プロテインキナーゼＣＫ２の強力阻害剤として有用な縮合ピリジン誘導体
本発明は、新しいファミリーのプロテインキナーゼＣＫ２阻害剤として特異的な式（Ｉ）の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩の使用に関し；本発明はまた、がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患；感染性疾患；糖尿病；血管新生関連障害；網膜症及び心肥大から選択される障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物の調製への式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼＣＫ２阻害する医薬品としての特定の式（Ｉ）の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩の使用に関し、本発明はまた、がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患；感染性疾患；糖尿病及び心肥大から選択される障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物の調製への式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＫ２（又はカゼインキナーゼ２）タンパク質は、真核生物においてよく保存されている、多機能性で且つ遍在性のセリン／スレオニンキナーゼであり、このホロ酵素は、αα’β２、α’２β２又はα２β２ヘテロ四量体の形態で結合している、２つの触媒サブユニットα及びα'と２つの同一の調節サブユニットβとから構成されている（図１を参照）。
【０００３】
このタンパク質は、多くの生理的又は病理学的プロセスの制御において不可欠な役割を果たし、胚発生(embryonic development)に、最終分化(terminal differentiation)に、並びに細胞周期進行及び細胞生存の制御に不可欠であり、ウイルス起源の腫瘍を含む多くのがんにおいては、その発現が調節解除されてアポトーシスの阻害をもたらし（Ａｈｍｅｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、２２６〜２３０；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００３、３６９、１〜１５）；細胞成長(cell growth)の促進及びアポトーシスの抑制におけるその二重機能は、その発がん能を説明し得る（Ｔａｗｆｉｃら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２００１年４月；１６（２），５７３〜８２）。
【０００４】
ＣＫ２タンパク質はまた、糸球体腎炎のような炎症性疾患に（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００５、１０２（２１）、７７３６〜７７４１）、生活環に不可欠なタンパク質のリン酸化に細胞ＣＫ２を利用する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びポリオウイルス（ＰＶ）のような一部の感染性疾患に、並びに病原寄生虫感染症に（Ｍｅｇｇｉｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、４３、１２９３１〜１２９３６）関与する。
【０００５】
異常なＣＫ２発現と、前立腺がん（Ｌａｒａｍａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００７、４３、９２８〜９３４）及び急性骨髄性白血病（Ｋｉｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、１３、１０１９〜１０２８）における好ましくない予後マーカーとの最近の関連付けから、腫瘍形成におけるＣＫ２の意味が確認されている。
【０００６】
多くの生理的プロセスにおける不可欠な役割のため及びその機能不全に関連付けられる病態の重要性のため、ＣＫ２タンパク質は、医薬品、特に抗がん剤及び抗ウイルス剤の開発に重要な薬理学的標的となっている。
【０００７】
したがって、ＣＫ２タンパク質は、化学的阻害剤の同定及び特性決定を裏付ける、治療的介入に適する妥当な生理病理学的標的であると考えられる（Ｐａｇａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３２１、１０４０〜１０４４；Ｄｕｎｃａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００８、１７８４、３３〜４７）。
【０００８】
がん、糖尿病又は炎症のような多くの疾患はプロテインキナーゼＣＫ２の摂動(perturbation)と関連するため、このタンパク質の効果的な阻害剤が必要とされている。
【０００９】
これまで先行技術において、いくつかの分子が、ＣＫ２タンパク質を阻害できると記載されている：
- ４種の主要分子：ケルセチン、エモジン、４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）及びその誘導体並びに５−オキソ−５，６−ジヒドロインドロ−（１，２−ａ）キナゾリン−７−イル）酢酸を含むＡＴＰ競合的阻害剤（Ｄｕｎｃａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００８、１７８４、３３〜４７）。ＣＫ２の触媒活性を特異的に阻害できるこれらの分子としては、ＣＫ２に対してより顕著な選択性を示すＴＢＢ、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）の誘導体（Ｓａｒｎｏら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００１、４９６、４４〜４８；Ｄｕｎｃａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００８、７、１０７７〜１０８８）を挙げることができる。しかし、ＴＢＢ及び他のキナーゼ基質類似体は、細胞ＡＴＰを用いて他の既知又は未知タンパク質の活性を阻害できるが；このような製品の特異性は確実でないので、それらの使用はインビボでは除外されている；
− 米国特許出願公開第２００２／１４７１６３号及び米国特許第６，４５５，３０７号に記載されている、ＣＫ２のαサブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。しかし、インビトロで立証されているＣＫ２の阻害は、部分的且つ一過性であって、非常に高用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（細胞の感受性に応じて数十又は数百μｇ／ｍＬ）を必要とする；
− 国際公開ＷＯ２００５／００５６３２に開示されているｓｉＲＮＡ。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｈｍｅｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、２２６〜２３０
【非特許文献２】Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００３、３６９、１〜１５）
【非特許文献３】Ｔａｗｆｉｃら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２００１年４月；１６（２），５７３〜８２
【非特許文献４】Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００５、１０２（２１）、７７３６〜７７４１
【非特許文献５】Ｍｅｇｇｉｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、４３、１２９３１〜１２９３６
【非特許文献６】Ｌａｒａｍａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００７、４３、９２８〜９３４
【非特許文献７】Ｋｉｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、１３、１０１９〜１０２８
【非特許文献８】Ｐａｇａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３２１、１０４０〜１０４４
【非特許文献９】Ｄｕｎｃａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００８、１７８４、３３〜４７
【非特許文献１０】Ｓａｒｎｏら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００１、４９６、４４〜４８
【非特許文献１１】Ｄｕｎｃａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００８、７、１０７７〜１０８８
【非特許文献１２】Ｂｉｓｓｅｒｙら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、１９９３、１１、２６３〜２７７
【非特許文献１３】Ｎａｂｉｅｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３、９０１３〜９０２３
【非特許文献１４】Ｒｉｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、５９８７〜５９９３）
【非特許文献１５】Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７
【非特許文献１６】Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｊ−Ｍ．Ｌｈｏｓｔｅ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、３３、１５１９〜１５２８
【非特許文献１７】Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｃ．Ｈｕｅｌ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９２、７、２３５〜２５１
【非特許文献１８】Ｓ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ、Ｖ．Ｒｏｉｇ、Ｚ．Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ、Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｐ．Ａｒｉｍｏｎｄｏ、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｃ．Ｈｅｌｅｎｅ及びＵ．Ａｓｓｅｌｉｎｅ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５
【非特許文献１９】Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｅ．Ｆａｎ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｐ．Ｖｒｉｇｎａｕｄ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７
【非特許文献２０】Ｃ．Ｅｓｃｕｄｅ、Ｃ．Ｈ．Ｎｕｙｅｎ、Ｓ．Ｋｕｋｒｅｄｉ、Ｙ．Ｊａｎｉｎ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｔ．Ｇａｒｅｓｔｉｅｒ及びＣ．Ｈｅｌｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９８、９５、３５９１〜３５９６
【非特許文献２１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５
【非特許文献２２】Ｐｒｕｄｅｎｔ，Ｒ．ら（２００８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１６（１−２）：７１〜８５
【非特許文献２３】Ｆｉｌｈｏｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：９９２８〜３６（１９９０））
【非特許文献２４】Ｔｈｉ Ｍｙ−Ｎｈｕｎｇ Ｈｏａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、２００９年、第８巻、第５号、７６５〜７７２頁
【非特許文献２５】Ｐｒｕｄｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７８０（１２）：１４１２〜２０
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／１４７１６３号
【特許文献２】米国特許第６，４５５，３０７号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／００５６３２
【特許文献４】ＥＰ０４０２２３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、例えば、がん化学療法における耐性の問題を克服するのに有効な方法でプロテインキナーゼＣＫ２を特異的に阻害し得る新規分子を提供することが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、今回、プロテインキナーゼＣＫ２の競合的阻害剤を同定した。
【００１４】
本発明の主題は、プロテインキナーゼＣＫ２阻害薬としての使用が開示されていない特異的な化合物に関する。この化合物は、医薬品として使用するための、式（Ｉ）：
【００１５】
【化１】
【００１６】
［式中、
− 環Ｃは、ピロール複素環又はピラジン複素環であり、
− Ｒ１は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ１は、環Ｃがピロール複素環である場合にのみ存在し、
− Ｒ２は、−Ｈ、二重結合によって環Ｄに連結されている酸素原子、ハロゲン原子、１，２−エタンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）、１，２−エタンジチオ基（−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−）、フェニル基、ベンジル基、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲ若しくは−Ｎ（Ｒ）２基（式中、Ｒは−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）であり、
− Ｒ３は、Ｒ２が二重結合によって環Ｄと連結されている酸素原子、１，２−エタンジオキシ基又は１，２−エタンジチオ基である場合にのみ存在し、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、
− Ｒ４及びＲ５は、同一であるか異なり、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換若しくは非置換アリール環を表し、
− Ｒ６及びＲ７は、水素原子、又は炭素原子６及び７を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
− Ｒ８及びＲ９は、水素原子、又は炭素原子８及び９を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
但し、
・ Ｒ６及びＲ７が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ８及びＲ９は水素原子であり、
・ Ｒ８及びＲ９が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ６及びＲ７は水素原子である］
の化合物及びそれらの互変異性型並びにそれらの薬学的に許容される塩から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語「アルキル」は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチル−プロピル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル及びヘキシルを意味する。
【００１８】
用語「アリール」は、６〜１０個の環炭素原子を有する単環式炭化水素芳香環系又は複素環系を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ及び−Ｉ、好ましくは−Ｃｌ、−Ｂｒ及び−Ｉ、より好ましくは−Ｃｌから選択されるハロゲン原子を意味する。
【００２０】
「薬学的に許容される」という表現は、ヒト及び動物の組織との接触に好適であり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答又は他の合併症を起こさず、妥当なベネフィット／リスク比に相応する化合物、物質、組成物及び／又は剤形を意味する。
【００２１】
本発明の化合物と類似した構造を示す化合物は、以前にも記載されている。特に、ＥＰ０４０２２３２は、一般式：
【００２２】
【化２】
【００２３】
のピリドベンゾインドール誘導体及びそれらの酸付加塩を記載しており、これらの化合物は抗腫瘍剤として有用である。
【００２４】
これらのうち、ＲＰ６０４７５又はイントプリシンと称される、Ｒ１＝−Ｈ、Ｒ２＝−ＯＨ、Ｒ３＝−ＣＨ３、ａｌｋ＝−（ＣＨ２）３−及びＲ＝−ＣＨ３の化合物が広く研究されている。この化合物は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤であり、強いＤＮＡ結合親和性を示す。インビトロでは、この化合物は、種々の細胞型に対して細胞毒性があり、固形腫瘍状細胞に対する細胞毒性が比較的大きいことがわかった（Ｂｉｓｓｅｒｙら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、１９９３、１１、２６３〜２７７；Ｎａｂｉｅｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３、９０１３〜９０２３；Ｒｉｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、５９８７〜５９９３）。
【００２５】
Ｎｇｕｙｅｎらは、ピロール複素環がピラジン複素環によって置き換えられた同様な化合物を合成した（Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７）。特に、式：
【００２６】
【化３】
【００２７】
［式中、Ｒ＝−Ｈ又は−ＣＨ３、ａｌｋ＝−（ＣＨ２）２−又は−（ＣＨ２）３−及びＲ’＝−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５］
の化合物は、強いＤＮＡトポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤であり、抗腫瘍特性を示す。
【００２８】
この論文は、式：
【００２９】
【化４】
【００３０】
［式中、Ｒ＝−ＯＨ又は−ＯＣＨ３］
の化合物も記載しているが、これらの化合物は、抗腫瘍性活性を有さない。このことは、これらの化合物の化学構造の変化は、微小であっても、異なる生物活性をもたらし得ることを示している。
【００３１】
驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物は、プロテインキナーゼＣＫ２の選択的阻害剤であって、トポイソメラーゼ阻害剤ではないことがわかった。したがって、これらの化合物は、ＣＫ２調節解除を伴う病態の予防及び／又は治療の開発において有用であることがわかった。
【００３２】
好ましい一実施形態において、本発明の式（Ｉ）の化合物の環Ｃは、下記式（Ｉａ）：
【００３３】
【化５】
【００３４】
［式中、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は前記で定義した通りであり、基Ｒ１は好ましくは水素原子である］
を定義するピロール複素環である。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、本発明の式（Ｉ）の化合物の環Ｃ、下記式（Ｉｂ）：
【００３６】
【化６】
【００３７】
［式中、基Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は前記で定義した通りである］
を定義するピラジン複素環である。
【００３８】
好ましくは、Ｒ６及びＲ７又はＲ８及びＲ９が置換アリール基を表す場合には、前記置換アリール基は、−ＯＨ基によって置換されているフェニル環である。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、基Ｒ２は、ハロゲン原子、より好ましくは塩素原子である。
【００４０】
別の好ましい実施形態によれば、基Ｒ４が水素原子であり及び／又は基Ｒ５がメチル基である式（Ｉ）の化合物が、非常に良好な活性のために、特に重要である。
【００４１】
別の特に好ましい実施形態によれば、基Ｒ４及びＲ５は、炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換又は非置換フェニル環を表し、式（Ｉ）の前記化合物は、下記式（Ｉｃ）：
【００４２】
【化７】
【００４３】
［式中、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は前記で定義した通りである］
に相当する。
【００４４】
本発明による式（Ｉ）の最も好ましい化合物は、以下の通りである：
−化合物１：
【００４５】
【化８】
【００４６】
−化合物２：
【００４７】
【化９】
【００４８】
薬学的に許容される塩としては、無機酸との付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、若しくは有機酸との付加塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、又はこれらの酸の代替誘導体との付加塩を挙げることができる。
【００４９】
本発明の化合物は、当業者によく知られている多くの方法で製造できる。試薬及び出発原料は、市販されているか、又は周知の技術によって容易に合成される。
【００５０】
本発明の化合物の合成は、文献中に記載されている：
- 式（Ｉａ）の化合物の合成は、以下の論文：Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｊ−Ｍ．Ｌｈｏｓｔｅ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、３３、１５１９〜１５２８；Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｃ．Ｈｕｅｌ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９２、７、２３５〜２５１；並びにＳ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ、Ｖ．Ｒｏｉｇ、Ｚ．Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ、Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｐ．Ａｒｉｍｏｎｄｏ、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｃ．Ｈｅｌｅｎｅ及びＵ．Ａｓｓｅｌｉｎｅ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５中に記載されており；
- 式（Ｉｂ）の化合物の合成は、Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｅ．Ｆａｎ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｐ．Ｖｒｉｇｎａｕｄ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７に記載されており、
- 式（Ｉｃ）の化合物の合成は、Ｃ．Ｅｓｃｕｄｅ、Ｃ．Ｈ．Ｎｕｙｅｎ、Ｓ．Ｋｕｋｒｅｄｉ、Ｙ．Ｊａｎｉｎ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｔ．Ｇａｒｅｓｔｉｅｒ及びＣ．Ｈｅｌｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９８、９５、３５９１〜３５９６に記載されている。
【００５１】
通常、反応は、好適な溶媒中で実施する。関与する反応又は試薬に悪影響を及ぼさなければ、種々の溶媒を使用できる。好適な溶媒の例としては、芳香族、脂肪族又は脂環式炭化水素であることができる炭化水素、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン及びキシレン；アミド、例えば、ジメチルホルムアミド；アルコール、例えば、エタノール、２-メトキシエタノール及びメタノール；エーテル、例えば、ジエチルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン；アセトニトリル；並びに水が挙げられる。
【００５２】
反応は、広範囲の温度にわたって起こり得る。一般に、０〜１５０℃、より好ましくは室温〜２６０℃の温度において反応を実施するのが都合良い。反応に必要な時間もまた、多くの因子、特に反応温度及び試薬の性質に応じて、広範囲に変動し得る。しかし、反応が前記で概説した好ましい条件下で行われるならば、３〜７２時間の時間で通常は充分であろう。
【００５３】
製造された式（Ｉ）の化合物は、常法によって反応混合物から回収できる。例えば、化合物の回収は、反応混合物から溶媒を留去することによって、又は必要ならば、反応混合物から溶媒を留去後に残分を水中に流し込み、続いて水不混和性有機溶媒で抽出し、抽出物から溶媒を留去することによって、行うことができる。加えて、生成物は、所望ならば、種々の周知技術、例えば、再結晶、再沈殿又は種々のクロマトグラフィー技術、特にカラムクロマトグラフィー又は分取薄層クロマトグラフィーによって更に精製できる。
【００５４】
本発明の化合物１及び２は、下記ステップを含む方法によって得ることができる：
【００５５】
【化１０】
【００５６】
化合物１又は２の製造方法は、以下の主要ステップ：
（ｉ）化合物ＩＩＩ又はＶＩＩＩを得るための、化合物ＩとＩＩとの又はＩとＶＩＩとの縮合と
（ｉｉ）化合物ＩＶ又はＩＸを得るための、得られたヒドラゾンＩＩＩ又はＶＩＩＩの熱的フィッシャーインドール化(thermal Fischer indolization)によるインドール化と
（ｉｉｉ）木炭上パラジウムの存在下における化合物ＩＶ又はＩＸの芳香族化による、化合物Ｖ又はＸの直接生成と
を含む。
【００５７】
インドール化ステップ（ｉｉ）及び芳香族化ステップ（ｉｉｉ）は、同一容器で、各ステップを制御して適切な完了を確実にしながら、実施できる。次いで、アセトニトリル−オキシ塩化リン−塩化ベンジルトリエチルアンモニウム−ジエチルアニリン混合物中で化合物Ｖ又はＸを煮沸し、続いて塩化水素水溶液中で塩化ベンジルトリエチルアンモニウムの存在下でメトキシ化合物ＶＩ又はＸＩを煮沸することによって、本発明の化合物１又は２が得られる。
【００５８】
本発明はまた、前記で定義した式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に含む医薬組成物に関する。
【００５９】
「薬学的に許容される賦形剤」という表現は、任意の希釈剤、補助剤又は賦形剤、例えば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、分散媒、剤皮、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及びおび吸収遅延剤などを意味する。
【００６０】
式（Ｉ）の化合物のプロテインキナーゼＣＫ２阻害生物活性を、評価した（実施例２〜６を参照）。
【００６１】
前記化合物及びそれらの塩は、これらの性質により、抗腫瘍剤、抗感染症剤、抗炎症剤、抗マラリア剤並びに糖尿病、自己免疫疾患及び炎症性疾患に対して有用な薬剤などの活性薬剤として、更にまた、ＣＫ２酵素の過剰な活性に関連する障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療への、特にヒトなどの哺乳類の治療への医薬品としての使用に好適である。
【００６２】
ＣＫ２酵素の過剰な活性に関連する障害及び／又は疾患は、例えば、がん、特に乳がん、前立腺がん、肺がん、頸部がん及び脳がん、腎臓がん、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌並びに膵臓がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、糸球体腎炎；感染性疾患、例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＰＶ、単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルスなど）；糖尿病；血管新生関連障害；網膜症（例えば、加齢黄斑変性症、ＡＲＭＤ）及び心肥大である。
【００６３】
ヒト又は場合によっては動物に投与される式（Ｉ）の化合物の量は、下記実施例中に開示する手段によって測定され得るこの化合物の特異活性によって異なる。この量は、治療される疾病の重症度並びに個々の患者の年齢及び体重によっても異なる。
【００６４】
上記の条件に加えて、本発明は、一般式（Ｉ）の化合物の生物活性を例示する実施例及びまた、添付した図面に言及する、以下の説明から明白になる他の条件も含む。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】２つのα触媒サブユニット及び２つのβ調節サブユニットを含むプロテインキナーゼＣＫ２の略図を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、生細胞中における、ＴＢＢ、化合物１及び２によるＣＫ２活性の阻害を示す。
【図３】化合物１及び２によるＨｅＬａ細胞の増殖阻害を、ＤＭＳＯ及びＴＢＢと比較して示す、（相対生存率）対（試験化合物濃度（μＭ））のグラフである。
【図４】ＤＭＳＯ及びＴＢＢと比較した、化合物１及び２によるＵ３７３がん細胞の増殖阻害を示す。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、ＨｅＬａ（ｐ５３陽性）野生細胞型及びＵ３７３細胞（ｐ５３陰性）における細胞周期に対する、化合物１及び化合物２の影響の分析を示す。
【図６】ＤＭＳＯと比較した、化合物１及び２による、軟寒天培地上における細胞コロニー形成の阻害を示す。
【図７】図７Ａは、化合物１によって誘発された腫瘍成長のインビボにおける阻害を、ＤＭＳＯと比較して示すグラフ（腫瘍成長（ｍｍ３）対時間（日））である。図７Ｂは、この試験中における体重変化を示すグラフ（体重（ｇ）対時間（日））である。
【実施例１】
【００６６】
式（Ｉ）の化合物の合成
式（Ｉ）の化合物１及び２を、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５に記載され且つ公表された手順に従って、合成した。
【実施例２】
【００６７】
式（Ｉ）の化合物のＣＫ２阻害活性の特性決定
式（Ｉ）の化合物の作用機序を特徴付けるために、それらを、ＣＫ２、ｃ−ｋｉｔ及びトポイソメラーゼＩＩ活性並びにそれらのＤＮＡ挿入能について試験した。
【００６８】
１．材料及び方法
− ＣＫ２活性に対する式（Ｉ）の化合物の作用を、Ｐｒｕｄｅｎｔら（Ｐｒｕｄｅｎｔ，Ｒ．ら（２００８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１６（１−２）：７１〜８５）に従って測定する：指示濃度の化合物３μＬ、３μＬのＣＫ２α（３６ｎｇ）、及び１００μＭのペプチド基質（ＲＲＲＥＤＥＥＳＤＤＥＥ、配列番号：１）と１０ｍＭ ＭｇＣｌ２と１００μＭ ［γ-３２Ｐ］-ＡＴＰとを含む混合物を含む最終容量１８μＬ中で実施される放射能分析で、化合物を試験した。分析は、室温で５分間実施後に、６０μＬの４％ＴＣＡ添加によって終了させた。ペプチド基質への３２Ｐの取り込みを、Ｆｉｌｈｏｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：９９２８〜３６（１９９０））に既に記載されているようにして、測定した。
【００６９】
− ｃ−ｋｉｔ活性に対する式（Ｉ）の化合物の作用を、製造業者の推奨基準（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照記号１４−５５９）に従って測定する：２５μＬの最終反応容量で、ｃ−ｋｉｔ（５〜１０ｍＵ）を、８ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２５μＭ ＡＴＰ、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１、１０ｍＭ ＭｇＡｃｅｔａｔｅ及び［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（特異活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要濃度）と共にインキュベートする。反応は、ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、３％リン酸溶液５μＬの添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応(reaction)を、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ Ａ上にスポットし、７５ｍＭリン酸中で５分間ずつ３回、メタノール中で１回洗浄後、乾燥及びシンチレーション計数を行う。
【００７０】
− トポイソメラーゼＩＩ活性に対する式（Ｉ）の化合物の作用を、製造業者の推奨基準（Ｖａｘｒｏｎ、Ｔａ−００１）に従って測定する：１０μＬの最終反応容量で、１ＵのトポイソメラーゼＩＩαを、０．１Ｍトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＡＴＰ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ＢＳＡ ２μｇ、キネトプラストＤＮＡ５００ｎｇ、及びアッセイされる化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ原液から、ＤＭＳＯの最終濃度１％未満）と共にインキュベートする。反応は、トポイソメラーゼＩＩαの添加によって開始する。３７℃において１５分間のインキュベーション後、停止液（３％ＳＤＳ、１．５ｍｇ．ｍＬ−１プロテイナーゼＫ）１μＬの添加によって反応を停止させる。３７℃において３０分間のインキュベーション後、反応混合物をアガロースゲル（１％アガロース）上で分離し、ＤＮＡトポ異性体をデンシトメトリー分析によって定量化する。
【００７１】
− ＤＮＡ挿入に対する式（Ｉ）の化合物の作用。ＤＮＡ挿入を、ＦＩＤ（蛍光インターカレーター置換(Fluorescence Intercalator Displacement)）を使用して実施した。このアッセイは、ＤＮＡ結合分子による置換時におけるＤＮＡ結合インターカレーター（チアゾールオレンジ）の蛍光の消失に基づいた。簡潔には、二本鎖オリゴヌクレオチドＣＡＡＴＣＧＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＣＧＡＴＴＧ（配列番号：２）（０．２５μＭ）を、１０ｍＭカコジラート、１００ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．２）を含む緩衝液中のチアゾールオレンジ（０．７５μＭ）に混合する。試験化合物及び臭化エチジウム（正の対照）を、混合物（０．７５μＭ〜１０μＭ）に加える。２０分間のインキュベーション後、蛍光を測定する（励起：４９０ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）。このアッセイにおいて、化合物の自己蛍光は陰性であった。
【００７２】
２．結果：本発明の範囲外の２種の化合物と比較した、式（Ｉ）の化合物の活性
化合物３及び化合物４の式はそれぞれ、アリール環の−ＯＨ基が−ＯＣＨ３基によって置き換えられた本発明の化合物1及び２の式に対応する。化合物４は具体的には、先行技術において開示された化合物の定義に対応し：化合物６は、Ｔｈｉ Ｍｙ−Ｎｈｕｎｇ Ｈｏａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、２００９年、第８巻、第５号、７６５〜７７２頁に記載されている。
【００７３】
【表１】
【００７４】
これらの結果は、化合物１及び２はＣＫ２活性を強く阻害すること、即ち、これらの２つの化合物に関する残留ＣＫ２活性は、化合物３及び４と比較して非常に低いが、ｃ−ｋｉｔ及びトポイソメラーゼＩＩ活性又はＤＮＡ挿入に対しては全く又は殆ど阻害作用がないことを示しており；式（Ｉ）の化合物は、プロテインキナーゼＣＫ２の選択的阻害剤である。
【実施例３】
【００７５】
細胞に対して強力な(cell-potent)、式（Ｉ）の化合物のＣＫ２阻害活性
１．材料及び方法
生細胞へのＣＫ２に対する化合物の阻害能力を試験するための細胞アッセイを開発した。
【００７６】
細胞ＣＫ２活性アッセイ：ＹＦＰタンパク質のＣ末端に６つのＣＫ２コンセンサスリン酸化部位を添加することによって、キメラＹＦＰベースのＣＫ２活性レポーターを発現するプラスミドｐＥＹＦＰｃ１を設計した（ｐＥＹＦＰｃ１−ＳβＳ）。ｐＥＹＦＰｃ１−ＳβＳは、ｐＥＹＦＰｃ１−ＣＫ２βから、突然変異誘発１には
５’−ＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧ−３’（配列番号：３）及び
５’−ＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号：４）並びに
突然変異誘発２には
５’−ＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＴ−３’（配列番号：５）及び
５’−ＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号：６）
を用いて、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ−Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による引き続く２ラウンドの突然変異後に得られた（Ｐｒｕｄｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７８０（１２）：１４１２〜２０）。
【００７７】
− プラスミドによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクション、
ＨｅＬａ細胞を、１２ウェルプレート中に細胞１０６個／ウェルで蒔き、リポフェクタミン(lipofectamine)試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＫ２活性レポータープラスミド（ｐＥＹＦＰｃ１−ＳβＳ）をトランスフェクトした。
【００７８】
− ＣＫ２阻害活性の試験：正の対照として、生細胞中におけるＣＫ２活性のＴＢＢ阻害を最初に試験する：キメラＣＫ２活性−ＧＦＰベースのレポーターを発現するプラスミドがトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、ＣＫ２阻害剤ＴＢＢと共に及び負の対照としてのＤＭＳＯと共に２４時間インキュベートする。
【００７９】
次いで、細胞抽出物をネイティブ電気泳動(native electrophoresis)によって分析し、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を免疫ブロットによって可視化する：トランスフェクションの翌日、培地を、化合物を含む新しい培地に置き換え、２４時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、洗浄ペレットを氷中で３０分間、溶解用緩衝液（製造業者推奨基準によれば、５０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、トリトンＸ１００ １／１００、ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ）１／１００及びロイペプチン、アプロチニン、ＡＥＢＳＦ）１００μΛによって可溶化した。５０ｍｇのタンパク質にグリセロールとブロムフェノールブルーとの混合物を加え、１２％ネイティブポリアクリルアミドゲル中を泳動させた。通電転写後、ニトロセルロース膜を１％ ＢＳＡで遮断し、ｍＡｂ抗ＧＦＰ（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１８１４４６０）１／１０００と共に終夜４℃においてインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギ抗-マウス−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ４４１６）１／２０００と共に１時間インキュベートし、ＧＦＰをＥＣＬ＋ウェスタンブロット検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。
【００８０】
いくつかの濃度の化合物１及び２を、細胞ＣＫ２活性アッセイにおいて同一条件で試験する。
【００８１】
２．結果
非処理又はＤＭＳＯ処理ＨｅＬａ細胞において、ＣＫ２は十分に活性であり、ＣＫ２活性レポーターは殆どリン酸化アイソフォームとして検出できた（図２Ａの下方のバンドを参照）。
【００８２】
細胞を既知のＣＫ２阻害剤ＴＢＢ、化合物１又は化合物２と共に２４時間インキュベートする場合には、リン酸化ＣＫ２レポーターアイソフォームは、特異的なＣＫ２活性阻害により、用量依存的に消失した（図２Ａ及び２Ｂを参照）。
【００８３】
下記表ＩＩは、細胞ＣＫ２活性アッセイにおける、ＴＢＢ、化合物１及び２の活性を示している：
【００８４】
【表２】
【実施例４】
【００８５】
化合物１及び化合物２による細胞増殖阻害の特性決定
既知のＣＫ２阻害剤は細胞生存率を低下させるので、いくつかの細胞型の生存率を、化合物１及び２による４８時間処理後に測定した。
【００８６】
１．材料及び方法
− 細胞：ＨｅＬａ（ヒトの子宮頚部腺癌）及びＵ３７３（ヒトのグリア芽細胞腫）がん細胞株、
− ＨｅＬａ細胞の増殖阻害を、以下のようにして評価する：Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレートに細胞１．５×１０４個／ウェルで蒔いた。翌日、培地を、漸増濃度の阻害剤又は対照としての当量のＤＭＳＯを含む、新しい培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ）が補充されたダルベッコ（Dulbecco）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））に置き換えた。２日後、細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造業者推奨基準に従って測定した。
【００８７】
− Ｕ３７３細胞の増殖阻害を、ＨｅＬａ細胞と同一プロトコールで評価する：蒔いた翌日に、Ｕ３７３細胞を、５μＭの化合物１、化合物２又はＤＭＳＯで処理する。結果を、ＤＭＳＯに関して記録された発光を基準として示す。
【００８８】
２．結果
ＨｅＬａ細胞の細胞生存率の低下：
化合物１及び２は、低用量であっても、腫瘍細胞の強い増殖阻害を誘発する（図３）。
【００８９】
Ｕ３７３がん細胞株の細胞生存率の低下：
５μＭの化合物１及び化合物２は、４８時間の処理後に、これらの細胞株の細胞増殖を減少させる効果がある（図４）。
【実施例５】
【００９０】
化合物１による細胞周期阻害の分析
１．材料及び方法
次に、実施例４において化合物１及び化合物２で予め処理した細胞を、ヨウ化プロピジウムの混和後に細胞周期分析に供する。
【００９１】
細胞周期分布の分析：細胞を、６ウェルプレートで蒔いた。翌日、細胞を、５μＭの化合物又は当量のＤＭＳＯで処理した。２４時間後、細胞を収集し、７０％エタノールで３０分間固定し、１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムで３０分間ラベルした。ＤＮＡ含量を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【００９２】
２．結果
分析から、化合物１及び化合物２で処理されたＨｅＬａ細胞及びＵ３７３細胞が、Ｇ２／Ｍ期におけるかなりの蓄積によって細胞周期停止を示すことがわかった。ＨｅＬａ処理細胞ではアポトーシス細胞の付随的増加も観察されるが、Ｕ３７６３細胞ではアポトーシス細胞の付随的増加は観察されず、これらの細胞はアポトーシスに抵抗性である（図５Ａ）。ｓｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期におけるＨｅＬａ細胞及びＵ３７３細胞の比率（％）を、図５Ｂの表に要約する。
【実施例６】
【００９３】
化合物１による、腫瘍細胞の腫瘍形成阻害
１．材料及び方法
腫瘍細胞の腫瘍形成に対する化合物の作用を、コロニー形成アッセイで試験する。
【００９４】
軟寒天培養によるコロニー形成アッセイの阻害は、以下のようにして行う：Ｕ３７３細胞を、化合物（５μＭ）又は当量のＤＭＳＯを含む、０．３％寒天−ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中に埋め込まれた、０．６％寒天−ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ層上に注いだ。１５日後に、コロニー（細胞２０個以上）の数を、１０視野／ウェルで計数した。実験は、少なくとも２回、二重反復試験で行った。
【００９５】
２．結果
図６に示すように、５μＭの化合物１は、コロニー形成の５０％阻害の誘発に十分である。
【実施例７】
【００９６】
化合物１による、インビボでの腫瘍形成阻害
１．材料及び方法
実験手順は全て、地域の倫理委員会に従った（Ｃｏｍｉｔｅ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ ｐｏｕｒ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ ＣＲＥＥＡ、Ｒｈｏｎｅ Ａｌｐｅｓ−プロトコール番号２８６）。雌のＨａｒｌａｎ胸腺欠損ヌードマウス（週齢６〜８週）の右側腹部に、Ｕ３７３細胞７．５ｘ１０５個を皮下播種した。腫瘍が±５０ｍｍ３（体積＝長さ×幅×高さ）に達したら、２２．５％ ＰＥＧ３３５０、０．４５％ＢＳＡに溶解された化合物１（０．１４ｍｇ／１００μＬ／注射−マウス４匹）又は同一緩衝液に溶解された当量のＤＭＳＯ（最終濃度１０％−マウス３匹）（対照群）を、週に３回（２日毎に）２週間、動物に腹腔内投与した。体重及び腫瘍体積を、週２回測定した。腫瘍体積が約１０００ｍｍ３となった時点で、実験を終了させた。結果を、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【００９７】
２．結果
化合物１が注射されたマウスでは、ＤＭＳＯが注射されたマウスと比較して、腫瘍発生率が全ての時点で著しく低下したことが観察される（図７Ａ）。最初の化合物注射後１５日で、化合物１が注射されたマウスの腫瘍は、ＤＭＳＯが注射されたマウスの腫瘍の４．７倍小さかった。更に、記録された体重変化は、統計的に有意でなかった。これは、化合物１が、適用用量において忍容性が高かったことを示している（図７Ｂ）。
【実施例８】
【００９８】
構造−活性相関試験
構造−活性相関はまた、いくつかの位置が置換に対して許容性があることを示している。ＣＫ２−式（Ｉ）の化合物の複合体のＸ線共構造(co-structure)から、キナーゼと阻害剤との分子相互作用へのより深い洞察が得られる。
【００９９】
ＣＫ２−式（Ｉ）の化合物の複合体のＸ線共構造：
ＣＫ２−式（Ｉ）の化合物の複合体のＸ線構造において、化合物（Ｉ）のフェニル環の−ＯＨ基とＶａｌ１１６の窒素骨格(nitrogen backbone)との間に水素結合が形成されていることが観察でき、これは、この位置に遊離−ＯＨ基が必要な根拠を示している。
【０１００】
基Ｒ３に関しては、溶媒への曝露時に、基Ｒ３と水との好ましくない疎水性相互作用により、活性が低下すると思われる。これは、基Ｒ３の位置が、溶媒への高曝露環境であることと一致している。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号２：オリゴヌクレオチド
配列番号３：オリゴヌクレオチド
配列番号４：オリゴヌクレオチド
配列番号５：オリゴヌクレオチド
配列番号６：オリゴヌクレオチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼＣＫ２阻害する医薬品としての特定の式（Ｉ）の化合物及びそれらの薬学的に許容される塩の使用に関し、本発明はまた、がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患；感染性疾患；糖尿病及び心肥大から選択される障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物の調製への式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＫ２（又はカゼインキナーゼ２）タンパク質は、真核生物においてよく保存されている、多機能性で且つ遍在性のセリン／スレオニンキナーゼであり、このホロ酵素は、αα’β２、α’２β２又はα２β２ヘテロ四量体の形態で結合している、２つの触媒サブユニットα及びα'と２つの同一の調節サブユニットβとから構成されている（図１を参照）。
【０００３】
このタンパク質は、多くの生理的又は病理学的プロセスの制御において不可欠な役割を果たし、胚発生(embryonic development)に、最終分化(terminal differentiation)に、並びに細胞周期進行及び細胞生存の制御に不可欠であり、ウイルス起源の腫瘍を含む多くのがんにおいては、その発現が調節解除されてアポトーシスの阻害をもたらし（Ａｈｍｅｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、２２６〜２３０；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００３、３６９、１〜１５）；細胞成長(cell growth)の促進及びアポトーシスの抑制におけるその二重機能は、その発がん能を説明し得る（Ｔａｗｆｉｃら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２００１年４月；１６（２），５７３〜８２）。
【０００４】
ＣＫ２タンパク質はまた、糸球体腎炎のような炎症性疾患に（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００５、１０２（２１）、７７３６〜７７４１）、生活環に不可欠なタンパク質のリン酸化に細胞ＣＫ２を利用する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びポリオウイルス（ＰＶ）のような一部の感染性疾患に、並びに病原寄生虫感染症に（Ｍｅｇｇｉｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、４３、１２９３１〜１２９３６）関与する。
【０００５】
異常なＣＫ２発現と、前立腺がん（Ｌａｒａｍａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００７、４３、９２８〜９３４）及び急性骨髄性白血病（Ｋｉｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、１３、１０１９〜１０２８）における好ましくない予後マーカーとの最近の関連付けから、腫瘍形成におけるＣＫ２の意味が確認されている。
【０００６】
多くの生理的プロセスにおける不可欠な役割のため及びその機能不全に関連付けられる病態の重要性のため、ＣＫ２タンパク質は、医薬品、特に抗がん剤及び抗ウイルス剤の開発に重要な薬理学的標的となっている。
【０００７】
したがって、ＣＫ２タンパク質は、化学的阻害剤の同定及び特性決定を裏付ける、治療的介入に適する妥当な生理病理学的標的であると考えられる（Ｐａｇａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３２１、１０４０〜１０４４；Ｄｕｎｃａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００８、１７８４、３３〜４７）。
【０００８】
がん、糖尿病又は炎症のような多くの疾患はプロテインキナーゼＣＫ２の摂動(perturbation)と関連するため、このタンパク質の効果的な阻害剤が必要とされている。
【０００９】
これまで先行技術において、いくつかの分子が、ＣＫ２タンパク質を阻害できると記載されている：
- ４種の主要分子：ケルセチン、エモジン、４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）及びその誘導体並びに５−オキソ−５，６−ジヒドロインドロ−（１，２−ａ）キナゾリン−７−イル）酢酸を含むＡＴＰ競合的阻害剤（Ｄｕｎｃａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００８、１７８４、３３〜４７）。ＣＫ２の触媒活性を特異的に阻害できるこれらの分子としては、ＣＫ２に対してより顕著な選択性を示すＴＢＢ、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）の誘導体（Ｓａｒｎｏら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００１、４９６、４４〜４８；Ｄｕｎｃａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００８、７、１０７７〜１０８８）を挙げることができる。しかし、ＴＢＢ及び他のキナーゼ基質類似体は、細胞ＡＴＰを用いて他の既知又は未知タンパク質の活性を阻害できるが；このような製品の特異性は確実でないので、それらの使用はインビボでは除外されている；
− 米国特許出願公開第２００２／１４７１６３号及び米国特許第６，４５５，３０７号に記載されている、ＣＫ２のαサブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。しかし、インビトロで立証されているＣＫ２の阻害は、部分的且つ一過性であって、非常に高用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（細胞の感受性に応じて数十又は数百μｇ／ｍＬ）を必要とする；
− 国際公開ＷＯ２００５／００５６３２に開示されているｓｉＲＮＡ。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｈｍｅｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、２２６〜２３０
【非特許文献２】Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００３、３６９、１〜１５）
【非特許文献３】Ｔａｗｆｉｃら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２００１年４月；１６（２），５７３〜８２
【非特許文献４】Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００５、１０２（２１）、７７３６〜７７４１
【非特許文献５】Ｍｅｇｇｉｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４、４３、１２９３１〜１２９３６
【非特許文献６】Ｌａｒａｍａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００７、４３、９２８〜９３４
【非特許文献７】Ｋｉｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、１３、１０１９〜１０２８
【非特許文献８】Ｐａｇａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２００４、３２１、１０４０〜１０４４
【非特許文献９】Ｄｕｎｃａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２００８、１７８４、３３〜４７
【非特許文献１０】Ｓａｒｎｏら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、２００１、４９６、４４〜４８
【非特許文献１１】Ｄｕｎｃａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００８、７、１０７７〜１０８８
【非特許文献１２】Ｂｉｓｓｅｒｙら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、１９９３、１１、２６３〜２７７
【非特許文献１３】Ｎａｂｉｅｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３、９０１３〜９０２３
【非特許文献１４】Ｒｉｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、５９８７〜５９９３）
【非特許文献１５】Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７
【非特許文献１６】Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｊ−Ｍ．Ｌｈｏｓｔｅ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、３３、１５１９〜１５２８
【非特許文献１７】Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｃ．Ｈｕｅｌ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９２、７、２３５〜２５１
【非特許文献１８】Ｓ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ、Ｖ．Ｒｏｉｇ、Ｚ．Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ、Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｐ．Ａｒｉｍｏｎｄｏ、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｃ．Ｈｅｌｅｎｅ及びＵ．Ａｓｓｅｌｉｎｅ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５
【非特許文献１９】Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｅ．Ｆａｎ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｐ．Ｖｒｉｇｎａｕｄ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７
【非特許文献２０】Ｃ．Ｅｓｃｕｄｅ、Ｃ．Ｈ．Ｎｕｙｅｎ、Ｓ．Ｋｕｋｒｅｄｉ、Ｙ．Ｊａｎｉｎ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｔ．Ｇａｒｅｓｔｉｅｒ及びＣ．Ｈｅｌｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９８、９５、３５９１〜３５９６
【非特許文献２１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５
【非特許文献２２】Ｐｒｕｄｅｎｔ，Ｒ．ら（２００８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１６（１−２）：７１〜８５
【非特許文献２３】Ｆｉｌｈｏｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：９９２８〜３６（１９９０））
【非特許文献２４】Ｔｈｉ Ｍｙ−Ｎｈｕｎｇ Ｈｏａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、２００９年、第８巻、第５号、７６５〜７７２頁
【非特許文献２５】Ｐｒｕｄｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７８０（１２）：１４１２〜２０
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／１４７１６３号
【特許文献２】米国特許第６，４５５，３０７号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／００５６３２
【特許文献４】ＥＰ０４０２２３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、例えば、がん化学療法における耐性の問題を克服するのに有効な方法でプロテインキナーゼＣＫ２を特異的に阻害し得る新規分子を提供することが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、今回、プロテインキナーゼＣＫ２の競合的阻害剤を同定した。
【００１４】
本発明の主題は、プロテインキナーゼＣＫ２阻害薬としての使用が開示されていない特異的な化合物に関する。この化合物は、医薬品として使用するための、式（Ｉ）：
【００１５】
【化１】
【００１６】
［式中、
− 環Ｃは、ピロール複素環又はピラジン複素環であり、
− Ｒ１は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ１は、環Ｃがピロール複素環である場合にのみ存在し、
− Ｒ２は、−Ｈ、二重結合によって環Ｄに連結されている酸素原子、ハロゲン原子、１，２−エタンジオキシ基（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）、１，２−エタンジチオ基（−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−）、フェニル基、ベンジル基、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲ若しくは−Ｎ（Ｒ）２基（式中、Ｒは−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）であり、
− Ｒ３は、Ｒ２が二重結合によって環Ｄと連結されている酸素原子、１，２−エタンジオキシ基又は１，２−エタンジチオ基である場合にのみ存在し、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、
− Ｒ４及びＲ５は、同一であるか異なり、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換若しくは非置換アリール環を表し、
− Ｒ６及びＲ７は、水素原子、又は炭素原子６及び７を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
− Ｒ８及びＲ９は、水素原子、又は炭素原子８及び９を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
但し、
・ Ｒ６及びＲ７が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ８及びＲ９は水素原子であり、
・ Ｒ８及びＲ９が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ６及びＲ７は水素原子である］
の化合物及びそれらの互変異性型並びにそれらの薬学的に許容される塩から選択される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語「アルキル」は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチル−プロピル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル及びヘキシルを意味する。
【００１８】
用語「アリール」は、６〜１０個の環炭素原子を有する単環式炭化水素芳香環系又は複素環系を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ及び−Ｉ、好ましくは−Ｃｌ、−Ｂｒ及び−Ｉ、より好ましくは−Ｃｌから選択されるハロゲン原子を意味する。
【００２０】
「薬学的に許容される」という表現は、ヒト及び動物の組織との接触に好適であり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答又は他の合併症を起こさず、妥当なベネフィット／リスク比に相応する化合物、物質、組成物及び／又は剤形を意味する。
【００２１】
本発明の化合物と類似した構造を示す化合物は、以前にも記載されている。特に、ＥＰ０４０２２３２は、一般式：
【００２２】
【化２】
【００２３】
のピリドベンゾインドール誘導体及びそれらの酸付加塩を記載しており、これらの化合物は抗腫瘍剤として有用である。
【００２４】
これらのうち、ＲＰ６０４７５又はイントプリシンと称される、Ｒ１＝−Ｈ、Ｒ２＝−ＯＨ、Ｒ３＝−ＣＨ３、ａｌｋ＝−（ＣＨ２）３−及びＲ＝−ＣＨ３の化合物が広く研究されている。この化合物は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤であり、強いＤＮＡ結合親和性を示す。インビトロでは、この化合物は、種々の細胞型に対して細胞毒性があり、固形腫瘍状細胞に対する細胞毒性が比較的大きいことがわかった（Ｂｉｓｓｅｒｙら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ、１９９３、１１、２６３〜２７７；Ｎａｂｉｅｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３、９０１３〜９０２３；Ｒｉｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、５９８７〜５９９３）。
【００２５】
Ｎｇｕｙｅｎらは、ピロール複素環がピラジン複素環によって置き換えられた同様な化合物を合成した（Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７）。特に、式：
【００２６】
【化３】
【００２７】
［式中、Ｒ＝−Ｈ又は−ＣＨ３、ａｌｋ＝−（ＣＨ２）２−又は−（ＣＨ２）３−及びＲ’＝−ＣＨ３又は−Ｃ２Ｈ５］
の化合物は、強いＤＮＡトポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤であり、抗腫瘍特性を示す。
【００２８】
この論文は、式：
【００２９】
【化４】
【００３０】
［式中、Ｒ＝−ＯＨ又は−ＯＣＨ３］
の化合物も記載しているが、これらの化合物は、抗腫瘍性活性を有さない。このことは、これらの化合物の化学構造の変化は、微小であっても、異なる生物活性をもたらし得ることを示している。
【００３１】
驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物は、プロテインキナーゼＣＫ２の選択的阻害剤であって、トポイソメラーゼ阻害剤ではないことがわかった。したがって、これらの化合物は、ＣＫ２調節解除を伴う病態の予防及び／又は治療の開発において有用であることがわかった。
【００３２】
好ましい一実施形態において、本発明の式（Ｉ）の化合物の環Ｃは、下記式（Ｉａ）：
【００３３】
【化５】
【００３４】
［式中、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は前記で定義した通りであり、基Ｒ１は好ましくは水素原子である］
を定義するピロール複素環である。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、本発明の式（Ｉ）の化合物の環Ｃ、下記式（Ｉｂ）：
【００３６】
【化６】
【００３７】
［式中、基Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は前記で定義した通りである］
を定義するピラジン複素環である。
【００３８】
好ましくは、Ｒ６及びＲ７又はＲ８及びＲ９が置換アリール基を表す場合には、前記置換アリール基は、−ＯＨ基によって置換されているフェニル環である。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、基Ｒ２は、ハロゲン原子、より好ましくは塩素原子である。
【００４０】
別の好ましい実施形態によれば、基Ｒ４が水素原子であり及び／又は基Ｒ５がメチル基である式（Ｉ）の化合物が、非常に良好な活性のために、特に重要である。
【００４１】
別の特に好ましい実施形態によれば、基Ｒ４及びＲ５は、炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換又は非置換フェニル環を表し、式（Ｉ）の前記化合物は、下記式（Ｉｃ）：
【００４２】
【化７】
【００４３】
［式中、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は前記で定義した通りである］
に相当する。
【００４４】
本発明による式（Ｉ）の最も好ましい化合物は、以下の通りである：
−化合物１：
【００４５】
【化８】
【００４６】
−化合物２：
【００４７】
【化９】
【００４８】
薬学的に許容される塩としては、無機酸との付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、若しくは有機酸との付加塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、又はこれらの酸の代替誘導体との付加塩を挙げることができる。
【００４９】
本発明の化合物は、当業者によく知られている多くの方法で製造できる。試薬及び出発原料は、市販されているか、又は周知の技術によって容易に合成される。
【００５０】
本発明の化合物の合成は、文献中に記載されている：
- 式（Ｉａ）の化合物の合成は、以下の論文：Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｊ−Ｍ．Ｌｈｏｓｔｅ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、３３、１５１９〜１５２８；Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｃ．Ｈｕｅｌ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９２、７、２３５〜２５１；並びにＳ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ、Ｖ．Ｒｏｉｇ、Ｚ．Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ、Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｐ．Ａｒｉｍｏｎｄｏ、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｃ．Ｈｅｌｅｎｅ及びＵ．Ａｓｓｅｌｉｎｅ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５中に記載されており；
- 式（Ｉｂ）の化合物の合成は、Ｃ．Ｈ．Ｎｇｕｙｅｎ、Ｅ．Ｆａｎ、Ｊ．Ｆ．Ｒｉｏｕ、Ｍ．Ｃ．Ｂｉｓｓｅｒｙ、Ｐ．Ｖｒｉｇｎａｕｄ、Ｆ．Ｌａｖｅｌｌｅ及びＥ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９５、１０、２７７〜２９７に記載されており、
- 式（Ｉｃ）の化合物の合成は、Ｃ．Ｅｓｃｕｄｅ、Ｃ．Ｈ．Ｎｕｙｅｎ、Ｓ．Ｋｕｋｒｅｄｉ、Ｙ．Ｊａｎｉｎ、Ｊ−Ｓ．Ｓｕｎ、Ｅ．Ｂｉｓａｇｎｉ、Ｔ．Ｇａｒｅｓｔｉｅｒ及びＣ．Ｈｅｌｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９８、９５、３５９１〜３５９６に記載されている。
【００５１】
通常、反応は、好適な溶媒中で実施する。関与する反応又は試薬に悪影響を及ぼさなければ、種々の溶媒を使用できる。好適な溶媒の例としては、芳香族、脂肪族又は脂環式炭化水素であることができる炭化水素、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン及びキシレン；アミド、例えば、ジメチルホルムアミド；アルコール、例えば、エタノール、２-メトキシエタノール及びメタノール；エーテル、例えば、ジエチルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン；アセトニトリル；並びに水が挙げられる。
【００５２】
反応は、広範囲の温度にわたって起こり得る。一般に、０〜１５０℃、より好ましくは室温〜２６０℃の温度において反応を実施するのが都合良い。反応に必要な時間もまた、多くの因子、特に反応温度及び試薬の性質に応じて、広範囲に変動し得る。しかし、反応が前記で概説した好ましい条件下で行われるならば、３〜７２時間の時間で通常は充分であろう。
【００５３】
製造された式（Ｉ）の化合物は、常法によって反応混合物から回収できる。例えば、化合物の回収は、反応混合物から溶媒を留去することによって、又は必要ならば、反応混合物から溶媒を留去後に残分を水中に流し込み、続いて水不混和性有機溶媒で抽出し、抽出物から溶媒を留去することによって、行うことができる。加えて、生成物は、所望ならば、種々の周知技術、例えば、再結晶、再沈殿又は種々のクロマトグラフィー技術、特にカラムクロマトグラフィー又は分取薄層クロマトグラフィーによって更に精製できる。
【００５４】
本発明の化合物１及び２は、下記ステップを含む方法によって得ることができる：
【００５５】
【化１０】
【００５６】
化合物１又は２の製造方法は、以下の主要ステップ：
（ｉ）化合物ＩＩＩ又はＶＩＩＩを得るための、化合物ＩとＩＩとの又はＩとＶＩＩとの縮合と
（ｉｉ）化合物ＩＶ又はＩＸを得るための、得られたヒドラゾンＩＩＩ又はＶＩＩＩの熱的フィッシャーインドール化(thermal Fischer indolization)によるインドール化と
（ｉｉｉ）木炭上パラジウムの存在下における化合物ＩＶ又はＩＸの芳香族化による、化合物Ｖ又はＸの直接生成と
を含む。
【００５７】
インドール化ステップ（ｉｉ）及び芳香族化ステップ（ｉｉｉ）は、同一容器で、各ステップを制御して適切な完了を確実にしながら、実施できる。次いで、アセトニトリル−オキシ塩化リン−塩化ベンジルトリエチルアンモニウム−ジエチルアニリン混合物中で化合物Ｖ又はＸを煮沸し、続いて塩化水素水溶液中で塩化ベンジルトリエチルアンモニウムの存在下でメトキシ化合物ＶＩ又はＸＩを煮沸することによって、本発明の化合物１又は２が得られる。
【００５８】
本発明はまた、前記で定義した式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に含む医薬組成物に関する。
【００５９】
「薬学的に許容される賦形剤」という表現は、任意の希釈剤、補助剤又は賦形剤、例えば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、分散媒、剤皮、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及びおび吸収遅延剤などを意味する。
【００６０】
式（Ｉ）の化合物のプロテインキナーゼＣＫ２阻害生物活性を、評価した（実施例２〜６を参照）。
【００６１】
前記化合物及びそれらの塩は、これらの性質により、抗腫瘍剤、抗感染症剤、抗炎症剤、抗マラリア剤並びに糖尿病、自己免疫疾患及び炎症性疾患に対して有用な薬剤などの活性薬剤として、更にまた、ＣＫ２酵素の過剰な活性に関連する障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療への、特にヒトなどの哺乳類の治療への医薬品としての使用に好適である。
【００６２】
ＣＫ２酵素の過剰な活性に関連する障害及び／又は疾患は、例えば、がん、特に乳がん、前立腺がん、肺がん、頸部がん及び脳がん、腎臓がん、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌並びに膵臓がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、糸球体腎炎；感染性疾患、例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＰＶ、単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルスなど）；糖尿病；血管新生関連障害；網膜症（例えば、加齢黄斑変性症、ＡＲＭＤ）及び心肥大である。
【００６３】
ヒト又は場合によっては動物に投与される式（Ｉ）の化合物の量は、下記実施例中に開示する手段によって測定され得るこの化合物の特異活性によって異なる。この量は、治療される疾病の重症度並びに個々の患者の年齢及び体重によっても異なる。
【００６４】
上記の条件に加えて、本発明は、一般式（Ｉ）の化合物の生物活性を例示する実施例及びまた、添付した図面に言及する、以下の説明から明白になる他の条件も含む。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】２つのα触媒サブユニット及び２つのβ調節サブユニットを含むプロテインキナーゼＣＫ２の略図を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、生細胞中における、ＴＢＢ、化合物１及び２によるＣＫ２活性の阻害を示す。
【図３】化合物１及び２によるＨｅＬａ細胞の増殖阻害を、ＤＭＳＯ及びＴＢＢと比較して示す、（相対生存率）対（試験化合物濃度（μＭ））のグラフである。
【図４】ＤＭＳＯ及びＴＢＢと比較した、化合物１及び２によるＵ３７３がん細胞の増殖阻害を示す。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、ＨｅＬａ（ｐ５３陽性）野生細胞型及びＵ３７３細胞（ｐ５３陰性）における細胞周期に対する、化合物１及び化合物２の影響の分析を示す。
【図６】ＤＭＳＯと比較した、化合物１及び２による、軟寒天培地上における細胞コロニー形成の阻害を示す。
【図７】図７Ａは、化合物１によって誘発された腫瘍成長のインビボにおける阻害を、ＤＭＳＯと比較して示すグラフ（腫瘍成長（ｍｍ３）対時間（日））である。図７Ｂは、この試験中における体重変化を示すグラフ（体重（ｇ）対時間（日））である。
【実施例１】
【００６６】
式（Ｉ）の化合物の合成
式（Ｉ）の化合物１及び２を、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２００３、１４、１２０〜１３５に記載され且つ公表された手順に従って、合成した。
【実施例２】
【００６７】
式（Ｉ）の化合物のＣＫ２阻害活性の特性決定
式（Ｉ）の化合物の作用機序を特徴付けるために、それらを、ＣＫ２、ｃ−ｋｉｔ及びトポイソメラーゼＩＩ活性並びにそれらのＤＮＡ挿入能について試験した。
【００６８】
１．材料及び方法
− ＣＫ２活性に対する式（Ｉ）の化合物の作用を、Ｐｒｕｄｅｎｔら（Ｐｒｕｄｅｎｔ，Ｒ．ら（２００８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１６（１−２）：７１〜８５）に従って測定する：指示濃度の化合物３μＬ、３μＬのＣＫ２α（３６ｎｇ）、及び１００μＭのペプチド基質（ＲＲＲＥＤＥＥＳＤＤＥＥ、配列番号：１）と１０ｍＭ ＭｇＣｌ２と１００μＭ ［γ-３２Ｐ］-ＡＴＰとを含む混合物を含む最終容量１８μＬ中で実施される放射能分析で、化合物を試験した。分析は、室温で５分間実施後に、６０μＬの４％ＴＣＡ添加によって終了させた。ペプチド基質への３２Ｐの取り込みを、Ｆｉｌｈｏｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：９９２８〜３６（１９９０））に既に記載されているようにして、測定した。
【００６９】
− ｃ−ｋｉｔ活性に対する式（Ｉ）の化合物の作用を、製造業者の推奨基準（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照記号１４−５５９）に従って測定する：２５μＬの最終反応容量で、ｃ−ｋｉｔ（５〜１０ｍＵ）を、８ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２５μＭ ＡＴＰ、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１、１０ｍＭ ＭｇＡｃｅｔａｔｅ及び［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（特異活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要濃度）と共にインキュベートする。反応は、ＭｇＡＴＰ混合物の添加によって開始する。室温で４０分間のインキュベーション後、３％リン酸溶液５μＬの添加によって、反応を停止させる。次いで、１０μＬの反応(reaction)を、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ Ａ上にスポットし、７５ｍＭリン酸中で５分間ずつ３回、メタノール中で１回洗浄後、乾燥及びシンチレーション計数を行う。
【００７０】
− トポイソメラーゼＩＩ活性に対する式（Ｉ）の化合物の作用を、製造業者の推奨基準（Ｖａｘｒｏｎ、Ｔａ−００１）に従って測定する：１０μＬの最終反応容量で、１ＵのトポイソメラーゼＩＩαを、０．１Ｍトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＡＴＰ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ＢＳＡ ２μｇ、キネトプラストＤＮＡ５００ｎｇ、及びアッセイされる化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ原液から、ＤＭＳＯの最終濃度１％未満）と共にインキュベートする。反応は、トポイソメラーゼＩＩαの添加によって開始する。３７℃において１５分間のインキュベーション後、停止液（３％ＳＤＳ、１．５ｍｇ．ｍＬ−１プロテイナーゼＫ）１μＬの添加によって反応を停止させる。３７℃において３０分間のインキュベーション後、反応混合物をアガロースゲル（１％アガロース）上で分離し、ＤＮＡトポ異性体をデンシトメトリー分析によって定量化する。
【００７１】
− ＤＮＡ挿入に対する式（Ｉ）の化合物の作用。ＤＮＡ挿入を、ＦＩＤ（蛍光インターカレーター置換(Fluorescence Intercalator Displacement)）を使用して実施した。このアッセイは、ＤＮＡ結合分子による置換時におけるＤＮＡ結合インターカレーター（チアゾールオレンジ）の蛍光の消失に基づいた。簡潔には、二本鎖オリゴヌクレオチドＣＡＡＴＣＧＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＣＧＡＴＴＧ（配列番号：２）（０．２５μＭ）を、１０ｍＭカコジラート、１００ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．２）を含む緩衝液中のチアゾールオレンジ（０．７５μＭ）に混合する。試験化合物及び臭化エチジウム（正の対照）を、混合物（０．７５μＭ〜１０μＭ）に加える。２０分間のインキュベーション後、蛍光を測定する（励起：４９０ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）。このアッセイにおいて、化合物の自己蛍光は陰性であった。
【００７２】
２．結果：本発明の範囲外の２種の化合物と比較した、式（Ｉ）の化合物の活性
化合物３及び化合物４の式はそれぞれ、アリール環の−ＯＨ基が−ＯＣＨ３基によって置き換えられた本発明の化合物1及び２の式に対応する。化合物４は具体的には、先行技術において開示された化合物の定義に対応し：化合物６は、Ｔｈｉ Ｍｙ−Ｎｈｕｎｇ Ｈｏａｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ、２００９年、第８巻、第５号、７６５〜７７２頁に記載されている。
【００７３】
【表１】
【００７４】
これらの結果は、化合物１及び２はＣＫ２活性を強く阻害すること、即ち、これらの２つの化合物に関する残留ＣＫ２活性は、化合物３及び４と比較して非常に低いが、ｃ−ｋｉｔ及びトポイソメラーゼＩＩ活性又はＤＮＡ挿入に対しては全く又は殆ど阻害作用がないことを示しており；式（Ｉ）の化合物は、プロテインキナーゼＣＫ２の選択的阻害剤である。
【実施例３】
【００７５】
細胞に対して強力な(cell-potent)、式（Ｉ）の化合物のＣＫ２阻害活性
１．材料及び方法
生細胞へのＣＫ２に対する化合物の阻害能力を試験するための細胞アッセイを開発した。
【００７６】
細胞ＣＫ２活性アッセイ：ＹＦＰタンパク質のＣ末端に６つのＣＫ２コンセンサスリン酸化部位を添加することによって、キメラＹＦＰベースのＣＫ２活性レポーターを発現するプラスミドｐＥＹＦＰｃ１を設計した（ｐＥＹＦＰｃ１−ＳβＳ）。ｐＥＹＦＰｃ１−ＳβＳは、ｐＥＹＦＰｃ１−ＣＫ２βから、突然変異誘発１には
５’−ＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧ−３’（配列番号：３）及び
５’−ＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号：４）並びに
突然変異誘発２には
５’−ＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＴ−３’（配列番号：５）及び
５’−ＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号：６）
を用いて、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ−Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）による引き続く２ラウンドの突然変異後に得られた（Ｐｒｕｄｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７８０（１２）：１４１２〜２０）。
【００７７】
− プラスミドによるＨｅＬａ細胞のトランスフェクション、
ＨｅＬａ細胞を、１２ウェルプレート中に細胞１０６個／ウェルで蒔き、リポフェクタミン(lipofectamine)試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＫ２活性レポータープラスミド（ｐＥＹＦＰｃ１−ＳβＳ）をトランスフェクトした。
【００７８】
− ＣＫ２阻害活性の試験：正の対照として、生細胞中におけるＣＫ２活性のＴＢＢ阻害を最初に試験する：キメラＣＫ２活性−ＧＦＰベースのレポーターを発現するプラスミドがトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を、ＣＫ２阻害剤ＴＢＢと共に及び負の対照としてのＤＭＳＯと共に２４時間インキュベートする。
【００７９】
次いで、細胞抽出物をネイティブ電気泳動(native electrophoresis)によって分析し、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を免疫ブロットによって可視化する：トランスフェクションの翌日、培地を、化合物を含む新しい培地に置き換え、２４時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、洗浄ペレットを氷中で３０分間、溶解用緩衝液（製造業者推奨基準によれば、５０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、トリトンＸ１００ １／１００、ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ）１／１００及びロイペプチン、アプロチニン、ＡＥＢＳＦ）１００μΛによって可溶化した。５０ｍｇのタンパク質にグリセロールとブロムフェノールブルーとの混合物を加え、１２％ネイティブポリアクリルアミドゲル中を泳動させた。通電転写後、ニトロセルロース膜を１％ ＢＳＡで遮断し、ｍＡｂ抗ＧＦＰ（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１８１４４６０）１／１０００と共に終夜４℃においてインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギ抗-マウス−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ．Ａ４４１６）１／２０００と共に１時間インキュベートし、ＧＦＰをＥＣＬ＋ウェスタンブロット検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。
【００８０】
いくつかの濃度の化合物１及び２を、細胞ＣＫ２活性アッセイにおいて同一条件で試験する。
【００８１】
２．結果
非処理又はＤＭＳＯ処理ＨｅＬａ細胞において、ＣＫ２は十分に活性であり、ＣＫ２活性レポーターは殆どリン酸化アイソフォームとして検出できた（図２Ａの下方のバンドを参照）。
【００８２】
細胞を既知のＣＫ２阻害剤ＴＢＢ、化合物１又は化合物２と共に２４時間インキュベートする場合には、リン酸化ＣＫ２レポーターアイソフォームは、特異的なＣＫ２活性阻害により、用量依存的に消失した（図２Ａ及び２Ｂを参照）。
【００８３】
下記表ＩＩは、細胞ＣＫ２活性アッセイにおける、ＴＢＢ、化合物１及び２の活性を示している：
【００８４】
【表２】
【実施例４】
【００８５】
化合物１及び化合物２による細胞増殖阻害の特性決定
既知のＣＫ２阻害剤は細胞生存率を低下させるので、いくつかの細胞型の生存率を、化合物１及び２による４８時間処理後に測定した。
【００８６】
１．材料及び方法
− 細胞：ＨｅＬａ（ヒトの子宮頚部腺癌）及びＵ３７３（ヒトのグリア芽細胞腫）がん細胞株、
− ＨｅＬａ細胞の増殖阻害を、以下のようにして評価する：Ｈｅｌａ細胞を、９６ウェルプレートに細胞１．５×１０４個／ウェルで蒔いた。翌日、培地を、漸増濃度の阻害剤又は対照としての当量のＤＭＳＯを含む、新しい培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ）が補充されたダルベッコ（Dulbecco）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））に置き換えた。２日後、細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造業者推奨基準に従って測定した。
【００８７】
− Ｕ３７３細胞の増殖阻害を、ＨｅＬａ細胞と同一プロトコールで評価する：蒔いた翌日に、Ｕ３７３細胞を、５μＭの化合物１、化合物２又はＤＭＳＯで処理する。結果を、ＤＭＳＯに関して記録された発光を基準として示す。
【００８８】
２．結果
ＨｅＬａ細胞の細胞生存率の低下：
化合物１及び２は、低用量であっても、腫瘍細胞の強い増殖阻害を誘発する（図３）。
【００８９】
Ｕ３７３がん細胞株の細胞生存率の低下：
５μＭの化合物１及び化合物２は、４８時間の処理後に、これらの細胞株の細胞増殖を減少させる効果がある（図４）。
【実施例５】
【００９０】
化合物１による細胞周期阻害の分析
１．材料及び方法
次に、実施例４において化合物１及び化合物２で予め処理した細胞を、ヨウ化プロピジウムの混和後に細胞周期分析に供する。
【００９１】
細胞周期分布の分析：細胞を、６ウェルプレートで蒔いた。翌日、細胞を、５μＭの化合物又は当量のＤＭＳＯで処理した。２４時間後、細胞を収集し、７０％エタノールで３０分間固定し、１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムで３０分間ラベルした。ＤＮＡ含量を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ及びＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【００９２】
２．結果
分析から、化合物１及び化合物２で処理されたＨｅＬａ細胞及びＵ３７３細胞が、Ｇ２／Ｍ期におけるかなりの蓄積によって細胞周期停止を示すことがわかった。ＨｅＬａ処理細胞ではアポトーシス細胞の付随的増加も観察されるが、Ｕ３７６３細胞ではアポトーシス細胞の付随的増加は観察されず、これらの細胞はアポトーシスに抵抗性である（図５Ａ）。ｓｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期におけるＨｅＬａ細胞及びＵ３７３細胞の比率（％）を、図５Ｂの表に要約する。
【実施例６】
【００９３】
化合物１による、腫瘍細胞の腫瘍形成阻害
１．材料及び方法
腫瘍細胞の腫瘍形成に対する化合物の作用を、コロニー形成アッセイで試験する。
【００９４】
軟寒天培養によるコロニー形成アッセイの阻害は、以下のようにして行う：Ｕ３７３細胞を、化合物（５μＭ）又は当量のＤＭＳＯを含む、０．３％寒天−ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中に埋め込まれた、０．６％寒天−ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ層上に注いだ。１５日後に、コロニー（細胞２０個以上）の数を、１０視野／ウェルで計数した。実験は、少なくとも２回、二重反復試験で行った。
【００９５】
２．結果
図６に示すように、５μＭの化合物１は、コロニー形成の５０％阻害の誘発に十分である。
【実施例７】
【００９６】
化合物１による、インビボでの腫瘍形成阻害
１．材料及び方法
実験手順は全て、地域の倫理委員会に従った（Ｃｏｍｉｔｅ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ ｐｏｕｒ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ ＣＲＥＥＡ、Ｒｈｏｎｅ Ａｌｐｅｓ−プロトコール番号２８６）。雌のＨａｒｌａｎ胸腺欠損ヌードマウス（週齢６〜８週）の右側腹部に、Ｕ３７３細胞７．５ｘ１０５個を皮下播種した。腫瘍が±５０ｍｍ３（体積＝長さ×幅×高さ）に達したら、２２．５％ ＰＥＧ３３５０、０．４５％ＢＳＡに溶解された化合物１（０．１４ｍｇ／１００μＬ／注射−マウス４匹）又は同一緩衝液に溶解された当量のＤＭＳＯ（最終濃度１０％−マウス３匹）（対照群）を、週に３回（２日毎に）２週間、動物に腹腔内投与した。体重及び腫瘍体積を、週２回測定した。腫瘍体積が約１０００ｍｍ３となった時点で、実験を終了させた。結果を、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。
【００９７】
２．結果
化合物１が注射されたマウスでは、ＤＭＳＯが注射されたマウスと比較して、腫瘍発生率が全ての時点で著しく低下したことが観察される（図７Ａ）。最初の化合物注射後１５日で、化合物１が注射されたマウスの腫瘍は、ＤＭＳＯが注射されたマウスの腫瘍の４．７倍小さかった。更に、記録された体重変化は、統計的に有意でなかった。これは、化合物１が、適用用量において忍容性が高かったことを示している（図７Ｂ）。
【実施例８】
【００９８】
構造−活性相関試験
構造−活性相関はまた、いくつかの位置が置換に対して許容性があることを示している。ＣＫ２−式（Ｉ）の化合物の複合体のＸ線共構造(co-structure)から、キナーゼと阻害剤との分子相互作用へのより深い洞察が得られる。
【００９９】
ＣＫ２−式（Ｉ）の化合物の複合体のＸ線共構造：
ＣＫ２−式（Ｉ）の化合物の複合体のＸ線構造において、化合物（Ｉ）のフェニル環の−ＯＨ基とＶａｌ１１６の窒素骨格(nitrogen backbone)との間に水素結合が形成されていることが観察でき、これは、この位置に遊離−ＯＨ基が必要な根拠を示している。
【０１００】
基Ｒ３に関しては、溶媒への曝露時に、基Ｒ３と水との好ましくない疎水性相互作用により、活性が低下すると思われる。これは、基Ｒ３の位置が、溶媒への高曝露環境であることと一致している。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号２：オリゴヌクレオチド
配列番号３：オリゴヌクレオチド
配列番号４：オリゴヌクレオチド
配列番号５：オリゴヌクレオチド
配列番号６：オリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用するための、下記式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
− 環Ｃは、ピロール複素環又はピラジン複素環であり、
− Ｒ１は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ１は、環Ｃがピロール複素環である場合にのみ存在し、
− Ｒ２は、−Ｈ、二重結合によって環Ｄに連結されている酸素原子、ハロゲン原子、１，２−エタンジオキシ基、１，２−エタンジチオ基、フェニル基、ベンジル基、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）２基（式中、Ｒは−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）であり、
− Ｒ３は、Ｒ２が二重結合によって環Ｄと連結されている酸素原子、１，２−エタンジオキシ基又は１，２−エタンジチオ基である場合にのみ存在し、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、
− Ｒ４及びＲ５は、同一であるか異なり、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換若しくは非置換アリール環を表し、
− Ｒ６及びＲ７は、水素原子、又は炭素原子６及び７を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
− Ｒ８及びＲ９は、水素原子、又は炭素原子８及び９を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
但し、
・ Ｒ６及びＲ７が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ８及びＲ９は水素原子であり、
・ Ｒ８及びＲ９が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ６及びＲ７は水素原子である］
に対応する化合物及びそれらの互変異性型並びにそれらの薬学的に許容される塩であることを特徴とする化合物。
【請求項２】
環Ｃがピロール複素環であり、Ｒ１が水素原子であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ６及びＲ７が、炭素原子６及び７を介して環Ｂと縮合されているフェニル環を表し、前記フェニル環が少なくとも１つの−ＯＨ基によって置換されていることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ８及びＲ９が、炭素原子８及び９を介して環Ｂと縮合されているフェニル環を表し、前記フェニル環が少なくとも１つの−ＯＨ基によって置換されていることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がハロゲン原子であることを特徴とする、請求項１から４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が塩素原子であることを特徴とする、請求項５に記載に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４が水素原子であることを特徴とする、請求項１から６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５がメチル基であることを特徴とする、請求項１から７に記載の化合物。
【請求項９】
基Ｒ４及びＲ５が、炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換又は非置換フェニル環を表し、式（Ｉ）の前記化合物が、下記式（Ｉｃ）：
【化２】
に対応することを特徴とする、請求項１から６に記載の化合物。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、以下の
− 化合物１：
【化３】
又は
− 化合物２：
【化４】
であることを特徴とする、請求項１から８に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患；感染性疾患；糖尿病；血管新生関連障害；網膜症及び心肥大から選択される障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品の調製への、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１】
医薬品として使用するための、下記式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
− 環Ｃは、ピロール複素環又はピラジン複素環であり、
− Ｒ１は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ１は、環Ｃがピロール複素環である場合にのみ存在し、
− Ｒ２は、−Ｈ、二重結合によって環Ｄに連結されている酸素原子、ハロゲン原子、１，２−エタンジオキシ基、１，２−エタンジチオ基、フェニル基、ベンジル基、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）２基（式中、Ｒは−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）であり、
− Ｒ３は、Ｒ２が二重結合によって環Ｄと連結されている酸素原子、１，２−エタンジオキシ基又は１，２−エタンジチオ基である場合にのみ存在し、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、
− Ｒ４及びＲ５は、同一であるか異なり、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換若しくは非置換アリール環を表し、
− Ｒ６及びＲ７は、水素原子、又は炭素原子６及び７を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
− Ｒ８及びＲ９は、水素原子、又は炭素原子８及び９を介して環Ｂと縮合されているアリール環を表し、前記アリール環は少なくとも１つの−ＯＨ又は−ＮＨＲ’基（式中、Ｒ’は、−Ｈ又は炭素数１〜６のアルキル基である）によって置換されており、
但し、
・ Ｒ６及びＲ７が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ８及びＲ９は水素原子であり、
・ Ｒ８及びＲ９が少なくとも１つの−ＯＨ若しくは−ＮＨＲ’基によって置換されているアリール環を表す場合には、Ｒ６及びＲ７は水素原子である］
に対応する化合物及びそれらの互変異性型並びにそれらの薬学的に許容される塩であることを特徴とする化合物。
【請求項２】
環Ｃがピロール複素環であり、Ｒ１が水素原子であることを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ６及びＲ７が、炭素原子６及び７を介して環Ｂと縮合されているフェニル環を表し、前記フェニル環が少なくとも１つの−ＯＨ基によって置換されていることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ８及びＲ９が、炭素原子８及び９を介して環Ｂと縮合されているフェニル環を表し、前記フェニル環が少なくとも１つの−ＯＨ基によって置換されていることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がハロゲン原子であることを特徴とする、請求項１から４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が塩素原子であることを特徴とする、請求項５に記載に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ４が水素原子であることを特徴とする、請求項１から６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５がメチル基であることを特徴とする、請求項１から７に記載の化合物。
【請求項９】
基Ｒ４及びＲ５が、炭素原子３及び４を介して環Ｄと縮合されている置換又は非置換フェニル環を表し、式（Ｉ）の前記化合物が、下記式（Ｉｃ）：
【化２】
に対応することを特徴とする、請求項１から６に記載の化合物。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、以下の
− 化合物１：
【化３】
又は
− 化合物２：
【化４】
であることを特徴とする、請求項１から８に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
がん；自己免疫疾患及び炎症性疾患；感染性疾患；糖尿病；血管新生関連障害；網膜症及び心肥大から選択される障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品の調製への、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５００３２５（Ｐ２０１３−５００３２５Ａ）
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２２７６（Ｐ２０１２−５２２２７６）
【出願日】平成２２年７月２８日（２０１０．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２１５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１３００２
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０６４２３２９１）コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ (85)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【出願人】（５０９０００７４７）アンスティトゥー ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル（イエヌエスエエールエム） (6)
【出願人】（５０００５６４７１）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２８日（２０１０．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２１５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１３００２
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５０６４２３２９１）コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ (85)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【出願人】（５０９０００７４７）アンスティトゥー ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル（イエヌエスエエールエム） (6)
【出願人】（５０００５６４７１）
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【Ｆターム（参考）】
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