プロピオン酸の定量方法
【課題】 簡易かつ高感度にプロピオン酸を定量する手段を提供する。
【解決手段】 以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするプロピオン酸の定量方法、
（１）試料中のプロピオン酸に、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させる工程、
（２）プロピオニルCoAトランスフェラーゼの作用によって生成するプロピオニルCoAにアシルCoAオキシダーゼを作用させる工程、
（３）アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素又はアシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程。
【解決手段】 以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするプロピオン酸の定量方法、
（１）試料中のプロピオン酸に、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させる工程、
（２）プロピオニルCoAトランスフェラーゼの作用によって生成するプロピオニルCoAにアシルCoAオキシダーゼを作用させる工程、
（３）アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素又はアシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロピオン酸を特異的かつ高感度に定量する方法に関し、より詳細には、プロピオニルCoAトランスフェラーゼとアシルCoAオキシダーゼを組み合わせることにより、血液や発酵液などの中のプロピオン酸を簡易かつ特異的かつ高感度に定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピオン酸の検出・定量は、医療分野や工業分野で重要である。医療分野では、致死的先天性代謝異常病のプロピオン酸血症などにおいて、血中や尿中にプロピオン酸が蓄積することが知られている。プロピオン酸蓄積は神経などの異常を引き起こすので、迅速なプロピオン酸の検出が必要である（Feliz, B., Witt, D.R. & Harris, B.T. Propionic acidemia: a neuropathology case report and review of prior cases. Arch. Pathol. Lab. Med. 127, 325-328. 2003）。廃棄物処理の分野では、メタン発酵消化槽において、発酵過程の不調に伴いプロピオン酸が蓄積することが知られており、発酵過程の好不調判定のためにプロピオン酸の検出が必要である（Ahring, B.K., Sandberg, M. & Angelidaki, I. Volatile fatty acids as indicators of process imbalance in anaerobic digesters. App. Microbial. Biotechnol. 43, 559-565. 1995.）。また食品分野でも、発酵過程（腐敗に伴いプロピオン酸が蓄積する）の管理や防腐剤として食品に添加したプロピオン酸の管理などを目的として、プロピオン酸の検出が必要である（Rebollo, M.P.S., Rodriguez, H.R., Masana, M.O. & Lasta, J.A. Sodium propionate to control Clostridium botulisms toxigenesis in a shelf-stable beef product prepared by using combined processes including irradiation. J. Food Prot. 60, 771-776. 1997.）。従来は、プロピオン酸検出にガスクロマトグラフィーを用いてきた（Kuhara T. Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using urease-pretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781, 497-517. 2002.）。しかしこの方法は、専門的技術を要する前処理やガスクロマトグラフという機器を必要とすることから、調べたい現場（例えば患者の家や廃棄物処理場など）でプロピオン酸を簡易に検出・定量することはできなかった。
【０００３】
ある特定の物質を簡易かつ高感度に検出する手段として酵素等を利用したバイオセンサーがよく知られている。例えば、Sodeらは、アシルCoAシンテターゼとアシルCoAオキシダーゼを利用した長鎖脂肪酸を検出するためのバイオセンサーを報告している（非特許文献１）
【０００４】
【非特許文献１】Sode, K., Tamiya, E., Karube, I. & Kameda Y. Sensor for free fatty acids based on acyl coenzyme-A synthetase and acyl coenzyme-A oxidase. Anal. Chim. Acta 220, 251-255. 1989.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記バイオセンサーは、アシルCoAシンテターゼを使用しているが、この酵素を使用する場合、反応系にCoAを添加しなければならない。しかし、CoAは電極と非酵素的な反応をするため、この反応の影響によってバイオセンサーの検出感度が低下してしまう。このため、上記バイオセンサーは、かなり高濃度（0.5mM以上）の脂肪酸しか検出できなかった。
【０００６】
本発明は、以上のような技術的な背景の下になされたものであり、簡易かつ高感度にプロピオン酸を定量する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、上記バイオセンサーにおいて使用されているアシルCoAシンテターゼの代わりに、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを使用することにより、反応系にCoAを添加することなく、プロピオン酸を定量できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１９〕を提供する。
【０００９】
〔１〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを用いることを特徴とするプロピオン酸の定量方法。
【００１０】
〔２〕以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするプロピオン酸の定量方法、
（１）試料中のプロピオン酸に、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させる工程、
（２）プロピオニルCoAトランスフェラーゼの作用によって生成するプロピオニルCoAにアシルCoAオキシダーゼを作用させる工程、
（３）アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素又はアシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程。
【００１１】
〔３〕アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、発色物質又は蛍光物質を定量する工程を含むことを特徴とする〔２〕記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１２】
〔４〕アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、過酸化水素によって生じる電流を測定する工程を含むことを特徴とする〔２〕記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１３】
〔５〕アシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程が、アシルCoAオキシダーゼの作用前の酸素量を酸素電極によって測定する工程及びアシルCoAオキシダーゼの作用後の酸素量を酸素電極によって測定する工程を含むことを特徴とする〔２〕記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１４】
〔６〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１５】
〔７〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１６】
〔８〕アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼであることを特徴とする〔１〕乃至〔７〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１７】
〔９〕アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１〕乃至〔７〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１８】
〔１０〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを含むことを特徴とするプロピオン酸の定量キット。
【００１９】
〔１１〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする〔１０〕記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２０】
〔１２〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１０〕記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２１】
〔１３〕アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする〔１０〕乃至〔１２〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２２】
〔１４〕アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１０〕乃至〔１２〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２３】
〔１５〕固定化プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及び固定化アシルCoAオキシダーゼを具備することを特徴とするプロピオン酸定量装置。
【００２４】
〔１６〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする〔１５〕記載のプロピオン酸定量装置。
【００２５】
〔１７〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１５〕記載のプロピオン酸定量装置。
【００２６】
〔１８〕アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする〔１５〕乃至〔１７〕のいずれか記載のプロピオン酸定量装置。
【００２７】
〔１９〕アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１５〕乃至〔１７〕のいずれか記載のプロピオン酸定量装置。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の方法により、プロピオン酸をオンサイト（患者の家、食品の工場や保管所、廃棄物処理場、など）で簡易に定量したり、オンラインで定量（発酵槽の無人管理などを目的として）することができるようになる。
【００２９】
また、本発明の方法は、従来のガスクロ法よりも高感度にプロピオン酸を定量できるので、プロピオン酸血症などを早期に診断することも可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明のプロピオン酸の定量方法は、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ（以下、「PCT」という）及びアシルCoAオキシダーゼ（以下、「ACO」という）を用いることを特徴とするものである。具体的には、以下の二つの酵素反応を利用し、プロピオン酸を定量する。
【００３２】
【化１】
【００３３】
なお、本発明において「プロピオン酸の定量」とは、試料中にプロピオン酸がどれくらい存在するかを調べることだけでなく、試料中にプロピオン酸が含まれるかどうかを調べること（即ち、「プロピオン酸の検出」）も含む。
【００３４】
上記酵素反応を生じさせる方法は特に限定されず、例えば、プロピオン酸を含む試料に、アセチルCoA、PCT及びACOを添加し、これらを混合してもよく、また、プロピオン酸を含む試料にアセチルCoAを添加し、これを、PCT及びACOが固定された樹脂等と接触させてもよい。
【００３５】
試料としては、例えば、プロピオン酸血症の患者又はその疑いのある者の尿や血液、メタン発酵消化槽内の発酵液、防腐剤としてプロピオン酸が添加された醤油、ジュース、パンなどの食品などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
使用するPCTは、ACOとの組み合わせにより、プロピオン酸の定量を行うことができるものであれば特に限定されないが、プロピオン酸と特異的に反応するものを使用するのが好ましい。ここで、「プロピオン酸と特異的に反応する」とは、プロピオン酸以外の物質とはほとんど反応性を示さないことをいい、例えば、酪酸との反応性がプロピオン酸との反応性の５％以下である場合、吉草酸との反応性がプロピオン酸との反応性の５％以下である場合は、「プロピオン酸と特異的に反応する」ということができる。
【００３７】
プロピオン酸と特異的に反応するPCTとしては、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のPCTを例示できる。この酵素は、アセチルCoAをCoAの供与体としたときに、プロピオン酸（C3）と特異的に反応し、プロピオニルCoAを生成する。酪酸（C4）との反応性はプロピオン酸の数％程度で、吉草酸（C5）とは反応しない。この酵素は、例えば、以下のようにして得ることができる。クロストリジウム・プロピオニカム（DSMZ 1682）からゲノムDNAを抽出し、このゲノムDNAからPCR法などにより酵素遺伝子をクローニングできる。この酵素遺伝子を大腸菌用の発現ベクター（pET28a plasmidなど）に挿入し、得られたプラスミドにより形質転換した大腸菌の細胞内に発現させる。その際に、His-tagなどとの融合タンパク質として発現させれば、His-tagに対するアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる。
【００３８】
クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCTの代わりに、その変異体を使用することもできる。ここでいう「変異体」とは、クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCTのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表され、プロピオン酸に特異的なPCT活性を示すタンパク質をいう。なお、クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCTのアミノ酸配列は公知である（GenBank Accession No. CAB77207）。
【００３９】
クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCT以外のプロピオン酸と特異的に反応するPCTを使用することも可能である。このような酵素としては、例えば、クロストリジウム・パーフリンゲンス由来のPCT（GenBank Accession No. NP_561012）などを挙げることができる。
【００４０】
ACOは、PCTとの組み合わせにより、プロピオン酸の定量を行うことができるものであれば特に限定されないが、実質的にアセチルCoAとは反応しないものを使用するのが好ましい。ここで、「実質的にアセチルCoAとは反応しない」とは、アセチルCoAに対する反応性が、アセチルCoA以外のアシルCoAの反応性と比べて著しく低いことをいい、例えば、アセチルCoAとの反応性がプロピオニルCoAとの反応性の１％以下である場合は、「実質的にアセチルCoAとは反応しない」ということができる。
【００４１】
実質的にアセチルCoAとは反応しないACOとしては、シロイヌナズナ（Arabidopsis）由来のACOを例示できる。この酵素は、プロピオニルCoAからオクタノイルCoAまでのアシルCoAを酸化して過酸化水素を発生させるが、アセチルCoAとは反応しない。この酵素は、例えば、以下のようにして得ることができる。シロイヌナズナからゲノムDNAを抽出し、このゲノムDNAからPCR法などにより酵素遺伝子をクローニングできる。この酵素遺伝子を大腸菌用の発現ベクター（pET28a plasmidなど）に挿入し、得られたプラスミドにより形質転換した大腸菌の細胞内に発現させる。その際に、His-tagなどとの融合タンパク質として発現させれば、His-tagに対するアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる。
【００４２】
シロイヌナズナ由来のACOの代わりに、その変異体を使用することもできる。ここでいう「変異体」とは、シロイヌナズナ由来のACOのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表され、実質的にアセチルCoAとは反応せず、ACO活性を示すタンパク質をいう。なお、シロイヌナズナ由来のACOのアミノ酸配列は公知である（GenBank Accession No. BAA82478）。
【００４３】
シロイヌナズナ由来のACO以外の実質的にアセチルCoAとは反応しないACOを使用することも可能である。このような酵素としては、例えば、チャボ由来のACO（GenBank Accession No. XP_414406）などを挙げることができる。
【００４４】
使用するアセチルCoA、PCT及びACOの量は特に限定されないが、例えば、試料に、アセチルCoA、PCT及びACOを添加する場合、アセチルCoAの濃度が50〜500 nmol/ml、PCTの濃度が0.5〜10 U/ml、ACO濃度が10〜200 U/mlとなるようにするのが好ましい。
【００４５】
上記酵素反応によってプロピオン酸の量に応じて過酸化水素が生成し、酸素が消費される。従って、生成した過酸化水素又は消費された酸素を定量することにより、プロピオン酸を定量することができる。
【００４６】
生成した過酸化水素を定量する方法はどのような方法でもよく、発色物質や蛍光物質を用いた方法などを例示できる。発色物質や蛍光物質としては、ペルオキシダーゼ反応により過酸化水素で還元されることによって発色する物質や蛍光を発する物質などを例示できる。発色物質等は、必ずしも単一の物質である必要はなく、複数の物質の組み合わせにより発色又は蛍光を発するようなものでもよい。発色物質や蛍光物質の具体例としては、p-アミノ安息香酸と4-アミノアンチピリンの組み合わせ、アンプレックスレッド（Amplex red、登録商標、10-アセチル-3-7-ジヒドロキシフェノキサジン）などを挙げることができる。
【００４７】
過酸化水素の定量は、過酸化水素によって生じる電流を利用して行ってもよい。酵素の反応系にプラチナ電極等を配置しておくと、酵素反応の結果生成した過酸化水素が電極と反応し、電子を電極に渡す。従って、酵素反応後に電極に発生する電流量を測定することにより、プロピオン酸を定量できる。
【００４８】
このような電気的定量方法を利用したプロピロン酸定量用バイオセンサーの概念図を図１に示す。図１に示すバイオセンサーは、電極１、酵素カラム２、温度調節器３、サンプル注入口４、空気トラップ５、ポンプ６、緩衝液槽７、廃液槽８、電流測定器９からなる。このバイオセンサー内では、緩衝液が緩衝液槽７から廃液槽８へ移動しており、これにより、サンプル注入口４から入った試料は、酵素カラム２を通過した後、電極１に到達する。酵素カラム２には、PCTとACOが固定されており、これらの酵素が試料中のプロピオン酸に作用し、過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素は、電極と反応し、電流を発生させる。この電流を電流測定器９によって測定することによって、プロピオン酸の定量を行うことができる。バイオセンサーとしては、このようなタイプのものだけでなく、例えば、チップ上に酵素を固定したポータブル型のものも作製できる。
【００４９】
消費された酸素を定量する方法も特に限定されず、例えば、酵素反応前後の酸素量を酸素電極によって測定することにより、消費された酸素を定量できる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００５１】
〔実施例１〕 PCTの組換え生産
pET28a(+)(Novagen)にクローニングされたクロストリジウム・プロピオニカムのPCT遺伝子は、ドイツのPhilipps大学Dr. Selmerから提供された。PCT遺伝子の5’末端には、His-tag（His6）遺伝子が付加されている。これを用いて大腸菌Rosetta株 (DE3)を形質転換し、PCT生産株とした。この株を50μg/ml のカナマイシンを含む200 mlのSOC培地（Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）で培養し、OD600（660 nmの濁度）が0.6に達した時に1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えてPCT遺伝子の発現を誘導し、さらに一晩培養した。培養後菌体を遠心分離により回収し、20 mlのバッファーA（50 mM リン酸ナトリウム, 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, pH 7.0）に懸濁した。これをフレンチプレス（12 MPa）処理して菌を破砕し、8000 rpm、20分の遠心分離の上清を回収した。この上清を0.5 mlのNiNTAレジン（キアゲン製）と混合して、30分間氷上に放置した。このレジンをポリスチレンカラムにパッキングし、十分量のバッファーAで洗浄して非結合のタンパク質を除去した。次に、レジンに結合したHis-tag PCTをバッファーB（50 mM リン酸ナトリウム, 300 mM NaCl, 2000 mM イミダゾール, pH 7.0）により溶出した。この酵素溶液をバッファーA により十分透析してイミダゾールを除去後、4℃で保存した。PCT酵素の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により調べた（図２）。
【００５２】
〔実施例２〕ACOの組換え生産
国立基礎生物学研究所の真野博士より提供されたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のACOのcDNAを含むプラスミドベクターpZLから下記のプライマーを用いたPCRによりACO遺伝子断片を回収し、プライマー内にある制限酵素サイトを制限酵素NdeIとSacIにより切断した。
【００５３】
5’−C CAT ATG GCG GTG CTT TCA T−3’
5’−C GAG CTC AGA GAC GGC TAC−3’
（下線は、制限酵素サイト）
ACOを含む断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、pET28a(+)(Novagen)にクローニングした。これによりACO遺伝子の5’末端にHis-tag（His6）遺伝子を付加した。これを用いて大腸菌Rosetta株(DE3)を形質転換し、ACO生産株とした。この株によりPCTと同様にACOを発現させ、精製した。最終酵素溶液に50 μMのFADを入れて、4℃で保存した。酵素の純度は、SDS-PAGEにより調べた（図３）。
【００５４】
〔実施例３〕プロピオン酸の比色定量（アミノアンチピリン法）
反応溶液(100μl、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0) は、PCT (7.75μg)、ACO (5.6μmg)、100μMアセチルCoA、50μM FAD、0.04 U 西洋ワサビペルオキシダーゼ（horse radish peroxidase; HRP）、13 mM p-アミノ安息香酸、1 mM ４-アミノアンチピリンを含む。この方法の発色の反応式を以下に示す。
【００５５】
【化２】
【００５６】
この反応液に各種濃度のプロピオン酸を添加して、定量可能な濃度の範囲を調べた。反応は25℃で10分間行い、分光光度計より500 nmの吸光度を測定した。得られた検量線を図4に示す。これにより、この方法は5μM以上で直線的に定量可能であることが示された。また、50μMにおける活性を酪酸と比較したところ、表１に示すように、酪酸に対する活性はプロピオン酸に対する活性の約５％であることが示された。
【００５７】
【表１】
【００５８】
〔実施例４〕プロピオン酸の比色定量（アンプレックスレッド法）
反応溶液（100μl、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0） は、PCT (7.75μg)、ACO (5.6μg)、10μMアセチルCoA、50μM FAD、0.04 U HRP、50μM アンプレックスレッド（Amplex red、Molecular probe社）を含む。この方法の発色の反応式を以下に示す。反応は25℃で10分間行い、分光光度計より550 nmの吸光度を測定した。結果を図5に示す。これにより、この方法で1μM以上の濃度のプロピオン酸を定量できることが示された。
【００５９】
【化３】
【００６０】
〔実施例５〕プロピオン酸の酸素電極による定量
反応溶液(1500μl、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0) は、PCT (116μg)、ACO (84 μg)、100μMアセチルCoA、50μM FADを含む。この溶液を酸素電極（Oxygraph、ギルソン社）の恒温キュベット（25℃）に入れ、電極が安定したところでプロピオン酸を添加して酸素消費量を測定した。検出範囲を図6に示す。これにより、50μMから200μMの濃度で定量可能であることが明らかになった。
【００６１】
〔実施例６〕プロピオン酸の電気的定量法
PCTとACOを酵素固定用レジン（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）に定法に従い固定し、バイオセンサー装置BF-5（王子科学機器）用カラムにパッキングし、図１に示したような構成になるように装置にセットした。緩衝液は50μM FADを含む50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0、反応温度は30℃であった。サンプルに100μM アセチルCoAを混合した後30μlを装置に注入し、電流発生量を測定した。その結果、図7に示したように、20μMから200μMの範囲で定量性があることが示された。
【００６２】
〔実施例７〕メタン発酵液中のプロピオン酸の定量
家畜糞尿処理用のメタン発酵消化槽（別海町）の汚泥を種に、合成基質（スクロース、酢酸、プロピオン酸、ペプトンを4.5:2.25:2.25:1の比で含む。無機塩の組成は文献[Sekiguchi Y, Kamagata Y, Syutsubo K, Ohashi A, Harada H, Nakamura K. Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology 144, 2655-2665. 1998.]に従った。）を用いて完全混合型のメタン発酵消化系を立ち上げた。基質負荷速度を変動させることにより処理が安定に行われている状態及び過負荷により基質処理に不調をきたす状態を作り、それぞれの状態から発酵液を5 ml採取し、各発酵液中のプロピオン酸の濃度を〔実施例３〕から〔実施例６〕に示した方法及びガスクロマトグラフを用いた方法（Imachi H, Sekiguchi Y, Kamagata Y, Ohashi A, Harada H. Cultivation and in situ detection of a thermophilic bacterium capable of oxidizing propionate in syntrophic association with hydrogenotrophic methanogens in a thermophilic methanogenic granular sludge. Appl Environ Microbiol. 66, 3608-3615. 2000.に記載された方法）により定量した。結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
表２に示すように、ガスクロマトグラフ法の結果と本発明の定量方法の結果には高い相関関係があることが示された。
【００６５】
〔実施例８〕血清中のプロピオン酸の定量
ウサギおよびヤギの血清に最終濃度0.5 mMになるようにプロピオン酸を添加し、実施例４のアンプレックスレッド法により測定を行った。この際に、上記のプロピオン酸添加血清を10倍に純水で希釈したもの10 μLを反応液（100 μL）に添加した。結果を表３に示す。これらの結果から、本発明のプロピオン酸定量法は血清中のプロピオン酸の定量にも用いることができることが示された。
【００６６】
【表３】
【００６７】
〔実施例９〕食品中のプロピオン酸の定量
純水を用いて醤油（キッコーマン）を500倍に希釈し、U/mlのアスコルビン酸酸化酵素（和光純薬）により10分間室温で処理した。この試料10 μLを反応液（100 μL）に添加し、実施例４のアンプレックスレッド法によりプロピオン酸濃度を測定した。この際、アセチルCoA濃度を250 μMに変更した。
【００６８】
純水を用いてリンゴジュース（ミニッツメイド）を10倍に希釈し、この試料10 μLを反応液（100 μL）に添加し、実施例４のアンプレックスレッド法によりプロピオン酸濃度を測定した。この際、アセチルCoA濃度を250 μMに変更した。
【００６９】
アンプレックスレッド法の測定結果を表４に示す。比較のために、この表にはガスクロ法により同じサンプルを測定した結果も合わせて示す。醤油サンプルについてはガスクロ法での定量ができなかったが、0.3％以下程度のプロピオン酸が含まれることが知られており、検出結果（32 mMは0.24%に相当する）は妥当なものと考えられた。これにより、本発明のプロピオン酸定量法は食品サンプル中のプロピオン酸の定量にも用いることができることが示された。
【００７０】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】プロピロン酸定量用バイオセンサーの概念図。
【図２】精製PCTの電気泳動の結果を示す図。
【図３】精製ACOの電気泳動の結果を示す図。
【図４】アミノアンチピリン法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【図５】アプレックスレッド法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【図６】酸素電極法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【図７】電気的検出法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【符号の説明】
【００７２】
１ 電極
２ 酵素カラム
３ 温度調節器
４ サンプル注入口
５ 空気トラップ
６ ポンプ
７ 緩衝液槽
８ 廃液槽
９ 電流測定器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロピオン酸を特異的かつ高感度に定量する方法に関し、より詳細には、プロピオニルCoAトランスフェラーゼとアシルCoAオキシダーゼを組み合わせることにより、血液や発酵液などの中のプロピオン酸を簡易かつ特異的かつ高感度に定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピオン酸の検出・定量は、医療分野や工業分野で重要である。医療分野では、致死的先天性代謝異常病のプロピオン酸血症などにおいて、血中や尿中にプロピオン酸が蓄積することが知られている。プロピオン酸蓄積は神経などの異常を引き起こすので、迅速なプロピオン酸の検出が必要である（Feliz, B., Witt, D.R. & Harris, B.T. Propionic acidemia: a neuropathology case report and review of prior cases. Arch. Pathol. Lab. Med. 127, 325-328. 2003）。廃棄物処理の分野では、メタン発酵消化槽において、発酵過程の不調に伴いプロピオン酸が蓄積することが知られており、発酵過程の好不調判定のためにプロピオン酸の検出が必要である（Ahring, B.K., Sandberg, M. & Angelidaki, I. Volatile fatty acids as indicators of process imbalance in anaerobic digesters. App. Microbial. Biotechnol. 43, 559-565. 1995.）。また食品分野でも、発酵過程（腐敗に伴いプロピオン酸が蓄積する）の管理や防腐剤として食品に添加したプロピオン酸の管理などを目的として、プロピオン酸の検出が必要である（Rebollo, M.P.S., Rodriguez, H.R., Masana, M.O. & Lasta, J.A. Sodium propionate to control Clostridium botulisms toxigenesis in a shelf-stable beef product prepared by using combined processes including irradiation. J. Food Prot. 60, 771-776. 1997.）。従来は、プロピオン酸検出にガスクロマトグラフィーを用いてきた（Kuhara T. Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using urease-pretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781, 497-517. 2002.）。しかしこの方法は、専門的技術を要する前処理やガスクロマトグラフという機器を必要とすることから、調べたい現場（例えば患者の家や廃棄物処理場など）でプロピオン酸を簡易に検出・定量することはできなかった。
【０００３】
ある特定の物質を簡易かつ高感度に検出する手段として酵素等を利用したバイオセンサーがよく知られている。例えば、Sodeらは、アシルCoAシンテターゼとアシルCoAオキシダーゼを利用した長鎖脂肪酸を検出するためのバイオセンサーを報告している（非特許文献１）
【０００４】
【非特許文献１】Sode, K., Tamiya, E., Karube, I. & Kameda Y. Sensor for free fatty acids based on acyl coenzyme-A synthetase and acyl coenzyme-A oxidase. Anal. Chim. Acta 220, 251-255. 1989.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記バイオセンサーは、アシルCoAシンテターゼを使用しているが、この酵素を使用する場合、反応系にCoAを添加しなければならない。しかし、CoAは電極と非酵素的な反応をするため、この反応の影響によってバイオセンサーの検出感度が低下してしまう。このため、上記バイオセンサーは、かなり高濃度（0.5mM以上）の脂肪酸しか検出できなかった。
【０００６】
本発明は、以上のような技術的な背景の下になされたものであり、簡易かつ高感度にプロピオン酸を定量する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、上記バイオセンサーにおいて使用されているアシルCoAシンテターゼの代わりに、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを使用することにより、反応系にCoAを添加することなく、プロピオン酸を定量できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１９〕を提供する。
【０００９】
〔１〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを用いることを特徴とするプロピオン酸の定量方法。
【００１０】
〔２〕以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするプロピオン酸の定量方法、
（１）試料中のプロピオン酸に、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させる工程、
（２）プロピオニルCoAトランスフェラーゼの作用によって生成するプロピオニルCoAにアシルCoAオキシダーゼを作用させる工程、
（３）アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素又はアシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程。
【００１１】
〔３〕アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、発色物質又は蛍光物質を定量する工程を含むことを特徴とする〔２〕記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１２】
〔４〕アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、過酸化水素によって生じる電流を測定する工程を含むことを特徴とする〔２〕記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１３】
〔５〕アシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程が、アシルCoAオキシダーゼの作用前の酸素量を酸素電極によって測定する工程及びアシルCoAオキシダーゼの作用後の酸素量を酸素電極によって測定する工程を含むことを特徴とする〔２〕記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１４】
〔６〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１５】
〔７〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１６】
〔８〕アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼであることを特徴とする〔１〕乃至〔７〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１７】
〔９〕アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１〕乃至〔７〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量方法。
【００１８】
〔１０〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを含むことを特徴とするプロピオン酸の定量キット。
【００１９】
〔１１〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする〔１０〕記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２０】
〔１２〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１０〕記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２１】
〔１３〕アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする〔１０〕乃至〔１２〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２２】
〔１４〕アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１０〕乃至〔１２〕のいずれか記載のプロピオン酸の定量キット。
【００２３】
〔１５〕固定化プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及び固定化アシルCoAオキシダーゼを具備することを特徴とするプロピオン酸定量装置。
【００２４】
〔１６〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする〔１５〕記載のプロピオン酸定量装置。
【００２５】
〔１７〕プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１５〕記載のプロピオン酸定量装置。
【００２６】
〔１８〕アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする〔１５〕乃至〔１７〕のいずれか記載のプロピオン酸定量装置。
【００２７】
〔１９〕アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする〔１５〕乃至〔１７〕のいずれか記載のプロピオン酸定量装置。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の方法により、プロピオン酸をオンサイト（患者の家、食品の工場や保管所、廃棄物処理場、など）で簡易に定量したり、オンラインで定量（発酵槽の無人管理などを目的として）することができるようになる。
【００２９】
また、本発明の方法は、従来のガスクロ法よりも高感度にプロピオン酸を定量できるので、プロピオン酸血症などを早期に診断することも可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明のプロピオン酸の定量方法は、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ（以下、「PCT」という）及びアシルCoAオキシダーゼ（以下、「ACO」という）を用いることを特徴とするものである。具体的には、以下の二つの酵素反応を利用し、プロピオン酸を定量する。
【００３２】
【化１】
【００３３】
なお、本発明において「プロピオン酸の定量」とは、試料中にプロピオン酸がどれくらい存在するかを調べることだけでなく、試料中にプロピオン酸が含まれるかどうかを調べること（即ち、「プロピオン酸の検出」）も含む。
【００３４】
上記酵素反応を生じさせる方法は特に限定されず、例えば、プロピオン酸を含む試料に、アセチルCoA、PCT及びACOを添加し、これらを混合してもよく、また、プロピオン酸を含む試料にアセチルCoAを添加し、これを、PCT及びACOが固定された樹脂等と接触させてもよい。
【００３５】
試料としては、例えば、プロピオン酸血症の患者又はその疑いのある者の尿や血液、メタン発酵消化槽内の発酵液、防腐剤としてプロピオン酸が添加された醤油、ジュース、パンなどの食品などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
使用するPCTは、ACOとの組み合わせにより、プロピオン酸の定量を行うことができるものであれば特に限定されないが、プロピオン酸と特異的に反応するものを使用するのが好ましい。ここで、「プロピオン酸と特異的に反応する」とは、プロピオン酸以外の物質とはほとんど反応性を示さないことをいい、例えば、酪酸との反応性がプロピオン酸との反応性の５％以下である場合、吉草酸との反応性がプロピオン酸との反応性の５％以下である場合は、「プロピオン酸と特異的に反応する」ということができる。
【００３７】
プロピオン酸と特異的に反応するPCTとしては、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のPCTを例示できる。この酵素は、アセチルCoAをCoAの供与体としたときに、プロピオン酸（C3）と特異的に反応し、プロピオニルCoAを生成する。酪酸（C4）との反応性はプロピオン酸の数％程度で、吉草酸（C5）とは反応しない。この酵素は、例えば、以下のようにして得ることができる。クロストリジウム・プロピオニカム（DSMZ 1682）からゲノムDNAを抽出し、このゲノムDNAからPCR法などにより酵素遺伝子をクローニングできる。この酵素遺伝子を大腸菌用の発現ベクター（pET28a plasmidなど）に挿入し、得られたプラスミドにより形質転換した大腸菌の細胞内に発現させる。その際に、His-tagなどとの融合タンパク質として発現させれば、His-tagに対するアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる。
【００３８】
クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCTの代わりに、その変異体を使用することもできる。ここでいう「変異体」とは、クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCTのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表され、プロピオン酸に特異的なPCT活性を示すタンパク質をいう。なお、クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCTのアミノ酸配列は公知である（GenBank Accession No. CAB77207）。
【００３９】
クロストリジウム・プロピオニカム由来のPCT以外のプロピオン酸と特異的に反応するPCTを使用することも可能である。このような酵素としては、例えば、クロストリジウム・パーフリンゲンス由来のPCT（GenBank Accession No. NP_561012）などを挙げることができる。
【００４０】
ACOは、PCTとの組み合わせにより、プロピオン酸の定量を行うことができるものであれば特に限定されないが、実質的にアセチルCoAとは反応しないものを使用するのが好ましい。ここで、「実質的にアセチルCoAとは反応しない」とは、アセチルCoAに対する反応性が、アセチルCoA以外のアシルCoAの反応性と比べて著しく低いことをいい、例えば、アセチルCoAとの反応性がプロピオニルCoAとの反応性の１％以下である場合は、「実質的にアセチルCoAとは反応しない」ということができる。
【００４１】
実質的にアセチルCoAとは反応しないACOとしては、シロイヌナズナ（Arabidopsis）由来のACOを例示できる。この酵素は、プロピオニルCoAからオクタノイルCoAまでのアシルCoAを酸化して過酸化水素を発生させるが、アセチルCoAとは反応しない。この酵素は、例えば、以下のようにして得ることができる。シロイヌナズナからゲノムDNAを抽出し、このゲノムDNAからPCR法などにより酵素遺伝子をクローニングできる。この酵素遺伝子を大腸菌用の発現ベクター（pET28a plasmidなど）に挿入し、得られたプラスミドにより形質転換した大腸菌の細胞内に発現させる。その際に、His-tagなどとの融合タンパク質として発現させれば、His-tagに対するアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる。
【００４２】
シロイヌナズナ由来のACOの代わりに、その変異体を使用することもできる。ここでいう「変異体」とは、シロイヌナズナ由来のACOのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表され、実質的にアセチルCoAとは反応せず、ACO活性を示すタンパク質をいう。なお、シロイヌナズナ由来のACOのアミノ酸配列は公知である（GenBank Accession No. BAA82478）。
【００４３】
シロイヌナズナ由来のACO以外の実質的にアセチルCoAとは反応しないACOを使用することも可能である。このような酵素としては、例えば、チャボ由来のACO（GenBank Accession No. XP_414406）などを挙げることができる。
【００４４】
使用するアセチルCoA、PCT及びACOの量は特に限定されないが、例えば、試料に、アセチルCoA、PCT及びACOを添加する場合、アセチルCoAの濃度が50〜500 nmol/ml、PCTの濃度が0.5〜10 U/ml、ACO濃度が10〜200 U/mlとなるようにするのが好ましい。
【００４５】
上記酵素反応によってプロピオン酸の量に応じて過酸化水素が生成し、酸素が消費される。従って、生成した過酸化水素又は消費された酸素を定量することにより、プロピオン酸を定量することができる。
【００４６】
生成した過酸化水素を定量する方法はどのような方法でもよく、発色物質や蛍光物質を用いた方法などを例示できる。発色物質や蛍光物質としては、ペルオキシダーゼ反応により過酸化水素で還元されることによって発色する物質や蛍光を発する物質などを例示できる。発色物質等は、必ずしも単一の物質である必要はなく、複数の物質の組み合わせにより発色又は蛍光を発するようなものでもよい。発色物質や蛍光物質の具体例としては、p-アミノ安息香酸と4-アミノアンチピリンの組み合わせ、アンプレックスレッド（Amplex red、登録商標、10-アセチル-3-7-ジヒドロキシフェノキサジン）などを挙げることができる。
【００４７】
過酸化水素の定量は、過酸化水素によって生じる電流を利用して行ってもよい。酵素の反応系にプラチナ電極等を配置しておくと、酵素反応の結果生成した過酸化水素が電極と反応し、電子を電極に渡す。従って、酵素反応後に電極に発生する電流量を測定することにより、プロピオン酸を定量できる。
【００４８】
このような電気的定量方法を利用したプロピロン酸定量用バイオセンサーの概念図を図１に示す。図１に示すバイオセンサーは、電極１、酵素カラム２、温度調節器３、サンプル注入口４、空気トラップ５、ポンプ６、緩衝液槽７、廃液槽８、電流測定器９からなる。このバイオセンサー内では、緩衝液が緩衝液槽７から廃液槽８へ移動しており、これにより、サンプル注入口４から入った試料は、酵素カラム２を通過した後、電極１に到達する。酵素カラム２には、PCTとACOが固定されており、これらの酵素が試料中のプロピオン酸に作用し、過酸化水素を生成させる。生成した過酸化水素は、電極と反応し、電流を発生させる。この電流を電流測定器９によって測定することによって、プロピオン酸の定量を行うことができる。バイオセンサーとしては、このようなタイプのものだけでなく、例えば、チップ上に酵素を固定したポータブル型のものも作製できる。
【００４９】
消費された酸素を定量する方法も特に限定されず、例えば、酵素反応前後の酸素量を酸素電極によって測定することにより、消費された酸素を定量できる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００５１】
〔実施例１〕 PCTの組換え生産
pET28a(+)(Novagen)にクローニングされたクロストリジウム・プロピオニカムのPCT遺伝子は、ドイツのPhilipps大学Dr. Selmerから提供された。PCT遺伝子の5’末端には、His-tag（His6）遺伝子が付加されている。これを用いて大腸菌Rosetta株 (DE3)を形質転換し、PCT生産株とした。この株を50μg/ml のカナマイシンを含む200 mlのSOC培地（Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）で培養し、OD600（660 nmの濁度）が0.6に達した時に1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えてPCT遺伝子の発現を誘導し、さらに一晩培養した。培養後菌体を遠心分離により回収し、20 mlのバッファーA（50 mM リン酸ナトリウム, 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, pH 7.0）に懸濁した。これをフレンチプレス（12 MPa）処理して菌を破砕し、8000 rpm、20分の遠心分離の上清を回収した。この上清を0.5 mlのNiNTAレジン（キアゲン製）と混合して、30分間氷上に放置した。このレジンをポリスチレンカラムにパッキングし、十分量のバッファーAで洗浄して非結合のタンパク質を除去した。次に、レジンに結合したHis-tag PCTをバッファーB（50 mM リン酸ナトリウム, 300 mM NaCl, 2000 mM イミダゾール, pH 7.0）により溶出した。この酵素溶液をバッファーA により十分透析してイミダゾールを除去後、4℃で保存した。PCT酵素の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により調べた（図２）。
【００５２】
〔実施例２〕ACOの組換え生産
国立基礎生物学研究所の真野博士より提供されたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のACOのcDNAを含むプラスミドベクターpZLから下記のプライマーを用いたPCRによりACO遺伝子断片を回収し、プライマー内にある制限酵素サイトを制限酵素NdeIとSacIにより切断した。
【００５３】
5’−C CAT ATG GCG GTG CTT TCA T−3’
5’−C GAG CTC AGA GAC GGC TAC−3’
（下線は、制限酵素サイト）
ACOを含む断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、pET28a(+)(Novagen)にクローニングした。これによりACO遺伝子の5’末端にHis-tag（His6）遺伝子を付加した。これを用いて大腸菌Rosetta株(DE3)を形質転換し、ACO生産株とした。この株によりPCTと同様にACOを発現させ、精製した。最終酵素溶液に50 μMのFADを入れて、4℃で保存した。酵素の純度は、SDS-PAGEにより調べた（図３）。
【００５４】
〔実施例３〕プロピオン酸の比色定量（アミノアンチピリン法）
反応溶液(100μl、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0) は、PCT (7.75μg)、ACO (5.6μmg)、100μMアセチルCoA、50μM FAD、0.04 U 西洋ワサビペルオキシダーゼ（horse radish peroxidase; HRP）、13 mM p-アミノ安息香酸、1 mM ４-アミノアンチピリンを含む。この方法の発色の反応式を以下に示す。
【００５５】
【化２】
【００５６】
この反応液に各種濃度のプロピオン酸を添加して、定量可能な濃度の範囲を調べた。反応は25℃で10分間行い、分光光度計より500 nmの吸光度を測定した。得られた検量線を図4に示す。これにより、この方法は5μM以上で直線的に定量可能であることが示された。また、50μMにおける活性を酪酸と比較したところ、表１に示すように、酪酸に対する活性はプロピオン酸に対する活性の約５％であることが示された。
【００５７】
【表１】
【００５８】
〔実施例４〕プロピオン酸の比色定量（アンプレックスレッド法）
反応溶液（100μl、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0） は、PCT (7.75μg)、ACO (5.6μg)、10μMアセチルCoA、50μM FAD、0.04 U HRP、50μM アンプレックスレッド（Amplex red、Molecular probe社）を含む。この方法の発色の反応式を以下に示す。反応は25℃で10分間行い、分光光度計より550 nmの吸光度を測定した。結果を図5に示す。これにより、この方法で1μM以上の濃度のプロピオン酸を定量できることが示された。
【００５９】
【化３】
【００６０】
〔実施例５〕プロピオン酸の酸素電極による定量
反応溶液(1500μl、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0) は、PCT (116μg)、ACO (84 μg)、100μMアセチルCoA、50μM FADを含む。この溶液を酸素電極（Oxygraph、ギルソン社）の恒温キュベット（25℃）に入れ、電極が安定したところでプロピオン酸を添加して酸素消費量を測定した。検出範囲を図6に示す。これにより、50μMから200μMの濃度で定量可能であることが明らかになった。
【００６１】
〔実施例６〕プロピオン酸の電気的定量法
PCTとACOを酵素固定用レジン（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）に定法に従い固定し、バイオセンサー装置BF-5（王子科学機器）用カラムにパッキングし、図１に示したような構成になるように装置にセットした。緩衝液は50μM FADを含む50 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.0、反応温度は30℃であった。サンプルに100μM アセチルCoAを混合した後30μlを装置に注入し、電流発生量を測定した。その結果、図7に示したように、20μMから200μMの範囲で定量性があることが示された。
【００６２】
〔実施例７〕メタン発酵液中のプロピオン酸の定量
家畜糞尿処理用のメタン発酵消化槽（別海町）の汚泥を種に、合成基質（スクロース、酢酸、プロピオン酸、ペプトンを4.5:2.25:2.25:1の比で含む。無機塩の組成は文献[Sekiguchi Y, Kamagata Y, Syutsubo K, Ohashi A, Harada H, Nakamura K. Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology 144, 2655-2665. 1998.]に従った。）を用いて完全混合型のメタン発酵消化系を立ち上げた。基質負荷速度を変動させることにより処理が安定に行われている状態及び過負荷により基質処理に不調をきたす状態を作り、それぞれの状態から発酵液を5 ml採取し、各発酵液中のプロピオン酸の濃度を〔実施例３〕から〔実施例６〕に示した方法及びガスクロマトグラフを用いた方法（Imachi H, Sekiguchi Y, Kamagata Y, Ohashi A, Harada H. Cultivation and in situ detection of a thermophilic bacterium capable of oxidizing propionate in syntrophic association with hydrogenotrophic methanogens in a thermophilic methanogenic granular sludge. Appl Environ Microbiol. 66, 3608-3615. 2000.に記載された方法）により定量した。結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
表２に示すように、ガスクロマトグラフ法の結果と本発明の定量方法の結果には高い相関関係があることが示された。
【００６５】
〔実施例８〕血清中のプロピオン酸の定量
ウサギおよびヤギの血清に最終濃度0.5 mMになるようにプロピオン酸を添加し、実施例４のアンプレックスレッド法により測定を行った。この際に、上記のプロピオン酸添加血清を10倍に純水で希釈したもの10 μLを反応液（100 μL）に添加した。結果を表３に示す。これらの結果から、本発明のプロピオン酸定量法は血清中のプロピオン酸の定量にも用いることができることが示された。
【００６６】
【表３】
【００６７】
〔実施例９〕食品中のプロピオン酸の定量
純水を用いて醤油（キッコーマン）を500倍に希釈し、U/mlのアスコルビン酸酸化酵素（和光純薬）により10分間室温で処理した。この試料10 μLを反応液（100 μL）に添加し、実施例４のアンプレックスレッド法によりプロピオン酸濃度を測定した。この際、アセチルCoA濃度を250 μMに変更した。
【００６８】
純水を用いてリンゴジュース（ミニッツメイド）を10倍に希釈し、この試料10 μLを反応液（100 μL）に添加し、実施例４のアンプレックスレッド法によりプロピオン酸濃度を測定した。この際、アセチルCoA濃度を250 μMに変更した。
【００６９】
アンプレックスレッド法の測定結果を表４に示す。比較のために、この表にはガスクロ法により同じサンプルを測定した結果も合わせて示す。醤油サンプルについてはガスクロ法での定量ができなかったが、0.3％以下程度のプロピオン酸が含まれることが知られており、検出結果（32 mMは0.24%に相当する）は妥当なものと考えられた。これにより、本発明のプロピオン酸定量法は食品サンプル中のプロピオン酸の定量にも用いることができることが示された。
【００７０】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】プロピロン酸定量用バイオセンサーの概念図。
【図２】精製PCTの電気泳動の結果を示す図。
【図３】精製ACOの電気泳動の結果を示す図。
【図４】アミノアンチピリン法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【図５】アプレックスレッド法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【図６】酸素電極法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【図７】電気的検出法によるプロピオン酸定量の検量線を示す図。
【符号の説明】
【００７２】
１ 電極
２ 酵素カラム
３ 温度調節器
４ サンプル注入口
５ 空気トラップ
６ ポンプ
７ 緩衝液槽
８ 廃液槽
９ 電流測定器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを用いることを特徴とするプロピオン酸の定量方法。
【請求項２】
以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするプロピオン酸の定量方法、
（１）試料中のプロピオン酸に、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させる工程、
（２）プロピオニルCoAトランスフェラーゼの作用によって生成するプロピオニルCoAにアシルCoAオキシダーゼを作用させる工程、
（３）アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素又はアシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程。
【請求項３】
アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、発色物質又は蛍光物質を定量する工程を含むことを特徴とする請求項２記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項４】
アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、過酸化水素によって生じる電流を測定する工程を含むことを特徴とする請求項２記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項５】
アシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程が、アシルCoAオキシダーゼの作用前の酸素量を酸素電極によって測定する工程及びアシルCoAオキシダーゼの作用後の酸素量を酸素電極によって測定する工程を含むことを特徴とする請求項２記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項６】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項７】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項８】
アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項９】
アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項１０】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを含むことを特徴とするプロピオン酸の定量キット。
【請求項１１】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１０記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１２】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１０記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１３】
アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１４】
アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１５】
固定化プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及び固定化アシルCoAオキシダーゼを具備することを特徴とするプロピオン酸定量装置。
【請求項１６】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１５記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１７】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１５記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１８】
アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１９】
アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを用いることを特徴とするプロピオン酸の定量方法。
【請求項２】
以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするプロピオン酸の定量方法、
（１）試料中のプロピオン酸に、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させる工程、
（２）プロピオニルCoAトランスフェラーゼの作用によって生成するプロピオニルCoAにアシルCoAオキシダーゼを作用させる工程、
（３）アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素又はアシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程。
【請求項３】
アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、発色物質又は蛍光物質を定量する工程を含むことを特徴とする請求項２記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項４】
アシルCoAオキシダーゼの作用によって生成する過酸化水素を定量する工程が、過酸化水素によって生じる電流を測定する工程を含むことを特徴とする請求項２記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項５】
アシルCoAオキシダーゼの作用によって消費される酸素を定量する工程が、アシルCoAオキシダーゼの作用前の酸素量を酸素電極によって測定する工程及びアシルCoAオキシダーゼの作用後の酸素量を酸素電極によって測定する工程を含むことを特徴とする請求項２記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項６】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項７】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項８】
アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項９】
アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量方法。
【請求項１０】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及びアシルCoAオキシダーゼを含むことを特徴とするプロピオン酸の定量キット。
【請求項１１】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１０記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１２】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１０記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１３】
アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１４】
アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項記載のプロピオン酸の定量キット。
【請求項１５】
固定化プロピオニルCoAトランスフェラーゼ及び固定化アシルCoAオキシダーゼを具備することを特徴とするプロピオン酸定量装置。
【請求項１６】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、プロピオン酸と特異的に反応するプロピオニルCoAトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１５記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１７】
プロピオニルCoAトランスフェラーゼが、クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１５記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１８】
アシルCoAオキシダーゼが、実質的にアセチルCoAと反応しないアシルCoAオキシダーゼあることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項記載のプロピオン酸定量装置。
【請求項１９】
アシルCoAオキシダーゼが、シロイヌナズナ由来のアシルCoAオキシダーゼ又はその変異体であることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項記載のプロピオン酸定量装置。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１５８２９７（Ｐ２００６−１５８２９７Ａ）
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３５４７８４（Ｐ２００４−３５４７８４）
【出願日】平成１６年１２月８日（２００４．１２．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発／メタン発酵プロセスの高効率化、安定化に必要な技術の開発／メタン発酵共生微生物群の制御とメタン生成効率化に関する技術開発 委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月８日（２００４．１２．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発／メタン発酵プロセスの高効率化、安定化に必要な技術の開発／メタン発酵共生微生物群の制御とメタン生成効率化に関する技術開発 委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]