ｋｄ＝１５．１ｎＭ）が高いことを示す。
【図６Ａ】図６は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
【図６Ｂ】図６Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ）。
【図６Ｃ】図６Ｂは、遺伝学的にサイトカインＴＮＦαに融合し、前記ヘテロ二量体２４Ｈ１２が多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ）。
【図６Ｄ】図６Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体クローン９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。
【図６Ｅ】図６Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図６Ｆ】図６Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。
【図７】図７は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。
【図８】図８は、配列アライメントを示す。
【図９】図９は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。
【図１０】図１０は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１１】図１１は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。
【図１２】図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。
【図１３】図１３は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１４】図１４は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、固定化されたヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）ヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への結合を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、固定化されたマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞への結合を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、固定化されたマウスＳＴ−２細胞への結合を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、哺乳類組織切片における、ターゲットへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、野生型ユビキチンとの比較における、腫瘍組織での１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性についての、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）（Ｌ９２９細胞）によるテストを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性についての、細胞ベースアッセイ（Ｌ９２９細胞）によるテストを示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ターゲットであるＥＤ−Ｂへの、ヘテロ二量体ユビキチン１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い選択性を証明している。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、培養細胞における変異体１０４１−Ｄ１１で観察された高い結合特異性が、１０４１−Ｄ１１がＴＮＦαに融合されても維持されることを示す。
【図１８】図１８は、ＴＮＦαに融合した変異体１０４１−Ｄ１１とメルファランとの併用による、７日間のマウスの処置期間中のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的腫瘍成長を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
より具体的には、本願発明者は、ヒトフィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合可能なタンパク質を提供する。前記タンパク質は、２つの単量体（ユビキチンユニット）が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含み、さらなる修飾、好ましくは、他のアミノ酸の置換を任意で含み、
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％および少なくとも９０％の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する前記タンパク質の特異的結合親和性がＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍであり、前記タンパク質が、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示す。
【００２４】
好ましい実施形態において、前記タンパク質は、組換えタンパク質である。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態では、各単量体ユビキチンユニットにおいて、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、７、８、９個または全てのアミノ酸が、修飾される。本発明においては、各単量体ユニット、すなわち、第１ユニットおよび第２ユニットにおいて、これらの変異は、それぞれ組み合わせることができると理解される。例えば、前記第１ユニットが、６つの修飾を含むことができ、一方、前記第２ユニットが、７つまたは８つの修飾を含み、前記第１単量体ユニットが８つの修飾を、前記第２単量体ユニットが７つの修飾を含んでもよい、等である。前述に列挙する各アミノ酸は、前記第１ユニット、前記第２ユニットから選択でき、その後、前記両ユニットは、組み合わせられる。好ましい置換は、以下に記載する。
【００２６】
「フィブロネクチンのエクストラドメインＢ」または省略した「ＥＤ−Ｂ」は、配列番号２との配列同一性が、少なくとも７０％、任意に７５％以上、さらに任意に８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％以上、または１００％を示し、上記のＥＤ−Ｂの機能性を有する、全てのタンパク質を含む。
【００２７】
「結合可能なタンパク質」または「結合タンパク質」は、さらに後述するＥＤ−Ｂに対する結合ドメインを含むユビキチンタンパク質を指す。このようなユビキチンベースの結合タンパク質は、いずれも、例えば、多量体化部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー等の結合ドメインでない付加的なタンパク質ドメイン、および／または、非タンパク性のポリマー分子を含んでもよい。非タンパク性のポリマー分子は、例えば、ヒドロキシエチルでんぷん、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン等である。
【００２８】
抗体およびそのフラグメントは、当業者に周知である。前記本発明の結合タンパク質は、抗体またはそのフラグメント、例えば、ＦａｂもしくはｓｃＦｖフラグメント等ではない。また、前記本発明の結合ドメインは、抗体に存在する免疫グロブリンフォールドを含まない。
【００２９】
本明細書において、「リガンド」、「ターゲット」および「結合パートナー」は、同意語として使用され、置き換え可能である。リガンドは、前述のヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質に、ここで定義される親和性をもって結合可能な任意の分子である。
【００３０】
「ユビキチンタンパク質」は、配列番号１のユビキチン、および、下記の定義によるその修飾物を包含する。ユビキチンは、真核生物において、高度に保存されている。例えば、今日まで研究されてきた全ての哺乳類において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。ヒト、げっ歯類、ブタおよび霊長類由来のユビキチン分子が、特に好ましい。また、任意の他の真核生物起源のユビキチンを使用することもできる。例えば、酵母由来のユビキチンは、配列番号１と３つのアミノ酸が異なるのみである。前記「ユビキチンタンパク質」に包含される前記ユビキチンタンパク質は、通常、配列番号１に対し、７０％を超える、好ましくは７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、または９７％までのアミノ酸同一性を示す。
【００３１】
「修飾ユビキチンタンパク質」は、前記ユビキチンタンパク質の修飾、アミノ酸の置換、挿入または欠失のいずれか一つ、または、それらの組み合わせを指す。ただし、上記修飾のいずれか一つによりなされる修飾で、最も好ましいのは置換である。前記修飾数は、配列番号１に対して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つであるアミノ酸同一性を有する、前記修飾単量体ユビキチンユニットのように、厳密に限定されている。それゆえ、単量体ユニットにおける全置換数は、８０％のアミノ酸同一性に対応して、最大で１５個のアミノ酸に限定される。前記ヘテロ二量体ユビキチン分子における修飾アミノ酸の全数は、前記ヘテロ二量体タンパク質に基づく、２０％のアミノ酸の修飾に対応して、３０個である。前記二量体修飾ユビキチンタンパク質の前記アミノ酸同一性は、配列番号１の基本単量体配列を有する二量体非修飾ユビキチンタンパク質と比較して、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８３％および少なくとも９０％のいずれか一つから選択される。
【００３２】
配列番号１のアミノ酸配列に対する前記ユビキチン誘導体の配列同一性の程度の決定には、例えば、ＳＩＭ Ｌｏｃａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， ｖｏｌ． １２： ３３７− ３５７， １９９１）またはＣｌｕｓｔａｌ，Ｗ．を使用できる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２（２２）： ４６７３−４６８０， １９９４．）。好ましくは、配列番号１に対する前記修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列に対して相対的に決定される。
【００３３】
前記本発明の「ヘテロ二量体融合タンパク質」または「ヘテロ二量体タンパク質」は、２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質と考えられる。前記２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質は、前記特異的結合パートナーであるＥＤ−Ｂに対する一価の結合特性（結合ドメイン）を共同でもたらす、２つの相互作用結合ドメイン領域を有する。ヘテロ二量体は、２つの単量体ユビキチン分子の融合により得られ、これらの両分子は、前述のように異なる修飾がなされる。
【００３４】
一価の結合活性を有するヘテロ多量体結合タンパク質（ここでは、ヘテロ二量体タンパク質）を生成するための、異なる修飾ユビキチン単量体の多量体化の利点は、ＥＤ−Ｂに対する新規な高親和性の結合特性を発生するために修飾され得るアミノ酸残基の総数の増加にある。主要な利点は、多くのアミノ酸が修飾されても、ＥＤ−Ｂに対する前記新規に生成された結合タンパク質の足場全体の安定性の低下させることなく、タンパク質の化学的完全性（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が維持されることである。ＥＤ−Ｂに対する新規結合部位を発生させるために修飾され得る残基の総数は、前記修飾残基が２つの単量体ユビキチンタンパク質に割り当てられることで増加する。修飾数は、修飾単量体ユビキチン分子数に応じて、２倍にできる。ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質のモジュール構造は、２つの単量体ユビキチン分子に前記修飾アミノ酸が含まれると、前記修飾アミノ酸の総数を増加できる。本発明の方法は、ＥＤ−Ｂに対する一価の特異性（一つのシングルエピトープ）を有するヘテロ二量体ユビキチン分子の同定を提供する。
【００３５】
したがって、これらの修飾残基の全量が、前記二量体を形成する前記２つの単量体ユニットに割り振られるため、結合パートナーに対して共通の結合部位を有するヘテロ二量体の使用は、最終的な結合分子の前記タンパク質の化学的完全性に過度に影響を与えない修飾残基数を増加させる可能性を切り開く。ＥＤ−Ｂに結合する前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質ライブラリーに存在する。
【００３６】
「一価」は、前記修飾二量体ユビキチンの前記第１および前記第２単量体ユニットにおいて生成された両結合領域が共に、ＥＤ−Ｂに相乗的に組み合わせられるように結合する機能、すなわち、両結合領域が、共同で一価の結合活性を形成する役割を果たす機能と理解されるべきである。前記二量体分子における前記第１および前記第２修飾ユビキチン両方の各結合領域を、別々に取り除いた場合、ＥＤ−Ｂへの結合は、前記二量体分子より明らかに効率および親和性が低下するだろう。前記修飾ユビキチンが、各単量体タンパク質を単独で使用するよりも、より効率的にＥＤ−Ｂに結合可能となるように、両結合領域は、アミノ酸の連続領域として前記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質表面に形成されるユビキチン結合部位を形成する。本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後に、前記２つの単量体タンパク質が互いに連結されるのではなく、既に前記ヘテロ二量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング工程を行うことが、特に重要である。最も有力な結合ユビキチン分子の配列情報を取得した後に、任意の他の方法、例えば、化学合成または遺伝子工学手法により、例えば、前記２つの同定した単量体ユビキチンユニット同士を連結することにより、これらの分子を得てもよい。
【００３７】
本発明によれば、１つのリガンドに結合する前記２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、例えば、遺伝学的手法を使用して、互いにヘッドトゥテイル融合で結合される。前記異なる修飾融合ユビキチン単量体は、一価で結合し、両方の「結合ドメイン領域」（「ＢＤＲ」）が共に作用する場合にのみ効果的である。「結合ドメイン領域」は、前記ターゲットへの結合に関与する、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸が修飾されたユビキチン単量体における領域として定義される。
【００３８】
前記ヘテロ二量体タンパク質を形成する前記修飾および結合ユビキチン単量体は、一つの連続的な結合領域を介して同じエピトープに結合する。前記ヘテロマーのこの連続的な領域は、２つの異なる修飾ユビキチン単量体により形成される前記２つのモジュールの両結合決定領域により形成される。
【００３９】
「ヘッドトゥテイル融合」は、２つのタンパク質が、前記二量体に含まれるユニット数に応じて、Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ方向においてそれらを連結することにより、互いに融合することと理解される。このヘッドトゥテイル融合において、前記ユビキチン単量体は、リンカーを介すことなく、直接連結されてもよい。または、前記ユビキチン単量体の融合は、リンカーを介して行うことができる。前記リンカーは、例えば、少なくともＧＩＧのアミノ酸配列もしくは少なくともＳＧＧＧＧのアミノ酸配列を有するリンカー、または、任意の他のリンカー、例えば、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧもしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられる。２つのユビキチン単量体の遺伝学的融合用の他のリンカーも、当該技術分野では公知であり、使用できる。
【００４０】
本発明の前記修飾ユビキチンタンパク質は、ターゲットまたはリガンド（両用語は、同じ意味として使用される）としてのＥＤ−Ｂに対する新規な結合親和性を有する人工タンパク質である。「置換」は、例えば、元のアミノ酸への化学基もしくは残基の置換または付加によるアミノ酸の化学的修飾も含む。βシート領域の少なくとも一つのβシート鎖に位置するアミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接した３個までのアミノ酸に位置するアミノ酸を含む前記タンパク質の少なくとも一つの表面露出領域におけるアミノ酸の置換が、重要である。
【００４１】
本発明によれば、ＥＤ−Ｂに特異的な新規の結合ドメイン発生のための前記アミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸に行うことができる。すなわち、ＥＤ−Ｂに対する新規の結合特性を発生させる修飾のために、任意の所望のアミノ酸をこの目的に使用できるように、アミノ酸が、置換されたアミノ酸のそれと同様の特定の化学的特性または側鎖を有する必要はない。
【００４２】
本発明によれば、前記選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくは、ランダム変異導入法による遺伝学的レベルでの突然変異、すわなち、前記選択されたアミノ酸のランダム置換により行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、前記各タンパク質に属するＤＮＡを改変する遺伝子工学的手法により行われる。好ましくは、ユビキチンタンパク質の発現は、その後、原核生物または真核生物において行われる。
【００４３】
置換は、特に、ユビキチンタンパク質のβシートの４つのβ鎖の表面露出アミノ酸、または、前記βシート鎖に隣接する３つ以内の表面露出アミノ酸において行われる。各β鎖は、通常、５〜７個のアミノ酸からなる。配列番号１に関して、例えば、前記β鎖は、通常、アミノ酸残基２〜７、１２〜１６、４１〜４５および６５〜７１を包含する。付加的に且つ好ましく修飾され得る領域は、前記βシート鎖に隣接する３つ目までのアミノ酸（すなわち、１番目、２番目または３番目）の部位を含む。付加的に且つ好ましく修飾され得る前記好ましい領域は、特に、アミノ酸残基８〜１１、６２〜６４および７２〜７５を含む。前記好ましい領域は、２つのβ鎖が互いに結合したβターンを含む。好ましいβターンは、アミノ酸残基６２〜６４があげられる。前記βシート鎖に密接する最も好ましいアミノ酸は、８位のアミノ酸である。また、アミノ酸置換のさらなる好ましい例は、３６、４４、７０および／または７１位である。例えば、付加的に且つ好ましく修飾され得る領域は、６２、６３および６４位のアミノ酸（３個のアミノ酸）、７２、７３位のアミノ酸（２個のアミノ酸）または８位のアミノ酸（１個のアミノ酸）を含む。
【００４４】
好ましい実施形態において、前記アミノ酸残基は、アミノ酸置換により改変される。欠失および挿入も可能である。付加または欠失され得るアミノ酸数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸に限定され、それに応じて、前記二量体ユビキチンタンパク質については、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個のアミノ酸に限定される。一実施形態において、アミノ酸挿入はなされない。さらなる実施形態において、欠失は行われない。
【００４５】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質が、請求項で特定され明細書で説明された前記置換に加えて、１以上のアミノ酸の欠失および／または付加を含む場合には、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）に与えられる前記アミノ酸部位を、対応するタンパク質同士で分配するために、前記修飾ユビキチンについてアライメントさせなければならない。融合タンパク質の場合（後述を参照）、各単量体ユビキチンサブユニットのナンバリング（およびアライメント）は、同様の方法、すなわち、例えば、各サブユニットの１位のアミノ酸から開始される二量体のアライメントによりなされる。
【００４６】
単量体ユビキチン、好ましくは、例えば、ヒト等の哺乳類由来の単量体ユビキチンにおいて、β鎖または前記βシート鎖に隣接する３個以内のアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも２５％が修飾されることができ、好ましくは置換され、本発明によれば、従来は存在しなかった結合特性が発生する。最大で、β鎖または前記βシート鎖に隣接する３個以内のアミノ酸の部位に存在するアミノ酸の約５０％、さらに好ましくは最大で約４０％、約３５％、約３０％以下、または約２５％以下が修飾され、好ましくは置換される。通常、一つのβ鎖において、１〜４個のアミノ酸が修飾される。一実施形態では、好ましくは、第１β鎖および第４β鎖、例えば、２〜７位もしくは６５〜７１位のアミノ酸残基の領域において、６個のアミノ酸のうちの３個が修飾される。
【００４７】
ヘテロ二量体の構成ユニットとして使用される本発明の修飾単量体ユビキチンは、合計でアミノ酸の２０％以下を占める。これを考慮すると、配列番号１に対する前記修飾ユビキチンタンパク質の配列同一性は、少なくとも８０％である。本発明のさらなる実施形態において、アミノ酸レベルでの配列同一性は、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、さらに、少なくとも９０％、少なくとも９２％、または少なくとも９５％である。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、９７％以上のアミノ酸配列同一性の前記修飾ユビキチンタンパク質をも包含する。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチンは、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、３、４、５、６、または７個のアミノ酸において修飾される。他の実施形態において、これらの部位において修飾されるユビキチンは、既に前修飾（ｐｒｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）されていた。例えば、さらなる修飾は、７４および７５位のアミノ酸または４５位のアミノ酸における修飾を含むことができ、この修飾により、より良好な安定性またはタンパク質化学特性を発生する。修飾ユビキチン単量体は、配列番号１のユビキチンにおける、合計９、１０、１１、１２、１３、１４および、最大で１５個のアミノ酸が修飾され、好ましくは置換されることで得られる。一例によれば、修飾単量体ユビキチンは、１４個の置換および１個の欠失を有するものが得られた。ユビキチンの総アミノ酸数に基づいて、これは、約２０％の割合に相当する。このことは、非常に驚くべきことであり、通常、もっと低い割合で、十分にタンパク質のフォールディングを阻害してしまうため、予測できなかったことである。
【００４９】
本発明の一実施形態において、これらのアミノ酸は、タンパク質表面上に連続的な領域を形成する、新規なＥＤ−Ｂ結合特性を有する領域の発生のために修飾される。このようにして、ＥＤ−Ｂへの結合特性を有する連続的な領域を発生させることができる。本発明において、「連続的な領域」は、以下の通りである。側鎖の電荷、空間的構造および疎水性／親水性により、それに対応して、アミノ酸は、その環境と相互作用する。前記環境は、溶媒、通常は、水または、例えば、空間的に近いアミノ酸等の他の分子であり得る。タンパク質に関する構造情報および各種ソフトウェアの手段により、前記タンパク質表面の特徴を決定できる。例えば、タンパク質の原子と溶媒との接触領域を、この接触領域がどのような構造であるか、溶媒に接触しやすい表面領域はどれか、または、前記改変が表面においてどのように分布しているか、についての情報を含むこの方法により可視化できる。連続的な領域は、例えば、適切なソフトウェアを使用したこの種の可視化により明らかにされ得る。このような方法は、当業者に公知である。本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体が、新規な結合特性の発生のために修飾される表面上の前記連続的な領域として使用され得る。一実施形態において、この目的のための修飾は、αへリックス領域を含んでもよい。ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質において、結合決定領域は、１つの結合決定領域の２倍の長さを有する１つの連続的な領域を共同で形成する、２つの前記表面露出領域を含む。
【００５０】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位の少なくとも一方を含む、前記タンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の修飾が、重要である。前記「βシート構造」は、本質的にシート状で、ほぼ完全に伸長されている（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ）ことにより定義される。一方、ポリペプチド鎖の連続したセグメントから形成されるαへリックスに対して、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域により形成され得る。このようにして、一次構造において離れて位置する領域同士が、近傍同士となることができる。β鎖は、概して、５〜１０個のアミノ酸長を有し（通常は、ユビキチンにおける５〜６残基）、ほぼ完全なストレッチ構造を有する。前記β鎖は、互いに近接し、一方の鎖のＣＯ基と他方の鎖のＮＨ基との間で水素結合が形成される。逆もまた同様である。βシートは、複数の鎖から形成され、シート状構造を有し、Ｃα原子の部位が、シート状平面の上方または下方の間で交互に入れ替わる。アミノ酸側鎖は、このパターンに追随し、そして、上端もしくは下端に向く。前記β鎖の方向により、前記シートは、平行シートおよび逆平行シートに分類される。本発明によれば、両方とも、変異可能であり、請求されたタンパク質の調製に使用可能である。
【００５１】
前記β鎖および前記βシート構造の突然変異のために、表面に近いβ鎖または前記β鎖（前記βシートの１つの鎖）に隣接する３つ以内のアミノ酸部位が、ユビキチンにおいて選択される。表面露出アミノ酸は、利用可能なＸ線結晶構造により同定できる。利用できる結晶構造がない場合、利用可能な一次構造または３次元タンパク質構造モデルに関して、表面露出βシート領域および個々のアミノ酸部位の接触性を予測するコンピュータ解析手法による試みをなし得る。このようにして、潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を入手し得る。さらなる開示は、例えば、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８７ Ａｐｒ ５； １９４（３）：５３１−４４． Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｂｕｇｇ Ｃ．Ｅ．， Ｃｏｏｋ Ｗ．Ｊから得ることができる。
【００５２】
前記βシートまたは前記β鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位における修飾を行えるが、突然変異を生成させるアミノ酸部位の前選択は時間がかかるため、除外し得る。前記βシート構造または前記βシート鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸をコードするＤＮＡ領域を、ＤＮＡ環境（ＤＮＡ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）から単離し、ランダム突然変異に供し、その後、それらを予め除去したタンパク質をコードするＤＮＡに再度組み込む。続いて、所望の結合特性を有する変異体の選択工程を行う。
【００５３】
本発明の他の実施形態において、表面に近い、前記β鎖または前記β鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位は、前述のように選択され、これらの選択された領域内部の突然変異誘発された前記アミノ酸部位は、同定される。ついで、このようにして選択されたアミノ酸部位は、部位特異的突然変異によりＤＮＡレベルで、突然変異され得る。すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが、予め選択された他の特定のアミノ酸をコードするコドンにより置換され、または、この置換がランダム突然変異との関連で行われる。前記置換されるアミノ酸部位は、新規な部分をコードするコドンのみではなく、未定のアミノ酸も定義される。
【００５４】
「表面露出アミノ酸」は、周囲の溶媒に接触可能なアミノ酸である。タンパク質におけるアミノ酸の接触性が、モデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙにおけるアミノ酸の接触性と比較して８％以上である場合、前記アミノ酸は、「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域または個々のアミノ酸部位は、それぞれ、本発明により選択される、潜在的な結合パートナーに対する好ましい結合部位でもある。また、参考文献として、Ｃａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２１， ７０９ − ７１３， ａｎｄ Ｓｈｒａｋｅ ＆ Ｒｕｐｌｅｙ， １９７３ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７９（２）：３５１−３７１があげられ、開示の全てを、本願に取り込む。
【００５５】
元のタンパク質および互いのタンパク質から新たに発生させた人工結合部位の領域における、アミノ酸置換によるユビキチンタンパク質足場の変異体を、対象とされた各配列セグメントのターゲット突然変異により、発生できる。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性／親水性等の所定の特性を有するアミノ酸を、それぞれ、各特性を有するアミノ酸で交換または置換できる。置換の他に、「突然変異」、「修飾」および「交換」は、挿入および欠失も含む。タンパク質レベルにおいて、前記修飾を、当業者に公知の方法によるアミノ酸側鎖の化学的改変により行ってもよい。
【００５６】
ユビキチンの突然変異方法
各配列セグメントの突然変異の開始点として、例えば、当業者に公知の方法により、調製され、改変され、増幅されたユビキチンのｃＤＮＡを使用できる。一次配列の比較的狭い領域（例えば、１〜３個のアミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬および方法が利用可能である（「Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；「Ｍｕｔａｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」、Ｂｉｏｒａｄ）。大きい領域の部位特異的な突然変異には、具体的な態様として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、当業者に利用可能である。この目的のために、所望の部位が変性された塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合は、例えば、変異の誘導に使用できる。これは、イノシン等のゲノムＤＮＡに自然には発生しない塩基対類似体の使用によってもなされ得る。
【００５７】
βシート領域のβ鎖または前記βシート鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位の１つ以上の突然変異の開始点は、例えば、ユビキチンのｃＤＮＡでもよいし、ゲノムＤＮＡでもよい。また、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子は、合成的に調製されてもよい。
【００５８】
突然変異に利用可能な公知の他の手法は、部位特異的突然変異の方法、ランダム突然変異の方法、ＰＣＲを使用する突然変異または類似の方法である。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、突然変異が生成される前記アミノ酸部位は予め定められている。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるべきアミノ酸に関して、請求項１の限定を満たすように行われる。いずれの場合にも、異なる変異のライブラリーは、通常、公知の方法によりスクリーニングされて確立される。修飾されたユビキチンタンパク質について、十分な構造情報が利用可能な場合には、通常、修飾されるアミノ酸の前選択が、特に簡易に行われ得る。
【００６０】
本発明によれば、例えば、標的変異、および、従来技術であるＰＣＲ、化学的突然変異、細菌の突然変異誘発株を使用する、長い配列セグメントの突然変異を使用できる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記突然変異は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により行われる。ただし、他のコドン（トリプレット）を使用できることも理解すべきである。前記βシート構造が維持されるように、前記変異が行われる。通常、前記突然変異は、タンパク質の表面上に露出される安定なβシート領域の外側で行われるのが好ましい。それには、部位特異的突然変異およびランダム突然変異の両方が含まれる。一次構造の比較的狭い領域（例えば、３〜５個のアミノ酸）を含む部位特異的突然変異は、市販のキットにより発生できる。前記市販のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標））またはＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（登録商標） ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ）（ＵＳ５，７８９，１６６；ＵＳ４，８７３，１９２参照）があげられる。
【００６２】
より広い領域を部位特異的突然変異に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異される領域は、変異された部位および変異されていない部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ７７２−７７７； ＭｃＣｏｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５０， ４６０−４７０．）。ランダム突然変異は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播、または、ＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）により導入され得る（例えば、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｇｅｎｅ １２８， １３５ １４０）。このためには、エラー率の高いポリメラーゼが使用される。導入される突然変異の度合いを高め、異なる変異同士をそれぞれ組み合わせるために、ＰＣＲ断片における変異を、ＤＮＡシャッフリングの手法により組み合わせることができる（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９−３９１）。酵素に関するこれらの突然変異戦略についての報告として、Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９７） ＴＩＢＴＥＣＨ １５， ５２３−５３０の報告が提供される。選択されたＤＮＡ領域に、このランダム突然変異を行うためにも、突然変異に使用されるＤＮＡカセットを、構築しなければならない。
【００６３】
ランダム修飾は、当該技術分野において、十分に確立された公知の方法により行われる。「ランダムに修飾されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列」は、いくつかの部位が、ヌクレオチドまたはアミノ酸により挿入、欠失または置換され、特性が予測できないヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。多くの場合、挿入された前記ランダムヌクレオチド（アミノ酸）配列、または、ヌクレオチド（アミノ酸）配列は、「完全にランダム」であろう（例えば、ランダム化合成またはＰＣＲを介した突然変異の結果として）。ただし、前記ランダム配列は、共通の機能的特性（例えば、発現産物のリガンドへの反応性）を有する配列を含み得る。また、前記ランダム配列は、最終的な発現産物が、例えば、異なるアミノ酸の分布においても、完全にランダムな配列であるという意味で、ランダムでもよい。
【００６４】
ランダム化された断片をベクター中に適切に導入するために、本発明では、前記ランダムヌクレオチドは、部位特異的ＰＣＲを介した突然変異の方式により、発現ベクター中に導入されるのが好ましい。ただし、他の選択肢は、当業者に公知であり、例えば、合成ランダム配列ライブラリーを同様にベクターに挿入可能である。
【００６５】
融合ＰＣＲにより変異体またはライブラリーを発生させるために、例えば、３回のＰＣＲ反応を行ってもよい。２回のＰＲＣ反応は、部分的に重なった中間体フラグメントを発生するように行われる。３回目のＰＣＲ反応は、前記中間体フラグメントを融合するように行われる。
【００６６】
ライブラリーまたは変異体株の構築方法は、所望の制限酵素認識部位周辺のプライマー（制限酵素認識部位プライマー）の第１セット、および、例えば、目的のコドンの上流および下流周辺のプライマー（変異原性プライマー）の第２セットを構築する工程を含んでもよい。制限酵素認識部位プライマーは、フォワード制限酵素認識部位プライマーおよびリバース制限酵素認識部位プライマーを含む。変異原性プライマーは、フォワード変異原性プライマーおよびリバース変異原性プライマーを含む。一実施形態において、前記プライマーは、目的のコドンの上流および下流について構築される。前記制限酵素認識部位プライマーおよび前記変異原性プライマーは、第１中間体フラグメントおよび第２中間体フラグメントの構築に使用される。２回のＰＣＲ反応により、これらの直線状の中間体フラグメントが生成される。これらの各直線状の中間体フラグメントは、少なくとも一つの目的の変異コドン、フランキングヌクレオチド配列および切断部位を含む。前記３回目のＰＣＲ反応では、前記２つの中間体フラグメントならびに前記フォワード制限酵素認識部位プライマーおよび前記リバース制限酵素認識部位プライマーが使用され、直線状の融合産物が生成される。一方、前記直線状の産物の結合していない末端は、制限酵素で切断され、前記直線状の産物に付着末端が作製される。前記直線状の産物の前記付着末端は、ＤＮＡリガーゼの使用により融合され、環状の産物、例えば、環状のポリヌクレオチド配列が生成される。
【００６７】
前記中間体フラグメントの構築のために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの２つのセットについての設計および合成が行われる。前記２つのセットは、制限酵素切断部位をおよびそのフランキングヌクレオチド配列を含む第１セット、ならびに、目的の変異コドンを少なくとも一つ含む第２セット（変異原性プライマー）を含む。当業者は、前記変異の数が所望の変異アミノ酸修飾の数に対応することを認識するであろう。本願発明者は、他の制限酵素が前記工程に使用可能かを熟考した。この切断部位の正確な位置、ならびに、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの対応する配列は、適宜改変され得る。当該技術分野において利用可能な他の方法も、代替として使用され得る。
【００６８】
本発明において、足場に導入される発現産物のランダム化フラグメントを有することを除けば、少なくとも一つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列に融合される、ランダム化ヌクレオチド配列を有することにより、融合パートナーに前記ランダム配列を連結する必要がある。融合パートナーは、例えば、前記発現産物の発現および／または精製／単離および／または、さらに安定化を促進できる。
【００６９】
本発明の一例によれば、単量体ユビキチンの２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位における、少なくとも６個のアミノ酸のランダム置換を、非常に簡易にＰＣＲの手段により行うことができる。前述の部位が、前記タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端の近くに位置しているためである。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡ鎖の５’末端および３’末端である。そこで、突然変異ＰＣＲ反応に使用される前記第１オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される２、４、６および／または８位のコドンから離れており、ユビキチンの配列におけるアミノ末端のコード鎖に対応する。したがって、前記第２オリゴデオキシヌクレオチドは、変異される６２、６３、６４、６５、６６および／または６８位から離れており、少なくとも部分的に、カルボキシ末端のポリペプチド配列の非コード鎖に対応する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドにより、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として単量体ユビキチンをコードするＤＮＡ配列を使用して行うことができる。
【００７０】
また、得られた増幅産物を、例えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を導入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを使用する、他のポリメラーゼ連鎖反応に添加できる。本発明によれば、所定のハプテンまたは抗原に対する結合特性を有するユビキチン変異体の単離のための次の選択工程での使用に適したベクター系中に得られた前記遺伝子カセットを導入するのが好ましい。
【００７１】
ユビキチンの修飾領域
基本的に、結合パートナーであるＥＤ−Ｂに接触可能かどうか、および、タンパク質の全体構造が、推測上修飾に耐性を示すかどうかで、修飾領域は、選択され得る。
【００７２】
表面露出β鎖における修飾の他に、前記タンパク質の他の表面露出領域も修飾でき、前記β鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位において行われるのが好ましい。これらの修飾領域は、新規に発生させるＥＤ−Ｂに対する高い結合親和性に関与する。
【００７３】
本発明の他の任意の実施形態において、前記タンパク質における４つのβ鎖の１つもしくは２つにおけるアミノ酸、好ましくは２つにおけるアミノ酸、または、好ましくは前記４つのβ鎖の２つに隣接する３つ以内のアミノ酸部位が、修飾され、新規の結合特性が発生する。前記４つのβ鎖の３つもしくは４つにおける修飾、または前記β鎖の３つもしくは４つに隣接する３つ以内のアミノ酸部位の修飾も、ＥＤ−Ｂ結合発生のために、任意で行ってもよい。
【００７４】
アミノ末端およびカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸、または、アミノ末端およびカルボキシ末端鎖に隣接する３つ以内のアミノ酸部位が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、ＥＤ−Ｂへの新規の結合部位を発生させる。この点において、前記カルボキシ末端βシート鎖に隣接する４つ以内のアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換され、および、前記アミノ末端β鎖に隣接する１つ以内のアミノ酸が修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換される。
【００７５】
哺乳類のユビキチン、好ましくはヒトのユビキチンにおける下記の部位の表面露出アミノ酸の少なくとも３つが、修飾されるのが特に好ましく、好ましくは置換される：２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位。前記アミノ酸グループの少なくとも４つのアミノ酸は、結合パートナーであるＥＤ−Ｂに対して従来は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の発生に特に適していることが見出された、ユビキチンの表面に連続的な表面露出領域を形成する。これらのアミノ酸残基の少なくとも３つは、修飾されなければならない。任意に、前記アミノ酸残基の３、４、５、６、７、８、９または１０個が修飾され、任意にアミノ酸残基の付加を組み合わせることもできる。
【００７６】
上記修飾後、本願発明者は、実施例で述べるアミノ酸修飾ユビキチン配列が、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０−９以下）でＥＤ−Ｂと結合することを見出した。
【００７７】
融合タンパク質
他の好ましい実施形態において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した、前記本発明の結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、薬学的活性成分および／または診断用活性成分と融合した、前記本発明のヘテロ二量体結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分、例えば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンド、例えば、治療または診断に関連する放射線核種を含んでもよい。低分子の有機化合物または非アミノ酸化合物、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等を含んでもよい。本発明の好ましい一実施形態において、前記ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合ヘテロマー分子は、治療または診断特性を有するタンパク質またはペプチドに、共有的にまたは非共有的に接合される。
【００７９】
ＥＤ−Ｂ結合能を有するユビキチンベースの融合タンパク質の取得方法について、いくつかの例を、以下に示す。
ａ）ユビキチンに存在するリジン残基を介した前記タンパク質の接合；
ｂ）システイン残基を介した前記ヘテロ二量体ユビキチン結合タンパク質の接合
前記システイン残基は、Ｃ末端に位置するか、または任意の他の部位（例えば、２４もしくは５７位のアミノ酸残基）に位置し得る；マレイミド選択的成分による接合；
ｃ）ペプチド性またはタンパク質性の接合−遺伝学的融合（好ましくはＣ末端またはＮ末端）
ｄ）タグに基づく融合−前記ターゲットタンパク質ＥＤ−ＢのＣ末端またはＮ末端に位置するタンパク質またはペプチド。融合「タグ」、例えば、ポリヒスチジン（特に、放射性標識に関する）。
【００８０】
補助目的のタンパク質に共有的および非共有的に付着するための、これらおよび他の方法は、当該技術分野において周知であるので、さらに詳細には説明しない。
【００８１】
前記活性成分は、サイトカイン、好ましくは、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＲＯ（ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ）、ＭＩＰ（ＭＩＰ−１−α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β）、ＴＧＦ−β ＬＩＦ１ ＣＤ８０、ＣＤ−４０リガンド Ｂ７０、ＬＴ−β、Ｆａｓ−リガンド、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１α／β、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＣＰ−１−５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチン、フラクタルカイン等からなる群から選択されるサイトカインである。
【００８２】
本発明において使用される最も好ましいサイトカインの一つは、ＴＮＦαである。炎症性サイトカインであるＴＮＦは、哺乳類の体内において、抗腫瘍作用を含む複数の活性を有する。ＴＮＦは、ヒトにおいて、有効量では許容できない毒性を示すために、近年、臨床的に適切ではなくなっている。近年、ＴＮＦは、メルファラン等の細胞増殖抑制物質との併用で、治療に使用される。
【００８３】
さらに任意に、前記ヘテロ多量体ユビキチン結合タンパク質に接合可能な前記活性成分は、毒性化合物、好ましくは、低分子有機化合物またはポリペプチド、任意に、毒性化合物、例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、トランケート緑膿菌外毒素Ａ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ）、組換えゲロニン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｌｏｎｉｎ）、リシンーＡ鎖（Ｒｉｃｉｎ−Ａ ｃｈａｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）、マデュロペプチン（ｍａｄｕｒｏｐｅｐｔｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、コレラトキシン（ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）からなる群から選択される毒性化合物である。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態において、前記本発明のヘテロ多量体ユビキチン結合タンパク質は、人工アミノ酸を含んでもよい。
【００８５】
前記本発明の融合タンパク質のさらなる実施形態において、前記活性成分は、蛍光色素、好ましくは、ガンマ放射同位体のグループの放射線核種のいずれか、好ましくは、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、または陽電子放出体のグループ、好ましくは、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉ、またはベータ放出体のグループ、好ましくは、１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、またはアルファ放射体のグループ、好ましくは、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ；Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒまたはＣｙ ｄｙｅｓ（Ｂｅｒｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５１ （１２）： １６９９−１７１２， ２００３）；光増感剤；プロコアグラント因子、好ましくは、組織因子（例えば、ｔＴＦ（断ち切った組織因子）；プロドラッグ活性の酵素、好ましくは、カルボキシぺプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群から選択される一つの酵素；および／または機能性Ｆｃドメイン、好ましくは、ヒト機能性Ｆｃドメインからなる群から選択される一つの成分である。
【００８６】
本発明の融合タンパク質に関するさらなる実施形態は、さらに、血清半減期を調整する成分、好ましくは、ポリエチレングリコール、アルブミン結合ペプチドおよび免疫グロブリンからなる群から選択される成分を含む。
【００８７】
結合特性（解離定数）
前記本発明の融合タンパク質の結合特異性は、Ｋｄで与えられる非融合タンパク質で前述のように定義したのと同様である。本発明によれば、特異的結合親和性を定義する「Ｋｄ」は、１０−７〜１０−１２Ｍの範囲である。１０−５Ｍ以下の値であれば、定量化可能な結合親和性であると考えられる。適用に応じて、Ｋｄの値は、例えば、クロマトグラフィーへの適用の場合には、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍが好ましく、または、診断もしくは治療への適用の場合には、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍが好ましい。さらに好ましい結合親和性は、１０−７〜１０−１０Ｍであり、好ましくは、１０−１１Ｍである。
【００８８】
前記結合親和性を決定する方法は、それ自体公知であり、例えば、下記の方法から選択できる：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により提供される）、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、超遠心分析法、ＦＡＣＳ。
【００８９】
上記修飾後、本願発明者は、実施例で述べるアミノ酸修飾ユビキチン配列が、非常に高い親和性（Ｋｄ値１０−１０Ｍ以下）でターゲットと結合することを見出した。
【００９０】
ユビキチンの二量体化
本発明において、「二量体」は、２つの単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質であると考えられる。前記二量体が２つの異なる修飾単量体を含む場合、前記二量体は、「ヘテロマー二量体」または「ヘテロ二量体」と呼ばれる。したがって、前記本発明の「ヘテロ二量体」は、特異的結合パートナーＥＤ−Ｂに対して共同で一価の結合特性を示す、２つの異なる修飾単量体ユビキチンタンパク質の融合物であると考えられる。前記本発明の修飾ヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合ユビキチンタンパク質は、各単量体ユビキチンタンパク質を個々にスクリーニングし、その後、これら２つを結合することによっては、得ることができず、前記ＥＤ−Ｂリガンドへの共同での一価の結合活性を示す第１単量体ユニットおよび第２単量体ユニットからなるヘテロ二量体をスクリーニングすることにより、得ることができることを強調しておく。前記各サブユニットは、ＥＤ−Ｂへの結合親和性がかなり制限され、結合した二量体修飾ユビキチンタンパク質のみが、前述の優れた結合特性を有することが期待される（例えば、図４参照）。
【００９１】
本発明によれば、遺伝学的にヘッドトゥテイルで結合された２つの異なる修飾ユビキチン単量体は、ＥＤ−Ｂの同じエピトープに結合し、両方の結合ドメイン領域が共に作用することでのみ効果を示す。前記単量体の前記ＢＤＲは、単独の連続的な結合領域を形成する。
【００９２】
したがって、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂに効果的に結合する、前記本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、二量体化される。前述のように、前記単量体は、直接連結されてもよいし、リンカーを介して連結されてもよい。種々の取り得るリンカーが、使用され得る。
【００９３】
各単量体ユビキチンは、２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の修飾を示す。前記単量体タンパク質は、遺伝学的に互いに融合される。前記ターゲットへの結合は、前記ＢＤＲの共同によりなされる。すなわち、前記ＢＤＲは、共同して、フィブロネクチンの前記ＥＤ−Ｂドメインに一価で結合可能な、共通の結合領域を一つ形成する。
【００９４】
ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチンへテロ二量体
Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２ＭでＥＤ−Ｂに結合し、フィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示す、前記本発明のユビキチンのヘテロ二量体は、下記の２つの選択肢から選択される。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換、および、
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
【００９５】
実施形態において、前記融合タンパク質は、第１ユビキチン単量体の６、８、６３〜６６位のアミノ酸の置換、ならびに、第２ユビキチン単量体の６、８、６２〜６６位、および、任意に２位のアミノ酸の置換を有する、前記ユビキチン単量体が、遺伝学的に融合されたヘテロ二量体であり、好ましくは、
前記第１ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換、
８位におけるロイシン（Ｌ）のトリプトファンまたはフェニルアラニン（Ｗ、Ｆ）への置換、
６３位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）への置換、
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換、
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のプロリン（Ｐ）への置換；
前記第２ユビキチン単量体において、
６位におけるリジン（Ｋ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
８位におけるロイシン（Ｌ）のトレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）への置換
６２位におけるグルタミン（Ｑ）のトリプトファン（Ｗ）またはフェニルアラニン（Ｆ）への置換
６３位におけるリジン（Ｋ）のセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）またはグルタミン（Ｑ）への置換
６５位におけるセリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）への置換
６６位におけるトレオニン（Ｔ）のグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）への置換
任意に、２位におけるグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）またはロイシン（Ｋ）への置換が好ましい。
【００９６】
得られた修飾ユビキチンへテロ二量体が、Ｋｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍでフィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対する特異的結合親和性を示し、フィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示し、且つ、ユビキチンタンパク質の構造的安定性が破壊されず、妨害されない限り、各単量体におけるこれらの置換の選択肢は、互いに組み合わせることができる。
【００９７】
最も好ましい置換は、下記のとおりある。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＦおよびＴ６６Ｐの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５ＷおよびＴ６６Ｅの置換；任意にさらにＱ２Ｒの置換、または
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓの置換；
および、第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｘ、Ｌ８Ｘ、Ｑ６２Ｘ、Ｋ６３Ｘ、Ｅ６４Ｘ、Ｓ６５ＸおよびＴ６６Ｘの置換；任意にさらにＱ２Ｘの置換、Ｘは、任意のアミノ酸（図２参照）。
【００９８】
ＥＤ−Ｂへの結合タンパク質を発生させる前記第１ユビキチン単量体において、特に好ましい置換は、下記のとおりである。
２位：Ｑ→Ｔ、４位：Ｆ→Ｗ、６位：Ｋ→Ｈ、６２位：Ｑ→Ｎ、６３位：Ｋ→Ｆ、６４位：Ｅ→Ｋ、６５位：Ｓ→Ｌ、６６位：Ｔ→Ｓ
【００９９】
２つの単量体のヘッドトゥテイルでの結合には、リンカーを使用しなくてもよいし、どのようなリンカーを使用してもよい。好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたは、ＧＩＧ配列、ＳＧＧＧＧＩＧ配列もしくはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列のリンカーである。
【０１００】
好ましい実施形態において、２つの結合決定領域（ＢＤＲ）を有し、ＥＤ−Ｂに対して共に作用するユビキチンヘテロ二量体は、配列番号３３または３４のアミノ酸配列を含む。さらに好ましいタンパク質は、下記配列（配列番号４７）が提示される。下記配列において、ＸＸＸＸは、どのようなアミノ酸でよい。リンカーは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列が使用される。他の種類のリンカー、またはリンカーなしも、代替可能と理解される。
【化１】
【０１０１】
これらの配列のタンパク質のコンセンサス配列の例を、図２に示す。
【０１０２】
薬学的活性成分としてＴＮＦαを含む、前記本発明の好ましい融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有する。
【０１０３】
本発明のさらなる態様において、本発明は、前述のタンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをも包含する。また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明に包含される。
【０１０４】
本発明のさらなる態様において、前述のタンパク質もしくは融合タンパク質、および／または、前記本発明の組換えタンパク質もしくは組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞は、包含される。
【０１０５】
本発明のタンパク質の使用、例えば、ＥＤ−Ｂに対する特異的結合特性を有し、ＴＮＦα等のエフェクターに融合したヘテロ二量体ユビキチンの使用
前記本発明の修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用する診断薬、および治療薬の調製に使用される。前記本発明のタンパク質は、例えば、直接的なエフェクター分子（修飾物質、拮抗物質、作用物質）または抗原認識ドメインとして使用できる。ＥＤ−Ｂ抗原が大量に出現する腫瘍の例を、図１の表に示す。
【０１０６】
選択する融合パートナーに応じて、本発明の医薬組成物は、癌、例えば、乳癌および結腸直腸癌、またはＥＤ−Ｂが大量に出現する任意の他の腫瘍性疾患（図１に列記したこれらの例を参照）に適用される。
【０１０７】
前記組成物は、治療上の有効量を含むように適応される。投与量は、治療対象の組織、疾患の種類、患者の年齢および体重、ならびにさらに公知の要因によって決まる。
【０１０８】
前記組成物は、薬学的または診断的に許容されるキャリアを含み、任意に、さらに、従来公知の助剤および添加剤を含み得る。これらは、特に制限されず、例えば、安定化剤、界面活性剤、塩類、緩衝剤、着色剤等を含む。
【０１０９】
前記医薬組成物は、局所塗布用の液状製剤、クリーム、ローションの剤形；エアロゾル；粉末、細粒、錠剤、座剤、カプセル剤の剤形；エマルジョン、リポソーム製剤の剤形とし得る。前記組成物は、無菌、非発熱原性、等張性で、薬学的に従来公知で許容される添加剤を含むことが好ましい。また、Ｕ．Ｓ． ＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）の規則を参照できる。
【０１１０】
ヒトおよび獣医学の医薬療法および予防法の分野において、少なくとも一つの本発明のヘテロマーＥＤ−Ｂ結合ユビキチンタンパク質を含む、薬学的に有効な薬剤を、それ自体公知な方法により調製できる。生薬製剤に応じて、これらの組成物を、注射、点滴、全身投与、直腸投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与または他の従来から使用されている投与方法により、非経口的に投与できる。医薬品の種類は、治療対象の疾患の種類、疾患の重症度、治療対象の患者、および医学分野の当業者に公知の他の要因によって決まる。
【０１１１】
一実施形態において、前記医薬組成物は、前記本発明のタンパク質、融合タンパク質またはこれらの混合物を含み、さらに、１以上の化学療法剤、好ましくは、下記表に示すものから選択される化学療法剤を含む。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
好ましい実施形態において、前記化学療法剤は、メルファラン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ダクチノマイシン、フルオロデオキシウラシル、シスプラチン、パクリタキセルおよびゲムシタビン、またはキナーゼ阻害剤群から選択される。
【０１１４】
本発明の「医薬組成物」は、組成物の形態で提供されてもよい。種々の活性成分および希釈剤および／または担体は、互いに混合され、混合製剤の形態でもよい。前記活性成分は、部分的にまたは全体的に別々の形態で存在する。このような混合または混合製剤の一例は、複数の部品からなるキットである。
【０１１５】
本発明の「組成物」は、少なくとも２つの薬理学的な活性化合物を含む。これらの化合物は、同時に投与してもよいし、１分〜数日の時間間隔で個々に投与してもよい。これらの化合物は、同じ経路で投与してもよいし、異なる経路、例えば、一方の活性化合物を経口投与し、他方の活性化合物を非経口投与することも可能である。また、前記活性化合物は、一つの薬剤、例えば、一つの点滴液に処方されてもよいし、個々に処方された両化合物を含むキットとして処方されてもよい。また、両方の化合物は、２以上の包装でも提供可能である。
【０１１６】
特に好ましい組み合わせは、前記本発明の融合タンパク質ならびにメルファランおよび／またはドキソルビシン（リポソーム製剤）である。ＡＴＣ Ｌ０１分類の抗悪性腫瘍剤以外に、前記本発明のＴＮＦ融合タンパク質は、サイトカインおよびその誘導体、放射性医薬品、治療用細胞（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）ならびにナノ粒子を含む、他の抗悪性腫瘍剤と併用できる。
【０１１７】
腫瘍透過処理活性により、前記本発明のＴＮＦ融合タンパク質は（また、前記本発明の他の組換えタンパク質／融合タンパク質も）、世界保健機関により設定された解剖治療化学分類法（ＡＴＣ）において、Ｌ０１に示される全ての抗悪性腫瘍剤と併用できる。
【０１１８】
驚くべきことに、ＴＮＦαに融合したユビキチンヘテロ二量体の融合タンパク質、好ましくは、配列番号３５または３６の配列を有する融合タンパク質が、治療において有利に適用できることがわかった。ＴＮＦαは、毒性が高いため、通常、最小治療閾を下回る低用量でしか投与できない（このため、治療的に不活性である）。ＴＮＦαの毒性のため、治療的に有効な濃度への到達には、ＴＮＦαを使用する際、現在、四肢分離かん流アプローチが選択される。四肢かん流は、腕および足に直接抗癌剤を輸送するのに使用できる医療技術である。四肢への血流および四肢からの血流を、止血帯で一次的に停止させ、抗癌剤を直接四肢の血液に注入する。これにより、癌が発生している領域に高い投与量のＴＮＦαを、患者に受け入れさせることができる。
【０１１９】
しかし、前記本発明のＴＮＦα融合タンパク質を適用することにより、非毒性であって且つ治療的に有効な濃度でＴＮＦαを投与できる。ＴＮＦαは、前記本発明の（結合）融合タンパク質に連結されるため、疾病部位（例えば、腫瘍部位）に直接活性を示し、「遊離」のＴＮＦαを、徹底的に低減できる。
【０１２０】
前記本発明の融合タンパク質としてＴＮＦαを投与することにより、ＴＮＦαによる全身性の副作用を、著しく低減できる。前記本発明のＴＮＦα融合タンパク質の使用により、治療効果に達するためのＴＮＦαの全投与量を、大幅に低減でき、特に化学療法剤（上記参照）との併用において、全身の腫瘍の治療に有利に使用できる（四肢かん流の必要性および制約がない）。
【０１２１】
さらなる実施形態において、前記医薬組成物は、複数の部品からなるキットの形態でもよく、前記本発明の組換えユビキチンタンパク質／融合タンパク質、および１以上の化学療法剤が個々に提供される。
【０１２２】
前記本発明のヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の製造方法
前記本発明のＥＤ−Ｂ結合タンパク質は、例えば、単純な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、任意の従来公知の種々の技術により、または、市販の自動合成装置により調製できる。一方、従来の遺伝子組換え技術単独で、または、従来の合成技術との組み合わせにより、調製することもできる。
【０１２３】
本発明の他の態様において、組換え修飾ユビキチンタンパク質の発生方法が提供される。前記方法は、少なくとも下記の工程を含む。
ａ）単量体ユビキチンタンパク質から生じる異なる修飾がなされた二量体ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つの修飾ユビキチン単量体を含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含む、前記工程
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
ｂ）潜在的なリガンドとして、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であり、
前記修飾二量体ユビキチンタンパク質は、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程。
任意に、
ｅ）前記修飾二量体ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性で、単離する工程
【０１２４】
任意に、前記修飾は、ＤＮＡレベルでの遺伝子工学、および、原核生物、真核生物またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける修飾タンパク質の発現により行われてもよい。
【０１２５】
さらなる実施形態において、前記修飾工程は、化学的合成工程を含む。
【０１２６】
本発明の一態様において、異なる修飾がなされたタンパク質群は、互いに異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質をコードする、２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することにより得られる。
【０１２７】
さらなる態様において、前記修飾へテロ二量体ユビキチンタンパク質を、薬学的活性成分、任意に、サイトカイン、好ましくは、ＴＮＦα、または、診断用活性成分と融合させるように、また、前記組換え修飾へテロ二量体ユビキチンタンパク質を、前記薬学的活性成分、任意に、ＴＮＦα、または、前記診断用活性成分を介して形成されるように、前記方法は適用される。
【０１２８】
本発明によれば、修飾タンパク質は、さらに、化学的合成により調製されてもよい。この実施形態において、請求項１の前記ｃ）工程からｄ）工程は、一つの工程で行われる。
【０１２９】
さらなる態様において、本発明は、前記本発明のヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を形成する、前述の修飾単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリーに関する。
【０１３０】
本発明のさらなる態様において、前述の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーが提供され、各ライブラリーは、ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、異なる修飾がされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合され、前記ライブラリーは、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする。前記相互結合は、当業者に公知のリンカーまたは前述のリンカーのいずれか１つにより行われる。本発明の一実施形態において、ＴＮＦαは、同時に薬学的活性化合物としての役割も果たすリンカーとして使用される。
【０１３１】
複合ライブラリーの製造は、実施例１で概要を述べる。ただし、ライブラリーの品質に注意を払わなければならない。足場技術におけるライブラリーの品質は、そもそも、複雑性（個々の変異体の数）および機能性（得られた候補の構造的およびタンパク質の化学的完全性）に左右される。両方の特性が互いにネガティブな影響を与える場合もあり、前記足場における修飾部位の数の増加によるライブラリーの複雑性の増大が、変異体のタンパク質の化学的完全性の低下をまねくおそれもある。これにより、溶解度、凝集性が低下し、および／または収量が低下する場合もある。この理由は、エネルギー的に良好なタンパク質パッケージを有する本来の足場から大きく逸脱するためである。
【０１３２】
このため、適切な足場ライブラリーを構築するために、両極端な、ターゲットへの結合性を最適化するために、本来の配列に可能な限り多くの変異を導入すること、および、ネガティブなタンパク質化学的効果を避けるために、可能なかぎり本来の一次配列を保存することの間で、天秤にかけることとなる。
【０１３３】
本開示は、前記本発明の態様または実施形態を考慮して、前述の特徴の考え得る組み合わせも包含することに留意する。
【０１３４】
ターゲットであるＥＤ−Ｂに対する結合親和性を有する修飾ユビキチンタンパク質の選択、および、結合親和性を発生させる修飾アミノ酸の決定
例えば、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つのＤＮＡライブラリーが、各単量体ユビキチンユニットにおいて、選択されたアミノ酸に異なる修飾をすることにより確立された後、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得るために、これらのライブラリーは、例えば、リンカー技術により遺伝学的に融合される。本発明によれば、これらのライブラリーのＤＮＡがタンパク質を発現し、このようにして得られた修飾二量体タンパク質がＥＤ−Ｂに接触されて、結合親和性が存在する場合には、パートナーへの結合が可能となる。
【０１３５】
接触工程およびスクリーニング工程が、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質について、既に行われていることが本発明の重要な態様である。この工程により、ＥＤ−Ｂへの一価の結合活性を提供するユビキチンタンパク質のスクリーニングが可能である。
【０１３６】
本発明における接触は、適切な提示方法および選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、または細菌表面ディスプレイ等の方法、好ましくは、ファージディスプレイ方法により、行われることが好ましい。徹底した開示のために、下記の参考文献を参照できる；Ｈｏｅｓｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．． ３ （１９９３）， ５７２−５７９；Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２ （１９９２）， ５９７−６０４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９６）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。前述の方法は、当業者に公知であり、本発明における修飾に使用できる。
【０１３７】
本発明によれば、前記修飾タンパク質が、所定の結合パートナーに対して、定量化できる結合親和性を有するかどうかの決定は、１以上の下記の方法により行うことが好ましい：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、および超遠心分析法。
【０１３８】
ファージディスプレイ選択法
本願に適用されるファージディスプレイ法の一種は、結合特性を示すユビキチン変異体についての、本発明における選択手法の一例として、後述する。同様に、例えば、細菌上（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１（９）：８２５−８３２）もしくは酵母細胞上に提示する方法（ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ； Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０（１１）：１３０３−１０）、または、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９４（１０）：４９３７−４９４２； Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ， １９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（２４）：５１３２−５１３４）、ｃｉｓディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０１（９）：２８０６−２８１０）もしくはｍＲＮＡディスプレイ等の無細胞選択システムを、適用できる。後者の場合、遺伝子型および表現型の一過性の物理的な結合が、リボソームを介して、適切なｍＲＮＡへのタンパク質変異体の連結により達成される。
【０１３９】
前記ファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換え変異体は、繊維状ファージ上に提示される。一方、この変異体のコードＤＮＡは、一本鎖の形状でファージエンベロープパッケージされ、同時に提示される。このため、親和性濃縮の枠組みにおいて、所定の特性を有する変異体を、ライブラリーから選択でき、その遺伝情報を、それぞれ、適切な細菌に感染させることにより増幅でき、また異なる濃縮サイクルに添加できる。ファージ表面での変異したユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくはＰｅｌＢシグナル配列、および、前記ファージのカプシドまたは表面タンパク質への遺伝子融合により達成され、カプシドタンパク ｐＩＩＩまたはそのフラグメントのカルボキシ末端融合が好ましい。また、コードされた融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる検出および／または精製のためのアフィニティータグもしくは抗体エピトープ、または、前記親和性濃縮過程における融合タンパク質の特異的切断のためのプロテアーゼ認識配列等のさらなる機能性成分を含んでもよい。また、例えば、ユビキチン変異体の遺伝子およびファージカプシドタンパク質またはそのフラグメントのコード領域の間に、アンバー停止コドンを存在させてもよい。前記アンバー停止コドンは、１つのアミノ酸の導入により、部分的に、適切なサプレッサー株における翻訳の際に認識されない。
【０１４０】
ＥＤ−Ｂへの結合特性を有するユビキチン変異体の単離に関する選択工程に適切であり、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入された細菌ベクターは、ファージミドという。中でも、繊維状ファージの遺伝子間領域（例えば、Ｍ１３もしくはｆ１）、または、その部分を含む。例えば、Ｍ１３Ｋ０７等のヘルパーファージによる前記ファージミドを輸送する細菌細胞の重複感染の際、ファージカプシド中に、ファージミドＤＮＡの閉鎖鎖がパッケージングされる。このようにして発生したファージミドは、細菌により分泌され、前記カプシドタンパク質 ｐＩＩＩまたはそのフラグメントとの融合により、コードされた各ユビキチン変異体を、細菌表面に提示する。本来のｐＩＩＩカプシドタンパク質は、適切な細菌株への再感染できるように、ファージミドに存在する。このため、対応するＤＮＡの増幅の可能性は、保持される。このため、前記ユビキチン変異体の表現型、すなわち、潜在的な結合特性とその遺伝子型との間の物理的な結合が、確保される。
【０１４１】
得られたファージミドを、当業者に公知の手法により、ファージ上に提示されたユビキチン変異体のＥＤ−Ｂへの結合により選択できる。このために、前記提示されたユビキチン変異体は、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一次的に固定化され、結合しない変異体を分離した後に、特異的に溶出し得る。前記溶出は、例えば、１００ｍＭ トリエチルアミン等の基本溶液により行うことが好ましい。また、前記溶出は、酸性条件下で、タンパク質分解または感染細菌の直接添加により行うことができる。このようにして、得られたファージミドは、ＥＤ−Ｂへの結合特性を有するユビキチン変異体の、連続的な選択サイクルおよび増幅サイクルにより、再度増幅され、濃縮され得る。
【０１４２】
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、ファージミドの形態、すなわち、ファージに融合され、または、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、可溶性のタンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、または前記文献に記載されている。前記特性評価は、例えば、単離された変異体の一次配列のＤＮＡ配列の決定を含んでもよい。また、単離された変異体の親和性および特異性は、例えば、標準的な生化学的方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、超遠心分析法、またはその他の方法により検出できる。安定性分析については、例えば、化学的または物理的変性についての分光法が、当業者に公知である。
【０１４３】
リボソームディスプレイ選択法
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチン変異体のリボソームディスプレイ法を、無細胞転写／翻訳系の手法により準備し、対応するｍＲＮＡおよびリボソームが複合体として提示される。このために、前述のＤＮＡライブラリーは、基礎として使用され、変異体の遺伝子は、対応する発現およびタンパク質生合成の制御配列との融合の形態で提示される。前記遺伝子ライブラリー３’末端での前記停止コドンの欠失、および、初期の３つのタンパク質からなる複合体に適した実験条件（低温、高濃度のＭｇ２＋）により、前記ｍＲＮＡリボソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳中において維持される。
【０１４４】
各単量体ユビキチンユニットにおける選択されたアミノ酸の異なる修飾により、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質を含むタンパク質ライブラリーが確立された後に、本発明によれば、前記修飾二量体は、結合親和性を有する場合には、ＥＤ−Ｂに接触され、パートナー同士の結合を可能にする。これらのタンパク質ライブラリーは、前記修飾タンパク質と前記ＥＤ−Ｂターゲットタンパク質との間で接触可能な方法で、前記修飾タンパク質を提示する任意の他の方法をディスプレイし、または使用する、ディスプレイ法ライブラリーの形態でもよい。前記ディスプレイ法は、任意に、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＴＡＴファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイ法である。
【０１４５】
１０−７〜１０−１２Ｍの範囲のＫｄの特異的結合親和性によるＥＤ−Ｂへの結合活性に関して、修飾ユビキチン変異体の選択を、当業者に公知の方法により行うことができる。このために、例えば、リボソーム複合体で提示される前記ユビキチン変異体は、それぞれ、例えば、マイクロタイタープレート上に結合したターゲット物質に、一時的に固定化され、または、溶液中で結合した後に磁性粒子に結合され得る。非結合変異体の分離に続けて、結合活性を有する変異体の遺伝子情報を、リボソーム複合体の破壊により、ｍＲＮＡの形態で特異的に溶出できる。前記溶出は、５０ｍＭ ＥＤＴＡで行うのが好ましい。このようにして得られた前記ｍＲＮＡは、単離され、適切な方法を使用してＤＮＡに逆転写され（逆転写反応）、このようにして得られた前記ＤＮＡは、再度増幅され得る。
【０１４６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳、選択および増幅の連続サイクルにより、所定のハプテンまたは抗原に結合特性を有するユビキチン変異体を、濃縮できる。
【０１４７】
ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の特性評価
このようにして得られた前記ユビキチン変異体のさらなる特性評価は、適切な発現ベクター内の対応する遺伝子カセットのクローニング後、前述のように、可溶性のタンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に公知であるか、前記文献に記載されている。
【０１４８】
好ましくは、所定の結合パートナーに対する結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、検出されたタンパク質の単離工程および／または濃縮工程が続く。
【０１４９】
前記本発明の修飾ユビキチンタンパク質の発現に続いて、それ自体公知の方法によりさらに、精製および濃縮される。前記選択された方法は、例えば、使用する発現ベクター、宿主組織、使用する意図した領域、タンパク質の大きさ、およびその他の要因等、それ自体当業者に公知の複数の要因により決定される。簡易に精製するために、前記本発明の修飾タンパク質は、分離材料への高い親和性を有する他のペプチド配列に融合させることができる。ユビキチンタンパク質の機能性に有害な効果を有さないか、または、特定のプロテアーゼ切断部位の導入により精製後に分離可能な融合が、好ましく選択される。このような方法は、それ自体当業者に公知である。
【０１５０】
図面の簡単な説明
図１は、種々の腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生を列記した表を示す。
【０１５１】
図２は、ＥＤ−Ｂへの驚くほど強力な結合親和性を有することが見出された、さらなる１６種類の配列のコンセンサス部位およびアミノ酸置換を示す。前記コンセンサスアミノ酸部位は、前記第１単量体の結合決定領域である、２、４、６、６２、６３、６４、６５、６６位である。一方、コンセンサスアミノ酸置換は、Ｑ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓである。図２に示すように、４種類のファミリーの配列を濃縮できた（コンセンサス配列、文字サイズはアミノ酸の発生頻度に対応する）。８５および８７位は、前記ヘテロ二量体タンパク質において、前記第２単量体における６および８位に対応する部位であり、１４１〜１４５位は、６２〜６４位に対応する。暗青色で示したＴＷＨＮＦＫＬＳは、１０７１−Ｃ１２由来である。赤色で示した残基は、前記４種類のファミリーの配列のうちの１種類に属する。赤色で示した残基が、主に濃縮され（１７８／４５７配列）、ＨＩＴ ＥＬＩＳＡによれば、最も強力な結合分子を含む。
【０１５２】
図３は、親和性を向上させた四量体化を示す。修飾ユビキチン単量体からなる四量体と比較した、修飾ユビキチン単量体のＫｄ値を、表に示す。ユビキチン変異体５Ｅ１および１Ｈ４を、例として示す。ＥＤ−Ｂ結合を、ｃ−ＦＮ（細胞性フィブロネクチン）への結合と比較する。前記図は、前記単量体（５Ｅ１は４．５１μＭ、１Ｈ４は９．９８μＭ）と比較したターゲットであるＥＤ−Ｂへの四量体変異体（例えば、５Ｅ１は５６ｎＭ、１Ｈ４は１．４ｎＭ）の結合において、親和性が著しく高いことを示している。
【０１５３】
図４は、ヘテロ二量体を発生させる、前方（第１）修飾ユビキチン単量体（ＢＤＲ１を有する）と異なる修飾がされた後方（第２）ユビキチン単量体（ＢＤＲ２を有する）との遺伝子組み換えが、親和性および特異性を有意に向上させることを示す。細胞および組織切片に結合する前記修飾ユビキチン分子を、Ｂｉａｃｏｒｅ、蛍光偏光測定により分析した。ヒトＥＤ−Ｂへの複数の変異体の結合の濃度依存性ＥＬＩＳＡ（ｃｏｎｃ．−ＥＬＩＳＡ）を示す。
【０１５４】
図４Ａは、単量体４１Ｂ１０についての、Ｋｄ＝９．４５μＭの結合親和性を示す。
【０１５５】
図４Ｂは、４１Ｂ１０が異なる第２単量体と結合して得られた４６Ｈ９についての、Ｋｄ＝１３１ｎＭの結合親和性を示す。
【０１５６】
図５は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）と融合した特異的変異体を示す。前記融合タンパク質は、前記修飾ユビキチン単量体を三量体形成し、生物学的に活性な分子である。
【０１５７】
図５Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合エフェクター融合タンパク質の模式図である。同図において、緑色（上部の構造）は、エフェクター、例えば、サイトカイン、好ましくは、ＴＮＦα；茶色、薄い茶色は、前記修飾ユビキチン単量体（Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標））である。
【０１５８】
図５Ｂは、前記修飾ユビキチンエフェクター接合５Ｅ１−ＴＮＦコンジュゲートが、アポトースシス促進活性（Ｌ９２９アポトーシスアッセイで測定）を有すること示す。
【０１５９】
図５Ｃは、１Ｈ４−ＴＮＦα融合物のＥＤ−Ｂへの結合親和性（Ｋｄ＝１５．１ｎＭ）が高いことを示す（一致した線により連結された黒丸）。ＢＳＡへの結合をコントロールとしてプロットした（線により連結されていない黒丸）。
【０１６０】
図６は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦαに融合した、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子の親和性および活性を示す。
・修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合サイトカイン融合物のアポトーシス誘導活性：ＥＣ５０ ０．７８±０．２４ｐＭ
・遊離サイトカインのアポトーシス誘導活性：ＥＣ５０ ３．１４±３．５９ｐＭ
【０１６１】
図６Ａは、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ ５０．７ｎＭ）。
【０１６２】
図６Ｂは、遺伝学的にサイトカインＴＮＦαに融合し、前記ヘテロ二量体２４Ｈ１２が多量体化された、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合へテロ二量体分子２４Ｈ１２の親和性を示す（Ｋｄ＝５．６ｎＭ）。
【０１６３】
図６Ｃは、ヘテロ二量体修飾ユビキチンライブラリー選択からの代表的な候補、例えば、ヘテロ二量体クローン９Ｅ１２、２２Ｄ１、２４Ｈ１２、４１Ｂ１０の分析を示す。細胞基質のフィブロネクチンをコントロールとして使用した場合と比較して、ターゲットであるＥＤ−Ｂに対して、Ｋｄ ＥＬＩＺＡ値が向上され、前記ターゲットへの特異的結合が確認された。
【０１６４】
図６Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子９Ｅ１２の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜１５μＭ ９Ｅ１２）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、前記ヘテロ二量体変異体９Ｅ１２とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析するチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析した。会合解離曲線の分析からは、Ｋｄを、決定できなかった。
【０１６５】
図６Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾ヘテロ二量体ユビキチン分子４１Ｂ１０の、無標識相互作用分析による分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜１５μＭ ４１Ｂ１０）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、前記ヘテロ二量体変異体４１Ｂ１０とＥＤ−Ｂとの間の相互作用を分析するチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、６２３ｎＭ（６２３×１０−９Ｍ、６．２×１０−７Ｍ）であった。
【０１６６】
図７は、結合親和性および結合特異性に対する、異なる修飾がなされたユビキチン変異体の寄与を示す。前記異なる変異体は、小文字でマークされる共通の配列モジュールを共有する。前記変異体について、ＥＤ−Ｂ結合を分析した。図７は、修飾ユビキチンへテロ二量体が得られる、単量体の種々の組み合わせを示す。ヘテロ二量体変異体４６−Ａ５、５０−Ｇ１１および４６−Ｈ４は、すべて同一の、ＢＤＲ１を有する第１（前方）修飾単量体（同図において、「ａ」で示す）を有するが、第２（後方）ユビキチン単量体は、ＢＤＲ２における異なる部位が修飾されている。変異体５２−Ｄ１０および５２−Ｂ３は、ＢＤＲ１を有する４６−Ｈ９と比較して、異なる第１（前方）修飾単量体を有し、ＢＤＲ２を有する同一の第２（後方）ユビキチン単量体（同図において、「ｅ」で示す）を有している。
【０１６７】
前記修飾ユビキチンヘテロ二量体は、下記配列を有する：
４６−Ｈ４：配列番号２５、４５−Ｈ９：配列番号２６、４６−Ａ５：配列番号２７、５０−Ｇ１１：配列番号２８、５２−Ｂ３：配列番号２９、５２−Ｄ１０：配列番号３０。
【０１６８】
実験過程において、配列ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１）を有するＨｉｓタグにより、前述の配列を修飾した。
【０１６９】
図７に示すように、４６−Ｈ４は、ＥＤ−Ｂへの優れた結合親和性を有する（Ｋｄ＝１８９ｎＭ）。４６−Ａ５および５２−Ｄ１０は、結合活性を有さない。また、他の修飾ユビキチンタンパク質は、ＥＤ−Ｂへの結合活性が４６−Ｈ４と比較して低い。したがって、ヘテロ二量体変異体における両単量体が、ターゲットへの高い結合親和性のために必要とされると結論付けることができ、両単量体がターゲットに対する一価の結合を示す。
【０１７０】
高いＥＤ−Ｂ結合活性を有する前記修飾ユビキチンヘテロ二量体４６−Ｈ９は、前記２つの単量体の両結合ドメイン領域における下記のアミノ酸置換により、野生型ユビキチン単量体と比較して同定される。
前記第１モジュール（ＢＤＲ１）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュール（ＢＤＲ２）において、（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５０Ｇ１１
前記第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュールにおいて、（ｃ）Ｋ６Ｍ、Ｌ８Ｒ、Ｑ６２Ｍ、Ｋ６３Ｎ、Ｅ６４Ａ、Ｓ６５Ｒ、Ｔ６６Ｌ
４６Ｈ４
前記第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュールにおいて、（ｄ）Ｋ６Ｇ、Ｌ８Ｗ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ｑ、Ｅ６４Ｑ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｒ
５２Ｂ３
前記第１モジュールにおいて、（ｇ）Ｑ２Ｒ、Ｆ４Ｐ、Ｋ６Ｙ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｒ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）において、Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
５２Ｄ１０（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュールにおいて、Ｑ２Ｖ、Ｆ４Ｃ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｔ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｇ、Ｔ６６Ｄ
前記第２モジュール（４６Ｈ９）において、（ｅ）Ｋ６Ｈ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｐ、Ｅ６４Ｉ、Ｓ６５Ａ、Ｔ６６Ｅ
４６Ａ５（ＥＤ−Ｂに結合しない）
前記第１モジュール（４６Ｈ９）において、（ａ）Ｑ２Ｇ、Ｆ４Ｖ、Ｋ６Ｒ、Ｑ６２Ｐ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｐ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｌ
前記第２モジュールにおいて、（ｂ）Ｋ６Ｌ、Ｌ８Ｍ、Ｑ６２Ｌ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｆ、Ｓ６５Ａ
【０１７１】
図８は、配列アライメントを示す。１行目：野生型ユビキチンタンパク質の２つの単量体（１行目）は、７７位から８８位までの１２個のアミノ酸のリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧにより結合される。ＢＤＲ２を有する第２単量体は、８９位のメチオニンから始まる。この二量体野生型ユビキチンタンパク質は、第１単量体および第２単量体の２つのＢＤＲにおいて異なる修飾を有する、前記修飾へテロ二量体変異体４６−Ｈ９（２行目）で整列されている。ターゲットへの一価の結合のために、両ＢＤＲは、ターゲットとの結合において、共に作用する。
【０１７２】
図９は、「Ｕｂ２＿ＴｓＸ９」（両単量体の４５位がトリプトファンに修飾され、２つの単量体の間にリンカーＧＩＧ（７７〜７９位；８０位のメチオニンから第２単量体が開始）を示すユビキチン）に対する、修飾ユビキチンへテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１（１行目）の配列アライメントを示す。前記第２単量体の最後のＣ末端アミノ酸において、グリシンからアラニンに置換されている。３行目は、二量体である野生型ユビキチンであり、リンカーアライメントを示さない（このため、７７位のメチオニンから第２単量体が開始する）、「Ｕｂｉ−Ｄｉｍｅｒ ｗｔ」を示す。４行目は、ヒトの野生型ユビキチンである「Ｕｂｉ−Ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ」を示す。
【０１７３】
図１０は、ヒトＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（Ｋｄ＝６．９ｎＭ＝６．９×１０−９Ｍ）。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９−ｔ０という）への結合親和性を示すことを、黒丸で示し、この変異体が、ネガティブコントロール（６７８９−ｔ０という）には結合しないこと（白丸）と比較する。
【０１７４】
図１１は、フィブロネクチンフラグメントを含む固定化されたＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）へのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合についての、量が増加する遊離ターゲットの存在下での、競合濃度依存性ＥＬＩＳＡを示す。ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１は、非常に高いＥＤ−Ｂへの結合親和性を示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。
【０１７５】
図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用した、前記修飾へテロ二量体ユビキチン分子１０４１−Ｄ１１の、無標識相互作用分析における分析結果を示す。種々の濃度（図中の凡例：０〜２００ｎＭ １０４１−Ｄ１１）の前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体について、ＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化された、フィブロネクチンフラグメントを含むＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９という）への結合を分析した。会合解離曲線の分析から、Ｋｄは、１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）であり、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体の長期間における半減期を示すｋｏｆｆ率は、７．７×１０−４ｓ−１であった。
【０１７６】
図１３は、結合活性の血清安定性分析を同時に分析する濃度依存性ＥＬＩＳＡにおける、ＥＤ−Ｂへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。マウス血清もしくはラット血清またはコントロールとしてのＰＢＳＴ中での、３７℃で１時間での前記変異体のプレインキュベーション等について、種々の条件を示す。Ｋｄ値は、すべて１０〜２０ｎＭである。したがって、ＥＤ−Ｂへの前記ヘテロ二量体１０４１−Ｄ１１の結合は、血清による顕著な影響を受けないと結論付けることができる。
【０１７７】
図１４は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１とフィブロネクチンフラグメントとの複合体形成の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析を示す。
【０１７８】
図１４Ａは、１０４１−Ｄ１１とＥＤ−Ｂとの複合体形成を示す。３回のＨＰＬＣのランを重ねている。ＳＥ−ＨＰＬＣ後の、保持時間２１．６５１分の青色のピークは、純粋な１０４１−Ｄ１１に由来し、保持時間２６．２８９分の黒色のピークは、フィブロネクチンフラグメント６７Ｂ８９を表し、保持時間２１．４０７分の赤色のピークは、１０４１−Ｄ１１と６７Ｂ８９との混合物の結果を示す。１０４１−Ｄ１１のピークの保持時間が短くなる側へのシフト、および、６７Ｂ８９のピークの消失は、１０４１−Ｄ１１と可溶性ＥＤ−Ｂとの複合体の形成を示す。
【０１７９】
図１４Ｂは、３回のＳＥ−ＨＰＬＣのラン、１０４１−Ｄ１１（青色、２１．９４４分）、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９（黒色、２６．２８９分）および１０４１−Ｄ１１と６７８９との混合物（２１．９２９分および２６．２８９分にピークを有する赤色線）を重ねて示す。前記１０４１−Ｄ１１のピークのシフトは、ほとんど観察されなかった。６７８９のピークが消失しなかったこととあわせて、この事実は、ＥＤ−Ｂを含まないフィブロネクチンフラグメント６７８９に、有意に結合しないことを示す。
【０１８０】
図１５は、ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の培養細胞への結合を示す。
【０１８１】
図１５Ａは、固定化されたヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を示す。図１５において、１列目は、抗ＥＤ−Ｂ抗体を使用したコントロールを示し、２列目は、タンパク質濃度５８．７ｎＭでの変異体のインキュベーションを示し、３列目は、１０倍高濃度（５８７ｎＭ）の１０４１−Ｄ１１タンパク質でのインキュベーションを示し、４列目は、ＰＢＳでのネガティブコントロールである。１行目において、ヒトＷｉ３８繊維芽細胞を、位相差で示し、２行目において、免疫蛍光法で示し、３行目において、核のＤＡＰＩ染色を示す。前記変異体１０４１−Ｄ１１は、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、Ｗｉ３８に結合すると結論付けることができる。ＥＤＢを低レベルで発現するＮＨＤＦ細胞を使用するコントロールを行った（データ示さず）。前記変異体は、それらの細胞には結合しなかった。
【０１８２】
図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）ヒト胎児肺繊維芽細胞（Ｗｉ３８）への結合を示す。前記ネガティブコントロールのＮＨＤＦ細胞は、主要な正常繊維芽細胞であり、ＥＤＢ−フィブロネクチンを低レベルで発現する。１行目および３行目は、種々のタンパク質濃度での変異体およびネガティブコントロールを示す。２行目および４行目は、ＥＤＢ抗体を使用するコントロールのインキュベーションを示す。１〜２行目は、前記変異体とＷｉ３８細胞株へのポジティブコントロールを示す。３〜４行目は、ＮＨＤＦ細胞のインキュベーションを示す。前記変異体１０４１−Ｄ１１が、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、Ｗｉ３８に結合するのが観察できた。
【０１８３】
図１５Ｃは、固定化されたマウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞への結合を示す。前記変異体について、３つの異なるタンパク質濃度（１、１０、５０ｎＭ）でテストした。１行目は、細胞への前記変異体（ＳＰＶＦ−２８−１０４１−４１１−ＴｓＸ９）を示し、２行目は、ポジティブコントロール（Ｆｖ２８−ＥＤＢ−抗体）を示し、３行目は、ネガティブコントロール（ＵＢ２＿ＴｓＳ９；配列番号１に相当する非修飾ユビキチン）でのインキュベーションを示す。前記変異体１０４１−Ｄ１１が、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、マウスＢａｌｂ ３Ｔ３細胞に結合するのが観察できた。
【０１８４】
図１５Ｄは、固定化されたマウスＳＴ−２細胞への結合を示す。前記変異体について、３つの異なるタンパク質濃度（１、１０、５０ｎＭ）でテストした。１行目は、細胞への前記変異体（ＳＰＶＦ−２８−１０４１−４１１−ＴｓＸ９）を示し、２行目は、ポジティブコントロール（Ｆｖ２８−ＥＤＢ−抗体）を示し、３行目は、ネガティブコントロール（ＵＢ２＿ＴｓＳ９；配列番号１に相当する非修飾ユビキチン）でのインキュベーションを示す。前記ヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１が、細胞外マトリックスを含むＥＤ−Ｂに高い特異性で、マウスＢａｌｂ ＳＴ−２細胞に結合するのを観察できた。
【０１８５】
図１６Ａは、哺乳類組織切片における、ターゲットへのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。７つの検体からのＦ９腫瘍細胞について、評価した。１０ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の異なる濃度でのヘテロ二量体ユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の免疫組織学的検査において、マウス由来のＦ９腫瘍でのＥＤ−Ｂ特異的血管染色（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示した。ＥＤ−Ｂは、腫瘍血管構造の高特異的マーカーである。ターゲットタンパク質であるＥＤ−Ｂは、血管の反管腔側に局在する。変異体１０４１−Ｄ１１は、特異的にＦ９腫瘍由来の組織切片において、血管構造を装飾する。得られた結果は、抗体フラグメントＬ１９に匹敵する。さらに、４８組織をテストした。ＦＤＡ関連パネルにおける４８通りの組織について、非特異的な染色は観察されなかった。
【０１８６】
図１６Ｂは、野生型ユビキチン（同図において、Ｕｂ２（ＮＣＰ２））との比較における、腫瘍組織での１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。Ｆ９腫瘍組織について、３０分から１６時間の間の異なる時点で、１０４１−Ｄ１１および野生型ユビキチンの存在を分析した。腫瘍組織における１０４１−Ｄ１１の最も高い蓄積は、投与後３０分および１６時間で観察された。一方、Ｆ９腫瘍組織における野生型ユビキチンの蓄積は、低かった。前記変異体は、野生型ユビキチンと比較して、ＥＤ−Ｂを発現する腫瘍に濃縮される。このことは、腫瘍組織への１０４１−Ｄ１１の直接的ターゲッティングの証拠となる。また、癌モデルにおける腫瘍への１０４１−Ｄ１１のｂｌｏｏｄ−ｒａｔｉｏは、動物における１０４１−Ｄ１１変異体ｉｎ ｖｉｖｏ活性を明らかに証明している（データを示さず）。
【０１８７】
図１７は、ＴＮＦα融合タンパク質１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する高い選択性および特異性を示す。
【０１８８】
図１７Ａおよび１７Ｂ：１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質におけるＴＮＦαのアポトーシス誘導活性を、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）（Ｌ９２９細胞）によりテストした。前記両図は、前記１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦα融合タンパク質（図１７Ｂ）が、遊離ＴＮＦαと同程度に活性であることを、明らかに示している。
【０１８９】
図１７Ｃは、ターゲットであるＥＤ−Ｂへの、ヘテロ二量体ユビキチン１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い選択性を証明している。前記ヒトＥＤ−Ｂフィブロネクチンドメイン６７Ｂ８９は、１０４１−Ｄ１１変異体に、見かけのＫＤ値１．８ｎＭで結合され（黒丸）、ターゲットへの高い親和性を示す。ＥＤ−Ｂドメインを欠損するヒトフィブロネクチン（ｈ６７８９）は、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦαに結合されない（白丸）。
【０１９０】
図１７Ｄ＋Ｅは、修飾ユビキチンＥＤ−Ｂ結合１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質についての、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる結合分析を示す。結果から、ＫＤ値１．１３ｎＭを示す１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質の高い親和性が証明された。
【０１９１】
図１７Ｆは、培養細胞における変異体１０４１−Ｄ１１で観察された高い結合特異性が、１０４１−Ｄ１１がＴＮＦαに融合されても維持されることを示す。前記融合タンパク質は、ＥＤＢ発現細胞に特異的に結合する。したがって、１０４１−Ｄ１１ＴＮＦα融合タンパク質は、非常に高い親和性および特異性でターゲットであるＥＤ−Ｂ（ターゲット（＋））に結合する。ＥＤ−Ｂを含まない血清（ターゲット（−））では、交差反応は観察されなかった。
【０１９２】
図１８は、ＴＮＦαに融合した変異体１０４１−Ｄ１１とメルファランとの併用による、７日間のマウスの処置期間中のｉｎ ｖｉｖｏでの相対的腫瘍成長を示す。データから、細胞増殖抑制剤であるメルファランと組み合わせた１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαは、ｍＴＮＦαとメルファランとの組み合わせ、またはメルファラン単独の場合より効果的に、相対的腫瘍成長を減少させることが、明らかに示された。７日間の処置後の前記腫瘍成長は、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαによる高効率での減少を示す。このことは、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαとメルファランとの併用による腫瘍治療の効能の明らかな証拠である。ＥＤ−Ｂは、マウスおよびヒトを含む、種々の哺乳類において同一である。このため、前記結果から、ヒトにおける変異体１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαの性能が、予測される。
【実施例】
【０１９３】
下記実施例は、本発明をさらに説明するために提供するものである。本発明は、特に、ユビキチンの修飾を例にあげて実証されている。しかし、本発明は、これに限定されず、以下の実施例は、単に、前述の記載に基づいた本発明の実施可能性を示しているにすぎない。本発明の完全な開示のため、本願および付属書類に引用されている文献についても言及しているが、これらの引用文献は全て、引用により、その開示全体が本願に取り込まれている。
【０１９４】
［実施例１］
修飾ユビキチンタンパク質に基づくヘテロ二量体ＥＤ−Ｂ結合タンパク質の同定
【０１９５】
ライブラリーの構築とクローニング
特に示さない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌに記載されているような、確立された組換え遺伝学的手法を使用した。合計１５の選択されたアミノ酸部位における協調した変異誘発によって、高度な複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを用意した。ＮＮＫトリプレットによって置換された修飾アミノ酸は、近位（第１）ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸、および遠位（第２）ユビキチン単量体内の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８位から選択された少なくとも３個のアミノ酸を含む。両ユビキチン単量体は、少なくともＧＩＧ配列、または少なくともＳＧＧＧＧ配列を有するグリシン／セリンリンカーによって遺伝的に結合（ヘッドトゥテイル配置）しており、リンカー配列の例としては、ＧＩＧ、ＳＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧＩＧ、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号３２）またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧがあげられるが、その他のリンカーでもよい。
【０１９６】
ＴＡＴファージディスプレイ選択
ヘテロ二量体ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを使用し、ターゲットに対して濃縮した。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットは、タンパク質結合表面上に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して、非特異的に固定化され得る。ビオチンを介するストレプトアビジンビーズまたはニュートラアビジンストリップ上への固定化が好ましい。ターゲット結合ファージは、溶液中または固定化ターゲット上のいずれかにおいて選択される。例えば、ビオチン化され固定化されたターゲットとファージとを、インキュベートし、続いて、マトリックスに結合したファージの洗浄およびマトリックス結合ファージの溶出を行う。ターゲットのインキュベーションに続く各サイクルにおいて、前記ビーズを磁力により溶液から分離し、数回洗浄した。最初の選択サイクルにおいて、ビオチン化ターゲットを、ニュートラアビジンストリップに固定化し、一方、２回目から４回目のサイクルにおいて、溶液における選択を行い、続いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）上に、ターゲットとファージとの複合体を固定化した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のファージを、酸性溶液での溶出により遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のファージ溶出を行った。溶出したファージを再増幅した。バインダーの特異性を誘導するため、選択に際し、ターゲットに類似するタンパク質を含めてもよい。
【０１９７】
ＴＡＴファージディスプレイ選択の代替：リボソームディスプレイ選択
ユビキチンライブラリーを、例えば、選択システムとしてリボソームディスプレイを使用して、ターゲットに対して濃縮した（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００７、Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。当該技術分野において公知である他の選択方法を用いることもできる。前記ターゲットを、標準的な方法によってビオチン化し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。リボソーム、ｍＲＮＡおよび新生ユビキチンポリペプチドを含む三元複合体を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓ（登録商標） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて構築した。選択の一次ラウンドを２回行い、三元複合体をインキュベートし、続いて、類似する選択のラウンドを２回行った。ターゲットインキュベーションに続く各サイクルにおいて、ビーズを磁力により溶液から分離し、ストリンジェンシーを増加させながら、リボソームディスプレイバッファーで洗浄した。最初の２回の選択サイクルでの洗浄後、前記ビーズを再度磁力により溶液から分離し、５０ｍＭ ＥＤＴＡの添加により、ターゲットが結合した修飾ユビキチン分子のｍＲＮＡをリボソームから遊離させた。選択サイクルにおいて、過剰量のターゲットを用いた競合的溶出により、３回目および４回目のｍＲＮＡの溶出を行った（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， ２００４）。各サイクルの後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、アメリカ）、およびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製、ドイツ）を用いて、ＲＮＡの精製とｃＤＮＡの合成を行った。
【０１９８】
濃縮プールのクローニング
４回目の選択サイクルの後、合成ｃＤＮＡを、Ｆ１プライマー（ＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧ）（配列番号９）およびＷＵＢＩ（ｃｏ）ＲＤ＿ｘｈｏプライマー（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧ）（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより増幅し、制限ヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、アメリカ）で切断し、適合性付着端を介して発現ベクターｐＥＴ−２０ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）に連結した。
【０１９９】
単一コロニーのヒット解析
ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）への形質転換の後、アンピシリン耐性単一コロニーを、２００μｌ ＳＯＢＡＧ培地（１００μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２０ｇ／ｌ グルコースを含むＳＯＢ培地）において、３７℃で６時間培養した。５００μｌの自己誘導培地ＺＹＭ−５０５２（Ｓｔｕｄｉｅｒ社製、２００５）を用い、９６ディープウェルプレート（Ｇｅｎｅｔｉｘ社製、イギリス）において、３７℃で１６時間培養することにより、ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチンを発現させた。４℃、３６００×ｇで、１５分間遠心分離して、細胞を回収した。その後、ウェルあたり３００μｌの溶解バッファーを用いて、３７℃で３０分間インキュベートし、前記細胞を溶解した。前記溶解バッファーは、０．２×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチーム（ＶＷＲ社製、ドイツ）、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｒｏｔｈ社製、ドイツ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．２Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（ＶＷＲ社製、ドイツ）を含む、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）とした。４℃、３６００×ｇで、３０分間遠心分離した後、得られた上清を、４μｇ／ｍｌ ＥＤ−Ｂ、およびセイヨウワサビぺルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とのユビキチン特異的ＦａｂフラグメントコンジュゲートでコートしたＮｕｎｃ ＭｅｄｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、アメリカ）を用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。検出試薬としてＴＭＢ−Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ社製、ドイツ）を用いた。ウェルあたり５０μｌの０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて、黄色を発色させ、プレートリーダーにおいて４５０ｎｍと６２０ｎｍを測定した。
【０２００】
通常、数回、例えば、４サイクルの選択ディスプレイを、ＥＤ−Ｂに対して行った。最後の２サイクルの選択において、結合分子を、過剰量の遊離ＥＤ−Ｂを用いて溶出した。これらのＥＤ−Ｂ結合変異体を、他のものとの間で同定した。
４６Ｈ９配列
MGIVVRTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIPHPTLLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVHTMTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIKPIAELHLVLRLRGG（配列番号６）
９Ｅ１２配列
MRIPVYTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIPPFARLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVMTRTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIMNARLLHLVLRLRGG（配列番号７）
２２Ｄ１配列
MLILVRTLTDKTITLEVEPSDTIGNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNISVGAMLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVLTWTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIRRLPPLHLVLRLRGG（配列番号８）
【０２０１】
野生型ユビキチン単量体（Ｕｂｉ ｍｏｎｏｍｅｒ ｗｔ）と野生型ユビキチン二量体（ｕｂｉ ｄｉｍｅｒ ｗｔ）、野生型ユビキチンタンパク質（図９におけるＵｂ２−ＴｓＸ、各単量体の４５位の置換およびＣ末端に２つの置換を有する）、および修飾ユビキチンヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１との配列アライメントを、図９に示す。デユビキチナーゼは、ユビキチンのＧＧの後ろを切断し、ＡＡの後ろを切断しないため、Ｕｂ２−ＴｓＸにおいて、前記単量体のＣ末端の置換（ＧＧからＡＡ）は、血清における安定性を増加させる。野生型ユビキチンの二次構造は、前記Ｃ末端における置換を有するユビキチンと比較して、ほぼ同一である。
【０２０２】
１０４１−Ｄ１１（図９、配列番号３６）または１０４５−Ｄ１０と呼ばれる、優れたＥＤ−Ｂ結合親和性を有する修飾ユビキチンは、野生型と比較して、後述のアミノ酸置換によって同定される。
第１モジュール
Ｋ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５Ｆ、Ｔ６６Ｐ
第２モジュール
Ｋ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｗ、Ｔ６６Ｅ
任意に、Ｑ２Ｒ（当該置換は、変異体１０４１−Ｄ１１に存在し、変異体１０４５−Ｄ１０には存在しない）
融合タンパク質に適した好ましいリンカーは、配列番号３２のリンカーまたはＧＩＧ配列のリンカーである。ただし、代わりに使用できる、多くのリンカーが考えられる。
【０２０３】
さらに好ましい例として、下記の配列のタンパク質（配列番号４７）が提示され、前記配列において、前記配列のＸＸＸＸは、どのようなアミノ酸でもよい。リンカーとして、ここでは、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧが使用される（イタリックで示す）。ただし、他の種類のリンカー、またはリンカーなしも、代替可能である。
【化２】
タンパク質の例と、これらの配列とのコンセンサス配列は、図２に示す。
【０２０４】
［実施例２］
ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチン変異体とヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）からの融合タンパク質の生成
【０２０５】
前記変異体を、修飾ユビキチン、例えば、ヘテロ二量体変異体１０４１−Ｄ１１と、マウスまたはヒトＴＮＦαとの間の融合タンパク質として、大腸菌内で発現させる。融合タンパク質のタンパク質解析は、タンパク質発現と純度、非凝集能、細胞培養におけるＴＮＦα活性、ターゲットタンパク質ＥＤ−Ｂへの親和性、選択性、細胞培養における特異的結合を含む。Ｆ９腫瘍を有するマウスにおける腫瘍の縮小を誘導するための動物実験における必須条件は、マウスＴＮＦαとの融合物である。
【０２０６】
工程１：融合タンパク質のクローニングのためのベクターの生成（ｐＥＴＳＵＭＯ−ＴＮＦα）
ｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔは、修飾ベクターｐＥＴＳＵＭＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）であり、付加マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の挿入によって修飾されている。ｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔへのＴＮＦαのクローン化から開始し、ＥＤ−Ｂに結合する修飾ユビキチン変異体を挿入するための制限部位を導入した。得られた構築物は、下記ＤＮＡ配列（配列番号１１）の構造体Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＴＮＦαの構造を有する。
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTAGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTGTGCGTAGCAGCAGCCGTACCCCGAGCGATAAACCGGTGGCGCATGTGGTGGCGAATCCGCAGGCGGAAGGCCAGCTGCAGTGGCTGAACCGTCGTGCGAATGCGCTGCTGGCCAACGGCGTGGAACTGCGTGATAATCAGCTGGTTGTGCCGAGCGAAGGCCTGTATCTGATTTATAGCCAGGTGCTGTTTAAAGGCCAGGGCTGCCCGAGCACCCATGTGCTGCTGACCCATACCATTAGCCGTATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAACCTGCTGTCTGCGATTAAAAGCCCGTGCCAGCGTGAAACCCCGGAAGGCGCGGAAGCGAAACCGTGGTATGAACCGATTTATCTGGGCGGCGTGTTTCAGCTGGAAAAAGGCGATCGTCTGAGCGCGGAAATTAACCGTCCGGATTATCTGGATTTTGCGGAAAGCGGCCAGGTGTATTTTGGCATTATTGCGCTGTAATAA
【０２０７】
ＴＮＦα配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位の導入により、ＰＣＲで増幅した。
使用したプライマーは、以下の通りである。
【化３】
前記ｆｗプライマー（配列番号１２）は、ＴＮＦαの最初の１５塩基対（下線部）を認識し、ＢａｍＨＩ配列（太字部）を有する。前記ｒｅｖプライマー（配列番号１３）は、ＴＮＦαの最後の塩基対、終止コドン（下線部）およびＸｈｏＩ制限部位（太字部）を含む。
【０２０８】
ＰＣＲ反応ミックス（１００μｌ）
８４．５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×Ｐｗｏバッファー＋Ｍｇ；
２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（＝２００μＭ）；
各０．５μｌ １００μＭ プライマーｆｗ／ｒｅｖ（＝各０．５μＭ）；
２μｌ ＤＮＡ（＝０．２５μｇ）；
０．５μｌ Ｐｗｏポリメラーゼ（＝２．５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）
【０２０９】
ＰＣＲプログラム
９４℃で３分、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分（工程２〜４：３０サイクル）、７２℃で５分、続いて４℃で処理し、続いて、Ｑｉａｇｅｎ−ＭｉｎＥｌｕｔｅ−Ｋｉｔ（１０μｌ ＥＢに溶出）によるＰＣＲ産物の精製を行った。前記ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限およびライゲーションにより、ベクターｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔのＭＣＳに導入した。
【０２１０】
制限ミックス（１００μｌ）
ベクター：８３μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢａｍＨＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ），
１．５μｌ ＸｈｏＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
１．６５μｌ ベクター；
３ｈ、３７℃でインキュベーション
ＰＣＲ産物：７６．５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢａｍＨＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ），
１．５μｌ ＸｈｏＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
８μｌ 挿入断片；
３ｈ、３７℃でインキュベーション
１％アガロースゲル（１００Ｖ、６０分間ラン）において制限ミックスを分離；
切断されたベクターフラグメント（５６５９ｂｐ）と挿入断片（４９１ｂｐ）を、Ｑｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製（３０μｌ ＥＢに溶出）。
【０２１１】
ライゲーション（２０μｌ）
１５．２μｌ Ｈ２Ｏ；
２μｌ １０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼバッファー；
２．２６μｌ ベクター（２００ｎｇ）；
０．５４μｌ 挿入断片（４０ｎｇ）
５分間、６５℃でインキュベーション；
１６℃に冷却；
１μｌ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（＝３Ｕ；ＮＥＢ）添加；
１６時間、１６℃でインキュベーション
【０２１２】
ＮａＡｃ／イソプロパノール沈殿
ライゲーションミクスチャー（２０μｌ）＋２．２μｌ ３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）＋２２．２μｌ イソプロパノール；
３０分間、−２０℃；
１５分間、４℃、１３０００Ｕｐｍ；
５００μｌの７０％ ＥｔＯＨにペレットを再懸濁；
スピン；
１０μｌのＨ２Ｏにペレットを再懸濁
【０２１３】
形質転換
エレクトロコンピテントＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞（４０μｌアリコート）と１０μｌのライゲーション産物とを混合；
０．１ｃｍ エレクトロポレーションキュベットに移動；
エレクトロポレーターでパルスを印加（１．８ｋＶ、５０μＦ、１００ Ｏｈｍ）；
３７℃、２２０Ｕｐｍ、４５分間、１ｍｌのＳＯＣ培地と、溶液とをインキュベート；
カナマイシン含有ＬＢプレートに、１００μｌを播き、３７℃、一晩インキュベーション
【０２１４】
工程２：修飾ユビキチンベースのＥＤＢ融合タンパク質のクローニング
ＥＤＢ結合修飾ユビキチンベースの変異体とＴＮＦαとの融合物の生成のために、ＰＣＲにより、対象であるＥＤＢ修飾ユビキチンベースの配列をｐＥＴ２０ｂベクターから増幅し、ＢｓａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入する。この方法は、単量体および二量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体に好適である。単量体ＷＴユビキチン（Ｗｕｂｉ）用のプライマーは、下記のとおりである。
【化４】
【０２１５】
前記ｆｗプライマー（配列番号１４）は、修飾ユビキチンの最初の１５塩基対（下線部）を認識し、ＢｓａＩ配列（太字部）を有する。前記ｒｅｖプライマー（配列番号１５）は、修飾ユビキチンの最後の１５塩基対を認識し、アミノ酸リンカー（ＳＧＧＧＧ配列）およびＢａｍＨＩ制限部位（太字部分）を挿入する。修飾ユビキチンベースの変異体それぞれについて、特異的ｆｗプライマーを使用する。単量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体１Ｈ４、５Ｅ１および４Ｂ１０のプライマーは、下記のとおりである。
【化５】
【０２１６】
前記ｒｅｖプライマーは、全ての単量体修飾ユビキチンベースの変異体に使用する。二量体修飾ユビキチンベースの変異体用のｒｅｖプライマーは、下記のとおりである。
【化６】
【０２１７】
二量体ＷＴユビキチン（ＷｕｂｉＨｕｂｉ）のクローニング用および二量体ＥＤＢ修飾ユビキチンベースの変異体用のｆｗプライマーは、下記のとおりである。
【化７】
【０２１８】
ＰＣＲミックス（１００μｌ）
８４．５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×Ｐｗｏバッファー＋Ｍｇ；
２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（＝２００μＭ）；
各０．５μｌ １００μＭ プライマーｆｗ／ｒｅｖ（＝０．５μＭ）；
２μｌ ＤＮＡ（変異体により決定）；
０．５μｌ Ｐｗｏポリメラーゼ（＝２．５Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）
【０２１９】
ＰＣＲプログラム
１．９４℃で３分
２．９４℃で３０秒
３．６０℃で３０秒
４．７２℃で２分（工程２〜４：３０サイクル）
５．７２℃で５分、続いて４℃
【０２２０】
アガロースゲルでＰＣＲ産物を精製し、必要なバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ−ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製する。ＢｓａＩ−ＢａｍＨＩ制限により、前記ＰＣＲ産物をクローニングする（ｐＥＴＳＵＭＯ−ＴＮＦα内に）。
【０２２１】
制限ミックス（１００μｌ）
７５μｌ Ｈ２Ｏ；
１０μｌ １０×ＮＥバッファー３；
１μｌ １００×ＢＳＡ；
３μｌ ＢｓａＩ（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）；
８μｌ ＤＮＡ（ベクターまたはＰＣＲ産物）２時間、５０℃でインキュベーション、
１０分間、６５℃、
３μｌ ＢａｍＨＩの添加（＝３０Ｕ；ＮＥＢ）、
２時間、３７℃
１％アガロースゲルにおいて制限ミックスを分離；
切断されたベクターフラグメントおよび挿入断片を、Ｑｉａｇｅｎ−ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔで精製（３０μｌ ＥＢに溶出）。
【０２２２】
ライゲーション（２０μｌ）
１２．５μｌ Ｈ２Ｏ；
２μｌ １０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼバッファー；
５μｌ ベクター（６６ｎｇ）；
０．５μｌ 挿入断片（変異体の種類により変わる）
５分間、６５℃でインキュベーション；
１６℃に冷却；
１μｌ Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（＝３Ｕ；ＮＥＢ）添加；
１６時間、１６℃でインキュベーション
【０２２３】
ＮａＡｃ／イソプロパノール沈殿（工程１参照）
【０２２４】
形質転換
エレクトロコンピテントＮｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）細胞の形質転換は、前述のとおりである。結果として、下記の融合構築物が得られた。すなわち、Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−修飾ユビキチン−ＳＧＧＧＧ−ＴＮＦαを有するｐＥＴＳＵＭＯａｄａｐｔにおけるＥＤＢ修飾ユビキチンとＴＮＦαとの融合構築物である（単量体修飾ユビキチンの場合、３５９個のアミノ酸からなり、二量体修飾ユビキチンの場合、４４７個のアミノ酸からなる）。
【０２２５】
［実施例３］
ユビキチンベースのＴＮＦα融合タンパク質の発現と精製
【０２２６】
ＤＮＡ配列解析により、ＳＵＭＯ−ＴＮＦα融合タンパク質の正しい配列が示された。変異体の発現のために、前培養物をＬＢ／カナマイシンで１：１００に希釈し、前記培養液を、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）０．５まで、２００ｒｐｍ、３７℃で攪拌することで、クローンを振とうフラスコで培養した。発現は、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）の添加で誘導した。３０℃、４時間、２００ｒｐｍで、培養を続けた。４℃、６０００×ｇで２０分間遠心分離し、細菌細胞を回収した。前記細胞ぺレットを、ベンゾナーゼおよびリゾチームを含むＮＰＩ２０バッファー３０ｍｌに懸濁した。細胞を、氷上で超音波処理（３×２０秒）によって破砕した。懸濁液を、４℃、４００００×ｇで３０分間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む上清を得た。両タンパク質を、室温でのアフィニティークロマトグラフィーにより、精製した。Ｎｉ−アガロース（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の一本のカラムを、５０ｍｌのＮＰＩ−２０で平衡化した。可溶性タンパク質を含む前記上清を、前記カラムにアプライし、続いて、ＮＰＩ−２０で洗浄した。前記結合タンパク質を、ＮＰＩ−２０から５０％ＮＰＩ−５００（１００ｍｌ）の直線勾配で溶出した。各画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その純度を解析した。好適な画分をプールし、ＳＵＭＯヒドロラーゼ切断バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、１．６×６０ｃｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に、流速１ｍｌ／分で、アプライした。
【０２２７】
切断反応は、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書にしたがって行った。切断後、前記タンパク質をＮｉ−アガロースカラム（５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。Ｈｉｓタグ化ＳＵＭＯヒドロラーゼおよびＨｉｓタグ化ＳＵＭＯは、前記カラムに結合し、正しい融合タンパク質（Ｈｉｓタグフリー）は、前記カラムを通過した。前記タンパク質の純度は、ｒｐＨＰＬＣ解析およびゲル電気泳動によって、証明した。前記三量体（ＴＮＦαを介する）が正しい分子量を有することは、分析用ＳＥＣ解析（１０／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて確認した。
【０２２８】
［実施例４］
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体のヒトＥＤ−Ｂに対する結合分析
【０２２９】
実施例４Ａ：濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
ユビキチンベースの変異体のヒトＥＤ−Ｂに対する結合を、濃度依存ＥＬＩＳＡによって分析した。精製タンパク質を、ヒトＥＤ−Ｂ、ＢＳＡおよび細胞フィブロネクチン（ｃＦＮ）でコーティングされた複数のＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに、量を増加させてアプライした。ウェルあたり抗原５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）でのコーティングを、４０℃で一晩行った。前記プレートを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４；ＰＢＳＴ）で洗浄した後、前記ウェルを、３７℃で２時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ ｐＨ７．４；３％ ＢＳＡ；０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてブロッキングした。前記ウェルを、ＰＢＳＴでさらに３回洗浄した。前記ウェルにおいて、異なる濃度の修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合タンパク質（５０μｌ量）を、室温で１時間インキュベートした（図１０、開始濃度として、５００ｎＭの１０４１−Ｄ１１タンパク質を使用した）。ＰＢＳＴで前記ウェルを洗浄した後、抗ユビキチンｆａｂフラグメント（ＡｂｙＤ）ＰＯＤコンジュゲートを、ＰＢＳＴに適切に希釈（例えば、１：２０００または１：６５００）して、アプライした。前記プレートを、ウェルあたり３００μｌのバッファーＰＢＳＴで、３回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）を各ウェルに加え、１５分間インキュベートした。ウェルあたり５０μｌの０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させ、前記ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＥＣＡＮ Ｓｕｎｒｉｓｅ ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを用いて読み取った。参照波長を６２０ｎｍとして、４５０ｎｍで吸光光度測定を行った。図１は、みかけＫＤ値１１ｎＭという、ＥＤ−Ｂに対する１Ｈ４の特異的結合を明瞭に示している。変異体５Ｅ１は、みかけＫＤ値７．７μＭ、４Ｂ１０は、みかけＫＤ値２８０ｎＭを、それぞれ示している。図１０は、変異体１０４１−Ｄ１１のＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性を示す（ＫＤ＝６．９ｎＭ）。このように、ユビキチン野生型のわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）により、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２３０】
実施例４Ｂ：競合的濃度依存ＥＬＩＳＡによる、修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
競合的濃度依存ＥＬＩＳＡにより、量が増加する遊離のターゲットの存在下、フィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９）を含む固定化ＥＤ−Ｂに対するユビキチン変異体１０４１−Ｄ１１の結合を分析した。ＥＬＩＳＡの条件は、１０４１−Ｄ１１タンパク質を、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）（０μＭ〜１０μＭ）、またはネガティブコントロール６７８９（０μＭ〜１０μＭ）で、１時間プレインキュベートし、その後、その混合物を、Ｍｅｄｉｓｏｒｐ−ｐｌａｔｅ上に配置したターゲット６７Ｂ８９に添加した以外は、実施例５Ａで述べたとおりである。これに続き、前記変異体を、対応する抗体によって検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ；希釈度１：６５００）。図１１は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂに対して非常に高い結合親和性を有することを示す（ＩＣ５０＝１４０ｎＭ）。図１０に示した結果が裏付けられている。すなわち、ユビキチン野生型のわずかな修飾（各単量体において８個の置換まで）のみにより、ＥＤ−Ｂに対する非常に高い結合親和性がもたらされる。
【０２３１】
実施例４Ｃ：結合活性の血清安定性を同時に分析する、濃度依存ＥＬＩＳＡによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当該技術分野における公知の方法により、前述（実施例５Ａおよび５Ｂ）と同様に、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９ともいう）を、マイクロタイタープレートにコーティングし、前記変異体を、ＥＤ−Ｂに結合させ、特異的ユビキチン抗体により検出した（抗ユビキチン−Ｆａｂ−ＰＯＤ）。この分析において、前記変異体は、異なる方法で処理した。すなわち、前記変異体を、３７℃で１時間、マウス血清中でインキュベートする処理（図１３参照、青丸部分）、前記変異体を、３７℃で１時間、ラット血清中でインキュベートする処理（図１３、赤丸部分）、または、前記変異体を、３７℃で１時間、ＰＢＳでインキュベートする処理（図１３、黒丸部分）である。図１３は、変異体１０４１−Ｄ１１の全てのＫＤが、１０．３ｎＭ（ＰＢＳ）から２０．７４ｎＭ（マウス血清）の間にあることを示す。
【０２３２】
実施例４Ｄ：Ｂｉａｃｏｒｅ分析による修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の結合分析
当業者に公知の方法を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に固定化したフィブロネクチンフラグメント（６７Ｂ８９という）を含むＥＤ−Ｂに対する結合について、前記変異体を異なる濃度で分析した（例えば、０〜２００ｎＭの変異体、好ましくは１０４１−Ｄ１１）。得られたデータは、ＢＩＡ評価ソフトウェアおよび１：１−Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｆｉｔｔｉｎｇにより処理した。図１２に示すように、変異体１０４１−Ｄ１１のＫＤは、１．０ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝７．６×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝７．７×１０−４ｓ−１であった。図１７Ｄに示すように、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαのＫＤは、１．１３ｎＭであった。結合速度定数は、ｋｏｎ＝４．５×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝５．０×１０−４ｓ−１であった。
【０２３３】
実施例４Ｅ：ＳＥ−ＨＰＬＣによる修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体の複合体構造の分析
複合体構造の分析のために、Ｔｒｉｃｏｒｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）（Ｖ＝３ｍｌ）を使用し、５０μｌのタンパク質をアプライした。さらなる条件は、バッファー：１×ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、流速：０．３ｍｌ／分、ラン：４５分（サンプルの注入：１５分後）とした。
【０２３４】
条件：０．７２ｎｍｏｌ １０４１−Ｄ１１タンパク質＋０．７２ｎｍｏｌ ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９またはネガティブコントロール６７８９ともいう）を、室温で１時間インキュベートし、複合体構造を分析するために、カラムにアプライした。図１４では、前記変異体のみを黒で示し、ターゲットＥＤ−Ｂのみを青で示し、ＥＤ−Ｂとの複合体を構成する変異体結合をピンクで示す。図１４Ａは、前記変異体を有するＥＤ−Ｂを示す。図１４Ｂは、ＥＤ−Ｂを有さない変異体を示す。同図は、変異体１０４１−Ｄ１１が、ＥＤ−Ｂ（６７Ｂ８９）と複合体を構築するが、６７８９とは複合体を構築しないことを示す。
【０２３５】
［実施例５］
ＴＮＦαの生物学的分析
【０２３６】
ＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体の生理学的ＴＮＦα活性を、Ｌ９２９アポトーシス分析によって決定した（Ｆｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８４ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ６８：１６７−１７５）。この分析では、ＴＮＦαが、ピコモル範囲のＥＣ５０値で、アクチノマイシンＤ感受性細胞の細胞死を効果的に促進する。細胞を、ＦＢＳと抗生物質を含む培地に再懸濁した。密度３．５×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液１００μｌを、９６ウェル標準細胞培養プレートのウェルに播き、加湿したＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベートした。その後、前記培養培地を除去し、ＦＢＳ、アクチノマイシンＤおよび抗生物質を含む培地５０μｌを各ウェルに加え、その後、さらに３０分間インキュベートした。その後、５０μｌのテスト項目と、１０−７から１０−１８Ｍの適切な濃度範囲のＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体またはヒト組換えＴＮＦαコントロールを添加した。さらに４８時間インキュベートした後、細胞生存の尺度である代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて決定した。
【０２３７】
１つのテスト項目あたり、少なくとも３通りの独立した実験を行い、各実験は３回行った。ＴＮＦα修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合タンパク質の各テストは、分析間のばらつきの情報を得るために、ヒト組換えＴＮＦαの投与量範囲のテストと並行させた。
【０２３８】
定量評価は、ＥＣ５０値、すなわち、半数の細胞の生存を促進するテスト項目濃度による値に基づく。
【表２】
ｍｕｂ：修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合
【０２３９】
修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合融合体の、１つのユビキチン単量体構築物（Ｗｕｂｉ）および３つのユビキチン二量体構築物のＴＮＦαを分析した。ＴＮＦα部分に結合した修飾ユビキチンベースのＥＤ−Ｂ結合変異体に依存して、ＴＮＦαに関連する活性は、約１桁分増加（ＳＰＷＦ−２８＿２４−Ｈ１２＿ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）または減少した（ＳＰＷＦ−２８＿２２−Ｄ１＿ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、Ｗｕｂｉ−Ｈｕｂｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）。変異体１０４１−Ｄ１１ ＴＮＦα分析は、図１７参照。
【０２４０】
［実施例６］
細胞培養分析におけるユビキチン変異体の結合分析
【０２４１】
培養細胞に対する前記変異体１０４１−Ｄ１１の結合をテストした。ＥＤ−Ｂが高発現レベルである正常ヒト胎児肺線維芽細胞（Ｗｉ３８細胞）、マウス胚性線維芽細胞株（Ｂａｌｂ ３Ｔ３）、マウス骨髄（ＳＴ−２）または単球／マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）由来のストローマ細胞株、ＮＨＤＦ細胞およびマウス線維芽細胞（ＬＭ）を含む、異なる培養細胞を分析した。
【０２４２】
前記変異体１０４１−Ｄ１１（異なる濃度）またはＥＤ−Ｂ特異的抗体（５００ｎＭ ＦＶ２８ ＣＨ４／Ｆ１ １×ＰＢＳ）を、Ｗｉ３８細胞（６００００細胞／ｍｌ、ＡＴＣＣ由来）とともにインキュベートし（１時間、３７℃）、その後、メタノールで固定化し（５分、−２０℃）、ブロッキングした（５％ウマ／ＰＢＳ、１時間）。その後、ｒａｂｂｉｔ−ａ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ−ＩｇＧ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 Ａ００８７５、１：５００）とともに１時間インキュベートし、ａ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ＊Ａｌｅｘａ４８８−ＡＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ａ１１００８、１：１０００）とともに１時間インキュベートした。核を、ＤＡＰＩで染色した。図１５Ａの１列目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールを示し、２列目は、５８．７ｎＭのタンパク質濃度での変異体のインキュベーションを示し、３列目は、１０倍高濃度（５８７ｎＭ）の１０４１−Ｄ１１タンパク質のインキュベーションを示し、４列目は、ＰＢＳでのネガティブコントロールである。１行目には、ヒトＷｉ３８線維芽細胞を位相差で示し、２行目には、免疫蛍光法を示し、３行目には、ＤＡＰＩ染色を示す。これらの写真から、前記変異体１０４１−Ｄ１１は、細胞外マトリックスに含まれるＥＤ−Ｂに対する高い特異性で、固定化Ｗｉ３８細胞に結合すると結論づけられる。ネガティブコントロール細胞型ＮＨＤＦは、ＥＤＢフィブロネクチンを低レベルで発現する主要な正常線維芽細胞である（データを示さず）。前記変異体は、それらの細胞に結合しない。
【０２４３】
図１５Ｂは、バイタル（ｖｉｔａｌ）Ｗｉ３８細胞での変異体１０４１−Ｄ１１の分析を示す。ネガティブコントロール細胞型ＮＨＤＦは、ＥＤＢフィブロネクチンを低レベルで発現する主要な正常線維芽細胞である。前記細胞を、チャンバースライドに播いた（ＮＵＮＣ、６０００細胞／ｍｌ）。結合能の分析のため、前記細胞を、−２０℃で５分間、１００％ＭｅＯＨで固定した。非特異的結合をブロックするために、前記細胞を、３７℃で１時間、５％ウマ血清でインキュベートした。前記細胞を、異なる濃度の前記変異体１０４１−Ｄ１１と、ポジティブコントロールであるＥＤ−Ｂ特異的抗体ＦＶ２８ ＣＨ４／Ｆ１またはネガティブコントロールであるＵＢ＿２とで、室温で１時間、テストした。ｒａｂｂｉｔ−ａ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ−ＩｇＧ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製 Ａ００８７５、１：５００）との１時間のインキュベーション、ａ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ＊ Ａｌｅｘａ４８８−ＡＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製 Ａ１１００８、１：１０００）との１時間のインキュベーションにより、機能を証明した（ｐｒｏｖｉｎｇ）。核を、ＤＡＰＩで染色した。図１５Ｂの１行目および３行目は、異なるタンパク質濃度の変異体およびネガティブコントロールを示す。２行目および４行目は、ＥＤＢ抗体を用いたコントロールのインキュベーションを示す。最初の２行は、Ｗｉ３８細胞株における前記変異体とポジティブコントロールを示す。３行目および４行目は、ＮＨＤＦ細胞のインキュベーションを示す。写真からわかるように、前記変異体１０４１−Ｄ１１は、細胞外マトリックスに含まれるＥＤ−Ｂに対する高い特異性で、バイタル（ｖｉｔａｌ）Ｗｉ３８細胞に結合することがわかる。低ＥＤＢを含まないＮＨＤＦ細胞を用いた対照試験を行った（データ示さず）。前記変異体は、それらの細胞に結合しない。
【０２４４】
異なる細胞タイプ、例えば、Ｂａｌｂ３Ｔ３（ＡＴＣＣ、Ｋａｔ−Ｎｒ．３０−２００２）、Ｒａｗ（Ｌｏｎｚａ社製、Ｋａｔ−Ｎｒ．ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）、ＳＴ−２（Ｌｏｎｚａ社製、Ｋａｔ−Ｎｒ．ＢＥ１２−１１５Ｆ／Ｕ１）を用いて、同様の実験を行った。図１５ＣおよびＤは、ＥＤ−Ｂの結合が、マウスＢａｌｂ３Ｔ３とＳＴ−２細胞に高い特異性であることを示す。単球／マクロファージ（Ｒａｗ）への結合は、見られなかった（データ示さず）。
【０２４５】
概要を前述したとおり、図１６Ａは、組織切片における１０４１−Ｄ１１の特異性を示す。７サンプルからのＦ９腫瘍組織を評価した。５００ｎＭ １０４１−Ｄ１１を用いた免疫組織化学から、マウス由来のＦ９腫瘍におけるＥＤ−Ｂ特異的血管が染色される結果が得られた。ＥＤ−Ｂは、腫瘍脈管構造に対する高い特異性のマーカーである。ターゲットタンパク質ＥＤＢは、血管の反管腔側に位置する。１０４１−Ｄ１１は、Ｆ９腫瘍由来の組織切片において、血管構造を特異的に装飾する。得られた結果は、抗体フラグメントＬ１９の組織特異性に匹敵する。さらに、４８組織をテストした。ＦＤＡ関連パネルにおいて、４８組織のいずれにも、非特異的染色は観察されなかった。図１６Ｂは、野生型ユビキチンと比較した、腫瘍細胞における１０４１−Ｄ１１の蓄積を示す。このように、ＥＤ−Ｂに特異的に結合する修飾ユビキチンベースの融合タンパク質は、癌に対するＥＤ−Ｂに基づくターゲット治療に好適である。
【０２４６】
［実施例７］
１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
【０２４７】
１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαの治療上の有効性を確立するために、化合物をマウスモデルのＦ９テラトーマ（Ｂｏｒｓｉ ｅｔ ａｌ．、２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２， ４３８４−４３９２参照）によりテストした。マウスにおけるＥＤ−Ｂ発現は、ｉｎ ｖｉｖｏの状態でヒトに匹敵し、癌に対する１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαの治療上の影響、好ましくはこれをメルファラン等の細胞傷害性化合物と併用した際の治療上の影響を、評価するのに適している。Ｆ９テラトーマは、高い血管密度を有する高悪性度の腫瘍である。Ｂｏｒｓｉ ｅｔ ａｌには、ＥＤＢ抗体を介するマウスＴＮＦαのターゲティングは、メルファランの有効性を向上させ、それは腫瘍の成長の遅延によって実証されていると記載されている。有効性研究のための実験計画は、Ｂｏｒｓｉ、２００３から採用した。
【０２４８】
ステージ１では、腫瘍と体重、体重減少および生存との割合に関係するエンドポイントについて、薬理的に活性かつ許容可能な投与量を明らかにした。本願発明者は、１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαが、最も高い投与量（６．７５ｐｍｏｌ／ｇ）で許容されるが、腫瘍の成長に対して抑制効果を有さず（３、４および８日後に体重の１０％を上回る→動物死亡）、一方、最も低投与量（０．２５ｐｍｏｌ／ｇ）の１０４１Ｄ１１−ＴＮＦαが、腫瘍の成長を遅らせるようであることを見出した。使用したさらに別の投薬グループでは、投与量２．２５ｐｍｏｌ／ｇ １０４１Ｄ１１−ＴＮＦαから、低下させた。
【０２４９】
研究のステージ２では、腫瘍成長の遅延をエンドポイントとするメルファランの投与量依存的な有効性を明らかにした（動物体重減少＞１０％、腫瘍＞体重の１０％、腫瘍の潰瘍化）。研究では、１０４１Ｄ１１／ｍＴＮＦαおよびマウスＴＮＦαについて、メルファランとの併用をテストした。１６８匹の動物を使用し、１４投薬グループ（グループあたり８匹のマウス、Ｆ９腫瘍の大きさが３００〜４００ｍｍ３の時点で採用）について、テストサンプルを静脈（ｉ．ｖ．）に投与し、２４時間後にメルファランを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。表１は、投薬スケジュールを示す。
【表３】
【０２５０】
図１８は、処置期間中（７日間）の相対的腫瘍成長を示す。図１８ａは、メルファランと併用した本発明の化合物１０４１−Ｄ１１−ＴＮＦαが、メルファランと併用したｍＴＮＦαまたはメルファラン単独よりも効果的に、相対的腫瘍成長を減少させることを明確に示す。処置後７日間の腫瘍成長速度は、１０４１−Ｄ１１−ｍＴＮＦαによる腫瘍の有意な減少を示す。これは、メルファランとの併用の有効性の明確な証拠である。
【０２５１】
刊行物
１． Ｂｉｒｃｈｌｅｒ， Ｍ．， Ｆ． Ｖｉｔｉ， Ｌ． Ｚａｒｄｉ， Ｂ． Ｓｐｉｅｓｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｎｅｒｉ． １９９９． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９８４−８．
２． Ｂｒｅｎｍｏｅｈｌ， Ｊ．， Ｍ． Ｌａｎｇ， Ｍ． Ｈａｕｓｍａｎｎ， Ｓ． Ｎ． Ｌｅｅｂ， Ｗ． Ｆａｌｋ， Ｊ． Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ， Ｍ． Ｇｏｋｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｒｏｇｌｅｒ． ２００７． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ ＥＤ−Ａ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ （ＣＤ） ｍｕｃｏｓａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ ２２：６１１−２３．
３． Ｄｕｂｉｎ， Ｄ．， Ｊ． Ｈ． Ｐｅｔｅｒｓ， Ｌ． Ｆ． Ｂｒｏｗｎ， Ｂ． Ｌｏｇａｎ， Ｋ． Ｃ． Ｋｅｎｔ， Ｂ． Ｂｅｒｓｅ， Ｓ． Ｂｅｒｖｅｎ， Ｂ． Ｃｅｒｃｅｋ， Ｂ． Ｇ． Ｓｈａｒｉｆｉ， Ｒ． Ｅ． Ｐｒａｔｔ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂａｌｌｏｏｎ ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １５：１９５８−６７．
４． Ｇｏｏｄｓｅｌｌ， Ｄ． Ｓ． ２００１． ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ： Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ６：５４７−５４８．
５． Ｋａｃｚｍａｒｅｋ， Ｊ．， Ｐ． Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ， Ｇ． Ｎｉｃｏｌｏ， Ｂ． Ｓｐｉｎａ， Ｇ． Ａｌｌｅｍａｎｎｉ， ａｎｄ Ｌ． Ｚａｒｄｉ． １９９４． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ， ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５９：１１−６．
６． Ｍｅｎｒａｄ， Ａ．， ａｎｄ Ｈ． Ｄ． Ｍｅｎｓｓｅｎ． ２００５． ＥＤ−Ｂ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ９：４９１−５００．
７． Ｐｕｊｕｇｕｅｔ， Ｐ．， Ａ． Ｈａｍｍａｎｎ， Ｍ． Ｍｏｕｔｅｔ， Ｊ． Ｌ． Ｓａｍｕｅｌ， Ｆ． Ｍａｒｔｉｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｒｔｉｎ． １９９６． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＥＤ−Ａ＋ ａｎｄ ＥＤ−Ｂ＋ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４８：５７９−９２．
８． Ｔｒａｃｈｓｅｌ， Ｅ．， Ｍ． Ｋａｓｐａｒ， Ｆ． Ｂｏｏｔｚ， Ｍ． Ｄｅｔｍａｒ， ａｎｄ Ｄ． Ｎｅｒｉ． ２００７． Ａ ｈｕｍａｎ ｍＡｂ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２７：８８１−６．
９． Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ， Ａ．， Ｈ． Ｊ． Ｂａｅｌｄｅ， Ｌ． Ｊ． Ｖｌｅｍｉｎｇ， Ｅ． ｄｅ Ｈｅｅｒ， ａｎｄ Ｊ． Ａ． Ｂｒｕｉｊｎ． ２００１． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９３：２５６−６２．
１０． Ｌｉｐｏｖｓｅｋ， Ｄ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００４）． Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０， ５１−６７．
１１． Ｏｈａｓｈｉ， Ｈ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ．， Ｙｉｎｇ， Ｂ．Ｗ．， ａｎｄ Ｕｅｄａ， Ｔ． （２００７）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３５２， ２７０−２７６．
１２． Ｓｔｕｄｉｅｒ， Ｆ．Ｗ． （２００５）． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４１， ２０７−２３４．
１３． Ｚａｈｎｄ， Ｃ．， Ａｍｓｔｕｔｚ， Ｐ．， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （２００７）． Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｔａｒｇｅｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４， ２６９−２７９．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能なタンパク質であって、
前記タンパク質は、２つの単量体ユビキチンユニットが、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含み、さらなる修飾、好ましくは、他のアミノ酸の置換を任意で含み、
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％および少なくとも９０％の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する前記タンパク質の特異的結合親和性がＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍであり、前記タンパク質が、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示す、
タンパク質。
【請求項２】
前記置換が、下記（１）または（２）を含む、請求項１記載のタンパク質。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＦおよびＴ６６Ｐの置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５ＷおよびＴ６６Ｅの置換、任意にさらにＱ２Ｒの置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓの置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位の置換、任意にさらに２位の置換
【請求項３】
さらに追加で１〜７個のアミノ酸が修飾され、
前記アミノ酸は、任意に、３６、４４、７０および７１位の１以上のアミノ酸から選択され、
さらに、任意に、６２、６３、および６４または７２、ならびに、７３または８位を追加した１以上のアミノ酸から選択される、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
ユビキチン単量体同士が、直接的に結合されるか、またはリンカーにより、
好ましくは、少なくともＧＩＧ配列またはＳＧＧＧＧ配列、好ましくは、ＳＧＧＧＧＩＧ配列またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列（配列番号３２）を有するリンカーにより結合される、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
薬学的活性成分または診断用成分と融合した、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号３３、３４もしくは４７のユビキチンヘテロ二量体を含む、
または、配列番号３３、３４もしくは４７の配列と少なくとも９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する、
請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記薬学的活性成分が、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、または酵素であり、
前記診断用活性成分が、蛍光化合物、光増感剤、または放射性核種である、
請求項５または６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記薬学的活性成分が、ＴＮＦαまたはその誘導体であり、
好ましくは、前記融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有し、
または、配列番号４７は、ＴＮＦαもしくはその誘導体と融合し、
または、前記融合タンパク質は、配列番号３５もしくは３６の配列、またはＴＮＦαもしくはその誘導体に融合した配列番号４７と、少なくとも９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する、
請求項５から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインと結合可能な、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、または、請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、それぞれ薬学的に効果的な量で含み、
１以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
さらに、１以上の化学療法剤を含み、
前記化学療法剤が、好ましくは、メルファラン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ダクチノマイシン、フルオロデオキシウラシル、シスプラチン、パクリタキセルおよびゲムシタビンから選択されるか、あるいはキナーゼ阻害剤群、または放射性医薬品から選択される、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
混合製剤の形態または複数の部品からなるキットの形態である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、または、請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、
請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、
請求項１４記載のベクター、
および／または請求項１２記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１５】
診断上許容される担体と、
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを含む、診断用組成物。
【請求項１６】
以下の工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
ａ）単量体ユビキチンタンパク質から生じる異なる修飾がなされた二量体ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つの修飾ユビキチン単量体を含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾
がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含む、前記工程
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
ｂ）潜在的なリガンドとして、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であり、
前記修飾二量体ユビキチンタンパク質は、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程
任意に、
ｅ）前記修飾二量体ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性で、単離する工程
【請求項１７】
前記異なる修飾がなされたタンパク質群が、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質をそれぞれコードする２つのＤＮＡライブラリーの遺伝的融合により得られる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を、薬学的活性成分または診断用成分と融合させる、請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
医学的治療方法または診断方法に使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、または請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリー。
【請求項２１】
請求項２０記載の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーであり、
各ライブラリーが、ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、
前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合され、
前記ライブラリーは、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする、融合ライブラリー。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載のＤＮＡライブラリーの発現により得られる、タンパク質ライブラリー。
【請求項１】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合可能なタンパク質であって、
前記タンパク質は、２つの単量体ユビキチンユニットが、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含み、さらなる修飾、好ましくは、他のアミノ酸の置換を任意で含み、
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
前記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％および少なくとも９０％の群から選択される少なくとも一つのアミノ酸同一性を有し、
前記フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する前記タンパク質の特異的結合親和性がＫｄ＝１０−７〜１０−１２Ｍであり、前記タンパク質が、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示す、
タンパク質。
【請求項２】
前記置換が、下記（１）または（２）を含む、請求項１記載のタンパク質。
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｗ、Ｌ８Ｗ、Ｋ６３Ｒ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＦおよびＴ６６Ｐの置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくともＫ６Ｔ、Ｌ８Ｑ、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｓ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５ＷおよびＴ６６Ｅの置換、任意にさらにＱ２Ｒの置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくともＱ２Ｔ、Ｆ４Ｗ、Ｋ６Ｈ、Ｑ６２Ｎ、Ｋ６３Ｆ、Ｅ６４Ｋ、Ｓ６５ＬおよびＴ６６Ｓの置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位の置換、任意にさらに２位の置換
【請求項３】
さらに追加で１〜７個のアミノ酸が修飾され、
前記アミノ酸は、任意に、３６、４４、７０および７１位の１以上のアミノ酸から選択され、
さらに、任意に、６２、６３、および６４または７２、ならびに、７３または８位を追加した１以上のアミノ酸から選択される、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
ユビキチン単量体同士が、直接的に結合されるか、またはリンカーにより、
好ましくは、少なくともＧＩＧ配列またはＳＧＧＧＧ配列、好ましくは、ＳＧＧＧＧＩＧ配列またはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ配列（配列番号３２）を有するリンカーにより結合される、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
薬学的活性成分または診断用成分と融合した、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号３３、３４もしくは４７のユビキチンヘテロ二量体を含む、
または、配列番号３３、３４もしくは４７の配列と少なくとも９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する、
請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記薬学的活性成分が、サイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物、または酵素であり、
前記診断用活性成分が、蛍光化合物、光増感剤、または放射性核種である、
請求項５または６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記薬学的活性成分が、ＴＮＦαまたはその誘導体であり、
好ましくは、前記融合タンパク質は、配列番号３５または３６の配列を有し、
または、配列番号４７は、ＴＮＦαもしくはその誘導体と融合し、
または、前記融合タンパク質は、配列番号３５もしくは３６の配列、またはＴＮＦαもしくはその誘導体に融合した配列番号４７と、少なくとも９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する、
請求項５から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインと結合可能な、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、または、請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、それぞれ薬学的に効果的な量で含み、
１以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
さらに、１以上の化学療法剤を含み、
前記化学療法剤が、好ましくは、メルファラン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ダクチノマイシン、フルオロデオキシウラシル、シスプラチン、パクリタキセルおよびゲムシタビンから選択されるか、あるいはキナーゼ阻害剤群、または放射性医薬品から選択される、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
混合製剤の形態または複数の部品からなるキットの形態である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、または、請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、
請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、
請求項１４記載のベクター、
および／または請求項１２記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１５】
診断上許容される担体と、
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質とを含む、診断用組成物。
【請求項１６】
以下の工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
ａ）単量体ユビキチンタンパク質から生じる異なる修飾がなされた二量体ユビキチンタンパク質群を提供する工程であり、
前記群が、互いにヘッドトゥテイル配置で結合された２つの修飾ユビキチン単量体を含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体タンパク質の各単量体は、配列番号１の２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６および６８位における、少なくとも６個のアミノ酸の置換により、異なる修飾
がなされ、
前記置換は、下記（１）または（２）を含む、前記工程
（１）第１単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
（２）第１単量体ユニットにおける、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、および、
第２単量体ユニットにおける少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５および６６位のアミノ酸の置換、任意にさらに２位のアミノ酸の置換
ｂ）潜在的なリガンドとして、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を提供する工程
ｃ）前記異なる修飾がなされたタンパク質群を、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と接触させる工程
ｄ）スクリーニング処理により、修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であり、
前記修飾二量体ユビキチンタンパク質は、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）と、Ｋｄ１０−７〜１０−１２Ｍの範囲の特異的結合親和性で結合し、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して、一価の結合活性を示すタンパク質である、前記工程
任意に、
ｅ）前記修飾二量体ユビキチンタンパク質を、前記結合親和性で、単離する工程
【請求項１７】
前記異なる修飾がなされたタンパク質群が、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質をそれぞれコードする２つのＤＮＡライブラリーの遺伝的融合により得られる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を、薬学的活性成分または診断用成分と融合させる、請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項１９】
医学的治療方法または診断方法に使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、または請求項５から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾単量体ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡを含むライブラリー。
【請求項２１】
請求項２０記載の２つのライブラリーの融合により得られるＤＮＡを含む融合ライブラリーであり、
各ライブラリーが、ヘテロ二量体ユビキチン融合タンパク質を得るために、異なる修飾がなされた単量体ユビキチンタンパク質ユニットをコードし、
前記単量体ユニットは、互いにヘッドトゥテイル配置で結合され、
前記ライブラリーは、前記フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して一価の結合活性を示すユビキチンのヘテロ二量体融合タンパク質をコードする、融合ライブラリー。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載のＤＮＡライブラリーの発現により得られる、タンパク質ライブラリー。
【図１】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図５Ａ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図５Ａ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１３】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ｆ】
【公表番号】特表２０１２−５２３２２７（Ｐ２０１２−５２３２２７Ａ）
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０４０３６（Ｐ２０１２−５０４０３６）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９６６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３２０８
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル プロテインズ ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ． ０１， Ｄ−０６１２０， Ｈａｌｌｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９６６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７３２０８
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１１３９８７０）シル プロテインズ ゲーエムベーハー (7)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｄａｍｅｒｏｗ−Ｓｔｒ． ０１， Ｄ−０６１２０， Ｈａｌｌｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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