プレニルフラバノン化合物およびその使用
【課題】癌及び多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変成疾患を治療するためのHDAC阻害剤の提供。
【解決手段】プロポリスから単離される5,7,3’,4’−テトラヒドロキシ−6−ファルネシルフラボン(“プロポリンI”と称される)と、5,7,4’−トリヒドロキシ−6−ゲラニルフラボン(“プロポリンJ”と称される)。
【解決手段】プロポリスから単離される5,7,3’,4’−テトラヒドロキシ−6−ファルネシルフラボン(“プロポリンI”と称される)と、5,7,4’−トリヒドロキシ−6−ゲラニルフラボン(“プロポリンJ”と称される)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の背景
本発明は、新規プレニルフラバノン化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロポリスは、木の芽、フルーツ、樹液または他の植物源から蜜蜂が集める樹脂性混合物である。それは様々な活性成分を含み、抗腫瘍活性(3)、抗酸化活性(4)、抗細菌活性(5)、抗ウイルス活性(6)、抗真菌活性(7)、および抗炎症活性(8)を含む広範囲の生物学的活性を示すことが報告されている。異なる地域由来のプロポリスは、異なる活性成分を含み得る。
【0003】
本発明者らは、下記の式1から8によりそれぞれ示される台湾製プロポリスから単離された8種のプレニルフラバノンを以前報告した。
【化1】
【化2】
【0004】
【化3】
【0005】
これらのプロポリスは、抗癌活性(10−15)、抗酸化活性(10−16)および抗菌活性(16)を含む、広範囲の生物学的活性を示すことが報告されている。加えて、最近の研究により、沖縄製プロポリスが台湾製プロポリスと同じ活性成分を含むことが証明された(17−18)。
【0006】
ヒストン脱アセチラーゼ(HDAC)は、ヒストンのN末端においてリシンアミノ酸残基のε−アミノ基の脱アセチル化を触媒する酵素である。あるHDAC阻害剤は、前臨床および臨床段階の異なるタイプの癌を有する患者に対して治療的効果を有することが発見および証明されている(19−21)。HDAC阻害剤の抗癌機構の現在のモデルによると、該阻害剤は、コアヒストンの高アセチル化をもたらし、故に、クロマチン再構築を誘発し、腫瘍抑制遺伝子のようなサイレント遺伝子を発現させ、その結果、腫瘍細胞増殖の阻害をもたらす(26−27)。
【0007】
多機能性プロポリス由来の新規化合物の発見およびそれらの有用な生理的活性の評価が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
文献
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【発明の概要】
【0009】
発明の簡単な概要
一局面において、本発明は、
【化4】
からなる群から選択される式により示される、新規プレニルフラバノン化合物を提供する。
【0010】
別の局面において、本発明は、上記のプレニルフラバノン化合物の少なくとも1個を含む医薬組成物を提供する。
【0011】
さらに別の局面において、本発明は、疾患または状態を処置する方法またはそれを必要とする対象に所望の効果を与える方法であって、少なくとも1個の上記の化合物または上記の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0012】
発明の詳細な説明
他に特に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術および科学用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
【0013】
一局面において、本発明は、台湾製プロポリスから単離されたプレニルフラバノン化合物を提供する。
【0014】
該プレニルフラバノン化合物の一態様は、下記の式:
【化5】
で示される、5,7,3’,4’−テトラヒドロキシ−6−ファルネシルフラボン(“プロポリンI”と称される)である。
【0015】
式Iの化合物は、分子式C30H36O6および分子量492.25Daを有する。
【0016】
プレニルフラバノン化合物の別の態様は、下記の式:
【化6】
で示される、5,7,4’−トリヒドロキシ−6−ゲラニルフラボン(“プロポリンJ”と称される)である。
【0017】
式IIの化合物は、式C25H28O5および分子量408.19Daを有する。
【0018】
上記の本発明のプレニルフラバノン化合物は、HDAC酵素活性および癌細胞、好ましくは乳癌細胞の増殖に対して阻害効果を有する。
【0019】
従って、別の局面において、本発明は、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、HDAC阻害剤としての医薬組成物を提供する。
【0020】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の化合物の少なくとの1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、癌細胞増殖を阻止するための医薬組成物を提供する。
【0021】
本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置のための医薬組成物を提供する。
【0022】
さらに、公知のHDAC阻害剤の多くは、HDAC阻害剤が神経変性疾患の処置に有用であることを示す、神経保護効果(30,31)を有することが証明されている。神経変性疾患の例は、多発性硬化症(MS)(32)、ハンチントン病(HD)(33,39,40)、脊髄性筋萎縮症(SMA)(34,35,36)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)(37)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)(38)であるが、これらに限定されない。
【0023】
従って、本発明は、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、神経保護効果を有する医薬組成物に関する。
【0024】
本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、神経変性疾患を処置するための医薬組成物に関する。好ましくは、該神経変性疾患は、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、または筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。
【0025】
本発明の組成物の製造において、活性成分としての本発明の化合物は通常、賦形剤を用いて希釈されるか、またはカプセル剤、カシェ剤(sachet)、ペーパーまたは他の容器の形態であり得る担体中に入れられる。用いる賦形剤は、典型的に、ヒト対象または他の哺乳動物への投与に適する賦形剤である。適する賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン類、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸類、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、およびメチルセルロースが含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、錠剤、ピル、粉末、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル(固体として、または液体媒体中)、軟膏、カプセル、または滅菌包装粉末の形態であり得る。
【0026】
該組成物は、ヒト、サル、イヌなどを含む対象に、例えば経口投与により投与され得るか、または注射製剤の形態で非経腸投与により投与され得る。典型的には、本発明の組成物は、約125ないし約250mgの本発明の化合物(プロポリンIもしくはJ、または両方)を含む。成人への投与量は、好ましくは1日当たり約500ないし約1000mgであり、それは単一用量または分割用量の形態で投与され得る。
【0027】
別の局面において、本発明は、疾患または状態を処置する方法またはそれを必要とする対象に所望の効果を与える方法であって、少なくとも1個の上記の化合物または上記の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0028】
本明細書に記載の本発明の処置を必要とする対象には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。非ヒト哺乳動物は、ネコ、イヌなどのペット動物およびウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜動物が含まれるが、これらに限定されない。
【0029】
特に、上記の本発明の方法は、対象における癌細胞増殖の阻止に有用である。とりわけ、本発明の方法は、対象における乳癌細胞増殖の阻止に有用である。
【0030】
加えて、本発明の方法は、ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置に有用である。さらに、本発明の方法は、対象において神経保護効果を供し得る。
【0031】
さらに、本発明の方法は、対象における神経変性疾患の処置に有用である。具体的には、該神経変性疾患は、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される。
【0032】
本発明は、本明細書中、限定ではなく説明を目的として提供される下記の態様を参照してより具体的に記載され得る。
【図面の簡単な説明】
【0033】
多角的な図面の簡単な説明
上記の発明の概要、ならびに上記の本発明の詳細な説明は、添付の図面を併用して読むとき、より理解され得る。本発明の説明を目的として、現在好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、示した好ましい態様に限定されないことが理解されるべきである。
【0034】
【図1】図1は、プロポリンIのHとCの重要なHMBC相関を示す。
【図2】図2は、プロポリンJのHとCの重要なHMBC相関を示す。
【図3】図3は、実施例2の逆相分取HPLCのピークを示す。
【図4A】図4Aは、種々の濃度の異なるプロポリンで24時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4B】図4Bは、種々の濃度の異なるプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4C】図4Cは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4D】図4Dは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)および(c)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;そして(d)および(e)は、それぞれ5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(f)および(g)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4E】図4Eは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の数を示す。
【図5A】図5Aは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞についてのフローサイトメトリー分析の結果を示し、ここで、(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図5B】図5Bは、様々な濃度の異なるプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞についてのフローサイロメトリー分析の結果を示し、ここで、(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図5C】図5Cは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMDA−MB−231細胞についてのフローサイロメトリー分析の結果を示し、ここで、(a)は、対照処理であり;(b)および(c)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;そして(d)および(e)は、それぞれ5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(f)および(g)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図6A】図6Aは、実施例6の免疫細胞化学実験の結果を示す。
【図6B】図6Bは、実施例6のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【実施例】
【0035】
実施例1:一次抽出
200gのTW−I等級の台湾製プロポリス(hives located in Tainan, Taiwanから入手)(29)を、低温で撹拌により均質化した。その後、均質化したサンプルを1.0Lの脱イオン水で3回洗浄し、残渣を95%エタノールで3回抽出した。濾過したエタノール抽出物を減圧下で蒸発乾固し、褐色粉末(135.6g)を得て、それをさらなる精製まで−20℃で貯蔵した。
【0036】
実施例2:化合物の単離および精製
エタノール抽出物から得られた褐色粉末をメタノール中に溶解し、Sephadex LH−20カラム(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)に適用して溶出溶媒として95%エタノールを用いた。再クロマトグラフィーにより得られた画分を含む全ての溶出物を、ヒト乳癌増殖に対するそれらの効果について分析し、活性画分を、Sephadex LH−20カラムのクロマトグラフィーにより95%エタノールを溶出剤として用いて再び分離した。次に、該活性画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Kiesel gel 60, E. Merck, Darmstadt 1, Germany)に付してn−ヘキサン/EtOAc溶媒系を用いた。
【0037】
最も活性な画分の精製を、逆相分取HPLC(n−ヘキサン/EtOAc、30:70)により行った。実験条件は、下記の通りであった:カラムは、Luna Phenomenex (C18、250×4.6mm)であり;溶媒系は、メタノール/水(8:2)であり;流速は、1mL/分であり;そして、検出は、UV280nmで行った。保持時間19.0分(プロポリンI)および10.5分(プロポリンJ)の画分を集め、それによりプロポリンI(淡黄色粉末)およびプロポリンJ(淡黄色液体)をそれぞれ単離した。図3は、逆相分取HPLCのピークを示す。
【0038】
実施例3:プロポリンIおよびプロポリンJの同定
プロポリンIおよびJそれぞれの構造を、下記の装置:参照基準として溶媒ピーク(MeOH−d3)を用いて、Perkin Elmer 1760−X IR−FT分光計;日立 150−20 UV;Jasco J−710 分光偏光計;Finnigan MAT−95XL質量分光計(EI);および、Bruker AV−500 分光計、を用いて分析した。
【0039】
プロポリンI
プロポリンIの物理化学的データを下記に示す:
[□]20D+3.8(c 0.26、CH3OH);IR νmax(フィルム)3747、3390、2923、1636cm−1;UV(EtOH)λmax nm(logε)207.0(1.65)、291(0.73);CD(MeOH)347nm(Δε+3.19)、294nm(Δε−3.98);HREIMS m/z492.2512(C30H36O6の計算値492.2512);1Hおよび13C NMR。
【0040】
1H NMRスペクトルから、4個のオレフィンメチル基(δH 1.52、1.56、1.63、1.74)、8個のメチレンプロトン(δH 1.87、1.95、2.05)、2個のベンジルメチレンプロトン(δH 3.20)および2個のビニルプロトン(δH 5.04、5.18)の存在が確認され、それはファルネシル基の存在を示した。また、13C NMRスペクトルは、4個のメチル基(δc 16.1、16.2、17.8、25.9)、5個のメチレン炭素(δc 21.8、27.3、27.8、40.8、40.9)、3個の第三級オレフィン炭素(δc 124.1、125.3、125.6)および3個の第四級オレフィン炭素(δc 132.0、134.9、135.8)の存在を示し、それはファルネシル基の存在をさらに支持した。さらに、δH 5.21(1H, dd, J=3.0, 13.0Hz)、2.65(1H, dd, J=3.0, 17.0Hz)、および3.02(1H, dd, J=13.0, 17.0Hz)でのABX系は、H−2およびH−3位それぞれでフラバノン骨格に特徴的なパターンを示した。
【0041】
加えて、全体の1Hおよび13C NMR配置および結合(connectivity)は、1H−1H COSY、HSQC、およびHMBCデータの推論に基づいて決定された。プロポリンIのHMBCスペクトルは、δH 3.20(H−1”)でのメチレンシグナルが、C−5(δc 162.5)およびC−7(δc 165.9)それぞれと相関したことを明らかにし、それはファルネシル基がC−6に結合したことを示唆した(図1)。加えて、そのCDスペクトルは、C−2配座がS形であることを示した。
【0042】
従って、プロポリンIは、上記の式Iにより示される5,7,3’,4’−テトラヒドロキシ−6−ファルネシルフラバノンとして同定された。この化合物は初めて単離され、既刊文献に開示されていなかった。
【0043】
プロポリンJ
プロポリンJの物理化学的データを下記に示す:
[□]20D+2.4(c 0.41、CH3OH);IR νmax(フィルム)3747、3393、2925、2361、1637cm−1;UV(EtOH)λmax nm(logε)209.0(1.82)、293(0.92);CD(MeOH)328.9nm(Δε+2.37)、289nm(Δε−3.98);HREIMS m/z 408.1944(C25H28O5の計算値408.1937);1Hおよび13C NMR。
【0044】
1H NMRスペクトルから、3個のオレフィンメチル基(δH 1.55、1.61、1.74)、4個のメチレンプロトン(δH 1.93、2.04)、2個のベンジルメチレンプロトン(δH 3.18)および2個のビニルプロトン(δH 5.05、5.18)の存在が確認され、それはゲラニル基の存在を示した。また、13C NMRスペクトルは、3個のメチル基(δc 16.2、17.7、25.9)、3個のメチレン炭素(δc 21.8、27.7、40.9)、2個の第三級オレフィン炭素(δc 123.9、125.5)、および2個の第四級オレフィン炭素(δc 132.0、135.3)の存在を示し、それはゲラニル基の存在をさらに支持した。さらに、δH 5.29(1H, dd, J=2.7, 13.0Hz)、2.67(1H, dd, J=2.7, 17.0Hz)、および3.08(1H, dd, J=13.0, 17.0Hz)でのABX系は、H−2およびH−3位それぞれでフラバノン骨格に特徴的なパターンを示した。
【0045】
加えて、全体の1Hおよび13C NMR配置および結合は、1H−1H COSY、HSQC、およびHMBCデータの推論に基づいて決定された。プロポリンJのHMBCスペクトルは、δH 3.18(H−1”)でのメチレンシグナルが、C−5(δc 162.5)およびC−7(δc 166.0)それぞれと相関したことを明らかにし、それはゲラニル基がC−6に結合したことを示唆した(図2)。加えて、そのCDスペクトルは、C−2配座がS形であることを示した。
【0046】
従って、プロポリンJは、上記の式IIにより示される5,7,4’−トリヒドロキシ−6−ゲラニルフラバノンとして同定された。この化合物は初めて単離され、既刊文献に開示されていなかった。
【0047】
表1は、プロポリンIおよびJの物理化学的データを列記する。
【表1】
【0048】
実施例4:細胞培養および細胞毒性分析
ヒト乳癌MCF−7およびMDA−MB−231細胞を、Food Industry Research and Development Institute(Hsinchu, Taiwan)から購入した。細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン希釈液、および2mMグルタミンを含むダルベッコの修飾イーグルス培地(Gibco)中で培養した。細胞を、95%大気および5%CO2の加湿雰囲気下、37℃で維持した。しかしながら、MDA−MB−231細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン希釈液、および2mMグルタミンを含むL−15培地(Gibco)中で培養した。細胞を、100%大気および0%CO2の加湿雰囲気下、37℃で維持した。
【0049】
プロポリンF、IおよびJをジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、10mg/mLの一定濃度で調製した。細胞(ディッシュ当たり1.5×106)を、100mmディッシュ中で培養して14時間インキュベートし、その後DMSOまたは異なる濃度のプロポリン(2.5、5.0、10および20.0μg/mL)で48時間処理した。プロポリンは、408−492Daの範囲の分子量を有する小さい化合物である。これらの値は、それぞれのモル濃度に変換された。
【0050】
細胞を計測し、それらの生存率をトリパンブルー排除分析により決定した。活性は、IC50値(50%細胞毒性をもたらすのに必要な濃度)として示され、平均値を3つのデータ点から得た。
【0051】
表2は、本発明のプロポリンIおよびJのIC50(μM)値、および細胞毒性分析で得られた対照としてプロポリンFのIC50(μM)値を示す。
【表2】
【0052】
従って、本発明の化合物(プロポリンIおよびJ)は、ヒト乳癌細胞に対して細胞毒性活性を有することが見出されている。
【0053】
実施例5:癌細胞増殖に対するプロポリンIおよびJの阻害効果
細胞染色
2タイプの乳癌細胞株、MCF−7(ER受容体陽性)およびMDA−MB−231細胞(ER受容体陰性)を、実施例5に記載の条件で培養した。細胞を、様々な濃度の異なるプロポリンで24時間または72時間処理した。処理した細胞をトリパンブルーで染色し、生存率を評価した。
【0054】
図4Aは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示す。図4Bは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示す。図4Cは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示す。図4Dは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示す。図4Eは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の細胞数を示す。
【0055】
フローサイロメトリー分析
100mmディッシュ中、ヒト乳癌MCF−7およびMDA−MB−231細胞(1.5×106)を、種々の濃度のプロポリンF、I、およびJで24時間または72時間処理した。細胞をトリプシン処理し、氷冷PBSで集めた。細胞を200μLのPBS中に再懸濁し、800μLの氷100%エタノールを添加して固定し、その後−20℃で一晩インキュベートした。細胞ペレットを遠心により集め、1mLの低張緩衝液(PBS中0.5%トライトンX−100および1μg/mL RNaseA)中に再懸濁し、そして37℃で30分間インキュベートした。その後、1mLのPI溶液(50μg/mL)を添加し、混合物を30分間4℃で放置した。その後、細胞のDNA含有量をFACScanサイトメトリー(Becton Dickinson)により分析した。
【0056】
図5Aは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の結果を示す。図5Bは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の結果を示す。図5Cは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の結果を示す。
【0057】
図4および5に示す通り、本発明の化合物は、癌細胞の増殖に阻害効果を有することが証明された。
【0058】
ウェスタンブロットアッセイ
100mmディッシュ中、ヒト乳癌MCF−7細胞(1.5×106)を、様々な濃度のプロポリンF、I、およびJで24時間処理した。処理後、細胞を集め、100μLの溶解緩衝液中に再懸濁した。等量のタンパク質(30μg)を2×サンプル緩衝液で混合し、β−アクチン、Bid、p21、Ac−ヒストン3、CTPS、およびゲルゾリン検出のために12.5%SDS−PAGEにより分離させた。タンパク質をimmobilon膜(PVDF; Millipore Corp.)に電気的に移動させ、当量のタンパク質充填を、可逆的色素のアミドブラック(Sigma Chemical Co.)で膜を染色して確認した。次いで、これを一晩、20mM Tris−HCl(pH7.4)、125mM NaCl、0.2% トゥイーン20、および3%BSAを含む溶液でブロッキングした。用いた特異的抗体は、抗ヒトBid(1:500のウサギポリクローナル; Cell Signaling Technology, Inc.)、抗Ac−ヒストン3(1:1000のウサギポリクローナル;Cell Signaling Technology, Inc.)、抗p21(1:1000のマウスモノクローナル;BD Pharmingen Technology, Inc.)抗CTPS(1:1000のマウスモノクローナル;ABNOVA TAIWAN Corporation)、ゲルゾリン(1:1000のマウスモノクローナル; Sigma Chemical Co.)、および抗−β−アクチン(1:5000のマウスモノクローナル;Cell Signaling Technology, Inc.)であった。これらのタンパク質を化学発光(ECL, Amersham)により検出した。
【0059】
実施例6:HDAC酵素活性分析
免疫細胞化学実験
MCF−7細胞を6ウェルの培養スライド上で培養し、プロポリンF、IおよびJで6時間処理した。HDAC阻害剤として公知のSAHAを陽性対照として用いた。スライドを室温で80%メタノール溶液中30分間固定し、その後、PBSで3回洗浄した。細胞を室温で0.3%トライトンX−100で30分間透過処理し、次いでPBS中10%ウシ胎仔血清(FBS)中で1時間、室温でブロッキングし、その後、4℃で一晩、1:500希釈した抗アセチル化ヒストンH3(Cell Signaling)と共にインキュベートした。PBSで3回洗浄後、スライドを抗ウサギIgG−結合二次抗体で1.0時間染色し、その後、PBSで3回洗浄し、封入剤(Sigma)でマウントした。対照実験と並行して、一次抗体の脱落が、染色を排除することが観察された。スライドを、Olympus PM30 カメラを備える蛍光顕微鏡(Melville, NY)を用いて分析した。図6Aは、免疫細胞化学実験の結果を示す。
【0060】
ウェスタンブロッティング分析
ウェスタンブロティング分析を、実施例6に記載の方法に従い、Ac−ヒストン3、p21、ゲルゾリン、CTPSおよびβ−アクチンについて行った。図6Bは、ウェスタンブロティング分析の結果を示す。
【0061】
図6AおよびBに示す通り、本発明の化合物は、HDAC酵素活性に対する阻害効果を有することが証明された。
【技術分野】
【0001】
発明の背景
本発明は、新規プレニルフラバノン化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロポリスは、木の芽、フルーツ、樹液または他の植物源から蜜蜂が集める樹脂性混合物である。それは様々な活性成分を含み、抗腫瘍活性(3)、抗酸化活性(4)、抗細菌活性(5)、抗ウイルス活性(6)、抗真菌活性(7)、および抗炎症活性(8)を含む広範囲の生物学的活性を示すことが報告されている。異なる地域由来のプロポリスは、異なる活性成分を含み得る。
【0003】
本発明者らは、下記の式1から8によりそれぞれ示される台湾製プロポリスから単離された8種のプレニルフラバノンを以前報告した。
【化1】
【化2】
【0004】
【化3】
【0005】
これらのプロポリスは、抗癌活性(10−15)、抗酸化活性(10−16)および抗菌活性(16)を含む、広範囲の生物学的活性を示すことが報告されている。加えて、最近の研究により、沖縄製プロポリスが台湾製プロポリスと同じ活性成分を含むことが証明された(17−18)。
【0006】
ヒストン脱アセチラーゼ(HDAC)は、ヒストンのN末端においてリシンアミノ酸残基のε−アミノ基の脱アセチル化を触媒する酵素である。あるHDAC阻害剤は、前臨床および臨床段階の異なるタイプの癌を有する患者に対して治療的効果を有することが発見および証明されている(19−21)。HDAC阻害剤の抗癌機構の現在のモデルによると、該阻害剤は、コアヒストンの高アセチル化をもたらし、故に、クロマチン再構築を誘発し、腫瘍抑制遺伝子のようなサイレント遺伝子を発現させ、その結果、腫瘍細胞増殖の阻害をもたらす(26−27)。
【0007】
多機能性プロポリス由来の新規化合物の発見およびそれらの有用な生理的活性の評価が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
文献
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【発明の概要】
【0009】
発明の簡単な概要
一局面において、本発明は、
【化4】
からなる群から選択される式により示される、新規プレニルフラバノン化合物を提供する。
【0010】
別の局面において、本発明は、上記のプレニルフラバノン化合物の少なくとも1個を含む医薬組成物を提供する。
【0011】
さらに別の局面において、本発明は、疾患または状態を処置する方法またはそれを必要とする対象に所望の効果を与える方法であって、少なくとも1個の上記の化合物または上記の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0012】
発明の詳細な説明
他に特に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術および科学用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
【0013】
一局面において、本発明は、台湾製プロポリスから単離されたプレニルフラバノン化合物を提供する。
【0014】
該プレニルフラバノン化合物の一態様は、下記の式:
【化5】
で示される、5,7,3’,4’−テトラヒドロキシ−6−ファルネシルフラボン(“プロポリンI”と称される)である。
【0015】
式Iの化合物は、分子式C30H36O6および分子量492.25Daを有する。
【0016】
プレニルフラバノン化合物の別の態様は、下記の式:
【化6】
で示される、5,7,4’−トリヒドロキシ−6−ゲラニルフラボン(“プロポリンJ”と称される)である。
【0017】
式IIの化合物は、式C25H28O5および分子量408.19Daを有する。
【0018】
上記の本発明のプレニルフラバノン化合物は、HDAC酵素活性および癌細胞、好ましくは乳癌細胞の増殖に対して阻害効果を有する。
【0019】
従って、別の局面において、本発明は、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、HDAC阻害剤としての医薬組成物を提供する。
【0020】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の化合物の少なくとの1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、癌細胞増殖を阻止するための医薬組成物を提供する。
【0021】
本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置のための医薬組成物を提供する。
【0022】
さらに、公知のHDAC阻害剤の多くは、HDAC阻害剤が神経変性疾患の処置に有用であることを示す、神経保護効果(30,31)を有することが証明されている。神経変性疾患の例は、多発性硬化症(MS)(32)、ハンチントン病(HD)(33,39,40)、脊髄性筋萎縮症(SMA)(34,35,36)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)(37)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)(38)であるが、これらに限定されない。
【0023】
従って、本発明は、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、神経保護効果を有する医薬組成物に関する。
【0024】
本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも1個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、神経変性疾患を処置するための医薬組成物に関する。好ましくは、該神経変性疾患は、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、または筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。
【0025】
本発明の組成物の製造において、活性成分としての本発明の化合物は通常、賦形剤を用いて希釈されるか、またはカプセル剤、カシェ剤(sachet)、ペーパーまたは他の容器の形態であり得る担体中に入れられる。用いる賦形剤は、典型的に、ヒト対象または他の哺乳動物への投与に適する賦形剤である。適する賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン類、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸類、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、およびメチルセルロースが含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、錠剤、ピル、粉末、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル(固体として、または液体媒体中)、軟膏、カプセル、または滅菌包装粉末の形態であり得る。
【0026】
該組成物は、ヒト、サル、イヌなどを含む対象に、例えば経口投与により投与され得るか、または注射製剤の形態で非経腸投与により投与され得る。典型的には、本発明の組成物は、約125ないし約250mgの本発明の化合物(プロポリンIもしくはJ、または両方)を含む。成人への投与量は、好ましくは1日当たり約500ないし約1000mgであり、それは単一用量または分割用量の形態で投与され得る。
【0027】
別の局面において、本発明は、疾患または状態を処置する方法またはそれを必要とする対象に所望の効果を与える方法であって、少なくとも1個の上記の化合物または上記の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0028】
本明細書に記載の本発明の処置を必要とする対象には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。非ヒト哺乳動物は、ネコ、イヌなどのペット動物およびウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜動物が含まれるが、これらに限定されない。
【0029】
特に、上記の本発明の方法は、対象における癌細胞増殖の阻止に有用である。とりわけ、本発明の方法は、対象における乳癌細胞増殖の阻止に有用である。
【0030】
加えて、本発明の方法は、ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置に有用である。さらに、本発明の方法は、対象において神経保護効果を供し得る。
【0031】
さらに、本発明の方法は、対象における神経変性疾患の処置に有用である。具体的には、該神経変性疾患は、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される。
【0032】
本発明は、本明細書中、限定ではなく説明を目的として提供される下記の態様を参照してより具体的に記載され得る。
【図面の簡単な説明】
【0033】
多角的な図面の簡単な説明
上記の発明の概要、ならびに上記の本発明の詳細な説明は、添付の図面を併用して読むとき、より理解され得る。本発明の説明を目的として、現在好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、示した好ましい態様に限定されないことが理解されるべきである。
【0034】
【図1】図1は、プロポリンIのHとCの重要なHMBC相関を示す。
【図2】図2は、プロポリンJのHとCの重要なHMBC相関を示す。
【図3】図3は、実施例2の逆相分取HPLCのピークを示す。
【図4A】図4Aは、種々の濃度の異なるプロポリンで24時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4B】図4Bは、種々の濃度の異なるプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4C】図4Cは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4D】図4Dは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示し、ここで(a)は、対照処理であり;(b)および(c)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;そして(d)および(e)は、それぞれ5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(f)および(g)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図4E】図4Eは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の数を示す。
【図5A】図5Aは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞についてのフローサイトメトリー分析の結果を示し、ここで、(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図5B】図5Bは、様々な濃度の異なるプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞についてのフローサイロメトリー分析の結果を示し、ここで、(a)は、対照処理であり;(b)、(c)および(d)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;(e)、(f)および(g)は、それぞれ2.5、5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(h)、(i)および(j)は、それぞれ5、10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図5C】図5Cは、種々の濃度の異なるプロポリンで72時間処理したMDA−MB−231細胞についてのフローサイロメトリー分析の結果を示し、ここで、(a)は、対照処理であり;(b)および(c)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンF処理であり;そして(d)および(e)は、それぞれ5.0および7.5μg/mL濃度のプロポリンI処理であり;そして、(f)および(g)は、それぞれ10および15μg/mL濃度のプロポリンJ処理である。
【図6A】図6Aは、実施例6の免疫細胞化学実験の結果を示す。
【図6B】図6Bは、実施例6のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【実施例】
【0035】
実施例1:一次抽出
200gのTW−I等級の台湾製プロポリス(hives located in Tainan, Taiwanから入手)(29)を、低温で撹拌により均質化した。その後、均質化したサンプルを1.0Lの脱イオン水で3回洗浄し、残渣を95%エタノールで3回抽出した。濾過したエタノール抽出物を減圧下で蒸発乾固し、褐色粉末(135.6g)を得て、それをさらなる精製まで−20℃で貯蔵した。
【0036】
実施例2:化合物の単離および精製
エタノール抽出物から得られた褐色粉末をメタノール中に溶解し、Sephadex LH−20カラム(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)に適用して溶出溶媒として95%エタノールを用いた。再クロマトグラフィーにより得られた画分を含む全ての溶出物を、ヒト乳癌増殖に対するそれらの効果について分析し、活性画分を、Sephadex LH−20カラムのクロマトグラフィーにより95%エタノールを溶出剤として用いて再び分離した。次に、該活性画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Kiesel gel 60, E. Merck, Darmstadt 1, Germany)に付してn−ヘキサン/EtOAc溶媒系を用いた。
【0037】
最も活性な画分の精製を、逆相分取HPLC(n−ヘキサン/EtOAc、30:70)により行った。実験条件は、下記の通りであった:カラムは、Luna Phenomenex (C18、250×4.6mm)であり;溶媒系は、メタノール/水(8:2)であり;流速は、1mL/分であり;そして、検出は、UV280nmで行った。保持時間19.0分(プロポリンI)および10.5分(プロポリンJ)の画分を集め、それによりプロポリンI(淡黄色粉末)およびプロポリンJ(淡黄色液体)をそれぞれ単離した。図3は、逆相分取HPLCのピークを示す。
【0038】
実施例3:プロポリンIおよびプロポリンJの同定
プロポリンIおよびJそれぞれの構造を、下記の装置:参照基準として溶媒ピーク(MeOH−d3)を用いて、Perkin Elmer 1760−X IR−FT分光計;日立 150−20 UV;Jasco J−710 分光偏光計;Finnigan MAT−95XL質量分光計(EI);および、Bruker AV−500 分光計、を用いて分析した。
【0039】
プロポリンI
プロポリンIの物理化学的データを下記に示す:
[□]20D+3.8(c 0.26、CH3OH);IR νmax(フィルム)3747、3390、2923、1636cm−1;UV(EtOH)λmax nm(logε)207.0(1.65)、291(0.73);CD(MeOH)347nm(Δε+3.19)、294nm(Δε−3.98);HREIMS m/z492.2512(C30H36O6の計算値492.2512);1Hおよび13C NMR。
【0040】
1H NMRスペクトルから、4個のオレフィンメチル基(δH 1.52、1.56、1.63、1.74)、8個のメチレンプロトン(δH 1.87、1.95、2.05)、2個のベンジルメチレンプロトン(δH 3.20)および2個のビニルプロトン(δH 5.04、5.18)の存在が確認され、それはファルネシル基の存在を示した。また、13C NMRスペクトルは、4個のメチル基(δc 16.1、16.2、17.8、25.9)、5個のメチレン炭素(δc 21.8、27.3、27.8、40.8、40.9)、3個の第三級オレフィン炭素(δc 124.1、125.3、125.6)および3個の第四級オレフィン炭素(δc 132.0、134.9、135.8)の存在を示し、それはファルネシル基の存在をさらに支持した。さらに、δH 5.21(1H, dd, J=3.0, 13.0Hz)、2.65(1H, dd, J=3.0, 17.0Hz)、および3.02(1H, dd, J=13.0, 17.0Hz)でのABX系は、H−2およびH−3位それぞれでフラバノン骨格に特徴的なパターンを示した。
【0041】
加えて、全体の1Hおよび13C NMR配置および結合(connectivity)は、1H−1H COSY、HSQC、およびHMBCデータの推論に基づいて決定された。プロポリンIのHMBCスペクトルは、δH 3.20(H−1”)でのメチレンシグナルが、C−5(δc 162.5)およびC−7(δc 165.9)それぞれと相関したことを明らかにし、それはファルネシル基がC−6に結合したことを示唆した(図1)。加えて、そのCDスペクトルは、C−2配座がS形であることを示した。
【0042】
従って、プロポリンIは、上記の式Iにより示される5,7,3’,4’−テトラヒドロキシ−6−ファルネシルフラバノンとして同定された。この化合物は初めて単離され、既刊文献に開示されていなかった。
【0043】
プロポリンJ
プロポリンJの物理化学的データを下記に示す:
[□]20D+2.4(c 0.41、CH3OH);IR νmax(フィルム)3747、3393、2925、2361、1637cm−1;UV(EtOH)λmax nm(logε)209.0(1.82)、293(0.92);CD(MeOH)328.9nm(Δε+2.37)、289nm(Δε−3.98);HREIMS m/z 408.1944(C25H28O5の計算値408.1937);1Hおよび13C NMR。
【0044】
1H NMRスペクトルから、3個のオレフィンメチル基(δH 1.55、1.61、1.74)、4個のメチレンプロトン(δH 1.93、2.04)、2個のベンジルメチレンプロトン(δH 3.18)および2個のビニルプロトン(δH 5.05、5.18)の存在が確認され、それはゲラニル基の存在を示した。また、13C NMRスペクトルは、3個のメチル基(δc 16.2、17.7、25.9)、3個のメチレン炭素(δc 21.8、27.7、40.9)、2個の第三級オレフィン炭素(δc 123.9、125.5)、および2個の第四級オレフィン炭素(δc 132.0、135.3)の存在を示し、それはゲラニル基の存在をさらに支持した。さらに、δH 5.29(1H, dd, J=2.7, 13.0Hz)、2.67(1H, dd, J=2.7, 17.0Hz)、および3.08(1H, dd, J=13.0, 17.0Hz)でのABX系は、H−2およびH−3位それぞれでフラバノン骨格に特徴的なパターンを示した。
【0045】
加えて、全体の1Hおよび13C NMR配置および結合は、1H−1H COSY、HSQC、およびHMBCデータの推論に基づいて決定された。プロポリンJのHMBCスペクトルは、δH 3.18(H−1”)でのメチレンシグナルが、C−5(δc 162.5)およびC−7(δc 166.0)それぞれと相関したことを明らかにし、それはゲラニル基がC−6に結合したことを示唆した(図2)。加えて、そのCDスペクトルは、C−2配座がS形であることを示した。
【0046】
従って、プロポリンJは、上記の式IIにより示される5,7,4’−トリヒドロキシ−6−ゲラニルフラバノンとして同定された。この化合物は初めて単離され、既刊文献に開示されていなかった。
【0047】
表1は、プロポリンIおよびJの物理化学的データを列記する。
【表1】
【0048】
実施例4:細胞培養および細胞毒性分析
ヒト乳癌MCF−7およびMDA−MB−231細胞を、Food Industry Research and Development Institute(Hsinchu, Taiwan)から購入した。細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン希釈液、および2mMグルタミンを含むダルベッコの修飾イーグルス培地(Gibco)中で培養した。細胞を、95%大気および5%CO2の加湿雰囲気下、37℃で維持した。しかしながら、MDA−MB−231細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン希釈液、および2mMグルタミンを含むL−15培地(Gibco)中で培養した。細胞を、100%大気および0%CO2の加湿雰囲気下、37℃で維持した。
【0049】
プロポリンF、IおよびJをジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、10mg/mLの一定濃度で調製した。細胞(ディッシュ当たり1.5×106)を、100mmディッシュ中で培養して14時間インキュベートし、その後DMSOまたは異なる濃度のプロポリン(2.5、5.0、10および20.0μg/mL)で48時間処理した。プロポリンは、408−492Daの範囲の分子量を有する小さい化合物である。これらの値は、それぞれのモル濃度に変換された。
【0050】
細胞を計測し、それらの生存率をトリパンブルー排除分析により決定した。活性は、IC50値(50%細胞毒性をもたらすのに必要な濃度)として示され、平均値を3つのデータ点から得た。
【0051】
表2は、本発明のプロポリンIおよびJのIC50(μM)値、および細胞毒性分析で得られた対照としてプロポリンFのIC50(μM)値を示す。
【表2】
【0052】
従って、本発明の化合物(プロポリンIおよびJ)は、ヒト乳癌細胞に対して細胞毒性活性を有することが見出されている。
【0053】
実施例5:癌細胞増殖に対するプロポリンIおよびJの阻害効果
細胞染色
2タイプの乳癌細胞株、MCF−7(ER受容体陽性)およびMDA−MB−231細胞(ER受容体陰性)を、実施例5に記載の条件で培養した。細胞を、様々な濃度の異なるプロポリンで24時間または72時間処理した。処理した細胞をトリパンブルーで染色し、生存率を評価した。
【0054】
図4Aは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示す。図4Bは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示す。図4Cは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の染色結果を示す。図4Dは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMDA−MB−231細胞の染色結果を示す。図4Eは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の細胞数を示す。
【0055】
フローサイロメトリー分析
100mmディッシュ中、ヒト乳癌MCF−7およびMDA−MB−231細胞(1.5×106)を、種々の濃度のプロポリンF、I、およびJで24時間または72時間処理した。細胞をトリプシン処理し、氷冷PBSで集めた。細胞を200μLのPBS中に再懸濁し、800μLの氷100%エタノールを添加して固定し、その後−20℃で一晩インキュベートした。細胞ペレットを遠心により集め、1mLの低張緩衝液(PBS中0.5%トライトンX−100および1μg/mL RNaseA)中に再懸濁し、そして37℃で30分間インキュベートした。その後、1mLのPI溶液(50μg/mL)を添加し、混合物を30分間4℃で放置した。その後、細胞のDNA含有量をFACScanサイトメトリー(Becton Dickinson)により分析した。
【0056】
図5Aは、種々の濃度のプロポリンで72時間処理したMCF−7細胞の結果を示す。図5Bは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の結果を示す。図5Cは、種々の濃度のプロポリンで24時間処理したMDA−MB−231細胞の結果を示す。
【0057】
図4および5に示す通り、本発明の化合物は、癌細胞の増殖に阻害効果を有することが証明された。
【0058】
ウェスタンブロットアッセイ
100mmディッシュ中、ヒト乳癌MCF−7細胞(1.5×106)を、様々な濃度のプロポリンF、I、およびJで24時間処理した。処理後、細胞を集め、100μLの溶解緩衝液中に再懸濁した。等量のタンパク質(30μg)を2×サンプル緩衝液で混合し、β−アクチン、Bid、p21、Ac−ヒストン3、CTPS、およびゲルゾリン検出のために12.5%SDS−PAGEにより分離させた。タンパク質をimmobilon膜(PVDF; Millipore Corp.)に電気的に移動させ、当量のタンパク質充填を、可逆的色素のアミドブラック(Sigma Chemical Co.)で膜を染色して確認した。次いで、これを一晩、20mM Tris−HCl(pH7.4)、125mM NaCl、0.2% トゥイーン20、および3%BSAを含む溶液でブロッキングした。用いた特異的抗体は、抗ヒトBid(1:500のウサギポリクローナル; Cell Signaling Technology, Inc.)、抗Ac−ヒストン3(1:1000のウサギポリクローナル;Cell Signaling Technology, Inc.)、抗p21(1:1000のマウスモノクローナル;BD Pharmingen Technology, Inc.)抗CTPS(1:1000のマウスモノクローナル;ABNOVA TAIWAN Corporation)、ゲルゾリン(1:1000のマウスモノクローナル; Sigma Chemical Co.)、および抗−β−アクチン(1:5000のマウスモノクローナル;Cell Signaling Technology, Inc.)であった。これらのタンパク質を化学発光(ECL, Amersham)により検出した。
【0059】
実施例6:HDAC酵素活性分析
免疫細胞化学実験
MCF−7細胞を6ウェルの培養スライド上で培養し、プロポリンF、IおよびJで6時間処理した。HDAC阻害剤として公知のSAHAを陽性対照として用いた。スライドを室温で80%メタノール溶液中30分間固定し、その後、PBSで3回洗浄した。細胞を室温で0.3%トライトンX−100で30分間透過処理し、次いでPBS中10%ウシ胎仔血清(FBS)中で1時間、室温でブロッキングし、その後、4℃で一晩、1:500希釈した抗アセチル化ヒストンH3(Cell Signaling)と共にインキュベートした。PBSで3回洗浄後、スライドを抗ウサギIgG−結合二次抗体で1.0時間染色し、その後、PBSで3回洗浄し、封入剤(Sigma)でマウントした。対照実験と並行して、一次抗体の脱落が、染色を排除することが観察された。スライドを、Olympus PM30 カメラを備える蛍光顕微鏡(Melville, NY)を用いて分析した。図6Aは、免疫細胞化学実験の結果を示す。
【0060】
ウェスタンブロッティング分析
ウェスタンブロティング分析を、実施例6に記載の方法に従い、Ac−ヒストン3、p21、ゲルゾリン、CTPSおよびβ−アクチンについて行った。図6Bは、ウェスタンブロティング分析の結果を示す。
【0061】
図6AおよびBに示す通り、本発明の化合物は、HDAC酵素活性に対する阻害効果を有することが証明された。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式
【化1】
からなる群から選択される式により示される化合物。
【請求項2】
少なくとも1個の請求項1記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、HDAC阻害剤としての医薬組成物。
【請求項3】
HDAC阻害剤として有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項4】
癌細胞増殖の阻止に有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項5】
乳癌細胞の増殖を阻止するのに有効な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項6】
ヒストン脱アセチル化と関係する疾患を処置するのに有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項7】
神経保護効果を供し得る、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項8】
神経変性疾患を処置するのに有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項9】
該神経変性疾患が、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項10】
癌細胞増殖を阻止する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項11】
乳癌細胞の増殖を阻止する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項12】
ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項13】
神経保護効果を提供する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項14】
神経変性疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項15】
該神経変性疾患が、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項1】
下記の式
【化1】
からなる群から選択される式により示される化合物。
【請求項2】
少なくとも1個の請求項1記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、HDAC阻害剤としての医薬組成物。
【請求項3】
HDAC阻害剤として有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項4】
癌細胞増殖の阻止に有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項5】
乳癌細胞の増殖を阻止するのに有効な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項6】
ヒストン脱アセチル化と関係する疾患を処置するのに有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項7】
神経保護効果を供し得る、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項8】
神経変性疾患を処置するのに有用な、請求項2記載の医薬組成物。
【請求項9】
該神経変性疾患が、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項10】
癌細胞増殖を阻止する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項11】
乳癌細胞の増殖を阻止する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項12】
ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項13】
神経保護効果を提供する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項14】
神経変性疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象において、請求項1記載の化合物または請求項2記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項15】
該神経変性疾患が、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病(HD)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、球脊髄性筋萎縮症(SBMA)、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される、請求項14記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【公開番号】特開2010−195762(P2010−195762A)
【公開日】平成22年9月9日(2010.9.9)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2009−92164(P2009−92164)
【出願日】平成21年4月6日(2009.4.6)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 西暦2008年8月1日 中國蜂業之主編発行の「中國蜂業 第59巻8号第10〜13ページ」に発表
【出願人】(506107726)彦臣生技藥品股▲ふん▼有限公司 (5)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成22年9月9日(2010.9.9)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−92164(P2009−92164)
【出願日】平成21年4月6日(2009.4.6)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り 西暦2008年8月1日 中國蜂業之主編発行の「中國蜂業 第59巻8号第10〜13ページ」に発表
【出願人】(506107726)彦臣生技藥品股▲ふん▼有限公司 (5)
【Fターム(参考)】
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