ペグ化第ＶＩＩＩ因子
本発明は、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷であり、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する、ポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーに結合した第ＶＩＩＩ因子分子を含む、タンパク質性構築体である。この構築体は、未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも８０％の生物学的活性を有し、該構築体のインビボでの半減期は、未改変因子ＦＶＩＩＩのインビボでの半減期と比較して少なくとも１．５倍延長する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレンオキシド）のような、少なくとも一つの可溶性ポリマーと結合した凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含む、タンパク質性構築体に関する。更に、本発明は、ＦＶＩＩＩの機能欠陥またはＦＶＩＩＩ欠損に関係する出血障害を有する哺乳動物の血液中におけるＦＶＩＩＩのインビボでの半減期を延長するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）因子は、血漿中を非常に低濃度で循環しており、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）と非共有的に結合している。止血の間ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離して、カルシウムおよびリン脂質または細胞膜の存在下での活性化の速度を高めることによって、活性化された第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）が仲介する第Ｘ（ＦＸ）因子の活性化の補因子として働く。
【０００３】
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を持つ、約２７０〜３３０ｋＤの単鎖の前駆体として合成される。血漿から精製した場合、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成されている。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるのに対し、Ｂドメイン内でタンパク質分解を受けるため、重鎖は、９０〜２２０ｋＤの範囲内にある。
【０００４】
ＦＶＩＩＩは、出血障害での治療使用を目的とする組換え体タンパク質としても合成される。治療薬としての組換え体ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的効力を決定するために様々なインビトロアッセイが工夫されている。これらのアッセイは、内因性のＦＶＩＩＩのインビボでの作用を模倣するものである。インビトロアッセイで測定した場合、ＦＶＩＩＩをインビトロでトロンビン処理すると、その凝固促進活性は急速に上昇し、続いて低下する。この活性化および不活性化は、重鎖および軽鎖両方の特異的で限定的なタンパク質分解と一致しており、それら分解はＦＶＩＩＩ内の各種結合エピトープの利用可能性を変化させ、例えばＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させ、リン脂質表面に結合させるか、または特定のモノクローナル抗体への結合能力を変化させる。
【０００５】
ＦＶＩＩＩの欠如または機能異常は、最も頻度の高い出血性障害である血友病Ａと関連する。血友病Ａの管理に選択される処理は、血漿由来の、またはｒＦＶＩＩＩの濃縮製剤を用いた代償療法である。ＦＶＩＩＩレベルが１％未満の重症の血友病Ａ患者には、一般的には投与間のＦＶＩＩＩを１％より高く維持することを目的とした予防療法が行われる。各種ＦＶＩＩＩ製品の血液循環中の平均半減期を考慮に入れると、これは、１週間に２〜３回ＦＶＩＩＩを与えることにより、通常、達成できる。
【０００６】
血友病Ａの治療を目的として、多くの濃縮製剤が販売されている。これら濃縮製剤の一つは、組換え体製品Ａｄｖａｔｅ（登録商標）であり、この製剤はＣＨＯ細胞で産生され、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造している。この製品の細胞培養プロセス、精製、または最終製剤化では、ヒトまたは動物の血漿タンパク質またはアルブミンのいずれも、加えられることはない。
【０００７】
ＦＶＩＩＩ濃縮製剤および治療ポリペプチド薬の多くの製造業者の目標は、他の全ての製品特性を維持しながら、薬力学特性および薬物動態特性を高めた次世代製品を開発することである。
【０００８】
治療ポリペプチド薬は、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、抗体によって中和される。このことは、それらの半減期および循環時間を短縮し、その結果、その治療有効性を制限している。ポリペプチドへの可溶性ポリマーまたは炭水化物の付加は、分解を阻止し、ポリペプチドの半減期を延長することが示されている。例えばポリペプチド薬のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、それらを保護し、それらの薬物動態プロフィールおよび薬力学的プロフィールを改善する（非特許文献１）。ＰＥＧ化のプロセスは、ポリペプチド薬にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反復単位を付着させる。分子のＰＥＧ化は、酵素分解に対する薬物の耐性を高めることができ、インビボでの半減期を延長することができ、投与頻度を減らすことができ、免疫原性を低下させることができ、物理的安定性および熱安定性を高めることができ、可溶性を高めることができ、脂質安定性を高めることができ、凝集を減らすことができる。
【０００９】
このように、（例えば、ＰＥＧ化による）可溶性ポリマーの付加は、ＦＶＩＩＩ製品の特性を改良する一つのアプローチである。従来技術の状態は、様々な特許および特許出願によって文書化されている：
特許文献１は、ポリ（アルキレンオキシド）−ＦＶＩＩＩ結合体またはポリ（アルキレンオキシド）−ＦＩＸ結合体を記載する。ここでは、このタンパク質は該ＦＶＩＩＩのカルボニル基を通してポリ（アルキレンオキシド）に共有結合する。
【００１０】
特許文献２は、ＦＶＩＩＩと生体適合性ポリマーとの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製する方法を記載する。この特許は、非特許文献２の刊行物によって補完されている。この結合体は、モノメトキシポリエチレングリコールで改変された、Ｂドメインが欠失した組換え体ＦＶＩＩＩを含む。この結合体は、低下したＦＶＩＩＩ機能を有し、改変の度合いに応じて凝固活性が急激に低下した。
【００１１】
特許文献３は、複数の結合体を含むポリマー−ＦＶＩＩＩ分子結合体であって、各結合体がＦＶＩＩＩ分子に共有結合している１〜３つの水溶性ポリマーを有する、ポリマー−ＦＶＩＩＩ分子結合体を記載する。このＦＶＩＩＩ分子は、Ｂ−ドメインを欠失している。
【００１２】
特許文献４は、ＦＶＩＩＩ活性を有するタンパク質を含む注入可能な結合体が非抗原性リガンドに共有結合している改変ＦＶＩＩＩを記載する。
【００１３】
特許文献５は、ポリペプチドと生体適合性ポリマーとの結合体を記載する。
【００１４】
特許文献６は、５，０００ダルトン以下の好ましい分子量を有するポリエチレングリコールに結合したＦＶＩＩＩを記載する。
【特許文献１】米国特許第６０３７４５２号明細書
【特許文献２】欧州特許第１２５８４９７号明細書
【特許文献３】国際公開第０４／０７５９２３号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４９７０３００号明細書
【特許文献５】米国特許第６０４８７２０号明細書
【特許文献６】国際公開第９４／１５６２５号パンフレット
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ ｅｔ Ｃｈｅｓｓ ＲＢ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００３；２：２１４−２１
【非特許文献２】Ｒｏｅｓｔｉｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２０００；１１：３８７−９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比べた時にインビボでの半減期は延長されるが、機能活性は維持されている、インビボでのＦＶＩＩＩ半減期を延長するために可溶性ポリマーが結合されたＦＶＩＩＩ（例えば、１０，０００ダルトンを超えるＰＥＧが結合している完全長ＦＶＩＩＩのようなＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ）は今も求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、ポリアクリロリルモルホリン、またはポリシアル酸（ＰＳＡ）のような炭水化物である水溶性ポリマーに結合した、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷であるＦＶＩＩＩ分子を含むタンパク質性構築体である。本発明の一つの実施形態では、水溶性ポリマーは、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有するポリエチレングリコール分子である。この構築体は、標準的な治療用ＦＶＩＩＩ製品の完全な機能活性を維持し、且つ標準的な治療用ＦＶＩＩＩ製品に比較して、延長されたインビボでの半減期を提供する。
【００１７】
本発明の出発材料はＦＶＩＩＩであり、これはヒト血漿に由来してもよく、または米国特許第４７５７００６号；米国特許第５７３３８７３号；米国特許第５１９８３４９号；米国特許第５２５０４２１号；米国特許第５９１９７６６号；欧州特許第３０６９６８号に記載されているような組換え体操作技術によって生成されてもよい。
【００１８】
本明細書においては、用語「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」とは、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷であり、且つ未改変（ｎａｔｉｖｅ）ＦＶＩＩＩに付随する生物学的活性を示す、任意のＦＶＩＩＩ分子を指す。本発明の一つの実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子は完全長の第ＶＩＩＩ因子である。ＦＶＩＩＩ分子は、第ＶＩＩＩ因子：ＣをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションできるＤＮＡ配列によってコードされているタンパク質である。このようなタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（米国特許第４８６８１１２号）間またはその中の各種部位にアミノ酸欠失を含んでもよい。ＦＶＩＩＩ分子はまた、一つまたは複数のアミノ酸残基が部位特異的変異誘発によって置換されている、未改変ＦＶＩＩＩの類似体であってもよい。
【００１９】
例をあげると、ＦＶＩＩＩ分子は、様々な化学的方法によってＰＥＧ化できる（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６）。例えばＦＶＩＩＩは、マレイミド化学を用いて遊離ＳＨ基にＰＥＧを結合させることによって、または前もって酸化させた後にＦＶＩＩＩの炭水化物部分にＰＥＧヒドラジドもしくはＰＥＧアミンを結合させることによってＰＥＧ化できる。
【００２０】
本発明の一つの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、スクシンイミジルスクシナート、スクシンイミジルグルタラート、またはスクシンイミジルプロピオナートのような活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコール誘導体を用いて、リジン残基を介して改変された。これら誘導体は、安定したアミド結合を形成することにより、穏和な条件下でＦＶＩＩＩのリジン残基と反応する。本発明の一つの実施形態では、ＰＥＧ誘導体の鎖長は５，０００Ｄａである。直鎖状構造および分枝状構造を含め、５００〜２，０００Ｄａ、２，０００〜５，０００Ｄａ、５，０００より大きく１０，０００Ｄａまで、または１０，０００より大きく２０，０００Ｄａまで、または２０，０００より大きく１５０，０００Ｄａまでの鎖長を有する別のＰＥＧ誘導体を用いることができる。
【００２１】
アミノ基をＰＥＧ化する別の方法は、ウレタン結合を形成させることによるＰＥＧカルボネートとの化学的結合、または二次アミド結合を形成する還元的アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応である。
【００２２】
本発明では、ＦＶＩＩＩ分子は、市販されているＰＥＧ誘導体を用いて化学的に改変される。これらＰＥＧ誘導体は、直鎖状構造または分枝状構造を有してよい。ＮＨＳ基を含むＰＥＧ誘導体の例を以下に挙げる。
【００２３】
以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ；ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ ｒｅａｇｅｎｔ ｃａｔａｌｏｇ；Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｌｙａｔｉｏｎ，価格表２００５−２００６を見よ）から販売されているＰＥＧ誘導体の例である：
【００２４】
【化１】
この分枝状構造を持つ試薬は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉらによって、より詳細に記載されている（ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００１；５：４１９−２９）。
【００２５】
ＰＥＧ誘導体の他の例は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ：Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ２００５を見よ）から市販されている。
【００２６】
直鎖状ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の一般構造：
【００２７】
【化２】
分枝状ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の構造：
【００２８】
【化３】
これらプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール骨格を示す。本発明では、１，３置換を有する分枝状グリセロール構造または米国特許２００３／０１４３５９６Ａ１に記載されている他の分枝状構造に基づく分枝状ＰＥＧ誘導体も用いることができる。
【００２９】
Ｔｓｕｂｅｒｙら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：３８１１８−２４）およびＳｈｅｃｈｔｅｒら（国際公開第０４０８９２８０Ａ３号）が記載するような分解可能なもの（例えば加水分解可能なリンカー）を有するＰＥＧ誘導体も、本発明に用いることができる。
【００３０】
驚くべきことに、本発明のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、延長されたインビボでのＦＶＩＩＩ半減期と合わせて、完全な機能活性も示す。これに加えて本ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、トロンビン不活性化に対してより抵抗性であるようである。このことは様々なインビトロでの方法およびインビボでの方法によって示された。そしてこのことは、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシナートを用いたｒＦＶＩＩＩ内リジン残基のＰＥＧ化
Ａｄｖａｔｅ製造プロセスに由来するｒＦＶＩＩＩのバルク溶液（３，４００Ｕ／ｍｌ）を、０．５％のショ糖および０．１％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４を用いたＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してゲル濾過した。次に鎖長５，０００ＤａのｍＰＥＧスクシンイミジルスクシナート（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９８４；７：１７５−８６）（ＰＥＧ−ＳＳ ５０００）をこの溶液に、ゆっくり攪拌しながら加え（５ｍｇ ＰＥＧ−ＳＳ／ｍｇタンパク質）、０．５ＭのＮａＯＨを滴下して加えてｐＨ値を７．４に調整した。次に、ゆっくり攪拌しながら、１時間、室温でＰＥＧ化を実施した。
【００３２】
続いて反応混合液を、０．５％のショ糖および０．１％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４で平衡化したイオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ６５０Ｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−１０カラム、ベッド高：１５．０ｃｍ）にかけた。次にカラムを２０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄して過剰の試薬を取り除き、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、０．１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、ｐＨ ７．４）を用いてＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを溶出した。溶出液を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ ７．４からなる緩衝液系を用い、分子量カットオフが３０ｋＤの再生セルロースから成る膜を利用した限外濾過／ダイアフィルトレーションによって濃縮した。
【００３３】
実施例２：インビトロでのＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの生化学的特徴付け
Ａｄｖａｔｅ製造プロセスに由来するｒＦＶＩＩＩを実施例１に従ってＰＥＧ化し、ＰＥＧ化したＦＶＩＩＩ製品を生化学的に特徴付けした。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの機能活性を、ＦＶＩＩＩ色素形成アッセイ（Ｒｏｓｅｎ Ｓ，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９８４；３３（Ｓｕｐｐｌ ４０）：１３９−４５）を用いて決定した。この方法は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．第５版（５．０５）２．７．４ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩに基づく。
【００３４】
第ＶＩＩＩ因子を含有するサンプル（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を、カルシウム含有緩衝液の中で、トロンビン、活性化された第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、および第Ｘ因子（ＦＸ）と混合した。ＦＶＩＩＩはトロンビンにより活性化され、続いてリン脂質、ＦＩＸａ、およびカルシウムイオンと複合体を形成する。この複合体は第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化し、これが次に色素形成基質ＦＸａ−１（ＡｃＯＨ＊ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を切断する。放出されるパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の時間経過をマイクロプレートリーダーを使って４０５ｎｍで測定する。反応の傾きは、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子の濃度に比例する。ＦＶＩＩＩ抗原値を、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ， Ｈｏｒｎｂｙ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）を若干変更して使用して測定した。これらの値から、ＦＶＩＩＩ色素原／ＦＶＩＩＩ抗原比を計算した。調製物中のタンパク質含有量を、２８０ｎｍでの光学密度を測定することによって決定した。これらのデータからタンパク質含有量を計算し（Ｈｏｙｅｒ ＬＷ：Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ． Ｉｎｓｔａｌｌｍｅｎｔｓ １−６；Ｈｅｂｅｒｌｉ Ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９８）、ｍｇ／ｍｌで表した。
【００３５】
【表１】
表１のデータは、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩ調製物では、生物学的活性（ＦＶＩＩＩ色素形成活性の、ＦＶＩＩＩ抗原に対する比として表した）は、未改変ｒＦＶＩＩＩの生物学的活性（１００％）と比較して、９０％を上回って回収されることを示す。
【００３６】
実施例３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術によるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの特徴付け
未改変のｒＦＶＩＩＩを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）より得た４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを製造業者の指示書に従って使用し、還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって特徴付けした。分子量マーカー（ＭＷ）としてはＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より得たＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓマーカー（１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）を用いた。次にタンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より得たＰＶＤＦ膜上にエレクロトブロッティングによって移し、続いてＣｅｄａｒｌａｎｅ（Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）より得たポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ：Ｃ抗体とともにインキュベーションした。免疫ブロッティング手順の最後の工程は、Ａｃｃｕｒａｔｅ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）より得たアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ヒツジ抗体とインキュベーションし、続いてＡＬＰ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い最終的に視覚化することであった。結果は、図１にまとめている。ブロットは、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのドメイン構造を明らかにしている。ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩは、未改変の組換え体タンパク質に比べ、バンドがより広範囲であり、より高い分子量を有していることが示されている。
【００３７】
実施例４：ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスモデルにおけるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの薬物動態
Ｂｉら（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９５；１０：１１９−２１）が詳細に記載したＦＶＩＩＩ欠損マウスを、重症のヒト血友病Ａのモデルとして用いた。５匹のマウスから成る群に、実施例１に従って調製されたＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ＳＳ、５Ｋ）または未改変のｒＦＶＩＩＩのいずれかを２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ体重の用量で尾静脈からボーラス注射（１０ｍｌ／ｋｇ）を与えた。注射の５分後、３時間後、６時間後、９時間後、および２４時間後に、麻酔後に心臓穿刺によって各群からクエン酸血漿を調製した。血漿サンプルのＦＶＩＩＩ活性レベルを測定した。この実験の結果を、図２にまとめている。平均半減期は、１．９時間（未改変ｒＦＶＩＩＩの場合）から４．９時間（ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの場合）延長され、曲線下面積（ＡＵＣ）は１３．０から２５．２時間*ＩＵ／ｍｌに増加した。半減期の計算を、薬物動態ライブラリーからのＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、モデル１（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【００３８】
実施例５：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術による、ｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化の詳細な分析
未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを１ｎＭのトロンビンを用いて６０分間、６０℃で消化した結果、ＦＶＩＩＩ分子は特異的に切断されて良く規定された消化産物を生じた。これらの重鎖および軽鎖の断片を、実施例３に記載したようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてエレクトロブロッティングを行った。切断断片を視覚化するために、重鎖のＡ１ドメインおよびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインおよび軽鎖Ｎ末端Ａ３ドメインに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を適用した。
【００３９】
図３に見られるように、全てのドメインは、程度に差はあるがＰＥＧ化されていた。Ｂドメインは強くＰＥＧ化されていた。重鎖のＡ１およびＡ２両ドメインは部分的にＰＥＧ化された。軽鎖Ａ３ドメインでは、様々な程度（モノ−、ジ−、トリ−等）のＰＥＧ化が観察できた。実施例６と同様、ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩはトロンビンに対してより耐性であるようであった。
【００４０】
実施例６：ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのトロンビン抵抗性
インビトロでＦＶＩＩＩをトロンビン処理すると、その凝固促進活性は急速に上昇し、続いて低下する。活性化および不活性化の速度は、トロンビンの濃度およびＦＶＩＩＩの完全性に依存し、これを、以下のようにしてＦＩＸａ補因子アッセイによってモニタリングした：
ＦＶＩＩＩを３７℃で０．５ｎＭまたは１ｎＭのトロンビンとともにインキュベーションした。０．５分〜４０分の間に、一定間隔でサンプルの一部を抜取り、更なるトロンビン仲介反応を停止させるための特異的トロンビン阻害剤も含有するＦＩＸａ、ＦＸ、ＰＬ−小胞およびＣａＣｌ２の混合液に加えて、３分間インキュベーションした。サンプルの一部を色素形成基質に加えた。この色素形成基質は、ＦＸａによって選択的に切断され、且つ更なるＸａ活性化を停止するためのＥＤＴＡも含有した。１５分間インキュベーションした後、酢酸により反応を停止させた。ＦＸａ濃度に比例する吸光度（Ａ４０５）の値を、ＥＬＩＳＡリーダーで測定し、精製したＦＸａの参照曲線を利用してＦＸａ濃度に変換した。算出されたＦＸａ濃度を、トロンビンとのインキュベーション時間に対してプロットした。
【００４１】
ＦＶＩＩＩの偽一次不活性化速度を、曲線の下降部分を一指数関数当てはめにあてはめるることによって決定した。
【００４２】
【表２】
図４および表２に示すように、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩは、適用した両方のトロンビン濃度において、より遅い不活性化速度を示した。
【００４３】
実施例７：分枝状２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ，ペンチルオキシ）プロパンを用いたｒＦＶＩＩＩ中のリジン残基のＰＥＧ化
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、および０．１％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中のｒＦＶＩＩＩの溶液を、Ａｄｖａｔｅ製造プロセスからの４８９ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌを含有するバルク材料から調製した。ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より得た分子量２０ｋＤの分枝状ＰＥＧスクシンイミジルグルタラート（ＰＥＧ−ＳＧ）試薬（２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパン）を、１５３ｍｌのこの溶液にゆっくりと攪拌しながら加え（５ｍｇ試薬／ｍｇタンパク質）、１０分後に０．５ＭのＮａＯＨを滴下して加えてｐＨ値を７．４に調整した。次にｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化を、ゆっくり攪拌しながら１時間、室温で実施した。
【００４４】
続いて、反応混合液を、０．５％ショ糖および０．１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中の平衡化したイオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ６５０Ｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベッド高：１４．５ｃｍ）に、１ｃｍ／分の線形流速を用いて適用した。カラムを２５ＣＶ平衡化緩衝液を用いて洗浄して過剰の試薬を取り除き（線形流速：２ｃｍ／分）、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、０．１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、ｐＨ ７．４）を用いて線形流速０．５ｃｍ／分で溶出した。次に溶出液を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝液系を用いて、分子量カットオフが３０ｋＤの再生セルロースからなる膜を利用した限外濾過／ダイアフィルトレーションによって濃縮した。
【００４５】
実施例８：分枝状ＰＥＧ−ＳＧ ２０ｋＤでＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩのインビトロでの特徴付け
Ａｄｖａｔｅ製造プロセスに由来するｒＦＶＩＩＩを、実施例７に従って、分枝状ＰＥＧ−ＳＧ試薬を用いてリジン残基を介してＰＥＧ化し、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩ製品を実施例２に記載したように生化学的に特徴付けした。
【００４６】
【表３】
表３のデータは、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩ調製物では、生物学的活性（ＦＶＩＩＩ色素形成活性の、ＦＶＩＩＩ抗原に対する比として表された）が、未改変のｒＦＶＩＩＩの生物学的活性（１００％）と比較して、完全に回収されていることを示す。
【００４７】
ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを、実施例３に記載されているように、還元条件下、４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術によって特徴付けした。結果を図５にまとめている。ブロットは、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのドメイン構造を明らかにしている。ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩは、未改変の組換え体タンパク質に比べると、より広範囲のバンドおよびより高い分子量を有することが示される。
【００４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術によってｒＦＶＩＩＩ調製物のＰＥＧ化をより詳細に解析するために、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを１ｎＭのトロンビンで６０分間、６０℃で消化し、その結果、実施例５に記載したように良く規定されたＦＶＩＩＩ分子の特異的切断が起こった。断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてエレクトロブロッティングし、各種抗ＦＶＩＩＩ抗体によって視覚化した。図６からわかるように、程度の差はあるが、全てのドメインがＰＥＧ化されていた。Ｂドメインは強くＰＥＧ化されていた。軽鎖Ａ３−ドメインでは、様々な程度（モノ−ＰＥＧ化、ジ−ＰＥＧ化、トリ−ＰＥＧ化、等）のＰＥＧ化が観察できた。結果は、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩはトロンビンに対してより耐性であるようであることを示している。
【００４９】
トロンビンによる活性化および不活性化の速度を、実施例６に記載したとおりのＦＩＸａ補因子アッセイによってモニタリングした。ＦＶＩＩＩの偽一次不活性化速度を、曲線の下降部分を一指数関数当てはめに当てはめることによって決定した。
【００５０】
【表４】
図７および表４に示すように、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩは、適用した両方のトロンビン濃度において、より遅い不活性化速度を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ＰＥＧ結合後にｒＦＶＩＩＩの範囲が広がることおよび質量が増すことを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の免疫ブロッティングによって測定して示す。
【図２】図２は、血友病マウスにおける、非結合ＦＶＩＩＩと比較したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の薬物動態を示す。中抜きの四角：ＰＥＧｒＶＩＩＩ、用量２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ。塗りつぶし菱形：未改変ｒＦＶＩＩＩ、用量２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ。
【図３】図３は、様々な抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＥＧ化部位の詳細な分析を示す。
【図４】図４は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのトロンビンで誘発した活性化および不活性化を示す。
【図５】図５は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのドメインを表すバンドを示す。
【図６】図６は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩの各種ドメインのＰＥＧ化の程度を示す。
【図７】図７は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのトロンビン不活性化速度を示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレンオキシド）のような、少なくとも一つの可溶性ポリマーと結合した凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含む、タンパク質性構築体に関する。更に、本発明は、ＦＶＩＩＩの機能欠陥またはＦＶＩＩＩ欠損に関係する出血障害を有する哺乳動物の血液中におけるＦＶＩＩＩのインビボでの半減期を延長するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）因子は、血漿中を非常に低濃度で循環しており、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）と非共有的に結合している。止血の間ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離して、カルシウムおよびリン脂質または細胞膜の存在下での活性化の速度を高めることによって、活性化された第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）が仲介する第Ｘ（ＦＸ）因子の活性化の補因子として働く。
【０００３】
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を持つ、約２７０〜３３０ｋＤの単鎖の前駆体として合成される。血漿から精製した場合、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成されている。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるのに対し、Ｂドメイン内でタンパク質分解を受けるため、重鎖は、９０〜２２０ｋＤの範囲内にある。
【０００４】
ＦＶＩＩＩは、出血障害での治療使用を目的とする組換え体タンパク質としても合成される。治療薬としての組換え体ＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的効力を決定するために様々なインビトロアッセイが工夫されている。これらのアッセイは、内因性のＦＶＩＩＩのインビボでの作用を模倣するものである。インビトロアッセイで測定した場合、ＦＶＩＩＩをインビトロでトロンビン処理すると、その凝固促進活性は急速に上昇し、続いて低下する。この活性化および不活性化は、重鎖および軽鎖両方の特異的で限定的なタンパク質分解と一致しており、それら分解はＦＶＩＩＩ内の各種結合エピトープの利用可能性を変化させ、例えばＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させ、リン脂質表面に結合させるか、または特定のモノクローナル抗体への結合能力を変化させる。
【０００５】
ＦＶＩＩＩの欠如または機能異常は、最も頻度の高い出血性障害である血友病Ａと関連する。血友病Ａの管理に選択される処理は、血漿由来の、またはｒＦＶＩＩＩの濃縮製剤を用いた代償療法である。ＦＶＩＩＩレベルが１％未満の重症の血友病Ａ患者には、一般的には投与間のＦＶＩＩＩを１％より高く維持することを目的とした予防療法が行われる。各種ＦＶＩＩＩ製品の血液循環中の平均半減期を考慮に入れると、これは、１週間に２〜３回ＦＶＩＩＩを与えることにより、通常、達成できる。
【０００６】
血友病Ａの治療を目的として、多くの濃縮製剤が販売されている。これら濃縮製剤の一つは、組換え体製品Ａｄｖａｔｅ（登録商標）であり、この製剤はＣＨＯ細胞で産生され、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造している。この製品の細胞培養プロセス、精製、または最終製剤化では、ヒトまたは動物の血漿タンパク質またはアルブミンのいずれも、加えられることはない。
【０００７】
ＦＶＩＩＩ濃縮製剤および治療ポリペプチド薬の多くの製造業者の目標は、他の全ての製品特性を維持しながら、薬力学特性および薬物動態特性を高めた次世代製品を開発することである。
【０００８】
治療ポリペプチド薬は、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、抗体によって中和される。このことは、それらの半減期および循環時間を短縮し、その結果、その治療有効性を制限している。ポリペプチドへの可溶性ポリマーまたは炭水化物の付加は、分解を阻止し、ポリペプチドの半減期を延長することが示されている。例えばポリペプチド薬のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、それらを保護し、それらの薬物動態プロフィールおよび薬力学的プロフィールを改善する（非特許文献１）。ＰＥＧ化のプロセスは、ポリペプチド薬にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反復単位を付着させる。分子のＰＥＧ化は、酵素分解に対する薬物の耐性を高めることができ、インビボでの半減期を延長することができ、投与頻度を減らすことができ、免疫原性を低下させることができ、物理的安定性および熱安定性を高めることができ、可溶性を高めることができ、脂質安定性を高めることができ、凝集を減らすことができる。
【０００９】
このように、（例えば、ＰＥＧ化による）可溶性ポリマーの付加は、ＦＶＩＩＩ製品の特性を改良する一つのアプローチである。従来技術の状態は、様々な特許および特許出願によって文書化されている：
特許文献１は、ポリ（アルキレンオキシド）−ＦＶＩＩＩ結合体またはポリ（アルキレンオキシド）−ＦＩＸ結合体を記載する。ここでは、このタンパク質は該ＦＶＩＩＩのカルボニル基を通してポリ（アルキレンオキシド）に共有結合する。
【００１０】
特許文献２は、ＦＶＩＩＩと生体適合性ポリマーとの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製する方法を記載する。この特許は、非特許文献２の刊行物によって補完されている。この結合体は、モノメトキシポリエチレングリコールで改変された、Ｂドメインが欠失した組換え体ＦＶＩＩＩを含む。この結合体は、低下したＦＶＩＩＩ機能を有し、改変の度合いに応じて凝固活性が急激に低下した。
【００１１】
特許文献３は、複数の結合体を含むポリマー−ＦＶＩＩＩ分子結合体であって、各結合体がＦＶＩＩＩ分子に共有結合している１〜３つの水溶性ポリマーを有する、ポリマー−ＦＶＩＩＩ分子結合体を記載する。このＦＶＩＩＩ分子は、Ｂ−ドメインを欠失している。
【００１２】
特許文献４は、ＦＶＩＩＩ活性を有するタンパク質を含む注入可能な結合体が非抗原性リガンドに共有結合している改変ＦＶＩＩＩを記載する。
【００１３】
特許文献５は、ポリペプチドと生体適合性ポリマーとの結合体を記載する。
【００１４】
特許文献６は、５，０００ダルトン以下の好ましい分子量を有するポリエチレングリコールに結合したＦＶＩＩＩを記載する。
【特許文献１】米国特許第６０３７４５２号明細書
【特許文献２】欧州特許第１２５８４９７号明細書
【特許文献３】国際公開第０４／０７５９２３号パンフレット
【特許文献４】米国特許第４９７０３００号明細書
【特許文献５】米国特許第６０４８７２０号明細書
【特許文献６】国際公開第９４／１５６２５号パンフレット
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ ｅｔ Ｃｈｅｓｓ ＲＢ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００３；２：２１４−２１
【非特許文献２】Ｒｏｅｓｔｉｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２０００；１１：３８７−９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩと比べた時にインビボでの半減期は延長されるが、機能活性は維持されている、インビボでのＦＶＩＩＩ半減期を延長するために可溶性ポリマーが結合されたＦＶＩＩＩ（例えば、１０，０００ダルトンを超えるＰＥＧが結合している完全長ＦＶＩＩＩのようなＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ）は今も求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、ポリアクリロリルモルホリン、またはポリシアル酸（ＰＳＡ）のような炭水化物である水溶性ポリマーに結合した、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷であるＦＶＩＩＩ分子を含むタンパク質性構築体である。本発明の一つの実施形態では、水溶性ポリマーは、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有するポリエチレングリコール分子である。この構築体は、標準的な治療用ＦＶＩＩＩ製品の完全な機能活性を維持し、且つ標準的な治療用ＦＶＩＩＩ製品に比較して、延長されたインビボでの半減期を提供する。
【００１７】
本発明の出発材料はＦＶＩＩＩであり、これはヒト血漿に由来してもよく、または米国特許第４７５７００６号；米国特許第５７３３８７３号；米国特許第５１９８３４９号；米国特許第５２５０４２１号；米国特許第５９１９７６６号；欧州特許第３０６９６８号に記載されているような組換え体操作技術によって生成されてもよい。
【００１８】
本明細書においては、用語「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」とは、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷であり、且つ未改変（ｎａｔｉｖｅ）ＦＶＩＩＩに付随する生物学的活性を示す、任意のＦＶＩＩＩ分子を指す。本発明の一つの実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子は完全長の第ＶＩＩＩ因子である。ＦＶＩＩＩ分子は、第ＶＩＩＩ因子：ＣをコードするＤＮＡにハイブリダイゼーションできるＤＮＡ配列によってコードされているタンパク質である。このようなタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（米国特許第４８６８１１２号）間またはその中の各種部位にアミノ酸欠失を含んでもよい。ＦＶＩＩＩ分子はまた、一つまたは複数のアミノ酸残基が部位特異的変異誘発によって置換されている、未改変ＦＶＩＩＩの類似体であってもよい。
【００１９】
例をあげると、ＦＶＩＩＩ分子は、様々な化学的方法によってＰＥＧ化できる（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６）。例えばＦＶＩＩＩは、マレイミド化学を用いて遊離ＳＨ基にＰＥＧを結合させることによって、または前もって酸化させた後にＦＶＩＩＩの炭水化物部分にＰＥＧヒドラジドもしくはＰＥＧアミンを結合させることによってＰＥＧ化できる。
【００２０】
本発明の一つの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、スクシンイミジルスクシナート、スクシンイミジルグルタラート、またはスクシンイミジルプロピオナートのような活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含むポリエチレングリコール誘導体を用いて、リジン残基を介して改変された。これら誘導体は、安定したアミド結合を形成することにより、穏和な条件下でＦＶＩＩＩのリジン残基と反応する。本発明の一つの実施形態では、ＰＥＧ誘導体の鎖長は５，０００Ｄａである。直鎖状構造および分枝状構造を含め、５００〜２，０００Ｄａ、２，０００〜５，０００Ｄａ、５，０００より大きく１０，０００Ｄａまで、または１０，０００より大きく２０，０００Ｄａまで、または２０，０００より大きく１５０，０００Ｄａまでの鎖長を有する別のＰＥＧ誘導体を用いることができる。
【００２１】
アミノ基をＰＥＧ化する別の方法は、ウレタン結合を形成させることによるＰＥＧカルボネートとの化学的結合、または二次アミド結合を形成する還元的アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応である。
【００２２】
本発明では、ＦＶＩＩＩ分子は、市販されているＰＥＧ誘導体を用いて化学的に改変される。これらＰＥＧ誘導体は、直鎖状構造または分枝状構造を有してよい。ＮＨＳ基を含むＰＥＧ誘導体の例を以下に挙げる。
【００２３】
以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ；ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ ｒｅａｇｅｎｔ ｃａｔａｌｏｇ；Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｌｙａｔｉｏｎ，価格表２００５−２００６を見よ）から販売されているＰＥＧ誘導体の例である：
【００２４】
【化１】
この分枝状構造を持つ試薬は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉらによって、より詳細に記載されている（ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００１；５：４１９−２９）。
【００２５】
ＰＥＧ誘導体の他の例は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ；ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ：Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ２００５を見よ）から市販されている。
【００２６】
直鎖状ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の一般構造：
【００２７】
【化２】
分枝状ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の構造：
【００２８】
【化３】
これらプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール骨格を示す。本発明では、１，３置換を有する分枝状グリセロール構造または米国特許２００３／０１４３５９６Ａ１に記載されている他の分枝状構造に基づく分枝状ＰＥＧ誘導体も用いることができる。
【００２９】
Ｔｓｕｂｅｒｙら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：３８１１８−２４）およびＳｈｅｃｈｔｅｒら（国際公開第０４０８９２８０Ａ３号）が記載するような分解可能なもの（例えば加水分解可能なリンカー）を有するＰＥＧ誘導体も、本発明に用いることができる。
【００３０】
驚くべきことに、本発明のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは、延長されたインビボでのＦＶＩＩＩ半減期と合わせて、完全な機能活性も示す。これに加えて本ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩは、トロンビン不活性化に対してより抵抗性であるようである。このことは様々なインビトロでの方法およびインビボでの方法によって示された。そしてこのことは、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシナートを用いたｒＦＶＩＩＩ内リジン残基のＰＥＧ化
Ａｄｖａｔｅ製造プロセスに由来するｒＦＶＩＩＩのバルク溶液（３，４００Ｕ／ｍｌ）を、０．５％のショ糖および０．１％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４を用いたＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してゲル濾過した。次に鎖長５，０００ＤａのｍＰＥＧスクシンイミジルスクシナート（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９８４；７：１７５−８６）（ＰＥＧ−ＳＳ ５０００）をこの溶液に、ゆっくり攪拌しながら加え（５ｍｇ ＰＥＧ−ＳＳ／ｍｇタンパク質）、０．５ＭのＮａＯＨを滴下して加えてｐＨ値を７．４に調整した。次に、ゆっくり攪拌しながら、１時間、室温でＰＥＧ化を実施した。
【００３２】
続いて反応混合液を、０．５％のショ糖および０．１％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４で平衡化したイオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ６５０Ｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−１０カラム、ベッド高：１５．０ｃｍ）にかけた。次にカラムを２０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄して過剰の試薬を取り除き、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、０．１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、ｐＨ ７．４）を用いてＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩを溶出した。溶出液を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ ７．４からなる緩衝液系を用い、分子量カットオフが３０ｋＤの再生セルロースから成る膜を利用した限外濾過／ダイアフィルトレーションによって濃縮した。
【００３３】
実施例２：インビトロでのＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの生化学的特徴付け
Ａｄｖａｔｅ製造プロセスに由来するｒＦＶＩＩＩを実施例１に従ってＰＥＧ化し、ＰＥＧ化したＦＶＩＩＩ製品を生化学的に特徴付けした。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの機能活性を、ＦＶＩＩＩ色素形成アッセイ（Ｒｏｓｅｎ Ｓ，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９８４；３３（Ｓｕｐｐｌ ４０）：１３９−４５）を用いて決定した。この方法は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．第５版（５．０５）２．７．４ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩに基づく。
【００３４】
第ＶＩＩＩ因子を含有するサンプル（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を、カルシウム含有緩衝液の中で、トロンビン、活性化された第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、リン脂質、および第Ｘ因子（ＦＸ）と混合した。ＦＶＩＩＩはトロンビンにより活性化され、続いてリン脂質、ＦＩＸａ、およびカルシウムイオンと複合体を形成する。この複合体は第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化し、これが次に色素形成基質ＦＸａ−１（ＡｃＯＨ＊ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を切断する。放出されるパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の時間経過をマイクロプレートリーダーを使って４０５ｎｍで測定する。反応の傾きは、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子の濃度に比例する。ＦＶＩＩＩ抗原値を、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ， Ｈｏｒｎｂｙ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）を若干変更して使用して測定した。これらの値から、ＦＶＩＩＩ色素原／ＦＶＩＩＩ抗原比を計算した。調製物中のタンパク質含有量を、２８０ｎｍでの光学密度を測定することによって決定した。これらのデータからタンパク質含有量を計算し（Ｈｏｙｅｒ ＬＷ：Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ． Ｉｎｓｔａｌｌｍｅｎｔｓ １−６；Ｈｅｂｅｒｌｉ Ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９８）、ｍｇ／ｍｌで表した。
【００３５】
【表１】
表１のデータは、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩ調製物では、生物学的活性（ＦＶＩＩＩ色素形成活性の、ＦＶＩＩＩ抗原に対する比として表した）は、未改変ｒＦＶＩＩＩの生物学的活性（１００％）と比較して、９０％を上回って回収されることを示す。
【００３６】
実施例３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術によるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの特徴付け
未改変のｒＦＶＩＩＩを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）より得た４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲルを製造業者の指示書に従って使用し、還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって特徴付けした。分子量マーカー（ＭＷ）としてはＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より得たＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓマーカー（１０ｋＤ〜２５０ｋＤ）を用いた。次にタンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）より得たＰＶＤＦ膜上にエレクロトブロッティングによって移し、続いてＣｅｄａｒｌａｎｅ（Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）より得たポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ：Ｃ抗体とともにインキュベーションした。免疫ブロッティング手順の最後の工程は、Ａｃｃｕｒａｔｅ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）より得たアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ヒツジ抗体とインキュベーションし、続いてＡＬＰ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い最終的に視覚化することであった。結果は、図１にまとめている。ブロットは、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのドメイン構造を明らかにしている。ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩは、未改変の組換え体タンパク質に比べ、バンドがより広範囲であり、より高い分子量を有していることが示されている。
【００３７】
実施例４：ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスモデルにおけるＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの薬物動態
Ｂｉら（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９５；１０：１１９−２１）が詳細に記載したＦＶＩＩＩ欠損マウスを、重症のヒト血友病Ａのモデルとして用いた。５匹のマウスから成る群に、実施例１に従って調製されたＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ＳＳ、５Ｋ）または未改変のｒＦＶＩＩＩのいずれかを２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ体重の用量で尾静脈からボーラス注射（１０ｍｌ／ｋｇ）を与えた。注射の５分後、３時間後、６時間後、９時間後、および２４時間後に、麻酔後に心臓穿刺によって各群からクエン酸血漿を調製した。血漿サンプルのＦＶＩＩＩ活性レベルを測定した。この実験の結果を、図２にまとめている。平均半減期は、１．９時間（未改変ｒＦＶＩＩＩの場合）から４．９時間（ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの場合）延長され、曲線下面積（ＡＵＣ）は１３．０から２５．２時間*ＩＵ／ｍｌに増加した。半減期の計算を、薬物動態ライブラリーからのＭｉｃｒｏＭａｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、モデル１（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【００３８】
実施例５：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術による、ｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化の詳細な分析
未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを１ｎＭのトロンビンを用いて６０分間、６０℃で消化した結果、ＦＶＩＩＩ分子は特異的に切断されて良く規定された消化産物を生じた。これらの重鎖および軽鎖の断片を、実施例３に記載したようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてエレクトロブロッティングを行った。切断断片を視覚化するために、重鎖のＡ１ドメインおよびＡ２ドメイン、ならびにＢドメインおよび軽鎖Ｎ末端Ａ３ドメインに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を適用した。
【００３９】
図３に見られるように、全てのドメインは、程度に差はあるがＰＥＧ化されていた。Ｂドメインは強くＰＥＧ化されていた。重鎖のＡ１およびＡ２両ドメインは部分的にＰＥＧ化された。軽鎖Ａ３ドメインでは、様々な程度（モノ−、ジ−、トリ−等）のＰＥＧ化が観察できた。実施例６と同様、ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩはトロンビンに対してより耐性であるようであった。
【００４０】
実施例６：ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩのトロンビン抵抗性
インビトロでＦＶＩＩＩをトロンビン処理すると、その凝固促進活性は急速に上昇し、続いて低下する。活性化および不活性化の速度は、トロンビンの濃度およびＦＶＩＩＩの完全性に依存し、これを、以下のようにしてＦＩＸａ補因子アッセイによってモニタリングした：
ＦＶＩＩＩを３７℃で０．５ｎＭまたは１ｎＭのトロンビンとともにインキュベーションした。０．５分〜４０分の間に、一定間隔でサンプルの一部を抜取り、更なるトロンビン仲介反応を停止させるための特異的トロンビン阻害剤も含有するＦＩＸａ、ＦＸ、ＰＬ−小胞およびＣａＣｌ２の混合液に加えて、３分間インキュベーションした。サンプルの一部を色素形成基質に加えた。この色素形成基質は、ＦＸａによって選択的に切断され、且つ更なるＸａ活性化を停止するためのＥＤＴＡも含有した。１５分間インキュベーションした後、酢酸により反応を停止させた。ＦＸａ濃度に比例する吸光度（Ａ４０５）の値を、ＥＬＩＳＡリーダーで測定し、精製したＦＸａの参照曲線を利用してＦＸａ濃度に変換した。算出されたＦＸａ濃度を、トロンビンとのインキュベーション時間に対してプロットした。
【００４１】
ＦＶＩＩＩの偽一次不活性化速度を、曲線の下降部分を一指数関数当てはめにあてはめるることによって決定した。
【００４２】
【表２】
図４および表２に示すように、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩは、適用した両方のトロンビン濃度において、より遅い不活性化速度を示した。
【００４３】
実施例７：分枝状２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ，ペンチルオキシ）プロパンを用いたｒＦＶＩＩＩ中のリジン残基のＰＥＧ化
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、および０．１％ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中のｒＦＶＩＩＩの溶液を、Ａｄｖａｔｅ製造プロセスからの４８９ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌを含有するバルク材料から調製した。ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より得た分子量２０ｋＤの分枝状ＰＥＧスクシンイミジルグルタラート（ＰＥＧ−ＳＧ）試薬（２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパン）を、１５３ｍｌのこの溶液にゆっくりと攪拌しながら加え（５ｍｇ試薬／ｍｇタンパク質）、１０分後に０．５ＭのＮａＯＨを滴下して加えてｐＨ値を７．４に調整した。次にｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化を、ゆっくり攪拌しながら１時間、室温で実施した。
【００４４】
続いて、反応混合液を、０．５％ショ糖および０．１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中の平衡化したイオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ６５０Ｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、ベッド高：１４．５ｃｍ）に、１ｃｍ／分の線形流速を用いて適用した。カラムを２５ＣＶ平衡化緩衝液を用いて洗浄して過剰の試薬を取り除き（線形流速：２ｃｍ／分）、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、０．１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、ｐＨ ７．４）を用いて線形流速０．５ｃｍ／分で溶出した。次に溶出液を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４からなる緩衝液系を用いて、分子量カットオフが３０ｋＤの再生セルロースからなる膜を利用した限外濾過／ダイアフィルトレーションによって濃縮した。
【００４５】
実施例８：分枝状ＰＥＧ−ＳＧ ２０ｋＤでＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩのインビトロでの特徴付け
Ａｄｖａｔｅ製造プロセスに由来するｒＦＶＩＩＩを、実施例７に従って、分枝状ＰＥＧ−ＳＧ試薬を用いてリジン残基を介してＰＥＧ化し、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩ製品を実施例２に記載したように生化学的に特徴付けした。
【００４６】
【表３】
表３のデータは、ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩ調製物では、生物学的活性（ＦＶＩＩＩ色素形成活性の、ＦＶＩＩＩ抗原に対する比として表された）が、未改変のｒＦＶＩＩＩの生物学的活性（１００％）と比較して、完全に回収されていることを示す。
【００４７】
ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを、実施例３に記載されているように、還元条件下、４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術によって特徴付けした。結果を図５にまとめている。ブロットは、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのドメイン構造を明らかにしている。ＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩは、未改変の組換え体タンパク質に比べると、より広範囲のバンドおよびより高い分子量を有することが示される。
【００４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング技術によってｒＦＶＩＩＩ調製物のＰＥＧ化をより詳細に解析するために、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩを１ｎＭのトロンビンで６０分間、６０℃で消化し、その結果、実施例５に記載したように良く規定されたＦＶＩＩＩ分子の特異的切断が起こった。断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いてエレクトロブロッティングし、各種抗ＦＶＩＩＩ抗体によって視覚化した。図６からわかるように、程度の差はあるが、全てのドメインがＰＥＧ化されていた。Ｂドメインは強くＰＥＧ化されていた。軽鎖Ａ３−ドメインでは、様々な程度（モノ−ＰＥＧ化、ジ−ＰＥＧ化、トリ−ＰＥＧ化、等）のＰＥＧ化が観察できた。結果は、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩはトロンビンに対してより耐性であるようであることを示している。
【００４９】
トロンビンによる活性化および不活性化の速度を、実施例６に記載したとおりのＦＩＸａ補因子アッセイによってモニタリングした。ＦＶＩＩＩの偽一次不活性化速度を、曲線の下降部分を一指数関数当てはめに当てはめることによって決定した。
【００５０】
【表４】
図７および表４に示すように、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩは、適用した両方のトロンビン濃度において、より遅い不活性化速度を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ＰＥＧ結合後にｒＦＶＩＩＩの範囲が広がることおよび質量が増すことを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の免疫ブロッティングによって測定して示す。
【図２】図２は、血友病マウスにおける、非結合ＦＶＩＩＩと比較したＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体の薬物動態を示す。中抜きの四角：ＰＥＧｒＶＩＩＩ、用量２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ。塗りつぶし菱形：未改変ｒＦＶＩＩＩ、用量２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｋｇ。
【図３】図３は、様々な抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＥＧ化部位の詳細な分析を示す。
【図４】図４は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのトロンビンで誘発した活性化および不活性化を示す。
【図５】図５は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのドメインを表すバンドを示す。
【図６】図６は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩの各種ドメインのＰＥＧ化の程度を示す。
【図７】図７は、未改変ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ化したｒＦＶＩＩＩのトロンビン不活性化速度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性構築体であって、該タンパク質性構築体は、
（ａ）Ｂドメインの少なくとも一部が無傷である第ＶＩＩＩ因子分子；および
（ｂ）該第ＶＩＩＩ因子分子に結合した少なくとも一つのポリエチレングリコール分子であって、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する、ポリエチレングリコール分子；
を含み、
該構築物は、未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも８０％の生物学的活性を有し、該構築体および未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性は、色素形成活性の、ＦＶＩＩＩ抗原値に対する比（ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）によって決定され、且つ該構築体のインビボでの半減期は、未改変第ＶＩＩＩ因子のインビボでの半減期と比較して少なくとも１．５倍まで延長するタンパク質構築体。
【請求項２】
前記構築体は、未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも９０％の生物学的活性を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項３】
前記第ＶＩＩＩ因子分子は、組換え体第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項４】
前記第ＶＩＩＩ因子分子は、完全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコール分子は、１０，０００Ｄａより大きく、約１２５，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコール分子は、約１５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコール分子は、約１８，０００Ｄａから約２５，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコール分子は、約２０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコール分子は、約２０，０００Ｄａから約１５０，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコール分子は、直鎖状構造または分枝状構造を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項１】
タンパク質性構築体であって、該タンパク質性構築体は、
（ａ）Ｂドメインの少なくとも一部が無傷である第ＶＩＩＩ因子分子；および
（ｂ）該第ＶＩＩＩ因子分子に結合した少なくとも一つのポリエチレングリコール分子であって、１０，０００ダルトンより大きな分子量を有する、ポリエチレングリコール分子；
を含み、
該構築物は、未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも８０％の生物学的活性を有し、該構築体および未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性は、色素形成活性の、ＦＶＩＩＩ抗原値に対する比（ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）によって決定され、且つ該構築体のインビボでの半減期は、未改変第ＶＩＩＩ因子のインビボでの半減期と比較して少なくとも１．５倍まで延長するタンパク質構築体。
【請求項２】
前記構築体は、未改変第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも９０％の生物学的活性を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項３】
前記第ＶＩＩＩ因子分子は、組換え体第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項４】
前記第ＶＩＩＩ因子分子は、完全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコール分子は、１０，０００Ｄａより大きく、約１２５，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコール分子は、約１５，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコール分子は、約１８，０００Ｄａから約２５，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコール分子は、約２０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコール分子は、約２０，０００Ｄａから約１５０，０００Ｄａまでの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコール分子は、直鎖状構造または分枝状構造を有する、請求項１に記載のタンパク質性構築体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５３２３５１（Ｐ２００９−５３２３５１Ａ）
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０２９４４（Ｐ２００９−５０２９４４）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７５６０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２６８０８
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７５６０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２６８０８
【国際公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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