フコキサンチン含有微細藻類培養物、及びその製造方法
【課題】効率的なフコキサンチンの製造方法を提供することである。
【解決手段】ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法。
【解決手段】ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類を培養することによるフコキサンチンの製造方法、及びフコキサンチン含有微細藻類培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコキサンチンは、非プロビタミンＡ類のカロテノイドの一種で、キサントフィルに属する成分である。近年、フコキサンチンについて、抗肥満・抗糖尿病作用、抗癌作用、生体内抗酸化作用、血管新生抑制作用、及び抗炎症作用などの機能が報告されている。
【０００３】
かかるフコキサンチンは、昆布やワカメなどの褐藻類、珪藻、黄金色藻、ラフィド藻、及びハプト藻に含まれることが知られている（非特許文献１）。しかしながら、昆布やワカメから抽出されるフコキサンチンの量は微量であり、フコキサンチンを製造するには、多量の藻類を調整する必要があった。
【０００４】
フコキサンチンを含有する微細藻類としては、珪藻、黄金色藻、ラフィド藻、及びハプト藻が知られている（非特許文献１）。また、珪藻に属する微細藻類であるファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、培養液の鉄濃度を高くすることによって、クロロフィルやフコキサンチン等の色素含有量が増加したことが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】千原光雄編 「バイオディバーシティ・シリーズ３ 藻類の多様性と系統」 裳華房発行 １９９９年
【非特許文献２】BioMetals 17: 45-52, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、昆布やワカメなどから微量にしか抽出されないフコキサンチンを、効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養することにより、効率的にフコキサンチンを製造することができることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のものに関する。
［１］ ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び
培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法。
［２］ 前記培養工程における培養が、通気されながら行われるものである［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記培養工程における培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記培養工程における培養が、通気されながら行われ、かつ培養工程の前半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供され、培養工程の後半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、［１］に記載の製造方法。
［５］ ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［７］ フコキサンチンを含有する、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を、通気しながら培養することにより得られる、培養物。
［８］ 前記培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる［７］に記載の培養物。
［９］ 前記培養が、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されたのち、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、［７］又は［８］に記載の培養物。
［１０］ ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である［７］〜［９］のいずれかに記載の培養物。
［１１］ タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である［７］〜［９］のいずれかに記載の培養物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、フコキサンチンを効率的に製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）ＡＰ０８０３２株の成長率に対する、通気培養の有無による影響を示すグラフである。図１上段のグラフＡの縦軸は、成長率を示す。図１中段のグラフＢの縦軸は、微細藻類の乾燥重量（ｇ ｄｒｙ ｗｔ）当りのフコキサンチン量（ｍｇ・ｇ−１）を示す。図１下段のグラフＣの縦軸は、成長率とフコキサンチン産生量との積を示す。図１のグラフの横軸において、「ａｉｒａｔｅｄ」は、通気培養にて生育させた群を、「ｎｏｔ ａｉｒａｔｅｄ」は、静置培養にて生育させた群を表す。図１のグラフの横軸において、「ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ」は、ＢＧ１１培地を使用して生育させた群を表す。
【図２】ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株の、成長率に対する、光強度の影響を示すグラフである。図２のグラフの横軸は、光強度（μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）を示し、縦軸は成長率を示す。
【図３】ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株の、フコキサンチン産生能及び成長率に対する、光強度の影響を示すグラフである。図３のグラフの横軸は、光強度（μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）を示し、左縦軸はフコキサンチン量（ｍｇ／ｇ）又はフコキサンチン量と成長率との積を示し、右縦軸は成長率を示す。図３中、黒四角はフコキサンチン量（ｍｇ／ｇ）を、白抜きのダイヤはフコキサンチン量と成長率との積を、灰色のダイヤは成長率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法に関する。
【００１２】
本発明に使用される微細藻類としては、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻が挙げられる。好ましい種に限定するならば、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）が挙げられる。
【００１３】
本発明の製造方法において、前記微細藻類の培養に使用される培地は、沿岸海藻を生育させるのに適した培地であれば、いずれも使用できる。かかる培地としては、Ｆ／２培地、ＢＧ１１培地などが挙げられる。中でもＦ／２培地がより適している。
【００１４】
前記微細藻類は、その培養を通気性の良くすることにより、微細藻類のフコキサンチン産生能をより高めることができる。通気性が高まる培養法としては、例えば、通気培養、振とう培養、攪拌培養、及び通気攪拌培養等が挙げられるが、その他当技術分野に公知の培養法を用いても良い。
【００１５】
光照射強度を弱く調節することにより、微細藻類のフコキサンチン産生能をより高めることができる。好ましい光照射強度は、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上であり、より好ましくは、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上である。なお、前記微細藻類は、光照射強度を弱くすることにより、その成長率は低くなる傾向にあるため、培養の前半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射にて行い、培養の後半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射にて行うことがより好ましい。なお、微細藻類の成長率は、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１までは光照射強度に比例して成長率は高まるが、光照射強度が５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の場合、その成長率は一定であることから、光照射強度の上限は、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１を限度にしてもよい。また、光照射強度が０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１（暗所）の場合、微細藻類の成長率はほとんど０になるため、光照射強度の下限は、０より大きい必要があり、少なくとも５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上であることが好ましい。
【００１６】
このようにして得られた微細藻類の培養物から、当技術分野に公知の抽出方法によりフコキサンチンを採取することができる。例えば、微細藻類をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出する方法や、フレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してから、有機溶媒によって抽出する方法などが適用できる。フコキサンチンは、その抽出後の溶媒を、ＨＰＬＣ等の公知の方法により分離することにより得ることができる。
【００１７】
また本発明は、前記微細藻類を用いるフコキサンチンの製造方法の過程において製造される、フコキサンチンを含有する、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻の培養物にも関する。
【実施例】
【００１８】
本発明を以下、具体的な実施例に基づいて説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
［実施例１］
微細藻類の培養
微細藻類培養用培地（Ｆ／２培地）を、以下のようにして作製した。９５０ｍＬの濾過滅菌された自然海水に、以下の表１に示す組成の各成分を加えた。その溶液を、濾過滅菌された自然海水で最終量１Ｌとし、オートクレーブ滅菌を行った。
【００２０】
【表１】
【００２１】
Ｆ／２培地に使用した微量金属溶液を、９５０ｍＬの蒸留水に、表２に示す組成の各成分を溶解し、蒸留水で最終量１Ｌとすることによって作製した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
Ｆ／２培地に使用したビタミン溶液を、９５０ｍＬの蒸留水に、表３に示す組成の各成分を溶解し、蒸留水で最終量１Ｌとすることによって作製した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
以下の表４に示す各微細藻類は、１００ｍＬ三角フラスコを培養器として、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて生育させた。
【００２６】
フコキサンチン量の分析
付着性株の場合にはピペッティングにてはがし、なるべく均一な細胞懸濁液にした。その細胞懸濁液２０ｍＬ中の藻体を、予め重量を測定しておいたWhatman社製 ＧＦ／Ｃグラスファイバー上に吸引濾過によって捕集し、７０℃一晩乾燥後、再度重量を測定し、その差と濾過量から、培養液当たりの乾燥重量Ａ（ｍｇ／ｍＬ ｃｕｌｔｕｒｅ）を求めた。また、残りの細胞懸濁液は、予め重量を測定しておいた５０ｍＬポリプロピレン遠心菅に移し、重量を再度測定して液量Ｂ（ｍＬ）を算出した後、遠心（１１，０００ｇ、１０分）によって細胞を収穫し、培地を捨て、アルミホイルに包み、−８０℃に保存した。収穫した細胞ペレットの乾燥重量換算量をＡ×Ｂで求め、収穫量（ｍｇ ｄｒｙ ｗｔ）とした。上で得られた細胞ペレットを適当量の９０％アセトン／水で再懸濁し、ガラス製目盛り付き試験管に移し、全量を２ｍＬに合わせた。その再懸濁液１ｍＬを、２ｍＬマイクロチューブに移し、約１ｍＬ相当のジルコニア／シリカビーズ（０．１ｍｍ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と混合し、氷冷した後、Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ ＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ製）を用いて破砕処理を行った。振動数は３０／ｓで、破砕条件は、２分破砕〜２分氷冷〜２分破砕とした。得られた抽出液数百μＬを濾過した後、バイアルに移し、分析に供した。ＨＰＬＣによるフコキサンチン分析は、以下のようにして行った。Ｗａｔｅｒ社のＨＰＬＣ（Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ付き）を使用し、カラムはＴＳＫ −ｇｅｌ ＯＤＳ −８０Ｔｓ ４．５×１５０ｍｍ、流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は、室温、ＨＰＬＣ移動相は（Ａ）メタノール：水＝（９５：５（ｖ／ｖ））、（Ｂ）メタノール：テトラヒドロフラン＝（７０：３０（ｖ／ｖ））で、０〜５分は（Ａ）、５．０〜１０．０分は（Ａ）から（Ｂ）にリニアグラジエントをして、１０．０〜１８．０分は（Ｂ）、１８．０〜１８．１分は（Ｂ）から（Ａ）にリニアグラジエントをして、１８．１〜２０．０分は（Ａ）を流した。モニタリングは４５０ｎｍで行った。
【００２７】
微細藻類中に含まれるフコキサンチンの同定は、標品のフコキサンチンと微細藻類中のフコキサンチンと思われるピークのリテンションタイム及びスペクトルを比較して行った。標品のフコキサンチンをＨＰＬＣで分析した結果、リテンションタイムは３．８分付近で、スペクトルは４４９．８ｎｍに吸収極大波長を持つ。微細藻類中に含まれる脂質はリテンションタイムが３．８〜３．９分付近、スペクトルは４４９．８ｎｍに吸収極大波長を持つスペクトルを示すピークが存在した。リテンションタイム及びスペクトルから判断して、このピークがフコキサンチンであると同定した。
【００２８】
以上の情報を元に、それぞれの微細藻類によるフコキサンチン産生量を調べた結果を、表４示す。フコキサンチン量は、微細藻類の乾燥重量（ｇ ｄｒｙ ｗｔ）当りの量（ｍｇ）である。
【００２９】
【表４】
【００３０】
各微細藻類の入手先を、以下の表に示す。また、以下の微細藻類以外の藻類は、オランダ沿岸の海域から採取したものであり、微細藻類の形態、色素等に基づき表４のように分類を行った。
【００３１】
【表５】
【００３２】
以上の結果より、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）が、他の微細藻類に比べて有意にフコキサンチンを産生する能力を有することが示された。
【００３３】
［実施例２］
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の培養
実施例１で用いたＦ／２培地を使用し、以下の表６に示す微細藻類を、１００ｍＬ三角フラスコを培養器として、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて生育させた。各微細藻類のフコキサンチン産生量の結果を、表６に示す。フコキサンチン産生量は、実施例１と同様の手法にて分析した。
【００３４】
【表６】
【００３５】
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）について、ＡＰ０８０３０以外の他の株においても同様に良好な結果が示された。
【００３６】
［実施例３］
培養条件の検討−１
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）ＡＰ０８０３２株を用いて、微細藻類の最適な培養条件を検討した。
【００３７】
各微細藻類を、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）、二酸化炭素雰囲気下で４〜５日間、通気培養にて生育させた群（図１中「ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）と、静置培養にて生育させた群（図１中「ｎｏｔ ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）とに分けて検討した。結果を、図１に示す。
【００３８】
図１上段のグラフＡより、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）ＡＰ０８０３２株のいずれの株においても、通気培養にて生育させることによって、より微細藻類の成長が向上することが分かる。なお、成長率は、下記の数式で示される値である。
成長率 ＝ ｌｎ（Nt / N0）/Δt
N0 （培養開始時の細胞数）、Nt （培養終了時の細胞数）
Δt （培養開始から終了までの培養時間）
【００３９】
図１中段のグラフＢより、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、及びタラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株は、通気培養にて生育させることによって、フコキサンチン産生量が増加することが分かる。また、成長率とフコキサンチン産生量との積を示す図１下段のグラフＣより、いずれの株においても、フコキサンチンを効率的に産生させるには、通気培養が最適であることが分かる。
【００４０】
また、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、真水でも生育することが知られているため、培地としてＦ／２培地ではなく、ＢＧ１１培地を用いる以外は、前述と同様の培養条件で（光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）で、４〜５日間培養）、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株を培養生育した。また、通気培養にて生育させた群（図１中「ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）と、静置培養にて生育させた群（図１中「ｎｏｔ ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）とに分けて検討した。結果を図１上段のグラフＡに示す。
【００４１】
ＢＧ１１培地は、以下のようにして作製した。９５０ｍＬの濾過滅菌された蒸留水に、以下の表７に示す組成の各成分を加えた。その溶液を、濾過滅菌された蒸留水で最終量１Ｌとし、オートクレーブ滅菌を行った後、１Ｎの塩酸溶液を用いｐＨを７．１に調整した。
【００４２】
【表７】
【００４３】
ＢＧ１１培地に使用した微量金属溶液Ａ５を、９５０ｍＬの蒸留水に、表８に示す組成の各成分を溶解し、蒸留水で最終量１Ｌとすることによって作製した。
【００４４】
【表８】
【００４５】
この結果から、培地としてＦ／２培地ではなくＢＧ１１培地を用いた場合は、通気培養の方がフコキサンチン産生量が多いものの、成長率、及び成長率とフコキサンチン産生量との積の結果は、通気培養した場合と静置培養を行った場合とで有意な差はなかった。
【００４６】
[実施例４]
培養条件の検討−２
微細藻類の成長率は、全体的なフコキサンチン産生にも影響するため、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株を用いて、微細藻類の成長に最適な光照射強度の条件を検討した。
微細藻類を、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて、様々な光照射強度で生育させた。結果を、図２に示す。
図２より、微細藻類の成長率は、光照射強度が強いほど高いことが分かる。
【００４７】
［実施例５］
培養条件の検討−３
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株を用いて、微細藻類のフコキサンチン産生能において最適な光照射強度の条件を検討した。
微細藻類を、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて、光照射強度を、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１、又は７５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で生育させ、検討した。結果を、図３に示す。
【００４８】
図３より、微細藻類のフコキサンチン産生能は光照射強度が弱いほど高く、微細藻類の成長度は、光照射強度が強いほど高いことが分かる。フコキサンチン量と成長率との積の結果より、フコキサンチン産生量は、成長率も大きく影響するため、微細藻類乾燥重量当りのフコキサンチン産生量は、光照射強度が強いほど高いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のフコキサンチンの製造方法は、効率的にフコキサンチンを製造することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類を培養することによるフコキサンチンの製造方法、及びフコキサンチン含有微細藻類培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコキサンチンは、非プロビタミンＡ類のカロテノイドの一種で、キサントフィルに属する成分である。近年、フコキサンチンについて、抗肥満・抗糖尿病作用、抗癌作用、生体内抗酸化作用、血管新生抑制作用、及び抗炎症作用などの機能が報告されている。
【０００３】
かかるフコキサンチンは、昆布やワカメなどの褐藻類、珪藻、黄金色藻、ラフィド藻、及びハプト藻に含まれることが知られている（非特許文献１）。しかしながら、昆布やワカメから抽出されるフコキサンチンの量は微量であり、フコキサンチンを製造するには、多量の藻類を調整する必要があった。
【０００４】
フコキサンチンを含有する微細藻類としては、珪藻、黄金色藻、ラフィド藻、及びハプト藻が知られている（非特許文献１）。また、珪藻に属する微細藻類であるファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、培養液の鉄濃度を高くすることによって、クロロフィルやフコキサンチン等の色素含有量が増加したことが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】千原光雄編 「バイオディバーシティ・シリーズ３ 藻類の多様性と系統」 裳華房発行 １９９９年
【非特許文献２】BioMetals 17: 45-52, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、昆布やワカメなどから微量にしか抽出されないフコキサンチンを、効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養することにより、効率的にフコキサンチンを製造することができることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のものに関する。
［１］ ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び
培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法。
［２］ 前記培養工程における培養が、通気されながら行われるものである［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記培養工程における培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記培養工程における培養が、通気されながら行われ、かつ培養工程の前半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供され、培養工程の後半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、［１］に記載の製造方法。
［５］ ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［７］ フコキサンチンを含有する、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を、通気しながら培養することにより得られる、培養物。
［８］ 前記培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる［７］に記載の培養物。
［９］ 前記培養が、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されたのち、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、［７］又は［８］に記載の培養物。
［１０］ ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である［７］〜［９］のいずれかに記載の培養物。
［１１］ タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である［７］〜［９］のいずれかに記載の培養物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、フコキサンチンを効率的に製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）ＡＰ０８０３２株の成長率に対する、通気培養の有無による影響を示すグラフである。図１上段のグラフＡの縦軸は、成長率を示す。図１中段のグラフＢの縦軸は、微細藻類の乾燥重量（ｇ ｄｒｙ ｗｔ）当りのフコキサンチン量（ｍｇ・ｇ−１）を示す。図１下段のグラフＣの縦軸は、成長率とフコキサンチン産生量との積を示す。図１のグラフの横軸において、「ａｉｒａｔｅｄ」は、通気培養にて生育させた群を、「ｎｏｔ ａｉｒａｔｅｄ」は、静置培養にて生育させた群を表す。図１のグラフの横軸において、「ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ」は、ＢＧ１１培地を使用して生育させた群を表す。
【図２】ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株の、成長率に対する、光強度の影響を示すグラフである。図２のグラフの横軸は、光強度（μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）を示し、縦軸は成長率を示す。
【図３】ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株の、フコキサンチン産生能及び成長率に対する、光強度の影響を示すグラフである。図３のグラフの横軸は、光強度（μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）を示し、左縦軸はフコキサンチン量（ｍｇ／ｇ）又はフコキサンチン量と成長率との積を示し、右縦軸は成長率を示す。図３中、黒四角はフコキサンチン量（ｍｇ／ｇ）を、白抜きのダイヤはフコキサンチン量と成長率との積を、灰色のダイヤは成長率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法に関する。
【００１２】
本発明に使用される微細藻類としては、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻が挙げられる。好ましい種に限定するならば、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）が挙げられる。
【００１３】
本発明の製造方法において、前記微細藻類の培養に使用される培地は、沿岸海藻を生育させるのに適した培地であれば、いずれも使用できる。かかる培地としては、Ｆ／２培地、ＢＧ１１培地などが挙げられる。中でもＦ／２培地がより適している。
【００１４】
前記微細藻類は、その培養を通気性の良くすることにより、微細藻類のフコキサンチン産生能をより高めることができる。通気性が高まる培養法としては、例えば、通気培養、振とう培養、攪拌培養、及び通気攪拌培養等が挙げられるが、その他当技術分野に公知の培養法を用いても良い。
【００１５】
光照射強度を弱く調節することにより、微細藻類のフコキサンチン産生能をより高めることができる。好ましい光照射強度は、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上であり、より好ましくは、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上である。なお、前記微細藻類は、光照射強度を弱くすることにより、その成長率は低くなる傾向にあるため、培養の前半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射にて行い、培養の後半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射にて行うことがより好ましい。なお、微細藻類の成長率は、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１までは光照射強度に比例して成長率は高まるが、光照射強度が５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の場合、その成長率は一定であることから、光照射強度の上限は、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１を限度にしてもよい。また、光照射強度が０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１（暗所）の場合、微細藻類の成長率はほとんど０になるため、光照射強度の下限は、０より大きい必要があり、少なくとも５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上であることが好ましい。
【００１６】
このようにして得られた微細藻類の培養物から、当技術分野に公知の抽出方法によりフコキサンチンを採取することができる。例えば、微細藻類をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出する方法や、フレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してから、有機溶媒によって抽出する方法などが適用できる。フコキサンチンは、その抽出後の溶媒を、ＨＰＬＣ等の公知の方法により分離することにより得ることができる。
【００１７】
また本発明は、前記微細藻類を用いるフコキサンチンの製造方法の過程において製造される、フコキサンチンを含有する、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻の培養物にも関する。
【実施例】
【００１８】
本発明を以下、具体的な実施例に基づいて説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
［実施例１］
微細藻類の培養
微細藻類培養用培地（Ｆ／２培地）を、以下のようにして作製した。９５０ｍＬの濾過滅菌された自然海水に、以下の表１に示す組成の各成分を加えた。その溶液を、濾過滅菌された自然海水で最終量１Ｌとし、オートクレーブ滅菌を行った。
【００２０】
【表１】
【００２１】
Ｆ／２培地に使用した微量金属溶液を、９５０ｍＬの蒸留水に、表２に示す組成の各成分を溶解し、蒸留水で最終量１Ｌとすることによって作製した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
Ｆ／２培地に使用したビタミン溶液を、９５０ｍＬの蒸留水に、表３に示す組成の各成分を溶解し、蒸留水で最終量１Ｌとすることによって作製した。
【００２４】
【表３】
【００２５】
以下の表４に示す各微細藻類は、１００ｍＬ三角フラスコを培養器として、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて生育させた。
【００２６】
フコキサンチン量の分析
付着性株の場合にはピペッティングにてはがし、なるべく均一な細胞懸濁液にした。その細胞懸濁液２０ｍＬ中の藻体を、予め重量を測定しておいたWhatman社製 ＧＦ／Ｃグラスファイバー上に吸引濾過によって捕集し、７０℃一晩乾燥後、再度重量を測定し、その差と濾過量から、培養液当たりの乾燥重量Ａ（ｍｇ／ｍＬ ｃｕｌｔｕｒｅ）を求めた。また、残りの細胞懸濁液は、予め重量を測定しておいた５０ｍＬポリプロピレン遠心菅に移し、重量を再度測定して液量Ｂ（ｍＬ）を算出した後、遠心（１１，０００ｇ、１０分）によって細胞を収穫し、培地を捨て、アルミホイルに包み、−８０℃に保存した。収穫した細胞ペレットの乾燥重量換算量をＡ×Ｂで求め、収穫量（ｍｇ ｄｒｙ ｗｔ）とした。上で得られた細胞ペレットを適当量の９０％アセトン／水で再懸濁し、ガラス製目盛り付き試験管に移し、全量を２ｍＬに合わせた。その再懸濁液１ｍＬを、２ｍＬマイクロチューブに移し、約１ｍＬ相当のジルコニア／シリカビーズ（０．１ｍｍ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）と混合し、氷冷した後、Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ ＭＭ３００（Ｒｅｔｓｃｈ製）を用いて破砕処理を行った。振動数は３０／ｓで、破砕条件は、２分破砕〜２分氷冷〜２分破砕とした。得られた抽出液数百μＬを濾過した後、バイアルに移し、分析に供した。ＨＰＬＣによるフコキサンチン分析は、以下のようにして行った。Ｗａｔｅｒ社のＨＰＬＣ（Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ付き）を使用し、カラムはＴＳＫ −ｇｅｌ ＯＤＳ −８０Ｔｓ ４．５×１５０ｍｍ、流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は、室温、ＨＰＬＣ移動相は（Ａ）メタノール：水＝（９５：５（ｖ／ｖ））、（Ｂ）メタノール：テトラヒドロフラン＝（７０：３０（ｖ／ｖ））で、０〜５分は（Ａ）、５．０〜１０．０分は（Ａ）から（Ｂ）にリニアグラジエントをして、１０．０〜１８．０分は（Ｂ）、１８．０〜１８．１分は（Ｂ）から（Ａ）にリニアグラジエントをして、１８．１〜２０．０分は（Ａ）を流した。モニタリングは４５０ｎｍで行った。
【００２７】
微細藻類中に含まれるフコキサンチンの同定は、標品のフコキサンチンと微細藻類中のフコキサンチンと思われるピークのリテンションタイム及びスペクトルを比較して行った。標品のフコキサンチンをＨＰＬＣで分析した結果、リテンションタイムは３．８分付近で、スペクトルは４４９．８ｎｍに吸収極大波長を持つ。微細藻類中に含まれる脂質はリテンションタイムが３．８〜３．９分付近、スペクトルは４４９．８ｎｍに吸収極大波長を持つスペクトルを示すピークが存在した。リテンションタイム及びスペクトルから判断して、このピークがフコキサンチンであると同定した。
【００２８】
以上の情報を元に、それぞれの微細藻類によるフコキサンチン産生量を調べた結果を、表４示す。フコキサンチン量は、微細藻類の乾燥重量（ｇ ｄｒｙ ｗｔ）当りの量（ｍｇ）である。
【００２９】
【表４】
【００３０】
各微細藻類の入手先を、以下の表に示す。また、以下の微細藻類以外の藻類は、オランダ沿岸の海域から採取したものであり、微細藻類の形態、色素等に基づき表４のように分類を行った。
【００３１】
【表５】
【００３２】
以上の結果より、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）が、他の微細藻類に比べて有意にフコキサンチンを産生する能力を有することが示された。
【００３３】
［実施例２］
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の培養
実施例１で用いたＦ／２培地を使用し、以下の表６に示す微細藻類を、１００ｍＬ三角フラスコを培養器として、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて生育させた。各微細藻類のフコキサンチン産生量の結果を、表６に示す。フコキサンチン産生量は、実施例１と同様の手法にて分析した。
【００３４】
【表６】
【００３５】
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）について、ＡＰ０８０３０以外の他の株においても同様に良好な結果が示された。
【００３６】
［実施例３］
培養条件の検討−１
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）ＡＰ０８０３２株を用いて、微細藻類の最適な培養条件を検討した。
【００３７】
各微細藻類を、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）、二酸化炭素雰囲気下で４〜５日間、通気培養にて生育させた群（図１中「ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）と、静置培養にて生育させた群（図１中「ｎｏｔ ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）とに分けて検討した。結果を、図１に示す。
【００３８】
図１上段のグラフＡより、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株、及びイソクリシス ｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）ＡＰ０８０３２株のいずれの株においても、通気培養にて生育させることによって、より微細藻類の成長が向上することが分かる。なお、成長率は、下記の数式で示される値である。
成長率 ＝ ｌｎ（Nt / N0）/Δt
N0 （培養開始時の細胞数）、Nt （培養終了時の細胞数）
Δt （培養開始から終了までの培養時間）
【００３９】
図１中段のグラフＢより、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株、及びタラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）ＡＰ０８０３１株は、通気培養にて生育させることによって、フコキサンチン産生量が増加することが分かる。また、成長率とフコキサンチン産生量との積を示す図１下段のグラフＣより、いずれの株においても、フコキサンチンを効率的に産生させるには、通気培養が最適であることが分かる。
【００４０】
また、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、真水でも生育することが知られているため、培地としてＦ／２培地ではなく、ＢＧ１１培地を用いる以外は、前述と同様の培養条件で（光照射強度１０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で、１８℃（室温）で、４〜５日間培養）、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株を培養生育した。また、通気培養にて生育させた群（図１中「ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）と、静置培養にて生育させた群（図１中「ｎｏｔ ａｉｒａｔｅｄ」と示されるグラフ）とに分けて検討した。結果を図１上段のグラフＡに示す。
【００４１】
ＢＧ１１培地は、以下のようにして作製した。９５０ｍＬの濾過滅菌された蒸留水に、以下の表７に示す組成の各成分を加えた。その溶液を、濾過滅菌された蒸留水で最終量１Ｌとし、オートクレーブ滅菌を行った後、１Ｎの塩酸溶液を用いｐＨを７．１に調整した。
【００４２】
【表７】
【００４３】
ＢＧ１１培地に使用した微量金属溶液Ａ５を、９５０ｍＬの蒸留水に、表８に示す組成の各成分を溶解し、蒸留水で最終量１Ｌとすることによって作製した。
【００４４】
【表８】
【００４５】
この結果から、培地としてＦ／２培地ではなくＢＧ１１培地を用いた場合は、通気培養の方がフコキサンチン産生量が多いものの、成長率、及び成長率とフコキサンチン産生量との積の結果は、通気培養した場合と静置培養を行った場合とで有意な差はなかった。
【００４６】
[実施例４]
培養条件の検討−２
微細藻類の成長率は、全体的なフコキサンチン産生にも影響するため、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株を用いて、微細藻類の成長に最適な光照射強度の条件を検討した。
微細藻類を、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて、様々な光照射強度で生育させた。結果を、図２に示す。
図２より、微細藻類の成長率は、光照射強度が強いほど高いことが分かる。
【００４７】
［実施例５］
培養条件の検討−３
ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）ＡＰ０８０３０株を用いて、微細藻類のフコキサンチン産生能において最適な光照射強度の条件を検討した。
微細藻類を、５０ｍＬのＦ／２培地に播種し、１８℃（室温）で４〜５日間、通気培養にて、光照射強度を、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１、又は７５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１で生育させ、検討した。結果を、図３に示す。
【００４８】
図３より、微細藻類のフコキサンチン産生能は光照射強度が弱いほど高く、微細藻類の成長度は、光照射強度が強いほど高いことが分かる。フコキサンチン量と成長率との積の結果より、フコキサンチン産生量は、成長率も大きく影響するため、微細藻類乾燥重量当りのフコキサンチン産生量は、光照射強度が強いほど高いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のフコキサンチンの製造方法は、効率的にフコキサンチンを製造することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び
培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法。
【請求項２】
前記培養工程における培養が、通気されながら行われるものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養工程における培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記培養工程における培養が、通気されながら行われ、かつ培養工程の前半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供され、培養工程の後半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
フコキサンチンを含有する、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を、通気しながら培養することにより得られる、培養物。
【請求項８】
前記培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる請求項７に記載の培養物。
【請求項９】
前記培養が、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されたのち、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、請求項７又は８に記載の培養物。
【請求項１０】
ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である請求項７〜９のいずれかに記載の培養物。
【請求項１１】
タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である請求項７〜９のいずれかに記載の培養物。
【請求項１】
ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を培養する工程、及び
培養物からフコキサンチンを採取する工程を含む、フコキサンチンの製造方法。
【請求項２】
前記培養工程における培養が、通気されながら行われるものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養工程における培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記培養工程における培養が、通気されながら行われ、かつ培養工程の前半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供され、培養工程の後半を５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
フコキサンチンを含有する、ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻、又はイソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）に属する単細胞ハプト藻を、通気しながら培養することにより得られる、培養物。
【請求項８】
前記培養が、２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されて行われる請求項７に記載の培養物。
【請求項９】
前記培養が、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以上の光照射に供されたのち、５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１以下の光照射に供されて行われる、請求項７又は８に記載の培養物。
【請求項１０】
ファエオダクチルム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）に属する単細胞珪藻が、ファエオダクチルム トリコニウタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）である請求項７〜９のいずれかに記載の培養物。
【請求項１１】
タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）に属する単細胞珪藻が、タラシオシーラ シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）である請求項７〜９のいずれかに記載の培養物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２３３５１７（Ｐ２０１０−２３３５１７Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８６０６１（Ｐ２００９−８６０６１）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００３００１）帝人株式会社 (1,209)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００３００１）帝人株式会社 (1,209)
【Ｆターム（参考）】
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